KR20230002611A - 세포 분류기 회로 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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바르톨로메오 안젤리치
야코브 베넨손
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아이드제노시쉐 테크니쉐 훽슐레 쥐리히
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Abstract

본원에 개시되는 것은 정밀한 생체내 세포 표적화를 위한 고도로 콤팩트한 다중-입력 유전자 논리 게이트를 코딩하는 인접 DNA 서열, 및 생체내 전달 및 이러한 인접 DNA 서열의 조합을 사용하여 질환을 치료하는 방법이다.

Description

세포 분류기 회로 및 그의 사용 방법
본원에 개시되는 것은 정밀한 생체내 세포 표적화를 위한 고도로 콤팩트한 다중-입력 유전자 논리 게이트를 코딩하는 인접 DNA 서열, 및 생체내 전달 및 이러한 인접 DNA 서열의 조합을 사용하여 질환을 치료하는 방법이다.
유전자 요법이 유전자 질환 및 암의 차세대 치료 옵션으로 부상하고 있다. 그러나, 현재의 유전자 요법 벡터는 낮은 효능, 높은 독성, 그리고 치료를 선도하기에는 긴 개발 일정으로 어려움을 겪고 있다. 이들 결점의 한 가지 이유는 (i) 의도하지 않은 세포 유형 및 조직에서의 유전자 발현 또는 (ii) 불충분하거나 너무 높은 것 중 어느 하나인 투여량의 유전자 발현으로 이어지는, 유전자 요법 벡터에서의 치료 유전자 발현의 견고한 제어의 불충분성이다. 달리 말하면, 유전자 산물 투여량 (즉, 세포당 단백질 분자의 수) 및 세포 유형-제한 발현 양쪽 면에서의 유전자 발현의 정밀한 제어가 유전자 요법에 공공연한 과제로 남아 있다.
생체분자 컴퓨팅 및 합성 생물학에서의 연구는 (i) 분자 질환 지표의 다중-입력 센싱; (ii) 치료 반응의 강도를 결정하는 분자 수준 계산; 및 (iii) 고도로 정밀하고 조화된 방식으로의 계내에서의 요법의 강화에 기반한 새로운 유형의 치료 접근법을 가능하게 하기 위해 오래도록 추구되었다. 본원에 기재되는 것은 다수의 세포 입력의 복잡한 논리적 통합을 통한 이질적 세포 유형의 정밀한 확인을 가능하게 하는 세포 분류기 유전자 회로이다. 또한 본원에 기재되는 것은 질환을 치료하기 위해 분류기 유전자 회로를 사용하는 방법이다. 암은 건강한 세포와의 종양 유사성, 종양 이질성, 및 1차 및 2차 로커스 둘 다에서의 그의 전파로 인하여 세포 분류기 접근법으로부터 가장 이익을 얻을 질환의 부류로 간주되었다. 본원에 기재된 연구는 정밀한 세포 표적화를 위한 다중-입력 유전자 회로가 차세대의 유전자 요법을 위한 이상적인 방안이라는 개념을 지지한다.
따라서, 일부 측면에서 본 개시내용은 인접 폴리핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 a) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 제1 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; 및 (ii) 표 1에 열거된 miRNA에 대한 표적 부위 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 제1 카세트; 및 b) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트를 포함하며; 여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA는 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA는 3' UTR을 포함하며, 여기서 3' UTR은 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA는 5' UTR을 포함하며, 여기서 5' UTR은 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 RNA는 표 1에 열거된 마이크로RNA에 대한 표적 부위 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 여기서 제2 RNA는 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 RNA는 3' UTR을 포함하며, 여기서 3' UTR은 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 RNA는 5' UTR을 포함하며, 여기서 5' UTR은 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트의 적어도 하나의 miRNA 표적 부위 및 제2 카세트의 적어도 하나의 miRNA 표적 부위는 동일한 핵산 서열이거나 또는 동일한 miRNA에 의해 조절되는 상이한 서열이다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 각각 let-7c 표적 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 표 3에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 RNA의 발현은 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 표 4에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자는 독립적으로 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA의 발현은 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 표 4에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자는 전사 인자 반응 요소에 결합된 전사 인자의 존재 하에서만 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트는 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 표 5에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하고; 제2 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트의 전사 인자 반응 요소 및 제2 카세트의 전사 인자 반응 요소는 동일한 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트의 전사 인자 반응 요소 및 제2 카세트의 전사 인자 반응 요소는 상이한 핵산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트는 2개 이상의 전사 인자 반응 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트는 2개의 상이한 전사 인자 반응 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트의 상류 조절 구성요소는 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 카세트의 상류 조절 구성요소는 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트 및 제2 카세트는 수렴형 배향으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트 및 제2 카세트는 발산형 배향으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트 및 제2 카세트는 머리-대-꼬리 배향으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트는 인슐레이터에 의해 플랭킹된다.
일부 실시양태에서, 제2 카세트의 전사활성인자는 tTA, rtTA, PIT-RelA, PIT-VP16, ET-VP16, ET-RelA, NarLc-VP16, 또는 NarLc-RelA이다.
일부 실시양태에서, 제2 카세트의 전사활성인자는 표 2에 열거된 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 출력은 단백질 또는 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 출력은 치료제이다. 일부 실시양태에서, 출력은 형광 단백질, 세포독소, 전구약물 활성화를 촉매하는 효소, 면역조정 단백질 및/또는 RNA, DNA-변형 인자, 세포-표면 수용체, 유전자 발현-조절 인자, 키나제, 후성적 변형인자, 및/또는 벡터 복제에 필요한 인자, 및/또는 병원체의 항원 폴리펩티드를 코딩하는 서열이다. 일부 실시양태에서, 출력은 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스 1로부터의 티미딘 키나제 효소 (HSV-TK)이다. 일부 실시양태에서, 상기 면역조정 단백질 및/또는 RNA는 시토카인 또는 콜로니 자극 인자이다. 일부 실시양태에서, DNA-변형 인자는 유전자 결함을 보정하도록 되어 있는 단백질을 코딩하는 유전자, DNA-변형 효소, 및/또는 DNA-변형 시스템의 구성요소이다. 일부 실시양태에서, DNA-변형 효소는 부위-특이적 레콤비나제, 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 CRISPR/Cas DNA 변형 시스템의 단백질 구성요소이다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현-조절 인자는 유전자 발현을 조절할 수 있는 단백질, 또는 유전자 발현을 조절할 수 있는 다중-구성요소 시스템의 구성요소이다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 RNA를 코딩하는 카세트를 포함하며, 여기서 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; (ii) 전사활성인자의 핵산 서열; 및 (iii) 표 1에 열거된 miRNA에 대한 표적 부위 또는 이들의 조합을 포함하며; 여기서 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA는 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA는 출력 및 전사활성인자의 핵산 서열들을 분리하는 폴리시스트론성 발현 요소의 핵산 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA는 3' UTR을 포함하며, 여기서 3' UTR은 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA는 5' UTR을 포함하며, 여기서 5' UTR은 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA는 let-7c 표적 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 표 3에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자는 독립적으로 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, RNA의 발현은 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 표 4에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자는 전사 인자 반응 요소에 결합된 전사 인자의 존재 하에서만 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 카세트는 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 표 5에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력 및 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, (i)에서의 상류 조절 구성요소는 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 카세트의 전사활성인자는 tTA, rtTA, PIT-RelA, PIT-VP16, ET-VP16, ET-RelA, NarLc-VP16, 또는 NarLc-RelA이다.
일부 실시양태에서, 출력은 단백질 또는 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 출력은 치료 단백질 또는 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 출력은 형광 단백질, 세포독소, 전구약물 활성화를 촉매하는 효소, 면역조정 단백질 및/또는 RNA, DNA-변형 인자, 세포-표면 수용체, 유전자 발현-조절 인자, 키나제, 후성적 변형인자, 및/또는 벡터 복제에 필요한 인자, 및/또는 병원체의 항원 폴리펩티드를 코딩하는 서열이다. 일부 실시양태에서, 출력은 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스 1로부터의 티미딘 키나제 효소 (HSV-TK)이다. 일부 실시양태에서, 면역조정 단백질 및/또는 RNA는 시토카인 또는 콜로니 자극 인자이다. 일부 실시양태에서, DNA-변형 인자는 유전자 결함을 보정하도록 되어 있는 단백질을 코딩하는 유전자, DNA-변형 효소, 및/또는 DNA-변형 시스템의 구성요소이다. 일부 실시양태에서, DNA-변형 효소는 부위-특이적 레콤비나제, 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 CRISPR/Cas 시스템의 단백질 구성요소이다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현-조절 인자는 유전자 발현을 조절할 수 있는 단백질, 또는 유전자 발현을 조절할 수 있는 다중-구성요소 시스템의 구성요소이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 인접 폴리핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 인접 폴리핵산을 포함하는 조작된 바이러스 게놈에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조작된 바이러스 게놈은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 게놈, 렌티바이러스 게놈, 아데노바이러스 게놈, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 게놈, 백시니아 바이러스 게놈, 폭스바이러스 게놈, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 게놈, 콕사키바이러스 게놈, 레오바이러스 게놈, 홍역 바이러스 게놈, 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 게놈, 파르보바이러스 게놈, 세네카 밸리 바이러스 게놈, 마라바 바이러스 게놈, 또는 감기 바이러스 게놈으로부터 유래된다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조작된 바이러스 게놈을 포함하는 비리온에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 비리온은 AAV-DJ, AAV8, AAV6, 또는 AAV-B1 캡시드를 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법은 세포의 집단을 본원에 기재된 인접 폴리핵산 분자, 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 본원에 기재된 비리온과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 하나 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성은 표적 세포의 각각에 비해 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고; 여기서 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트는 내인성 전사 인자의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자는 내인성 전사 인자에 상응하는 전사 인자 반응 요소를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트는 프로모터 단편의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자는 이 프로모터 단편을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태를 진단하는 방법은 본원에 기재된 인접 폴리핵산 분자, 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 본원에 기재된 비리온을 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 출력의 수준은 질환 및 또는 병태의 존재 또는 부재를 지시한다.
일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태를 치료하는 방법은 본원에 기재된 인접 폴리핵산 분자, 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 본원에 기재된 비리온을 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 전구약물을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 전구약물은 간시클로비르이고, 여기서 임의적으로 인접 폴리핵산 분자는 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법에 사용하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법에 사용하기 위한 조성물은 세포의 집단을 본원에 기재된 인접 폴리핵산 분자, 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 본원에 기재된 비리온과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 하나 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성은 표적 세포의 각각에 비해 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고; 여기서 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트는 내인성 전사 인자의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자는 내인성 전사 인자에 상응하는 전사 인자 반응 요소를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트는 프로모터 단편의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자는 이 프로모터 단편을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 사용하기 위한 조성물은 본원에 기재된 인접 폴리핵산 분자, 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 본원에 기재된 비리온을 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 출력의 수준은 질환 및 또는 병태의 존재 또는 부재를 지시한다.
일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물은 본원에 기재된 인접 폴리핵산 분자, 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 본원에 기재된 비리온을 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 전구약물을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 전구약물은 간시클로비르이고, 임의적으로 여기서 인접 폴리핵산 분자는 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법은 세포의 집단을 인접 폴리핵산 분자 또는 상기 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서: a) 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 2개 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준은 표적 세포의 각각에 비해 비-표적 세포의 적어도 하위세트, 예컨대 적어도 2개 및 임의적으로 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고; b) 인접 폴리핵산 분자는 (i) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 출력의 핵산 서열; 및 하나 이상의 내인성 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 부위를 포함하는 것인 제1 카세트; 및 (ii) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트를 포함하며; 여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키고; 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법은 세포의 집단을 인접 폴리핵산 분자 또는 상기 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서: a) 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 2개 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준은 표적 세포의 각각에 비해 비-표적 세포의 적어도 하위세트, 예컨대 적어도 2개 및 임의적으로 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고; b) 인접 폴리핵산 분자는 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 mRNA를 코딩하는 카세트를 포함하며, 여기서 RNA는 출력의 핵산 서열; 전사활성인자의 핵산 서열; 및 하나 이상의 내인성 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 부위를 포함하며; 여기서 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키고; 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절된다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물은 인접 폴리핵산을 포함하는 벡터, 인접 폴리핵산을 포함하는 조작된 바이러스 게놈, 또는 폴리핵산을 포함하는 비리온을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 miRNA는 표 1에 열거된 miRNA 또는 표 1에 열거된 miRNA의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 내인성 miRNA는 let-7c, let-7a, let-7b, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7i, miR-22, miR-26b, miR-122, miR-208a, miR-208b, miR-1, miR-217, miR-216a, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트는 내인성 전사 인자의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자는 내인성 전사 인자에 상응하는 전사 인자 반응 요소를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트는 프로모터 단편의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자는 이 프로모터 단편을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 종양 세포이고, 세포-특이적 이벤트는 종양 세포 사멸이다. 일부 실시양태에서, 종양 세포 사멸은 활성화 수용체 리간드, 특이적 항원, 자극 시토카인 또는 이들의 임의의 조합의 발현을 통한 면역 표적화에 의해 매개된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 노화 세포이고, 세포-특이적 이벤트는 노화 세포 사멸이다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포의 집단을 출력에 의해 치료제 또는 독성 화합물로 대사되는 전구약물 또는 비-독성 전구체 화합물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 출력 발현은, 비-표적 세포가 출력 발현의 결여로 인하여 그리고 무관하며 비특이적인 세포 사멸-유도 작용제의 존재 하에서 제거되는 동안, 표적 세포 집단의 생존을 보장한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 관심의 특정한 표현형을 포함하며, 그에 따라 출력 발현은 이 특정한 표현형의 세포에 제한된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 선택되는 세포 유형이고, 세포-특이적 이벤트는 자연적으로는 선택되는 세포 유형에서는 부재하거나 불활성인 유전자의 발현을 통한 신규 기능의 코딩이다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 다세포 유기체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다세포 유기체는 동물이다. 일부 실시양태에서, 동물은 인간이다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 생체외에서 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포의 집단은 생체내에서 접촉된다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 인접 폴리핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 a) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 제1 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; 및 (ii) miRNA에 대한 표적 부위를 포함하며, 여기서 상기 miRNA는 포유동물의 적어도 2개의 상이한 건강한 조직에서 고도로 발현되고/거나 활성이고, 표적 세포의 하나 이상의 유형에서 낮은 수준으로 발현되는 것인 제1 카세트; b) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트를 포함하며, 여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
하기하는 도면은 본 명세서의 일부를 형성하는 것으로서, 본원에 제시된 구체적인 실시양태에 대한 상세한 설명과 함께 해당 도면 중 하나 이상을 참조하면 더 잘 이해될 수 있는 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 설명하기 위하여 포함된다. 도면에 예시되어 있는 데이터가 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 범주를 제한하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
도 1a-1n. 바이러스 벡터에 대한 다중-플라스미드 회로 아키텍처의 번역. 도 1a. 유전자 배열의 개략도. 발산형 (상부) 및 수렴형 (하부) 배열을 생성하였으며; 2개의 변이체를 보조 전사활성인자 PIT의 상이한 변이체를 사용하여 각각에 대해 생성하였다 (발산형: D-P2: PIT=PIT::RelA; D-PV: PIT=PIT::VPI6; 수렴형: C-P2: PIT=PIT::RelA; C-PV: PIT=PIT::VPI6). 도 1b. HeLa 세포에서의 일시적 형질감염 및 이소성 입력 발현을 사용한 백본 DNA 성능의 시험. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: C-P2, D-P2, C-PV, D-PV. 도 1c. HuH-7 및 HeLa 세포에서의 내인성 입력에 대한 구축물의 반응의 평가. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: C-P2, D-P2, C-PV, D-PV. 도 1d. miR-424 표적 서열을 사용하여 예시된 강건한 오프 스위치로서 miRNA 표적을 혼입하는 구축물의 개략도. 발산형 (상부) 및 수렴형 (하부) 배열을 생성하였으며; 2개의 변이체를 보조 전사활성인자 PIT의 상이한 변이체를 사용하여 각각에 대해 생성하였다 (발산형: D-P2: PIT=PIT::RelA-T424; D-PV: PIT=PIT::VPI6-T424; 수렴형: C-P2: PIT=PIT::RelA-T424; C-PV: PIT=PIT::VPI6-T424). 도 1e. TF 입력의 이소성 발현을 통한 HeLa 세포에서의 논리 프로그램의 AND-게이트 구성요소의 확인. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: C-P2-T424, D-P2-T424, C-PV-T424, D-PV-T424. 도 1f. HuH-7 및 HeLa 세포에서의 내인성 전사 입력에 대한 회로 반응의 평가. 막대의 순서는 도 1e와 동일하다. 도 1g. 이소성 입력 전달을 사용한 HeLa 세포에서의 발산형 배향 상에 코딩된 3-입력 프로그램의 완전한 평가. 모든 입력의 부재 하에서의 발현의 결여 및 miR-424가 음성 조절인자라는 사실을 고려하여, miR-424만이 존재하는 입력 조합은 자명한 무용으로 인하여 평가되지 않았다. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: D-P2-T424, D-PV-T424. 도 1h. 유도 TF 입력의 존재 하에서의 miRNA 스위치의 기능성. 회로 출력은 miR-424 모방체의 이소성 형질감염을 갖는 및 갖지 않는 HuH-7 세포에서 시험된다 (X 축 아래에 지시됨). 막대의 순서는 도 1g와 동일하다. 도 1i. 내인적으로 발현된 유도 TF 입력의 존재 하에서의 그들의 억제성에 관한 miR-126 표적을 갖는 회로의 평가. 막대의 순서는 도 1g와 동일하다. 도 1j. 2개의 HCC 세포주 및 음성 대조군으로서 HeLa 세포로의 세포 분류 성능에 대한 miRNA 표적 효과의 평가. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: D-P2, D-PV, D-P2-T424, D-PV-T424, C-PV-T126, D-PV-T126. 도 1k. HCC 세포주 HepG2 및 HuH-7에서의 DJ-위형화된 AAV 벡터 내로 패키징된 혼입된 miRNA 센서를 갖는 및 갖지 않는 회로 패널의 평가. HeLa 및 HCT-116 세포주는 카운터 샘플로서 사용된다. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: CMV, D-P2, D-PV, D-P2-T424, D-PV-T424, C-PV-T126, D-PV-T126. 도 1l. 건강한 1차 간세포를 HCC 세포주로부터 구별하는 그들의 능력에 대한 miRNA의 패널의 시험관내 평가. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: TFF5, T424, T126, T122. 도 1m-1n. 상이한 miRNA 표적 배열 및 출력 억제의 규모에 대한 그들의 영향의 탐구. 도 1m. 상이한 구축물 및 그들의 약칭 표기의 개략도. 도 1n. HepG2 세포 (miR-122 발현 없음) 및 HuH-7 세포 (중간 수준의 miR-122 발현)에서 생성된 출력. 각각의 그룹핑에서의 막대, 좌측에서 우측으로: HepG2, Huh-7. 약어: ITR: AAV2의 내부 말단 반복부; pA: SV40 폴리아데닐화 신호 (수렴형 배향), 발산형 배향으로 mCherry 다음 hGH 및 PIT 유전자 다음 SV40 pA; Cherry: mCherry 형광 단백질을 코딩하는 서열; TATA: 최소 TATA 박스 (Angelici et al., 2016); HNF1 RE: HNF1A 및 HNF1B에 결합하는 반응 요소; PIT RE: PIT::RelA 및 PIT::VP16 전사활성인자에 결합하는 반응 요소; SOX RE: SOX9 및 SOX10 전사 인자, 및 가능하게는 SOX 패밀리 SOX1-SOX15, SOX17, SOX18, SOX21, SOX30, 및 SRY로부터의 다른 전사 인자에 결합하는 DNA 서열; PIT: PIT:RelA 또는 PIT::VP16 융합물 중 어느 하나를 나타내는 프리스티노마이신-유도성 전사활성인자 (Fussenegger et al., 2000). 차트 디자인: 출력 mCherry의 정규화된 발현은 Y 축 상에 제시된다.
도 2a-2f. HCC의 동소성 마우스 모델에서의 특이성 및 효능의 파일럿 평가. 도 2a. DJ-위형화된 바이러스 벡터 내로 패키징된 선택된 회로의 세포 분류 능력의 시험관내 확인. 도 2b. 구성적 대조군 벡터에 비해 HSV-TK 출력을 갖는 회로에 의한 시험관내 세포 제거. 여기서 채용된 회로의 개략도는 막대 차트 위에 제시된다. 모든 세포주 또는 1차 간세포에 대해, 간시클로비르에 대한 용량-반응 (X 축)은 구성적 HSV-TK 벡터, 회로의 존재 하에서, 및 GCV 단독으로 측정된다. 세포 생존율 MTS 판독은 Y 축 상에 제시된다. 도 2c. 패널에서 지시된 바와 같은, 파일럿 실험 (n=2)의 상이한 실험 부문에 대해 제시된 종양-보유 마우스에서의 종양 부담의 진행. 도 2d. 발광에 의해 정량화된 종결 시의 간에서의 종양 부담, 좌측의 화상은 간의 중첩 (그레이스케일) 및 생물발광 신호이다. 도 2e. 종결 후 간에서의 종양 부담의 정량적 분석. 도 2f. 접종 바로 후의 종양 부담 및 종결 시의 종양 부담 사이의 상관관계. 치료 부문으로부터의 2마리의 마우스는 2개의 적색 점에 의해 나타내어진다.
도 3a-3f. 종양-표적화 프로그램을 위한 선택적이고 폭넓게 적용가능한 miRNA 입력의 확인. 도 3a. 건강한 간에서의 그들의 높은 발현 및 HCC 샘플에서의 낮은 발현에 기반한 miRNA 후보의 세포 프로파일링 및 순위화의 개략도. 도 3b. 미리 선택된 miRNA 입력의 기능적 확인의 개략도. 리포터 바이러스 벡터는 모든 입력에 대해 생성되고, 모든 벡터는 입력의 생물학적 활성을 평가하기 위해 모든 관심의 샘플에 (하나씩) 전달된다. 도 3c. 2개의 HCC 세포주 및 1차 건강한 간세포에서의 miRNA 패널의 기능적 평가의 결과. 낮은 리포터 발현은 높은 miRNA 활성에 상응한다. FF5는 대조군 표적이다. 도 3d. NGS 프로파일링 실험 (Dastor et al., 2018)에서 확인된 miRNA 발현 카운트 및 선택된 miRNA 센서의 기능적 반응 사이의 상관관계. 추세선은 리프레서 힐(Hill) 함수에 피팅된다. 도 3e. 전신 전달 후 상이한 마우스 기관에서의 miRNA 리포터 벡터의 패널의 정량화된 발현. 동일한 기관에서의 상이한 리포터의 발현 (차트 위에 지시됨)은 함께 그룹핑된다. 막대 음영은 어느 기관에서 리포터가 문헌 분석 및 프로파일링 데이터에 기반하여 반응할 것으로 예상되었는지를 지시한다. 값은 TFF5 표적을 보유하는 대조군 벡터에 대해 정규화되며; 그것으로, 이 표적은 생체내에서 난해한 입력에 반응하고 있으며 많은 리포터는 1 초과의 출력 값을 초래함이 명백하다. 도 3f. 다양한 기관에서의 리포터 발현의 대표적 화상. 리포터의 명칭은 좌측에 지시된다. Cerulean 패널은 구성적 mCerulean 내부 대조군의 발현을 제시한다. Cherry 패널은 지시된 miRNA 표적이 제공된 mCherry 리포터의 잔류 발현을 제시한다.
