CN112823209A - 使用编码高度紧凑的多输入逻辑门的核酸载体治疗疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于精确体内细胞靶向的编码高度紧凑的多输入遗传逻辑门的连续DNA序列，和使用体内递送和这种连续DNA序列的组合治疗疾病的方法。
Description
技术领域
本文公开了用于精确体内细胞靶向的编码高度紧凑的多输入遗传逻辑门的连续DNA序列，和使用体内递送和这种连续DNA序列的组合治疗疾病的方法。
背景技术
基因疗法作为遗传疾病和癌症的下一代疗法选择正在崛起。然而，目前基因疗法载体受到低疗效、高毒性和产生治疗先导物(lead)的开发时间长的困扰。这些缺点的原因之一是不够严格的控制基因疗法载体中治疗基因表达，其导致基因表达(i)在非预期的细胞类型和组织中或(ii)以不足或过高的剂量。换句话说，基因表达的精确控制，无论是在基因产物剂量(即每个细胞的蛋白质分子数量)还是细胞类型限制性表达的方面，仍然是基因疗法中的公开挑战。
发明内容
工程化含有多特征细胞探测所需的多个组件并且产生适当的治疗作用的连续DNA分子是非常具有挑战性的任务，即使初始构成要素是部分已知的。本公开描述了工程化连续DNA分子的方法，该DNA分子编码能够同时探测多个转录因子和/或启动子活性以及任选地microRNA特征的复杂多输入遗传逻辑电路。正因如此，连续分子适合于在各种病毒载体中实施，各种病毒载体包括封装能力低但治疗价值高的载体(如AAV、慢病毒、腺病毒)、非复制和复制病毒以及非病毒递送载体。所得病毒和非病毒递送载体可用于在体内和体外选择性地靶向特定的细胞类型或细胞状态，并且用作疗法。
在一些方面中，本公开涉及编码至少两个盒的连续多核酸分子，其中每个盒包括调节组件和响应组件。
在一些实施方式中：(i)至少一个盒包括：包含反式激活因子响应元件的5’调节组件和包含输出的3’响应组件；和(ii)至少一个盒包括：包含编码反式激活因子蛋白质的核酸序列的5’调节组件和3’响应组件；并且其中(ii)的反式激活因子，当作为蛋白质表达时，结合和反式激活(i)的反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，反式激活因子独立地结合和反式激活反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，(i)中盒的5’调节组件进一步包括转录因子响应元件和/或最小启动子。在其他实施方式中，仅在结合至转录因子响应元件的转录因子存在的情况下，反式激活因子结合并反式激活反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，5’调节组件包括5’至3’：反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，5’调节组件包括5’至3’：转录因子响应元件、反式激活因子响应元件和最小启动子。
在一些实施方式中，(i)中的5’调节组件进一步包括启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包括哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中，5’调节组件包括5’至3’：反式激活因子响应组件和启动子元件和任选地最小启动子。
在一些实施方式中，(ii)中盒的5’调节组件包括启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包括转录因子响应元件和最小启动子，任选地其中转录因子响应元件是独特的。在一些实施方式中，启动子元件包括哺乳动物启动子或启动子片段和任选地最小启动子。
在一些实施方式中，(i)的至少一个盒和(ii)的至少一个盒以趋同方向(convergent orientation)。在一些实施方式中，(i)的至少一个盒和(ii)的至少一个盒以趋异方向。在一些实施方式中，(i)的至少一个盒和(ii)的至少一个盒以头-至-尾方向。
在一些实施方式中，(i)中盒的3’响应组件进一步包括至少一个microRNA靶位点。在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是3’至输出。在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是5’至输出或在输出内。
在一些实施方式中，(ii)中的盒进一步包括至少一个microRNA靶位点。在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是3’至反式激活因子蛋白质-编码DNA序列。在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是5’至反式激活因子蛋白质-编码DNA序列或在反式激活因子蛋白质-编码DNA序列内。
在一些实施方式中，(i)中盒的至少一个microRNA靶位点和(ii)中盒的至少一个microRNA靶位点是相同核酸序列或是由相同microRNA调节的不同序列。
在一些实施方式中，至少一个盒位于绝缘子的侧面。
在一些实施方式中，至少一个盒的反式激活因子是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
在一些实施方式中，输出是蛋白质或RNA分子。在一些实施方式中，输出是治疗性的。在一些实施方式中，输出是荧光蛋白质、细胞毒素、催化前药激活的酶、免疫调节蛋白质和/或RNA、DNA-修饰因子、细胞-表面受体、基因表达-调节因子、激酶、表观遗传修饰剂和/或载体复制必需的因子。在一些实施方式中，免疫调节蛋白质和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。在一些实施方式中，DNA-修饰因子是编码旨在校正遗传缺陷的蛋白质、DNA-修饰酶和/或DNA-修饰系统的组件的基因。在一些实施方式中，DNA-修饰酶是CRISPR/Cas DNA修饰系统的位点特异性重组酶、回归内切核酸酶或蛋白质组件。在一些实施方式中，基因表达-调节因子是能够调节基因表达的蛋白质或能够调节基因表达的多组件系统的组件。
在一些方面中，本公开涉及编码至少一个盒的连续多核酸分子，其中盒包括：(i)包含反式激活因子响应元件的5’调节组件；和(ii)包含输出、反式激活因子和任选的多顺反子表达元件的3’响应组件，其中输出和反式激活因子任选地通过多顺反子表达元件分开；其中响应组件的转录生成单个mRNA；和其中(ii)的反式激活因子，当作为蛋白质表达时，结合并反式激活(i)的反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，反式激活因子独立地结合并反式激活反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，(i)中的5’调节组件进一步包括转录因子响应元件和/或最小启动子。在一些实施方式中，仅在结合至转录因子响应元件的转录因子存在的情况下，反式激活因子结合并反式激活反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，5’调节组件包括5’至3’：反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，5’调节组件包括5’至3’：转录因子响应元件、反式激活因子响应元件和最小启动子。
在一些实施方式中，(i)中的5’调节组件进一步包括启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包括哺乳动物启动子或启动子片段。在一些实施方式中，(i)中的5’调节组件包括5’至3’：反式激活因子响应组件和启动子元件。
在一些实施方式中，(ii)的3’响应组件进一步包括至少一个microRNA靶位点。在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是3’至输出和/或反式激活因子。在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是5’至输出和/或反式激活因子或输出和/或反式激活因子内。
在一些实施方式中，至少一个盒位于绝缘子的侧面。
在一些实施方式中，至少一个盒的反式激活因子是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
在一些实施方式中，输出是蛋白质或RNA分子。在一些实施方式中，输出是治疗性蛋白质或RNA分子。在一些实施方式中，输出是荧光蛋白质、细胞毒素、催化前药激活的酶、免疫调节蛋白质和/或RNA、DNA-修饰因子、细胞-表面受体、基因表达-调节因子、激酶、表观遗传修饰剂和/或载体复制必需的因子。在一些实施方式中，免疫调节蛋白质和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。在一些实施方式中，DNA-修饰因子是编码旨在校正遗传缺陷的蛋白质、DNA-修饰酶和/或DNA-修饰系统的组件的的基因。在一些实施方式中，DNA-修饰酶是CRISPR/Cas DNA修饰系统的位点特异性重组酶、回归内切核酸酶或蛋白质组件。在一些实施方式中，基因表达-调节因子是能够调节基因表达的蛋白质或能够调节基因表达的多组件系统的组件。
在一些方面中，本公开涉及包括如以上所述的连续多核酸分子的载体。
在一些方面中，本公开涉及包括如以上所述的连续多核酸分子的工程化的病毒基因组。在一些实施方式中，病毒基因组是腺伴随病毒(AAV)基因组、慢病毒基因组、腺病毒基因组、单纯性疱疹病毒(HSV)基因组、牛痘病毒基因组、痘病毒基因组、新城疫病毒(NDV)基因组、柯萨奇病毒基因组、流变病毒基因组、麻疹病毒基因组、水泡性口炎病毒(VSV)基因组、细小病毒基因组、塞内加谷病毒基因组、马拉巴病毒基因组或感冒病毒基因组。
在一些方面中，本公开涉及包括如以上所述的工程化的病毒基因组的病毒粒子。
在一些方面中，本公开涉及刺激细胞群中的细胞-特异性事件的方法。在一些实施方式中，方法包括以如上所述的连续多核酸分子、如上所述的载体、如上所述的工程化的病毒基因组或如上所述的病毒粒子接触细胞群。
在一些实施方式中，细胞-特异性事件通过以下调节：结合和反式激活至少一个盒的调节组件的内源转录因子；和/或启动子片段的转录活性；和/或补充至少一个盒的响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA；或通过以下调节：结合和反式激活至少一个盒的5’调节组件的转录因子响应元件的内源转录因子；和/或启动子片段的转录活性；和/或补充至少一个盒的3’响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA。
在一些实施方式中，细胞群包括至少一种靶细胞和至少一种非靶细胞。
在一些实施方式中，靶细胞和非靶细胞区别在于：(i)结合和反式激活至少一个盒的调节组件的内源转录因子的蛋白质水平或活性；和/或(ii)启动子片段的转录活性；和/或(iii)补充至少一个盒的响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA的RNA水平或活性；并且其中不同的(i)中的蛋白质水平或活性和/或(ii)中的启动子片段的转录活性和/或(iii)中的RNA水平或活性导致靶细胞和非靶细胞在至少一个盒的响应组件的输出的表达水平中不同，从而刺激细胞-特异性事件。
在一些实施方式中，靶细胞和非靶细胞区别在于：(i)结合和反式激活至少一个盒的5’调节组件的转录因子响应元件的内源转录因子的蛋白质水平或活性；和/或(ii)启动子片段的转录活性；和/或(iii)补充至少一个盒的3’响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA的RNA水平；并且其中(i)中的不同蛋白质水平和/或(ii)中的启动子片段的转录活性和/或(iii)中的RNA水平导致靶细胞和非靶细胞在至少一个盒的3’响应组件的输出的表达水平不同，从而刺激细胞-特异性事件。
