TW202113080A - 癌症治療劑 - Google Patents

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TW202113080A
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山本浩文
吳鑫
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日商癌症主幹技術股份有限公司
國立大學法人大阪大學
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Abstract

本發明之目的在於提供一種可有效治療癌症之癌症治療用核酸醫藥。 miR-4711-5p可抑制KLF5、TFDP1及MDM2的表現，其結果是，能有效抑制癌細胞之增殖、浸潤及遷移，誘導細胞自戕與G1阻滯(G1 arrest)，並進一步使幹細胞性降低。

Description

癌症治療劑
本發明有關一種癌症治療劑。更具體而言，本發明有關一種癌症治療劑，其可達致優異的抗腫瘤效果，且亦可使癌幹細胞的幹細胞性降低。
miRNA是由18~24個核苷酸構成的小RNA，且廣泛存在於真核生物中，已知在人類中存在著數千種miRNA。miRNA是在1993年首次報告出之內源性表現的短RNA。能從DNA轉錄出稱為pri-miRNA之具有環(loop)結構的RNA。環會被酵素切斷，製作出pre-miRNA。該pre-miRNA被輸送到核外，透過Dicer切出20~25個鹼基左右的miRNA序列。其會被納入稱為RNA誘導沉默複合物(RNA-induced silencing complex，RISC)之核糖核酸與Argonoute蛋白的複合物中並形成miRNA-RISC複合物，與mRNA之3'UTR結合而抑制基因表現。由於miRNA與mRNA之結合並不完全，因此標的基因不會限於1個，可將複數個基因作為標的進行調控這一點是重要的特徵。又，miRNA在活體內基因表現之調控上扮演重要的角色，且亦已知，miRNA調控系統之異常與許多疾病之原因、進展有關。特別是，針對與癌症之發病、進展顯示出關聯性的miRNA已獲諸多闡明，並且作為癌症治療用核酸醫藥的幫手而受到了注目。
另一方面，癌細胞具有自我增殖能力，而具有所謂能夠侵潤至周邊組織、轉移到遠處組織的特性。然而，已知，並非在形成癌組織的所有癌細胞上都具備該等特性，會使癌症發病、使癌症進行的癌細胞，是即便在癌細胞之中亦僅存在極少的癌幹細胞。癌幹細胞與正常幹細胞一樣，表現出未分化的表面性質，具有自我複製能力與分化能力，並且具有在構成癌組織之多樣的分化階段中產生所有癌細胞的特性。亦即，可認為癌幹細胞是一個源頭，其透過在癌組織中自我複製以維持與自身相同的細胞，同時，透過分化而生出大多數的癌細胞。因此可認為，將癌幹細胞本身設為治療對象可導向癌症的根治。
又，KLF5是鋅指轉錄因子之KLF家族之1者。已知，KLF5在正常腸道的隱窩中會強烈表現，然在癌症部位會廣泛表現並增強Wnt/Catnb訊息傳遞，藉此促進癌細胞的增殖(非專利文獻1)。又，還有報導指出，在Lgr5陽性細胞、小鼠中，若使Klf5缺失時，則不會形成腫瘤(非專利文獻1)。
[先行技術文獻] 非專利文獻 [非專利文獻1]Takeo Nakaya et al., Cancer Res; 74(10) May 15, 2014
[發明欲解決之課題] 如前述，KLF5是癌化所必需之要素，且已暗示與癌幹細胞之關聯，然以往並未發現可結合至KLF5並有效治療癌症的miRNA。又，如試驗例2所示，即便是可結合KLF5的miRNA，不顯示出對癌細胞增殖效果者是存在多數。在如此狀況下，本發明之目的在於提供一種可有效治療癌症之癌症治療用核酸醫藥。
[用以解決課題之手段] 本案發明人等為了解決前述問題進行精心探討而判斷出miR-4711-5p具有以下特性：其不僅會結合到與癌化有關之KLF5的mRNA，還會結合到在細胞週期從G1期移行至S期上重要之TFDP1的mRNA。進一步，亦確認到，miR-4711-5p會抑制MDM2之表現，而該MDM2會抑制對細胞之細胞自戕、細胞週期之調控重要的p53。發現，miR-4711-5p可抑制KLF5、TFDP1及MEM2的表現，其結果是，能有效抑制癌細胞之增殖、浸潤及遷移，將細胞留在G1期，並進一步可誘導癌細胞之細胞自戕。還發現，miR-4711-5p具有使癌幹細胞之幹細胞性降低的作用，對抑制癌幹細胞的之增殖是有效的。本發明是基於該等知識，並進一步經由一再探討而完成者。
亦即，本發明提供下揭態樣之發明。 項1. 一種癌症治療劑，含有miR-4711-5p作為有效成分。 項2. 如項1之癌症治療劑，其中miR-4711-5p是成熟型miRNA、pri-miRNA或pre-miRNA。 項3. 如項1或2之癌症治療劑，其中miR-4711-5p複合化於碳酸磷灰石粒子。 項4. 一種癌幹細胞之增殖抑制劑，含有miR-4711-5p作為有效成分。 項5. 一種miR-4711-5p用以製造癌症治療劑之用途。 項6. 一種miR-4711-5p，使用在用以治療癌症之處置。 項7. 一種癌症之治療方法，是對癌症患者投予治療有效量之miR-4711-5p。 項8. 一種miR-4711-5p用以製造癌幹細胞之增殖抑制劑之用途。 項9. 一種miR-4711-5p，使用在用以抑制癌幹細胞之增殖的處置。 項10. 一種癌幹細胞之增殖抑制方法，是對癌症患者投予治療有效量之miR-4711-5p，以抑制癌幹細胞之增殖。
[發明效果] 本發明之癌症治療劑不僅會與和癌幹細胞有關之KLF5的mRNA結合，亦會與使細胞週期從G1期移行至S期上必要之TFDP1、進行抑制p53之MDM2的mRNA結合，而可達致優異的抗腫瘤效果，抑制癌細胞之增殖、浸潤及遷移，進一步可有效誘導癌細胞之細胞自戕。又，由於本發明之癌症治療劑亦可使癌幹細胞之幹細胞性減少，因此可抑制癌幹細胞之增殖，作為癌症治療用之核酸醫藥在臨床上之有用性是極高。
1.癌症治療劑 本發明癌症治療劑之特徵在於含有miR-4711-5p作為有效成分。以下，將詳細描述本發明之癌症治療劑。
[有效成分] 本發明之癌症治療劑是使用miR-4711-5p作為有效成分。miR-4711-5p是源自人類的miRNA，其鹼基序列，若為成熟型miRNA(mature-miRNA)，則為5'-UGCAUCAGGCCAGAAGACAUGAG-3'(序列編號1)。
在本發明之癌症治療劑中，作為有效成分使用之miR-4711-5p，可為成熟型miRNA，亦可為髮夾型前驅物miRNA(pri-miRNA)、pri-miRNA的一部分經切斷的pre-miRNA。該pri-miRNA、pre-miRNA，在細胞內會接受處理(processing)而成為成熟型miRNA。又，前述各miRNA亦可形成與具有互補鹼基序列之RNA所構成之雙股前驅物。該雙股的前驅物在癌細胞內雙股會解開而使成熟型miRNA游離。又，關於髮夾型前驅物miRNA、pre-miRNA之鹼基序列，可設定成能夠產生由以序列編號1所示鹼基序列構成之多核苷酸作為成熟型miRNA即可，如此鹼基序列對習於此藝者而言是可適宜設定的。
