CN115702247A - 细胞分类器回路及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了编码用于精确体内细胞靶向的高度紧凑的多输入基因逻辑门的连续DNA序列，以及使用体内递送和此类连续DNA序列的组合治疗疾病的方法。

Description

细胞分类器回路及其使用方法
技术领域
本文公开了编码用于精确体内细胞靶向的高度紧凑的多输入基因逻辑门的连续DNA序列，以及使用体内递送和此类连续DNA序列的组合治疗疾病的方法。
背景技术
基因治疗作为基因疾病和癌症的下一代治疗选项正在增加。然而，目前的基因治疗载体被为了产生治疗性引线(therapeutic lead)的低效力、高毒性和长开发时间线所困扰。这些缺点的一个原因是对基因治疗载体中治疗基因表达的控制不够严格，这导致(i)在非预期的细胞类型和组织中的或(ii)以不足的或过高的剂量的基因表达。换句话说，基因表达的精确控制，在基因产物剂量(即，每细胞的蛋白分子数目)和细胞类型限制的表达两方面在基因治疗中仍然是开放的挑战。
发明内容
在生物分子计算和合成生物学中的研究已经长期寻求能够基于以下来实现新类型的治疗方法：(i)分子疾病指示器的多输入感测；(ii)以确定治疗响应强度的分子水平计算；以及(iii)以高度精确和协调的方式原位治疗的增强。本文描述了细胞分类器基因回路，其能够经由多个细胞输入的复杂逻辑集成来精确鉴定异质细胞类型。本文还描述了使用分类器基因回路治疗疾病的方法。癌症已被认为是一类这样的疾病，由于与健康细胞的肿瘤相似性、肿瘤异质性以及其在初级和次级基因座二者处的传播，所述疾病将从细胞分类器方法收益最多。本文所述的研究支持用于精确细胞靶向的多输入基因回路是用于下一代基因治疗的理想途径的概念。
因此，在一些方面，本公开涉及连续多核酸分子。在一些实施方式中，连续多核酸分子包含：a)第一盒，其编码第一RNA，所述第一RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：(i)输出的核酸序列；和(ii)用于表1中列出的miRNA的靶位点或其组合；和b)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含转活化剂的核酸序列；其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化第一盒的转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，第一RNA包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，第一RNA包含3’UTR，并且其中3’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，第一RNA包含5’UTR，并且其中5’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，第二RNA进一步包含用于表1中列出的microRNA的靶位点或其组合。
在一些实施方式中，其中第二RNA进一步包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，第二RNA包含3’UTR，并且其中3’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，第二RNA包含5’UTR，并且其中5’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，第一盒的至少一个miRNA靶位点和第二盒的至少一个miRNA靶位点是由同一miRNA调节的相同的核酸序列或不同的序列。
在一些实施方式中，第一RNA和第二RNA各自包含let-7c靶位点。
在一些实施方式中，转活化剂响应元件包含表3中列出的核酸序列或其组合。
在一些实施方式中，第二RNA的表达可操作地连接至转录因子响应元件。在一些实施方式中，转录因子响应元件包含表4中列出的核酸序列或其组合。
在一些实施方式中，转活化剂独立地结合和转活化转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，第一RNA的表达可操作地连接至转录因子响应元件。在一些实施方式中，转录因子响应元件包含表4中列出的核酸序列或其组合。
在一些实施方式中，转活化剂仅在结合至转录因子响应元件的转录因子的存在下结合和转活化转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，第一盒和/或第二盒包含启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包含表5中列出的核酸序列或其组合。在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中：第一盒从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分；和第二盒从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
在一些实施方式中，第一盒的转录因子响应元件和第二盒的转录因子响应元件由相同的核酸序列组成。
在一些实施方式中，第一盒的转录因子响应元件和第二盒的转录因子响应元件由不同的核酸序列组成。
在一些实施方式中，第一盒和/或第二盒包含两个或多个转录因子响应元件。
在一些实施方式中，第一盒和/或第二盒包含两个不同的转录因子响应元件。
在一些实施方式中，第一盒的上游调节组分包含启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中，第二盒的上游调节组分包含启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中，第一盒和第二盒处于会聚取向。在一些实施方式中，第一盒和第二盒处于发散取向。在一些实施方式中，第一盒和第二盒处于头到尾取向。
在一些实施方式中，第一盒和/或第二盒侧翼为绝缘体。
在一些实施方式中，第二盒的转活化剂是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
在一些实施方式中，第二盒的转活化剂包含表2中列出的核酸序列。
在一些实施方式中，输出是蛋白或RNA分子。在一些实施方式中，输出是治疗剂。在一些实施方式中，输出是荧光蛋白、细胞毒素、催化前药活化的酶、免疫调节蛋白和/或RNA、DNA修饰因子、细胞表面受体、基因表达调节因子、激酶、表观基因修饰剂、和/或载体复制所需的因子和/或编码病原体的抗原多肽的序列。在一些实施方式中，输出是来自人单纯疱疹病毒1(HSV-TK)的胸苷激酶。在一些实施方式中，免疫调节蛋白和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。在一些实施方式中，DNA修饰因子是编码用来校正基因缺陷的蛋白、DNA修饰酶和/或DNA修饰系统的组分的基因。在一些实施方式中，DNA修饰酶是位点特异性重组酶、归巢核酸内切酶或CRISPR/Cas DNA修饰系统的蛋白组分。在一些实施方式中，基因表达调节因子是能够调节基因表达的蛋白或能够调节基因表达的多组分系统的组分。
在一些实施方式中，连续多核酸分子，其包含表6中列出的核酸序列。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包含编码RNA的盒，所述RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中RNA包含：(i)输出的核酸序列；(ii)转活化剂的核酸序列；和(iii)用于表1中列出的miRNA的靶位点或其组合；其中转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，第一RNA包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，RNA进一步包含多顺反子表达元件的核酸序列，其隔开输出和转活化剂的核酸序列。
在一些实施方式中，RNA包含3’UTR，并且其中3’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，RNA包含5’UTR，并且其中5’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
在一些实施方式中，RNA包含let-7c靶位点。
在一些实施方式中，转活化剂响应元件包含表3中列出的核酸序列或其组合。
在一些实施方式中，转活化剂独立地结合和转活化转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件和转录因子响应元件。在一些实施方式中，转录因子响应元件包含表4中列出的核酸序列或其组合。
在一些实施方式中，转活化剂仅在结合至转录因子响应元件的转录因子的存在下结合和转活化转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，盒包含启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包含表5中列出的核酸序列或其组合。在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中，连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出和转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
在一些实施方式中，(i)中的上游调节组分包含启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中，至少一个盒的转活化剂是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
在一些实施方式中，输出是蛋白或RNA分子。在一些实施方式中，输出是治疗性蛋白或RNA分子。在一些实施方式中，输出是荧光蛋白、细胞毒素、催化前药活化的酶、免疫调节蛋白和/或RNA、DNA修饰因子、细胞表面受体、基因表达调节因子、激酶、表观基因修饰剂、和/或载体复制所需的因子和/或编码病原体的抗原多肽的序列。在一些实施方式中，输出是来自人单纯疱疹病毒1(HSV-TK)的胸苷激酶。在一些实施方式中，免疫调节蛋白和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。在一些实施方式中，DNA修饰因子是编码用来校正基因缺陷的蛋白、DNA修饰酶和/或DNA修饰系统的组分的基因。在一些实施方式中，DNA修饰酶是位点特异性重组酶、归巢核酸内切酶或CRISPR/Cas系统的蛋白组分。在一些实施方式中，基因表达调节因子是能够调节基因表达的蛋白或能够调节基因表达的多组分系统的组分。
在其他方面，本公开涉及载体，其包含本文所述的连续多核酸。
在其他方面，本公开涉及工程化病毒基因组，其包含本文所述的连续多核酸。在一些实施方式中，工程化病毒基因组源自腺相关病毒(AAV)基因组、慢病毒基因组、腺病毒基因组、单纯疱疹病毒(HSV)基因组、牛痘病毒基因组、痘病毒基因组、新城疫疾病病毒(NDV)基因组、柯萨奇病毒基因组、rheo病毒(rheovirus)基因组、麻疹病毒基因组、水泡性口炎病毒(VSV)基因组、细小病毒基因组、塞内卡谷病毒基因组、马拉巴病毒基因组或常见感冒病毒基因组。
在其他方面，本公开涉及病毒体，其包含本文公开的工程化病毒基因组。在一些实施方式中，病毒体包含AAV-DJ、AAV8、AAV6或AAV-B1衣壳。
在其他方面，本公开涉及在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法。在一些实施方式中，在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法包含将细胞群与本文所述的连续多核酸分子、本文所述的载体、本文所述的工程化病毒基因组或本文所述的病毒体接触，其中细胞群包含至少一个靶细胞类型和一个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性在两个或多个非靶细胞的每一个中相对于靶细胞的每一个至少两倍高；并且其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。
在一些实施方式中，靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在内源性转录因子的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含与内源性转录因子相对应的转录因子响应元件。
在一些实施方式中，靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在启动子片段的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含该启动子片段。
在其他方面，本公开涉及诊断疾病或病况的方法。在一些实施方式中，一种诊断疾病或病况的方法，其包含向表现出与疾病或病况相关的一个或多个标志或症状的受试者施用本文所述的连续多核酸分子、本文所述的载体、本文所述的工程化病毒基因组或本文所述的病毒体，其中输出的水平指示疾病和或病况的存在或不存在。
在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
在其他方面，本公开涉及治疗疾病或病况的方法。在一些实施方式中，一种治疗疾病或病况的方法，其包含向具有疾病或病况的受试者施用本文所述的连续多核酸分子、本文所述的载体、本文所述的工程化病毒基因组或本文所述的病毒体。
在一些实施方式中，所述方法进一步包含施用前药，任选地其中前药是更昔洛韦，任选地其中连续多核酸分子包含表6中列出的核酸序列。
在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
在一些方面，本公开涉及在刺激细胞特异性事件的方法中使用的方法。在一些实施方式中，在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法中使用组合物，所述方法包含将细胞群与本文所述的连续多核酸分子、本文所述的载体、本文所述的工程化病毒基因组或本文所述的病毒体接触，其中细胞群包含至少一个靶细胞类型和一个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性在两个或多个非靶细胞的每一个中相对于靶细胞的每一个至少两倍高；并且其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。
在一些实施方式中，靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在内源性转录因子的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含与内源性转录因子相对应的转录因子响应元件。
在一些实施方式中，靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在启动子片段的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含该启动子片段。
在其他方面，本公开涉及诊断疾病或病况的方法中使用的组合物。在一些实施方式中，一种诊断疾病或病况的方法中使用组合物，所述方法包含向表现出与疾病或病况相关的一个或多个标志或症状的受试者施用本文所述的连续多核酸分子、本文所述的载体、本文所述的工程化病毒基因组或本文所述的病毒体，其中输出的水平指示疾病和或病况的存在或不存在。
在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
在其他方面，本公开涉及在治疗疾病或病况的方法中使用的组合物。在一些实施方式中，在治疗疾病或病况的方法中使用组合物，所述方法包含向具有疾病或病况的受试者施用本文所述的连续多核酸分子、本文所述的载体、本文所述的工程化病毒基因组或本文所述的病毒体。
在一些实施方式中，所述方法进一步包含施用前药，任选地其中前药是更昔洛韦，任选地其中连续多核酸分子包含表6中列出的核酸序列。
在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
在其他方面，本公开涉及在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法。在一些实施方式中，一种在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法包含将细胞群与连续多核酸分子或包含所述连续多核酸分子的组合物接触，其中：a)细胞群包含至少一个靶细胞类型和两个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平在非靶细胞的至少一个子集中，例如两个或多个非靶细胞的至少两个和任选地每一个中，相对于靶细胞的每一个至少两倍高；和b)连续多核酸分子包含：(i)第一盒，其编码RNA，所述RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：输出的核酸序列；和与一个或多个内源性miRNA相对应的一个或多个miRNA靶位点；和(ii)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含转活化剂的核酸序列；其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化第一盒的转活化剂响应元件；并且其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。在一些实施方式中，连续多核酸分子包含表6中列出的核酸序列。
在一些实施方式中，一种在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法，其包含将细胞群与或包含所述连续多核酸分子的组合物接触，其中：a)细胞群包含至少一个靶细胞类型和两个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平在非靶细胞的至少一个子集中，例如在两个或多个非靶细胞的至少两个和任选地每一个中，相对于靶细胞的每一个至少两倍高；和b)连续多核酸分子包含盒，所述盒编码mRNA，所述RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中RNA包含：输出的核酸序列；转活化剂的核酸序列；和与一个或多个内源性miRNA相对应的一个或多个miRNA靶位点；并且其中转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化盒的转活化剂响应元件；并且其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。
在一些实施方式中，包含连续多核酸分子的组合物包括包含连续多核酸的载体、包含连续多核酸的工程化病毒基因组或包含多核酸的病毒体。
在一些实施方式中，内源性miRNA选自表1中列出的miRNA或表1中列出的miRNA的组合。在一些实施方式中，内源性miRNA选自由let-7c、let-7a、let-7b、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-22、miR-26b、miR-122、miR-208a、miR-208b、miR-1、miR-217、miR-216a或其组合组成的组。
在一些实施方式中，靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在内源性转录因子的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含与内源性转录因子相对应的转录因子响应元件。
在一些实施方式中，靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在启动子片段的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含该启动子片段。
在一些实施方式中，靶细胞是肿瘤细胞并且细胞特异性事件是肿瘤细胞死亡。在一些实施方式中，肿瘤细胞死亡通过活化受体配体、特异性抗原、刺激细胞因子或其任意组合的表达由免疫靶向来介导。
在一些实施方式中，靶细胞是衰老细胞并且细胞特异性事件是衰老细胞死亡。
在一些实施方式中，方法进一步包含将细胞群与由输出代谢成治疗性或有毒化合物的前药或无毒前体化合物接触。
在一些实施方式中，输出表达确保靶细胞群的存活，而非靶细胞由于缺乏输出表达和在不相关和非特异性细胞死亡诱导剂的存在下被消除。
在一些实施方式中，靶细胞包含感兴趣的特定表型使得输出表达限于该特定表型的细胞。
在一些实施方式中，靶细胞是精选的细胞类型，并且通过在精选的细胞类型中天然不存在或无活性的基因的表达，细胞特异性事件是新功能的编码。
在一些实施方式中，细胞群包含多细胞有机体。在一些实施方式中，多细胞有机体是动物。在一些实施方式中，动物是人。
在一些实施方式中，细胞群是离体接触的。在一些实施方式中，细胞群是体内接触的。
在其他方面，本公开涉及连续多核酸分子。在一些实施方式中，连续多核酸分子包含：a)第一盒，其编码第一RNA，所述第一RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：(i)输出的核酸序列；和(ii)用于miRNA的靶位点，其中所述miRNA在哺乳动物的至少两个不同的健康组织中是高表达的和/或有活性的并且在一个或多个类型的靶细胞中以低水平表达；b)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含核酸序列，其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合以及转活化第一盒的转活化剂响应元件。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步展示本公开的某些方面，其可以通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文呈现的具体实施方式的详细描述，被更好地理解。应当理解，附图中所示的数据决不限制本公开的范围。
图1A-1N.将多质粒回路结构翻译成病毒载体。图1A.基因设置示意图。制备发散的(顶部)和会聚的(底部)设置；使用辅助转活化剂PIT的不同变体为每个制备两个变体(发散的：D-P2：PIT＝PIT：：RelA；D-PV：PIT＝PIT：：VPI6；会聚的：C-P2：PIT＝PIT：：RelA；C-PV：PIT＝PIT：：VPI6)。图1B.在HeLa细胞中使用瞬时转染和异位输入表达测试骨架DNA性能。每个分组中的柱条从左到右：C-P2、D-P2、C-PV、D-PV。图1C.在HuH-7和HeLa细胞中评估构建体对内源性输入的响应。每个分组中的柱条从左到右：C-P2、D-P2、C-PV、D-PV。图1D.使用miR-424靶序列说明并入miRNA靶的构建体作为鲁棒关断开关的示意图。制备发散的(顶部)和会聚的(底部)设置；使用辅助转活化剂PIT的不同变体为每个制备两个变体(发散的：D-P2：PIT＝PIT：：RelA-T424；D-PV：PIT＝PIT：：VPI6-T424；会聚的：C-P2：PIT＝PIT：：RelA-T424；C-PV：PIT＝PIT：：VPI6-T424)。图1E.经由TF输入的异位表达对HeLa细胞中的逻辑程序的AND-门组分进行验证。每个分组中的柱条从左到右：C-P2-T424、D-P2-T424、C-PV-T424、D-PV-T424。图1F.在HuH-7和HeLa细胞中评估回路对内源性转录输入的响应。柱条的顺序与图1E相同。图1G.使用异位输入递送在HeLa细胞中完整评估在发散的取向上编码的三-输入程序。鉴于在不存在所有输入的情况下表达的缺乏以及miR-424是负调节剂的事实，具有仅存在的miR-424的输入组合由于明显无用而未被评估。每个分组中的柱条从左到右：D-P2-T424、D-PV-T424。图1H.miRNA开关在诱导TF输入的存在下的功能性。在有和没有miR-424模拟物的异位转染的HuH-7细胞中测试回路输出(在X轴下指示)。柱条的顺序与图1G相同。图1I.在内源性表达的诱导TF输入的存在下，具有miR-126靶的回路相对于它们的抑制性的评估。柱条的顺序与图1G相同。图1J.以两个HCC细胞系和HeLa细胞作为阴性对照，评估miRNA靶对细胞分类性能的作用。每个分组中的柱条从左到右：D-P2、D-PV、D-P2-T424、D-PV-T424、C-PV-T126、D-PV-T126。图1K.在HCC细胞系HepG2和HuH-7中，有和没有并入、包装到DJ-假型AAV载体中的miRNA传感器的回路组的评估。HeLa和HCT-116细胞系用作计数器样本。每个分组中的柱条从左到右：CMV、D-P2、D-PV、D-P2-T424、D-PV-T424、C-PV-T126、D-PV-T126。图1L.区分健康的原代肝细胞与HCC细胞系的一组miRNA的容量的体外评估。每个分组中的柱条从左到右：TFF5、T424、T126、T122。图1M-1N.不同miRNA靶设置以及它们对输出抑制幅度的影响的探究。图1M.不同构建体及它们的速记符号的示意图。图1N.HepG2细胞(无miR-122表达)和HuH-7细胞(中间水平的miR-122表达)中生成的输出。每个分组中的柱条从左到右：HepG2、Huh-7。缩写：ITR：AAV2的内部终端重复；pA：SV40多腺苷酸化信号(会聚取向)，在发散取向上hGH与mCherry相邻并且SV40pA与PIT基因相邻；Cherry：编码mCherry荧光蛋白的序列；TATA：最小TATA盒(Angelici等，2016)；HNF1 RE：结合HNF1A和HNF1B的响应元件；PIT RE：结合PIT：：RelA和PIT：：VP16转活化剂的响应元件；SOX RE：结合SOX9和SOX10转录因子的DNA序列，以及可能来自SOX家族SOX1-SOX15、SOX17、SOX18、SOX21、SOX30和SRY的其他转录因子；PIT：普那霉素-诱导型转活化剂(Fussenegger等，2000)，其代表PIT：RelA或PIT：：VP16融合物二者其一。图表设计：输出mCherry的归一化表达显示在Y轴上。
图2A-2F.HCC的原位小鼠模型中的特异性和功效的可行性评估。图2A.包装到DJ-假型病毒载体中的所选回路的细胞分类能力的体外验证。图2B.与组成型对照载体相比，通过具有HSV-TK输出的回路的体外细胞去除。在此采用的回路的示意图显示在条形图的上方。对于每个细胞系或原代肝细胞，在组成型HSV-TK载体、回路以及单独的GCV的存在下，测量对更昔洛韦的剂量响应(X轴)。细胞活力MTS读数显示在Y轴上。图2C.如图中所示，针对先导实验的不同试验组(n＝2)示出荷瘤小鼠中的肿瘤负荷的进展。图2D.在终止时通过发光定量肝脏中的肿瘤负荷，左边的图像是肝脏(灰度)和生物发光信号的叠加。图2E.终止后肝脏中的肿瘤负荷的定量分析。图2F.接种后不久肿瘤负荷与终止时的肿瘤负荷之间的相关性。来自治疗组的两个小鼠用两个红点表示。
图3A-3F.用于肿瘤靶向程序的选择的且广泛适用的miRNA输入的鉴定。图3A.基于miRNA候选物在健康肝脏中的高表达和在HCC样本中的低表达，它们的细胞概况分析和排列的示意图。图3B.预选择的miRNA输入的功能验证的示意图。针对每个输入产生报告物病毒载体，并且将每个载体递送到感兴趣的每个样本(逐个)以评估输入的生物活性。图3C.miRNA组在两个HCC细胞系和原代健康肝细胞中的功能评估的结果。低报告物表达对应于高miRNA活性。FF5是对照靶。图3D.NGS概况分析实验中鉴定的miRNA表达计数(Dastor等，2018)与所选miRNA传感器的功能响应之间的相关性。趋势线拟合到抑制物Hill函数。图3E.在全身递送后，在不同的小鼠器官中一组miRNA报告物载体的定量表达。将同一器官(在图上方标示)中不同报告物的表达分组在一起。柱条阴影指示基于文献分析和概况分析数据报告物预期在哪个器官中作出响应。将这些值归一化到具有TFF5靶的对照载体；接着，清楚的是该靶在体内响应隐藏的输入，并且许多报告物分子导致高于1的输出值。图3F.在各器官的报告物表达的代表性图像。报告物的名字标示在左边。Cerulean图显示了组成型mCerulean内部对照的表达。Cherry图显示了mCherry报告物的残留表达，并提供了指定的miRNA靶。
图4A-4C.在体外回路特异性的验证。图4A.用于评估回路的作用机制的对照构建体的图。缩写与图1A、1D和1M中相同。图4B.将C.TF-AND子回路响应映射到10个细胞系和原代肝细胞中的内源性输入。对于每个细胞系，分别在X和Y轴上显示归一化到这些细胞中的组成型输出的SOX9/10和HNF1A/B的反馈-放大传感器的对数变换输出。C.TF-AND回路的输出显示在Z轴上。图4C.映射10个细胞系和原代肝细胞中的HCC.V2回路响应。C.TF-AND回路的对数变换输出和对数变换的C.let-7c报告物回路响应幅值绘制在轴X和Y上，而每个细胞系中的完整回路的输出显示在轴Z上。给定细胞类型的所有值归一化为该细胞类型中的组成型表达。
图5A-5D.回路靶向特异性的体内表征。图5A.在各种器官中使用B1-假型AAV载体获得的所选子程序、对照载体、全程序和背景的输出。通过定量图像分析获得这些值。图5B.组织切片的图像表示不同的器官，显示了来自不同载体的mCherry的表达，如图所示。显示了相位图像和mCherry通道。使用两种不同的曝光来表示胰腺切片，以反映mCherry变化的大动态范围。图5C.在肿瘤和在负荷HepG2-肿瘤小鼠的器官中，来自HCC.V2回路的mCherry输出的表达。肿瘤用mCitrine稳定转导，并显示在黄色荧光通道中。图5D.使用图像处理获得的肿瘤和荷瘤小鼠的各种器官中的mCherry表达的定量分析。
图6A-6B.两个HCC细胞系和原代肝细胞中的回路和对照的体外功效。图6A.在不存在任何AAV载体的情况下(正方形)、在组成型HSV-TK表达盒(三角形)或完整回路(圆圈)的存在下对GCV的剂量响应。使用MTS测定法测量的细胞活力显示在Y轴上。回路及它们的ID的示意图显示在顶部。图6B.HuH-7细胞系对组成型HSV-TK盒和两种不同的肿瘤靶向程序的不同载体剂量的敏感性。顶图，两个回路变体之间的比较；底图，组成型载体和第二回路变体之间的比较。
图7A-7F.原位小鼠模型中HCC靶向回路的功效。图7A.肿瘤建立和处理方案示意图。图7B.在各种试验组中的随时间的肿瘤负荷。经由体内全身生物发光测量的肿瘤负荷随时间的成像。对于每个动物，将负载归一化为在开始GCV注入方案之前的那天的负荷。图7C.蜘蛛图，其显示了主试验组中的个体动物的肿瘤负荷进展，归一化为在开始GCV注入方案之前的那天的肿瘤负荷。图7D.来自一些试验组的个体动物的全身发光的代表性图像。图7E.一些试验组在终止时通过整个器官生物发光测量的的个体肝脏和肝脏中的肿瘤负荷的图像。图7F.图7E中的肿瘤负荷的定量。
图8A-8C.AAV-B1肿瘤转导的体内评估。图8A.在肝脏和HepG2-肿瘤中，将封装在DJ-假型AAV载体中的对照载体、C.TF-AND子程序以及全程序的输出与封装在B1-假型AAV载体中的全回路的输出进行比较。肿瘤用mCitrine稳定转导，并显示在黄色荧光通道中。图8B.AAV-DJ和AAV-B1递送时肿瘤中的HCC.V2驱动的输出水平(mCherry)的定量。通过定量图像分析获得这些值。图8C.在大肿瘤结节的核心部分中来自由B1-假型AAV递送的HCC.V2回路的输出。
图9A-9B.结合多种肝脏保护性miRNA的优化的回路的合理设计。图9A.结合强miR-let7c和弱miR-122抑制的候选回路(HCC.V3)的示意图。通过使用在HCC.V2中描述的靶构型获得强miR-let7c抑制。可以通过改变miRNA靶的数量、设置或序列来调节由miR-122引起的抑制强度。示出了3种不同策略以减少与HCC.V1相比的miR-122抑制水平：(i)仅在回路的转活化剂分支上使用完美的miR-122靶(T-122*)；(ii)使用具有不完美互补性的miR-122靶(T-122*)的转活化剂和输出的双重抑制；或(iii)依赖于完美靶以抑制转活化剂和不完美miRNA靶以抑制输出的混合方法。选择使肝细胞系中的抑制最大化而使一组HCC细胞系(特别是HUH-7)中的表达损失最小化的候选物。在两种可能的miRNA靶相对定位变体中测试每个候选物。图9B.由miR-122(上和下分别为SEQ ID NO：305和306)调节的内源基因(P4HA1)的保守UTR区衍生的不完美miR-122靶(T-122*)的实例。通过使用内源基因中存在的序列或通过在miRNA种子序列侧翼的区域中引入随机突变获得具有不完美互补性的靶。两种方法都将用于产生具有不同剂量-响应分布的靶的选择。
具体实施方式
分子计算(Benenson，2012)和合成生物学(Weber和Fussenegger，2012)的前景之一已经是“智能”治疗的合理设计(Benenson等，2004)，其以复杂的方式并且实时地感测和响应与疾病相关的线索，从而导致精确的和“基于需求”的治疗行动。为了在该前景上递送，解决了三个单独的挑战。首先，充分理解疾病机制，以便为治疗相关的感测-计算-响应级联设计蓝图。特别地，识别相关的输入，并且确定将优先地导致最有效和最小毒性响应的程序。第二，存在能够实现这些治疗级联的强大的合成生物学平台，或者为该目的被重新开发。第三，这些平台适于临床相关的治疗模式。在后者中，细胞和基因治疗已被确定为最适合于合成基因回路的临床翻译，考虑到这两种模态能够并且经常需要并入工程化基因载荷。
解决所有三种挑战使潜在医学指征的领域变窄，以在翻译设置中开发方法。一条线的工作集中在基于细胞的植入物上，其中基因修饰的细胞能够感测血液循环中的特定疾病相关的提示，并且在响应中分泌具有治疗性质的分子剂。在这条线的工作中，细胞植入物用作感测器官疾病状态并在响应中产生影响整个有机体的治疗(Auslander等，2014；Tastanova等，2018；Ye等，2017)。研究的第二条线已经以CAR-T细胞治疗方法为基础并且扩增具有多输入组合感测性质的这些细胞，以便改善它们对表达表面抗原的组合的癌细胞的特异性，以及降低靶上、肿瘤外效应(Cho等，2018；Kloss等，2013；Roybal等，2016；Zah等，2016)。
基因治疗领域的合成生物学应用也显示了动物疾病模型的初始成功。将处理卵巢癌细胞和在这些细胞中表达免疫调节剂的一组慢病毒载体与工程化T细胞组合的混合方法，在小鼠卵巢转移模型中表现出对腹膜腔的功效。细胞靶向被实施为两个启动子之间的miRNA海绵使能的(miRNA sponge-enabled)AND门，两个启动子的组合显示为肿瘤特异性(Nissim等，2017)。在另一项最近的工作中，溶瘤腺病毒被工程化为基于其生命周期的多输入逻辑控制进行复制，并在瘤内注入到皮下肿瘤时显示出功效(Huang等，2019)。
用于基因和细胞治疗的合成基因回路的主要的附加值来自于对治疗响应进行“编程”的先进方法，即，以预定方式，潜在地以动态方式并组合各种反馈调节基序(Angelici等，2016；Xie等，2011)调节治疗行动的特异性、时机和剂量。然而，用调节其表达的基因回路提供已知的治疗性转基因可能不一定优于通常使用包装到病毒载体(其经由其衣壳另外具有一定程度的器官或细胞类型特异性)中的组成型-驱动或组织特异性启动子-驱动的治疗基因的更被认可的方法(Al-Zaidy等，2019；Landegger等，2017；Scholl等，2016)。可替代地，病毒载体可以直接注入到感兴趣的组织或器官中(Juttner等，2019；Nelson等，2016)，从而减少需要特别解决的细胞类型的多样性。实际上，基于该方法被工程化的大多数批准的治疗，包括临床上批准的CAR-T细胞(June等，2018)和许多基因治疗(Keeler和Flotte，2019)，显示出令人满意的功效和安全概况。因此，负担是在合成生物学领域上证明该优势。
癌症是具有巨大潜力从由合成生物学推动的治疗中受益的疾病。在患者组之间，并且甚至在同一患者中的各个肿瘤之间，甚至受限定义的癌症是异源性疾病(Dagogo-Jack和Shaw，2018)。患者中的肿瘤通常在主和转移位点(loci)之间传播，使瘤内注入仅可针对病灶的子集。最后，抗肿瘤治疗是非常有毒的，这意味着它们在非肿瘤细胞中的激活将导致经常显著的不良反应。总之，与系统地递送药剂以解决肿瘤的传播群的需求相结合的，对精确地解决复杂的、异质的细胞群的要求表明使用合成生物学方法可以是有益的。
本文公开了连续多核酸分子，其编码与常用的基因治疗病毒和非病毒载体相容的分类器基因回路。本文还公开了在细胞群中对输出(即，感兴趣的基因)的表达实施复杂的多输入控制的方法。这些方法包括用于诊断和治疗疾病例如癌症(例如，肝细胞癌(HCC))的基因治疗。
I.连续多核酸分子的组合物
在一些方面，本公开涉及连续多核酸分子，其包含基因回路。如本文所用，术语“连续多核酸分子”是指单个连续核酸分子(即，单链多核酸分子)或两个互补的连续核酸分子(即，包含两个互补链的双链多核酸分子)。在一些实施方式中，连续多核酸是RNA(例如，单链的或双链的)。在一些实施方式中，连续多核酸是DNA(例如，单链的或双链的)。在一些实施方式中，连续多核酸是DNA:RNA杂合体。
本文所述的连续多核酸包含一个或多个表达盒编码的基因回路。如本文所用，术语“表达盒”和“盒”可互换使用并且是指多核酸，其包含：(i)编码RNA的核酸序列(例如，其包含输出和/或转活化剂的核酸序列)；和(ii)调节RNA(例如，转活化剂响应元件、转录因子响应元件、最小启动子和/或启动子元件)的表达水平的核酸序列。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包含由单个盒组成的基因回路。在其他实施方式中，连续多核酸分子包括包含两个或多个盒的基因回路。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包含两个或多个盒并且至少两个盒处于发散取向。如本文所用，术语“发散取向”是指这样的配置，其中：(i)第一盒和第二盒的转录在连续多核酸分子的不同链上进行，并且(ii)第一盒的转录被引导远离第二盒并且第二盒的转录被引导远离第一盒。图1A(上部示意图)提供了各种发散配置的实例。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包含两个或多个盒并且至少两个盒处于会聚取向。如本文所用，术语“会聚取向”是指这样的配置，其中：(i)第一盒和第二盒的转录在连续多核酸分子的不同链上进行并且(ii)第一盒的转录被引导朝向第二盒并且第二盒的转录被引导朝向第一盒。在一些实施方式中，两个会聚的盒共享多腺苷酸化序列。图1A(下部示意图)提供了各种会聚配置的实例。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包含两个或多个盒并且至少两个盒处于头到尾取向。如本文所用，术语“头到尾”是指这样的配置，其中：(i)第一盒和第二盒的转录或翻译在连续多核酸分子的同一链上进行，并且(ii)第一盒的转录或翻译被引导朝向第二盒并且第二盒的转录或翻译被引导远离第一盒(5’...→...→...3’)。
在一些实施方式中，两个盒由一个或多个绝缘体隔开。绝缘体是核酸序列，其当由绝缘体结合蛋白结合时，屏蔽调节组分或响应组分免受其他附近调节元件的影响。例如，连续多核酸分子的盒的侧翼可屏蔽每个盒免受其他盒的调节元件的影响。绝缘体的实例是本领域技术人员已知的。
本文所述的基因回路利用一个或多个机制以调节输出分子(即，感兴趣的基因)的表达水平。因此，本文所述的每个连续多核酸包含编码RNA的盒，所述RNA包含输出的核酸序列。以下提供了示例性的输出分子。包含输出的核酸序列的RNA可操作地连接至转活化剂响应元件(以及，任选地，一个或多个另外的调节RNA，例如转录因子响应元件、最小启动子和/或启动子元件的表达的核酸序列)。
为了调节输出分子(即，感兴趣的基因)的表达水平，本文所述的每个连续多核酸进一步包含：(i)编码RNA(例如，mRNA)的盒，所述RNA包含转活化剂的核酸序列；和(ii)编码RNA的盒，所述RNA包含miRNA靶位点。以下提供了示例性的转活化剂和miRNA靶位点。
编码RNA(例如，mRNA)(其包含转活化剂的核酸序列)的盒可操作地连接至调节RNA(例如，转活化剂响应元件、转录因子响应元件、最小启动子和/或启动子和/或增强子元件)的表达的核酸序列。在一些实施方式中，编码包含转活化剂的核酸序列的RNA的盒与编码包含输出的核酸序列的RNA的盒是相同的(即，单RNA包含转活化剂和输出二者的核酸序列)。
编码包含miRNA靶位点的RNA的盒可以与编码包含输出的核酸序列的RNA的盒是相同的(即，包含输出的核酸序列的RNA进一步包含miRNA靶位点)。可选地或另外地，编码包含miRNA靶位点的RNA的盒可以与编码包含转活化剂的核酸序列的RNA的盒是相同的(即，转活化剂的核酸序列进一步包含miRNA靶位点)。
在一些实施方式中，由盒编码的RNA的核酸序列进一步包含多腺苷酸化序列。在一些实施方式中，多腺苷酸化序列适合于哺乳动物细胞中的转录终止和多腺苷酸化。
(i)MiRNA靶位点
本文所述的每个连续多核酸包含编码RNA的一个或多个盒(例如，RNA包含编码输出的核酸序列和/或RNA包含转活化剂的核酸序列)，所述RNA包含miRNA靶位点。miRNA是一类小的非编码RNA，其长度通常为21-25个核苷酸，其下调它们以多种方式结合的RNA的水平，包括翻译抑制、mRNA切割和脱腺苷酸化。如本文所用，术语“miRNA靶位点”是指与miRNA互补和由miRNA调节的序列。miRNA靶位点可具有与结合和调节miRNA靶位点的miRNA至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的互补性。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个miRNA靶位点。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个miRNA靶位点。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、6-7、6-8、6-9、6-10、7-8、7-9、7-10、8-9、8-10或9-10个miRNA靶位点。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含多个miRNA靶位点并且每个miRNA靶位点具有相同的序列或包含由同一miRNA调节的不同的核酸序列。在其他实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含由不同的miRNA调节的两个或多个miRNA靶位点(即，不同的miRNA靶位点)；其包含例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个不同的miRNA靶位点。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的miRNA靶位点。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、6-7、6-8、6-9、6-10、7-8、7-9、7-10、8-9、8-10或9-10个不同的miRNA靶位点。
由本文所述的盒编码的RNA的miRNA靶位点可位于RNA的序列内的任何位置。例如，在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含3’UTR，并且3’UTR包含miRNA靶位点。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含内含子，并且内含子包含miRNA靶位点。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含5’UTR，并且5’UTR包含miRNA靶位点。
示例性的miRNA和miRNA靶位点是表1中列出的。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含用于表1中列出的miRNA的miRNA靶位点。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含与表1中列出的miRNA相对应的多个miRNA靶位点(例如，包括let-7c靶位点和miR-122靶位点的组合)。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含miRNA靶位点，其具有与表1中列出的miRNA靶位点的至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含多个miRNA靶位点，其具有与表1中列出的miRNA靶位点的至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7c靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合(例如，let7c靶位点和miR-122靶位点的组合)。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含let-7c靶位点(即，与hsa-let-7c互补和由hsa-let-7c调节的核酸序列)。在一些实施方式中，let-7c靶位点由核酸序列AACCATACAACCTACTACCTCA(SEQ ID NO：42)组成。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含miR-22靶位点(即，与miR-22互补和由miR-22调节的核酸序列)。在一些实施方式中，miR-22靶位点由核酸序列ACAGTTCTTCAACTGGCAGCTT(SEQ ID NO：43)组成。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含miR-26b靶位点(即，与miR-26b互补和由miR-26b调节的核酸序列)。在一些实施方式中，miR-26b靶位点由核酸序列ACCTATCCTGAATTACTTGAA(SEQ ID NO：44)组成。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含miR-126-5p靶位点(即，与miR-126-5p互补和由miR-126-5p调节的核酸序列)。在一些实施方式中，miR-126-5p靶位点由核酸序列CGTGTTCACAGCGGACCTTGAT(SEQ ID NO：45)组成。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含miR-424靶位点(即，与miR-424互补和由miR-424调节的核酸序列)。在一些实施方式中，miR-424靶位点由核酸序列GTCCAAAACATGAATTGCTGCT(SEQ ID NO：48)组成。
在一些实施方式中，由本文所述的盒编码的RNA包含miR-122靶位点(即，与miR-122互补和由miR-122调节的核酸序列)。在一些实施方式中，miR-122靶位点由核酸序列CAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO：46)组成。
表1.示例性的miRNA和示例性的miRNA靶位点。
Figure BDA0003983634320000241
Figure BDA0003983634320000251
Figure BDA0003983634320000261
在一些实施方式中，本文所述的连续多核酸由单个盒组成，其中单个盒编码包含miRNA靶位点的RNA(除了包含输出的核酸序列和转活化剂的核酸序列)。
在其他实施方式中，连续多核酸包含两个或多个盒，其至少一个编码包含miRNA靶位点的RNA。
在一些实施方式中，连续多核酸分子的多个盒包含至少一个miRNA靶位点。在一些实施方式中，连续多核酸的每个miRNA靶位点是独特的(即，连续多核酸包括仅一个拷贝的miRNA靶)。在一些实施方式中，连续多核酸分子包含至少两个盒，其各自包含是相同的核酸序列的至少一个miRNA靶位点。在一些实施方式中，连续多核酸分子包含至少两个盒，其各自包含至少一个miRNA靶位点，其中每个盒的至少一个miRNA靶位点包含由同一miRNA调节的不同的核酸序列。例如，第一盒可包含miRNA靶位点X和第二盒可包含miRNA靶位点Y并且miRNA Z调节靶位点X和靶位点Y。
在一些实施方式中，本文所述的调节连续多核酸的miRNA靶位点的miRNA(即，至少一个miRNA)在(例如，多细胞有机体的，诸如哺乳动物的)至少一个细胞类型中是高表达的和/或有活性的，其中输出表达必须是低的。如本文所述的，在所述组织细胞类型中，当相对于参考连续多核酸(即，缺少由miRNA调节的miRNA靶位点，但除此之外包含相同的核酸序列)的输出表达的水平，输出表达被降低至少50％时，miRNA是高表达的和/或有活性的。在一些实施方式中，相对于参考连续多核酸，输出被降低至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％。
在一些实施方式中，本文所述的调节连续多核酸的miRNA靶位点的miRNA(即，至少一个miRNA)在(例如，多细胞有机体的，诸如哺乳动物的)至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少500、至少1000种细胞类型中是高表达的和/或有活性的，其中输出表达必须是低的。
