KR102271675B1 - 헌팅톤병의 aav 치료 - Google Patents

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닐 아로닌
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Abstract

본 개시내용의 측면들은 헌팅톤병을 치료하는 데에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 헌팅틴 유전자 (HTT)를 표적으로 하는 간섭 핵산 (예컨대 인공 miRNA), 및 그를 사용한 헌팅톤병의 치료 방법을 제공한다.

Description

헌팅톤병의 AAV 치료
[관련 출원]
본 출원은 발명의 명칭이 "AAV TREATMENT OF HUNTINGTON'S DISEASE"인 2016년 9월 22일자 U.S. 가출원 제62/398,487호의 출원일에 대한 35 U.S.C. 119(e)하의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
[연방 후원 연구]
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 교부되는 NS038194하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권리를 가진다.
헌팅톤병(Huntington's disease) (HD)은 헌팅틴(huntingtin) 유전자 엑손 1 CAG 반복 영역의 확장에 의해 야기되는 파괴적인 유전성 신경변성 질환이다. 헌팅틴 단백질 (HTT)이 신체 전체에 걸쳐 발현되기는 하지만, 폴리글루타민 확장 단백질은 선조체의 중간 가시 뉴런(medium spiny neuron) 및 그의 피질 연결에 대하여 특히 독성이다. 환자들은 우울 및 불안을 포함한 정서적 증상 및 특징적인 운동 교란 및 무도병으로 고생한다. 현재 헌팅톤병에 대한 치유법은 존재하지 않으며; 치료 선택사항은 질환 증상을 개선하는 것에 제한된다.
[발명의 개요]
본 개시내용의 측면들은 헌팅톤병 (HD)을 치료하는 데에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서는, 인간 헌팅틴 (HTT)과 특이적으로 혼성화되어 그의 발현을 억제하는 억제성 핵산 (예컨대 인공 miRNA와 같은 miRNA)이 제공된다.
이에 따라, 일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호(SEQ ID NO): 2-10 또는 21-22 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하거나 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 헌팅틴은 서열식별번호: 1에 제시되어 있는 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 적어도 2개 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개)의 연속되는 염기에 대하여 상보성인 핵산 (예컨대 miRNA)을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다: 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체(inverted terminal repeat) (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 제1 영역; 및 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 영역. 일부 실시양태에서, 각 miRNA를 코딩하는 서열은 miRNA 백본 서열을 코딩하는 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각 miRNA 백본 서열은 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열이다.
일부 실시양태에서, 상기 트랜스진은 추가적으로 프로모터를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 추가적으로 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 치료용 단백질 (예컨대 비-돌연변이 헌팅틴) 또는 리포터 단백질 (예를 들면 형광 단백질 예컨대 GFP)이다.
일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 miRNA는 트랜스진의 비번역 부분에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 비번역 부분은 인트론이다. 일부 실시양태에서, 비번역 부분은 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 최종 코돈과 폴리-A 테일 서열 사이에 존재한다. 일부 실시양태에서, 비번역 부분은 프로모터 서열의 최종 핵산 염기와 폴리-A 테일 서열의 첫 번째 염기 사이에 존재한다.
일부 실시양태에서, 상기 단리된 핵산은 추가적으로 제2 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 제3 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 ITR 변이체에는 기능성인 말단 분해 부위(terminal resolution site) (TRS)가 결핍되어 있으며, 임의적으로 이 경우 ITR 변이체는 ΔTRS ITR이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA는 인간 헌팅틴과 혼성화되어 그의 발현을 억제한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 플라스미드이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 재조합 AAV (rAAV)를 제공한다: 캡시드 단백질; 및 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산.
일부 실시양태에서, 상기 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 rAAV는 자가-상보성(self-complementary) AAV (scAAV)이다.
일부 실시양태에서, rAAV는 중추신경계 (CNS)에의 전달용으로 제제화된다.
본 개시내용의 측면들은 병원성 헌팅틴의 발현을 감소시킬 수 (예컨대 억제할 수) 있으며, 그에 따라 헌팅톤병의 치료에 유용할 수 있는 단리된 핵산에 관한 것이다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 그를 필요로 하는 대상체에서의 헌팅톤병의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 헌팅톤병에 걸려 있거나 그것이 발병할 위험이 있는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대상체는 36개를 초과하는 CAG 반복체, 40개를 초과하는 반복체 또는 100개를 초과하는 반복체를 가지는 헌팅틴 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연령 20세 미만이거나, 또는 청소년 HD에 걸린 것으로 진단되어 있다.
일부 실시양태에서, 상기 투여는 대상체의 중추신경계 (CNS)에 대한 상기 단리된 핵산 또는 rAAV의 전달을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 투여는 주사, 임의적으로는 정맥내 주사 또는 선조체내 주사를 통한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각 miRNA 백본 서열은 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 서열식별번호: 21 또는 22에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진에는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR) 또는 그의 변이체가 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 ITR 변이체에는 기능성인 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있다. 일부 실시양태에서, TRS가 결핍되어 있는 ITR 변이체는 ΔTRS ITR이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진의 각 miRNA 백본 서열은 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 서열식별번호: 21 또는 22에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진에는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR) 또는 그의 변이체가 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, ITR 변이체에는 기능성인 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있다. 일부 실시양태에서, TRS가 결핍되어 있는 ITR 변이체는 ΔTRS ITR이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 캡시드 단백질; 및 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 포함하는 재조합 AAV (rAAV)를 제공하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 서열이 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 및 ΔTRS ITR이 플랭킹되어 있다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 그를 필요로 하는 대상체에서의 헌팅톤병의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 헌팅톤병에 걸려 있거나 그것이 발병할 위험이 있는 대상체에게 본원에서 기술되는 바와 같은 rAAV (예컨대 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV)의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 서열이 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 및 ΔTRS ITR이 플랭킹되어 있다.
일부 실시양태에서, rAAV는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 36개를 초과하는 CAG 반복체, 40개를 초과하는 반복체 또는 100개를 초과하는 반복체를 가지는 헌팅틴 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연령 20세 미만이다.
일부 실시양태에서, 투여는 주사를 통한다. 일부 실시양태에서, 주사는 정맥내 주사 또는 선조체내 주사이다.
도 1은 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 mir-HTT-6433을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 헬라(HeLa) 세포를 나타낸다. 형질감염 48시간 후, 세포를 수확하고, 정량 RT-PCR (qRT-PCR)용으로 RNA를 추출하였다. 결과는 mir-HTT-6433이 50 %까지 만큼 내생 인간 헌팅틴을 감소시킨다는 것을 표시한다.
도 2는 AAV9 벡터에 패키지화되어 돌연변이 인간 헌팅틴을 발현하는 트랜스제닉 마우스 (Yac128 마우스)의 선조체에 직접 주사되는 mir-HTT-6433을 나타낸다. 주사 1개월-후, qRT-PCR에 의해 인간 헌팅틴 mRNA의 수준을 측정하였다. 하나의 동물 세트 (n=5)에서는, 주사된 측면에서 인간 헌팅틴의 수준을 비-주사 측면에서의 수준과 비교하였다. 주사된 측면에서 헌팅틴 mRNA의 상당한 (p=0.0017) 감소가 관찰되었다. 두 번째 동물 세트 (n=5/군)에서는, mir-HTT-6433이 주사된 동물에서 헌팅틴 mRNA의 수준을 비히클 단독 주사를 투여받은 동물과 비교하였다. 이러한 동물에서도 역시 헌팅틴의 상당한 감소 (p=0.0004)가 관찰되었다. 세 번째 동물 세트 (n=5/군)에서는, mir-HTT-6433이 주사된 동물에서 헌팅틴 mRNA의 수준을 AAV9-GFP가 주사된 것들과 비교하였다. 이러한 동물에서도 역시 헌팅틴 mRNA의 상당한 (p=0.0064) 감소가 존재하였다. 종합하면, 데이터는 mir-HTT-6433이 생체 내의 뇌에서 헌팅틴 mRNA를 50 %까지 감소시킨다는 것을 표시한다.