在一些实施方式中，靶细胞类型和非靶细胞类型之间的3’响应组件的输出的表达水平的差异至少2、至少5、至少10、至少100、至少1,000或至少10,000倍。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞是肿瘤细胞和细胞-特异性事件是细胞死亡。在一些实施方式中，肿瘤细胞死亡由通过激活受体配体、特异性抗原、刺激细胞因子或其任何组合的表达的免疫靶向介导的。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞是衰老细胞和细胞-特异性事件是细胞死亡。
在一些实施方式中，方法进一步包括以通过将输出代谢为治疗或有毒化合物的前药或无毒前体化合物接触细胞群。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞相对于相同类型的野生型细胞不同地表达因子，和细胞-特异性事件是调节因子的表达水平。
在一些实施方式中，输出表达确保靶细胞群的生存，同时由于输出表达的缺乏和在无关的和非特异性细胞死亡-诱导剂存在的情况下，消除非靶细胞。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞包括感兴趣的特定表型，使得输出表达限于该特定表型的细胞。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞是选择的细胞类型，并且细胞-特异性事件是通过在选择的细胞类型中天然地不存在或不活跃的基因表达来编码新的功能。
在一些实施方式中，细胞群包括多细胞生物体。在一些实施方式中，多细胞生物体是动物。在一些实施方式中，动物是人。
在一些实施方式中，细胞群离体接触。在一些实施方式中，细胞群体内接触。
附图说明
以下的附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步表明本公开的某些方面，通过参考这些附图的一个或多个，结合本文呈现的具体的实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开的某些方面。应当理解，图中阐释的数据不限制本公开的范围。
图1A-1B。图1A.示意性表示可在本文所述的连续DNA分子中实施的遗传相互作用的各种选择。注释了特征的细条和粗条表示各种功能DNA-编码的构成要素。仅DNA、microRNA(miR)和蛋白质组件明确地显示。钝箭头(blunt arrow)表示通过microRNA的基因表达的抑制，其发生在mRNA水平。mRNA未明确地显示，但是其暗示存在microRNA靶比如T-X和T-Y作为DNA序列的一部分也将导致转录mRNA中该相同靶的存在，然后其将通过miRNA输入被靶向。中空尖的箭头指示基因表达的激活。填满尖的箭头指示基因表达(如从DNA至蛋白质的直接转变显示的，未显示mRNA中间体)。缩写如下：TF-A：任意转录因子A；TF-B：任意转录因子B；miR-X：任意microRNA X；miR-Y：任意microRNA Y；T-X：miR-X靶向的序列；T-Y：miR-Y靶向的序列；TF-A-RE：由任意转录因子A识别的响应；TF-B-RE：任意转录因子B的响应元件；AA：辅助反式激活因子蛋白质；AA-RE：由辅助反式激活因子识别的响应元件；Pmin：具有低固有泄漏的最小启动子；输出：任意蛋白质或RNA-编码基因；PR-E：任意启动子或启动子片段。图1B.根据选择项3a和3b的microRNA靶的存在导致输出表达的非常强烈下调，即大于100-倍抑制。Ctr miR代表“对照”miRNA，不引起针对miR-424或miR-126靶的作用的miRNA序列。每分组中左侧的条指示含有miR-424靶序列的输出基因和每分组中右侧的条表示含有miR-126靶的输出基因。
图2.连续DNA结构变体。如图1A中描绘的基因电路，如连续DNA分子中实施。每种结构变体表示不同多输入程序；显示了趋异和趋同构型。缩写如下：病毒序列L：对病毒载体特异性的且无论基因电路载荷如何都需要在载体中的任何序列，其包括反向末端重复序列(ITR)、长末端重复序列(LTR)、Psi序列、封装信号、病毒复制所需的基因和在溶瘤载体的情况下的封装等；病毒序列R：与病毒序列L相同，但从右侧连续DNA盒在侧面；PolyA：多腺苷酸化信号和基因的3’-非翻译区(3’-UTR)；Rep基因：载体-特异性基因或触发病毒载体复制的基因；TF-A：任意转录因子A；TF-B：任意转录因子B；miR-X：任意microRNA X；miR-Y：任意microRNA Y；T-X：miR-X靶向的序列；T-Y：miR-Y靶向的序列；TF-A-RE：任意转录因子A的响应元件；TF-B-RE：任意转录因子B的响应元件；AA：辅助反式激活因子蛋白质；AA-RE：结合辅助反式激活因子的响应元件；Pmin：具有低固有泄漏的最小启动子；输出：任意蛋白质或RNA-编码基因；PR-E：任意启动子或启动子片段。
图3A-3B.图3A.与腺伴随病毒载体(AAV)相匹配的具体的实施。在图中指示了不用microRNA靶或用microRNA靶构建的趋异和趋同变体。使用两个不同辅助反式激活因子(PIT-RelA融合物和PIT-VP16融合物)。连续DNA构建体的侧面是对在AAV病毒粒子中封装所必需的AAV2 ITR(反向末端重复序列)。图3B.Huh-7细胞中趋同和趋异变体之间的比较。当DNA分子瞬时地转染入细胞时，测量mCherry荧光。左侧的两个条比较不具有miRNA靶的趋同和趋异变体。它们显示了相当的输出表达水平。右侧的两个条比较包括miRNA靶T-miR-424的趋异和趋同变体。趋异变体清楚地显示比趋同变体改善得多的基因表达。
图4A-4B.按照目前公开实施基因电路的AAV病毒粒子的证明。图4A.已经构建的四个不同连续DNA盒的示意图。含有不同DNA盒的病毒粒子按照嵌入盒的miRNA靶(没有靶；miR-126靶；miR-424靶；miR-122靶。注意与含有病毒粒子的miR-122靶有关的数据仅在图6A-6B和图7A-7C中显示)加阴影。DNA载荷实施逻辑机制‘输出’～Sox9/10AND Hnf1A/B ANDNOT(MiR-X)，其中X＝126或424或122；当没有靶存在时，DNA载荷实施机制‘输出’～Sox9/10AND Hnf1A/B。有两种不同输出：mCherry荧光报告剂和将无毒的前药更昔洛韦转换为导致细胞死亡的有毒的产物的酶HSV-TK(胸苷激酶)。条状图显示测量的用携带各自DNA载荷(电路载体，从左至右：HNF1A/B AND SOX9/10、HNF1A/B AND SOX9/10AND NOT(mir-126)、HNF1A/B AND SOX9/10AND NOT(mir-424))的病毒粒子感染的各种细胞系(每分组中从左至右：HepG2、Huh7、HCT-116、Hela)中的mCherry表达。在没有miRN-126或miR-424的表达的情况下，细胞系HepG2和Huh7表达高水平的Sox9/10和HNF1A/B，并且因此预期导致高输出表达。细胞系HCT-116和HeLa不表达Sox9/10或HNF1A/B，并且因此预期导致非常低的输出表达。数据显示确实如此，病毒粒子导致细胞系HepG2和Huh-7中非常强烈的mCherry表达并且低于细胞系HeLa和HCT-116中的表达几乎1000-倍，与预期一致。图4B.右侧的示意图显示当Sox9/10和HNF1A/B二者高度表达且miRNA不表达时，逻辑程序控制输出并且导致细胞死亡。左侧的条状图显示当用三种类型的病毒粒子感染HepG2细胞(每分组中的左侧条)时强烈的细胞死亡以及HeLa细胞(每分组中的右侧条)的可以忽略的细胞死亡，如预期的。电路载体，从左至右：HNF1A/B AND SOX9/10、HNF1A/B AND SOX9/10AND NOT(mir-126)、HNF1A/B ANDSOX9/10AND NOT(mir-424)。标记为“组成型Cherry”的两个条显示细胞没有通过AAV感染杀死但是经有毒的输出杀死。中间的条状图显示两种细胞系(左：HepG2；右：Hela)通过组成性地表达的HSV-TK杀死，所以不同效果是由于基因电路DNA载荷。
图5A-5C.慢病毒载体中的实施方式之一的实施。图5A.连续DNA盒的示意图。实施两种不同对的绝缘子以及不具有绝缘子的结构。图5B.预期导致高输出表达的两种细胞系(HuH-7和HepG2)和不预期导致高表达的细胞系HCT-116中的荧光输出的表达。总体上，结果与预期一致。一对绝缘子A1/A3显示预期细胞系中的高输出表达和‘阴性’细胞系中的低表达的良好组合。对于每组条：左，无；中间，A1/A3；右，F1/C3。图5C.输出表达的时间过程从阳性和阴性细胞系中这些整合的载体获得。使用该对绝缘子A1/A3用构建体在60天内观察到良好的表达稳定性。顶部线：Huh7；中间线：HepG2；底部线：HCT-116。
图6A-6B.通过携带连续DNA盒的病毒粒子体内靶向的特定细胞的证明。图6A.连续DNA盒的示意性概括结构(也参见图4A-4B)。通过基因电路实施的程序是HNF1A/B ANDSox9/10AND NOT(miR-122)。这预期导致HepG2肿瘤细胞中的高表达和小鼠肝中的低表达，由于肝中miR-122的高表达。用这些连续盒生成AAV-DJ病毒粒子。生成另外不具有miRNA-122靶的连续盒。两种连续盒分子生成mCherry输出并且用于评估细胞靶向特异性。在DNA方案下，例证实验工作流程。图6B.用荧光素酶注入小鼠并且将YFP-修饰的HepG2癌细胞注入脾。将细胞散布入肝，形成类似肝癌临床表现的多个肿瘤灶。在建立肿瘤后，将病毒粒子经尾静脉全身地注入。几天后，将动物安乐死并且测试肝组织以及植入的肿瘤的mCherry输出蛋白质的表达。当表示肿瘤细胞的“黄色”信号与表示电路输出的“mCherry”信号共定位时，实现特异性表达。对代表性新鲜的肝切片进行显微镜快照。图像显示，从顶部至底部，切片的相位对比图像；肿瘤的位置和载体输出的表达。从左至右，具有组成型mCherry表达的载体；实施程序HNF1A/B AND Sox9/10的载体；和实施程序HNF1A/B ANDSox9/10AND NOT(miR-122)的载体。两个后者载体在他们连续DNA载荷中实施趋异方向。
图7A-7C.基因电路-携带病毒载体的抗肿瘤效力的证明。图7A.图6A中显示的连续DNA盒被修饰为含有编码HSV-TK酶的基因作为输出。图7A-7B.类似于图6B中的描述在小鼠肝中建立肿瘤。AAV-DJ-类型的载体两次在尾静脉中全身地注入；GCV施用在第一次注入后的三天开始，接下来15天每天。图7B.图表显示终止的时间处整个肝中的肿瘤载荷，如通过整个-器官生物发光评估。三个组包括单独用病毒载体注入的小鼠、单独用GCV处理的小鼠和用病毒注射液和GCV的组合处理的小鼠。与对照相比，仅在后者的组中肿瘤尺寸大大减小。右侧的图像验证该主张。图7C.列“整个肝生物发光”显示来自死后整个肝的发光信号。第二列显示代表性肝切片的阶段图像。第三列显示代表性新鲜的肝的切片，具有指示肿瘤灶的信号。仅用病毒载体和用GCV处理的小鼠展示处大大降低的肿瘤载荷，如预期的。
具体实施方式
分类器基因电路是人工基因网络或电路(工程化的相互作用的基因和遗传元件的集合)，其能够根据可编程规则将的细胞质分子特征的特定组合转换成特定的细胞响应，例如仅在某些分子缺失或存在的细胞中激活基因(Xie Z.等，Science.2011Sep 2；333(6047):1307-11；Benenson Y.,Nat.Rev.Genet.2012Jun 12；13(7):455-468)。精确控制细胞行为的能力为研究、生物技术和生物医学应用提供了巨大的前景。然而，用于治疗应用的这种技术的潜力受阻于实施治疗相关动作所需的遗传电路的大小和复杂性，以及这种电路与治疗上接受的方式比如病毒载体和工程化的细胞本质上不兼容的事实。相反，大多数----如果不是全部----关于分类器电路的报告都已公开了使用瞬时转染将质粒的组递送至培养细胞，而不是通过具有潜在医疗效用的病毒载体。
事实上，这些发展的医学转化需要体内高效的DNA递送至体细胞，其目前是借助专门的病毒载体和越来越多的非病毒递送载体(其根据施用途径、待靶向的组织和其他特定要求来选择的)来实现的。将现有的分类器电路技术与这些载体组合仍然是严峻的挑战。随着特定细胞靶向所需的电路复杂性(输入特征的数量和电路基因的数量)的增加，病毒载体中的电路封装至少由于两个原因变得逐渐困难。
首先，任何病毒递送媒介具有有限的运载能力，因此难以容纳电路功能性和感兴趣的治疗输出所需的所有遗传组件。相似地，由于DNA与封装物质之间形成的颗粒复合物的尺寸增大，非病毒载体的性能可随着DNA尺寸的增大而下降。
