KR20210098483A - 신경독성이 감소된 hsv 벡터 - Google Patents
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Abstract
변형된 종양용해성 헤르페스 바이러스 게놈을 갖는 재조합 단순 헤르페스 바이러스이며, 여기서 변형된 헤르페스 바이러스 게놈은 ICP34.5 유전자의 제1, 또는 제1 및 제2 카피에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 갖는 것인, 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 제공한다. 상기 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 갖는 제약 조성물 뿐만 아니라, 암을 앓는 대상체의 치료에서 상기 조성물을 사용하는 방법 또한 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2018년 11월 29일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/773,119의 이익을 주장하고, 상기 출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 신경독성이 감소된 HSV 벡터에 관한 것이다.
종양용해성 바이러스요법은, 종양용해성 바이러스가 화학요법 또는 방사선 치료보다 유의적으로 더 적은 부작용을 유발하면서, 종양용해성 바이러스가 종양에 대해 강력한 종양용해를 일으키고, 전신 종양-특이적 면역을 유도하기 때문에 암 치료에 유망한 새로운 치료 접근법으로서 인식되어 왔다.
다양한 OV 중에, 단순 헤르페스 바이러스 타입 1 ("HSV-1") 기반 OV가 가장 발전된 것이며, 예컨대, 헤르페스 바이러스 기반 OV (T-Vec)는 흑색종 치료용으로서 미국 FDA의 승인을 받았다. HSV 벡터의 대표적인 예로는 미국 특허 번호 7,223,593, 7,537,924, 7,063,835, 7,063,851, 7,118,755, 8,277,818, 및 8,680,068에 기술되어 있는 것들을 포함한다.
종양용해성 헤르페스 바이러스 벡터의 한 가지 문제점은 HSV의 신경친화성 성질이다. 신경침윤은 주로 바이러스 단백질 ICP34.5에 의해 매개되며, 이는 종양용해성 바이러스요법에서 사용되는 벡터로부터 ICP34.5를 결실시키는 일반 전략법으로 이루어진다. 그러나, ICP34.5를 완전히 결실시키면 광범위한 조직에서 바이러스가 복제할 수 있는 능력은 대략 10배만큼 감소된다. 본 발명은 현행 HSV 벡터와 연관된 특정의 문제점들을 극복하고, 관련 다른 이점들을 추가로 제공한다.
배경기술 섹션에서 논의된 주제가 모두 반드시 선행 기술이어야 할 필요는 없으며, 단지 배경기술 섹션에서의 논의의 결과로서 그가 선행 기술인 것으로 간주되지 않아야 한다. 이러한 맥락에서, 배경기술 섹션에서 논의되거나, 또는 상기 주제와 연관된 선행 기술의 문제에 대한 인식은 선행 기술에 관하여 명확하게 언급되지 않는 한, 선행 기술로서 취급되지 않아야 한다. 대신, 배경기술 섹션에서의 주제에 대한 논의는 그 자체로도 창의적일 수 있는, 특정 문제에 대한 본 발명자의 접근법의 일부로 취급되어야 한다.
간략히 말하면, 본 출원은 ICP34.5의 3' 비번역 영역에 적어도 2개의 miRNA 표적 서열을 갖는 적어도 하나의 ICP34.5 유전자를 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (이는 또한 "oHSV 벡터"로도 지칭된다)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 동일한 miRNA에 대한 표적이다. 다른 실시양태에서, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 mIR-122, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-132, mIR-133a, mIR133b, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, mIR-145, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, mIR216a, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 대한 표적이다. 통상, 최종 생성물인 것으로 더욱 빈번하게 발견되는 가닥은 miRNA로 지칭되고, 더 드물게 발견되는 파트너는 miRNA*로 지칭된다.
다른 실시양태에서, 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 변형된 ICP27 또는 ICP4 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 변형은 5' UTR, 프로모터-조절 영역, 또는 5' UTR 및 프로모터-조절 영역, 둘 모두의 대체이다. 일부 실시양태에서, 5' UTR은 FGF 유전자로부터 유래된 것이다.
특정 실시양태에서, 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 적어도 하나의 면역 자극 인자, 체크포인트 차단 펩티드, 또는 그 둘 모두를 코딩하는 유전자 서열을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 ICP34.5의 3' 비번역 영역에 적어도 2개의 miRNA 표적 서열을 갖는 적어도 하나의 ICP34.5 유전자를 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 간단한 요약은 하기 상세한 설명에서 더 자세히 설명되는 특정 개념을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공되다. 달리 명확하게 언급되는 경우를 제외하면, 본 간단한 요약은 청구된 주제의 핵심 또는 필수 특징을 확인하고자 하는 것이 아니며, 청구된 주제의 범주를 제한하고자 하는 것도 아니다.
하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 하기 설명에서 기술된다. 한 예시적인 실시양태와 관련하여 예시되거나, 또는 기술되는 특징은 다른 실시양태의 특징과 조합될 수 있다. 다른 특징, 목적 및 이점은 설명, 도면, 및 청구범위로부터 자명해질 것이다. 추가로, 본원에서 참조된 모든 특허 및 특허 출원의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용의 예시적인 특징, 그의 성질 및 다양한 이점은 첨부된 도면 및 다양한 실시양태의 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 비-제한적이고 비-포괄적인 실시양태가 첨부된 도면을 참조로 하여 기술되고, 여기서 유사한 라벨 또는 참조 번호는 달리 명시되지 않는 한, 다양한 뷰에서 전체적으로 유사한 부분을 지칭한다. 도면 중 요소의 크기 및 상대적 위치는 반드시 일정 비율로 그려진 것은 아니다. 예를 들어, 도면의 가독성을 향상시키기 위해 다양한 요소의 형상이 선택, 확대 및 배치된다. 도면으로 작성된 요소의 특정 형상은 도면에서 쉽게 알아볼 수 있도록 하기 위해 선택되었다. 하나 이상의 실시양태가 이하 첨부된 도면을 참조로 하여 기술되며, 여기서
도 1은 ICP34.5의 3' 비번역 영역에 3개의 상이한 miRNA 표적을 갖는 예시적인 HSV 벡터의 개략도이다.
도 2는 변형된 γ34.5 유전자 및 변형된 ICP4 또는 ICP27 유전자를 갖는 예시적인 HSV 벡터의 개략도이다.
도 3은 정상 마우스 및 인간 뇌 종양 (U87)을 보유하는 마우스의 뇌에서의 ICP27, ICP4, 및 ICP47의 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 4는 뉴런 및 종양 세포 (LNCaP 및 A549)에서의 ICP34.5 및 β-액틴의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 5는 전사 및 번역 이중-조절 바이러스의 개략도이다.
도 6은 플랫폼 바이러스에서 사용될 수 있는 다양한 조절 요소를 도시한 것이다.
도 7은 CXCR4-TF-Fc-h1215 바이러스 또는 CXCR4-TF-Fc-h1215-miR 바이러스의 두개내 주사 이후 뮤린 뇌 절편의 사진이다. 뇌 절편을 토끼 폴리클로날 항-HSV 1차 항체 및 형광성 래트 항-토끼 2차 항체로 염색하였다.
도 8a, 8b, 및 8c는 다양한 MOI로의 바이러스 감염 후의 세포 생존 그래프이다. 도 8a는 폐 종양 세포 A549 및 정상 폐 세포 BEAS-2b에 대한 세포 생존을 보여주는 것이다. 도 8b는 폐 종양 세포 A549 및 정상 폐 세포 HPL1D에 대한 세포 생존을 보여주는 것이다. 도 8c는 폐 종양 세포 A549, PC9, H460, H23S, H1975에 대한 세포 생존을 보여주는 것이다.
도 9는 A549 폐 종양 세포 및 BEAS-2b 정상 폐 세포에서의 VG182LF 바이러스의 복제를 보여주는 그래프이다.
도 10은 hVG161 또는 hVG182LF 감염 후 A549 폐 종양 세포 및 LNCaP 전립선 종양 세포에서의 IL-12의 증가 (증가 배수)를 보여주는 막대 차트이다.
도 11a, 11b, 및 11c는 다양한 폐 종양 세포에서의 VG182LF 바이러스의 복제를 도시한 것이다. 도 11a: H1975 세포. 도 11b: H460 세포. 도 11c: PC9 세포.
도 12는 비히클 또는 VG182LF 바이러스로 처리한 후 1주째의 H1975 종양을 보유하는 누드 마우스에서의 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 13a 및 13b는 종양 중 마이크로RNA의 선택된 목록을 개시한 것이다. 이들 마이크로RNA는 https ://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed의 PubMed에서 및 http://www.mirbase.org/의 마이크로RNA 데이터베이스 ("mIRBASE")에서 살펴볼 수 있으며, 이는 모두 그 전문이 참조로 포함된다.
도 14a, 14b, 및 14c는 각각 293FT 세포에서의 감염 후 6시간째의 miR-143의 형질감염 효율, 감염 후 6시간째의 바이러스 유전자 발현, 및 감염 후 24시간째의 바이러스 복제를 보여주는 그래프이다.
도 15는 뮤린 뇌 및 척수 절편의 HSV-1 면역염색을 보여주는 사진이다. 마우스에 대조군 비히클, 야생형 HSV-1, ICP34.5가 결실된 HSV-1 변이체 (VG161) 또는 gB의 카르복실 말단에의 융합생성(fusogenic) 돌연변이 (gB-876t)와 함께 ICP34.5의 3' UTR에 miR-143 및 miR-124에 대한 결합 부위를 코딩하는 변이체 (VG301)를 피하로 주사하였다.
도 16은 야생형 HSV-1, ICP34.5가 결실된 HSV-1 변이체 (VG161) 또는 gB의 카르복실 말단에 융합생성 돌연변이 (gB-876t)와 함께 ICP34.5의 3' UTR에 miR-143 및 miR-124에 대한 결합 부위를 코딩하는 변이체 (VG301)를 피하로 주사한 마우스의 생존 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 17은 세포를 고정시키고, 바이러스 플라크, 및 바이러스 유도 세포 융합으로부터 생성된 융합체를 시각화하기 위해 김사(Giemsa) 염색한, 융합 검정법의 결과를 보여주는 그래프이다. 세포를 gB의 카르복실 말단에 융합생성 돌연변이를 포함하거나 (+ gB-876t) 또는 그를 포함하지 않는 (- gB-876t) 재조합 종양용해성 HSV-1로 감염시켰다.
도 1은 ICP34.5의 3' 비번역 영역에 3개의 상이한 miRNA 표적을 갖는 예시적인 HSV 벡터의 개략도이다.
도 2는 변형된 γ34.5 유전자 및 변형된 ICP4 또는 ICP27 유전자를 갖는 예시적인 HSV 벡터의 개략도이다.
도 3은 정상 마우스 및 인간 뇌 종양 (U87)을 보유하는 마우스의 뇌에서의 ICP27, ICP4, 및 ICP47의 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 4는 뉴런 및 종양 세포 (LNCaP 및 A549)에서의 ICP34.5 및 β-액틴의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 5는 전사 및 번역 이중-조절 바이러스의 개략도이다.
도 6은 플랫폼 바이러스에서 사용될 수 있는 다양한 조절 요소를 도시한 것이다.
