JP2023552203A - 脳腫瘍の治療のための腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスi型 - Google Patents
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Abstract
脳腫瘍の治療のために遺伝子操作された腫瘍溶解性HSV-1ウイルスを開示し、それはγ34.5遺伝子の両方のコピー及び内部逆方向反復領域を欠き、且つ任意に免疫刺激及び/又は免疫療法遺伝子が組み込まれる。前記腫瘍溶解性HSV-1ウイルスは、特に脳腫瘍においては優れた抗腫瘍活性を示した。さらに、腫瘍溶解性HSV-1ウイルスと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、及びそれを用いる脳腫瘍の治療方法を開示する。【選択図】なし
Description
本開示は、腫瘍の治療のための腫瘍溶解性ウイルスに関し、特に、脳腫瘍の治療のために遺伝子操作された腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスI型(oHSV-1)に関する。本開示は、さらに、本明細書に開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスを用いて脳腫瘍を治療する方法、並びにその医薬組成物及び使用に関する。
脳の原発性腫瘍は、中枢神経系の様々なタイプの細胞から発生する可能性がある。髄芽腫(Medulloblastoma)は神経細胞の前駆体に由来し、星細胞腫(astrocytoma)はグリア細胞の星状細胞サブセットに由来し、乏突起神経膠腫はグリア細胞の乏突起膠細胞前駆体サブセットに由来する。他のタイプの原発性腫瘍としては、上衣細胞からの上衣腫、及び髄膜を構成する細胞からの髄膜腫など、それぞれ脳の内層及び外層を形成する細胞に由来する。星状細胞に由来する多形性膠芽腫(GBM)は、最も一般的で致命的な原発性脳腫瘍であるため、WHOグレードIV星細胞腫に分類される。
悪性多形性膠芽腫(GBM)の現在の治療レジメンは腫瘍切除、そして化学療法及び放射線療法である。GBMの臨床試験では腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)の安全性が証明されているにも関わらず、その有効性は、主に腫瘍切除後のウイルス拡散が不十分であるため最適ではない。多形性膠芽腫(GBM)は、成人で最も一般的な脳腫瘍であり、その分子的理解が大きく進歩しているにも関わらず、依然として治療が最も難しい悪性腫瘍の1つである。GBM腫瘍切除は重要な治療的介入であるが、腫瘍切除後の放射線及びテモゾロミド(temozolomide)化学療法による標準治療は、さほど臨床的利益を提供していない。したがって、腫瘍減量(debulking)後のGBM腫瘍切除腔への直接投与が可能な新規な局所療法の開発が急務となる。
臨床的に承認された、化学療法剤BCNUを含有するポリ無水物ウェハースであるGliadelウェハースを切除されたGBMの空洞に局所療法で使用しようとする以前の研究では、治療効果が限られていることが示される。腫瘍切除後にそのような腫瘍残留物を排除できる療法を探し続ける中で、腫瘍溶解性ウイルスは前臨床研究で大きな可能性を示している。これらのウイルスは一般に、腫瘍細胞でしか複製せずそれを殺すよう、遺伝子操作されている。これは、活発に増殖している腫瘍細胞が、増殖していない又はゆっくりと増殖している正常な細胞である脳にうまく適合する方法である。治療用ウイルスの中でも、oHSVは、本質的に神経向性ウイルスであり、その腫瘍溶解効果は特定の宿主細胞受容体、突然変異又は細胞内経路への依存度が低いため、GBMの治療で最も有望な候補の1つである。また、oHSVは、充分に研究されたゲノムと、その腫瘍溶解力をさらに強化するために追加の治療遺伝子を挿入するための大きな遺伝子導入容量を備える。これまでにGBMに対して実施されたI期及びIb期のoHSV臨床試験では、抗腫瘍活性の兆候が示されているが、臨床反応率は最適ではなかった。
本発明者らは、既存のoHSV-1ウイルスと比較して、γ34.5遺伝子の両方のコピー及び逆方向内部反復領域を欠失しているoHSV-1が、非脳腫瘍よりも脳腫瘍に対して予期せぬ優れた抗腫瘍活性を有するという驚くべき事実を見出した。
一態様において、本明細書は、改変ゲノムを含む腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスI型(oHSV-1)を提供し、前記改変は、(a)γ34.5遺伝子のコピーが機能的なICP34.5タンパク質を発現できないようにするゲノムの末端反復にあるγ34.5遺伝子のコピーの変化と、(b)二重コピー遺伝子のそれぞれの1つのコピー及び内部逆方向反復領域内の重複された非コード配列の1つのコピーの欠失を引き起こすゲノムの内部逆方向反復領域の欠失とを含み、前記二重コピー遺伝子は、ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oをコードする遺伝子を含み、且つゲノムのUL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、それらがそれぞれの機能的なタンパク質を発現できるよう、いずれも無傷である。
一部の実施形態において、変化は、γ34.5遺伝子のコピーのコード領域又は調節領域の全部又は一部の欠失を含む。
一部の実施形態において、重複された非コード配列は、ICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列を含む。
一部の実施形態において、UL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、UL成分中のUL1~UL56遺伝子及びUS成分中のUS1~US12遺伝子を含む。
一部の実施形態において、oHSV-1は、F株、KOS株及び17株からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、内部逆方向反復領域の欠失は、F株のゲノム中のヌクレオチド位置117005~132096の切除を引き起こす。
一部の実施形態において、oHSV-1は、プロトタイプ(P)のゲノム異性体、及びUL成分中の最後の遺伝子(例えば、UL56)の停止コドンからUS成分中の最初の遺伝子(例えば、US1)のプロモーターまでの内部逆方向反復領域の欠失を有する。
一部の実施形態において、免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれ、前記組み込みはHSV-1ゲノムの天然遺伝子の発現に干渉しない。一部の実施形態において、免疫刺激剤及び免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。
一部の実施形態において、免疫刺激剤はGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、免疫刺激剤はIL-12である。
一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤、抗CTLA-4剤又はその両方である。一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤である。一部の実施形態において、抗PD-1剤は、Fab、scFv、(scFv)2、Fab’又はF(ab’)2などの抗PD-1抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、抗CTLA-4剤は、Fab、scFv、(scFv)2、Fab’又はF(ab’)2などの抗CTLA-4抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、抗PD-1抗体又は抗CTLA-4抗体は、抗体薬物複合体(ADC)、二重特異性抗体、ナノボディ(又はVHH)など抗体の改変形態を含む。
一部の実施形態において、異種核酸配列は、内部逆方向反復領域内及び/又はUL成分中のUL3とUL4遺伝子との間に組み込まれる。
一部の実施形態において、IL-12及び抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。一部の実施形態において、IL-12をコードする異種核酸配列が内部逆方向反復領域に組み込まれ、且つ抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。
別の態様において、有効量の本明細書に開示されるoHSV-1のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む脳腫瘍の治療のための医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
別の態様において、脳腫瘍の治療のための薬物の製造における、本明細書に開示されるoHSV-1のいずれかの使用を提供する。一部の実施形態において、脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
別の態様において、脳腫瘍の治療のための、本明細書に開示されるoHSV-1のいずれかの使用を提供する。一部の実施形態において、脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
別の態様において、治療有効量の、本明細書に開示されるoHSV-1のいずれか又は本明細書に開示される医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む対象における脳腫瘍の治療方法を提供する。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるoHSV-1又は本明細書に開示される医薬組成物が投与される前に、同時に又はその後に、第2療法が対象に投与される。一部の実施形態において、第2療法は化学療法、放射線療法、免疫療法及び/又は外科的介入である。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
本開示のこれら並びに他の態様及び利点は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明から明らかになるであろう。ここで、
図1は、oHSV-1構築物T3011、C5252、C8282、C1212及びR3616のゲノム構造を示す。
図2は、C5252、C8282及びC1212によりICP34.5タンパク質の発現を欠くという結果を示す。Vero細胞の6ウェルプレートが偽感染されたか又は1細胞あたり1PFUのHSV-1(F)、R3616、C5252、C8282、C1212で感染された。感染後6、12及び24時間にそれぞれ細胞を回収した。イムノブロッティングによってICP34.5タンパク質の発現を検出した。
図3は、ヒト悪性神経膠腫細胞の増殖に対するC5252のインビトロ阻害評価の結果を示す。各サンプルには6つの重複ウェルがあり、これらの結果は、別の独立した実験によって確認された。U87-MG、U138-MG、U373-MG、D54-MG及びU251-MGを96ウェルプレート(5000の細胞/ウェル)に播種し、一連の力価のC5252/C1212(0.01、0.1、1、10、33.33、100PFU/細胞)で感染させた。感染から48時間後、Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability AssayでU87-MG、U373-MG、U138-MG、D54-MG及びU251-MGの阻害率を決定し、IC50を計算した。
図4は、正常な細胞及び腫瘍細胞に対するC5252の阻害効果の結果を示す。U373-MG、ACHN、HA及びHRGECを96ウェルプレート(5000の細胞/ウェル)に播種し、一連の力価のC5252(0.01~500PFU/細胞)で感染させた。感染から48時間後、Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability AssayでU373-MG、ACHN、HA及びHRGECの相対的細胞生存率を決定し、IC50を計算した。
図5は、C57BL/6マウスのGL261皮下移植モデルの治療におけるC8282の有効性研究の結果を示す。32匹の雌のC57BL/6Jマウスの右側腹部にGL261腫瘍細胞(1×106)を皮下接種した。腫瘍体積が約70mm3に達した時に、マウスを1群あたり8匹でランダムに4群に分けた。マウスに対してC8282で腫瘍内治療を行った(5×104、5×105又は5×106PFU/動物、合計3回、Q3d)。腫瘍体積及び体重を週2回測定した。腫瘍体積及び体重は平均±SEMとして示された。
図6は、ヌードマウスの同所性(orthotropic)U87ヒト神経膠腫モデルの治療におけるC5252の有効性研究の結果を示す。30匹の雌のBalb/cヌードマウスの左線条体に5μLのU87-Luc腫瘍細胞を脳内接種した。播種から2週間後、IVIS画像システムによって取得された関心領域(ROI)内の発光信号に従って、マウスを1群あたり8匹でランダムに3群に分けた。3日ごとにC5252(3×104又は3×105PFU/マウス、5μL)でマウスを治療し、合計6回であった(D1、4、7、10、13、16)。腫瘍の増殖を監視するために週1回IVISを実施した。