도 3은 AAV9-mir-HTT-6433 또는 PBS를 사용한 편측으로의 돌연변이 헌팅틴 (인간)을 발현하는 트랜스제닉 마우스의 주사를 나타낸다. 주사 6개월-후, 평균대에서 마우스를 시험하였다. 데이터는 mir-HTT-6433으로 처리된 마우스가 PBS로 처리된 HD 마우스에 비해 평균대를 건너는 데에 걸리는 시간량의 감소를 나타낸다는 것을 표시한다.
도 4a-4c는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA가 세포 배양물 및 생체 내에서 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 4a는 인간 헌팅틴 mRNA상 표적 부위들의 위치를 나타낸다. 도 4b는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 헬라 세포를 나타내는데; 48시간 후 qPCR에 의해 헌팅틴 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 발현은 세포 수에 있어서의 웰별 변이를 반영하기 위하여 HPRT에 대하여 정규화하고, 미처리/나이브 대조에 대비하여 나타내었다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4c는 세포 배양물에서의 결과를 바탕으로 하여 생체내 시험용으로 선택된 후보 miRNA들을 나타낸다. 마우스의 선조체에 편측으로 주사하였다. 주사 1개월-후, 선조체를 수확하고, GFP 양성 조직을 절제 분리하였다. 데이터는 HPRT에 대하여 정규화하고, GFP-단독 대조에 대비하여 나타내었다.
도 5a-5c는 U6 프로모터로부터 인공 miRNA를 발현시키는 것이 마우스 선조체에서의 헌팅틴의 침묵화를 향상시키지 않는다는 것을 보여준다. 도 5a는 CBA (polII) 및 U6 프로모터로부터 miRNA를 발현하는 AAV9 구성체에 관한 데이터를 나타낸다. CBA-프로모터 추진 miRNA는 GFP 유전자의 3'-UTR에 위치하는 반면, U6 프로모터 추진 인공 miRNA를 포함하는 구성체는 별도의 프로모터로부터 GFP를 공동-발현한다. 도 5b는 부위 5155 (좌측) 및 6433 (우측)을 표적으로 하는 U6 및 CBA-프로모터 추진 인공 miRNA의 주사 후 주사된 선조체에서의 헌팅틴 mRNA의 상대적인 양을 나타낸다. 데이터는 비-주사 측면에 대비하여 나타내었다. 도 5c는 부위 6433을 표적으로 하는 U6 및 CBA-프로모터 추진 miRNA가 편측으로 주사된 마우스에서의 헌팅틴 mRNA의 상대적인 양을 나타낸다. 데이터는 GFP-발현 대조 벡터가 주사된 마우스의 군에 대비하여 나타내었다.
도 6a-6b는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 선조체 발현이 행동 이상을 야기한다는 것을 보여준다. 도 6a는 주사 6개월-후, U6-프로모터 추진 mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 보금자리를 트는 데에 실패하였음을 보여준다. 사진은 케이지에 새로운 네슬렛(nestlet)을 위치시키고 24시간 후에 촬영되었다. 도 6b는 PBS, CBA-mir-HTT-6433 또는 U6-mir-HTT-6433으로 처리된 Yac128 마우스의 케이지 모니터링을 나타낸다. 24-27시간 동안, 케이지 주변으로 움직이면서 소요되는 시간량을 기록하였다. 시간 당 평균 시간은 총 시간량을 기록 시간 수로 나누는 것에 의해 계산하였다.
도 7a-7b는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 발현이 선조체 수축을 야기한다는 것을 보여준다. 도 7a는 주사 1개월 (상단) 및 6개월 (하단)-후의 Yac128 마우스의 주사된 측면에서의 DARPP-32 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 7b는 주사 6개월-후의 DARPP-32 양성 면적의 정량을 나타낸다.
도 8a-8d는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 발현이 소교세포의 지속적인 활성화를 야기한다는 것을 보여준다. 도 8a는 주사 1개월 (상단) 및 6개월 (하단)-후의 Yac128 마우스의 주사된 측면에서의 Iba1 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 이미지는 주사 측면에서 촬영되었다. 주사 6개월 후의 총 (도 8b), 활성화 (도 8c) 및 휴지 (도 8d) 소교세포의 정량을 나타내었다.
도 9a-9c는 U6 프로모터로부터의 mir155 기반 인공 miRNA의 발현이 헌팅틴 표적화 가이드 가닥 및 다른 서열의 과발현을 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 9a는 판독의 개시 위치가 헌팅틴 표적화 인공 miRNA 헤어핀 (mir-155 백본)에 맵핑된다는 것을 보여준다. 위치는 성숙한 가닥에 대비하여 기록하였으며, 각 샘플에서 맵핑되는 내생 miRNA의 총 수에 대하여 판독치를 정규화하였다. 수평선은 대조 샘플에서 발견되는 인공 miRNA의 바탕 수준을 나타낸다. 도 9b는 정량 RT-PCR에 의한 성숙한 miR-HTT (mir-155 백본으로부터의 것)의 상대적 정량을 나타낸다. 도 9c는 판독의 개시 부분이 mir-30 백본에 삽입되어 U6 프로모터로부터 발현되는 헌팅틴 표적화 인공 miRNA에 맵핑된다는 것을 보여준다.
도 10a-10b는 mir-HTT-6433의 발현이 표적 부위를 가지는 mRNA를 우선적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 10a는 mRNA가 인공 miRNA 부위들 (범례)에 일치하는 정준(canonical) miRNA 결합을 포함하는 것들 및 없는 것들로 분할되었다는 것을 보여준다. AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스 군에서는, 그와 같은 부위가 있고 없는 mRNA들 사이에 차이가 없었다. 반면, 도 10b는 AAV-U6-mir-HTT-6433 군에서 완전한 8량체 부위를 가지는 mRNA의 발현쪽으로 이동이 있었음을 보여준다.
도 11a-11c는 벡터 투여량을 감소시키는 것이 마우스 선조체에서의 감소된 확산 및 녹다운을 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 11a는 헌팅틴 표적화 인공 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스 선조체에서의 GFP 염색을 보여준다. GFP 양성인 선조체의 %를 측정하기 위하여, 이미지J가 사용되었다. 도 11b는 Yac128 마우스의 선조체에서 인간 헌팅틴 mRNA를 측정하는 정량 RT-PCR을 나타낸다. 도 11c는 3종의 서로 다른 투여량으로 헌팅틴 표적화 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스의 대표적인 사진을 나타낸다. 데이터는 벡터 투여량을 감소시키는 것이 감소된 확산 및 녹다운을 발생시킨다는 것을 표시한다.
도 12a-12b는 U6-프로모터 추진 헌팅틴 표적화 인공 miRNA의 주사 후, Yac128 마우스가 평균대를 건너는 능력의 감소를 나타낸다는 것을 표시하는 데이터를 나타낸다. 도 12a는 2-3개월에 주사된 마우스가 평균대를 건너는 시간의 분명한 증가를 나타내며, 그 중 일부는 완전히 건너는 데에 실패한다는 것을 보여준다. 도 12b는 7개월령에 PBS 또는 CBA-mir-HTT-6433 중 어느 하나가 주사된 Yac128 마우스가 평균대에서의 행동에 있어서 연령-관련 감소를 나타낸다는 것을 보여준다. U6-mir-HTT-6433 (적색 점)을 사용한 주사는 이와 같은 감소를 가속한다.
