JP2022513347A - 高度にコンパクトな多入力論理ゲートをコードする核酸ベクターを使用して疾患を処置する方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に開示されるのは、正確なin vivoの細胞ターゲティングのための高度にコンパクトな多入力遺伝論理ゲートをコードする連続的なＤＮＡ配列、および、in vivo送達とかかる連続的なＤＮＡ配列との組み合わせを使用して疾患を処置する方法である。

Description

分野
本明細書に開示されるのは、正確なin vivoの細胞ターゲティングのための高度にコンパクトな多入力遺伝論理ゲートをコードする連続的な（contiguous）ＤＮＡ配列、および、in vivo送達とかかる連続的なＤＮＡ配列との組み合わせを使用して疾患を処置する方法である。

背景
遺伝子治療は、遺伝病およびがんのための次世代の治療選択肢として増えつつある。しかしながら、現在の遺伝子治療ベクターは、低い効き目、高い毒性、および、治療上の手がかり（therapeutic leads）を生成するための長い開発タイムラインに悩まされている。これらの欠点の一つの理由は、遺伝子治療ベクターにおける治療遺伝子発現の厳密な管理の不十分さであり、これは、（ｉ）意図しない細胞型および組織においてのまたは（ｉｉ）不十分か高すぎるかのいずれかの投薬量での遺伝子発現に導く。換言すれば、遺伝子産物投薬量（すなわち、細胞あたりのタンパク質分子の数）と細胞型に制限的な発現との両方の面での遺伝子発現の正確なコントロールは、依然として、遺伝子治療における取り組む余地のある難題のまま残っている。

多機能細胞プローブに必要な複数のコンポーネントを含む連続的なＤＮＡ分子（contiguous DNA molecules）を操作し、適切な治療作用を生成することは、元々の構築ブロックが部分的に既知であるときでさえも極めて困難な課題である。この開示は、複数の転写因子および／またはプロモーター活性、および任意にマイクロＲＮＡ機能を、同時にプローブすることが可能な、複雑な多入力遺伝論理回路をコードする連続的なＤＮＡ分子を操作するためのアプローチを記載する。これを踏まえ、連続的な分子は、低いパッケージング容量であるが高い治療的価値を持つベクター（例として、ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス)、非複製型および複製型ウイルスを包含する多岐にわたるウイルスベクター、ならびに非ウイルス送達ベクターにおける実施に適している。その結果もたらされるウイルスおよび非ウイルス送達ベクターは、in vivoおよびin vitroの両方において、特異的な細胞型または細胞状態を選択的に標的とすることに使用され、および治療法として使用されることができる。

いくつかの側面において、本開示は、少なくとも２つのカセットをコードする連続的なポリ核酸分子であって、各カセットは、制御成分および応答成分を含む、連続的なポリ核酸分子に関する。

いくつかの態様において、（ｉ）少なくとも１つのカセットは、トランス活性化因子応答要素を含む５’制御成分、およびアウトプットを含む３’応答成分を含み；および（ｉｉ）少なくとも１つのカセットは、５’制御成分、およびトランス活性化因子タンパク質をコードする核酸配列を含む３’応答成分を含み；およびここで、（ｉｉ）のトランス活性化因子は、タンパク質として発現したときに（ｉ）のトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。
いくつかの態様において、トランス活性化因子は、独立してトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。

いくつかの態様において、（ｉ）におけるカセットの５’制御成分は、転写因子応答要素および／または最小プロモーターをさらに含む。他の態様において、トランス活性化因子は、転写因子応答要素に結合した転写因子の存在下でのみトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。

いくつかの態様において、５’制御成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子応答要素、転写因子応答要素、および最小プロモーターを含む。いくつかの態様において、５’制御成分は、５’から３’へ、転写因子応答要素、トランス活性化因子応答要素、および最小プロモーターを含む。

いくつかの態様において、（ｉ）における５’制御成分は、プロモーター要素をさらに含む。いくつかの態様において、プロモーター要素は、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、５’制御成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子応答成分およびプロモーター要素、および任意に最小プロモーターを含む。

いくつかの態様において、（ｉｉ）におけるカセットの５’制御成分は、プロモーター要素を含む。いくつかの態様において、プロモーター要素は、転写因子応答要素および最小プロモーターを含み、任意に、転写因子応答要素は唯一のものである。いくつかの態様において、プロモーター要素は、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメント、および任意に最小プロモーターを含む。

いくつかの態様において、（ｉ）の少なくとも１つのカセットと（ｉｉ）の少なくとも１つのカセットとは、収斂（convergent）配向である。いくつかの態様において、（ｉ）の少なくとも１つのカセットと（ｉｉ）の少なくとも１つのカセットとは、発散（divergent）配向である。いくつかの態様において、（ｉ）の少なくとも１つのカセットと（ｉｉ）の少なくとも１つのカセットとは、ヘッドトゥーテール配向である。

いくつかの態様において、（ｉ）におけるカセットの３’応答成分は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、アウトプットに対し３’側である。いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、アウトプットに対し５’側であるかまたはアウトプット内にある。

いくつかの態様において、（ｉｉ）におけるカセットは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、トランス活性化因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対し３’側である。いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、トランス活性化因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対し５’側であるかまたはトランス活性化因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列内にある。

いくつかの態様において、（ｉ）におけるカセットの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位と（ｉｉ）におけるカセットの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位とは、同じ核酸配列であるか、または、同じマイクロＲＮＡによって制御される異なる配列である。

いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットは、インスレーターに隣接している。
いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットのトランス活性化因子は、tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16、またはNarLc-RelAである。

いくつかの態様において、アウトプットは、タンパク質またはＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、アウトプットは、治療剤である。いくつかの態様において、アウトプットは、蛍光タンパク質、細胞毒素、プロドラッグの活性化を触媒する酵素、免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡ修飾因子、細胞表面受容体、遺伝子発現制御因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／または、ベクター複製のために必要とされる因子である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡは、サイトカインまたはコロニー刺激因子である。

いくつかの態様において、ＤＮＡ修飾因子は、遺伝的欠陥を修正することを意図したタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡ修飾酵素、および／またはＤＮＡ修飾系の成分である。いくつかの態様において、ＤＮＡ修飾酵素は、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、または、CRISPR/Cas ＤＮＡ修飾系のタンパク質成分である。いくつかの態様において、遺伝子発現制御因子は、遺伝子発現を制御することが可能なタンパク質か、または遺伝子発現を制御することが可能な多成分系の成分である。

いくつかの側面において、本開示は、少なくとも１つのカセットをコードする連続的なポリ核酸分子に関し、ここでカセットは、（ｉ）トランス活性化因子応答要素を含む５’制御成分；および、（ｉｉ）アウトプット、トランス活性化因子、および任意であるポリシストロニック発現要素を含む３’応答成分、ここで、アウトプットとトランス活性化因子とは任意にポリシストロニック発現要素によって分離されている、を含み；ここで、応答成分の転写は、単一ｍＲＮＡを生成し；およびここで、（ｉｉ）のトランス活性化因子は、タンパク質として発現したときに（ｉ）のトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。

いくつかの態様において、トランス活性化因子は、独立してトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。
いくつかの態様において、（ｉ）における５’制御成分は、転写因子応答要素および／または最小プロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、トランス活性化因子は、転写因子応答要素に結合した転写因子の存在下でのみトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。

いくつかの態様において、５’制御成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子応答要素、転写因子応答要素、および最小プロモーターを含む。いくつかの態様において、５’制御成分は、５’から３’へ、転写因子応答要素、トランス活性化因子応答要素、および最小プロモーターを含む。

いくつかの態様において、（ｉ）における５’制御成分は、プロモーター要素をさらに含む。いくつかの態様において、プロモーター要素は、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。いくつかの態様において、（ｉ）における５’制御成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子応答成分およびプロモーター要素を含む。

いくつかの態様において、（ｉｉ）の３’応答成分は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、アウトプットおよび／またはトランス活性化因子に対し３’側である。いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、アウトプットおよび／またはトランス活性化因子に対し５’側であるかまたはアウトプットおよび／またはトランス活性化因子の内部にある。

いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットは、インスレーターに隣接している。
いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットのトランス活性化因子は、tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16、またはNarLc-RelAである。

いくつかの態様において、アウトプットは、タンパク質またはＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、アウトプットは、治療用タンパク質またはＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、アウトプットは、蛍光タンパク質、細胞毒素、プロドラッグの活性化を触媒する酵素、免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡ修飾因子、細胞表面受容体、遺伝子発現制御因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／または、ベクター複製のために必要とされる因子である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡは、サイトカインまたはコロニー刺激因子である。

いくつかの態様において、ＤＮＡ修飾因子は、遺伝的欠陥を修正することを意図したタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡ修飾酵素、および／またはＤＮＡ修飾系の成分である。いくつかの態様において、ＤＮＡ修飾酵素は、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、または、CRISPR/Cas ＤＮＡ修飾系のタンパク質成分である。いくつかの態様において、遺伝子発現制御因子は、遺伝子発現を制御することが可能なタンパク質か、または遺伝子発現を制御することが可能な多成分系の成分である。

いくつかの側面において、本開示は、上に記載したとおりの連続的なポリ核酸分子を含むベクターに関する。

いくつかの側面において、本開示は、上に記載したとおりの連続的なポリ核酸分子を含む操作されたウイルスゲノムに関する。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム、レンチウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、麻疹ウイルスゲノム、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノム、パルボウイルスゲノム、セネカバレーウイルスゲノム、マラバウイルスゲノム、または一般的な風邪ウイルスゲノムである。

いくつかの側面において、本開示は、上に記載したとおりの操作されたウイルスゲノムを含むビリオンに関する。
いくつかの側面において、本開示は、細胞の集団において細胞特異的イベントを刺激する方法に関する。いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、上に記載したとおりの連続的なポリ核酸分子、上に記載したとおりのベクター、上に記載したとおりの操作されたウイルスゲノム、または上に記載したとおりのビリオンと接触させることを含む。

いくつかの態様において、細胞特異的イベントは、少なくとも１つのカセットの制御成分に結合し、および該成分をトランス活性化する内因性転写因子；および／またはプロモーターフラグメントの転写活性；および／または少なくとも１つのカセットの応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡ；によって制御されるか、あるいは、少なくとも１つのカセットの５’制御成分の転写因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する内因性転写因子；および／またはプロモーターフラグメントの転写活性；および／または少なくとも１つのカセットの３’応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡ；によって制御される。

いくつかの態様において、細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞および少なくとも１つの非標的細胞を含む。
いくつかの態様において、標的細胞と非標的細胞とは、（ｉ）少なくとも１つのカセットの制御成分に結合し、および該成分をトランス活性化する内因性転写因子のタンパク質レベルまたは活性；および／または（ｉｉ）プロモーターフラグメントの転写活性；および／または（ｉｉｉ）少なくとも１つのカセットの応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡのＲＮＡレベルまたは活性；の点で異なり、およびここで、その異なる（ｉ）におけるタンパク質レベルまたは活性、および／または（ｉｉ）におけるプロモーターフラグメントの転写活性、および／または（ｉｉｉ）におけるＲＮＡレベルまたは活性は、標的細胞と非標的細胞とを、少なくとも１つのカセットの応答成分のアウトプットの発現レベルの点で異なるようにさせ、それによって細胞特異的イベントを刺激する。

いくつかの態様において、標的細胞と非標的細胞とは、（ｉ）少なくとも１つのカセットの５’制御成分の転写因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する内因性転写因子のタンパク質レベルまたは活性；および／または（ｉｉ）プロモーターフラグメントの転写活性；および／または（ｉｉｉ）少なくとも１つのカセットの３’応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡのＲＮＡレベル；の点で異なり、およびここで、その異なる（ｉ）におけるタンパク質レベル、および／または（ｉｉ）におけるプロモーターフラグメントの転写活性、および／または（ｉｉｉ）におけるＲＮＡレベルは、標的細胞と非標的細胞とを、少なくとも１つのカセットの３’応答成分のアウトプットの発現レベルの点で異なるようにさせ、それによって細胞特異的イベントを刺激する。

いくつかの態様において、３’応答成分のアウトプットの発現レベルは、標的細胞型と非標的細胞型との間で、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００または少なくとも１０，０００倍異なる。
いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、腫瘍細胞であり、および細胞特異的イベントは、細胞死である。いくつかの態様において、腫瘍細胞死は、腫瘍細胞死が、活性化受容体リガンド、特異的抗原、刺激サイトカイン、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を通じた免疫ターゲティングに媒介される。

いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、老化細胞であり、および、細胞特異的イベントは、細胞死である。
いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、プロドラッグと、またはアウトプットによって治療剤もしくは毒性化合物へと代謝される非毒性の前駆体化合物と、接触させることをさらに含む。

いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、同型の野生型細胞に対して相対的に因子を差次的に発現し、および、細胞特異的イベントは、因子の発現レベルを調節することである。
いくつかの態様において、アウトプット発現は、標的細胞集団の生存を確保し、一方、アウトプット発現の欠如に起因しておよび無関係かつ非特異的な細胞死誘発剤の存在下で非標的細胞が排除される。

いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、対象の特定の表現型を、アウトプット発現がこの特定の表現型の細胞に限定されるように含む。
いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、選ばれた細胞型であり、および、細胞特異的イベントは、選ばれた細胞型において自然には存在しないかまたは不活性である遺伝子の発現を通じた新規な機能をコードすることである。

いくつかの態様において、細胞の集団は、多細胞生物を含む。いくつかの態様において、多細胞生物は、動物である。いくつかの態様において、動物は、ヒトである。
いくつかの態様において、細胞の集団は、ex-vivoで接触させられる。いくつかの態様において、細胞の集団は、in-vivoで接触させられる。

