JP2023522025A - 細胞分類指標回路およびその使用の方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書において開示されるのは、正確なin vivoでの細胞ターゲティングのための、高度にコンパクトなマルチインプット遺伝子論理ゲートをコードする、切れ目のないＤＮＡ配列、およびin vivoでの送達とかかる切れ目のないＤＮＡ配列との組み合わせを用いて疾患を処置する方法である。

Description

分野
本明細書において開示されるのは、正確なin vivoでの細胞ターゲティングのための、高度にコンパクトなマルチインプット遺伝子論理ゲートをコードする切れ目のない（contiguous）ＤＮＡ配列、およびin vivoでの送達とかかる切れ目のないＤＮＡ配列との組み合わせを用いて疾患を処置する方法である。
背景
遺伝子治療は、遺伝子疾患およびがんのための次世代の治療の選択肢として上昇中である。しかし、現在の遺伝子治療ベクターは、低い効率、高い毒性、および治療用リード化合物（lead）を生み出すための長い開発タイムラインにより悩まされている。これらの弱点についての１つの理由は、遺伝子治療ベクターにおける治療遺伝子発現の不十分に厳格な制御であり、これは、（ｉ）意図されない細胞型および組織における、または（ｉｉ）不十分であるかまたは高すぎる薬用量における遺伝子発現をもたらす。換言すると、遺伝子生成物の投与量（すなわち、細胞１つあたりのタンパク質分子の数）および細胞型により限定される発現の両方に関して、遺伝子発現の正確な制御は、未だ遺伝子治療における未解決の課題である。
要旨
生体分子コンピューティングおよび合成生物学における研究は、長年、以下に基づく新たな型の治療アプローチを可能にしようと努めてきた：（ｉ）分子疾患指標のマルチインプットセンシング；（ｉｉ）治療的応答の強度を決定するための分子レベルの計算；ならびに（ｉｉｉ）高度に正確かつ協調された様式におけるin situでの治療の増強。本明細書において記載されるのは、細胞分類指標遺伝子回路であって、これは、複数の細胞のインプットの複雑な論理的統合を介する、不均一な細胞型の正確な同定を可能にする。また本明細書において記載されるのは、分類指標遺伝子回路を用いて疾患を処置する方法である。がんは、健康な細胞に対する腫瘍の類似性、腫瘍の不均一性、および原発および続発の部位の両方におけるその播種性に起因して、細胞分類指標アプローチから多大な利益を得るであろう疾患のクラスであると考えられてきた。本明細書において記載される研究は、正確な細胞ターゲティングのためのマルチインプット遺伝子回路が、次世代の遺伝子治療のための理想的な手段であるという概念を支持する。
したがって、いくつかの側面において、本開示は、切れ目のないポリ核酸分子に関する。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、
ａ）その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結される第１のＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；および（ｉｉ）表１に列記されるｍｉＲＮＡのための標的部位またはこれらの組み合わせを含む；
ならびに
ｂ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、トランスアクチベーターの核酸配列を含む；
を含み、
ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、およびここで、３’ＵＴＲは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、およびここで、５’ＵＴＲは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、表１において列記されるｍｉｃｒｏＲＮＡまたはこれらの組み合わせのための、標的部位をさらに含む。
いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせをさらに含む。
いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、およびここで、３’ＵＴＲは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、およびここで、５’ＵＴＲは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、第２のカセットの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位とは、同一の核酸配列であるか、または同じｍｉＲＮＡにより調節される異なる配列である。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、各々、ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む。
いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、表３において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、第２のＲＮＡの発現は、転写因子応答エレメントに作動可能に連結される。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、表４において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、トランスアクチベーターは、独立してトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡの発現は、転写因子応答エレメントに作動可能に連結される。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、表４において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、トランスアクチベーターは、転写因子応答エレメントに結合した転写因子の存在下においてのみ、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、第１のカセットおよび／または第２のカセットは、プロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、表５において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含み；かつ、第２のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットの転写因子応答エレメントと第２のカセットの転写因子応答エレメントとは、同一の核酸配列からなる。
いくつかの態様において、第１のカセットの転写因子応答エレメントと第２のカセットの転写因子応答エレメントとは、異なる核酸配列からなる。
いくつかの態様において、第１のカセットおよび／または第２のカセットは、２つ以上の転写因子応答エレメントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットおよび／または第２のカセットは、２つの異なる転写因子応答エレメントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットの上流の調節コンポーネントは、プロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、第２のカセットの上流の調節コンポーネントは、プロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットと第２のカセットとは、収束型（convergent）の配向にある。いくつかの態様において、第１のカセットと第２のカセットとは、分散型（divergent）の配向にある。いくつかの態様において、第１のカセットと第２のカセットとは、ヘッドトゥーテール（head-to-tail）の配向にある。
いくつかの態様において、第１のカセットおよび／または第２のカセットは、インスレーターに隣接する。
いくつかの態様において、第２のカセットのトランスアクチベーターは、ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、ＰＩＴ－ＲｅｌＡ、ＰＩＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＲｅｌＡ、ＮａｒＬｃ－ＶＰ１６、またはＮａｒＬｃ－ＲｅｌＡである。
いくつかの態様において、第２のカセットのトランスアクチベーターは、表２において列記される核酸配列を含む。
いくつかの態様において、アウトプットは、タンパク質またはＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、アウトプットは、治療剤である。いくつかの態様において、アウトプットは、蛍光タンパク質、サイトトキシン、プロドラッグ活性を触媒する酵素、免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡを修飾する因子、細胞表面受容体、遺伝子発現を調節する因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／またはベクター複製のために必要な因子、および／または病原体の抗原ポリペプチドをコードする配列である。いくつかの態様において、アウトプットは、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－ＴＫ）からのチミジンキナーゼ酵素である。いくつかの態様において、免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡは、サイトカインまたはコロニー刺激因子である。いくつかの態様において、ＤＮＡを修飾する因子は、遺伝子欠損を補正することを意図されたタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡを修飾する酵素、および／またはＤＮＡを修飾する系のコンポーネントである。いくつかの態様において、ＤＮＡを修飾する酵素は、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＤＮＡ修飾系のタンパク質コンポーネントである。いくつかの態様において、遺伝子発現を調節する因子は、遺伝子発現を調節することができるタンパク質または遺伝子発現を調節することができるマルチコンポーネント系のコンポーネントである。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、表６において列記される核酸配列を含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、その発現が、トランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるＲＮＡをコードするカセットを含み、ここで、ＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；（ｉｉ）トランスアクチベーターの核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）表１に列記されるｍｉＲＮＡのための標的部位またはこれらの組み合わせを含み；ここで、トランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、ＲＮＡは、アウトプットおよびトランスアクチベーターの核酸配列を分離するポリシストロニック発現エレメントの核酸配列をさらに含む。
いくつかの態様において、ＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、およびここで、３’ＵＴＲは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、ＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、およびここで、５’ＵＴＲは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、ＲＮＡは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む。
いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、表３において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、トランスアクチベーターは、独立してトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、ＲＮＡの発現は、トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントに作動可能に連結される。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、表４において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、トランスアクチベーターは、転写因子応答エレメントに結合した転写因子の存在下においてのみ、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、カセットは、プロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、表５において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットおよびトランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、（ｉ）における上流の調節コンポーネントは、プロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットのトランスアクチベーターは、ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、ＰＩＴ－ＲｅｌＡ、ＰＩＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＲｅｌＡ、ＮａｒＬｃ－ＶＰ１６、またはＮａｒＬｃ－ＲｅｌＡである。
いくつかの態様において、アウトプットは、タンパク質またはＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、アウトプットは、治療用タンパク質またはＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、アウトプットは、蛍光タンパク質、サイトトキシン、プロドラッグ活性を触媒する酵素、免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡを修飾する因子、細胞表面受容体、遺伝子発現を調節する因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／またはベクター複製のために必要な因子、および／または病原体の抗原ポリペプチドをコードする配列である。いくつかの態様において、アウトプットは、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－ＴＫ）からのチミジンキナーゼ酵素である。いくつかの態様において、免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡは、サイトカインまたはコロニー刺激因子である。いくつかの態様において、ＤＮＡを修飾する因子は、遺伝子欠損を補正することを意図されたタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡを修飾する酵素、および／またはＤＮＡを修飾する系のコンポーネントである。いくつかの態様において、ＤＮＡを修飾する酵素は、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のタンパク質コンポーネントである。いくつかの態様において、遺伝子発現を調節する因子は、遺伝子発現を調節することができるタンパク質または遺伝子発現を調節することができるマルチコンポーネント系のコンポーネントである。
他の側面において、本開示は、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸を含む、ベクターに関する。
他の側面において、本開示は、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸を含む、操作されたウイルスゲノムに関する。いくつかの態様において、操作されたウイルスゲノムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム、レンチウイルスゲノム、アデノウィルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、麻疹ウイルスゲノム、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノム、パルボウイルスゲノム、セネカバレー（Seneca valley）ウイルスゲノム、マラバウイルスゲノムまたは風邪ウイルスゲノムから誘導される。
他の側面において、本開示は、本明細書において開示される操作されたウイルスゲノムを含む、ビリオンに関する。いくつかの態様において、ビリオンは、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ－Ｂ１キャプシドを含む。
他の側面において、本開示は、細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法に関する。いくつかの態様において、細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法は、細胞の集団を、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸分子、本明細書において記載されるベクター、本明細書において記載される操作されたウイルスゲノム、または本明細書において記載されるビリオンと接触させることを含み、ここで、細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および１つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性が、２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して、少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性において異なり；およびここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される。
いくつかの態様において、少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとは、内因性転写因子のレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、内因性転写因子に応答する転写因子応答エレメントをさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとは、プロモーターフラグメントのレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、このプロモーターフラグメントをさらに含む。
他の側面において、本開示は、疾患または状態を診断する方法に関する。いくつかの態様において、疾患または状態を診断する方法は、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸分子、本明細書において記載されるベクター、本明細書において記載される操作されたウイルスゲノム、または本明細書において記載されるビリオンを、疾患または状態に関連する１つ以上の徴候または症状を示している対象に投与することを含み、ここで、アウトプットのレベルは、疾患および／または状態の存在または不在を示す。
いくつかの態様において、疾患は、がんである。いくつかの態様において、がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である。
他の側面において、本開示は、疾患または状態を処置する方法に関する。いくつかの態様において、疾患または状態を処置する方法は、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸分子、本明細書において記載されるベクター、本明細書において記載される操作されたウイルスゲノム、または本明細書において記載されるビリオンを、疾患または状態を有する対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、方法は、プロドラッグを投与することをさらに含み、任意にここで、プロドラッグは、ガンシクロビルであり、任意にここで、切れ目のないポリ核酸分子は、表６において列記される核酸配列を含む。
いくつかの態様において、疾患は、がんである。いくつかの態様において、がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である。
いくつかの側面において、本開示は、細胞特異的なイベントを刺激する方法における使用のための方法に関する。いくつかの態様において、細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法における使用のための組成物は、細胞の集団を、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸分子、本明細書において記載されるベクター、本明細書において記載される操作されたウイルスゲノム、または本明細書において記載されるビリオンと接触させることを含み、ここで、細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および１つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性が、２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して、少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性において異なり；およびここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される。
いくつかの態様において、少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとは、内因性転写因子のレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、内因性転写因子に応答する転写因子応答エレメントをさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとは、プロモーターフラグメントのレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、このプロモーターフラグメントをさらに含む。
他の側面において、本開示は、疾患または状態を診断する方法における使用のための組成物に関する。いくつかの態様において、疾患または状態を診断する方法における使用のための組成物は、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸分子、本明細書において記載されるベクター、本明細書において記載される操作されたウイルスゲノム、または本明細書において記載されるビリオンを、疾患または状態に関連する１つ以上の徴候または症状を示している対象に投与することを含み、ここで、アウトプットのレベルは、疾患および／または状態の存在または不在を示す。
いくつかの態様において、疾患は、がんである。いくつかの態様において、がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である。
他の側面において、本開示は、疾患または状態を処置する方法における使用のための組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は、疾患または状態を処置する方法における使用のためのものであって、前記方法は、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸分子、本明細書において記載されるベクター、本明細書において記載される操作されたウイルスゲノム、または本明細書において記載されるビリオンを、疾患または状態を有する対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、方法は、プロドラッグを投与することをさらに含み、任意にここで、プロドラッグは、ガンシクロビルであり、任意にここで、切れ目のないポリ核酸分子は、表６において列記される核酸配列を含む。
いくつかの態様において、疾患は、がんである。いくつかの態様において、がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である。
他の側面において、本開示は、細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法に関する。いくつかの態様において、細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法は、細胞の集団を、切れ目のないポリ核酸分子または前記切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物と接触させることを含み、ここで：ａ）細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および２つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルが、少なくとも非標的細胞のサブセット、例えば少なくとも２つおよび任意に２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルにおいて異なり；かつ、ｂ）切れ目のないポリ核酸分子は、以下を含む：（ｉ）その発現が、トランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、アウトプットの核酸配列；および１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡに対応する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位を含む；ならびに（ｉｉ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、トランスアクチベーターの核酸配列を含む；ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する；およびここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、表６において列記される核酸配列を含む。
いくつかの態様において、細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法は、細胞の集団を、切れ目のないポリ核酸分子または前記切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物と接触させることを含み、ここで、ａ）細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および２つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルが、少なくとも非標的細胞のサブセット、例えば少なくとも２つおよび任意に２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルにおいて異なり；かつ、ｂ）切れ目のないポリ核酸分子は、その発現が、トランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるｍＲＮＡをコードするカセットを含み、ここで、ＲＮＡは、アウトプットの核酸配列；トランスアクチベーターの核酸配列；および１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡに対応する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位を含み；およびここで、トランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、カセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する；およびここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物は、切れ目のないポリ核酸を含むベクター、切れ目のないポリ核酸を含む操作されたウイルスゲノム、またはポリ核酸を含むビリオンを含む。
いくつかの態様において、内因性ｍｉＲＮＡは、表１において列記されるｍｉＲＮＡまたは表１において列記されるｍｉＲＮＡの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、内因性ｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ－７ｃ、ｌｅｔ－７ａ、ｌｅｔ－７ｂ、ｌｅｔ－７ｄ、ｌｅｔ－７ｅ、ｌｅｔ－７ｆ、ｌｅｔ－７ｇ、ｌｅｔ－７ｉ、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－２６ｂ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１６ａ、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの態様において、少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとは、内因性転写因子のレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、内因性転写因子に応答する転写因子応答エレメントをさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとは、プロモーターフラグメントのレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、このプロモーターフラグメントをさらに含む。