도 13a-13b는 C57BL/6 마우스가 U6-프로모터 추진 헌팅틴 표적화 인공 miRNA의 주사 후 평균대에서 최초의 행동 악화를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 13a는 대조 (나이브) 마우스, 및 AAV-U6-mir-HTT-6433 및 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스의 평균대를 건너는 데에 걸리는 시간량을 보여준다. 도 13b는 대조 (나이브) 마우스, 및 AAV-U6-mir-HTT-6433 및 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 DARPP-32 양성 선조체 면적의 정량을 나타낸다.
도 14a-14b는 내생 miRNA의 분포가 mir-HTT-6433을 사용한 주사 후 거의 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 도 14a는 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 분포를 보여주는데; mir-HTT-6433 가이드 및 패신저 가닥의 수준은 녹색으로 나타내었으며, 적색으로 나타낸 것은 모두 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서 상당한 변화를 나타내는 내생 miRNA 종들이다. 도 14b는 AAV-U6-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 분포를 나타낸다.
도 15a-15c는 mir-HTT-6433으로 처리된 마우스에서의 mRNA 프로파일을 보여준다. 도 15a는 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 mRNA 발현에 있어서 거의 변화를 나타내지 않는다는 것을 보여주는데; 녹색으로 나타낸 것은 모두 상당한 p-값을 나타내는 유전자이며, 청색으로 나타낸 것은 다중 비교를 위한 조정 후 유의성 있게 유지되는 것들이다. 도 15b는 AAV-U6-mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 CBA에 비해 mRNA 발현에 있어서 더 많은 변화를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 15c는 mir-HTT-6433로 처리된 마우스에서의 mRNA 프로파일을 보여주는데; 7종의 RNA가 U6 및 CbA 처리 군 사이에서 상당히 차별적으로 발현되었다.
도 16은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 1개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵(middle caudate)에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신(calnexin)에 대하여 정규화하였다. 주의: CBA 및 U6 구성체 각각에는 mir155 백본을 사용하였음.
도 17은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 1개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵(middle putamen)에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 18은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵의 내측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 19는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵의 외측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 20은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 21은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵의 외측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 22는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵의 내측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 23은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 24는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 전방 선조체에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 25a-25b는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다. 도 25a는 mir-155-6433 (서열식별번호: 23)의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다. 도 25b는 mir-30-6433 (서열식별번호: 24)의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다.
도 26a-26b는 양 뇌로의 AAV 벡터의 전달을 보여준다. 도 26a는 전체 선조체가 4, 6 mm 블록 내에 포함되도록 관상면에서 절제된 양 뇌의 개략적인 개관을 보여준다 (상단). 전방 블록은 속섬유막에 의해 분할되지 않은 선조체의 전방 부분을 포함한다 (중단). 주사가 표적으로 하는 내측 블록은 한정된 조가비핵을 포함하며, 미상핵은 하단에 나타내었다. 도 26b는 대조 (AAV9) 및 처리 (AAV9miRHTT) 처리된 동물에서의 AAV 벡터 게놈을 나타낸다. 벡터 게놈은 참조 유전자로서 게놈 HPRT를 사용하는 디지털 액적 PCR에 의해 측정하였다. 값들은 log 척도로 플로팅하였다.
도 27은 인공 miRNA 가이드 가닥이 디지털 액적 PCR에 의해 정량되었음을 보여준다. let-7e*에 대하여 정규화함으로써 상대적인 miRNA 수준을 계산하고, 그와 같은 값을 log 척도로 플로팅하였다. RQN < 5인 샘플은 배제하였다. 기록되는 수는 이와 같은 품질 임계치를 통과하여 miRNA 분석에 사용된 샘플의 총 수이다. P 값은 다중 시험을 위한 튜키(tukey) 보정을 포함하는 2-원 아노바(ANOVA)를 사용하여 계산하였다.
도 28은 scAAV9-항-HTT-6433이 선조체에서 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 보여준다. 나타낸 데이터는 양 칼넥신에 대하여 정규화된 HTT mRNA의 신호이다. 별표는 비쌍형 t-검정을 사용한 p,0.03 이하에서의 처리 군들 (AAV9 또는 AAV9miRHTT) 사이의 상당한 평균 차이를 표시한다. U6-프로모터 추진 인공 miRNA는 주사 1개월-후에 미상핵 및 조가비핵에서, 그리고 주사 6개월-후에는 조가비핵에서 인간 돌연변이 HTT mRNA를 상당히 낮추었다. CBA-프로모터 추진 인공 miRNA는 주사 1개월-후에 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서, 주사 6개월-후에는 미상핵 및 조가비핵에서 HTT mRNA를 낮추었다. 분석에서는 미상핵의 내측 영역, 외측 조가비핵 및 전방 선조체를 조사하였다.
도 29a-29b는 AAV9 및 AAV9miRHTT 처리된 양에서의 내생 양 htt mRNA 및 단백질의 수준을 나타낸다. 도 29a는 양 htt mRNA 수준이 방법에서 기술된 바와 같이 측정되었으며 양 칼넥신 (Canx)에 대비하여 표현되었음을 보여준다. 나타낸 것은 연구 2의 결과이다. AAV9와 AAV9miRHTT 처리 군 사이에 내생 양 htt mRNA 수준의 차이는 존재하지 않았다. 도 29b는 연구 2의 주사 6개월-후 조가비핵에서 항-htt1-17 항체 (Ab1)를 사용하여 검출된 내생 양 헌팅틴 및 인간 mHTT 단백질의 수준을 나타낸다. 샘플 웨스턴 블럿은 AAV9miRHTT가 일 측면상에 주사된 4 마리의 서로 다른 양에서의 뇌의 주사 및 비-주사 측면의 wt htt (화살표) 및 인간 돌연변이 htt (화살촉)의 신호를 보여준다. 그래프는 % 주사된 측면 대 비-주사 측면으로서 농도측정에 의해 측정된 평균 wt 양 htt 및 인간 mHTT 신호를 나타낸다. AAV9miRHTT를 사용한 처리가 내생 양 헌팅틴 단백질의 수준에는 영향을 주지 않았으나, 인간 mHTT의 수준은 상당히 감소시켰음에 유의한다. 별표는 비쌍형 t-검정을 사용한 p=0.005를 표시한다.
도 30은 AAV9-miRHTT가 선조체에서 인간 돌연변이 헌팅틴 단백질을 감소시킨다는 것을 보여준다. 연구 1 및 2로부터의 조가비핵의 샘플 웨스턴 블럿은 항체 3B5H10를 사용하여 검출되는 돌연변이 HTT 및 적재 대조로서의 액틴을 보여준다 (상단). 그래프는 AAV9 (대조) 또는 AAV9-miRHTT 중 어느 하나로 처리된 양에서의 개별 값 및 평균 (수평 막대)의 분포를 나타낸다 (하단). 나타낸 것은 연구 1 및 2, 그리고 주사 1 및 6개월-후의 서로 다른 선조체 영역 (미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체)에서의 결과이다. 연구 2에서는, 주사 6개월-후 각 영역에서 2개의 영역 (영역 1 및 2)을 조사하였다. 별표는 비쌍형 t-검정을 기준으로 한 p<0.05 이하에서의 주사된 측면상에서의 AAV9과 AAV9-miRHTT 사이의 상당한 차이를 표시한다.