도 7은 CXCR4-TF-Fc-h1215 바이러스 또는 CXCR4-TF-Fc-h1215-miR 바이러스의 두개내 주사 이후 뮤린 뇌 절편의 사진이다. 뇌 절편을 토끼 폴리클로날 항-HSV 1차 항체 및 형광성 래트 항-토끼 2차 항체로 염색하였다.
도 8a, 8b, 및 8c는 다양한 MOI로의 바이러스 감염 후의 세포 생존 그래프이다. 도 8a는 폐 종양 세포 A549 및 정상 폐 세포 BEAS-2b에 대한 세포 생존을 보여주는 것이다. 도 8b는 폐 종양 세포 A549 및 정상 폐 세포 HPL1D에 대한 세포 생존을 보여주는 것이다. 도 8c는 폐 종양 세포 A549, PC9, H460, H23S, H1975에 대한 세포 생존을 보여주는 것이다.
도 9는 A549 폐 종양 세포 및 BEAS-2b 정상 폐 세포에서의 VG182LF 바이러스의 복제를 보여주는 그래프이다.
도 10은 hVG161 또는 hVG182LF 감염 후 A549 폐 종양 세포 및 LNCaP 전립선 종양 세포에서의 IL-12의 증가 (증가 배수)를 보여주는 막대 차트이다.
도 11a, 11b, 및 11c는 다양한 폐 종양 세포에서의 VG182LF 바이러스의 복제를 도시한 것이다. 도 11a: H1975 세포. 도 11b: H460 세포. 도 11c: PC9 세포.
도 12는 비히클 또는 VG182LF 바이러스로 처리한 후 1주째의 H1975 종양을 보유하는 누드 마우스에서의 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 13a 및 13b는 종양 중 마이크로RNA의 선택된 목록을 개시한 것이다. 이들 마이크로RNA는 https ://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed의 PubMed에서 및 http://www.mirbase.org/의 마이크로RNA 데이터베이스 ("mIRBASE")에서 살펴볼 수 있으며, 이는 모두 그 전문이 참조로 포함된다.
도 14a, 14b, 및 14c는 각각 293FT 세포에서의 감염 후 6시간째의 miR-143의 형질감염 효율, 감염 후 6시간째의 바이러스 유전자 발현, 및 감염 후 24시간째의 바이러스 복제를 보여주는 그래프이다.
도 15는 뮤린 뇌 및 척수 절편의 HSV-1 면역염색을 보여주는 사진이다. 마우스에 대조군 비히클, 야생형 HSV-1, ICP34.5가 결실된 HSV-1 변이체 (VG161) 또는 gB의 카르복실 말단에의 융합생성(fusogenic) 돌연변이 (gB-876t)와 함께 ICP34.5의 3' UTR에 miR-143 및 miR-124에 대한 결합 부위를 코딩하는 변이체 (VG301)를 피하로 주사하였다.
도 16은 야생형 HSV-1, ICP34.5가 결실된 HSV-1 변이체 (VG161) 또는 gB의 카르복실 말단에 융합생성 돌연변이 (gB-876t)와 함께 ICP34.5의 3' UTR에 miR-143 및 miR-124에 대한 결합 부위를 코딩하는 변이체 (VG301)를 피하로 주사한 마우스의 생존 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 17은 세포를 고정시키고, 바이러스 플라크, 및 바이러스 유도 세포 융합으로부터 생성된 융합체를 시각화하기 위해 김사(Giemsa) 염색한, 융합 검정법의 결과를 보여주는 그래프이다. 세포를 gB의 카르복실 말단에 융합생성 돌연변이를 포함하거나 (+ gB-876t) 또는 그를 포함하지 않는 (- gB-876t) 재조합 종양용해성 HSV-1로 감염시켰다.
본 발명은 하기 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 상세한 설명 및 본원에 포함된 실시예를 참조함으로써 더욱 쉽게 이해될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "마이크로RNA" 또는 "miRNA"라는 용어는 동물 및 식물, 둘 모두를 비롯한, 매우 다양한 유기체에서 발현되는 짧은 (전형적으로, 21-25 뉴클레오티드), 내인성, 단일 가닥 RNA 패밀리를 지칭한다. 1,000개를 초과하는 고유한 miRNA가 인간에서 발현된다. miRNA는 메신저 RNA (mRNA)에서 발견되는 특이적 표적 서열에 결합한다. mRNA 분자 중의 상보적 또는 부분적으로 상보적인 서열 (표적 서열)에 결합하게 되면, mRNA의 절단에 의해 유전자 발현은 하향조절되고, 그의 폴리A 테일의 단축으로 분해는 증가되고, 번역은 직접적으로 억제된다. 종양 중에서 선택된 마이크로RNA 목록이 (연관된 참조 기호와 함께) 도 13a 및 도 13b에 제공되어 있고, 목록 및 연관된 참조 기호는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
"종양용해성 헤르페스 바이러스" 또는 "oHSV"라는 용어는 일반적으로 종양 세포에서 복제가능하고, 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 헤르페스 바이러스를 지칭한다. 특정 실시양태 범위 내에서, 바이러스는 종양 세포를 더욱 선택적으로 표적화하도록 조작될 수 있다. 종양용해성 헤르페스 바이러스의 대표적인 예는 미국 특허 번호 7,223,593, 7,537,924, 7,063,835, 7,063,851, 7,118,755, 8,216,564, 8,277,818, 및 8,680,068에 기술되어 있고, 상기 특허들은 모두 그 전문이 참조로 포함된다
본원에서 사용되는 바, "치료하다" 또는 "치료하는" 또는 "치료"란, 임상 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는 검출가능 여부와 상관없이, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 호전, 질환 정도 감소, 질환 상태 안정화 (즉, 비악화), 질환 확산 방지, 질환 진행 지연 또는 저속화, 질환 상태 호전 또는 완화, 질환 재발 감소, 및 (부분적이든 또는 완전하든) 관해를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 또한 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존과 비교하여 생존 연장도 의미할 수 있다.
대표적인 암 형태로는 암종, 백혈병, 림프종, 골수종 및 육종을 포함한다. 추가 예로는 담관암인 암, 뇌암 (예컨대, 교모세포종), 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, CNS 암 (예컨대, 청신경종, 성상세포종, 두개인두종, 상의세포종, 교모세포종, 혈관모세포종, 수모세포종, 수막종, 신경모세포종, 희소돌기교종, 송과체종 및 망막모세포종), 자궁내막암, 조혈 세포 암 (예컨대, 백혈병 및 림프종), 신장암, 후두암, 폐암, 간암, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암 (예컨대, 흑색종 및 편평 세포 암종) 및 갑상선암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 암은 고형 종양 (예컨대, 육종, 예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종 및 골육종), 미만성 (예컨대, 백혈병), 또는 이들의 일부 조합 (예컨대, 고형 종양 및 파종성 또는 미만성 암 세포, 둘 모두를 갖는 전이성 암)을 포함할 수 있다. 암은 또한 종래 치료 (예컨대, 종래 화학요법 및/또는 방사선 요법)에 대해 내성을 나타낼 수 있다.
특히 바람직한, 치료하고자 하는 암으로는 폐 종양, 유방 종양 및 전립선 종양, 교모세포종, 위장관 (및 연관 기관)의 종양, 예컨대, 식도 종양, 담관암종, 항문 종양, 위 종양, 장 종양, 췌장 종양, 결장 종양 및 간 종양, 및 모든 표면 주사가능한 종양 (예컨대, 흑색종)을 포함한다.
양성 종양 및 원치않는 세포 증식인 다른 병태 또한 치료될 수 있다.
본원의 다양한 실시양태의 이해를 증진시키기 위해, 다양한 실시양태를 기술하는 하기 섹션을 제공한다: A. 종양용해성 헤르페스 바이러스; B. 마이크로RNA; C. 치료 조성물, 및 D. 투여.
A. 종양용해성 헤르페스 바이러스
단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 1 및 2는 인간을 감염시키는 헤르페스비리다에 과의 구성원이다. HSV 게놈은 고유한 긴 (UL) 및 고유한 짧은 (US) 영역으로 지정된 2개의 고유 영역을 함유한다. 이들 영역은 각각 한 쌍의 역 말단 반복 서열에 플랭킹되어 있다. 약 75개의 공지된 오픈 리딩 프레임이 존재한다. 바이러스 게놈은 예컨대, 암 요법에서 사용하기 종양용해성 바이러스를 발생하도록 조작되었다. HSV의 종양 선택적 복제는 HSV ICP34.5 (또한 γ34.5로도 명명) 유전자의 돌연변이에 의해 부여될 수 있다. HSV는 ICP34.5의 카피 2개를 함유한다. ICP34.5 유전자의 두 카피 중 하나, 또는 그 둘 모두를 불활성화시키는 돌연변이체는 신경병독성 결핍, 즉, 무독성/비-신경병독성이고, 종양용해성인 것으로 공지되어 있다. HSV의 종양 선택적 복제는 또한 중요한 바이러스 유전자, 예컨대, ICP27 및/또는 ICP4의 발현 제어에 의해서도 부여될 수 있다.
적합한 종양용해성 HSV는 임의의 실험실용 균주 또는 임상 분리주를 비롯한, HSV-1 또는 HSV-2로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, oHSV는 실험실용 균주인 HSV-1 균주 17, HSV-1 균주 F, 또는 HSV-2 균주 HG52 중 하나일 수 있거나, 또는 그로부터 유래될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이는 비-실험실용 균주 JS-1일 수 있거나, 또는 그로부터 유래될 수 있다. 다른 적합한 HSV-1 바이러스로는 HrrR3 (Goldstein and Weller, J. Virol . 62, 196-205, 1988), G2O7 (Mineta et al. Nature Medicine. 1(9):938-943, 1995; Kooby et al. The FASEB Journal, 13(11):1325-1334, 1999); G47Delta (Todo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001; 98(11):6396-6401); HSV 1716 (Mace et al. Head & Neck, 2008; 30(8):1045-1051; Harrow et al. Gene Therapy. 2004; 11(22):1648-1658); HF10 (Nakao et al. Cancer Gene Therapy. 2011; 18(3):167-175); NV1020 (Fong et al. Molecular Therapy, 2009; 17(2):389-394); T-VEC (Andtbacka et al. Journal of Clinical Oncology, 2015: 33(25):2780-8); J100 (Gaston et al. PloS one, 2013; 8(11):e81768); M002 (Parker et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000; 97(5):2208-2213); NV1042 (Passer et al. Cancer Gene Therapy. 2013; 20(1):17-24); G2O7-IL2 (Carew et al. Molecular Therapy, 2001; 4(3):250-256); rQNestin34.5 (Kambara et al. Cancer Research, 2005; 65(7):2832-2839); G47Δ-mIL-18 (Fukuhara et al. Cancer Research, 2005; 65(23):10663-10668); 및 PCT 출원 PCT/US2017/030308 (발명의 명칭: "HSV Vectors with Enhanced Replication in Cancer Cells"), 및 PCT/US2017/018539 (발명의 명칭: "Compositions and Methods of Using Stat1/3 Inhibitors with Oncolytic Herpes Virus")에서 개시된 상기 벡터 (상기 문헌들은 모두 그 전문이 참조로 포함된다)를 포함한다.