作為效成分使用之miRNA，為了賦予對酵素之分解耐受性等，亦可視需要，進行一般可施加在核酸的各種修飾。如此修飾可舉例如，2'-O甲基化等醣鏈部分的修飾；鹼基部分的修飾；胺基化、低級烷基胺基化、乙醯基化等磷酸部分的修飾等。
[適用對象] 作為本發明癌幹細胞之癌症治療劑之適用對象的癌症種類，並無特別限制，可舉例如，大腸癌、食道癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝臟癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮頸癌、腎臟癌、腦腫瘤、頭頸部癌、膽管癌、膽囊癌、口腔癌等固態癌；白血病、惡性淋巴瘤等血液癌。該等癌症種類中，宜舉固態癌，更佳可舉大腸癌。
又，本發明之癌症治療劑亦可抑制癌幹細胞之增殖，因此即使對化學療法無效的癌症亦可觀察到有效的治療效果，故本發明癌幹細胞之癌症治療劑之適用對象的一態樣可舉化學療法無效的癌症。
[投予方法] 本發明癌症治療劑之投予方法，在可將miR-4711-5p於活體內送達前述癌之組織或細胞為限度下，則無特別限制，可舉例如血管內(動脈內或靜脈內)注射、持續點滴、皮下投予、局部投予、肌肉內投予、腹膜內投予等。該等中，宜舉動靜脈內投予。
本發明癌症治療劑之投予量可因應作為適用對象之癌幹細胞之種類、患者之性別、年齡、症狀等而適宜決定，而無法一概決定，然可舉例如，以miR-4711-5p之成熟型miRNA量換算每1日1~100mg/m2 (體表面積)左右。
[製劑化] 本發明之癌症治療劑透過可將miR-4711-5p送達癌幹細胞內並表現機能，而可達致癌症治療效果，因此本發明之癌治療劑較佳與可與miRNA導入劑一起製劑化以使miR-4711-5p容易送達癌細胞內。如此miRNA導入劑並無特別限制，可為例如，碳酸磷灰石粒子、lipofectamine、oligofectamine、RNAi　Fect等之任一。該等miRNA導入劑之中，碳酸磷灰石粒子可在活體內集聚於癌細胞並有效率的進行miR-4711-5p至癌細胞內的移行，因此本發明癌症治療劑之較佳一態樣可舉以如下狀態存在者：miR-4711-5p是與碳酸磷灰石粒子之混合狀態、或miR-4711-5p複合化(內包)於碳酸磷灰石粒子而成之複合粒子之狀態。
以下，將針對使用作為miR-4711-5p導入劑之碳酸磷灰石粒子進行說明。
(碳酸磷灰石粒子) 碳酸磷灰石具有羥磷灰石(Ca10 (PO4 )6 (OH)2 )之羥基的一部分經CO3 取代之結構，且是以通式Ca10-m Xm (PO4 )6 (CO3 )1-n Yn 表示之化合物。在此，X是可部份取代在碳酸磷灰石中Ca的元素，可舉例如Sr、Mn、稀土類元素等。m通常為0以上且1以下之正數，且宜為0以上且0.1以下、以0以上且0.01以下為佳、以0以上且0.001以下更佳。Y是可部份取代碳酸磷灰石中CO3 的基或元素，可舉OH、F、Cl等。n通常為0以上且0.1以下之正數，且宜為0以上且0.01以下、以0以上且0.001以下為佳、以0以上且0.0001以下更佳。
本發明所使用之碳酸磷灰石粒子的平均粒徑，只要是可投予於活體內並可移行至細胞內程度的大小即可，而無特別限制。具體而言，本發明所使用之碳酸磷灰石粒子的平均粒徑，通常可舉超過30nm，且宜為30〜3000nm，以30〜2000nm更佳、以30〜1500nm特別為佳。
此外，前述碳酸磷灰石之平均粒徑是利用動態光散射法粒子分析儀(DLS)測定之值。在存在不適合使用DLS測定的巨大粒子(例如，粒徑5μm以上)時，可將該等從測定對象範圍中去除。又，在本說明書中，所謂粒徑，意指在以掃描型探針顯微鏡測定時，可作為個別粒子而辨識之獨立粒子的粒徑。故，當複數個粒子凝集時，將其等之集合體判斷為一個粒子。
碳酸磷灰石粒子可以依照眾所皆知的手法獲得。例如，可利用在水溶液中使鈣離子、磷酸離子及碳酸氫離子共存來調製，並藉此獲得。水溶液中各離子之濃度只要可形成碳酸磷灰石粒子即可，沒有特別限制，可參照下述適宜設定。
水溶液中之鈣離子濃度通常可舉0.1〜1000mM，且宜為0.5〜100mM、以1〜10mM更佳。
水溶液中之磷酸離子濃度通常可舉0.1〜1000mM，且宜為0.5〜100mM、以1〜10mM更佳。
水溶液中之碳酸氫離子濃度，通常可舉1.0〜10000mM，且宜為5〜1000mM、以10〜100mM更佳。
鈣離子、磷酸離子及碳酸氫離子之供給源，只要可將該等離子供給於水溶液中即可，而無特別限制，可舉例如該等離子之水溶性鹽。具體而言，可使用CaCl2 作為鈣離子源、可使用NaH2 PO4 ˙2H2 O作為磷酸離子源、可使用NaHCO3 作為碳酸離子源。
用以調製碳酸磷灰石粒子之水溶液，只要可形成碳酸磷灰石粒子，則亦可含有上述各離子供給源及其他物質以外的成分。例如，亦可在水溶液中透過在上述組成物中添加氟離子、氯離子、Sr、Mn等，部分取代碳酸磷灰石中Ca或CO3 。但，氟離子、氯離子、Sr及Mn之添加量宜設在不會顯著影響所形成之複合粒子之pH溶解性、粒徑範圍的範圍內。又，用以調製碳酸磷灰石粒子之水溶液使用水作為基劑即可，然亦可使用細胞培養用之各種培養基、緩衝液等。
在調製本發明所使用之碳酸磷灰石粒子時，各離子供給源及其他物質混合到水溶液中之順序並無特別限定，只要可獲得目的之碳酸磷灰石粒子，則亦可藉由任何混合順序來調製水溶液。例如，在調製含有鈣離子及其他物質的第1溶液之同時，可另外調製含有磷酸離子及碳酸氫離子之第2溶液，並混合第1溶液與第2溶液調製水溶液。
碳酸磷灰石粒子可藉由將含有上述各離子之水溶液的pH調整到6.0~9.0之範圍並放置(incubate)一定時間來獲得。形成碳酸磷灰石粒子時之該水溶液的pH，可舉例如6.5~9.0，且宜為6.7~8.8、以6.7~8.6為佳、以6.8~8.5更佳、以7.0~8.5特別佳、以7.1~8.0最佳。
形成碳酸磷灰石粒子時之該水溶液的溫度條件，只要可形成碳酸磷灰石粒子則無特別限制，通常為0℃以上，可舉例如4℃以上，或37℃。
用以形成碳酸磷灰石粒子之該水溶液的放置(incubate) 時間，只要可形成碳酸磷灰石粒子則無有特別限制，通常可舉1分~24小時，且宜為5分~1小時。粒子形成之有無可透過例如在顯微鏡下觀察來確認。
又，將碳酸磷灰石粒子之平均粒徑調控在前述範圍內之方法並無特別限制，可舉例如在碳酸磷灰石粒子之製造過程中、或在碳酸磷灰石粒子製造後，添加分散劑的方法。針對分散劑之種類，只要在可分散碳酸磷灰石粒子的限度下則無特別限制，一般在醫藥品中所添加之分散劑即可，可舉白蛋白作為一例。分散劑可1種單獨使用，亦可2種以上組合使用。在含有碳酸磷灰石粒子之水溶液中之分散劑的濃度，只要可獲得微細化及/或再凝集抑制之效果，則無特別限制，可舉例如0.1〜500mg/ml，且宜為1〜100mg/ml、以1至10mg/ml更佳；或0.001~10重量%左右。又，粒徑調控法之另一例可舉將在前述水溶液中形成之碳酸磷灰石粒子進行超音波振動處理的方法。超音波振動處理具體可舉如下處理：使超音波破碎機等超音波振動器直接接觸試料來施加超音波的處理；使用具備有超音波振動器及水槽(洗淨槽)的超音波洗淨器，將液體(例如，水)置入該水槽中，將收容有碳酸磷灰石粒子之容器(例如，塑膠製的管子(tube))漂浮於此，並經由液體對含有碳酸磷灰石粒子之水溶液施加超音波的處理等。透過如此超音波振動處理，可以簡便且有效率的將碳酸磷灰石粒子之粒徑微細化至前述範圍。