在一些实施方式中，本文所述的调节连续多核酸的miRNA靶的miRNA(即，至少一个miRNA)在(例如，多细胞有机体的，例如哺乳动物的)至少一种靶细胞类型中具有低表达和/或是无活性的，其中输出表达必须是高的。如本文所述，在所述靶细胞类型中，当相对于参考连续多核酸(即，缺少由miRNA调节的miRNA靶位点，但除此之外包含相同的核酸序列)的输出表达的水平，输出表达被降低小于40％时，miRNA具有低表达和/或是无活性的。在一些实施方式中，相对于参考连续多核酸，输出被降低小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施方式中，在来自包含miRNA靶的连续多核酸和参考连续多核酸分子的输出表达的水平之间没有统计学差异。
在一些实施方式中，本文所述的调节连续多核酸的miRNA靶位点的miRNA(即，至少一个miRNA)在(例如，多细胞有机体的，例如哺乳动物的)至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少500、至少1000种靶细胞类型中是以低水平表达的和/或无活性的，其中输出表达必须是高的。
(ii)示例性的转活化剂
本文所述的每个连续多核酸包含编码RNA(例如，mRNA)的盒，所述RNA包含转活化剂的核酸序列。在一些实施方式中，连续多核酸包含单个转活化剂的核酸序列。在其他实施方式中，连续多核酸包含多个转活化剂(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个转活化剂)的核酸序列。
如本文所用，术语“转活化剂”或“转活化剂蛋白”是指在连续多核酸分子上编码的蛋白，其转活化输出(即，感兴趣的基因)的表达并结合至可操作地连接至编码输出(即，感兴趣的基因)的核酸的转活化剂响应元件。在一些实施方式中，转活化剂独立地(即，在不存在任何另外的因子的情况下)结合和转活化转活化剂响应元件。在其他实施方式中，转活化剂仅在结合至转录因子响应元件的转录因子的存在下结合和转活化转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，转活化剂蛋白包含DNA-结合结构域。在一些实施方式中，DNA结合结构域被工程化(即，非天然存在的)以结合不同于天然存在的序列的DNA序列。DNA结合结构域的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，使用锌指技术或TALEN技术衍生的或源自来自细菌的两组分信号传导途径的突变响应调节剂的DNA结合结构域。
在一些实施方式中，DNA结合结构域源自哺乳动物蛋白。在其他实施方式中，DNA结合结构域源自非哺乳动物蛋白。例如，在一些实施方式中，DNA结合结构域源自起源于细菌、酵母或植物的蛋白。在一些实施方式中，DNA结合结构域需要另外的组分(例如，蛋白或RNA)以靶向转活化剂响应元件。例如，在一些实施方式中，DNA结合结构域是CRISPR/Cas蛋白(例如，Cas1、Cas2、Cas3、Cas5、Cas4、Cas6、Cas7、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、Csm2、Cmr5、Csx10、Csx11、Csf1、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3)的DNA结合结构域，其需要引导RNA的另外的组分以靶向转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，转活化剂蛋白源自天然存在的转录因子，其中天然存在的转录因子的DNA结合结构域已被突变，导致相对于野生型转录因子的改变的DNA结合特异性。在一些实施方式中，转活化剂是天然存在的转录因子。
在一些实施方式中，转活化剂蛋白进一步包含转活化结构域(即，包含DNA结合结构域和转活化结构域的融合蛋白)。如本文所用，术语“转活化结构域”是指发挥功能以招募转录机器至最小启动子的蛋白结构域。在一些实施方式中，转活化结构域不独立地触发基因活化。在一些实施方式中，转活化结构域是天然存在的。在其他实施方式中，转活化结构域是工程化的。转活化结构域的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于RelA转活化结构域、VP16、VP48和VP64。
示例性的转活化剂在表2中列出。在一些实施方式中，至少一个盒的转活化剂是表2中列出的转活化剂或是其氨基酸序列与表2中列出的一个或多个转活化剂具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的转活化剂。在一些实施方式中，本文所述的连续多核酸分子编码表2中列出的转活化剂的组合或其氨基酸序列与表2中列出的一个或多个转活化剂具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的转活化剂的组合。
在一些实施方式中，至少一个盒的转活化剂是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。参见例如，Angelici B.等，Cell Rep.2016年8月30日；16(9)：2525-2537。
表2.示例性的转活化剂。DNA序列仅仅是能够编码所描绘的蛋白序列的实例；由于简并密码子，非常大组的DNA序列可编码相同的蛋白序列。诸如RelA和VP16的转活化剂结构域仅是可能的转活化剂结构域(TAD)的实例。″VP16 TAD″代表源自单纯疱疹病毒的VP16基因的转活化剂结构域；当融合至DNA结合结构域时，多个结构域及它们的组合和它们的突变体可用作转活化剂结构域。当源自全长蛋白时，转活化剂的DNA结合结构域(DBD)仅仅是这样的结构域的实例；它们可进一步减少或提高以包括来自它们的全长蛋白祖先的更多氨基酸。基于它们在大肠杆菌中的蛋白质序列，示出了源自原核两组分信号传导系统的响应调节剂的DBD，然而，来自其它原核菌株和物种的这些基因的同源序列也可被使用。此外，不具有大肠杆菌中的同源序列的来自两组分信号传导途径的响应调节剂的DNA结合结构域也可用于相同目的。M(下划线)代表在各种DBD的前面引入的起始密码子，以使它们能够翻译。″：：″代表DBD和TAD之间的融合点。
Figure BDA0003983634320000301
Figure BDA0003983634320000311
Figure BDA0003983634320000321
Figure BDA0003983634320000331
Figure BDA0003983634320000341
Figure BDA0003983634320000351
Figure BDA0003983634320000361
Figure BDA0003983634320000371
Figure BDA0003983634320000381
Figure BDA0003983634320000391
Figure BDA0003983634320000401
(iii)示例性输出分子
本文所述的每个连续多核酸包含编码RNA(例如，mRNA)的盒，所述RNA包含输出(即，感兴趣的基因)的核酸序列。在一些实施方式中，连续多核酸包含单个输出的核酸序列。在其他实施方式中，连续多核酸包含多个输出(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个输出)的核酸序列。
在一些实施方式中，输出是RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子是编码蛋白的mRNA。在一些实施方式中，输出是非编码RNA分子。非编码RNA分子的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、miRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA和长ncRNA。
在一些实施方式中，输出是治疗性分子(即，与疾病的治疗有关)，例如治疗性蛋白或RNA分子。治疗性分子的实例包括但不限于，抗体(例如，单克隆的或多克隆的；嵌合的；人源化的；包括抗体片段和抗体衍生物(双特异性、三特异性、scFv和Fab))、酶、激素、炎性分子、抗炎分子、免疫调节分子、抗癌分子、短发夹RNA、短干扰RNA和miRNA。前述种类的治疗性分子的具体实例在本领域中是已知的，其中的任何一种可根据本公开使用。
在一些实施方式中，输出编码抗原蛋白、蛋白结构域、或源自病原体并且当在体内产生时已知引发免疫响应的肽。
在一些实施方式中，输出是可检测的蛋白，例如荧光蛋白。
在一些实施方式中，输出是细胞毒素。如本文所用，术语“细胞毒素”是指对细胞有毒的物质。例如，在一些实施方式中，输出是细胞毒蛋白。细胞毒蛋白的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，粒溶素、穿孔素/粒酶B和Fas/Fas配体。
在一些实施方式中，输出是催化前药的活化的酶。催化前药活化的酶的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、对氧磷酶(paraxonases)、基质金属蛋白酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、伐昔洛韦酶(valacyclovirases)、前列腺特异性抗原、嘌呤核苷磷酸酶、羧肽酶、酰胺酶、β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、和胞嘧啶脱氨酶。参见例如，Yang Y.等，Enzyme-mediated hydrolyticactivation of prodrugs.Acta.Pharmaceutica.Sinica B.2011年10月；1(3)：143-159。类似地，各种前药是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，阿昔洛韦、别嘌呤醇(allopurinaol)、叠氮胸苷、班布特罗、巴氨西林(becampicillin)、卡培他滨、卡托普利、卡马西平、卡立普多、环磷酰胺、乙烯雌酚二磷酸酯、地匹福林、依那普利、泛昔洛韦、氟达拉滨三磷酸、氟尿嘧啶、膦沙那韦(fosmaprenavir)、磷苯妥英(fosphentoin)、呋喃硫胺、加巴喷丁encarbil、更昔洛韦、吉西他滨、酰肼MAO抑制剂、来氟米特、左旋多巴、甲胺、巯基嘌呤、丝裂霉素、吗多明、萘丁美酮、奥沙拉秦、奥美拉唑、帕利哌酮、非那西汀、匹氨西林、扑米酮、氯胍、赛洛西宾、雷米普利、S-甲基多巴、辛伐他汀、柳氮磺吡啶、苏灵大、替加氟、特非那定、伐昔洛韦、缬更昔洛韦和齐多夫定。
在一些实施方式中，输出是HSV-TK、来自人α疱疹病毒1(HHV-1)的胸苷激酶、UniProtKB-Q9QNF7(KITH_HHV1)。
在一些实施方式中，输出是免疫调节蛋白和/或RNA。如本文所用，术语“免疫调节蛋白”(或免疫调节RNA)是指通过诱导免疫系统组分的活化和/或提高活性来调节(刺激(即，免疫刺激蛋白或RNA)或抑制(即，免疫抑制蛋白或RNA))免疫系统的蛋白(或RNA)。各种免疫调节蛋白是本领域技术人员已知的。参见例如，Shahbazi S.和BolhassaniA.Immunostimulants：Types and Funtions.J.Med.Microbiol.Infec.Dis.2016；4(3-4)：45-51。在一些实施方式中，免疫调节蛋白是细胞因子、趋化因子(例如，IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、CCR3、CXCR3、CXCR4和CCR10)或集落刺激因子。
在一些实施方式中，输出是DNA修饰因子。如本文所用，术语“DNA修饰因子”是指改变DNA的结构和/或改变DNA的序列(例如，通过诱导重组或引入突变)的因子。在一些实施方式中，DNA修饰因子是编码用来校正基因缺陷的蛋白、DNA修饰酶和/或DNA修饰系统的组分的基因。在一些实施方式中，DNA修饰酶是位点特异性重组酶、归巢核酸内切酶或CRISPR/Cas DNA修饰系统的蛋白组分。
在一些实施方式中，输出是细胞表面受体。在一些实施方式中，输出是激酶。
在一些实施方式中，输出是基因表达调节因子。如本文所用，术语“基因表达调节因子”是指当存在时，提高或降低至少一个基因的转录的任何因子。在一些实施方式中，基因表达调节因子是蛋白。在一些实施方式中，基因表达调节因子是RNA。在一些实施方式中，基因表达调节因子是能够调节基因表达的多组分系统的组分。
在一些实施方式中，输出是表观基因修饰剂。如本文所用，术语“表观基因修饰剂”是指提高、降低或改变表观基因修饰的因子(例如，蛋白或RNA)。表观基因修饰的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，DNA甲基化和组蛋白修饰。
在一些实施方式中，输出是载体复制所需的因子。载体复制所需的因子的实例是本领域技术人员已知的。
(iv)调节组分
编码RNA(例如，包含输出和/或转活化剂的核酸序列)的盒可进一步包含调节组分。如本文所述，调节组分是控制RNA的表达(即，刺激提高的或降低的RNA的表达)的核酸序列。例如，在一些实施方式中，本文所述的盒可编码可操作地连接至转活化剂响应元件、转录因子响应元件、最小启动子和/或启动子元件的RNA。调节组分“可操作地连接”至编码RNA的核酸，当它关于核酸序列处于正确的功能位置和取向时，使得它调节(或驱动)序列的转录起始和/或表达。
在一些实施方式中，调节组分包含转活化剂响应元件。“转活化剂响应元件”可包含由转活化剂蛋白结合和识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，转活化剂响应元件包含由转活化剂蛋白结合和识别的最小DNA序列的多于一个拷贝(即，重复)。在一些实施方式中，转活化剂响应元件包含由转活化剂蛋白结合和识别的最小DNA序列的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个重复。在一些实施方式中，重复是串联重复。在一些实施方式中，转活化剂响应元件包含最小DNA序列的组合。在一些实施方式中，最小DNA序列散置有间隔序列。在一些实施方式中，间隔序列长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20个核苷酸。
在一些实施方式中，转活化剂响应元件包含与最小DNA序列的偏差或侧翼为另外的DNA序列，同时仍能够结合转活化剂蛋白。在一些实施方式中，不同的转活化剂响应元件可彼此相邻放置，同时所有能够结合至同一转活化剂蛋白。
示例性的转活化剂响应元件在表3中列出。在一些实施方式中，转活化剂响应元件由表3中列出的核酸序列或与表3中列出的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列组成。
表3.示例性的转活化剂响应元件。″：：″代表在转活化剂结构域(TAD)和DNA结合结构域(DBD)之间的融合点。TAD和DBD的序列的简化符号对应于表2。DNA序列使用以下命名法：W＝A或T；S＝C或G；K＝A或C；M＝G或T；Y＝A或G；R＝C或T；V＝C、G或T；H＝A、G或T；D＝A、C或T；B＝A、C或G；N＝A、C、G或T。大写字母代表强保守；小写符号代表较弱的保守。
Figure BDA0003983634320000441
Figure BDA0003983634320000451
Figure BDA0003983634320000461
Figure BDA0003983634320000471
在一些实施方式中，调节组分包含转录因子响应元件。术语“转录因子响应元件”是指由转录因子结合和识别的DNA序列。如本文所用，术语“转录因子”是指不在调制基因转录的连续多核酸上编码的蛋白。在一些实施方式中，转录因子是转录活化剂(即，提高转录)。在其他实施方式中，转录因子是转录抑制剂(即，抑制转录)。在一些实施方式中，转录因子是细胞的内源性转录因子。
在一些实施方式中，转录因子响应元件被工程化以直接结合以下转录因子的一个或多个，或被以下转录因子的一个或多个间接地影响：ABL1、CEBPA、ERCC3、HIST1H2BE、MDM4、PAX7、SMARCA4、TFPT、AFF1、CHD1、ERCC6、HIST1H2BG、MED12、PAX8、SMARCB1、THRAP3、AFF3、CHD2、ERF、HLF、MEF2B、PBX1、SMARCD1、TLX1、AFF4、CHD4、ERG、HMGA1、MEF2C、PEG3、SMARCE1、TLX3、APC、CHD5、ESPL1、HMGA2、MEN1、PER1、SMURF2、TNFAIP3、AR、CHD7、ESR1、HOXA11、MITF、PHF3、SOX2、SOX4、TP53、ARID1A、CIC、ETS1、HOXA13、MKL1、PHF6、SOX5、TRIM24、ARID1B、CIITA、ETV1、HOXA7、MLLT1、PHOX2B、SOX9、TRIM33、ARID3B、CNOT3、ETV4、HOXA9、MLLT10、PLAG1、SRCAP、TRIP11、ARID5B、CREB1、ETV5、HOXC11、MLLT3、PML、SS18L1、TRPS1、ARNT、CREB3L1、ETV6、HOXC13、MLLT6、PMS1、SSB、TRRAP、ARNT2、CREBBP、EWSR1、HOXD11、MYB、PNN、SSX1、TSC22D1、ASB15、CRTC1、EYA4、HOXD13、MYBL1、MYBL2、POU2AF1、SSX2、TSHZ3、ASXL1、CSDE1、EZH2、ID3、MYC、POU2F2、SSX4、VHL、ATF1、CTCF、FEV、IRF2、MYCN、POU5F1、STAT3、WHSC1、ATF7IP、CTNNB1、FLI1、IRF4、MYOD1、PPARG、STAT4、WHSC1L1、ATM、DACH1、FOXA1、IRF6、NCOA1、PRDM1、STAT5B、WT1、ATRX、DACH2、FOXE1、IRF8、NCOA2、PRDM16、STAT6、WWP1、BAZ2B、DAXX、FOXL2、IRX6、NCOA4、PRDM9、SUFU、WWTR1、BCL11A、DDB2、FOXP1、JUN、NCOR1、PRRX1、SUZ12、XBP1、BCL11B、DDIT3、FOXQ1、KHDRBS2、NCOR2、PSIP1、TAF1、XPC、BCL3、DDX5、FUBP1、KHSRP、NEUROG2、RARA、TAF15、ZBTB16、BCL6、DEK、FUS、KLF2、NFE2L2、RB1、TAL1、ZBTB20、BCLAF1、DIP2C、FXR1、KLF4、NFE2L3、RBM15、TAL2、ZFP36L1、BCOR、DNMT1、GATA1、KLF5、NFIB、RBMX、TBX18、ZFX、BRCA1、DNMT3A、GATA2、KLF6、NFKB2、REL、TBX22、ZHX2、BRCA2、DOT1L、GATA3、LDB1、NFKBIA、RUNX1、TBX3、ZIC3、BRD7、EED、GLI3、LMO1、NONO、RUNX1T1、TCEA1、ZIM2、BRD8、EGR2、GTF2I、LMO2、NOTCH2、RXRA、TCEB1、ZNF208、BRIP1、ELAVL2、HDAC9、LMX1A、NOTCH3、SALL3、TCERG1、ZNF226、BRPF3、ELF3、HEY1、LYL1、NPM1、SATB2、TCF12、ZNF331、BTG1、ELF4、HIST1H1B、LZTR1、NR3C2、SETBP1、TCF3、ZNF384、BTG2、ELK4、HIST1H1C、MAF、NR4A3、SFPQ、TCF7L2、ZNF469、CBFA2T3、ELL、HIST1H1D、MAFA、NSD1、SIN3A、TFAP2D、ZNF595、CBFB、EP300、HIST1H1E、MAFB、OLIG2、SMAD2、TFDP1、ZNF638、CDX2、EPC1、HIST1H2BC、MAML1、PAX3、SMAD4、TFE3、CDX4、ERCC2、HIST1H2BD、MAX、PAX5、SMARCA1和TFEB。
“转录因子响应元件”可包含由转录因子结合和识别的最小DNA序列。在一些实施方式中，转录因子响应元件包含由转录因子结合和识别的最小DNA序列的多于一个拷贝(即，重复)。在一些实施方式中，转录因子响应元件包含由转录因子结合和识别的最小DNA序列的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个重复。在一些实施方式中，重复是串联重复。在一些实施方式中，转录因子响应元件包含最小DNA序列的组合。在一些实施方式中，最小DNA序列散置有间隔序列。在一些实施方式中，间隔序列长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20个核苷酸。在一些实施方式中，转活化剂响应元件包含与最小DNA序列的偏差或侧翼有另外的DNA序列，同时仍能够结合转活化剂蛋白。在一些实施方式中，不同的转活化剂响应元件可彼此相邻放置，同时所有能够结合至同一转活化剂蛋白。
在一些实施方式中，转录因子响应元件是独特的(即，连续多核酸仅包括一个拷贝的转录因子响应元件)。在其他实施方式中，转录因子响应元件不是独特的。在一些实施方式中，结合至转录因子响应元件的转录因子活化它可操作地连接的RNA的表达。在其他实施方式中，结合至转录因子响应元件的转录因子抑制它可操作地连接的RNA的表达。
在一些实施方式中，调节组分包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个不同的转录因子响应元件，每个由不同的转录因子结合。在一些实施方式中，调节组分包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的转录因子响应元件，每个由不同的转录因子结合。
示例性的转录因子响应元件在表4中列出。在一些实施方式中，转录因子响应元件由表4中列出的核酸序列或与表4中列出的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列组成。
表4.示例性的转录因子响应元件。
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Figure BDA0003983634320000511
Figure BDA0003983634320000521
在一些实施方式中，调节组分包含启动子元件(或启动子片段)。示例性的启动子元件在表5中列出。在一些实施方式中，启动子元件由表5中列出的核酸序列或与表5中列出的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列组成。
表5.示例性的启动子元件。
Figure BDA0003983634320000522
Figure BDA0003983634320000531
Figure BDA0003983634320000541
Figure BDA0003983634320000551
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Figure BDA0003983634320000571
Figure BDA0003983634320000581
在一些实施方式中，启动子元件包含转录因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。在一些实施方式中，哺乳动物启动子或启动子片段是独特的(即，连续多核酸仅包括一个拷贝的哺乳动物启动子或启动子片段)。在其他实施方式中，哺乳动物启动子或启动子片段不是独特的。
在一些实施方式中，调节组分包含最小启动子。如本文所用，术语“最小启动子”是指必需但不足以启动输出的表达的核酸序列。在一些实施方式中，最小的启动子是天然存在的。在其他实施方式中，最小启动子是工程化的，例如通过改变和/或缩短天然存在的序列、组合天然存在的序列、或将天然存在的序列与非天然存在的序列组合；在每种情况下，工程化的最小启动子是非天然存在的序列。在一些实施方式中，最小启动子从病毒或非病毒来源工程化的。最小启动子的实例是本领域技术人员已知的。
在一些实施方式中，调节组分包含转活化剂响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。本领域技术人员将理解这些元件可以以各种配置被定向。例如，转活化剂响应元件可以是5’或3’至启动子元件和/或转录因子响应元件；转录因子响应元件可以是5’或3’至启动子元件和/或转活化剂响应元件；启动子元件可以是5’或3’至转录因子响应元件和/或转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，盒的调节组分从5’至3’包含：转活化剂响应元件、转录因子响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，调节组分从5’至3’包含：转录因子响应元件、转活化剂响应元件和最小启动子。
在一些实施方式中，盒的调节组分包含转活化剂响应元件和启动子元件。在一些实施方式中，盒的调节组分从5’至3’包含：转活化剂响应元件和启动子元件。在一些实施方式中，盒的调节组分包含转活化剂响应元件、启动子元件和最小启动子。在一些实施方式中，盒的调节组分从5’至3’包含：转活化剂响应元件、启动子元件和最小启动子。在一些实施方式中，盒的调节组分从5’至3’包含：启动子元件和转活化剂响应元件。在一些实施方式中，盒的调节组分从5’至3’包含：启动子元件、转活化剂响应元件和最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是哺乳动物启动子。在一些实施方式中，启动子元件是启动子片段。
(v)示例性的连续多核酸
在一些实施方式中，连续多核酸分子包含具有单个盒的基因回路。例如，在一些实施方式中，连续多核酸分子包含编码RNA的盒，所述RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中RNA包含：(i)输出的核酸序列；(ii)转活化剂的核酸序列；和(iii)miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)；其中转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，mRNA进一步包含多顺反子表达元件的核酸序列。如本文所用，术语“多顺反子响应元件”是指促进从单个mRNA生成两个或多个蛋白的核酸序列。多顺反子响应元件可包含编码内部识别序列(IRES)或2A肽的多核酸。参见例如，Liu等，Systematiccomparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronicvector.Sci.Rep.2017年5月19日；7(1)：2193。在一些实施方式中，多顺反子表达元件隔开输出和转活化剂的核酸序列。
在一些实施方式中，mRNA包含3’UTR，其中3’UTR包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)。在一些实施方式中，mRNA包含5’UTR，其中5’UTR包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)。
在一些实施方式中，连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出和转活化剂的核酸序列；和(iii)包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)的下游组分。
在一些实施方式中，连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件和转活化剂响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出和转活化剂的核酸序列；和(iii)包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)的下游组分。
在一些实施方式中，连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂和输出的核酸序列；和(iii)包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)的下游组分。
在一些实施方式中，连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件和转活化剂响应元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂和输出的核酸序列；和(iii)包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)的下游组分。
在一些实施方式中，连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含启动子元件和转活化剂响应元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂和输出的核酸序列；和(iii)包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)的下游组分。
在一些实施方式中，连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和启动子元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂和输出的核酸序列；和(iii)包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)的下游组分。
在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中，连续多核酸分子包含具有多个盒的基因回路。例如，在一些实施方式中，一种连续多核酸分子，其包含：a)第一盒，其编码第一RNA，所述第一RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：(i)输出的核酸序列；和(ii)miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)；和b)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含转活化剂的核酸序列；其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合以及转活化第一盒的转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，第一RNA包含3’UTR，并且3’UTR包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)。在一些实施方式中，第一RNA包含5’UTR，并且5’UTR包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)。
在一些实施方式中，第二RNA包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)。在一些实施方式中，第二RNA包含3’UTR，并且3’UTR包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)。在一些实施方式中，第二RNA包含5’UTR，并且5’UTR包含miRNA靶位点(例如，let-7c靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点或其组合)。在一些实施方式中，第一盒的至少一个miRNA靶位点和第二盒的至少一个miRNA靶位点是由同一miRNA调节的同一核酸序列或不同的序列。
在一些实施方式中，第一RNA可操作地连接至转录因子响应元件。在一些实施方式中，第二RNA可操作地连接至转录因子响应元件。在一些实施方式中，第一盒的转录因子响应元件和第二盒的转录因子响应元件由相同的核酸序列组成。在一些实施方式中，第一盒的转录因子响应元件和第二盒的转录因子响应元件由不同的核酸序列组成。在一些实施方式中，第一盒或第二盒二者其一或二者包含至少两种、至少三种...类型的转录因子响应元件。
在一些实施方式中，第一盒从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分；并且第二盒从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
在一些实施方式中，第一盒从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件和转活化剂响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分；并且第二盒从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
在一些实施方式中，第一盒从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分；并且第二盒从5’至3’包含：(i)包含启动子元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
在一些实施方式中，第一盒从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件和转活化剂响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分；并且第二盒从5’至3’包含：(i)包含启动子元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
在一些实施方式中，第一盒的上游调节组分除了转录因子响应元件之外包含启动子元件。在一些实施方式中，启动子元件取代转录因子响应元件。在一些实施方式中，启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
在一些实施方式中，第一盒和第二盒处于会聚取向。在一些实施方式中，第一盒和第二盒处于发散取向。在一些实施方式中，第一盒和第二盒处于头到尾取向。
第一和/或第二盒可侧翼为一个或多个绝缘体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个绝缘体)。例如，在一些实施方式中，第一盒或第二盒侧翼为绝缘体。在一些实施方式中，第一盒和第二盒二者侧翼为绝缘体。在一些实施方式中，第一盒或第二盒在两侧侧翼为绝缘体。
示例性的连续多核酸在表6中列出。在一些实施方式中，连续多核酸包含表6中列出的核酸序列或与表6中列出的核酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
表6.示例性的连续多核酸。
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II.其他组合物
在其他方面，本公开涉及载体的组合物。在一些实施方式中，载体包含上文描述的连续多核酸分子。
在其他方面，本公开涉及工程化病毒基因组的组合物。在一些实施方式中，病毒基因组包含上文描述的连续多核酸分子。在一些实施方式中，病毒基因组是腺相关病毒(AAV)基因组、慢病毒基因组、腺病毒基因组、单纯疱疹病毒(HSV)基因组、牛痘病毒基因组、痘病毒基因组、新城疫疾病病毒(NDV)基因组、柯萨奇病毒基因组、rheo病毒基因组、麻疹病毒基因组、水泡性口炎病毒(VSV)基因组、细小病毒基因组、塞内卡谷病毒基因组、马拉巴病毒基因组或常见的感冒病毒基因组。
在其他方面，本公开涉及病毒体的组合物。如本文所用，术语“病毒体”是指在宿主细胞之外的感染形式的病毒(例如，包含DNA/RNA基因组和衣壳蛋白)。在一些实施方式中，病毒体包含上文描述的工程化病毒基因组。在一些实施方式中，病毒体包含AAV-DJ衣壳蛋白。在一些实施方式中，病毒体包含AAV-B1衣壳蛋白、AAV8衣壳蛋白或AAV6衣壳蛋白。
在其他方面，本公开涉及组合物，其包含上文描述的连续多核酸分子、上文描述的载体、上文描述的工程化病毒基因组或上文描述的病毒体。在一些实施方式中，组合物是治疗性组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂或缓冲剂。示例性的药物赋形剂和缓冲剂是本领域技术人员已知的。
III.刺激细胞特异性事件的方法
在其他方面，本公开涉及在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法。在一些实施方式中，刺激细胞特异性事件的方法包含将细胞群与上文描述的连续多核酸分子、上文描述的载体、上文描述的工程化病毒基因组或上文描述的病毒体接触，其中细胞特异性事件经由细胞群的细胞中表达的输出的水平引发。
在一些实施方式中，细胞群包含至少一个靶细胞和至少一个非靶细胞。靶细胞和非靶细胞类型在至少一个内源性转录因子的水平和/或至少一个内源性启动子或它的片段和/或至少一个内源性miRNA的表达强度上不同。在一些实施方式中，输出的表达水平在靶细胞和非靶细胞之间的差异为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少500、至少1,000或至少10,000倍。
在一些实施方式中，方法包括将细胞群与连续多核酸分子或包含所述连续多核酸分子的组合物接触，其中：a)细胞群包含至少一个靶细胞类型和两个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA(例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20个内源性miRNA)的水平上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平在两个或多个非靶细胞的每一个中相对于靶细胞的每一个至少两倍高(例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍高)；和b)连续多核酸分子包含：(i)第一盒，其编码RNA，所述RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：输出的核酸序列；和与一个或多个内源性miRNA相对应的一个或多个miRNA靶位点；和(ii)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含转活化剂的核酸序列；其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化第一盒的转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，方法包括将细胞群与连续多核酸分子或包含所述连续多核酸分子的组合物接触，其中：a)细胞群包含至少一个靶细胞类型和两个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA(例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20个内源性miRNA)的水平上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平在两个或多个非靶细胞的每一个中相对于靶细胞的每一个至少两倍高(例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍高)；和b)连续多核酸分子包含编码mRNA的盒，所述mRNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中RNA包含：输出的核酸序列；转活化剂的核酸序列；和与一个或多个内源性miRNA相对应的一个或多个miRNA靶位点；并且其中转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化盒的转活化剂响应元件。
在一些实施方式中，靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性转录因子(例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20个内源性转录因子)的水平上不同，其中连续核酸分子进一步包含与内源性转录因子相对应的一个或多个转录因子响应元件。
在一些实施方式中，宿主细胞与上文描述的连续多核酸分子或上文描述的载体的接触经由非病毒递送方法发生。实例包括但不限于，转染(例如，DEAE葡聚糖介导的转染、CaPO4介导的转染、脂质介导的摄取、PEI介导的摄取和激光转染)、转化(例如，氯化钙、电穿孔和热激)、基因转移和粒子轰击。
在一些实施方式中，细胞群是离体接触的(即，细胞群分离自有机体，并且细胞群是在有机体外接触的)。在一些实施方式中，细胞群是体内接触的。
如本文所用，术语“内源性”-在细胞的背景中-是指在细胞中以其天然状态被发现的因子(例如，蛋白或RNA)。在一些实施方式中，内源性转录因子可结合和活化至少一个盒的调节组分的启动子元件(例如，转录因子响应元件)。在一些实施方式中，内源性miRNA可与至少一个盒的调节组分或响应组分的miRNA靶位点互补。
在一些实施方式中，“转活化剂”和相应的“转活化剂响应元件”将被选择使得转活化剂将特异性地结合至″转活化剂响应元件″，但是尽可能少地结合至细胞中天然存在的响应元件。在一些实施方式中，转活化剂蛋白的DNA结合结构域将不能有效地结合细胞中存在的天然调节序列并且因此将不触发过量的不良反应。
在一些实施方式中，靶细胞和非靶细胞是不同的细胞类型。
在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞并且非靶细胞是非癌细胞。在一些实施方式中，靶细胞可以是癌性肝细胞癌细胞或胆管癌细胞并且非靶细胞可以是实质和非实质肝脏细胞，包括肝细胞、吞噬库普弗细胞、星形细胞、窦内皮细胞。
在一些实施方式中，靶细胞是肝细胞并且非靶细胞是非肝细胞(例如，肌细胞)。在其他实施方式中，靶细胞和非靶细胞是同一细胞类型(例如，二者是肝细胞)，但是尽管如此，在至少一个内源性转录因子和/或至少一个内源性miRNA的水平上不同。例如，靶细胞可以是衰老肌肉细胞和非靶细胞可以是非衰老肌肉细胞。
在一些实施方式中，靶细胞是肿瘤细胞并且细胞特异性事件是细胞死亡。在一些实施方式中，靶细胞是衰老细胞并且细胞特异性事件是细胞死亡。在一些实施方式中，细胞死亡通过活化受体配体、特异性抗原、刺激细胞因子或其任意组合的表达由免疫靶向来介导。在一些实施方式中，方法进一步包括将细胞群与由输出代谢成治疗性或有毒化合物的前药或非毒前体化合物接触。
在一些实施方式中，靶细胞相对于同一类型的野生型细胞(例如，健康的和/或非患病的)差异表达因子并且细胞特异性事件是调制因子的表达水平。
在一些实施方式中，输出表达确保靶细胞群的存活，而非靶细胞由于缺乏输出表达和在细胞死亡诱导剂的存在下被消除。在其他实施方式中，输出确保非靶细胞群的存活，而靶细胞由于输出表达和在细胞死亡诱导剂的存在下被消除。
在一些实施方式中，靶细胞包含感兴趣的特定表型使得输出表达限于该特定表型的细胞。
在一些实施方式中，靶细胞是精选的细胞类型，并且通过在精选的细胞类型中天然不存在或无活性的基因的表达，细胞特异性事件是新功能的编码。
在一些实施方式中，细胞群包含多细胞有机体。在一些实施方式中，多细胞有机体是动物。在一些实施方式中，动物是人。
IV.诊断和/或治疗疾病或病况的方法
在一些方面，本公开涉及在表现出疾病或病况的一个或多个标志或症状的受试者中诊断疾病或病况(例如，癌症)的方法。如本文所用，术语“诊断”是指鉴定或确定疾病或病况的性质和/或原因的过程。在一些实施方式中，方法包括向表现出与疾病或病况相关的一个或多个标志或症状的受试者施用上文描述的连续多核酸分子、上文描述的载体、上文描述的工程化病毒基因组或上文描述的病毒体，其中输出的水平指示疾病或病况的存在或不存在。
在一些方面，本公开涉及治疗疾病或病况(例如，癌症)的方法。如本文所用，术语“治疗”是指预防与疾病或病况相关的一个或多个症状的恶化的行为和/或减轻与疾病或病况相关的一个或多个症状的行为。在一些实施方式中，方法包含向具有疾病或病况的受试者施用上文描述的连续多核酸分子、上文描述的载体、上文描述的工程化病毒基因组或上文描述的病毒体。
在一些实施方式中，涉及治疗疾病或病况，施用方法包括静脉内递送上文描述的载体。在一些实施方式中，施用方法包括多于一次行为的静脉内递送上文描述的载体。在一些实施方式中，施用方法包括以一次或多次给药瘤内递送上文描述的载体。在一些实施方式中，施用方法包括以一次或多次给药经动脉递送上文描述的载体。在一些实施方式中，施用方法包括肌内递送、鼻内递送、视网膜递送或口服递送。
在一些实施方式中，治疗疾病的方法进一步包括前药以一次或多次给药施用。在一些实施方式中，前药的递送是静脉内的、经动脉或腹膜内的。在一些实施方式中，前药是更昔洛韦。
在一些实施方式中，治疗疾病的方法进一步包括施用另一治疗例如小分子、生物制剂、单克隆抗体、另一基因治疗产物或基于细胞的治疗性产物。
在一些实施方式中，疾病或病况是癌症。可通过本文所述的方法治疗的示例性的癌症包括但不限于，肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌(mCRC)、任何其他转移至肝的癌症、肺癌、乳腺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
可通过本文所述的方法治疗的示例性的癌症包括但不限于，肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌(mCRC)、肺癌、乳腺癌、视网膜母细胞瘤、胶质母细胞瘤。
在一些实施方式中，癌症是肝细胞癌(HCC))。实际上，用于HCC的治疗性选择是有限的(Llovet和Lencioni，2020)，产生了探索突破的新模态的迫切需要。本文所述的方法显著地推进了当前HCC治疗方法。
实施例
实施例1.翻译为基因治疗载体的多路诊断回路。
设计实验以评估来自多个分离的组分(即，每个质粒一个基因，并且特征在于瞬时转染细胞系)的逻辑门放在一起是否可以被再工程化以适合治疗相关的载体，并作为在动物疾病模型中的治疗性候选物研究。先前显示，通过在这些传感器的活性之间实施AND逻辑的多质粒系统，整合用于转录因子(TF)SOX9/10和HNF1A/B的传感器，当瞬时转染至HuH-7细胞时引发强响应(Angelici等，2016)。SOX9是与重度HCC相关的预后标志物(Richtig等，2017)。有趣的是，SOX9响应元件可能被SOX4(另外的其过表达与恶性HCC表型相关的TF)结合(Liao等，2008；Uhlen等，2017)。HNF1A和HNF1B是已知的肝脏管家因子(Harries等，2009)；尽管它们也在胃肠道的其它器官中表达。
设计实验以测量先前描述的多质粒系统是否能够适应于连续DNA盒并最终包装在病毒载体中。为此，显示在多质粒设置(Angelici等，2016)中实施逻辑“SOX9/10AND HNF1A/B”的回路组分(其包含SOX9/10-驱动的基于PIT的活化剂(PIT：：RelA或PIT：：VP16)(Fussenegger等，2000)以及由PIT和HNF1A/B协同驱动的荧光输出蛋白))，以发散或会聚取向二者其一被克隆在腺相关病毒(AAV)转移载体中的ITR之间(图1A)。将得到的质粒瞬时转染至HEK293细胞中，并且将TF输入SOX10和HNF1A从TRE-驱动的质粒中局部表达，以生成至该门的所有四个逻辑输入组合。有趣的是，尽管趋势在所有四种情况下都被保持，但是当存在两个输入时，不同的变体在它们的绝对开水平上显著不同(图1B)。同一构建体也被转染至HuH-7和HeLa细胞中，其中SOX9/10和HNF1A/B的内源性表达有望在前者中诱导回路，并且不在后者中激活它。在这种情况下，差异不那么明显，但是发散取向生成稍微更高的输出。
AND门策略是活化期望细胞类型中的输出的方式，并且这种活化的增强通过并入有意的“关”开关(相当于NOT门，其在治疗的背景中将包括另外的安全层)来设计。为此，microRNA靶被并入在输出基因的3′-UTR以及在PIT衍生的组分的3′-UTR中。具体输入包括miR-424、miR-126和miR-122的选择，是基于先前执行的概况分析进行的(Dastor等，2018)。miR-424靶被初始地引入，并且四个所得构建体(图1D)被再次测试它们在HEK细胞中对异位TF组合的响应(图1E)和在HuH-7和HeLa细胞中的内源性输入的存在下(图1F)。在性能上观察到标记的和一致的差异。与发散构建体相比，会聚构建体未能在HEK细胞中响应异位输入并在HuH-7细胞中以大大降低的强度进行响应。该事实强调了从在不同质粒上携带的回路以及整合在与基因治疗递送载体相容的连续主链上的回路的转变的复杂性。接下来，两个发散盒经历更广泛的逻辑表征，包括TF和miR-424模拟输入。两种构建体如预期的那样响应，实施逻辑“SOX10 AND HNF1A AND NOT(miR-424)”(图1G)。为了证实高miR-424表达也以内源性TF输入覆盖输出活化，miR-424模拟物被转染至HuH-7细胞中并且被发现关闭输出表达至几乎背景水平(图1H)。接着，用miR-126靶取代miR-424靶。仅在HuH-7细胞中关于新的构建体对外源性miR-126的响应测试新的构建体组，并且结果类似于miR-424且与预期一致(图1I)。为了总结该设计阶段，评估没有miRNA靶、具有miR-424或miR-126靶的发散构建体的容量，以将HCC细胞系HuH-7和HepG2与HeLa细胞区分(图1J)。