도 4a-4c. 시험관내에서의 회로 특이성의 확인. 도 4a. 회로의 작용의 메커니즘을 평가하는데 사용된 대조군 구축물의 패널. 약어는 도 1a, 1d 및 1m에서와 동일하다. 도 4b. 10개의 세포주 및 1차 간세포에서의 내인성 입력에 대한 C.TF-AND 하위-회로 반응의 맵핑. 모든 세포주에 대해, 이들 세포에서 구성적 출력에 대해 정규화된 SOX9/10 및 HNF1A/B에 대한 피드백-증폭된 센서의 로그-변환된 출력이 각각 X 및 Y 축 상에 제시된다. C.TF-AND 회로의 출력은 Z 축 상에 제시된다. 도 4c. 10개의 세포주 및 1차 간세포에서의 HCC.V2 회로 반응의 맵핑. C.TF-AND 회로의 로그-변환된 출력 및 로그-변환된 C.let-7c 리포터 회로 반응 규모가 축 X 및 Y 상에 플롯팅되는 반면, 모든 세포주에서의 완전한 회로의 출력은 축 Z 상에 제시된다. 주어진 세포 유형에 대한 모든 값은 그 세포 유형에서의 구성적 발현에 대해 정규화된다.
도 5a-5d. 회로 표적화 특이성의 생체내 특징규명. 도 5a. 다양한 기관에서의 B1-위형화된 AAV 벡터를 사용하여 수득된, 선택된 하위-프로그램, 대조군 벡터, 전체 프로그램, 및 배경의 출력. 값은 정량적 화상 분석에 의해 수득된다. 도 5b. 지시된 바와 같은 상이한 벡터로부터의 mCherry의 발현을 제시하는, 상이한 기관을 나타내는 조직 슬라이스의 화상. 위상 화상 및 mCherry 채널이 제시된다. 2개의 상이한 노출을 사용하여 mCherry 변화의 큰 동적 범위를 반영하는 췌장 슬라이스를 나타낸다. 도 5c. 종양에서의 및 HepG2-종양 보유 마우스의 기관에서의 HCC.V2 회로로부터의 mCherry 출력의 발현. 종양은 mCitrine으로 안정하게 형질도입되고, 황색 형광 채널에서 제시하고 있다. 도 5d. 화상 프로세싱을 사용하여 수득된 종양-보유 마우스의 종양 및 다양한 기관에서의 mCherry 발현의 정량적 분석.
도 6a-6b. 2개의 HCC 세포주 및 1차 간세포에서의 회로 및 대조군의 시험관내 효능. 도 6a. 임의의 AAV 벡터의 부재 하에서의 (정사각형), 구성적 HSV-TK 발현 카세트 (삼각형) 또는 완전한 회로 (원)의 존재 하에서의 GCV에 대한 용량-반응. MTS 검정을 사용하여 측정된 세포 생존율은 Y 축 상에 제시된다. 회로 및 그들의 ID의 개략적 제시는 상부에 제시된다. 도 6b. 구성적 HSV-TK 카세트 및 2개의 상이한 종양 표적화 프로그램의 상이한 벡터 투여량에 대한 HuH-7 세포주의 민감도. 상부 차트, 2개의 회로 변이체 사이의 비교; 하부, 구성적 벡터 및 제2 회로 변이체 사이의 비교.
도 7a-7f. 동소성 마우스 모델에서의 HCC-표적화 회로의 효능. 도 7a. 종양 확립 및 치료 요법의 개략도. 도 7b. 다양한 실험 부문에서의 시간 경과에 따른 종양 부담. 생체내 전신 생물발광을 통해 측정된 종양 부담은 시간 경과에 따라 화상화된다. 각각의 동물에 대해, 부담은 GCV 주사 요법을 개시하기 전의 날에서의 부담에 대해 정규화된다. 도 7c. GCV 주사 요법을 개시하기 전의 날에서의 종양 부담에 대해 정규화된, 주요 실험 부문에서의 개별적 동물에 대한 종양 부담 발달을 제시하는 스파이더 플롯. 도 7d. 다수의 실험 부문으로부터의 개별적 동물의 전신 발광의 대표적 화상. 도 7e. 다수의 실험 부문에 대한 개별적 간의 화상 및 종결 시의 전체-기관 생물발광에 의해 측정된 간에서의 종양 부담. 도 7f. 도 7e에서의 종양 부담의 정량화.
도 8a-8c. AAV-B1 종양 형질도입의 생체내 평가. 도 8a. 대조군 벡터, C.TF-AND 하위프로그램 및 DJ-위형화된 AAV 벡터에서 패키징된 전체 프로그램의 출력은 간 및 HepG2-종양에서의 B1-위형화된 AAV 벡터에서 패키징된 전체 회로의 출력과 비교된다. 종양은 mCitrine으로 안정하게 형질도입되고, 황색 형광 채널에서 제시하고 있다. 도 8b. AAV-DJ 및 AAV-B1 전달 시 종양에서의 HCC.V2 유도된 출력 수준 (mCherry)의 정량화. 값은 정량적 화상 분석에 의해 수득된다. 도 8c. 큰 종양 결절의 코어 섹션에서의 B1-위형화된 AAV에 의해 전달된 HCC.V2 회로로부터의 출력.
도 9a-9b. 다수의 간 보호 miRNA를 조합하는 최적화된 회로의 합리적인 디자인. 도 9a. 강한 miR-let7c 및 약한 miR-122 억제를 조합하는 후보 회로 (HCC.V3)의 개략도. 강한 miR-let7c 억제는 HCC.V2에 기재된 표적 배열구조를 사용함으로써 수득된다. miR-122에 의해 유발된 억제 강도는 miRNA 표적의 수, 배열 또는 서열을 다양화함으로써 조정될 수 있다. HCC.V1에 비해 miR-122 억제 수준을 감소시키는 3가지 상이한 전략이 제시된다: (i) 회로의 전사활성인자 분지 상에서만 완벽한 miR-122 표적 (T-122*)의 사용; (ii) 불완전한 상보성을 갖는 miR-122 표적 (T-122*)을 사용한 전사활성인자 및 출력의 이중 억제; 또는 (iii) 전사활성인자를 억제하는 완벽한 표적 및 출력을 억제하는 불완전한 miRNA 표적에 의존하는 혼합된 접근법. HCC 세포주 (특히 HUH-7)의 패널에서의 발현의 소실을 최소화하면서 간 주에서의 억제를 최대화하는 후보가 선택된다. 각각의 후보는 위치화 변이체에 비해 둘 다의 가능한 miRNA 표적에서 시험된다. 도 9b. miR-122에 의해 조절되는 내인성 유전자 (P4HA1)의 보존된 UTR 영역으로부터 유래된 불완전한 miR-122 표적 (T-122*)의 예 (서열식별번호(SEQ ID NO): 305 및 306, 각각 상부 및 하부). 불완전한 상보성을 갖는 표적은 내인성 유전자에서 발생하는 서열을 사용함으로써 또는 miRNA 시드 서열을 플랭킹하는 영역에서 무작위 돌연변이를 도입함으로써 수득된다. 둘 다의 접근법은 상이한 용량-반응 프로파일을 갖는 표적의 선택을 생성하는데 사용될 것이다.
분자 컴퓨팅 (Benenson, 2012) 및 합성 생물학 (Weber and Fussenegger, 2012)의 약속 중 하나는 질환-관련 신호를 복잡한 방식으로 및 실시간으로 감지하고 그에 반응하여 정밀하고 "주문형" 치료 작용을 초래하는 "스마트한" 요법의 합리적인 디자인이었다 (Benenson et al., 2004). 이 약속을 이행하기 위해, 3가지 별개의 과제가 다루어진다. 첫째로, 치료적으로 관련된 감지-계산-반응 캐스케이드를 위한 청사진을 디자인하기 위해 질환 메커니즘이 충분히 이해된다. 특히, 관련된 입력이 확인되고, 가장 효율적이고 가장 적은 독성 반응을 초래할 프로그램이 바람직하게 결정된다. 둘째로, 이들 치료 캐스케이드를 실행할 수 있는 강건한 합성 생물학 플랫폼이 존재하거나, 또는 상기 목적을 위해 데 노보 개발된다. 셋째로, 이들 플랫폼은 임상적으로 관련된 치료 양상에 적응된다. 후자 중에서, 세포 및 유전자 요법은 이들 양상 둘 다가 조작된 유전자 탑재물의 혼입을 가능하게 하고, 종종 이를 요구한다는 사실을 고려하여, 합성 유전자 회로의 임상적 번역에 가장 적합한 것으로 확인되었다.
모든 3가지 과제를 다루는 것은 번역 설정에서의 접근법을 개발하기 위한 잠재적인 의학적 징후의 분야를 좁힌다. 한 가지 연구는 세포-기반 이식물에 초점을 맞추었는데, 여기서 유전자 변형된 세포는 혈액 순환에서 특정한 질환-관련 신호를 감지하고, 이에 반응하여 치료 특성을 갖는 분자 작용제를 분비할 수 있다. 이 연구에서, 세포 이식물은 유기체 질환 상태를 감지하고, 이에 반응하여 전체 유기체에 영향을 미치는 요법을 생성하는 감시병 및 "공장"으로서 역할을 한다 (Auslander et al., 2014; Tastanova et al., 2018; Ye et al., 2017). 두번째 연구는 CAR-T 세포 요법 접근법에 대해 수립되었고, 다중-입력 조합적 감지 특성을 갖는 이들 세포를 증대시켜 표면 항원의 조합을 발현하는 암 세포에 대한 그들의 특이성을 개선시키고, 온-표적, 오프-종양 효과를 감소시켰다 (Cho et al., 2018; Kloss et al., 2013; Roybal et al., 2016; Zah et al., 2016).
유전자 요법의 분야에서 합성 생물학 적용은 또한 동물 질환 모델에서 초기 성공을 제시하였다. 난소암 세포를 다루고 이들 세포에서 면역조정인자를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 세트, 및 조작된 T-세포를 조합하는 혼성 접근법은 복강으로의 난소 전이의 마우스 모델에서 효능을 나타내었다. 세포 표적화는 그의 조합이 종양 특이적인 것으로 나타난 2개의 프로모터 사이의 miRNA 스폰지-가능화된 AND 게이트로서 실행되었다 (Nissim et al., 2017). 또 다른 최근의 연구에서, 종양용해성 아데노바이러스는 그의 생활 주기의 다중-입력 논리적 제어에 기반하여 복제하도록 조작되었고, 피하 종양 내로의 종양내 주사 시 효능을 나타내었다 (Huang et al., 2019).
유전자 및 세포 요법에 대한 합성 유전자 회로의 주요 부가 가치는 치료 반응을 "프로그래밍"하는, 즉, 치료 작용의 특이성, 시기, 및 투여량을 미리 결정된 방식으로, 잠재적으로 동적 방식으로 및 다양한 피드백 조절 모티프와 조합으로 조절하는 정교한 접근법으로부터 발생한다 (Angelici et al., 2016; Xie et al., 2011). 그러나, 그의 발현을 조절하는 유전자 회로를 갖는 알려진 치료 트랜스진을 제공하는 것은 그의 캡시드를 통해 어느 정도의 기관 또는 세포 유형 특이성을 추가로 갖는 바이러스 벡터 내로 패키징된 구성적으로-유도된 또는 조직-특이적 프로모터-유도된 치료 유전자를 종종 사용하는 보다 확립된 접근법보다 반드시 더 낫다고 할 수 없다 (Al-Zaidy et al., 2019; Landegger et al., 2017; Scholl et al., 2016). 대안적으로, 바이러스 벡터는 관심의 조직 또는 기관 내로 직접적으로 주사되어 (Juttner et al., 2019; Nelson et al., 2016), 특이적으로 다루어질 필요가 있는 세포 유형의 다양성을 감소시킨다. 사실, 이 접근법에 기반하여 조작된 임상적으로 승인된 CAR-T 세포 (June et al., 2018) 및 많은 유전자 요법 (Keeler and Flotte, 2019)을 포함하는 대다수의 승인된 요법은 만족할 만한 효능 및 안전성 프로파일을 나타낸다. 따라서, 이 이점을 입증하는 것은 합성 생물학 커뮤니티에게 부담이다.
암은 합성 생물학에 의해 공급된 요법으로부터 이익을 얻을 엄청난 잠재성을 갖는 질환이다. 심지어 좁게 정의된 암은 환자 그룹 사이 및 심지어 동일한 환자에서의 개별적 종양 사이 둘 다에서 이질성 질환이다 (Dagogo-Jack and Shaw, 2018). 환자에서의 종양은 종종 원발성 및 전이성 로커스 사이에 확산되어, 종양내 주사를 사례의 하위세트에 대해서만 가능하게 만든다. 마지막으로, 항-종양 요법은 매우 독성이며, 이는 비-종양 세포에서의 그들의 활성화가 종종 극적인 유해 효과를 초래할 것임을 의미한다. 함께, 종양의 확산된 집단을 다루기 위해 전신적으로 작용제를 전달할 필요와 조합되어 복잡한 이질적 세포 집단을 정밀하게 다루어야 할 필요는 합성 생물학 접근법의 사용이 유익할 수 있음을 시사한다.
본원에 개시되는 것은 통상적으로 사용되는 유전자 요법 바이러스 및 비-바이러스 벡터와 혼화성인 분류기 유전자 회로를 코딩하는 인접 폴리핵산 분자이다. 또한 본원에 개시되는 것은 세포의 집단에서 출력 (즉, 관심의 유전자)의 발현에 대한 복잡한 다중-입력 제어를 실행하는 방법이다. 이들 방법은 질환, 예컨대 암 (예를 들어, 간세포 암종 (HCC))의 진단 및 치료를 위한 유전자 요법을 포함한다.
I. 인접 폴리핵산 분자의 조성
일부 측면에서, 본 개시내용은 유전자 회로를 포함하는 인접 폴리핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "인접 폴리핵산 분자"라는 용어는 단일 연속 핵산 분자 (즉, 단일-가닥 폴리핵산 분자) 또는 2개의 상보적인 연속 핵산 분자 (즉, 2개의 상보적인 가닥을 포함하는 이중-가닥 폴리핵산 분자)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 RNA (예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥)이다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 DNA (예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥)이다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 DNA:RNA 혼성체이다.
본원에 기재된 인접 폴리핵산은 코딩된 하나 이상의 발현 카세트인 유전자 회로를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "발현 카세트" 및 "카세트"라는 용어는 상호교환가능하게 사용되며, (i) RNA를 코딩하는 (예를 들어, 출력 및/또는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는) 핵산 서열; 및 (ii) RNA의 발현 수준을 조절하는 핵산 서열 (예를 들어, 전사활성인자 반응 요소, 전사 인자 반응 요소, 최소 프로모터, 및/또는 프로모터 요소)을 포함하는 폴리핵산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 단일 카세트로 이루어진 유전자 회로를 포함한다. 다른 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 2개 이상의 카세트를 포함하는 유전자 회로를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 2개 이상의 카세트를 포함하고, 적어도 2개의 카세트는 발산형 배향으로 존재한다. 본원에 사용된 바와 같이, "발산형 배향"이라는 용어는 하기인 배열구조를 지칭한다: (i) 제1 카세트 및 제2 카세트의 전사가 인접 폴리핵산 분자의 상이한 가닥 상에서 진행되며, (ii) 제1 카세트의 전사는 제2 카세트로부터 멀리 지향되고, 제2 카세트의 전사는 제1 카세트로부터 멀리 지향됨. 도 1a (상부 개략도)는 다양한 발산형 배열구조의 예를 제공한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 2개 이상의 카세트를 포함하고, 적어도 2개의 카세트는 수렴형 배향으로 존재한다. 본원에 사용된 바와 같이, "수렴형 배향"이라는 용어는 하기인 배열구조를 지칭한다: (i) 제1 카세트 및 제2 카세트의 전사가 인접 폴리핵산 분자의 상이한 가닥 상에서 진행되며, (ii) 제1 카세트의 전사는 제2 카세트를 향해 지향되고, 제2 카세트의 전사는 제1 카세트를 향해 지향됨. 일부 실시양태에서, 2개의 수렴형 카세트는 폴리아데닐화 서열을 공유한다. 도 1a (하부 개략도)는 다양한 수렴형 배열구조의 예를 제공한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 2개 이상의 카세트를 포함하고, 적어도 2개의 카세트는 머리-대-꼬리 배향으로 존재한다. 본원에 사용된 바와 같이, "머리-대-꼬리"라는 용어는 하기인 배열구조를 지칭한다: (i) 제1 카세트 및 제2 카세트의 전사 또는 번역이 인접 폴리핵산 분자의 동일한 가닥 상에서 진행되며, (ii) 제1 카세트의 전사 또는 번역은 제2 카세트를 향해 지향되고, 제2 카세트의 전사 또는 번역은 제1 카세트로부터 멀리 지향됨 (5'...→...→...3').
일부 실시양태에서, 2개의 카세트는 1개 이상의 인슐레이터에 의해 분리된다. 인슐레이터는 인슐레이터-결합 단백질에 의해 결합되는 경우 조절 구성요소 또는 반응 구성요소를 다른 인접 조절 요소의 효과로부터 차단하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 인접 폴리핵산 분자의 카세트를 플랭킹하는 것은 각각의 카세트를 다른 카세트의 조절 요소의 효과로부터 차단할 수 있다. 인슐레이터의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
본원에 기재된 유전자 회로는 출력 분자 (즉, 관심의 유전자)의 발현 수준을 조절하는 하나 이상의 메커니즘을 이용한다. 따라서, 본원에 기재된 인접 폴리핵산의 각각은 출력의 핵산 서열을 포함하는 RNA를 코딩하는 카세트를 포함한다. 예시적인 출력 분자는 하기에 제공된다. 출력의 핵산 서열을 포함하는 RNA는 전사활성인자 반응 요소 (및, 임의적으로, RNA의 발현을 조절하는 하나 이상의 추가의 핵산 서열, 예컨대 전사 인자 반응 요소, 최소 프로모터, 및/또는 프로모터 요소)에 작동가능하게 연결된다.
출력 분자 (즉, 관심의 유전자)의 발현 수준을 조절하기 위해, 본원에 기재된 인접 폴리핵산의 각각은 (i) 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 RNA (예를 들어, mRNA)를 코딩하는 카세트; 및 (ii) miRNA 표적 부위를 포함하는 RNA를 코딩하는 카세트를 추가로 포함한다. 예시적인 전사활성인자 및 miRNA 표적 부위는 하기에 제공된다.
전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 RNA (예를 들어, mRNA)를 코딩하는 카세트는 RNA의 발현을 조절하는 핵산 서열 (예를 들어, 전사활성인자 반응 요소, 전사 인자 반응 요소, 최소 프로모터, 및/또는 프로모터 및/또는 인핸서 요소)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 RNA를 코딩하는 카세트는 출력의 핵산 서열을 포함하는 RNA를 코딩하는 동일한 카세트이다 (즉, 단일 RNA가 전사활성인자 및 출력 둘 다의 핵산 서열을 포함함).
miRNA 표적 부위를 포함하는 RNA를 코딩하는 카세트는 출력의 핵산 서열을 포함하는 RNA를 코딩하는 동일한 카세트일 수 있다 (즉, 출력의 핵산 서열을 포함하는 RNA가 miRNA 표적 부위를 추가로 포함함). 대안적으로 또는 추가로, miRNA 표적 부위를 포함하는 RNA를 코딩하는 카세트는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 RNA를 코딩하는 동일한 카세트일 수 있다 (즉, 전사활성인자의 핵산 서열이 miRNA 표적 부위를 추가로 포함함).
일부 실시양태에서, 카세트에 의해 코딩되는 RNA의 핵산 서열은 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 포유동물 세포에서의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 적합하다.
(i) MiRNA 표적 부위
본원에 기재된 인접 폴리핵산의 각각은 miRNA 표적 부위를 포함하는 RNA (예를 들어, 출력을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 RNA 및/또는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 RNA)를 코딩하는 하나 이상의 카세트를 포함한다. MiRNA는 번역 억제, mRNA 절단, 및 탈아데닐화를 포함하는 이들이 다양한 방식으로 결합하는 RNA의 수준을 하향조절하는 전형적으로 길이가 21-25개의 뉴클레오티드인 작은 비-코딩 RNA의 부류이다. 본원에 사용된 바와 같이, "miRNA 표적 부위"라는 용어는 miRNA에 상보적이고 그에 의해 조절되는 서열을 지칭한다. miRNA 표적 부위는 miRNA 표적 부위에 결합하여 그를 조절하는 miRNA와 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상보성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 7-8, 7-9, 7-10, 8-9, 8-10, 또는 9-10개의 miRNA 표적 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 다수의 miRNA 표적 부위를 포함하고, miRNA 표적 부위의 각각은 동일한 서열을 갖거나, 또는 동일한 miRNA에 의해 조절되는 상이한 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 별개의 miRNA 표적 부위를 포함하는 별개의 miRNA에 의해 조절되는 2개 이상의 miRNA 표적 부위 (즉, 별개의 miRNA 표적 부위)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 별개의 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 7-8, 7-9, 7-10, 8-9, 8-10, 또는 9-10개의 별개의 miRNA 표적 부위를 포함한다.
본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA의 miRNA 표적 부위는 RNA의 서열 내의 어디에나 위치할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 3' UTR을 포함하고, 3' UTR은 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 인트론을 포함하고, 인트론은 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 5' UTR을 포함하고, 5' UTR은 miRNA 표적 부위를 포함한다.