도 31은 연구 1 (U6 프로모터) 및 연구 2 (CBA 프로모터)에서의 주사 1 및 6개월-후의 MSD 검정에 의해 검출되는 인간 돌연변이 HTT 수준을 나타낸다. 그래프는 AAV9 (대조) 또는 AAV9-miRHTT 중 어느 하나로 처리된 양에서의 개별 값 및 평균 (수평 막대)의 분포를 나타낸다. 서로 다른 선조체 영역 (미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체)에 대하여 결과를 나타내었다. 별표 *는 비쌍형 t-검정을 기준으로 한 p<0.05 이하에서의 주사된 측면상에서의 AAV9과 AAV9-miRHTT 사이의 상당한 차이를 표시한다.
도 32a-32b는 miRHTT 주사된 양 선조체의 같은쪽 피질 및 반대쪽 미상핵 조가비핵에서 mHTT 수준이 변화되지 않는다는 것을 보여준다. 도 32a는 miRHTT 주사된 선조체의 같은쪽 피질에서의 액틴에 대하여 정규화된 mHTT의 평균 수준을 표시하는 그래프를 나타낸다. 데이터는 연구 1에서의 비쌍형 t-검정을 기반으로 한 주사 1 및 6개월-후 NS의 것이다. 도 32b는 miRHTT-주사된 선조체의 반대쪽 미상핵 및 조가비핵에서의 액틴에 대하여 정규화된 mHTT의 수준을 표시하는 막대 그래프를 나타낸다. 데이터는 연구 1에서의 비쌍형 t-검정을 기반으로 한 주사 1 및 6개월-후 NS의 것이다.
본 발명의 측면들은 대상체에게 전달되었을 때 대상체에서의 병원성 헌팅틴 단백질 (HTT)의 발현을 감소시키는 데에 효과적인 특정 간섭 RNA(interfering RNA) (예컨대 인공 miRNA와 같은 miRNA)에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술되는 방법 및 조성물은 헌팅톤병의 치료에 유용하다.
헌팅톤병의 치료 방법
본 개시내용에 의해, 대상체에게 트랜스진 (예컨대 miRNA와 같은 억제성 RNA)을 전달하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 통상적으로 헌팅틴 (htt) 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 간섭 RNA를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 헌팅틴 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 억제성 RNA를 발현시키기 위한 핵산을 포함하는 rAAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 헌팅틴 (예컨대 서열식별번호: 1)의 적어도 2개 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상)의 연속되는 염기에 특이적으로 결합하는 (예컨대 그와 혼성화되는) 억제성 miRNA를 제공한다. 본원에서 사용될 때, "연속되는 염기"는 (예컨대 핵산 분자의 일부로서) 서로 공유 결합되어 있는 (예컨대 하나 이상의 포스포디에스테르 결합 등에 의함) 2개 이상의 뉴클레오티드 염기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA는 서열식별번호: 1의 2개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상)의 연속되는 뉴클레오티드 염기와 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 %, 약 99 % 또는 약 100 % 동일하다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하거나 그에 의해 코딩되는 miRNA이다.
본원에서 사용될 때, "헌팅톤병" 또는 "HD"는 병원성 돌연변이 헌팅틴 단백질 (HTT 또는 mHTT)의 생성을 초래하는 HTT 유전자에서의 3-뉴클레오티드 반복체 확장 (예컨대 CAG, 폴리-글루타민 또는 폴리Q, 트랙트(tract)로 번역됨)에 의해 야기되는 점진적으로 악화되는 운동, 인지 및 행동 변화를 특징으로 하는 신경변성 질환을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 헌팅틴 단백질은 뇌의 특정 영역에서의 뉴런 세포 사멸 속도를 가속한다. 일반적으로, HD의 중증도는 대상체에서의 3-뉴클레오티드 반복체 확장의 크기와 상관된다. 예를 들어, 36 내지 39개 사이의 반복체를 포함하는 CAG 반복체 영역을 가지는 대상체는 "발현성 감퇴(reduced penetrance)" HD를 가지는 것을 특징으로 하는 반면, 40개를 초과하는 반복체를 가지는 대상체는 "완전 발현성" HD를 가지는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, HD에 걸려 있거나 그것에 걸릴 위험이 있는 대상체는 약 36 내지 약 39개 사이의 CAG 반복체 (예컨대, 36, 37, 38 또는 39개의 반복체)를 포함하는 HTT 유전자를 가진다. 일부 실시양태에서, HD에 걸려 있거나 그것에 걸릴 위험이 있는 대상체는 40개를 초과하는 (예컨대, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200개 또는 그 이상인) CAG 반복체를 포함하는 HTT 유전자를 가진다. 일부 실시양태에서, 100개를 초과하는 CAG 반복체를 포함하는 HTT 유전자를 가지는 대상체는 100개 미만의 CAG 반복체를 가지는 대상체에 비해 더 일찍 HD를 발병한다. 일부 실시양태에서, 100개를 초과하는 CAG 반복체를 포함하는 HTT 유전자를 가지는 대상체는 약 20세의 연령 전에 HD 증상들을 발병할 수 있는데, 청소년 HD (무동-경직성 HD 또는 웨스트팔(Westphal) 변이 HD로도 지칭됨)에 걸린 것으로 지칭된다. 대상체 HTT 유전자 대립유전자(allele)에서의 CAG 반복체의 수는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 양식에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 대상체의 생물학적 샘플 (예컨대 혈액)로부터 핵산 (예컨대 DNA)이 단리될 수 있으며, PCR 또는 핵산 서열분석 (예컨대 일루미나(Illumina) 서열분석, 생거(Sanger) 서열분석, SMRT 서열분석 등)과 같은 혼성화-기반 방법에 의해 HTT 대립유전자의 CAG 반복체 수가 측정될 수 있다.
물질의 "유효량"은 원하는 효과를 산출하기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 유효량은 대상체 표적 조직의 충분한 수의 표적 세포를 형질감염 (또는 rAAV 매개 전달 맥락에서의 감염)시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 중추신경계 (CNS) 조직 (예컨대 뇌 조직, 척수 조직, 뇌척수액 (CSF) 등)이다. 일부 실시양태에서, (예컨대 rAAV를 통하여 전달될 수 있는) 단리된 핵산의 유효량은 대상체에서 치료적 이익을 가지기에, 예를 들면 병원성 유전자 또는 단백질 (예컨대 HTT)의 발현을 감소시키기에, 대상체의 수명을 연장하기에, 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상 (예컨대 헌팅톤병의 증상)을 개선하기에 충분한 양일 수 있는 등이다. 유효량은 예를 들면 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 및 표적화될 조직과 같은 다양한 인자들에 따라 달라지게 되며, 그에 따라 본 개시내용의 다른 어딘가에서 기술되는 바와 같이 대상체 및 조직간에 가변적일 수 있다.