其次，随着相同载体上独立转录单元数量的增加，背景效应(例如，转录读通、启动子背景、结点组成)的风险也会增加。背景效应很难预测，并且可影响电路性能，或甚至完全改变预期行为。
本文公开了编码与常用的基因疗法病毒和非病毒载体兼容的分类器基因电路(图1)的连续多核酸分子。这里还公开了对细胞群中感兴趣的基因表达实施复杂的多输入控制的方法。
连续多核酸分子的组成
在一些方面中，本公开涉及包括至少一个表达盒的连续多核酸分子。如本文使用的，术语“连续多核酸分子”指单个连续的核酸分子(即，每个表达盒在单一多核酸分子上编码)或两个互补的连续的核酸分子(即，每个表达盒在包括两条互补链的双链的多核酸分子上编码)。在一些实施方式中，连续多核酸是RNA(例如，单链或双链的)。在一些实施方式中，连续多核酸是DNA(例如，单链或双链的)。在一些实施方式中，连续多核酸是DNA：RNA杂合体。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包括至少两个盒。在一些实施方式中，至少两个盒是以趋异方向。如本文使用的术语“趋异方向”指这样的构型，其中：(i)第一盒和第二盒的转录在连续多核酸分子的不同链上进行和(ii)第一盒的转录被引导远离第二盒并且第二盒的转录被引导远离第一盒。图2提供了各种趋异构型的示例。
在一些实施方式中，两个盒是以趋同方向。如本文使用的，术语“趋同方向”指这样的构型，其中：(i)第一盒和第二盒的转录在连续多核酸分子的不同链上进行和(ii)第一盒的转录被引导朝向第二盒并且第二盒的转录被引导至朝向第一盒。在一些实施方式中，两个趋同盒共用多腺苷酸化序列。图2提供了各种趋同构型的示例。
在一些实施方式中，至少两个盒是以头-至-尾方向。如本文使用的术语“头-至-尾”指这样的构型，其中：(i)第一盒和第二盒的转录或翻译在连续多核酸分子的相同链上进行和(ii)第一盒的转录或翻译被引导朝向第二盒并且第二盒的转录或翻译被引导远离第一盒(5’…→…→…3’)。
如本文使用的，术语“表达盒”或“盒”是互换使用的并且指包括至少一种调节组件和至少一种响应组件的多核酸，其中调节组件调节响应组件的转录、响应组件的RNA水平和/或由响应组件的蛋白质生成。
在一些实施方式中，连续多核酸分子的至少一个盒位于绝缘子的侧面。绝缘子是核酸序列，其当通过绝缘子-结合蛋白质结合时，庇护调节组件或响应组件免遭其他附近调节元件的影响。例如，连续多核酸分子的侧面盒可庇护每个盒免遭其他盒的调节元件的影响。绝缘子的示例对本领域技术人员是已知的。
调节组件
连续多核酸分子的盒包括至少一种调节组件。调节组件可包括反式激活因子响应元件、转录因子响应元件、启动子元件或最小启动子的一个或多个。本领域技术人员将认识到这些元件可在各种构型中定向。例如，反式激活因子响应元件可以是5’或3’至启动子元件和/或转录因子响应元件；转录因子响应元件可以是5’或3’至启动子元件和/或反式激活因子响应元件；启动子元件可以是5’或3’至转录因子响应元件和/或反式激活因子响应元件。
如本文使用的术语“反式激活因子”或“反式激活因子蛋白质”指在反式激活输出(即，感兴趣的基因)的表达和结合至可操作地连接至编码输出(即，感兴趣的基因)的核酸的反式激活因子响应元件的连续多核酸分子上编码的蛋白质。当反式激活因子在关于其调节的核酸序列的正确功能位置和方向时，反式激活因子响应元件“可操作地连接”至编码输出的核酸，以控制(“驱动”)该序列的转录启动和/或表达。在一些实施方式中，反式激活因子独立地结合和反式激活反式激活因子响应元件(即，在任何另外因素没有的情况下)。在其他实施方式中，仅在结合至转录因子响应元件的转录因子存在的情况下，反式激活因子结合和反式激活反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，反式激活因子蛋白质包括DNA-结合结构域。在一些实施方式中，DNA-结合结构域被工程化(即，非天然存在的)以结合与天然存在的序列不同的DNA序列。DNA-结合结构域的示例对本领域技术人员是已知的并且包括但不限于使用锌指技术或TALEN技术或来自细菌的双组件信号传导途径的突变响应调节子衍生的DNA-结合结构域。
在一些实施方式中，DNA-结合结构域源自哺乳动物蛋白质。在其他实施方式中，DNA结合结构域源自非哺乳动物蛋白质。例如，在一些实施方式中，DNA-结合结构域源自起源于细菌、酵母或植物的蛋白质。在一些实施方式中，DNA-结合结构域需要另外组件(例如，蛋白质或RNA)以靶向反式激活因子响应元件。例如，在一些实施方式中，DNA-结合结构域是CRISPR/Cas蛋白质(例如，Cas1、Cas2、Cas3、Cas5、Cas4、Cas6、Cas7、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、Csm2、Cmr5、Csx10、Csx11、Csf1、Cpf1、C2c1、C2c2C2c3)的那些，其需要指导RNA的另外组件至靶向反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，反式激活因子蛋白质源自天然存在的转录因子，其中天然存在的转录因子的DNA-结合结构域已经突变，导致相对于野生型转录因子的改变的DNA结合特异性。在一些实施方式中，反式激活因子是天然存在的转录因子。
在一些实施方式中，反式激活因子蛋白质进一步包括反式激活结构域(即，包括DNA结合结构域和反式激活结构域的融合蛋白质)。如本文使用的，术语“反式激活结构域”指起作用将转录机制招募至最小启动子的蛋白质结构域。在一些实施方式中，反式激活结构域不独立地触发基因激活。在一些实施方式中，反式激活结构域是天然存在的。在其他实施方式中，反式激活结构域是工程化的。反式激活结构域的示例对本领域技术人员是已知的并且包括但不限于RelA反式激活结构域、VP16、VP48和VP64。
在一些实施方式中，至少一个盒的反式激活因子是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。参见例如，Angelici B.等，CellRep.2016Aug 30；16(9):2525-2537。
在一些实施方式中，调节组件包括反式激活因子响应元件。“反式激活因子响应元件”可包括被反式激活因子蛋白质结合并识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，反式激活因子响应元件包括大于一个拷贝(即，重复序列)的被反式激活因子蛋白质结合并识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，反式激活因子响应元件包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个重复序列的被反式激活因子蛋白质结合并识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，重复序列是串联重复序列。在一些实施方式中，反式激活因子响应元件包括最小DNA序列的组合。在一些实施方式中，最小DNA序列散布有间隔序列。在一些实施方式中，间隔序列是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20个核苷酸的长度。
在一些实施方式中，调节组件包括转录因子响应元件。术语“转录因子响应元件”指被转录因子结合并识别的DNA序列。如本文使用的，术语“转录因子”指没有在调节基因转录的连续多核酸上编码的蛋白质。在一些实施方式中，转录因子是转录激活因子(即，增加转录)。在其他实施方式中，转录因子是转录抑制剂(即，抑制转录)。在一些实施方式中，转录因子是细胞的内源转录因子。
“转录因子响应元件”可包括被转录因子结合并识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，转录因子响应元件包括大于一个拷贝(即，重复序列)的被转录因子结合并识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，转录因子响应元件包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个重复序列的被转录因子结合并识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，重复序列是串联重复序。在一些实施方式中，转录因子响应元件包括最小DNA序列的组合。在一些实施方式中，最小DNA序列散布有间隔序列。在一些实施方式中，间隔序列是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20个核苷酸的长度。在一些实施方式中，转录因子响应元件是独特的(即，连续多核酸仅包括转录因子响应元件的一个拷贝)。在其他实施方式中，转录因子响应元件是非独特的。
在一些实施方式中，调节组件包括启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包括转录因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件包括哺乳动物启动子或启动子片段。在一些实施方式中，哺乳动物启动子或启动子片段是独特的(即，连续多核酸仅包括哺乳动物启动子或启动子片段的一个拷贝)。在其他实施方式中，哺乳动物启动子或启动子片段是非独特的。
在一些实施方式中，调节组件包括最小启动子。如本文使用的，术语“最小启动子”指启动输出的表达所必需但不充分的核酸序列。在一些实施方式中，最小启动子是天然存在的。在其他实施方式中，最小启动子是工程化的，比如通过改变和/或缩短天然存在的序列、组合天然存在的序列或组合天然存在的序列与非天然存在的序列；在每个情况下，工程化的最小启动子为非天然存在的序列。在一些实施方式中，最小启动子由病毒或非病毒来源工程化的。最小启动子的示例对本领域技术人员是已知的。
在一些实施方式中，调节组件包括反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，盒的调节组件从5’至3’包括：反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，调节组件从5’至3’包括：转录因子响应元件、反式激活因子响应元件和最小启动子。
在一些实施方式中，盒的调节组件包括反式激活因子响应元件和启动子元件。在一些实施方式中，盒的调节组件从5’至3’包括：反式激活因子响应元件和启动子元件。在一些实施方式中，盒的调节组件包括反式激活因子响应元件、启动子元件和最小启动子。在一些实施方式中，盒的调节组件从5’至3’包括：反式激活因子响应元件、启动子元件和最小启动子。在一些实施方式中，盒的调节组件从5’至3’包括：启动子元件和反式激活因子响应元件。在一些实施方式中，盒的调节组件从5’至3’包括：启动子元件、反式激活因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是哺乳动物启动子。在一些实施方式中，启动子元件是启动子片段。
在一些实施方式中，调节组件(例如，反式激活因子响应元件，和/或转录因子响应元件，和/或启动子元件，和/或最小启动子)可操作地连至编码反式激活因子蛋白质和/或输出的核酸。当调节组件在关于其调节的核酸序列的正确功能位置和方向时，调节组件被认为“可操作地连接”，以控制(“驱动”)该序列的转录启动和/或表达。调节组件可通过增加或减少反式激活因子蛋白质和/或输出的表达的转录因子和/或反式激活因子蛋白质结合。
响应组件
连续多核酸分子的盒包括至少一种响应组件。在一些实施方式中，响应组件包括编码输出或感兴趣的基因的核酸序列。在一些实施方式中，输出是RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子是编码蛋白质的mRNA。在一些实施方式中，输出是非编码RNA分子。非编码RNA分子的示例对本领域技术人员是已知的并且包括但不限于包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、microRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA和长ncRNA。