예시적인 miRNA 및 miRNA 표적 부위는 표 1에 열거된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 표 1에 열거된 miRNA에 대한 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 표 1에 열거된 miRNA에 상응하는 다수의 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위 및 miR-122 표적 부위를 포함하는 조합)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 표 1에 열거된 miRNA 표적 부위와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 표 1에 열거된 miRNA 표적 부위와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 다수의 miRNA 표적 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7c 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합 (예를 들어, let7c 표적 부위 및 miR-122 표적 부위의 조합)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 let-7c 표적 부위 (즉, hsa-let-7c에 상보적이고 그에 의해 조절되는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서 let-7c 표적 부위는 핵산 서열 AACCATACAACCTACTACCTCA (서열식별번호: 42)로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 miR-22 표적 부위 (즉, miR-22에 상보적이고 그에 의해 조절되는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서 miR-22 표적 부위는 핵산 서열 ACAGTTCTTCAACTGGCAGCTT (서열식별번호: 43)로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 miR-26b 표적 부위 (즉, miR-26b에 상보적이고 그에 의해 조절되는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서 miR-26b 표적 부위는 핵산 서열 ACCTATCCTGAATTACTTGAA (서열식별번호: 44)로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 miR-126-5p 표적 부위 (즉, miR-126-5p에 상보적이고 그에 의해 조절되는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서 miR-126-5p 표적 부위는 핵산 서열 CGTGTTCACAGCGGACCTTGAT (서열식별번호: 45)로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 miR-424 표적 부위 (즉, miR-424에 상보적이고 그에 의해 조절되는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서 miR-424 표적 부위는 핵산 서열 GTCCAAAACATGAATTGCTGCT (서열식별번호: 48)로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트에 의해 코딩되는 RNA는 miR-122 표적 부위 (즉, miR-122에 상보적이고 그에 의해 조절되는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서 miR-122 표적 부위는 핵산 서열 CAAACACCATTGTCACACTCCA (서열식별번호: 46)로 이루어진다.
표 1. 예시적인 miRNA 및 예시적인 miRNA 표적 부위.
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인접 폴리핵산은 단일 카세트로 이루어지며, 여기서 단일 카세트는 (출력의 핵산 서열 및 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것에 추가로) miRNA 표적 부위를 포함하는 RNA를 코딩한다.
다른 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 2개 이상의 카세트를 포함하며, 이 중 적어도 하나는 miRNA 표적 부위를 포함하는 RNA를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자의 다수의 카세트는 적어도 하나의 miRNA 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산의 각각의 miRNA 표적 부위는 유일한 것이다 (즉, 인접 폴리핵산은 miRNA 표적의 1개의 카피만을 포함함). 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 동일한 핵산 서열인 적어도 하나의 miRNA 표적 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 적어도 하나의 miRNA 표적 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 카세트의 적어도 하나의 miRNA 표적 부위는 동일한 miRNA에 의해 조절되는 상이한 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 제1 카세트는 miRNA 표적 부위 X를 포함할 수 있고, 제2 카세트는 miRNA 표적 부위 Y를 포함할 수 있고, miRNA Z는 표적 부위 X 및 표적 부위 Y를 조절한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인접 폴리핵산의 miRNA 표적 부위를 조절하는 miRNA (즉, 적어도 하나의 miRNA)는 출력 발현이 낮아야 하는 (예를 들어, 다세포 유기체, 예컨대 포유동물의) 적어도 하나의 세포 유형에서 고도로 발현되고/거나 활성이다. miRNA는 본원에 기재된 바와 같이, 출력 발현이 상기 조직 세포 유형에서 참조 인접 폴리핵산 (즉, miRNA에 의해 조절되는 miRNA 표적 부위(들)를 결여하지만, 그렇지 않다면 동일한 핵산 서열을 함유함)의 출력 발현의 수준에 비해 적어도 50% 감소되는 경우, 고도로 발현되고/거나 활성이다. 일부 실시양태에서, 출력은 참조 인접 폴리핵산에 비해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 감소된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인접 폴리핵산의 miRNA 표적 부위를 조절하는 miRNA (즉, 적어도 하나의 miRNA)는 출력 발현이 낮아야 하는 (예를 들어, 다세포 유기체, 예컨대 포유동물의) 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1000개의 세포 유형에서 고도로 발현되고/거나 활성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인접 폴리핵산의 miRNA 표적을 조절하는 miRNA (즉, 적어도 하나의 miRNA)는 출력 발현이 높아야 하는 (예를 들어, 다세포 유기체, 예컨대 포유동물의) 적어도 하나의 표적 세포 유형에서 낮은 발현을 갖고/거나 불활성이다. miRNA는 출력 발현이 상기 표적 세포 유형에서 참조 인접 폴리핵산 (즉, miRNA에 의해 조절되는 miRNA 표적 부위(들)를 결여하지만, 그렇지 않다면 동일한 핵산 서열을 함유함)의 출력 발현의 수준에 비해 40% 미만 감소되는 경우, 본원에 기재된 바와 같이 낮은 발현을 갖고/거나 불활성이다. 일부 실시양태에서, 출력은 참조 인접 폴리핵산에 비해 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만 감소된다. 일부 실시양태에서, miRNA 표적을 포함하는 인접 폴리핵산 및 참조 연속 폴리핵산 분자로부터의 출력 발현의 수준 사이에 통계적 차이가 없다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인접 폴리핵산의 miRNA 표적 부위를 조절하는 miRNA (즉, 적어도 하나의 miRNA)는 출력 발현이 높아야 하는 (예를 들어, 다세포 유기체, 예컨대 포유동물의) 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1000개의 표적 세포 유형에서 낮은 수준으로 발현되고/거나 불활성이다.
(ii) 예시적인 전사활성인자
본원에 기재된 인접 폴리핵산의 각각은 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 RNA (예를 들어, mRNA)를 코딩하는 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 단일 전사활성인자의 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 다수의 전사활성인자 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 전사활성인자)의 핵산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "전사활성인자" 또는 "전사활성인자 단백질"이라는 용어는 출력 (즉, 관심의 유전자)의 발현을 전사활성화시키며 출력 (즉, 관심의 유전자)을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 전사활성인자 반응 요소에 결합하는, 인접 폴리핵산 분자 상에 코딩되는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자는 독립적으로 (즉, 임의의 추가의 인자의 부재 하에서) 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다. 다른 실시양태에서, 전사활성인자는 전사 인자 반응 요소에 결합된 전사 인자의 존재 하에서만 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자 단백질은 DNA-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 자연-발생 서열과 구별되는 DNA 서열에 결합하도록 조작된다 (즉, 자연-발생이 아님). DNA-결합 도메인의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 아연-핑거 기술 또는 TALEN 기술을 사용하여 유도되거나, 또는 박테리아로부터의 2-구성요소 신호전달 경로의 돌연변이 반응 조절인자로부터 유래하는 DNA-결합 도메인이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 포유동물 단백질로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 비-포유동물 단백질로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 박테리아, 효모, 또는 식물에서 기원하는 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 전사활성인자 반응 요소를 표적화하기 위한 추가의 구성요소 (예를 들어, 단백질 또는 RNA)를 필요로 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 전사활성인자 반응 요소를 표적화하기 위한 가이드 RNA의 추가의 구성요소를 필요로 하는 CRISPR/Cas 단백질 (예를 들어, Cas1, Cas2, Cas3, Cas5, Cas4, Cas6, Cas7, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, Csm2, Cmr5, Csx10, Csx11, Csf1, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3)의 것이다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자 단백질은 자연-발생 전사 인자로부터 유래되며, 여기서 자연-발생 전사 인자의 DNA-결합 도메인이 돌연변이되어 야생형 전사 인자에 비해 변경된 DNA 결합 특이성을 초래한다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자는 자연-발생 전사 인자이다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자 단백질은 전사활성화 도메인을 추가로 포함한다 (즉, DNA 결합 도메인 및 전사활성화 도메인을 포함하는 융합 단백질). 본원에 사용된 바와 같이, "전사활성화 도메인"이라는 용어는 최소 프로모터로 전사 기구를 동원하는 기능을 하는 단백질 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 전사활성화 도메인은 독립적으로는 유전자 활성화를 촉발시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 전사활성화 도메인은 자연-발생이다. 다른 실시양태에서, 전사활성화 도메인은 조작된다. 전사활성화 도메인의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, RelA 전사활성화 도메인, VP16, VP48 및 VP64가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적인 전사활성인자는 표 2에 열거된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 카세트의 전사활성인자는 표 2에 열거된 전사활성인자 또는 표 2에 열거된 하나 이상의 전사활성인자와 그의 아미노산 서열의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 전사활성인자이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인접 폴리핵산 분자는 표 2에 열거된 전사활성인자의 조합 또는 표 2에 열거된 하나 이상의 전사활성인자와 그의 아미노산 서열의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 전사활성인자의 조합을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 카세트의 전사활성인자는 tTA, rtTA, PIT-RelA, PIT-VP16, ET-VP16, ET-RelA, NarLc-VP16 또는 NarLc-RelA이다. 예를 들어, 문헌 [Angelici B. et al., Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537]을 참조한다.
표 2. 예시적인 전사활성인자. DNA 서열은 나타내어진 단백질 서열을 코딩할 수 있는 예일 뿐이며; 축중성 코돈으로 인하여, DNA 서열의 매우 많은 세트는 동일한 단백질 서열을 코딩할 수 있다. 전사활성인자 도메인, 예컨대 RelA 및 VP16은 가능한 전사활성인자 도메인 (TAD)의 예일 뿐이다. "VP16 TAD"는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 유전자로부터 유래된 전사활성인자 도메인을 나타내며; 다수의 도메인 및 그들의 조합 및 그들의 돌연변이체는 DNA 결합 도메인에 융합되는 경우 전사활성인자 도메인으로서 역할을 할 수 있다. 전사활성인자의 DNA 결합 도메인 (DBD)은, 전장 단백질로부터 유래되는 경우, 이러한 도메인의 예일 뿐이며; 이들은 그들의 전장 단백질 전구체로부터 보다 많은 아미노산을 포함하도록 추가로 감소되거나 증가될 수 있다. 원핵생물 2 구성요소 신호전달 시스템의 반응 조절인자로부터 유래된 DBD는 이. 콜라이(E. coli)에서의 그들의 단백질 서열에 기반하여 제시되지만, 다른 원핵생물 균주 및 종으로부터의 이들 유전자의 이종상동체는 또한 사용될 수 있다. 추가로, 이. 콜라이에서 이종상동체를 갖지 않는 2-구성요소 신호전달 경로로부터의 반응 조절인자의 DNA 결합 도메인은 또한 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. M (밑줄표시됨)은 그들의 번역을 가능하게 하는 다양한 DBD 앞에 도입된 시작 코돈을 나타낸다. "::"는 DBD 및 TAD 사이의 융합점을 나타낸다.
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(iii) 예시적인 출력 분자
본원에 기재된 인접 폴리핵산의 각각은 출력 (즉, 관심의 유전자)의 핵산 서열을 포함하는 RNA (예를 들어, mRNA)를 코딩하는 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 단일 출력의 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 다수의 출력 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 출력)의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 출력은 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 단백질을 코딩하는 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 출력은 비-코딩 RNA 분자이다. 비-코딩 RNA 분자의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), miRNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, 및 긴 ncRNA가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 출력은 치료 분자 (즉, 질환의 치료에 관련됨), 예컨대 치료 단백질 또는 RNA 분자이다. 치료 분자의 예에 대해서는 항체 (예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날; 키메라; 인간화; 항체 단편 및 항체 유도체 (이중특이적, 삼중특이적, scFv, 및 Fab)를 포함함), 효소, 호르몬, 염증 분자, 항-염증 분자, 면역조정 분자, 항암 분자, 짧은-헤어핀 RNA, 짧은 간섭 RNA 및 miRNA가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료 분자의 상기 부류의 구체적인 예에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것은 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 출력은 병원체로부터 유래되고 신체에서 생성되는 경우 면역 반응을 유발하는 것으로 알려진 항원 단백질, 단백질 도메인, 또는 펩티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 출력은 검출가능한 단백질, 예컨대 형광 단백질이다.
일부 실시양태에서, 출력은 세포독소이다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포독소"라는 용어는 세포에 대해 독성인 물질을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 출력은 세포독성 단백질이다. 세포독성 단백질의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 그라눌리신, 퍼포린/그란자임 B, 및 Fas/Fas 리간드가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 출력은 전구약물의 활성화를 촉매하는 효소이다. 전구약물 활성화를 촉매하는 효소의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 카르복실에스테라제, 아세틸콜린에스테라제, 부티릴콜린에스테라제, 파락소나제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제, 발라시클로비라제, 전립선-특이적 항원, 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제, 카르복시펩티다제, 아미다제, β-락타마제, β-갈락토시다제, 및 시토신 데아미나제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌 [Yang Y. et al., Enzyme-mediated hydrolytic activation of prodrugs. Acta. Pharmaceutica. Sinica B. 2011 Oct; 1(3): 143-159]을 참조한다. 마찬가지로, 다양한 전구약물이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 아시클로비르, 알로퓨리나올, 아지도티미딘, 밤부테롤, 베캄피실린, 카페세타빈, 캅토프릴, 카르바마제핀, 카리소프로돌, 시클로포스파미드, 디에틸스틸베스트롤 디포스페이트, 디피베프린, 에날라프릴, 팜시클로비르, 플루다라빈 트리포스페이트, 플루오로우라실, 포스마프레나비르, 포스펜토인, 푸르술티아민, 가바펜틴 엔카르빌, 간시클로비르, 겜시타빈, 히드라지드 MAO 억제제, 레플루노미드, 레보도파, 메탄아민, 메르캅토퓨린, 미토마이신, 몰시도민, 나부메톤, 올살라진, 오메프라졸, 팔리페리돈, 페나세틴, 피밤피실린, 프리미돈, 프로구아닐, 실로시빈, 라미프릴, S-메틸도파, 심바스타틴, 술파살라진, 술린닥, 테가푸르, 테르페나딘, 발라시클로비르, 발간시클로비르 및 지도부딘이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 출력은 HSV-TK, 즉, 인간 알파헤르페스바이러스 1 (HHV-1), 유니프롯(UniProt)KB - Q9QNF7 (KITH_HHV1)로부터의 티미딘 키나제이다.
일부 실시양태에서, 출력은 면역조정 단백질 및/또는 RNA이다. 본원에 사용된 바와 같이, "면역조정 단백질" (또는 면역조정 RNA)이라는 용어는 면역 시스템 구성요소의 활성화를 유도하고/거나 활성을 증가시킴으로써 면역 시스템을 조정하는 (자극하거나 (즉, 면역자극 단백질 또는 RNA) 억제하는 (즉, 면역억제 단백질 또는 RNA)) 단백질 (또는 RNA)을 지칭한다. 다양한 면역조정 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Shahbazi S. and Bolhassani A. Immunostimulants: Types and Funtions. J. Med. Microbiol. Infec. Dis. 2016; 4(3-4): 45-51]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 면역조정 단백질은 시토카인 또는 케모카인 (예를 들어, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, CCR3, CXCR3, CXCR4, 및 CCR10) 또는 콜로니 자극 인자이다.
일부 실시양태에서, 출력은 DNA-변형 인자이다. 본원에 사용된 바와 같이, "DNA-변형 인자"라는 용어는 (예를 들어, 재조합 또는 돌연변이의 도입을 유도함으로써) DNA의 구조를 변경하고/거나 DNA의 서열을 변경하는 인자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA-변형 인자는 유전자 결함을 보정하도록 되어 있는 단백질을 코딩하는 유전자, DNA-변형 효소, 및/또는 DNA-변형 시스템의 구성요소이다. 일부 실시양태에서, DNA-변형 효소는 부위-특이적 레콤비나제, 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 CRISPR/Cas DNA 변형 시스템의 단백질 구성요소이다.
일부 실시양태에서, 출력은 세포-표면 수용체이다. 일부 실시양태에서, 출력은 키나제이다.
일부 실시양태에서, 출력은 유전자 발현-조절 인자이다. 본원에 사용된 바와 같이, "유전자 발현-조절 인자"라는 용어는 존재할 경우 적어도 하나의 유전자의 전사를 증가시키거나 감소시키는 임의의 인자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현-조절 인자는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현-조절 인자는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현-조절 인자는 유전자 발현을 조절할 수 있는 다중-구성요소 시스템의 구성요소이다.
일부 실시양태에서, 출력은 후성적 변형인자이다. 본원에 사용된 바와 같이, "후성적 변형인자"라는 용어는 후성적 변형을 증가시키거나, 감소시키거나, 또는 변경하는 인자 (예를 들어, 단백질 또는 RNA)를 지칭한다. 후성적 변형인자의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, DNA 메틸화 및 히스톤 변형이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 출력은 벡터 복제에 필요한 인자이다. 벡터 복제에 필요한 인자의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
(iv) 조절 구성요소
RNA (예를 들어, 출력 및/또는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함함)를 코딩하는 카세트는 조절 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 조절 구성요소는 RNA의 발현을 제어하는 (즉, 그의 증가된 또는 감소된 발현을 조절하는) 핵산 서열이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 카세트는 전사활성인자 반응 요소, 전사 인자 반응 요소, 최소 프로모터, 및/또는 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 RNA를 코딩할 수 있다. 조절 구성요소는 그것이 핵산 서열에 관하여 정확한 기능적 위치 및 배향으로 존재하며, 그에 따라 그것이 전사 개시 및/또는 그 서열의 발현을 조절하는 (또는 유도하는) 경우 RNA를 코딩하는 핵산에 "작동가능하게 연결된다."
일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 전사활성인자 반응 요소를 포함한다. "전사활성인자 반응 요소"는 전사활성인자 단백질이 결합 및 인식하는 최소 DNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 전사활성인자 단백질이 결합 및 인식하는 최소 DNA 서열의 1개 초과의 카피 (즉, 반복체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 전사활성인자 단백질이 결합 및 인식하는 최소 DNA 서열 반복체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반복체는 탠덤 반복체이다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 최소 DNA 서열의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 최소 DNA 서열은 스페이서 서열에 의해 점재된다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 최소 DNA 서열로부터의 편차를 포함하거나, 또는 추가의 DNA 서열에 의해 플랭킹되지만, 여전히 전사활성인자 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 전사활성인자 반응 요소는 나란히 놓일 수 있지만, 모두는 동일한 전사활성인자 단백질에 결합할 수 있다.
예시적인 전사활성인자 반응 요소는 표 3에 열거된다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 표 3에 열거된 핵산 서열 또는 표 3에 열거된 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다.
표 3. 예시적인 전사활성인자 반응 요소. "::"는 전사활성인자 도메인 (TAD) 및 DNA 결합 도메인 (DBD) 사이의 융합점을 나타낸다. TAD 및 DBD의 서열의 약칭 표기는 표 2에 상응한다. DNA 서열은 하기 명명법을 사용한다: W= A 또는 T; S = C 또는 G; K = A 또는 C; M = G 또는 T; Y = A 또는 G; R = C 또는 T; V = C,G, 또는 T; H = A, G 또는 T; D = A, C 또는 T; B = A, C, 또는 G; N = A,C,G, 또는 T. 대문자는 강한 보존을 나타내고; 소문자 기호는 약한 보존을 나타낸다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 전사 인자 반응 요소를 포함한다. "전사 인자 반응 요소"라는 용어는 전사인자가 결합 및 인식하는 DNA 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "전사 인자"라는 용어는 유전자 전사를 조정하는 인접 폴리핵산 상에 코딩되어 있지 않은 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 전사 인자는 전사 활성인자이다 (즉, 전사를 증가시킴). 다른 실시양태에서, 전사 인자는 전사 억제인자이다 (즉, 전사를 억제함). 일부 실시양태에서, 전사 인자는 세포의 내인성 전사 인자이다.
일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 하기 전사 인자 중 하나 이상에 의해 직접적으로 결합되거나, 또는 간접적으로 영향을 받도록 조작된다: ABL1, CEBPA, ERCC3, HIST1H2BE, MDM4, PAX7, SMARCA4, TFPT, AFF1, CHD1, ERCC6, HIST1H2BG, MED12, PAX8, SMARCB1, THRAP3, AFF3, CHD2, ERF, HLF, MEF2B, PBX1, SMARCD1, TLX1, AFF4, CHD4, ERG, HMGA1, MEF2C, PEG3, SMARCE1, TLX3, APC, CHD5, ESPL1, HMGA2, MEN1, PER1, SMURF2, TNFAIP3, AR, CHD7, ESR1, HOXA11, MITF, PHF3, SOX2, SOX4, TP53, ARID1A, CIC, ETS1, HOXA13, MKL1, PHF6, SOX5, TRIM24, ARID1B, CIITA, ETV1, HOXA7, MLLT1, PHOX2B, SOX9, TRIM33, ARID3B, CNOT3, ETV4, HOXA9, MLLT10, PLAG1, SRCAP, TRIP11,ARID5B, CREB1, ETV5, HOXC11, MLLT3, PML, SS18L1, TRPS1, ARNT, CREB3L1, ETV6, HOXC13, MLLT6, PMS1, SSB, TRRAP, ARNT2, CREBBP, EWSR1, HOXD11, MYB, PNN, SSX1, TSC22D1, ASB15, CRTC1, EYA4, HOXD13, MYBL1, MYBL2, POU2AF1, SSX2, TSHZ3, ASXL1, CSDE1, EZH2, ID3, MYC, POU2F2, SSX4, VHL, ATF1, CTCF, FEV, IRF2, MYCN, POU5F1, STAT3, WHSC1, ATF7IP, CTNNB1, FLI1, IRF4, MYOD1, PPARG, STAT4, WHSC1L1, ATM, DACH1, FOXA1, IRF6, NCOA1, PRDM1, STAT5B, WT1, ATRX, DACH2, FOXE1, IRF8, NCOA2, PRDM16, STAT6, WWP1, BAZ2B, DAXX, FOXL2, IRX6, NCOA4, PRDM9, SUFU, WWTR1, BCL11A, DDB2, FOXP1, JUN, NCOR1, PRRX1, SUZ12, XBP1, BCL11B, DDIT3, FOXQ1, KHDRBS2, NCOR2, PSIP1, TAF1, XPC, BCL3, DDX5, FUBP1, KHSRP, NEUROG2, RARA, TAF15, ZBTB16, BCL6, DEK, FUS, KLF2, NFE2L2, RB1, TAL1, ZBTB20, BCLAF1, DIP2C, FXR1, KLF4, NFE2L3, RBM15, TAL2, ZFP36L1, BCOR, DNMT1, GATA1, KLF5, NFIB, RBMX, TBX18, ZFX, BRCA1, DNMT3A, GATA2, KLF6, NFKB2, REL, TBX22, ZHX2, BRCA2, DOT1L, GATA3, LDB1, NFKBIA, RUNX1, TBX3, ZIC3, BRD7, EED, GLI3, LMO1, NONO, RUNX1T1, TCEA1, ZIM2, BRD8, EGR2, GTF2I, LMO2, NOTCH2, RXRA, TCEB1, ZNF208, BRIP1, ELAVL2, HDAC9, LMX1A, NOTCH3, SALL3, TCERG1, ZNF226, BRPF3, ELF3, HEY1, LYL1, NPM1, SATB2, TCF12, ZNF331, BTG1, ELF4, HIST1H1B, LZTR1, NR3C2, SETBP1, TCF3, ZNF384, BTG2, ELK4, HIST1H1C, MAF, NR4A3, SFPQ, TCF7L2, ZNF469, CBFA2T3, ELL, HIST1H1D, MAFA, NSD1, SIN3A, TFAP2D, ZNF595, CBFB, EP300, HIST1H1E, MAFB, OLIG2, SMAD2, TFDP1, ZNF638, CDX2, EPC1, HIST1H2BC, MAML1, PAX3, SMAD4, TFE3, CDX4, ERCC2, HIST1H2BD, MAX, PAX5, SMARCA1, 및 TFEB.