いくつかの態様において、標的細胞は、腫瘍細胞であり、細胞特異的なイベントが、腫瘍細胞の死である。いくつかの態様において、腫瘍細胞の死は、活性化受容体リガンド、特異的抗原、刺激性サイトカインまたはこれらの任意の組み合わせの発現を通した免疫ターゲティングにより媒介される。
いくつかの態様において、標的細胞は、老化細胞であり、細胞特異的なイベントは、老化細胞の死である。
いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、アウトプットにより代謝されて治療的または毒性の化合物となるプロドラッグまたは非毒性の前駆体化合物と接触させることをさらに含む。
いくつかの態様において、アウトプット発現は、標的細胞集団の生存を保証するが、一方で、非標的細胞は、アウトプット発現の欠落に起因して、かつ無関係かつ非特異的な細胞死誘導剤の存在下において、除去される。
いくつかの態様において、アウトプット発現がこの特定の表現型の細胞に限定されるように、標的細胞が、目的の特定の表現型を含む。
いくつかの態様において、標的細胞は、選択された細胞型であり、細胞特異的なイベントは、選択された細胞型においては天然で不在であるかまたは不活性な遺伝子の発現を通して、新規の機能をコードすることである。
いくつかの態様において、細胞の集団は、多細胞生物を含む。いくつかの態様において、多細胞生物は、動物である。いくつかの態様において、動物は、ヒトである。
いくつかの態様において、細胞の集団は、ex-vivoで接触させられる。いくつかの態様において、細胞の集団は、in-vivoで接触させられる。
他の側面において、本開示は、切れ目のないポリ核酸分子に関する。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、
ａ）その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結される第１のＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；および（ｉｉ）ｍｉＲＮＡのための標的部位を含み、ここで、前記ｍｉＲＮＡは、哺乳動物の少なくとも２つの異なる健康な組織において、高度に発現されるか、および／または活性であり、１つ以上の型の標的細胞において低レベルで発現される；
ｂ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、 の核酸配列を含む；
を含み、
ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに示すために含められる。本開示は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせたこれらの図面のうちの１つ以上への参照により、より良好に理解され得る。図面において示されるデータは、本開示の範囲を決して限定するものではないことが、理解されるべきである。
図１Ａ－１Ｎ．マルチプラスミド回路の構造のウイルスベクターへの変換。図１Ａ．遺伝子の配置の模式図。分散型（上）および収束型（下）の配置を行った；各々について、補助的なトランスアクチベーターＰＩＴの異なるバリアントを用いて、２つのバリアントを作製した（分散型：Ｄ－Ｐ２：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＲｅｌＡ；Ｄ－ＰＶ：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＶＰＩ６；収束型：Ｃ－Ｐ２：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＲｅｌＡ；Ｃ－ＰＶ：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＶＰＩ６）。図１Ｂ．ＨｅＬａ細胞における一過性トランスフェクションおよび異所性インプット発現を用いる骨格ＤＮＡの性能の試験。各々の群におけるバー、左から右へ：Ｃ－Ｐ２、Ｄ－Ｐ２、Ｃ－ＰＶ、Ｄ－ＰＶ。図１Ｃ．ＨｕＨ－７およびＨｅＬａ細胞における内因的インプットに対するコンストラクトの応答の評価。各々の群におけるバー、左から右へ：Ｃ－Ｐ２、Ｄ－Ｐ２、Ｃ－ＰＶ、Ｄ－ＰＶ。 図１Ａ－１Ｎ．マルチプラスミド回路の構造のウイルスベクターへの変換。図１Ｄ．ｍｉＲ－４２４標的配列を用いて示される、ｍｉＲＮＡ標的を強力なオフスイッチとして組み込むコンストラクトの模式図。分散型（上）および収束型（下）の配置を行った；各々について、補助的なトランスアクチベーターＰＩＴの異なるバリアントを用いて、２つのバリアントを作製した（分散型：Ｄ－Ｐ２：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＲｅｌＡ－Ｔ４２４；Ｄ－ＰＶ：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＶＰＩ６－Ｔ４２４；収束型：Ｃ－Ｐ２：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＲｅｌＡ－Ｔ４２４；Ｃ－ＰＶ：ＰＩＴ＝ＰＩＴ：：ＶＰＩ６－Ｔ４２４）。図１Ｅ．ＴＦインプットの異所性発現を介した、ＨｅＬａ細胞における論理プログラムのＡＮＤ－ゲートコンポーネントの検証。各々の群におけるバー、左から右へ：Ｃ－Ｐ２－Ｔ４２４、Ｄ－Ｐ２－Ｔ４２４、Ｃ－ＰＶ－Ｔ４２４、Ｄ－ＰＶ－Ｔ４２４。図１Ｆ．ＨｕＨ－７およびＨｅＬａ細胞における内因的転写インプットに対する回路応答の評価。バーの順序は、図１Ｅと同一である。 図１Ａ－１Ｎ．マルチプラスミド回路の構造のウイルスベクターへの変換。図１Ｇ．異所性インプット送達を用いる、ＨｅＬａ細胞において分散型配向においてコードされる３インプットプログラムの完全な評価。ｍｉＲ－４２４のみが存在するインプットの組み合わせは、全てのインプットの不在下における発現の欠失、およびｍｉＲ－４２４が負の調節因子であるという事実に基づいて、無益であることが自明であるため、評価しなかった。各々の群におけるバー、左から右へ：Ｄ－Ｐ２－Ｔ４２４、Ｄ－ＰＶ－Ｔ４２４。図１Ｈ．誘導性のＴＦインプットの存在下におけるｍｉＲＮＡスイッチの機能性。回路アウトプットを、ＨｕＨ－７細胞において、ｍｉＲ－４２４模倣物の異所性トランスフェクションありまたはなしで（Ｘ軸下において示される）、試験する。バーの順序は、図１Ｇと同一である。図１Ｉ．ｍｉＲ－１２６標的を保有する回路の、内因的に発現される誘導性のＴＦインプットの存在下における、それらの抑制能力（repressibility）に関する評価。バーの順序は、図１Ｇと同一である。図１Ｊ．２つのＨＣＣ細胞株および陰性対照としてＨｅＬａ細胞による、細胞分類性能に対するｍｉＲＮＡ標的の効果の評価。各々の群におけるバー、左から右へ：Ｄ－Ｐ２、Ｄ－ＰＶ、Ｄ－Ｐ２－Ｔ４２４、Ｄ－ＰＶ－Ｔ４２４、Ｃ－ＰＶ－Ｔ１２６、Ｄ－ＰＶ－Ｔ１２６。 図１Ａ－１Ｎ．マルチプラスミド回路の構造のウイルスベクターへの変換。図１Ｋ．ＨＣＣ細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７における、ＤＪ－シュードタイプＡＡＶベクター中に組み込まれてパッケージングされたｍｉＲＮＡセンサーありおよびなしの回路パネルの評価。ＨｅＬａおよびＨＣＴ－１１６細胞株を、カウンター試料として用いる。各々の群におけるバー、左から右へ：ＣＭＶ、Ｄ－Ｐ２、Ｄ－ＰＶ、Ｄ－Ｐ２－Ｔ４２４、Ｄ－ＰＶ－Ｔ４２４、Ｃ－ＰＶ－Ｔ１２６、Ｄ－ＰＶ－Ｔ１２６。図１Ｌ．ｍｉＲＮＡのパネルの、それらが健康な初代培養肝細胞をＨＣＣ細胞株と区別する能力についてのin vitro評価。各々の群におけるバー、左から右へ：ＴＦＦ５、Ｔ４２４、Ｔ１２６、Ｔ１２２。 図１Ａ－１Ｎ．マルチプラスミド回路の構造のウイルスベクターへの変換。図１Ｍ－１Ｎ．異なるｍｉＲＮＡ標的の配置およびアウトプット抑制の強さに対するそれらの影響の調査。図１Ｍ．異なるコンストラクトの模式図およびそれらの短縮表示。 図１Ａ－１Ｎ．マルチプラスミド回路の構造のウイルスベクターへの変換。図１Ｍ－１Ｎ．異なるｍｉＲＮＡ標的の配置およびアウトプット抑制の強さに対するそれらの影響の調査。図１Ｎ．ＨｅｐＧ２細胞（ｍｉＲ－１２２発現なし）およびＨｕＨ－７細胞（中間レベルのｍｉＲ－１２２発現）において生じたアウトプット。各々の群におけるバー、左から右へ：ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ－７。略語：ＩＴＲ：ＡＡＶ２の内部末端反復配列（internal terminal repeat）；ｐＡ：ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（収束型配向）、分散型配向において、mCherryの次にｈＧＨ、およびＰＩＴ遺伝子の次にＳＶ４０ｐＡ；Cherry：mCherry蛍光タンパク質をコードする配列；ＴＡＴＡ：最小ＴＡＴＡボックス（Angeliciら、2016年）；ＨＮＦ１ ＲＥ：ＨＮＦ１ＡおよびＨＮＦ１Ｂに結合する応答エレメント；ＰＩＴ ＲＥ：ＰＩＴ：：ＲｅｌＡおよびＰＩＴ：：ＶＰ１６トランスアクチベーターに結合する応答エレメント；ＳＯＸ ＲＥ：ＳＯＸ９およびＳＯＸ１０転写因子、ならびに場合によってはＳＯＸファミリーからの他の転写因子ＳＯＸ１～ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ２１、ＳＯＸ３０およびＳＲＹに結合するＤＮＡ配列；ＰＩＴ：プリスチノマイシン（pristinomycin）誘導性トランスアクチベーター（Fusseneggerら、2000年）であって、これは、ＰＩＴ：ＲｅｌＡまたはＰＩＴ：：ＶＰ１６融合物のいずれかを表す。図表のデザイン：アウトプットmCherryの正規化された発現を、Ｙ軸上に示す。
図２Ａ－２Ｆ．ＨＣＣの同所性マウスモデルにおける特異性および効力の予備評価。図２Ａ．ＤＪ－シュードタイプウイルスベクター中にパッケージングされた選択された回路の細胞分類能力のin vitro検証。 図２Ａ－２Ｆ．ＨＣＣの同所性マウスモデルにおける特異性および効力の予備評価。図２Ｂ．構成的対照ベクターと比較した、ＨＳＶ－ＴＫアウトプットによる回路によるin vitro細胞除去。ここで使用された回路の模式図を、棒グラフの上に示す。全ての細胞株または初代培養肝細胞について、ガンシクロビルに対する用量－応答（Ｘ軸）を、構成的ＨＳＶ－ＴＫベクター、回路の存在下において、ＧＣＶのみにより、測定する。細胞生存率ＭＴＳの読み出し値を、Ｙ軸上に示す。 図２Ａ－２Ｆ．ＨＣＣの同所性マウスモデルにおける特異性および効力の予備評価。図２Ｃ．腫瘍担持マウスにおける腫瘍負荷の進行を、パネルにおいて示されるとおり、パイロット実験の異なる実験群（experimental arm）（ｎ＝２）について示したもの。 図２Ａ－２Ｆ．ＨＣＣの同所性マウスモデルにおける特異性および効力の予備評価。図２Ｄ．終了時における肝臓における腫瘍負荷を、発光により定量したものであり、左側の画像は、肝臓（グレースケール）および生物発光シグナルの重ね合わせである。図２Ｅ．終了後の肝臓における腫瘍負荷の定量的分析。図２Ｆ．播種の直後の腫瘍負荷と、終了時の腫瘍負荷との間の相関。処置群からの２個体のマウスは、２つの赤い点により表される。
図３Ａ－３Ｆ．腫瘍ターゲティングプログラムのための選択的でありかつ広範に適用可能なｍｉＲＮＡインプットの同定。図３Ａ．ｍｉＲＮＡ候補の健康な肝臓における高い発現およびＨＣＣ試料中での低い発現に基づく、細胞のプロファイリングおよびｍｉＲＮＡ候補のランク付けの模式図。図３Ｂ．予め選択されたｍｉＲＮＡインプットの機能の検証の模式図。全てのインプットについて、レポーターウイルスベクターを作製し、全てのベクターを全ての目的の試料に（１つずつ）送達し、インプットの生物学的活性を評価する。 図３Ａ－３Ｆ．腫瘍ターゲティングプログラムのための選択的でありかつ広範に適用可能なｍｉＲＮＡインプットの同定。図３Ｃ．２つのＨＣＣ細胞株および初代培養の健康な肝細胞におけるｍｉＲＮＡパネルの機能評価の結果。低いレポーター発現は、高いｍｉＲＮＡ活性に対応する。ＦＦ５は、対照標的である。図３Ｄ．ＮＧＳプロファイリング実験（Dastorら、2018年）において同定されたｍｉＲＮＡ発現カウントと、選択されたｍｉＲＮＡセンサーの機能的応答との間の相関。傾向線は、リプレッサーのヒル関数にフィットさせる。 図３Ａ－３Ｆ．腫瘍ターゲティングプログラムのための選択的でありかつ広範に適用可能なｍｉＲＮＡインプットの同定。図３Ｅ．異なるマウスの臓器における、全身送達の後の、ｍｉＲＮＡレポーターベクターのパネルの定量された発現。同じ臓器における異なるレポーターの発現（図表の上に示される）を、一緒にグループ化する。バーの濃淡は、文献の分析およびプロファイリングのデータに基づいて、どの臓器においてレポーターが応答することを予測されたかを示す。値は、ＴＦＦ５標的を保有する対照ベクターに対して正規化される；これにより、この標的がin vivoでの潜在的なインプットに対して応答しており、多くのレポーターが１よりも高いアウトプット値をもたらすことが明らかである。 図３Ａ－３Ｆ．腫瘍ターゲティングプログラムのための選択的でありかつ広範に適用可能なｍｉＲＮＡインプットの同定。図３Ｆ．多様な臓器におけるレポーター発現の代表的な画像。レポーターの名称を、左側に示す。Ceruleanのパネルは、構成的mCerulean内部対照の発現を示す。Cherryのパネルは、示されたｍｉＲＮＡ標的を備えたmCherryレポーターの残りの発現を示す。
図４Ａ－４Ｃ．in vitroでの回路特異性の検証。図４Ａ．回路の作用機序を評価するために用いられた対照コンストラクト のパネル。略語は、図１Ａ、１Ｄおよび１Ｍにおけるものと同じである。 図４Ａ－４Ｃ．in vitroでの回路特異性の検証。図４Ｂ．１０の細胞株および初代培養肝細胞における内因的インプットに対するＣ．ＴＦ－ＡＮＤ部分回路応答のマッピング。全ての細胞株について、ＳＯＸ９／１０およびＨＮＦ１Ａ／Ｂについてのフィードバック増幅されたセンサーの対数変換されたアウトプットをこれらの細胞における構成的アウトプットに対して正規化したものを、それぞれＸ軸およびＹ軸において示す。Ｃ．ＴＦ－ＡＮＤ回路のアウトプットを、Ｚ軸において示す。図４Ｃ．１０の細胞株および初代培養肝細胞におけるＨＣＣ．Ｖ２回路応答のマッピング。Ｃ．ＴＦ－ＡＮＤ回路の対数変換されたアウトプットおよび対数変換されたＣ．ｌｅｔ－７ｃレポーター回路応答の規模を、Ｘ軸およびＹ軸にプロットし、一方、全ての細胞株における完全な回路のアウトプットを、Ｚ軸において示す。所与の細胞型についての全ての値を、その細胞型における構成的発現に対して正規化する。
図５Ａ－５Ｄ．回路ターゲティングの特異性のin vivoでの特徴づけ。図５Ａ．多様な臓器においてＢ１－シュードタイプＡＡＶベクターを用いて得られた、選択された部分プログラム、対照ベクター、完全なプログラム、およびバックグラウンドのアウトプット。値は、定量的画像分析により得られる。 図５Ａ－５Ｄ．回路ターゲティングの特異性のin vivoでの特徴づけ。図５Ｂ．異なる臓器を代表する組織切片の画像は、示されるとおりの異なるベクターからのmCherryの発現を示す。位相画像およびmCherryのチャネルを示す。２回の異なる撮影を用いて膵臓の切片を表し、mCherryの変化の大きなダイナミックレンジを反映させる。 図５Ａ－５Ｄ．回路ターゲティングの特異性のin vivoでの特徴づけ。図５Ｃ．ＨｅｐＧ２腫瘍担持マウスの、腫瘍における、および臓器における、ＨＣＣ．Ｖ２回路からのmCherryアウトプットの発現。腫瘍は、mCitrineを安定に形質導入され、黄色蛍光チャネルにおいて現れる。図５Ｄ．画像処理を用いて得られた腫瘍担持マウスの腫瘍および多様な臓器におけるmCherry発現の定量的分析。
図６Ａ－６Ｂ．２つのＨＣＣ細胞株および初代培養肝細胞における回路および対照のin vitroでの効力。図６Ａ．任意のＡＡＶベクターの不在下における（四角）、構成的ＨＳＶ－ＴＫ発現カセット（三角）または完全な回路（円）の存在下における、ＧＣＶに対する用量応答。ＭＴＳアッセイを用いて測定された細胞生存率を、Ｙ軸において示す。回路の模式的代表およびそれらのＩＤを、上に示す。 図６Ａ－６Ｂ．２つのＨＣＣ細胞株および初代培養肝細胞における回路および対照のin vitroでの効力。図６Ｂ．構成的ＨＳＶ－ＴＫカセットおよび２つの異なる腫瘍ターゲティングプログラムの異なるベクター投与量に対するＨｕＨ－７細胞株の感受性。上の図表、２つの回路バリアントの間の比較；下、構成的ベクターと第２の回路バリアントとの間の比較。
図７Ａ－７Ｆ．同所性マウスモデルにおけるＨＣＣターゲティング回路の効力。図７Ａ．腫瘍の確立および処置レジメンの模式図。図７Ｂ．多様な実験群における経時的な腫瘍負荷。in vivoでの全身生物発光を介して測定された腫瘍負荷量を、経時的にイメージングする。各々の動物について、負荷量を、ＧＣＶ注射レジメンを開始する１日前の負荷量に対して正規化する。図７Ｃ．主要な実験群における個々の動物についての腫瘍負荷の発達を、ＧＣＶ注射レジメンを開始する１日前の腫瘍負荷に対して正規化したものを示すスパイダープロット。 図７Ａ－７Ｆ．同所性マウスモデルにおけるＨＣＣターゲティング回路の効力。図７Ｄ．多数の実験群からの個々の動物の全身発光の代表的な画像。 図７Ａ－７Ｆ．同所性マウスモデルにおけるＨＣＣターゲティング回路の効力。図７Ｅ．多数の実験群についての、個々の肝臓の画像および終了時において臓器全体の生物発光により測定された肝臓における腫瘍負荷。図７Ｆ．図７Ｅにおける腫瘍負荷の定量。
図８Ａ－８Ｃ．ＡＡＶ－Ｂ１腫瘍形質導入のin vivoでの評価。図８Ａ．肝臓およびＨｅｐＧ２腫瘍において、対照ベクター、ＤＪ－シュードタイプＡＡＶベクター中にパッケージングされたＣ．ＴＦ－ＡＮＤのサブプログラムおよび完全なプログラムのアウトプットを、Ｂ１－シュードタイプＡＡＶベクター中にパッケージングされた完全な回路のアウトプットと比較する。腫瘍は、mCitrineを安定に形質導入され、黄色蛍光チャネルにおいて現れる。図８Ｂ．ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ－Ｂ１の送達による腫瘍におけるＨＣＣ．Ｖ２により駆動されるアウトプットレベル（mCherry）の定量。値は、定量的画像分析により得られる。 図８Ａ－８Ｃ．ＡＡＶ－Ｂ１腫瘍形質導入のin vivoでの評価。図８Ｃ．大きな癌巣のコアセクションにおいてＢ１－シュードタイプＡＡＶにより送達されるＨＣＣ．Ｖ２回路からのアウトプット。
図９Ａ－９Ｃ．複数の肝臓保護的なｍｉＲＮＡを組み合わせる最適化された回路の合理的設計。図９Ａ．強力なｍｉＲ－ｌｅｔ７ｃおよび弱いｍｉＲ－１２２の抑制を組み合わせる候補回路（ＨＣＣ．Ｖ３）の模式図。強力なｍｉＲ－ｌｅｔ７ｃの抑制は、ＨＣＣ．Ｖ２において記載される標的の立体配置を用いて得られる。ｍｉＲ－１２２により誘発される抑制の強度は、ｍｉＲＮＡ標的の数、配置または配列を変化させることにより調整することができる。表されるのは、ｍｉＲ－１２２抑制レベルをＨＣＣ．Ｖ１と比較して低下させるための、明らかとなった３つの異なる戦略である：（ｉ）回路のトランスアクチベーター分岐のみにおける完全なｍｉＲ－１２２標的（Ｔ－１２２*）の使用；（ｉｉ）不完全な相補性を有するｍｉＲ－１２２標的（Ｔ－１２２*）を用いるトランスアクチベーターおよびアウトプットの二重の抑制；または（ｉｉｉ）トランスアクチベーターを抑制するための完全な標的、およびアウトプット区政するための不完全なｍｉＲＮＡ標的に依存する混合アプローチ。肝臓の系統における抑制を最大化しつつ、ＨＣＣ細胞株（特にＨＵＨ－７）のパネルにおける発現の損失を最小化する候補を選択する。各々の候補を、両方の可能なｍｉＲＮＡ標的に相対的に配置されるバリアントにおいて試験する。図９Ｂ．ｍｉＲ－１２２により調節される内因性遺伝子（Ｐ４ＨＡ１）の保存されたＵＴＲ領域から駆動される不完全なｍｉＲ－１２２標的（Ｔ－１２２*）の例（配列番号３０５および３０６、それぞれ上および下）。内因性遺伝子中に存在する配列を用いることにより、またはｍｉＲＮＡシード配列に隣接する領域においてランダム変異を導入することにより、不完全な相補性を有する標的を得る。いずれのアプローチも、様々な用量－応答プロフィールを有する標的の選択物を作製するために用いられるであろう。
詳細な説明
分子コンピューティング（Benenson、2012年）および合成生物学（WeberおよびFussenegger、2012年）の将来性の１つは、複雑な様式において、およびリアルタイムで、疾患に関連する手がかりを感知してこれに応答し、正確かつ「オンデマンド」の治療の発動をもたらす、「スマート」治療の合理的設計（Benensonら、2004年）であった。この将来性を実現するために、３つの別々の課題に取り組む。第１に、治療に関連性のある感知－計算－応答（sense-compute-respond）カスケードのための青写真を設計するために、疾患の機序を十分に理解する。特に、関連性のあるインプットを同定し、最も有効かつ最も毒性の低い応答をもたらすであろうプログラムを、好ましくは決定する。第２に、これらの治療カスケードを実行することができる強力な合成生物学プラットフォームは、存在するか、または目的のために新規に開発される。第３に、これらのプラットフォームを、臨床に関連する治療モダリティーに適応させる。後者の中で、細胞および遺伝子治療は、これらのモダリティーがいずれも操作された遺伝子ペイロードの組み込みを可能にし、しばしばこれを必要とするという事実に基づいて、合成遺伝子回路の臨床への橋渡し（clinical translation）のために最も好適なものとして同定されてきた。
全てのこれらの課題に取り組むことは、潜在的な医療適用の分野を、橋渡しのセッティングにおけるアプローチを開発することに絞り込む。一連の研究は、遺伝子改変された細胞が血液循環中の特定の疾患に関連するキューを感知して、それに応答して治療特性を有する分子の剤を分泌することができる、細胞ベースのインプラントに焦点を当てている。この一連の研究において、細胞インプラントは、生命体の疾患状態を感知し、それに応答して生命体全体に影響を及ぼす治療を生成する、見張り（sentinel）および「工場」（factory）として働く（Auslanderら、2014年；Tastanovaら、2018年；Yeら、2017年）。第２の一連の研究は、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療アプローチに基づき、表面抗原の組み合わせを発現する癌細胞に対するそれらの特異性を改善し、オンターゲット、オフ腫瘍（off-tumor）効果を軽減するために、これらの細胞をマルチインプットコンビナトリアルセンシング特性で増強する（Choら、2018年；Klossら、2013年；Roybalら、2016年；Zahら、2016年）。
遺伝子治療の分野における合成生物学の適用もまた、動物疾患モデルにおいて、初めの成功を示した。卵巣癌細胞を標的としてこれらの細胞において免疫調節因子を発現するレンチウイルスベクターのセットと、操作されたＴ細胞とを組み合わせる、ハイブリッドアプローチは、腹腔への卵巣転移のマウスモデルにおいて効力を示した。細胞のターゲティングを、その組み合わせが腫瘍特異的であることが示された２つのプロモーターの間の、ｍｉＲＮＡスポンジ（miRNA sponge）により可能になるＡＮＤゲートとして実行した（Nissimら、2017年）。別の最近の研究においては、腫瘍溶解性アデノウィルスが、その生活環のマルチインプット論理的制御に基づいて複製するように操作され、皮下腫瘍中への腫瘍内注射により、効力を示した（Huangら、2019年）。
遺伝子および細胞治療のための合成遺伝子回路の主な付加値は、治療的応答を「プログラム」する、すなわち、予め決定された様式において、潜在的に動的な様式において、および多様なフィードバック調節性モチーフと組み合わせた、治療発動の特異性、タイミングおよび投与量を調節する、精巧なアプローチから生じる（Angeliciら、2016年；Xieら、2011年）。しかし、既知の治療用導入遺伝子にその発現を調節する遺伝子回路を供給することは、必ずしも、そのキャプシドを介して付加的にある程度の臓器または細胞型特異性を有するウイルスベクター中にパッケージングされた、構成的に駆動されるか組織特異的プロモーターにより駆動される治療用遺伝子をしばしば用いる、より確立したアプローチよりも優れているとは限らない（Al-Zaidyら、2019年；Landeggerら、2017年；Schollら、2016年）。あるいは、ウイルスベクターは、目的の組織または臓器中に直接的に注射することができ（Juttnerら、2019年；Nelsonら、2016年）、これにより、特異的に標的とする必要がある細胞型の多様性が軽減される。実際に、このアプローチに基づいて操作された臨床的に承認されているＣＡＲ－Ｔ細胞（Juneら、2018年）を含む承認されている治療の大多数および多くの遺伝子治療（KeelerおよびFlotte、2019年）は、満足な効力および安全性のプロフィールを示す。したがって、この利点を証明する責任は、合成生物学コミュニティにある。
がんは、合成生物学により力を与えられる治療から利益を得る多大な可能性を有する疾患である。狭義のがんですら、患者の群の間で、および同じ患者における個々の腫瘍の間ですら、不均一な疾患である（Dagogo-JackおよびShaw、2018年）。患者における腫瘍は、しばしば、原発性および転移性の位置の間で拡散され、これが、腫瘍内注射を、症例のサブセットについてのみ可能なものとしている。最後に、抗腫瘍治療は、非常に毒性であり、これは、非腫瘍細胞におけるそれらの活性化は、しばしば劇的な有害効果をもたらすであろうことを意味している。まとめると、複雑で不均一な細胞集団を正確に標的とする必要性は、腫瘍の拡散集団を標的とするために剤を全身で送達する必要性と組み合わせて、合成生物学アプローチの使用が有益であり得ることを示唆する。
本明細書において開示されるのは、一般的に用いられる遺伝子治療ウイルスおよび非ウイルスベクターに匹敵する、分類指標遺伝子回路をコードする切れ目のないポリ核酸分子である。また本明細書において開示されるのは、細胞の集団において、アウトプット（すなわち、目的の遺伝子）の発現に対して複雑なマルチインプット制御を実行する方法である。これらの方法は、がん（例として、肝細胞癌（ＨＣＣ））などの疾患の診断および処置のための遺伝子治療を含む。
Ｉ．切れ目のないポリ核酸分子の組成物
いくつかの側面において、本開示は、遺伝子回路を含む、切れ目のないポリ核酸分子に関する。本明細書において用いられる場合、用語「切れ目のないポリ核酸分子」とは、単一の連続的な核酸分子（すなわち、一本鎖ポリ核酸分子）または二つの相補的な連続的な核酸分子（すなわち、２本の相補的な鎖を含む二本鎖ポリ核酸分子）を指す。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸は、ＲＮＡ（例として、一本鎖または二本鎖）である。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸は、ＤＮＡ（例として、一本鎖または二本鎖）である。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドである。
本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸は、１つ以上の発現カセットにおいてコードされる遺伝子回路を含む。本明細書において用いられる場合、用語「発現カセット」および「カセット」は、交換可能に用いられ、以下を含むポリ核酸を指す：（ｉ）ＲＮＡをコードする核酸配列（例として、アウトプットの核酸配列および／またはトランスアクチベーターを含むもの）；ならびに（ｉｉ）ＲＮＡの発現レベルを調節する核酸配列（例として、トランスアクチベーター応答エレメント、転写因子応答エレメント、ミニマルプロモーター、および／またはプロモーターエレメント）。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、単一のカセットからなる遺伝子回路を含む。他の態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、２つ以上のカセットを含む遺伝子回路を含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、２つ以上のカセットを含み、少なくとも２つのカセットは、分散型の配向にある。用語「分散型配向」とは、本明細書において用いられる場合、（ｉ）第１のカセットおよび第２のカセットの転写は、切れ目のないポリ核酸分子の異なる鎖上で進行し、（ｉｉ）第１のカセットの転写は、第２のカセットとは離れて指揮され、第２のカセットの転写は、第１のカセットとは離れて指揮される、立体配置を指す。図１Ａ（上の模式図）は、多様な分散型立体配置の例を提供する。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、２つ以上のカセットを含み、少なくとも２つのカセットは、収束型の配向にある。本明細書において用いられる場合、用語「収束型配向」とは、（ｉ）第１のカセットおよび第２のカセットの転写は、切れ目のないポリ核酸分子の異なる鎖上で進行し、（ｉｉ）第１のカセットの転写は、第２のカセットに向けて指揮され、第２のカセットの転写は、第１のカセットに向けて指揮される、立体配置を指す。いくつかの態様において、２つの収束型カセットは、ポリアデニル化配列を共有する。図１Ａ（下の模式図）は、多様な収束型立体配置の例を提供する。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、２つ以上のカセットを含み、少なくとも２つのカセットは、ヘッドトゥーテールの配向にある。本明細書において用いられる場合、用語「ヘッドトゥーテール」とは、（ｉ）第１のカセットおよび第２のカセットの転写または翻訳は、切れ目のないポリ核酸分子の同じ鎖上で進行し、（ｉｉ）第１のカセットの転写または翻訳は、第２のカセットに向けて指揮され、第２のカセットの転写または翻訳は、第１のカセットから離れて指揮される立体配置を指す（５’．．．－＞．．．－＞．．．３’）。