下一步是将盒引入至病毒载体中，并在临床前翻译之前评估它们的逻辑性能。已知AAV递送的基因组在人细胞中形成多联体(Duan等，2003)，并且这与编码AAV基因组但不在AAV衣壳的帮助下包装和递送的DNA盒相比将包括复杂性的另外的层。为此，使用ITR侧翼有的基因组，并且制造少量的DJ假型(Grimm等，2008)AAV载体。使用载体转导两个HCC细胞系HepG2和HuH-7，以及两个非HCC细胞系HeLa和HCT-116。结果显示在靶细胞中高表达，并且在非靶细胞中非常低的表达(图1K)。一些另外的效果是明显的，例如，与没有miRNA靶的载体相比，在HuH-7细胞中用具有T424靶的载体获得的输出表达的减少，其比用裸DNA盒观察到的减少强得多。
为了获得两个miRNA靶(T424或T126)的初步信息(其在体内更好)，设计实验以评估它们中的哪一个将执行关键保护功能(即，能够区分HCC细胞和健康肝细胞)。分离原代小鼠肝细胞用于体外培养。将原代肝细胞和HCC细胞以AAV-DJ包装的用于miR-424、miR-126以及miR-122(已知的肝脏miRNA，其显示在体内在肝脏中高效地关闭基因表达(Dastor等，2018；Della Peruta等，2015)，并且已知在HCC肿瘤的子集中被下调(Coulouarn等，2009))的基因报告物(Dastor等，2018)进行转导。该测试的结果(图1L)显示，令人惊讶的是，肝脏中miR-424和miR-126的高表达计数没有转化为肝细胞中的高生物敲低活性。仅miR-122是始终有活性的。miR-122在HepG2细胞系中是无活性的，但其在HuH-7细胞系中表现出部分活性，表明包含该miRNA靶将有益于HCC肿瘤的子集，而不是它们所有。尽管该事实，但是为了其特异性和在先导实验设置中的抗肿瘤潜力，进一步用miR-122研究了回路。还测试了不同miRNA靶设置的影响，以评估它们的数量在miRNA输入的存在下如何影响总体输出抑制。测试了四个不同的盒，并且发现提高靶的数量并将靶放置在输出和PIT 3’-UTR二者中提高了抑制(图1M-1N)。这提供了可以以两种方式使用的另一杵(knob)：以提高非靶细胞中输出的敲低，但也降低表达miRNA输入的部分水平的靶细胞中的敲低。
实施例2.翻译背景中第一HCC靶向回路变体的初始评估。
基于报告物研究，构建了具有miR-122靶的回路变体。PIT：：VP16活化剂变体由于其较低的DNA载荷和提高的对输出基因的可用覆盖区(footprint)而被使用。将称为HCC.V1-mCherry的具有mCherry输出的回路包装至DJ-假型AAV载体中，并重测试其区分HCC细胞系与原代鼠肝细胞的能力。数据突出显示，与原代肝细胞相比，全回路在HepG2和Hep3B细胞系中生成高度特异性表达，而在HuH-7中，回路由于这些细胞系中miR-122的中度活性而生成降低的输出(图2A)。因此，在NSG小鼠中采用HepG2细胞的原位异种移植瘤模型的背景中，在先导实验中评估了该肿瘤靶向程序。为了肿瘤建立和跟踪的目的，HepG2细胞以编码mCitrine荧光蛋白和萤火虫萤光素酶基因的慢病毒载体稳定地修饰，并被分类用于均质mCitrine表达。通过1M HepG2-LC细胞的脾注入和随后的脾解剖建立肿瘤。
在体内实验之前，进行了体外药效试验，比较原代肝细胞、HepG2细胞和HeLa细胞，作为另外的阴性对照细胞系。具有HSV-TK输出基因并称为AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TK的载体需要GCV作为前药以引发具有显著的旁观者效应的细胞毒性(Freeman等，1993)。数据(图2B)显示，实际上，HepG2细胞被回路以及对照组成型载体选择性地消除，而原代肝细胞和HeLa细胞被组成型载体消除但不受具有回路的载体的影响。值得注意的是，与非定制的组成型载体相比，回路消除的HepG2细胞比组成型对照更好，突出了由定制的TF逻辑驱动的高输出表达的重要性。
为了在体内测量抗肿瘤效力，在间隔三天的两次连续注入中，AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TK被递送至HepG2荷瘤小鼠。四个实验组(该先导试验中n＝2)包括AAV-DJ-HCC.V1-HSV-TK与GCV治疗方案(治疗组)、单独的相同的载体而无GCV、补充有GCV方案的假注入、以及假PBS注入且无GCV组合。在处理的动物中的肿瘤进展的实时成像(图2C)，以及以生物发光对肝脏中的总肿瘤负荷的尸体解剖分析(图2D-2E)清楚地证明了，具有全回路程序的基因治疗载体与HSV-TK输出和GCV治疗方案组合具有强抗肿瘤活性，这在任何对照组中不存在。PBS对照组中的动物之一中的低肿瘤负荷由初始差的肿瘤植入引起(图2F)，并且总体上所有三个对照组表现相同，导致最终的肿瘤负荷与初始负荷成比例，意味着肿瘤生长由相同的动力学支配。在先导试验的治疗组中的动物是明显的离群值(outlier)，其提供治疗在降低肿瘤负荷方面是有效的另一证据。
实施例3.具有更高特异性和更宽范围的肿瘤靶向程序的工程化。
通过先导实验的结果鼓励，寻求改进肿瘤靶向程序且并行地执行对体外和体内作用的回路机制的更彻底的评估。假设SOX9/10和HNF1A/B输入的组合是限制肝脏和肝脏肿瘤的表达的良好起点，然而，在体内miR-122活性上的先前数据表明它的活性被限制在肝脏(Dastor等，2018)，并且因此必须依赖于回路的仅TF组分用于所有其他器官，如果使用具有广泛器官特异性的载体衣壳，其可能成为问题。此外，虽然miR-122是从一些HCC亚型中分离健康肝细胞的良好分类标志物，但它不是通用的HCC特征。因此，探索集中在miRNA输入上，其可能实现肝脏与肝脏肿瘤的更宽分类以及保护另外的器官。该探索的起源点为1)先前获得的miRNA概况分析数据集(Dastor等，2018)和2)用于不同器官中的高度表达的microRNA的广泛文献分析。HuH-7细胞和健康肝细胞在早期实验中被概况分析，并且首先尝试鉴定在肝细胞中高度表达但在HuH-7细胞中下调的miRNA(图3A)。基于NGS概况分析数据集中的计数比选择的miRNA集包括miR-122(作为参考)、miR-424、miR-126-5p、miR-22、miR-26b和let-7c。双向miRNA报告物(Dastor等，2018)被构建并包装到AAV-DJ载体中，以确保体外对原代肝细胞的高递送效率(图3B)。在HuH-7、HepG2和原代分离的鼠肝细胞中测量miRNA候选物的生物活性。在测试的miRNA中，let-7c显示出最高的差异活性；而且，它在HuH-7和HepG2细胞二者中被下调(图3C)。有趣的是，比较NGS计数与生物活性的回顾性分析(图3D)仅显示非常表面的相关性，突出候选物输入的功能测试的重要性。
针对潜在的器官保护miRNA的文献搜索和概况分析数据集的调查导致了一组miRNA：miR-424(肾脏和其它器官)、miR-208a和miR-208(心脏)、miR-216A、miR-217和miR-375(胰腺)。将基于体外筛选活动发现的用于肝脏保护的候选物Let-7c添加到该表中。对于这些miRNA中的每一种，双向报告物被工程化并被包装在B1-假型AAV载体(Choudhury等，2016)(由于其广泛的生物分布被选择)中。制备对照载体，其具有推测的中性miRNA靶(“TFF5”)。(然而，当数据显示时，该靶在至少一些器官中响应于miRNA输入)。将载体全身注入到健康小鼠中，并在注入后3周在各种器官中评估报告物表达。在肝脏、胰腺、心脏和肾脏中发现强生物分布，并且将分析集中在这些器官上。Let-7c是来自所述集的在体内显示作为健康的肝脏特异性输入的潜力的唯一miRNA。在体内的胰腺中，miR-217和miR-375二者显示如从文献数据预期的活性；然而，let-7c具有最强的响应。在心脏中，miR-208a和miR-208b显示与先前数据一致的活性，但再次let-7c具有最强的响应。最后，如预期的，miR-424在肾脏中是有活性的，然而，也在该器官中，let-7c给出最强的效果(图3EF)。
总之，体外和体内数据的组合表明，出于该研究的目的，let-7c可用作“通用的”输入，其同时发挥用于多个器官的保护性miRNA输入的作用，在肿瘤研究中使用的两种HCC细胞系中被强烈地下调。因此，该回路的下一迭代(称为HCC.V2)实施了程序“SOX9/10 ANDHNF1A/B AND NOT(let-7c)”。
实施例4.体外和体内的作用机制。
使用AAV-DJ衣壳作为用于体外细胞转导的有效载体，并且AAV-B1作为在体内具有广泛生物分布的衣壳，进行了AAV包装的回路的广泛的机制研究。在研究早期，通过将携带回路的质粒DNA转染到不表达任何输入的背景细胞系中，并且然后通过所有可能的输入组合的系统性异位表达(将结果与预期进行比较)来分析和验证逻辑程序。在病毒载体的情况下，该策略现在更长效，因为当回路本身经由AAV转导递送时，几乎不可能共同递送单独的异位输入。实际上，更有趣的问题是载体如何响应内源性表达的输入，因为在治疗的背景中的细胞分类必须依赖于内源性输入并充分地响应于内源性输入。因此，机制的证明包括细胞类型中的全回路的输出是否与这些细胞中的单独的回路输入的活性以及回路的逻辑程序一致的问题。
因此，针对每个回路输入(分别为用于SOX9/10和HNF1A/B反馈-放大传感器的AAV-DJ.C.SOX-FB.mCherry和AAV-DJ.C.HNF1-FB.mCherry)；let-7c传感器(AAV-DJ.C.let-7c.mCherry)；仅实施AND门的部分回路(AAV-DJ.C.TF-AND.mCherry)；全回路(AAV-DJ.HCC.V2.mCherry)；和作为参考的组成型报告物(AAV-DJ.C.CMV.mCherry)，创建单独的基因传感器并将其包装到AAV-DJ中(图4A)。在10个细胞系和原代肝细胞中测定这些构建体的输出。结果(图4B-4C)显示了多输入回路的响应与各个输入的表达一致，其证实了在基于质粒的和病毒载体包装的系统之间保留的作用机制。需要用于SOX9/10和HNF1A/B的两个单独传感器的强响应以触发TF-AND门的高响应；并且需要TF-AND门的强响应以及let-7c传感器的缺乏响应来实现完整程序的高输出。
对于体内表征，将分别包装组成型对照AAV-B1.C.CMV.mCherry、仅TF的AND门AAV-B1.C.TF-AND.mCherry、let-7c报告物AAV-B1.C.let-7c.mCherry和全回路AAV-B1.HCC.V2.mCherry，并表达mCherry为输出的B1-假型载体全身注入到小鼠尾静脉中，并且在注入后3周在各种器官中评估mCherry表达。通过图像处理在新鲜器官切片中对表达进行定量。结果(图5A-5B)突出了在不同器官中多个输入的复杂协同作用及它们的不同作用。在肝脏中，与组成型对照相比，AND-门导致阳性细胞数目的减少，但导致在表现出阳性表达的细胞上升高的表达。与对照相比，let-7c报告物显示了降低的表达，但是残留表达明显高于背景。完整回路导致表达实际上不能与背景区分。在胰腺中，AND门-控制的表达和let-7c控制的表达导致输出表达的大量减少，然而在每种情况下，表达高于背景。如在肝脏中，完整的靶向程序没有产生任何在背景以上的可检测的表达。在心脏中，AND门或let-7c它们自身并且当在完整回路中组合时提供背景水平表达。在肾脏中情况类似于胰腺，无论是AND门还是let-7c调节都不能将表达降低至背景，而完整的程序可以。总之，数据集强烈地支持这样的假设：需要多输入逻辑回路以在体内实现从健康器官高度有效的去靶向；如由逻辑程序“SOX9/10 AND HNF1A/B AND NOT(let-7c)”提取的，多个输入的协同效应在四种情况的三种中是明显的。然后设计实验以确定同一程序是否能够在体内高效地靶向肿瘤，并将具有mCherry输出的B1-型AAV-B1.HCC.V2.mCherry回路注入载瘤NSG小鼠中。数据(图5C)显示，实际上，在体内肿瘤被特异性地且高效地靶向，而其它器官不表达输出，与图5A-5B中的数据一致。
实施例5.体外和体内的抗肿瘤功效。
由于回路程序在体内显示出优异的肿瘤特异性表达和从主要器官去靶向，使用HSV-TK酶结合作为基准抗肿瘤执行器的前药更昔洛韦来进行其抗肿瘤活性的详细评估。该回路称为HCC.V2-HSV-TK。沿着类似于先导实验(图2)但具有较大的动物组和扩展数量的实验组的路线进行测试。在HuH-7、HepG2和HeLa细胞系中以及在体外培养的原代肝细胞中，制造包括组成型对照和完整回路的DJ-假型载体，并且评估它们对更昔洛韦的剂量响应。如预期的，Huh-7和HepG2细胞被组成型载体和回路AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK等同地靶向，而HeLa阴性对照细胞和原代肝细胞二者对组成型载体敏感，但未被全供应的回路消除(图6A)。另外，由于使用在这些细胞中未下调的let-7c传感器，在HuH-7细胞中，AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK比AAV-DJ.HCC.V1-HSV-TK更有效。然而，由于miR-122的不完全关闭，在HuH-7细胞中，AAV-DJ.HCC.V1-HSV-TK仍是有活性的(图6B)。
接下来，将含有回路的DJ-假型AAV载体全身递送至HepG2-LC荷瘤小鼠(图7A)。没有更昔洛韦的实验组包括假注入(生理盐水)；编码TF-AND程序的载体AAV-DJ.C.TF-AND-HSV-TK；以及编码全回路AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK的载体。具有更昔洛韦的组在尾静脉递送载体或假冒物(sham)，然后是更昔洛韦注入方案方面反映了上述组；即：包括假注入+GCV；AND-门回路+GCV；和完整的回路+GCV。使用体内生物发光跟踪动物(每组n＝4)的肿瘤负荷，并使用评分表标准跟踪它们的健康状况。数据(图7B-7F)表明，用含有提供有HSV-TK输出和补充有GCV方案的全HCC.V2-HSV-TK程序的载体处理的小鼠显示出稳健且可重现的遏制并且然后消退它们的肿瘤负荷，而没有GCV的对照组或仅注入GCV的组显示随着时间的推移指数肿瘤负荷增加。与AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK相比，编码具有HSV-TK输出的AND门的载体AAV-DJ-C.TF-AND-HSV-TK表现出相似的抗肿瘤效果，然而也引发了强烈的不良反应，并且因此该组中的动物不得不在计划完成之前被安乐死。另一方面，用完整的AAV-DJ.HCC.V2-HSV-TK回路处理的组显示出延长的肿瘤负荷减少，而没有明显的不良反应。这些结果明确地说明了体内靶向特异性(图5A-5D)与体内不良反应程度之间的紧密联系。因此，在未来，从荧光输出表达来测量的肿瘤外输出表达的存在将构成预筛选阶段，无需评估它们功能输出的毒性。
实施例6.AAV-B1和AAV-DJ假型回路驱动的HCC靶向的体内比较。
鉴于针对B1型AAV衣壳观察到的广泛的取向和强体内转导以及在HCC.V2程序的控制下放置基因表达完成的广泛的多器官去靶向，有理由认为得到的B1型AAV-B1.HCC.V2回路可在不损害选择性的情况下产生高肿瘤转导。为了研究这种可能性，当使用B1衣壳代替先前功效研究中使用的DJ衣壳递送AAV-B1.HCC.V2-mCherry全回路输出时，比较回路输出(mCherry)。数据(图8A)显示，当以相同剂量施用时，B1型回路极大地胜过所有DJ变体(AAV-DJ.HCC.V2.mCherry、仅TF的AND门AAV-DJ.C.TF-AND.mCherry或AAV-DJ.C.CMV.mCherry)的肿瘤表达水平，同时保持其对邻近肝脏组织的选择性。瘤内输出表达约40倍高(图8B)，并且甚至在大肿瘤结节的核心部分中导致强荧光。与肿瘤渗入结合的强选择性表达提示回路靶向性，耦合到B1型衣壳作为HCC基因治疗的有前景的候选物。
实施例7.miR-let-7c和miR-122的组合。
体外功效数据显示，当HCC.V1即使以高剂量也完全保护肝细胞(图2B)，同一程序相比于HCC.V2仅显示HUH-7细胞杀伤效率的部分降低(图5B)，并导致与高病毒剂量几乎相当的性能。与HUH-7细胞相比，该差异与肝细胞中观察到的更严格的基因抑制一致(图2A)。
如本文所确立的，miR-122靶的数量和布置的变化可用于调制抑制强度，从而导致具有不同miR-122水平的细胞系中的不同表达水平(图1M)。假设通过靶数量、布置或经由使用不完美的互补靶miR-122抑制效率的降低可在肝去靶向部分减少的风险下，用于提高HUH-7(甚至以较低的病毒剂量)中的回路效力。
从这些数据，预期与来自具有较弱miR-122抑制的HCC.V2的miR-Let7c靶(图9A)组合的HCC.V3回路同时胜过HCC.V3回路和HCC.V2回路。miR-122引起的抑制强度可通过改变T-122靶的数量和定位、通过引入不完美互补的靶或通过两种方法的组合来调节。不完美互补的靶可通过在miRNA种子序列侧翼的序列中引入随机突变或通过使用源自由miRNA调节的基因的保守3’UTR的miR-122靶来获得(图9B)。可以选择最大化肝脏保护和针对HCC细胞(特别是HUH-7)的功效的所需组合的候选物。
预期HCC.V3将展现从主要器官的一般化miRNA去靶向(Let-7c)，并受益于肝脏中的组合保护(Let7c和miR-122)，而没有显著降低其在HepG2和HUH-7二者中的功效。作为对于大多数病毒载体具有最高生物分布的器官，实现最紧密的可能肝脏去靶向是特别期望的，并且可能导致治疗窗的进一步提高。
实施例8.讨论。
本公开显示了到逻辑基因回路方法的临床翻译的路径。需要三个根本的核心来支持这样的翻译，即：(1)组成疾病的分子的知识；(2)能够利用该知识的优势的平台的可用性；以及(3)该平台至临床相关治疗模态的可译性合在一起以递送在体外和体内功效和安全概况中具有前景的可行的治疗候选物。本文所述的广泛的机理表征突出了多输入细胞分类器的独特性质，与它的单独的组分相比，其被按照系统过程以合理的自下而上的方式构建。重要的是，本文中证明了，由报告物输出所测量的靶向特异性与体内的功效和不良反应二者紧密相关。
诸如时机和剂量的治疗控制的特定表达和其它模态是不仅用于癌症而且用于其它指征的基因治疗的下一前沿。已经投入了大量努力来开发具有优先组织靶向的新型衣壳，以及用于特异性组织表达的启动子元件。值得注意的是，两个工作线都依赖于大文库的广泛筛选，并且它们不保证成功；而且，声称的特异性只能在大的相对样本组的存在下进行。对于人治疗，这些样本必须是人源的。由于人组织的大的多样性，叠加在衣壳和/或启动子筛选的大文库尺寸上，将使该努力过分复杂。本文所述的自下而上的方法使用合理的设计来从多个单独的输入创建组合特异性。通过概况分析使候选输入空间变窄，使得复杂程序的工程化能够在合理的、正向设计背景上解决异质细胞群(如在我们的Huh-7和HepG2细胞实施例中)。该方法不排除使用靶向衣壳或特异性启动子：它们可以根据需要应用。然而，对于传播的疾病(例如癌症)，广泛的趋向衣壳可能是优选的；然后将特异性表达的负担转移到在治疗的基因载荷中编码的分类的程序。在其它情况下，衣壳特异性和分类器程序可以协同使用以实现最佳期望的效果。
在单个全身注入之后，在体内实现了肝脏中大的多病灶肿瘤的有效渗入(图5C-5D和图8A-8C)，并且这提供了强的证据，即使单个注入也能向弥散的和血管化良好的肿瘤(例如HCC)递送载荷。然后，具有旁观者效应的输出能够有效地治疗这些肿瘤。
实施例9.用于实施例1-8的材料和方法。
细胞系：HuH-7细胞购自日本健康科学基金会的健康科学研究资源库(HealthScience Research Resources bank of the Japan Health Sciences Foundation)(Cat-#JCRB0403)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Lifetechnologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的低葡萄糖DMEM，GlutaMAX(Life technologies，Cat#21885-025)中，在37℃、5％CO2下培养。Hep G2细胞购自ATCC(Cat#HB-8065)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或LifeTechnologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的RPMI(Gibco A10491-01)中，在37℃、5％CO2下培养。HeLa细胞购自ATCC(Cat#CCL-2)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life Technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的高葡萄糖DMEM(Life technologies，Cat#41966)中，在37℃、5％CO2下培养。Hep3B细胞购自ATCC(Cat#HB-8064)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的低葡萄糖DMEM，GlutaMAX(Life technologies，Cat#21885-025)中，在37℃、5％CO2下培养。HCT-116细胞购自Deutsche Sammlung VonMicroorganismen和Zellkulturen(DMZ)，DMZ No ACC-581，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的DMEM GlutaMAX(Life technologies，Cat#31966-021)中，在37℃、5％CO2下培养。SW-620细胞购自ATCC(Cat#CCL-227)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life Technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的DMEM GlutaMAX(Life technologies，Cat#31966-021)中，在37℃、5％CO2下培养。LoVo细胞购自ATCC(Cat#CCL-229)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life Technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的DMEM GlutaMAX(Life technologies，Cat#31966-021)中，在37℃、5％CO2下培养。A549细胞购自ATCC(Cat#CCL-185)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life Technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的DMEM GlutaMAX(Life technologies，Cat#31966-021)中，在37℃、5％CO2下培养。SH4细胞购自ATCC(Cat#CCL-185)，并且在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life Technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的DMEM GlutaMAX(Life technologies，Cat#31966-021)中，在37℃、5％CO2下培养。IGROV1细胞是NCI-60组的一部分并通过NCI(NIH)获得。细胞在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，Cat#F9665或Life Technologies，Cat#10270106)和1％青霉素/链霉素溶液(Sigma-Aldrich，P4333)的RPMI(Gibco A10491-01)中，在37℃、5％CO2下培养。
荧光素酶和mCitrine稳定细胞系(HepG2 LC)的创建：经由AAVS基因座的TALEN编辑创建稳定表达mCitrine和萤光素酶的HepG2细胞系(HepG2 LC)。将4x105个HepG2细胞接种于6孔板中，并且24h后用总共2μg的DNA和Lipofectamine 2000转染。转染混合物由以下构成：在EF1A启动子(pIK014)的控制下的500ng hAAVS1 1L TALEN(pIK11)、500ng hAAVS11R TALEN(pIK12)和1μg的荧光素酶2A Citrine。将转化的细胞扩增并保持培养3周，以便稀释由瞬时转染引起的表达。3周后，使用BD FACS Aria III对mCitrine+混合群(＜1％)进行分选。将得到的20.000个细胞接种在24孔板中的补充有20％FBS的RPMI中持续第一周，以促进初始回收。培养细胞并扩增2周，以选择具有稳定转基因表达的细胞，并避免倾向发生沉默的克隆。在96孔板中分选单个mCitrine+克隆，在补充有20％FBS的RPMI中培养和扩增。选择三种不同的高表达克隆，并将最好的用于连续试验。使用PhotonIMAGERRT(BiospaceLaboratories)测量克隆的生物发光5分钟以确认萤光素酶表达。
病毒载体质粒和病毒产生：如先前所述产生和纯化单链AAV载体(Paterna 2004，Conway 1999)。简要地，用以1∶1∶1摩尔比的聚乙烯亚胺(PEI)介导的AAV载体质粒(提供待包装的AAV载体基因组)、AAV辅助质粒(提供感兴趣的AAV血清型2rep蛋白和AAV血清型的cap蛋白)和腺病毒(AV)辅助质粒pBS-E2A-VA-E4(Glatzel 2000)共转染表达猿病毒大T抗原(293T)的人胚肾细胞(HEK293T)。在转染后96至120h收集HEK293T细胞并通过低速离心(在1500g/4℃，15min)从它们的上清中分离HEK293T细胞。通过添加PEG 8000溶液(最终：8％v/v)和NaCl(最终：0.5M)，将释放到上清中的AAV载体在4℃条件下进行PEG-沉淀过夜。通过低速离心(在3488g/4℃，60min)完成PEG沉淀。丢弃清的上清液，并将造粒的AAV载体重悬于AAV重悬缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.5)中。将HEK293T细胞重悬于AAV重悬缓冲液中，并通过Bertin’s Minilys Homogenizer结合7mL软组织均质CK14管进行裂解(在5000rpm/RT下两个1min循环，在-20℃通过＞4min冷却来中断)。将粗细胞裂解物用BitNuclease内切酶(75U/mL，在37℃，30至90min)处理并通过离心(在17000g/4℃，10min)清除。将PEG-造粒的AAV载体与清除的裂解物结合并经受不连续的密度碘克沙醇(OptiPrep，Axis-Shield)梯度(等密度)超速离心(在365929g/15℃，2h 15min)。随后，根据制造商的说明书，使用Vivaspin 20超滤装置(100 000 MWCO，PES膜，Sartorius)和补充有1mM MgCl2和2.5mM KCl的1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)，通过三轮渗滤(超滤)从包含馏分的AAV载体中去除碘克沙醇。在-80℃等分储存AAV载体。使用Qubit 3.0荧光计结合QubitdsDNA HS Assay Kit(二者来自Life Technologies)对包封的病毒载体基因组(vg)进行定量。简言之，5μL未稀释的(或1∶10稀释的)AAV载体一式两份制备。根据制造商的说明书，将一份样本热变性(在95℃，5min)，并对未处理的和热变性的样本进行定量。通过从总的内-和外病毒(衣壳化的和非衣壳化的；热变性的样本)中减去外病毒(非衣壳化的；未处理的样本)来计算内病毒(衣壳化的)vg/mL。
体内注入用细胞制剂：将HepG2 LC细胞培养并传代直到在T-75或T-150瓶中70-80％汇合。对于体内注入，我们使用具有低传代数(传代12或更少)的细胞以最小化报告物基因的沉默。通过去除生长培养基，用PBS(10ml用于T-75或20ml用于T-150)洗涤，并且在37℃用Trypsin(Gibco，25200056)(2ml用于T-75或6ml用于T-150瓶)解离细胞5min，使细胞脱离。将细胞悬液用8mL(T-75)或24ml(T-150)的PBS稀释，通过移液轻轻重悬，并且随后在50ml Falcon管中使用100μm过滤器过滤，以得到单细胞悬液。使用另外的PBS洗涤过滤器，10ml(T-75)或20ml用于T-150，进一步将细胞稀释至20ml(T-75)或50ml(T-150)的总体积。将细胞悬液在4℃以498rpm离心9min。用20ml PBS洗涤细胞小球，并在4℃以498rpm离心6min再两次以去除任何痕量的胰蛋白酶(trypsin)。根据试验所需的细胞数量，用一个或多个瓶和管进行该程序。将每小球重悬于少量PBS(250-300ul用于每小球)中，并稀释小的等分试样(1∶50和1∶100)，用于使用Neubauer室和台盼蓝对活细胞进行手动计数。每细胞悬液取至少四个独立的计数，并使用平均值来确定待注入的细胞数。在显微镜下目视检查细胞悬液以验证不存在大团块。在结束时，用PBS将体积调节至约2×107细胞/mL。在手术的持续时间内将细胞悬液保持在冰上，鉴于高细胞浓度，在每次注入前细胞需要重悬。为了最小化操作和提高活力，将细胞分成多个存储物(2-3管)。我们注意到细胞团块的存在和残留的胰蛋白酶或其它细胞解离试剂的存在对动物是有毒的并潜在地威胁动物的生命。
异种移植小鼠肝脏小鼠模型：根据瑞士联邦法律和瑞士苏黎世联邦理工大学(
Figure BDA0003983634320001401
Technische Hochschule(ETH)Zurich)的机构指南来执行所有动物过程，并且由州Basel-Stadt的动物伦理委员会批准。将8至10周龄的免疫缺陷NSG小鼠(德国苏尔茨费尔德查尔斯河的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)饲养在特定无病原体的设施中。为了产生源自人肿瘤细胞的小鼠肝脏肿瘤，用吸入式异氟烷麻醉NSG小鼠。使用无菌手术技术，进行1-1.5cm的左肋下切口并且暴露脾。使用27号针将105个HepG2细胞的50μl PBS注入到脾的下叶中。一旦去除针头，立即结扎脾的下极点。在结扎主脾脉管系统和移除脾之前，允许用于大多数细胞到达肝脏以定殖的10分钟引流。然后用缝线闭合腹部切口。小鼠中的肿瘤生长通过生物发光成像每星期2-3次监测(PhotonIMAGER RT，Biospace Lab)。
通过荧光显微术和流式细胞术的体内递送报告物AAV和基因表达分析：为了使体内回路输出表达可视化，在肿瘤细胞移植后2周，将编码mCherry输出的2x1012vg(病毒基因组)的AAV或PBS以单剂量通过尾静脉施用。3周后，将小鼠安乐死并立即用50-70mL的含10或25U/mL肝素(Sigma-Aldrich)的HBSS灌注以去除自动荧光红细胞。收获器官和组织(肝脏、肺、脑、胰脏、骨骼肌、心脏和肾脏)，并制备新鲜的组织切片并将其保持在冰上的PBS中。通过荧光显微术立即分析mCherry的表达。
体内递送治疗性AAV和前药治疗：在肿瘤细胞接种后两周，首先基于生物发光强度(高与低)反映的肿瘤负荷对荷瘤小鼠进行分层，并且然后将其随机分为各种处理组，以确保组之间的肿瘤负荷的可比性。将4x1012vg(病毒基因组)的AAV-回路构建体或PBS经由相隔一周的两次分开的注入进行静脉内施用。在第一AAV注入后第3天开始前药GCV(50mg/kg，InvivoGen)或盐水处理，每天一次腹膜内注入小鼠持续2周。每周用生物发光成像评估肿瘤生长2-3次。如果到了终点，则用评分表监测小鼠并安乐死。在前药处理14天后终止所有小鼠。收获肝脏用于肿瘤负荷的离体生物发光成像分析。在肿瘤细胞接种后两周，首先基于生物发光强度(高与低)反映的肿瘤负荷对荷瘤小鼠进行分层，并且然后将其随机分为各种处理组，以确保组之间的肿瘤负荷的可比性。将4x1012vg(病毒基因组)的AAV-回路构建体或PBS经由相隔一周的两次分开的注入进行静脉内施用。在第一AAV注入后第3天开始前药GCV(50mg/kg，InvivoGen)或盐水处理，每天一次腹膜内注入小鼠持续2周。每周用生物发光成像评估肿瘤生长2-3次。如果达到了终点，则用评分表监测小鼠并安乐死。在前药处理14天后终止所有小鼠。收获肝脏用于肿瘤负荷的离体生物发光成像分析。
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其他实施方式
本说明书中公开的所有特征可以以任意组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以用服务于相同、等同或类似目的的替代特征来取代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等同或类似特征的通用系列的实例。
从以上描述中，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和改进以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施方式也在权利要求内。
等同物
虽然本文中已经描述和示出了若干发明的实施方式，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且这些变型和/或改进中的每一个被认为在本文所述的发明实施方式的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置目的是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于发明教导所使用的具体的一个应用或多个应用。本领域技术人员将认识到，或能够使用不多于常规试验来确定本文所述的具体的发明实施方式的许多等同物。因此，应当理解的是，前述实施方式仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，发明实施方式可以以不同于具体描述和要求保护的方式实践。本公开的发明实施方式涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本公开的发明范围内。
本文定义和使用的所有定义应当被理解为相对于字典定义、以引用方式并入的文献中的定义和/或所定义的术语的普通含义起控制作用。
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请通过引用关于引用每个参考文献、专利和专利申请的主题并入，其在一些情况下可涵盖整个文本。
除非明确相反地指出，否则本文在说明书和权利要求书中所使用的不定冠词“一种(a/an)”和“一个(a/an)”应理解为意指“至少一种/个”。
本文在说明书和权利要求书中使用的短语″和/或″应被理解为意指这样结合的元件的“二者其一或二者”，即在一些情况下结合地存在并且在其它情况下分离地存在的元件。以“和/或”所列出的多个元件应当以相同的方式解释，即，如此结合的元件的“一个或多个”。除了通过“和/或”具体确定的元件之外，其它元件可任选地存在，无论与具体鉴定的那些元件相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言例如“包含”使用时，提到“A和/或B”可在一个实施方式中，指仅A(任选地包含除B之外的元件)；在另一实施方式中，指仅B(任选地包含除A之外的元件)；在又一实施方式中，指A和B二者(任选地包含其它元件)；等。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，“或”或“和/或”将被解释为包括性的，即包括一些元件或元件列表以及任选地另外未列出的项目的至少一个，但也包括多于一个。仅被清楚地相反指示的术语例如“……的仅一个”或“……的确切一个”或当在权利要求中使用时的“由……组成”，将指包含一些元件或元件列表的确切一个元件。通常，本文中所使用的术语“或”，当其前面是排他性的术语例如“二者其一”、“一个”，“仅一个”或“确切一个”时，仅应被解释为指示排他的替代方案(即，“一个或另一个但不是二者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，涉及一个或多个元件的列表的短语″至少一个″应被理解为意指选自元件列表中的任何一个或多个元件的至少一个元件，但不一定包含元件列表中具体列出的每一个元件中的至少一个，并且不排除元件列表中的元件的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指的元件列表内具体确定的元件之外，元件可以任选地存在，无论与具体确定的那些元件相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B的至少一个”(或等效地，“A或B的至少一个”，或等效地，“A和/或B的至少一个”)可以在一个实施方式中，指代至少一个、任选地包含不止一个A，不存在B(并且任选地包含除B之外的元件)；在另一实施方式中，指代至少一个、任选地包含多于一个B，不存在A(并且任选地包含除A之外的元件)；在又一个实施方式中，指代至少一个、任选地包含多于一个A，并且至少一个、任选地包含多于一个B(并且任选地包含其他元件)；等。
还应当理解的是，除非明确相反地指出，在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或方法的动作的顺序不一定限于所叙述的方法的步骤或动作的顺序。
在上文的权利要求书以及说明书中，所有过渡短语如“包含”，“包括、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等将被理解为开放式的，即，意指包括但不限于。只有“由……组成”和“基本由……组成”的过渡短语应分别为封闭或半封闭过渡短语，如美国专利局《专利审查程序手册》第2111.03节中所述。应当理解的是，在该文档中描述的实施方式使用开放式过渡短语(例如，“包含”)描述的实施方式在替代实施方式中也被考虑为“由开放式过渡短语所描述的特征组成”和“基本上由开放式过渡短语所描述的特征组成”。例如，如果本公开描述了“包含A和B的组合物”，则本公开还考虑了替代实施方式“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。
序列表
<110> 瑞士苏黎世联邦理工大学
<120> 细胞分类器回路及其使用方法
<130> E0583.70001WO00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/009,736
<151> 2020-04-14
<160> 306
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
ugagguagua gguuguaugg uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
aagcugccag uugaagaacu gu 22
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
uucaaguaau ucaggauagg u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
cauuauuacu uuugguacgc g 21
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
cagcagcaau ucauguuuug ga 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
cagcagcaau ucauguuuug aa 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
auaagacgag caaaaagcuu gu 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
auaagacgaa caaaagguuu gu 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
uaaucucagc uggcaacugu ga 22
<210> 11
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
uacugcauca ggaacugacu gga 23
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
uacugcauca ggaacugauu gga 23
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
uggaauguaa agaaguaugu au 22
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
uuuggucccc uucaaccagc ug 22
<210> 17
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
uuuggucccc uucaaccagc ua 22
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
ucuuugguua ucuagcugua uga 23
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
uccagcauca gugauuuugu ug 22
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
ugauugucca aacgcaauuc u 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 21
uuuugcaccu uuuggaguga a 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
auugacacuu cugugaguag a 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
uacugcagac aguggcaauc a 21
<210> 24
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
uggaagacua gugauuuugu uguu 24
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
uccuucauuc caccggaguc ug 22
<210> 26
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
uguaguguuu ccuacuuuau gga 23
<210> 27
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
acaguagucu gcacauuggu ua 22
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
uaacacuguc ugguaacgau gu 22
<210> 29
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
uaauacugcc ugguaaugau ga 22
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
cugaccuaug aauugacagc c 21
<210> 31
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
uguaacagca acuccaugug ga 22
<210> 32
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
uggcagugua uuguuagcug gu 22
<210> 33
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 34
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 35
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
agagguagua gguugcauag uu 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210> 37
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
ugagguagua gauuguauag uu 22
<210> 38
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
ugagguagua guuuguacag uu 22
<210> 39
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
ugagguagua guuugugcug uu 22
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
ugagaugaag cacuguagcu c 21
<210> 41
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
ucagugcacu acagaacuuu gu 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
aaccatacaa cctactacct ca 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
acagttcttc aactggcagc tt 22
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
acctatcctg aattacttga a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
cgcgtaccaa aagtaataat g 21
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
caaacaccat tgtcacactc ca 22
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
gtccaaaaca tgaattgctg ct 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
gtccaaaaca tgaattgctg ct 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
acaagctttt tgctcgtctt at 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
acaaaccttt tgttcgtctt at 22
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
tcacagttgc cagctgagat ta 22
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
tccagtcagt tcctgatgca gta 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
tccaatcagt tcctgatgca gta 23
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
tcacgcgagc cgaacgaaca aa 22
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
ttggcattca ccgcgtgcct ta 22
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
atacatactt ctttacattc ca 22
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
cagctggttg aaggggacca aa 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
tagctggttg aaggggacca aa 22
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
tcatacagct agataaccaa aga 23
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
tccagcatca gtgattttgt tg 22
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
tgattgtcca aacgcaattc t 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
ttcactccaa aaggtgcaaa a 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