"전사 인자 반응 요소"는 전사 인자가 결합 및 인식하는 최소 DNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 전사 인자가 결합 및 인식하는 최소 DNA 서열의 1개 초과의 카피 (즉, 반복체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 전사 인자가 결합 및 인식하는 최소 DNA 서열의 반복체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반복체는 탠덤 반복체이다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 최소 DNA 서열의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 최소 DNA 서열은 스페이서 서열에 의해 점재된다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자 반응 요소는 최소 DNA 서열로부터의 편차를 포함하거나, 또는 추가의 DNA 서열에 의해 플랭킹되지만, 여전히 전사활성인자 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 전사활성인자 반응 요소는 나란히 놓일 수 있지만, 모두는 동일한 전사활성인자 단백질에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 유일한 것이다 (즉, 인접 폴리핵산은 전사 인자 반응 요소의 1개의 카피만을 포함함). 다른 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 유일하지 않다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소에 결합하는 전사 인자는 그것이 작동가능하게 연결된 RNA의 발현을 활성화시킨다. 다른 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소에 결합하는 전사 인자는 그것이 작동가능하게 연결된 RNA의 발현을 억제한다.
일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 각각 상이한 전사 인자에 의해 결합된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 상이한 전사 인자 반응 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 각각 상이한 전사 인자에 의해 결합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 전사 인자 반응 요소를 포함한다.
예시적인 전사 인자 반응 요소는 표 4에 열거된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자 반응 요소는 표 4에 열거된 핵산 서열 또는 표 4에 열거된 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다.
표 4. 예시적인 전사 인자 반응 요소.
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Figure pct00019
일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 프로모터 요소 (또는 프로모터 단편)를 포함한다. 예시적인 프로모터 요소는 표 5에 열거된다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 표 5에 열거된 핵산 서열 또는 표 5에 열거된 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다.
표 5. 예시적인 프로모터 요소.
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Figure pct00023
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일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 전사 인자 반응 요소 및 최소 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편은 유일한 것이다 (즉, 인접 폴리핵산이 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편의 1개의 카피만을 포함함). 다른 실시양태에서, 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편은 유일하지 않다.
일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 최소 프로모터를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "최소 프로모터"라는 용어는 출력의 발현을 개시하는데 필요하나 충분하지는 않은 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 최소 프로모터는 자연 발생이다. 다른 실시양태에서, 최소 프로모터는 예컨대 자연 발생 서열을 변경하고/거나 단축하는 것, 자연 발생 서열을 조합하는 것, 또는 자연 발생 서열을 비-자연 발생 서열과 조합하는 것에 의해 조작되는데; 각각의 경우 조작되는 최소 프로모터는 비-자연 발생 서열이다. 일부 실시양태에서, 최소 프로모터는 바이러스 또는 비-바이러스 공급원으로부터 조작된다. 최소 프로모터의 예에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 전사활성인자 반응 요소, 전사 인자 반응 요소, 및 최소 프로모터를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 요소가 다양한 배열구조로 배향될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 전사활성인자 반응 요소는 프로모터 요소 및/또는 전사 인자 반응 요소에 대해 5' 또는 3'일 수 있고; 전사 인자 반응 요소는 프로모터 요소 및/또는 전사활성인자 반응 요소에 대해 5' 또는 3'일 수 있고; 프로모터 요소는 전사 인자 반응 요소 및/또는 전사활성인자 반응 요소에 대해 5' 또는 3'일 수 있다.
일부 실시양태에서, 카세트의 조절 구성요소는 5'에서 3'으로: 전사활성인자 반응 요소, 전사 인자 반응 요소, 및 최소 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 구성요소는 5'에서 3'으로: 전사 인자 반응 요소, 전사활성인자 반응 요소, 및 최소 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 카세트의 조절 구성요소는 전사활성인자 반응 요소 및 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카세트의 조절 구성요소는 5'에서 3'으로: 전사활성인자 반응 요소 및 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카세트의 조절 구성요소는 전사활성인자 반응 요소, 프로모터 요소 및 최소 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카세트의 조절 구성요소는 5'에서 3'으로: 전사활성인자 반응 요소, 프로모터 요소 및 최소 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카세트의 조절 구성요소는 5'에서 3'으로: 프로모터 요소 및 전사활성인자 반응 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카세트의 조절 구성요소는 5'에서 3'으로: 프로모터 요소, 전사활성인자 반응 요소 및 최소 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터 요소는 포유동물 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 프로모터 단편이다.
(v) 예시적인 인접 폴리핵산
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 단일 카세트를 갖는 유전자 회로를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 RNA를 코딩하는 카세트를 포함하며, 여기서 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; (ii) 전사활성인자의 핵산 서열; 및 (iii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하며; 여기서 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, mRNA는 폴리시스트론성 발현 요소의 핵산 서열을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "폴리시스트론성 반응 요소"라는 용어는 단일 mRNA로부터의 2개 이상의 단백질의 생성을 촉진하는 핵산 서열을 지칭한다. 폴리시스트론성 반응 요소는 내부 인식 서열 (IRES) 또는 2A 펩티드를 코딩하는 폴리핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Liu et al., Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci. Rep. 2017 May 19; 7(1): 2193]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론성 발현 요소는 출력 및 전사활성인자의 핵산 서열들을 분리한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 3' UTR을 포함하며, 여기서 3' UTR은 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 5' UTR을 포함하며, 여기서 5' UTR은 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력 및 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소 및 전사활성인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력 및 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자 및 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소 및 전사활성인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자 및 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 요소 및 전사활성인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자 및 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 프로모터 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자 및 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 다수의 카세트를 갖는 유전자 회로를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산 분자는 a) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 제1 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; 및 (ii) miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함하는 것인 제1 카세트; 및 b) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트를 포함하며; 여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA는 3' UTR을 포함하고, 3' UTR은 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 RNA는 5' UTR을 포함하고, 5' UTR은 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 RNA는 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 RNA는 3' UTR을 포함하고, 3' UTR은 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 RNA는 5' UTR을 포함하고, 5' UTR은 miRNA 표적 부위 (예를 들어, let-7c 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트의 적어도 하나의 miRNA 표적 부위 및 제2 카세트의 적어도 하나의 miRNA 표적 부위는 동일한 핵산 서열이거나 또는 동일한 miRNA에 의해 조절되는 상이한 서열이다.
일부 실시양태에서, 제1 RNA는 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제2 RNA는 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트의 전사 인자 반응 요소 및 제2 카세트의 전사 인자 반응 요소는 동일한 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트의 전사 인자 반응 요소 및 제2 카세트의 전사 인자 반응 요소는 상이한 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트 또는 제2 카세트 중 어느 하나 또는 둘 다는 적어도 2개, 적어도 3개...의 유형의 전사 인자 반응 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하고; 제2 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소 및 전사활성인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하고; 제2 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하고; 제2 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소 및 전사활성인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하고; 제2 카세트는 5'에서 3'으로: (i) 프로모터 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트의 상류 조절 구성요소는 전사 인자 반응 요소에 추가로 프로모터 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 전사 인자 반응 요소를 대체한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 요소는 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 카세트 및 제2 카세트는 수렴형 배향으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트 및 제2 카세트는 발산형 배향으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트 및 제2 카세트는 머리-대-꼬리 배향으로 존재한다.
제1 및/또는 제2 카세트는 하나 이상의 인슐레이터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 인슐레이터)에 의해 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 카세트 또는 제2 카세트는 인슐레이터에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트 및 제2 카세트 둘 다는 인슐레이터에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 제1 카세트 또는 제2 카세트는 인슐레이터에 의해 둘 다의 측 상에 플랭킹된다.
예시적인 인접 폴리핵산은 표 6에 열거된다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리핵산은 표 6에 열거된 핵산 서열 또는 표 6에 열거된 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
표 6. 예시적인 인접 폴리핵산.
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II. 다른 조성물
다른 측면에서, 본 개시내용은 벡터의 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 상기 기재된 인접 폴리핵산 분자를 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 조작된 바이러스 게놈의 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 상기 기재된 인접 폴리핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 게놈, 렌티바이러스 게놈, 아데노바이러스 게놈, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 게놈, 백시니아 바이러스 게놈, 폭스바이러스 게놈, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 게놈, 콕사키바이러스 게놈, 레오바이러스 게놈, 홍역 바이러스 게놈, 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 게놈, 파르보바이러스 게놈, 세네카 밸리 바이러스 게놈, 마라바 바이러스 게놈, 또는 감기 바이러스 게놈이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 비리온의 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "비리온"이라는 용어는 숙주 세포의 외부에 있는 (예를 들어, DNA/RNA 게놈 및 캡시드 단백질을 포함하는) 바이러스의 감염성 형태를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비리온은 상기 기재된 조작된 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비리온은 AAV-DJ 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비리온은 AAV-B1 캡시드 단백질, AAV8 캡시드 단백질, 또는 AAV6 캡시드 단백질을 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 기재된 인접 폴리핵산 분자, 상기 기재된 벡터, 상기 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 상기 기재된 비리온을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상-허용되는 부형제 또는 완충제를 추가로 포함하는 치료 조성물이다. 예시적인 제약 부형제 및 완충제에 대해서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
III. 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법
다른 측면에서, 본 개시내용은 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법은 세포의 집단을 상기 기재된 인접 폴리핵산 분자, 상기 기재된 벡터, 상기 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 상기 기재된 비리온과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서 발현되는 출력의 수준을 통해 유발된다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 및 적어도 하나의 비-표적 세포를 포함한다. 표적 세포 및 비-표적 세포 유형은 적어도 하나의 내인성 전사 인자의 수준 및/또는 적어도 하나의 내인성 프로모터 또는 그의 단편 및/또는 적어도 하나의 내인성 miRNA의 발현 강도에 있어서 상이하다. 일부 실시양태에서, 출력의 발현 수준은 표적 세포 및 비-표적 세포 사이에 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 또는 적어도 10,000배 상이하다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포의 집단을 인접 폴리핵산 분자 또는 상기 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서: a) 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 2개 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA (예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20개의 내인성 miRNA)의 수준에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준은 표적 세포의 각각에 비해 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고 (예를 들어, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 더 높고); b) 인접 폴리핵산 분자는 (i) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 출력의 핵산 서열; 및 하나 이상의 내인성 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 부위를 포함하는 것인 제1 카세트; 및 (ii) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트를 포함하며; 여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포의 집단을 인접 폴리핵산 분자 또는 상기 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서: a) 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 2개 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA (예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20개의 내인성 miRNA)의 수준에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준은 표적 세포의 각각에 비해 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고 (예를 들어, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 더 높고); b) 인접 폴리핵산 분자는 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 mRNA를 코딩하는 카세트를 포함하며, 여기서 RNA는 출력의 핵산 서열; 전사활성인자의 핵산 서열; 및 하나 이상의 내인성 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 부위를 포함하며; 여기서 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 전사 인자 (예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20개의 내인성 전사 인자)의 수준에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자는 내인성 전사 인자(들)에 상응하는 하나 이상의 전사 인자 반응 요소를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포를 상기 기재된 인접 폴리핵산 분자 또는 상기 기재된 벡터와 접촉시키는 것은 비-바이러스 전달 방법을 통해 일어난다. 예로는 형질감염 (예를 들어, DEAE 덱스트란-매개 형질감염, CaPO4-매개 형질감염, 지질-매개 흡수, PEI-매개 흡수, 및 레이저 형질감염), 형질전환 (예를 들어, 칼슘 클로라이드, 전기천공 및 열-충격), 유전자 전달, 및 입자 충격이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 생체외에서 접촉된다 (즉, 세포의 집단이 유기체로부터 단리되고, 세포의 집단이 유기체의 외부에서 접촉됨). 일부 실시양태에서, 세포의 집단은 생체내에서 접촉된다.
본원에 사용된 바와 같이, "내인성"이라는 용어는 - 세포의 맥락에서 - 그의 자연 상태에 있는 세포 내에서 발견되는 인자 (예를 들어, 단백질 또는 RNA)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 내인성 전사 인자는 적어도 하나의 카세트의 조절 구성요소 (예를 들어, 전사 인자 반응 요소)의 프로모터 요소에 결합하여 그를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 miRNA는 적어도 하나의 카세트의 조절 구성요소 또는 반응 구성요소의 miRNA 표적 부위에 상보적일 수 있다.
일부 실시양태에서, "전사활성인자" 및 상응하는 "전사활성인자 반응 요소"는 전사활성인자가 "전사활성인자 반응 요소"에 특이적으로 결합하기는 하나 세포 내에 자연적으로 존재하는 반응 요소에는 가능한 한 적게 결합하게 되도록 선택될 것이다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자 단백질의 DNA 결합 도메인은 세포에 존재하는 고유한 조절 서열에는 효율적으로 결합하지 않을 것이며, 따라서 과도한 부작용을 촉발시키지 않을 것이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포 및 비-표적 세포는 상이한 세포 유형이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 암성 세포이고, 비-표적 세포는 비-암성 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 암성 간세포 암종 세포 또는 담관암종 세포일 수 있고, 비-표적 세포는 간세포, 포식작용적 쿠퍼 세포, 성상 세포, 굴모양 내피 세포를 포함하는 실질 및 비-실질 간 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 간세포이고, 비-표적 세포는 비-간세포 (예를 들어, 근세포)이다. 다른 실시양태에서, 표적 세포 및 비-표적 세포는 동일한 세포-유형의 것이나 (예를 들어, 둘 다가 간세포임), 그럼에도 불구하고 적어도 하나의 내인성 전사 인자 및/또는 적어도 하나의 내인성 miRNA의 수준에 있어서 상이하다. 예를 들어, 표적 세포는 노화 근육 세포일 수 있고, 비-표적 세포는 비-노화 근육 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 종양 세포이고, 세포-특이적 이벤트는 세포 사멸이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 노화 세포이고, 세포-특이적 이벤트는 세포 사멸이다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸은 활성화 수용체 리간드, 특이적 항원, 자극 시토카인, 또는 이들의 임의의 조합의 발현을 통한 면역 표적화에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포의 집단을 출력에 의해 치료제 또는 독성 화합물로 대사되는 전구약물 또는 비-독성 전구체 화합물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 동일한 유형의 야생형 세포 (예를 들어, 건강한 및/또는 비-질환에 걸린)에 비해 인자를 차등적으로 발현하고, 세포-특이적 이벤트는 인자의 발현 수준을 조정하는 것이다.
일부 실시양태에서, 출력 발현은, 비-표적 세포가 출력 발현의 결여로 인하여 그리고 세포 사멸-유도 작용제의 존재 하에서 제거되는 동안, 표적 세포 집단의 생존을 보장한다. 다른 실시양태에서, 출력은 표적 세포가 출력 발현으로 인하여 그리고 세포 사멸-유도제의 존재 하에서 제거되는 동안, 비-표적 세포 집단의 생존을 보장한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 관심의 특정한 표현형을 포함하며, 그에 따라 출력 발현은 이 특정한 표현형의 세포에 제한된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 선택되는 세포 유형이고, 세포-특이적 이벤트는 자연적으로는 선택되는 세포 유형에서는 부재하거나 불활성인 유전자의 발현을 통한 신규 기능의 코딩이다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단은 다세포 유기체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다세포 유기체는 동물이다. 일부 실시양태에서, 동물은 인간이다.
IV. 질환 또는 병태를 진단하고/거나 치료하는 방법
일부 측면에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에서 질환 또는 병태 (예를 들어, 암)를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "진단하다"라는 용어는 질환 또는 병태의 성질 및/또는 원인을 확인하거나 결정하는 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 기재된 인접 폴리핵산 분자, 상기 기재된 벡터, 상기 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 상기 기재된 비리온을 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 출력의 수준은 질환 또는 병태의 존재 또는 부재를 지시한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태 (예를 들어, 암)를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료하다"라는 용어는 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 악화를 예방하는 활동 및/또는 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상을 완화시키는 활동을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 기재된 인접 폴리핵산 분자, 상기 기재된 벡터, 상기 기재된 조작된 바이러스 게놈, 또는 상기 기재된 비리온을 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
질환 또는 병태를 치료하는 것에 관한 일부 실시양태에서, 투여의 방법은 상기 기재된 벡터의 정맥내 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여의 방법은 상기 기재된 벡터의 정맥내 전달의 하나 초과의 활동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여의 방법은 하나 이상의 투여로 상기 기재된 벡터의 종양내 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여의 방법은 하나 이상의 투여로 상기 기재된 벡터의 경동맥 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여의 방법은 근육내 전달, 비내 전달, 망막하 전달, 또는 경구 전달을 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환을 치료하는 방법은 하나 이상의 투여로 전구약물의 투여를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구약물의 전달은 정맥내, 경동맥, 또는 복강내이다. 일부 실시양태에서, 전구약물은 간시클로비르이다.
일부 실시양태에서, 질환을 치료하는 방법은 또 다른 요법, 예컨대 소분자, 생물제제, 모노클로날 항체, 또 다른 유전자 요법 산물, 또는 세포-기반 치료 산물의 투여를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 암이다. 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 암에는 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암 (mCRC), 간으로 전이된 임의의 다른 암, 폐암, 유방암, 망막모세포종, 및 교모세포종이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 암에는 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암 (mCRC), 폐암, 유방암, 망막모세포종, 교모세포종이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 암은 간세포 암종 (HCC))이다. 사실, HCC에 대한 치료 옵션은 제한되므로 (Llovet and Lencioni, 2020), 돌파구를 위한 신규 양상을 탐구할 긴급한 필요가 생기게 한다. 본원에 기재된 방법은 현재의 HCC 치료 방법론을 상당히 진전시킨다.
실시예
실시예 1. 다중화 진단 회로는 유전자 요법 벡터로 번역한다.
다수의 해체된 구성요소 (즉, 플라스미드당 하나의 유전자 및 세포주의 일시적 형질감염에서 특징규명됨)로부터 함께 놓인 논리 게이트가 치료적으로 관련된 벡터 내로 피팅되도록 재-조작되고 동물 질환 모델에서 치료 후보로서 연구될 수 있는지 여부를 평가하기 위한 실험을 디자인하였다. 전사 인자 (TF) SOX9/10 및 HNF1A/B에 대한 센서의 이들 센서의 활성 사이의 AND 논리를 실행하는 다중-플라스미드 시스템에 의한 통합은 HuH-7 세포 내로 일시적으로 형질감염되는 경우 강한 반응을 유발하였음이 이전에 제시되었다 (Angelici et al., 2016). SOX9는 진행성 HCC와 연관된 예후적 마커이다 (Richtig et al., 2017). 흥미롭게도, SOX9 반응 요소는 그의 과발현이 악성 HCC 표현형과 연관되는 또 다른 TF인 SOX4에 의해 결합될 가능성이 있다 (Liao et al., 2008; Uhlen et al., 2017). HNF1A 및 HNF1B는 알려진 간 하우스키핑 인자이지만 (Harries et al., 2009); 이들은 또한 GI 관의 다른 기관에서 발현된다.
이전에 기재된 다중-플라스미드 시스템이 인접 DNA 카세트에 적응되고 결국 바이러스 벡터에서 패키징될 수 있는지 여부를 판단하기 위한 실험을 디자인하였다. 이를 위해, SOX9/10-유도된 PIT-기반 활성인자 (PIT::RelA 또는 PIT::VP16) (Fussenegger et al., 2000), 뿐만 아니라 PIT 및 HNF1A/B에 의해 상승작용적으로 유도된 형광 출력 단백질을 포함하는 다중-플라스미드 설정 (Angelici et al., 2016)에서 논리 "SOX9/10 AND HNF1A/B"를 실행하는 것으로 제시된 회로 구성요소를 발산형 또는 수렴형 배향 중 어느 하나의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 전달 벡터에서 ITR 사이에 클로닝하였다 (도 1a). 생성된 플라스미드를 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고, TF 입력 SOX10 및 HNF1A를 TRE-유도된 플라스미드로부터 이소적으로 발현하여 이 게이트에 대한 모든 4개의 논리 입력 조합을 생성하였다. 흥미롭게도, 추세는 모든 4개의 경우에 보존되었지만, 상이한 변이체는 둘 다의 입력이 존재하는 경우 그들의 절대 ON 수준에 있어서 현저하게 상이하다 (도 1b). 동일한 구축물을 또한 HuH-7 및 HeLa 세포 내로 형질감염시켰으며, 여기서 SOX9/10 및 HNF1A/B의 내인성 발현은 전자에서는 회로를 유도하고, 후자에서는 이를 활성화시키지 않을 것으로 예상된다. 이 경우, 차이는 덜 현저하지만, 발산형 배향은 다소 더 높은 출력을 생성하였다.