図面の簡単な説明
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本明細書に提示される具体的な態様と組み合わせてのこれらの図面の１つ以上への参照によってよりよく理解され得る本開示のある側面をさらに実証するために包含される。図面に例証されているデータは、いかなるあり方でも本開示の範囲を限定するものではないということが理解されるべきである。

図１Ａ－１Ｂ。図１Ａ。本明細書に記載される連続的なＤＮＡ分子において実施することができる遺伝的相互作用の種々のオプションを表す概観。細いバーと太い注釈付き特徴部は、種々の機能的ＤＮＡにコードされたビルディングブロックを表す。ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）およびタンパク質成分のみがはっきりと示されている。尖っていない矢印は、マイクロＲＮＡによる遺伝子発現の抑制を表し、これは、ｍＲＮＡレベルで起こる。ｍＲＮＡは、はっきりと示されないが、しかし、ＤＮＡ配列の一部としてのＴ－ＸおよびＴ－ＹなどのマイクロＲＮＡ標的の存在はまた、転写されるｍＲＮＡにおけるこの同じ標的の存在に導くということも暗示され、これは次いでｍｉＲＮＡインプットにより標的とされる。先が白抜きの矢印は、遺伝子発現の活性化を示す。先が完全な矢印は、遺伝子発現（ＤＮＡからタンパク質への直接的な移行として示され、ｍＲＮＡ中間体は示されない）を表示する。略語は次のとおりである： ＴＦ－Ａ：任意転写因子Ａ； ＴＦ－Ｂ：任意転写因子Ｂ； ｍｉＲ－Ｘ：任意マイクロＲＮＡ Ｘ； ｍｉＲ－Ｙ：任意マイクロＲＮＡ Ｙ； Ｔ－Ｘ：ｍｉＲ－Ｘにより標的とされる配列； Ｔ－Ｙ：ｍｉＲ－Ｙにより標的とされる配列； ＴＦ－Ａ－ＲＥ：任意転写因子Ａによって認識される応答； ＴＦ－Ｂ－ＲＥ：任意転写因子に対する応答要素Ｂ； ＡＡ：補助トランス活性化因子タンパク質； ＡＡ－ＲＥ：補助トランス活性化因子によって認識される応答要素； Ｐｍｉｎ：低い内因性の漏れ（low intrinsic leakage）を伴う最小プロモーター； アウトプット：任意タンパク質またはＲＮＡのコード遺伝子； ＰＲ－Ｅ：任意プロモーターまたはプロモーターフラグメント。図１Ｂ。オプション３ａおよび３ｂに従うマイクロＲＮＡ標的の存在は、アウトプット発現の極めて強い下方制御、つまり１００倍超の抑制を、結果的にもたらした。Ctr miRは、「対照」ｍｉＲＮＡの略であり、miR-424またはmiR-126標的のいずれに対しても効果を引き出さないｍｉＲＮＡ配列である。各グルーピングにおける左のバーは、miR-424標的配列を含有するアウトプット遺伝子を表示し、および、各グルーピングにおける右のバーは、miR-126標的を含有するアウトプット遺伝子を表す。

図２。連続的なＤＮＡ構造バリアント。連続的なＤＮＡ分子において実施されたものとして、図１Ａ中のものと同様に遺伝子回路が描かれている。 各構造バリアントは、異なる多入力プログラムを表し；発散および収斂構成が示される。略語は次のとおりである： ウイルス配列Ｌ：ウイルスベクターに特異的であり、かつ、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、長い末端反復（ＬＴＲ）、Psi配列、パッケージングシグナル、腫瘍溶解性ベクターの場合におけるウイルス複製およびパッケージングのために要求される遺伝子、等々を包含する、遺伝子回路ペイロードに無関係なベクター中にある必要がある、何らかの配列； ウイルス配列Ｒ：ウイルス配列Ｌと同じであるが、しかし連続的なＤＮＡカセットに右から隣接する； ポリＡ：ポリアデニル化配列、および遺伝子の３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）； Rep遺伝子：ウイルスベクター複製をトリガーするベクター特異的遺伝子（単数または複数）; ＴＦ－Ａ：任意転写因子 Ａ； ＴＦ－Ｂ：任意転写因子 Ｂ； ｍｉＲ－Ｘ：任意マイクロＲＮＡ Ｘ； ｍｉＲ－Ｙ：任意マイクロＲＮＡ Ｙ； Ｔ－Ｘ：ｍｉＲ－Ｘにより標的とされる配列； Ｔ－Ｙ：ｍｉＲ－Ｙにより標的とされる配列； ＴＦ－Ａ－ＲＥ：任意転写因子に対する応答要素Ａ； ＴＦ－Ｂ－ＲＥ：任意転写因子に対する応答要素Ｂ； ＡＡ：補助トランス活性化因子タンパク質； ＡＡ－ＲＥ：補助トランス活性化因子に結合する応答要素； Ｐｍｉｎ：低い内因性の漏れを伴う最小プロモーター； アウトプット：任意タンパク質またはＲＮＡのコード遺伝子； ＰＲ－Ｅ：任意プロモーターまたはプロモーターフラグメント。

図３Ａ－３Ｂ。図３Ａ。アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）に対し適合性がある具体的な実施。マイクロＲＮＡ標的なしで、または図中に表示されたマイクロＲＮＡ標的とともに、のいずれかで、発散および収斂バリアントを構築した。２つの異なる補助トランス活性化因子（PIT-RelA融合物およびPIT-VP16融合物）を使用した。連続的なＤＮＡコンストラクトは、ＡＡＶビリオンにおけるパッキングに必要とされるＡＡＶ２ ＩＴＲ（逆方向末端反復）で両側から挟まれている。図３Ｂ。Huh-7細胞における収斂および発散バリアント間の比較。ＤＮＡ分子を細胞中へと一過性にトランスフェクトしたときにmCherry蛍光を測定した。左の２本のバーは、ｍｉＲＮＡ標的なしでの収斂および発散バリアントを比較する。それらは、同程度のアウトプット発現レベルを示した。右の２本のバーは、ｍｉＲＮＡ標的T-miR-424を包含する発散および収斂バリアントを比較する。発散バリアントは収斂バリアントに対し大幅に改善した遺伝子発現を明らかに示した。

図４Ａ－４Ｂ。現在の開示に従って遺伝子回路を実施したＡＡＶビリオンの実証。図４Ａ。構築されている４つの異なる連続的なＤＮＡカセットの概観。異なるＤＮＡカセットを含有するビリオンが、カセット中に埋め込まれたｍｉＲＮＡ標的に従って影付きで表示される（標的なし；miR-126標的；miR-424標的；miR-122標的。ビリオンを含有するmiR-122標的に関するデータは図６Ａ～６Ｂおよび図７Ａ～７Ｃにのみ示されているということに留意)。ＤＮＡペイロードは、論理機構「アウトプット」～Sox9/10 AND Hnf1A/B AND NOT(MiR-X)、ここでX=126または424または122、を実施する；標的が存在しないとき、ＤＮＡペイロードは機構「アウトプット」～Sox9/10 AND Hnf1A/Bを実施する。以下の異なる２つのアウトプットがある：mCherry蛍光レポーター、および、細胞死に導く毒性の生成物に非毒性のプロドラッグガンシクロビルを変換する酵素ＨＳＶ－ＴＫ（チミジンキナーゼ）。棒グラフは、夫々のＤＮＡペイロード（回路ベクター、左から右へ: HNF1A/B AND SOX9/10、HNF1A/B AND SOX9/10 AND NOT(mir-126)、HNF1A/B AND SOX9/10 AND NOT(mir-424)）を抱えるビリオンに感染させた種々の細胞株（各グルーピングにおいて左から右へ：HepG2、Huh7、HCT-116、Hela）において測定されたmCherry発現を示す。細胞株HepG2およびHuh7は、miRN-126またはmiR-424のいずれの発現もなしで、高レベルのSox9/10およびHNF1A/Bを発現し、およびしたがって高いアウトプット発現を結果的にもたらすことが予測された。細胞株HCT-116およびHeLaはSox9/10またはHNF1A/Bのいずれも発現せず、およびしたがって極めて低いアウトプット発現を結果的にもたらすことが予測された。データは、実に、予測に一致して、ビリオンが、細胞株HepG2およびHuh-7における極めて強いmCherry発現、および細胞株HeLaおよびHCT-116における１０００倍近く低い発現を引き起こしたということを示した。図４Ｂ。右にある概観は、アウトプットをコントロールし、および、Sox9/10およびHNF1A/Bの両方が高度に発現しかつｍｉＲＮＡが発現していないときに細胞死に導く、論理プログラムを示す。左にある棒グラフは、予測されたとおり、HepG2細胞（各グルーピングにおける左のバー）に３タイプのビリオンを感染させたときの強い細胞死、およびHeLa細胞の無視できる程度の細胞死（各グルーピングにおける右のバー）を示す。回路ベクター、左から右：HNF1A/B AND SOX9/10、HNF1A/B AND SOX9/10 AND NOT(mir-126)、HNF1A/B AND SOX9/10 AND NOT(mir-424)。「構成的cherry」とラベル付けされた２本のバーは、細胞がＡＡＶ感染によってではなくしかし毒性のアウトプットを介して殺されたということを示す。中央の棒グラフは、構成的に発現したＨＳＶ－ＴＫによって両方の細胞株（左：HepG2； 右：Hela）が殺されており、したがって差次的な効果は遺伝子回路ペイロードに起因するということを示す。

図５Ａ－５Ｃ。レンチウイルスベクターにおける態様の１つの実施。図５Ａ。連続的なＤＮＡカセットの概観。２対の異なるインスレーターのペアならびにインスレーターなしの構造を実施した。 図５Ｂ。高いアウトプット発現を結果的にもたらすことが予測された２つの細胞株（HuH-7およびHepG2）および高い発現に導くとは予測されない細胞株HCT-116の２つの細胞株における蛍光アウトプットの発現。一般に、結果は予測と一致していた。インスレーターのペアＡ１／Ａ３は、意図された細胞株における高いアウトプット発現と「ネガティブ」細胞株における低い発現との良い組み合わせを示した。バーの各セットについて： 左、なし； 中央、Ａ１／Ａ３； 右、Ｆ１／Ｃ３。図５Ｃ。ポジティブおよびネガティブ細胞株におけるこれらの統合されたベクターから得られたアウトプット発現の経時変化。インスレーターのペアＡ１／Ａ３を使用したコンストラクトで６０日間にわたって良好な発現安定性が観察された。上のライン：Huh7； 中央のライン：HepG2； 下のライン：HCT-116。

図６Ａ－図６Ｂ。連続的なＤＮＡカセットを抱えるビリオンによるin vivoでの特異的細胞ターゲティングの実証。図６Ａ。連続的なＤＮＡカセット（図４Ａ～４Ｂもまた参照）の、概略的な概説された構造。遺伝子回路によって実施されたプログラムは、HNF1A/B AND Sox9/10 AND NOT(miR-122)である。これは、肝臓におけるmiR-122の高い発現に起因して、HepG2腫瘍細胞における高い発現およびマウス肝臓における低い発現を結果的にもたらすと予測された。AAV-DJビリオンを、これらの連続的なカセットを用いて生成した。これに加えて、miRNA-122標的なしで連続的なカセットを生成した。両方の連続的なカセット分子は、mCherryアウトプットを生成し、および、細胞ターゲティング特異性を査定する役割を果たす。実験ワークフローは、ＤＮＡスキーム下に例示される。

マウスに、ルシフェラーゼおよびＹＦＰ修飾ＨｅｐＧ２がん細胞を脾臓中へと注射した。細胞は肝臓へ伝播し、肝臓がんの臨床初見に似た複数の腫瘍病巣を形成する。腫瘍が確立した後、ビリオンを、尾静脈を介して全身的に注射した。数日後、動物を安楽死させ、および、肝組織ならびに埋め込まれた腫瘍をmCherryアウトプットタンパク質の発現について試験した。腫瘍細胞を表す「イエロー」シグナルが回路アウトプットを表す「mCherry」シグナルとともに共局在化しているときに、特異的な発現が達成される。代表的な新鮮な肝臓薄片から顕微鏡スナップショットを撮った。画像は、上から下へ、薄片の位相差画像；腫瘍の位置；およびベクターアウトプットの発現を示す。左から右へ、構成的mCherry発現を伴うベクター；プログラムHNF1A/B AND Sox9/10を実施するベクター；およびプログラムHNF1A/B AND Sox9/10 AND NOT(miR-122)を実施するベクター。後者の２つのベクターは、それらの連続的なＤＮＡペイロードにおいて発散配向を実施する。

図７Ａ－７Ｃ。遺伝子回路を保有するウイルスベクターの抗がん効能の実証。図７Ａ。図６Ａに示される連続的なＤＮＡカセットを、アウトプットとしてＨＳＶ－ＴＫ酵素をコードする遺伝子を含有するように修飾した。図７Ａ－７Ｂ。腫瘍を、図６Ｂにおける記載と似たように、マウス肝臓において確立させた。AAV-DJ型のベクターを尾静脈に２回全身注射して；ＧＣＶ投与を最初の注射の３日後に開始し、次の１５日間１日１回行った。