いくつかの態様において、２つのカセットは、１つ以上のインスレーターにより分離される。インスレーターは、インスレーター結合タンパク質により結合された場合に、調節コンポーネントまたは応答コンポーネントを他の近傍の調節エレメントの効果から遮蔽する核酸配列である。例えば、切れ目のないポリ核酸分子のカセットに隣接することにより、各々のカセットを、他のカセットの調節エレメントの効果から遮蔽することができる。インスレーターの例は、当業者に公知である。
本明細書において記載される遺伝子回路は、アウトプット分子（すなわち目的の遺伝子）の発現レベルを調節するために、１つ以上の機構を利用する。したがって、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸の各々は、アウトプットの核酸配列を含むＲＮＡをコードするカセットを含む。例示的なアウトプット分子は、以下に提供される。。アウトプットの核酸配列を含むＲＮＡは、トランスアクチベーター応答エレメント（および、任意に、ＲＮＡの発現を調節する１つ以上のさらなる核酸配列、例えば転写因子応答エレメント、ミニマルプロモーター、および／またはプロモーターエレメント）に作動可能に連結される。
アウトプット分子（すなわち目的の遺伝子）の発現レベルを調節するために、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸の各々は、以下をさらに含む：（ｉ）トランスアクチベーターの核酸配列を含むＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）をコードするカセット；および（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位を含むＲＮＡをコードするカセット。例示的なトランスアクチベーターおよびｍｉＲＮＡ標的部位は、以下に提供される。
トランスアクチベーターの核酸配列を含むＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）をコードするカセットは、ＲＮＡの発現を調節する核酸配列（例として、トランスアクチベーター応答エレメント、転写因子応答エレメント、ミニマルプロモーター、および／またはプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント）に作動可能に連結されていてもよい。いくつかの態様において、トランスアクチベーターの核酸配列を含むＲＮＡをコードするカセットは、アウトプットの核酸配列を含むＲＮＡをコードするものと同じカセットである（すなわち、単一のＲＮＡが、トランスアクチベーターおよびアウトプットの両方の核酸配列を含む）。
ｍｉＲＮＡ標的部位を含むＲＮＡをコードするカセットは、アウトプットの核酸配列を含むＲＮＡをコードするものと同じカセットであってもよい（すなわち、アウトプットの核酸配列を含むＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ標的部位をさらに含む）。あるいは、または加えて、ｍｉＲＮＡ標的部位を含むＲＮＡをコードするカセットは、トランスアクチベーターの核酸配列を含むＲＮＡをコードするものと同じカセットであってもよい（すなわち、トランスアクチベーターの核酸配が、、ｍｉＲＮＡ標的部位をさらに含む）。
いくつかの態様において、カセットによりコードされるＲＮＡの核酸配列は、ポリアデニル化配列をさらに含む。いくつかの態様において、ポリアデニル化配列は、哺乳動物細胞において、転写終結およびポリアデニル化のために好適である。
（ｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位
本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸の各々は、ＲＮＡをコードする１つ以上のカセット（例として、アウトプットをコードする核酸配列を含むＲＮＡおよび／またはトランスアクチベーターの核酸配列を含むＲＮＡ）を含み、これは、ｍｉＲＮＡ標的部位を含む。ｍｉＲＮＡは、典型的には２１～２５ヌクレオチド長である小さい非コードＲＮＡのクラスであって、それらが結合するＲＮＡのレベルを、翻訳の抑制、ｍＲＮＡの切断および脱アデニル化を含む多様な様式において下方調節するものである。用語「ｍｉＲＮＡ標的部位」とは、本明細書において用いられる場合、ｍｉＲＮＡと相補的であって、これにより調節される配列を指す。ｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡ標的部位に結合してこれを調節するｍｉＲＮＡに対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相補性を有していてもよい。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、６～７、６～８、６～９、６～１０、７～８、７～９、７～１０、８～９、８～１０、または９～１０個のｍｉＲＮＡ標的部位を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、複数のｍｉＲＮＡ標的部位を含み、ｍｉＲＮＡ標的部位の各々は、同一の配列を有しているか、または同じｍｉＲＮＡにより調節される異なる核酸配列を含む。他の態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、区別し得るｍｉＲＮＡにより調節される２つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位（すなわち、区別し得るｍｉＲＮＡ標的部位）を含み、これは、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の区別し得るｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の区別し得るｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、６～７、６～８、６～９、６～１０、７～８、７～９、７～１０、８～９、８～１０、または９～１０個の区別し得るｍｉＲＮＡ標的部位を含む。
本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡのｍｉＲＮＡ標的部位は、ＲＮＡの配列中のどこに位置していてもよい。例えば、いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、イントロンを含み、イントロンは、ｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位を含む。
例示的なｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ標的部位は、表１において列記される。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、表１において列記されるｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、表１において列記されるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的部位を含む（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位およびｍｉＲ－１２２標的部位を含む組み合わせ）。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、表１において列記されるｍｉＲＮＡ標的部位に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する、ｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、表１において列記されるｍｉＲＮＡ標的部位に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する、複数のｍｉＲＮＡ標的部位を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせ（例として、ｌｅｔ７ｃ標的部位およびｍｉＲ－１２２標的部位の組み合わせ）を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、ｌｅｔ－７ｃ標的部位（すなわち、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃに対して相補的でありこれにより調節される核酸配列）を含む。いくつかの態様において、ｌｅｔ－７ｃ標的部位は、核酸配列ＡＡＣＣＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ（配列番号４２）からなる。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、ｍｉＲ－２２標的部位（すなわち、ｍｉＲ－２２に対して相補的でありこれにより調節される核酸配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲ－２２標的部位は、核酸配列ＡＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴ（配列番号４３）からなる。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位（すなわち、ｍｉＲ－２６ｂに対して相補的でありこれにより調節される核酸配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位は、核酸配列ＡＣＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＧＡＡ（配列番号４４）からなる。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６－５ｐ標的部位（すなわち、ｍｉＲ－１２６－５ｐに対して相補的でありこれにより調節される核酸配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲ－１２６－５ｐ標的部位は、核酸配列ＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＡＴ（配列番号４５）からなる。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、ｍｉＲ－４２４標的部位（すなわち、ｍｉＲ－４２４に対して相補的でありこれにより調節される核酸配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲ－４２４標的部位は、核酸配列ＧＴＣＣＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＴＧＣＴ（配列番号４８）からなる。
いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットによりコードされるＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２標的部位（すなわち、ｍｉＲ－１２２に対して相補的でありこれにより調節される核酸配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲ－１２２標的部位は、核酸配列ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号４６）からなる。
表１．例示的なｍｉＲＮＡおよび例示的なｍｉＲＮＡ標的部位．
Figure 2023522025000002
Figure 2023522025000003
Figure 2023522025000004
いくつかの態様において、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸は、単一のカセットからなり、ここで、単一のカセットは、（アウトプットの核酸配列およびトランスアクチベーターの核酸配列を含むことに加えて）ｍｉＲＮＡ標的部位を含むＲＮＡをコードする。
他の態様において、切れ目のないポリ核酸は、２つ以上のカセットを含み、そのうちの少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ標的部位を含むＲＮＡをコードする。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子の複数のカセットは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸の各々のｍｉＲＮＡ標的部位は、ユニークである（すなわち、切れ目のないポリ核酸は、１コピーのみのｍｉＲＮＡ標的を含む）。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、各々が、同じ核酸配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位を含む、少なくとも２つのカセットを含む。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、各々が少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位を含む少なくとも２つのカセットを含む、ここで、各々のカセットの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、同じｍｉＲＮＡにより調節される異なる核酸配列を含む。例えば、第１のカセットは、ｍｉＲＮＡ標的部位Ｘを含んでもよく、第２のカセットは、ｍｉＲＮＡ標的部位Ｙを含んでもよく、ｍｉＲＮＡ Ｚは、標的部位Ｘおよび標的部位Ｙを調節する。
いくつかの態様において、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸のｍｉＲＮＡ標的部位を調節するｍｉＲＮＡ（すなわち、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ）は、アウトプット発現が低くなければならない少なくとも１つの細胞型（例として、哺乳動物などの多細胞生物のもの）において、高度に発現されるか、および／または活性である。ｍｉＲＮＡは、アウトプット発現が、前記組織細胞型における、参照の切れ目のないポリ核酸（すなわち、当該ｍｉＲＮＡにより調節されるｍｉＲＮＡ標的部位を欠失するが、それ以外は同一の核酸配列を含むもの）のアウトプット発現のレベルと比較して、少なくとも５０％低下する場合に、本明細書において記載されるように、高度に発現されるか、および／または活性である。いくつかの態様において、アウトプットは、参照の切れ目のないポリ核酸と比較して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％、低下する。
いくつかの態様において、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸のｍｉＲＮＡ標的部位を調節するｍｉＲＮＡ（すなわち、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ）は、アウトプット発現が低くなければならない少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００の細胞型（例として、哺乳動物などの多細胞生物のもの）において、高度に発現されるか、および／または活性である。
いくつかの態様において、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸のｍｉＲＮＡ標的を調節するｍｉＲＮＡ（すなわち、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ）は、アウトプット発現が高くなければならない少なくとも１つの標的細胞型（例として、哺乳動物などの多細胞生物のもの）において、低い発現を有するか、および／または不活性である。ｍｉＲＮＡは、前記標的細胞型における、参照の切れ目のないポリ核酸（すなわち、当該ｍｉＲＮＡにより調節されるｍｉＲＮＡ標的部位を欠失するがそれ以外は同一の核酸配列を含むもの）のアウトプット発現のレベルと比較して、アウトプット発現が４０％未満低下する場合に、本明細書において記載されるように、低い発現を有するか、および／または不活性である。いくつかの態様において、アウトプットは、参照の切れ目のないポリ核酸と比較して、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満低下する。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ標的を含む切れ目のないポリ核酸と参照の連続的なポリ核酸分子とのアウトプット発現のレベルの間に、統計学的差異は存在しない。
いくつかの態様において、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸のｍｉＲＮＡ標的部位を調節するｍｉＲＮＡ（すなわち、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ）は、アウトプット発現が高くなければならない少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００の標的細胞型（例として、哺乳動物などの多細胞生物のもの）において、低レベルにおいて発現されるか、および／または不活性である。
（ｉｉ）例示的なトランスアクチベーター
本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸の各々は、トランスアクチベーターの核酸配列を含むＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）をコードするカセットを含む。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸は、単一のトランスアクチベーターの核酸配列を含む。他の態様において、切れ目のないポリ核酸は、複数のトランスアクチベーター（例として、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のトランスアクチベーター）の核酸配列を含む。
用語「トランスアクチベーター」または「トランスアクチベータータンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、切れ目のないポリ核酸分子上でコードされるタンパク質であって、アウトプット（すなわち、目的の遺伝子）の発現をトランス活性化し、アウトプット（すなわち、目的の遺伝子）をコードする核酸に作動可能に連結されたトランスアクチベーター応答エレメントに結合するものを指す。いくつかの態様において、トランスアクチベーターは、独立して（すなわち、任意のさらなる因子の不在下において）トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。他の態様において、トランスアクチベーターは、転写因子応答エレメントに結合した転写因子の存在下においてのみ、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、トランスアクチベータータンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在する配列とは区別し得るＤＮＡ配列に結合するように操作されている（すなわち、天然に存在しない）。ＤＮＡ結合ドメインの例は、当業者には公知であり、これらに限定されないが、ジンクフィンガー技術またはＴＡＬＥＮ技術を用いて、または細菌からの２コンポーネントシグナル伝達経路の変異体応答調節因子から誘導されるＤＮＡ結合ドメインを含む。
いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、哺乳動物のタンパク質から誘導される。他の態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、非哺乳動物のタンパク質から誘導される。例えば、いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、細菌、酵母または植物に由来するタンパク質から誘導される。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、トランスアクチベーター応答エレメントを標的とするために、さらなるコンポーネント（例として、タンパク質またはＲＮＡ）を必要とする。例えば、いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のもの（例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ４、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）であって、これは、トランスアクチベーター応答エレメントを標的とするために、さらなるガイドＲＮＡのコンポーネントを必要とする。
いくつかの態様において、トランスアクチベータータンパク質は、天然に存在する転写因子から誘導され、ここで、天然に存在する転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、変異しており、これは、野生型転写因子と比較して改変されたＤＮＡ結合特異性をもたらす。いくつかの態様において、トランスアクチベーターは、天然に存在する転写因子である。
いくつかの態様において、トランスアクチベータータンパク質は、トランス活性化ドメイン（すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質）をさらに含む。本明細書において用いられる場合、用語「トランス活性化ドメイン」とは、転写機構をミニマルプロモーターに動員するように機能するタンパク質ドメインを指す。いくつかの態様において、トランス活性化ドメインは、独立して遺伝子の活性化を引き起こさない。いくつかの態様において、トランス活性化ドメインは、天然に存在する。他の態様において、トランス活性化ドメインは、操作されている。トランス活性化ドメインの例は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、ＲｅｌＡトランス活性化ドメイン、ＶＰ１６、ＶＰ４８およびＶＰ６４を含む。
例示的なトランスアクチベーターは、表２において列記される。いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットのトランスアクチベーターは、表２において列記されるトランスアクチベーターまたは、表２において列記される１つ以上のトランスアクチベーターと、そのアミノ酸配列の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する、トランスアクチベーターである。いくつかの態様において、本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸分子は、表２において列記されるトランスアクチベーターの組み合わせ、または表２において列記される１つ以上のトランスアクチベーターと、そのアミノ酸配列の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する、トランスアクチベーターの組み合わせをコードする。
いくつかの態様において、少なくとも１つのカセットのトランスアクチベーターは、ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、ＰＩＴ－ＲｅｌＡ、ＰＩＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＲｅｌＡ、ＮａｒＬｃ－ＶＰ１６、またはＮａｒＬｃ－ＲｅｌＡである。例として、Angelici B. et al., Cell Rep. 2016 Aug 30; 16(9): 2525-2537を参照。
表２．例示的なトランスアクチベーター．ＤＮＡ配列は、表されるタンパク質配列をコードすることができるものの単なる例である；縮重コドンに起因して、ＤＮＡ配列の非常に大きなセットが、同じタンパク質配列をコードし得る。ＲｅｌＡおよびＶＰ１６などのトランスアクチベータードメインは、可能なトランスアクチベータードメイン（ＴＡＤ）の単なる例である。「ＶＰ１６ ＴＡＤ」は、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６遺伝子から誘導されるトランスアクチベータードメインを表す；複数のドメインおよびそれらの組み合わせおよびそれらの変異体が、ＤＮＡ結合ドメインに融合された場合に、トランスアクチベータードメインとして働き得る。トランスアクチベーターのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、全長タンパク質から誘導される場合、かかるドメインの例に過ぎない；それらは、さらに縮小または増大されて、それらの全長タンパク質前駆体よりも多くのアミノ酸を含んでもよい。原核生物の２コンポーネントシグナル伝達系の応答調節因子から誘導されるＤＢＤは、E. coliにおけるそれらのタンパク質配列に基づいて示される。しかし、他の真核生物の株および種からのこれらの遺伝子のオルトログも、まさに同じように用いることができる。加えて、２コンポーネントシグナル伝達経路からの応答調節因子のＤＮＡ結合ドメインであってE. coliにおいてオルトログを有しないものもまた、同じ目的のために用いることができる。Ｍ（下線）は、多様なＤＢＤの前に導入されてそれらの翻訳を可能にする開始コドンを表す。「：：」は、ＤＢＤとＴＡＤとの間の融合の点を表す。
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（ｉｉｉ）例示的なアウトプット分子
本明細書において記載される切れ目のないポリ核酸の各々は、アウトプットの核酸配列（すなわち、目的の遺伝子）を含むＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）をコードするカセットを含む。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸は、単一のアウトプットの核酸配列を含む。他の態様において、切れ目のないポリ核酸は、複数のアウトプット（例として、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアウトプット）の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、アウトプットは、ＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、ＲＮＡ分子は、タンパク質をコードするｍＲＮＡである。いくつかの態様において、アウトプットは、非コードＲＮＡ分子である。非コードＲＮＡ分子の例は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、および長鎖（long）ｎｃＲＮＡを含む。
いくつかの態様において、アウトプットは、治療用タンパク質またはＲＮＡ分子などの治療用分子（すなわち、疾患の処置に関連する）である。治療用分子の例として、これらに限定されないが、抗体（例として、モノクローナルまたはポリクローナル；キメラ；ヒト化；抗体フラグメントおよび抗体誘導体（二重特異性、三重特異性、ｓｃＦｖおよびＦａｂ）を含む）、酵素、ホルモン、炎症性分子、抗炎症性分子、免疫調節性分子、抗がん分子、ショートヘアピンＲＮＡ、低分子干渉（short interfering）ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが挙げられる。前述のクラスの治療用分子の具体例は、当該分野において公知であり、それらのうちの任意のものを、本開示に従って用いてもよい。
いくつかの態様において、アウトプットは、病原体から誘導され、体内で生成された場合に免疫応答を引き起こすことが知られている、抗原タンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドをコードする。
いくつかの態様において、アウトプットは、蛍光タンパク質などの検出可能なタンパク質である。
いくつかの態様において、アウトプットは、サイトトキシンである。本明細書において用いられる場合、用語「サイトトキシン」とは、細胞にとって毒性である物質を指す。例えば、いくつかの態様において、アウトプットは、細胞傷害性タンパク質である。細胞傷害性タンパク質の例は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、グラニュライシン、パーフォリン／グランザイムＢ、およびＦａｓ／Ｆａｓリガンドを含む。
いくつかの態様において、アウトプットは、プロドラッグの活性化を触媒する酵素である。プロドラッグの活性化を触媒する酵素の例は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、カルボキシルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、パラオキソナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、アルカリホスファターゼ、β－グルクロニダーゼ、バラシクロビラーゼ（valacyclovirases）、前立腺特異的抗原、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミダーゼ、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびシトシンデアミナーゼを含む。例として、Yang Y. et al., Enzyme-mediated hydrolytic activation of prodrugs. Acta. Pharmaceutica. Sinica B. 2011 Oct; 1(3): 143-159を参照。同様に、多様なプロドラッグが、当業者に公知であり、これらに限定されないが、アシクロビル、アロプリノール、アジドチミジン、バンブテロール、バカンピシリン、カペシタビン、カプトプリル、カルバマゼピン、カリソプロドール、シクロホスファミド、ジエチルスチルベストロール二リン酸塩、ジピベフリン、エナラプリル、ファムシクロビル、フルダラビン三リン酸塩、フルオロウラシル、ホスアンプレナビル、ホスフェニトイン、フルスルチアミン、ガバペンチンエナカルビル、ガンシクロビル、ゲムシタビン、ヒドラジドＭＡＯ阻害剤、レフルノミド、レボドパ、メタンアミン（methanamine）、メルカプトプリン、マイトマイシン、モルシドミン、ナブメトン、オルサラジン、オメプラゾール、パリペリドン、フェナセチン、ピバンピシリン、プリミドン、プログアニル、シロシビン、ラミプリル、Ｓ－メチルドパ、シンバスタチン、スルファサラジン、スリンダク、テガフール、テルフェナジン、バラシクロビル、バルガンシクロビルおよびジドブジンを含む。