단리된 핵산
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 헌팅틴 (HTT)의 발현을 감소시키는 (예컨대 억제하는) 데에 유용한 단리된 핵산을 제공한다. "핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 및 핵산은 단리된다. 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 인공적으로 산출되는 것을 의미한다. 핵산과 관련하여 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 하기를 의미한다: (i) 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 시험관 내에서 증폭되는 것; (ii) 클로닝에 의해 재조합으로 제조되는 것; (iii) 절단 및 겔 분리에 의한 것과 같이 정제되는 것; 또는 (iv) 예를 들면 화학적 합성에 의해 합성되는 것. 단리된 핵산은 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 조작가능한 핵산이다. 따라서, 5' 및 3' 제한 부위가 알려져 있거나 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 프라이머 서열이 개시되어 있는 벡터에 포함되어 있는 뉴클레오티드 서열은 단리된 것으로 간주되나, 그의 자연 숙주 내에서 그의 고유 상태로 존재하는 핵산 서열은 그렇지 않다. 단리된 핵산이 실질적으로 정제될 수도 있으나, 그럴 필요가 있는 것은 아니다. 예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터 내에서 단리되는 핵산은 그것이 존재하는 세포내 물질을 미미한 백분율이지만 그것이 포함할 수 있다는 점에서 순수하지 않다. 그러나, 본원에서 용어가 사용될 때 그와 같은 핵산은 단리된 것인데, 그것이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 표준 기술에 의해 용이하게 조작가능하기 때문이다. 단백질 또는 펩티드와 관련하여 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 그의 자연 환경으로부터 단리되거나 인공적으로 제조된 (예컨대 화학적 합성, 재조합 DNA 기술 등에 의함) 단백질 또는 펩티드를 지칭한다.
숙련 기술자라면, 캡시드 단백질의 기능적으로 등가인 변이체 또는 동종체를 제공하기 위하여 보존성 아미노산 치환이 이루어질 수 있다는 것도 알고 있을 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 보존성 아미노산 치환을 발생시키는 서열 대안을 포괄한다. 본원에서 사용될 때, 보존성 아미노산 치환은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적인 전하 또는 크기 특징을 변경하지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 해당 방법들을 열거하고 있는 참고문헌 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에 나와 있는 것들과 같이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 폴리펩티드 서열 변경 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존성 치환에는 하기 군 내의 아미노산들 사이에서 이루어지는 치환이 포함된다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 이에 따라, 본원에서 개시되는 단백질 및 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 보존성 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산은 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (rAAV 벡터)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산은 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 영역 (예컨대 제1 영역)을 포함한다. 단리된 핵산 (예컨대 재조합 AAV 벡터)은 캡시드 단백질에 패키지화되어 대상체에게 투여되고/거나 선택된 표적 세포로 전달될 수 있다. "재조합 AAV (rAAV) 벡터"는 통상적으로 최소한 트랜스진 및 그의 조절 서열, 그리고 5' 및 3' AAV 역전 말단 반복체 (ITR)로 구성된다. 트랜스진은 본원의 다른 어딘가에서 개시되는 바와 같이 대상체의 내생 mRNA를 표적으로 하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 억제성 RNA (예컨대 miRNA)를 코딩하는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 다른 어딘가에서 기술되는 바와 같이, 트랜스진은 또한 예를 들면 단백질 및/또는 발현 조절 서열 (예컨대 폴리-A 테일)을 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
일반적으로, ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 이러한 서열의 어느 정도의 사소한 변형은 허용가능하지만, 바람직하게는 실질적으로 전체인 ITR 코딩 서열이 분자에 사용된다. 이러한 ITR 서열을 변형시키는 능력은 관련 기술분야의 기술에 속한다 (예컨대 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)]과 같은 교재; 및 문헌 [K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)] 참조). 본 발명에 사용되는 그와 같은 분자의 예는 선택된 트랜스진 서열 및 연관 조절 요소들이 5' 및 3' AAV ITR 서열에 의해 플랭킹되어 있는, 트랜스진을 포함하는 "시스-작용(cis-acting)" 플라스미드이다. AAV ITR 서열은 현재 확인되어 있는 포유동물 AAV 유형들을 포함하여, 어떠한 알려져 있는 AAV로부터도 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예컨대 rAAV 벡터)은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 이들의 변이체에서 선택되는 혈청형을 가지는 적어도 하나의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 AAV2 ITR을 코딩하는 영역 (예컨대 제1 영역)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 추가적으로 제2 AAV ITR을 포함하는 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 이들의 변이체에서 선택되는 혈청형을 가진다. 일부 실시양태에서, 제2 ITR은 기능성인 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있는 돌연변이 ITR이다. "말단 분해 부위가 결핍되어 있는"이라는 용어는 ITR의 말단 분해 부위 (TRS)의 기능을 무효화하는 돌연변이 (예컨대 센스(sense) 돌연변이 예컨대 비-동의 돌연변이, 또는 미스센스 돌연변이)를 포함하는 AAV ITR, 또는 기능성인 TRS를 코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있는 감축된 AAV ITR (예컨대 ΔTRS ITR)을 지칭할 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 기능성인 TRS가 결핍되어 있는 ITR을 포함하는 rAAV 벡터는 예를 들면 문헌 [McCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656]에 기술되어 있는 바와 같이 자가-상보성인 rAAV 벡터를 산출한다.
재조합 AAV 벡터에 대하여 상기에서 밝힌 주요 요소들 이외에, 벡터는 또한 본 발명에 의제 제조되는 벡터에 의해 형질감염되거나 바이러스에 의해 감염된 세포에서의 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 가능하게 하는 방식으로 트랜스진의 요소들과 작용가능하게 연결된 통상적인 조절 요소들을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "작용가능하게 연결된" 서열에는 해당 유전자와 연속되는 발현 조절 서열, 및 트랜스로 작용하거나 원거리에서 작용하여 해당 유전자를 조절하는 발현 조절 서열 둘 다가 포함된다. 발현 조절 서열에는 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉 코자크(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 원할 경우 코딩된 생성물의 분비를 강화하는 서열이 포함된다. 고유성, 상시성, 유도성 및/또는 조직-특이성인 프로모터를 포함한 수많은 발현 조절 서열들이 관련 기술분야에 알려져 있으며, 활용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 핵산 서열 (예컨대 코딩 서열)과 조절 서열은 핵산 서열의 발현 또는 전사를 조절 서열의 영향 또는 조절하에 위치시키도록 하는 방식으로 그들이 공유 연결되는 경우, 작용가능하게 연결된 것으로 지칭된다. 핵산 서열이 기능성인 단백질로 번역되는 것을 원하는 경우, 2개의 DNA 서열은 5' 조절 서열에서의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 발생시키는 경우, 그리고 2개 DNA 서열들 사이 연결의 특성이 (1) 프레임-쉬프트(frame-shift) 돌연변이의 도입을 발생시키지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 유도하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역되는 해당 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는 경우에 작용가능하게 연결된 것으로 지칭된다. 따라서, 생성되는 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 프로모터 영역이 해당 DNA 서열의 전사에 영향을 줄 수 있었던 경우, 프로모터 영역은 핵산 서열에 작용가능하게 연결되는 것이다. 마찬가지로, 2개 이상의 코딩 영역들은 공통 프로모터로부터의 그들의 전사가 2개 이상 단백질의 발현이 인 프레임(in frame)으로 번역되도록 하는 것을 발생시키는 방식으로 그들이 연결되는 경우, 작용가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서는, 작용가능하게 연결된 코딩 서열들이 융합 단백질을 산출한다. 일부 실시양태에서, 작용가능하게 연결된 코딩 서열들은 기능성 RNA (예컨대 miRNA)를 산출한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 상기 트랜스진은 하나 이상의 마이크로RNA(microRNA) (예컨대 miRNA)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 전사 또는 전사-후 유전자 침묵화(silencing)를 매개할 수 있는 소형 비-코딩 RNA 분자이다. 통상적으로, miRNA는 효소적으로 프레(pre)-miRNA로 프로세싱되는 (예컨대 드로샤(Drosha), DGCR8, 파샤(Pasha) 등에 의함) 일차 miRNA (프리(pri)-miRNA)로 지칭되는 헤어핀 또는 스템-루프 (예컨대 자가-상보성, 단일-가닥 백본을 가짐) 이중체 구조로 전사된다. 프리-miRNA의 길이는 가변적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프리-miRNA는 길이가 약 100 내지 약 5000개 염기쌍 (예컨대 약 100, 약 200, 약 500, 약 1000, 약 1200, 약 1500, 약 1800 또는 약 2000개 염기쌍) 범위이다. 일부 실시양태에서, 프리-miRNA는 길이가 200개 염기쌍을 초과한다 (예컨대 2500, 5000, 7000, 9000개 또는 그 이상 염기쌍의 길이).