(詳細な説明)
(定義)
用語「一」又は「1つ」又は「1種」の実体とは、当該実体の1つ又は複数又は1種又は複数種を指すことに注意されたい。例えば、「腫瘍溶解性HSV-1」は1種又は複数種の腫瘍溶解性HSV-1ウイルスを表すものと理解される。したがって、用語「1つ」又は「1種」、「1つ又は複数」又は「1種又は複数種」及び「少なくとも1つ」又は「少なくとも1種」は、本明細書で入れ替えて使用できる。
(定義)
用語「一」又は「1つ」又は「1種」の実体とは、当該実体の1つ又は複数又は1種又は複数種を指すことに注意されたい。例えば、「腫瘍溶解性HSV-1」は1種又は複数種の腫瘍溶解性HSV-1ウイルスを表すものと理解される。したがって、用語「1つ」又は「1種」、「1つ又は複数」又は「1種又は複数種」及び「少なくとも1つ」又は「少なくとも1種」は、本明細書で入れ替えて使用できる。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、2つのペプチド間又は2つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列された各配列の位置を比較することによって決定されてもよい。被比較配列の位置が同じ塩基又はアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有されるマッチングする又は相同な位置の数の関数である。「無関係」又は「非相同」の配列は、本開示の1つの配列と40%未満の同一性を、好ましくは25%未満の同一性を有する。
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域(又はポリペプチド又はポリペプチド領域)が別の配列に対して特定のパーセンテージ(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%)の「配列同一性」を有するとは、整列された場合、2つの配列を比較する際に塩基(又はアミノ酸)の当該パーセンテージが同じであることを意味する。当該整列及びパーセンテージ相同性又は配列同一性は、当分野で知られるソフトウェアプログラムを用いて決定されてもよい。
本明細書で使用される場合、「抗体」又は「抗原結合ポリペプチド」とは、1種又は複数種の抗原を特異的に認識して結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は抗体全体及びそのいずれかの抗原結合フラグメント又はその単鎖であってもよい。したがって、用語「抗体」には、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含むいずれのタンパク質又はペプチド含有分子を含む。そのような例は、重鎖又は軽鎖の相補性決定領域(CDR)若しくはそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク(FR)領域若しくはそのいずれの部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部を含み、ただしそれらに限定されない。用語抗体には、活性化されると抗原結合能力を有するポリペプチド又はポリペプチド複合体がさらに含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「抗体フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」は、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFvなど、抗体の一部である。抗体フラグメントは、構造に関わらず、無傷抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。用語「抗体フラグメント」には、アプタマー、シュピーゲルマー、ダイアボディが含なれる。用語「抗体フラグメント」は、特定の抗原と結合して複合体を形成することによって抗体のように作用するいずれの合成された又は遺伝子操作されたタンパク質も含まれる。
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、それらの変異体又は誘導体には、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、又はキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント(例えば、Fab、Fab’及びF(ab’)2、Fd、Fvs、単鎖Fvs(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合によって連結されたFvs(sdFv))、VK又はVHドメインを含むフラグメント、Fab発現ライブラリーによって生成されるフラグメント及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書に開示されるLIGHT抗体に対する抗Id抗体を含む)を含み、ただしそれらに限定されない。本開示の免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであってもよい。例えば、抗PD-1抗体とは、Fabフラグメント又はそのscFvを指してもよい。
「特異的に結合する」又は「…に対して特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープと結合すること、及び当該結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の何らかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、ランダムで無関係なエピトープと結合するよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープと結合する場合、エピトープと「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープと結合する相対的な親和性を定量するために使用される。例えば、抗体「A」は、所与のエピトープに対して抗体「B」よりも高い特異性を有すると見なすことができ、又は抗体「A」は、関連するエピトープ「D」に対してより高い特異性でエピトープ「C」と結合すると言うことができる。
本明細書で使用される場合、本明細書では入れ替えて使用される「がん」又は「腫瘍」とは、本開示に従って治療することができ、体の他の部位への侵入又は拡散が可能で異常な細胞増殖を伴う一連の疾患を指す。全ての腫瘍ががん性というわけではなく、良性腫瘍は体の他の部分に広がらない。可能な徴候及び症状は、新しいしこり、異常な出血、長引く咳、原因不明の体重減少、排便の変化などを含む。ヒトに影響を与える既知のがんは100種類以上ある。本開示は、好ましくは固形腫瘍に適用され、より好ましくは脳腫瘍に適用される。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」又は「治療」とは、治療的な処置及び予防的措置の両方を指し、目的は、がんの進行など望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は遅延(軽減)することである。有益な又は望ましい臨床結果は、検出可能であるか検出不可であるかに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の状態の安定化(即ち悪化しないこと)、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解(部分的又は全体的)を含み、ただしそれらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味する。治療を必要とする者には、既に疾患若しくは障害を有している者、及び疾患若しくは障害を有する傾向のある者、又は疾患若しくは障害が予防されるべき者が含まれる。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は治療が望まれるいずれの対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜、農場の動物、及び動物園の動物、競技動物又は愛玩動物が含まれ、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などである。
本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者に」又は「治療を必要とする対象に」などの語句は、例えば検出、診断手順及び/又は治療のための本開示のoHSV-1又は組成物の投与から利益を受けると考えられる対象を含み、例えば、哺乳動物対象である。
本明細書に開示される改変ゲノムは、それらが由来する改変ポリヌクレオチドからのヌクレオチド配列が異なるよう改変されてもよいということが、当業者に理解されるであろう。例えば、指定されたDNA配列に由来するポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は、類似するものであってもよく、例えば、開始配列に対して特定のパーセンテージの同一性を有し、例えば、それは開始配列に対して60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%同一であってもよい。
さらに、「非必須」アミノ酸領域における保存的置換又は変化をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失又は挿入を行うことができる。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、1つ又は複数の単独のアミノ酸の置換、挿入又は欠失(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20又はそれ以上の単独のアミノ酸の置換、挿入又は欠失)を除いて、残りの部分は開始配列と同じであってもよい。特定の実施形態において、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、開始配列に対して1~5個、1~10個、1~15個又は1~20個の単独のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する。
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスI型:
HSV-1ゲノムは、L及びSと呼ばれる共有結合した2つの成分からなる。各成分は、固有の配列(L成分はUL、S成分はUS)からなり、固有の配列の両側は、末端反復及び内部反復である逆方向反復である。L成分の逆方向反復はab及びb’a’として示される。S成分の逆方向反復はa’c’及びcaとして示される。逆方向反復b’a’及びa’c’は、内部逆方向反復領域を構成する。L及びS成分の両方の逆方向反復領域は、それぞれICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びOFR Oと呼ばれるタンパク質をコードする5種の遺伝子の両方のコピーと転写されるがタンパク質をコードしない大型のDNAストレッチを含有することが知られており、前記DNAは、例えば、ICP0のイントロン、LATドメイン、「a」配列などを含む。
HSV-1ゲノムは、L及びSと呼ばれる共有結合した2つの成分からなる。各成分は、固有の配列(L成分はUL、S成分はUS)からなり、固有の配列の両側は、末端反復及び内部反復である逆方向反復である。L成分の逆方向反復はab及びb’a’として示される。S成分の逆方向反復はa’c’及びcaとして示される。逆方向反復b’a’及びa’c’は、内部逆方向反復領域を構成する。L及びS成分の両方の逆方向反復領域は、それぞれICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びOFR Oと呼ばれるタンパク質をコードする5種の遺伝子の両方のコピーと転写されるがタンパク質をコードしない大型のDNAストレッチを含有することが知られており、前記DNAは、例えば、ICP0のイントロン、LATドメイン、「a」配列などを含む。
末端反復間の相同組換えによりHSV-1ゲノムのL及びS成分が反転し、4種類の等モル濃度の線型異性体が得られる。異性体は、P(プロトタイプ)、IL(L成分の反転)、IS(S成分の反転)及びISL(L及びS成分の両方の反転)として示される。HSV-1ゲノムは約90の固有の転写単位(遺伝子)をコードし、その約半分は寛容な組織培養環境でのウイルス複製に不可欠である。残りは、培養中の細胞の増殖に不要である。しかし、それらのいわゆる「非必須」遺伝子は、動物系での複製に不要ではないという可能性が高い。それらは、例えば、免疫回避及び宿主細胞のシャットオフ(shut-off)の誘導など、ウイルス-宿主相互作用に関与する機能をコードする場合が多い。