いくつかの態様において、アウトプットは、ＨＳＶ－ＴＫ、ヒトアルファヘルペスウイルス１（ＨＨＶ－１）、UniProtKB-Q9QNF7（ＫＩＴＨ＿ＨＨＶ１）からのチミジンキナーゼである。
いくつかの態様において、アウトプットは、免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡである。本明細書において用いられる場合、用語「免疫調節性タンパク質」（または免疫調節性ＲＮＡ）とは、免疫系の構成成分の活性化を誘導するか、および／またはその活性を増大させることにより、免疫系を調節する（刺激する（すなわち、免疫刺激性のタンパク質またはＲＮＡ）かまたは阻害するタンパク質（またはＲＮＡ）（すなわち、免疫阻害性のタンパク質またはＲＮＡ））を指す。多様な免疫調節性タンパク質が、当業者に公知である。例として、Shahbazi S. and Bolhassani A. Immunostimulants: Types and Funtions. J. Med. Microbiol. Infec. Dis. 2016; 4(3-4): 45-51を参照。いくつかの態様において、免疫調節性タンパク質は、サイトカイン、ケモカイン（例として、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＲ１０）またはコロニー刺激因子である。
いくつかの態様において、アウトプットは、ＤＮＡを修飾する因子である。本明細書において用いられる場合、用語「ＤＮＡを修飾する因子」とは、ＤＮＡの構造を改変し、および／またはＤＮＡの配列を改変する因子を指す（例として、組み換えを誘導することまたは変異の導入により）。いくつかの態様において、ＤＮＡを修飾する因子は、遺伝子欠損を補正することを意図されたタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡを修飾する酵素、および／またはＤＮＡを修飾する系のコンポーネントである。いくつかの態様において、ＤＮＡを修飾する酵素は、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＤＮＡ修飾系のタンパク質コンポーネントである。
いくつかの態様において、アウトプットは、細胞表面受容体である。いくつかの態様において、アウトプットは、キナーゼである。
いくつかの態様において、アウトプットは、遺伝子発現を調節する因子である。用語「遺伝子発現を調節する因子」とは、本明細書において用いられる場合、存在する場合に、少なくとも１つの遺伝子の転写を増大または減少させる任意の因子を指す。いくつかの態様において、遺伝子発現を調節する因子は、タンパク質である。いくつかの態様において、遺伝子発現を調節する因子は、ＲＮＡである。いくつかの態様において、遺伝子発現を調節する因子は、遺伝子発現を調節することができるマルチコンポーネント系のコンポーネントである。
いくつかの態様において、アウトプットは、エピジェネティック修飾因子である。用語「エピジェネティック修飾因子」とは、本明細書において用いられる場合、エピジェネティックな修飾を増大するか、減少させるか、またはこれを改変する因子（例として、タンパク質またはＲＮＡ）を指す。エピジェネティックな修飾の例は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、ＤＮＡのメチル化およびヒストン修飾を含む。
いくつかの態様において、アウトプットは、ベクター複製のために必要な因子である。ベクター複製のために必要な因子の例は、当業者に公知である。
（ｉｖ）調節コンポーネント
ＲＮＡをコードするカセット（例として、アウトプットの核酸配列および／またはトランスアクチベーターを含む）は、調節コンポーネントをさらに含んでもよい。本明細書において記載される場合、調節コンポーネントは、ＲＮＡの発現を制御する（すなわち、その発現の増大または減少を刺激する）核酸配列である。例えば、いくつかの態様において、本明細書において記載されるカセットは、トランスアクチベーター応答エレメント、転写因子応答エレメント、ミニマルプロモーター、および／またはプロモーターエレメントに作動可能に連結されるＲＮＡをコードしていてもよい。調節コンポーネントは、それが、核酸配列に対して、その配列の転写開始および／または発現を調節する（または駆動する）ように、正確な機能的な位置および配向にある場合に、ＲＮＡをコードする核酸に「作動可能に連結される」。
いくつかの態様において、調節コンポーネントは、トランスアクチベーター応答エレメントを含む。「トランスアクチベーター応答エレメント」は、トランスアクチベータータンパク質により結合および認識される最小のＤＮＡ配列を含んでもよい。いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、トランスアクチベータータンパク質により結合および認識される最小のＤＮＡ配列の１つより多くのコピー（すなわち、反復）を含む。いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、トランスアクチベータータンパク質により結合および認識される最小のＤＮＡ配列の、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の反復を含む。いくつかの態様において、反復は、タンデム反復である。いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、最小のＤＮＡ配列の組み合わせを含む。いくつかの態様において、最小のＤＮＡ配列は、スペーサー配列により散在している。いくつかの態様において、スペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長より長い。
いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、最小のＤＮＡ配列からの逸脱を含むか、さらなるＤＮＡ配列に隣接しつつ、なおトランスアクチベータータンパク質に結合することができる。いくつかの態様において、異なるトランスアクチベーター応答エレメントが、互いに接して配置されていてもよく、全て同じトランスアクチベータータンパク質に結合することができる。
例示的なトランスアクチベーター応答エレメントは、表３において列記される。いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、表３において列記される核酸配列、または表３において列記される核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する核酸配列からなる。
表３．例示的なトランスアクチベーター応答エレメント．「：：」は、トランスアクチベータードメイン（ＴＡＤ）とＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）との間の融合点を表す。ＴＡＤおよびＤＢＤの配列の簡略記号は、表２に対応する。ＤＮＡ配列は、以下の命名法を用いる：Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｋ＝ＡまたはＣ；Ｍ＝ＧまたはＴ；Ｙ＝ＡまたはＧ；Ｒ＝ＣまたはＴ；Ｖ＝Ｃ、Ｇ、またはＴ；Ｈ＝Ａ、ＧまたはＴ；Ｄ＝Ａ、ＣまたはＴ；Ｂ＝Ａ、ＣまたはＧ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ。大文字は、強力な保存を表す；小文字記号は、より弱い保存を表す。
Figure 2023522025000017
Figure 2023522025000018
Figure 2023522025000019
Figure 2023522025000020
いくつかの態様において、調節コンポーネントは、転写因子応答エレメントを含む。用語「転写因子応答エレメント」とは、転写因子により結合および認識されるＤＮＡ配列を指す。本明細書において用いられる場合、用語「転写因子」とは、切れ目のないポリ核酸上でコードされないタンパク質であって、遺伝子の転写を調節するものを指す。いくつかの態様において、転写因子は、転写アクチベーターである（すなわち、転写を増大する）。他の態様において、転写因子は、転写阻害剤である（すなわち、転写を阻害する）。いくつかの態様において、転写因子は、細胞の内因性転写因子である。
いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、以下の転写因子のうちの１つ以上に直接的に結合するように、またはそれにより間接的に影響を受けるように、操作される：ＡＢＬ１、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＣＣ３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＭＤＭ４、ＰＡＸ７、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＦＰＴ、ＡＦＦ１、ＣＨＤ１、ＥＲＣＣ６、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＭＥＤ１２、ＰＡＸ８、ＳＭＡＲＣＢ１、ＴＨＲＡＰ３、ＡＦＦ３、ＣＨＤ２、ＥＲＦ、ＨＬＦ、ＭＥＦ２Ｂ、ＰＢＸ１、ＳＭＡＲＣＤ１、ＴＬＸ１、ＡＦＦ４、ＣＨＤ４、ＥＲＧ、ＨＭＧＡ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＰＥＧ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＴＬＸ３、ＡＰＣ、ＣＨＤ５、ＥＳＰＬ１、ＨＭＧＡ２、ＭＥＮ１、ＰＥＲ１、ＳＭＵＲＦ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＲ、ＣＨＤ７、ＥＳＲ１、ＨＯＸＡ１１、ＭＩＴＦ、ＰＨＦ３、ＳＯＸ２、ＳＯＸ４、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＣＩＣ、ＥＴＳ１、ＨＯＸＡ１３、ＭＫＬ１、ＰＨＦ６、ＳＯＸ５、ＴＲＩＭ２４、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＣＩＩＴＡ、ＥＴＶ１、ＨＯＸＡ７、ＭＬＬＴ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＳＯＸ９、ＴＲＩＭ３３、ＡＲＩＤ３Ｂ、ＣＮＯＴ３、ＥＴＶ４、ＨＯＸＡ９、ＭＬＬＴ１０、ＰＬＡＧ１、ＳＲＣＡＰ、ＴＲＩＰ１１，ＡＲＩＤ５Ｂ、ＣＲＥＢ１、ＥＴＶ５、ＨＯＸＣ１１、ＭＬＬＴ３、ＰＭＬ、ＳＳ１８Ｌ１、ＴＲＰＳ１、ＡＲＮＴ、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＥＴＶ６、ＨＯＸＣ１３、ＭＬＬＴ６、ＰＭＳ１、ＳＳＢ、ＴＲＲＡＰ、ＡＲＮＴ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＷＳＲ１、ＨＯＸＤ１１、ＭＹＢ、ＰＮＮ、ＳＳＸ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＡＳＢ１５、ＣＲＴＣ１、ＥＹＡ４、ＨＯＸＤ１３、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＳＳＸ２、ＴＳＨＺ３、ＡＳＸＬ１、ＣＳＤＥ１、ＥＺＨ２、ＩＤ３、ＭＹＣ、ＰＯＵ２Ｆ２、ＳＳＸ４、ＶＨＬ、ＡＴＦ１、ＣＴＣＦ、ＦＥＶ、ＩＲＦ２、ＭＹＣＮ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＴＡＴ３、ＷＨＳＣ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＬＩ１、ＩＲＦ４、ＭＹＯＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＴＡＴ４、ＷＨＳＣ１Ｌ１、ＡＴＭ、ＤＡＣＨ１、ＦＯＸＡ１、ＩＲＦ６、ＮＣＯＡ１、ＰＲＤＭ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＴ１、ＡＴＲＸ、ＤＡＣＨ２、ＦＯＸＥ１、ＩＲＦ８、ＮＣＯＡ２、ＰＲＤＭ１６、ＳＴＡＴ６、ＷＷＰ１、ＢＡＺ２Ｂ、ＤＡＸＸ、ＦＯＸＬ２、ＩＲＸ６、ＮＣＯＡ４、ＰＲＤＭ９、ＳＵＦＵ、ＷＷＴＲ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＤＤＢ２、ＦＯＸＰ１、ＪＵＮ、ＮＣＯＲ１、ＰＲＲＸ１、ＳＵＺ１２、ＸＢＰ１、ＢＣＬ１１Ｂ、ＤＤＩＴ３、ＦＯＸＱ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＮＣＯＲ２、ＰＳＩＰ１、ＴＡＦ１、ＸＰＣ、ＢＣＬ３、ＤＤＸ５、ＦＵＢＰ１、ＫＨＳＲＰ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＲＡＲＡ、ＴＡＦ１５、ＺＢＴＢ１６、ＢＣＬ６、ＤＥＫ、ＦＵＳ、ＫＬＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＢ１、ＴＡＬ１、ＺＢＴＢ２０、ＢＣＬＡＦ１、ＤＩＰ２Ｃ、ＦＸＲ１、ＫＬＦ４、ＮＦＥ２Ｌ３、ＲＢＭ１５、ＴＡＬ２、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＢＣＯＲ、ＤＮＭＴ１、ＧＡＴＡ１、ＫＬＦ５、ＮＦＩＢ、ＲＢＭＸ、ＴＢＸ１８、ＺＦＸ、ＢＲＣＡ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＧＡＴＡ２、ＫＬＦ６、ＮＦＫＢ２、ＲＥＬ、ＴＢＸ２２、ＺＨＸ２、ＢＲＣＡ２、ＤＯＴ１Ｌ、ＧＡＴＡ３、ＬＤＢ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＢＸ３、ＺＩＣ３、ＢＲＤ７、ＥＥＤ、ＧＬＩ３、ＬＭＯ１、ＮＯＮＯ、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＴＣＥＡ１、ＺＩＭ２、ＢＲＤ８、ＥＧＲ２、ＧＴＦ２Ｉ、ＬＭＯ２、ＮＯＴＣＨ２、ＲＸＲＡ、ＴＣＥＢ１、ＺＮＦ２０８、ＢＲＩＰ１、ＥＬＡＶＬ２、ＨＤＡＣ９、ＬＭＸ１Ａ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＡＬＬ３、ＴＣＥＲＧ１、ＺＮＦ２２６、ＢＲＰＦ３、ＥＬＦ３、ＨＥＹ１、ＬＹＬ１、ＮＰＭ１、ＳＡＴＢ２、ＴＣＦ１２、ＺＮＦ３３１、ＢＴＧ１、ＥＬＦ４、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＬＺＴＲ１、ＮＲ３Ｃ２、ＳＥＴＢＰ１、ＴＣＦ３、ＺＮＦ３８４、ＢＴＧ２、ＥＬＫ４、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＭＡＦ、ＮＲ４Ａ３、ＳＦＰＱ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＺＮＦ４６９、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＥＬＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄ、ＭＡＦＡ、ＮＳＤ１、ＳＩＮ３Ａ、ＴＦＡＰ２Ｄ、ＺＮＦ５９５、ＣＢＦＢ、ＥＰ３００、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＭＡＦＢ、ＯＬＩＧ２、ＳＭＡＤ２、ＴＦＤＰ１、ＺＮＦ６３８、ＣＤＸ２、ＥＰＣ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＣ、ＭＡＭＬ１、ＰＡＸ３、ＳＭＡＤ４、ＴＦＥ３、ＣＤＸ４、ＥＲＣＣ２、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＭＡＸ、ＰＡＸ５、ＳＭＡＲＣＡ１、およびＴＦＥＢ。
「転写因子応答エレメント」は、転写因子により結合および認識される最小のＤＮＡ配列を含んでもよい。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、転写因子により結合および認識される最小のＤＮＡ配列の１つより多くのコピー（すなわち、反復）を含む。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、転写因子により結合および認識される最小のＤＮＡ配列の、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の反復を含む。いくつかの態様において、反復は、タンデム反復である。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、最小のＤＮＡ配列の組み合わせを含む。いくつかの態様において、最小のＤＮＡ配列は、スペーサー配列により散在している。いくつかの態様において、スペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長より長い。いくつかの態様において、トランスアクチベーター応答エレメントは、最小のＤＮＡ配列からの逸脱を含むか、さらなるＤＮＡ配列に隣接しつつ、なおトランスアクチベータータンパク質に結合することができる。いくつかの態様において、異なるトランスアクチベーター応答エレメントが、互いに接して配置されていてもよく、全て同じトランスアクチベータータンパク質に結合することができる。
いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、ユニークである（すなわち、切れ目のないポリ核酸は、転写因子応答エレメントの１つのみのコピーを含む）。他の態様において、転写因子応答エレメントは、ユニークではない。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントに結合する転写因子は、それが作動可能に連結されたＲＮＡの発現を活性化する。他の態様において、転写因子応答エレメントに結合する転写因子は、それが作動可能に連結されたＲＮＡの発現を阻害する。
いくつかの態様において、調節コンポーネントは、各々が異なる転写因子により結合された、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の異なる転写因子応答エレメントを含む。いくつかの態様において、調節コンポーネントは、各々が異なる転写因子により結合された、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる転写因子応答エレメントを含む。
例示的な転写因子応答エレメントは、表４において列記される。いくつかの態様において、転写因子応答エレメントは、表４において列記される核酸配列、または表４において列記される核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する核酸配列からなる。
表４．例示的な転写因子応答エレメント．
Figure 2023522025000021
Figure 2023522025000022
Figure 2023522025000023
いくつかの態様において、調節コンポーネントは、プロモーターエレメント（またはプロモーターフラグメント）を含む。例示的なプロモーターエレメントは、表５において列記される。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、表５において列記される核酸配列、または表５において列記される核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する核酸配列からなる。
表５．例示的なプロモーターエレメント．
Figure 2023522025000024
Figure 2023522025000025
Figure 2023522025000026
Figure 2023522025000027
Figure 2023522025000028
Figure 2023522025000029
Figure 2023522025000030
いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、転写因子応答エレメントおよびミニマルプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。いくつかの態様において、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントは、ユニークである（すなわち、切れ目のないポリ核酸は、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントの１つのみのコピーを含む）。他の態様において、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントは、ユニークではない。
いくつかの態様において、調節コンポーネントは、ミニマルプロモーターを含む。本明細書において用いられる場合、用語「ミニマルプロモーター」とは、アウトプットの発現を開始させるために必要であるが十分ではない核酸配列を指す。いくつかの態様において、ミニマルプロモーターは、天然に存在するものである。他の態様において、ミニマルプロモーターは、例えば、天然に存在する配列を改変および／または短縮すること、天然に存在する配列を組み合わせること、または天然に存在する配列を天然に存在しない配列と組み合わせることにより、操作されたものである；各々の場合において、操作されたミニマルプロモーターは、天然に存在しない配列である。いくつかの態様において、ミニマルプロモーターは、ウイルス性または非ウイルス性のソースから操作されたものである。ミニマルプロモーターの例は、当業者に公知である。
いくつかの態様において、調節コンポーネントは、トランスアクチベーター応答エレメント、転写因子応答エレメント、およびミニマルプロモーターを含む。当業者は、これらのエレメントが、多様な立体配置において配向され得ることを理解するであろう。例えば、トランスアクチベーター応答エレメントは、プロモーターエレメントおよび／または転写因子応答エレメントに対して５’または３’であってよい；転写因子応答エレメントは、プロモーターエレメントおよび／またはトランスアクチベーター応答エレメントに対して５’または３’であってよい；プロモーターエレメントは、転写因子応答エレメントおよび／またはトランスアクチベーター応答エレメントに対して５’または３’であってよい。
いくつかの態様において、カセットの調節コンポーネントは、５’から３’へ、トランスアクチベーター応答エレメント、転写因子応答エレメントおよびミニマルプロモーターを含む。いくつかの態様において、調節コンポーネントは、５’から３’へ、転写因子応答エレメント、トランスアクチベーター応答エレメントおよびミニマルプロモーターを含む。
いくつかの態様において、カセットの調節コンポーネントは、トランスアクチベーター応答エレメントおよびプロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、カセットの調節コンポーネントは、５’から３’へ、トランスアクチベーター応答エレメントおよびプロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、カセットの調節コンポーネントは、トランスアクチベーター応答エレメント、プロモーターエレメントおよびミニマルプロモーターを含む。いくつかの態様において、カセットの調節コンポーネントは、５’から３’へ、トランスアクチベーター応答エレメント、プロモーターエレメントおよびミニマルプロモーターを含む。いくつかの態様において、カセットの調節コンポーネントは、５’から３’へ、プロモーターエレメントおよびトランスアクチベーター応答エレメントを含む。いくつかの態様において、カセットの調節コンポーネントは、５’から３’へ、プロモーターエレメント、トランスアクチベーター応答エレメントおよびミニマルプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、プロモーターフラグメントである。
（ｖ）例示的な切れ目のないポリ核酸
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、単一のカセットを有する遺伝子回路を含む。例えば、いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、その発現が、トランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるＲＮＡをコードするカセットを含み、ここで、ＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；（ｉｉ）トランスアクチベーターの核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含み；ここで、トランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、ポリシストロニックな発現エレメントの核酸配列をさらに含む。用語「ポリシストロニック応答エレメント」とは、本明細書において用いられる場合、単一のｍＲＮＡからの２つ以上のタンパク質の生成を促進する核酸配列を指す。ポリシストロニック応答エレメントは、内部認識配列（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドをコードするポリ核酸を含んでもよい。例として、Liu et al., Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci. Rep. 2017 May 19; 7(1): 2193を参照。。いくつかの態様において、ポリシストロニックな発現エレメントは、アウトプットの核酸配列とトランスアクチベーターとを分離する。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、ここで、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位（例えば、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、ここで、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットおよびトランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントおよびトランスアクチベーター応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットおよびトランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターおよびアウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントおよびトランスアクチベーター応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターおよびアウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、５’から３’へ、（ｉ）プロモーターエレメントおよびトランスアクチベーター応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターおよびアウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよびプロモーターエレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターおよびアウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、複数のカセットを有する遺伝子回路を含む。例えば、いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸分子は、以下：
ａ）その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結される第１のＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；および（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む；
ならびに
ｂ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、トランスアクチベーターの核酸配列を含む；
を含み、
ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様において、第１のＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む。
いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、５’ＵＴＲを含み、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ標的部位（例として、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、またはこれらの組み合わせ）を含む。いくつかの態様において、第１のカセットの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、第２のカセットの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位とが、同じ核酸配列であるか、または同じｍｉＲＮＡにより調節される異なる配列である。