oHSV 벡터는 본원에 개시된 바와 같이 그의 3' UTR에 miRNA 표적 서열로 변형된 적어도 하나의 γ34.5 유전자를 갖고; 벡터 중 비변형된 γ34.5 유전자는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, oHSV는 2개의 변형된 γ34.5 유전자를 갖고; 다른 실시양태에서, oHSV는 단 하나의 γ34.5 유전자를 갖고, 이는 변형된 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 γ34.5 유전자(들)는 시험관내에서 구축되고, 바이러스 유전자(들)에 대한 대체로서 oHSV 벡터 내로 삽입된다. 변형된 γ34.5 유전자가 유일의 γ34.5 유전자의 대체일 때, 나머지 다른 한 γ34.5는 결실된 것이다. 천연 γ34.5 유전자 중 어느 것이든 결실될 수 있다. 한 실시양태에서, γ34.5 유전자 및 ICP4 유전자를 포함하는 말단 반복부가 결실된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 변형된 γ34.5 유전자는 예컨대, 외인성 프로모터를 갖는 것과 같이, 추가 변이를 포함할 수 있다.
oHSV는 추가 돌연변이를 포함할 수 있고, 이는 바이러스의 병독성 또는 그의 복제 능력에 영향을 줄 수 있는, 불능화 돌연변이 (예컨대, 결실, 치환, 삽입)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이화는 ICP6, ICPO, ICP4, ICP27, ICP47, ICP24, ICP56 중 하나 이상의 임의의 것에서 이루어질 수 있다. 바람직하게, 상기 유전자 중 하나에서 (임의적으로, 적절할 경우, 상기 유전자의 두 카피 모두에서) 돌연변이는 상응하는 기능성 폴리펩티드를 발현할 수 있는 HSV의 능력을 불능화 (또는 그의 능력을 감소화)시킨다. 일부 실시양태에서, 바이러스 유전자의 프로모터는 표적 세포에서 선택적으로 활성을 나타내는, 또는 유도제 전달시 유도성이거나, 또는 세포 이벤트 또는 특정 환경에서 유도성인 프로모터로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, ICP4 또는 ICP27의 발현은 외인성 프로모터, 예컨대, 종양-특이적 프로모터에 의해 제어된다. 예시적인 종양-특이적 프로모터는 서바이빈, CEA, CXCR4, PSA, ARR2PB, 또는 텔로머라제를 포함하고; 다른 적합한 종양-특이적 프로모터는 단일 종양 유형에 특이적일 수 있고, 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다른 요소도 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 인핸서, 예컨대, NFkB/oct4/sox2 인핸서가 존재한다. 또한, 5' UTR, 예컨대, FGF와 같은 성장 인자 유전자로부터의 5' UTR은 외인성일 수 있다. 예시적인 구축물에 대해 도 2를 참조한다.
oHSV는 또한 기원이 비-HSV인 유전자 및 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 다른 것들 중에서도 특히 프로드럭을 코딩하는 서열, 시토카인 또는 다른 면역 자극 인자를 코딩하는 서열, 종양-특이적 프로모터, 유도성 프로모터, 인핸서, 숙주 세포에 상동성인 서열이 oHSV 게놈 중에 존재할 수 있다. 예시적인 서열은 IL12, IL15, IL15 수용체 알파 서브유닛, OX40L, PD-L1 차단제 또는 PD-1 차단제를 코딩한다. 생성물을 코딩하는 서열의 경우, 이는 프로모터 서열 및 발현에 필요하거나, 또는 바람직한 다른 조절 서열 (예컨대, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 서열)에 작동적으로 연결된다.
바이러스 유전자의 조절 영역은 발현에 영향을 주는 반응 요소를 포함하도록 변형될 수 있다. 예시적인 반응 요소로는 NF-κB, Oct-3/4-SOX2, 인핸서, 사일런서, cAMP 반응 요소, CAAT 인핸서 결합 서열, 및 인슐레이터에 대한 반응 요소를 포함한다. 다른 반응 요소 또한 포함될 수 있다. 바이러스 프로모터는 상이한 프로모터로 대체될 수 있다. 프로모터 선택은 HSV 벡터의 제안된 용도, 환자 치료, 질환 상태 또는 병태, 및 (유도성 프로모터인 경우) 유도제 적용의 용이성과 같은 많은 인자에 의존할 것이다. 암 치료를 위해, 일반적으로 프로모터가 대체될 때, 프로모터는 세포-특이적 또는 조직-특이적 또는 종양-특이적 프로모터 프로모터로 대체될 것이다. 종양-특이적, 세포-특이적 및 조직-특이적 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다른 유전자 요소도 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 유전자의5' UTR은 외인성 UTR로 대체될 수 있다.
B. 마이크로RNA
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 적어도 2개의 miRNA 표적 서열을 갖는 oHSV를 제공한다. 간략하면, miRNA는 전형적으로는 3'-비번역 영역 (3'-UTR)에 존재하는, mRNA 중의 그의 표적 서열에 결합한다. 결합은 miRNA의 5'-단부로부터 약 뉴클레오티드 2-8개만큼의 거리에 위치하는, "시드 영역"으로도 불리는 영역에서 개시될 수 있거나, 또는 그를 필요로 할 수 있다. 부분적으로 상보적일 때, 5'-단부는 3'-단부보다 표적 서열에 대해 더 큰 동일성을 갖는 경향이 있다. 상보성 양이 높을수록 특히, mRNA 절단을 통한 mRNA 억제는 증진될 수 있다.
개별 miRNA 및 miRNA들의 군은 특정 조직 유형에서 배타적으로 또는 차별적으로 발현될 수 있다. 뉴런 세포에 농축 또는 배타적인 miRNA로는 mIR-122, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-132, mIR-133a, mIR133b, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, mIR-145, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, mIR216a, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873의 것을 포함한다. 통상, 최종 생성물인 것으로 더욱 빈번하게 발견되는 가닥은 miRNA로 지칭되고, 더 드물게 발견되는 파트너는 miRNA*로 지칭된다. 종양 중에서 선택된 마이크로RNA 목록이 (연관된 참조 기호와 함께) 도 13a 및 도 13b에 제공되어 있고, 목록 및 연관된 참조 기호는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
miRNA 표적 서열은 γ34.5 유전자의 3' UTR에 삽입된다. 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 직렬로 삽입되어 있다. 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10개 등의 표적 서열이 존재할 수 있다. 다른 실시양태 범위 내에서, 10, 20, 50, 또는 100개 미만의 표적 서열이 존재한다. 표적 서열의 최적 개수는 ICP34.5의 발현 수준을 검정함으로써 결정될 수 있다. ICP34.5가 비존재 내지 저수준인 것이 바람직한다. 다중 miRNA 표적 서열이 모두 동일한 miRNA에 결합할 수 있거나, 또는 상이한 miRNA에 결합할 수 있다. 표적 서열은 예를 들어, 제1 miRNA에 결합하는 적어도 2개의 표적 서열이 직렬로 존재하고, 이어서, 제2 miRNA에 결합하는 적어도 2개의 표적 서열이 직렬로 존재하고, 이어서, 제3 miRNA에 결합하는 적어도 2개의 표적 서열이 직렬로 존재하는 것인 클러스터로 존재할 수 있다 (예컨대, 도 1). 대안적으로, 상이한 miRNA에 결합하는 다중 miRNA 표적 서열은 특정한 순서없이 존재할 수 있다. 또한, 각 miRNA 표적 서열이 유일의 단일 카피로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 3-5개의 상이한 miRNA 표적이 존재한다. 다른 실시양태에서, 각 표적 서열의 카피가 3-5개 존재한다. 다른 실시양태에서, 3-5개의 상이한 miRNA 표적이 존재하고, 이들 각 표적 서열의 카피 3-5개가 클러스터로 존재한다. 예시적인 구축물에 대해서는 도 1을 참조한다.
다중 miRNA 표적 서열은 개입 뉴클레오티드 없이 인접해 있을 수 있거나, 또는 1 내지 약 25, 또는 1 내지 약 20, 또는 1 내지 약 15, 또는 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5, 또는 3 내지 약 10, 또는 5 내지 약 10개의 개입 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 개입 뉴클레오티드는 3' UTR과 유사한 G+C 함량을 갖도록 선택될 수 있고, 바람직하게는 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하지 않는다. 개입 뉴클레오티드 선택을 위한 다른 고려 사항은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 특정 실시양태 범위 내에서, 본원에 기술된 바와 같은 oHSV는 전사 및 번역, 둘 모두의 이중-조절 (이는 "TTDR"로도 지칭된다)을 사용하도록 구축된다. 상기 벡터의 한 예시적인 도해가 도 5에 제공되어 있다. 간략하면, 특정 바람직한 실시양태 범위 내에서, ICP34.5 유전자의 3'-UTR에 miR-124 및 miR-143에 대한 결합 부위의 카피 5개를 삽입함으로써 ICP34.5 유전자의 번역 제어가 이루어진다. 플랫폼 바이러스 벡터의 중요한 요소는 또한 종양-특이적 프로모터를 이용하는, 바이러스 복제에 필수적인 유전자인 ICP27 유전자의 전사 제어를 포함할 수 있다.
균주 17, 균주 KOS, 균주 F, 및 균주 McKrae를 비롯한, 매우 다양한 HSV-1 균주가 재조합 종양용해성 바이러스 구축을 위한 백본으로서 사용될 수 있다. 모든 바이러스 돌연변이유발법은 박테리아 인공 염색체 (BAC)로 클로닝된 HSV-1 게놈에서 실행되는 표준 람다 Red-매개 재조합 기술을 이용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 수행될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Tischer BK, Smith GA, Osterrieder N. Methods Mol Biol. 2010;634:421-30. doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30. PMID: 20677001]; [Tischer BK, von Einem J, Kaufer B, and Osterrieder N., BioTechniques 40:191-197, Feb. 2006] ((Supplementary Material, doi: 10.2144/000112096) 포함); 및 [Tischer BK, Smith, GA and Osterrieder N. Chapter 30, Jeff Braman (ed.), In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 634, doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30, Springer Sceince+Business Media, LLC 2010] 참조).
종양-특이적 프로모터는 또한 항-종양 면역 반응을 증강시키는 면역조정인자 IL12/IL15/IL15RA를 코딩하는 카세트의 발현을 구동시키는 데에도 사용될 수 있다. 면역조정인자 발현 카세트는 hCEA, hCXCR4, 또는 PSA 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 바이러스 유전자 발현 및 복제에 어떤 부정적 영향도 미치지 않는 위치에, 예컨대, 바이러스 유전자 US1/US2, UL3/UL4 및/또는 UL50/UL51 사이에 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 다양한 마우스 모델에서의 생체내 시험을 촉진시키기 위해, 인간 IL12 대신 뮤린 IL12를 발현하는 다른 재조합 바이러스를 구축할 수 있다. 인간 IL15는 마우스 세포에서의 그의 활성에 기인하여 마우스-특이적 종양용해성 바이러스에 유지될 수 있다.