在一些实施方式中，输出是治疗分子(即，与疾病的治疗有关)，比如治疗蛋白质或RNA分子。治疗分子的示例包括但不限于抗体(例如，单克隆或多克隆的；嵌合的；人源化的；包括抗体片段和抗体衍生物(双特异性、三特异性、scFv和Fab))、酶、激素、炎症性分子、消炎分子、免疫调节分子、抗癌症分子、短发夹RNA、短干扰RNA和microRNA。前述种类的治疗分子的具体示例是本领域已知的，其中任何一种可按照本公开使用。
在一些实施方式中，输出是可检测的蛋白质，比如荧光蛋白质。
在一些实施方式中，输出是细胞毒素。如本文使用的，术语“细胞毒素”指对细胞有毒的物质。例如，在一些实施方式中，输出是细胞毒素蛋白质。细胞毒素蛋白质的示例对本领域技术人员是已知的并且包括但不限于粒溶蛋白、穿孔蛋白/粒酶B、Fas/Fas配体和各种细胞因子/趋化因子(例如，IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、CCR3、CXCR3、CXCR4和CCR10)。
在一些实施方式中，输出是催化前药激活的酶。催化前药激活的酶的示例对本领域技术人员是已知的并且包括但不限于羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、副糖酶、基质金属蛋白酶、碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、缬沙酮酶、前列腺特异性抗原、嘌呤-核苷磷酸化酶、羧肽酶、酰胺酶、β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶和胞嘧啶脱氨酶。参见例如，Yang Y.等，Enzyme-mediated hydrolytic activation of prodrugs.Acta.Pharmaceutica.Sinica B.2011Oct；1(3):143-159。相似地，各种前药对本领域技术人员是已知的并且包括但不限于阿昔洛韦、别嘌呤醇、叠氮胸苷、班布特罗、盐酸巴氨西林、卡培他滨、卡托普利、卡马西平、卡利普多、环磷酰胺、二烯雌酚二磷酸酯、二匹夫林、依那普利、法米克洛韦、三磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、fosmaprenavir、fosphentoin、呋喃硫胺、加巴喷丁恩卡比、更昔洛韦、吉西他滨、肼类MAO抑制剂、来氟米特、左旋多巴、甲胺、巯基嘌呤、丝裂霉素、吗多明、萘丁美酮、奥沙拉嗪、奥美拉唑、帕利哌酮、非那西汀、匹氨西林、扑痫酮、氯胍、光盖伞素、雷米普利、S-甲基多巴、辛伐他汀、硫氮磺胺吡啶、舒林达克、替加福、特非那定、伐昔洛韦、缬更昔洛韦和齐多夫定。
在一些实施方式中，输出是免疫调节蛋白质和/或RNA。如本文使用的，术语“免疫调节蛋白质”(或免疫调节RNA)指通过诱导激活和/或增加免疫系统组件的活性调节(刺激(即，免疫刺激蛋白质或RNA)或抑制，(即，免疫抑制蛋白质或RNA))免疫系统的蛋白质(或RNA)。各种免疫调节蛋白质对本领域技术人员是已知的。参见例如，Shahbazi S.andBolhassani A.Immunostimulants:Types and Funtions.J.Med.Microbiol.Infec.Dis.2016；4(3-4):45-51。在一些实施方式中，免疫调节蛋白质是细胞因子或集落刺激因子。
在一些实施方式中，输出是DNA-修饰因子。如本文使用的术语“DNA-修饰因子”指改变DNA的结构和/或改变DNA的序列(例如，通过诱导重组或引入突变)的因子。在一些实施方式中，DNA-修饰因子是编码旨在校正遗传缺陷的蛋白质、DNA-修饰酶和/或DNA-修饰系统的组件的的基因。在一些实施方式中，DNA-修饰酶是CRISPR/Cas DNA修饰系统的位点特异性重组酶、回归内切核酸酶或蛋白质组件。
在一些实施方式中，输出是细胞-表面受体。在一些实施方式中，输出是激酶。
在一些实施方式中，输出是基因表达-调节因子。如本文使用的，术语“基因表达-调节因子”指当存在时增加或减少至少一个基因的转录的任何因子。在一些实施方式中，基因表达-调节因子是蛋白质。在一些实施方式中，基因表达-调节因子是RNA。在一些实施方式中，基因表达-调节因子是能够调节基因表达的多组件系统的组件。
在一些实施方式中，输出是表观遗传修饰剂。如本文使用的，术语“表观遗传修饰剂”指增加、减少或改变表观遗传修饰的因子(例如，蛋白质或RNA)。表观遗传修饰的示例对本领域技术人员是已知的并且包括但不限于DNA甲基化和组蛋白修饰。
在一些实施方式中，输出是载体复制必需的因子。对载体复制必需的因子的示例对本领域技术人员是已知的。
在一些实施方式中，响应组件包括编码反式激活因子的核酸序列。
在一些实施方式中，响应组件包括多顺反子表达元件。如本文使用的，术语“多顺反子响应元件”指促进由单个mRNA生成两种或更多种蛋白质的核酸序列。多顺反子响应元件可包括编码内部识别序列(IRES)或2A肽的多核酸。参见例如，Liu等，Systematiccomparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronicvector.Sci.Rep.2017May 19；7(1):2193。
在一些实施方式中，响应组件包括编码输出、反式激活因子和多顺反子表达元件的核酸序列，其中响应组件的转录生成单个mRNA。在一些实施方式中，输出和反式激活因子通过多顺反子表达元件分开。
在一些实施方式中，响应组件包括至少一种多腺苷酸化序列。在一些实施方式中，多腺苷酸化序列适合于哺乳动物中的细胞转录终止和多腺苷酸化。
在一些实施方式中，响应组件包括至少一个microRNA靶位点。在一些实施方式中，响应组件包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个microRNA靶位点。microRNA是一类长度通常是21-25个核苷酸的小型非编码RNA，以各种方式，包括翻译抑制、mRNA裂解和脱腺苷化来下调它们结合的RNA的水平。
如本文使用的，术语“microRNA靶位点”指补充且通过microRNA调节的序列。microRNA靶位点可具有与结合和调节microRNA靶位点的microRNA至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是3’至输出。在一些实施方式中，至少一个microRNA靶位点是5’至输出。
在一些实施方式中，响应组件包括5’至3’：输出和至少一个microRNA靶位点。在一些实施方式中，响应组件包括5’至3’：编码反式激活因子蛋白质的核酸序列和至少一个microRNA靶位点。在一些实施方式中，响应组件包括5’至3’：编码反式激活因子蛋白质的核酸序列、编码输出的核酸序列和至少一个microRNA靶位点。
在一些实施方式中，连续多核酸分子的多个盒包括至少一个microRNA靶位点。在一些实施方式中，连续多核酸的每个microRNA靶位点是独特的(即，连续多核酸仅包括一个拷贝的microRNA靶)。在一些实施方式中，连续多核酸分子包括至少两个盒，每个盒包括至少一个是相同核酸序列的microRNA靶位点。在一些实施方式中，连续多核酸分子包括至少两个盒，每个盒包括至少一个microRNA靶位点，其中每个盒的至少一个microRNA靶位点包括由相同microRNA调节的不同核酸序列。例如，第一盒可包括microRNA靶位点X和第二盒可包括microRNA靶位点Y和microRNA Z调节靶位点X和靶位点Y。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包括至少一个盒，其中盒包括：(i)5’调节组件，其包括反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子；和(ii)3’响应组件，其包含输出、反式激活因子和任选的多顺反子表达元件，其中输出和反式激活因子任选地通过多顺反子表达元件分开；其中响应组件的转录生成单个mRNA；和其中(ii)的反式激活因子，当作为蛋白质表达时，结合和反式激活(i)的反式激活因子响应元件。
在一些实施方式中，连续多核酸分子编码至少两个盒，其中：(i)至少一个盒包括：5’调节组件，其包括反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子，和3’响应组件，其包括输出；和(ii)至少一个盒包括：启动子元件，其可操作地连接至编码反式激活因子蛋白质的核酸序列；并且其中(ii)的反式激活因子，当作为蛋白质表达时，结合和反式激活(i)的反式激活因子响应元件。
其他组合物
在其他方面中，本公开涉及载体的组合物。在一些实施方式中，载体包括以上所述的连续多核酸分子。
在其他方面中，本公开涉及工程化的病毒基因组的组合物。在一些实施方式中，病毒基因组包括以上所述的连续多核酸分子。在一些实施方式中，病毒基因组是腺伴随病毒(AAV)基因组、慢病毒基因组、腺病毒基因组、单纯性疱疹病毒(HSV)基因组、牛痘病毒基因组、痘病毒基因组、新城疫病毒(NDV)基因组、柯萨奇病毒基因组、流变病毒基因组、麻疹病毒基因组、水泡性口炎病毒(VSV)基因组、细小病毒基因组、塞内加谷病毒基因组、马拉巴病毒基因组或感冒病毒基因组。
在其他方面中，本公开涉及病毒粒子的组合物。如本文使用的，术语“病毒粒子”指在宿主细胞外的病毒的感染形式(例如，包括DNA/RNA基因组和蛋白质衣壳)。在一些实施方式中，病毒粒子包括以上所述的工程化的病毒基因组。
刺激细胞-特异性事件的方法
在其他方面中，本公开涉及刺激细胞群中的细胞-特异性事件的方法。在一些实施方式中，方法包括用以上所述的连续多核酸分子、以上所述的载体、以上所述的工程化的病毒基因组或以上所述的病毒粒子接触细胞群，其中细胞-特异性事件通过至少一种内源转录因子和/或至少一种内源microRNA调节。
在一些实施方式中，用以上所述的连续多核酸分子或以上所述的载体接触宿主细胞经非病毒递送方法发生。示例包括但不限于转染(例如，DEAE葡聚糖-介导转染、CaPO4-介导转染、脂质-介导吸收、PEI-介导吸收和激光器转染)、转化(例如，氯化钙、电穿孔和热休克)、基因转移和颗粒轰击。
在一些实施方式中，细胞群离体接触(即，细胞群与生物体是分离的，和细胞群在生物体外接触)。在一些实施方式中，细胞群体内接触。
如本文使用的，术语“内源”–在细胞的背景中–指其自然状态中在细胞中发现的因子(例如，蛋白质或RNA)。在一些实施方式中，内源转录因子可结合和激活至少一个盒的调节组件的启动子元件(例如，转录因子响应元件)。在一些实施方式中，内源microRNA可补充至少一个盒的调节组件或响应组件的microRNA靶位点。
在一些实施方式中，将选择“反式激活因子”和相应的“反式激活因子响应元件”，使得反式激活因子将特异性结合“反式激活因子响应元件”，但是尽可能少结合至细胞中天然存在的响应元件。在一些实施方式中，反式激活因子蛋白质的DNA结合结构域将未有效地结合细胞中存在的天然调节序列，因此将不触发过度副作用。
在一些实施方式中，细胞群包括至少一种靶细胞和至少一种非靶细胞。靶细胞和非靶细胞类型在至少一种内源转录因子的水平和/或至少一种内源启动子或其片段和/或至少一种内源microRNA的表达强度方面不同。在一些实施方式中，靶细胞和非靶细胞是不同细胞类型。例如，在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞和非靶细胞是非癌细胞。相似地，在一些实施方式中，靶细胞是肝细胞和非靶细胞是非肝细胞(例如，肌细胞)。在其他实施方式中，靶细胞和非靶细胞是相同细胞类型(例如，两种都是肝细胞)，但是尽管如此，在至少一种内源转录因子和/或至少一种内源microRNA的水平不同。例如，靶细胞可以是衰老肌肉细胞和非靶细胞可以是非衰老肌肉细胞。
在一些实施方式中，靶细胞和非靶细胞之间的响应组件的输出的表达水平的差异为至少2、至少5、至少10、至少100、至少1,000或至少10,000倍。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞是肿瘤细胞和细胞-特异性事件是细胞死亡。在一些实施方式中，靶细胞群的细胞是衰老细胞和细胞-特异性事件是细胞死亡。在一些实施方式中，细胞死亡由免疫靶向通过激活受体配体、特定抗原、刺激细胞因子或其任何组合的表达介导。在一些实施方式中，方法进一步包括以通过输出代谢为治疗或有毒化合物的前药或无毒的前体化合物接触细胞群。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞相对于相同类型的野生型细胞不同地表达因子和细胞-特异性事件是调节因子的表达水平。