いくつかの態様において、第１のＲＮＡは、転写因子応答エレメントに作動可能に連結される。いくつかの態様において、第２のＲＮＡは、転写因子応答エレメントに作動可能に連結される。いくつかの態様において、第１のカセットの転写因子応答エレメントおよび第２のカセットの転写因子応答エレメントは、同一の核酸配列からなる。いくつかの態様において、第１のカセットの転写因子応答エレメントおよび第２のカセットの転写因子応答エレメントは、異なる核酸配列からなる。いくつかの態様において、第１のカセットまたは第２のカセットのいずれかまたは両方が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、・・・、の型の転写因子応答エレメントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含み；第２のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント（ｉｉ）トランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントおよびトランスアクチベーター応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含み；第２のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含み；第２のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）プロモーターエレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントおよびトランスアクチベーター応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含み；第２のカセットは、５’から３’へ、（ｉ）プロモーターエレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットの上流の調節コンポーネントは、転写因子応答エレメントに加えて、プロモーターエレメントを含む。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、転写因子応答エレメントを置き換える。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む。
いくつかの態様において、第１のカセットと第２のカセットとは、収束型配向にある。いくつかの態様において、第１のカセットと第２のカセットとは、分散型配向にある。いくつかの態様において、第１のカセットと第２のカセットとは、ヘッドトゥーテールの配向にある。
第１および／または第２のカセットは、１つ以上のインスレーター（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のインスレーター）に隣接していてもよい。例えば、いくつかの態様において、第１のカセットまたは第２のカセットは、インスレーターに隣接する。いくつかの態様において、第１のカセットおよび第２のカセットの両方が、インスレーターに隣接する。いくつかの態様において、第１のカセットまたは第２のカセットは、両側においてインスレーターに隣接する。
例示的な切れ目のないポリ核酸は、表６において列記される。いくつかの態様において、切れ目のないポリ核酸は、表６において列記される核酸配列、または、表６において列記される核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
表６．例示的な切れ目のないポリ核酸．
Figure 2023522025000031
Figure 2023522025000032
Figure 2023522025000033
Figure 2023522025000034
Figure 2023522025000035
Figure 2023522025000036
Figure 2023522025000037
Figure 2023522025000038
Figure 2023522025000039
Figure 2023522025000040
Figure 2023522025000041
Figure 2023522025000042
Figure 2023522025000043
Figure 2023522025000044
Figure 2023522025000045
Figure 2023522025000046
Figure 2023522025000047
Figure 2023522025000048
Figure 2023522025000049
Figure 2023522025000050
Figure 2023522025000051
Figure 2023522025000052
Figure 2023522025000053
Figure 2023522025000054
Figure 2023522025000055
Figure 2023522025000056
Figure 2023522025000057
Figure 2023522025000058
Figure 2023522025000059
Figure 2023522025000060
Figure 2023522025000061
Figure 2023522025000062
Figure 2023522025000063
Figure 2023522025000064
Figure 2023522025000065
Figure 2023522025000066
ＩＩ．他の組成物
他の側面において、本開示は、ベクターの組成物に関する。いくつかの態様において、ベクターは、上記の切れ目のないポリ核酸分子を含む。
他の側面において、本開示は、操作されたウイルスゲノムの組成物に関する。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、上記の切れ目のないポリ核酸分子を含む。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム、レンチウイルスゲノム、アデノウィルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、麻疹ウイルスゲノム、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノム、パルボウイルスゲノム、セネカバレーウイルスゲノム、マラバウイルスゲノム、または風邪ウイルスゲノムである。
他の側面において、本開示は、ビリオンの組成物に関する。本明細書において用いられる場合、用語「ビリオン」とは、ウイルスの感染性の形態であって、宿主細胞の外側にあるものを指す（例として、ＤＮＡ／ＲＮＡゲノムおよびキャプシドタンパク質を含む）。いくつかの態様において、ビリオンは、上記の操作されたウイルスゲノムを含む。いくつかの態様において、ビリオンは、ＡＡＶ－ＤＪキャプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、ビリオンは、ＡＡＶ－Ｂ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ６キャプシドタンパク質を含む。
他の側面において、本開示は、上記の切れ目のないポリ核酸分子、上記のベクター、上記の操作されたウイルスゲノム、または上記のビリオンを含む、組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤またはバッファーをさらに含む、治療用組成物である。例示的な医薬用の賦形剤およびバッファーは、当業者に公知である。
ＩＩＩ．細胞特異的イベントを刺激する方法
他の側面において、本開示は、細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法に関する。いくつかの態様において、細胞特異的なイベントを刺激する方法は、細胞の集団を、上記の切れ目のないポリ核酸分子、上記のベクター、上記の操作されたウイルスゲノム、または上記のビリオンと接触させることを含み、ここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団のうちの細胞において発現されるアウトプットのレベルを介して引き起こされる。
いくつかの態様において、細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞および少なくとも１つの非標的細胞を含む。標的細胞と非標的細胞型とは、少なくとも１つの内因性転写因子のレベル、ならびに／あるいはは少なくとも１つの内因性プロモーターもしくはそのフラグメントおよび／または少なくとも１つの内因性ｍｉＲＮＡの発現強度において異なる。いくつかの態様において、アウトプットの発現レベルは、標的細胞と非標的細胞との間で、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍異なる。
いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、切れ目のないポリ核酸分子または前記切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物と接触させることを含み、ここで：ａ）細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および２つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルが、２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して、少なくとも２倍高くなる（例として、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍高くなる）ように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡ（例として、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０の内因性ｍｉＲＮＡ）のレベルにおいて異なり；かつ、ｂ）切れ目のないポリ核酸分子は、以下を含む：（ｉ）その発現が、トランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、アウトプットの核酸配列；および１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡに対応する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位を含み；ならびに（ｉｉ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、トランスアクチベーターの核酸配列を含む；ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、切れ目のないポリ核酸分子または前記切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物と接触させることを含み、ここで：ａ）細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および２つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルが、２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して、少なくとも２倍高くなる（例として、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍高くなる）ように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡ（例として、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０の内因性ｍｉＲＮＡ）のレベルにおいて異なり；かつ、ｂ）切れ目のないポリ核酸分子は、その発現が、トランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるｍＲＮＡをコードするカセットを含み、ここで、ＲＮＡは、アウトプットの核酸配列；トランスアクチベーターの核酸配列；および１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡに対応する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位を含み；およびここで、トランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、カセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する。
いくつかの態様において、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性転写因子（例として、少なくとも1、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０の内因性転写因子）のレベルにおいて異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、内因性転写因子に応答する１つ以上の転写因子応答エレメントをさらに含む。
いくつかの態様において、宿主細胞と上記の切れ目のないポリ核酸分子または上記のベクターとを接触させることは、非ウイルス性送達方法を介して行われる。例として、これらに限定されないが、トランスフェクション（例として、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、ＣａＰＯ４媒介性トランスフェクション、脂質媒介性取り込み、ＰＥＩ媒介性取り込み、およびレーザートランスフェクション）、形質転換（例として、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、およびヒートショック）、遺伝子導入、ならびに微粒子銃が挙げられる。
いくつかの態様において、細胞の集団は、ex vivoで接触させられる（すなわち、細胞の集団は、生物体から単離され、細胞の集団は、生物体の外側で接触させられる）。いくつかの態様において、細胞の集団は、in vivoで接触させられる。
本明細書において用いられる場合、用語「内因性」とは、細胞に関する場合、天然の状態において細胞において見出される因子（例として、タンパク質またはＲＮＡ）を指す。いくつかの態様において、内因性転写因子は、少なくとも１つのカセットの調節コンポーネントのプロモーターエレメント（例として、転写因子応答エレメント）に結合してこれを活性化することができる。いくつかの態様において、内因性ｍｉＲＮＡは、少なくとも１つのカセットの調節コンポーネントまたは応答コンポーネントのｍｉＲＮＡ標的部位を補完する。
いくつかの態様において、「トランスアクチベーター」および対応する「トランスアクチベーター応答エレメント」は、トランスアクチベータが、「トランスアクチベーター応答エレメント」に特異的に結合するが、細胞において天然に存在する応答エレメントに対しては、可能な限り結合しないであろうように選択されるであろう。いくつかの態様において、トランスアクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、細胞において存在するネイティブの調節性配列には効率的には結合せず、したがって、過剰な副作用は引き起こさないであろう。
いくつかの態様において、標的細胞と非標的細胞とは、異なる細胞型である。
いくつかの態様において、標的細胞は、癌性細胞であり、非標的細胞は、非癌性細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、癌性肝細胞癌細胞または胆管細胞癌細胞であってよく、非標的細胞は、肝細胞、貪食性のクッパー細胞、星状細胞、類洞内皮細胞を含む、実質性および非実質性の肝臓細胞であってよい。
いくつかの態様において、標的細胞は、肝細胞であり、非標的細胞は、非肝細胞（例として、筋細胞）である。他の態様において、標的細胞と非標的細胞とは、同じ細胞型である（例として、両方が肝細胞である）が、それにもかかわらず、少なくとも１つの内因性転写因子および／または少なくとも１つの内因性ｍｉＲＮＡのレベルにおいて異なる。例えば、標的細胞は、老化筋肉細胞であってよく、非標的細胞は、非老化筋肉細胞であってよい。
いくつかの態様において、標的細胞は、腫瘍細胞であり、細胞特異的なイベントは、細胞死である。いくつかの態様において、標的細胞は、老化細胞であり、細胞特異的なイベントは、細胞死である。いくつかの態様において、細胞死は、活性化受容体リガンド、特異的抗原、刺激性サイトカイン、またはこれらの任意の組み合わせの発現を通した免疫ターゲティングにより媒介される。いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を、アウトプットにより代謝されて治療的または毒性の化合物となるプロドラッグまたは非毒性の前駆体化合物と接触させることをさらに含む。
いくつかの態様において、標的細胞は、同じ型の野生型細胞（例として、健康なおよび／または疾患でない）と比較して、ある因子を異なって発現し、細胞特異的なイベントは、当該因子の発現レベルを調節している。
いくつかの態様において、アウトプット発現は、標的細胞集団の生存を保証し、一方で、非標的細胞は、細胞死誘導剤の存在下において、アウトプット発現の欠落に起因して除去される。他の態様において、アウトプットは、非標的細胞集団の生存を保証し、一方で、標的細胞は、細胞死誘導剤の存在下において、アウトプット発現に起因して除去される。
いくつかの態様において、アウトプット発現がこの特定の表現型の細胞に限定されるように、標的細胞が、目的の特定の表現型を含む。
いくつかの態様において、標的細胞は、選択された細胞型であり、細胞特異的なイベントは、選択された細胞型においては天然で不在であるかまたは不活性な遺伝子の発現を通して、新規の機能をコードすることである。
いくつかの態様において、細胞の集団は、多細胞生物を含む。いくつかの態様において、多細胞生物は、動物である。いくつかの態様において、動物は、ヒトである。
ＩＶ．疾患または状態を診断および／または処置する方法
いくつかの側面において、本開示は、疾患または状態の１つ以上の徴候または症状を示す対象において疾患または状態（例として、がん）を診断する方法に関する。本明細書において用いられる場合、用語「診断する」とは、疾患または状態の性質および／または原因を同定または決定するプロセスを指す。いくつかの態様において、方法は、上記の切れ目のないポリ核酸分子、上記のベクター、上記の操作されたウイルスゲノム、または上記のビリオンを、疾患または状態に関連する１つ以上の徴候または症状を示している対象に投与することを含み、ここで、アウトプットのレベルが、疾患または状態の存在または不在を示す。
いくつかの側面において、本開示は、疾患または状態（例として、がん）を処置する方法に関する。本明細書において用いられる場合、用語「処置する」とは、疾患もしくは状態に関連する１つ以上の症状の悪化を予防する行為、および／または疾患もしくは状態に関連する１つ以上の症状を軽減する行為を指す。いくつかの態様において、方法は、上記の切れ目のないポリ核酸分子、上記のベクター、上記の操作されたウイルスゲノム、または上記のビリオンを、疾患または状態を有する対象に投与することを含む。
疾患または状態を処置することに関するいくつかの態様において、投与の方法は、上記のベクターの静脈内送達を含む。いくつかの態様において、投与の方法は、上記のベクターの静脈内送達の１つより多くの行為を含む。いくつかの態様において、投与の方法は、１回以上の投与における、上記のベクターの腫瘍内送達を含む。いくつかの態様において、投与の方法は、１回以上の投与における、上記のベクターの経動脈送達を含む。いくつかの態様において、投与の方法は、筋肉内送達、鼻内送達、網膜下送達、または経口送達を含む。
いくつかの態様において、疾患を処置する方法は、１回以上の投与における、プロドラッグの投与をさらに含む。いくつかの態様において、プロドラッグの送達は、静脈内、経動脈、または腹腔内である。いくつかの態様において、プロドラッグは、ガンシクロビルである。
いくつかの態様において、疾患を処置する方法は、小分子、生物製剤、モノクローナル抗体、別の遺伝子治療生成物、または細胞ベースの治療用生成物などの、別の治療の投与をさらに含む。
いくつかの態様において、疾患または状態は、がんである。本明細書において記載される方法により処置することができる例示的ながんとして、これらに限定されないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌（ｍＣＲＣ）、肝臓に転移している任意の他のがん、肺癌、乳癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫が挙げられる。
本明細書において記載される方法により処置することができる例示的ながんとして、これらに限定されないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌（ｍＣＲＣ）、肺癌、乳癌、網膜芽細胞腫、膠芽腫が挙げられる。
いくつかの態様において、がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）であり。実際に、ＨＣＣのための治療選択肢は、限定されており（LlovetおよびLencioni、2020年）、これが、ブレークスルーのための新規のモダリティーを探索することへの緊急の必要性を生んでいる。本明細書において記載される方法は、現在のＨＣＣの処置方法を、著しく前進させる。
例
例１．多重診断回路は遺伝子治療ベクターに変換される．
複数の未連結のコンポーネントから組み立てられる論理ゲート（すなわち、１つのプラスミドあたり１つの遺伝子、および細胞株の一過性トランスフェクションにおいて特徴づけられるもの）を、治療に関連するベクター中にフィットするように再操作することができるか否かを評価するために、実験を設計し、動物疾患モデルにおける治療候補として研究した。以前に、転写因子（ＴＦ）ＳＯＸ９／１０およびＨＮＦ１Ａ／Ｂのためのセンサーの活性の間でＡＮＤ論理を実行するマルチプラスミド系による、これらのセンサーの組み込みは、ＨｕＨ－７細胞中に一過性にトランスフェクトされた場合に、強力な応答を引き起こすことが示された（Angeliciら、2016年）。ＳＯＸ９は、進行性ＨＣＣに関連する予後マーカーである（Richtigら、2017年）。興味深いことに、ＳＯＸ９応答エレメントは、その過剰発現が悪性ＨＣＣ表現型に関連する別のＴＦであるＳＯＸ４により結合される可能性が高い（Liaoら、2008年；Uhlenら、2017年）。ＨＮＦ１ＡおよびＨＮＦ１Ｂは、既知の肝臓ハウスキーピング因子である（Harriesら、2009年）；しかし、それらはまた、ＧＩ管の他の臓器においても発現される。
以前に記載されたマルチプラスミド系を、切れ目のないＤＮＡカセットに適応させて、最終的にウイルスベクター中にパッケージングすることができるか否かを計測するために、実験を設計した。この目的のために、マルチプラスミドのセッティングにおける論理「SOX9/10 AND HNF1A/B」を実行することが示された回路コンポーネント（Angeliciら、2016年）が、ＳＯＸ９／１０により駆動されるＰＩＴベースのアクチベーター（ＰＩＴ：：ＲｅｌＡまたはＰＩＴ：：ＶＰ１６）を含むもの（Fusseneggerら、2000年）、ならびに、ＰＩＴおよびＨＮＦ１Ａ／Ｂにより相乗的に駆動される蛍光アウトプットタンパク質を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）トランスファーベクター中にＩＴＲの間に、分散型または収束型配向のいずれかにおいてクローニングした（図１Ａ）。結果として生じたプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトし、ＴＦインプットであるＳＯＸ１０およびＨＮＦ１Ａを、ＴＲＥにより駆動されるプラスミドから異所的に発現させて、このゲートに対して、４つ全ての論理インプットの組み合わせを生成させた。興味深いことに、４つ全ての場合において傾向は保存されていたが、一方で、異なるバリアントは、両方のインプットが存在する場合に、それらの絶対的なオン（ON）レベルにおいて著しく異なる（図１Ｂ）。同じコンストラクトをまた、ＨｕＨ－７およびＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ここで、ＳＯＸ９／１０およびＨＮＦ１Ａ／Ｂの内因性発現が、前者においては回路を誘導すること、および後者においてはそれを活性化しないことが予測される。この場合において、差異は、より顕著ではなかったが、分散型配向が、いくらかより高いアウトプットを生じた。
ＡＮＤゲート戦略は、所望される細胞型においてアウトプットを活性化するための方法であり、意図的な「オフ」スイッチの組み込みにより設計されたこの活性化の増大は、ＮＯＴゲートと等しく、これは、治療に関連して、さらなる安全層を含むであろう。この目的のために、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的を、アウトプット遺伝子の３’－ＵＴＲ中に、ならびにＰＩＴにより駆動されるコンポーネントの３’－ＵＴＲ中に組み込んだ。ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１２６およびｍｉＲ－１２２を含む特定のインプットの選択は、以前に行われたプロファイリング（Dastorら、2018年）に基づいて行われた。ｍｉＲ－４２４標的を、初めに導入し、４つの結果として生じたコンストラクト（図１Ｄ）を、ＨＥＫ細胞における異所性ＴＦの組み合わせ（図１Ｅ）に対する、ならびにＨｕＨ－７およびＨｅＬａ細胞における内因的インプットの存在下における（図１Ｆ）、それらの応答について、再び試験した。性能において、顕著かつ一貫した差異が観察された。収束型コンストラクトは、ＨＥＫ細胞における異所性インプットに対して応答することができず、ＨｕＨ－７細胞において、分散型のものと比較して著しく低下した強度により応答した。この事実は、共通点のないプラスミド上に担持される回路から遺伝子治療送達ベクターに適合可能な切れ目のない骨格上に組み込まれた回路への転移の複雑性を強調する。次に、２つの分散型カセットに、ＴＦおよびｍｉＲ－４２４模倣物の両方のインプットを含むより広範な論理的特徴づけを行う。いずれのコンストラクトも、予測されたとおりに応答し、論理「SOX10 AND HNF1A AND NOT(miR-424)」を実行した（図１Ｇ）。高いｍｉＲ－４２４発現もまた内因性ＴＦインプットによるアウトプットの活性化を無効化することを確認するために、ｍｉＲ－４２４模倣物をＨｕＨ－７細胞中にトランスフェクトし、これがアウトプット発現をほとんどバックグラウンドレベルまで消すことを見出した（図１Ｈ）。次に、ｍｉＲ－４２４標的を、ｍｉＲ－１２６標的で置き換えた。新たなコンストラクトのセットを、ＨｕＨ－７細胞においてのみ、外因性のｍｉＲ－１２６に対するその応答に関して試験し、結果は、ｍｉＲ－４２４と類似しており、予測と一致した（図１Ｉ）。この設計のステージをまとめるために、ｍｉＲＮＡ標的を含まない、ｍｉＲ－４２４を含む、またはｍｉＲ－１２６標的を含む、分散型コンストラクトを、ＨＣＣ細胞株ＨｕＨ－７およびＨｅｐＧ２をＨｅＬａ細胞と区別するそれらの能力について評価した。（図１Ｊ）。
次のステップは、ウイルスベクター中へのカセットの組み込み、および前臨床への橋渡しに先立つ論理性能に関するそれらの評価である。ＡＡＶにより送達されるゲノムは、ヒト細胞において鎖状体を形成することが知られており（Duanら、2003年）、これは、ＡＡＶゲノムをコードするがＡＡＶキャプシドの補助によってパッケージングされ送達されるものではないＤＮＡカセットと比較して複雑性のさらなる層を含むことになる。この目的のために、ＩＴＲに隣接するゲノムを用い、少量のＤＪ－シュードタイプ（Grimmら、2008年）ＡＡＶベクターを製造した。ベクターを、２つのＨＣＣ細胞株、ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７、ならびに２つの非ＨＣＣ細胞株、ＨｅＬａおよびＨＣＴ－１１６に形質導入するために用いた。結果は、標的細胞における高い発現および非標的細胞における非常に低い発現を示した（図１Ｋ）。いくつかのさらなる効果が明らかであり、例えば、ＨｕＨ－７細胞においてＴ４２４標的を含むベクターにより得られたアウトプット発現が、ｍｉＲＮＡ標的を含まないベクターと比較して低下し、これは、ネイキッドのＤＮＡカセットにより観察された低下よりもはるかに強力である。
２つのｍｉＲＮＡ標的（Ｔ４２４またはＴ１２６）のうちいずれが、in vivoでより良好に作動するであろうかという予備情報を得るために、それらのいずれが、重要な保護機能を行う（すなわち、ＨＣＣ細胞と健康な肝細胞との間を区別することができる）かを評価する実験を設計した。初代培養マウス肝細胞を、in vitro培養のために単離した。初代培養肝細胞およびＨＣＣ細胞に、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１２６、ならびに肝臓においてin vivoで遺伝子発現を効率的に停止させることが示されており（Dastorら、2018年；Della Perutaら、2015年）、ＨＣＣ腫瘍のサブセットにおいて下方調節されることが知られている（Coulouarnら、2009年）既知の肝臓ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１２２について、ＡＡＶ－ＤＪにパッケージングされた遺伝子レポーターで形質導入した（Dastorら、2018年）。この試験の結果（図１Ｌ）は、驚くべきことに、肝臓におけるｍｉＲ－４２４およびｍｉＲ－１２６の高い発現カウントが、肝細胞における高い生物学的ノックダウン活性には変換されなかったことを示す。ｍｉＲ－１２２のみが、一貫して活性であった。ｍｉＲ－１２２は、ＨｅｐＧ２細胞株において不活性であったが、それは、ＨｕＨ－７細胞株において部分的な活性を示した。このことは、ｍｉＲＮＡ標的の包含は、ＨＣＣ腫瘍のあるサブセットにとっては有益であろうが、それらの全てにとって有益ではないことを示唆している。この事実にもかかわらず、ｍｉＲ－１２２を含む回路を、パイロット実験のセッティングにおけるその特異性および抗腫瘍の潜在能力のために、さらに研究した。異なるｍｉＲＮＡ標的配置の影響もまた、ｍｉＲＮＡインプットの存在下においてそれらの数がアウトプット抑制全体にどのように影響を及ぼすかを評価するために試験した。４つの異なるカセットを試験し、標的の数を増加させること、および標的をアウトプットおよびＰＩＴ ３’－ＵＴＲの両方において配置することは、抑制を増大させることが見出された（図１Ｍ～１Ｎ）。このことは、非標的細胞におけるアウトプットのノックダウンを増大させるが、また、ｍｉＲＮＡインプットの部分的なレベルを発現する標的細胞におけるノックダウンを低下させるための、二通りに用いることができる別のノブ（knob）を提供する。