感染細胞タンパク質34.5(ICP34.5)は、γ34.5遺伝子(γ134.5としても知られる)によってコードされるタンパク質であり、ウイルス感染に対する細胞ストレス応答を遮断する。細胞がHSVに感染すると、ウイルスの二本鎖RNAによってプロテインキナーゼRが活性化される。次にプロテインキナーゼRは真核生物開始因子2A(eIF-2A)と呼ばれるタンパク質をリン酸化して、eIF-2Aを不活性化させる。eIF-2Aは翻訳に必要であるため、eIF-2Aをシャットダウンすれば、細胞はウイルスがそれ自身のタンパク質生成機構をハイジャックするのを防ぐ。次にウイルスは、ICP34.5を進化させて防御を打ち負かした。それはeIF-2Aを脱リン酸化させるプロテインホスファターゼ1Aを活性化させて、翻訳を再開させる。γ34.5遺伝子を欠くHSVは、タンパク質を作れないため、正常な細胞では複製できない。HSV-1ゲノムには、UL成分の両側に位置する、一方は末端反復にあり他方は内部反復に位置するγ34.5遺伝子の両方のコピーがある。
一態様において、本開示は、γ34.5遺伝子の両方のコピーが機能的なICP34.5タンパク質を発現できないよう遺伝子改変され、且つさらに、ゲノムの内部逆方向反復領域を欠失するよう改変される腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスI型(oHSV-1)を提供する。内部逆方向反復領域の欠失は、ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oをコードする遺伝子を含む二重コピー遺伝子のそれぞれの1つのコピーと、内部逆方向反復領域内の重複された非コード配列の1つのコピーを欠失することを引き起こす。しかしながら、ゲノムのUL及びUS成分中の全ての単一コピー遺伝子(UL1~UL56及びUS1~US12を含む)はいずれも無傷であるため、それぞれの機能的なタンパク質を発現できる。
一部の実施形態において、改変は、γ34.5遺伝子のコピーが機能的なICP34.5タンパク質を発現できないようにする、ゲノムの末端反復にあるγ34.5遺伝子のコピーの変化を含む。「機能的なICP34.5タンパク質を発現できない」とは、操作されたウイルスからタンパク質又はmRNAレベルにおいてγ34.5を検出できないこと、又はICP34.5タンパク質がウイルスによって発現されるが機能しないか部分的に機能することを意味する。上記を達成するための手段は、遺伝子工学分野で利用しやすく当業者にも知られる。例えば、変化は、γ34.5遺伝子の前記コピーのコード又は調節領域における1つ又は複数のヌクレオチドの挿入、突然変異若しくは付加、又はγ34.5遺伝子の前記コピーのコード若しくは調節領域の全部若しくは一部の欠失を含む。一部の実施形態において、変化は、γ34.5遺伝子の前記コピーのコード又は調節領域の全部又は一部の欠失を含む。
本明細書に開示されるoHSV-1は、γ34.5遺伝子の両方のコピーを欠いている。UL成分の内部反復内に位置するγ34.5遺伝子の他方のコピーは、ゲノムの内部逆方向反復領域の欠失によって欠失される。上述したように、内部逆方向反復領域は、UL成分の内部反復及びUS成分の内部反復からなる。ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oをコードする遺伝子を含む二重コピー遺伝子の1つのコピー及び重複された非コード配列の1つのコピーは内部逆方向反復領域内に位置する。したがって、内部逆方向反復領域の欠失は、γ34.5遺伝子の他方のコピーを含む二重コピー遺伝子の1つのコピーと、重複された非コード配列の1つのコピーの欠失を引き起こす。一部の実施形態において、重複された非コード配列は、例えば、ICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列を含む。したがって、一部の実施形態において、ゲノムの内部逆方向反復領域の欠失は、ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oのそれぞれの1つのコピー並びにICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列のそれぞれの1つのコピーの欠失をもたらす。したがって、ICP0、ICP4、ORF P及びORF Oのそれぞれの他方のコピー並びにICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列のそれぞれの他方のコピーは、操作されたoHSV-1ゲノムにおいて保存される。
本開示において、内部逆方向反復領域の欠失は、ゲノムのUL及びUS成分中のUL1~UL56及びUS1~US12を含む全ての単一コピー遺伝子が、それぞれの機能的なタンパク質を発現できるよう無傷であるように、正確な方法で実行される。この文脈において、「ゲノムのUL及びUS成分中の全ての単一コピー遺伝子が無傷である」とは、ORFの発現が成功し、ORFから翻訳されたタンパク質が機能することが確保されるよう、これらの単一コピー遺伝子のそれぞれのORF及びプロモーター、エンハンサーなどの各ORFの発現に必要な調節配列が無傷であることを意味する。「無傷」とは、単一コピー遺伝子のそれぞれのコード配列が少なくとも機能的であることを意味するが、配列は必ず天然に存在する配列と100%同一でなければならないことを意味しない。「非必須」領域が、例えば、保存的置換又は変化を含めることで当該配列は、天然に存在する配列に対してヌクレオチド配列がわずかに異なってもよい。この文脈において、当該配列は、天然に存在する配列に対して90%、95%、98%又は99%同一であってもよい。
単一コピー遺伝子のそれぞれのHSV-1ゲノムにおける位置は当分野で知られており、且つHSV-1ウイルスの株及びゲノム異性体に依存することを考えると、内部逆方向反復領域において欠失されるヌクレオチドの正確な開始位置及び終了位置は、株ごとに又は異性体ごとに異なるが、当分野で知られる技術によって容易に決定できるということは当業者に理解できるであろう。本開示は、HSV-1ウイルスのいずれの特定のゲノム異性体又は株に限定されることを意図しないということが理解されるべきである。むしろ、本開示において、HSV-1ウイルスの全ての株及び異性体が有用であると推測される。
例えば、HSV-1 F株が使用される実施形態では、そのゲノムはGenBankアクセッション番号GU734771.1にて利用可能であり、内部逆方向反復領域の欠失は、ゲノム中のヌクレオチド117005~132096の切除を引き起こす。ゲノムDNAが配列決定されれば、他の株も利用可能であるということは、当業者に理解されるであろう。配列決定技術は、文献や市場からは利用しやすい。例えば、別の実施形態において、欠失はHSV-1株17において行うことができ、そのゲノムは、GenBankアクセッション番号NC_001806.2にて利用可能である。別の実施形態において、KOS1.1株において欠失を行うことができ、そのゲノムはGenBankアクセッション番号KT899744にて利用可能である。
一部の実施形態において、所定の位置において欠失を正確に実行することにより、L成分の最後の遺伝子(P異性体の場合、UL56など)からS成分の最初の遺伝子(P異性体の場合、US1)までのDNAフラグメントの切除を実現する。HSV-1には4種の異なる異性体(即ち、異性体P、IS、IL及びISL)が存在することを考えると、最初の遺伝子及び最後の遺伝子の名称は異性体によって異なる。本開示の文脈において、UL成分中の遺伝子の番号付け(即ち、最初と最後)は、UL成分の末端反復からUL成分の内部反復までの方向において定義され、US成分中の遺伝子の番号付けは、US成分の内部反復からUS成分の末端反復までの方向において定義される。したがって、異性体プロトタイプ(P)の場合、UL成分中の最初の遺伝子は、例えばUL1遺伝子になり、UL成分中の最後の遺伝子は、例えばUL56になり、US成分中の最初の遺伝子は、例えばUS1遺伝子になり、US成分中の最後の遺伝子は、例えばUS12になる。異性体ISの場合、UL成分中の最初の遺伝子は、例えばUL1遺伝子になり、UL成分中の最後の遺伝子は、例えばUL56になり、US成分中の最初の遺伝子は、例えばUS12遺伝子になり、US成分中の最後の遺伝子は、例えばUS1になる。異性体ILの場合、UL成分中の最初の遺伝子は、例えばUL56遺伝子になり、UL成分中の最後の遺伝子は、例えばUL1になり、US成分中の最初の遺伝子は、例えばUS1遺伝子になり、US成分中の最後の遺伝子は、例えばUS12になる。異性体ISLの場合、UL成分中の最初の遺伝子は、例えばUL56遺伝子になり、UL成分中の最後の遺伝子は、例えばUL1になり、US成分中の最初の遺伝子は、例えばUS12遺伝子になり、US成分中の最後の遺伝子は、例えばUS1になる。
内部逆方向反復領域の欠失は、US又はUL成分中の単一コピー遺伝子に損傷をもたらすことはないから、単一コピー遺伝子の発現に必要なプロモーター配列を含む単一コピー遺伝子のコード配列及び調節配列が無傷である。例えば、異性体Pの場合、欠失は、UL56遺伝子などの停止コドンの末端からUS1遺伝子などのプロモーター配列の開始までのDNAフラグメントの切除を引き起こす。例えば、異性体ILの場合、欠失は、UL1遺伝子などのプロモーター配列の開始からUS1遺伝子などのプロモーター配列の開始までのDNAフラグメントの切除を引き起こす。
操作されたoHSV-1ゲノム中の全ての単一コピー遺伝子並びにICP0、ICP4、ORF P及びORF Oのそれぞれの他方のコピー並びにICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列のそれぞれの他方のコピーの保持は、挿入された外来遺伝子を組み込む前に又はその後に、いずれもより強力なウイルスを提供する。したがって、oHSV-1は、温度、圧力、紫外線などの環境要因に対して最大限の耐性がある。また、腫瘍溶解性HSV-1が有効ながん細胞の範囲を最大にする。
当分野で知られる様々な遺伝子操作方法を用いて、本開示に記載の改変HSV-1ベクターを得ることができる。例えば、細菌人工染色体(BAC)技術を用いる。別の実施例として、COSプラスミドを本開示で用いることができる。WO2017/181420は、BAC技術によって構築されたoHSV-1ベクターを開示しており、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
野生型ウイルスに挿入できる外来DNA配列の量は、DNAのビリオンへのパッケージングを妨げるため制限されている。指定された領域における正確な欠失は、外来DNA配列の挿入に理想的なスペースを提供する。本開示の一実施形態によれば、欠失は腫瘍溶解性ウイルスベクターの少なくとも15kbpを除去し、同程度の量の外来DNA配列を収容できるようになる。他の研究は、野生型ゲノムには追加の7kBのDNAが許容されることを示している。
一部の実施形態において、遺伝子操作されたoHSV-1には、免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列が組み込まれる。本開示において、異種核酸配列の組み込みは、上記の単一コピー遺伝子のいずれか又は他の二重コピー遺伝子などHSV-1ゲノムの天然遺伝子の発現に干渉しない。
一部の実施形態において、異種核酸配列は、内部逆方向反復領域に組み込まれる。一部の実施形態において、異種核酸配列は、UL又はUS成分中の隣接する単一コピー遺伝子の間に組み込まれる。一部の実施形態において、異種核酸配列は、内部逆方向反復領域内及びUL又はUS成分中の隣接する単一コピー遺伝子の間に組み込まれる。一部の実施形態において、異種核酸配列は、内部逆方向反復領域内及びUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。
一部の実施形態において、oHSV-1は、免疫刺激剤をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態において、免疫刺激剤はGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選ばれる。一実施形態において、免疫刺激剤はIL-12である。一実施形態において、免疫刺激剤はヒトIL-12又はヒト化IL-12である。
一部の実施形態において、oHSV-1は、免疫療法剤をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態において、免疫療法剤は、抗PD-1剤、抗CTLA-4剤又はその両方から選ばれる。一実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤である。
一部の実施形態において、oHSV-1は、免疫刺激剤及び免疫療法剤の両方をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態において、免疫刺激剤はGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選ばれる。一実施形態において、免疫刺激剤はIL-12である。一実施形態において、免疫刺激剤はヒト又はヒト化IL-12である。一部の実施形態において、免疫療法剤は、抗PD-1剤、抗CTLA-4剤又はその両方から選ばれる。一実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤である。