図７Ｂ。終了の時点での、全器官生物発光によって査定した全肝における腫瘍負荷を示すプロット。３つの群は、ウイルスベクター単独を注射したマウス、ＧＣＶ単独で処置したもの、および、ウイルス注射およびＧＣＶの組み合わせで処置したものを包含する。後者の群においてのみ、対照と比較して腫瘍サイズが大きく低減した。右にある画像が、この主張を立証する。図７Ｃ。「全肝生物発光」という欄は、死後の全肝からの発光シグナルを示す。第２のカラムは、代表的な肝臓薄片の位相画像を示している。第３のカラムは、腫瘍病巣を表示するシグナルを伴う、新鮮な肝臓の代表的な薄片を示す。予測されたとおり、ウイルスベクターで処置されたマウスおよびＧＣＶで処置されたマウスのみが、大きく低減された腫瘍負荷を呈した。

詳細な説明
分類器遺伝子回路（classifier gene circuits）は、プログラム可能なルールに従い、特異的な細胞質分子特徴の組み合わせを特異的な細胞応答へと形質導入すること、例えば、ある分子が不在であるかまたは存在するような細胞においてのみ遺伝子を活性化させること、が可能である人工的な遺伝子ネットワークまたは回路（操作された相互作用する遺伝子および遺伝要素のセット）である（Xie Z. et al., Science. 2011 Sep 2; 333(6047): 1307-11; Benenson Y., Nat. Rev. Genet. 2012 Jun 12; 13(7): 455-468）。細胞挙動を正確にコントロールする能力は、研究、バイオテクノロジーおよびバイオ医学への応用について大いに有望である。

しかしながら、治療的応用のためのこの技術の潜在性は、治療的に関係のある作用を実施するために要求される遺伝回路のサイズおよび複雑度によって、およびかかる回路はウイルスベクターおよび操作された細胞などの治療的に受け入れられているモダリティとは元来は適合性がないという事実によって、妨害されている。その代わりに、全てではなくともほとんどの、分類器回路についての報告は、医学的実用化の潜在性があるウイルス担体によってよりもむしろ一過性のトランスフェクションを使用して培養細胞へ送達されるプラスミドのセットを開示している。

実に、これらの開発の医学的な転換は、in vivoでの体細胞への効率的なＤＮＡ送達を要求し、これは現在、投与ルート、標的とされる組織、および他の具体的な要件に基づいて選択される、特殊化されたウイルスベクター、および次第に、非ウイルス送達ベクターの助けで、実施されている。既存の分類器回路技術をこれらのベクターと組み合わせることは、重大な難題のまま残っている。具体的な細胞ターゲティングのために要求される回路複雑度（入力特徴の数および回路遺伝子の数）が増加するにつれて、ウイルス担体中への回路パッケージングは、少なくとも２つの理由のために徐々に難しくなる。

第一に、あらゆるウイルス送達ビヒクルは限られたカーゴ容量を有し、これは対象の回路機能性および治療的アウトプットのために要求される全ての遺伝成分を収容することを困難にする。同じように、非ウイルスベクターのパフォーマンスは、ＤＮＡとパッケージング物質との間に形成される粒子複合体の増加するサイズに起因してＤＮＡサイズが増加するにつれて、劣化し得る。

第二に、コンテクスト効果（context effect）（例として、転写リードスルー、プロモーターコンテクスト、ジャンクション組成）のリスクは、同じベクター上の独立した転写ユニットの数とともに増加する。コンテクスト効果は予想することが難しく、および回路パフォーマンスに影響を及ぼす可能性があり、または総合的には、予測される挙動を変える可能性さえある。

本明細書に開示されるのは、普通に使用される遺伝子治療ウイルスおよび非ウイルスベクターに対して適合性がある、分類器遺伝子回路をコードする連続的なポリ核酸分子である（図１）。本明細書に開示されるのはまた、細胞の集団での対象の遺伝子の発現に対して複雑な多入力制御（multi-input control）を実施する方法である。

連続的なポリ核酸分子の組成
いくつかの側面において、本開示は、少なくとも１つの発現カセットを含む連続的なポリ核酸分子に関する。本明細書に使用されるとき、用語「連続的なポリ核酸分子」は、単一の一続きの（continuous）核酸分子（すなわち、各発現カセットが単一のポリ核酸分子上にコードされる）、または２つの相補的な一続きの核酸分子（すなわち、各発現カセットが２つの相補鎖を含む二本鎖ポリ核酸分子上にコードされる）を指す。いくつかの態様において、連続的なポリ核酸は、ＲＮＡ（例として、一本鎖または二本鎖の）である。いくつかの態様において、連続的なポリ核酸は、ＤＮＡ（例として、一本鎖または二本鎖の）である。いくつかの態様において、連続的なポリ核酸は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドである。

いくつかの態様において、連続的なポリ核酸分子は、少なくとも２つのカセットを含む。いくつかの態様において、２つのカセットは、発散配向である。用語「発散配向」は、本明細書に使用されるとき、以下の構成を指す：（ｉ）第１のカセットおよび第２のカセットの転写が、連続的なポリ核酸分子の異なる鎖上で進行し、かつ（ｉｉ）第１のカセットの転写が第２のカセットから離れる方向へ向かい、かつ第２のカセットの転写が第１のカセットから離れる方向へ向かう。図２は、種々の発散の構成の例を提供する。

いくつかの態様において、２つのカセットは、収斂配向である。本明細書に使用されるとき、用語「収斂配向」は、以下の構成を指す：（ｉ）第１のカセットおよび第２のカセットの転写が、連続的なポリ核酸分子の異なる鎖上で進行し、かつ（ｉｉ）第１のカセットの転写が第２のカセットの方向へ向かい、かつ第２のカセットの転写が第１のカセットの方向へ向かう。いくつかの態様において、２つの収斂カセットは、ポリアデニル化配列を共通に持つ。図２は、種々の収斂の構成の例を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つのカセットは、ヘッドトゥーテール配向である。本明細書に使用されるとき、用語「ヘッドトゥーテール」は、以下の構成を指す：（ｉ）第１のカセットおよび第２のカセットの転写または翻訳が、連続的なポリ核酸分子の同じ鎖上で進行し、かつ（ｉｉ）第１のカセットの転写または翻訳が第２のカセットの方向へ向かい、かつ第２のカセットの転写または翻訳が第１のカセットから離れる方向へ向かう（５’…→…→…３’）。

本明細書に使用されるとき、用語「発現カセット」または「カセット」は、 同義的に使用され、少なくとも１つの制御成分および少なくとも１つの応答成分を含むポリ酢酸を指し、ここで、制御成分は、応答成分の転写、応答成分のＲＮＡレベル、および／または応答成分からのタンパク質生成を調節する。

いくつかの態様において、連続的なポリ核酸分子の少なくとも１つのカセットは、インスレーターに隣接している。インスレーターは、インスレーター結合タンパク質によって結合されたときに、制御成分または応答成分を他の近くの制御要素の効果から守る核酸配列である。例えば、連続的なポリ核酸分子に隣接することで、各カセットを他のカセットの制御要素の影響から守ることができる。インスレーターの例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られている。

制御成分
連続的なポリ核酸分子のカセットは、少なくとも１つの制御成分を含む。制御成分は、トランス活性化因子応答要素、転写因子応答要素、プロモーター要素、または最小プロモーターの１つ以上を含んでもよい。当該技術分野における知識を有する者は、これらの要素が種々の構成で配向されていてもよいということを当然理解する。例えば、トランス活性化因子応答要素が、プロモーター要素および／または転写因子応答要素に対し５’側または３’側であってもよく；転写因子応答要素が、プロモーター要素および／またはトランス活性化因子応答要素に対し５’側または３’側であってもよく；プロモーター要素が、転写因子応答要素および／またはトランス活性化因子応答要素に対し５’側または３’側であってもよい。

用語「トランス活性化因子」または「トランス活性化因子タンパク質」は、本明細書に使用されるとき、アウトプット（すなわち、対象の遺伝子）の発現をトランス活性化する、およびアウトプットをコードする核酸配列（すなわち、対象の遺伝子）に作動可能に連結（operably linked）されたトランス活性化因子応答要素に結合する、連続的なポリ核酸分子上に、コードされたタンパク質を指す。トランス活性化因子応答要素は、それがその配列の転写開始および／または発現をコントロール（「駆動（drive）」）すべく制御する核酸配列との関係で正しい機能位置および配向にあるとき、アウトプットをコードする核酸に「作動可能に連結」されている。いくつかの態様において、トランス活性化因子は、独立して（すなわち、あらゆる追加の因子の不在下で）トランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。他の態様において、トランス活性化因子は、転写因子応答要素に結合した転写因子の存在下でのみトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。

いくつかの態様において、トランス活性化因子タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、自然発生の配列とは区別されるＤＮＡ配列に結合するように操作される（すなわち、自然発生ではない）。ＤＮＡ結合ドメインの例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られており、および、ジンクフィンガー技術もしくはTALEN技術を使用したことに由来するまたは細菌からの２成分シグナリング経路の突然変異応答レギュレーターに由来するＤＮＡ結合ドメインを包含するが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、哺乳動物タンパク質に由来する。他の態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、非哺乳動物タンパク質に由来する。例えば、いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、細菌、酵母、または植物に起源を持つタンパク質に由来する。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、トランス活性化因子応答要素を標的とするための追加の成分（例として、タンパク質またはＲＮＡ）を要求する。例えば、いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、トランス活性化因子応答要素を標的とするためのガイドＲＮＡの追加の成分を要求するCRISPR/Casタンパク質（例として、Cas1、Cas2、Cas3、Cas5、Cas4、Cas6、Cas7、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、Csm2、Cmr5、Csx10、Csx11、Csf1、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3）のそれである。

いくつかの態様において、トランス活性化因子タンパク質は、自然発生の転写因子に由来し、ここで、自然発生の転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、突然変異しており、これは、野生型の転写因子に対して改変されたＤＮＡ結合特異性を結果的にもたらす。いくつかの態様において、トランス活性化因子は、自然発生の転写因子である。

いくつかの態様において、トランス活性化因子タンパク質は、トランス活性化ドメインをさらに含む（すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質）。本明細書に使用されるとき、用語「トランス活性化ドメイン」は、最小プロモーターへ転写機構を動員するように機能するタンパク質ドメインを指す。いくつかの態様において、トランス活性化ドメインは、独立して遺伝子活性化をトリガーしない。いくつかの態様において、トランス活性化ドメインは、自然発生のもの（naturally-occurring）である。他の態様において、トランス活性化ドメインは操作される。トランス活性化ドメインの例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られており、および、RelAトランス活性化ドメイン、VP16、VP48、およびVP64を包含するが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットのトランス活性化因子 は、tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16、またはNarLc-RelAである。例として、Angelici B. et al., Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537を参照のこと。

いくつかの態様において、制御成分は、トランス活性化因子応答要素を含む。「トランス活性化因子応答要素」は、トランス活性化因子タンパク質に結合しおよび認識される最小ＤＮＡ配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランス活性化因子応答要素は、トランス活性化因子タンパク質に結合しおよび認識される最小ＤＮＡ配列の１つよりも多いコピー（すなわち、反復）を含む。いくつかの態様において、トランス活性化因子応答要素は、トランス活性化因子タンパク質に結合しおよび認識される最小ＤＮＡ配列の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の反復を含む。

いくつかの態様において反復は、縦列反復（tandem repeats）である。いくつかの態様において、トランス活性化因子応答要素は、最小ＤＮＡ配列の組み合わせを含む。いくつかの態様において、最小ＤＮＡ配列には、スペーサー配列が散りばめられている。いくつかの態様において、スペーサー配列は、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０ヌクレオチド超である。

いくつかの態様において、制御成分は、転写因子応答要素を含む。用語「転写因子応答要素」は、転写因子に結合しおよび認識されるＤＮＡ配列を指す。本明細書に使用されるとき、用語「転写因子」は、遺伝子転写を調節する連続的なポリ核酸上にコードされないタンパク質を指す。いくつかの態様において、転写因子は、転写活性化因子である（すなわち、転写を増加させる）。他の態様において、転写因子は、転写阻害剤である（すなわち、転写を阻害する）。いくつかの態様において、転写因子は、細胞の内因性転写因子である。

「転写因子応答要素」は、転写因子に結合しおよび認識される最小ＤＮＡ配列を含むことができる。いくつかの態様において、転写因子応答要素は、転写因子に結合しおよび認識される最小ＤＮＡ配列の１つよりも多いコピー（すなわち、反復）を含む。いくつかの態様において、転写因子応答要素は、転写因子に結合しおよび認識される最小ＤＮＡ配列の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の反復を含む。いくつかの態様において反復は、縦列反復である。

いくつかの態様において、転写因子応答要素は、最小ＤＮＡ配列の組み合わせを含む。いくつかの態様において、最小ＤＮＡ配列には、スペーサー配列が散りばめられている。いくつかの態様において、スペーサー配列は、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０ヌクレオチド超である。いくつかの態様において、転写因子応答要素は、唯一のものである（すなわち、連続的なポリ核酸は、転写因子応答要素のコピーを１つだけ包含する）。他の態様において、転写因子応答要素は、唯一ではない。

いくつかの態様において、制御成分は、プロモーター要素を含む。いくつかの態様において、プロモーター要素は、転写因子応答要素および最小プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーター要素は、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。いくつかの態様において、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、唯一のものである（すなわち、連続的なポリ核酸は、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントのコピーを１つだけ包含する）。他の態様において、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、唯一ではない。

いくつかの態様において、制御成分は、最小プロモーターを含む。本明細書に使用されるとき、用語「最小プロモーター」は、アウトプットの発現を開始するのに必要であるが十分ではない核酸配列を指す。いくつかの態様において、最小プロモーターは、自然発生のものである。他の態様において、最小プロモーターは、自然発生の配列を改変および／または短縮すること、自然発生の配列を組み合わせること、または自然発生の配列を自然発生ではない配列と組み合わせることによってなど、操作され；各場合において、操作される最小プロモーターは自然発生ではない配列である。いくつかの態様において、最小プロモーターは、ウイルスのまたは非ウイルスの入手源から操作される。最小プロモーターの例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られている。