例２．橋渡しの文脈における第１のＨＣＣを標的とする回路のバリアントの初期評価．
レポーター研究に基づいて、ｍｉＲ－１２２標的を有する回路のバリアントを構築した。そのより低いＤＮＡペイロードに起因してＰＩＴ：：ＶＰ１６アクチベーターバリアントを用い、アウトプット遺伝子のために利用可能なフットプリントを増大させた。HCC.V1-mCherryと称されるmCherryアウトプットを有する回路を、ＤＪ－シュードタイプＡＡＶベクター中にパッケージングし、ＨＣＣ細胞株を初代培養マウス肝細胞から区別するその能力において再試験した。データは、完全な回路は、初代培養肝細胞と比較してＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞株において高度に特異的な発現を生じるが、一方、ＨｕＨ－７回路においては、これらの細胞株におけるｍｉＲ－１２２の中程度の活性に起因して、低下したアウトプットを生じることを強調する（図２Ａ）。したがって、この腫瘍ターゲティングプログラムは、ＮＳＧマウスにおいてＨｅｐＧ２細胞を使用する同所性異種移植片腫瘍モデルに関するパイロット実験において評価された。腫瘍の確立および追跡を目的として、ＨｅｐＧ２細胞を、mCitrine蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターにより安定に修飾し、同種のmCitrine発現について選別した。１ＭのＨｅｐＧ２－ＬＣ細胞の脾臓への注射およびその後の脾臓の解剖により腫瘍を確立した。
in vivo実験に先立ち、初代培養肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞および別の陰性対照細胞株としてＨｅＬａ細胞を比較するin vitroでの効力試験を行った。ＨＳＶ－ＴＫアウトプット遺伝子を有しAAV-DJ-HCC.V1-HSV-TKと称されるベクターは、顕著な傍観者効果により、細胞傷害性を引き起こすためのプロドラッグとしてＧＣＶを必要とする（Freemanら、1993年）。データ（図２Ｂ）は、実際に、ＨｅｐＧ２細胞は、回路ならびに対照の構成的ベクターにより、選択的に除去されるが、一方で、初代培養肝細胞およびＨｅＬａ細胞は、構成的ベクターによっては除去されるが、回路を有するベクターによっては影響を受けないことを示した。注目すべきことに、回路は、構成的対照よりも良好にＨｅｐＧ２細胞を除去し、このことは、目的のために仕立てられてはいない構成的ベクターと比較して、目的のために仕立てられたＴＦ論理により駆動された、高いアウトプット発現の重要性を強調している。
抗腫瘍効力をin vivoで測定するために、AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TKを、３日間の間隔を空けた２回の連続した注射において、ＨｅｐＧ２腫瘍担持マウスに送達した。４つの実験群（このパイロット実験においてはｎ＝２）は、AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TKを、ＧＣＶレジメン（処置群）、ＧＣＶなしで単独での同じベクター、ＧＣＶレジメンを追加したシャム注射、ならびにシャムのＰＢＳ注射およびＧＣＶなしと組み合わせて含んだ。処置された動物における腫瘍進行のライブでのイメージング（図２Ｃ）、および生物発光による肝臓における合計の腫瘍負荷の剖検分析（図２Ｄ～２Ｅ）は、完全な回路プログラムをＨＳＶ－ＴＫアウトプットおよびＧＣＶレジメンと組み合わせて有する遺伝子治療ベクターが、強力な抗腫瘍活性を有し、これは、対照群のいずれにおいても不在であることを明らかに示した。ＰＢＳ対照群中の動物のうちの１個体における低い腫瘍負荷は、初めの不十分な腫瘍移植から生じたものであり（図２Ｆ）、一般的に、３つの対照群全ては、同じ挙動を示し、初めの負荷量に比例する最終的な腫瘍負荷を生じ、このことは、腫瘍の増殖が同じ動態学により支配されたことを意味する。パイロット実験の処置群中の動物は、明らかな外れ値であり、これは、処置が腫瘍負荷を低下させることにおいて有効であったという別の証左を提供している。
例３．より高い特異性およびより広い範囲を有する腫瘍ターゲティングプログラムの設計．
パイロット実験の結果に励まされ、腫瘍ターゲティングプログラムを改変し、並行して、in vitroおよびin vivoでの回路の作用機序のより徹底的な評価を行うことを模索した。ＳＯＸ９／１０とＨＮＦ１Ａ／Ｂインプットとの組み合わせが、発現を肝臓および肝臓腫瘍に制限するための良好な開始点であるという仮説を立てたが、in vivoでのｍｉＲ－１２２活性についての以前のデータは、その活性が肝臓に制限されることを示した（Dastorら、2018年）。したがって、全ての他の臓器について、回路のＴＦのみのコンポーネントに依存しなければならず、これは、広範な臓器特異性を有するベクターキャプシドを用いる場合には、問題となる可能性がある。加えて、ｍｉＲ－１２２は、健康な肝細胞をいくつかのＨＣＣサブタイプから分離するための良好な分類マーカーであるが、一方で、それは、普遍的なＨＣＣの特徴ではない。したがって、探索は、肝臓・対・肝臓腫瘍のより広範な分類能力を可能にするのみならず、さらなる臓器を保護することができるｍｉＲＮＡインプットに注目した。この探索の起点は、１）以前に得られたｍｉＲＮＡプロファイリングデータセット（Dastorら、2018年）、および２）様々な臓器において高度に発現されたｍｉｃｒｏＲＮＡについての詳細な文献分析である。より早期の実験において、ＨｕＨ－７細胞および健康な肝細胞をプロファイリングし、初めに、肝細胞においては高度に発現するがＨｕＨ－７細胞においては下方調節されるｍｉＲＮＡを同定することを試みた（図３Ａ）。ＮＧＳプロファイリングデータセットにおけるカウント比に基づいて選択されたｍｉＲＮＡのセットは、ｍｉＲ－１２２（参照として）、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－２６ｂおよびｌｅｔ－７ｃを含んだ。in vitroでの初代培養肝細胞への高い送達効率を保証するために、双方向性ｍｉＲＮＡレポーター（Dastorら、2018年）を構築して、ＡＡＶ－ＤＪベクター中にパッケージングした（図３Ｂ）。ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２、および初代培養の単離されたマウス肝細胞において、ｍｉＲＮＡ候補の生物学的活性を測定した。試験されたｍｉＲＮＡのうち、ｌｅｔ－７ｃは、最も高い差次的活性を示し、さらに、それは、ＨｕＨ－７およびＨｅｐＧ２細胞の両方において下方調節された（図３Ｃ）。興味深いことに、ＮＧＳカウントを生物学的活性と比較するレトロスペクティブ分析（図３Ｄ）は、非常に表面的な相関のみを示し、このことは、候補インプットの機能的試験の重要性を強調している。
潜在的な臓器保護ｍｉＲＮＡについての文献の探索およびプロファイリングデータセットの実験は、ｍｉＲＮＡのセットをもたらした：ｍｉＲ－４２４（腎臓および他の臓器）、ｍｉＲ－２０８ａおよびｍｉＲ－２０８（心臓）、ｍｉＲ－２１６Ａ、ｍｉＲ－２１７およびｍｉＲ－３７５（膵臓）。in vitroスクリーニングキャンペーンに基づいて見出された肝臓保護のための候補であるＬｅｔ－７ｃを、このリストに加えた。これらのｍｉＲＮＡの各々について、双方向性レポーターを設計して、その広範な体内分布に起因して選択されたＢ１－シュードタイプＡＡＶベクター中にパッケージングした（Choudhuryら、2016年）。ニュートラルであると考えられるｍｉＲＮＡ標的を有する対照ベクターを作製した（「ＴＦＦ５」）（しかし、データが明らかにしたように、この標的は、少なくともいくつかの臓器においてｍｉＲＮＡインプットに対して応答していた）。ベクターを、健康なマウス中に全身注射し、注射の３週間後に多様な臓器においてレポーター発現を評価した。肝臓、すい臓、心臓および腎臓において、強力な体内分布が見出され、分析は、これらの臓器に注目した。Ｌｅｔ－７ｃは、in vivoでの健康な肝臓特異的インプットとしての潜在能力を示すセットからの唯一のｍｉＲＮＡであった。膵臓においては、in vivoでは、ｍｉＲ－２１７およびｍｉＲ－３７５の両方が、文献のデータから予測されるとおりの活性を示した；しかし、ｌｅｔ－７ｃが、最も強力な応答を有した。心臓においては、ｍｉＲ－２０８ａおよびｍｉＲ－２０８ｂは、以前のデータと一致する活性を示したが、やはり、ｌｅｔ－７ｃが最も強力な応答を有した。最後に、ｍｉＲ－４２４は、予測されたとおり、腎臓において活性であったが、この臓器においても、ｌｅｔ－７ｃが、最も強力な効果を示した（図３ＥＦ）。
まとめると、in vitroおよびin vivoのデータの組み合わせは、本研究の目的のために、ｌｅｔ－７ｃが、腫瘍研究において用いられた両方のＨＣＣ細胞株において強力に下方調節されることから、即時的かつ同時に、複数の臓器のための保護的なｍｉＲＮＡインプットの役割を果たす「普遍的な」インプットとして役立ち得ることを示した。したがって、ＨＣＣ．Ｖ２と称される回路の次の繰り返しは、プログラム「SOX9/10 AND HNF1A/B AND NOT(let-7c)」を実行する。
例４．in vitroおよびin vivoでの作用の機序．
ＡＡＶ－ＤＪキャプシドをin vitroでの細胞形質導入のための効率的なビヒクルとして、およびＡＡＶ－Ｂ１をin vivoでの広範な体内分布を有するキャプシドとして使用して、ＡＡＶにパッケージングされた回路の詳細な機序の研究を行った。研究においてより早期に、回路を担持するプラスミドＤＮＡを、インプットのうちのいずれも発現しないバックグラウンド細胞株中にトランスフェクトすることにより、および次いで、全ての可能なインプットの組み合わせの全身の異所性発現により結果を予測と比較することにより、論理プログラムを分析して検証した。ウイルスベクターの場合において、この戦略は、いまや、より長く有効である。なぜならば、回路自体がＡＡＶ形質導入を介して送達される場合に、個々の異所性インプットを共送達することはほとんど不可能であるからである。実際に、より興味深い質問は、ベクターが内因的に発現されるインプットに対してどのように応答するかである。なぜならば、治療に関する細胞分類は、内因的インプットに依存しなければならず、これに対して適切に応答しなければならないからである。機序の証明は、したがって、ある細胞型における完全な回路のアウトプットは、これらの細胞における個々の回路インプットの活性および回路の論理プログラムと一致するか否かという質問を含む。
したがって、全ての回路インプットについて、個々の遺伝子センサーを作製し、ＡＡＶ－ＤＪ中にパッケージングした（それぞれ、ＳＯＸ９／１０およびＨＮＦ１Ａ／Ｂフィードバック増幅センサーについて、AAV-DJ.C.SOX-FB.mCherryおよびAAV-DJ.C.HNF1-FB.mCherry）；ｌｅｔ－７ｃセンサー（AAV-DJ.C.let-7c.mCherry）；ＡＮＤゲートのみを実行する部分的回路（AAV-DJ.C.TF-AND.mCherry）；完全な回路（AAV-DJ.HCC.V2.mCherry）；および参照として役立つ構成的レポーター（AAV-DJ.C.CMV.mCherry）（図４Ａ）。これらのコンストラクトのアウトプットを、１０個の細胞株および初代培養肝細胞において測定した。結果（図４Ｂ～４Ｃ）は、マルチインプット回路の応答が、個々のインプットの発現と一致することを示し、このことは、プラスミドベースのものとウイルスベクターにパッケージングされた系との間で作用の機序が保存されていることを確認している。ＳＯＸ９／１０およびＨＮＦ１Ａ／Ｂについての個々のセンサーの両方の強力な応答は、ＴＦ－ＡＮＤゲートの高い応答を引き起こすために必要とされ；ＴＦ－ＡＮＤゲートの強力な応答およびｌｅｔ－７ｃセンサーの応答の不在は、完全なプログラムの高いアウトプットを達成するために必要とされる。
in vivoでの特徴づけのために、構成的対照であるAAV-B1.C.CMV.mCherry、ＴＦのみのＡＮＤゲートであるAAV-B1.C.TF-AND.mCherry、ｌｅｔ－７ｃレポーターAAV-B1.C.let-7c.mCherry、および完全な回路であるAAV-B1.HCC.V2.mCherryををそれぞれパッケージングし、mCherryをアウトプットとして発現するＢ１－シュードタイプベクターを、マウス尾静脈中に全身注射し、注射の３週間後に多様な臓器においてmCherryの発現を評価した。フレッシュな臓器切片において、画像処理により発現を定量した。結果（図５Ａ～５Ｂ）は、複数のインプットの複雑な相乗作用および様々な臓器におけるそれらの多様な役割を強調する。肝臓において、ＡＮＤ－ゲートは、構成的対照と比較して、陽性細胞の数の減少をもたらしたが、陽性の発現を示した細胞における発現は上昇していた。ｌｅｔ－７ｃレポーターは、対照と比較して低下した発現を示したが、残りの発現は、バックグラウンドよりも明らかに高かった。完全な回路は、バックグラウンドと実質的に区別不可能な発現をもたらした。膵臓においては、ＡＮＤゲートにより制御された発現およびｌｅｔ－７ｃにより制御された発現は、アウトプット発現のより大きな低下をもたらしたが、しかし、各々の場合において、発現は、バックグラウンドよりも高かった。肝臓におけるもののように、完全なターゲティングプログラムは、バックグラウンドより高いいかなる検出可能な発現も生じなかった。心臓においては、ＡＮＤゲートまたはｌｅｔ－７ｃのいずれかは、それら自体で、および完全な回路において組み合わされた場合に、バックグラウンドレベルの発現を示した。腎臓において、ＡＮＤゲートまたはｌｅｔ－７ｃのいずれの調節も、発現をバックグラウンドまで低下させないが、一方で、完全なプログラムは発現をバックグラウンドまで低下させるという点において、状況は膵臓と類似した。まとめると、データセットは、マルチインプット論理回路は、in vivoで健康な臓器からの高度に効率的な脱ターゲティング（de-targeting）を達成するために必要であるという仮説を、強力に支持する；論理プログラム「SOX9/10 AND HNF1A/B and NOT(let-7c)」により要約されるような複数のインプットの相乗効果は、４つの場合のうちの３つにおいて明らかである。次いで、同じプログラムが、in vivoで腫瘍を効率的に標的とすることができるか否かを決定するために実験を設計し、mCherryアウトプットを有するＢ１型のAAV-B1.HCC.V2.mCherry回路を、腫瘍担持ＮＳＧマウスに注射した。データ（図５Ｃ）は、実際に、腫瘍が、in vivoで特異的にかつ効率的に標的とされる一方で、他の臓器はアウトプットを発現しないことを示し、これは、図５Ａ～５Ｂにおけるデータと一致する。
例５．in vitroおよびin vivoでの抗腫瘍効力．
回路プログラムが、in vivoで優れた腫瘍特異的発現および主要な臓器からの脱ターゲティングを示したため、ベンチマーク抗腫瘍アクチュエーターとしてのプロドラッグガンシクロビルと組み合わせて、ＨＳＶ－ＴＫ酵素を用いて、その抗腫瘍活性の詳細な評価を行った。回路は、HCC.V2-HSV-TKと名付けられた。試験は、パイロット実験（図２）と類似の線に沿って、しかし、より大きな動物群および拡張された数の実験群により行った。構成的対照および完全な回路を含むＤＪ－シュードタイプベクターを製造し、それらのガンシクロビルに対する用量－応答を、ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２、およびＨｅＬａ細胞株において、およびin vitroで培養された初代培養肝細胞において評価した。予測されたとおり、Ｈｕｈ－７およびＨｅｐＧ２細胞は、構成的ベクターおよび回路AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TKにより、同等に標的とされたが、一方、ＨｅＬａ陰性対照細胞および初代培養肝細胞はいずれも、構成的ベクターに対して感受性であったが、完全に装備された回路によって除去されなかった（図６Ａ）。加えて、AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TKは、ＨｕＨ－７細胞において、これらの細胞において下方調節されないｌｅｔ－７ｃセンサーに使用に起因して、AAV-DJ.HCC.V1-HSV-TKよりも強力である。しかし、AAV-DJ.HCC.V1-HSV-TKは、ｍｉＲ－１２２による不完全なシャットダウンに起因して、ＨｕＨ－７細胞においてもなお活性であった（図６Ｂ）。
次に、回路を有するＤＪ－シュードタイプＡＡＶベクターを、ＨｅｐＧ２－ＬＣ腫瘍担持マウスに全身送達した（図７Ａ）。ガンシクロビルを用いない実験群は、以下を含んだ：シャム注射（生理食塩水）；ＴＦ－ＡＮＤプログラムをコードするベクターAAV-DJ.C.TF-AND-HSV-TK；および完全な回路AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TKをコードするベクター。ガンシクロビルを用いた群は、ベクターまたはシャムの尾静脈送達に関して、上の群を模倣し、その後、ガンシクロビル注射のレジメンを行った；すなわち、以下を含んだ：シャム注射＋ＧＣＶ；ＡＮＤ－ゲート回路＋ＧＣＶ；および完全な回路＋ＧＣＶ。動物（１群あたりｎ＝４）を、それらの腫瘍負荷についてはin vivo生物発光を用いて、それらの健康についてはスコアシート基準を用いて、追跡調査した。データ（図７Ｂ～７Ｆ）は、ＨＳＶ－ＴＫアウトプットを備え、ＧＣＶレジメンを追加された、完全なHCC.V2-HSV-TKプログラムを有するベクターで処置されたマウスは、それらの腫瘍負荷の強力かつ再生可能な封じ込め、および次いで退縮を示したが、一方で、ＧＣＶなしの対照群、またはＧＣＶを注射されただけの群は、経時的に指数関数的な腫瘍負荷の増大を示す。ＡＮＤゲートをＨＳＶ－ＴＫアウトプットと共にコードするベクター、AAV-DJ-C.TF-AND-HSV-TKは、AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TKと比較して類似の抗腫瘍効果を示したが、しかしまた強力な有害効果をも引き起こし、したがって、この群の動物は、予定された完了に先立って安楽死させなければならなかった。完全なAAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK回路により処置された群は、一方、明白な有害効果を伴うことなく、腫瘍負荷の減少の拡大を示した。これらの結果は、疑いの余地なく、in vivoでのターゲティングの特異性（図５Ａ～５Ｄ）と、in vivoでの有害効果の規模との間の厳格な関係性を示す。したがって、将来的に、蛍光アウトプット発現から測定されるような腫瘍の外側におけるアウトプット発現の存在は、それらの毒性について機能的アウトプットと共に評価される必要がない、プレスクリーニングステージを構成するであろう。
例６．ＡＡＶ－Ｂ１およびＡＡＶ－ＤＪシュードタイプ回路により駆動されるＨＣＣターゲティングのin vivoでの比較．
Ｂ１型ＡＡＶキャプシドについて観察されたin vivoでの広範な向性および強力な形質導入、ならびに遺伝子発現をHCC.V2プログラムの制御下に置いて達成された大規模な多臓器脱ターゲティングを前提として、結果として生じるＢ１型のAAV-B1.HCC.V2回路は、選択性を損なうことなく高い腫瘍形質導入を生じ得ると考えた。この可能性を調べるために、AAV-B1.HCC.V2-mCherryの完全回路アウトプットを、以前の効力研究において用いられたＤＪキャプシドの代わりにＢ１キャプシドを用いて送達した場合の、回路アウトプット（mCherry）を比較した。データ（図８Ａ）は、同じ投与量で投与された場合に、Ｂ１型の回路は、全てのＤＪバリアント（AAV-DJ.HCC.V2.mCherry、ＴＦのみのＡＮＤゲートAAV-DJ.C.TF-AND.mCherryまたはAAV-DJ.C.CMV.mCherry）の腫瘍発現レベルを大きく凌駕しつつ、その選択性を隣接する肝臓組織に対して保持することを示す。腫瘍内アウトプット発現は、約４０倍高く（図８Ｂ）、大きな癌巣のコアセクションにおいてすら、強力な蛍光をもたらした。腫瘍浸透と組み合わされた強力な選択的発現は、Ｂ１型キャプシドとカップリングされた回路のターゲティングを、ＨＣＣ遺伝子治療のための有望な候補として示唆する。
例７．ｍｉＲ－ｌｅｔ－７ｃおよびｍｉＲ－１２２の組み合わせ．
in vitroでの効力データはＨＣＣ．Ｖ１は、高い投与量においてすら肝細胞を完全に保護するが（図２Ｂ）、一方で、同じプログラムは、ＨＣＣ．Ｖ２と比較した場合にＨＵＨ－７細胞の殺傷効率の部分的な低下のみを示し（図５Ｂ）、高いウイルス投与量についてはほぼ匹敵する性能をもたらすことを示す。この差異は、肝細胞において観察された、ＨＵＨ－７細胞と比較してより厳格な遺伝子抑制と一致する（図２Ａ）。
本明細書において確率されるとおり、ｍｉＲ－１２２標的の数および配置の変更は、抑制強度を調節するために用いることができ、これは、異なるｍｉＲ－１２２レベルを有する細胞株において、異なる発現レベルをもたらす（図１Ｍ）。標的の数、配置の変更を通した、または不完全に相補的な標的の使用を介した、ｍｉＲ－１２２抑制効率の低下は、肝臓脱ターゲティングの部分的な低下のリスクがあるＨＵＨ－７において（より低いウイルス投与量においてすら）回路の効力を増大させるために用いることができるという仮説を立てた。
これらのデータから、ＨＣＣ．Ｖ２からのｍｉＲ－Ｌｅｔ７ｃ標的をより弱いｍｉＲ－１２２抑制と組み合わせるＨＣＣ．Ｖ３回路（図９Ａ）は、ＨＣＣ．Ｖ３回路およびＨＣＣ．Ｖ２回路の両方を凌駕することが予測される。ｍｉＲ－１２２により引き起こされる抑制強度は、不完全に相補的な標的を導入することにより、または２つのアプローチの組み合わせにより、Ｔ－１２２標的の数および配置を変更することにより、調整することができる。不完全に相補的な標的は、ｍｉＲＮＡシード配列に隣接する配列中にランダム変異を導入することにより、または、ｍｉＲＮＡにより調節される遺伝子の保存された３’ＵＴＲから駆動されるｍｉＲ－１２２標的を用いることにより、得ることができる（図９Ｂ）。肝臓保護とＨＣＣ細胞（特にＨＵＨ－７）に対する効力との所望される組み合わせを最大化する候補を選択することができる。
ＨＣＣ．Ｖ３は、主要な臓器からの一般化されたｍｉＲＮＡ脱ターゲティング（Ｌｅｔ－７ｃ）、ならびに、ＨｅｐＧ２およびＨＵＨ－７のいずれにおいてもその効力の著しい低下を伴くことなく、肝臓における組み合わされた保護からの利益（Ｌｅｔ７ｃおよびｍｉＲ－１２２）を示すであろうことが予測される。ほとんどのウイルスベクターについて最も高い体内分布を有する臓器であることから、最も厳格な可能な肝臓脱ターゲティングを達成することは、特に望ましく、治療ウィンドウのさらなる拡大をもたらし得る。
例８．考察．
本開示は、論理遺伝子回路アプローチの臨床への橋渡しへの経路を示す。３つの基礎をなす柱が、かかる橋渡しを支持するために必要であり、すなわち：（１）疾患を構成する分子の知識；（２）この知識を利用することができるプラットフォームの利用可能性；および（３）このプラットフォームを臨床に関連する治療モダリティーに転換する能力が、集約されて、有望なin vitroおよびin vivoでの効力および安全性プロフィールを有する実行可能な治療候補を送達する。本明細書において記載される詳細な機序の特徴づけは、系統的な手順を追って合理的なボトムアップ様式において構築され、その個々のコンポーネントと比較された、マルチインプット細胞分類指標のユニークな特性を強調する。重要なことに、レポーターアウトプットにより測定されるようなターゲティング特異性は、in vivoでの効力および有害効果の両方と厳格に相関することが、本明細書において示される。
特異的な発現、ならびにタイミングおよび投与量などの治療の制御の他のモダリティーは、がんのためのみならず、他の適応症のためにもまた、遺伝子治療の次のフロンティアである。優先的な組織ターゲティングを有する新規のキャプシド、ならびに特異的組織発現のためのプロモーターエレメントの開発に、多大な努力が投資されている。注目すべきことに、いずれの研究の系統も、大きなライブラリーの大規模なスクリーニングに依存し、それらは、成功を保証しない；さらに、特異性の主張は、カウンター試料の大きなパネルの存在下においてのみ行い得る。ヒト治療のためには、これらの試料は、ヒト由来のものでなければならない。キャプシドおよび／またはプロモーターのスクリーニングのための大きなライブラリーサイズに重ねて、ヒト組織の大きな多様性に起因して、この労力は禁制的に複雑となるであろう。本明細書において記載されるボトムアップ型のアプローチは、複数の個々のインプットからのコンビナトリアルな特異性を作り出すための合理的設計を用いる。プロファイリングにより候補インプットの空間を狭めることは、不均一な細胞集団に取り組むことが可能な複雑なプログラムの操作（本発明者らの例におけるＨｕｈ－７およびＨｅｐＧ２細胞のもののような）を、合理的な、前向き設計のバックグラウンド上に置く。このアプローチは、ターゲティングされたキャプシドまたは特異的プロモーターの使用を除外しない：それらは、必要に応じて適用することができる。しかし、がんなどの播種性の疾患については、広範な向性のキャプシドが優先的である場合がある；特異的発現の負荷は、次いで、当該治療の遺伝子ペイロードにおいてコードされる分類されたプログラムへとシフトする。他の場合において、最良の所望される効果を達成するために、キャプシド特異性と分類指標プログラムとを相乗的に用いることができる。
肝臓における大きな多巣性腫瘍の効率的な浸透は、単一の全身注射の後でin vivoで達成され（図５Ｃ～５Ｄおよび図８Ａ～８Ｃ）、このことは、単一の注射ですら、ＨＣＣなどの播種性であかつ血管新生が進んだ腫瘍にペイロードを送達することができるという、強力な証左を提供する。傍観者効果を有するアウトプットが、次いで、これらの腫瘍を効果的に処置することができる。
例９．例１～８についての材料および方法．
細胞株：ＨｕＨ－７細胞は、ヒューマンサイエンス振興財団（Japan Health Sciences Foundation）のヒューマンサイエンス研究資源バンク（Health Science Research Resources bank）から購入し（Cat-# JCRB0403）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、低グルコース、GlutaMAX（Life technologies、Cat＃21885-025）中で培養した。Ｈｅｐ Ｇ２細胞は、ATCCから購入し（Cat# HB-8065）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＲＰＭＩ（Gibco A10491-01）中で培養した。ＨｅＬａ細胞は、ＡＴＣＣから購入し（Cat＃CCL-2）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、高グルコース（Life technologies、Cat＃41966）中で培養した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、ATCCから購入し（Cat# HB-8064）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、低グルコース、GlutaMAX（Life technologies、Cat＃21885-025）中で培養した。ＨＣＴ－１１６細胞は、Deutsche Sammlung Von Microorganismen and Zellkulturen（DMZ）から購入し（DMZ番号ACC-581）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、GlutaMAX（Life technologies、Cat＃31966-021）中で培養した。ＳＷ－６２０細胞は、ATCCから購入し（Cat＃CCL-227）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、GlutaMAX（Life technologies、Cat＃31966-021）中で培養した。ＬｏＶｏ細胞は、ATCCから購入し（Cat＃CCL-229）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、GlutaMAX（Life technologies、Cat＃31966-021）中で培養した。Ａ５４９細胞は、ATCCから購入し（Cat＃CCL-185）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、GlutaMAX（Life technologies、Cat＃31966-021）中で培養した。ＳＨ４細胞は、ATCCから購入し（Cat＃CCL-185）、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＤＭＥＭ、GlutaMAX（Life technologies、Cat＃31966-021）中で培養した。ＩＧＲＯＶ１細胞は、NCI-60パネルの一部であり、NCI（NIH）から得た。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat＃F9665またはLife Technologies、Cat＃10270106）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、P4333）を補充したＲＰＭＩ（Gibco A10491-01）中で培養した。