上述超音波振動處理之條件，只要可將粒徑調控在預定範圍內，則無特別限制。例如，在使用具備有超音波振動器及水槽(洗淨槽)之超音波洗淨器來進行時，可例示以下條件。 水槽之溫度：例如5~45℃、宜為10~35℃、更佳為20~30℃。 高頻率輸出：例如10~500W、宜為20~400W、更佳為30~300W、特佳為40~100W。 振盪頻率數：例如10~60Hz、宜為20~50Hz、更佳為30~40Hz。 處理時間：例如30秒~30分、宜為1~20分、更佳為3~10分。
進行超音波振動處理時使用之包含碳酸磷灰石粒子之容器種類，只要可將粒子微細化至預定的粒徑範圍，則無限制，可因應水溶液之容量、使用目的來適宜選擇。例如，可使用1~1000ml容量之塑膠製管子。
又，超音波振動處理宜在分散劑的存在下(亦即，將分散劑添加到含有碳酸磷灰石粒子之水溶液中的狀態)進行。這是因為，透過在分散劑與碳酸磷灰石粒子共存的環境下進行超音波振動處理，可獲得具有更微細粒徑之碳酸磷灰石奈米粒子，且亦可抑制粒子的再凝集。
(miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合粒子) 本發明癌症治療劑之一較佳態樣是使用miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子經複合化的複合粒子。透過如此使miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子進行複合化，將可藉由碳酸磷灰石之作用使miR-4711-5p集聚在活體內之癌細胞，並可使miR-4711-5p有效率的導入癌細胞。又，在導入細胞內之後，在細胞內miR-4711-5p可從碳酸磷灰石粒子游離，因此亦可有效發揮miR-4711-5p所致抗腫瘤效果。
在本發明中，所謂miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合粒子，是指miR-4711-5p對碳酸磷灰石粒子是利用離子鍵、氫鍵等來吸附並載持的狀態。miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合粒子的形成方法並無特別限制，可舉例如以下方法等：透過使miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子在水溶液中共存而形成之方法；在調製碳酸磷灰石粒子之水溶液中，透過使鈣離子、磷酸離子及碳酸氫離子一起與miR-4711-5p共存，而同時進行碳酸磷灰石粒子之形成，以及miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合化的方法。
若使miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合粒子的形成，和碳酸磷灰石粒子之形成以及miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合化同時進行時，在調製碳酸磷灰石所使用之水溶液中添加miR-4711-5p使其成為，例如0.1~1000nM、宜為0.5~500nM、更佳為1~200nM即可。
在miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子的複合粒子中，miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之比率並無特別限制，視miR-4711-5p之投予量適宜設定即可。例如，在使2mg之miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子複合化時，對前述用以調製碳酸磷灰石粒子之水溶液2.5L中添加5mg之miR-4711-5p，以同時進行碳酸磷灰石粒子之形成，以及miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合化即可。
又，在本發明中，在使用經與碳酸磷灰石粒子複合化的miR-4711-5p時，可在已分散在適合投予到活體之溶劑中的狀態下使用。如前所述，碳酸磷灰石粒子可透過使成為各種離子供給源之物質溶解於水、培養基或緩衝液等溶劑中來獲得，然如此獲得之碳酸磷灰石粒子分散溶液，從滲透壓、緩衝能力、無菌性等觀點來看，並不一定適合投予到活體(血管內投予)。因此，為了將分散有碳酸磷灰石粒子之溶劑置換成適合投予到活體的溶劑(例如，生理時鹽水等)，通常需要操作如下：利用離心將碳酸磷灰石粒子從溶劑分離、回收，並置換溶劑。然而，若進行如此操作，則碳酸磷灰石粒子彼此會凝集、粒子會巨大化，因此反而朝向不適合投予到活體的狀態變化。就此，可在將已凝集之碳酸磷灰石粒子添加到適合投予到活體之溶劑中之後，藉由進行前述超音波振動處理，使miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合粒子能夠以適度之粒徑(前述範圍之平均粒徑)分散在適合投予到活體的溶劑中。
又，在本發明之癌症治療劑中，在使用經與碳酸磷灰石粒子複合化之miR-4711-5p時，本發明癌症治療劑之投予是期望在使miR-4711-5p與碳酸磷灰石粒子之複合粒子利用超音波振動處理而以微小粒子之狀態分散後，在該粒子凝集之前迅速進行。例如，適當的是超音波振動處理後1分以內之投予，且宜為30秒以內之投予。但是，如前所述，透過添加白蛋白來抑制碳酸磷灰石粒子之凝集時，亦可在超音波振動處理後經過數分~至數十分鐘後投予。
2.癌幹細胞之增殖抑制劑 miR-4711-5p可使癌幹細胞之幹細胞性減少且亦可抑制癌幹細胞之增殖，因此本發明進一步提供一種含有miR-4711-5p作為有效成分之癌幹細胞的增殖抑制劑。
本發明癌幹細胞之增殖抑制劑是可使用來用以抑制癌幹細胞之增殖來使用的核酸醫藥，關於使用之有效成分、為適用對象之癌症種類、投予方法、製劑化等，則與前述「1.癌症治療劑」之情況相同。
[實施例] 以下，將舉實施例說明本發明。但，本發明並不被限定解釋成以下之實施例。
試驗例1：候補miRNA之提取 使用miRBase與Target Scan這2個資料庫，提取具有結合至KLF5之可能性的miRNA。在經提取之miRNA之內，提取出與Wnt/β-鏈蛋白訊息、Wnt/Ca+ 訊息及Notch訊息之任一有關係者。其結果是，可從miRBase提取出29種miRNA、可從Target Scan提取出31種miRNA。在miRBase提取出之miRNA與在Target Scan提取出之miRNA中重複的有16種，因此合計提取出44種miRNA。在44種miRNA之內，已對3種miRNA進行了機能解析，故排除該等而選擇出41種miRNA作為候補。
試驗例2：miRNA之篩選(screening) 使用在前述提取出之41種候補miRNA，進行大腸癌細胞株的增殖試驗。具體而言，首先，在96孔盤之各孔中分別以成為5000 cells/well的方式播種DLD-1、HCT116、及HT29這3種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染候補miRNA或陰性對照miRNA(NC、5'-AUCCGCGCGAUAGUACGUA-3'、序列編號2)。自轉染72小時後，使用cell counting kit-8(同仁化學研究所)並以GloMax-Multi+Detection System(Promega)測定細胞生存率(cell viability、%)。