attgacactt ctgtgagtag a 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
tactgcagac agtggcaatc a 21
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
aacaacaaaa tcactagtct tcca 24
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
cagactccgg tggaatgaag ga 22
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
tccataaagt aggaaacact aca 23
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
taaccaatgt gcagactact gt 22
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
acatcgttac cagacagtgt ta 22
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
tcatcattac caggcagtat ta 22
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
ggctgtcaat tcataggtca g 21
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
tccacatgga gttgctgtta ca 22
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
accagctaac aatacactgc ca 22
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
aactatacaa cctactacct ca 22
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
aaccacacaa cctactacct ca 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
aactatgcaa cctactacct ct 22
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
aactatacaa cctcctacct ca 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
aactatacaa tctactacct ca 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
aactgtacaa actactacct ca 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
aacagcacaa actactacct ca 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
gagctacagt gcttcatctc at 22
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
acaaagttct gtagtgcact ga 22
<210> 83
<211> 578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
atgatgagtt tcccaccatg gtgtttcctt ctgggcagat cagccaggcc tcggccttgg 60
ccccggcccc tccccaagtc ctgccccagg ctccagcccc tgcccctgct ccagccatgg 120
tatcagctct ggcccaggcc ccagcccctg tcccagtcct agccccaggc cctcctcagg 180
ctgtggcccc acctgccccc aagcccaccc aggctgggga aggaacgctg tcagaggccc 240
tgctgcagct gcagtttgat gatgaagacc tgggggcctt gcttggcaac agcacagacc 300
cagctgtgtt cacagacctg gcatccgtcg acaactccga gtttcagcag ctgctgaacc 360
agggcatacc tgtggccccc cacacaactg agcccatgct gatggagtac cctgaggcta 420
taactcgcct agtgacaggg gcccagaggc cccccgaccc agctcctgct ccactggggg 480
ccccggggct ccccaatggc ctcctttcag gagatgaaga cttctcctcc attgcggaca 540
tggacttctc agccctgctg agtcagatca gctcctaa 578
<210> 84
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
His Asp Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln
1 5 10 15
Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro
50 55 60
Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala
65 70 75 80
Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn
100 105 110
Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His
115 120 125
Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu
130 135 140
Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly
145 150 155 160
Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser
165 170 175
Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser
180 185 190
<210> 85
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
caggctgggg aaggaacgct gtcagaggcc ctgctgcagc tgcagtttga tgatgaagac 60
ctgggggcct tgcttggcaa cagcacagac ccagctgtgt tcacagacct ggcatccgtc 120
gacaactccg agtttcagca gctgctgaac cagggcatac ctgtggcccc ccacacaact 180
gagcccatgc tgatggagta ccctgaggct ataactcgcc tagtgacagg cgcacaacgc 240
ccacctgatc cggcaccagc accccttgga gctcccggtc tccccaatgg cctcctttca 300
ggagatgaag acttctcctc cattgcggac atggacttct cagccctgct gagtcagatc 360
agctcc 366
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe
1 5 10 15
Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala
20 25 30
Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu
35 40 45
Leu Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu
50 55 60
Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg
65 70 75 80
Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn
85 90 95
Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp
100 105 110
Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 630
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
cccaagccag caccccagcc ctatcccttt acgtcatccc tgagcaccat caactatgat 60
gagtttccca ccatggtgtt tccttctggg cagatcagcc aggcctcggc cttggccccg 120
gcccctcccc aagtcctgcc ccaggctcca gcccctgccc ctgctccagc catggtatca 180
gctctggccc aggccccagc ccctgtccca gtcctagccc caggccctcc tcaggctgtg 240
gccccacctg cccccaagcc cacccaggct ggggaaggaa cgctgtcaga ggccctgctg 300
cagctgcagt ttgatgatga agacctgggg gccttgcttg gcaacagcac agacccagct 360
gtgttcacag acctggcatc cgtcgacaac tccgagtttc agcagctgct gaaccagggc 420
atacctgtgg ccccccacac aactgagccc atgctgatgg agtaccctga ggctataact 480
cgcctagtga caggggccca gaggcccccc gacccagctc ctgctccact gggggccccg 540
gggctcccca atggcctcct ttcaggagat gaagacttct cctccattgc ggacatggac 600
ttctcagccc tgctgagtca gatcagctcc 630
<210> 88
<211> 210
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr Ser Ser Leu Ser Thr
1 5 10 15
Ile Asn Tyr Asp Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile
20 25 30
Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu Pro Gln
35 40 45
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met Val Ser Ala Leu Ala Gln
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln Ala Val
65 70 75 80
Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser
85 90 95
Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu
100 105 110
Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val
115 120 125
Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala
130 135 140
Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr
145 150 155 160
Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp
180 185 190
Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile
195 200 205
Ser Ser
210
<210> 89
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
gcccccccga ccgatgtcag cctgggggac gagctccact tagacggcga ggacgtggcg 60
atggcgcatg ccgacgcgct agacgatttc gatctggaca tgttggggga cggggattcc 120
ccgggtccgg gatttacccc ccacgactcc gccccctacg gcgctctgga tatggccgac 180
ttcgagtttg agcagatgtt taccgatgcc cttggaattg acgagtacgg tggg 234
<210> 90
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly
1 5 10 15
Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
20 25 30
Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu
50 55 60
Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
65 70 75
<210> 91
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
ccggcagatg cccttgatga cttcgatttg gacatgctcc cagcggatgc cttggacgat 60
tttgatctcg atatgcttcc cgccgacgca ctcgatgatt tcgatctgga tatgctcccg 120
ggt 123
<210> 92
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp
20 25 30
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
35 40
<210> 93
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
ggtccggcag atgcccttga tgacttcgat ttggacatgc tcccagcgga tgccttggac 60
gattttgatc tcgatatgct tcccgccgac gcactcgatg atttcgatct ggatatgctc 120
ccgggt 126
<210> 94
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Gly Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu
20 25 30
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
35 40
<210> 95
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
atgagtcgag gagaggtgcg catggcgaag gcagggcggg aggggccgcg ggacagcgtg 60
tggctgtcgg gggaggggcg gcgcggcggt cgccgtgggg ggcagccgtc cgggctcgac 120
cgggaccgga tcaccggggt caccgtccgg ctgctggaca cggagggcct gacggggttc 180
tcgatgcgcc gcctggccgc cgagctgaac gtcaccgcga tgtccgtgta ctggtacgtc 240
gacaccaagg accagttgct cgagctcgcc ctggacgccg tcttcggcga gctgcgccac 300
ccggacccgg acgccgggct cgactggcgc gaggaactgc gggccctggc ccgggagaac 360
cgggcgctgc tggtgcgcca cccctggtcg tcccggctgg tcggcaccta cctcaacatc 420
ggcccgcact cgctggcctt ctcccgcgcg gtgcagaacg tcgtgcgccg cagcgggctg 480
cccgcgcacc gcctgaccgg cgccatctcg gccgtcttcc agttcgtcta cggctacggc 540
accatcgagg gccgcttcct cgcccgggtg gcggacaccg ggctgagtcc ggaggagtac 600
ttccaggact cgatgaccgc ggtgaccgag gtgccggaca ccgcgggcgt catcgaggac 660
gcgcaggaca tcatggcggc ccggggcggc gacaccgtgg cggagatgct ggaccgggac 720
ttcgagttcg ccctcgacct gctcgtcgcg ggcatcgacg cgatggtcga acaggcctcc 780
gcgtacagcc gcgcgcatga tgagtttccc accatggtgt ttccttctgg gcagatcagc 840
caggcctcgg ccttggcccc ggcccctccc caagtcctgc cccaggctcc agcccctgcc 900
cctgctccag ccatggtatc agctctggcc caggccccag cccctgtccc agtcctagcc 960
ccaggccctc ctcaggctgt ggccccacct gcccccaagc ccacccaggc tggggaagga 1020
acgctgtcag aggccctgct gcagctgcag tttgatgatg aagacctggg ggccttgctt 1080
ggcaacagca cagacccagc tgtgttcaca gacctggcat ccgtcgacaa ctccgagttt 1140
cagcagctgc tgaaccaggg catacctgtg gccccccaca caactgagcc catgctgatg 1200
gagtaccctg aggctataac tcgcctagtg acaggggccc agaggccccc cgacccagct 1260
cctgctccac tgggggcccc ggggctcccc aatggcctcc tttcaggaga tgaagacttc 1320
tcctccattg cggacatgga cttctcagcc ctgctgagtc agatcagctc ctaa 1374
<210> 96
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Met Ser Arg Gly Glu Val Arg Met Ala Lys Ala Gly Arg Glu Gly Pro
1 5 10 15
Arg Asp Ser Val Trp Leu Ser Gly Glu Gly Arg Arg Gly Gly Arg Arg
20 25 30
Gly Gly Gln Pro Ser Gly Leu Asp Arg Asp Arg Ile Thr Gly Val Thr
35 40 45
Val Arg Leu Leu Asp Thr Glu Gly Leu Thr Gly Phe Ser Met Arg Arg
50 55 60
Leu Ala Ala Glu Leu Asn Val Thr Ala Met Ser Val Tyr Trp Tyr Val
65 70 75 80
Asp Thr Lys Asp Gln Leu Leu Glu Leu Ala Leu Asp Ala Val Phe Gly
85 90 95
Glu Leu Arg His Pro Asp Pro Asp Ala Gly Leu Asp Trp Arg Glu Glu
100 105 110
Leu Arg Ala Leu Ala Arg Glu Asn Arg Ala Leu Leu Val Arg His Pro
115 120 125
Trp Ser Ser Arg Leu Val Gly Thr Tyr Leu Asn Ile Gly Pro His Ser
130 135 140
Leu Ala Phe Ser Arg Ala Val Gln Asn Val Val Arg Arg Ser Gly Leu
145 150 155 160
Pro Ala His Arg Leu Thr Gly Ala Ile Ser Ala Val Phe Gln Phe Val
165 170 175
Tyr Gly Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Arg Phe Leu Ala Arg Val Ala Asp
180 185 190
Thr Gly Leu Ser Pro Glu Glu Tyr Phe Gln Asp Ser Met Thr Ala Val
195 200 205
Thr Glu Val Pro Asp Thr Ala Gly Val Ile Glu Asp Ala Gln Asp Ile
210 215 220
Met Ala Ala Arg Gly Gly Asp Thr Val Ala Glu Met Leu Asp Arg Asp
225 230 235 240
Phe Glu Phe Ala Leu Asp Leu Leu Val Ala Gly Ile Asp Ala Met Val
245 250 255
Glu Gln Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala His Asp Glu Phe Pro Thr Met
260 265 270
Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala
275 280 285
Pro Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
290 295 300
Met Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala
305 310 315 320
Pro Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln
325 330 335
Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp
340 345 350
Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val
355 360 365
Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu
370 375 380
Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met
385 390 395 400
Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro
405 410 415
Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly
420 425 430
Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe
435 440 445
Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser
450 455
<210> 97
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
atgagtcgag gagaggtgcg catggcgaag gcagggcggg aggggccgcg ggacagcgtg 60
tggctgtcgg gggaggggcg gcgcggcggt cgccgtgggg ggcagccgtc cgggctcgac 120
cgggaccgga tcaccggggt caccgtccgg ctgctggaca cggagggcct gacggggttc 180
tcgatgcgcc gcctggccgc cgagctgaac gtcaccgcga tgtccgtgta ctggtacgtc 240
gacaccaagg accagttgct cgagctcgcc ctggacgccg tcttcggcga gctgcgccac 300
ccggacccgg acgccgggct cgactggcgc gaggaactgc gggccctggc ccgggagaac 360
cgggcgctgc tggtgcgcca cccctggtcg tcccggctgg tcggcaccta cctcaacatc 420
ggcccgcact cgctggcctt ctcccgcgcg gtgcagaacg tcgtgcgccg cagcgggctg 480
cccgcgcacc gcctgaccgg cgccatctcg gccgtcttcc agttcgtcta cggctacggc 540
accatcgagg gccgcttcct cgcccgggtg gcggacaccg ggctgagtcc ggaggagtac 600
ttccaggact cgatgaccgc ggtgaccgag gtgccggaca ccgcgggcgt catcgaggac 660
gcgcaggaca tcatggcggc ccggggcggc gacaccgtgg cggagatgct ggaccgggac 720
ttcgagttcg ccctcgacct gctcgtcgcg ggcatcgacg cgatggtcga acaggcctcc 780
gcgtacagcc gcgcgcgtac gaaaaacaat tacgggtcta ccatcgaggg cctgctcgat 840
ctcccggacg acgacgcccc cgaagaggcg gggctggcgg ctccgcgcct gtcctttctc 900
cccgcgggac acacgcgcag actgtcgacg gcccccccga ccgatgtcag cctgggggac 960
gagctccact tagacggcga ggacgtggcg atggcgcatg ccgacgcgct agacgatttc 1020
gatctggaca tgttggggga cggggattcc ccgggtccgg gatttacccc ccacgactcc 1080
gccccctacg gcgctctgga tatggccgac ttcgagtttg agcagatgtt taccgatgcc 1140
cttggaattg acgagtacgg tggg 1164
<210> 98
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Met Ser Arg Gly Glu Val Arg Met Ala Lys Ala Gly Arg Glu Gly Pro
1 5 10 15
Arg Asp Ser Val Trp Leu Ser Gly Glu Gly Arg Arg Gly Gly Arg Arg
20 25 30
Gly Gly Gln Pro Ser Gly Leu Asp Arg Asp Arg Ile Thr Gly Val Thr
35 40 45
Val Arg Leu Leu Asp Thr Glu Gly Leu Thr Gly Phe Ser Met Arg Arg
50 55 60
Leu Ala Ala Glu Leu Asn Val Thr Ala Met Ser Val Tyr Trp Tyr Val
65 70 75 80
Asp Thr Lys Asp Gln Leu Leu Glu Leu Ala Leu Asp Ala Val Phe Gly
85 90 95
Glu Leu Arg His Pro Asp Pro Asp Ala Gly Leu Asp Trp Arg Glu Glu
100 105 110
Leu Arg Ala Leu Ala Arg Glu Asn Arg Ala Leu Leu Val Arg His Pro
115 120 125
Trp Ser Ser Arg Leu Val Gly Thr Tyr Leu Asn Ile Gly Pro His Ser
130 135 140
Leu Ala Phe Ser Arg Ala Val Gln Asn Val Val Arg Arg Ser Gly Leu
145 150 155 160
Pro Ala His Arg Leu Thr Gly Ala Ile Ser Ala Val Phe Gln Phe Val
165 170 175
Tyr Gly Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Arg Phe Leu Ala Arg Val Ala Asp
180 185 190
Thr Gly Leu Ser Pro Glu Glu Tyr Phe Gln Asp Ser Met Thr Ala Val
195 200 205
Thr Glu Val Pro Asp Thr Ala Gly Val Ile Glu Asp Ala Gln Asp Ile
210 215 220
Met Ala Ala Arg Gly Gly Asp Thr Val Ala Glu Met Leu Asp Arg Asp
225 230 235 240
Phe Glu Phe Ala Leu Asp Leu Leu Val Ala Gly Ile Asp Ala Met Val
245 250 255
Glu Gln Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly
260 265 270
Ser Thr Ile Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu
275 280 285
Glu Ala Gly Leu Ala Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His
290 295 300
Thr Arg Arg Leu Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp
305 310 315 320
Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala
325 330 335
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly
340 345 350
Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met
355 360 365
Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp
370 375 380
Glu Tyr Gly Gly
385
<210> 99
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
atgccccgcc ccaagctcaa gtccgatgac gaggtactcg aggccgccac cgtagtgctg 60
aagcgttgcg gtcccataga gttcacgctc agcggagtag caaaggaggt ggggctctcc 120
cgcgcagcgt taatccagcg cttcaccaac cgcgatacgc tgctggtgag gatgatggag 180
cgcggcgtcg agcaggtgcg gcattacctg aatgcgatac cgataggcgc agggccgcaa 240
gggctctggg aatttttgca ggtgctcgtt cggagcatga acactcgcaa cgacttctcg 300
gtgaactatc tcatctcctg gtacgagctc caggtgccgg agctacgcac gcttgcgatc 360
cagcggaacc gcgcggtggt ggaggggatc cgcaagcgac tgcccccagg tgctcctgcg 420
gcagctgagt tgctcctgca ctcggtcatc gctggcgcga cgatgcagtg ggccgtcgat 480
ccggatggtg agctagctga tcatgtgctg gctcagatcg ctgccatcct gtgtttaatg 540
tttcccgaac acgacgattt ccaactcctc caggcacatg cgtccgcgta cagccgcgcg 600
catgatgagt ttcccaccat ggtgtttcct tctgggcaga tcagccaggc ctcggccttg 660
gccccggccc ctccccaagt cctgccccag gctccagccc ctgcccctgc tccagccatg 720
gtatcagctc tggcccaggc cccagcccct gtcccagtcc tagccccagg ccctcctcag 780
gctgtggccc cacctgcccc caagcccacc caggctgggg aaggaacgct gtcagaggcc 840
ctgctgcagc tgcagtttga tgatgaagac ctgggggcct tgcttggcaa cagcacagac 900
ccagctgtgt tcacagacct ggcatccgtc gacaactccg agtttcagca gctgctgaac 960
cagggcatac ctgtggcccc ccacacaact gagcccatgc tgatggagta ccctgaggct 1020
ataactcgcc tagtgacagg ggcccagagg ccccccgacc cagctcctgc tccactgggg 1080
gccccggggc tccccaatgg cctcctttca ggagatgaag acttctcctc cattgcggac 1140
atggacttct cagccctgct gagtcagatc agctcctaa 1179
<210> 100
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Met Pro Arg Pro Lys Leu Lys Ser Asp Asp Glu Val Leu Glu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Val Val Leu Lys Arg Cys Gly Pro Ile Glu Phe Thr Leu Ser Gly
20 25 30
Val Ala Lys Glu Val Gly Leu Ser Arg Ala Ala Leu Ile Gln Arg Phe
35 40 45
Thr Asn Arg Asp Thr Leu Leu Val Arg Met Met Glu Arg Gly Val Glu
50 55 60
Gln Val Arg His Tyr Leu Asn Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Pro Gln
65 70 75 80
Gly Leu Trp Glu Phe Leu Gln Val Leu Val Arg Ser Met Asn Thr Arg
85 90 95
Asn Asp Phe Ser Val Asn Tyr Leu Ile Ser Trp Tyr Glu Leu Gln Val
100 105 110
Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Ile Gln Arg Asn Arg Ala Val Val Glu
115 120 125
Gly Ile Arg Lys Arg Leu Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ala Ala Glu Leu
130 135 140
Leu Leu His Ser Val Ile Ala Gly Ala Thr Met Gln Trp Ala Val Asp
145 150 155 160
Pro Asp Gly Glu Leu Ala Asp His Val Leu Ala Gln Ile Ala Ala Ile
165 170 175
Leu Cys Leu Met Phe Pro Glu His Asp Asp Phe Gln Leu Leu Gln Ala
180 185 190
His Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala His Asp Glu Phe Pro Thr Met Val
195 200 205
Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro
210 215 220
Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met
225 230 235 240
Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro
245 250 255
Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala
260 265 270
Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp
275 280 285
Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe
290 295 300
Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn
305 310 315 320
Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu
325 330 335
Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro
340 345 350
Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu
355 360 365
Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser
370 375 380
Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser
385 390
<210> 101
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
atgccccgcc ccaagctcaa gtccgatgac gaggtactcg aggccgccac cgtagtgctg 60
aagcgttgcg gtcccataga gttcacgctc agcggagtag caaaggaggt ggggctctcc 120
cgcgcagcgt taatccagcg cttcaccaac cgcgatacgc tgctggtgag gatgatggag 180
cgcggcgtcg agcaggtgcg gcattacctg aatgcgatac cgataggcgc agggccgcaa 240
gggctctggg aatttttgca ggtgctcgtt cggagcatga acactcgcaa cgacttctcg 300
gtgaactatc tcatctcctg gtacgagctc caggtgccgg agctacgcac gcttgcgatc 360
cagcggaacc gcgcggtggt ggaggggatc cgcaagcgac tgcccccagg tgctcctgcg 420
gcagctgagt tgctcctgca ctcggtcatc gctggcgcga cgatgcagtg ggccgtcgat 480
ccggatggtg agctagctga tcatgtgctg gctcagatcg ctgccatcct gtgtttaatg 540
tttcccgaac acgacgattt ccaactcctc caggcacatg cgtccgcgta cagccgcgcg 600
cgtacgaaaa acaattacgg gtctaccatc gagggcctgc tcgatctccc ggacgacgac 660
gcccccgaag aggcggggct ggcggctccg cgcctgtcct ttctccccgc gggacacacg 720
cgcagactgt cgacggcccc cccgaccgat gtcagcctgg gggacgagct ccacttagac 780
ggcgaggacg tggcgatggc gcatgccgac gcgctagacg atttcgatct ggacatgttg 840
ggggacgggg attccccggg tccgggattt accccccacg actccgcccc ctacggcgct 900
ctggatatgg ccgacttcga gtttgagcag atgtttaccg atgcccttgg aattgacgag 960
tacggtggg 969
<210> 102
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Met Pro Arg Pro Lys Leu Lys Ser Asp Asp Glu Val Leu Glu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Val Val Leu Lys Arg Cys Gly Pro Ile Glu Phe Thr Leu Ser Gly
20 25 30
Val Ala Lys Glu Val Gly Leu Ser Arg Ala Ala Leu Ile Gln Arg Phe
35 40 45
Thr Asn Arg Asp Thr Leu Leu Val Arg Met Met Glu Arg Gly Val Glu
50 55 60
Gln Val Arg His Tyr Leu Asn Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Pro Gln
65 70 75 80
Gly Leu Trp Glu Phe Leu Gln Val Leu Val Arg Ser Met Asn Thr Arg
85 90 95
Asn Asp Phe Ser Val Asn Tyr Leu Ile Ser Trp Tyr Glu Leu Gln Val
100 105 110
Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Ile Gln Arg Asn Arg Ala Val Val Glu
115 120 125
Gly Ile Arg Lys Arg Leu Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ala Ala Glu Leu
130 135 140
Leu Leu His Ser Val Ile Ala Gly Ala Thr Met Gln Trp Ala Val Asp
145 150 155 160
Pro Asp Gly Glu Leu Ala Asp His Val Leu Ala Gln Ile Ala Ala Ile
165 170 175
Leu Cys Leu Met Phe Pro Glu His Asp Asp Phe Gln Leu Leu Gln Ala
180 185 190
His Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser
195 200 205
Thr Ile Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu
210 215 220
Ala Gly Leu Ala Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr
225 230 235 240
Arg Arg Leu Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu
245 250 255
Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu
260 265 270
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro
275 280 285
Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala
290 295 300
Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu
305 310 315 320
Tyr Gly Gly
<210> 103
<211> 896
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (128)..(128)
<223> n是a、c、g或t
<400> 103
atgaaagcgt taacggccag gcaacaagag gtgtttgatc tcatccgtga tcacatcagc 60
cagacaggta tgccgccgac gcgtgcggaa atcgcgcagc gtttggggtt ccgttcccca 120
aacgcggntg aagaacatct gaaggcgctg gcacgcaaag gcgttattga aattgtttcc 180
ggcgcatcac gcgggattcg tctgttgcag gaagaggaag aagggttgcc gctggtaggt 240
cgtgtggctg ccggtgaacc acttctggcg caacagcata ttgaaggtca ttatcaggtc 300
gatccttcct tattcaagcc gaatgctgat ttcctgctgc gcgtcagcgg gatgtcgatg 360
aaagatatcg gcattatgga tggtgacttg ctggcagtgc ataaaactca ggatgtacgt 420
aacggtcagg tcgttgtcgc acgtattgat gacgaagtta ccgttaagcg cctgaaaaaa 480
cagggcaata aagtcgaact gttgccagaa aatagcgagt ttaaaccaat tgtcgttgac 540
cttcgtcagc agagcttcac cattgaaggt ctggcggttg gggttattcg caacggcgac 600
tggctgtcta gctatcctta tgacgtgcct gactatgcca gcctgggagg atctagagcc 660
cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag acggcgagga cgtggcgatg 720
gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt tgggggacgg ggattccccg 780
ggtccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg ctctggatat ggccgacttc 840
gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg agtacggtgg gtagtg 896
<210> 104
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Met Lys Ala Leu Thr Ala Arg Gln Gln Glu Val Phe Asp Leu Ile Arg
1 5 10 15
Asp His Ile Ser Gln Thr Gly Met Pro Pro Thr Arg Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Gln Arg Leu Gly Phe Arg Ser Pro Asn Ala Glu Glu His Leu Lys Ala
35 40 45
Leu Ala Arg Lys Gly Val Ile Glu Ile Val Ser Gly Ala Ser Arg Gly
50 55 60
Ile Arg Leu Leu Gln Glu Glu Glu Glu Gly Leu Pro Leu Val Gly Arg
65 70 75 80
Val Ala Ala Gly Glu Pro Leu Leu Ala Gln Gln His Ile Glu Gly His
85 90 95
Tyr Gln Val Asp Pro Ser Leu Phe Lys Pro Asn Ala Asp Phe Leu Leu
100 105 110
Arg Val Ser Gly Met Ser Met Lys Asp Ile Gly Ile Met Asp Gly Asp
115 120 125
Leu Leu Ala Val His Lys Thr Gln Asp Val Arg Asn Gly Gln Val Val
130 135 140
Val Ala Arg Ile Asp Asp Glu Val Thr Val Lys Arg Leu Lys Lys Gln
145 150 155 160
Gly Asn Lys Val Glu Leu Leu Pro Glu Asn Ser Glu Phe Lys Pro Ile
165 170 175
Val Val Asp Leu Arg Gln Gln Ser Phe Thr Ile Glu Gly Leu Ala Val
180 185 190
Gly Val Ile Arg Asn Gly Asp Trp Leu Ser Ser Tyr Pro Tyr Asp Val
195 200 205
Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Ser Arg Ala Pro Pro Thr Asp Val
210 215 220
Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala
225 230 235 240
His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly
260 265 270
Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala
275 280 285
Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
290 295
<210> 105
<211> 339
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 105
atggctacga ccgagcggga cgtaaaccag cttactccga gagagaggga cattttgaag 60
ctgattgcgc aggggcttcc caataagatg attgccagac gccttgatat cacggaaagc 120
actgtgaaag tccacgtgaa acacatgctc aaaaagatga aactcaagtc ccgcgtggaa 180
gctgcggtct gggtacatca ggagcgaatc tttggtccgg cagatgccct tgatgacttc 240
gatttggaca tgctcccagc ggatgccttg gacgattttg atctcgatat gcttcccgcc 300
gacgcactcg atgatttcga tctggatatg ctcccgggt 339
<210> 106
<211> 113
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 106
Met Ala Thr Thr Glu Arg Asp Val Asn Gln Leu Thr Pro Arg Glu Arg
1 5 10 15
Asp Ile Leu Lys Leu Ile Ala Gln Gly Leu Pro Asn Lys Met Ile Ala
20 25 30
Arg Arg Leu Asp Ile Thr Glu Ser Thr Val Lys Val His Val Lys His
35 40 45
Met Leu Lys Lys Met Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Ala Ala Val Trp
50 55 60
Val His Gln Glu Arg Ile Phe Gly Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe
65 70 75 80
Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
85 90 95
Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro
100 105 110
Gly
<210> 107
<211> 456
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 107
atggctacga ccgagcggga cgtaaaccag cttactccga gagagaggga cattttgaag 60
ctgattgcgc aggggcttcc caataagatg attgccagac gccttgatat cacggaaagc 120
actgtgaaag tccacgtgaa acacatgctc aaaaagatga aactcaagtc ccgcgtggaa 180
gctgcggtct gggtacatca ggagcgaatc tttgccagcg cccccccgac cgatgtcagc 240
ctgggggacg agctccactt agacggcgag gacgtggcga tggcgcatgc cgacgcgcta 300
gacgatttcg atctggacat gttgggggac ggggattccc cgggtccggg atttaccccc 360
cacgactccg ccccctacgg cgctctggat atggccgact tcgagtttga gcagatgttt 420
accgatgccc ttggaattga cgagtacggt gggtga 456
<210> 108
<211> 151
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 108
Met Ala Thr Thr Glu Arg Asp Val Asn Gln Leu Thr Pro Arg Glu Arg
1 5 10 15
Asp Ile Leu Lys Leu Ile Ala Gln Gly Leu Pro Asn Lys Met Ile Ala
20 25 30
Arg Arg Leu Asp Ile Thr Glu Ser Thr Val Lys Val His Val Lys His
35 40 45
Met Leu Lys Lys Met Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Ala Ala Val Trp
50 55 60
Val His Gln Glu Arg Ile Phe Ala Ser Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His
85 90 95
Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp
100 105 110
Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala
115 120 125
Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu
130 135 140
Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
145 150
<210> 109
<211> 348
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 109
atggctacga ccgagcggga cgtaaaccag cttactccga gagagaggga cattttgaag 60
ctgattgcgc aggggcttcc caataagatg attgccagac gccttgatat cacggaaagc 120
actgtgaaag tccacgtgaa acacatgctc aaaaagatga aactcaagtc ccgcgtggaa 180
gctgcggtct gggtacatca ggagcgaatc tttgccagcg gtccggcaga tgcccttgat 240
gacttcgatt tggacatgct cccagcggat gccttggacg attttgatct cgatatgctt 300
cccgccgacg cactcgatga tttcgatctg gatatgctcc cgggttga 348
<210> 110
<211> 115
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 110
Met Ala Thr Thr Glu Arg Asp Val Asn Gln Leu Thr Pro Arg Glu Arg
1 5 10 15
Asp Ile Leu Lys Leu Ile Ala Gln Gly Leu Pro Asn Lys Met Ile Ala
20 25 30
Arg Arg Leu Asp Ile Thr Glu Ser Thr Val Lys Val His Val Lys His
35 40 45
Met Leu Lys Lys Met Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Ala Ala Val Trp
50 55 60
Val His Gln Glu Arg Ile Phe Ala Ser Gly Pro Ala Asp Ala Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
85 90 95
Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
100 105 110
Leu Pro Gly
115
<210> 111
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
atgcaagaaa actacaagat tctcgtggtg gatgatgaca tgcgacttcg cgcattgctc 60
gaaagatatc tgaccgagca gggatttcaa gtgcgctccg tggccaatgc cgagcagatg 120
gataggctct tgacgaggga gtcgttccat ctgatggtgc tggaattgat gcttcccggt 180
gaggacggat tgtccatttg ccggagactt aggtcgcagt caaaccccat gccgatcatc 240
atggtcacag cgaagggaga ggaggtcgat agaattgtag gtcttgagat tggggcagac 300
gactacatcc ccaagccgtt caatccccgg gaacttcttg cgcgaatccg agccgtgctc 360
aggcgacagg ccaacgagct gcccggagct ccatcgcaag aggaagcggt catcgcgttc 420
gggaagttca agttgaacct cggcacgaga gagatgtttc gggaagatga acctatgccg 480
ctcacatcgg gggagtttgc ggtcttgaaa gcacttgtct cacacccgag agaacctctg 540
tcgcgggata aactcatgaa tctggcgaga ggcagagagt atagcgcgat ggaaaggtcc 600
atcgatgtcc agattagccg cctccgccgc atggtggagg aagatccagc ccaccctcgg 660
tacatccaga ctgtatgggg attggggtat gtgttcgtac cggatgggtc aaaagcagga 720
ccggcggacg cactggatga ctttgacttg gatatgctcc cagcggatgc gttggacgat 780
tttgaccttg acatgttgcc tgccgacgcg cttgacgact tcgacttgga catgctgccc 840
ggt 843
<210> 112
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 112
Met Gln Glu Asn Tyr Lys Ile Leu Val Val Asp Asp Asp Met Arg Leu
1 5 10 15
Arg Ala Leu Leu Glu Arg Tyr Leu Thr Glu Gln Gly Phe Gln Val Arg
20 25 30
Ser Val Ala Asn Ala Glu Gln Met Asp Arg Leu Leu Thr Arg Glu Ser
35 40 45
Phe His Leu Met Val Leu Glu Leu Met Leu Pro Gly Glu Asp Gly Leu
50 55 60
Ser Ile Cys Arg Arg Leu Arg Ser Gln Ser Asn Pro Met Pro Ile Ile
65 70 75 80
Met Val Thr Ala Lys Gly Glu Glu Val Asp Arg Ile Val Gly Leu Glu
85 90 95
Ile Gly Ala Asp Asp Tyr Ile Pro Lys Pro Phe Asn Pro Arg Glu Leu
100 105 110
Leu Ala Arg Ile Arg Ala Val Leu Arg Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro
115 120 125
Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu Ala Val Ile Ala Phe Gly Lys Phe Lys
130 135 140
Leu Asn Leu Gly Thr Arg Glu Met Phe Arg Glu Asp Glu Pro Met Pro
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Glu Phe Ala Val Leu Lys Ala Leu Val Ser His Pro
165 170 175
Arg Glu Pro Leu Ser Arg Asp Lys Leu Met Asn Leu Ala Arg Gly Arg
180 185 190
Glu Tyr Ser Ala Met Glu Arg Ser Ile Asp Val Gln Ile Ser Arg Leu
195 200 205
Arg Arg Met Val Glu Glu Asp Pro Ala His Pro Arg Tyr Ile Gln Thr
210 215 220
Val Trp Gly Leu Gly Tyr Val Phe Val Pro Asp Gly Ser Lys Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp
245 250 255
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp
260 265 270
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
275 280
<210> 113
<211> 141
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 113
Met Val Glu Ser Tyr Lys Phe Asn Gly Trp Glu Leu Asp Ile Asn Ser
1 5 10 15
Arg Ser Leu Ile Gly Pro Asp Gly Glu Gln Tyr Lys Leu Pro Arg Ser
20 25 30
Glu Phe Arg Ala Met Leu His Phe Cys Glu Asn Pro Gly Lys Ile Gln
35 40 45
Ser Arg Ala Glu Leu Leu Lys Lys Met Thr Gly Arg Glu Leu Lys Pro
50 55 60
His Asp Arg Thr Val Asp Val Thr Ile Arg Arg Ile Arg Lys His Phe
65 70 75 80
Glu Ser Thr Pro Asp Thr Pro Glu Ile Ile Ala Thr Ile His Gly Glu
85 90 95
Gly Tyr Arg Phe Cys Gly Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
100 105 110
Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
115 120 125
Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
130 135 140
<210> 114
<211> 381
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 114
Met Gln Leu Gln Ser Met Lys Lys Glu Ile Arg His Leu His Gln Ala
1 5 10 15
Leu Ser Thr Ser Trp Gln Trp Gly His Ile Leu Thr Asn Ser Pro Ala
20 25 30
Met Met Asp Ile Cys Lys Asp Thr Ala Lys Ile Ala Leu Ser Gln Ala
35 40 45
Ser Val Leu Ile Ser Gly Glu Ser Gly Thr Gly Lys Glu Leu Ile Ala
50 55 60
Arg Ala Ile His Tyr Asn Ser Arg Arg Ala Lys Gly Pro Phe Ile Lys
65 70 75 80
Val Asn Cys Ala Ala Leu Pro Glu Ser Leu Leu Glu Ser Glu Leu Phe
85 90 95
Gly His Glu Lys Gly Ala Phe Thr Gly Ala Gln Thr Leu Arg Gln Gly
100 105 110
Leu Phe Glu Arg Ala Asn Glu Gly Thr Leu Leu Leu Asp Glu Ile Gly
115 120 125
Glu Met Pro Leu Val Leu Gln Ala Lys Leu Leu Arg Ile Leu Gln Glu
130 135 140
Arg Glu Phe Glu Arg Ile Gly Gly His Gln Thr Ile Lys Val Asp Ile
145 150 155 160
Arg Ile Ile Ala Ala Thr Asn Arg Asp Leu Gln Ala Met Val Lys Glu
165 170 175
Gly Thr Phe Arg Glu Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Asn Val Ile His Leu
180 185 190
Ile Leu Pro Pro Leu Arg Asp Arg Arg Glu Asp Ile Ser Leu Leu Ala
195 200 205
Asn His Phe Leu Gln Lys Phe Ser Ser Glu Asn Gln Arg Asp Ile Ile
210 215 220
Asp Ile Asp Pro Met Ala Met Ser Leu Leu Thr Ala Trp Ser Trp Pro
225 230 235 240
Gly Asn Ile Arg Glu Leu Ser Asn Val Ile Glu Arg Ala Val Val Met
245 250 255
Asn Ser Gly Pro Ile Ile Phe Ser Glu Asp Leu Pro Pro Gln Ile Arg
260 265 270
Gln Pro Val Cys Asn Ala Gly Glu Val Lys Thr Ala Pro Val Gly Glu
275 280 285
Arg Asn Leu Lys Glu Glu Ile Lys Arg Val Glu Lys Arg Ile Ile Met
290 295 300
Glu Val Leu Glu Gln Gln Glu Gly Asn Arg Thr Arg Thr Ala Leu Met
305 310 315 320
Leu Gly Ile Ser Arg Arg Ala Leu Met Tyr Lys Leu Gln Glu Tyr Gly
325 330 335
Ile Asp Pro Ala Asp Val Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
340 345 350
Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
355 360 365
Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
370 375 380
<210> 115
<211> 144
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 115
Met Gln Arg Glu Leu Gln Gln Gln Asp Ala Glu Ser Pro Leu Ile Ile
1 5 10 15
Asp Glu Gly Arg Phe Gln Ala Ser Trp Arg Gly Lys Met Leu Asp Leu
20 25 30
Thr Pro Ala Glu Phe Arg Leu Leu Lys Thr Leu Ser His Glu Pro Gly
35 40 45
Lys Val Phe Ser Arg Glu Gln Leu Leu Asn His Leu Tyr Asp Asp Tyr
50 55 60
Arg Val Val Thr Asp Arg Thr Ile Asp Ser His Ile Lys Asn Leu Arg
65 70 75 80
Arg Lys Leu Glu Ser Leu Asp Ala Glu Gln Ser Phe Ile Arg Ala Val
85 90 95
Tyr Gly Val Gly Tyr Arg Trp Glu Ala Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
100 105 110
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
115 120 125
Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
130 135 140
<210> 116
<211> 139
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 116
Met Glu Glu Val Ile Glu Met Gln Gly Leu Ser Leu Asp Pro Thr Ser
1 5 10 15
His Arg Val Met Ala Gly Glu Glu Pro Leu Glu Met Gly Pro Thr Glu
20 25 30
Phe Lys Leu Leu His Phe Phe Met Thr His Pro Glu Arg Val Tyr Ser
35 40 45
Arg Glu Gln Leu Leu Asn His Val Trp Gly Thr Asn Val Tyr Val Glu
50 55 60
Asp Arg Thr Val Asp Val His Ile Arg Arg Leu Arg Lys Ala Leu Glu
65 70 75 80
Pro Gly Gly His Asp Arg Met Val Gln Thr Val Arg Gly Thr Gly Tyr
85 90 95
Arg Phe Ser Thr Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
100 105 110
Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala
115 120 125
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
130 135
<210> 117
<211> 127
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 117
Met Asn Gly Tyr Cys Tyr Phe Pro Phe Ser Leu Asn Arg Phe Val Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ser Asp Gln Gln Lys Leu Asp Ser Leu Ser Lys Gln Glu
20 25 30
Ile Ser Val Met Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Lys Asp Asn Asn Asp Ile
35 40 45
Ala Glu Lys Met Phe Ile Ser Asn Lys Thr Val Ser Thr Tyr Lys Ser
50 55 60
Arg Leu Met Glu Lys Leu Glu Cys Lys Ser Leu Met Asp Leu Tyr Thr
65 70 75 80
Phe Ala Gln Arg Asn Lys Ile Gly Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe
85 90 95
Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
100 105 110
Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
115 120 125
<210> 118
<211> 390
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 118
Met Ser His Tyr Gln Glu Gln Gln Gln Pro Arg Asn Val Gln Leu Asn
1 5 10 15
Gly Pro Thr Thr Asp Ile Ile Gly Glu Ala Pro Ala Met Gln Asp Val
20 25 30
Phe Arg Ile Ile Gly Arg Leu Ser Arg Ser Ser Ile Ser Val Leu Ile
35 40 45
Asn Gly Glu Ser Gly Thr Gly Lys Glu Leu Val Ala His Ala Leu His
50 55 60
Arg His Ser Pro Arg Ala Lys Ala Pro Phe Ile Ala Leu Asn Met Ala
65 70 75 80
Ala Ile Pro Lys Asp Leu Ile Glu Ser Glu Leu Phe Gly His Glu Lys
85 90 95
Gly Ala Phe Thr Gly Ala Asn Thr Ile Arg Gln Gly Arg Phe Glu Gln
100 105 110
Ala Asp Gly Gly Thr Leu Phe Leu Asp Glu Ile Gly Asp Met Pro Leu
115 120 125
Asp Val Gln Thr Arg Leu Leu Arg Val Leu Ala Asp Gly Gln Phe Tyr
130 135 140
Arg Val Gly Gly Tyr Ala Pro Val Lys Val Asp Val Arg Ile Ile Ala
145 150 155 160
Ala Thr His Gln Asn Leu Glu Gln Arg Val Gln Glu Gly Lys Phe Arg
165 170 175
Glu Asp Leu Phe His Arg Leu Asn Val Ile Arg Val His Leu Pro Pro
180 185 190
Leu Arg Glu Arg Arg Glu Asp Ile Pro Arg Leu Ala Arg His Phe Leu
195 200 205
Gln Val Ala Ala Arg Glu Leu Gly Val Glu Ala Lys Leu Leu His Pro
210 215 220
Glu Thr Glu Ala Ala Leu Thr Arg Leu Ala Trp Pro Gly Asn Val Arg
225 230 235 240
Gln Leu Glu Asn Thr Cys Arg Trp Leu Thr Val Met Ala Ala Gly Gln
245 250 255
Glu Val Leu Ile Gln Asp Leu Pro Gly Glu Leu Phe Glu Ser Thr Val
260 265 270
Ala Glu Ser Thr Ser Gln Met Gln Pro Asp Ser Trp Ala Thr Leu Leu
275 280 285
Ala Gln Trp Ala Asp Arg Ala Leu Arg Ser Gly His Gln Asn Leu Leu
290 295 300
Ser Glu Ala Gln Pro Glu Leu Glu Arg Thr Leu Leu Thr Thr Ala Leu
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Arg His Thr Gln Gly His Lys Gln Glu Ala Ala Arg Leu Leu Gly Trp
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Gly Arg Asn Thr Leu Thr Arg Lys Leu Lys Glu Leu Gly Met Glu Pro
340 345 350
Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala
355 360 365
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
370 375 380
Phe Asp Leu Asp Met Leu
385 390
<210> 119
<211> 130
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 119
Met Gly Ser Lys Val Phe Ser Glu Arg Val Asn Gln Tyr Leu Arg Glu
1 5 10 15
Arg Glu Met Phe Gly Ala Glu Glu Asp Pro Phe Ser Val Leu Thr Glu
20 25 30
Arg Glu Leu Asp Val Leu His Glu Leu Ala Gln Gly Leu Ser Asn Lys
35 40 45
Gln Ile Ala Ser Val Leu Asn Ile Ser Glu Gln Thr Val Lys Val His
50 55 60
Ile Arg Asn Leu Leu Arg Lys Leu Asn Val Arg Ser Arg Val Ala Ala
65 70 75 80
Thr Ile Leu Phe Leu Gln Gln Arg Gly Ala Gln Pro Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe
100 105 110
Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
115 120 125
Met Leu
130
<210> 120
<211> 146
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 120
Met Arg Arg His Asn Asn Gln Gly Glu Ser Glu Leu Ile Val Gly Asn
1 5 10 15
Leu Thr Leu Asn Met Gly Arg Arg Gln Val Trp Met Gly Gly Glu Glu
20 25 30
Leu Ile Leu Thr Pro Lys Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Arg Leu Met Leu
35 40 45
Lys Ala Gly Ser Pro Val His Arg Glu Ile Leu Tyr Asn Asp Ile Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Leu Arg Asp Lys Val Gly Lys Ala Arg Ile Arg Thr Val Arg Gly
85 90 95
Phe Gly Tyr Met Leu Val Ala Asn Glu Glu Asn Pro Ala Asp Ala Leu
100 105 110
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe
115 120 125
Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
130 135 140
Met Leu
145
<210> 121
<211> 163
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 121
Met Gln Glu Arg Ser Lys Gln Asp Val Ser Leu Leu Pro Glu Asn Gln
1 5 10 15
Gln Ala Leu Lys Phe Ile Pro Cys Thr Gly His Ser Arg Ile Tyr Leu
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Leu Gln Met Lys Asp Val Ala Phe Val Ser Ser Arg Met Ser Gly Val
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Arg Tyr Leu Lys Ser Leu Lys Glu Ala Ile Gly Leu Pro Ala Asp Ala
115 120 125
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
130 135 140
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
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Asp Met Leu
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<211> 157
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 122
Met Arg Arg Ser His Trp Ser Glu Gln Gln Gln Asn Asn Asp Asn Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Leu Glu Val Asp Ala Leu Val Leu Asn Pro Gly Arg Gln
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Ala Ile Asp Met His Ile Ser Asn Leu Arg Arg Lys Leu Pro Asp
85 90 95
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100 105 110
Leu Met Val Ser Ala Ser Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
115 120 125
Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
130 135 140
Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
145 150 155
<210> 123
<211> 150
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 123
Met Arg Arg Val Lys Lys Phe Ser Thr Pro Ser Pro Val Ile Arg Ile
1 5 10 15
Gly His Phe Glu Leu Asn Glu Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Phe Asp
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Thr Pro Leu Ala Leu Thr Arg Tyr Glu Phe Leu Leu Leu Lys Thr Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala
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Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
130 135 140
Phe Asp Leu Asp Met Leu
145 150
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<211> 151
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 124
Met Arg Arg Gly Ala Ala Val Ile Ile Glu Ser Gln Phe Gln Val Ala
1 5 10 15
Asp Leu Met Val Asp Leu Val Ser Arg Lys Val Thr Arg Ser Gly Thr
20 25 30
Arg Ile Thr Leu Thr Ser Lys Glu Phe Thr Leu Leu Glu Phe Phe Leu
35 40 45
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50 55 60
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Lys Arg Leu Arg Gly Lys Ile Asp Asn Asp Phe Glu Pro Lys Leu Ile
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100 105 110
Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp
115 120 125
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp
130 135 140
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
145 150
<210> 125
<211> 158
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 125
Met Gln Lys Lys Met Ala Leu Glu Lys His Gln Tyr Tyr Asp Gln Ala
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gln Leu Ile His Gly Ser Ser Ser Asn Glu Gln Asp Pro
20 25 30
Arg Arg Leu Pro Lys Gly Leu Thr Pro Gln Thr Leu Arg Thr Leu Cys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Trp Leu Val Asn Cys His Ile Leu Phe Thr Ser Ile His Tyr Gly Val
85 90 95
Thr Gly Arg Pro Val Tyr Arg Tyr Arg Ile Gln Ala Glu His Tyr Ser
100 105 110
Leu Leu Lys Gln Tyr Cys Gln Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
115 120 125
Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
130 135 140
Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
145 150 155
<210> 126
<211> 144
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 126
Met Gln Arg Lys His Met Leu Glu Ser Ile Asp Ser Ala Ser Gln Lys
1 5 10 15
Gln Ile Asp Glu Met Phe Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Glu Pro Lys Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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Ala Ser Arg His Leu Ile Ile Ala Glu Ile Val His Gly Lys Val Gly
85 90 95
Arg Pro Gln Arg Ile Tyr His Ser Gly Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
100 105 110
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
115 120 125
Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
130 135 140
<210> 127
<211> 362
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 127
Met Gln Ser Ala Pro Ala Thr Asp Glu Arg Trp Arg Glu Ala Ile Val
1 5 10 15
Thr Arg Ser Pro Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu Gln Ala Arg Leu Val
20 25 30
Ala Gln Ser Asp Val Ser Val Leu Ile Asn Gly Gln Ser Gly Thr Gly
35 40 45
Lys Glu Ile Phe Ala Gln Ala Ile His Asn Ala Ser Pro Arg Asn Ser
50 55 60
Lys Pro Phe Ile Ala Ile Asn Cys Gly Ala Leu Pro Glu Gln Leu Leu
65 70 75 80
Glu Ser Glu Leu Phe Gly His Ala Arg Gly Ala Phe Thr Gly Ala Val
85 90 95
Ser Asn Arg Glu Gly Leu Phe Gln Ala Ala Glu Gly Gly Thr Leu Phe
100 105 110
Leu Asp Glu Ile Gly Asp Met Pro Ala Pro Leu Gln Val Lys Leu Leu
115 120 125
Arg Val Leu Gln Glu Arg Lys Val Arg Pro Leu Gly Ser Asn Arg Asp
130 135 140
Ile Asp Ile Asn Val Arg Ile Ile Ser Ala Thr His Arg Asp Leu Pro
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Lys Ala Met Ala Arg Gly Glu Phe Arg Glu Asp Leu Tyr Tyr Arg Leu
165 170 175
Asn Val Val Ser Leu Lys Ile Pro Ala Leu Ala Glu Arg Thr Glu Asp
180 185 190
Ile Pro Leu Leu Ala Asn His Leu Leu Arg Gln Ala Ala Glu Arg His
195 200 205
Lys Pro Phe Val Arg Ala Phe Ser Thr Asp Ala Met Lys Arg Leu Met
210 215 220
Thr Ala Ser Trp Pro Gly Asn Val Arg Gln Leu Val Asn Val Ile Glu
225 230 235 240
Gln Cys Val Ala Leu Thr Ser Ser Pro Val Ile Ser Asp Ala Leu Val
245 250 255
Glu Gln Ala Leu Glu Gly Glu Asn Thr Ala Leu Pro Thr Phe Val Glu
260 265 270
Ala Arg Asn Gln Phe Glu Leu Asn Tyr Leu Arg Lys Leu Leu Gln Ile
275 280 285
Thr Lys Gly Asn Val Thr His Ala Ala Arg Met Ala Gly Arg Asn Arg
290 295 300
Thr Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Ser Arg His Glu Leu Asp Ala Asn Asp
305 310 315 320
Phe Lys Glu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
325 330 335
Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp
340 345 350
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
355 360
<210> 128
<211> 147
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 128
Met Gln His His Ala Leu Asn Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly Leu Arg
1 5 10 15
Met Asp Ser Val Ser His Ser Val Ser Arg Asp Asn Ile Ser Ile Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Ala Lys Val Asp Asp Pro Phe Pro Glu Lys Leu Ile Ala Thr Ile
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Arg Gly Met Gly Tyr Ser Phe Val Ala Val Lys Lys Pro Ala Asp Ala
100 105 110
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
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Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
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Asp Met Leu
145
<210> 129
<211> 147
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 129
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1 5 10 15
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Asn Asn Gly Lys Val Val Ser Lys Asp Ser Leu Met Leu Gln Leu Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gln Ala Gln Tyr Pro Gln Glu Val Ile Thr
85 90 95
Thr Val Arg Gly Gln Gly Tyr Leu Phe Glu Leu Arg Pro Ala Asp Ala
100 105 110
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
115 120 125
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
130 135 140
Asp Met Leu
145
<210> 130
<211> 142
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 130
Met Arg Thr Asn Gly Gln Ala Ser Asn Glu Leu Arg His Gly Asn Val
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Met Leu Asp Pro Gly Lys Arg Ile Ala Thr Leu Ala Gly Glu Pro Leu
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Thr Leu Lys Pro Lys Glu Phe Ala Leu Leu Glu Leu Leu Met Arg Asn
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Leu Arg Arg Lys Leu Gly Ser Asp Phe Ile Arg Thr Val His Gly Ile
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Gly Tyr Thr Leu Gly Glu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
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Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
115 120 125
Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
130 135 140
<210> 131
<211> 131
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 131
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50 55 60
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Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
100 105 110
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Asp Met Leu
130
<210> 132
<211> 163
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 132
Met Arg Gln Asn Glu Gln Ala Thr Leu Thr Lys Gly Leu Gln Glu Thr
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Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
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Asp Met Leu
<210> 133
<211> 120
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 133
Met Thr Gly Gly Cys Tyr Leu Thr Pro Asp Ile Ala Ile Lys Leu Ala
1 5 10 15
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Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
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<210> 134
<211> 168
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 134
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala
130 135 140
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
165
<210> 135
<211> 359
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 135
Met His Thr His Ser Ile Asp Ala Glu Thr Pro Ala Val Thr Ala Ser
1 5 10 15
Gln Phe Gly Met Val Gly Lys Ser Pro Ala Met Gln His Leu Leu Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
His Arg Asp Leu Ala Ala Glu Val Asn Ala Gly Arg Phe Arg Gln Asp
165 170 175
Leu Tyr Tyr Arg Leu Asn Val Val Ala Ile Glu Val Pro Ser Leu Arg
180 185 190
Gln Arg Arg Glu Asp Ile Pro Leu Leu Ala Gly His Phe Leu Gln Arg
195 200 205
Phe Ala Glu Arg Asn Arg Lys Ala Val Lys Gly Phe Thr Pro Gln Ala
210 215 220
Met Asp Leu Leu Ile His Tyr Asp Trp Pro Gly Asn Ile Arg Glu Leu
225 230 235 240
Glu Asn Ala Val Glu Arg Ala Val Val Leu Leu Thr Gly Glu Tyr Ile
245 250 255
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260 265 270
Gly Gln Ser Gln Asp Ile Gln Pro Leu Val Glu Val Glu Lys Glu Val
275 280 285
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Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
355
<210> 136
<211> 401
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Met Ala His Val Ser Ser Glu Thr Gln Asp Val Ser Pro Lys Asp Glu
1 5 10 15
Leu Thr Ala Ser Glu Ala Ser Thr Arg Ser Pro Leu Cys Glu His Thr
20 25 30
Phe Pro Gly Asp Ser Asp Leu Arg Ser Met Ile Glu Glu His Ala Phe
35 40 45
Gln Val Leu Ser Gln Gly Ser Leu Leu Glu Ser Pro Ser Tyr Thr Val
50 55 60
Cys Val Ser Glu Pro Asp Lys Asp Asp Asp Phe Leu Ser Leu Asn Phe
65 70 75 80
Pro Arg Lys Leu Trp Lys Ile Val Glu Ser Asp Gln Phe Lys Ser Ile
85 90 95
Ser Trp Asp Glu Asn Gly Thr Cys Ile Val Ile Asn Glu Glu Leu Phe
100 105 110
Lys Lys Glu Ile Leu Glu Thr Lys Ala Pro Tyr Arg Ile Phe Gln Thr
115 120 125
Asp Ala Ile Lys Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Leu Tyr Gly Phe Ser
130 135 140
Lys Ile Gln Gln Asn Phe Gln Arg Ser Ala Phe Leu Ala Thr Phe Leu
145 150 155 160
Ser Glu Glu Lys Glu Ser Ser Val Leu Ser Lys Leu Lys Phe Tyr Tyr
165 170 175
Asn Pro Asn Phe Lys Arg Gly Tyr Pro Gln Leu Leu Val Arg Val Lys
180 185 190
Arg Arg Ile Gly Val Lys Asn Ala Ser Pro Ile Ser Thr Leu Phe Asn
195 200 205
Glu Asp Phe Asn Lys Lys His Phe Arg Ala Gly Ala Asn Met Glu Asn
210 215 220
His Asn Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Ser Glu Glu Ser Leu Phe Ser
225 230 235 240
Ala Ser Lys Asn Leu Asn Met Pro Leu Thr Arg Glu Ser Ser Val Arg
245 250 255
Gln Ile Ile Ala Asn Ser Ser Val Pro Ile Arg Ser Gly Phe Pro Pro
260 265 270
Pro Ser Pro Ser Thr Ser Val Gly Pro Ser Glu Gln Ile Ala Thr Asp
275 280 285
Gln His Ala Ile Leu Asn Gln Leu Thr Thr Ile His Met His Ser His
290 295 300
Ser Thr Tyr Met Gln Ala Arg Gly His Ile Val Asn Phe Ile Thr Thr
305 310 315 320
Thr Thr Ser Gln Tyr His Ile Ile Ser Pro Leu Gln Asn Gly Tyr Phe
325 330 335
Gly Leu Thr Val Glu Pro Ser Ala Val Pro Thr Arg Tyr Pro Leu Val
340 345 350
Ser Val Asn Glu Ala Pro Tyr Arg Asn Met Leu Pro Ala Gly Asn Pro
355 360 365
Trp Leu Gln Met Pro Thr Ile Ala Asp Arg Ser Ala Ala Pro His Ser
370 375 380
Arg Leu Ala Leu Gln Pro Ser Pro Leu Asp Lys Tyr His Pro Asn Tyr
385 390 395 400
Asn
<210> 137
<211> 272
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Met Asn Ser Asp Ser Ser Ser Val Ser Ser Arg Ala Ser Ser Pro Asp
1 5 10 15
Met Asp Glu Met Tyr Leu Arg Asp His His His Arg His His His His
20 25 30
Gln Glu Ser Arg Leu Asn Ser Val Ser Ser Thr Gln Gly Asp Met Met
35 40 45
Gln Lys Met Pro Gly Glu Ser Leu Ser Arg Ala Gly Ala Lys Ala Ala
50 55 60
Gly Glu Ser Ser Lys Tyr Lys Ile Lys Lys Gln Leu Ser Glu Gln Asp
65 70 75 80
Leu Gln Gln Leu Arg Leu Lys Ile Asn Gly Arg Glu Arg Lys Arg Met
85 90 95
His Asp Leu Asn Leu Ala Met Asp Gly Leu Arg Glu Val Met Pro Tyr
100 105 110
Ala His Gly Pro Ser Val Arg Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu
115 120 125
Leu Ala Arg Asn Tyr Ile Leu Met Leu Thr Ser Ser Leu Glu Glu Met
130 135 140
Lys Arg Leu Val Gly Glu Ile Tyr Gly Gly His His Ser Ala Phe His
145 150 155 160
Cys Gly Thr Val Gly His Ser Ala Gly His Pro Ala His Ala Ala Asn
165 170 175
Ser Val His Pro Val His Pro Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Ser Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Leu Pro Ala Ile Gly Thr
195 200 205
Ile Arg Pro Pro His Ser Leu Leu Lys Ala Pro Ser Thr Pro Pro Ala
210 215 220
Leu Gln Leu Gly Ser Gly Phe Gln His Trp Ala Gly Leu Pro Cys Pro
225 230 235 240
Cys Thr Ile Cys Gln Met Pro Pro Pro Pro His Leu Ser Ala Leu Ser
245 250 255
Thr Ala Asn Met Ala Arg Leu Ser Ala Glu Ser Lys Asp Leu Leu Lys
260 265 270
<210> 138
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Met Asp Asn Leu Arg Glu Thr Phe Leu Ser Leu Glu Asp Gly Leu Gly
1 5 10 15
Ser Ser Asp Ser Pro Gly Leu Leu Ser Ser Trp Asp Trp Lys Asp Arg
20 25 30
Ala Gly Pro Phe Glu Leu Asn Gln Ala Ser Pro Ser Gln Ser Leu Ser
35 40 45
Pro Ala Pro Ser Leu Glu Ser Tyr Ser Ser Ser Pro Cys Pro Ala Val
50 55 60
Ala Gly Leu Pro Cys Glu His Gly Gly Ala Ser Ser Gly Gly Ser Glu
65 70 75 80
Gly Cys Ser Val Gly Gly Ala Ser Gly Leu Val Glu Val Asp Tyr Asn
85 90 95
Met Leu Ala Phe Gln Pro Thr His Leu Gln Gly Gly Gly Gly Pro Lys
100 105 110
Ala Gln Lys Gly Thr Lys Val Arg Met Ser Val Gln Arg Arg Arg Lys
115 120 125
Ala Ser Glu Arg Glu Lys Leu Arg Met Arg Thr Leu Ala Asp Ala Leu
130 135 140
His Thr Leu Arg Asn Tyr Leu Pro Pro Val Tyr Ser Gln Arg Gly Gln
145 150 155 160
Pro Leu Thr Lys Ile Gln Thr Leu Lys Tyr Thr Ile Lys Tyr Ile Gly
165 170 175
Glu Leu Thr Asp Leu Leu Asn Arg Gly Arg Glu Pro Arg Ala Gln Ser
180 185 190
Ala
<210> 139
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 139
gaaatagcgc tgtacagcgt atgggaatct cttgtacggt gtacgagtat cttcccgtac 60
accgtac 67
<210> 140
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 140
catgtgattg aatataaccg acgtgactgt tacatttagg gg 42
<210> 141
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 141
tactgtatat atatacagta tactgtatat atatacagta 40
<210> 142
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 142
tacccctata ggggtatagc gccggctacc cctatagggg tat 43
<210> 143
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 143
tacccctata ggggtatagc gccggctacc cctatagggg tattacccct ataggggtat 60
agcgccggct acccctatag gggta 85
<210> 144
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 144
wakrrkta 8
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 145
atttacattt tgaaacatct a 21
<210> 146
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 146
wahatgwwac maarwdtww 19
<210> 147
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 147
atgttaataa 10
<210> 148
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 148
atgttaataa tatgtggcat aagcgttaaa tg 32
<210> 149
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
wamawwtwrt taama 15
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
gctatgcaga aatttgcaca 20
<210> 151
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
ttctycmyda tyksyks 17
<210> 152
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 152
tgtcataaaa ctgtcatatt ccttacatat aactgtca 38
<210> 153
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 153
ctgwcayaaa wctgwm 16
<210> 154
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 154
ttcttacgcc tgtaggatta gtaagaa 27
<210> 155
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 155
tkcytacamc tgtarga 17
<210> 156
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 156
tgcaccawww tggtgca 17
<210> 157
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 157
tgcmcyaaaa tsgtgca 17
<210> 158
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(1)
<223> n是a、c、g或t
<400> 158
ntaccccta 9
<210> 159
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 159
mtacyyct 8
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (10)..(11)
<223> n是a、c、g或t
<400> 160
cttaaggttn ncttaaggtt 20
<210> 161
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (2)..(2)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 混合_特征
<222> (4)..(4)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 混合_特征
<222> (10)..(10)
<223> n是a、c、g或t
<400> 161
ancnctaaan t 11
<210> 162
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (6)..(10)
<223> n是a、c、g或t
<400> 162
gtaaannnnn gtaaa 15
<210> 163
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 163
gtaaarmwry gwaar 15
<210> 164
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (6)..(11)
<223> n是a、c、g或t
<400> 164
ttcacnnnnn nttcac 16
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (11)..(12)
<223> n是a、c、g或t
<400> 165
aaaatgacaa nnttgtcatt ttt 23
<210> 166
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 166
tgattacaaa actttaaaaa gtgctg 26
<210> 167
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
tgattacaaa actttaaaaa gtgctgcata gcgccggccg cgcctgatta caaaacttta 60
aaaagtgctg 70
<210> 168
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
tgattacaaa actttaaaaa gtgctgtagc gccggctgat tacaaaactt taaaaagtgc 60
tg 62
<210> 169
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 169
tkwwttwaat twykwwa 17
<210> 170
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 170
gatctattct ttt 13
<210> 171
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 171
tatctttttt tat 13
<210> 172
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (5)..(14)
<223> n是a、c、g或t
<400> 172
tgtcnnnnnn nnnngaca 18
<210> 173
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (9)..(9)
<223> n是a、c、g或t
<400> 173
cattacaant tgtaatg 17
<210> 174
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (7)..(11)
<223> n是a、c、g或t
<400> 174
catgaannnn ntgttta 17
<210> 175
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 175
wrtttaksww yygttta 17
<210> 176
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (7)..(11)
<223> n是a、c、g或t
<400> 176
rttaamnnnn nrttaam 17
<210> 177
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 177
taagaatatt ccta 14
<210> 178
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 178
awymrgaykw wtyt 14
<210> 179
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(2)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 混合_特征
<222> (7)..(12)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 混合_特征
<222> (17)..(18)
<223> n是a、c、g或t
<400> 179
nntacannnn nntactnn 18
<210> 180
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 180
kwcwtwtvgt taca 14
<210> 181
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 181
ggcaaaacta agaaattttc caggttttgc c 31
<210> 182
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 182
ggcatttcat 10
<210> 183
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 183
gcgagtcaaa aaaactca 18
<210> 184
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 混合_特征
<222> (7)..(9)
<223> n是a、c、g或t
<400> 184
ttcgaannnt tcgaa 15
<210> 185
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 185
rcrttcgaaa crttcgaww 19
<210> 186
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 186
rttcgaahsd ttcgaay 17
<210> 187
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 187
rcattcyaaa cattcyahw 19
<210> 188
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 188
rttcgaaysd ttcgaay 17
<210> 189
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 189
accatatgtt 10
<210> 190
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 190
rccatatgkt 10
<210> 191
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 191
avcakmtgtt 10
<210> 192
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 192
rccatatgkt 10
<210> 193
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 193
accatatgkt 10
<210> 194
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 194
amcakmtgtt 10
<210> 195
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 195
accatatgkt 10
<210> 196
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 196
amcatatgby 10
<210> 197
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 197
srccawwtgk ys 12
<210> 198
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 198
brccawwtgk yv 12
<210> 199
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 199
agatcaaagg gggta 15
<210> 200
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 200
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta agatcaaagg gggta 45
<210> 201
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 201
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta 60
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta 90
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 202
cgcgccgacc acgtggtcca 20
<210> 203
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 203
cgcgccgacc acgtggtcga ccacgtggtc ca 32
<210> 204
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 204
cgcgccgacc acgtggtcga ccacgtggtc gaccacgtgg tcca 44
<210> 205
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 205
gaccttgagt acgtgcgtct ctgcacgtat g 31
<210> 206
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 206
gaccttgagt acgtgcgtct ctgcacgtat ggaccttgag tacgtgcgtc tctgcacgta 60
tg 62
<210> 207
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 207
gaccttgagt acgtgcgtct ctgcacgtat ggaccttgag tacgtgcgtc tctgcacgta 60
tggaccttga gtacgtgcgt ctctgcacgt atg 93
<210> 208
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 208
tgtttattgt ttattgttta t 21
<210> 209
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 209
tgtttattgt ttattgttta ttgtttattg tttattgttt at 42
<210> 210
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 210
gcaaagcaaa cagcaaagca aacagcaaag caaaca 36
<210> 211
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 211
gcaaagcaaa cagcaaagca aacagcaaag caaacagcaa agcaaacagc aaagcaaaca 60
gcaaagcaaa ca 72
<210> 212
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 212
tgtttgcttt gctgtttgct ttgctgtttg ctttgc 36
<210> 213
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 213
tgtttgcttt gctgtttgct ttgctgtttg ctttgctgtt tgctttgctg tttgctttgc 60
tgtttgcttt gc 72
<210> 214
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 214
gaacacccag aacacccaga acacccagaa cacccagaac acccagaaca cccagaacac 60
ccagaacacc ca 72
<210> 215
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 215
gaacacccag aacacccaga acacccagaa cacccagaac acccagaaca ccca 54
<210> 216
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 216
agttaataat ttaac 15
<210> 217
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 217
agttaataat ttaacagtta ataatttaac 30
<210> 218
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 218
agttaataat ttaacagtta ataatttaac agttaataat ttaac 45
<210> 219
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 219
agttaataat ttaacagtta ataatttaac agttaataat ttaacagtta ataatttaac 60
<210> 220
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 220
ctacacaaag ccctctgtgt aagactacac aaagccctct gtgtaaga 48
<210> 221
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 221
ctacacaaag ccctctgtgt aagactacac aaagccctct gtgtaagact acacaaagcc 60
ctctgtgtaa ga 72
<210> 222
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 222
ctacacaaag ccctctttgt gagactacac aaagccctct ttgtgaga 48
<210> 223
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 223
ctacacaaag ccctctttgt gagactacac aaagccctct ttgtgagact acacaaagcc 60
ctctttgtga ga 72
<210> 224
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 224
ccattgttct ccattgttct ccattgttct 30
<210> 225
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 225
ccattgttct ccattgttct ccattgttct ccattgttct ccattgttct ccattgttct 60
<210> 226
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 226
aacaaagaac aaagaacaaa gaacaaag 28
<210> 227
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 227
aaccgttaaa cggttaaccg ttaaacggtt aaccgttaaa cggtt 45
<210> 228
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 228
agagatattt agtgaatcag caagtggaac caaaaagact tgaggactga ttggatgagg 60
agaggttag 69
<210> 229
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 229
agagatattt agtgaatcag caagtggaac caaaaagact tgaggactga ttggatgagg 60
agaggttaga gagatattta gtgaatcagc aagtggaacc aaaaagactt gaggactgat 120
tggatgagga gaggttag 138
<210> 230
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 230
actggtgccc tcctcaactc ccacctgcat ctggggccca tactggttgg ctcccgcggt 60
gccatgtctg cagtgtgccc cccagccccg g 91
<210> 231
<211> 182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 231
actggtgccc tcctcaactc ccacctgcat ctggggccca tactggttgg ctcccgcggt 60
gccatgtctg cagtgtgccc cccagccccg gactggtgcc ctcctcaact cccacctgca 120
tctggggccc atactggttg gctcccgcgg tgccatgtct gcagtgtgcc ccccagcccc 180
gg 182
<210> 232
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 232
cgcgccgacc acgtggtcga ccacgtggtc cacgcgccga ccacgtggtc gaccacgtgg 60
tccacgcgcc gaccacgtgg tcgaccacgt ggtccacgcg ccgaccacgt ggtcgaccac 120
gtggtcca 128
<210> 233
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 233
gtcacgtggc tcagtcacgt ggctcagtca cgtggctcag tcacgtggc 49
<210> 234
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 234
gtcacgtggc tcagtcacgt ggctcagtca cgtggctcag tcacgtggcg tcacgtggct 60
cagtcacgtg gctcagtcac gtggctcagt cacgtggc 98
<210> 235
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 235
gaccacgtgg tcgaccacgt ggtcgaccac gtggtcgacc acgtggtc 48
<210> 236
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 236
gaccacgtgg tcgaccacgt ggtcgaccac gtggtcgacc acgtggtcga ccacgtggtc 60
gaccacgtgg tcgaccacgt ggtcgaccac gtggtc 96
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<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 237
cctctacccc ctttgatctt accccctttg atcttacccc ctttgatctt accccctttg 60
atcttacccc ctttgatctt accccctttg atcttacccc ctttgatctt accccctttg 120
atct 124
<210> 238
<211> 514
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 238
ggcctgaaat aacctctgaa agaggaactt ggttaggtac cttctgaggc tgaaagaacc 60
agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 120
gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc 180
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccactgc 240
agtttgagga gaatatttgt tatatttgca aaataaaata agtttgcaag tttttttttt 300
ctgccccaaa gagctctgtg tccttgaaca taaaatacaa ataaccgcta tgctgttaat 360
tattggcaaa tgtcccattt tcaacctaag gaaataccat aaagtaacag atataccaac 420
aaaaggttac tagttaacag gcattgcctg aaaagagtat aaaagaattt cagcatgatt 480
ttccatattg tgcttccacc actgccaata acac 514
<210> 239
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 239
ctgtgtcctt gaacataaaa tacaaataac cgctatgctg ttaattattg gcaaatgtcc 60
cattttcaac ctaaggaaat accataaagt aacagatata ccaacaaaag gttactagtt 120
aacaggcatt gcctgaaaag agtataaaag aatttcagca tgattttcca tattgtgctt 180
ccaccactgc caataacac 199
<210> 240
<211> 1150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 240
aaattagttt tgaatctttc taataccaaa gttcagttta ctgttccatg ttgcttctga 60
gtggcttcac agacttatga aaaagtaaac ggaatcagaa ttacatcaat gcaaaagcat 120