ルシフェラーゼおよびmCitrine安定細胞株（ＨｅｐＧ２ ＬＣ）の作製：mCitrineおよびルシフェラーゼ（ＨｅｐＧ２ ＬＣ）を安定して発現するＨｅｐＧ２細胞株を、ＡＡＶＳ遺伝子座のＴＡＬＥＮ編集を介して作成した。４ｘ１０５のＨｅｐＧ２細胞を、６ウェルプレート中に播種し、２４時間後に、Lipofectamine（登録商標）2000により、合計で２μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションミックスは、以下のとおりに構成した：５００ｎｇのhAAVS1 1L TALEN（ｐＩＫ１１）、５００ｎｇのhAAVS1 1R TALEN（ｐＩＫ１２）およびＥＦ１Ａプロモーター（ｐＩＫ０１４）の制御下における１μｇのルシフェラーゼ２Ａシトリン（Citrine）。形質転換された細胞を、増殖させ、一過性トランスフェクションから生じる発現を希釈するために、３週間にわたり培養中で保持した。３週間後、mCitrine＋のバルク集団（＜１％）を、BD FACS Aria IIIを用いて選別した。結果として生じた２００００個の細胞を、初期の回復を促進するために、初めの１週間にわたり２０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で２４ウェルプレート中に播種した。細胞を、２週間にわたり培養して増殖させて、安定な導入遺伝子発現を有する細胞を選択し、サイレンシングされやすいクローンを回避した。単一のmCitrine＋クローンを、９６ウェルプレート中で選別し、２０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で培養して増殖させた。３つの異なる高発現クローンを選択し、最良のものを、連続する実験のために用いた。クローンの生物発光を、PhotonIMAGER RT（Biospace Laboratories）を用いて５分間にわたり測定し、ルシフェラーゼの発現を確認した。
ウイルスベクタープラスミドおよびウイルス生成：以前に記載されたとおり、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶベクターを生成し、精製した（Paterna、2004年、Conway、1999年）。簡単に述べると、サルウイルスラージＴ抗原（２９３Ｔ）を発現するヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）により媒介されるＡＡＶベクタープラスミド（パッケージングされるべきＡＡＶベクターゲノムを提供する）、ＡＡＶヘルパープラスミド（ＡＡＶ血清型２のｒｅｐタンパク質および目的のＡＡＶ血清型のｃａｐタンパク質を提供する）、ならびにアデノウィルス（ＡＶ）ヘルパープラスミドpBS-E2A-VA-E4（Glatzel 2000年）で、１：１：１のモル比においてコトランスフェクトした。トランスフェクションの９６～１２０時間後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、低速遠心分離（１５００ｇ／４℃で１５分間）によりそれらの上清から分離した。上清中に放出されたＡＡＶベクターを、４℃で一晩、ＰＥＧ８０００溶液（最終：８％ｖ／ｖ）およびＮａＣｌ（最終：０．５Ｍ）を添加することにより、ＰＥＧ沈殿させた。低速遠心分離（３４８８ｇ／４℃で６０分間）によりＰＥＧ沈殿を完了させた。清澄化した上清を廃棄し、ペレット化したＡＡＶベクターを、ＡＡＶ再懸濁バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中で再懸濁した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＡＡＶ再懸濁バッファー中で再懸濁し、７ｍＬの軟組織ホモジェナイジングＣＫ１４チューブと組みわせたBertin社のMinilysホモジェナイザーにより溶解した（５０００ｒｐｍ／ＲＴで１分間のサイクルを２回、＞４分間の－２０℃での冷却により間を空けて）。粗細胞ライセートを、BitNucleaseエンドヌクレアーゼ（７５Ｕ／ｍＬ、３７℃で３０～９０分間）で処置し、遠心分離により清澄化した（１７０００ｇ／４℃で１０分間）。ＰＥＧでペレット化されたＡＡＶベクターを、清澄化されたライセートと組み合わせて、不連続密度のイオジキサノール（OptiPrep、Axis-Shield）勾配（等密度）超遠心に供した（３６５９２９ｇ／１５℃で２時間１５分間）。その後、Vivaspin 20限外濾過デバイス（100000 MWCO、PESメンブレン、Sartorius）ならびに１ｍＭのＭｇＣｌ２および２．５ｍＭのＫＣｌを補充した１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を製造者の指示に従って用いて、３ラウンドの透析濾過（限外濾過）により、ＡＡＶベクターを含有する画分からイオジキサノールを取り除いた。ＡＡＶベクターを、アリコートにおいて－８０℃で保存した。Qubit 3.0蛍光光度計をQubit dsDNA HSアッセイキット（いずれもLife Technologies）と組み合わせて用いて、キャプシド形成されたウイルスベクターゲノム（ｖｇ）を定量した。簡単に述べると、５μＬの無希釈の（または１：１０希釈された）ＡＡＶベクターを、２つ組において調製した。１つの試料を、熱変性し（９５℃で５分間）、未処置のおよび熱変性された試料を、製造者の指示に従って定量した。ウイルス外（キャプシド形成されていない；未処置の試料）を、ウイルス内およびウイルス外の合計（キャプシド形成された、およびキャプシド形成されていない；熱変性された試料）から減算することにより、ウイルス内（キャプシド形成された）のｖｇ／ｍＬを計算した。
in vivo注射のための細胞調製：ＨｅｐＧ２ ＬＣ細胞を、培養し、Ｔ－７５またはＴ－１５０フラスコ中で７０～８０％のコンフルエンスまで継代した。in vivo注射のために、本発明者らは、レポーター遺伝子のサイレンシングを最少化するために、低い継代数（継代数１２以下）を有する細胞を用いた。増殖培地を取り除き、ＰＢＳ（Ｔ－７５については１０ｍｌまたはＴ－１５０については２０ｍｌ）で洗浄し、細胞をトリプシン（Gibco、25200056）（Ｔ－７５については２ｍｌまたはＴ－１５０フラスコについては６ｍｌ）で５分間にわたり３７℃で解離させることにより、細胞を脱離させた。細胞懸濁液を、８ｍＬ（Ｔ－７５）または２４ｍｌ（Ｔ－１５０）のＰＢＳで希釈し、ピペッティングにより温和に再懸濁し、その後、５０ｍｌのFalconチューブ中で１００μｍのフィルターを用いてろ過して、単一の細胞の懸濁液を得た。１０ｍｌ（Ｔ－７５）またはＴ－１５０については２０ｍｌのさらなるＰＢＳを用いてフィルターを洗浄し、合計容積２０ｍｌ（Ｔ－７５）または５０ｍｌ（Ｔ－１５０）まで細胞をさらに希釈した。細胞懸濁液を、４９８ｒｐｍで４℃で９分間にわたり遠心分離した。細胞ペレットを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４９８ｒｐｍで４℃で６分間にわたり、さらに２回遠心分離して、トリプシンの任意の痕跡を取り除いた。手順は、実験のために必要とされる細胞の数に依存して、１つ以上のフラスコおよびチューブにおいて行われる。各々のペレットを、少量のＰＢＳ（各々のペレットについて２５０～３００ｕｌ）中で再懸濁し、ノイバウエル（Neubauer）チャンバーおよびトリパンブルーを用いる手作業での生細胞の計数のために、小さなアリコートを希釈する（１：５０および１：１００）。細胞懸濁液１つあたり少なくとも４回の独立した計数を行い、平均値を用いて、注射されるべき細胞の数を決定した。細胞懸濁液を、顕微鏡下において目視検査し、大きな凝集塊の不在を確認した。最後に、容積をＰＢＳで約２×１０７細胞／ｍＬまで調整した。細胞懸濁液を、外科手術の期間にわたり氷上に保持した。高い細胞濃度が示された場合には、細胞は、各々の注射の前に再懸濁を必要とする。操作を最少化し、生存率を改善するため、細胞を、複数のストック（２～３個のチューブ）において分割する。本発明者らは、細胞凝集塊の存在および残留トリプシンまたは他の細胞解離試薬の存在は、いずれも毒性であり、動物にとって潜在的に生命を脅かすことを注意する。
異種移植片マウス肝臓マウスモデル：全ての動物の手順は、スイス連邦法およびEidgenoessische Technische Hochschule（ETH）Zurichの機関のガイドラインに従って行われ、Basel-Stadt州の動物倫理委員会により承認されている。８～１０週齢の免疫欠損ＮＳＧマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ、Charles River、Sulzfeld、Germany）を、特定病原体フリーの施設に収容した。ヒト腫瘍細胞に由来するマウス肝臓腫瘍を作製するために、ＮＳＧマウスを吸入イソフルランで麻酔した。無菌的な外科手術技術を用いて、１～１．５ｃｍの左肋骨下（subcostal）切開を行い、脾臓を露出させた。５０μｌのＰＢＳ中の１０５のＨｅｐＧ２細胞を、２７ゲージの針を用いて脾臓の下葉中に注射した。針の除去の直後に、脾臓の下極を結紮した。主要な脾臓の脈管構造を結紮する前に、１０分間のドレーンにより大多数の細胞を肝臓に到達させ、脾臓を取り除いた。次いで、腹部の切開を縫合により閉腹した。マウスにおける腫瘍増殖を、１週間あたり２～３回、生物発光イメージングによりモニタリングした（PhotonIMAGER RT、Biospace Lab）。
in vivoでのレポーターＡＡＶの送達ならびに蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーによる遺伝子発現の分析：in vivoでの回路のアウトプットの発現を可視化するために、mCherryアウトプットをコードする２×１０１２ｖｇ（ウイルスゲノム）のＡＡＶまたはＰＢＳを、腫瘍細胞移植の２週間後に、単一用量として尾静脈を通して投与した。３週間後、マウスを安楽死させ、すぐに１０または２５Ｕ／ｍＬのヘパリン（Sigma-Aldrich）を含む５０～７０ｍＬのＨＢＳＳを経心的に灌流して、自家蛍光性の赤血球細胞を除去した。臓器および組織（肝臓、肺、脳、膵臓、骨格筋、心臓および腎臓）を採取して、フレッシュな組織切片を調製し、氷上でＰＢＳ中で保持した。すぐに、蛍光顕微鏡法によりmCherryの発現を分析した。
in vivoでの治療用ＡＡＶの送達およびプロドラッグ処置：腫瘍細胞播種の２週間後、腫瘍担持マウスを、初めに、生物発光強度（高いｖｓ低い）によって反映される腫瘍負荷に基づいて層別化し、次いで、群の間の腫瘍負荷比較性を保証するために、多様な処置群に無作為化した。４×１０１２ｖｇ（ウイルスゲノム）のＡＡＶ－回路コンストラクトまたはＰＢＳを、１週間の間隔を空けた２回の別々の注射を介して静脈内投与した。プロドラッグＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ、InvivoGen）または生理食塩水の処置を、１回目のＡＡＶ注射の３日後に開始し、マウスに、１日１回、２週間の期間にわたり、腹腔内注射した。１週間当たり２～３回による生物発光イメージングにより、腫瘍の増殖を評価した。マウスを、スコアシートによりモニタリングし、エンドポイントが達成された場合には、安楽死させた。全てのマウスを、プロドラッグ処置の１４日後に終了させた。ex vivoでの腫瘍負荷の生物発光イメージング分析のために、肝臓を採取した。腫瘍細胞播種の２週間後に、腫瘍担持マウスを、初めに、生物発光強度（高いｖｓ低い）によって反映される腫瘍負荷に基づいて層別化し、次いで、群の間の腫瘍負荷比較性を保証するために、多様な処置群に無作為化した。４×１０１２ｖｇ（ウイルスゲノム）のＡＡＶ－回路コンストラクトまたはＰＢＳを、１週間の間隔を空けた２回の別々の注射を介して静脈内投与した。プロドラッグＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ、InvivoGen）または生理食塩水の処置を、１回目のＡＡＶ注射の３日後に開始し、マウスに、１日１回、２週間の期間にわたり、腹腔内注射した。１週間当たり２～３回による生物発光イメージングにより、腫瘍の増殖を評価した。マウスを、スコアシートによりモニタリングし、エンドポイントが達成された場合には、安楽死させた。全てのマウスを、プロドラッグ処置の１４日後に終了させた。ex vivoでの腫瘍負荷の生物発光イメージング分析のために、肝臓を採取した。
参考文献
Figure 2023522025000067
Figure 2023522025000068
Figure 2023522025000069
Figure 2023522025000070
他の態様
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせてよい。本明細書において開示される各々の特徴は、同じか、等価か、または類似の目的において役立つ代替的な特徴により、置き換えることができる。したがって、別段に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、等価または類似の特徴の一般的なシリーズの単なる例である。
上の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、多様な用途および条件にそれを適応させるために、本開示の多様な変更および修飾を行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲のうちである。
均等物
いくつかの態様が本明細書において記載され、説明されるが、一方で、当業者は、機能を行うため、および／または結果を得るため、および／または本明細書において開示される利点のうちの１つ以上のための、多様な他の手段および／または構造を容易に想起し、かかる変更および／または修飾の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるものとみなされる。より一般的には、当業者は、全てのパラメーター、本明細書において記載される寸法、材料および立体配置は、例示的であることを意図されること、ならびい、実際のパラメーター、寸法、材料および／または立体配置は、本発明の教示が使用される特定の適用に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書において記載される特定の発明の態様に対する多くの均等物を、認識するか、または慣用的な実験のみを用いて確認することができるであろう。したがって、前述の態様は、単に例として提示されるものであること、および、添付の請求の範囲およびそれに対する均等物の範囲内において、本発明の態様は、特に記載され、請求されるものとは別段に実施されてもよいことが、理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法に向けられる。加えて、２つ以上のかかる特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法が互いに不一致でない場合には、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
本明細書において定義され用いられる全ての定義は、辞書の定義、参考として援用される文書における定義、および／または定義される用語の通常の意味に対して優先されることが理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して参考として援用され、それは、いくつかの場合においては、文書の全体を包含していてもよい。
不定冠詞「a」および「an」は、ここで本明細書において、および請求の範囲において用いられる場合、明らかに逆であることが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
句「および／または（and/or）」は、ここで本明細書において、および請求の範囲において用いられる場合、そのように接続された要素のうちの「いずれかまたは両方」、すなわち、いくつかの場合においては接続的に存在し、他の場合においては離接的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」により列記される複数の要素は、同じ様式、すなわち、そのように接続された要素のうちの「１つ以上」において解釈されるべきである。「および／または」節により特に同定される要素以外の他の要素が、任意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」についての言及は、「含むこと（comprising）」などのオープンエンドの語法と組み合わせて用いられる場合、一態様においては、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を；別の態様においては、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を；さらに別の態様においては、ＡとＢとの両方（任意の他の要素を含む）、などを指すことができる。
ここで、本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、「または（or）」は、上で定義される「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的であるもの、すなわち、多数の要素または要素のリスト、および任意にさらなる列記されていない項目のうちの少なくとも１つの包含（であるが、また１つ以上を含む）として解釈されるべきである。「～のうちの１つのみ」または「～のうちの正確に１つ」、または請求の範囲において用いられる場合には、「～からなる（consisting of）」などの、明らかに逆であることを示される用語のみが、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般的に、用語「または」は、本明細書において用いられる場合、「～のいずれか（either）」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つのみ」または「～のうちの正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとして解釈されるべきである。「～から本質的になる」は、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられるその通常の意味を有するべきである。
ここで、本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、句「少なくとも１つ」は、１つ以上の要素のリストに関して、要素のリスト中の要素のうちの任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきであるが、これは、必ずしも、要素のリスト内に特に列記される各々および全ての要素の少なくとも１つを含まず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト内に特に同定される要素以外の要素が、これらの特に同定された要素に関するものであるかこれと無関係であるかにかかわらず、任意に存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例において、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、等価に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または等価に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一態様においては、少なくとも１つ、任意に１つより多くの、Ａであって、Ｂは存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様においては、少なくとも１つ、任意に１つより多くの、Ｂであって、Ａは存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様においては、少なくとも１つ、任意に１つより多くの、Ａ、および少なくとも１つ、任意に１つより多くの、Ｂ（および任意に他の要素を含む）、などを指すことができる。
また、明らかに逆であることが示されない限り、ここで請求される任意の方法であって、１つより多くのステップまたは行為を含むものにおいて、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、当該方法のステップまたは行為が記述される順序に限定されないことが、理解されるべきである。
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、「～を含むこと（comprising）」、「～を含むこと（including）」、「～を担持すること（carrying）」、「～を有すること（having）」、「～を含むこと（containing）」、「～を含むこと（involving）」、「～を保持すること（holding）」、「～から構成されること（composed of）」および類似のものなどの全ての移行句は、オープンエンドであるもの、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）、セクション2111.03において記載されるとおり、移行句「～からなる（consisting of）」および「～から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ、クローズまたはセミクローズの移行句であるべきである。この文書においてオープンエンドの移行句（例として、「～を含むこと（comprising）」）を用いて記載される態様はまた、オープンエンドの移行句により記載される特徴「～からなる」およびこれら「～から本質的になる」ものとしての代替的な態様においても企図されることが、理解されるべきである。例えば、本開示が、「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替的な態様「ＡおよびＢからなる組成物」ならびに「ＡおよびＢから本質的になる組成物」を企図する。

Claims (117)

  1. 切れ目のないポリ核酸分子であって、
    ａ）その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結される第１のＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；および（ｉｉ）表１に列記されるｍｉＲＮＡのための標的部位またはこれらの組み合わせを含む；ならびに
    ｂ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、トランスアクチベーターの核酸配列を含む；
    を含み、
    ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する、
    前記切れ目のないポリ核酸分子。
  2. 第１のＲＮＡが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  3. 第１のＲＮＡが、３’ＵＴＲを含み、およびここで、３’ＵＴＲが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１または請求項２に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  4. 第１のＲＮＡが、５’ＵＴＲを含み、およびここで、５’ＵＴＲが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  5. 第２のＲＮＡが、表１において列記されるｍｉｃｒｏＲＮＡまたはこれらの組み合わせのための、標的部位をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  6. 第２のＲＮＡが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  7. 第２のＲＮＡが、３’ＵＴＲを含み、およびここで、３’ＵＴＲが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  8. 第２のＲＮＡが、５’ＵＴＲを含み、およびここで、５’ＵＴＲが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６または請求項７に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  9. 第１のカセットの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、第２のカセットの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位とが、同一の核酸配列であるか、または同じｍｉＲＮＡにより調節される異なる配列である、請求項６～８のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  10. 第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡが、各々、ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  11. トランスアクチベーター応答エレメントが、表３において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  12. 第２のＲＮＡの発現が、転写因子応答エレメントに作動可能に連結される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  13. 転写因子応答エレメントが、表４において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  14. トランスアクチベーターが、独立してトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  15. 第１のＲＮＡの発現が、転写因子応答エレメントに作動可能に連結される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  16. 転写因子応答エレメントが、表４において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  17. トランスアクチベーターは、転写因子応答エレメントに結合した転写因子の存在下においてのみ、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する、請求項１２、１３または１６のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  18. 第１のカセットおよび／または第２のカセットが、プロモーターエレメントを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  19. プロモーターエレメントが、表５において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  20. プロモーターエレメントが、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む、請求項１８に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  21. 第１のカセットが、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含み；かつ
    第２のカセットが、５’から３’へ、（ｉ）転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）トランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む、