免疫刺激剤又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列が1つだけ挿入される実施形態において、当該異種核酸配列は、ゲノムの欠失された内部逆方向反復領域に組み込まれることが好ましい。一実施形態において、異種核酸配列は欠失されたフラグメントと同様の長さを有する。一実施形態において、異種核酸配列は欠失されたフラグメントの長さより20%長い又は短い長さを有する。別の実施形態において、異種核酸配列は、欠失されたフラグメントよりも15%、10%、5%、4%、3%、2%又は1%長い又は短い長さを有する。
一実施形態において、異種核酸配列は、約18kbp、約17kbp又は約16kbp未満の長さを有する。一実施形態において、異種核酸配列は約10kbp、11kbp、12kbp、13kbp又は14kbpを超える長さを有する。一実施形態において、異種核酸配列は約14kbpから約16kbpの間の長さを有する。一実施形態において、異種核酸配列は約15kbpの長さを有する。
一部の実施形態において、oHSV-1は、免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする少なくとも2種の異種核酸配列を含む。一部の実施形態において、oHSV-1は2種の異なる免疫刺激剤をコードする異種核酸配列を含む。例えば、一実施形態において、oHSV-1はIL-12及びGM-CSFの両方をコードする異種核酸配列を含む。別の実施形態において、oHSV-1はIL-15及びGM-CSFの両方をコードする異種核酸配列を含む。別の実施形態において、oHSV-1はIL-12及びIL-15の両方をコードする異種核酸配列を含む。
一部の実施形態において、oHSV-1は2種の異なる免疫療法剤をコードする異種核酸配列を含む。一実施形態において、例えば、oHSV-1は抗PD-1剤及び抗CTLA-4剤の両方をコードする異種核酸配列を含む。
免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする1種以上の異種核酸配列が組み込まれる実施形態において、第1異種核酸配列はゲノムの欠失された内部反復領域に挿入されることが好ましい。第2又は更なる異種核酸配列はゲノムのL成分に挿入されてもよい。一実施形態において、第2異種核酸配列はL成分のUL3とUL4遺伝子の間に挿入される。一実施形態において、第2異種核酸配列はL成分のUL37とUL38遺伝子の間に挿入される。
一実施形態において、第1異種核酸配列はゲノムの欠失された内部反復領域に挿入されるIL-12をコードする。一実施形態において、第2異種核酸配列はL成分のUL3とUL4遺伝子の間に挿入される抗PD-1剤をコードする。
腫瘍溶解性HSV-1のゲノムへの1つ又は複数の異種核酸配列の挿入は、天然HSV-1遺伝子の発現に干渉せず、異種核酸配列の機能的な発現が期待できるように、異種核酸配列は改変HSV-1ゲノムに安定的に組み込まれることが理解されるであろう。
免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列は、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸を発現のための調節要素と共に含有する。一般には、組換え遺伝子に存在し、かつ発現される核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される調節要素は、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーターを含む。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、興味のあるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする(例えば、インビトロ転写/翻訳系において、又はウイルスが宿主細胞に導入される時に宿主細胞の中で発現される)方式で調節配列に連結されることを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図している。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例えば、組織特異的調節配列)が含まれる。
当業者は、例えば、所望の組織特異性及び発現レベルに基づいて、適切な調節要素を選択することができる。例えば、細胞タイプ特異的又は腫瘍特異的プロモーターを用いて、遺伝子産物の発現を特定の細胞タイプに限定することができる。組織特異的プロモーターの使用に加え、ウイルスの局所投与により局所的な発現と効果が得られる。使用できる非組織特異的プロモーターの例には、初期サイトメガロウイルスウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第4,168,062号)及びラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma Virus)プロモーターが含まれる。また、HSV-1 IEプロモーターなどのHSVプロモーターを使用してもよい。
例えば、本技術に使用できる組織特異的プロモーターの例には、前立腺の細胞に特異的な前立腺特異抗原(PSA)プロモーター、筋肉細胞に特異的なデスミンプロモーター、ニューロンに特異的なエノラーゼプロモーター、赤血球系細胞に特異的なベータグロビンプロモーター、また赤血球系細胞に特異的なタウグロビン(tau-globin)プロモーター、垂体細胞に特異的な成長ホルモンプロモーター、膵臓ベータ細胞に特異的なインスリンプロモーター、星状細胞に特異的なグリア線維性酸性タンパク質プロモーター、カテコールアミン作動性ニューロンに特異的なチロシン水酸化酵素プロモーター、ニューロンに特異的なアミロイド前駆体タンパク質プロモーター、ノルアドレナリン作動性及びアドレナリン作動性ニューロンに特異的なドーパミンベータ水酸化酵素プロモーター、5-ヒドロキシトリプタミン/松果体細胞に特異的なトリプトファン水酸化酵素プロモーター、コリン作動性ニューロンに特異的なコリンアセチル転移酵素プロモーター、カテコールアミン作動性/5-HT/D型細胞に特異的な芳香族L-アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)プロモーター、ニューロン/精子を形成する精巣上体細胞に特異的なプロエンケファリンプロモーター、結腸及び直腸腫瘍並びに膵臓及び腎細胞に特異的なreg(膵石タンパク質)プロモーター、肝臓及び盲腸腫瘍並びに神経鞘腫、腎細胞、膵臓細胞及び副腎細胞に特異的な副甲状腺ホルモン関連ペプチド(PTHrP)プロモーターが含まれる。
腫瘍細胞で特異的に機能するプロモーターの例には、乳がん細胞に特異的なストロメリシン(stromelysin)3プロモーター、非小細胞肺がん細胞に特異的な界面活性タンパク質Aプロモーター、SLPI発現がんに特異的な分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤(SLPI)プロモーター、メラノーマ細胞に特異的なチロシナーゼプロモーター、線維肉腫/腫瘍原性細胞に特異的なストレス誘導性grp78/BiPプロモーター、脂肪細胞に特異的なAP2脂肪エンハンサー、肝細胞に特異的なα-1アンチトリプシン トランスサイレチンプロモーター、多形性膠芽腫に特異的なインターロイキン-10プロモーター、膵臓、乳房、胃、卵巣及び非小細胞肺がん細胞に特異的なc-erbB-2プロモーター、脳腫瘍細胞に特異的なα-B-クリスタリン/熱ショックタンパク質27プロモーター、神経膠腫及び髄膜腫細胞に特異的な塩基性線維芽細胞増殖因子プロモーター、扁平上皮がん、神経膠腫及び乳腺腫瘍細胞に特異的な上皮成長因子受容体プロモーター、乳がん細胞に特異的なムチン様糖タンパク質(DF3、MUC1)プロモーター、転移性腫瘍に特異的なmts1プロモーター、小細胞肺がん細胞に特異的なNSEプロモーター、小細胞肺がん細胞に特異的なソマトスタチン受容体プロモーター、乳がん細胞に特異的なc-erbB-3及びc-erbB-2プロモーター、乳がん及び胃がんに特異的なc-erbB4プロモーター、甲状腺がん細胞に特異的なサイログロブリンプロモーター、肝がん細胞に特異的なα-フェトプロテイン(AFP)プロモーター、胃がん細胞に特異的なビリン(villin)プロモーター、肝がん細胞に特異的なアルブミンプロモーターが含まれる。別の実施形態において、TERTプロモーター又はサバイビン(survivin)プロモーターが使用される。
例えば、一部の実施形態において、異種核酸配列は、例えば、CMVプロモーター又はEgr-1プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結される。一実施形態において、IL-12をコードするヌクレオチド配列は、Egr-1プロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態において、scFv-抗hPD1をコードするヌクレオチド配列は、CMVプロモーターに作動可能に連結される。
特定の実施形態において、本開示のoHSV-1は、IL-2、IL4、IL-12、GM-CSF、IFNγなどのサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8などのケモカイン、及び成長因子を含む1種又は複数種の免疫刺激剤(免疫刺激分子とも呼ばれる)をコードする。
代替形態として又はさらに、本開示のoHSV-1は、1種又は複数種の免疫療法剤、例えば、PD-1結合剤(又は抗PD-1剤)又はCTLA-4結合剤(又は抗CTLA-4剤)をコードし、それは、例えば、PD-1に特異的に結合する抗PD1抗体又はCTLA-4に特異的に結合する抗CTLA-4抗体など、抗体又はそのフラグメントを含む。抗PD-1抗体は、PD-1活性に拮抗する単鎖抗体であってもよい。他の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、PD-1リガンドと受容体の結合に拮抗する薬剤、例えば、抗PD-L1及び/又はPD-L2抗体、PD-L1及び/又はPD-L2デコイ、又は可溶性PD-1受容体を発現する。
PD-1シグナル伝達経路は、腫瘍関連の免疫機能障害において重要な役割を果たす。腫瘍細胞の感染と溶解は、接種された腫瘍の細胞だけでなく、離れて確立された接種されていない腫瘍の細胞を殺す、非常に特異的な抗腫瘍免疫応答を引き起こす可能性がある。腫瘍とその微小環境は、自然な抗腫瘍免疫応答を回避、阻害、不活性化するメカニズムを発達させてきた。例えば、腫瘍は、目標受容体を下方制御したり、繊維状の細胞外間質マトリックスに自身を包み込んだり、又は調節性免疫細胞の活性化若しくは動員に関与する宿主受容体又はリガンドを上方制御したりする。天然及び/又は適応性制御性T細胞(Treg)は、腫瘍を介した免疫阻害に関与している。理論に拘束されることは望まないが、PD-1遮断は、Treg活性を阻害し、腫瘍反応性CTLの有効性を改善する可能性がある。当該技術の更なる態様は、以下にさらに詳細に説明される。PD-1遮断は、T細胞(CTL及びヘルパー)及びB細胞の不活性化を遮断することにより、抗腫瘍免疫応答を刺激する可能性もある。
一態様において、本技術は、PD-1結合剤をコードする遺伝子を備える腫瘍溶解性ウイルスを提供する。プログラム細胞死1(PD-1)は、アポトーシスを起こしているマウスT細胞株のサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションによって最初に同定された50~55kDaのタイプI膜貫通受容体である。CD28遺伝子ファミリーのメンバーであるPD-1は活性化されたT、B及び骨髄系細胞において発現される。ヒトとマウスPD-1は、Ig-Vドメインを定義する4つの潜在的なN-グリコシル化部位及び残基が保存された状態で、約60%のアミノ酸同一性を有している。PD-1の2種のリガンドとして、PDリガンド1(PD-L1)及びリガンド2(PD-L2)が同定されており、そのどちらもB7スーパーファミリーに属する。PD-L1はT、B、内皮細胞、上皮細胞、抗原提示細胞など、多くの細胞タイプにおいて発現される。これに対して、PD-L2は、樹状細胞、マクロファージなどの専門的な抗原提示細胞において限定的に発現される。
PD-1はT細胞の活性化を負に調節し、この阻害機能は、その細胞質ドメインの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ(ITIM)に関連している。PD-1のこの阻害機能の破壊は、自己免疫につながる可能性がある。逆の場合も有害になる場合がある。PD-1による持続的な負のシグナルは、腫瘍の免疫回避や慢性的なウイルス感染など、多くの病理学的状況におけるT細胞の機能不全に関与している。
宿主の抗腫瘍免疫は、主に腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の影響を受ける。複数の証拠が、TILはPD-1阻害調節を受けることを示している。第一に、PD-L1の発現は多くのヒト及びマウス腫瘍株で確認されており、その発現はインビトロにおいてIFN-γによってさらに上方制御される可能性がある。第二に、腫瘍細胞によるPD-L1の発現は、インビトロでの抗腫瘍T細胞による溶解への耐性と直接関連している。第三に、PD-1ノックアウトマウスは、腫瘍攻撃に対して耐性があり、PD-1ノックアウトマウスからのT細胞は、担がんマウスに養子移入された場合、腫瘍拒絶に非常に効果的である。第四に、モノクローナル抗体によるPD-1阻害シグナルの遮断は、マウスにおける宿主の抗腫瘍免疫を強化できる。第五に、腫瘍における高度のPD-L1発現(免疫組織化学染色によって検出される)は、多くのヒトがんタイプの予後不良と関連している。