tgctgtgaac tctgtactta ggactaaact ttgagcaata acacatatag attgaggatt 180
gtttgctgtt agtatacaaa ctctggttca aagctcctct ttattgcttg tcttggaaaa 240
tttgctgttc ttcatggttt ctcttttcac tgctatctat ttttctcaac cactcacatg 300
gctacaataa ctgtctgcaa gcttatgatt cccaaatatc tatctctagc ctcaatcttg 360
ttccagaaga taaaaagtag tattcaaatg cacatcaacg tctccacttg gagggcttaa 420
agacgtttca acatacaaac cggggagttt tgcctggaat gtttcctaaa atgtgtcctg 480
tagcacatag ggtcctcttg ttccttaaaa tctaattact tttagcccag tgctcatccc 540
acctatgggg agatgagagt gaaaagggag cctgattaat aattacacta agtcaatagg 600
catagagcca ggactgtttg ggtaaactgg tcactttatc ttaaactaaa tatatccaaa 660
actgaacatg tacttagtta ctaagtcttt gactttatct cattcatacc actcagcttt 720
atccaggcca cttatttgac agtattattg cgaaaacttc ctaactggtc tccttatcat 780
agtcttatcc ccttttgaaa caaaagagac agtttcaaaa tacaaatatg atttttatta 840
gctccctttt gttgtctata atagtcccag aaggagttat aaactccatt taaaaagtct 900
ttgagatgtg gcccttgcca actttgccag gctgtgtcct tgaacataaa atacaaataa 960
ccgctatgct gttaattatt ggcaaatgtc ccattttcaa cctaaggaaa taccataaag 1020
taacagatat accaacaaaa ggttactagt taacaggcat tgcctgaaaa gagtataaaa 1080
gaatttcagc atgattttcc caagtttgct tatttatgaa aagttatcga taatttcttt 1140
agttttgtat 1150
<210> 241
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 241
tccctgccca cccgcggaaa ccgccccagg tgggccgcgc cccctcccca gcagccagca 60
gggcgccagg gctgagccgg ccgtggaggg gagcgggtcc cgcgggttat acaggcgccg 120
gggctccgcg gcaggcaaga gaagctgagg cctgagaacg gcccgggcct tggcgtacgg 180
caggggacga cctgggatgg gggcagcggg cggcggcgca gggagtgggc cgggggccgg 240
tgtgcgcggg cgggacgggg cccggggtcg ggagaccacc gctcggaaga tggggccggg 300
agaggccgcc gtcgcagcgc agagggcacc ggcggggaga cgcgaggacg cggggccggg 360
aacacggacg ccggagtaga agcgcggggg gcgcgggctg gagcgggggc ggggacgccg 420
gggtcggggg cggtgcgggt ttgaggggag ggggcggggc gggtccttcc ctgggggggt 480
ggggagaggg ggcgggggcc catgtgaccg gctcagaccg gttctggaga caaaaggggc 540
cgcggcggcc ggagcgggac gggcccggcg cgggagggag cgaagcagcg cgggcagcga 600
gcgagtgag 609
<210> 242
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 242
accaccgctc ggaagatggg gccgggagag gccgccgtcg cagcgcagag ggcaccggcg 60
gggagacgcg aggacgcggg gccgggaaca cggacgccgg agtagaagcg cggggggcgc 120
gggctggagc gggggcgggg acgccggggt cgggggcggt gcgggtttga ggggaggggg 180
cggggcgggt ccttccctgg gggggtgggg agagggggcg ggggcccatg tgaccggctc 240
agaccggttc tggagacaaa aggggccgcg gcggccggag cgggacgggc ccggcgcggg 300
agggagcgaa gcagcgcgg 319
<210> 243
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 243
ccgcggcggc cggagcggga cgggcccggc gcgggaggga gcgaagcagc gcgggcagcg 60
agcgagtgag 70
<210> 244
<211> 1511
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 244
ggagtctcac tctgtcgccc aagctggagt gcagtagtgc gatctcagct cactgcaacc 60
tctgccctct gagttcaagt gattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggattacag 120
gcgcctgcca ccgcgcccag ctaatttttt gtatttttgg tagagacggg gtttcaccat 180
cttggccagg ctggtcttga actcctgacc tcatgatcca cccgcctcgg cttcccaaag 240
tgctgggatt acaggcgtga gccaccgtgc ctggcctaaa gaactggatt tctaatggtg 300
aaatctaagc aggagaggtg ggatttgggt gtaggatacc tttcaaatag ccttctactc 360
catctatgaa ataggctagc tttggctcag taaatttgct gtgtaatgat tttctaatga 420
gttaggctgg ctttaagccc ctggttattt cgttgtaacc agttaggctt tgcctcttga 480
agggccacct gggactgtcg tgcagtagat tttcttttaa cgccccagaa tcaggtgctt 540
tctctgactt tgtgtggctc tactgaatca aatctagcaa gccacagagg ctttcagact 600
tttaagatac aatattcaaa ggtgaggcag gctgtgaaaa gcccagcggt ccctggctgt 660
ccctgaacgc gactatttgc aggttggctt tgagaacccg gtcagagctg cgttaggaaa 720
acggttcccg ggaagctcct cagagagtag aatgaggagg tggattttgt gtgaaggaac 780
accttgtgtg gctctggtgg ccaggaaaga gctggcacaa gctgaaagaa ggcctgtggc 840
gaagcggagg gggacctaag tcagggaccc ccacctgccc ccaggaagga tgaaaaggag 900
acaaaaatcc taaagggaaa agccctccag gctgtaggcc aatgagcggc gggaaggagg 960
agtgaggctg gggaacttct cccagagcca gtcagagcgg acggctgctg ggaagccaat 1020
cagcgcgctc gagcctgcag cccctctgca gtagttatgc cagagcgccc tgtgtagagc 1080
ggctgcgagc gggcagctgg gctcggctgc cgggagccac cgcgcgggct ccgcaccctc 1140
ctctcgcact gccttcgccc ggtccccgcg ccgcggtgcc ccagtggccc ccgccgcgct 1200
ccacgccgcg cccccgcacc ccgccggcta ccggccgcac aaccgccacc gccccctggc 1260
cgcgcggctc gcctcgcccc gccccgtccc tcctcgcccc gccccacccc agtcagcccc 1320
gccctgcccc gcgccgccaa gcggttcccg ccctcgccca gcgcccaggt agctgcgagg 1380
aaacttttgc agcggctggg tagcagcacg tctcttgctc ctcagggcca ctgccaggct 1440
tgccgagtcc tgggactgct ctcgctccgg ctgccactct cccgcgctct cctagctccc 1500
tgcgaagcag g 1511
<210> 245
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 245
ggagaggtgg gatttgggtg taggatacct ttcaaatagc cttctactcc atctatgaaa 60
taggctagct ttggctcagt aaatttgctg tgtaatgatt ttctaatgag ttaggctggc 120
tttaagcccc tggttatttc gttgtaacca gttaggcttt gcctcttgaa gggccacctg 180
ggactgtcgt gcagtagatt ttcttttaac gccccagaat caggtgcttt ctctgacttt 240
gtgtggctct actgaatcaa atctagcaag ccacagaggc tttcagactt ttaagataca 300
atattcaaag gtgaggcagg ctgtgaaaag cccagcggtc cctggctgtc cctgaacgcg 360
actatttgca ggttggcttt gagaacccgg tcagagctgc gttaggaaaa cggttcccgg 420
gaagctcctc agagagtaga atgaggaggt ggattttgtg tgaaggaaca ccttgtgtgg 480
ctctggtggc caggaaagag ctggcacaag ctgaaagaag gcctgtggcg aagcggaggg 540
ggacctaagt cagggacccc cacctgcccc caggaaggat gaaaaggaga caaaaatcct 600
aaagggaaaa gccctccagg ctgtaggcca atgagcggcg ggaaggagga gtgaggctgg 660
ggaacttctc ccagagccag tcagagcgga cggctgctgg gaagccaatc agcgcgctcg 720
agcctgcagc ccctctgcag tagttatgcc agagcgccct gtgtagagcg gctgcgagcg 780
ggcagctggg ctcggctgcc gggagccacc gcgcgggctc cgcaccctcc tctcgcactg 840
ccttcgcccg gtccccgcgc cgcggtgccc cagtggcccc cgccgcgctc cacgccgcgc 900
ccccgcaccc cgccggctac cggccgcaca accgccaccg ccccctggcc gcgcggctcg 960
cctcgccccg ccccgtccct cctcgccccg ccccacccca gtcagccccg ccctgccccg 1020
cgccgccaag cggttcccgc cctcgcccag cgcccaggta gctgcgagga aacttttgca 1080
gcggctgggt agcagcacgt ctcttgctcc tcagggccac tgccaggctt gccgagtcct 1140
gggactgctc tcgctccggc tgccactctc ccgcgctctc ctagctccct gcgaagcagg 1200
<210> 246
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 246
aaagggaaaa gccctccagg ctgtaggcca atgagcggcg ggaaggagga gtgaggctgg 60
ggaacttctc ccagagccag tcagagcgga cggctgctgg gaagccaatc agcgcgctcg 120
agcctgcagc ccctctgcag tagttatgcc agagcgccct gtgtagagcg gctgcgagcg 180
ggcagctggg ctcggctgcc gggagccacc gcgcgggctc cgcaccctcc tctcgcactg 240
ccttcgcccg gtccccgcgc cgcggtgccc cagtggcccc cgccgcgctc cacgccgcgc 300
ccccgcaccc cgccggctac cggccgcaca accgccaccg ccccctggcc gcgcggctcg 360
cctcgccccg ccccgtccct cctcgccccg ccccacccca gtcagccccg ccctgccccg 420
cgccgccaag cggttcccgc cctcgcccag cgcccaggta gctgcgagga aacttttgca 480
gcggctgggt agcagcacgt ctcttgctcc tcagggccac tgccaggctt gccgagtcct 540
gggactgctc tcgctccggc tgccactctc ccgcgctctc ctagctccct gcgaagcagg 600
<210> 247
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 247
ccccgcaccc cgccggctac cggccgcaca accgccaccg ccccctggcc gcgcggctcg 60
cctcgccccg ccccgtccct cctcgccccg ccccacccca gtcagccccg ccctgccccg 120
cgccgccaag cggttcccgc cctcgcccag cgcccaggta gctgcgagga aacttttgca 180
gcggctgggt agcagcacgt ctcttgctcc tcagggccac tgccaggctt gccgagtcct 240
gggactgctc tcgctccggc tgccactctc ccgcgctctc ctagctccct gcgaagcagg 300
<210> 248
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 248
gtcagccccg ccctgccccg cgccgccaag cggttcccgc cctcgcccag cgcccaggta 60
gctgcgagga aacttttgca gcggctgggt agcagcacgt ctcttgctcc tcagggccac 120
tgccaggctt gccgagtcct gggactgctc tcgctccggc tgccactctc ccgcgctctc 180
ctagctccct gcgaagcagg 200
<210> 249
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 249
cgcccaggta gctgcgagga aacttttgca gcggctgggt agcagcacgt ctcttgctcc 60
tcagggccac tgccaggctt gccgagtcct gggactgctc tcgctccggc tgccactctc 120
ccgcgctctc ctagctccct gcgaagcagg 150
<210> 250
<211> 455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 250
tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60
ctcgctggcg tccctgcacc ctgggagcgc gagcggcgcg cgggcgggga agcgcggccc 120
agacccccgg gtccgcccgg agcagctgcg ctgtcggggc caggccgggc tcccagtgga 180
ttcgcgggca cagacgccca ggaccgcgct tcccacgtgg cggagggact ggggacccgg 240
gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc 300
ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc 360
tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag gcagcgctgc gtcctgctgc 420
gcacgtggga agccctggcc ccggccaccc ccgcg 455
<210> 251
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 251
ccaggaccgc gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct 60
tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc ctcccgggtc 120
cccggcccag ccccctccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc 180
tctcctcgcg gcgcgagttt caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg 240
gccccggcca cccccgcg 258
<210> 252
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 252
cgtcccgacc cctcccgggt ccccggccca gccccctccg ggccctccca gcccctcccc 60
ttcctttccg cggccccgcc ctctcctcgc ggcgcgagtt tcaggcagcg ctgcgtcctg 120
ctgcgcacgt gggaagccct ggccccggcc acccccgcg 159
<210> 253
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 253
cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc tctcctcgcg gcgcgagttt caggcagcgc 60
tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca cccccgcg 108
<210> 254
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 254
cccgggtccc cggcccagcc ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc ctttccgcgg 60
ccccgccctc tcctcgcggc gcg 83
<210> 255
<211> 976
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 255
ccatagaacc agagaagtga gtggatgtga tgcccagctc cagaagtgac tccagaacac 60
cctgttccaa agcagaggac acactgattt tttttttaat aggctgcagg acttactgtt 120
ggtgggacgc cctgctttgc gaagggaaag gaggagtttg ccctgagcac aggcccccac 180
cctccactgg gctttcccca gctcccttgt cttcttatca cggtagtggc ccagtccctg 240
gcccctgact ccagaaggtg gccctcctgg aaacccaggt cgtgcagtca acgatgtact 300
cgccgggaca gcgatgtctg ctgcactcca tccctcccct gttcatttgt ccttcatgcc 360
cgtctggagt agatgctttt tgcagaggtg gcaccctgta aagctctcct gtctgacttt 420
tttttttttt ttagactgag ttttgctctt gttgcctagg ctggagtgca atggcacaat 480
ctcagctcac tgcaccctct gcctcccggg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg 540
agtagttggg attacaggca tgcaccacca cgcccagcta atttttgtat ttttagtaga 600
gacaaggttt caccgtgatg gccaggctgg tcttgaactc caggactcaa gtgatgctcc 660
tgcctaggcc tctcaaagtg ttgggattac aggcgtgagc cactgcaccc ggcctgcacg 720
cgttctttga aagcagtcga gggggcgcta ggtgtgggca gggacgagct ggcgcggcgt 780
cgctgggtgc accgcgacca cgggcagagc cacgcggcgg gaggactaca actcccggca 840
caccccgcgc cgccccgcct ctactcccag aaggccgcgg ggggtggacc gcctaagagg 900
gcgtgcgctc ccgacatgcc ccgcggcgcg ccattaaccg ccagatttga atcgcgggac 960
ccgttggcag aggtgg 976
<210> 256
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 256
caatctcagc tcactgcacc ctctgcctcc cgggttcaag cgattctcct gcctcagcct 60
cccgagtagt tgggattaca ggcatgcacc accacgccca gctaattttt gtatttttag 120
tagagacaag gtttcaccgt gatggccagg ctggtcttga actccaggac tcaagtgatg 180
ctcctgccta ggcctctcaa agtgttggga ttacaggcgt gagccactgc acccggcctg 240
cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg ggcagggacg agctggcgcg 300
gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg gcgggaggac tacaactccc 360
ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc gcggggggtg gaccgcctaa 420
gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta accgccagat ttgaatcgcg 480
ggacccgttg gcagaggtgg 500
<210> 257
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 257
ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg ggcagggacg agctggcgcg gcgtcgctgg 60
gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg gcgggaggac tacaactccc ggcacacccc 120
gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc gcggggggtg gaccgcctaa gagggcgtgc 180
gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta accgccagat ttgaatcgcg ggacccgttg 240
gcagaggtgg 250
<210> 258
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 258
tacaactccc ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc gcggggggtg 60
gaccgcctaa gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta accgccagat 120
ttgaatcgcg ggacccgttg gcagaggtgg 150
<210> 259
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 259
cctaagaggg cgtgcgctcc cgacatgccc cgcggcgcgc cattaaccgc cagatttgaa 60
tcgcgggacc cgttggcaga ggtgg 85
<210> 260
<211> 860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 260
aattctagtt tggtcctaga tgaccacata tccattgttc cttcaacgag cacatggtaa 60
agagcctaga acacagagac acagaacaca gtggagaaaa gggagtgaaa tgtctttaat 120
gacacttact atatatggga ttttgtgaca atatacaagg atggttaaga catataaggt 180
gatgcaaaaa aacatattaa caattatagt gacaaaaaat gaggagcata taattataca 240
ttgatttata cagagtacca gaggaacaca gcattgagag ccgtaacacc acctgaggga 300
gtggagaaag gcttcagaga gaaagtgttt tttggaatgg atcactgttt ccaaaagaac 360
taaagtacag tttgagaaat gcatacttaa ttcattactt ttttcccctc aactttaata 420
ataaatttac ccaacaaaaa agtttatttt tgacttgtaa atctcttaaa atcataaaaa 480
agtaaaatta gcttttaaaa acaggtagtc accatagcat tgaatgtgta gtttataata 540
cagcaaagtt aaatacaatt tcaaattacc tattaagtta gttgctcatt tctttgattt 600
catttagcat tgatctaact caatgtggaa gaaggttaca ttcgtgcaag ttaacacggc 660
ttaatgatta actatgttca cctaccaacc ttaccttttc tgggcaaata ttggtatata 720
tagagttaag aagtctaggt ctgcttccag aagaaaacag ttccacgttg cttgaaattg 780
aaaatcaaga taaaaatgtt cacaattaag ctccttcttt ttattgttcc tctagttatt 840
tcctccagaa ttgatcaaga 860
<210> 261
<211> 347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 261
atagcattga atgtgtagtt tataatacag caaagttaaa tacaatttca aattacctat 60
taagttagtt gctcatttct ttgatttcat ttagcattga tctaactcaa tgtggaagaa 120
ggttacattc gtgcaagtta acacggctta atgattaact atgttcacct accaacctta 180
ccttttctgg gcaaatattg gtatatatag agttaagaag tctaggtctg cttccagaag 240
aaaacagttc cacgttgctt gaaattgaaa atcaagataa aaatgttcac aattaagctc 300
cttcttttta ttgttcctct agttatttcc tccagaattg atcaaga 347
<210> 262
<211> 241
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 262
tcaatgtgga agaaggttac attcgtgcaa gttaacacgg cttaatgatt aactatgttc 60
acctaccaac cttacctttt ctgggcaaat attggtatat atagagttaa gaagtctagg 120
tctgcttcca gaagaaaaca gttccacgtt gcttgaaatt gaaaatcaag ataaaaatgt 180
tcacaattaa gctccttctt tttattgttc ctctagttat ttcctccaga attgatcaag 240
a 241
<210> 263
<211> 404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 263
tgggatgttt cgagcagtcc tgctgaagtc cttttatatc ctgtttaagg gatgcctgtt 60
aactagtaac cttcagtgag caaacatatg actctatttc cttacgttga agttaggcaa 120
tttgccaata attaacagag caggggtcac ttgtatccta tgttcaagga caaagaccac 180
ttcagagtgg aaaaaaaatc taaactgttc aaatagatta tttcccctga agaataattc 240
attcatctca acataagaca tagatatagc cataaagaaa aggtagcaga cttactatgt 300
aactccaaat acaagttcag gctattcatt agtggatata tttcttgatt atccagttat 360
agtatatttt attttattta gtgtatcgca tctggtttaa cata 404
<210> 264
<211> 470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 264
atgagggaag cgggtgtgat ccacttgaaa actgctggtt ccttcaccgc aggcagtgct 60
ggaagtggga tgtttcgagc agtcctgctg aagtcctttt atatcctgtt taagggatgc 120
ctgttaacta gtaaccttca gtgagcaaac atatgactct atttccttac gttgaagtta 180
ggcaatttgc caataattaa cagagcaggg gtcacttgta tcctatgttc aaggacaaag 240
accacttcag agtggaaaaa aaatctaaac tgttcaaata gattatttcc cctgaagaat 300
aattcattca tctcaacata agacatagat atagccataa agaaaaggta gcagacttac 360
tatgtaactc caaatacaag ttcaggctat tcattagtgg atatatttct tgattatcca 420
gttatagtat attttatttt atttagtgta tcgcatctgg tttaacatag 470
<210> 265
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 265
atgagggaag cgggtgtgat ccacttgaaa actgctggtt ccttcaccgc aggcagtgct 60
ggaagtggga tgtttcgagc agtcctgctg aagtcctttt atatcctgtt taagggatgc 120
ctgttaacta gtaaccttca gtgagcaaac atatgactct atttccttac gttgaagtta 180
ggcaatttgc caataattaa cagagcaggg gtcacttgta tcctatgttc aaggacaaag 240
accacttcag agtggaaaaa aaatctaaac tgttcaaata gattatttcc cctgaagaat 300
aattcattca tctcaacata agacatagat atagccataa agaaaaggta gcagacttac 360
tatgtaactc caaatacaag ttcaggctat tcattagtgg atatatttct tgattatcca 420
gttatagtat attttatttt atttagtgta tcgcatctgg tttaacatag aaaacttaca 480
gcacaaaacc tgatgagcca gctcccattc taattttatg tgccaaagaa taattccata 540
tgtatgtcac aggtgcatgg gtcagctgca acatcctctc aagccctaag atgatgatgc 600
taacagcaac aaatgggcac tgatagtttc catttctcta cacattagag ttgatggaaa 660
acttttaaaa cttcccagtg cgtatcgaaa ctagaactca gacgttggcg tgtcagagtc 720
tgtgtgtcta gaggtccaga catgtttgct aaggcttcat atgtagttga gtttattttt 780
tattttttta aattcatggc 800
<210> 266
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 266
atgagggaag cgggtgtgat ccacttgaaa actgctggtt ccttcaccgc aggcagtgct 60
ggaagtggga tgtttcgagc agtcctgctg aagtcctttt atatcctgtt taagggatgc 120
ctgttaacta gtaaccttca gtgagcaaac atatgactct atttccttac gttgaagtta 180
ggcaatttgc caataattaa cagagcaggg gtcacttgta tcctatgttc aaggacaaag 240
accacttcag agtggaaaaa aaatctaaac tgttcaaata gattatttcc cctgaagaat 300
aattcattca tctcaacata agacatagat atagccataa agaaaaggta gcagacttac 360
tatgtaactc caaatacaag ttcaggctat tcattagtgg atatatttct tgattatcca 420
gttatagtat attttatttt atttagtgta tcgcatctgg tttaacatag aaaacttaca 480
gcacaaaacc tgatgagcca gctcccattc taattttatg tgccaaagaa taattccata 540
tgtatgtcac aggtgcatgg gtcagctgca acatcctctc aagccctaag atgatgatgc 600
taacagcaac aaatgggcac tgatagtttc catttctcta cacattagag ttgatggaaa 660
acttttaaaa cttcccagtg cgtatcgaaa ctagaactca gacgttggcg tgtcagagtc 720
tgtgtgtcta gaggtccaga catgtttgct aaggcttcat atgtagttga gtttattttt 780
tattttttta aattcaggcg actgggtttg aattttgccc tctccgttat ctgccacatg 840
actttgtgtg aggtttctaa taccaactgc aaacaaccct aagcccacgt gtgctgttgc 900
tcaaagcttt gtcgcaaata ctgagctcac accacatacc tctcatagct ctatgtctgg 960
ttctgtttgt cacttcctga gcccatgaaa cctctcagaa gcaatatggt taaacaaact 1020
ggactttagt ctatgaaagg ctctaccctt gactattcaa actgtcagcc agatgacaaa 1080
aactcaaacc agctttattc tggc 1104
<210> 267
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 267
atgagggaag cgggtgtgat ccacttgaaa actgctggtt ccttcaccgc aggcagtgct 60
ggaagtggga tgtttcgagc agtcctgctg aagtcctttt atatcctgtt taagggatgc 120
ctgttaacta gtaaccttca gtgagcaaac atatgactct atttccttac gttgaagtta 180
ggcaatttgc caataattaa cagagcaggg gtcacttgta tcctatgttc aaggacaaag 240
accacttcag agtggaaaaa aatcttgcaa atgctgcaaa tgttcttcac catctaaact 300
gttcaaatag attatttccc ctgaagaata attcattcat ctcaacataa gacatagata 360
tagccataaa gaaaaggtag cagacttact atgtaactcc aaatacattc tttttgaaag 420
aaataataaa atgcacacca tatgctaggc actgaacaaa ttgtttcagt agttcaggct 480
attcattagt ggatatattt cttgattatc cagttattat ttcgctcaaa accatcggtc 540
aagtatattt tattttattt agtgtatcgc atctggttta acatagaaaa cttacagcac 600
aaaacctgat gagccagctc ccattctaat tttatgtgcc aaagaataat tccatatgta 660
tgtcacaggt gcatgggtca gctgcaacat cctctcaagc cctaagatga tgatgctaac 720
agcaacaaat gggcactgac atacttctga ccctaagagt gcttcactca taccttcacc 780
ctcaatgccg tagagtctat gatagtttcc atttctctac acattagagt tgatggaaaa 840
cttttaaaac ttcccagtgc gtatcgaaac tagaactcag acgttggcgt gtcagagtct 900
gtgtgtctag aggtccagac atgtttgcta aggcttcata tg 942
<210> 268
<211> 1097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 268
tagcccgaca gagcaagaga ggagccgcta cccagccgcc gcaaaagttt cctcgcagct 60
acctgggcgc tgggcgaggg cgggaacagc ttggcggtgc ggggcggccc ggggcggagc 120
cttgtgggcg tggcgaggag ggacggggcg gggcgaggca aggcgagccg cgctgcctgg 180
aggacggcgt ggggtcgtgt agctgctggc ctgcgggatg cggggcgtgg caaggagctt 240
agctgggaga ttgggtttac caaggtggcg ggcaagcctt ggtgggagag gcgcgggaag 300
aggataagga gcgtgtgcgg tggctcccgg caatcctgcc ctgacactcg ctcgccgctg 360
ctctacactg ggcgctctgg cataactact gcagaggggc tgcaggctca ggcacgctga 420
ttggcttccc agcagcagtc ccctctgact ggctctggga gaagttcccc agcctcactc 480
ctcctttccg cctccctttg gcctacagcc gggagggctt ttccttttca gcctttgcaa 540
gctctccatc ttccttggag tggagtggag gtctgcggtt taggtacccg actcgaccct 600
aggccttctc ccacccagat ctggctcctt ctggccacca gagcccacac aaggtttcct 660
aagcacaaaa tccctctcct tgctgttttc tgagaaaggt ttcttgggaa ccctttccca 720
atgcagctgt ggccaagccc tcaaagccta cccacaaata gtcacgttcc agagcgctgg 780
ggacctctgg atttcacagc ctggctcatc tttgtaccta aaaggtctgg aagcccgtgt 840
agcttgctgg gtttcattca atagaaccac acaaagtaaa tgtgtgcaaa tttaggcact 900
tgatcctgat tcctaggtga atcatatcat ctacaggata atcacgggcg accctcataa 960
agcaaagtgt agctggtgag agtaactcat tcaggaaatc attttacaga tgaaattcat 1020
taagtcatgg ttagtctgtt tcatacctgg agtagagccc tatttagaag atttcctgga 1080
tgtcaatcca cgtttct 1097
<210> 269
<211> 3793
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 269
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtaactt gtggactaag tttgttcaca 180
tccccttctc caaccccctc agtacatcac cctgggggaa cagggtccac ttgctcctgg 240
gcccacacag tcctgcagta ttgtgtatat aaggccaggg caaagaggag caggttttaa 300
agtgaaaggc aggcaggtgt tggggaggca gttaccgggg caacgggaac agggcgtttc 360
ggaggtggtt gccatgggga cctggatgct gacgaaggct cgattattga agcatttatc 420
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 480
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt cggcagtgaa aaaaatgctt 540
tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca 600
agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 660
tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtatggct gattatgatc ctctagactg 720
cagcctcagg agatctgggc ccccgcggca tatgttactt gtacagctcg tccatgccga 780
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ggtctttgct cagcttggac tgggtgctca ggtagtggtt gtcgggcagc agcacggggc 900
cgtcgccgat gggggtgttc tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg ccgtcctcga 960
tgttgtggcg gatcttgaag ttggccttga tgccgttctt ctgcttgtcg gcggtgatat 1020
agacgttgtc gctgatggcg ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg ccgtcctcct 1080
tgaagtcgat gcccttcagc tcgatgcggt tcaccagggt gtcgccctcg aacttcacct 1140
cggcgcgggt cttgtagttg ccgtcgtcct tgaagaagat ggtgcgctcc tggacgtagc 1200
cttcgggcat ggcggacttg aagaagtcgt gctgcttcat gtggtcgggg tagcgggcga 1260
agcactgcac gccccaggtc agggtggtca cgagggtggg ccagggcacg ggcagcttgc 1320
cggtggtgca gatgaacttc agggtcagct tgccgtaggt ggcatcgccc tcgccctcgc 1380