    請求項１５～１７のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  22. 第１のカセットの転写因子応答エレメントと第２のカセットの転写因子応答エレメントとが、同一の核酸配列からなる、請求項２１に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  23. 第１のカセットの転写因子応答エレメントと第２のカセットの転写因子応答エレメントとが、異なる核酸配列からなる、請求項２１に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  24. 第１のカセットおよび／または第２のカセットが、２つ以上の転写因子応答エレメントを含む、請求項１５～２３のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  25. 第１のカセットおよび／または第２のカセットが、２つの異なる転写因子応答エレメントを含む、請求項２４に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  26. 第１のカセットの上流の調節コンポーネントが、プロモーターエレメントを含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  27. プロモーターエレメントが、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む、請求項２６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  28. 第２のカセットの上流の調節コンポーネントが、プロモーターエレメントを含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  29. プロモーターエレメントが、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む、請求項２８に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  30. 第１のカセットと第２のカセットとが、収束型の配向にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  31. 第１のカセットと第２のカセットとが、分散型の配向にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  32. 第１のカセットと第２のカセットとが、ヘッドトゥーテールの配向にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  33. 第１のカセットおよび／または第２のカセットが、インスレーターに隣接する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  34. 第２のカセットのトランスアクチベーターが、ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、ＰＩＴ－ＲｅｌＡ、ＰＩＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＲｅｌＡ、ＮａｒＬｃ－ＶＰ１６、またはＮａｒＬｃ－ＲｅｌＡである、請求項１～３３のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  35. 第２のカセットのトランスアクチベーターが、表２において列記される核酸配列を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  36. アウトプットが、タンパク質またはＲＮＡ分子である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  37. アウトプットが、治療剤である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  38. アウトプットが、蛍光タンパク質、サイトトキシン、プロドラッグ活性を触媒する酵素、免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡを修飾する因子、細胞表面受容体、遺伝子発現を調節する因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／またはベクター複製のために必要な因子、および／または病原体の抗原ポリペプチドをコードする配列である、請求項３６または請求項３７に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  39. アウトプットが、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－ＴＫ）からのチミジンキナーゼ酵素である、請求項３６または請求項３７に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  40. 免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡが、サイトカインまたはコロニー刺激因子である、請求項３８に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  41. ＤＮＡを修飾する因子が、遺伝子欠損を補正することを意図されたタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡを修飾する酵素、および／またはＤＮＡを修飾する系のコンポーネントである、請求項３８に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  42. ＤＮＡを修飾する酵素が、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＤＮＡ修飾系のタンパク質コンポーネントである、請求項４１に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  43. 遺伝子発現を調節する因子が、遺伝子発現を調節することができるタンパク質または遺伝子発現を調節することができるマルチコンポーネント系のコンポーネントである、請求項３８に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  44. 表６において列記される核酸配列を含む、切れ目のないポリ核酸分子。
  45. その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるＲＮＡをコードするカセットを含む、切れ目のないポリ核酸分子であって、ここで、ＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；（ｉｉ）トランスアクチベーターの核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）表１に列記されるｍｉＲＮＡのための標的部位またはこれらの組み合わせを含み、ここで、トランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する、前記切れ目のないポリ核酸分子。
  46. 第１のＲＮＡが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４５に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  47. ＲＮＡが、アウトプットおよびトランスアクチベーターの核酸配列を分離するポリシストロニック発現エレメントの核酸配列をさらに含む、請求項４５または請求項４６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  48. ＲＮＡが、３’ＵＴＲを含み、およびここで、３’ＵＴＲが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  49. ＲＮＡが、５’ＵＴＲを含み、およびここで、５’ＵＴＲが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位、ｌｅｔ－７ａ標的部位、ｌｅｔ－７ｂ標的部位、ｌｅｔ－７ｄ標的部位、ｌｅｔ－７ｅ標的部位、ｌｅｔ－７ｆ標的部位、ｌｅｔ－７ｇ標的部位、ｌｅｔ－７ｉ標的部位、ｍｉＲ－２２標的部位、ｍｉＲ－２６ｂ標的部位、ｍｉＲ－１２２標的部位、ｍｉＲ－２０８ａ標的部位、ｍｉＲ－２０８ｂ標的部位、ｍｉＲ－１標的部位、ｍｉＲ－２１７標的部位、ｍｉＲ－２１６ａ標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  50. ＲＮＡが、ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  51. トランスアクチベーター応答エレメントが、表３において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  52. トランスアクチベーターが、独立してトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  53. ＲＮＡの発現が、トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントに作動可能に連結される、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  54. 転写因子応答エレメントが、表４において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項５３に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  55. トランスアクチベーターが、転写因子応答エレメントに結合した転写因子の存在下においてのみ、トランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する、請求項５３に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  56. カセットが、プロモーターエレメントを含む、請求項４５～５５のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  57. プロモーターエレメントが、表５において列記される核酸配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項５６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  58. プロモーターエレメントが、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む、請求項５６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  59. 切れ目のないポリ核酸分子が、５’から３’へ、（ｉ）トランスアクチベーター応答エレメントおよび転写因子応答エレメントを含む上流の調節コンポーネント；（ｉｉ）アウトプットおよびトランスアクチベーターをコードする核酸配列；ならびに（ｉｉｉ）ｌｅｔ－７ｃ標的部位を含む下流のコンポーネントを含む、請求項５３または請求項５５に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  60. （ｉ）における上流の調節コンポーネントが、プロモーターエレメントを含む、請求項５９に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  61. プロモーターエレメントが、哺乳動物のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む、請求項６０に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  62. 少なくとも１つのカセットのトランスアクチベーターが、ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、ＰＩＴ－ＲｅｌＡ、ＰＩＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＶＰ１６、ＥＴ－ＲｅｌＡ、ＮａｒＬｃ－ＶＰ１６、またはＮａｒＬｃ－ＲｅｌＡである、請求項４５～６１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  63. 第２のカセットのトランスアクチベーターが、表２において列記される核酸配列を含む、請求項４５～６１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  64. アウトプットが、タンパク質またはＲＮＡ分子である、請求項４５～６２のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  65. アウトプットが、治療用タンパク質またはＲＮＡ分子である、請求項４５～６４のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  66. アウトプットが、蛍光タンパク質、サイトトキシン、プロドラッグ活性を触媒する酵素、免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡ、ＤＮＡを修飾する因子、細胞表面受容体、遺伝子発現を調節する因子、キナーゼ、エピジェネティック修飾因子、および／またはベクター複製のために必要な因子、および／または病原体の抗原ポリペプチドをコードする配列である、請求項６４または請求項６５に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  67. アウトプットが、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－ＴＫ）からのチミジンキナーゼ酵素である、請求項６４または請求項６５に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  68. 免疫調節性のタンパク質および／またはＲＮＡが、サイトカインまたはコロニー刺激因子である、請求項６６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  69. ＤＮＡを修飾する因子が、遺伝子欠損を補正することを意図されたタンパク質をコードする遺伝子、ＤＮＡを修飾する酵素、および／またはＤＮＡを修飾する系のコンポーネントである、請求項６６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  70. ＤＮＡを修飾する酵素が、部位特異的リコンビナーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のタンパク質コンポーネントである、請求項６９に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  71. 遺伝子発現を調節する因子が、遺伝子発現を調節することができるタンパク質または遺伝子発現を調節することができるマルチコンポーネント系のコンポーネントである、請求項６６に記載の切れ目のないポリ核酸分子。
  72. 請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子を含む、ベクター。
  73. 請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子を含む、操作されたウイルスゲノム。
  74. ウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム、レンチウイルスゲノム、アデノウィルスゲノム、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、ワクシニアウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノム、コクサッキーウイルスゲノム、レオウイルスゲノム、麻疹ウイルスゲノム、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノム、パルボウイルスゲノム、セネカバレーウイルスゲノム、マラバウイルスゲノムまたは風邪ウイルスゲノムである、請求項７３に記載の操作されたウイルスゲノム。
  75. 請求項７３または請求項７４に記載の操作されたウイルスゲノムを含む、ビリオン。
  76. ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ－Ｂ１キャプシドをさらに含む、請求項７５に記載のビリオン。
  77. 細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法であって、細胞の集団を、請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子、請求項７２に記載のベクター、請求項７３または請求項７４に記載の操作されたウイルスゲノム、または請求項７５もしくは請求項７６に記載のビリオンと接触させることを含み、ここで、細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および１つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性が、２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して、少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性において異なり；およびここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される。
  78. 少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとが、内因性転写因子のレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、内因性転写因子に応答する転写因子応答エレメントをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとが、プロモーターフラグメントのレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、このプロモーターフラグメントをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
  80. 疾患または状態を診断する方法であって、請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子、請求項７２に記載のベクター、請求項７３または請求項７４に記載の操作されたウイルスゲノム、あるいは請求項７５または請求項７６に記載のビリオンを、疾患または状態に関連する１つ以上の徴候または症状を示している対象に投与することを含み、ここで、アウトプットのレベルは、疾患および／または状態の存在または不在を示す、前記方法。
  81. 疾患が、がんである、請求項８０に記載の方法。
  82. がんが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である、請求項８１に記載の方法。
  83. 疾患または状態を処置する方法であって、請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子、請求項７２に記載のベクター、請求項７３または請求項７４に記載の操作されたウイルスゲノム、あるいは請求項７５または請求項７６に記載のビリオンを、疾患または状態を有する対象に投与することを含む、前記方法。
  84. プロドラッグを投与することをさらに含む、請求項８３に記載の方法であって、任意にここで、プロドラッグは、ガンシクロビルであり、任意にここで、切れ目のないポリ核酸分子は、表６において列記される核酸配列を含む、前記方法。
  85. 疾患が、がんである、請求項８３に記載の方法。
  86. がんが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である、請求項８５に記載の方法。
  87. 細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法における使用のための組成物であって、前記方法が、細胞の集団を、請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子、請求項７２に記載のベクター、請求項７３または請求項７４に記載の操作されたウイルスゲノム、あるいは請求項７５または請求項７６に記載のビリオンと接触させることを含み、ここで、細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および１つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性が、２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して、少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルおよび／または活性において異なり；およびここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される、前記組成物。
  88. 少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとが、内因性転写因子のレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、内因性転写因子に応答する転写因子応答エレメントをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとが、プロモーターフラグメントのレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、このプロモーターフラグメントをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
  90. 疾患または状態を診断する方法における使用のための組成物であって、前記方法が、請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子、請求項７２に記載のベクター、請求項７３または請求項７４に記載の操作されたウイルスゲノム、あるいは請求項７５または請求項７６に記載のビリオンを、疾患または状態に関連する１つ以上の徴候または症状を示している対象に投与することを含み、ここで、アウトプットのレベルは、疾患および／または状態の存在または不在を示す、前記組成物。
  91. 疾患が、がんである、請求項９０に記載の使用のための組成物。
  92. がんが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である、請求項９１に記載の使用のための組成物。
  93. 疾患または状態を処置する方法における使用のための組成物であって、前記方法が、請求項１～４４または請求項４５～７１のいずれか一項に記載の切れ目のないポリ核酸分子、請求項７２に記載のベクター、請求項７３または請求項７４に記載の操作されたウイルスゲノム、あるいは請求項７５または請求項７６に記載のビリオンを、疾患または状態を有する対象に投与することを含む、前記組成物。
  94. プロドラッグを投与することをさらに含む、請求項９３に記載の方法であって、任意にここで、プロドラッグは、ガンシクロビルであり、任意にここで、切れ目のないポリ核酸分子は、表６において列記される核酸配列を含む、前記方法。
  95. 疾患が、がんである、請求項９３に記載の使用のための組成物。
  96. がんが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、転移性大腸癌、肝臓における転移性腫瘍、乳癌、肺癌、網膜芽細胞腫、および膠芽腫である、請求項９５に記載の使用のための組成物。
  97. 細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法であって、前記方法が、細胞の集団を、切れ目のないポリ核酸分子または前記切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物と接触させることを含み、ここで：
    ａ）細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および２つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルが、少なくとも非標的細胞のサブセット、例えば少なくとも２つおよび任意に２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルにおいて異なり；かつ
    ｂ）切れ目のないポリ核酸分子は、
    （ｉ）その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、アウトプットの核酸配列；および１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡに対応する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位を含む；ならびに
    （ｉｉ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、トランスアクチベーターの核酸配列を含む；
    を含み、
    ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化し；および
    ここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される、
    前記方法。
  98. 切れ目のないポリ核酸分子が、表６において列記される核酸配列を含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 細胞の集団において細胞特異的なイベントを刺激する方法であって、細胞の集団を、切れ目のないポリ核酸分子または前記切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物と接触させることを含み、ここで、
    ａ）細胞の集団は、少なくとも１つの標的細胞型および２つ以上の非標的細胞型を含み、ここで、標的細胞型（単数または複数）と非標的細胞型とは、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルが、少なくとも非標的細胞のサブセット、例えば少なくとも２つおよび任意に２つ以上の非標的細胞の各々において、標的細胞の各々と比較して少なくとも２倍高くなるように、１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡのレベルにおいて異なる；ならびに
    ｂ）切れ目のないポリ核酸分子は、その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結されるｍＲＮＡをコードするカセットを含み、ここで、ＲＮＡは、アウトプットの核酸配列；トランスアクチベーターの核酸配列；および１つ以上の内因性ｍｉＲＮＡに対応する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位を含む；ならびに
    ここで、トランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、カセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する；ならびに
    ここで、細胞特異的なイベントは、細胞の集団の細胞におけるアウトプットの発現レベルにより調節される、
    前記方法。
  100. 切れ目のないポリ核酸分子を含む組成物が、切れ目のないポリ核酸を含むベクター、切れ目のないポリ核酸を含む操作されたウイルスゲノム、またはポリ核酸を含むビリオンを含む、請求項９７または９９に記載の方法。
  101. 内因性ｍｉＲＮＡが、表１において列記されるｍｉＲＮＡまたは表１において列記されるｍｉＲＮＡの組み合わせから選択される、請求項９７～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 内因性ｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ－７ｃ、ｌｅｔ－７ａ、ｌｅｔ－７ｂ、ｌｅｔ－７ｄ、ｌｅｔ－７ｅ、ｌｅｔ－７ｆ、ｌｅｔ－７ｇ、ｌｅｔ－７ｉ、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－２６ｂ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１６ａ、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９７～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとが、内因性転写因子のレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、内因性転写因子に応答する転写因子応答エレメントをさらに含む、請求項９７～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  104. 少なくとも標的細胞のサブセットと少なくとも非標的細胞のサブセットとが、プロモーターフラグメントのレベルまたは活性において異なり、ここで、切れ目のない核酸分子は、このプロモーターフラグメントをさらに含む、請求項９７～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  105. 標的細胞が、腫瘍細胞であり、細胞特異的なイベントが、腫瘍細胞の死である、請求項９７～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  106. 腫瘍細胞の死が、活性化受容体リガンド、特異的抗原、刺激性サイトカインまたはこれらの任意の組み合わせの発現を通した免疫ターゲティングにより媒介される、請求項１０５に記載の方法。
  107. 標的細胞が、老化細胞であり、細胞特異的なイベントが、老化細胞の死である、請求項９７～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  108. 細胞の集団を、アウトプットにより代謝されて治療的または毒性の化合物となるプロドラッグまたは非毒性の前駆体化合物と接触させることをさらに含む、請求項９７～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. アウトプット発現は、標的細胞集団の生存を保証するが、一方で、非標的細胞は、アウトプット発現の欠落に起因して、かつ無関係かつ非特異的な細胞死誘導剤の存在下において、除去される、請求項９７～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  110. アウトプット発現がこの特定の表現型の細胞に限定されるように、標的細胞が、目的の特定の表現型を含む、請求項９７～１０３。
  111. 標的細胞が、選択された細胞型であり、細胞特異的なイベントが、選択された細胞型においては天然で不在であるかまたは不活性な遺伝子の発現を通して、新規の機能をコードすることである、請求項９７～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  112. 細胞の集団が、多細胞生物を含む、請求項９７～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 多細胞生物が、動物である、請求項１１２に記載の方法。
  114. 動物が、ヒトである、請求項１１３に記載の方法。
  115. 細胞の集団が、ex-vivoで接触させられる、請求項９７～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 細胞の集団が、in-vivoで接触させられる、請求項９７～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  117. 切れ目のないポリ核酸分子であって、
    ａ）その発現がトランスアクチベーター応答エレメントに作動可能に連結される第１のＲＮＡをコードする第１のカセット、ここで、第１のＲＮＡは、（ｉ）アウトプットの核酸配列；および（ｉｉ）ｍｉＲＮＡのための標的部位を含み、ここで、前記ｍｉＲＮＡは、哺乳動物の少なくとも２つの異なる健康な組織において、高度に発現されるか、および／または活性であり、１つ以上の型の標的細胞において低レベルで発現される；
    ｂ）第２のＲＮＡをコードする第２のカセット、ここで、第２のＲＮＡは、 の核酸配列を含む；
    を含み、
    ここで、第２のカセットのトランスアクチベーターは、タンパク質として発現された場合に、第１のカセットのトランスアクチベーター応答エレメントに結合してこれをトランス活性化する、
    前記切れ目のないポリ核酸分子。
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