AND 게이트 전략은 목적하는 세포 유형에서 출력을 활성화시키는 방식이며, 이 활성화의 증대는 요법의 맥락에서 추가의 안전성 층을 포함할 NOT 게이트와 등가의 의도적인 "오프" 스위치의 혼입에 의해 디자인된다. 이를 위해, 마이크로RNA 표적을 출력 유전자의 3'-UTR에, 뿐만 아니라 PIT-유래 구성요소의 3'-UTR에 혼입시켰다. miR-424, miR-126 및 miR-122를 포함하는 특이적 입력의 선택을 이전에 수행된 프로파일링 (Dastor et al., 2018)에 기반하여 행하였다. miR-424 표적은 초기에 도입되었으며, 4개의 생성된 구축물 (도 1d)을 HEK 세포 (도 1e)에서 및 HuH-7 및 HeLa 세포에서 내인성 입력의 존재 하에서 (도 1f) 이소성 TF 조합에 대한 그들의 반응에 대해 다시 시험하였다. 성능에 있어서 현저하고 일관된 차이가 관찰되었다. 수렴형 구축물은 HEK 세포에서 이소성 입력에 반응하는데 실패하였으며, 발산형의 것에 비해 HuH-7 세포에서 크게 감소된 강도로 반응하였다. 이 사실은 유전자 요법 전달 벡터와 혼화성인 인접 백본 상에 통합된 이질적인 플라스미드 및 회로 상에 운반되는 회로로부터의 전이의 복잡성을 강조한다. 다음으로, 2개의 발산형 카세트는 TF 및 miR-424 모방체 입력 둘 다를 포함하는 보다 광범위한 논리 특징규명을 겪었다. 둘 다의 구축물은 예상된 바와 같이 반응하여, 논리 "SOX10 AND HNF1A AND NOT(miR-424)"를 실행하였다 (도 1g). 높은 miR-424 발현이 또한 내인성 TF 입력을 갖는 출력 활성화를 무효화함을 확인하기 위해, miR-424 모방체를 HuH-7 세포 내로 형질감염시켰으며, 출력 발현을 거의 배경 수준으로 끄는 것으로 밝혀졌다 (도 1h). 다음으로, miR-424 표적을 miR-126 표적으로 대체하였다. 구축물의 새로운 세트를 외인성 miR-126에 대한 그의 반응에 관하여 HuH-7 세포에서만 시험하였으며, 결과는 miR-424와 유사하고 예상과 일치하였다 (도 1i). 이 디자인 단계를 결론내리기 위해, miR-424 또는 miR-126 표적을 갖는, miRNA 표적을 갖지 않는 발산형 구축물을 HCC 세포주 HuH-7 및 HepG2를 HeLa 세포로부터 구별하는 그들의 능력에 대해 평가하였다 (도 1j).
다음 단계는 바이러스 벡터 내로의 카세트의 혼입 및 전임상 번역 전에 논리 성능에 관한 그들의 평가이다. AAV-전달된 게놈은 인간 세포에서 연쇄체를 형성하고 (Duan et al., 2003), 이는 AAV 게놈을 코딩하지만 AAV 캡시드의 도움으로 패키징 및 전달되지 않는 DNA 카세트에 비해 복잡성의 추가의 층을 포함할 것임이 알려져 있다. 이를 위해, ITR-플랭킹된 게놈을 사용하고, 소량의 DJ-위형화된 (Grimm et al., 2008) AAV 벡터를 제조하였다. 벡터를 사용하여 2개의 HCC 세포주, HepG2 및 HuH-7, 및 2개의 비-HCC 세포주, HeLa 및 HCT-116을 형질도입하였다. 결과는 표적 세포에서 높은 발현 및 비-표적 세포에서 매우 낮은 발현을 제시하였다 (도 1k). 일부 추가의 효과, 예를 들어 miRNA 표적을 갖지 않는 벡터에 비해 HuH-7 세포에서 T424 표적을 보유하는 벡터로 수득된 출력 발현의 감소가 명백하며, 이는 네이키드 DNA 카세트로 관찰된 감소보다 훨씬 더 강하다.
2개의 miRNA 표적 (T424 또는 T126) 중 어느 것이 생체내에서 더 양호할 것인지 예비 정보를 얻기 위해, 이들 중 어느 것이 핵심적인 보호 기능을 수행할 (즉, HCC 세포 및 건강한 간세포 사이의 식별을 가능하게 할) 것인지를 평가하기 위한 실험을 디자인하였다. 1차 마우스 간세포를 시험관내 배양을 위해 단리하였다. 1차 간세포 및 HCC 세포를 miR-424, miR-126 뿐만 아니라 miR-122에 대한 AAV-DJ 패키징된 유전자 리포터 (Dastor et al., 2018), 즉, 생체내에서 간에서 유전자 발현을 효과적으로 끄는 것으로 제시되었고 (Dastor et al., 2018; Della Peruta et al., 2015), HCC 종양의 하위세트에서 하향조절되는 것으로 알려진 (Coulouarn et al., 2009) 공지된 간 miRNA로 형질도입하였다. 이 시험의 결과 (도 1l)는 놀랍게도, 간에서 miR-424 및 miR-126의 높은 발현 카운트가 간세포에서 높은 생물학적 넉-다운 활성으로 번역되지 않았음을 제시한다. miR-122만이 일관되게 활성이었다. miR-122는 HepG2 세포주에서 불활성이었지만, 이는 HuH-7 세포주에서 부분적 활성을 나타내었으며, 이는 이 miRNA 표적의 포함이 HCC 종양의 하위세트에 대해 유익할 것이지만, 이들 모두에 대해 그렇지는 않음을 시사한다. 이 사실에도 불구하고, 회로를 파일럿 실험 설정에서 그의 특이성 및 항종양 잠재성에 대해 miR-122로 추가로 조사하였다. 상이한 miRNA 표적 배열의 영향을 또한 시험하여 그들의 수가 얼마나 miRNA 입력의 존재 하에서 전체 출력 억제에 영향을 미치는지 평가하였다. 4개의 상이한 카세트를 시험하였으며, 표적의 수를 증가시키고, 출력 및 PIT 3'-UTR 둘 다에서 표적을 정치하는 것은 억제를 증가시킴이 밝혀졌다 (도 1m-1n). 이는 2가지 방식으로 사용될 수 있는 또 다른 마디를 제공한다: 비-표적 세포에서 출력의 넉다운을 증가시키지만, 또한 miRNA 입력의 부분적 수준을 발현하는 표적 세포에서 넉다운을 감소시키는 것.
실시예 2. 번역 맥락에서의 제1 HCC-표적화 회로 변이체의 초기 평가.
리포터 조사에 기반하여, miR-122 표적을 보유하는 회로 변이체를 구축하였다. PIT::VP16 활성인자 변이체를 그의 보다 낮은 DNA 탑재물 및 출력 유전자에 대한 증가된 이용가능한 풋프린트로 인하여 사용하였다. mCherry 출력을 갖는 회로, 더빙된 HCC.V1-mCherry를 DJ-위형화된 AAV 벡터 내로 패키징하고, HCC 세포주를 1차 뮤린 간세포로부터 식별하는 그의 능력에 있어서 재-시험하였다. 데이터는 전체 회로가 1차 간세포에 비해 HepG2 및 Hep3B 세포주에서 고도로 특이적 발현을 생성하는 반면, HuH-7에서 회로는 이들 세포주에서 miR-122의 중간 활성으로 인하여 감소된 출력을 생성함을 강조한다 (도 2a). 따라서, 이 종양-표적화 프로그램을 NSG 마우스에서 HepG2 세포를 채용하는 동소성 이종이식편 종양 모델의 맥락에서 파일럿 실험에서 평가하였다. 종양 확립 및 추적의 목적을 위해, HepG2 세포를 mCitrine 형광 단백질 및 반딧불이 루시페라제 유전자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 안정하게 변형시키고, 균질한 mCitrine 발현에 대해 분류하였다. 종양을 1M HepG2-LC 세포의 비장 주사 및 후속 비장 절제에 의해 확립하였다.
생체내 실험 전에, 또 다른 음성 대조군 세포주로서 1차 간세포, HepG2 세포 및 HeLa 세포를 비교하는 시험관내 효능 시험을 수행하였다. HSV-TK 출력 유전자 및 더빙된 AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TK를 보유하는 벡터는 현저한 구경꾼 효과를 갖는 세포독성을 유발하기 위해 전구약물로서 GCV를 요구한다 (Freeman et al., 1993). 데이터 (도 2b)는 사실, HepG2 세포는 회로 뿐만 아니라 대조군 구성적 벡터에 의해 선택적으로 제거된 반면, 1차 간세포 및 HeLa 세포는 구성적 벡터에 의해 제거되었지만, 회로-보유 벡터에 의해서는 영향을 받지 않았음을 제시하였다. 특히, 회로는 HepG2 세포를 구성적 대조군보다 더 잘 제거하였으며, 이는 비-맞춤 구성적 벡터에 비해 맞춤 TF 논리에 의해 유도된 높은 출력 발현의 중요성을 강조한다.
생체내에서 항종양 효능을 판단하기 위해, AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TK를 3일 떨어진 2회의 연속적 주사에서 HepG2 종양 보유 마우스에게 전달하였다. 4개의 실험 그룹 (이 파일럿에서 n=2)은 GCV 요법과 조합으로 AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TK (치료 부문), GCV를 갖지 않는 동일한 벡터 단독, GCV 요법으로 보충된 모의 주사, 및 모의 PBS 주사 및 GCV 없음을 포함하였다. 처리된 동물에서의 종양 진행의 라이브 영상화 (도 2c), 및 생물발광을 사용한 간에서의 총 종양 부담의 사후 분석 (도 2d-2e)은 HSV-TK 출력 및 GCV 요법과 조합으로 전체 회로 프로그램을 보유하는 유전자 요법 벡터가 강한 항종양 활성을 가지며, 이는 임의의 대조군 부문에서는 부재함을 명백하게 입증하였다. PBS 대조군 부문에서의 동물 중 하나에서의 낮은 종양 부담은 초기의 빈약한 종양 이식으로부터 초래되었고 (도 2f), 일반적으로 모든 3개의 대조군 부문은 동일하게 거동하여, 초기 부담에 비례하는 최종 종양 부담을 초래하였으며, 이는 종양 성장이 동일한 역학에 의해 지배되었음을 의미한다. 파일럿의 치료 부문에서의 동물은 자명한 이상치이며, 이는 치료가 종양 부담을 감소시키는데 효율적이었다는 또 다른 증거를 제공한다.
실시예 3. 보다 높은 특이성 및 보다 폭넓은 범위를 갖는 종양-표적화 프로그램의 조작.
파일럿 실험의 결과에 의해 고무되어, 종양 표적화 프로그램을 변형시키고 병행하여 시험관내에서 및 생체내에서 회로 작용의 메커니즘의 보다 철저한 평가를 수행하는 것을 추구하였다. SOX9/10 및 HNF1A/B 입력의 조합은 발현을 간 및 간 종양에 제한하는 양호한 시작점인 것으로 가설화되었지만, 생체내에서 miR-122 활성에 대한 이전의 데이터는 그의 활성이 간에 제한되었음을 제시하였고 (Dastor et al., 2018), 따라서 모든 다른 기관에 대해 회로의 TF-단독 구성요소에 의존해야 할 것이었는데, 이는 폭넓은 기관 특이성을 갖는 벡터 캡시드가 사용될 경우 문제가 될 수 있다. 추가로, miR-122는 일부 HCC 하위유형으로부터 건강한 간세포를 분리하는 양호한 분류 마커이지만, 이는 보편적인 HCC 특색은 아니다. 따라서, 검색은 간 대 간 종양의 보다 폭넓은 분류 능력을 가능하게 할 뿐만 아니라 추가의 기관을 보호할 수 있는 miRNA 입력에 초점을 맞추었다. 이 검색에 대한 기원점은 1) 이전에 수득된 miRNA 프로파일링 데이터세트 (Dastor et al., 2018) 및 2) 상이한 기관에서의 고도로-발현된 마이크로RNA에 대한 광범위한 문헌 분석이었다. HuH-7 세포 및 건강한 간세포를 보다 앞선 실험에서 프로파일링하였으며, 간세포에서 고도로 발현되지만 HuH-7 세포에서는 하향조절된 miRNA를 확인하기 위한 시도가 먼저 이루어졌다 (도 3a). NGS 프로파일링 데이터세트에서의 카운트 비에 기반하여 선택된 miRNA 세트는 miR-122 (참조물로서), miR-424, miR-126-5p, miR-22, miR-26b 및 let-7c를 포함하였다. 양방향성 miRNA 리포터 (Dastor et al., 2018)를 구축하고, AAV-DJ 벡터 내로 패키징하여, 시험관내에서 1차 간세포에 대한 높은 전달 효율을 보장하였다 (도 3b). miRNA 후보의 생물학적 활성을 HuH-7, HepG2, 및 1차 단리된 뮤린 간세포에서 측정하였다. 시험된 miRNA 중에서, let-7c는 가장 높은 차등적 활성을 나타내었으며; 더욱이, 이는 HuH-7 및 HepG2 세포 둘 다에서 하향조절되었다 (도 3c). 흥미롭게도, NGS 카운트를 생물학적 활성과 비교하는 소급적 분석 (도 3d)은 매우 표면적인 상관관계만을 제시하며, 이는 후보 입력의 기능적 시험의 중요성을 강조한다.
문헌 검색 및 잠재적 기관-보호 miRNA에 대한 프로파일링 데이터세트의 조사는 miRNA의 세트를 초래하였다: miR-424 (신장 및 다른 기관), miR-208a 및 miR-208 (심장), miR-216A, miR-217, 및 miR-375 (췌장). 시험관내 스크리닝 작전에 기반하여 발견된 간 보호르 위한 후보인 Let-7c는 이 목록에 첨가되었다. 이들 miRNA의 각각에 대해, 양방향성 리포터를 조작하고, 그의 폭넓은 생체분포로 인하여 선택된 B1-위형화된 AAV 벡터 (Choudhury et al., 2016)에서 패키징하였다. 짐작건대 중성 miRNA 표적 ("TFF5")을 보유하는 대조군 벡터를 제조하였다. (그러나, 데이터가 밝혀낸 바와 같이, 이 표적은 적어도 일부 기관에서 miRNA 입력에 대해 반응하고 있었음.) 벡터를 건강한 마우스 내로 전신적으로 주사하고, 리포터 발현을 주사 후 3주에 다양한 기관에서 평가하였다. 강한 생체분포가 간, 췌장, 심장 및 신장에서 발견되었으며, 분석은 이들 기관에 초점이 맞추어졌다. Let-7c는 생체내에서 건강한 간-특이적 입력으로서 잠재성을 나타낸 세트로부터의 유일한 miRNA였다. 생체내에서 췌장에서, miR-217 및 miR-375 둘 다는 문헌으로부터 예상된 바와 같은 활성을 나타내었지만; let-7c는 가장 강한 반응을 가졌다. 심장에서, miR-208a 및 miR-208b는 사전 데이터와 일치하는 활성을 나타내었지만, 다시 let-7c는 가장 강한 반응을 가졌다. 마지막으로, miR-424는 예상된 바와 같이 신장에서 활성이었지만, 이 기관에서 또한 let-7c는 가장 강한 효과를 제공하였다 (도 3ef).
요약하면, 시험관내 및 생체내 데이터의 조합은 이 연구의 목적을 위해, let-7c가 한꺼번에 및 동시에 다수의 기관에 대한 보호적 miRNA 입력의 역할을 하고, 종양 연구에 사용된 둘 다의 HCC 세포주에서 강하게 하향조절되는 "보편적인" 입력으로서 역할을 할 수 있음을 제시하였다. 따라서, 회로의 다음 반복, 더빙된 HCC.V2는 프로그램 "SOX9/10 AND HNF1A/B AND NOT(let-7c)"를 실행한다.
실시예 4. 시험관내에서의 및 생체내에서의 작용의 메커니즘.
시험관내에서의 세포 형질도입을 위한 효율적인 비히클로서 AAV-DJ 캡시드, 및 생체내에서의 폭넓은 생체분포를 갖는 캡시드로서 AAV-B1을 사용하여, AAV-패키징된 회로의 광범위한 기계론적 연구를 수행하였다. 연구에서 보다 먼저, 논리 프로그램을 분석하고, 회로-운반 플라스미드 DNA를 임의의 입력을 발현하지 않는 배경 세포주 내로 형질감염시키고; 이어서 결과를 예상과 비교하는 모든 가능한 입력 조합의 체계적 이소성 발현에 의해 확인하였다. 바이러스 벡터의 경우, 이 전략은 더 이상 유효하지 않은데, 이는 회로 자체가 AAV 형질도입을 통해 전달되는 경우 개별적 이소성 입력을 공동-전달하는 것이 거의 불가능하기 때문이다. 사실, 보다 흥미로운 질문은 어떻게 벡터가 내인적으로 발현된 입력에 반응하는가 하는 것인데, 이는 요법의 맥락에서 세포 분류가 내인성 입력에 의존하고, 그에 적당하게 반응해야 하기 때문이다. 따라서, 메커니즘의 증거는 세포 유형에서의 전체 회로의 출력이 이들 세포에서의 개별적 회로 입력의 활성 및 회로의 논리 프로그램과 일치하는지 여부의 질문을 포함한다.
따라서, 개별적 유전자 센서를 생성하고, 모든 회로 입력 (SOX9/10 및 HNF1A/B 피드백-증폭된 센서에 대해 각각 AAV-DJ.C.SOX-FB.mCherry 및 AAV-DJ.C.HNF1-FB.mCherry); let-7c 센서 (AAV-DJ.C.let-7c.mCherry); AND 게이트만을 실행하는 부분적 회로 (AAV-DJ.C.TF-AND.mCherry); 전체 회로 (AAV-DJ.HCC.V2.mCherry); 및 참조물로서 역할을 하는 구성적 리포터 (AAV-DJ.C.CMV.mCherry)에 대해 AAV-DJ 내로 패키징하였다 (도 4a). 이들 구축물의 출력을 10개의 세포주 및 1차 간세포에서 측정하였다. 결과 (도 4b-4c)는 다중 입력 회로의 반응이 개별적 입력의 발현과 일치함을 제시하며, 이는 작용의 메커니즘이 플라스미드-기반 및 바이러스 벡터-패키징된 시스템 사이에 보존됨을 확인시켜 준다. SOX9/10 및 HNF1A/B에 대한 둘 다의 개별적 센서의 강한 반응은 TF-AND 게이트의 높은 반응을 촉발시키는데 필요하고; TF-AND 게이트의 강한 반응 및 let-7c 센서의 반응의 결여는 완전한 프로그램의 높은 출력을 달성하는데 요구된다.
생체내 특징규명을 위해, 각각 구성적 대조군 AAV-B1.C.CMV.mCherry, TF-단독 AND 게이트 AAV-B1.C.TF-AND.mCherry, let-7c 리포터 AAV-B1.C.let-7c.mCherry, 및 전체 회로 AAV-B1.HCC.V2.mCherry를 패키징하고, 출력으로서 mCherry를 발현하는 B1-위형화된 벡터를 마우스 꼬리 정맥 내로 전신적으로 주사하고, mCherry 발현을 주사 후 3주에 다양한 기관에서 평가하였다. 발현을 신선한 기관 슬라이스에서 화상 프로세싱에 의해 정량화하였다. 결과 (도 5a-5b)는 다수의 입력의 복잡한 상승작용적 작용 및 상이한 기관에서의 그들의 다양한 역할을 강조한다. 간에서, AND-게이트는 구성적 대조군에 비해 양성 세포의 수의 감소를 초래하였지만, 양성 발현을 나타낸 세포 상의 상승된 발현을 초래하였다. let-7c 리포터는 대조군에 비해 감소된 발현을 나타내었지만, 잔류 발현은 명백하게 배경 초과였다. 완전한 회로는 배경으로부터 사실상 구별불가능한 발현을 초래하였다. 췌장에서, AND 게이트-제어된 발현 및 let-7c 제어된 발현은 출력 발현의 큰 감소를 발생시켰지만, 각각의 경우 발현은 배경 초과였다. 간에서와 같이, 완전한 표적화 프로그램은 배경 초과의 임의의 검출가능한 발현을 생성하지 않았다. 심장에서, AND 게이트 또는 let-7c 중 어느 하나는 그 자신 상의, 및 완전한 회로에서 조합되는 경우 배경-수준 발현을 제공하였다. 신장에서, AND 게이트도 let-7c 조절도 발현을 배경으로 하향시키지 않은 반면, 완전한 프로그램은 그러하다는 점에서, 상황은 췌장과 유사하다. 요약하면, 데이터세트는 다중-입력 논리 회로가 생체내에서 건강한 기관으로부터의 고도로 효율적인 탈-표적화를 달성하는데 요구된다는 가설을 강하게 지지하며; 논리 프로그램 "SOX9/10 AND HNF1A/B AND NOT(let-7c)"에 의해 추상화된 바와 같이, 다수의 입력의 상승작용적 효과가 4가지 경우 중 3가지에서 명백하다. 이어서 동일한 프로그램이 생체내에서 종양을 효율적으로 표적화할 수 있는지를 결정하기 위한 실험을 디자인하고, mCherry 출력을 갖는 B1-유형 AAV-B1.HCC.V2.mCherry 회로를 종양-보유 NSG 마우스에게 주사하였다. 데이터 (도 5c)는 도 5a-5b에서의 데이터와 일치하게, 사실, 종양은 생체내에서 특이적으로 및 효율적으로 표적화되는 반면, 다른 기관은 출력을 발현하지 않음을 제시한다.
실시예 5. 시험관내에서의 및 생체내에서의 항종양 효능.
회로 프로그램은 생체내에서 우수한 종양-특이적 발현 및 주요 기관으로부터의 탈-표적화를 제시하였기 때문에, 그의 항종양 활성의 상세한 평가를 기준점 항종양 작동인자로서 전구약물 간시클로비르와 조합으로 HSV-TK 효소를 사용하여 수행하였다. 회로는 더빙된 HCC.V2-HSV-TK였다. 시험을 파일럿 실험 (도 2)과 유사하지만, 보다 큰 동물 그룹 및 연장된 수의 실험 부문을 갖는 라인에 따라 수행하였다. 구성적 대조군 및 완전한 회로를 포함하는 DJ-위형화된 벡터를 제조하고, 간시클로비르에 대한 그들의 용량-반응을 HuH-7, HepG2, 및 HeLa 세포주에서 및 시험관내에서 배양된 1차 간세포에서 평가하였다. 예상된 바와 같이, Huh-7 및 HepG2 세포는 구성적 벡터 및 회로 AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK에 의해 동등하게 표적화된 반면, HeLa 음성 대조군 세포 및 1차 간세포 둘 다는 구성적 벡터에 대해 민감하였지만 완전히 제공된 회로에 의해서는 제거되지 않았다 (도 6a). 추가로, AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK는 HuH-7 세포에서, 이들 세포에서 하향조절되지 않는 let-7c 센서의 사용으로 인하여 AAV-DJ.HCC.V1-HSV-TK보다 더 강력하다. 그러나, AAV-DJ.HCC.V1-HSV-TK는 miR-122에 의한 불완전한 셧-다운으로 인하여 HuH-7 세포에서 여 전히 활성이었다 (도 6b).