벡터는 바이러스 세포독성을 증진시키는, C-말단 R-펩티드가 결핍된 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV: Gibbon ape leukemia virus) env 단백질의 융합생성 형태를 코딩하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 다른 실시양태 범위 내에서, 발현 카세트는 융합생성 형태의 HSV-1 당단백질 B를 코딩할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태 범위 내에서, 당단백질 B는 말단절단된 것일 수 있다 (예컨대, 결실이 gB의 아미노산 876 다음에서 발생 ("gB-876t")). 카세트는 바이러스 유전자 발현 및 복제에 어떤 부정적 영향도 미치지 않는 위치에, 예컨대, 바이러스 유전자 US1/US2, UL3/UL4 및/또는 UL50/UL51 사이에 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다.
BAC 재조합은 E. 콜라이(E. coli)에서의 돌연변이유발을 촉진시키기 위해 바이러스 게놈 내의 외인성 BAC DNA의 존재를 필요로 한다. BAC 서열은 가장 보편적으로는 바이러스 유전자, 예컨대, US1/US2, UL3/UL4 및/또는 UL50/UL51 사이에, 또는 티미딘 키나제 (TK) 유전자 내로 삽입되며, 이는 천연 TK의 발현을 파괴시킬 수 있다. TK 결핍 바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 비-코딩 영역 내로 삽입된 구성적 프로모터의 제어하에 HSV-1 티미딘 키나제 (TK) 유전자에 대한 발현 카세트를 포함할 수 있다. 외인성 TK 유전자의 존재는 바이러스를 구아노신 유사체, 예컨대, 간시클로비어 및 아시클로비어를 이용하는 일반 치료에 대해 감수성을 나타내도록 만듦으로써 바이러스 안전성을 증진시킨다.
대안적 실시양태 범위 내에서, 또 다른 TK를 삽입하는 대신 원래 파괴된 TK가 회복될 수 있거나, 또는 (TK-널 바이러스는 잠복으로부터 재활성화하지 못하기 때문에) TK 유전자는 신경발병성을 추가로 감소시키기 위해 파괴되고, 대체 또는 회복되지 않을 수 있다. 비록 TK가 파괴되더라도, 바이러스는 그의 기능을 위해 TK에 의존하지 않는 약물 치료에 대해서는 여전히 감수성을 나타낼 것이다. 예를 들어, 포스카넷 및 시도포비어가 바이러스 DNA 폴리머라제를 억제시키고, TK에 의존하지 않는다.
중요한 HSV-1 전사 조절인자 ICP27의 발현을 구동시키는 프로모터는 종양-특이적 프로모터, 예컨대, hCEA, hCXCR4, PSA, 또는 프로바신(Probasin) (ARR2PB)으로 대체될 수 있다. 신경병독성 인자 ICP34.5를 코딩하는 바이러스 유전자의 3' UTR은 또한 ICP34.5의 생산을 폐기하기 위하여 상응하는 마이크로RNA를 고수준으로 함유하는 조직에 마이크로RNA 인식 요소의 다중 카피를 삽입함으로써 변형될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, miR-124 인식 요소 카피 5개 및 miR-143 인식 요소 카피 5개가 직렬로 ICP34.5의 3' UTR 내로 삽입될 수 있다.
바이러스 게놈의 말단 반복 영역은 전체 게놈 크기를 축소시키고, 트랜스진 삽입을 위해 더 많은 공간을 생성하기 위해 완전히 결실될 수 있고; 결실된 TR은 보통은 말단 반복부의 일부인, ICP47 유전자의 천연 프로모터 파괴를 막도록 조작된다. 말단 반복 영역 대신 내부 반복 영역을 결실시킴으로써 유사 변형이 수행될 수 있다. 본원에서 논의되는 예시적인 요소에 관한 추가의 세부 사항은 도 6에 예시되어 있다.
C. 치료 조성물
질환, 예컨대, 예를 들어, 암의 영향을 예방, 치료, 또는 호전시키는 데 사용될 수 있는 치료 조성물을 제공한다. 더욱 특히, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 종양용해성 바이러스를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 것이다. "제약상 허용되는 담체"라는 어구는 종양용해성 바이러스의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않고, 그를 투여받는 대상체에게 독성을 나타내지 않는 임의의 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 것으로 의미된다 (일반적으로 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005 and in The United States PharmacopE1A: The National Formulary (USP 40 - NF 35 and Supplements] 참조).
본원에 기술된 바와 같은 종양용해성 바이러스의 경우, 적합한 제약 담체의 비제한적인 예로는 포스페이트 완충처리된 염수 용액, 물, 에멀젼 (예컨대, 유/수 에멀젼), 각종 유형의 습윤화제, 멸균 용액 등을 포함한다. 추가 제약상 허용되는 담체로는 겔, 생체흡수성 매트릭스 물질, 종양용해성 바이러스를 함유하는 이식 요소, 또는 임의의 다른 적합한 비히클, 전달 또는 분배 수단 또는 물질(들)을 포함한다. 상기 담체는 종래 방법에 의해 제제화될 수 있고, 대상체에게 유효 용량으로 투여될 수 있다. 추가 제약상 허용되는 부형제로는 물, 염수, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루론산 및 에탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 무기산 염 (예컨대, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등) 및 유기산 염 (예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등)과 같이, 제약상 허용되는 염 또한 그에 포함될 수 있다. oHSV를 암 세포로 전달하는 데 사용될 수 있는 상기 제약상 허용되는 (제약 등급) 담체, 희석제 및 부형제는 바람직하게는 조성물을 받은 개체 (대상체)에서 면역 반응을 유도하지 않을 것이다 (그리고, 바람직하게는 과도한 독성 없이 투여될 것이다).
본원에서 제공되는 조성물은 다양한 농도로 제공될 수 있다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스는 약 106 내지 약 109 pfu 범위의 투여량으로 제공될 수 있다. 추가 실시양태 범위 내에서, 투여량은 약 106 내지 약 108 pfu/ml 범위일 수 있고, 치료 매 2-3주마다, 큰 병변 (예컨대, >5 cm)을 갖는 환자에게는 최대 4 ml가 주사되고, 작은 병변 (예컨대, < 0.5 cm)을 갖는 환자에서는 더 작은 양 (예컨대, 최대 0.1 ml)이 주사될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태 범위 내에서, 표준보다 더 낮은 투여량으로 사용될 수 있다. 그러므로, 특정 실시양태 범위 내에서, 약 106 pfu/ml 미만 (최대 4 ml가 매 2-3주마다 환자 내로 주사)이 환자에게 투여될 수 있다.
조성물은 안정한 저장 수명에 도움이 되고, 실온 (약 20℃), 4℃, -20℃, -80℃를 포함하는 온도에서 및 액상 N2에서 보관될 수 있다. 생체내 사용을 위한 조성물은 일반적으로 보존제를 포함하지 않는 바, 보관은 일반적으로 더 차가운 냉온에서 이루어질 것이다. 조성물은 건식으로 (예컨대, 동결건조) 또는 액상 형태로 보관될 수 있다.
D. 투여
본원에 기술된 조성물 이외에도, 대상체에게 oHSV를 유효 용량 또는 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 호전시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 다양한 방법들을 제공한다.
"유효 용량" 및 "유효량"이라는 용어는 표적화된 암을 치료하는 데 충분한 종양용해성 바이러스의 양, 예컨대, 표적화된 종양 크기 또는 로드를 축소시키는 데, 또는 다르게는 표적화된 종양 세포의 성장률을 방해하는 데 효과적인 양을 지칭한다. 더욱 특히, 상기 용어는 필요한 투여량 및 치료 기간 하에 원하는 결과를 달성하는 데 효과적인 종양용해성 바이러스의 양을 지칭한다. 예를 들어, 암 치료와 관련하여, 본원에 기술된 조성물의 유효량은 관해를 유도하고/거나, 종양 부하를 감소시키고/거나, 종양 확산 또는 암 성장을 막는 양이다. 유효량은 예컨대, 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중 뿐만 아니라, 제약 제제, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 통상적으로는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
치료 조성물은 암 진단을 받은 대상체, 또는 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체에게 투여된다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다.
조성물을 암을 치료하는 데 사용된다. 본원에서 사용되는 바, "치료하다" 또는 "치료하는" 또는 "치료"란, 임상 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는 검출가능 여부와 상관없이, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 호전, 질환 정도 감소, 질환 상태 안정화 (즉, 비악화), 질환 확산 방지, 질환 진행 지연 또는 저속화, 질환 상태 호전 또는 완화, 질환 재발 감소, 및 (부분적이든 또는 완전하든) 관해를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 또한 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존과 비교하여 생존 연장도 의미할 수 있다.
대표적인 암 형태로는 암종, 백혈병, 림프종, 골수종 및 육종을 포함한다. 추가 예로는 담관암, 뇌암 (예컨대, 교모세포종), 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, CNS 암 (예컨대, 청신경종, 성상세포종, 두개인두종, 상의세포종, 교모세포종, 혈관모세포종, 수모세포종, 수막종, 신경모세포종, 희소돌기교종, 송과체종 및 망막모세포종), 자궁내막암, 조혈 세포 암 (예컨대, 백혈병 및 림프종), 신장암, 후두암, 폐암, 간암, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암 (예컨대, 흑색종 및 편평 세포 암종), GI 암 (예컨대, 식도암, 위암, 및 결장암) 및 갑상선암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 암은 고형 종양 (예컨대, 육종, 예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종 및 골육종), 미만성 (예컨대, 백혈병), 또는 이들의 일부 조합 (예컨대, 고형 종양 및 파종성 또는 미만성 암 세포, 둘 모두를 갖는 전이성 암)을 포함할 수 있다. 암은 또한 종래 치료 (예컨대, 종래 화학요법 및/또는 방사선 요법)에 대해 내성을 나타낼 수 있다.
특히 바람직한, 치료하고자 하는 암으로는 폐 종양, 유방 종양 및 전립선 종양, 교모세포종, 위장관 (및 연관 기관)의 종양, 예컨대, 식도 종양, 담관암종, 항문 종양, 위 종양, 장 종양, 췌장 종양, 결장 종양 및 간 종양, 및 모든 표면 주사가능한 종양 (예컨대, 흑색종)을 포함한다. 양성 종양 및 원치않는 세포 증식인 다른 병태 또한 치료될 수 있다.
본원에 기술된 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 예컨대, 경구, 국소, 비경구, 전신, 정맥내, 근육내, 안구내, 경막내, 종양내, 피하, 또는 경피인 경로에 의해 제공될 수 있다. 특정 실시양태 범위 내에서, 종양용해성 바이러스는 캐뉼라에 의해, 카테터에 의해, 또는 직접 주사에 의해 전달될 수 있다. 투여 부위는 종양내 또는 종양으로부터 떨어져 있는 원위부일 수 있다. 투여 경로는 대개 표적화된 암 유형에 의존할 것이다.