在一些实施方式中，由于缺乏输出表达和在细胞死亡-诱导剂存在的情况下，输出表达确保靶细胞群的生存同时消除非靶细胞。在其他实施方式中，由于输出表达和在细胞死亡-诱导剂存在的情况下，输出确保非靶细胞群的生存同时消除靶细胞。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞包括感兴趣的特定表型，使得输出表达限于该特定表型的细胞。
在一些实施方式中，靶细胞群的细胞是选择的细胞类型并且细胞-特异性事件是通过在选择的细胞类型中天然地不存在或无活性的基因的表达来编码新的功能。
在一些实施方式中，细胞群包括多细胞生物体。在一些实施方式中，多细胞生物体是动物。在一些实施方式中，动物是人。
相较于现有技术的进步
本文公开的组合物和方法以各种方式呈现出相较于现有技术的那些的进步。以下提供了这些进步的示例。
第一，这里描述的方案和方法展示出增加的精度。感知多个高信息量分子并且结合其信息的能力允许人们比使用先前描述的天然组织特异性启动子(通常在多种组织/细胞类型中程度不同表达)或脱靶更精确地限制表达。
第二，本文所述的电路架构显示出卓越的动态范围，具有紧密的Off和与强组成型启动子相当的完全表达。这种方案胜过经典的转录靶向，其通常被弱和泄漏的表达所困扰。强烈的绝对表达是许多基因疗法成功的关键，并且高动态范围在有毒基因的靶向(例如，癌症自杀疗法)中特别地重要。
第三，本文所述的电路结构本质上是模块化的(即单个传感序列可以交换以改变电路的特异性)，并且单个信号以可预测的方式组合。因此，单个传感器可以根据不断增长的TF和miRNA表达数据集进行组合，以合理设计具有不同特异性的载体。
此外，这些方案可用于开发具有提高的特异性和更高的效力的新的基因和细胞疗法(GCT)。可以编程逻辑电路以感知特定的条件，并且用基因、治疗蛋白质、纠正性miRNA或以多管齐下的输出组合响应。可编程的输入、紧凑尺寸以及适合多种不同病毒载体的所得能力打开了各种应用。电路可以被封装在最合适的AAV血清型中，并且被编程为仅在感兴趣的组织中驱动功能基因，用于精确的体细胞基因疗法。在这种应用的变体中，自杀基因治疗，杀伤基因在癌细胞中特异性表达，而不是在身体的其他健康组织中表达，如本文所述的用于肝细胞癌的特异性靶向。这表示了该技术的理想基准，因为这要求在癌细胞中的高表达水平，其与在泄漏表达会导致毒性作用的其他组织中的严格控制有关。
这些电路足够小，以封装在许多溶瘤细胞病毒(如腺病毒、HSV)中而不折损复制机制，因此可以很容易地用于精确地靶向癌细胞中的病毒复制。本文所述的电路设计也可与慢病毒载体结合使用，用于细胞的离体工程化，以用作干细胞或免疫疗法。在这种情况下，电路被设计为仅在满足某些体内条件时进行特定的遗传程序。作为示例，干细胞可以用本文所述的电路转导，在体外分化和选择；并且将分化的细胞重新融入患者，其中电路连续监测关键多能性标记的状态，在其出现时杀死细胞，以避免畸胎瘤形成。本文所述的电路可以插入绝缘子之间，并且封装在慢病毒颗粒中，且对电路性能无显著影响的展示，表明这个方向的第一个概念性证明。
本文公开的组合物和方法代表了以下领域的具体进步：
基因疗法中感兴趣的基因的靶向表达：将感兴趣的基因(GOI)的表达限制到感兴趣的组织/细胞类型，仍然是病毒疗法中的公开挑战。例如，这个问题在以下中特别严重：在(i)癌症病毒疗法中，由于健康组织和癌症组织之间的高度相似性，以及(ii)由于在非预期组织中的不良副作用必须对GOI非常严格调节的适应症中。
现有技术中控制嵌入病毒载体中的感兴趣的基因的特异性的主要方案是“转录靶向”(Dorer D.E.和Nettelbeck D.M.,Adv.Drug Deliv.Rev.2009.61(7-8):554-571；Robson T.和Hirst D.G.,J.Biomed.Biotechnol.2003；2003(2):110-137；Navarro S.A.等，Expert Opin.Ther.Pat.2016Sep；26(9):1095-1104)。在这种方案中，GOI被置于癌症特异性或组织特异性启动子的控制下。这种方法的缺点很多。例如，这种方案的特异性有限。被定义为“特异性”的启动子实际上通常在多个组织中表达。对于所谓的“癌症特异性启动子”尤其如此，因为它们通常与其他组织中为生理性的基因的过度表达有关。此外，这种方案的特征还在于靶向组织或细胞类型与那些不应该被靶向的组织或细胞类型之间的非常低的表达差异。大部分组织或癌症特异性启动子都是弱的，而且是泄漏的(例如，常用的组织特异性启动子的AFP启动子的活性比CAG低500倍)(Kanegae Y.等，Nucleic AcidsRes.2011Jan；39(2):e7)。这种表达的低差异限制了人们将高剂量所需的强细胞毒素基因和蛋白质的表达限制在只需要它们的细胞上的能力。增加选择性启动子强度的建议解决方案包括两步转录扩增(TSTA)(Iyer M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001Dec 4；98(25):14595-14600；US7527942B2；US2009/0192101A1)或将特异性启动子与源自强组成型启动子的序列元件混合(Sakaguchi M.等，Oncol.Rep.2017Aug；38(2):1108-1114)。这两种解决方案可被认为是成败参半，因为它们以泄漏为代价来增加启动子强度，并且通常导致特异性的降低。
更近的策略通常被称为“miRNA脱靶”，其结合组成型启动子与待被从表达谱中排除的组织中丰富的miRNA的靶(WO2007/000668A2)。由于使用组成型启动子，这种方案允许达到转基因的高剂量。虽然对完善靶向精度是有用的，但在依赖于系统递送的应用中，仅通过脱靶达到高选择性是困难的，因为其需要通过大组miRNA靶逐一排除许多组织。随着靶数量的增加，由于成分效应和潜在的遗传不稳定，盒设计变得更具挑战性(Ruiz A.J.等人，J.Virol.2016Mar 28；90(80):4078-4092)。此外，紧密的Off水平需要高度丰富的miRNA的存在，潜在地限制了可用分子靶的数量。[0001]Rinaudo等早先提出的使用质粒-编码基因电路的miRNA靶向的版本(Rinaudo K.等，Nature Biotechnol.2007Jul；25(7):795–801)，在慢病毒载体中进行了尝试(Amendola M.等，Mol.Ther.2013May；21(5):934-946)。有趣地，该研究使用两种不同的慢病毒载体实现了该方案，因此，说明将复杂的基因电路封装成连续的DNA分子是具有挑战性的任务。
合成的生物学：已经描述了各种各样的展示出复杂逻辑行为的电路。在使用转录和翻译调节子之前，已经显示了在哺乳动物细胞中所有可能的单输入和双输入逻辑门的实施(Auslander S.等，Nature.2012Jul 5；487(7405):123-27)。最近，几个小组证实且描述了基于重组酶的分子逻辑和记忆(memory)的实现(WO2014/093852A1；WO2015/188191A1)。
这些努力展示了使用生物分子进行细胞控制和逻辑实施的突出进展。然而，所有这些系统当面临用于体内细胞靶向时都经历两个缺点：(i)界面匹配和(ii)电路尺寸。
先前描述的电路都是在细胞培养中用良好表征的和外部调节的异位输入分子测试的，并且没有证明其当与内源细胞分子交界时的性能。虽然在开发逻辑整合中已经取得了很大的进展，但逻辑电路-细胞环境交界的建立仍然滞后。使用递送至培养细胞系的重组质粒的组之前已显示内源miRNA作为有效逻辑输入的示例(WO2012/012739A2)。用各自控制脱落蛋白(Nissim L.和Bar-Ziv R.H.,Mol.Syst.Biol.2010Dec 21；6:444)或Cas9和gRNA(Liu Y.C.等，Nat.Commun.2014Nov.6；5:5393)的片段的两个全长组织特异性启动子显示了能够处理内源转录因子输入的逻辑基因电路。也已经证明了能够将单个内源转录因子与合成电路和一对不相关的转录因子稳健地连接的系统(Angelici B.等，Cell Rep.2016Aug30；16(9):2525-2537)。然而，在所有以上情况中，实验实施--特别是在Angelici B.等(Cell Rep.2016Aug 30；16(9):2525-2537)中--限于瞬时转染至培养细胞的重组质粒的混合物。在任何情况下都没有显示逻辑电路可以在连续核酸分子中或在医学相关的载体系统中实施，或显示在动物模型中治疗疾病。
另外，以上大部分设计的目标是电路功能的最大灵活性，并且这通常是通过构建另外的重组质粒来实现的。事实上，许多复杂的电路需要10个独立的质粒以在瞬时转染的情况下操作。作为示例，Auslander等(Nature.2012Jul 5；487(7405):123-27)中描述的2输入AND门需要5种不同的质粒，并且W.Wong(WO2015/188191A1)描述的重组酶系统依赖于3种质粒(两种重组酶加上它们操作的输出表达盒)，并且都没有结合内源性细胞输入测试。而且，先前描述的设计为实施AND逻辑的系统需要3种质粒(Liu Y.C.等，Nat.Commun.2014Nov.6；5:5393；Angelici B.等，Cell Rep.2016Aug 30；16(9):2525-2537)。这些方案还需要使用完整的哺乳动物启动子作为与细胞背景的界面，在一种情况下，使用大蛋白(CAS9)逻辑整合，导致非常大的电路尺寸。
治疗应用的基因电路：在治疗相关的病毒和非病毒载体中实施多组件基因电路仍然非常罕见，尤其是由于以上提到的事实，即许多最先进的电路越来越复杂，并且需要大的DNA足迹。以上讨论的在连续DNA分子上整合多个基因的另外挑战(例如，基因之间的通读、调节干扰等)防止了以上许多基本进展的医学转化。现有的用于体内靶向的逻辑电路的示例已经限于慢病毒载体(Morel M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2016Jul 19；113(29):8133-8138；Nissim L.等，Cell.2017Nov 16；171(5):1138-1150)，由于其更高的载物能力。虽然对于离体应用(特别是免疫细胞工程化)很有用，但由于慢病毒骨架在导致突变和/或不需要的基因激活的宿主基因组中整合的能力，因此其对体内疗法来说远非理想。在Nissim L.等显示的基因电路(Cell.2017Nov 16；171(5):1138-1150)中使用一对慢病毒构建体而不是单个载体来实施，隐含着在连续DNA分子中编码复杂的基因电路的困难，如本文所示。如本文示例和图3A-3B、图5A-5C、图6A-6B和图7A-7B中显示的，非整合单个-组件AAV载体表示了安全的、经过验证的替代方案，其具有广泛的血清型选择，优化用于在不同细胞类型中的高效递送，并且具有高的穿透肿瘤的能力，但在载物能力上受到限制。Morel等的数据(Morel M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.Sci.U.S.A.2016Jul 19；113(29):8133-8138)也显示了天然特异性启动子差的On:Off特点如何影响电路性能，在灵敏度和特异性之间实施了严格的权衡(trade-off)。尽管这些工具的缺点，但Morel M.等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2016Jul 19；113(29):8133-8138)和Nissim L.等(Cell.2017Nov 16；171(5):1138-1150)使用的具体方法与本公开不重叠。
实施例
实施例1.连续DNA分子中实施的功能