結果顯示於圖1。在圖1中，No.20之候補miRNA是miR-4711-5p。如自圖1清楚可見，可確認到miR-4711-5p在大腸癌細胞株的增殖抑制效果優異。
試驗例3：分析miR-4711-5p對KLF5在mRNA層級上之表現量的影響 就對大腸癌細胞株之增殖抑制效果優異的miR-4711-5p，分析對KLF5 mRNA表現量的影響。具體而言，在6孔盤之各孔中分別以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。進行轉染24小時後，回收細胞，以miRNeasy Kit (Applied Biosystems)萃取總RNA，並透過PCR進行KLF5 mRNA量之測定。
結果顯示於圖2。該結果可確認到，miR-4711-5p具有在大腸癌細胞株中在mRNA層級上抑制KLF5表現的作用。
試驗例4：分析miR-4711-5p對KLF5在蛋白質層級上之表現量的影響 就miR-4711-5p，分析對KLF5在蛋白質層級之表現量的影響。具體而言，在6孔盤之各孔中分別以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。進行轉染48小時後，回收細胞，萃取細胞內之總蛋白質，並利用西方墨點法測定KLF5在蛋白質層級之表現量。
結果顯示於圖3。該結果可確認到，轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株亦可在蛋白質層級上抑制KLF5之表現。
試驗例5：確認miR-4711-5p與KLF5之結合 為了確認在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，miR-4711-5p是否有結合到KLF5，使用pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega)進行分析。首先，使用target scan，鑑定出可預期有miR-4711-5p所致強結合的結合位點1(binding site 1；KLF5之3'UTR的位置(position)1186-1208、5'-AAUAGUAAUGUGAUGCUGAUGCU-3'(序列編號3))，以及可預期有miR-4711-5p所致弱結合的結合位點2(binding site 2；KLF5之3'UTR的位置 917-939、5'-GACAAUGUUGCAUUUAUGAUGC-3'(序列編號4)、與KLF5之3'UTR的位置 951-973、5'-CAAAACGUUGAAUUGAUGAUGCA-5'(序列編號5)這2個區域)。做出含有結合位點1之DNA分子(片段1(insert 1))、及含有結合位點2(2個區域)之DNA分子(片段2(insert 2))，將片段1及2分別插入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector之多重選殖位(multi-cloning site)。
在96孔盤之各孔中分別以成為1.0×104 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，以含有10%FBS(胎牛血清)之D-MEM培養基進行12小時培養後，將培養基交換成不含有血清之Opti-MEM培養基，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)與插入有片段1或2的質體。進行轉染8小時後，將培養基交換成含有10%FBS之D-MEM培養基，進一步再進行24小時培養後，依照製品之實驗程序(protocol)，測定螢光素酶蛋白表現量。
結果顯示於圖4。該結果可確認到，因miR-4711-5p使螢光素酶之表現被抑制，miR-4711-5p有結合到結合位點1及2這兩者上。
試驗例6：細胞增殖試驗 使用miR-4711-5p，進行大腸癌細胞株的細胞增殖試驗。具體而言，首先，在96孔盤之各孔中分別以成為3.0×103 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染24、48、及72小時後，使用cell counting kit-8(同仁化學研究所)並以GloMax-Multi+Detection System(Promega)測定細胞生存數。
結果顯示於圖5。該結果可確認到，在進行有miR-4711-5p之轉染時，相較於陰性對照，在48及72小時後，可顯著抑制DLD-1及HCT116之細胞增殖。
試驗例7：浸潤分析 使用miR-4711-5p，進行大腸癌細胞株的浸潤分析。具體而言，首先，在6孔盤之各孔中分別以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染24小時後，將細胞播種到BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD biosciences)，並進行48小時培養。接著，以蘇木精進行核染色，計測浸潤之細胞數。
結果顯示於圖6。該結果可確認到，在進行有miR-4711-5p之轉染時，相較於陰性對照，可顯著抑制具浸潤能力細胞數。
試驗例8：遷移能力之評價 使用miR-4711-5p，進行利用傷口癒合分析之大腸癌細胞株的遷移能力之評價。具體而言，首先，將插入物(ibidi Culture Insert 2 Well (ibidi))安裝在24孔盤中，於各孔中分別以成為3.5×105 ~4.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行24小時培養。接著，去除插入物、做成傷口(wound)，然後繼續進行培養，並自去除插入物起24、48及72小時後，測定傷口面積。
結果顯示於圖7。該結果可確認到，在進行有miR-4711-5p之轉染時，相較於陰性對照，傷口面積是顯著變寬，細胞之遷移能力降低。
試驗例9：細胞自戕分析 使用miR-4711-5p，進行大腸癌細胞株的細胞自戕分析。具體而言，首先，在6孔盤之各孔中分別以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染48小時後，將細胞以Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (Thermo Fisher Scientific)處理，並使用SH800ZCell Sorter (Sony Biotechnology Inc.)，求出以Annexin V染色的比例。又，自轉染48小時後，回收細胞，萃取細胞內之總蛋白質，並利用西方墨點法測定p53、survivin、cPARP(cleaved PARP)、cCaspase3(cleaved Caspase3)、及ACTB(β-肌動蛋白)的表現量。