いくつかの態様において、制御成分は、トランス活性化因子応答要素、転写因子応答要素、および最小プロモーターを含む。いくつかの態様において、カセットの制御成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子応答要素、転写因子応答要素、および最小プロモーターを含む。いくつかの態様において、制御成分は、５’から３’へ、転写因子応答要素、トランス活性化因子応答要素、および最小プロモーターを含む。

いくつかの態様において、カセットの制御成分は、トランス活性化因子応答要素およびプロモーター要素を含む。いくつかの態様において、カセットの制御成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子応答要素およびプロモーター要素を含む。いくつかの態様において、カセットの制御成分は、トランス活性化因子応答要素、プロモーター要素、および最小プロモーターを含む。いくつかの態様において、カセットの制御成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子応答要素、プロモーター要素、および最小プロモーターを含む。

いくつかの態様において、カセットの制御成分は、５’から３’へ、プロモーター要素およびトランス活性化因子応答要素を含む。いくつかの態様において、カセットの制御成分は、５’から３’へ、プロモーター要素、トランス活性化因子応答要素および最小プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーター要素は、哺乳動物プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーター要素は、プロモーターフラグメントである。

いくつかの態様において、制御成分（例として、トランス活性化因子応答要素、および／または転写因子応答要素、および／またはプロモーター要素、および／または最小プロモーター）は、トランス活性化因子タンパク質および／またはアウトプットをコードする核酸に、作動可能に連結されている。制御成分は、それがその配列の転写開始および／または発現をコントロール（「駆動（drive）」）すべく制御する核酸配列との関係で正しい機能位置および配向にあるとき、「作動可能に連結」されているとみなされる。制御成分は、トランス活性化因子タンパク質および／またはアウトプットの発現を増加もしくは減少させる転写因子および／またはトランス活性化因子タンパク質に結合されていてもよい。

応答成分
連続的なポリ核酸分子のカセットは、少なくとも１つの応答成分を含む。いくつかの態様において、応答成分は、アウトプットまたは対象の遺伝子をコードする、核酸配列を含む。いくつかの態様において、アウトプットは、ＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、ＲＮＡ分子は、タンパク質をコードするｍＲＮＡである。いくつかの態様において、アウトプットは、非コードＲＮＡ分子である。非コードＲＮＡ分子の例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られており、および、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、および長鎖ｎｃＲＮＡを包含するが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、アウトプットは、治療用タンパク質またはＲＮＡ分子などの治療用分子（すなわち、疾患の処置に関連する）である。治療用分子の例は、抗体（例として、モノクローナルまたはポリクローナル；キメラ；ヒト化；これらは抗体フラグメントおよび抗体誘導体（二重特異性、三重特異性、ｓｃＦｖ、およびＦａｂ）を包含する）、酵素、ホルモン、炎症分子、抗炎症分子、免疫調節分子、抗がん分子、短鎖ヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを包含するが、これらに限定されない。前述した治療用分子の種類の具体的な例は当該技術分野において知られており、そのあらゆるものが、本開示に従って使用され得る。

いくつかの態様において、アウトプットは、蛍光タンパク質などの検出可能タンパク質である。
いくつかの態様において、アウトプットは、細胞毒素である。本明細書に使用されるとき、用語「細胞毒素」は、細胞に対して毒性がある物質を指す。例えば、いくつかの態様において、アウトプットは、細胞毒性タンパク質である。細胞毒性タンパク質の例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られており、および、グラニュライシン、パーフォリン／グランザイムＢ、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、および種々のサイトカイン／ケモカイン（例として、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、CCR3、CXCR3、CXCR4、およびCCR10）を包含するが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、アウトプットは、プロドラッグの活性化を触媒する酵素である。プロドラッグの活性化を触媒する酵素の例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られており、および、カルボキシルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチルコリンエステラーゼ、パラキソナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、バラシクロビラーゼ、前立腺特異抗原、プリン－ヌクレオシドホスホリラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミダーゼ、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびシトシンデアミナーゼを包含するが、これらに限定されない。例として、Yang Y. et al., Enzyme-mediated hydrolytic activation of prodrugs. Acta. Pharmaceutica. Sinica B. 2011 Oct; 1(3): 143-159を参照のこと。

同じように、種々のプロドラッグは、当該技術分野における知識を有する者らに知られており、および、アシクロビル、アロプリノール（allopurinaol）、アジドチミジン、バンブテロール、バカンピシリン（becampicillin）、カペシタビン（capecetabine）、カプトプリル、カルバマゼピン、カリソプロドール、シクロホスファミド、ジエチルスチルベストロール二リン酸、ジピベフリン、エナラプリル、ファムシクロビル、フルダラビン三リン酸、フルオロウラシル、ホスアンプレナビル、ホスフェニトイン（fosphentoin）、フルスルチアミン、ガバペンチンエナカルビル（gabapentin encarbil）、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドラジドＭＡＯ阻害剤、レフルノミド、レボドパ、メタナミン、メルカプトプリン、マイトマイシン、モルシドミン、ナブメトン、オルサラジン、オメプラゾール、パリペリドン、フェナセチン、ピバンピシリン、プリミドン、プログアニル、サイロシビン、ラミプリル、Ｓ－メチルドパ、シンバスタチン、スルファサラジン、スリンダク、テガフール、テルフェナジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、およびジドブジンを包含するが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、アウトプットは、免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡである。本明細書に使用されるとき、用語「免疫調節タンパク質」（または免疫調節ＲＮＡ）は、免疫系の成分の活性化を誘導するおよび／または活性を増加させることによって、免疫系を調節する（刺激する（すなわち、免疫刺激タンパク質もしくはＲＮＡ）または阻害する（すなわち、免疫阻害タンパク質もしくはＲＮＡ））、タンパク質（またはＲＮＡ）を指す。種々の免疫調節タンパク質は、当該技術分野における知識を有する者らに知られている。例として、Shahbazi S. and Bolhassani A. Immunostimulants: Types and Funtions. J. Med. Microbiol. Infec. Dis. 2016; 4(3-4): 45-51を参照のこと。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、サイトカインまたはコロニー刺激因子である。

いくつかの態様において、アウトプットは、ＤＮＡ修飾因子である。本明細書に使用されるとき用語「ＤＮＡ修飾因子」は、（例として、遺伝子組み換えを誘導することまたは突然変異の導入によって）ＤＮＡの構造を改変および／またはＤＮＡの配列を改変する因子を指す。いくつかの態様において、ＤＮＡ修飾因子は、遺伝的欠陥を修正することを意図したタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡ修飾酵素、および／またはＤＮＡ修飾系の成分である。いくつかの態様において、ＤＮＡ修飾酵素は、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、または、CRISPR/Cas ＤＮＡ修飾系のタンパク質成分である。

いくつかの態様において、アウトプットは、細胞表面受容体である。いくつかの態様において、アウトプットは、キナーゼである。
いくつかの態様において、アウトプットは、遺伝子発現制御因子である。用語「遺伝子発現制御因子」は、本明細書に使用されるとき、存在するときに少なくとも１つの遺伝子の転写を増加または減少させるあらゆる因子を指す。いくつかの態様において、遺伝子発現制御因子は、タンパク質である。いくつかの態様において、遺伝子発現制御因子は、ＲＮＡである。いくつかの態様において、遺伝子発現制御因子は、遺伝子発現を制御することが可能な多成分系の成分である。

いくつかの態様において、アウトプットは、エピジェネティック修飾因子である。用語「エピジェネティック修飾因子」は、本明細書に使用されるとき、エピジェネティック修飾を増加させるか、減少させるか、または改変する因子（例として、タンパク質またはＲＮＡ）を指す。エピジェネティック修飾の例は、当該技術分野における知識がある者らに知られており、および、ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾を包含するが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、アウトプットは、ベクター複製のために必要とされる因子である。ベクター複製のために必要とされる因子の例は、当該技術分野における知識を有する者らに知られている。

いくつかの態様において、応答成分は、トランス活性化因子をコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様において、応答成分は、ポリシストロニック発現要素を含む。用語「ポリシストロニック応答要素」は、本明細書に使用されるとき、単一ｍＲＮＡからの２つ以上のタンパク質の生成を円滑化する核酸配列を指す。ポリシストロニック応答要素は、内部認識配列（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドをコードするポリ核酸を含み得る。例として、Liu et al., Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci. Rep. 2017 May 19; 7(1): 2193を参照のこと。

いくつかの態様において、応答成分は、アウトプットをコードする核酸配列、トランス活性化因子、およびポリシストロニック発現要素を含み、ここで、応答成分の転写は、単一ｍＲＮＡを生成する。いくつかの態様において、アウトプットとトランス活性化因子とは、ポリシストロニック発現要素によって分離されている。
いくつかの態様において、応答成分は、少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む。いくつかの態様においてポリアデニル化配列は、哺乳動物細胞における転写終結およびポリアデニル化に適している。

いくつかの態様において、応答成分は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、応答成分は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む。マイクロＲＮＡは、翻訳抑制（translational repression）、ｍＲＮＡ切断、および脱アデニル化を包含する様々な方式でそれらが結合するＲＮＡのレベルを下方制御するための、典型的には長さ２１～２５ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡのクラスである。

用語「マイクロＲＮＡ標的部位」は、本明細書に使用されるとき、マイクロＲＮＡ配列に相補的でありおよび制御される配列を指す。マイクロＲＮＡ標的部位は、マイクロＲＮＡ標的部位に結合し、および該部位を制御するマイクロＲＮＡに対して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一性を有し得る。
いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、アウトプットに対し３’側である。いくつかの態様において、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、アウトプットに対し５’側である。

いくつかの態様において、応答成分は、５’から３’へ、アウトプットおよび少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、応答成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子タンパク質をコードする核酸配列、および少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、応答成分は、５’から３’へ、トランス活性化因子タンパク質をコードする核酸配列、アウトプットをコードする核酸配列、および少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む。

いくつかの態様において、連続的なポリ核酸分子の複数のカセットは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、連続的なポリ核酸の各マイクロＲＮＡ標的部位は、唯一のものである（すなわち、連続的なポリ核酸は、マイクロＲＮＡ標的のコピーを１つだけ包含する）。いくつかの態様において、連続的なポリ核酸分子は、同じ核酸配列である少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を各々含む少なくとも２つのカセットを含む。いくつかの態様において、連続的なポリ核酸分子は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を各々含む少なくとも２つのカセットを含み、ここで、各カセットの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位は、同じマイクロＲＮＡによって制御される異なる核酸配列を含む。例えば、第１のカセットは、マイクロＲＮＡ標的部位Ｘを含んでもよく、かつ、第２のカセットは、マイクロＲＮＡ標的部位Ｙを含んでもよく、かつ、マイクロＲＮＡ Ｚが標的部位Ｘおよび標的部位Ｙを制御する。

いくつかの態様において、連続的なポリ核酸分子は、少なくとも１つのカセットを含み、ここでカセットは、（ｉ）トランス活性化因子応答要素を含む５’制御成分、転写因子応答要素、および最小プロモーター；および、（ｉｉ）アウトプット、トランス活性化因子、および任意であるポリシストロニック発現要素を含む３’応答成分、ここで、アウトプットとトランス活性化因子とは任意にポリシストロニック発現要素によって分離されている、を含み；ここで、応答成分の転写は、単一ｍＲＮＡを生成し；およびここで、（ｉｉ）のトランス活性化因子は、タンパク質として発現したときに（ｉ）のトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。

いくつかの態様において、連続的なポリ核酸分子は、少なくとも２つのカセットをコードし、ここで少なくとも１つのカセットは、（ｉ）トランス活性化因子応答要素を含む５’制御成分、転写因子応答要素、および最小プロモーター、ならびに、アウトプットを含む３’応答成分を含み；ならびに、少なくとも１つのカセットは、（ｉｉ）トランス活性化因子タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター要素を含み；およびここで、（ｉｉ）のトランス活性化因子は、タンパク質として発現したときに（ｉ）のトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する。

他の組成物
他の側面において、本開示は、ベクターの組成物に関する。いくつかの態様において、ベクターは、上に記載された連続的なポリ核酸分子を含む。
他の側面において、本開示は、操作されたウイルスゲノムの組成物に関する。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、上に記載された連続的なポリ核酸分子を含む。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム、レンチウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、麻疹ウイルスゲノム、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノム、パルボウイルスゲノム、セネカバレーウイルスゲノム、マラバウイルスゲノム、または一般的な風邪ウイルスゲノムである。

他の側面において、本開示は、ビリオンの組成物に関する。本明細書に使用されるとき、用語「ビリオン」は、宿主細胞（例として、ＤＮＡ／ＲＮＡゲノムおよびタンパク質カプシドを含む）の外部のウイルスの感染型を指す。いくつかの態様において、ビリオンは、上に記載された操作されたウイルスゲノムを含む。

細胞特異的イベントを刺激する方法
他の側面において、本開示は、細胞の集団において細胞特異的イベントを刺激する方法に関する。いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、上に記載された連続的なポリ核酸分子、上に記載されたベクター、上に記載された操作されたウイルスゲノム、または上に記載されたビリオンと接触させることを含み、細胞特異的イベントは、少なくとも１つの内因性転写因子および／または少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡによって制御される。