종양용해성 바이러스의 최적 또는 적절한 투여량 요법은 관련 기술분야 범위 내에서 환자 데이터, 환자 관찰결과, 및 예를 들어, 대상체의 크기, 체표면적, 연령, 성별, 및 투여되는 특정 종양용해성 바이러스, 투여 시간 및 경로, 치료되는 암 유형, 환자의 건강 상태, 및 환자가 받고 있는 다른 약물 요법을 비롯한 다양한 임상 인자에 기초하여 주치의에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 특정 실시양태에 따라, 본원에 기술된 종양용해성 바이러스를 사용하여 대상체를 치료하는 것은 추가 유형의 요법, 예컨대, 화학요법제, 예컨대, 에토포시드, 이포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 독시사이클린 등을 이용하는 화학요법과 함께 조합될 수 있다.
본원에 기술된 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 임상용 의약 및 제약 조성물로 제제화될 수 있고, 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트와 함께 조합될 수 있다. 제제는 적어도 부분적으로는 투여 경로에 의존하게 될 것이다. 적합한 제제는 멸균 매질 중 바이러스 및 억제제를 포함할 수 있다. 제제는 유체, 겔, 페이스트, 고체 형태일 수 있다. 제제는 대상체 또는 전문 의료진에게 제공될 수 있다.
바람직하게 치료 유효량이 투여된다. 이는 대상체게 유익한 도움을 주는 데 충분한 양이다. 실제 투여량 및 투여 시간 경로는 적어도 부분적으로는 암의 성질, 대상체의 병태, 전달 부위, 및 다른 인자에 의존하게 될 것이다.
본 발명의 추가의 다른 실시양태 범위 내에서, 종양용해성 바이러스는 다양한 방법에 의해, 예컨대, 종양내로, 정맥내로, 또는 종양의 외과적 수술 후에 투여될 수 있다.
본 발명은 본원에서 광범위하게 및 일반적으로 기술되었다. 일반 개시내용 에 포함되는 하위 종 및 하위속 그룹들도 각각 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 삭제되는 물질이 본원에서 구체적으로 언급되었는지 그 여부와 상관없이, 임의의 대상 물질을 속으로부터 제거한다는 것을 조건부로 또는 그러한 부정적 한정하에서 본 발명의 일반적인 설명을 포함한다.
하기는 본 개시내용의 추가의 예시적인 실시양태이다:
1) ICP34.5의 3' 비번역 영역에 적어도 2개의 miRNA 표적 서열을 갖는 적어도 하나의 ICP34.5 유전자를 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 관련된 실시양태 범위 내에서, 변형된 종양용해성 헤르페스 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스이며, 여기서 변형된 헤르페스 바이러스 게놈은 ICP34.5 유전자의 제1, 또는 제1 및 제2 카피에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 제공한다.
2) 실시양태 1에 있어서, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열이 동일한 miRNA에 대한 표적인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
3) 실시양태 1 또는 2에 있어서, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열이 mIR-122, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-132, mIR-133a, mIR133b, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, mIR-145, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, mIR216a, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 대한 표적인 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 통상, 최종 생성물인 것으로 더욱 빈번하게 발견되는 가닥은 miRNA로 지칭되고, 더 드물게 발견되는 파트너는 miRNA*로 지칭된다. 본 발명의 특정 실시양태 범위 내에서, 실시양태 1, 2, 또는 3에 따라, miRNA 표적 부위가 miR-124 및 miR-143에 대한 결합 부위의 카피를 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과로 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
4) 실시양태 1-3 중 어느 한 실시양태에서, 변형된 ICP27 또는 ICP4 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 변형은 5' UTR의 대체인 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 다른 실시양태 범위 내에서, ICP27, 또는, ICP4 유전자는 천연 프로모터의 대체에 의해 변형된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태 범위 내에서, ICP27는 천연 프로모터의 hCEA 프로모터, 또는 hCXCR4 프로모터에 의한 대체에 의해 변형된다.
5) 실시양태 1, 2, 3, 또는 4 중 어느 한 실시양태에서, 변형된 ICP27을 추가로 포함하고, 여기서 변형은 ICP27의 전체 프로모터-조절 영역의 대체인 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 상기의 추가 실시양태 범위 내에서, 단순 헤르페스 바이러스는 HSV-1이다. 실시양태 1, 2, 3, 또는 4 중 어느 한 실시양태의 추가의 또 다른 실시양태 범위 내에서, 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 당단백질 B (gB)를 코딩하는 유전자에 융합생성 돌연변이를 추가로 포함한다. 관련된 실시양태 범위 내에서, 당단백질 B (gB)를 코딩하는 유전자는 아미노산 876 다음에서 종결되는 당단백질 B 변이체를 코딩한다. 추가의 또 다른 실시양태 범위 내에서, 게놈이 당단백질 B (gB)를 코딩하는 변형된 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 변형된 유전자는 아미노산 876 다음에서 종결되는 당단백질 B 변이체를 코딩하는 것인, 실시양태 1, 2, 3, 또는 4 중 어느 한 실시양태에 따른 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 제공한다. 추가의 또 다른 실시양태 범위 내에서, 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 ICP6, ICP0, ICP4, ICP27, ICP47, ICP24, 및 ICP56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이러스 유전자 중 추가의 돌연변이 또는 변형을 포함한다. 특정 바람직한 실시양태 범위 내에서, 추가의 돌연변이 또는 변형은 바이러스 유전자의 비-코딩 영역 중에 존재한다.
6) 실시양태 1, 2, 3, 4, 또는 5 중 어느 한 실시양태에서, 적어도 하나의 면역자극성 인자를 코딩하는 유전자 서열을 추가로 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 대표적인 면역자극성 인자로는 IL12, IL15, IL15 수용체 알파 서브유닛, OX40L, 및 PD-L1 차단제를 포함한다.
7) 실시양태 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 어느 한 실시양태에서, 면역 자극 인자, 또는 체크포인트 차단 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 추가로 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 실시양태 1, 2, 3, 4, 또는 5의 추가 측면 범위 내에서, 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 면역자극성 인자, 항체, 및 체크포인트 차단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함한다. 관련된 실시양태 범위 내에서, 적어도 하나의 핵산은 종양-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
8) 실시양태 1-7 중 어느 한 실시양태의 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법. 특히 바람직한, 치료하고자 하는 암으로는 폐 종양, 유방 종양 및 전립선 종양, 교모세포종, 위장관 (및 연관 기관)의 종양, 예컨대, 식도 종양, 담관암종, 항문 종양, 위 종양, 장 종양, 췌장 종양, 결장 종양 및 간 종양, 및 모든 표면 주사가능한 종양 (예컨대, 흑색종)을 포함한다.
하기는 본 발명의 추가의 또 다른 실시양태이다:
9) 변형된 종양용해성 헤르페스 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스이며, 여기서 변형된 헤르페스 바이러스 게놈은 ICP34.5 유전자의 제1, 또는 제1 및 제2 카피에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 바람직한 실시양태 범위 내에서, 단순 헤르페스 바이러스는 종양 세포와 비교하여 비형질전환된 세포에서 기능성 ICP34.5 단백질을 유의적으로 감소된 수준으로 생산한다.
10) 실시양태 9에 있어서, ICP34.5 유전자의 제2 카피가 불활성화 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
11) 실시양태 9에 있어서, ICP34.5 유전자의 제1, 또는 제1 및 제2 카피에 작동가능하게 연결된 2 내지 10개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
12) 실시양태 10 또는 11에 있어서, ICP34.5 유전자의 제1, 또는 제1 및 제2 카피에 작동가능하게 연결된 2개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
13) 실시양태 10 또는 11에 있어서, miRNA 표적 서열이 ICP34.5 유전자의 제1, 또는 제1 및 제2 카피의 3' 비번역 영역 내로 삽입되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
14) 실시양태 13에 있어서, miRNA 표적 서열이 직렬로 3' 비번역 영역 내로 삽입되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
15) 실시양태 10 또는 11에 있어서, 2 내지 10개의 miRNA 표적 서열이 단일 miRNA에 결합하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
16) 실시양태 10 또는 11에 있어서, 2 내지 10개의 miRNA 표적 서열이 적어도 2개의 상이한 miRNA에 결합하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
17) 실시양태 15 또는 16에 있어서, miRNA가 mIR-122, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-132, mIR-133a, mIR133b, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, mIR-145, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, mIR216a, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 통상, 최종 생성물인 것으로 더욱 빈번하게 발견되는 가닥은 miRNA로 지칭되고, 더 드물게 발견되는 파트너는 miRNA*로 지칭된다.
18) 실시양태 17에 있어서, miRNA 표적 부위가 miR-124 및 miR-143에 대한 결합 부위의 카피를 5개 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
19) 실시양태 9에 있어서, 종양용해성 헤르페스 바이러스가 HSV-1인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
20) 실시양태 9에 있어서, 변형된 헤르페스 바이러스 게놈이 ICP6, ICP0, ICP4, ICP27, ICP47, ICP 24, 및 ICP56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이러스 유전자 중 추가의 돌연변이 또는 변형을 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 바람직한 실시양태 범위 내에서, 코딩 서열은 무손상 상태 그대로 유지되고, 상기 바이러스 유전자는 천연 프로모터를 종양-특이적 프로모터로 대체시킴으로써 변형된다.
21) 실시양태 20에 있어서, 추가의 돌연변이 또는 변형이 바이러스의 병독성 또는 그의 복제 능력에 영향을 주는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
22) 실시양태 20에 있어서, 돌연변이화된 또는 변형된 바이러스 유전자가 ICP4 및/또는 ICP27인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
23) 실시양태 22에 있어서, 돌연변이 또는 변형이 ICP4 및 ICP27 유전자의 외인성 5' 비번역 영역에의 작동가능한 연결을 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
24) 실시양태 23에 있어서, 변형된 ICP27 또는 ICP4 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 변형이 5' UTR의 대체인, 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
25) 실시양태 22에 있어서, 변형된 ICP27을 추가로 포함하고, 여기서 변형이 ICP27의 전체 프로모터-조절 영역의 대체인, 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 특정 실시양태 범위 내에서, ICP27 프로모터는 hCEA 또는 hCXCR4 프로모터로 대체된다. 특정 실시양태 범위 내에서, 프로모터 영역의 일부만이 대체되고, 천연 5' UTR은 유지된다.
26) 실시양태 25에 있어서, 면역자극성 인자, 항체, 및 체크포인트 차단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 핵산은 종양-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
27) 실시양태 26에 있어서, 비-바이러스 단백질이 IL12, IL15, IL15 수용체 알파 서브유닛, OX40L, 및 PD-L1 차단제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
28) 실시양태 1 내지 27 중 어느 한 실시양태에서, C-말단 R-펩티드가 결핍된 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 env 단백질의 융합생성 변이체를 코딩하는 핵산 서열 및 임의적으로, HSV-1 티미딘 키나제를 코딩하는 핵산을 갖는 발현 카세트를 추가로 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 다른 실시양태 범위 내에서, HSV-1 당단백질 B의 융합생성 형태를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 발현 카세트를 포함하는, 실시양태 1 내지 27 중 어느 한 실시양태에 따른 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 제공한다. 특정 바람직한 실시양태 범위 내에서, 당단백질 B는 말단절단된 것일 수 있다 (예컨대, 결실이 gB의 아미노산 876 다음에서 발생).