將測定可被Annexin V染色之細胞(亦即，發生細胞自戕之細胞)之比例的結果顯示在圖8，將測定p53、survivin、cPARP、cCaspase3、及ACBT之表現量的結果顯示在圖9。該結果可知，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，可被Annexin V染色之細胞增加，細胞自戕是強烈被誘導。又，在具有野生型p53之HCT116，透過轉染miR-4711-5p，p53之表現會亢進、抗細胞自戕性蛋白質之survivin的表現量有減少、細胞自戕性蛋白質之cPARP及cCaspase3的表現量有增加。又，在具有突變型p53之DLD-1，透過轉染miR-4711-5p，survivin的表現有減少、cCaspase3的表現量有增加。亦即，從該等結果清楚可知，透過轉染miR-4711-5p，可誘導大腸癌細胞株細胞自戕。
試驗例10：幹細胞標誌之表現量的分析 分析miR-4711-5p對大腸癌細胞株之幹細胞標誌之表現量的影響。具體而言，首先，在6孔盤之各孔中分別以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染24小時後，回收細胞，以miRNeasy Kit (Applied Biosystems)萃取總RNA，並透過PCR測定KLF5、CD44v9、LGR5、BMI1、及LRIG1之mRNA量。又，關於自轉染48小時後的DLD-1，是進行利用FACS來測定細胞表面的CD44v9量。
將測定KLF5、CD44v9、LGR5、BMI1、及LRIG1之mRNA量的結果顯示在圖10，利用FACS測定DLD-1表面之CD44v9量的結果顯示在圖11。如自圖10可知，透過miR-4711-5p之轉染，在DLD-1，幹細胞標誌之CD44v9、LGR5、及BMI1的表現被抑制；在HCT116，幹細胞標誌之CD44v9、及BMI1的表現被抑制。又，如自圖11可知，透過miR-4711-5p之轉染，減少了存在於DLD-1細胞表面上的CD44v9。自以上結果清楚可知，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，幹細胞標誌之表現有被抑制，miR-4711-5p具有使癌幹細胞之幹細胞性減低的作用。
試驗例11：活性含氧物活性之測定 幹細胞性高的細胞具有保持低的活性含氧物(Reactive oxidant species, ROS)活性的性質。就此，分析了miR-4711-5p對大腸癌細胞株之ROS活性的影響。具體而言，首先，在6孔盤中以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染24小時後，回收細胞，以CellROX Deep Red (thermos fisher scientific)染色並利用FACS測定ROS活性。
結果顯示於圖12。此外，在圖12右圖所示的ROS活性(ROS activity)，是經判斷ROS活性為高的細胞比例。高與低之截止值(cut off value)是使用未暴露於Cell ROX試劑之細胞來決定。該結果可確認到，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，ROS活性高之細胞比例有增加，miR-4711-5p會使幹細胞性減少。
試驗例12：球狀(sphere)形成能力之分析 分析miR-4711-5p對大腸癌細胞株之球狀形成能力的影響。具體而言，首先，在6孔盤之各孔中分別以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)並轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染24小時後，回收細胞，做成細胞彼此未凝集的狀態，並在96-well ultra-low attachment plates (Corning Inc., USA)中以1×103 cells/well的方式播種、進行1週之培養。此外，在該培養中是使用含有EGF 20 ng/ml、bFGF 10 ng/ml、及盤尼西林G 100 μg/ml之無血清DMEM/F-12培養基。1周後，計測40μm以上之球狀體(spheroid)的數量(n=10)。
結果顯示於圖13。該結果可確認到，經轉染miR-4711-5p之大腸癌細胞株的球狀體數會減少，顯然miR-4711-5p具有使大腸癌細胞株之球狀形成能力降低之作用。
試驗例13：IPA解析 針對經轉染miR-4711-5p之大腸癌細胞株，使用進行了次世代定序之結果，進行Ingenuity Pathways Analysis(IPA)。具體而言，首先，在6孔盤中之各孔中以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)並轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染36小時後，回收細胞，以miRNeasy Kit (Applied Biosystems)萃取總RNA。接著，使用獲得之總RNA進行文庫(library)調製後，進行該文庫之次世代定序解析。然後，使用進行了次世代定序的結果，實施Ingenuity Pathways Analysis。
結果顯示於圖14。該結果暗示到，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株，細胞周期中從G1期至S期的移行受到抑制。
試驗例14：細胞周期分析 由於自前述試驗例13之結果暗示到miR-4711-5p抑制細胞周期中從G1期至S期的移行，故針對miR-4711-5p對大腸癌細胞株之細胞周期的影響進行詳細分析。具體而言，首先，在6孔盤中之各孔中以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1，使用含有10%FBS之D-MEM培養基，進行整晚培養。接著，將培養基交換成不含有FBS之D-MEM培養基，再進行24小時培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)並轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染24小時後，將培養基交換成含有10%FBS之D-MEM培養基。繼續進行8小時培養後，回收細胞並進行細胞週期分析。細胞之回收及細胞周期分析之手法如下。
將孔中之細胞以PBS洗淨，以Trypsin-EDTA處理並使細胞遊離。接著，將細胞懸浮在含有10%FBS之D-MEM培養基中並回收，置入15ml管子中進行離心分離及去除上清液。之後，添加PBS並再一次進行離心分離。接著，去除上清液，並且邊攪拌邊一點一點滴下冷70%乙醇水溶液200μl。之後，停止攪拌，將冷70%乙醇水溶液300μl邊沿著容器之壁面添加，並冰冷30分鐘。接著，進行離心分離及去除上清液，之後，以PBS洗淨，再一次進行離心分離。離心分離後去除上清液，置入500μl之0.1mg/ml的RNase，在37℃下培養20分鐘。培養後進行離心分離、去除上清液，之後，置入200μl之25μg/ml的碘化丙啶，培養20分鐘。接著，添加300μl的FACS flow鞘液(sheath fluid)，通過細胞過濾器(cell strainer)並以FACS進行解析。