역시 헤어핀 또는 스템-루프 이중체 구조를 특징으로 하는 프레-miRNA도 길이가 가변적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프레-miRNA는 크기가 약 40개 염기쌍 길이 내지 약 500개 염기쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, 프레-miRNA는 크기가 약 50 내지 100개 염기쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, 프레-miRNA는 크기가 약 50 내지 약 90개 염기쌍 길이 (예컨대 약 50, 약 52, 약 54, 약 56, 약 58, 약 60, 약 62, 약 64, 약 66, 약 68, 약 70, 약 72, 약 74, 약 76, 약 78, 약 80, 약 82, 약 84, 약 86, 약 88 또는 약 90개 염기쌍 길이) 범위이다.
일반적으로, 프레-miRNA는 세포질로 외수송되어 다이서(Dicer)에 의해 효소적으로 프로세싱됨으로써, 먼저 불완전한 miRNA/miRNA* 이중체를, 그리고 다음에는 단일-가닥의 성숙한 miRNA 분자를 산출하며, 이는 이후 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC)에 적재된다. 통상적으로, 성숙한 miRNA 분자는 크기가 약 19 내지 약 30개 염기쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, 성숙한 miRNA 분자는 길이가 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 30개 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 핵산은 서열식별번호: 2-10 또는 21-22 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하는 프리-miRNA, 프레-miRNA 또는 성숙한 miRNA를 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서는 단리된 핵산 또는 벡터 (예컨대 rAAV 벡터)가 하나를 초과하는 (예컨대 2, 3, 4, 5, 10개 또는 그 이상과 같은 다수의) miRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다는 것을 알아야 한다. 일부 실시양태에서, 상기 하나를 초과하는 miRNA 각각은 동일한 표적 유전자를 표적으로 한다 (예컨대 그와 혼성화되거나 거기에 특이적으로 결합함) (예를 들면 각 miRNA가 HTT 유전자를 표적으로 하는 3종의 독자적인 miRNA를 코딩하는 단리된 핵산). 일부 실시양태에서, 하나를 초과하는 miRNA 각각은 서로 다른 표적 유전자를 표적으로 한다 (예컨대 그와 혼성화되거나 거기에 특이적으로 결합함).
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 인공 miRNA를 코딩하는 단리된 핵산 및 벡터 (예컨대 rAAV 벡터)를 제공한다. 본원에서 사용될 때, "인공 miRNA" 또는 "amiRNA"는 예를 들면 문헌 [Eamens et al. (2014), Methods Mol . Biol . 1062:211-224]에 기술되어 있는 바와 같이 miRNA 및 miRNA* (예컨대 miRNA 이중체의 패신저(passenger) 가닥) 서열이 표적 유전자의 고도로 효율적인 RNA 침묵화를 유도하는 상응하는 amiRNA/amiRNA* 서열로 대체되어 있는 내생 프리-miRNA 또는 프레-miRNA (예컨대 기능성인 성숙한 miRNA를 생성시킬 수 있는 전구체 miRNA인 miRNA 백본)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인공 miRNA는 내생 miR-155 성숙 miRNA-코딩 서열 대신 성숙한 HTT-특이적 miRNA를 코딩하는 서열 (예컨대 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나)이 삽입되어 있는 miR-155 프리-miRNA 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 기술되는 바와 같은 miRNA (예컨대 인공 miRNA)는 miR-155 백본 서열, miR-30 백본 서열, miR-64 백본 서열 또는 miR-122 백본 서열을 포함한다.
트랜스진을 포함하는 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)은 단리된 핵산의 어떠한 적합한 위치에도 배치될 수 있다. 상기 영역은 예를 들면 인트론, 5' 또는 3' 비번역 영역 등을 포함하여 핵산의 어떠한 비번역 부분에도 배치될 수 있다.
일부 경우에는, 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (예컨대 단백질 코딩 서열) 첫 번째 코돈의 상류에 상기 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 배치시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 2000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 1000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 500개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 250개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 150개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다.
일부 경우 (예컨대 트랜스진에 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있는 경우)에는, 트랜스진의 폴리-A 테일의 상류에 상기 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 배치하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 2000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 1000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 500개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 250개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 150개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 100개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 50개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 20개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 영역은 프로모터 서열의 마지막 뉴클레오티드 염기와 폴리-A 테일 서열의 첫 번째 뉴클레오티드 염기 사이에 배치된다.
일부 경우에서, 상기 영역은 트랜스진 폴리-A 테일의 마지막 염기의 하류에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 2000개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 1000개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 500개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 250개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 150개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다.
트랜스진이 하나를 초과하는 miRNA를 코딩하는 경우, 각 miRNA는 트랜스진 내의 어떠한 적합한 위치에도 배치될 수 있다는 것을 알아야 한다. 예를 들면, 제1 miRNA를 코딩하는 핵산은 트랜스진의 인트론에 배치될 수 있으며, 제2 miRNA를 코딩하는 핵산 서열은 또 다른 비번역 영역 (예컨대 트랜스진의 단백질 코딩 서열 마지막 코돈과 폴리-A 테일 첫 번째 염기 사이)에 배치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 추가적으로 하나 이상의 발현 조절 서열 (예컨대 프로모터 등)을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 발현 조절 서열에는 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉 코자크 공통 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 원할 경우 코딩된 생성물의 분비를 강화하는 서열이 포함된다. 고유성, 상시성, 유도성 및/또는 조직-특이성인 프로모터를 포함한 대단히 많은 수의 발현 조절 서열들이 관련 기술분야에 알려져 있으며, 활용될 수 있다.
"프로모터"는 특정 유전자 전사를 개시하는 데에 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. "작용가능하게 배치된", "조절하에 있는" 또는 "전사 조절하에 있는"이라는 구는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 조절하는 데에 있어서 핵산과 관련하여 올바른 위치 및 배향으로 존재한다는 것을 의미한다.
단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 후 및 3' AAV ITR 서열 전에 삽입된다. 본 개시내용에 유용한 rAAV 구조체는 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 트랜스진 사이에 위치하는 인트론을 포함할 수도 있다. 한 가지 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래하며, SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다. 사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 하나를 초과하는 폴리펩티드를 생성시키는 데에 사용된다. IRES 서열은 하나를 초과하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질을 생성시키는 데에 사용되게 된다. 이러한 공통적인 벡터 요소들 및 다른 것들의 선택은 통상적인 것으로써, 많은 그와 같은 서열들이 구입가능하다 (예컨대 문헌 [Sambrook et al.] 및 예를 들면 그안의 페이지 3.18 3.26 및 16.17 16.27에 인용되어 있는 참고문헌, 그리고 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조). 일부 실시양태에서는, 발입병 바이러스 2A 서열이 다중단백질(polyprotein)에 포함되는데; 이는 다중단백질의 절단을 매개하는 것으로 나타나 있는 소형 펩티드 (대략 18개 아미노산 길이)이다 (문헌 [Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933]; [Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127]; [Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873]; 및 [Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459]). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 치료법 벡터 (AAV 및 레트로바이러스)를 포함한 인공 시스템에서 이미 입증되어 있다 (문헌 [Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933]; [Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127]; [Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873]; 및 [Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459]; [de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208]; [de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.]; 및 [Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817]).