腫瘍溶解性ウイルス療法は、腫瘍溶解後に放出される腫瘍特異的抗原に特異的なT又はB細胞集団を拡大することにより宿主の免疫系を形作る効果的な方法である。腫瘍特異的抗原の免疫原性は、宿主免疫受容体(B細胞受容体又はT細胞受容体)の抗原エピトープに対する親和性及び宿主寛容閾値に大きく依存する。高親和性相互作用は、複数回の増殖及び分化を通じて、宿主免疫細胞が長期記憶細胞になるのを駆動する。宿主の寛容メカニズムは、局所免疫活性化に起因する潜在的な組織損傷を最小限に抑えるために、そのような増殖と拡大を相殺する。PD-1阻害シグナルは、このような宿主寛容メカニズムの一部であり、これは次の一連の証拠から裏付けられている。第一に、PD-1発現は、活発に増殖するT細胞、特に最終分化表現型、即ちエフェクター表現型を有するT細胞において上昇する。エフェクター細胞は、多くの場合、強力な細胞傷害機能とサイトカインの産生に関連している。第二に、PD-L1は、末梢の寛容を保持し、過剰に活性化したT細胞を局所的に制限する上で重要である。したがって、腫瘍微小環境で発現されるPD-1結合剤を使用するPD-1阻害は、TILの活性を高め、効果的で持続的な抗腫瘍免疫応答を刺激するための効果的な方法になり得る。
一態様において、本技術は、抗PD-1剤をコードする異種核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。一部の実施形態において、抗PD-1剤は、PD-1エピトープへの特異的な結合を提供する抗体可変領域を含む。抗体可変領域は、例えば、完全な抗体、抗体フラグメント、及び抗体又は抗体フラグメントの組換え誘導体に存在してもよい。用語「抗体」とは、天然なものであるか、部分的又は完全に合成的に生成されるかに関わらず、免疫グロブリンを指す。したがって、本技術の抗PD-1剤には、PD-1エピトープへの結合に特異的な結合ドメインを有するいずれのポリペプチド又はタンパク質が含まれる。
異なるクラスの抗体は、異なる構造を有する。異なる抗体領域は、IgGを参照して説明できる。IgG分子は、ジスルフィド結合によって相互接続された2つの長い重鎖と2つの短い軽鎖の4つのポリペプチド鎖を含有する。重鎖と軽鎖は、それぞれ、定常領域及び可変領域を含む。重鎖は、重鎖可変領域(VH)及び重鎖定常領域(CH1、CH2及びCH3)によって構成される。軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)及び軽鎖定常領域(CL)によって構成される。抗原特異性に関与する可変領域内には3つの超可変領域がある。
超可変領域は、一般に相補性決定領域(「CDR」)と呼ばれ、フレームワーク領域(「FW」)と呼ばれるより保存された隣接領域の間に挿入される。NH2末端からCOOH末端まで、FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4と4つのFW領域及び3つのCDRが配置されている。例えば、フレームワーク領域及びCDRは、KabatとChothiaの両方の定義を考慮して特定できる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。2つの重鎖カルボキシ領域は、ジスルフィド結合によって接続されてFc領域を生成させる定常領域である。Fc領域は、エフェクター機能を提供する上で重要である。Fc領域を構成する2つの重鎖のそれぞれは、ヒンジ領域を介して異なるFab領域に伸びている。
抗PD-1剤又は抗CTLA-4剤は、一般に、抗体可変領域を含有する。そのような抗体フラグメントは、(i)VH、VL、CH及びCLドメインからなる一価フラグメントであるFabフラグメント、(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメントであるFab2フラグメント、(iii)VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント、(iv)抗体の単一アームのVHドメイン及びVLドメインからなるFvフラグメント、(v)VH又はVLドメインを含むdAbフラグメント、(vi)VH、VL及びC1又はCH1を含有する抗体フラグメントであるscAb、(vii)フィブロネクチンIII型ポリペプチド抗体を含み、ただしそれに限定されないタンパク質足場に基づく人工抗体を含み、ただしそれらに限定されない。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインであるVL及びVHは単独の遺伝子によってコードされるが、VL及びVH領域がペアになって、単鎖Fv(scFv)として知られる一価分子を形成させる単一のタンパク質鎖として製造できるように合成リンカーによる組換え方法を用いて接続されてもよい。したがって、抗体可変領域は、組換え誘導体に存在してもよい。組換え誘導体の例には、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)及びミニ抗体(miniantibody)が含まれる。抗PD-1剤又は抗CTLA-4剤は、同じ又は異なるエピトープを認識する1つ又は複数の可変領域を含んでもよい。
一部の実施形態において、抗PD-1剤又は抗CTLA-4剤は、組換え核酸技術を使用して生成された腫瘍溶解性ウイルスによってコードされる。例えば、リンカー配列によって接続されたVH領域及びVL領域を含有するscFvなどの単鎖タンパク質、及び抗体又はそのフラグメント、別々のポリペプチド上にVH及びVL領域を含有する多重鎖タンパク質を含む異なる技術によって異なる抗PD-1剤を生成できる。組換え核酸技術は、タンパク質合成のための核酸鋳型の構築に関する。適切な組換え核酸技術は、当分野で周知される。抗PD-1抗体又は抗CTLA-4抗体をコードする組換え核酸は、腫瘍溶解性ウイルスに感染し、ウイルス溶解後に腫瘍微小環境に放出される細胞において発現されてもよい。細胞は、実際にコードされたタンパク質の工場として機能する。
抗PD-1又は抗CTLA-4剤のVH領域又はVL領域のいずれか又は両方をコードする1つ又は複数の組換え遺伝子を含む核酸を使用して、PD-1/CTLA-4と結合する完全なタンパク質/ポリペプチドを生成してもよい。例えば、リンカーによって接続されたVH領域及びVL領域を含有するscFvなどの単鎖タンパク質をコードする単一の遺伝子を使用し、又は、複数の組換え領域を使用して、例えば、VH及びVL領域の両方を生成することにより、完全な結合剤を提供してもよい。
本開示に有用な例示的な抗PD-1抗体又は抗CTLA-4抗体又はそのフラグメント又は誘導体は、当分野では利用可能である。例えば、WO2006/121168、WO2014/055648、WO2008/156712、US2014/0234296又は米国特許第6,984,720号などを参照する。
医薬組成物:
別の態様において、本開示は、有効量の本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1と、薬学的に許容される担体とを含む腫瘍の治療のための医薬組成物を提供する。
別の態様において、本開示は、有効量の本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1と、薬学的に許容される担体とを含む腫瘍の治療のための医薬組成物を提供する。
一部の実施形態において、腫瘍の治療のための医薬組成物は、有効量の遺伝子操作されたoHSV-1と、薬学的に許容される担体とを含み、遺伝子操作されたoHSV-1は改変ゲノムを含み、前記改変は、(a)γ34.5遺伝子のコピーが機能的なICP34.5タンパク質を発現できないようにするゲノムの末端反復にあるγ34.5遺伝子のコピーの変化と、(b)二重コピー遺伝子のそれぞれの1つのコピー及び内部逆方向反復領域内の重複された非コード配列の1つのコピーの欠失を引き起こすゲノムの内部逆方向反復領域の欠失とを含み、前記二重コピー遺伝子は、ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oをコードする遺伝子を含み、且つゲノムのUL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、それらがそれぞれの機能的なタンパク質を発現できるよう、いずれも無傷である。
一部の実施形態において、変化は、γ34.5遺伝子のコピーのコード領域又は調節領域の全部又は一部の欠失を含む。一部の実施形態において、重複された非コード配列は、ICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列を含む。一部の実施形態において、UL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、UL成分中のUL1~UL56遺伝子及びUS成分中のUS1~US12遺伝子を含む。
一部の実施形態において、oHSV-1は、F株、KOS株及び17株からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、内部逆方向反復領域の欠失は、F株のゲノム中のヌクレオチド位置117005~132096の切除を引き起こす。
一部の実施形態において、oHSV-1は、プロトタイプ(P)のゲノム異性体、及びUL成分中の最後の遺伝子(例えば、UL56)の停止コドンからUS成分中の最初の遺伝子(例えば、US1)のプロモーターまでの内部逆方向反復領域の欠失を有する。
一部の実施形態において、免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれ、前記組み込みはHSV-1ゲノムの天然遺伝子の発現に干渉しない。一部の実施形態において、免疫刺激剤及び免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。
一部の実施形態において、免疫刺激剤はGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、免疫刺激剤はIL-12である。一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤、抗CTLA-4剤又はその両方である。一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤である。
一部の実施形態において、異種核酸配列は、内部逆方向反復領域内及び/又はUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。一部の実施形態において、IL-12及び抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。一部の実施形態において、IL-12をコードする異種核酸配列が内部逆方向反復領域に組み込まれ、且つ抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。
腫瘍溶解性ウイルスは、適切な薬学的に許容される担体又は賦形剤において製剤化することができる。通常の保管及び使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。注射可能な使用に適する薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の用時調製用の滅菌粉末が含まれる。いずれの場合も、当該形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動的でなければならない。当該形態は、製造及び保管条件下で安定的でなければならず、細菌や真菌などの微生物による汚染作用から保護されていなければならない。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物及び/又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合は必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって防止できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むこと好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンを組成物に使用することによって、注射用組成物の長期吸収を実現できる。
水溶液での非経口投与の場合、例えば、必要であれば溶液を適切に緩衝し、最初に十分な生理食塩水又はグルコースで液体希釈剤を等張にする必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内及び腹腔内投与に特に適する。これに関しては、使用可能な滅菌水性媒体は、本開示に照らせば当業者に知られる。例えば、1用量を1mLの等張NaCl溶液に溶解し、1000mLの皮下注射液に加えるか、又は推奨される注入部位に注射してもよい。用量の変動は、治療対象の状態に応じて必然的に発生するものである。いずれにせよ、投与の責任者は、個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、製剤は、FDAの生物学的基準において要求される滅菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の基準を満たさなければならない。