結果顯示於圖15。該結果可確認到，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，G1期細胞之比例有增加，從G1至S期的移行被抑制。
試驗例15：測定與G1期/S期檢查點之調控有關之蛋白質的表現量 針對miR-4711-5p，分析其對與G1期/S期檢查點調控有關之蛋白質之表現量的影響。具體而言，在6孔盤之各孔中分別以成為1.0×105 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p或陰性對照microRNA(NC、序列編號2)。轉染進行48小時後，回收細胞，萃取細胞內之總蛋白質，並利用西方墨點法，測定與G1期/S期檢查點之調控有關之蛋白質(TFDP1、E2F1、Rb、CCNE、CDK2、p21、p27、CCND1、CDK2、CDK6、及MDM2)與β-肌動蛋白(ACTB)在蛋白質層級上的表現量。
結果顯示於圖16。該結果可觀察到，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，使細胞週期停止之p21、p27的表現亢進，同時TFDP1及MDM2之表現亦降低。在p53野生株之HCT116中，p53的表現有亢進，且其下游之p21的表現有亢進。
試驗例16：miR-4711-5p與TFDP1之結合的確認 在Target Scan中，暗示TFDP1具有miR-4711-5p之結合區域。就此，為了確認在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，miR-4711-5p是否有結合到TFDP1，使用pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega)進行分析。首先，使用target scan，鑑定出可預期有miR-4711-5p所致結合的結合位點(TFDP1之3'UTR的位置191-213、5'-UUUGAUACCAGUGUGCUGAUGCA-3'(序列編號6))。做出含有該結合位點之DNA分子(片段)，將片段插入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector之多重選殖位。
在96孔盤之各孔中以成為3.0×103 cells/well的方式播種DLD-1，以含有10%FBS(胎牛血清)之D-MEM培養基進行12小時培養後，將培養基交換成不含有血清之Opti-MEM培養基，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)與插入有片段的質體。進行轉染8小時後，將培養基交換成含有10%FBS之D-MEM培養基，進一步再進行24小時培養後，依照製品之實驗程序，測定螢光素酶活性。
結果顯示於圖17。該結果可確認到，因miR-4711-5p使螢光素酶之表現被抑制，miR-4711-5p有結合到TFDP1之3'UTR的位置191-213。
試驗例17：miR-4711-5p與MDM2之結合的確認 在Target Scan中，暗示MDM2具有miR-4711-5p之結合區域。就此，為了確認在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株中，miR-4711-5p是否有結合到MDM2，使用pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega)進行分析。首先，使用target scan，鑑定出可預期有miR-4711-5p所致結合的結合位點(MDM2之3'UTR的位置2315-2337、5'-UAUGGAAUAAAACUACUGAUGCA-3'(序列編號7))。做出含有該結合位點之DNA分子(片段)，將片段插入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector之多重選殖位。
在96孔盤之各孔中以成為3.0×103 cells/well的方式播種DLD-1，以含有10%FBS(胎牛血清)之D-MEM培養基進行12小時培養後，將培養基交換成不含有血清之Opti-MEM培養基，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共轉染miR-4711-5p或陰性對照miRNA(NC、序列編號2)與插入有片段的質體。進行轉染8小時後，將培養基交換成含有10%FBS之D-MEM培養基，進一步再進行24小時培養後，依照製品之實驗程序，測定螢光素酶活性。
結果顯示於圖18。該結果可確認到，因miR-4711-5p使螢光素酶之表現被抑制，miR-4711-5p有結合到MDM2之3'UTR的位置2315-2337。
試驗例18：評價小鼠皮下固態腫瘤模式中，miR-4711-5p之抗腫瘤效果及安全性 1.製造miRNA與碳酸磷灰石的複合粒子 對100ml之蒸餾水依序添加0.37g之NaHCO3 、90μl之NaH2 PO4 ˙2H2 O(1M)及180μl之CaCl2 (1M)並使之溶解，以1N的HCl將pH調整到7.5。將其以直徑0.2μm的過濾器過濾。對獲得之緩衝液每1ml混合2μg之miRNA、4μl之CaCl2 (1M)，並在37℃的水浴中溫浴30分鐘。之後，以15000rpm×5分進行離心沉澱，使獲得之沉澱顆粒(pellet)分散在生理食鹽水(含有0.5重量%白蛋白)中，獲得使miRNA內包在碳酸磷灰石粒子中之複合粒子的分散液。就在供於試驗之前，對獲得之分散液施加10分鐘超音波振動處理。此外，超音波振動處理是使用具有超音波振動機能之水浴(water bath)，使收容在塑膠容器之前述分散液浮在經設定至20℃的水中，並以高頻率輸出55W、振盪頻率數38kHz之條件進行10分鐘。如此獲得之製劑立即用於後述之試驗中。
此外，可確認到，在超音波振動處理之分散液中有生成由包含有miRNA之碳酸磷灰石奈米粒子所構成之複合粒子，且在該複合粒子中，每1mg碳酸磷灰石含有約20μg左右的miRNA。
2.小鼠皮下固態腫瘤模式試驗 對6~8週齡之BALB/cA裸小鼠(雌、日本CLEA公司製)的背部左右以成為5×105 cells/腫瘤的方式皮下注射DLD-1，製作出具有固態腫瘤的模式小鼠。在腫瘤到達約20 mm3 大小之時間點，將小鼠隨機分成如下3組：miR-4711-5p投予組(miR-4711-5p)5隻、陰性對照組(Negative control)5隻、及未處置組(Parent)4隻。在miR-4711-5p投予組，令腫瘤到達約20 mm3 大小之時間點為第0日，並在第0日、第2日、第4日、第7日、第9日及第11日，經由尾靜脈來靜脈注射碳酸磷灰石奈米粒子，該碳酸磷灰石奈米粒子包含以miR-4711-5p量換算是40μg/次之miR-4711-5p。在陰性對照組，以與miR-4711-5p投予組相同之時程及用量，經由尾靜脈來靜脈注射包含有對照miRNA(序列編號2)的碳酸磷灰石奈米粒子。在未處置組，並未進行藥劑之投予。在試驗期間中，經時性的測定小鼠背部之腫瘤尺寸(長徑×短徑×短徑×1/2)及小鼠體重。又，在第14日，從小鼠摘出腫瘤並觀察大小。進一步，在第14天，從小鼠摘出腦、心臟、肺、肝臟、腎臟、脾臟及結腸，進行蘇木精-伊紅染色，並進行組織觀察。