本文所述的是能够实施多输入逻辑的连续DNA构建体，例如在两个转录因子(TF)之间、在内源性启动子(或启动子片段)和任意转录因子和任选地一个或多个microRNA(miRNA)之间。通常选择输入，使得它们的组合对电路被设计为靶的一个或多个生理细胞状态是唯一的。在图1A中显示了一般的电路结构示意图。任意转录因子A(TF-A)与邻近最小启动子(Pmin)的输出基因的启动子区域(TF-A-RE)中的响应元件结合。在这个启动子区域的其他地方存在被称为“辅助反式激活因子”(AA)的蛋白质的结合位点。AA是转录反式激活因子，当结合至其响应元件(AA-RE)时且在最小启动子存在的情况下能够激活基因表达。含有转录因子A和辅助反式激活因子AA的响应元件的启动子区域具有协同行为，即由单独转录因子A或辅助反式激活因子AA驱动的输出的表达小于同时在前者和后者都存在的情况下的输出的表达(Angelici B.等，Cell Rep.2016Aug 30；16(9):2525-2537)。
在图1A中电路的“选择项1a”中，AA蛋白表达是由任意转录因子B驱动，该转录因子B与邻近最小启动子的AA-编码基因的启动子区域中的响应元件(TF-B-RE)结合。在该选择项中，当TF-A和TF-B都是强活性时，输出被强烈表达，在TF-A和TF-B之间实施AND样逻辑行为，“TF-A AND TF-B”(表1)。可选地，AA表达可以由内源基因(PR-E)的启动子或这种启动子的一个或多个片段驱动(图1A中电路的“选择项1b”)。在这种情况下，仅当内源性启动子与高活性的TF-A同时有活性时，输出被强烈表达，实施逻辑“PR-E AND TF-A”(表1)。
| TF-A/PR-E | TF-B | 输出 |
| 高 | 高 | 100％ |
| 高 | 低 | 至多50％ |
| 低 | 高 | 至多50％ |
| 低 | 低 | 至多20％ |
表1：在指示条件下的输出水平
在图1A中电路的“选择项2”中，AA蛋白表达与输出表达相连系，例如经T2A连接体。在该选择项中，输出与由AA作用扩增的TF-A(或可替选地和/或除了PR-E以外)的强度成比例(Angelici B.等，Cell Rep.2016Aug 30；16(9):2525-2537)。
| TF-A | 输出 |
| 高 | 100％ |
| 低 | 至多50％ |
表2：在指示条件下的输出水平
在图1A中电路的“选择项3”中，输出进一步由任意microRNA(miR-X)经编码输出的mRNA中的靶位点控制。在“选择项3a”中，仅输出基因由miRNA控制，而在“选择项3b”(仅与以上选择项1兼容)中，编码AA的基因由相同miRNA控制。“选择项3a”和“选择项3b”可以一起或分开使用。
“选择项1a”与“选择项3a”、“选择项3b”或二者组合导致“TF-A AND TF-Band NOT(miR-X)”的逻辑行为，即同时在TF-A和TF-B存在的情况下而在miR-X不存在的情况下时，输出将被高度表达(表2)。类似地，“选择项1b”可与“选择项3a”、“选择项3b”或二者组合以实施类型“PR-E AND TF-A AND NOT(miR-X)”(TABLE 2)”的逻辑行为(表2)。
| TF-A/PR-E | TF-B | microRNA-X | 输出 |
| 高 | 高 | 低 | 100％ |
| 高 | 低 | 低 | 至多50％ |
| 低 | 高 | 低 | 至多50％ |
| 低 | 低 | 低 | 至多20％ |
| 高 | 高 | 高 | 至多20％ |
| 高 | 低 | 高 | 至多20％ |
| 低 | 高 | 高 | 至多20％ |
| 低 | 低 | 高 | 至多20％ |
表3：在指示条件下的输出水平
“选择项2”与“选择项3a”组合导致“TF-B AND NOT(miR-X)”的逻辑行为，即在TF-B存在的情况下和在miR-X没有的情况下，输出将被高度表达。
| TF-A | microRNA-X | 输出 |
| 高 | 低 | 100％ |
| 低 | 低 | 至多50％ |
| 高 | 高 | 至多50％ |
| 低 | 高 | 至多20％ |
表4：在指示条件下的输出水平
在图1A中电路的“选择项4”中，输出进一步由任意microRNA(miR-Y)经编码输出的mRNA中的靶位点控制。在“选择项4a”中，仅输出基因由miRNA控制，而在“选择项4b”(仅与以上“选择项1”兼容)中，编码AA的基因由相同miRNA控制。“选择项4a”和“选择项4b”可以一起或分开使用。
“选择项1a”与“选择项3a”、“选择项3b”或二者，和与“选择项4a”、“选择项4b”或二者组合导致“TF-A AND TF-B AND NOT(miR-X)AND NOT(miR-Y)”的逻辑行为，即在同时存在TF-A和TF-B的情况下而不存在miR-X和miR-Y的情况下，输出将被高度表达。这种布置的作用是防止在强烈表达miR-X或miR-Y或两者的组织中的输出表达，从而提高安全性特征，同时保留在表达TF-A和TF-B二者但不表达miR-X和miR-Y的细胞中的强烈表达。同样，“选择项1b”与“选择项3a”、“选择项3b”或二者，和“选择项4a”、“选择项4b”或二者组合以实施逻辑“PR-E AND TF-B AND NOT(miR-X)AND NOT(miR-Y)”。
“选择项2”与“选择项3a”和“选择项4a”组合导致“TF-A AND NOT(miR-X)AND NOT(miR-Y)”的逻辑行为，即在TF-B存在的情况下和在miR-X不存在的情况下和在miR-Y不存在的情况下，输出将被高度表达。
可以添加另外miRNA输入和其结合位点，并且可以以类似的方式扩展电路结构和逻辑行为(例如，miR-Z作为另一输入特征，和结构“选择项5a”和“选择项5b”等)。这些调节程序的具体遗传实施由图2中的结构来举例说明。
实施例2.连续DNA盒中的实施和与病毒载体的整合
如本文描述的，实施例1中所述电路的代表性示例在连续DNA分子中实施，并且进一步被并入病毒载体基因组中，在此产生病毒颗粒，并且测试其在体外和体内选择性靶向细胞，以及在体内抑制肿瘤生长的能力。因此，除了其他方面，公开了该方案的治疗效用的具体示例。基因以趋同或趋异方向整合在连续DNA构建体中。在后者中，转录因子输入的响应元件位于DNA分子的中心(在两个编码序列之间)，而miRNA靶和PolyA邻近选择的病毒骨架(图2)。也可以将基因以头-至-尾(共线性)的方式整合；这还没有在实验上尝试过，因为过去类似的系统是有问题的，但头至-尾方向也有可能是功能性的。此外，绝缘子可以放置在各个遗传模块之间，以提高它们彼此之间和病毒载体背景(context)的隔离。最后，该方案可导致条件复制(“溶瘤细胞的”)载体，其中输出基因是天然负责载体复制的一个或多个基因(图2)。
实施例3.优选的实施方式和功能示范
一个优选的实施方式是趋异头-至-头布置。在这种构型中，组件的物理组织最大化功能性，并且最小化不可预测的背景效应，导致强碱的模块化系统。趋异基因避免了转录跑通的风险。转录调节针对位于构建体中心的响应元件，周围是保持相对恒定的遗传组件(最小启动子通常是不变的，而反式激活因子和输出基因选自良好表征的组件列表中)。因此，预期的转录调节受病毒骨架上存在的隐性调节子或TF结合位点的庇护。miRNA靶通过转录后调节起作用，因此它们不受例如转录因子与邻近病毒序列的虚假结合(spuriousbinding)的影响。图3A-3B中显示的具有趋异构型的实施方式的优异性能，其中当“选择项1”与“选择项3a”或“选择项3b”组合使用时，基因表达有明显的增益。该实验是在病毒封装之前使用裸的DNA完成的，因此，在随后的病毒载体实施方式中只采用了趋异构型。
在腺相关病毒载体(AAV)和慢病毒载体中证明了连续DNA盒的功能。在图4A-4B中，显示了许多实施了将“选择项1”与“选择项3a”和“选择项3b”组合的趋异构型和电路结构的AAV载体的体外功能(图1A)。将DNA封装入AAV-DJ型病毒中(Grimm D.等，J.Virol.,2008Jun；82(12):5887-5911)。每个载体以以下两种变体生成：(i)荧光输出mCherry以测试靶向特异性和(ii)细胞毒素输出HSV-TK以测试选择性抗肿瘤活性。在图4A中，在一组细胞系中测试了具有荧光输出的各种载体。电路被编程为检测Sox9/10和HNF1A/B表达的组合，是典型的肝癌(Zhou D.等，Tumour Biol.2014Oct；35(10):9935-40；Guo X.等，Diagn.Pathol.2012Apr 19；7:44)。此外，基于这些miRNA在小鼠肝中高度表达但在肝癌细胞中不表达的事实，在健康肝中添加了miRNA控制元件以创建安全开关(内部剖析数据)。肝癌细胞系HepG2和Huh7用作阳性对照，而另外两个非肝癌细胞系HeLa和HCT-116用作阴性对照。如图4A中的柱状图显示，荧光输出在两个肝癌细胞系中以高水平表达，但在阴性对照细胞系中没有表达。在图4B中，当荧光输出用HSV-TK基因取代并且与前药更昔洛韦(GCV)组合时，显示了细胞毒素活性。HSV-TK(胸苷激酶)将GCV转化为导致细胞死亡的细胞毒素产物。这里正如预期的，肝癌细胞系HepG2由载体靶向，导致存活率大大降低。对照细胞系HeLa仍然是可生存的。右侧图显示，当HSV-TK由组成型启动子驱动并且在两个细胞系中以类似的水平表达时，两个细胞系都易受HSV-TK+GCV作用影响。
另外实施电路“选择项1”的趋异盒(图5A)被嵌入慢病毒载体中，并且在体外用荧光输出测试选择性输出表达。这里，绝缘子用于使盒在侧面并且邻近不具有绝缘子对的构建体采用两个不同绝缘子对。所有构建体在阳性对照细胞系Huh7和HepG2中显示出相当的输出表达，在阴性对照细胞系HCT-116中显示出非常低的表达(图5B)。这些整合载体也随着时间的推移达至2个月，而基因表达仅有边际损失。同时，阴性对照细胞系显示出一致的低表达(图5C)。
在散布的肝癌的原位(orthotopic)小鼠模型中，进一步体内测试了实施趋异DNA盒和根据“选择项1”与“选择项3a”的电路，的AAV病毒载体，执行细胞靶向程序“Sox9/10ANDHNF1A/B and NOT(miR-122)”。Nod-SCID-γ(NSG)免疫缺陷小鼠接受外科手术，其中将HepG2癌细胞注入脾，经门脉循环散布至肝，并且形成多个肿瘤灶(图6A)。为防止脾内原发肿瘤形成，手术切除脾。先前已经以YFP荧光报道基因和荧光素酶基因增强了细胞，以使能够进行肿瘤载荷的体内追踪和肿瘤灶的死后检查。在肿瘤细胞注射和肿瘤创建后，将AAV-DJ病毒粒子全身地注入尾静脉。在第一个实验中(图6B)荧光报告蛋白mCherry用来衡量输出的肿瘤特异性表达。不具有T-miR-122特征的电路的变体(仅“选择项1”)也被作为参考测试，以及在组成型启动子下表达mCherry的对照载体。如图6B中的数据显示，编码处理所有三个输入的电路的病毒粒子能够将输出基因表达靶向肿瘤，而实施“选择项1”的电路仅在健康肝中导致旁观者(bystander)输出表达。
实施个三输入细胞靶向程序的载体用细胞毒素输出HSV-TK构建，细胞毒素输出HSV-TK在小分子前药更昔洛韦(GCV)存在的情况下导致细胞死亡(图7A)。数据显示，与对照组相比，治疗的动物(病毒载体在尾静脉注入两次，随后每天施用更昔洛韦)具有低得多的肿瘤载荷(图7B-7C)。因此，证明了实施多输入分类器电路的封装连续DNA盒的病毒粒子的抗肿瘤潜力。
参考文献
1.Xie Z.,Wroblewska L.,Prochazka L.,Weiss R.,and Beneson Y.,Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancercells.Science.2011Sep 2；333(6047):1307-11.
2.Benenson Y.,Biomolecular computing systems:principles,progress andpotential.Nat.Rev.Genet.2012Jun 12；13(7):455–468.
3.Dorer D.E.and Nettelbeck D.M.,Targeting cancer by transcriptionalcontrol in cancer gene therapy and viral oncolysis.Adv.Drug Deliv.Rev.2009.61(7-8):554-571.
4.Robson T.and Hirst D.G.,Transcriptional Targeting in Cancer Gene Therapy.J.Biomed.Biotechnol.2003；2003(2):110-137.