다음으로, 회로를 갖는 DJ-위형화된 AAV 벡터를 HepG2-LC 종양-보유 마우스에게 전신적으로 전달하였다 (도 7a). 간시클로비르를 갖지 않는 실험 부문은 모의 주사 (염수); TF-AND 프로그램을 코딩하는 벡터 AAV-DJ.C.TF-AND-HSV-TK; 및 전체 회로 AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK를 코딩하는 벡터를 포함하였다. 간시클로비르를 갖는 부문은 벡터 또는 모의의 꼬리 정맥 전달, 이어서 간시클로비르 주사의 요법에 관하여 상기 부분을 반영하였으며; 즉: 모의 주사 + GCV; AND-게이트 회로 + GCV; 및 완전한 회로 + GCV를 포함하였다. 동물 (부문 당 n=4)을 생체내 생물발광을 사용하여 그들의 종양 부담에 대해, 및 점수 시트 기준을 사용하여 그들의 안녕에 대해 추적하였다. 데이터 (도 7b-7f)는 HSV-TK 출력이 제공되고 GCV 요법으로 보충된 전체 HCC.V2-HSV-TK 프로그램을 갖는 벡터로 처리된 마우스가 강건하고 재현가능한 봉쇄 및 이어서 그들의 종양 부담의 퇴행을 나타내는 반면, GCV를 갖지 않는 대조군 그룹, 또는 GCV로만 주사된 그룹은 시간 경과에 따라 지수적인 종양 부담 증가를 나타냄을 지시한다. HSV-TK 출력을 갖는 AND 게이트를 코딩하는 벡터, AAV-DJ-C.TF-AND-HSV-TK는 AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK에 비해 유사한 항종양 효과를 나타내었지만, 또한 강한 유해 효과를 촉발시켰으며, 따라서 이 부문에서의 동물은 예정된 완결 전에 안락사되어야 했다. 한편, 완전한 AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK 회로로 처리된 부문은 자명한 유해 효과 없이 종양 부담의 연장된 감소를 나타내었다. 이들 결과는 생체내에서의 표적화 특이성 (도 5a-5d) 및 생체내에서의 유해 효과의 규모 사이의 긴밀한 연관을 명백하게 예시한다. 따라서, 장래에 형광 출력 발현으로부터 판단된 바와 같은 종양의 외부의 출력 발현의 존재는 기능적 출력을 갖는 그들의 독성에 대해 평가될 필요가 없는 사전-스크리닝 단계를 구성할 것이다.
실시예 6. AAV-B1 및 AAV-DJ 위형 회로 유도된 HCC 표적화의 생체내 비교.
B1-유형 AAV 캡시드에 대해 관찰된 폭넓은 향성 및 강한 생체내 형질도입 및 유전자 발현을 HCC.V2 프로그램의 제어 하에 놓음으로 달성된 광범위한 다중-기관 탈표적화를 고려하여, 생성된 B1-유형 AAV-B1.HCC.V2 회로는 선택성을 손상시키지 않으면서 높은 종양 형질도입을 생성할 수 있다고 판단되었다. 이 가능성을 조사하기 위해, AAV-B1.HCC.V2-mCherry 전체 회로 출력이 이전의 효능 연구에 사용된 DJ 캡시드 대신 B1 캡시드를 사용하여 전달되는 경우 회로 출력 (mCherry)을 비교하였다. 데이터 (도 8a)는 동일한 투여량으로 투여되는 경우, B1 유형 회로가 이웃하는 간 조직에 대한 그의 선택성을 유지하면서 모든 DJ 변이체 (AAV-DJ.HCC.V2.mCherry, TF-단독 AND 게이트 AAV-DJ.C.TF-AND.mCherry 또는 AAV-DJ.C.CMV.mCherry)의 종양 발현 수준을 크게 능가함을 제시한다. 종양내 출력 발현은 약 40배 더 높았으며 (도 8b), 심지어 큰 종양 결절의 코어 섹션에서도 강한 형광을 초래하였다. 종양 침투와 조합된 강한 선택적 발현은 HCC 유전자 요법에 대한 유망한 후보로서 B1-유형 캡시드에 결합된 회로 표적화를 시사한다.
실시예 7. miR-let-7c 및 miR-122의 조합.
시험관내 효능 데이터는 HCC.V1이 심지어 높은 투여량에서도 간세포를 완전히 보호하는 반면 (도 2b), 동일한 프로그램은 HCC.V2와 비교할 경우 HUH-7 세포 살해 효율의 부분적 감소만을 나타내며 (도 5b), 높은 바이러스 투여량에 대해 거의 필적하는 성능을 초래함을 제시한다. 이 차이는 HUH-7 세포에 비해 간세포에서 관찰된 보다 견고한 유전자 억제와 일치한다 (도 2a).
본원에서 확립된 바와 같이, miR-122 표적의 수 및 배열의 변화는 억제 강도를 조정하여 상이한 miR-122 수준을 갖는 세포주에서 상이한 발현 수준을 초래하는데 사용될 수 있다 (도 1m). 표적 수, 배열의 변화를 통한, 또는 불완전하게 상보적인 표적의 사용을 통한 miR-122 억제 효율의 감소는 간 탈표적화의 부분적 감소의 위험에도, (심지어 보다 낮은 바이러스 투여량에서도) HUH-7에서의 회로 효능을 증가시키는데 사용될 수 있다고 가설화되었다.
이들 데이터로부터, 보다 약한 miR-122 억제를 갖는 HCC.V2로부터의 miR-Let7c 표적을 조합하는 HCC.V3 회로 (도 9a)는 HCC.V3 회로 및 HCC.V2 회로 둘 다를 능가할 것으로 예상된다. miR-122에 의해 유발된 억제 강도는 T-122 표적의 수 및 위치화를 변화시킴으로써, 불완전하게 상보적인 표적을 도입함으로써 또는 2가지 접근법의 조합에 의해 조정될 수 있다. 불완전하게 상보적인 표적은 miRNA 시드 서열을 플랭킹하는 서열에서 무작위 돌연변이를 도입함으로써 또는 miRNA에 의해 조절되는 유전자의 보존된 3' UTR로부터 유래된 miR-122 표적을 사용함으로써 수득될 수 있다 (도 9b). HCC 세포 (특히 HUH-7)에 대한 간 보호 및 효능의 목적하는 조합을 최대화하는 후보가 선택될 수 있다.
HCC.V3은 주요 기관 (Let-7c)으로부터의 일반화된 miRNA 탈표적화를 나타내고, HepG2 및 HUH-7 둘 다에서 그의 효능의 유의한 감소 없이 간에서 조합된 보호 (Let7c 및 miR-122)로부터 이익을 얻을 것으로 예상된다. 대부분의 바이러스 벡터에 대한 가장 높은 생체분포를 갖는 기관이므로, 가장 견고한 가능한 간 탈표적화를 달성하는 것은 특히 바람직하며, 치료 창의 추가의 증가를 초래할 수 있다.
실시예 8. 논의.
본 개시내용은 논리 유전자 회로 접근법의 임상적 번역에 대한 길을 제시한다. 3가지 기저의 기둥이 이러한 번역을 지지하는데 필요하며, 즉: (1) 질환의 분자 구성의 지식; (2) 이 지식을 이용하는 것을 가능하게 하는 플랫폼의 이용가능성; 및 (3) 이 플랫폼의 임상적으로 관련된 치료 양상으로의 번역가능성은 함께 모여 유망한 시험관내 및 생체내 효능 및 안전성 프로파일을 갖는 실행가능한 치료 후보를 전달한다. 본원에 기재된 광범위한 기계론적 특징규명은 그의 개별적 구성요소에 비해, 체계적인 절차에 따라 합리적인 상향식 방식으로 구축된 다중-입력 세포 분류기의 고유한 특성을 강조한다. 중요하게는, 리포터 출력에 의해 판단된 바와 같은 표적화 특이성은 생체내에서 효능 및 유해 효과 둘 다와 긴밀하게 상관됨이 본원에서 입증된다.
특이적 발현 및 치료 제어의 다른 양상, 예컨대 시기 및 투여량은 암에 대한 뿐만 아니라 다른 적응증에 대한 유전자 요법의 차기 첨단분야이다. 우선적 조직 표적화, 뿐만 아니라 특이적 조직 발현을 위한 프로모터 요소를 갖는 신규 캡시드의 개발에 많은 노력이 투자되었다. 특히, 둘 다의 연구는 큰 라이브러리의 광범위한 스크리닝에 의존하고, 이들은 성공을 보장하지 않으며; 더욱이, 특이성의 주장은 카운터 샘플의 큰 패널의 존재 하에서만 이루어질 수 있다. 인간 요법을 위해, 이들 샘플은 인간 기원의 것이어야 한다. 인간 조직의 큰 다양성으로 인하여, 캡시드 및/또는 프로모터 스크린에 대한 큰 라이브러리 크기에 중첩되어, 이 노력을 엄청나게 복잡하게 만들 것이다. 본원에 기재된 상향식 접근법은 다수의 개별적 입력으로부터 조합적 특이성을 생성하는 합리적인 디자인을 사용한다. 프로파일링에 의한 후보 입력 공간을 좁히는 것은 복잡한 프로그램의 조작을 합리적인 전방향 디자인 배경에 대한 이질적 세포 집단 (Huh-7 및 HepG2 세포의 본 발명자들의 예에서와 같이)을 다루는 것을 가능하게 한다. 이 접근법은 표적화된 캡시드 또는 특이적 프로모터의 사용을 배제하지 않는다: 이들은 필요에 따라 적용될 수 있다. 그러나, 파종성 질환, 예컨대 암에 대해, 폭넓은 향성 캡시드는 우선적일 수 있으며; 특이적 발현의 부담은 이어서 요법의 유전자 탑재물에서 코딩되는 분류된 프로그램으로 이동된다. 다른 경우, 캡시드 특이성 및 분류기 프로그램은 가장 양호한 목적하는 효과를 달성하기 위해 상승작용적으로 사용될 수 있다.
간에서의 큰 다초점성 종양의 효율적인 침투는 단일 전신 주사 후 생체내에서 달성되었으며 (도 5c-5d 및 도 8a-8c), 이는 심지어 단일 주사도 탑재물을 파종성 및 잘-혈관화된 종양, 예컨대 HCC에 전달할 수 있다는 강한 증거를 제공한다. 구경꾼 효과를 갖는 출력은 이어서 이들 종양을 효율적으로 치료할 수 있다.
실시예 9. 실시예 1-8에 대한 재료 및 방법.
세포주: HuH-7 세포를 일본 보건 과학 재단(Japan Health Sciences Foundation)의 보건 과학 연구 자원(Health Science Research Resources) 은행 (Cat-# JCRB0403)으로부터 구입하고, 37 ℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스(Life technologies), Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM, 저 글루코스, 글루타맥스(GlutaMAX) (라이프 테크놀로지스, Cat #21885-025)에서 배양하였다. Hep G2 세포를 ATCC (Cat# HB-8065)로부터 구입하고, 37℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 RPMI (깁코(Gibco) A10491-01)에서 배양하였다. HeLa 세포를 ATCC (Cat # CCL-2)로부터 구입하고, 37℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM, 고 글루코스 (라이프 테크놀로지스, Cat #41966)에서 배양하였다. Hep3B 세포를 ATCC (Cat# HB-8064)로부터 구입하고, 37 ℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM, 저 글루코스, 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스, Cat #21885-025)에서 배양하였다. HCT-116 세포를 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운드 첼쿨투렌(Deutsche Sammlung Von Microorganismen and Zellkulturen) (DMZ), DMZ No ACC-581로부터 구입하고, 37 ℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스, Cat #31966-021)에서 배양하였다. SW-620 세포를 ATCC (Cat # CCL-227)로부터 구입하고, 37℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스, Cat #31966-021)에서 배양하였다. LoVo 세포를 ATCC (Cat # CCL-229)로부터 구입하고, 37℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스, Cat #31966-021)에서 배양하였다. A549 세포를 ATCC (Cat # CCL-185)로부터 구입하고, 37℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스, Cat #31966-021)에서 배양하였다. SH4 세포를 ATCC (Cat # CCL-185)로부터 구입하고, 37℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 DMEM 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스, Cat #31966-021)에서 배양하였다. IGROV1 세포는 NCI-60 패널의 일부이며, NCI (NIH)에 의해 수득하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% FBS (시그마-알드리치, Cat #F9665 또는 라이프 테크놀로지스, Cat #10270106) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (시그마-알드리치, P4333)으로 보충된 RPMI (깁코 A10491-01)에서 배양하였다.
루시페라제 및 mCitrine 안정한 세포주 (HepG2 LC)의 생성: mCitrine 및 루시페라제를 안정하게 발현하는 HepG2 세포주 (HepG2 LC)를 AAVS 로커스의 TALEN 편집을 통해 생성하였다. 4x105개의 HepG2 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 후에 리포펙타민 2000을 갖는 총 2 μg DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 믹스는 하기와 같이 구성되었다: EF1A 프로모터 (pIK014)의 제어 하에서 500 ng hAAVS1 1L TALEN (pIK11), 500 ng hAAVS1 1R TALEN (pIK12) 및 1 μg의 루시페라제 2A Citrine. 형질전환된 세포를 확장시키고, 일시적 형질감염으로부터 발생하는 발현을 희석하기 위해 3주 동안 배양에서 유지하였다. 3주 후, mCitrine+ 벌크 집단 (< 1%)을 BD FACS 아리아(Aria) III을 사용하여 분류하였다. 생성된 20,000개의 세포를 초기 회수를 촉진하기 위해 제1 주 동안 20% FBS로 보충된 RPMI에서 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 2주 동안 배양하고 확장시켜 안정한 트랜스진 발현을 갖는 세포에 대해 선택하고 침묵인 경향이 있는 클론을 회피하였다. 단일 mCitrine+ 클론을 96-웰 플레이트에서 분류하고, 20% FBS로 보충된 RPMI에서 배양하고, 확장시켰다. 3개의 상이한 고 발현 클론을 선택하고, 가장 양호한 것을 연속적 실험에 사용하였다. 클론의 생물발광을 포톤이미저(PhotonIMAGER) RT (바이오스페이스 래보러토리즈(Biospace Laboratories))를 사용하여 5분 동안 측정하여 루시페라제 발현을 확인하였다.
바이러스 벡터 플라스미드 및 바이러스 생성: 단일-가닥 (ss) AAV 벡터를 이전에 기재된 바와 같이 생성하고 정제하였다 (Paterna 2004, Conway 1999). 간략하게, 시미안 바이러스 대형 T-항원 (293T)을 발현하는 인간 배아 신장 세포 (HEK293)를 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개 AAV 벡터 플라스미드 (패키징될 AAV 벡터 게놈을 제공함), AAV 헬퍼 플라스미드 (관심의 AAV 혈청형의 AAV 혈청형 2 rep 단백질 및 cap 단백질을 제공함) 및 아데노바이러스 (AV) 헬퍼 플라스미드 pBS-E2A-VA-E4 (Glatzel 2000)로 1:1:1 몰 비로 공동형질감염시켰다. 형질감염 후 96 내지 120시간에 HEK293T 세포를 수집하고, 저속 원심분리 (1500g/4 ℃에서 15분)에 의해 그들의 상청액으로부터 분리하였다. 상청액 내로 방출된 AAV 벡터를 PEG 8000 용액 (최종: 8% v/v) 및 NaCl (최종: 0.5 M)을 첨가함으로써 4 ℃에서 밤새 PEG-침전시켰다. PEG-침전을 저속 원심분리 (3488g/4 ℃에서 60분)에 의해 완결하였다. 투명화된 상청액을 버리고, 펠릿화된 AAV 벡터를 AAV 현탁 완충제 (150 mM NaCl, 50 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 8.5)에 재현탁시켰다. HEK293T 세포를 AAV 현탁 완충제에 재현탁시키고, 7 mL 연조직 균질화 CK14 튜브와 조합으로 베르틴 미닐리스 균질화기(Bertin's Minilys Homogenizer)에 의해 용해시켰다 (5000 rpm/RT에서 2회의 1분 사이클, -20 ℃에서 >4분 냉각에 의해 일시멈춤). 조 세포 용해물을 비트뉴클레아제(BitNuclease) 엔도뉴클레아제 (75 U/mL, 37 ℃에서 30 내지 90분)로 처리하고, 원심분리 (17000g/4 ℃에서 10분)에 의해 투명화하였다. PEG-펠릿화된 AAV 벡터를 투명화된 용해물과 합하고, 불연속적 밀도 아이오딕산올 (옵티프렙(OptiPrep), 액시스-쉴드(Axis-Shield)) 구배 (등밀도) 초원심분리 (365929g/15 ℃에서 2시간 15분)로 처리하였다. 이어서, 아이오딕산올을 비바스핀(Vivaspin) 20 한외여과 장치 (100000 MWCO, PES 막, 사르토리우스(Sartorius)) 및 1 mM MgCl2 및 2.5 mM KCl로 보충된 1x 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 사용하여 제조업체의 지시서에 따라 투석여과 (한외여과)의 3 라운드에 의해 AAV 벡터 함유 분획으로부터 제거하였다. AAV 벡터를 저장하고, -80 ℃에서 분취하였다. 캡시드화된 바이러스 벡터 게놈 (vg)을 큐빗(Qubit) dsDNA HS 검정 키트와 조합으로 큐빗 3.0 형광계 (둘 다 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 정량화하였다. 간략하게, 5 μL의 비희석된 (또는 1:10 희석된) AAV 벡터를 중복으로 제조하였다. 하나의 샘플을 열-변성시키고 (95 ℃에서 5분), 비처리된 및 열-변성된 샘플을 제조업체의 지시서에 따라 정량화하였다. 바이러스외 (비캡시드화된; 비처리된 샘플)를 총 바이러스내 및 바이러스외 (캡시드화된 및 비캡시드화된; 열-변성된 샘플)로부터 차감함으로써 바이러스내 (캡시드화된) vg/mL를 계산하였다.
생체내 주사를 위한 세포 제조: HepG2 LC 세포를 배양하고, T-75 또는 T-150 플라스크에서 70-80% 전면생장률까지 계대하였다. 생체내 주사를 위해 본 발명자들은 리포터 유전자의 침묵화를 최소화하기 위해 낮은 계대 수 (계대 12 이하)를 갖는 세포를 사용하였다. 성장 배지를 제거하고, PBS (T-75에 대해 10 ml 또는 T-150에 대해 20ml)로 세척하고, 세포를 트립신 (깁코, 25200056) (T-75에 대해 2ml 또는 T-150 플라스크에 대해 6ml)으로 37 ℃에서 5분 동안 해리함으로써 세포를 분리하였다. 세포 현탁액을 8 mL (T-75) 또는 24 ml (T-150)의 PBS로 희석하고, 피펫팅에 의해 부드럽게 재현탁시키고, 이어서 100 μm 필터를 사용하여 50ml 팔콘(Falcon) 튜브에서 여과하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 추가의 PBS를 사용하여 필터 10ml (T-75) 또는 T-150에 대해 20 ml를 세척하고, 세포를 20 ml (T-75) 또는 50 ml (T-150)의 총 부피로 추가로 희석하였다. 세포 현탁액을 498 rpm에서 4 ℃에서 9분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 20 ml의 PBS로 세척하고, 498 rpm에서 4 ℃에서 6분 동안 2회 더 원심분리하여 트립신의 임의의 자취를 제거하였다. 실험에 필요한 세포의 수에 따라 절차를 하나 이상의 플라스크 및 튜브로 수행한다. 각각의 펠릿을 소량의 PBS (각각의 펠릿에 대해 250-300ul)에 재현탁시키고, 작은 분취물을 뉴바우어(Neubauer) 챔버 및 트리판 블루를 사용하여 살아 있는 세포의 수동 카운팅을 위해 희석한다 (1:50 및 1:100). 적어도 4개의 독립적 카운트를 세포 현탁액당 취하고, 평균 값을 사용하여 주사될 세포의 수를 결정하였다. 세포 현탁액을 현미경 하에서 육안으로 검사하여 큰 무리의 부재를 확인하였다. 마지막에 부피를 PBS로 약 2x 107개의 세포/mL로 조정하였다. 세포 현탁액을 수술의 지속기간 동안 얼음 상에서 유지하였으며, 높은 세포 농도를 고려하여 세포는 각각의 주사 전에 재현탁을 요구한다. 조작을 최소화하고 생존율을 개선시키기 위해, 세포를 다수의 스톡 (2-3개의 튜브)에서 나눈다. 본 발명자들은 세포 무리의 존재 및 잔류 트립신 또는 다른 세포-해리 시약의 존재 둘 다가 독성이며 잠재적으로 동물의 생명을 위협함을 주목한다.
이종이식편 마우스 간 마우스 모델: 모든 동물 절차는 스위스 연방법 및 아이드제노시쉐 테크니쉐 훽슐레(Eidgenossische Technische Hochschule)(ETH) 취리히의 기관 지침에 따라 수행하였으며, 바젤-슈타츠 주의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 8 내지 10-주령 면역결핍성 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ, 찰스 리버(Charles River), 독일 슐츠펠트)를 특이적-병원체-무함유 시설에서 하우징하였다. 인간 종양 세포로부터 유래된 마우스 간 종양을 생성하기 위해, NSG 마우스를 흡입용 이소플루란으로 마취시켰다. 무균 수술 기술을 사용하여, 1-1.5cm의 좌측 늑골하 절개를 행하고, 비장을 노출시켰다. 50μl PBS 중 105개의 HepG2 세포를 27-게이지 바늘을 사용하여 비장의 하엽 내로 주사하였다. 바늘의 제거 즉시, 비장의 하극을 결찰시켰다. 대다수의 세포가 콜로니화를 위해 간에 도달하기 위해 10-분 배수를 허용한 후, 주요 비장 혈관구조를 결찰시키고 비장을 제거하였다. 이어서 복부 절개를 봉합선으로 닫았다. 마우스에서의 종양 성장을 주당 2-3회 생물발광 영상화에 의해 모니터링하였다 (포톤이미저 RT, 바이오스페이스 랩).