將經時性測定腫瘤尺寸之結果顯示在圖19，將觀察在第14日從小鼠摘出之腫瘤的結果顯示在圖20。該結果是，在miR-4711-5p投予組，相較於陰性對照組及未處置組，腫瘤尺寸是顯著的小。
又，將經時性測定小鼠體重之結果顯示在圖21。該結果可確認到，3組間在體重上無顯著差異，而無miR-4711-5p所致副作用。
又，在第14天從小鼠摘出腦、心臟、肺、肝臟、腎臟、脾臟及結腸，進行蘇木精-伊紅染色，並將結果顯示在圖22。從各組織之蘇木精-伊紅染色結果亦沒有觀察到miR-4711-5p所致副作用。
試驗例19：miR-4711-5p之抗腫瘤效果的評價 對8週齡之BALB/cA裸小鼠(雌、日本CLEA公司製)的背部左右，以成為2.5×106 cells/腫瘤的方式皮下注射DLD-1，製作出具有固態腫瘤的模式小鼠。將小鼠隨機分成如下2組：miR-4711-5p投予組(miR-4711-5p)3隻、及陰性對照組(Negative control)3隻。在miR-4711-5p投予組，令皮下注射DLD-1之時間點為第0日，並在第7日、第8日及第9日，經由尾靜脈來靜脈注射碳酸磷灰石奈米粒子(以與前述試驗例18相同條件調製者)，該碳酸磷灰石奈米粒子包含以miR-4711-5p量換算是40μg/次之miR-4711-5p。在陰性對照組，以與miR-4711-5p投予組相同之時程及用量，經由尾靜脈來靜脈注射包含有對照miRNA(序列編號2)的碳酸磷灰石奈米粒子。在第10日從小鼠摘出腫瘤。
利用PCR測定摘出之腫瘤中miR-4711-5p的量。又，利用PCR測定摘出之腫瘤中KLF5、TFDP1、及MDM2之mRNA量。進一步，自摘出之腫瘤萃取總蛋白質，並利用西方墨點法測定KLF5、TFDP1、MDM2、cPARP(cleaved PARP)、cCaspase3(cleaved Caspase3)、及ACTB(β-肌動蛋白)在蛋白質層級的表現量。進一步，針對摘出之腫瘤，利用TUNEL分析將因細胞自戕所產生之斷片化DNA進行染色，又，將核利用Hoechst來染色。
將測定腫瘤中miR-4711-5p量的結果顯示於圖23。該結果是，在miR-4711-5p投予組，相較於陰性對照組，腫瘤中miR-4711-5p量有顯著增加。
又，將測定腫瘤中KLF5、TFDP1、MDM2、及ACTB之mRNA量的結果顯示在圖24；將測定腫瘤中KLF5、TFDP1、MDM2、及ACTB之蛋白質量的結果顯示在圖25。該結果確認到，在miR-4711-5p投予組，相較於陰性對照組，KLF5、TFDP1、及MDM2之表現量在mRNA及蛋白質雙方上皆有降低。
將進行TUNEL分析之結果顯示在圖26及27；將測定cPARP、cCaspase3、及ACTB在蛋白層級之表現的結果顯示在圖28。該結果可知，在miR-4711-5p投予組，有被誘導細胞自戕之細胞有顯著增加，細胞自戕性蛋白質之cPARP及cCaspase3的表現量有增加。
試驗例20：細胞增殖試驗(與其他miRNA之比較) 使用大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)，並就miR-4711-5p、報告有KLF5表現抑制作用之4種miRNA(miR-21-5p、miR-152-5p、miR-153-3p及miR-448-3p)、報告有抗腫瘤效果之miR-34a，進行細胞增殖試驗。具體而言，首先，在96孔盤之各孔中分別以成為3.0×103 cells/well的方式播種DLD-1及HCT116這2種大腸癌細胞株，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p、miR-21-5p、miR-152-5p、miR-153-3p、miR-448-3p、miR-34a、及陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染24、48、及72小時後，使用cell counting kit-8(同仁化學研究所)並以GloMax-Multi+Detection System(Promega)測定細胞生存數。
結果顯示於圖29。此外，圖29之縱軸是450nm之吸光度。該結果是，在進行有miR-4711-5p轉染時，可觀察到最高的增殖抑制效果。
試驗例21：細胞增殖試驗(使用有採取自患者之大腸癌細胞的驗證) 使用採取自5名第II及III期患者(Pt.28、Pt.36、Pt.40、Pt.41及Pt.45)之大腸癌細胞，並進行細胞增殖試驗。本試驗是在獲得大阪大學醫院倫理委員會之許可下，且在該許可下，自取得知情同意之5名大腸癌患者採取大腸癌細胞，並使用該大腸癌細胞來進行。將採取自各患者之大腸癌細胞球狀體與trypLE express(Invitrogen)一起在37℃下培養30分鐘，藉此以解離成單一的大腸癌細胞。在96孔盤之各孔中以成為4.0×103 cells/well的方式播種所得之單一大腸癌細胞，進行整晚培養後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染miR-4711-5p、miR-34a及陰性對照miRNA(NC、序列編號2)。自轉染72小時後，觀察細胞狀態，同時使用cell counting kit-8(同仁化學研究所)並以GloMax-Multi+Detection System(Promega)測定細胞生存數。
將觀察細胞狀態之結果顯示於圖30，將測定細胞生存數之結果顯示於圖31。該結果可確認到，miR-4711-5p之對自大腸癌患者獲得之大腸癌細胞的增殖抑制效果，相較於miR-34a及陰性對照，是顯著的高(p＜0.01p)。
＜總合考察＞ 從前述試驗例1〜9的結果可明瞭以下幾點，並可確認miR-4711-5p具有抗腫瘤效果。 (1) 在針對KLF5的miRNA中，miR-4711-5p可使癌細胞之生存率有效降低，並可抑制癌細胞中KLF5的表現。 (2) miR-4711-5p會結合到KLF5之3'UTR。 (3) miR-4711-5p可抑制癌細胞之增殖、浸潤及遷移。 (4) miR-4711-5p可誘導癌細胞之細胞自戕。
又，從前述試驗例10〜12的結果可明瞭以下幾點，並可確認miR-4711-5p可使癌細胞之幹細胞性降低。 (5) miR-4711-5p可抑制癌幹細胞之幹細胞標誌的表現。 (6) miR-4711-5p會使ROS活性高的癌細胞比例增加。 (7) miR-4711-5p可抑制癌細胞之球狀形成。
又，從前述試驗例13〜17的結果可明瞭以下幾點，並可確認miR-4711-5p可抑制癌細胞之細胞周期中從G1期至S期的移行。 (8) miR-4711-5p會使G0/G1期的癌細胞比例增加。 (9) 因miR-4711-5p而可抑制從G1期至S期之移行的機制之一是，作為miR-4711-5p直接標的之TFDP1的負調控(downregulation) 。 (10) 因miR-4711-5p而可抑制從G1期至S期之移行的機制之一是，作為miR-4711-5p直接標的之MDM2的負調控。
從試驗例18及19之結果可確認到，miR-4711-5p即便在活體內(in vivo)亦可發揮抗腫瘤效果，且未觀察到對正常組織的副作用。