いくつかの態様において、宿主細胞と上に記載された連続的なポリ核酸分子または上に記載されたベクターとの接触は、非ウイルス送達法を介して起こる。例は、トランスフェクション（例として、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ＣａＰＯ_４媒介トランスフェクション、脂質媒介取り込み、ＰＥＩ媒介取り込み、およびレーザートランスフェクション）、形質転換（例として、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、およびヒートショック）、遺伝子導入、および粒子衝突を包含するが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、細胞の集団は、ex-vivoで接触させられる（すなわち、細胞の集団は生命体から単離され、および細胞の集団は生命体の外部で接触させられる）。いくつかの態様において、細胞の集団は、in-vivoで接触させられる。

本明細書に使用されるとき、用語「内因性」は、細胞の文脈において、自然な状態の細胞中で見出される因子（例として、タンパク質またはＲＮＡ）を指す。いくつかの態様において、内因性転写因子は、少なくとも１つのカセットの制御成分のプロモーター要素（例として、転写因子応答要素）を結合しおよび活性化させ得る。いくつかの態様において、内因性マイクロＲＮＡは、少なくとも１つのカセットの制御成分または応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的であり得る。

いくつかの態様において、「トランス活性化因子」および対応する「トランス活性化因子応答要素」は、トランス活性化因子が「トランス活性化因子応答要素」に特異的に結合するがしかし細胞中に自然に存在している応答要素にはできるだけ結合しないように選択される。いくつかの態様において、トランス活性化因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、細胞の中に存在するネイティブな制御配列に効率的に結合せず、およびしたがって、過剰な副作用をトリガーしない。

いくつかの態様において、細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞および少なくとも１つの非標的細胞を含む。標的細胞と非標的細胞型とは、少なくとも１つの内因性転写因子のレベル、ならびに／あるいは、少なくとも１つの内因性プロモーターもしくはそのフラグメントおよび／または少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡの発現強度の点で異なる。いくつかの態様において、標的細胞と非標的細胞とは異なる細胞型である。例えば、いくつかの態様において、標的細胞はがん性細胞であり、および非標的細胞は非がん性細胞である。同じように、いくつかの態様において、標的細胞は肝細胞であり、および非標的細胞は非肝細胞（例として、筋細胞）である。他の態様において、標的細胞と非標的細胞とは同じ細胞型（例として、両方が肝細胞）であるが、そうであっても、少なくとも１つの転写因子および／または少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡのレベルの点で異なる。例えば、標的細胞は、老化した筋細胞であり得、および、非標的細胞は、老化していない筋細胞であり得る。

いくつかの態様において、応答成分のアウトプットの発現レベルは、標的細胞と非標的細胞との間で、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００または少なくとも１０，０００倍異なる。
いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、腫瘍細胞であり、および細胞特異的イベントは、細胞死である。いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、老化細胞であり、および細胞特異的イベントは、細胞死である。いくつかの態様において、細胞死は、活性化受容体リガンド、特異的抗原、刺激サイトカイン、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を通じた免疫ターゲティングに媒介される。いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、プロドラッグと、またはアウトプットによって治療剤もしくは毒性化合物へと代謝される非毒性の前駆体化合物と、接触させることをさらに含む。

いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、同型の野生型細胞に対して相対的に因子を差次的に発現し、および、細胞特異的イベントは、因子の発現レベルを調節することである。
いくつかの態様において、アウトプット発現は、標的細胞集団の生存を確保し、一方、アウトプット発現の欠如に起因しておよび細胞死誘発剤の存在下で非標的細胞が排除される。他の態様において、アウトプット発現は、非標的細胞集団の生存を確保し、一方、アウトプット発現の欠如に起因しておよび無関係かつ非特異的な細胞死誘発剤の存在下で標的細胞が排除される。

いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、対象の特定の表現型を、アウトプット発現がこの特定の表現型の細胞に限定されるように含む。
いくつかの態様において、標的細胞集団の細胞は、選ばれた細胞型であり、および、細胞特異的イベントは、選ばれた細胞型において自然には存在しないかまたは不活性である遺伝子の発現を通じた新規な機能をコードすることである。
いくつかの態様において、細胞の集団は、多細胞生物を含む。いくつかの態様において、多細胞生物は、動物である。いくつかの態様において、動物は、ヒトである。

先行技術に対する利点
本明細書に開示される組成物および方法は、種々のあり方で先行技術に対する利点を示す。これらの利点の例は、以下に提供される。
第一に、ここに記載されるアプローチおよび方法は、増加した正確性を呈する。複数の高度に情報性ある分子を感知しおよびそれらの情報を組み合わせる能力は、以前に記載された自然の組織特異的プロモーター（通常は複数の組織／細胞型において異なる度合いまで発現する）または脱ターゲティングを使用するよりも正確に発現を制限させることを可能にする。

第二に、本明細書に記載される回路アーキテクチャは、厳密なＯｆｆを伴う優れたダイナミックレンジおよび強い構成的プロモーターと同程度の完全発現を示す。このアプローチは、弱く漏れやすい発現にしばしば悩まされるような古典的な転写ターゲティングを打ち負かす。強い絶対的な発現は、多数の遺伝子治療にとっての鍵であり、および、高いダイナミックレンジは、毒性遺伝子のターゲティング（例として、がん自殺療法）においてとりわけ重要である。

第三に、本明細書に記載される回路の構造は、元来、モジュール式（すなわち、個々のセンサー配列（sensing sequences）を入れ替えることで回路特異性を変えることができる）であり、単一のシグナルが、予想可能なあり方で組み合わせられている。結果として、単一のセンサーは、異なる特異性でベクターを合理的にデザインするための増え続けるＴＦｓおよびｍｉＲＮＡ発現データセットに従って組み合わせられることができる。

そのうえ、これらのアプローチは、改善された特異性およびより高い効き目がある新しい遺伝子および細胞治療（ＧＣＴ）の開発に使用することができる。論理回路は、特異的な条件を感知するように、および、遺伝子、治療用タンパク質、修正ｍｉＲＮＡでまたは複数に分かれたアウトプットの組み合わせで応答するように、プログラムされることができる。プログラム可能なインプット、コンパクトなサイズ、およびその結果もたらされる多数の異なるウイルスベクターにうまく適合する能力は、多岐にわたる応用を開放する。

回路は、最も適切なＡＡＶ血清型中にパッケージ化されることができ、および正確な体細胞遺伝子治療のための対象の組織においてのみ機能的遺伝子を駆動するようにプログラムされる。この応用のバリアント、自殺遺伝子療法においては、肝細胞癌の特異的ターゲティングについて本明細書に記載されるとおり、致死遺伝子（killing gene）はがん細胞において特異的に発現するが、体内における他の健康な組織では発現しない。これは、漏れやすい発現が毒性効果に導き得るような他の組織における厳密なコントロールと共役したがん細胞における高い発現レベルを要求することから、技術についての理想的なベンチマークを表す。

回路は、複製機構を損なうことなく数多くの腫瘍溶解性ウイルス（例として、アデノウイルス、ＨＳＶ）中にパッケージ化されるのに十分小さく、そのため、簡単に、がん細胞におけるウイルス複製を正確に標的とすることに使用することができる。本明細書に記載される回路デザインはまた、幹細胞としてまたは免疫療法において使用する細胞のex-vivo工学のためのレンチウイルスベクターと併せても、使用することができる。この場合において、回路は、あるin vivo条件が満たされたときにのみ特異的な遺伝プログラムを実行するようにデザインされる。

一例として、幹細胞は、本明細書に記載されるとおりの回路で形質導入され、分化しおよびin vitroで選択され得る；および、患者の中に再注入された分化した細胞では、回路が主要な多能性マーカーの状態を継続的にモニターし、テラトーマ形成を回避するためにそれらが出現すると細胞を殺し得る。本明細書に記載される回路がインスレーター間に挿入されることができ、および回路パフォーマンスに有意な影響を与えることなくレンチウイルス粒子中にパッケージ化されることができるということの実証は、この方向性での最初の概念的な証拠を表す。

本明細書に開示される組成物および方法は、以下の分野において具体的な進歩を表す：
遺伝子治療における対象の遺伝子の標的化された発現：対象の遺伝子（gene of interest）（ＧＯＩ）の発現を対象の組織／細胞型に制限することは、依然として、ウイルス治療における取り組む余地のある難題のまま残っている。例えば（ｉ）健康な組織とがん組織との間の高い類似性に起因してがんウイルス療法において、および（ｉｉ）意図しない組織における有害な副作用に起因してＧＯＩが極めて厳密に制御されなくてはならないような適応症において、問題は特に深刻である。

先行技術におけるウイルスベクター中に埋め込まれた対象の遺伝子の特異性をコントロールするための主なアプローチは、「転写ターゲティング」（Dorer D.E.およびNettelbeck D.M., Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. 61(7-8): 554-571；Robson T.およびHirst D.G., J. Biomed. Biotechnol. 2003; 2003(2): 110-137；Navarro S.A. et al., Expert Opin. Ther. Pat. 2016 Sep; 26(9): 1095-1104）である。このアプローチでは、ＧＯＩをがん特異的または組織特異的プロモーターのコントロール下に置く。この方法の短所は非常に多い。例えば、このアプローチが有する特異性は限られている。「特異的」として定義されるプロモーターは、実はしばしば複数の組織の中で発現する。これは、それらが通常、他の組織においては生理的である遺伝子の過剰発現に結び付けられることから、所謂「がん特異的プロモーター」については特に当てはまる。これに加えて、このアプローチはまた、標的とされる組織または細胞型と、標的とされるべきではないそれらとの間の、極めて低い発現の差によっても特徴付けられる。

組織特異的またはがん特異的プロモーターの大半は、両方とも、弱くかつ幾分漏れやすい（leaky）（例として、ＡＦＰプロモーター、普通に使用される組織特異的プロモーターは、ＣＡＧよりも５００倍低活性である）（Kanegae Y. et al., Nucleic Acids Res. 2011 Jan; 39(2): e7）。この発現の差異の低さは、高用量で必要な強い細胞毒性の遺伝子およびタンパク質の発現をそれを要求する細胞にのみ制限するための能力を限定する。選択的プロモーターの力を増加させるための提案される解決策は、二段階転写増幅（ＴＳＴＡ）（Iyer M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001 Dec 4; 98(25): 14595-14600; US7527942B2; US2009/0192101A1）、または、特異的プロモーターを、強い構成的プロモーターに由来する配列要素と混合すること（Sakaguchi M. et al., Oncol. Rep. 2017 Aug; 38(2): 1108-1114）を包含する。両方の解決策は、それらが漏れやすさを代償にしてプロモーター強度を増加させて、およびしばしば特異性の減少を結果的にもたらすことから、部分的には成功であるが部分的には失敗であるといえる。

しばしば「ｍｉＲＮＡ脱ターゲティング」と名指しされる、より最近の戦略は、構成的プロモーターを、発現プロファイルから除外される組織中に豊富にあるｍｉＲＮＡの標的と組み合わせる（WO2007/000668A2）。このアプローチは、構成的プロモーターの使用に起因して、導入遺伝子の高い投薬量に達することを可能にさせる。ターゲティング精度を精密化するのに有用である一方、全身送達に頼る応用において脱ターゲティング単独によって高い選択性に達することは難しく、それは、大きなセットのｍｉＲＮＡ標的を通して多数の組織の一対一除外を要求するからである。標的の数が増加するにつれて、カセットのデザインは、組成効果および潜在的な遺伝的不安定性のためにより困難になる（Ruiz A.J. et al., J. Virol. 2016 Mar 28; 90(80): 4078-4092）。そのうえ、厳密なＯｆｆレベルは、高度に豊富なｍｉＲＮＡを要求し、使用可能な分子標的の数を潜在的に限定する。

先にRinaudo et al.によって提案された、プラスミドにコードされる遺伝子回路を使用したｍｉＲＮＡターゲティングのバージョン（Rinaudo K. et al., Nature Biotechnol. 2007 Jul; 25(7): 795-801）は、レンチウイルスベクターにおいて試みられた（Amendola M. et al., Mol. Ther. 2013 May; 21(5): 934-946）。興味深いことに、研究は、２つの区別されるレンチウイルスベクターを使用したアプローチを実施し、およびこのようにして、連続的なＤＮＡ分子へと複雑な遺伝子回路をパッケージングすることは困難な課題であることを例示している。

合成生物学：複雑な論理挙動を呈する多彩な回路が記載されてきている。哺乳動物細胞における全ての可能な１入力および２入力論理ゲートの実施が、転写および翻訳レギュレーターを使用する前に示されている（Auslander S. et al., Nature. 2012 Jul 5; 487(7405): 123-27）。より最近では、複数のグループが、リコンビナーゼに基づいて分子の論理およびメモリーの実施を実証しおよび記載した（WO2014/093852A1; WO2015/188191A1）。
これらの努力は、細胞コントロールにおける傑出した進展および生体分子を使用した論理の実施を披露する。しかしながら、これらの系は全て、それらのin vivoでの細胞ターゲティングのための使用のことになると、以下の２つの短所を被る：（ｉ）インターフェースマッチング（interface matching）および（ｉｉ）回路サイズ。

以前に記載された回路は、よく特徴付けされかつ外部から調節された異所性のインプット分子を用いて細胞培養物中で試験されており、および、それらが内因性細胞分子と接したときのそれらのパフォーマンスの証拠はない。論理統合（logic integration）を開発することにおいて大幅な進展があった一方で、論理回路－細胞環境のインターフェースの創出は、未だに遅れをとっている。効果的な論理入力としての内因性ｍｉＲＮＡの例が、培養された細胞株へ送達された組換えプラスミドのセットを使用する前に示された（WO2012/012739A2）。内因性転写因子のインプットを処理することが可能な論理遺伝子回路は、分割されたタンパク質のフラグメントを（Nissim L.およびBar-Ziv R.H., Mol. Syst. Biol. 2010 Dec 21; 6:444）またはCas9とgRNAとを（Liu Y.C. et al., Nat. Commun. 2014 Nov. 6; 5: 5393）各々コントロールする２つの完全長組織特異的プロモーターを用いて示される。