cggacacgct gaacttgtgg ccgtttacgt cgccgtccag ctcgaccagg atgggcacca 1440
ccccggtgaa cagctcctcg cccttgctca ccatggtggc gaattcgcgg atctgacggt 1500
tcactaaacc agctctgctt atatagacct cccaccgtac acgcctaccg cccatttgcg 1560
tcaatggggc ggagttgtta cgacattttg gaaagtcccg ttgattttgg tgccaaaaca 1620
aactcccatt gacgtcaatg gggtggagac ttggaaatcc ccgtgagtca aaccgctatc 1680
cacgcccatt gatgtactgc caaaaccgca tcacactagt tattaatagt aatcaattac 1740
ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg 1800
cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc 1860
catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac 1920
tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa 1980
tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac 2040
ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta 2100
catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga 2160
cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa 2220
ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag 2280
agctcgtttc gtacgttcga agccaccatg gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc 2340
atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag 2400
ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg 2460
aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg 2520
tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc 2580
ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc 2640
gtgacccagg actcctccct ccaggacggc gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc 2700
accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc 2760
tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca gcggctgaag 2820
ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc 2880
gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag 2940
gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc gccactccac cggcggcatg 3000
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<213> 人工序列
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<210> 285
<211> 4213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 285
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<210> 286
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 286
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tgggcccccg cggcatatgt tacttgtaca gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg 540
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tggactgggt gctcaggtag tggttgtcgg gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg 660
tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct 720
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tggcgttgta ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct 840
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tgcaccgcgc gggagaaggc cagcgagtgc gggccgatgt tgaggtaggt gccgaccagc 1260
cgggacgacc aggggtggcg caccagcagc gcccggttct cccgggccag ggcccgcagt 1320
tcctcgcgcc agtcgagccc ggcgtccggg tccgggtggc gcagctcgcc gaagacggcg 1380
tccagggcga gctcgagcaa ctggtccttg gtgtcgacgt accagtacac ggacatcgcg 1440
gtgacgttca gctcggcggc caggcggcgc atcgagaacc ccgtcaggcc ctccgtgtcc 1500
agcagccgga cggtgacccc ggtgatccgg tcccggtcga gcccggacgg ctgcccccca 1560
cggcgaccgc cgcgccgccc ctcccccgac agccacacgc tgtcccgcgg cccctcccgc 1620
cctgccttcg ccatgcgcac ctctcctcga ctcataccgg tagcgctagc gatgagctct 1680
ggtagtagac tagtggcccc cattatatac cctctagagc atatgtctca caaagagggc 1740
tttgtgtagt ctcacaaaga gggctttgtg tagtctcaca aagagggctt tgtgtagggc 1800
gcgcccccgt agcttggcgt aatcacatgt ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 1860
accctggcct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 1920
taaaacgacg gacatgtgaa atagcgctgt acagcgtatg ggaatctctt gtacggtgta 1980
cgagtatctt cccgtacacc gtacggcgcg ccagttaata attaactagt taataattaa 2040
ctagttaata attaactcat atgctctaga gggtatataa tgggggccac tagtctacta 2100
ccagagctca tcgctagcgc tggatcccgc caccatggct tcgtacccct gccatcaaca 2160
cgcgtctgcg ttcgaccagg ctgcgcgttc tcgcggccat agcaaccgac gtacggcgtt 2220
gcgccctcgc cggcagcaag aagccacgga agtccgcctg gagcagaaaa tgcccacgct 2280
actgcgggtt tatatagacg gtcctcacgg gatggggaaa accaccacca cgcaactgct 2340
ggtggccctg ggttcgcgcg acgatatcgt ctacgtaccc gagccgatga cttactggca 2400
ggtgctgggg gcttccgaga caatcgcgaa catctacacc acacaacacc gcctcgacca 2460
gggtgagata tcggccgggg acgcggcggt ggtaatgaca agcgcccaga taacaatggg 2520
catgccttat gccgtgaccg acgccgttct ggctcctcat atcggggggg aggctgggag 2580
ctcacatgcc ccgcccccgg ccctcaccct catcttcgac cgccatccca tcgccgccct 2640
cctgtgctac ccggccgcgc gataccttat gggcagcatg accccccagg ccgtgctggc 2700
gttcgtggcc ctcatcccgc cgaccttgcc cggcacaaac atcgtgttgg gggcccttcc 2760
ggaggacaga cacatcgacc gcctggccaa acgccagcgc cccggcgagc ggcttgacct 2820
ggctatgctg gccgcgattc gccgcgttta cgggctgctt gccaatacgg tgcggtatct 2880
gcagggcggc gggtcgtggc gggaggattg gggacagctt tcggggacgg ccgtgccgcc 2940
ccagggtgcc gagccccaga gcaacgcggg cccacgaccc catatcgggg acacgttatt 3000
taccctgttt cgggcccccg agttgctggc ccccaacggc gacctgtaca acgtgtttgc 3060
ctgggccttg gacgtcttgg ccaaacgcct ccgtcccatg cacgtcttta tcctggatta 3120
cgaccaatcg cccgccggct gccgggacgc cctgctgcaa cttacctccg ggatggtcca 3180
gacccacgtc accacccccg gctccatacc gacgatctgc gacctggcgc gcacgtttgc 3240
ccgggagatg ggggaggcta actgaggtac ccaaacacca ttgtcacact ccaagatcta 3300
cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc 3360
agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc 3420
cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac 3480
aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg 3540
gctcactgca atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt 3600
gttgggattc caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg 3660
gggtttcacc atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga tctacccacc 3720
ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc ctgtcctt 3778
<210> 304
<211> 3926
<212> DNA
<213> 305
<400> 304
cagtattgtg tatataaggc cagggcaaag aggagcaggt tttaaagtga aaggcaggca 60
ggtgttgggg aggcagttac cggggcaacg ggaacagggc gtttcggagg tggttgccat 120
ggggacctgg atgctgacga aggctcgatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 180
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 240
ttccccgaaa agtgccacct gacgtcggca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 300
tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 360
ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta 420
aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgatcctcct aggtgaggta gtaggttgta 480
tggtttgagg tagtaggttg tatggtttga ggtagtaggt tgtatggttt gaggtagtag 540
gttgtatggt tatcgatgaa ttcgaagctt ctacccaccg tactcgtcaa ttccaagggc 600
atcggtaaac atctgctcaa actcgaagtc ggccatatcc agagcgccgt agggggcgga 660
gtcgtggggg gtaaatcccg gacccgggga atccccgtcc cccaacatgt ccagatcgaa 720
atcgtctagc gcgtcggcat gcgccatcgc cacgtcctcg ccgtctaagt ggagctcgtc 780
ccccaggctg acatcggtcg ggggggccgt cgacagtctg cgcgtgtgtc ccgcggggag 840
aaaggacagg cgcggagccg ccagccccgc ctcttcgggg gcgtcgtcgt ccgggagatc 900
gagcaggccc tcgatggtag acccgtaatt gtttttcgta cgcgcgcggc tgtacgcgga 960
ggcctgttcg accatcgcgt cgatgcccgc gacgagcagg tcgagggcga actcgaagtc 1020
ccggtccagc atctccgcca cggtgtcgcc gccccgggcc gccatgatgt cctgcgcgtc 1080
ctcgatgacg cccgcggtgt ccggcacctc ggtcaccgcg gtcatcgagt cctggaagta 1140
ctcctccgga ctcagcccgg tgtccgccac ccgggcgagg aagcggccct cgatggtgcc 1200
gtagccgtag acgaactgga agacggccga gatggcgccg gtcaggcggt gcgcgggcag 1260
cccgctgcgg cgcacgacgt tctgcaccgc gcgggagaag gccagcgagt gcgggccgat 1320
gttgaggtag gtgccgacca gccgggacga ccaggggtgg cgcaccagca gcgcccggtt 1380
ctcccgggcc agggcccgca gttcctcgcg ccagtcgagc ccggcgtccg ggtccgggtg 1440
gcgcagctcg ccgaagacgg cgtccagggc gagctcgagc aactggtcct tggtgtcgac 1500
gtaccagtac acggacatcg cggtgacgtt cagctcggcg gccaggcggc gcatcgagaa 1560
ccccgtcagg ccctccgtgt ccagcagccg gacggtgacc ccggtgatcc ggtcccggtc 1620
gagcccggac ggctgccccc cacggcgacc gccgcgccgc ccctcccccg acagccacac 1680
gctgtcccgc ggcccctccc gccctgcctt cgccatgcgc acctctcctc gactcatacc 1740
ggtagcgcta gcgatgagct ctggtagtag actagtggcc cccattatat accctctaga 1800
gcatatgtct cacaaagagg gctttgtgta gtctcacaaa gagggctttg tgtagtctca 1860
caaagagggc tttgtgtagg gcgcgccccc gtagcttggc gtaatcacat gtccgtcgtt 1920
ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 1980
ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggacatgtg aaatagcgct gtacagcgta 2040
tgggaatctc ttgtacggtg tacgagtatc ttcccgtaca ccgtacggcg cgccagttaa 2100
taattaacta gttaataatt aactagttaa taattaactc atatgctcta gagggtatat 2160
aatgggggcc actagtctac taccagagct catcgctagc gctggatccc gccaccatgg 2220
cttcgtaccc ctgccatcaa cacgcgtctg cgttcgacca ggctgcgcgt tctcgcggcc 2280
atagcaaccg acgtacggcg ttgcgccctc gccggcagca agaagccacg gaagtccgcc 2340
tggagcagaa aatgcccacg ctactgcggg tttatataga cggtcctcac gggatgggga 2400
aaaccaccac cacgcaactg ctggtggccc tgggttcgcg cgacgatatc gtctacgtac 2460
ccgagccgat gacttactgg caggtgctgg gggcttccga gacaatcgcg aacatctaca 2520
ccacacaaca ccgcctcgac cagggtgaga tatcggccgg ggacgcggcg gtggtaatga 2580
caagcgccca gataacaatg ggcatgcctt atgccgtgac cgacgccgtt ctggctcctc 2640
atatcggggg ggaggctggg agctcacatg ccccgccccc ggccctcacc ctcatcttcg 2700
accgccatcc catcgccgcc ctcctgtgct acccggccgc gcgatacctt atgggcagca 2760
tgacccccca ggccgtgctg gcgttcgtgg ccctcatccc gccgaccttg cccggcacaa 2820
acatcgtgtt gggggccctt ccggaggaca gacacatcga ccgcctggcc aaacgccagc 2880
gccccggcga gcggcttgac ctggctatgc tggccgcgat tcgccgcgtt tacgggctgc 2940
ttgccaatac ggtgcggtat ctgcagggcg gcgggtcgtg gcgggaggat tggggacagc 3000
tttcggggac ggccgtgccg ccccagggtg ccgagcccca gagcaacgcg ggcccacgac 3060
cccatatcgg ggacacgtta tttaccctgt ttcgggcccc cgagttgctg gcccccaacg 3120
gcgacctgta caacgtgttt gcctgggcct tggacgtctt ggccaaacgc ctccgtccca 3180
tgcacgtctt tatcctggat tacgaccaat cgcccgccgg ctgccgggac gccctgctgc 3240
aacttacctc cgggatggtc cagacccacg tcaccacccc cggctccata ccgacgatct 3300
gcgacctggc gcgcacgttt gcccgggaga tgggggaggc taactgaggt accaaccata 3360
caacctacta cctcaaacca tacaacctac tacctcaaac catacaacct actacctcaa 3420
accatacaac ctactacctc aagatctacg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc 3480
ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa 3540
gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg 3600
tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac 3660
caagctggag tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag 3720
cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca 3780
gctaattttt gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca 3840
actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt 3900
gaaccactgc tcccttccct gtcctt 3926
<210> 305
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 305
guuuacaauu gacuaacacu cca 23
<210> 306
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 306
uggaguguga caaugguguu ugu 23

Claims (117)

1.一种连续多核酸分子，其包含：
a)第一盒，其编码第一RNA，所述第一RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：(i)输出的核酸序列；和(ii)用于表1中列出的miRNA的靶位点或其组合；和
b)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含转活化剂的核酸序列；
其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化第一盒的转活化剂响应元件。
2.根据权利要求1所述的连续多核酸分子，其中第一RNA包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的连续多核酸分子，其中第一RNA包含3’UTR，并且其中3’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
4.根据权利要求1—3的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一RNA包含5’UTR，并且其中5’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的连续多核酸分子，其中第二RNA进一步包含用于表1中列出的microRNA的靶位点或其组合。
6.根据权利要求1—5的任一项所述的连续多核酸分子，其中第二RNA进一步包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
7.根据权利要求6所述的连续多核酸分子，其中第二RNA包含3’UTR，并且其中3’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的连续多核酸分子，其中第二RNA包含5’UTR，并且其中5’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
9.根据权利要求6-8的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒的至少一个miRNA靶位点和第二盒的至少一个miRNA靶位点是由同一miRNA调节的相同的核酸序列或不同的序列。
10.根据权利要求6-9的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一RNA和第二RNA各自包含let-7c靶位点。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的连续多核酸分子，其中转活化剂响应元件包含表3中列出的核酸序列或其组合。
12.根据权利要求1-10的任一项所述的连续多核酸分子，其中第二RNA的表达可操作地连接至转录因子响应元件。
13.根据权利要求12所述的连续多核酸分子，其中转录因子响应元件包含表4中列出的核酸序列或其组合。
14.根据权利要求1-13的任一项所述的连续多核酸分子，其中转活化剂独立地结合和转活化转活化剂响应元件。
15.根据权利要求1-13的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一RNA的表达可操作地连接至转录因子响应元件。
16.根据权利要求15所述的连续多核酸分子，其中转录因子响应元件包含表4中列出的核酸序列或其组合。
17.根据权利要求12、13或16的任一项所述的连续多核酸分子，其中转活化剂仅在结合至转录因子响应元件的转录因子的存在下结合和转活化转活化剂响应元件。
18.根据权利要求1-17的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒和/或第二盒包含启动子元件。
19.根据权利要求18所述的连续多核酸分子，其中启动子元件包含表5中列出的核酸序列或其组合。
20.根据权利要求18所述的连续多核酸分子，其中启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
21.根据权利要求15—17的任一项所述的连续多核酸分子，其中：
第一盒从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分；和
第二盒从5’至3’包含：(i)包含转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
22.根据权利要求21所述的连续多核酸分子，其中第一盒的转录因子响应元件和第二盒的转录因子响应元件由相同的核酸序列组成。
23.根据权利要求21所述的连续多核酸分子，其中第一盒的转录因子响应元件和第二盒的转录因子响应元件由不同的核酸序列组成。
24.根据权利要求15-23的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒和/或第二盒包含两个或多个转录因子响应元件。
25.根据权利要求24所述的连续多核酸分子，其中第一盒和/或第二盒包含两个不同的转录因子响应元件。
26.根据权利要求21-25的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒的上游调节组分包含启动子元件。
27.根据权利要求26所述的连续多核酸分子，其中启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
28.根据权利要求21—27的任一项所述的连续多核酸分子，其中第二盒的上游调节组分包含启动子元件。
29.根据权利要求28所述的连续多核酸分子，其中启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
30.根据权利要求1-29的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒和第二盒处于会聚取向。
31.根据权利要求1-29的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒和第二盒处于发散取向。
32.根据权利要求1—29的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒和第二盒处于头到尾取向。
33.根据权利要求1—32的任一项所述的连续多核酸分子，其中第一盒和/或第二盒侧翼为绝缘体。
34.根据权利要求1-33的任一项所述的连续多核酸分子，其中第二盒的转活化剂是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
35.根据权利要求1—33的任一项所述的连续多核酸分子，其中第二盒的转活化剂包含表2中列出的核酸序列。
36.根据权利要求1-35的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是蛋白或RNA分子。
37.根据权利要求1—36的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是治疗剂。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的连续多核酸分子，其中输出是荧光蛋白、细胞毒素、催化前药活化的酶、免疫调节蛋白和/或RNA、DNA修饰因子、细胞表面受体、基因表达调节因子、激酶、表观基因修饰剂、和/或载体复制所需的因子和/或编码病原体的抗原多肽的序列。
39.根据权利要求36或权利要求37所述的连续多核酸分子，其中输出是来自人单纯疱疹病毒1的胸苷激酶(HSV-TK)。
40.根据权利要求38所述的连续多核酸分子，其中免疫调节蛋白和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。
41.根据权利要求38所述的连续多核酸分子，其中DNA修饰因子是编码用来校正基因缺陷的蛋白、DNA修饰酶和/或DNA修饰系统的组分的基因。
42.根据权利要求41所述的连续多核酸分子，其中DNA修饰酶是位点特异性重组酶、归巢核酸内切酶或CRISPR/Cas DNA修饰系统的蛋白组分。
43.根据权利要求38所述的连续多核酸分子，其中基因表达调节因子是能够调节基因表达的蛋白或能够调节基因表达的多组分系统的组分。
44.一种连续多核酸分子，其包含表6中列出的核酸序列。
45.一种连续多核酸分子，其包含编码RNA的盒，所述RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中RNA包含：(i)输出的核酸序列；(ii)转活化剂的核酸序列；和(iii)用于表1中列出的miRNA的靶位点或其组合；其中转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化转活化剂响应元件。
46.根据权利要求45所述的连续多核酸分子，其中第一RNA包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的连续多核酸分子，其中RNA进一步包含多顺反子表达元件的核酸序列，其将输出和转活化剂的核酸序列分开。
48.根据权利要求45-47的任一项所述的连续多核酸分子，其中RNA包含3’UTR，并且其中3’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
49.根据权利要求45-48的任一项所述的连续多核酸分子，其中RNA包含5’UTR，并且其中5’UTR包含let-7c靶位点、let-7a靶位点、let-7b靶位点、let-7d靶位点、let-7e靶位点、let-7f靶位点、let-7g靶位点、let-7i靶位点、miR-22靶位点、miR-26b靶位点、miR-122靶位点、miR-208a靶位点、miR-208b靶位点、miR-1靶位点、miR-217靶位点、miR-216a靶位点或其组合。
50.根据权利要求45-49的任一项所述的连续多核酸分子，其中RNA包含let-7c靶位点。
51.根据权利要求45—50的任一项所述的连续多核酸分子，其中转活化剂响应元件包含表3中列出的核酸序列或其组合。
52.根据权利要求45—50的任一项所述的连续多核酸分子，其中转活化剂独立地结合和转活化转活化剂响应元件。
53.根据权利要求45—52的任一项所述的连续多核酸分子，其中RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件和转录因子响应元件。
54.根据权利要求53所述的连续多核酸分子，其中转录因子响应元件包含表4中列出的核酸序列或其组合。
55.根据权利要求53所述的连续多核酸分子，其中转活化剂仅在结合至转录因子响应元件的转录因子的存在下结合和转活化转活化剂响应元件。
56.根据权利要求45-55的任一项所述的连续多核酸分子，其中盒包含启动子元件。
57.根据权利要求56所述的连续多核酸分子，其中启动子元件包含表5中列出的核酸序列或其组合。
58.根据权利要求56所述的连续多核酸分子，其中启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
59.根据权利要求53或权利要求55所述的连续多核酸分子，其中连续多核酸分子从5’至3’包含：(i)包含转活化剂响应元件和转录因子响应元件的上游调节组分；(ii)编码输出和转活化剂的核酸序列；和(iii)包含let-7c靶位点的下游组分。
60.根据权利要求59所述的连续多核酸分子，其中(i)中的上游调节组分包含启动子元件。
61.根据权利要求60所述的连续多核酸分子，其中启动子元件包含哺乳动物启动子或启动子片段。
62.根据权利要求45—61的任一项所述的连续多核酸分子，其中至少一个盒的转活化剂是tTA、rtTA、PIT-RelA、PIT-VP16、ET-VP16、ET-RelA、NarLc-VP16或NarLc-RelA。
63.根据权利要求45—61的任一项所述的连续多核酸分子，其中第二盒的转活化剂包含表2中列出的核酸序列。
64.根据权利要求45—62的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是蛋白或RNA分子。
65.根据权利要求45-64的任一项所述的连续多核酸分子，其中输出是治疗性蛋白或RNA分子。
66.根据权利要求64或权利要求65所述的连续多核酸分子，其中输出是荧光蛋白、细胞毒素、催化前药活化的酶、免疫调节蛋白和/或RNA、DNA修饰因子、细胞表面受体、基因表达调节因子、激酶、表观基因修饰剂、和/或载体复制所需的因子和/或编码病原体的抗原多肽的序列。
67.根据权利要求64或权利要求65所述的连续多核酸分子，其中输出是来自人单纯疱疹病毒1的胸苷激酶(HSV-TK)。
68.根据权利要求66所述的连续多核酸分子，其中免疫调节蛋白和/或RNA是细胞因子或集落刺激因子。
69.根据权利要求66所述的连续多核酸分子，其中DNA修饰因子是编码用来校正基因缺陷的蛋白、DNA修饰酶和/或DNA修饰系统的组分的基因。
70.根据权利要求69所述的连续多核酸分子，其中DNA修饰酶是位点特异性重组酶、归巢核酸内切酶或CRISPR/Cas系统的蛋白组分。
71.根据权利要求66所述的连续多核酸分子，其中基因表达调节因子是能够调节基因表达的蛋白或能够调节基因表达的多组分系统的组分。
72.一种载体，其包含根据权利要求1-44或权利要求45-71的任一项所述的连续多核酸分子。
73.一种工程化病毒基因组，其包含根据权利要求1-44或权利要求45—71的任一项所述的连续多核酸分子。
74.根据权利要求73所述的工程化病毒基因组，其中病毒基因组是腺相关病毒(AAV)基因组、慢病毒基因组、腺病毒基因组、单纯疱疹病毒(HSV)基因组、牛痘病毒基因组、痘病毒基因组、新城疫疾病病毒(NDV)基因组、柯萨奇病毒基因组、rheo病毒基因组、麻疹病毒基因组、水泡性口炎病毒(VSV)基因组、细小病毒基因组、塞内卡谷病毒基因组、马拉巴病毒基因组或常见感冒病毒基因组。
75.一种病毒体，其包含根据权利要求73或权利要求74所述的工程化病毒基因组。
76.根据权利要求75所述的病毒体，进一步包含AAV-DJ、AAV8、AAV6或AAV-B1衣壳。
77.一种在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法，其包含将细胞群与根据权利要求1-44或权利要求45—71的任一项所述的连续多核酸分子、权利要求72所述的载体、权利要求73或权利要求74所述的工程化病毒基因组或权利要求75或权利要求76所述的病毒体接触，其中细胞群包含至少一个靶细胞类型和一个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性在两个或多个非靶细胞的每一个中相对于靶细胞的每一个至少两倍高；并且其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。
78.根据权利要求77所述的方法，其中靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在内源性转录因子的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含与内源性转录因子相对应的转录因子响应元件。
79.根据权利要求77所述的方法，其中靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在启动子片段的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含该启动子片段。
80.一种诊断疾病或病况的方法，其包含向表现出与疾病或病况相关的一个或多个标志或症状的受试者施用根据权利要求1-44或权利要求45-71的任一项所述的连续多核酸分子、权利要求72所述的载体、权利要求73或权利要求74所述的工程化病毒基因组或权利要求75或权利要求76所述的病毒体，其中输出的水平指示疾病和或病况的存在或不存在。
81.根据权利要求80所述的方法，其中疾病是癌症。
82.根据权利要求81所述的方法，其中癌症是肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
83.一种治疗疾病或病况的方法，其包含向具有疾病或病况的受试者施用根据权利要求1-44或权利要求45-71的任一项所述的连续多核酸分子、权利要求72所述的载体、权利要求73或权利要求74所述的工程化病毒基因组或权利要求75或权利要求76所述的病毒体。
84.根据权利要求83所述的方法，进一步包含施用前药，任选地其中前药是更昔洛韦，任选地其中连续多核酸分子包含表6中列出的核酸序列。
85.根据权利要求83所述的方法，其中疾病是癌症。
86.根据权利要求85所述的方法，其中癌症是肝细胞癌(HCC))、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
87.一种在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法中使用的组合物，所述方法包含将细胞群与根据权利要求1-44或权利要求45-71的任一项所述的连续多核酸分子、权利要求72所述的载体、权利要求73或权利要求74所述的工程化病毒基因组或权利要求75或权利要求76所述的病毒体接触，其中细胞群包含至少一个靶细胞类型和一个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平和/或活性在两个或多个非靶细胞的每一个中相对于靶细胞的每一个至少两倍高；并且其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。
88.根据权利要求87所述的方法，其中靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在内源性转录因子的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含与内源性转录因子相对应的转录因子响应元件。
89.根据权利要求87所述的方法，其中靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在启动子片段的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含该启动子片段。
90.一种在诊断疾病或病况的方法中使用的组合物，所述方法包含向表现出与疾病或病况相关的一个或多个标志或症状的受试者施用根据权利要求1-44或权利要求45-71的任一项所述的连续多核酸分子、权利要求72所述的载体、权利要求73或权利要求74所述的工程化病毒基因组或权利要求75或权利要求76所述的病毒体，其中输出的水平指示疾病和或病况的存在或不存在。
91.根据权利要求90所述的使用的组合物，其中疾病是癌症。
92.根据权利要求91所述的使用的组合物，其中癌症是肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
93.一种在治疗疾病或病况的方法中使用的组合物，其包含向具有疾病或病况的受试者施用根据权利要求1-44或权利要求45-71的任一项所述的连续多核酸分子、权利要求72所述的载体、权利要求73或权利要求74所述的工程化病毒基因组或权利要求75或权利要求76所述的病毒体。
94.根据权利要求93所述的方法，进一步包含施用前药，任选地其中前药是更昔洛韦，任选地其中连续多核酸分子包含表6中列出的核酸序列。
95.根据权利要求93所述的使用的组合物，其中疾病是癌症。
96.根据权利要求95所述的使用的组合物，其中癌症是肝细胞癌(HCC)、转移性结直肠癌、肝脏中转移性肿瘤、乳腺癌、肺癌、视网膜母细胞瘤和胶质母细胞瘤。
97.一种在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法，其包含使细胞群与连续多核酸分子或包含所述连续多核酸分子的组合物接触，其中：
a)细胞群包含至少一个靶细胞类型和两个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平在非靶细胞的至少一个子集中，例如在两个或多个非靶细胞的至少两个和任选地每一个中，相对于靶细胞的每一个至少两倍高；和
b)连续多核酸分子包含：
(i)第一盒，其编码RNA，所述RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：输出的核酸序列；和与一个或多个内源性miRNA相对应的一个或多个miRNA靶位点；和
(ii)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含转活化剂的核酸序列；
其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化第一盒的转活化剂响应元件：和
其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。
98.根据权利要求97所述的方法，其中连续多核酸分子包含表6中列出的核酸序列。
99.一种在细胞群中刺激细胞特异性事件的方法，其包含使细胞群与连续多核酸分子或包含所述连续多核酸分子的组合物接触，其中：
a)细胞群包含至少一个靶细胞类型和两个或多个非靶细胞类型，其中靶细胞类型和非靶细胞类型在一个或多个内源性miRNA的水平上不同，使得一个或多个内源性miRNA的水平在非靶细胞的至少一个子集中，例如在两个或多个非靶细胞的至少两个和任选地每一个中，相对于靶细胞的每一个至少两倍高；和
b)连续多核酸分子包含编码mRNA的盒，所述mRNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中RNA包含：输出的核酸序列；转活化剂的核酸序列；和与一个或多个内源性miRNA相对应的一个或多个miRNA靶位点；和
其中转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化盒的转活化剂响应元件；和
其中细胞特异性事件由细胞群的细胞中的输出的表达水平来调节。
100.根据权利要求97或99所述的方法，其中包含连续多核酸分子的组合物包括包含连续多核酸的载体、包含连续多核酸的工程化病毒基因组或包含多核酸的病毒体。
101.根据权利要求97—100的任一项所述的方法，其中内源性miRNA选自表1中列出的miRNA或表1中列出的miRNA的组合。
102.根据权利要求97—101的任一项所述的方法，其中内源性miRNA选自由let-7c、let-7a、let-7b、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-22、miR-26b、miR-122、miR-208a、miR-208b、miR-1、miR-217、miR-216a或其组合组成的组。
103.根据权利要求97—101的任一项所述的方法，其中靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在内源性转录因子的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含与内源性转录因子相对应的转录因子响应元件。
104.根据权利要求97-101的任一项所述的方法，其中靶细胞的至少一个子集和非靶细胞的至少一个子集在启动子片段的水平或活性上不同，其中连续核酸分子进一步包含该启动子片段。
105.根据权利要求97—103的任一项所述的方法，其中靶细胞是肿瘤细胞并且细胞特异性事件是肿瘤细胞死亡。
106.根据权利要求105所述的方法，其中肿瘤细胞死亡通过活化受体配体、特异性抗原、刺激细胞因子或其任意组合的表达由免疫靶向来介导。
107.根据权利要求97—103的任一项所述的方法，其中靶细胞是衰老细胞并且细胞特异性事件是衰老细胞死亡。
108.根据权利要求97-107的任一项所述的方法，进一步包含使细胞群与由输出代谢成治疗性或有毒化合物的前药或无毒前体化合物接触。
109.根据权利要求97-103的任一项所述的方法，其中输出表达确保靶细胞群的存活，而非靶细胞由于缺乏输出表达以及在不相关和非特异性细胞死亡诱导剂的存在下被消除。
110.根据权利要求97-103的任一项所述的方法，其中靶细胞包含感兴趣的特定表型使得输出表达限于该特定表型的细胞。
111.根据权利要求97-102的任一项所述的方法，其中靶细胞是精选的细胞类型，并且通过精选的细胞类型中天然不存在或无活性的基因的表达，细胞特异性事件是新功能的编码。
112.根据权利要求97-111的任一项所述的方法，其中细胞群包含多细胞有机体。
113.根据权利要求112所述的方法，其中多细胞有机体是动物。
114.根据权利要求113所述的方法，其中动物是人。
115.根据权利要求97-114的任一项所述的方法，其中细胞群是离体接触的。
116.根据权利要求97—114的任一项所述的方法，其中细胞群是体内接触的。
117.一种连续多核酸分子，其包含：
a)第一盒，其编码第一RNA，所述第一RNA的表达可操作地连接至转活化剂响应元件，其中第一RNA包含：(i)输出的核酸序列；和(ii)用于miRNA的靶位点，其中所述miRNA在哺乳动物的至少两个不同的健康组织中高表达和/或有活性并且在一个或多个类型的靶细胞中以低水平表达；
b)第二盒，其编码第二RNA，其中第二RNA包含核酸序列，
其中第二盒的转活化剂，当表达为蛋白质时，结合和转活化第一盒的转活化剂响应元件。
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