5.Navarro S.A.,Carrillo E.,Grinan-Lison C.,Martin A,Peran M,MarchalJ.A.,and Boulaiz H.,Cancer suicide gene therapy:a patent review.ExpertOpin.Ther.Pat.2016 Sep；26(9):1095-1104.
6.Kanegae Y.,Terashima M.,Kondo S.,Fukuda H.,Maekawa A.,Pei Z.,andSaito I.,High-level expression by tissue/cancer-specific promoter with strictspecificity using a single-adenoviral vector.Nucleic Acids Res.2011 Jan；39(2):e7.
7.Iyer M.,Wu L.,Carey M.,Wang Y.,Smallwood A.,and Gambhi S.S.,Two-step transcriptional amplification as a method for imaging reporter geneexpression using weak promoters.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001 Dec 4；98(25):14595-14600.
8.US7527942B2
9.US20090192101A1
10.Sakaguchi M.,Sadahira T,Ueki H..,Kinoshita R.,Murata H.,YamamotoK.I.,Futami J.,Nasu Y.,Ochiai K.,Kumon H.,Huh N.H.,and Watanabe M.,Robustcancer-specific gene expression by a novel cassette with hTERT and CMVpromoter elements.Oncol.Rep.2017 Aug；38(2):1108-1114.
11.WO2007/000668A2
12.Ruiz A.J.,Hadac E.M.,Nace R.A.,and Russell S.J.,MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy.J.Virol.2016Mar 28；90(80):4078-4092.
13.Rinaudo K.,Bleris L.,Maddamsetti R.,Subramanian S.,Weiss R.,andBenenson Y.,A universal RNAi-based logic evaluator that operates in mammaliancells.Nature Biotechnol.2007 Jul；25(7):795–801.
14.Amendola M.,Giustacchini A.,Gentner B.,and Naldini L.,A Double-Switch Vector System Positively Regulates Transgene Expression by EndogenousmicroRNA Expression(miR-ON Vector).Mol.Ther.2013 May；21(5):934-946.
15.Auslander S.,Auslander D.,Muller M.,Wieland M.,and Fussenegger M.,Programmable single-cell mammalian biocomputers.Nature.2012 Jul 5；487(7405):123-27.
16.WO2014/093852A1
17.WO2015/188191A1
18.WO2012/012739A2
19.Nissim L.and Bar-Ziv R.H.,A tunable dual-promoter integrator fortargeting of cancer cells.Mol.Syst.Biol.2010 Dec 21；6:444.
20.Liu Y.C.,Zeng Y.,Liu L.,Zhuang C.,Fu X.,Huang W.,and Cai Z.,Synthesizing AND gate genetic circuits based on CRISPR-Cas9 foridentification of bladder cancer cells.Nat.Commun.2014 Nov.6；5:5393.
21.Angelici B.,Mailand E.,Haefliger B.,and Benenson Y.,SyntheticBiology Platform for Sensing and Integrating Endogenous TranscriptionalInputs in Mammalian Cells.Cell Rep.2016 Aug 30；16(9):2525-2537(2016).
22.Morel M.,Shtrahman R.,Rotter V.,Nissim L.and Bar-Ziv R.H.,Cellularheterogeneity mediates inherent sensitivity-specificity tradeoff in cancertargeting by synthetic circuits.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2016 Jul 19；113(29):8133-8138.
23.Nissim L.,Wu M.R.,Pery E.,Binder-Nissim A.,Suzuki H.I.,Stupp D.,Wehrspaun C.,Tabach Y.,Sharp P.A.,and Lu T.K.,Synthetic RNA-BasedImmunomodulatory Gene Circuits for Cancer Immunotherapy.Cell.2017 Nov16；171(5):1138-1150.
24.Zhou D.,Bai F.,Zhang X.,Hu M.,Zhao G.,Zhao Z.,and Liu R.SOX10 is anovel oncogene in hepatocellular carcinoma through Wnt/β-catenin/TCF4cascade.Tumour Biol.2014 Oct；35(10):9935-40.
25.Guo X.,Xiong L.,Sun L.,Peng R.,Zou L.,Zhu H.,Zhang J.,Li H.andZhao J..Expression features of SOX9 associate with tumor progression and poorprognosis of hepatocellular carcinoma.Diagn.Pathol.2012 Apr 19；7:44.26.GrimmD.,Lee J.S.,Wang L.,Desai T.,Akache B.,Storm T.A.,and Kay M.A.,In vitro andin vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding andretargeting of adeno-associated viruses.J.Virol.,2008 Jun；82(12):5887-5911.
其他实施方式
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合被组合。本说明书中公开的每个特征可以被用作相同、等同或类似目的的可替代的特征所取代。因此，除非另有明确地说明，公开的每个特征仅是等同或类似的特征的通用系列的示例。
从以上描述中，本领域的技术人员可以很容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修饰，以适应各种用途和条件。因此，其他实施方式也在权利要求内。
等同物
虽然本文已经描述和阐释了几个发明性实施方式，但本领域技术人员将很容易设想各种其他手段和/或结构来进行功能和/或获得结果和/或本文所述的一个或多个优点，并且每个这种变化和/或修饰被认为是在本文所述的发明性实施方式的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易认识到本文所述的所有参数、尺寸、材料和构型意在作为示例，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构型将取决于发明教导被使用的具体的一个或多个应用。本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规实验来确定许多与本文所述的具体发明性实施方式的等同方式。因此，应该理解，上述实施方式仅通过示例呈现，在所附权利要求及其等同物的范围内，发明性实施方式可以以具体描述和权利要求以外的其他方式实践。本公开的发明性实施方式针对本文所述的每个单独的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法。另外，如果这些特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不是相互不一致的，两个或更多个这种特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义，应被理解为优于字典定义、以参考方式纳入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均以引用的方式并入关于所引用的主题，在某些情况下，这些主题可能包括文件的整体。
如本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“a”(“一个/一种”)和“an”(“一个/一种”)，除非有明确的相反指示，应理解为“至少一个/一种”。
如本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意味着如此连在一起的元素的“一种或两种”，即在一些情况下是联合存在的元素，在其他情况下是不联合存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应以相同方式解释，即如此联合的元素的“一个或多个”。除了由“和/或”子句具体确定的元素之外，其他元素可任选地存在，无论其与具体确定的那些元素相关或无关。因此，作为非限制性的示例，当与比如“包括”的开放式语言一起使用时，对“A和/或B”的提及可以在一个实施方式中仅指A(任选地包括B以外的元素)；在另一实施方式中，仅指B(任选地包括A以外的元素)；在仍另一实施方式中，同时指A和B(任选地包括其他元素)等等。
如本说明书和权利要求书中使用的“或”应理解为与如以上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分开列表中的术语时，“或”或“和/或”应被解释为是包含性的，即包括至少一个，但也包括大于一个元素的数量或列表，以及任选地另外未列出的术语。仅明确的相反指示的术语，例如“仅其中之一”或“恰好其中之一”，或当在权利要求书中使用“由…组成”时，将指包括元素的数量或列表的恰好一个元素。一般而言，如本文使用的术语“或”，当前面有排他性术语，比如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”时，应解释为指示排他性选择(即“一个或另一个，但不是两个”)。在权利要求书中使用的“基本上由…组成”应具有专利法领域使用的普通含义。
如本说明书和权利要求书中使用的提及一个或多个元素的列表的短语“至少一个”，应理解为意味着选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括在元素列表内具体列出的每个和全部元素中的至少一个，并且也不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许，除了短语“至少一种”所指的元素列表内具体确定的元素之外，还可以任选地存在其他元素，无论这些元素与具体确定的元素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方式中，“A和B的至少一个”(或等同地，“A或B的至少一个”，或等同地，“A和/或B的至少一个”)可以指至少一个，任选地包括大于一个A，而没有B存在(并且任选地包括B以外的元素)。在另一实施方式中，指至少一个，任选地包括大于一个B，而没有A存在(并且任选地包括A以外的元素)；在仍另一实施方式中，指至少一个，任选地包括大于一个A，和至少一个，任选地包括大于一个B(并且任选地包括其他元件)等等。
还应理解，除非有明确的相反指示，在包括大于一个步骤或行为的本文所要求的任何方法方法中，方法的步骤或行为的顺序不一定限于方法的步骤或行为阐述的顺序。
在以上权利要求书以及说明书中，所有的过渡短语比如“包括”(“comprising”)、“包括”(“including”)、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”、“由…组成”(“composedof”)等都应理解为开放式的，即指包括但不限于。仅过渡短语“由…组成”和“基本上由…组成”各自应为美国专利局的专利审查程序手册的第2111.03节陈述的封闭或半封闭的过渡短语。应当认识到，使用开放式过渡短语(例如，“包括”)在该文件中描述的实施方式，在可替选的实施方式中，也被设想为由开放式过渡短语描述的特征“由…组成”和“基本上由…组成”。例如，如果公开描述了“包括A和B的组合物”，则本公开还考虑了可选的实施方式“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。
Claims (79)
1.一种编码至少两个盒的连续多核酸分子，其中每个盒包括调节组件和响应组件。
2.根据权利要求1所述的连续多核酸分子，其中：
(i)至少一个盒包括：包含反式激活因子响应元件的5’调节组件和包含输出的3’响应组件；和
(ii)至少一个盒包括：包含编码反式激活因子蛋白质的核酸序列的5’调节组件和3’响应组件；和
其中(ii)的反式激活因子，当作为蛋白质表达时，结合和反式激活(i)的反式激活因子响应元件。
3.根据权利要求2所述的连续多核酸分子，其中反式激活因子独立地结合和反式激活反式激活因子响应元件。
4.根据权利要求2-3的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)中盒的5’调节组件进一步包括转录因子响应元件和/或最小启动子。
5.根据权利要求4所述的连续多核酸分子，其中仅在结合至转录因子响应元件的转录因子存在的情况下，反式激活因子结合和反式激活反式激活因子响应元件。
6.根据权利要求4所述的连续多核酸分子，其中所述5’调节组件从5’至3’包括：反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。
7.根据权利要求4所述的连续多核酸分子，其中所述5’调节组件从5’至3’包括：转录因子响应元件、反式激活因子响应元件和最小启动子。
8.根据权利要求2-4的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)中5’调节组件进一步包括启动子元件。
9.根据权利要求8所述的连续多核酸分子，其中所述启动子元件包括哺乳动物启动子或启动子片段。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的连续多核酸分子，其中(i)中所述5’调节组件从5’至3’包括：反式激活因子响应组件和启动子元件和任选地最小启动子。