単一の内因性転写因子をロバストに合成回路に接させることが可能な系、および無関係な転写因子のペアも、また実証されている（Angelici B. et al., Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537）。しかしながら、上の場合の全てにおいて、実験的な実施は、およびとりわけAngelici B. et al. （Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537）においては、培養された細胞にトランスフェクトされた組換えプラスミドの混合物に限定される。論理回路が連続的な核酸分子においてもしくは医学的に関連するベクター系において実施できたということが示されたこと、または動物モデルにおいて疾患を処置したことが示されたことは、いかなる場合にもなかった。

これに加えて、上述したデザインの大部分は、回路機能の最大の柔軟性を狙っており、および、これは通常、追加の組換えプラスミドを構築することによって達成される。実に、多数の複雑な回路は、一過性のトランスフェクションシナリオにおいて作動するのに１０の別々のプラスミドを要求する。一例として、Auslander et al.（Nature. 2012 Jul 5; 487(7405): 123-27）に記載された２入力ANDゲートは５つの異なるプラスミドを要求し、およびW. Wong（WO2015/188191A1）により記載されたリコンビナーゼ系は３つのプラスミド（２つのリコンビナーゼに加えてそれらが作動するアウトプット発現カセット）に頼り、およびいずれも内因性細胞のインプットと併せて試験されたことはない。

そのうえ、以前に記載された、ＡＮＤ論理を実施するためにデザインされた系は、３つのプラスミドを要求した（Liu Y.C. et al., Nat. Commun. 2014 Nov. 6; 5: 5393; Angelici B. et al., Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537）。これらのアプローチは、細胞バックグラウンドとのインターフェースとしての完全な哺乳動物プロモーターの使用をもまた要求し、および、ある１つの場合においては、回路統合のための大きなタンパク質（CAS9）の使用は、極めて大きな回路サイズを結果的にもたらす。

治療的応用のための遺伝子回路：治療的に関係のあるウイルスおよび非ウイルスベクターにおける多成分遺伝子回路の実施は、未だに極めて稀であり、これは、多数の最先端の技術水準の回路がますます複雑化し大きなＤＮＡによる痕跡を要求するという上述した事実に少なからず起因する。上で議論された連続的なＤＮＡ分子上に複数の遺伝子を統合することの追加の難題（例として、リードスルー、遺伝子間の制御的干渉、等々）は、上に記載された基本的な進歩の多くについての医学的な転換を妨げてきている。

ターゲティングのための論理回路の既存の例は、それらのより高いカーゴ容量に起因して、レンチウイルスベクターに限定されている（Morel M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016 Jul 19; 113(29): 8133-8138；Nissim L. et al., Cell. 2017 Nov 16; 171(5): 1138-1150）。レンチウイルス骨格は、ex-vivo応用（とりわけ、免疫細胞工学）に有用である一方、それらの宿主ゲノムに統合される能力によって突然変異および／または望ましくない遺伝子活性化を引き起こすことに起因して、in vivo治療には理想から程遠い。Nissim L. et al.（Cell. 2017 Nov 16; 171(5): 1138-1150）において示された遺伝子回路は、本明細書に示されるとおりの連続的なＤＮＡ分子における複雑な遺伝子回路をコードすることの困難性の根底にある、単一のベクターよりも、むしろレンチウイルスコンストラクトのペアを使用して実施される。

本明細書中の例および図３Ａ～３Ｂ、図５Ａ～５Ｃ、図６Ａ～６Ｂ、および図７Ａ～７Ｂに示されるとおり、非統合の単一成分ＡＡＶベクターは、安全な証明された代替物を表し、これは異なる細胞型における効率的な送達のために最適化される血清型の広範な選択肢および腫瘍へ浸透する高い能力を伴うが、しかしカーゴ容量の点で限定される。Morel et al.（Morel M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016 Jul 19; 113(29): 8133-8138）におけるデータもまた、自然な特異的プロモーターの劣ったＯｎ：Ｏｆｆ特性がいかにして回路パフォーマンスに影響を及ぼすかを示し、これは感度と特異性との間に厳しいトレードオフを課している。これらのツールの欠点にかかわらず、Morel M. et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016 Jul 19; 113(29): 8133-8138）およびNissim L. et al.（Cell. 2017 Nov 16; 171(5): 1138-1150）において使用されている具体的な方法は、現在の開示と重なるものではない。

例
例１．連続的なＤＮＡ分子において実施される機能性。
本明細書に開示されるのは、例えば２つの転写因子（ＴＦｓ）の間、内因性プロモーター（またはプロモーターフラグメント）と任意転写因子との、および任意に１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）との間の、多入力論理を実施することが可能な連続的なＤＮＡコンストラクトである。インプットは、典型的には、それらの組み合わせが、回路がそれを標的とするようにデザインされた１つ以上の生理学的細胞状態に固有であるように選ばれる。一般的な回路アーキテクチャ概観は、図１Ａに示される。任意転写因子Ａ（ＴＦ－Ａ）は、最小プロモーター（Ｐｍｉｎ）の隣のアウトプット遺伝子のプロモーター領域中の応答要素（ＴＦ－Ａ－ＲＥ）に結合する。このプロモーター領域中の他の場所には、「補助トランス活性化因子」（ＡＡ）と名付けられたタンパク質のための結合部位がある。

ＡＡは、その応答要素（ＡＡ－ＲＥ）に結合したときおよび最小プロモーターの存在下において遺伝子発現を活性化することが可能な転写トランス活性化因子である。転写因子Ａおよび補助トランス活性化因子ＡＡに対する応答要素を含有するプロモーター領域は、相乗効果のある挙動を有し、つまり、単独の転写因子Ａまたは補助トランス活性化因子ＡＡのいずれかによって駆動されるアウトプットの発現は、前者と後者との両方の存在下におけるアウトプットの発現よりも少ない（Angelici B. et al., Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537）。

図１Ａ中の回路の「オプション１ａ」において、ＡＡタンパク質発現は、最小プロモーターの隣のＡＡコード遺伝子のプロモーター領域中の応答要素（ＴＦ－Ｂ－ＲＥ）に結合する任意転写因子Ｂによって駆動される。このオプションにおいては、アウトプットは、ＴＦ－ＡおよびＴＦ－Ｂの両方が強く活性であるときに強く発現し、これはＴＦ－ＡとＴＦ－Ｂとの間のＡＮＤ様回路挙動「TF-A AND TF-B」を実施する（表１）。代替的に、ＡＡ発現は、内因性遺伝子のプロモーター（ＰＲ－Ｅ）またはかかるプロモーターの１つ以上のフラグメント（図１Ａ中の回路の「オプション１ｂ」）によって駆動されることができる。この場合において、アウトプットは、高度に活性なＴＦ－Ａと同時に内因性プロモーターが活性であるときにのみ強く発現し、これは論理「PR-E AND TF-A」を実施する（表１）。

図１Ａ中の回路の「オプション２」において、ＡＡタンパク質発現は、例としてＴ２Ａリンカーを介して、アウトプット発現に共役する。このオプションにおいては、アウトプットは、ＡＡ作用により増幅されたＴＦ－Ａ（または、代替的におよび／またはこれに加えてＰＲ－Ｅ）の力に比例する（Angelici B. et al., Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537）。

図１Ａ中の回路の「オプション３」において、アウトプットは、アウトプットは、アウトプットをコードするｍＲＮＡ中の標的部位を介して任意マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－Ｘ）によってさらにコントロールされる。「オプション３ａ」においてはアウトプット遺伝子のみがｍｉＲＮＡによってコントロールされ、一方「オプション３ｂ」（上のオプション１に対してのみ適合性がある）においては、ＡＡをコードする遺伝子が、同じｍｉＲＮＡによってコントロールされる。「オプション３ａ」と「オプション３ｂ」とは、一緒にまたは別々に使用することができる。

「オプション３ａ」、「オプション３ｂ」、または両方との組み合わせでの「オプション１ａ」は、「TF-A AND TF-B AND NOT(miR-X)」の論理挙動を結果的にもたらし、つまり、アウトプットは、ＴＦ－ＡおよびＴＦ－Ｂの同時の存在下かつｍｉＲ－Ｘの不在下であると、高度に発現する（表２）。同様に、「オプション１ｂ」は、「PR-E AND TF-A AND NOT(miR-X)」型の論理挙動を実施するために「オプション３ａ」、「オプション３ｂ」、または両方と組み合わせられることができる（表２）。

「オプション３ａ」との組み合わせでの「オプション２」は、「TF-B AND NOT(miR-X)」の論理挙動を結果的にもたらし、つまり、アウトプットは、ＴＦ－Ｂの存在下かつｍｉＲ－Ｘの不在下であると、高度に発現する。

図１Ａ中の回路の「オプション４」において、アウトプットは、アウトプットをコードするｍＲＮＡ中の標的部位を介して任意マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－Ｙ）によってさらにコントロールされる。「オプション４ａ」においてはアウトプット遺伝子のみがｍｉＲＮＡによってコントロールされ、一方「オプション４ｂ」（上の「オプション１」に対してのみ適合性がある）においては、ＡＡをコードする遺伝子が、同じｍｉＲＮＡによってコントロールされる。「オプション４ａ」と「オプション４ｂ」とは、一緒にまたは別々に使用することができる。

「オプション３ａ」、「オプション３ｂ」、または両方との組み合わせでの、および、「オプション４ａ」、「オプション４ｂ」、または両方との組み合わせでの、「オプション１ａ」は、「TF-A AND TF-B AND NOT(miR-X) AND NOT(miR-Y)」の論理挙動を結果的にもたらし、つまり、アウトプットは、ＴＦ－ＡおよびＴＦ－Ｂの同時の存在下かつｍｉＲ－ＸおよびｍｉＲ－Ｙの不在下であると、高度に発現する。この配置の実用性は、ｍｉＲ－ＸまたはｍｉＲ－Ｙまたは両方が強く発現する組織におけるアウトプット発現を防ぐことにあり、このようにして、ＴＦ－ＡおよびＴＦ－Ｂを両方とも発現するがｍｉＲ－ＸおよびｍｉＲ－Ｙのうちのいずれも発現しない細胞における強い発現を保持しながら、安全性の特徴を改善する。同じように、「オプション１ｂ」は、論理挙動「PR-E AND TF-B AND NOT(miR-X) AND NOT(miR-Y)」を実施するために「オプション３ａ」、「オプション３ｂ」、または両方、および「オプション４ａ」、「オプション４ｂ」、または両方と組み合わせられることができる。

「オプション３ａ」および「オプション４ａ」との組み合わせでの「オプション２」は、「TF-A AND NOT(miR-X) AND NOT(miR-Y)」の論理挙動を結果的にもたらし、つまり、つまり、アウトプットは、ＴＦ－Ｂの存在下かつｍｉＲ－Ｙの不在下であると、高度に発現する。
追加のｍｉＲＮＡインプットおよびそれらの結合部位を加えることができ、および、回路構造及び論理挙動を類似した様式で拡張することができる（例として、別の入力特徴としてのｍｉＲ－Ｚ、および構造的な「オプション５ａ」および「オプション５ｂ」、等々）。これらの制御プログラムの具体的な遺伝子上の実施は、図２中の構造によって例証される。

例２．連続的なＤＮＡカセットにおける実施およびウイルスベクターとの統合。
本明細書に記載されるとおり、例１に記載される回路の代表的な例を、連続的なＤＮＡ分子において実施し、および、ウイルスベクターゲノム中へとさらに組み込み、するとそのウイルス粒子が生産され、およびそれらのin vitroおよびin vivoで選択的に細胞を標的とする能力とin vivoで腫瘍の成長に歯止めをかける能力について試験した。したがって、数ある中でも特に、このアプローチの治療的実用化の具体例が開示される。遺伝子は、収斂または発散配向のいずれかで連続的なＤＮＡコンストラクト中に統合されている。後者では、転写因子のインプットに対する応答要素は、ＤＮＡ分子の中心（２つのコード配列の間に）に位置し、および、ｍｉＲＮＡ標的およびポリＡは、選ばれたウイルス骨格のすぐ隣にある（図２）。

ヘッドトゥーテール（共線）様式でもまた、遺伝子を統合することができるが；類似の系が過去に問題を有したことから、これが実験的に試されたことはなかったが、しかし、ヘッドトゥーテール配向が機能的であるという可能性もまたある。さらに、インスレーターは、互いからのおよびウイルスベクターコンテクスト（viral vector context）からのそれらの単離を改善するために、個々の遺伝モジュールの間に置くことができる。最後に、アプローチは、アウトプット遺伝子が生来ウイルスベクター複製の原因を担う遺伝子（単数または複数）であるような、条件付きで複製する（「腫瘍溶解性の」）ベクターに導くことができる（図２）。

例３．好ましい態様および機能的実証。
１つの好ましい態様は、発散（divergent）ヘッドトゥーテール配置である。この構成において、成分の物理的編成は、機能性を最大化し、および予想できないコンテクスト効果を最小化し、ロバストなモジュラーシステムを結果的にもたらす。発散遺伝子は、転写的ランスルー（run-through）のリスクを回避する。転写制御は、コンストラクトの中心に位置する応答要素に向かっており、これは、比較的定常のままである遺伝成分に取り囲まれていた（最小プロモーターは、通常変わらないままであり、一方、トランス活性化因子およびアウトプット遺伝子は、よく特徴付けされている化合物のリストから選択される）。