29) 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 내부 또는 말단 반복 영역이 결실된 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스. 추가의 특정 실시양태 범위 내에서, 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태의 재조합 헤르페스 바이러스는 ICP34.5의 3' UTR 중에 5x miR-124 및 5x miR-143 결합 부위를 갖고, 여기서 말단 반복부는 결실되어 있다 (이는 또한 ICP0, ICP4, 및 ICP34.5의 제2 카피를 결실시킨다).
30) 치료 유효량의 상기 실시양태 1 내지 29 중 어느 한 실시양태의 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 제공하는 단계를 포함하는, 종양 세포를 용해시키는 방법.
31) 상기 실시양태 1 내지 29 중 어느 한 실시양태의 재조합 단순 헤르페스 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물.
32) 치료 유효량의 실시양태 31의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 환자에서 암을 치료하는 방법. 특히 바람직한, 치료하고자 하는 암으로는 폐 종양, 유방 종양 및 전립선 종양, 교모세포종, 위장관 (및 연관 기관)의 종양, 예컨대, 식도 종양, 담관암종, 항문 종양, 위 종양, 장 종양, 췌장 종양, 결장 종양 및 간 종양, 및 모든 표면 주사가능한 종양 (예컨대, 흑색종)을 포함한다.
실시예
실시예 1
정상 마우스 뇌 및 인간 뇌 종양 U87에서의 Hsv-1 즉시 초기 유전자 발현
본 실시예에서, 마이크로RNA-조절 바이러스 주사 후 24시간째에 정상 마우스 뇌 및 인간 뇌 종양 U87 사이의 HSV-1 즉시 초기 유전자 발현을 비교하였다. 종양이 없는 누드 마우스 5마리 및 두개강 내에 인간 U87 뇌 종양을 보유하는 누드 마우스 5마리에 총 1x10^6 PFU/마우스의 CXCR4-miR 바이러스 또는 대조군 CXCR4 바이러스를 두개내로 1회 주사하였다. ICP34.5의 3' UTR 내에 직렬로 5개의 miR-124/143 결합 부위를 삽입할 뿐만 아니라, 바이러스 ICP27 유전자를 변형시켜 천연 ICP27 프로모터-조절 영역이 종양-특이적 CXCR4 프로모터로 대체되도록 CXCR4-miR 바이러스를 조작한다. 구축물은 또한 분비가능한 IL12/IL15/IL15RA에 대한 발현 카세트, 및 PD-1의 PD-L1에의 결합을 억제시키는 분비가능한 펩티드에 대한 발현 카세트도 포함한다. CXCR4 바이러스는 마이크로RNA 결합 부위가 결핍된 야생형 ICP34.5 유전자를 함유하지만, CXCR4-miR 바이러스와 동일하다.
감염 후 24 h째에 RT-qPCR을 이용하여 정상 뇌 조직에서 및 종양 조직에서의 바이러스 즉시 초기 유전자 ICP27, ICP4, 및 ICP47의 발현을 측정하였다. CXCR4 바이러스에서의 유전자 발현과 비교하여 CXCR4-miR 바이러스 경우에서의 유전자 발현 수준의 변화를 결정하였다. 정규화를 위해 액틴 발현을 사용하였다. 조정된 p-값을 본페로니-시닥(Bonferroni-Sidak) 방법을 이용하여 컴퓨팅하였다.
도 3은 CXCR4-miR 바이러스로 처리된 마우스가 종양 내에서는 고수준의 바이러스 유전자 발현을 유지하면서, 정상 뇌 조직에서는 시험된 바이러스 유전자 모두 발현이 고도로 유의적으로 (p < 0.01) 감소된 것으로 나타났다는 것을 보여주는 것이다. 이 결과는 miRNA-의존성 방식의, ICP34.5 유전자 발현 하향조절이 뇌 종양 조직 대비 정상 뇌 조직에서 HSV-1 복제를 감소시킨다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 2
뉴런 및 종양 세포에서의 ICP34.5의 발현
본 실시예는 CXCR4-miR 바이러스 또는 대조군 CXCR4 바이러스 감염 후의 뉴런 및 종양 세포에서의 ICP34.5 단백질의 발현을 보여주는 것이다. 마우스 뉴런 세포, LNCap 세포, 및 A549 세포를 CXCR4-miR 바이러스 또는 CXCR4 바이러스로 처리하였다. 감염 후 16 hr째, 세포를 펠릿화하고, 둘베코스 포스페이트 완충제 염수 (PBS)로 세척하고, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 RIPA 완충제 (10 mM 트리스(Tris)-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1% 트리톤(Triton) X-100, 0.1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 140 mM NaCl) 중에서 40분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시킴으로써 용해시켰다. 이어서, 용해물을 4℃에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리고, 상청액을 수집하였다.
웨스턴 블롯 분석에 의해 각 샘플 중 ICP34.5 단백질 수준을 결정하였다. BSA 검정법에 의해 전체 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 용해물 (30-40 ㎍)을 4x SDS 로딩 염료와 혼합한 후, 95℃에서 10분 동안 가열하였다. 이어서, 샘플을 로딩하고, 10% SDS-PAGE에서 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이어서, 막을 5% BSA를 포함하는, 트리스-완충처리된 염수 + 트윈(Tween) 20 (TBST) 중 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 차단된 막을 항-ICP34.5 또는 β-액틴 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 3 x 10분 동안 TBST로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 상응하는 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. TBST로 3회에 걸쳐 10분씩 세척한 후, 막을 1분 동안 증강 화학발광 (ECL) 시약과 함께 인큐베이션시킨 후, BIO-RAD ChemiDoc XRS+ 영상화 시스템에서 노출시켰다. 이미지J(ImageJ)를 이용하여 밴드 강도를 정량화하였다.
도 4에는 웨스턴 블롯의 결과가 제시되어 있다. "miRNA"로 표지된 행은 세포가 ICP34.5 유전자의 3' UTR에 miRNA 결합 요소를 포함 (+)하거나, 또는 그가 결핍된 (-) 바이러스로 감염되었다는 것을 나타낸다. ICP34.5 발현은 miRNA 결합 요소를 함유하는 바이러스로 감염된 뉴런 세포에서 더 낮은 것으로 나타났다. 그에 반해, 종양 세포에서, 발현은 miRNA 결합 요소를 포함하거나, 그가 결핍된 바이러스 구축물로 감염된 세포에서 유사하였다.
실시예 3
마이크로RNA-기반 종양용해성 바이러스 플랫폼
본 실시예는 일부 예시적인 조작된 바이러스 게놈을 갖는 마이크로RNA-기반 종양용해성 바이러스 플랫폼을 제시한다. 플랫폼은 본원에서 "전사 및 번역 이중-조절" (TTDR)로 지칭된다. 기본 플랫폼 HSV-1-기반 벡터는 도 5에 도시되어 있다. 플랫폼 HSV-1 바이러스의 중요한 특징은 ICP34.5 유전자의 3'-UTR에 miR-124 및 miR-143에 대한 결합 부위의 카피 5개를 삽입함으로써 이루어지는 ICP34.5 유전자의 번역 제어이다. 플랫폼 바이러스 벡터의 중요한 요소는 또한 종양-특이적 프로모터를 이용하는, 바이러스 복제에 필수적인 유전자인 ICP27 유전자의 전사 제어를 포함할 수 있다.
균주 17, 균주 KOS, 균주 F, 균주 McKrae 등을 비롯한, 매우 다양한 HSV-1 균주가 재조합 종양용해성 바이러스 구축을 위한 백본으로서 사용될 수 있다. 모든 바이러스 돌연변이유발법은 박테리아 인공 염색체 (BAC)로 클로닝된 HSV-1 게놈에서 실행되는 표준 람다 Red-매개 재조합 기술을 이용하여 에스케리키아 콜라이에서 수행될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Tischer BK, Smith GA, Osterrieder N. Methods Mol Biol. 2010;634:421-30. doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30. PMID: 20677001]; [Tischer BK, von Einem J, Kaufer B, and Osterrieder N., BioTechniques 40:191-197, Feb. 2006] ((Supplementary Material, doi: 10.2144/000112096) 포함); 및 [Tischer BK, Smith, GA and Osterrieder N. Chapter 30, Jeff Braman (ed.), In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 634, doi: 10.1007/978-1-60761-652-8_30, Springer Sceince+Business Media, LLC 2010] 참조).
종양-특이적 프로모터는 또한 항-종양 면역 반응을 증강시키는 면역조정인자 IL12/IL15/IL15RA를 코딩하는 카세트의 발현을 구동시키는 데에도 사용될 수 있다. 면역조정인자 발현 카세트는 hCEA, hCXCR4, 또는 PSA 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 바이러스 유전자 발현 및 복제에 어떤 부정적 영향도 미치지 않는 위치에, 예컨대, 바이러스 유전자 US1/US2, UL3/UL4 및/또는 UL50/UL51 사이에 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 다양한 마우스 모델에서의 생체내 시험을 촉진시키기 위해, 인간 IL12 대신 뮤린 IL12를 발현하는 다른 재조합 바이러스를 구축할 수 있다. 인간 IL15는 마우스 세포에서의 그의 활성에 기인하여 마우스-특이적 종양용해성 바이러스에 유지될 수 있다.
벡터는 바이러스 세포독성을 증진시키는, C-말단 R-펩티드가 결핍된 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GALV) env 단백질의 융합생성 형태를 코딩하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트는 융합생성 형태의 당단백질 B (예컨대, 말단절단된 gB 876t)를 코딩할 수 있다. 카세트는 바이러스 유전자 발현 및 복제에 어떤 부정적 영향도 미치지 않는 위치에, 예컨대, 바이러스 유전자 US1/US2, UL3/UL4 및/또는 UL50/UL51 사이에 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다.
바이러스 벡터는 또한 바이러스 유전자 US1/US2, UL3/UL4 및/또는 UL50/UL51 사이에 삽입된 HSV-1 티미딘 키나제 (TK) 유전자에 대한 발현 카세트를 포함할 수 있다. E. 콜라이에서의 돌연변이유발을 촉진시키기 위해 바이러스 게놈 내로 BAC 서열이 삽입된다면, 천연 TK 유전자는 파괴된다. 외인성 TK 유전자의 존재는 바이러스를 구아노신 유사체, 예컨대, 간시클로비어 및 아시클로비어를 이용하는 일반 치료에 대해 감수성을 나타내도록 만듦으로써 바이러스 안전성을 증진시킨다.
중요한 HSV-1 전사 조절인자 ICP27의 발현을 구동시키는 프로모터는 종양-특이적 프로모터, 예컨대, hCEA, hCXCR4, PSA, 또는 프로바신 (ARR2PB)으로 대체될 수 있다. 신경병독성 인자 ICP34.5를 코딩하는 바이러스 유전자의 3' UTR은 또한 ICP34.5의 생산을 폐기하기 위하여 상응하는 마이크로RNA를 고수준으로 함유하는 조직에 마이크로RNA 인식 요소의 다중 카피를 삽입함으로써 변형될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, miR-124 인식 요소 카피 5개 및 miR-143 인식 요소 카피 5개가 직렬로 ICP34.5의 3' UTR 내로 삽입될 수 있다.