從試驗例20及21之結果可確認到，miR-4711-5p具有抗腫瘤效果，且優於已報告有抗腫瘤效果的miR-34a，且實際上對自大腸癌患者摘出之大腸癌細胞，亦可發會優異的抗腫瘤效果。
圖1之圖是顯示，在轉染有41種候補miRNA之大腸癌細胞株(DLD-1、HCT116及HT29)進行增殖試驗的結果。 圖2之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，測定KLF5 mRNA表現量的結果。 圖3之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，測定KLF5(蛋白質)表現量的結果。 圖4之圖顯示，利用雙螢光素酶分析來確認miR-4711-5p與KLF5之結合的結果。 圖5之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)進行細胞增殖試驗的結果。 圖6之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)進行浸潤分析的結果。 圖7之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，評價細胞遷移能力的結果。 圖8之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，測定以Annexin V染色之細胞，亦即，發生細胞自戕之細胞，之比例的結果。 圖9之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，測定p53、survivin、cPARP及cCaspase3之表現量的結果。 圖10之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，測定KLF5、CD44v9、LGR5、BMI1、及LRIG1之mRNA量的結果。 圖11之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1)中，測定CD44v9陽性細胞之比例的結果。 圖12之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1)中，測定活性含氧物之活性的結果。 圖13之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，評價球狀形成能力的結果。 圖14之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p或陰性對照(negative control)之大腸癌細胞株(DLD-1)，使用次世代定序之結果並進行生物路徑分析(Ingenuity Pathways Analysis)的結果。 圖15之圖是顯示，對轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)進行細胞週期分析的結果。 圖16之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)中，測定與調控G1期/S期檢查點有關之蛋白質(TFDP1、E2F1、Rb、CCNE、CDK2、p53、p21、p27、CCND1、CDK2、CDK6、及MDM2)與β-肌動蛋白(ACTB)在蛋白質層級之表現量的結果。 圖17之圖顯示，利用雙螢光素酶分析來確認miR-4711-5p與TFDP1之結合的結果。 圖18之圖顯示，利用雙螢光素酶分析來確認miR-4711-5p與MDM2之結合的結果。 圖19之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，經時性的測定腫瘤尺寸的結果。 圖20之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，觀察在第14天從小鼠摘出之腫瘤的結果。 圖21之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，經時性的測定小鼠體重的結果。 圖22之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，在第14天從小鼠摘出之各組織，將各組織進行蘇木精-伊紅染色並觀察的結果。 圖23之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，測定腫瘤中miR-4711-5p量的結果。 圖24之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，測定腫瘤中KLF5、TFDP1、MDM2、及ACTB之mRNA量的結果。 圖25之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，測定腫瘤中KLF5、TFDP1、MDM2、及ACTB在蛋白質層級之表現量的結果。 圖26之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，將腫瘤組織進行TUNEL分析的結果。 圖27之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，將腫瘤組織進行TUNEL分析的結果。 圖28之圖顯示，在小鼠皮下固態腫瘤模式(大腸癌細胞株DLD-1)中，測定腫瘤中cPARP、cCaspase3、及ACTB之蛋白量的結果。 圖29之圖是顯示，在轉染有miR-4711-5p、miR-21-5p、miR-152-5p、miR-153-3p、miR-448-3p、及miR-34a之大腸癌細胞株(DLD-1及HCT116)進行細胞增殖試驗的結果。縱軸表示450nm之吸光度。 圖30之圖是顯示，對從大腸癌患者獲得之大腸癌細胞轉染miR-4711-5p及miR-34a，在72小時後觀察細胞狀態的結果。 圖31之圖是顯示，對從大腸癌患者獲得之大腸癌細胞轉染miR-4711-5p及miR-34a，並進行細胞增殖試驗的結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
(無)

Claims (10)

  1. 一種癌症治療劑，含有miR-4711-5p作為有效成分。
  2. 如請求項1之癌症治療劑，其中miR-4711-5p是成熟型miRNA、pri-miRNA或pre-miRNA。
  3. 如請求項1或2之癌症治療劑，其中miR-4711-5p是複合化於碳酸磷灰石粒子。
  4. 一種癌幹細胞之增殖抑制劑，含有miR-4711-5p作為有效成分。
  5. 一種miR-4711-5p用以製造癌症治療劑之用途。
  6. 一種miR-4711-5p，使用於用以治療癌症之處置。
  7. 一種癌症之治療方法，是對癌症患者投予治療有效量之miR-4711-5p。
  8. 一種miR-4711-5p用以製造癌幹細胞之增殖抑制劑之用途。
  9. 一種miR-4711-5p，使用於用以抑制癌幹細胞之增殖之處置。
  10. 一種癌幹細胞之增殖抑制方法，是對癌症患者投予治療有效量之miR-4711-5p，以抑制癌幹細胞之增殖。
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