無菌の注射可能溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記で列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒に組み込み、次に濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒及び上記で列挙されたものから必要な他の成分を含む滅菌担体に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と事前に無菌濾過された溶液からいずれの追加の所望の成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
本明細書に開示される組成物は、中性又は塩の形態として製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、(タンパク質の遊離アミノ基と形成される)酸付加塩が含まれ、これは、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。製剤化する時に、溶液は、用量の処方に適合する方法で、治療上有効な量で投与される。当該製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。
本明細書で使用される場合、「担体」には、あらゆる溶媒、分散媒体、担体、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。薬学的活性物質へのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知される。従来の媒体又は薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が考えられる。補助活性成分が組成物に組み込まれてもよい。
語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与される時にアレルギー反応又は同様の有害な反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、当技術分野でよく理解されている。典型的には、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかで、注射剤として調製される。注射前に液体に溶解又は懸濁するのに適する固体の形態として調製されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に開示される組成物は腫瘍の治療に用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される組成物は固形腫瘍の治療に用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される組成物は脳腫瘍の治療に用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される組成物は脳腫瘍の治療に用いられ、前記脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
使用と療法:
別の態様において、本開示は、対象における腫瘍の治療に使用される本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1を提供する。別の態様において、本開示は、対象における固形腫瘍の治療に使用される本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1を提供する。別の態様において、本開示は、対象における脳腫瘍の治療に使用される本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1を提供する。
別の態様において、本開示は、対象における腫瘍の治療に使用される本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1を提供する。別の態様において、本開示は、対象における固形腫瘍の治療に使用される本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1を提供する。別の態様において、本開示は、対象における脳腫瘍の治療に使用される本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1を提供する。
一部の実施形態において、遺伝子操作されたoHSV-1は改変ゲノムを含み、前記改変は、(a)γ34.5遺伝子のコピーが機能的なICP34.5タンパク質を発現できないようにするゲノムの末端反復にあるγ34.5遺伝子のコピーの変化と、(b)二重コピー遺伝子のそれぞれの1つのコピー及び内部逆方向反復領域内の重複された非コード配列の1つのコピーの欠失を引き起こすゲノムの内部逆方向反復領域の欠失とを含み、前記二重コピー遺伝子は、ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oをコードする遺伝子を含み、且つゲノムのUL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、それらがそれぞれの機能的なタンパク質を発現できるよう、いずれも無傷である。
一部の実施形態において、変化は、γ34.5遺伝子のコピーのコード領域又は調節領域の全部又は一部の欠失を含む。一部の実施形態において、重複された非コード配列は、ICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列を含む。一部の実施形態において、UL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、UL成分中のUL1~UL56遺伝子及びUS成分中のUS1~US12遺伝子を含む。
一部の実施形態において、oHSV-1は、F株、KOS株及び17株からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、内部逆方向反復領域の欠失は、F株のゲノム中のヌクレオチド位置117005~132096の切除を引き起こす。
一部の実施形態において、oHSV-1は、プロトタイプ(P)のゲノム異性体、及びUL成分中の最後の遺伝子(例えば、UL56)の停止コドンからUS成分中の最初の遺伝子(例えば、US1)のプロモーターまでの内部逆方向反復領域の欠失を有する。
一部の実施形態において、免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれ、前記組み込みはHSV-1ゲノムの天然遺伝子の発現に干渉しない。一部の実施形態において、免疫刺激剤及び免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。
一部の実施形態において、免疫刺激剤はGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、免疫刺激剤はIL-12である。一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤、抗CTLA-4剤又はその両方である。一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤である。
一部の実施形態において、異種核酸配列は、内部逆方向反復領域内及び/又はUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。一部の実施形態において、IL-12及び抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。一部の実施形態において、IL-12をコードする異種核酸配列が内部逆方向反復領域に組み込まれ、且つ抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。
別の態様において、本開示は、対象における治療の腫瘍のための薬物の製造における、本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1の使用を提供する。別の態様において、本開示は、対象における固形腫瘍の治療のための薬物の製造における、本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1の使用を提供する。別の態様において、本開示は、対象における脳腫瘍の治療のための薬物の製造における、本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSV-1の使用を提供する。
一部の実施形態において、遺伝子操作されたoHSV-1は改変ゲノムを含み、前記改変は、(a)γ34.5遺伝子のコピーが機能的なICP34.5タンパク質を発現できないようにするゲノムの末端反復にあるγ34.5遺伝子のコピーの変化と、(b)二重コピー遺伝子のそれぞれの1つのコピー及び内部逆方向反復領域内の重複された非コード配列の1つのコピーの欠失を引き起こすゲノムの内部逆方向反復領域の欠失とを含み、前記二重コピー遺伝子は、ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oをコードする遺伝子を含み、且つゲノムのUL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、それらがそれぞれの機能的なタンパク質を発現できるよう、いずれも無傷である。
一部の実施形態において、変化は、γ34.5遺伝子のコピーのコード領域又は調節領域の全部又は一部の欠失を含む。一部の実施形態において、重複された非コード配列は、ICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列を含む。一部の実施形態において、UL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、UL成分中のUL1~UL56遺伝子及びUS成分中のUS1~US12遺伝子を含む。
一部の実施形態において、oHSV-1は、F株、KOS株及び17株からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、内部逆方向反復領域の欠失は、F株のゲノム中のヌクレオチド位置117005~132096の切除を引き起こす。
一部の実施形態において、oHSV-1は、プロトタイプ(P)のゲノム異性体、及びUL成分中の最後の遺伝子(例えば、UL56)の停止コドンからUS成分中の最初の遺伝子(例えば、US1)のプロモーターまでの内部逆方向反復領域の欠失を有する。
一部の実施形態において、免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれ、前記組み込みはHSV-1ゲノムの天然遺伝子の発現に干渉しない。一部の実施形態において、免疫刺激剤及び免疫療法剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。
一部の実施形態において、免疫刺激剤はGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、免疫刺激剤はIL-12である。一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤、抗CTLA-4剤又はその両方である。一部の実施形態において、免疫療法剤は抗PD-1剤である。
一部の実施形態において、異種核酸配列は、内部逆方向反復領域内及び/又はUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。一部の実施形態において、IL-12及び抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がoHSV-1に組み込まれる。一部の実施形態において、IL-12をコードする異種核酸配列が内部逆方向反復領域に組み込まれ、且つ抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる。
別の態様において、本開示は、有効量のoHSV-1ウイルス又は上記のoHSV-1ウイルスを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む対象における腫瘍を治療又は緩和する方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。特定の実施形態において、腫瘍は脳腫瘍である。一部の実施形態において、脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる。一部の実施形態において、脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