상시성 프로모터의 예에는 비제한적으로 레트로바이러스 로우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의적으로 RSV 인핸서 포함), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의적으로 CMV 인핸서 포함) (예컨대 문헌 [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터 [인비트로겐(Invitrogen) 사]가 포함된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 강화된 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 U6 프로모터이다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하며, 외인성으로 공급되는 화합물, 온도와 같은 환경 인자, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들면 세포 또는 복제중인 세포에서만의 급성인 단계, 특정 분화 상태에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 비제한적으로 인비트로겐 사, 클론테크(Clontech) 사 및 아리아드(Ariad) 사를 포함한 다양한 시중의 공급원으로부터 구입가능하다. 많은 다른 시스템들이 기술된 바 있으며, 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인성으로 공급되는 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예에는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 포유동물 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템 (WO 98/10088호); 엑디손 곤충 프로모터 (문헌 [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]); 테트라사이클린-억제성 시스템 (문헌 [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]); 테트라사이클린-유도성 시스템 (문헌 [Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 문헌 [Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)]도 참조); RU486-유도성 시스템 (문헌 [Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]) 및 라파마이신-유도성 시스템 (문헌 [Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)])이 포함된다. 이와 같은 맥락에서 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들면 온도, 세포 또는 복제중인 세포에서만의 급성 단계, 특정 분화 상태에 의해 조절되는 것들이다.
또 다른 실시양태에서는, 트랜스진의 고유 프로모터가 사용되게 된다. 고유 프로모터는 트랜스진의 발현이 고유 발현을 모방하기를 원하는 경우에 바람직할 수 있다. 고유 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발생에 따라, 또는 조직-특이적인 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 고유 발현을 모방하기 위하여 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코자크 공통 서열과 같은 다른 고유 발현 조절 요소들이 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 조절 서열은 조직-특이적인 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에서, 조직-특이적인 조절 서열은 조직 특이적인 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적인 전사 인자에 결합한다. 그와 같은 조직-특이적 조절 서열 (예컨대 프로모터, 인핸서 등)에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 대표적인 조직-특이적 조절 서열에는 하기의 조직 특이적 프로모터들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 간-특이적 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 인슐린 프로모터, 글루카곤 프로모터, 소마토스타틴 프로모터, 췌장 폴리펩티드 (PPY) 프로모터, 시냅신-1 (Syn) 프로모터, 크레아틴 키나제 (MCK) 프로모터, 포유동물 데스민 (DES) 프로모터, α-미오신 중쇄 (a-MHC) 프로모터 또는 심장 트로포닌 T (cTnT) 프로모터. 다른 대표적인 프로모터로는 숙련 기술자라면 알고 있을 여러 가지 중에서도 베타-액틴 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터 (문헌 [Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)]); 알파-페토단백질 (AFP) 프로모터 (문헌 [Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)]), 골 오스테오칼신 프로모너 (문헌 [Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)]); 골 시알로단백질 프로모터 (문헌 [Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)]), CD2 프로모터 (문헌 [Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)]); 이뮤노글로불린 중쇄 프로모터; T 세포 수용체 α-사슬 프로모터, 뉴런성 예컨대 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터 (문헌 [Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]), 뉴로필라멘트 경-쇄 유전자 프로모터 (문헌 [Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)]) 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 프로모터 (문헌 [Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)])가 포함된다.
본 개시내용의 측면들은 하나를 초과하는 프로모터 (예컨대 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 프로모터)를 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 제1 영역 및 억제성 RNA (예컨대 miRNA)를 코딩하는 제2 영역을 포함하는 트랜스진을 가지는 구성체의 맥락에서는, 제1 프로모터 서열 (예컨대 단백질 코딩 영역에 작용가능하게 연결된 제1 프로모터 서열)을 사용하여 단백질 코딩 영역의 발현을 추진하고, 제2 프로모터 서열 (예컨대 억제성 RNA 코딩 영역에 작용가능하게 연결된 제2 프로모터 서열)을 사용하여 억제성 RNA 코딩 영역의 발현을 추진하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 상기 제1 프로모터 서열 및 제2 프로모터 서열은 동일한 프로모터 서열 또는 서로 다른 프로모터 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 프로모터 서열 (예컨대 단백질 코딩 영역의 발현을 추진하는 프로모터)은 RNA 폴리머라제 III (polIII) 프로모터 서열이다. polIII 프로모터 서열의 비-제한적인 예에는 U6 및 H1 프로모터 서열이 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 프로모터 서열 (예컨대 억제성 RNA의 발현을 추진하는 프로모터 서열)은 RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터 서열이다. polII 프로모터 서열의 비-제한적인 예에는 T7, T3, SP6, RSV 및 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열이 포함된다. 일부 실시양태에서는, polIII 프로모터 서열이 억제성 RNA (예컨대 miRNA) 코딩 영역의 발현을 추진한다. 일부 실시양태에서는, polII 프로모터 서열이 단백질 코딩 영역의 발현을 추진한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 상기 단백질은 치료용 단백질 (예컨대 포유동물 대상체에서의 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드) 또는 리포터 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 치료용 단백질은 헌팅톤병의 치료 또는 예방에 유용한 것, 예를 들면 문헌 [Marelli et al. (2016) Orphanet Journal of Rare Disease 11:24; doi:10.1186/s13023-016-0405-3]에 기술되어 있는 바와 같은 폴리글루타민 결합 펩티드 1 (QBP1), PTD-QBP1, ED11, C4 내부체(intrabody), VL12.3 내부체, MW7 내부체, Happ1 항체, Happ3 항체, mEM48 내부체, 특정 단일클론 항체 (예컨대 1C2) 및 펩티드 P42, 그리고 이들의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 치료용 단백질은 야생형 헌팅틴 단백질 (예컨대 36개 미만의 반복체를 포함하는 폴리Q 반복 영역을 가지는 헌팅틴 단백질)이다.
어떠한 특정 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 야생형 HTT 발현 및 기능이 세포에서 보존되기 때문에, 돌연변이 헌팅틴 (HTT)의 대립유전자-특이적 침묵화는 비-대립유전자 특이적 침묵화 (예컨대 야생형 및 돌연변이 HTT 대립유전자 둘 다의 침묵화)에 비해 대상체에서 향상된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다. 본 발명의 측면들은 비-대립유전자-특이적인 방식으로 HTT 유전자를 표적으로 하면서도 경화된(hardened) 야생형 HTT 유전자 (miRNA에 의해 표적화되지 않는 야생형 HTT 유전자)의 발현을 추진하는 하나 이상의 억제성 RNA (예컨대 miRNA) 서열을 포함하는 단리된 핵산 및 벡터가 예를 들면 CNS 조직에서 야생형 HTT의 증가된 발현에 의해 동시적인 돌연변이 HTT 녹다운(knockdown)을 달성할 수 있다는 발명자들의 인지 및 인식과 관련된다. 일반적으로, 내생 야생형 및 돌연변이 HTT mRNA를 코딩하는 핵산과 "경화된" 야생형 HTT mRNA를 코딩하는 트랜스진 핵산의 서열은 충분히 서로 달라서, "경화된" 야생형 HTT 트랜스진 mRNA는 하나 이상의 억제성 RNA (예컨대 miRNA)에 의해 표적화되지 않는다. 이는 예를 들면 HTT 트랜스진 서열에 하나 이상의 침묵 돌연변이를 도입함으로써 그것이 내생 야생형 HTT 유전자와 동일한 단백질을 코딩하나 상이한 핵산 서열을 가지도록 하는 것에 의해 달성될 수 있다. 이와 같은 경우, 외인성 mRNA는 "경화된" 것으로 지칭될 수 있다. 대안적으로, 억제성 RNA (예컨대 miRNA)는 내생 야생형 HTT mRNA의 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 표적으로 할 수 있다. 다음에, 이러한 5' 및/또는 3' 영역은 트랜스진 mRNA가 하나 이상의 억제성 RNA에 의해 표적화되지 않도록 트랜스진 mRNA에서는 제거되거나 대체될 수 있다.