したがって、意図される転写制御は、ウイルス骨格上に存在する潜在（cryptic）レギュレーターまたはＴＦ結合部位から遮蔽される。ｍｉＲＮＡ標的は、転写後制御を通じて作用し、およびしたがって、それらは、例として、隣にあるウイルス配列への転写因子の、疑似結合による影響を及ぼされない。発散構成を伴う態様の優れたパフォーマンスが、図３Ａ～３Ｂに示され、ここでは「オプション１」が「オプション３ａ」または「オプション３ｂ」と組み合わせられているときに遺伝子発現に明らかなゲインがある。この実験は、ウイルスパッケージングに先立って裸のＤＮＡを使用して行った；このようにして、後続するウイルスベクターの態様においては、発散構成のみが採用された。

連続的なＤＮＡカセットの機能を、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）においておよびレンチウイルスベクターにおいて実証した。図４Ａ～４Ｂにおいて、発散構成を実施する数々のＡＡＶベクターのin vitro機能、ならびに、「オプション１」を「オプション３ａ」および「オプション３ｂ」と組み合わせる回路アーキテクチャが示される（図１Ａ）。ＤＮＡを、AAV-DJ型ビリオン（Grimm D. et al., J. Virol., 2008 Jun; 82(12): 5887-5911）中へとパッケージ化した。各ベクターを、以下の２つのバリアントにおいて生成した：（ｉ）標的特異性を試験するための蛍光アウトプットmCherryおよび（ｉｉ）選択的抗腫瘍活性を試験するための細胞毒性アウトプットＨＳＶ－ＴＫ。図４Ａでは、細胞株のパネルにおいて、蛍光アウトプットを伴う種々のベクターを試験した。回路を、肝がんの典型であるSox9/10およびHNF1A/B発現の組み合わせを検出するようにプログラムした（Zhou D. et al., Tumour Biol. 2014 Oct; 35(10):9935-40；Guo X. et al., Diagn. Pathol. 2012 Apr 19; 7:44.）。

これに加えて、健康な肝臓における安全スイッチを作り出すためにｍｉＲＮＡコントロール要素を加えており、これは、これらのｍｉＲＮＡがマウス肝臓において高度に発現するが肝がん細胞においてはそうではないという事実に基づく（内部的なプロファイリングデータ）。肝がん細胞株HepG2およびHuh7を、ポジティブコントロールとして使用し、一方、他の２つ、非肝がん細胞株HeLaおよびHCT-116を、ネガティブコントロールとして使用した。図４Ａ中の棒グラフが示すとおり、蛍光アウトプットは、２種の肝がん細胞株において高いレベルで発現したが、しかしネガティブコントロール細胞株においてはそうではなかった。

図４Ｂにおいて、蛍光アウトプットがＨＳＶ－ＴＫ遺伝子で置き換えられ、かつプロドラッグガンシクロビル（ＧＣＶ）と組み合わられたときの細胞毒性活性が示される。ＨＳＶ－ＴＫ（チミジンキナーゼ）は、細胞死に導く毒性の生成物にＧＣＶを変換する。ここでは予測されるとおり、肝がん細胞株HepG2はベクターにより標的とされ、大きく低減した生存率を結果的にもたらす。対照細胞株HeLaは生きたままである。右にあるチャートは、ＨＳＶ－ＴＫが構成的プロモーターによって駆動されおよび両方の細胞株において同様のレベルで発現したときに、両方の細胞株がＨＳＶ－ＴＫ＋ＧＣＶ作用を受けやすいということを示す。

回路「オプション１」を実施する追加の発散カセット（図５Ａ）をレンチウイルスベクター中に埋め込み、および、蛍光アウトプットを用いてin vitroでの選択的アウトプット発現について試験した。ここでは、カセットに隣接するようにインスレーターを使用し、および、２対の異なるインスレーターペアを、インスレーターペアなしのコンストラクトの次に採用した。全てのコンストラクトは、ポジティブコントロール細胞株Huh7およびHepG2において同程度のアウトプット発現を示し、および、ネガティブコントロール細胞株HCT-116において極めて低い発現を示した（図５Ｂ）。これらの統合ベクターもまた、２か月までの間経時的に追跡し、遺伝子発現における損失はほんのわずかのみであった。並行して、ネガティブコントロール細胞株は、一貫した低い発現を示した（図５Ｃ）。

細胞ターゲティングプログラム「Sox9/10 AND HNF1A/B AND NOT(miR-122)」を実行する、発散ＤＮＡカセットおよび「オプション１」と「オプション３ａ」に従う回路を実施したＡＡＶウイルスベクターを、播種性肝がんの同所的マウスモデルにおいてin vivoでさらに試験した。Nod-SCID-Gamma（NSG）免疫欠損マウスに外科手術を経させ、そこではHepG2がん細胞を脾臓中へと注射し、門脈循環を介して肝臓へ伝播させ、および複数の腫瘍病巣を形成した（図６Ａ）。脾臓における原発腫瘍形成を防ぐために、脾臓を外科的に切除した。細胞は、腫瘍負荷のin vivoトラッキングおよび腫瘍病巣の死後検査を可能にするために、事前にＹＦＰ蛍光レポーターおよびルシフェラーゼ遺伝子で予めオーグメント（augment）させておいた。

腫瘍細胞注入および腫瘍確立に続いて、AAV-DJビリオンを尾静脈中へと全身注射した。第１の実験（図６Ｂ）において、蛍光レポータータンパク質mCherryを、アウトプットの腫瘍特異的発現を計測するために使用した。T-miR-122特徴なしの回路のバリアント（「オプション１」のみ）もまた参照として試験し、ならびに構成的プロモーター下でmCherryを発現する対照ベクターもまた試験した。図６Ｂ中のデータが示すとおり、３つ全てのインプットを処理する回路をコードするビリオンは、腫瘍へアウトプット遺伝子発現を標的化することが可能であり、一方、「オプション１」のみを実施する回路は、健康な肝臓における第三者的なアウトプット発現を結果的にもたらす。

小分子プロドラッグガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下で細胞死に導く細胞毒性アウトプットＨＳＶ－ＴＫを用いて、三入力細胞ターゲティングプログラムを実施するベクターを構築した（図７Ａ）。データは、処置された動物（ウイルスベクターを尾静脈に２回注射し、毎日のガンシクロビルの投与がこれに続いた）が、対照群と比較してはるかに低い腫瘍負荷を有したことを示す（図７Ｂ～７Ｃ）。このようにして、多入力分類器回路を実施する連続的なＤＮＡカセットをパッケージ化するビリオンについて抗腫瘍の潜在性を実証した。

参考文献

他の態様
この明細書に開示される全ての特徴は、あらゆる組み合わせで組み合わせられてもよい。この明細書に開示される各特徴は、同じ、等価または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。よって、明示的に別様に記述されない限り、開示された各特徴は、等価のまたは類似の特徴の包括的なシリーズのほんの一例である。
上の記載から、当業者は簡単に本開示の必須の特色を見極めることができ、および、その精神および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適応させるために本開示の種々の変更および改良を行うことができる。よって、他の態様もまた、請求項の範囲内にある。

均等物
数種の本発明の態様が本明細書に記載されおよび例証されているところ、当該技術分野の通常の知識の者は、機能を発揮するための、ならびに／あるいは、結果および／または本明細書に記載される利点の１つ以上を得るための、様々な他の手段および／または構造を、容易に構想でき、および、かかるバリエーションおよび／または改良は、本明細書に記載される本発明の態様の範囲内にあると認められる。より一般的に、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および構成は例示的であることを意味するということ、および、現実のパラメーター、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示（単数または複数）が使用される具体的な応用（単数または複数）に依存するということを容易に当然理解する。当業者は、日常的な実験を使用する以上のことをしなくても、本明細書に記載される具体的な本発明の態様に対する多数の等価物を認識するか、または見極めることができる。

したがって、前述の態様は一例として提示されたのみであるということ、および、添付の請求項およびそれらの等価物の範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載されおよびクレームされたとおりとは別様に実践されてもよいということが理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書に記載される各々の個々の、特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられる。これに加えて、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のあらゆる組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾するものでなければ、本開示の本発明の範囲内に包含される。

本明細書に定義されおよび使用されるとおりの全ての定義は、辞書的な定義、参照により組み込まれる文献中の定義、および／または定義される用語の普通の意味、に対して支配的であると理解されなければならない。
本明細書に開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々がそのために引用された主題に対して参照により組み込まれ、一部の場合においては文献の全体を網羅し得る。
不定冠詞「a」および「an」は、明細書中および請求項中で本明細書に使用されるとき、反対のことが明示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されなければならない。

用語「および／または」は、明細書中および請求項中で本明細書に使用されるとき、そのように等位接続された要素の「一方または両方」、すなわち、ある場合においては等位接続的に存在し他の場合においては選言的に存在することを意味するものと理解されなければならない。「および／または」で列記された複数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように等位接続された要素の「１つ以上」と解されなければならない。「および／または」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、それらの具体的に識別される要素に関係あろうと無関係であろうと、任意に存在していてもよい。このようにして、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（comprising）」などのオープンエンドの言葉と併せて使用されるとき、１つの態様においては、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意に包含する）に；別の態様においては、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意に包含する）に；さらに別の態様においては、ＡおよびＢの両方（他の要素を任意に包含する）に；等、言及することができる。

明細書中および請求項中で本明細書に使用されるとき、「または（or）」は、上で定義されたとおりの「および／または」と同じ意味を有するものと理解されなければならない。例えば、項目をリストに分けるとき、「または」もしくは「および／または」は、包括的であるものとして、すなわち、少なくとも１つのものの包含であるが、しかし、要素の数もしくはリストの１つよりも多くのものをも、および任意に追加の列記されていない事項をもまた包含すると解釈されるものとする。「のうちの１つのみ（only one of）」、または「のちょうど１つ（exactly one of）」、あるいは請求項中で使用されるときの「からなる（consisting of）」など、反対のことが明示された用語のみが、要素の数もしくはリストのちょうど１つの要素を包含することを指す。一般に、用語「または」は、本明細書に使用されるとき、「いずれか（either）」、「のうちの一方（one of）」、「のうちの１つのみ（only one of）」、または「のちょうど１つ（exactly one of）」などの排他性の用語に先行されるときのみ、排他的な選択肢（すなわち「一方または他方であるがしかし両方ではない」）を表すものとして解釈されるものとする。請求項中で使用されるとき、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許法の分野において使用されるときのその通常通りの意味を有するものとする。

明細書中および請求項中で本明細書に使用されるとき、１つ以上の要素のリストに言及する場合、句「少なくとも１つの」は、要素のリスト中の要素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、しかし必ずしも、要素のリスト内に具体的に列記された一つ一つの要素のうちの少なくとも１つを包含するものではなく、および、要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを排除するものではないものと理解されなければならない。この定義は、句「少なくとも１つの（at least one）」が指す要素のリスト内の具体的に識別される要素以外に、それらの具体的に識別される要素に関係あろうと無関係であろうと、要素が任意に存在してもよいということをもまた許容する。このようにして、非限定例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等価的に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または等価的に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様においては、Ｂの存在なしでの、少なくとも１つの、任意に１つより多い場合も包含する、Ａ（および任意にＢ以外の要素を包含する）；別の態様においては、Ａの存在なしでの、少なくとも１つの、任意に１つより多い場合も包含する、Ｂ（および任意にＡ以外の要素を包含する）；さらにまた別の態様においては、少なくとも１つの、任意に１つより多い場合も包含する、Ａ、および、少なくとも１つの、任意に１つより多い場合も包含する、Ｂ（および任意にその他の要素を包含する）；等々、を指すことができる。

１つよりも多いステップまたは動作を包含するあらゆる方法において、方法のステップまたは動作の順序は、反対のことが明示されない限り、必ずしも方法のステップまたは動作が述べられた順序に限定されるものではないということもまた理解されなければならない。

請求項中ならびに上の明細書中では、「含む（comprising）」、「包含する（including）」、「抱える（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「関与させている（involving）」、「持っている（holding）」、「で構成される（composed of）」、およびこれに類するものなどの全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、包含するがそれに限定されないということを意味するものとして理解される。米国特許庁米国特許審査基準セクション2111.03に規定されているとおり、移行句「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、夫々閉鎖または半閉鎖移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例として、「含む（comprising）」）を使用したこの書面に記載される態様はまた、代替の態様において、オープンエンドの移行句によって記載される特徴「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」ものとしても企図されるということが当然理解されなければならない。例えば、本開示に「ＡおよびＢを含む組成物」と記載されている場合、本開示はまた、代替の態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」をも企図する。

Claims (79)