特定の実施形態において、oHSV-1ウイルス又は医薬組成物は腫瘍内に投与される。一実施形態において、HSV-1ウイルス又は医薬組成物は注射可能な溶液の形態で腫瘍塊に直接注射される。
本発明の方法は、脳腫瘍の治療に有用である。これには、人間の頭蓋骨(頭蓋)内又は中心脊柱管内の全ての腫瘍が含まれる。前記腫瘍は、脳自体から発生するものであってもよいが、リンパ組織、血管、脳神経、脳エンベロープ(髄膜)、頭蓋骨、下垂体、又は松果体から発生するものであってもよい。脳自体の内部では、関与する細胞としてニューロン又はグリア細胞(星状細胞、乏突起膠細胞、及び上衣細胞を含む)が挙げられる。脳腫瘍は、主に他の臓器にあるがんから広がるもの(転移性腫瘍)であってもよい。
一部の実施形態において、脳腫瘍は、上衣腫、星細胞腫、乏突起星細胞腫、乏突起神経膠腫、神経節膠腫、神経膠芽腫(多形性膠芽腫としても知られる)又は混合性神経膠腫などの神経膠腫である。神経膠腫は原発性脳腫瘍であり、顕微鏡下のその外観、特に異型細胞、有糸分裂、内皮増殖及び壊死の存在に基づいて、4つのグレード(I、II、III及びIV)に分類される。「低悪性度神経膠腫」と呼ばれるグレードI及びII腫瘍には、これらの特徴がないか又は1つしかなく、びまん性星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、低悪性度星細胞腫、低悪性度乏突起星細胞腫、低悪性度乏突起神経膠腫、神経節膠腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、多形性黄色星細胞腫及び混合性神経膠腫が含まれる。「高悪性度神経膠腫」と呼ばれるグレードIII及びIV腫瘍には、これらの特徴の2つ又はそれ以上を有し、未分化星細胞腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化乏突起星細胞腫、未分化上衣腫及び神経膠芽腫(巨細胞神経膠芽腫及び神経膠肉腫を含む)が含まれる。これらの実施形態の一態様において、神経膠腫は低悪性度神経膠腫である。これらの実施形態の別の態様において、神経膠腫は高悪性度神経膠腫である。これらの実施形態の別の態様において、神経膠腫は神経膠芽腫である。
一部の実施形態において、oHSV-1をがんの治療に有効な他の薬剤と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、がんの治療は、腫瘍溶解性ウイルス及び抗がん剤又は手術など他の抗がん療法と実施してもよい。本技術の文脈において、腫瘍溶解性ウイルス療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法又は他の生物学的介入と併せて使用することが考えられる。
「抗がん」剤は、例えば、がん細胞を殺し、がん細胞のアポトーシスを誘導し、がん細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率又は数を低減させ、腫瘍サイズを縮小し、腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍又はがん細胞への血液供給を減少し、がん細胞又は腫瘍に対する免疫応答を促進し、がんの進行を予防又は阻害し又はがん患者の寿命を延長することにより、対象のがんに悪影響を与えることができる。抗がん剤には、生物剤(生物療法)、化学療法剤、放射線療法剤が含まれる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を殺し又はその増殖を阻害するのに有効な組み合わせの量で提供される。当該プロセスは、細胞を発現構築物及び薬剤又は複数種の因子と同時に接触させることを含んでもよい。これは、細胞を両方の薬剤を含む単一の組成物又は薬理学的製剤に接触させることによって、又は細胞を、一方の組成物は発現構築物を含み、他方は第2の薬剤を含む2種の異なる組成物又は製剤と同時に接触させることによって達成できる。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるoHSV-1はアジュバントと組み合わされる。一実施形態において、アジュバントはメチル化されていないCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドである。細菌のデオキシリボ核酸(DNA)のメチル化されていないジヌクレオチドCpGモチーフは、いくつかの免疫細胞を刺激して、自然免疫及び適応免疫を強化するためのサイトカインを分泌させるという利点を有する。
ウイルス療法は、数分から数週間の範囲の間隔で他の薬剤治療に先立って又は続いて行われてもよい。他の薬剤及び腫瘍溶解性ウイルスが細胞に別々に適用される実施形態において、一般に、薬剤及びウイルスは依然として細胞への複合効果を有利に発揮できるよう、各送達の時間の間に顕著な長さの期間が満了しないことを保証する。このような場合において、互いに約12~24時間以内の間隔で細胞を2種の療法と接触させてもよいということが考えられる。場合によっては、しかしながら、各投与間に数日(2、3、4、5、6又は7日)から数週間(1、2、3、4、5、6、7又は8週間)が経過する場合、治療の期間を顕著に延長させることが望ましい場合がある。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるoHSV-1又は本明細書に開示される医薬組成物が投与される前に、同時に又はその後に、第2療法が対象に投与される。一部の実施形態において、第2療法は化学療法、放射線療法、免疫療法及び/又は外科的介入である。一部の実施形態において、対象はヒトである。
(実施例)
以下の実施例に示されるように、γ34.5遺伝子の両方のコピーが欠失され且つ内部逆方向反復領域がさらに欠失された遺伝子操作されたoHSV-1ウイルスは、様々な脳腫瘍細胞に対して、非脳腫瘍細胞又は正常な細胞よりも、驚くほど予想外のより高い抗腫瘍活性を示した。これらの結果は、当分野で知られる類似のゲノム構造を有するoHSV-1ウイルス(例えば、T3011、R3616、WT株F)が、脳腫瘍細胞を殺す上で本明細書に開示されるoHSV-1(即ちC1212、C5252、C8282)よりも効率が低いという驚くべき事実を示した。
以下の実施例に示されるように、γ34.5遺伝子の両方のコピーが欠失され且つ内部逆方向反復領域がさらに欠失された遺伝子操作されたoHSV-1ウイルスは、様々な脳腫瘍細胞に対して、非脳腫瘍細胞又は正常な細胞よりも、驚くほど予想外のより高い抗腫瘍活性を示した。これらの結果は、当分野で知られる類似のゲノム構造を有するoHSV-1ウイルス(例えば、T3011、R3616、WT株F)が、脳腫瘍細胞を殺す上で本明細書に開示されるoHSV-1(即ちC1212、C5252、C8282)よりも効率が低いという驚くべき事実を示した。
oHSV-1 C5252、C8282及びC1212の構築:
oHSV-1 C5252の構築:
C5252はγ34.5遺伝子の欠失、UL3とUL4の間の抗ヒトPD-1抗体発現カセットの挿入、及びIL-12発現カセットによって置き換えられた改変内部反復(IR)領域を含む。組換えウイルスは、細菌人工染色体(BAC)システムによっていくつかのステップから構築された。ウイルス構築物の詳細な説明は以下のとおりである。
oHSV-1 C5252の構築:
C5252はγ34.5遺伝子の欠失、UL3とUL4の間の抗ヒトPD-1抗体発現カセットの挿入、及びIL-12発現カセットによって置き換えられた改変内部反復(IR)領域を含む。組換えウイルスは、細菌人工染色体(BAC)システムによっていくつかのステップから構築された。ウイルス構築物の詳細な説明は以下のとおりである。
γ34.5遺伝子の両方のコピー欠失の配置を有するHSV-1 BAC(BAC-Δ34.5)が使用される。野生型ゲノムを取り扱う文脈では、それぞれ2組のプライマー(GAAGATCTAATATTTTTATTGCAACTCCCTG(配列番号5)、CTAGCTAGCTTATAAAAGGCGCGTCCCGTGG(配列番号6))及び(GCTCTAGATTGCGACGCCCCGGCTC(配列番号7)、CCTTAATTAAGGTTACCACCCTGTAGCCCCGATGT(配列番号8))によって、上流がヌクレオチド117005に隣接し、下流がヌクレオチド132096に隣接するIL-12発現カセットを、HSV-1ウイルスゲノムからPCR増幅し、pKO1407を生成するために遺伝子置換プラスミドpKO5に挿入した。次に、pKO1407を電気穿孔法によりBAC-Δ34.5を備える大腸菌にトランスフェクトしてBAC-Δ34.5-IL12を生成した。次に、野生型ゲノムを取り扱う文脈では、それぞれ2組のプライマー(TCCCATGGATTTAACAAACGGGGGGGTGTCG(配列番号9)、GGCCCCCGAGGCCAGCATGACGTTATCT(配列番号10))及び(GAGTAACCGCCCCCCCCCCATGCCACCCTCAC(配列番号11)、GTGTTTTACTGCCACTACACCCCCGGGGAAC(配列番号12))によって、上流がヌクレオチド11658に隣接し、下流がヌクレオチド11659に隣接するPD-1 Fab遺伝子を駆動するCMVプロモーターカセットを、HSV-1ウイルスゲノムからPCR増幅し、pKOE1002プラスミドを生成するためにBglII及びPacI部位においてpKO5に結合した。次に、BAC-5252を生成するために、pKOE1002プラスミドを電気穿孔法によりBAC-Δ34.5-IL12を備える大腸菌にトランスフェクトした。BAC-5252プラスミドのトランスフェクション、続いて数ステップのプラーク精製及びVero細胞における増幅、続いてIL-12及びPD-1 Fab分泌(表1)及びγ34.5遺伝子をコードするタンパク質ICP34.5の発現(図2)の検出によるウイルスの同定により、C5252ウイルスを得た。
C8282はC5252と機能的に同一のマウスバージョンであり、ただしC8282はウイルスゲノム上の同じ位置に、IL-12のマウスバージョン及びマウス抗PD-1抗体(それぞれ配列番号13、14に示される配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する単鎖抗体フラグメント、scFv)を備え、C5252はヒトIL-12及び抗ヒトPD-1抗体を備える。
C1212はC5252と機能的に同一のバージョンであり、ただしウイルスゲノム上の同じ位置C1212に、CMVプロモーターと、それに続く3つの重複された停止コドン及び緑色蛍光タンパク質(GFP)を備え、C5252はヒトIL-12及び抗ヒトPD-1抗体(それぞれ配列番号1~4に示される配列の重鎖可変領域及び定常領域並びに軽鎖可変領域及び定常領域を含有するPD-1 Fab)を備える。
C5252、C8282及びC1212ウイルスによるIL-12及び抗PD-1抗体の発現並びにICP34.5タンパク質の発現の確認:
Vero細胞を1ウェル当たり4×105個の細胞の密度で6ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を偽感染させるか又は1細胞あたり1PFUのHSV-1(F)、R3616、C5252、C8282、C1212で感染させた。感染後6、12及び24時間にそれぞれ細胞を回収した。タンパク質を10%変性ゲルにおいて電気泳動により分離し、抗体ICP34.5又はGAPDHと反応させた。GAPDHをローディングコントロールとして用いた(図2)。C5252、C8282及びC1212の感染後24時間に収集した細胞上清をELISAアッセイ使用して、IL-12及び抗PD-1抗体の発現レベルを検出した。結果を表1に示した。
Vero細胞を1ウェル当たり4×105個の細胞の密度で6ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を偽感染させるか又は1細胞あたり1PFUのHSV-1(F)、R3616、C5252、C8282、C1212で感染させた。感染後6、12及び24時間にそれぞれ細胞を回収した。タンパク質を10%変性ゲルにおいて電気泳動により分離し、抗体ICP34.5又はGAPDHと反応させた。GAPDHをローディングコントロールとして用いた(図2)。C5252、C8282及びC1212の感染後24時間に収集した細胞上清をELISAアッセイ使用して、IL-12及び抗PD-1抗体の発現レベルを検出した。結果を表1に示した。
表1に示されるように、C5252及びC8282ウイルスによって発現されたIL-12及び抗PD-1抗体は、同等なレベルで検出された。バックボーンウイルスであるC1212は、ELISAアッセイによって決定された抗PD-1抗体の発現と同様に、IL-12が検出されなかった。
図2に示されるように、イムノブロッティングによって検出されたICP34.5タンパク質の発現は、ICP34.5タンパク質がC5252、C8282、C1212及びR3616感染サンプルでは発現を欠いているが、野生型(WT)F感染サンプルでは発現していることを示した。
上記の結果は、いずれも、IL-12、抗PD-1抗体の発現及びICP34.5タンパク質の発現欠失により組換えウイルスC5252、C8282及びC1212が確認されたということを示した。
インビトロ細胞殺傷活性-脳腫瘍細胞株:
A172、D54-MG、U87-MG、U138-MG及びD458細胞を96ウェルプレートに播種し(4000個の細胞/ウェル)、F、R3616、T3011及びC5252(0.1及び1.0PFU/細胞)で感染させた。感染から48時間後(48H p.i.)、CCK8-Kitによって細胞生存率を決定した。阻害率=(未感染ウェルのOD-oHSV感染ウェルのOD)/(未感染ウェルのOD-ブランクウェルのOD)×100%。ブランクウェルは培地だけを含有した。実験では全ての値が平均±SEMで示された。結果を表2に示した。
A172、D54-MG、U87-MG、U138-MG及びD458細胞を96ウェルプレートに播種し(4000個の細胞/ウェル)、F、R3616、T3011及びC5252(0.1及び1.0PFU/細胞)で感染させた。感染から48時間後(48H p.i.)、CCK8-Kitによって細胞生存率を決定した。阻害率=(未感染ウェルのOD-oHSV感染ウェルのOD)/(未感染ウェルのOD-ブランクウェルのOD)×100%。ブランクウェルは培地だけを含有した。実験では全ての値が平均±SEMで示された。結果を表2に示した。
表2に示されるように、oHSV-1 C5252は、1.0PFU/細胞で試験された全ての腫瘍脳細胞において有効な細胞殺傷剤であった。細胞株A172、D54-MG、U138-MGでは、試験されたoHSV-1ウイルスのうちC5252が最高の細胞殺傷能力を示した。細胞株U87-MG及びD458では、C5252の抗腫瘍効果がT3011と同等であった。γ34.5遺伝子ヌルoHSV-1でもあるR3616と比較して、C5252は試験された細胞株の殆どで2~3倍の効果があった。
インビトロ細胞殺傷活性-非脳腫瘍細胞株:
細胞を96ウェルプレートに播種し(4000個の細胞/ウェル)、F、T3011及びC5252(0.1及び1.0PFU/細胞)で感染させた。感染48から時間後(48H p.i.)、CCK8-Kitによって細胞生存率を決定した。阻害率=(未感染ウェルのOD-oHSV感染ウェルのOD)/(未感染ウェルのOD-ブランクウェルのOD)×100%。ブランクウェルは培地だけを含有した。実験では全ての値が平均±SEMで示された。結果を表3に示した。
細胞を96ウェルプレートに播種し(4000個の細胞/ウェル)、F、T3011及びC5252(0.1及び1.0PFU/細胞)で感染させた。感染48から時間後(48H p.i.)、CCK8-Kitによって細胞生存率を決定した。阻害率=(未感染ウェルのOD-oHSV感染ウェルのOD)/(未感染ウェルのOD-ブランクウェルのOD)×100%。ブランクウェルは培地だけを含有した。実験では全ての値が平均±SEMで示された。結果を表3に示した。
表3に示されるように、非脳腫瘍細胞株において試験した場合、T3011及びC5252の両方が、様々な非脳腫瘍細胞に対して有効な腫瘍殺傷剤であった。C5252の抗腫瘍活性は、本実施例で試験した8種の細胞株の全てにおいて、より低い又はより高い感染多重度(MOI)では、T3011と実質的に同等であることが注目された。C5252は、γ34.5遺伝子の2番目のコピーが欠失されたT3011のさらに弱毒化されたバージョンであるため、これは予想外であった。しかし、表2に示されるように、γ34.5遺伝子の2番目のコピーの欠失は、oHSV-1ウイルスの非脳腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性に不利な影響を示さなかったが、脳腫瘍細胞に対するその腫瘍殺傷効果を顕著に改善した。したがって、本明細書に開示されるoHSV-1ウイルスは、それが由来するoHSV-1よりも腫瘍殺傷において一般により効果的である。
ヒト悪性神経膠腫細胞の増殖に対するC5252のインビトロ阻害評価:
図3に示されるように、ヒト神経膠腫細胞株U87-MG、U138-MG、U373-MG、D54-MG及びU251-MGに対するC5252の感受性は基本的に同じであり、C5252及びC1212のこれらの神経膠腫細胞に対するIC50値は10MOI未満であった。C5252の阻害効果はバックボーンC1212と同等であった。ウイルスのゲノムへの異種遺伝子の組み込みは、oHSVの複製、したがって阻害能力に実質的な影響を与えなかったが、インビボ投与の場合、oHSV-1ウイルスによって発現される免疫刺激剤(IL-12)及び免疫療法剤(抗PD-1抗体)の性質により、対象の免疫系による腫瘍細胞の殺傷を顕著に助長させる。
図3に示されるように、ヒト神経膠腫細胞株U87-MG、U138-MG、U373-MG、D54-MG及びU251-MGに対するC5252の感受性は基本的に同じであり、C5252及びC1212のこれらの神経膠腫細胞に対するIC50値は10MOI未満であった。C5252の阻害効果はバックボーンC1212と同等であった。ウイルスのゲノムへの異種遺伝子の組み込みは、oHSVの複製、したがって阻害能力に実質的な影響を与えなかったが、インビボ投与の場合、oHSV-1ウイルスによって発現される免疫刺激剤(IL-12)及び免疫療法剤(抗PD-1抗体)の性質により、対象の免疫系による腫瘍細胞の殺傷を顕著に助長させる。
正常な細胞及び腫瘍細胞に対するC5252の阻害効果:
図4に示されるように、腫瘍細胞U373-MG及びACHNに対するC5252のIC50値は、それぞれ、6.890、9.102MOIであり、C5252の正常な細胞HA及びHRGECに対するIC50値は全て500MOIを超えていた。本実験の条件下では、C5252は正常な細胞に対して明らかな阻害効果を示さなかったが、腫瘍細胞に対して顕著な阻害効果を示した。正常な細胞と比較して、C5252の阻害効果は、ヒト腫瘍細胞に対してより高い標的化効果があった。この結果は、C5252が正常な細胞を温存しながら腫瘍細胞を選択的に殺すことを示した。
図4に示されるように、腫瘍細胞U373-MG及びACHNに対するC5252のIC50値は、それぞれ、6.890、9.102MOIであり、C5252の正常な細胞HA及びHRGECに対するIC50値は全て500MOIを超えていた。本実験の条件下では、C5252は正常な細胞に対して明らかな阻害効果を示さなかったが、腫瘍細胞に対して顕著な阻害効果を示した。正常な細胞と比較して、C5252の阻害効果は、ヒト腫瘍細胞に対してより高い標的化効果があった。この結果は、C5252が正常な細胞を温存しながら腫瘍細胞を選択的に殺すことを示した。
C57BL/6マウスへのGL261皮下移植モデルの治療におけるC8282の有効性研究:
C8282はC5252のマウスサロゲートであり、これにはヒトにおける同等物を置き換えるために、マウスIL-12(m-IL-12)及び抗マウスPD-1(m-PD-1)抗体がウイルスゲノムに導入された。図5に示されるように、C8282腫瘍内注射は、GL261皮下腫瘍モデルに対して顕著な有効性を示した。マウスを5×106PFU/動物以下の用量のC8282で治療した場合、動物には充分に許容された。5×105PFU/動物の中用量レベルは、試験された用量範囲において最高の有効性を示す。
C8282はC5252のマウスサロゲートであり、これにはヒトにおける同等物を置き換えるために、マウスIL-12(m-IL-12)及び抗マウスPD-1(m-PD-1)抗体がウイルスゲノムに導入された。図5に示されるように、C8282腫瘍内注射は、GL261皮下腫瘍モデルに対して顕著な有効性を示した。マウスを5×106PFU/動物以下の用量のC8282で治療した場合、動物には充分に許容された。5×105PFU/動物の中用量レベルは、試験された用量範囲において最高の有効性を示す。
ヌードマウスにおける同所性U87ヒト神経膠腫モデルの治療におけるC5252の有効性研究:
図6に示されるように、C5252の脳内注射は、ヌードマウス中のU87-MG細胞に対して顕著な有効性を示した。異なる用量レベルでは顕著な差が見られなかった。
図6に示されるように、C5252の脳内注射は、ヌードマウス中のU87-MG細胞に対して顕著な有効性を示した。異なる用量レベルでは顕著な差が見られなかった。
本開示は、好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される内容の補正、改良及び変化は当業者が想到しやすく、これらの補正、改良及び変化は本開示の範囲内であると見なされるということは理解されるべきである。本明細書において提供される材料、方法及び例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なもので、本開示の範囲に対する限定として意図するものではない。
Claims (27)
- 改変ゲノムを含む腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスI型(oHSV-1)であって、前記改変は、
a)γ34.5遺伝子のコピーが機能的なICP34.5タンパク質を発現できないようにするゲノムの末端反復にあるγ34.5遺伝子のコピーの変化と、
b)二重コピー遺伝子のそれぞれの1つのコピー及び内部逆方向反復領域内の重複された非コード配列の1つのコピーの欠失を引き起こすゲノムの内部逆方向反復領域の欠失とを含み、前記二重コピー遺伝子は、ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P及びORF Oをコードする遺伝子を含み、且つ
ゲノムのUL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、それらがそれぞれの機能的なタンパク質を発現できるよう、いずれも無傷であるoHSV-1。 - 前記変化は、γ34.5遺伝子の前記コピーのコード領域又は調節領域の全部又は一部の欠失を含む請求項1に記載のoHSV-1。
- 前記重複された非コード配列は、ICP0のイントロン、LATドメイン及び「a」配列を含む請求項1又は2に記載のoHSV-1。
- UL及びUS成分の両方における全ての単一コピー遺伝子は、UL成分中のUL1~UL56遺伝子及びUS成分中のUS1~US12遺伝子を含む請求項1又は2に記載のoHSV-1。
- HSV-1はF株、KOS株及び17株からなる群から選ばれる請求項1~4のいずれか一項に記載のoHSV-1。
- HSV-1は、プロトタイプ(P)のゲノム異性体を有する請求項1~5のいずれか一項に記載のoHSV-1。
- 前記内部逆方向反復領域の欠失は、F株のゲノム中のヌクレオチド位置117005~132096の切除を引き起こす請求項1~6のいずれか一項に記載のoHSV-1。
- 前記内部逆方向反復領域の欠失は、UL成分中の最後の遺伝子の停止コドンからUS成分中の最初の遺伝子のプロモーターまでである請求項6に記載のoHSV-1。
- UL成分中の最後の遺伝子はUL56遺伝子である請求項8に記載のoHSV-1。
- US成分中の最初の遺伝子はUS1遺伝子である請求項8又は9に記載のoHSV-1。
- 免疫刺激剤及び/又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列が前記oHSV-1に組み込まれ、前記組み込みはHSV-1ゲノムの天然遺伝子の発現に干渉しない請求項1~10のいずれか一項に記載のoHSV-1。
- 免疫刺激剤及び免疫療法剤をコードする異種核酸配列が前記oHSV-1に組み込まれる請求項11に記載のoHSV-1。
- 前記免疫刺激剤はGM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選ばれる請求項11又は12に記載のoHSV-1。
- 前記免疫刺激剤はIL-12である請求項13に記載のoHSV-1。
- 前記免疫療法剤は抗PD-1剤、抗CTLA-4剤又はその両方である請求項11~14のいずれか一項に記載のoHSV-1。
- 前記免疫療法剤は抗PD-1剤である請求項15に記載のoHSV-1。
- 前記異種核酸配列は、前記内部逆方向反復領域内及び/又はUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる請求項11~16のいずれか一項に記載のoHSV-1。
- IL-12及び抗PD-1剤をコードする異種核酸配列が前記oHSV-1に組み込まれる請求項11~17のいずれか一項に記載のoHSV-1。
- IL-12をコードする異種核酸配列が前記内部逆方向反復領域に組み込まれ、且つ抗PD-1剤をコードする異種核酸配列がUL成分中のUL3とUL4遺伝子の間に組み込まれる請求項18に記載のoHSV-1。
- 有効量の請求項1~18のいずれか一項に記載のoHSV-1と、薬学的に許容される担体とを含む腫瘍の治療のための医薬組成物。
- 前記腫瘍は脳腫瘍である請求項20に記載の医薬組成物。
- 前記脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる請求項21に記載の医薬組成物。
- 前記脳腫瘍は多形性膠芽腫である請求項22に記載の医薬組成物。
- 腫瘍の治療のための薬物の製造における請求項1~18のいずれか一項に記載のoHSV-1の使用。
- 前記腫瘍は脳腫瘍である請求項24に記載の使用。
- 前記脳腫瘍は神経膠腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、異型性髄膜腫、悪性髄膜腫及び神経芽細胞腫からなる群から選ばれる請求項25に記載の使用。
- 前記脳腫瘍は多形性膠芽腫である請求項25に記載の使用。
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