바이러스 게놈의 말단 반복 영역은 전체 게놈 크기를 축소시키고, 트랜스진 삽입을 위해 더 많은 공간을 생성하기 위해 완전히 결실될 수 있고; 결실된 TR은 보통은 말단 반복부의 일부인, ICP47 유전자의 천연 프로모터 파괴를 막도록 조작된다. 본원에서 논의되는 예시적인 요소에 관한 추가의 세부 사항은 도 6에 예시되어 있다.
생성된 재조합 바이러스를 퀴아젠 하이스피드 미디프렙 키트(Qiagen HiSpeed MidiPrep Kit)를 이용하여 단리시키고, 예컨대, 리포펙트아민(Lipofectamine) 2000을 사용하여 Vero 세포로 형질감염시켜 바이러스를 회수할 수 있다. 변형된 영역 모두에 대한 표적화된 서열분석 및 제한 프로파일링을 사용하여 게놈 완전성을 확인할 수 있다. 연속 계대배양하고, 트랜스진 발현을 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의해 주기적으로 확인함으로써 최종 재조합 바이러스의 안정성을 확인할 수 있다.
본 플랫폼에 대한 5개의 예시적인 실시양태가 하기 표에 기술되어 있다. 폐암 (또는 상피 세포 기원의 다른 암, 예컨대, 신장암, 및 유방암), 및 치료용으로 사용될 수 있도록 2개의 바이러스 및 전립선암 치료용으로 3개를 조작하였다.
실시예 4
ICP34.5 발현의 마이크로RNA-매개 조절이 생체내에서 신경병독성을 감소시킨다.
마우스에, 5개의 miR-124 및 miR-143 요소가 ICP34.5a 유전자의 3' UTR 내로 삽입되어 있는 CXCR4-TF-Fc-h1215-miR 바이러스, 또는 상기 삽입이 없는 대조군 CXCR4-TF-Fc-h1215 바이러스를 단일 용량 (5x10^7 PFU/mL)으로 두개내로 주사하였다. 두 바이러스 구축물 모두 CXCR4 프로모터-구동 ICP27 유전자, UL3과 UL4 사이에 삽입된 TF+Fc PD-L1 차단제 발현 카세트, 및 인간 IL12, IL15, 및 IL15 수용체 알파 서브유닛을 발현하는 카세트로 대체된 말단 반복 영역을 포함한다.
감염 후, 뮤린 뇌 절편을 토끼 폴리클로날 항-HSV 1차 항체 및 알렉사플루오르(AlexaFluor) 488에 접합된 래트 항-토끼 2차 항체로 염색하여 HSV-1 감염 정도를 시각화하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, miR-제어된 ICP34.5를 함유하는 바이러스로 감염된 마우스는 오직 바늘 경로를 따라서만 검출가능한 바이러스를 보인 반면, 야생형 ICP34.5를 함유하는 바이러스는 뇌 전역에 걸쳐 광범위하게 파종되어 있었다.
실시예 5
VG182LF 바이러스는 시험관내에서 폐암 세포를 선택적으로 사멸시킨다.
폐암 세포 (A549) 또는 정상 폐 세포 (BEAS-2b 및 HPL1D)를 MOI를 증가시키면서 VG182LF 바이러스와 함께 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 감염 후, MTT 검정법을 이용하여 세포 생존능을 측정하였다. 도 8a 및 8b에 제시된 바와 같이, VG182LF 바이러스는 용량에 의존하는 방식으로 정상 폐 세포 대비 폐암 세포 사멸 증가를 나타낸다.
하기 표는 각 세포주에 대해 결정된 IC50 값을 제공하고, 폐암 세포주, A549와 비교하여 정상 폐 세포 HPL1D 및 BEAS-2b는 IC50이 각각 6.54배 및 18.93배 증가하였음을 보여주고 있다.
이러한 데이터는 종양 세포 사멸 증가가 ICP34.5 유전자 발현의 마이크로RNA 제어 및 ICP27 유전자 및 IL12/IL15/IL15RA 유전자의 발현을 구동시키는 종양-특이적 프로모터의 사용과 연관이 있다는 것을 시사한다.
추가 폐암 세포주를 이용하여 본 실험을 반복하였다. 도 8c에 제시된 바와 같이, VG182LF 바이러스는 매우 다양한 상업적으로 이용가능한 폐암 세포를 효율적으로 사멸시켰다. 각 세포주에 대한 IC50 산출값이 하기 표에 기재되어 있다.
실시예 6
VG182LF는 시험관내 폐암 세포에서 선택적으로 복제된다.
폐암 세포 (A549) 및 정상 폐 세포 (BEAS-2b)를 상이한 시점에 MOI 0.1로 VG182LF 바이러스로 처리하였다. 감염 후, 바이러스를 수거하고, Vero 세포에서 역가를 측정하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, VG182LF 바이러스는 폐암 세포에서는 성공적으로 복제되었지만, 정상 폐 세포에서는 복제되지 못했다. 시점 48시간째에 A549 폐암 세포로부터 6x106 초과의 바이러스 입자인 역가를 수득하였고; 반면, BEAS-2b 정상 폐 세포로부터는 유의적인 바이러스를 수득하지 못했고, 이는 ICP34.5의 마이크로RNA 제어, 및 ICP27, 및 IL12/IL15/IL15RA의 발현을 구동시키는 종양-특이적 프로모터의 사용이 정상 세포에서는 바이러스 복제에 부정적인 영향을 미치는 반면, 종양 세포에서는 바이러스 복제를 촉진시킨다는 것을 시사한다.
A549 폐 종양 세포 또는 LNCaP 전립선 종양 세포에서의 VG182LF 바이러스의 복제를 연구하였다. 간략하면, 세포를 12 또는 24시간 동안 VG161 (대조군) 또는 VG182LF 바이러스로 감염시켰다. 이어서, 세포를 수거하고, 세포내로 항-인간 IL-12p70 항체를 이용하여 염색하였다. 인간 IL-12 양성 세포를 유세포 분석법으로 검출하였고, 인간 IL-12의 증가 배수를 산출하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, 인간 IL-12 발현 증가는 바이러스 복제 증진과 직접적인 상관관계가 있다.
다양한 상이한 폐암 세포주에서 VG182LF 바이러스의 복제 능력을 평가하였다. 폐암 세포주 H1975, PC9 및 H460으로부터의 세포를 MOI 0.1로 VG182LF 바이러스로 처리하고, 감염 후 0, 6, 24, 및 48시간째에 상청액을 수거하였다. Vero 세포에서 각 샘플로부터 바이러스 역가를 측정하였다. 본 실험으로부터의 데이터는 도 11a-c에 제시되어 있고, 여기서 역가 값은 3회의 생물학적 반복 실험의 평균을 나타낸다. 본 데이터는 감염 후 48째에 바이러스는 각 폐암 세포주에서 유의적인 수준으로 복제될 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 7
H1975 폐암 모델에서의 VG182LF 생체내 항-종양 효능.
H1975 종양을 보유하는 누드 마우스를 이식 후 1주째에 VG182LF로 처리하였다. 5.65x10^7 PFU/마우스의 VG182LF를 2일 간격으로 3회에 걸쳐 주사하였다. 비히클 처리된 마우스는 인간 종점에 도달하였고, 처리 개시 후 12일째 희생시켰다. 도 12에 제시된 바와 같이, VG182LF 바이러스로 처리된 마우스는 비히클 처리된 대조군과 비교하여 현저히 감소된 종양 성장을 보였고, 처리 개시 후 29일째까지 여전히 생존해 있었다.
실시예 8
배양물 중 형질감염된 세포에서의 ICP34.5 발현의 miR-매개 제어.
HSV-1 단백질 ICP34.5는 뉴런에서 효과적인 바이러스 복제를 위해 요구되지만, 배양물 중 비-뉴런 세포에서, 예컨대, 293FT 세포에서의 복제를 위해서는 대개 불필요하다. 본 실시예에서, miR-143이 293FT 세포에서 ICP34.5의 발현을 억제시킬 수 있는 능력을 평가하였다.
세포를 먼저 0일째 miR-143으로 형질감염시켰다. 대조군으로서, 293FT 세포를 스크램블드 miR로 형질감염시키거나, 또는 형질감염시키지 않았다. 형질감염 후 20시간째, 세포를 세척한 후, gB의 카르복실 말단에의 융합생성 돌연변이 (gB-876t)와 함께 ICP34.5의 3' UTR에 miR-143 및 miR-124에 대한 결합 부위를 코딩하는 재조합 종양용해성 HSV-1 (MOI=1)로 감염시켰다. 유전자 발현 및 형질감염 효율을 측정하기 위한 RNA 단리를 위해 감염 후 6시간째 및 바이러스 복제를 측정하기 위한 DNA 단리를 위해 감염 후 0시간 및 24시간째, 이 두 시점 모두에 세포를 수거하였다.
도 14a에 제시된 바와 같이, miR-143으로 형질감염된 세포에서 RT-qPCR에 의해 감염 후 6시간째 고수준의 miR-143이 검출된 반면, 비-형질감염된 세포 및 스크램블드 miR로 형질감염된 세포는 무시해도 될 정도의 수준으로 miR-143을 나타내었다. 도 14b에 제시된 바와 같이, RT-qPCR에 의해 감염 후 6시간째 평가된 바이러스 유전자 발현은 앞서 miR-143으로 형질감염된 샘플에서 ICP34.5 발현의 유의적인 감소를 보인 반면, miR 결합 부위를 함유하지 않는 또 다른 바이러스 유전자 (ICP27)의 경우, 유사한 감소가 관찰되지 않았다. ICP27 카피 측정을 위해 qPCR을 사용함으로써 감염 후 24시간째 바이러스 복제를 정량화하였고, 여기서 각 카피는 별개의 바이러스 게놈에 상응하는 것이다. 도 14c에 제시된 바와 같이, miR-143으로 또는 스크램블드 miR로 형질감염된 샘플과 비교하였을 때, 바이러스 복제 수준은 유의적으로 상이하지는 않았는데, 이는 miR-143으로 형질감염된 샘플에서 관찰된 ICP34.5 발현의 극적 감소는 바이러스 카피수 감소에 기인하는 것이 아니었다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 9
ICP34.5의 miR 조절은 신경병독성을 차단함으로써 안전성을 개선시킨다.
본 실시예에서, DBA/2 마우스 (각 군당 N=3)에 비히클 대조군, 야생형 HSV-1, ICP34.5가 결실되고, 융합 돌연변이는 없는 VG161 바이러스 변이체를, 또는 gB의 카르복실 말단에 융합생성 돌연변이 (gB-876t)와 함께 ICP34.5의 3' UTR에 miR-143 및 miR-124에 대한 결합 부위를 코딩하는 VG301 바이러스 변이체를 피하로 주사하였다. HSV-1 면역염색을 위해 주사 후 6일째 샘플을 수거하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, 야생형 HSV-1를 주사한 마우스의 뇌 및 척수, 둘 모두에서 강건한 바이러스 복제 패턴이 관찰되었다. 그에 반해, VG161 또는 VG301 변이체를 주사한 마우스의 뉴런 조직에서는 어떤 바이러스 복제도 관찰되지 않았고, 이는 ICP34.5의 miR 조절이 신경병독성을 막는 데 있어 ICP34.5를 완전히 결실시키는 것만큼 효과적이라는 것을 시사하는 것이다.