리포터 AAV의 생체내 전달 및 형광 현미경검사 및 유동 세포계측법에 의한 유전자 발현 분석: 생체내에서 회로 출력 발현을 시각화하기 위해, mCherry 출력을 코딩하는 AAV의 2x1012개의 vg (바이러스 게놈) 또는 PBS를 종양 세포 이식 후 2주에 꼬리 정맥을 통해 단일 용량으로서 투여하였다. 3주 후, 마우스를 안락사시키고, 즉시 10 또는 25U/mL 헤파린 (시그마-알드리치)을 함유하는 50-70 mL HBSS로 경심장적으로 관류시켜 자가형광 적혈구를 제거하였다. 기관 및 조직 (간, 폐, 뇌, 췌장, 골격근, 심장 및 신장)을 수거하고, 신선한 조직 슬라이스를 제조하고, PBS에서 얼음 상에서 유지하였다. mCherry의 발현을 형광 현미경검사에 의해 즉시 분석하였다.
치료 AAV의 생체내 전달 및 전구약물 치료: 종양 세포 접종 후 2주에, 종양-보유 마우스를 먼저 생물발광 강도 (높음 대 낮음)에 의해 반영된 종양 부담에 기반하여 계층화하고, 이어서 그룹 중에서의 종양 부담 비교가능성을 보장하기 위해 다양한 치료 그룹으로 무작위화하였다. AAV-회로 구축물의 4x1012개의 vg (바이러스 게놈) 또는 PBS를 1주 떨어진 2회의 별개의 주사를 통해 정맥내로 투여하였다. 전구약물 GCV (50 mg/kg, 인비보젠(InvivoGen)) 또는 염수 처리를 제1 AAV 주사 후 제3일에 개시하고, 마우스를 2-주 지속기간 동안 일당 1회 복강내로 주사하였다. 종양 성장을 주당 2-3회 생물발광 영상화로 평가하였다. 마우스를 점수 시트로 모니터링하고, 종점이 달성된 경우 안락사시켰다. 모든 마우스는 14일의 전구약물 처리 후 종결되었다. 간을 종양 부담의 생체외 생물발광 영상화 분석을 위해 수거하였다. 종양 세포 접종 후 2주에, 종양-보유 마우스를 먼저 생물발광 강도 (높음 대 낮음)에 의해 반영된 종양 부담에 기반하여 계층화하고, 이어서 그룹 중에서의 종양 부담 비교가능성을 보장하기 위해 다양한 치료 그룹으로 무작위화하였다. AAV-회로 구축물의 4x1012개의 vg (바이러스 게놈) 또는 PBS를 1주 떨어진 2회의 별개의 주사를 통해 정맥내로 투여하였다. 전구약물 GCV (50 mg/kg, 인비보젠) 또는 염수 처리를 제1 AAV 주사 후 제3일에 개시하고, 마우스를 2-주 지속기간 동안 일당 1회 복강내로 주사하였다. 종양 성장을 주당 2-3회 생물발광 영상화로 평가하였다. 마우스를 점수 시트로 모니터링하고, 종점이 달성된 경우 안락사시켰다. 모든 마우스는 14일의 전구약물 처리 후 종결되었다. 간을 종양 부담의 생체외 생물발광 영상화 분석을 위해 수거하였다.
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
다른 실시양태
본 명세서에서 개시되는 모든 특색은 어떠한 조합으로도 조합될 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 각각의 특색은 동일하거나, 등가이거나, 또는 유사한 목적에 기여하는 대안적인 특색에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 개시되는 각각의 특색은 일반적인 일련의 등가이거나 유사한 특색의 예일 뿐이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 상기 상세한 설명으로부터 본 개시내용의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 그의 취지 및 범주에서 벗어나지 않고도 다양한 용도 및 조건에 그를 적합화하기 위하여 개시내용의 다양한 변화 및 변형을 만들어 낼 수 있다. 따라서, 다른 실시양태가 또한 청구범위에 속하는 것이다.
등가물
본원에서 여러 발명 실시양태가 기재되고 예시되기는 하였지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나, 결과 및/또는 장점 중 하나 이상을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 떠올리게 될 것이므로, 그와 같은 변이 및/또는 변형의 각각은 본원에 기재된 발명 실시양태의 범주에 속하는 것으로 간주된다. 더 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 재료 및 배열구조가 예시적인 것을 의미한다는 것, 그리고 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 배열구조는 본 발명의 교시가 사용되는 구체적인 적용분야 또는 적용분야들에 따라 달라지게 된다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 일상적인 것을 초과하지 않는 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적인 발명 실시양태의 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전기한 실시양태가 단지 예로서 제시되었다는 것, 그리고 첨부된 청구범위 및 그의 등가물의 범주 내에서 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 발명 실시양태가 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 발명 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별적 특색, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 추가로, 2종 이상의 그와 같은 특색, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 어떠한 조합도, 그와 같은 특색, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는다면, 본 개시내용의 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에서 정의되어 사용되는 바와 같은 모든 정의는 사전상의 정의, 참조로 포함되는 문헌상의 정의 및/또는 정의되는 용어의 일반적인 의미에 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시되는 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용되는 주제와 관련하여 참조로 포함되는 바, 일부 경우에서 이는 문헌 전체를 포괄할 수 있다.
본원의 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형은 분명하게 달리 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원의 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, "및/또는"이라는 어구는 그렇게 결합되는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다", 즉, 일부 경우에는 합동으로 존재하며 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"을 사용하여 열거되는 다수의 요소도 동일한 방식으로, 즉, 그렇게 결합되는 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 임의적으로, 구체적으로 식별되는 요소와 관련되는지 또는 무관한지와 관계없이, "및/또는"이라는 문구에 의해 구체적으로 식별되는 요소 이외의 다른 요소가 존재할 수도 있다. 따라서, 비-제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때의 "A 및/또는 B"라는 언급은 하나의 실시양태에서는 A 단독 (임의적으로는 B가 아닌 다른 요소 포함)을; 또 다른 실시양태에서는 B 단독 (임의적으로는 A가 아닌 다른 요소 포함)을; 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 둘 다 (임의적으로는 다른 요소 포함)를 지칭할 수 있는 등이다.
본원의 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, "또는"은 상기에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉, 적어도 하나의 포함으로는 물론, 수많은 요소 또는 목록 요소 중 하나 초과, 및 임의적으로 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "중 오로지 하나" 또는 "중 정확하게 하나", 또는 청구범위에 사용될 때 "로 이루어진"과 같이 분명하게 달리 표시되는 용어만이 수많은 요소 또는 목록 요소 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같이 "또는"이라는 용어는 "중 어느 하나", "중 하나", "중 오로지 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같이 배제성을 갖는 용어가 선행하는 경우, 오로지 포괄적인 대안 (즉, "하나 또는 다른 것, 그러나 둘 다는 아님")을 지시하는 것으로 해석되어야 한다. 청구범위에 사용될 때, "로 본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에 사용된 바와 같은 그의 통상적인 의미를 가져야 한다.
본원의 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록에 대한 언급에서의 "적어도 하나"라는 구는 요소 목록의 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소 목록 내에서 구체적으로 열거되는 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며 요소 목록 중 요소의 임의의 조합을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이와 같은 정의는 또한 구체적으로 식별되는 요소와 관련되는지 또는 무관한지에 관계없이 "적어도 하나"라는 구가 지칭하는 요소 목록 내에서 구체적으로 식별되는 요소가 아닌 다른 요소가 임의적으로 존재할 수도 있다는 것을 가능하게 한다. 따라서, 비-제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 하나의 실시양태에서는 B가 존재하지 않는 (및 임의적으로 B가 아닌 다른 요소를 포함하는), 임의적으로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 A를; 또 다른 실시양태에서는 A가 존재하지 않는 (및 임의적으로 A가 아닌 다른 요소를 포함하는), 임의적으로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 B를; 또 다른 실시양태에서는 임의적으로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 A 및 임의적으로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 B (및 임의적으로 다른 요소 포함)를 지칭할 수 있는 등이다.
분명하게 달리 지시되지 않는 한, 하나를 초과하는 단계 또는 작용을 포함하는 본원에서 청구되는 임의의 방법에서, 방법 중 단계 또는 작용의 순서가 반드시 방법 중 단계 또는 작용이 언급되는 순서에 제한되는 것은 아니라는 것 역시 이해되어야 한다.
상기 명세서 뿐만 아니라 청구범위에서, "포함하는", "포함한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "수용하는", "로 구성된" 등과 같은 모든 전이 구는 개방형인 것으로, 즉, 포함하나 그에 제한되지는 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures) 섹션 2111.03에 제시되어 있는 바와 같이, "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"이라는 전이 구만이 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 전이 구일 수 있다. 개방형 전이 구 (예를 들어, "포함하는")를 사용하여 본 문서에서 기재된 실시양태가 대안적인 실시양태에서는 개방형 전이 구에 의해 기재된 특색"으로 이루어진" 및 그"로 본질적으로 이루어진" 것으로도 고려된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 개시내용이 "A 및 B를 포함하는 조성물"을 기재하는 경우, 본 개시내용은 대안적인 실시양태인 "A 및 B로 이루어진 조성물" 및 "본질적으로 A 및 B로 이루어진 조성물"도 고려하는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Eidgenossische Technische Hochschule Zurich <120> CELL CLASSIFIER CIRCUITS AND METHODS OF USE THEREOF <130> E0583.70001WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/009,736 <151> 2020-04-14 <160> 306 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 uucaaguaau ucaggauagg u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 cauuauuacu uuugguacgc g 21 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 cagcagcaau ucauguuuug ga 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<400> 136 Met Ala His Val Ser Ser Glu Thr Gln Asp Val Ser Pro Lys Asp Glu 1 5 10 15 Leu Thr Ala Ser Glu Ala Ser Thr Arg Ser Pro Leu Cys Glu His Thr 20 25 30 Phe Pro Gly Asp Ser Asp Leu Arg Ser Met Ile Glu Glu His Ala Phe 35 40 45 Gln Val Leu Ser Gln Gly Ser Leu Leu Glu Ser Pro Ser Tyr Thr Val 50 55 60 Cys Val Ser Glu Pro Asp Lys Asp Asp Asp Phe Leu Ser Leu Asn Phe 65 70 75 80 Pro Arg Lys Leu Trp Lys Ile Val Glu Ser Asp Gln Phe Lys Ser Ile 85 90 95 Ser Trp Asp Glu Asn Gly Thr Cys Ile Val Ile Asn Glu Glu Leu Phe 100 105 110 Lys Lys Glu Ile Leu Glu Thr Lys Ala Pro Tyr Arg Ile Phe Gln Thr 115 120 125 Asp Ala Ile Lys Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Leu Tyr Gly Phe Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Gln Asn Phe Gln Arg Ser Ala Phe Leu Ala Thr Phe Leu 145 150 155 160 Ser Glu Glu Lys Glu Ser Ser Val Leu Ser Lys Leu Lys Phe Tyr Tyr 165 170 175 Asn Pro Asn Phe Lys Arg Gly Tyr Pro Gln Leu Leu Val Arg Val Lys 180 185 190 Arg Arg Ile Gly Val Lys Asn Ala Ser Pro Ile Ser Thr Leu Phe Asn 195 200 205 Glu Asp Phe 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<211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 144 wakrrkta 8 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 145 atttacattt tgaaacatct a 21 <210> 146 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 146 wahatgwwac maarwdtww 19 <210> 147 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 147 atgttaataa 10 <210> 148 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 148 atgttaataa tatgtggcat aagcgttaaa tg 32 <210> 149 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 149 wamawwtwrt taama 15 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 150 gctatgcaga aatttgcaca 20 <210> 151 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 151 ttctycmyda tyksyks 17 <210> 152 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 152 tgtcataaaa ctgtcatatt ccttacatat aactgtca 38 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t <400> 179 nntacannnn nntactnn 18 <210> 180 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 180 kwcwtwtvgt taca 14 <210> 181 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 181 ggcaaaacta agaaattttc caggttttgc c 31 <210> 182 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 182 ggcatttcat 10 <210> 183 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 183 gcgagtcaaa aaaactca 18 <210> 184 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 184 ttcgaannnt tcgaa 15 <210> 185 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 185 rcrttcgaaa crttcgaww 19 <210> 186 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 186 rttcgaahsd ttcgaay 17 <210> 187 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 187 rcattcyaaa cattcyahw 19 <210> 188 <211> 17 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agaccggttc tggagacaaa aggggccgcg gcggccggag cgggacgggc ccggcgcggg 300 agggagcgaa gcagcgcgg 319 <210> 243 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 243 ccgcggcggc cggagcggga cgggcccggc gcgggaggga gcgaagcagc gcgggcagcg 60 agcgagtgag 70 <210> 244 <211> 1511 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 244 ggagtctcac tctgtcgccc aagctggagt gcagtagtgc gatctcagct cactgcaacc 60 tctgccctct gagttcaagt gattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggattacag 120 gcgcctgcca ccgcgcccag ctaatttttt gtatttttgg tagagacggg gtttcaccat 180 cttggccagg ctggtcttga actcctgacc tcatgatcca cccgcctcgg cttcccaaag 240 tgctgggatt acaggcgtga gccaccgtgc ctggcctaaa gaactggatt tctaatggtg 300 aaatctaagc aggagaggtg ggatttgggt gtaggatacc tttcaaatag ccttctactc 360 catctatgaa ataggctagc tttggctcag taaatttgct gtgtaatgat tttctaatga 420 gttaggctgg ctttaagccc ctggttattt cgttgtaacc agttaggctt tgcctcttga 480 agggccacct gggactgtcg tgcagtagat tttcttttaa cgccccagaa tcaggtgctt 540 tctctgactt 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atggtgccgt agccgtagac gaactggaag 1140 acggccgaga tggcgccggt caggcggtgc gcgggcagcc cgctgcggcg cacgacgttc 1200 tgcaccgcgc gggagaaggc cagcgagtgc gggccgatgt tgaggtaggt gccgaccagc 1260 cgggacgacc aggggtggcg caccagcagc gcccggttct cccgggccag ggcccgcagt 1320 tcctcgcgcc agtcgagccc ggcgtccggg tccgggtggc gcagctcgcc gaagacggcg 1380 tccagggcga gctcgagcaa ctggtccttg gtgtcgacgt accagtacac ggacatcgcg 1440 gtgacgttca gctcggcggc caggcggcgc atcgagaacc ccgtcaggcc ctccgtgtcc 1500 agcagccgga cggtgacccc ggtgatccgg tcccggtcga gcccggacgg ctgcccccca 1560 cggcgaccgc cgcgccgccc ctcccccgac agccacacgc tgtcccgcgg cccctcccgc 1620 cctgccttcg ccatgcgcac ctctcctcga ctcataccgg tagcgctagc gatgagctct 1680 ggtagtagac tagtggcccc cattatatac cctctagagc atatgtctca caaagagggc 1740 tttgtgtagt ctcacaaaga gggctttgtg tagtctcaca aagagggctt tgtgtagggc 1800 gcgcccccgt agcttggcgt aatcacatgt ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 1860 accctggcct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 1920 taaaacgacg gacatgtgaa atagcgctgt 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gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc 2820 ggcatggacg agctgtacaa gtagggtacc caaacaccat tgtcacactc caagatctac 2880 gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 2940 gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 3000 ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 3060 acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 3120 ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 3180 ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 3240 ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 3300 tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtcctt 3357 <210> 303 <211> 3778 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 303 cagtattgtg tatataaggc cagggcaaag aggagcaggt tttaaagtga aaggcaggca 60 ggtgttgggg aggcagttac cggggcaacg ggaacagggc gtttcggagg tggttgccat 120 ggggacctgg atgctgacga aggctcgatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 180 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 240 ttccccgaaa agtgccacct gacgtcggca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 300 tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 360 ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta 420 aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgatcctcct aggcttcgaa tcgatgaatt 480 cgaagcttct acccaccgta ctcgtcaatt ccaagggcat cggtaaacat ctgctcaaac 540 tcgaagtcgg ccatatccag agcgccgtag ggggcggagt cgtggggggt aaatcccgga 600 cccggggaat ccccgtcccc caacatgtcc agatcgaaat cgtctagcgc gtcggcatgc 660 gccatcgcca cgtcctcgcc gtctaagtgg agctcgtccc ccaggctgac atcggtcggg 720 ggggccgtcg acagtctgcg cgtgtgtccc gcggggagaa aggacaggcg cggagccgcc 780 agccccgcct cttcgggggc gtcgtcgtcc gggagatcga gcaggccctc gatggtagac 840 ccgtaattgt ttttcgtacg cgcgcggctg tacgcggagg cctgttcgac catcgcgtcg 900 atgcccgcga cgagcaggtc gagggcgaac tcgaagtccc ggtccagcat ctccgccacg 960 gtgtcgccgc cccgggccgc catgatgtcc tgcgcgtcct cgatgacgcc cgcggtgtcc 1020 ggcacctcgg tcaccgcggt catcgagtcc tggaagtact cctccggact cagcccggtg 1080 tccgccaccc gggcgaggaa gcggccctcg atggtgccgt agccgtagac gaactggaag 1140 acggccgaga tggcgccggt caggcggtgc gcgggcagcc cgctgcggcg cacgacgttc 1200 tgcaccgcgc gggagaaggc cagcgagtgc gggccgatgt tgaggtaggt gccgaccagc 1260 cgggacgacc aggggtggcg caccagcagc gcccggttct cccgggccag ggcccgcagt 1320 tcctcgcgcc agtcgagccc ggcgtccggg tccgggtggc gcagctcgcc gaagacggcg 1380 tccagggcga gctcgagcaa ctggtccttg gtgtcgacgt accagtacac ggacatcgcg 1440 gtgacgttca gctcggcggc caggcggcgc atcgagaacc ccgtcaggcc ctccgtgtcc 1500 agcagccgga cggtgacccc ggtgatccgg tcccggtcga gcccggacgg ctgcccccca 1560 cggcgaccgc cgcgccgccc ctcccccgac agccacacgc tgtcccgcgg cccctcccgc 1620 cctgccttcg ccatgcgcac ctctcctcga ctcataccgg tagcgctagc gatgagctct 1680 ggtagtagac tagtggcccc cattatatac cctctagagc atatgtctca caaagagggc 1740 tttgtgtagt ctcacaaaga gggctttgtg tagtctcaca aagagggctt tgtgtagggc 1800 gcgcccccgt agcttggcgt aatcacatgt ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 1860 accctggcct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 1920 taaaacgacg gacatgtgaa atagcgctgt acagcgtatg ggaatctctt gtacggtgta 1980 cgagtatctt cccgtacacc gtacggcgcg ccagttaata attaactagt taataattaa 2040 ctagttaata attaactcat atgctctaga gggtatataa tgggggccac tagtctacta 2100 ccagagctca tcgctagcgc tggatcccgc caccatggct tcgtacccct gccatcaaca 2160 cgcgtctgcg ttcgaccagg ctgcgcgttc tcgcggccat agcaaccgac gtacggcgtt 2220 gcgccctcgc cggcagcaag aagccacgga agtccgcctg gagcagaaaa tgcccacgct 2280 actgcgggtt tatatagacg gtcctcacgg gatggggaaa accaccacca cgcaactgct 2340 ggtggccctg ggttcgcgcg acgatatcgt ctacgtaccc gagccgatga cttactggca 2400 ggtgctgggg gcttccgaga caatcgcgaa catctacacc acacaacacc gcctcgacca 2460 gggtgagata tcggccgggg acgcggcggt ggtaatgaca agcgcccaga taacaatggg 2520 catgccttat gccgtgaccg acgccgttct ggctcctcat atcggggggg aggctgggag 2580 ctcacatgcc ccgcccccgg ccctcaccct catcttcgac cgccatccca tcgccgccct 2640 cctgtgctac ccggccgcgc gataccttat gggcagcatg accccccagg ccgtgctggc 2700 gttcgtggcc ctcatcccgc cgaccttgcc cggcacaaac atcgtgttgg gggcccttcc 2760 ggaggacaga cacatcgacc gcctggccaa acgccagcgc cccggcgagc ggcttgacct 2820 ggctatgctg gccgcgattc gccgcgttta cgggctgctt gccaatacgg tgcggtatct 2880 gcagggcggc gggtcgtggc gggaggattg gggacagctt tcggggacgg ccgtgccgcc 2940 ccagggtgcc gagccccaga gcaacgcggg cccacgaccc catatcgggg acacgttatt 3000 taccctgttt cgggcccccg agttgctggc ccccaacggc gacctgtaca acgtgtttgc 3060 ctgggccttg gacgtcttgg ccaaacgcct ccgtcccatg cacgtcttta tcctggatta 3120 cgaccaatcg cccgccggct gccgggacgc cctgctgcaa cttacctccg ggatggtcca 3180 gacccacgtc accacccccg gctccatacc gacgatctgc gacctggcgc gcacgtttgc 3240 ccgggagatg ggggaggcta actgaggtac ccaaacacca ttgtcacact ccaagatcta 3300 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc 3360 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc 3420 cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac 3480 aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg 3540 gctcactgca atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt 3600 gttgggattc caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg 3660 gggtttcacc atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga tctacccacc 3720 ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc ctgtcctt 3778 <210> 304 <211> 3926 <212> DNA <213> 305 <400> 304 cagtattgtg tatataaggc cagggcaaag aggagcaggt tttaaagtga aaggcaggca 60 ggtgttgggg aggcagttac cggggcaacg ggaacagggc gtttcggagg tggttgccat 120 ggggacctgg atgctgacga aggctcgatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 180 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 240 ttccccgaaa agtgccacct gacgtcggca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 300 tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 360 ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta 420 aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgatcctcct aggtgaggta gtaggttgta 480 tggtttgagg tagtaggttg tatggtttga ggtagtaggt tgtatggttt gaggtagtag 540 gttgtatggt tatcgatgaa ttcgaagctt ctacccaccg tactcgtcaa ttccaagggc 600 atcggtaaac atctgctcaa actcgaagtc ggccatatcc agagcgccgt agggggcgga 660 gtcgtggggg gtaaatcccg gacccgggga atccccgtcc cccaacatgt ccagatcgaa 720 atcgtctagc gcgtcggcat gcgccatcgc cacgtcctcg ccgtctaagt ggagctcgtc 780 ccccaggctg acatcggtcg ggggggccgt cgacagtctg cgcgtgtgtc ccgcggggag 840 aaaggacagg cgcggagccg ccagccccgc ctcttcgggg gcgtcgtcgt ccgggagatc 900 gagcaggccc tcgatggtag acccgtaatt gtttttcgta cgcgcgcggc tgtacgcgga 960 ggcctgttcg accatcgcgt cgatgcccgc gacgagcagg tcgagggcga actcgaagtc 1020 ccggtccagc atctccgcca cggtgtcgcc gccccgggcc gccatgatgt cctgcgcgtc 1080 ctcgatgacg cccgcggtgt ccggcacctc ggtcaccgcg gtcatcgagt cctggaagta 1140 ctcctccgga ctcagcccgg tgtccgccac ccgggcgagg aagcggccct cgatggtgcc 1200 gtagccgtag acgaactgga agacggccga gatggcgccg gtcaggcggt gcgcgggcag 1260 cccgctgcgg cgcacgacgt tctgcaccgc gcgggagaag gccagcgagt gcgggccgat 1320 gttgaggtag gtgccgacca gccgggacga ccaggggtgg cgcaccagca gcgcccggtt 1380 ctcccgggcc agggcccgca gttcctcgcg ccagtcgagc ccggcgtccg ggtccgggtg 1440 gcgcagctcg ccgaagacgg cgtccagggc gagctcgagc aactggtcct tggtgtcgac 1500 gtaccagtac acggacatcg cggtgacgtt cagctcggcg gccaggcggc gcatcgagaa 1560 ccccgtcagg ccctccgtgt ccagcagccg gacggtgacc ccggtgatcc ggtcccggtc 1620 gagcccggac ggctgccccc cacggcgacc gccgcgccgc ccctcccccg acagccacac 1680 gctgtcccgc ggcccctccc gccctgcctt cgccatgcgc acctctcctc gactcatacc 1740 ggtagcgcta gcgatgagct ctggtagtag actagtggcc cccattatat accctctaga 1800 gcatatgtct cacaaagagg gctttgtgta gtctcacaaa gagggctttg tgtagtctca 1860 caaagagggc tttgtgtagg gcgcgccccc gtagcttggc gtaatcacat gtccgtcgtt 1920 ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 1980 ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggacatgtg aaatagcgct gtacagcgta 2040 tgggaatctc ttgtacggtg tacgagtatc ttcccgtaca ccgtacggcg cgccagttaa 2100 taattaacta gttaataatt aactagttaa taattaactc atatgctcta gagggtatat 2160 aatgggggcc actagtctac taccagagct catcgctagc gctggatccc gccaccatgg 2220 cttcgtaccc ctgccatcaa cacgcgtctg cgttcgacca ggctgcgcgt tctcgcggcc 2280 atagcaaccg acgtacggcg ttgcgccctc gccggcagca agaagccacg gaagtccgcc 2340 tggagcagaa aatgcccacg ctactgcggg tttatataga cggtcctcac gggatgggga 2400 aaaccaccac cacgcaactg ctggtggccc tgggttcgcg cgacgatatc gtctacgtac 2460 ccgagccgat gacttactgg caggtgctgg gggcttccga gacaatcgcg aacatctaca 2520 ccacacaaca ccgcctcgac cagggtgaga tatcggccgg ggacgcggcg gtggtaatga 2580 caagcgccca gataacaatg ggcatgcctt atgccgtgac cgacgccgtt ctggctcctc 2640 atatcggggg ggaggctggg agctcacatg ccccgccccc ggccctcacc ctcatcttcg 2700 accgccatcc catcgccgcc ctcctgtgct acccggccgc gcgatacctt atgggcagca 2760 tgacccccca ggccgtgctg gcgttcgtgg ccctcatccc gccgaccttg cccggcacaa 2820 acatcgtgtt gggggccctt ccggaggaca gacacatcga ccgcctggcc aaacgccagc 2880 gccccggcga gcggcttgac ctggctatgc tggccgcgat tcgccgcgtt tacgggctgc 2940 ttgccaatac ggtgcggtat ctgcagggcg gcgggtcgtg gcgggaggat tggggacagc 3000 tttcggggac ggccgtgccg ccccagggtg ccgagcccca gagcaacgcg ggcccacgac 3060 cccatatcgg ggacacgtta tttaccctgt ttcgggcccc cgagttgctg gcccccaacg 3120 gcgacctgta caacgtgttt gcctgggcct tggacgtctt ggccaaacgc ctccgtccca 3180 tgcacgtctt tatcctggat tacgaccaat cgcccgccgg ctgccgggac gccctgctgc 3240 aacttacctc cgggatggtc cagacccacg tcaccacccc cggctccata ccgacgatct 3300 gcgacctggc gcgcacgttt gcccgggaga tgggggaggc taactgaggt accaaccata 3360 caacctacta cctcaaacca tacaacctac tacctcaaac catacaacct actacctcaa 3420 accatacaac ctactacctc aagatctacg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc 3480 ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa 3540 gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg 3600 tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac 3660 caagctggag tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag 3720 cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca 3780 gctaattttt gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca 3840 actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt 3900 gaaccactgc tcccttccct gtcctt 3926 <210> 305 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 305 guuuacaauu gacuaacacu cca 23 <210> 306 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 306 uggaguguga caaugguguu ugu 23

Claims (117)

  1. 하기를 포함하는 인접 폴리핵산 분자로서:
    a) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 제1 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; 및 (ii) 표 1에 열거된 miRNA에 대한 표적 부위 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 제1 카세트; 및
    b) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트;
    여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키는 것인
    인접 폴리핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 제1 RNA가 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 RNA가 3' UTR을 포함하며, 여기서 3' UTR이 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 RNA가 5' UTR을 포함하며, 여기서 5' UTR이 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 RNA가 표 1에 열거된 마이크로RNA에 대한 표적 부위 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 RNA가 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 제2 RNA가 3' UTR을 포함하며, 여기서 3' UTR이 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 제2 RNA가 5' UTR을 포함하며, 여기서 5' UTR이 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트의 적어도 하나의 miRNA 표적 부위 및 제2 카세트의 적어도 하나의 miRNA 표적 부위가 동일한 핵산 서열이거나 또는 동일한 miRNA에 의해 조절되는 상이한 서열인 인접 폴리핵산 분자.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 RNA 및 제2 RNA가 각각 let-7c 표적 부위를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전사활성인자 반응 요소가 표 3에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 RNA의 발현이 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 것인 인접 폴리핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 전사 인자 반응 요소가 표 4에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전사활성인자가 독립적으로 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 RNA의 발현이 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 것인 인접 폴리핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 전사 인자 반응 요소가 표 4에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  17. 제12항, 제13항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 전사활성인자가 전사 인자 반응 요소에 결합된 전사 인자의 존재 하에서만 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트가 프로모터 요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  19. 제18항에 있어서, 프로모터 요소가 표 5에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  20. 제18항에 있어서, 프로모터 요소가 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  21. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 카세트가 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력을 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하고;
    제2 카세트가 5'에서 3'으로: (i) 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하는 것인
    인접 폴리핵산 분자.