11.根据权利要求2-10的任一项所述的连续多核酸分子，其中(ii)中盒的所述5’调节组件包括启动子元件。
12.根据权利要求11所述的连续多核酸分子，其中所述启动子元件包括转录因子响应元件和最小启动子，任选地其中转录因子响应元件是独特的。
13.根据权利要求11所述的连续多核酸分子，其中所述启动子元件包括哺乳动物启动子或启动子片段和任选地最小启动子。
14.根据权利要求2-13的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)的至少一个盒和(ii)的至少一个盒以趋同方向。
15.根据权利要求2-13的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)的至少一个盒和(ii)的至少一个盒以趋异方向。
16.根据权利要求2-14的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)的至少一个盒和(ii)的至少一个盒以头-至-尾方向。
17.根据权利要求2-16的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)中盒的3’响应组件进一步包括至少一个microRNA靶位点。
18.根据权利要求17所述的连续多核酸分子，其中至少一个microRNA靶位点是3’至输出。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的连续多核酸分子，其中至少一个microRNA靶位点是5’至输出或在输出内。
20.根据权利要求2-13的任一项所述的连续多核酸分子，其中(ii)中盒进一步包括至少一个microRNA靶位点。
21.根据权利要求20所述的连续多核酸分子，其中至少一个microRNA靶位点是3’至反式激活因子蛋白质-编码DNA序列。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的连续多核酸分子，其中至少一个microRNA靶位点是5’至反式激活因子蛋白质-编码DNA序列或在反式激活因子蛋白质-编码DNA序列内。
23.根据权利要求20-22的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)中盒的至少一个microRNA靶位点和(ii)中盒的至少一个microRNA靶位点是相同核酸序列或是由相同microRNA调节的不同序列。
24.根据权利要求2-23的任一项所述的连续多核酸分子，其中至少一个盒位于绝缘子的侧面。
25.根据权利要求1-24的任一项所述的连续多核酸分子，其中至少一个盒的反式激活因子是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
26.根据权利要求1-25的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是蛋白质或RNA分子。
27.根据权利要求1-26的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是治疗性的。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的连续多核酸分子，其中输出是荧光蛋白质、细胞毒素、催化前药激活的酶、免疫调节蛋白质和/或RNA、DNA-修饰因子、细胞-表面受体、基因表达-调节因子、激酶、表观遗传修饰剂和/或载体复制必需的因子。
29.根据权利要求28所述的连续多核酸分子，其中所述免疫调节蛋白质和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。
30.根据权利要求28所述的连续多核酸分子，其中所述DNA-修饰因子是编码旨在校正遗传缺陷的蛋白质、DNA-修饰酶和/或DNA-修饰系统的组件的基因。
31.根据权利要求30所述的连续多核酸分子，其中所述DNA-修饰酶是CRISPR/Cas DNA修饰系统的位点特异性重组酶、回归内切核酸酶或蛋白质组件。
32.根据权利要求28所述的连续多核酸分子，其中所述基因表达-调节因子是能够调节基因表达的蛋白质或能够调节基因表达的多组件系统的组件。
33.一种载体，其包括根据权利要求1-32的任一项所述的连续多核酸分子。
34.一种工程化的病毒基因组，其包括根据权利要求1-32的任一项所述的连续多核酸分子。
35.根据权利要求34所述的工程化的病毒基因组，其中病毒基因组是腺伴随病毒(AAV)基因组、慢病毒基因组、腺病毒基因组、单纯性疱疹病毒(HSV)基因组、牛痘病毒基因组、痘病毒基因组、新城疫病毒(NDV)基因组、柯萨奇病毒基因组、流变病毒基因组、麻疹病毒基因组、水泡性口炎病毒(VSV)基因组、细小病毒基因组、塞内加谷病毒基因组、马拉巴病毒基因组或感冒病毒基因组。
36.一种病毒粒子，其包括根据权利要求34或权利要求35所述的工程化的病毒基因组。
37.一种编码至少一个盒的连续多核酸分子，其中所述盒包括：
(i)包含反式激活因子响应元件的5’调节组件；和
(ii)包含输出、反式激活因子和任选的多顺反子表达元件的3’响应组件，其中输出和反式激活因子任选地通过多顺反子表达元件分开；
其中响应组件的转录生成单个mRNA；和
其中(ii)的反式激活因子，当作为蛋白质表达时，结合和反式激活(i)的反式激活因子响应元件。
38.根据权利要求37所述的连续多核酸分子，其中所述反式激活因子独立地结合和反式激活反式激活因子响应元件。
39.根据权利要求37-38的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)中5’调节组件进一步包括转录因子响应元件和/或最小启动子。
40.根据权利要求39所述的连续多核酸分子，其中仅在结合至转录因子响应元件的转录因子存在的情况下，反式激活因子结合和反式激活反式激活因子响应元件。
41.根据权利要求39所述的连续多核酸分子，其中所述5’调节组件从5’至3’包括：反式激活因子响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。
42.根据权利要求39所述的连续多核酸分子，其中所述5’调节组件从5’至3’包括：转录因子响应元件、反式激活因子响应元件和最小启动子。
43.根据权利要求37-39的任一项所述的连续多核酸分子，其中(i)中5’调节组件进一步包括启动子元件。
44.根据权利要求43所述的连续多核酸分子，其中所述启动子元件包括哺乳动物启动子或启动子片段。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的连续多核酸分子，其中(i)中5’调节组件从5’至3’包括：反式激活因子响应组件和启动子元件。
46.根据权利要求37-45的任一项所述的连续多核酸分子，其中(ii)中3’响应组件进一步包括至少一个microRNA靶位点。
47.根据权利要求46所述的连续多核酸分子，其中所述至少一个microRNA靶位点是3’至输出和/或反式激活因子。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的连续多核酸分子，其中所述至少一个microRNA靶位点是5’至输出和/或反式激活因子或在输出和/或反式激活因子的内。
49.根据权利要求37-48的任一项所述的连续多核酸分子，其中至少一个盒位于绝缘子的侧面。
50.根据权利要求37-49的任一项所述的连续多核酸分子，其中至少一个盒的反式激活因子是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
51.根据权利要求37-50的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是蛋白质或RNA分子。
52.根据权利要求37-51的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是治疗蛋白质或RNA分子。
53.根据权利要求51或权利要求52所述的连续多核酸分子，其中所述输出是荧光蛋白质、细胞毒素、催化前药激活的酶、免疫调节蛋白质和/或RNA、DNA-修饰因子、细胞-表面受体、基因表达-调节因子、激酶、表观遗传修饰剂和/或载体复制必需的因子。
54.根据权利要求53所述的连续多核酸分子，其中所述免疫调节蛋白质和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。
55.根据权利要求53所述的连续多核酸分子，其中所述DNA-修饰因子是编码旨在校正遗传缺陷的蛋白质、DNA-修饰酶和/或DNA-修饰系统的组件的基因。
56.根据权利要求55所述的连续多核酸分子，其中所述DNA-修饰酶是CRISPR/Cas系统的位点特异性重组酶、回归内切核酸酶或蛋白质组件。
57.根据权利要求53所述的连续多核酸分子，其中所述基因表达-调节因子是能够调节基因表达的蛋白质或能够调节基因表达的多组件系统的组件。
58.一种载体，其包括根据权利要求37-57的任一项所述的连续多核酸分子。
59.一种工程化的病毒基因组，其包括根据权利要求37-57的任一项所述的连续多核酸分子。
60.根据权利要求59所述的工程化的病毒基因组，其中病毒基因组是腺伴随病毒(AAV)基因组、慢病毒基因组、腺病毒基因组、单纯性疱疹病毒(HSV)基因组、牛痘病毒基因组、痘病毒基因组、新城疫病毒(NDV)基因组、柯萨奇病毒基因组、流变病毒基因组、麻疹病毒基因组、水泡性口炎病毒(VSV)基因组、细小病毒基因组、塞内加谷病毒基因组、马拉巴病毒基因组或感冒病毒基因组。
61.一种病毒粒子，其包括根据权利要求59或权利要求60所述的工程化的病毒基因组。
62.一种刺激细胞群中的细胞-特异性事件的方法，其包括以根据权利要求2-32的任一项所述的连续多核酸分子、根据权利要求33所述的载体、根据权利要求34或权利要求35所述的工程化的病毒基因组或根据权利要求36所述的病毒粒子接触细胞群，其中细胞-特异性事件通过以下调节：
(i)结合和反式激活至少一个盒的调节组件的内源转录因子；和/或
(ii)启动子片段的转录活性；和/或
(iii)补充至少一个盒的响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA。
63.一种刺激细胞群中细胞-特异性响应的方法，其包括以根据权利要求37-57的任一项所述的连续多核酸分子、根据权利要求58所述的载体、根据权利要求59或权利要求60所述的工程化的病毒基因组或根据权利要求61所述的病毒粒子接触细胞群，其中细胞-特异性事件通过以下调节：
(i)结合和反式激活至少一个盒的5’调节组件的转录因子响应元件的内源转录因子；和/或
(ii)启动子片段的转录活性；和/或
(iii)补充至少一个盒的3’响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述细胞群包括至少一种靶细胞和至少一种非靶细胞，其中靶细胞和非靶细胞区别在于：
(i)结合和反式激活至少一个盒的调节组件的内源转录因子的蛋白质水平或活性；和/或
(ii)启动子片段的转录活性；和/或
(iii)补充至少一个盒的响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA的RNA水平或活性；和
其中不同的(i)中蛋白质水平或活性和/或(ii)中启动子片段的转录活性和/或(iii)中RNA水平或活性导致靶细胞和非靶细胞在至少一个盒的响应组件的输出的表达水平不同，从而刺激细胞-特异性事件。
65.根据权利要求64所述的方法，其中细胞群包括至少一种靶细胞和至少一种非靶细胞，其中靶细胞和非靶细胞区别在于：
(i)结合和反式激活至少一个盒的5’调节组件的转录因子响应元件的内源转录因子的蛋白质水平或活性：和/或
(ii)启动子片段的转录活性；和/或
(iii)补充至少一个盒的3’响应组件的microRNA靶位点的至少一种内源microRNA的RNA水平或活性；和
其中不同的(i)中蛋白质水平或活性和/或(ii)中启动子片段的转录活性和/或(iii)中RNA水平或活性导致靶细胞和非靶细胞在至少一个盒的3’响应组件的输出的表达水平不同，从而刺激细胞-特异性事件。
66.根据权利要求64或权利要求65所述的方法，其中靶细胞类型和非靶细胞类型之间的3’响应组件的输出的表达水平的差异为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。
67.根据权利要求64-66的任一项所述的方法，其中靶细胞群的细胞是肿瘤细胞，并且细胞-特异性事件是细胞死亡。
68.根据权利要求67所述的方法，其中肿瘤细胞死亡由通过激活受体配体、特异性抗原、刺激细胞因子或其任何组合的表达的免疫靶向来介导。
69.根据权利要求64-66的任一项所述的方法，其中靶细胞群的细胞是衰老细胞，并且细胞-特异性事件是细胞死亡。
70.根据权利要求67-69的任一项所述的方法，其进一步包括以通过输出代谢为治疗化合物或有毒化合物的前药或无毒前体化合物接触细胞群。
71.根据权利要求64-66的任一项所述的方法，其中靶细胞群的细胞不同地表达相对于相同类型的野生型细胞的因子，并且细胞-特异性事件是调节因子的表达水平。
72.根据权利要求64-66的任一项所述的方法，其中输出表达确保靶细胞群的生存，同时由于输出表达的缺乏和在无关和非特异性细胞死亡-诱导剂存在的情况下消除非靶细胞。
73.根据权利要求64-66的任一项所述的方法，其中靶细胞群的细胞包括感兴趣的特定表型，使得输出表达限于该特定表型的细胞。
74.根据权利要求64-66的任一项所述的方法，其中靶细胞群的细胞是选择的细胞类型，并且细胞-特异性事件是通过在选择的细胞类型中天然地不存在或无活性的基因的表达来编码新的功能。
75.根据权利要求62-74的任一项所述的方法，其中细胞群包括多细胞生物体。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述多细胞生物体是动物。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述动物是人。
78.根据权利要求62-77的任一项所述的方法，其中离体接触细胞群。
79.根据权利要求62-77的任一项所述的方法，其中体内接触细胞群。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862744173P | 2018-10-11 | 2018-10-11 | |
| US62/744,173 | 2018-10-11 | ||
| PCT/IB2019/001100 WO2020074956A2 (en) | 2018-10-11 | 2019-10-10 | A method to treat disease using a nucleic acid vector encoding a highly compact multi-input logic gate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112823209A true CN112823209A (zh) | 2021-05-18 |
Family
ID=68654816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980066858.9A Pending CN112823209A (zh) | 2018-10-11 | 2019-10-10 | 使用编码高度紧凑的多输入逻辑门的核酸载体治疗疾病的方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
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