1. 少なくとも２つのカセットをコードする連続的なポリ核酸分子であって、各カセットは、制御成分および応答成分を含む、前記連続的なポリ核酸分子。
2. （ｉ）少なくとも１つのカセットが、トランス活性化因子応答要素を含む５’制御成分、およびアウトプットを含む３’応答成分を含み；および
   （ｉｉ）少なくとも１つのカセットが、５’制御成分、およびトランス活性化因子タンパク質をコードする核酸配列を含む３’応答成分を含み；および
   ここで、（ｉｉ）のトランス活性化因子は、タンパク質として発現したときに（ｉ）のトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する、請求項１に記載の連続的なポリ核酸分子。
3. トランス活性化因子が、独立してトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する、請求項２に記載の連続的なポリ核酸分子。
4. （ｉ）におけるカセットの５’制御成分が、転写因子応答要素および／または最小プロモーターをさらに含む、請求項２または３に記載の連続的なポリ核酸分子。
5. トランス活性化因子が、転写因子応答要素に結合した転写因子の存在下でのみトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する、請求項４に記載の連続的なポリ核酸分子。
6. ５’制御成分が、５’から３’へ、トランス活性化因子応答要素、転写因子応答要素、および最小プロモーターを含む、請求項４に記載の連続的なポリ核酸分子。
7. ５’制御成分が、５’から３’へ、転写因子応答要素、トランス活性化因子応答要素、および最小プロモーターを含む、請求項４に記載の連続的なポリ核酸分子。
8. （ｉ）における５’制御成分が、プロモーター要素をさらに含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
9. プロモーター要素が、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む、請求項８に記載の連続的なポリ核酸分子。
10. （ｉ）における５’制御成分が、５’から３’へ、トランス活性化因子応答成分およびプロモーター要素、および任意に最小プロモーターを含む、請求項８または９に記載の連続的なポリ核酸分子。
11. （ｉｉ）におけるカセットの５’制御成分が、プロモーター要素を含む、請求項２～１０のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
12. プロモーター要素が、転写因子応答要素および最小プロモーターを含み、任意に、転写因子応答要素は唯一のものである、請求項１１に記載の連続的なポリ核酸分子。
13. プロモーター要素が、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメント、および任意に最小プロモーターを含む、請求項１１に記載の連続的なポリ核酸分子。
14. （ｉ）の少なくとも１つのカセットと（ｉｉ）の少なくとも１つのカセットとが、収斂配向である、請求項２～１３のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
15. （ｉ）の少なくとも１つのカセットと（ｉｉ）の少なくとも１つのカセットとが、発散配向である、請求項２～１３のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
16. （ｉ）の少なくとも１つのカセットと（ｉｉ）の少なくとも１つのカセットとが、ヘッドトゥーテール配向である、請求項２～１４のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
17. （ｉ）におけるカセットの３’応答成分が、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含む、請求項２～１６のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
18. 少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位が、アウトプットに対し３’側である、請求項１７に記載の連続的なポリ核酸分子。
19. 少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位が、アウトプットに対し５’側であるかまたはアウトプット内にある、請求項１７または１８に記載の連続的なポリ核酸分子。
20. （ｉｉ）におけるカセットが、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含む、請求項２～１３のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
21. 少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位が、トランス活性化因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対し３’側である、請求項２０に記載の連続的なポリ核酸分子。
22. 少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位が、トランス活性化因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対し５’側であるかまたはトランス活性化因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列内にある、請求項２０または２１に記載の連続的なポリ核酸分子。
23. （ｉ）におけるカセットの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位と（ｉｉ）におけるカセットの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位とが、同じ核酸配列であるか、または、同じマイクロＲＮＡによって制御される異なる配列である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
24. 少なくとも１つのカセットが、インスレーターに隣接している、請求項２～２３のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
25. 少なくとも１つのカセットのトランス活性化因子が、tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16、またはNarLc-RelAである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
26. アウトプットが、タンパク質またはＲＮＡ分子である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
27. アウトプットが、治療剤である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
28. アウトプットが、蛍光タンパク質、細胞毒素、プロドラッグの活性化を触媒する酵素、免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡ修飾因子、細胞表面受容体、遺伝子発現制御因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／または、ベクター複製のために必要とされる因子である、請求項２６または２７に記載の連続的なポリ核酸分子。
29. 免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡが、サイトカインまたはコロニー刺激因子である、請求項２８に記載の連続的なポリ核酸分子。
30. ＤＮＡ修飾因子が、遺伝的欠陥を修正することを意図したタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡ修飾酵素、および／またはＤＮＡ修飾系の成分である、請求項２８に記載の連続的なポリ核酸分子。
31. ＤＮＡ修飾酵素が、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、または、CRISPR/Cas ＤＮＡ修飾系のタンパク質成分である、請求項３０に記載の連続的なポリ核酸分子。
32. 遺伝子発現制御因子が、遺伝子発現を制御することが可能なタンパク質であるか、または、遺伝子発現を制御することが可能な多成分系の成分である、請求項２８に記載の連続的なポリ核酸分子。
33. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子を含む、ベクター。
34. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子を含む、操作されたウイルスゲノム。
35. ウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム、レンチウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、麻疹ウイルスゲノム、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノム、パルボウイルスゲノム、セネカバレーウイルスゲノム、マラバウイルスゲノム、または一般的な風邪ウイルスゲノムである、請求項３４に記載の操作されたウイルスゲノム。
36. 請求項３４または３５に記載の操作されたウイルスゲノムを含む、ビリオン。
37. 少なくとも１つのカセットをコードする連続的なポリ核酸分子であって、ここでカセットは、
    （ｉ）トランス活性化因子応答要素を含む５’制御成分；および
    （ｉｉ）アウトプット、トランス活性化因子、および任意であるポリシストロニック発現要素を含む３’応答成分、ここで、アウトプットとトランス活性化因子とは任意にポリシストロニック発現要素によって分離されている、を含み；
    ここで、応答成分の転写は、単一ｍＲＮＡを生成し；および
    ここで、（ｉｉ）のトランス活性化因子は、タンパク質として発現したときに（ｉ）のトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する、前記連続的なポリ核酸分子。
38. トランス活性化因子が、独立してトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する、請求項３７に記載の連続的なポリ核酸分子。
39. （ｉ）における５’制御成分が、転写因子応答要素および／または最小プロモーターをさらに含む、請求項３７または３８に記載の連続的なポリ核酸分子。
40. トランス活性化因子が、転写因子応答要素に結合した転写因子の存在下でのみトランス活性化因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する、請求項３９に記載の連続的なポリ核酸分子。
41. ５’制御成分が、５’から３’へ、トランス活性化因子応答要素、転写因子応答要素、および最小プロモーターを含む、請求項３９に記載の連続的なポリ核酸分子。
42. ５’制御成分が、５’から３’へ、転写因子応答要素、トランス活性化因子応答要素、および最小プロモーターを含む、請求項３９に記載の連続的なポリ核酸分子。
43. （ｉ）における５’制御成分が、プロモーター要素をさらに含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
44. プロモーター要素が、哺乳動物プロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む、請求項４３に記載の連続的なポリ核酸分子。
45. （ｉ）における５’制御成分が、５’から３’へ、トランス活性化因子応答成分およびプロモーター要素を含む、請求項４３または４４に記載の連続的なポリ核酸分子。
46. （ｉｉ）の３’応答成分が、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含む、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
47. 少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位が、アウトプットおよび／またはトランス活性化因子に対し３’側である、請求項４６に記載の連続的なポリ核酸分子。
48. 少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位が、アウトプットおよび／またはトランス活性化因子に対し５’側であるかまたはアウトプットおよび／またはトランス活性化因子の内部にある、請求項４６または４７に記載の連続的なポリ核酸分子。
49. 少なくとも１つのカセットが、インスレーターに隣接している、請求項３７～４８のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
50. 少なくとも１つのカセットのトランス活性化因子が、tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16、またはNarLc-RelAである、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
51. アウトプットが、タンパク質またはＲＮＡ分子である、請求項３７～５０のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
52. アウトプットが、治療用タンパク質またはＲＮＡ分子である、請求項３７～５１のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子。
53. アウトプットが、蛍光タンパク質、細胞毒素、プロドラッグの活性化を触媒する酵素、免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡ修飾因子、細胞表面受容体、遺伝子発現制御因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／または、ベクター複製のために必要とされる因子である、請求項５１または５２に記載の連続的なポリ核酸分子。
54. 免疫調節タンパク質および／またはＲＮＡが、サイトカインまたはコロニー刺激因子である、請求項５３に記載の連続的なポリ核酸分子。
55. ＤＮＡ修飾因子が、遺伝的欠陥を修正することを意図したタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡ修飾酵素、および／またはＤＮＡ修飾系の成分である、請求項５３に記載の連続的なポリ核酸分子。
56. ＤＮＡ修飾酵素が、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、または、CRISPR/Cas系のタンパク質成分である、請求項５５に記載の連続的なポリ核酸分子。
57. 遺伝子発現制御因子が、遺伝子発現を制御することが可能なタンパク質であるか、または、遺伝子発現を制御することが可能な多成分系の成分である、請求項５３に記載の連続的なポリ核酸分子。
58. 請求項３７～５７のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子を含む、ベクター。
59. 請求項３７～５７のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子を含む、操作されたウイルスゲノム。
60. ウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム、レンチウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、麻疹ウイルスゲノム、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノム、パルボウイルスゲノム、セネカバレーウイルスゲノム、マラバウイルスゲノム、または一般的な風邪ウイルスゲノムである、請求項５９に記載の操作されたウイルスゲノム。
61. 請求項５９または６０に記載の操作されたウイルスゲノムを含む、ビリオン。
62. 細胞の集団を、請求項２～３２のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子、請求項３３に記載のベクター、請求項３４または３５に記載の操作されたウイルスゲノム、または請求項３６に記載のビリオンと接触させることを含む、細胞の集団において細胞特異的イベントを刺激する方法であって、ここで、細胞特異的イベントは、
    （ｉ）少なくとも１つのカセットの制御成分に結合し、および該成分をトランス活性化する内因性転写因子；および／または
    （ｉｉ）プロモーターフラグメントの転写活性；および／または
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのカセットの応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡ、によって制御される、前記方法。
63. 細胞の集団を、請求項３７～５７のいずれか一項に記載の連続的なポリ核酸分子、請求項５８に記載のベクター、請求項５９または６０に記載の操作されたウイルスゲノム、または請求項６１に記載のビリオンと接触させることを含む、細胞の集団において細胞特異的応答を刺激する方法であって、ここで、細胞特異的イベントは、
    （ｉ）少なくとも１つのカセットの５’制御成分の転写因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する内因性転写因子；および／または
    （ｉｉ）プロモーターフラグメントの転写活性；および／または
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのカセットの３’応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡ、によって制御される、前記方法。
64. 細胞の集団が、少なくとも１つの標的細胞および少なくとも１つの非標的細胞を含み、ここで、標的細胞と非標的細胞とは、
    （ｉ）少なくとも１つのカセットの制御成分に結合し、および該成分をトランス活性化する内因性転写因子のタンパク質レベルまたは活性；および／または
    （ｉｉ）プロモーターフラグメントの転写活性；および／または
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのカセットの応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡのＲＮＡレベルまたは活性；の点で異なり、および
    ここで、その異なる（ｉ）におけるタンパク質レベルまたは活性、および／または（ｉｉ）におけるプロモーターフラグメントの転写活性、および／または（ｉｉｉ）におけるＲＮＡレベルまたは活性は、標的細胞と非標的細胞とを、少なくとも１つのカセットの応答成分のアウトプットの発現レベルの点で異なるようにさせ、それによって細胞特異的イベントを刺激する、請求項６２または６３に記載の方法。
65. 細胞の集団が、少なくとも１つの標的細胞および少なくとも１つの非標的細胞を含み、ここで、標的細胞と非標的細胞とは、
    （ｉ）少なくとも１つのカセットの５’制御成分の転写因子応答要素に結合し、および該要素をトランス活性化する内因性転写因子のタンパク質レベルまたは活性；および／または
    （ｉｉ）プロモーターフラグメントの転写活性；および／または
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのカセットの３’応答成分のマイクロＲＮＡ標的部位に相補的である少なくとも１つの内因性マイクロＲＮＡのＲＮＡレベルまたは活性；の点で異なり、および
    ここで、その異なる（ｉ）におけるタンパク質レベルまたは活性、および／または（ｉｉ）におけるプロモーターフラグメントの転写活性、および／または（ｉｉｉ）におけるＲＮＡレベルまたは活性は、標的細胞と非標的細胞とを、少なくとも１つのカセットの３’応答成分のアウトプットの発現レベルの点で異なるようにさせ、それによって細胞特異的イベントを刺激する、請求項６４に記載の方法。
66. ３’応答成分のアウトプットの発現レベルが、標的細胞型と非標的細胞型との間で、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、または少なくとも１０，０００倍異なる、請求項６４または６５に記載の方法。
67. 標的細胞集団の細胞が、腫瘍細胞であり、および、細胞特異的イベントが、細胞死である、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 腫瘍細胞死が、活性化受容体リガンド、特異的抗原、刺激サイトカイン、またはそれらのいずれかの組み合わせの発現を通じた免疫ターゲティングに媒介される、請求項６７に記載の方法。
69. 標的細胞集団の細胞が、老化細胞であり、および、細胞特異的イベントが、細胞死である、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
70. 細胞の集団を、プロドラッグと、またはアウトプットによって治療剤もしくは毒性化合物へと代謝される非毒性の前駆体化合物と接触させることをさらに含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 標的細胞集団の細胞が、同型の野生型細胞に対して相対的に因子を差次的に発現し、および、細胞特異的イベントが、因子の発現レベルを調節することである、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
72. アウトプット発現が、標的細胞集団の生存を確保し、一方、アウトプット発現の欠如に起因しておよび無関係かつ非特異的な細胞死誘発剤の存在下で非標的細胞が排除される、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
73. 標的細胞集団の細胞が、対象の特定の表現型を、アウトプット発現がこの特定の表現型の細胞に限定されるように含む、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
74. 標的細胞集団の細胞が、選ばれた細胞型であり、および、細胞特異的イベントが、選ばれた細胞型において自然には存在しないかまたは不活性である遺伝子の発現を通じた新規な機能をコードすることである、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
75. 細胞の集団が、多細胞生物を含む、請求項６２～７４のいずれか一項に記載の方法。
76. 多細胞生物が、動物である、請求項７５に記載の方法。
77. 動物が、ヒトである、請求項７６に記載の方法。
78. 細胞の集団が、ex vivoで接触させられる、請求項６２～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 細胞の集団が、in vivoで接触させられる、請求項６２～７７のいずれか一項に記載の方法。

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