  22. 제21항에 있어서, 제1 카세트의 전사 인자 반응 요소 및 제2 카세트의 전사 인자 반응 요소가 동일한 핵산 서열로 이루어진 것인 인접 폴리핵산 분자.
  23. 제21항에 있어서, 제1 카세트의 전사 인자 반응 요소 및 제2 카세트의 전사 인자 반응 요소가 상이한 핵산 서열로 이루어진 것인 인접 폴리핵산 분자.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트가 2개 이상의 전사 인자 반응 요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  25. 제24항에 있어서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트가 2개의 상이한 전사 인자 반응 요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트의 상류 조절 구성요소가 프로모터 요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  27. 제26항에 있어서, 프로모터 요소가 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 카세트의 상류 조절 구성요소가 프로모터 요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  29. 제28항에 있어서, 프로모터 요소가 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트 및 제2 카세트가 수렴형 배향으로 존재하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트 및 제2 카세트가 발산형 배향으로 존재하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트 및 제2 카세트가 머리-대-꼬리 배향으로 존재하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 카세트 및/또는 제2 카세트가 인슐레이터에 의해 플랭킹되는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 카세트의 전사활성인자가 tTA, rtTA, PIT-RelA, PIT-VP16, ET-VP16, ET-RelA, NarLc-VP16, 또는 NarLc-RelA인 인접 폴리핵산 분자.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 카세트의 전사활성인자가 표 2에 열거된 핵산 서열을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 출력이 단백질 또는 RNA 분자인 인접 폴리핵산 분자.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 출력이 치료제인 인접 폴리핵산 분자.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 출력이 형광 단백질, 세포독소, 전구약물 활성화를 촉매하는 효소, 면역조정 단백질 및/또는 RNA, DNA-변형 인자, 세포-표면 수용체, 유전자 발현-조절 인자, 키나제, 후성적 변형인자, 및/또는 벡터 복제에 필요한 인자, 및/또는 병원체의 항원 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 인접 폴리핵산 분자.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 출력이 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스 1로부터의 티미딘 키나제 효소 (HSV-TK)인 인접 폴리핵산 분자.
  40. 제38항에 있어서, 면역조정 단백질 및/또는 RNA가 시토카인 또는 콜로니 자극 인자인 인접 폴리핵산 분자.
  41. 제38항에 있어서, DNA-변형 인자가 유전자 결함을 보정하도록 되어 있는 단백질을 코딩하는 유전자, DNA-변형 효소, 및/또는 DNA-변형 시스템의 구성요소인 인접 폴리핵산 분자.
  42. 제41항에 있어서, DNA-변형 효소가 부위-특이적 레콤비나제, 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 CRISPR/Cas DNA 변형 시스템의 단백질 구성요소인 인접 폴리핵산 분자.
  43. 제38항에 있어서, 유전자 발현-조절 인자가 유전자 발현을 조절할 수 있는 단백질, 또는 유전자 발현을 조절할 수 있는 다중-구성요소 시스템의 구성요소인 인접 폴리핵산 분자.
  44. 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함하는 인접 폴리핵산 분자.
  45. 인접 폴리핵산 분자로서, 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 RNA를 코딩하는 카세트를 포함하며, 여기서 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; (ii) 전사활성인자의 핵산 서열; 및 (iii) 표 1에 열거된 miRNA에 대한 표적 부위 또는 이들의 조합을 포함하며; 여기서 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  46. 제45항에 있어서, 제1 RNA가 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, RNA가 출력 및 전사활성인자의 핵산 서열들을 분리하는 폴리시스트론성 발현 요소의 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 3' UTR을 포함하며, 여기서 3' UTR이 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 5' UTR을 포함하며, 여기서 5' UTR이 let-7c 표적 부위, let-7a 표적 부위, let-7b 표적 부위, let-7d 표적 부위, let-7e 표적 부위, let-7f 표적 부위, let-7g 표적 부위, let-7i 표적 부위, miR-22 표적 부위, miR-26b 표적 부위, miR-122 표적 부위, miR-208a 표적 부위, miR-208b 표적 부위, miR-1 표적 부위, miR-217 표적 부위, miR-216a 표적 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 let-7c 표적 부위를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 전사활성인자 반응 요소가 표 3에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  52. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 전사활성인자가 독립적으로 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, RNA의 발현이 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 것인 인접 폴리핵산 분자.
  54. 제53항에 있어서, 전사 인자 반응 요소가 표 4에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  55. 제53항에 있어서, 전사활성인자가 전사 인자 반응 요소에 결합된 전사 인자의 존재 하에서만 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 카세트가 프로모터 요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  57. 제56항에 있어서, 프로모터 요소가 표 5에 열거된 핵산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  58. 제56항에 있어서, 프로모터 요소가 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  59. 제53항 또는 제55항에 있어서, 인접 폴리핵산 분자가 5'에서 3'으로: (i) 전사활성인자 반응 요소 및 전사 인자 반응 요소를 포함하는 상류 조절 구성요소; (ii) 출력 및 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열; 및 (iii) let-7c 표적 부위를 포함하는 하류 구성요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  60. 제59항에 있어서, (i)에서의 상류 조절 구성요소가 프로모터 요소를 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  61. 제60항에 있어서, 프로모터 요소가 포유동물 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  62. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 카세트의 전사활성인자가 tTA, rtTA, PIT-RelA, PIT-VP16, ET-VP16, ET-RelA, NarLc-VP16, 또는 NarLc-RelA인 인접 폴리핵산 분자.
  63. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 카세트의 전사활성인자가 표 2에 열거된 핵산 서열을 포함하는 것인 인접 폴리핵산 분자.
  64. 제45항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 출력이 단백질 또는 RNA 분자인 인접 폴리핵산 분자.
  65. 제45항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 출력이 치료 단백질 또는 RNA 분자인 인접 폴리핵산 분자.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 출력이 형광 단백질, 세포독소, 전구약물 활성화를 촉매하는 효소, 면역조정 단백질 및/또는 RNA, DNA-변형 인자, 세포-표면 수용체, 유전자 발현-조절 인자, 키나제, 후성적 변형인자, 및/또는 벡터 복제에 필요한 인자, 및/또는 병원체의 항원 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 인접 폴리핵산 분자.
  67. 제64항 또는 제65항에 있어서, 출력이 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스 1로부터의 티미딘 키나제 효소 (HSV-TK)인 인접 폴리핵산 분자.
  68. 제66항에 있어서, 면역조정 단백질 및/또는 RNA가 시토카인 또는 콜로니 자극 인자인 인접 폴리핵산 분자.
  69. 제66항에 있어서, DNA-변형 인자가 유전자 결함을 보정하도록 되어 있는 단백질을 코딩하는 유전자, DNA-변형 효소, 및/또는 DNA-변형 시스템의 구성요소인 인접 폴리핵산 분자.
  70. 제69항에 있어서, DNA-변형 효소가 부위-특이적 레콤비나제, 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 CRISPR/Cas 시스템의 단백질 구성요소인 인접 폴리핵산 분자.
  71. 제66항에 있어서, 유전자 발현-조절 인자가 유전자 발현을 조절할 수 있는 단백질, 또는 유전자 발현을 조절할 수 있는 다중-구성요소 시스템의 구성요소인 인접 폴리핵산 분자.
  72. 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 벡터.
  73. 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조작된 바이러스 게놈.
  74. 제73항에 있어서, 바이러스 게놈이 아데노-연관 바이러스 (AAV) 게놈, 렌티바이러스 게놈, 아데노바이러스 게놈, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 게놈, 백시니아 바이러스 게놈, 폭스바이러스 게놈, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 게놈, 콕사키바이러스 게놈, 레오바이러스 게놈, 홍역 바이러스 게놈, 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 게놈, 파르보바이러스 게놈, 세네카 밸리 바이러스 게놈, 마라바 바이러스 게놈, 또는 감기 바이러스 게놈인 조작된 바이러스 게놈.
  75. 제73항 또는 제74항의 조작된 바이러스 게놈을 포함하는 비리온.
  76. 제75항에 있어서, AAV-DJ, AAV8, AAV6, 또는 AAV-B1 캡시드를 추가로 포함하는 비리온.
  77. 세포의 집단을 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자, 제72항의 벡터, 제73항 또는 제74항의 조작된 바이러스 게놈, 또는 제75항 또는 제76항의 비리온과 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법으로서, 여기서 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 하나 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성은 표적 세포의 각각에 비해 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고; 여기서 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절되는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트가 내인성 전사 인자의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자가 내인성 전사 인자에 상응하는 전사 인자 반응 요소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트가 프로모터 단편의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자가 이 프로모터 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
  80. 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자, 제72항의 벡터, 제73항 또는 제74항의 조작된 바이러스 게놈, 또는 제75항 또는 제76항의 비리온을 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 병태를 진단하는 방법으로서, 여기서 출력의 수준은 질환 및 또는 병태의 존재 또는 부재를 지시하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 질환이 암인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 암이 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종인 방법.
  83. 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자, 제72항의 벡터, 제73항 또는 제74항의 조작된 바이러스 게놈, 또는 제75항 또는 제76항의 비리온을 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 전구약물을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 전구약물이 간시클로비르이고, 임의적으로 여기서 인접 폴리핵산 분자가 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  85. 제83항에 있어서, 질환이 암인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 암이 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종인 방법.
  87. 세포의 집단을 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자, 제72항의 벡터, 제73항 또는 제74항의 조작된 바이러스 게놈, 또는 제75항 또는 제76항의 비리온과 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 여기서 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 하나 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준 및/또는 활성은 표적 세포의 각각에 비해 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고; 여기서 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절되는 것인 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트가 내인성 전사 인자의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자가 내인성 전사 인자에 상응하는 전사 인자 반응 요소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  89. 제87항에 있어서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트가 프로모터 단편의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자가 이 프로모터 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
  90. 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자, 제72항의 벡터, 제73항 또는 제74항의 조작된 바이러스 게놈, 또는 제75항 또는 제76항의 비리온을 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 병태를 진단하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 여기서 출력의 수준은 질환 및 또는 병태의 존재 또는 부재를 지시하는 것인 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 질환이 암인 사용하기 위한 조성물.
  92. 제91항에 있어서, 암이 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종인 사용하기 위한 조성물.
  93. 제1항 내지 제44항 및 제45항 내지 제71항 중 어느 한 항의 인접 폴리핵산 분자, 제72항의 벡터, 제73항 또는 제74항의 조작된 바이러스 게놈, 또는 제75항 또는 제76항의 비리온을 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 전구약물을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 임의적으로 여기서 전구약물이 간시클로비르이고, 임의적으로 여기서 인접 폴리핵산 분자가 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  95. 제93항에 있어서, 질환이 암인 사용하기 위한 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 암이 간세포 암종 (HCC), 전이성 결장직장암, 간에서의 전이성 종양, 유방암, 폐암, 망막모세포종, 및 교모세포종인 사용하기 위한 조성물.
  97. 세포의 집단을 인접 폴리핵산 분자 또는 상기 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법으로서, 여기서:
    a) 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 2개 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준은 표적 세포의 각각에 비해 비-표적 세포의 적어도 하위세트, 예컨대 적어도 2개 및 임의적으로 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고;
    b) 인접 폴리핵산 분자는 하기를 포함하고:
    (i) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 출력의 핵산 서열; 및 하나 이상의 내인성 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 부위를 포함하는 것인 제1 카세트; 및
    (ii) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트;
    여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키고;
    여기서 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절되는 것인
    방법.
  98. 제97항에 있어서, 인접 폴리핵산 분자가 표 6에 열거된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  99. 세포의 집단을 인접 폴리핵산 분자 또는 상기 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 집단에서 세포-특이적 이벤트를 자극하는 방법으로서, 여기서:
    a) 세포의 집단은 적어도 하나의 표적 세포 유형 및 2개 이상의 비-표적 세포 유형을 포함하며, 여기서 표적 세포 유형(들) 및 비-표적 세포 유형은 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준에 있어서 상이하며, 그에 따라 하나 이상의 내인성 miRNA의 수준은 표적 세포의 각각에 비해 비-표적 세포의 적어도 하위세트, 예컨대 적어도 2개 및 임의적으로 2개 이상의 비-표적 세포의 각각에서 적어도 2배 더 높고;
    b) 인접 폴리핵산 분자는 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 mRNA를 코딩하는 카세트를 포함하며, 여기서 RNA는 출력의 핵산 서열; 전사활성인자의 핵산 서열; 및 하나 이상의 내인성 miRNA에 상응하는 하나 이상의 miRNA 표적 부위를 포함하고;
    여기서 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키고;
    여기서 세포-특이적 이벤트는 세포의 집단의 세포에서의 출력의 발현 수준에 의해 조절되는 것인
    방법.
  100. 제97항 또는 제99항에 있어서, 인접 폴리핵산 분자를 포함하는 조성물이 인접 폴리핵산을 포함하는 벡터, 인접 폴리핵산을 포함하는 조작된 바이러스 게놈, 또는 폴리핵산을 포함하는 비리온을 포함하는 것인 방법.
  101. 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 miRNA가 표 1에 열거된 miRNA 또는 표 1에 열거된 miRNA의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  102. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 miRNA가 let-7c, let-7a, let-7b, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7i, miR-22, miR-26b, miR-122, miR-208a, miR-208b, miR-1, miR-217, miR-216a, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  103. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트가 내인성 전사 인자의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자가 내인성 전사 인자에 상응하는 전사 인자 반응 요소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  104. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포의 적어도 하위세트 및 비-표적 세포의 적어도 하위세트가 프로모터 단편의 수준 또는 활성에 있어서 상이하며, 여기서 인접 핵산 분자가 이 프로모터 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
  105. 제97항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 종양 세포이고, 세포-특이적 이벤트가 종양 세포 사멸인 방법.
  106. 제105항에 있어서, 종양 세포 사멸이 활성화 수용체 리간드, 특이적 항원, 자극 시토카인 또는 이들의 임의의 조합의 발현을 통한 면역 표적화에 의해 매개되는 것인 방법.
  107. 제97항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 노화 세포이고, 세포-특이적 이벤트가 노화 세포 사멸인 방법.
  108. 제97항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단을 출력에 의해 치료제 또는 독성 화합물로 대사되는 전구약물 또는 비-독성 전구체 화합물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  109. 제97항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 출력 발현이, 비-표적 세포가 출력 발현의 결여로 인하여 그리고 무관하며 비특이적인 세포 사멸-유도 작용제의 존재 하에서 제거되는 동안, 표적 세포 집단의 생존을 보장하는 것인 방법.
  110. 제97항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 관심의 특정한 표현형을 포함하며, 그에 따라 출력 발현이 이 특정한 표현형의 세포에 제한되는 것인 방법.
  111. 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 선택되는 세포 유형이고, 세포-특이적 이벤트가 자연적으로는 선택되는 세포 유형에서는 부재하거나 불활성인 유전자의 발현을 통한 신규 기능의 코딩인 방법.
  112. 제97항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 다세포 유기체를 포함하는 것인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 다세포 유기체가 동물인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 동물이 인간인 방법.
  115. 제97항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 생체외에서 접촉되는 것인 방법.
  116. 제97항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 생체내에서 접촉되는 것인 방법.
  117. 하기를 포함하는 인접 폴리핵산 분자로서:
    a) 그의 발현이 전사활성인자 반응 요소에 작동가능하게 연결된 제1 RNA를 코딩하며, 여기서 제1 RNA는 (i) 출력의 핵산 서열; 및 (ii) miRNA에 대한 표적 부위를 포함하며, 여기서 상기 miRNA는 포유동물의 적어도 2개의 상이한 건강한 조직에서 고도로 발현되고/거나 활성이고, 표적 세포의 하나 이상의 유형에서 낮은 수준으로 발현되는 것인 제1 카세트;
    b) 제2 RNA를 코딩하며, 여기서 제2 RNA는 전사활성인자의 핵산 서열을 포함하는 것인 제2 카세트,
    여기서 제2 카세트의 전사활성인자는, 단백질로서 발현되는 경우, 제1 카세트의 전사활성인자 반응 요소에 결합하여 그를 전사활성화시키는 것인
    인접 폴리핵산 분자.
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