도 16에 제시된 바와 같이, 야생형 HSV-1을 주사한 나머지 마우스에서는 신경학적 증상이 빠르게 발생하였고, 안락사시켜야 했던 반면, VG161 또는 VG301 변이체로 처리된 남은 마우스는 모두 실험이 진행되는 전 기간 동안 건강한 상태 그대로 유지되었다. 이러한 결과는 OV-유도성 신경병독성을 막기 위해 ICP34.5의 miR 조절을 사용하는 것의 안전성 및 효능을 입증하는 추가 증거를 제공한다. 추가로, VG301에서 융합생성 돌연변이가 이환율 또는 사망률을 증가시키지 않는다고 결론지을 수 있다.
실시예 10
종양용해성 HSV-1에서의 융합생성 돌연변이 평가
본 실시예에서, A549wt 및 BPH1 세포를 gB의 카르복실 말단에서 융합생성 돌연변이를 코딩하는 (+ gB-876t) 재조합 종양용해성 HSV-1로 감염시켰다. 대조군으로서, A549wt 및 BPH1 세포를 융합생성 돌연변이가 결핍된 (- gB-876t) HSV-1로 감염시켰다. 감염 후 48시간째, 세포를 고정시키고, 세포를 고정시키고, 바이러스 플라크, 및 바이러스 유도 세포 융합으로부터 생성된 융합체를 시각화하기 위해 김사 염색하였다. 도 17에 제시된 바와 같이, 융합생성 돌연변이를 보유하는 바이러스로 감염된 세포에서 대량의 세포-대-세포 융합이 관찰된 반면, 융합생성 돌연변이가 결핍된 바이러스로 감염된 세포에서 최소의 융합이 분명하게 나타났다.
본 발명은 본원에서 광범위하게 및 일반적으로 기술되었다. 일반 개시내용 에 포함되는 하위 종 및 하위속 그룹들도 각각 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 삭제되는 물질이 본원에서 구체적으로 언급되었는지 그 여부와 상관없이, 임의의 대상 물질을 속으로부터 제거한다는 것을 조건부로 또는 그러한 부정적 한정하에서 본 발명의 일반적인 설명을 포함한다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함하고, "X 및/또는 Y"는 "X" 또는 "Y", 또는 그 둘 모두 "X" 및 "Y"를 의미하고, 명사 다음의 문자 "들"은 상기 명사의 복수 형태 및 단수 형태, 그 둘 모두를 지정한다는 것 또한 이해하여야 한다. 추가로, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹으로 기술될 때, 본 발명은 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 및 구성원의 임의의 서브군을 포함하고, 또한 이로써, 그에 의해 기술되는 것으로 의도되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 내용을 인지할 것이며, 출원인은 출원 또는 청구범위를 수정하여 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 임의의 서브군을 구체적으로 지칭할 수 있는 권리를 갖는다.
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 그의 통상적인 의미를 제공하는 것임을 추가로 이해하여야 한다.
본 명세서 전역에 걸쳐 "한 실시양태" 또는 "실시양태" 및 그의 변형의 것을 언급하는 것은 실시양태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전역에 걸쳐 다양한 곳에서 "한 실시양태에서 "또는 "실시양태에서"라는 어구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 추가로, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"라는 단수 형태는 내용상 및 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급 대상, 즉, 하나 이상의 것을 포함한다. "및" 및 "또는"이라는 접속어는 일반적으로 내용상 및 문맥상 경우에 따라 포괄적으로 또는 배타적으로 명확하게 지시되지 않는 한, "및/또는"을 포함하는 것으로 가장 광범위한 의미로 사용된다는 점에도 주의하여야 한다. 따라서, 대안 (예컨대, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 그 둘 모두, 또는 그의 임의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 본원에서 "및/또는"으로 언급될 때, "및" 및 "또는"의 구성은 연관된 항목 또는 아이디어 모두를 포함하는 실시양태 및 전체 연관된 항목 또는 아이디어보다는 더 적게 포함하는 하나 이상의 다른 대안적 실시양태를 포함하는 것으로 의도된다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 전역 및 하기 청구범위에서, "포함하다(comprise)"라는 단어 및 예컨대, "갖는다" 및 "포함하다(include)"와 같은 동의어 및 그의 변이형 뿐만 아니라, 예컨대, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은, 상기 단어의 어미 변형은 예컨대, "~을 포함하나, 이에 제한되지 않는"과 같은, 개방식의 포괄적인 의미로 해석되어야 한다. "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 용어는 청구범위의 범주를 언급된 물질 또는 단계로, 또는 청구된 발명의 기본적이고, 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 것으로 제한한다.
본 명세서 내에서 사용된 임의의 표제는 단지 독자의 검토를 촉진하기 위해서만 사용되며, 어떤 방식으로든 본 발명 또는 청구범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서, 본원에 제공된 본 개시내용의 표제 및 요약서는 단지 편의를 위한 것일 뿐이며, 실시양태의 범주 또는 의미를 해석하지 않는다.
본원에서 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 그 범위 및 언급된 그 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재 값의 상한 및 하한 사이의 각각의 개재하는 값은 하한 단위의 1/10까지도 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
예를 들어, 본원에 제공된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우, 그의 분수 (예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 예컨대, 중합체 서브 유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 관련하여 본원에 언급된 임의의 수치 범위는 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 명시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다.
본 명세서에서 언급되고/거나, 출원 정보 요약서(Application Data Sheet)에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 상기 문헌은 예를 들어, 기술된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 공개문헌에 기술된 물질 및 방법론을 기술하고, 공개할 목적으로 참조로 포함될 수 있다. 상기 및 본 명세서 전역에 걸쳐 논의된 공개문헌은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 임의의 참조된 공개문헌을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에서 참조 또는 언급된 모든 특허, 공개문헌, 과학 논문, 웹 사이트, 및 다른 문헌들은 본 발명과 관련된 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준을 나타내며, 상기 참조된 각각의 문헌 및 자료는, 마치 그 전문이 개별적으로 참조로 포함되거나, 또는 그 전문이 본원에 기술된 것과 같은 정도로 본원에서 참조로 포함된다. 출원인은 임의의 상기 특허, 공개문헌, 과학 논문, 웹 사이트, 전자적으로 이용가능한 정보 및 다른 참조된 자료 또는 문헌으로부터의 임의의 모든 자료 및 정보를 본 명세서에 물리적으로 포함시킬 수 있는 권리를 갖는다.
일반적으로, 하기 청구범위에서 사용되는 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시되는 특정 실시양태로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 상기 청구범위의 자격이 있는 전 범주의 등가물과 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
추가로, 본 특허의 서면으로 작성된 설명 부분은 모든 청구범위를 포함한다. 추가로, 모든 원본 청구범위 뿐만 아니라, 임의의 모든 우선권 문헌으로부터의 모든 청구범위를 비롯한, 모든 청구범위는 그 전문이 본원에서 참조로 본 명세서의 서면으로 작성된 설명 부분으로 포함되고, 출원인은 임의의 모든 상기 청구범위를 본 출원의 서면으로 작성된 설명 부분 또는 임의의 다른 부분으로 물리적으로 포함시킬 수 있는 권리를 갖는다. 따라서, 예를 들어, 어떠한 경우에도 본 특허는 본 특허의 서면으로 작성된 설명 부분의 이 말에서 청구범위의 정확한 표현이 기술되지 않았다는 주장으로, 이른바, 청구범위에 대해 서면으로 작성된 설명이 제공되지 않은 것으로 해석될 수 없다.
청구범위는 법에 따라 해석될 것이다. 그러나, 임의의 청구범위 또는 그의 일부를 해석하는 것이 용이하거나 어렵다고 주장되거나 인식된 경우에도 불구하고, 어떠한 경우에도 이러한 특허로 이어지는 출원 또는 출원들을 심사하는 동안 청구범위 또는 그의 임의의 일부를 조정 또는 수정하는 것이 선행 기술의 일부를 형성하지 않는 그의 임의의 모든 등가물에 대한 임의의 권리를 상실하는 것으로 해석될 수 없다.
다른 비제한적인 실시양태도 하기 청구범위 내에 있다. 특허는 본원에서 구체적으로 및/또는 명확하게 개시된 특정 예 또는 비제한적인 실시양태 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석되지 않을 수 있다. 특허청(Patent and Trademark Office)의 임의의 심사관 또는 임의의 다른 공무원 또는 직원의 진술이 구체적으로, 및 무조건부로 또는 유보 없이 명확하게 출원인에 의해 답변서에서 채택되지 않았다면, 어떠한 경우에도 상기 진술에 의해 특허가 제한되는 것으로 해석될 수 없다.
Claims (13)
- 변형된 종양용해성 헤르페스 바이러스 게놈을 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스이며, 여기서 변형된 헤르페스 바이러스 게놈은 ICP34.5 유전자의 제1, 또는 제1 및 제2 카피에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제1항에 있어서, miRNA가 mIR-122, miR-124, miR-124*, miR-127, miR-128, miR-129, miR-129*, miR-132, mIR-133a, mIR133b, miR-135b, miR-136, miR-136*, miR-137, miR-139-5p, miR-143, mIR-145, miR-154, miR-184, miR-188, miR-204, mIR216a, miR-299, miR-300-3p, miR-300-5p, miR-323, miR-329, miR-337, miR-335, miR-341, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-376a, miR-376a*, miR-376b-3p, miR-376b-5p, miR-376c, miR-377, miR-379, miR-379*, miR-382, miR-382*, miR-409-5p, miR-410, miR-411, miR-431, miR-433, miR-434, miR-451, miR-466b, miR-485, miR-495, miR-539, miR-541, miR-543*, miR-551b, miR-758, 및 miR-873으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제2항에 있어서, miRNA 표적 부위가 miR-124 및 miR-143에 대한 결합 부위의 카피를 5개 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제1항에 있어서, 종양용해성 헤르페스 바이러스가 HSV-1인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제4항에 있어서, 게놈이 당단백질 B (gB)를 코딩하는 유전자 중에 융합생성 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제5항에 있어서, 당단백질 B (gB)를 코딩하는 유전자가 아미노산 876 다음에서 종결되는 당단백질 B 변이체를 코딩하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제1항에 있어서, 변형된 종양용해성 헤르페스 바이러스 게놈이 ICP6, ICP0, ICP4, ICP27, ICP47, ICP24, 및 ICP56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이러스 유전자 중 추가의 돌연변이 또는 변형을 포함하는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제7항에 있어서, 상기 적어도 하나의 바이러스 유전자가 천연 프로모터의 대체에 의해 변형된 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제1항에 있어서, 면역자극성 인자 및 체크포인트 차단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 핵산은 종양-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 제9항에 있어서, 비-바이러스 단백질이 IL12, IL15, IL15 수용체 알파 서브유닛, OX40L, 및 PD-L1 차단제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 단순 헤르페스 바이러스.
- 치료 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단순 헤르페스 바이러스를 제공하는 단계를 포함하는, 종양 세포를 용해시키는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단순 헤르페스 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물.
- 치료 유효량의 제12항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
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