트랜스진에 제공될 수 있는 리포터 유전자 (예컨대 리포터 단백질을 코딩하는 핵산 서열)에는 비제한적으로 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로르암페니콜 아세틸프랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 및 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 것들을 코딩하는 DNA 서열이 포함된다. 그의 발현을 추진하는 조절 요소들과 결합될 경우, 리포터 서열은 효소, 방사선사진, 색상측정, 형광 또는 기타 분광사진 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정, 그리고 효소 연관 면역흡착제 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA) 및 면역조직화학을 포함한 면역학적 검정을 포함한 통상적인 수단에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 보유하는 벡터의 존재는 β-갈락토시다제 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 트랜스진이 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 보유하는 벡터는 발광측정기에서 색상 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다. 이와 같은 리포터들은 예를 들면 핵산의 조직-특이적 표적화 능력 및 조직 특이적 프로모터 조절 활성을 검증하는 데에 유용할 수 있다.
재조합 아데노 -연관 바이러스 ( rAAV )
일부 측면에서, 본 개시내용은 단리된 AAV를 제공한다. AAV와 관련하여 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 인공적으로 제조되거나 수득된 AAV를 지칭한다. 단리된 AAV는 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 그와 같은 AAV는 본원에서 "재조합 AAV"로 지칭된다. 재조합 AAV (rAAV)는 바람직하게는 조직-특이적 표적화 능력을 가지고 있어서, rAAV의 뉴클레아제 및/또는 트랜스진이 하나 이상의 예정된 조직(들)으로 특이적으로 전달되게 된다. AAV 캡시드는 이러한 조직-특이적 표적화 능력을 결정하는 데에 있어서 중요한 요소이다. 이에 따라, 조직이 표적화되는 데에 적절한 캡시드를 가지는 rAAV가 선택될 수 있다.
원하는 캡시드 단백질을 가지는 재조합 AAV를 수득하기 위한 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들면 그 내용이 전체적으로 본원에 참조로 포함되는 US 2003/0138772호 참조). 통상적으로, 상기 방법은 AAV 캡시드 단백질; 기능성인 rep 유전자; AAV 역전 말단 반복체 (ITR) 및 트랜스진으로 구성되는 재조합 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 단백질에의 재조합 AAV 벡터의 패키지화를 가능하게 하기에 충분한 헬퍼(helper) 기능성들을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV의 cap 유전자에 의해 코딩되는 구조 단백질이다. AAV는 모두 대안적인 스플라이싱을 통하여 단일 cap 유전자로부터 전사되는 3종의 캡시드 단백질인 비리온 단백질 1 내지 3 (VP1, VP2 및 VP3으로 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2 및 VP3의 분자량은 각각 약 87 kDa, 약 72 kDa 및 약 62 kDa이다. 일부 실시양태에서, 번역시, 캡시드 단백질은 바이러스 게놈 주변으로 구형의 60-량체 단백질 쉘(shell)을 형성한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질의 기능은 바이러스 게놈을 보호하고, 게놈을 전달하며, 숙주와 상호작용하는 것이다. 일부 측면에서, 캡시드 단백질은 조직 특이적인 방식으로 숙주로 바이러스 게놈을 전달한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAVrh8, AAV9 및 AAV10으로 구성되는 군에서 선택되는 AAV 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 비-인간 영장류로부터 유래하는 혈청형, 예를 들면 AAVrh8 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
AAV 캡시드에 rAAV 벡터를 패키지화하기 위하여 숙주 세포에서 배양될 구성요소들은 트랜스로(in trans) 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 필요한 구성요소들 중 임의의 하나 이상 (예컨대 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능성)은 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 필요한 구성요소 중 하나 이상을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 그와 같은 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 조절하에 필요한 구성요소(들)를 함유하게 된다. 그러나, 필요한 구성요소(들)는 상시성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 상시성 프로모터의 예는 본원의 트랜스진과 함께 사용하기에 적합한 조절 요소들에 대한 논의에서 제공된다. 또 다른 대안에서, 선택되는 안정한 숙주 세포는 상시성 프로모터의 조절하에 있는 선택된 구성요소(들)를, 그리고 하나 이상의 유도성 프로모터의 조절하에 있는 다른 선택된 구성요소(들)를 함유할 수 있다. 예를 들면, 293 세포 (상시성 프로모터의 조절하에 E1 헬퍼 기능성을 포함함)로부터 유래하나 유도성 프로모터의 조절하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 또 다른 안정한 숙주 세포가 생성될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 (예컨대 야생형 헌팅틴 단백질, 임의적으로 "경화된" 야생형 헌팅틴 단백질)을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기한 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 숙주 세포를 포함하는 상기 조성물은 추가적으로 냉동보존제를 포함한다.
본 개시내용의 rAAV를 제조하는 데에 필요한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및 헬퍼 기능성은 어떠한 적절한 유전자 요소 (벡터)를 사용하여서도 패키지화용 숙주 세포로 전달될 수 있다. 선택되는 유전자 요소는 본원에서 기술되는 것들을 포함한 어떠한 적합한 방법에 의해서도 전달될 수 있다. 본 개시내용의 임의 실시양태를 구성하는 데에 사용되는 방법은 핵산 조작 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술이 포함된다. 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조한다. 마찬가지로, rAAV 비리온을 생성시키는 방법이 잘 알려져 있으며, 적합한 방법의 선택이 본 개시내용에 있어서 제한이 되는 것은 아니다. 예를 들면, 문헌 [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 U.S. 특허 제5,478,745호를 참조한다.
일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질감염법 (U.S. 특허 제6,001,650호에 상세하게 기술되어 있음)을 사용하여 제조될 수 있다. 통상적으로, 재조합 AAV는 AAV 입자로 패키지화될 재조합 AAV 벡터 (트랜스진을 포함하는 것), AAV 헬퍼 기능성 벡터 및 액세서리 기능성 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질감염시키는 것에 의해 제조된다. AAV 헬퍼 기능성 벡터는 증식성 AAV 복제 및 캡시드화(encapsidation)에 트랜스로 기능하는 "AAV 헬퍼 기능성" 서열 (즉 rep 및 cap)을 코딩한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능성 벡터는 조금의 검출가능한 야생형 AAV 비리온 (즉 기능성인 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)도 생성시키지 않는 효율적인 AAV 벡터 제조를 뒷받침한다. 본 개시내용과 함께 사용하기에 적합한 벡터의 비-제한적인 예에는 U.S. 특허 제6,001,650호에 기술되어 있는 pHLP19 및 U.S. 특허 제6,156,303호에 기술되어 있는 pRep6cap6 벡터가 포함되며, 둘 다 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. 액세서리 기능성 벡터는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 AAV가 복제를 위하여 의존하는 세포 기능성 (즉 "액세서리 기능성")을 위한 뉴클레오티드 서열들을 코딩한다. 액세서리 기능성에는 비제한적으로 AAV 유전자 전사 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 조립에 연관되어 있는 부분들을 포함한 AAV 복제에 필요한 기능성들이 포함된다. 바이러스-기반 액세서리 기능성은 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (헤르페스 심플렉스 바이러스 유형-1이 아닌 다른 것) 및 박시니아 바이러스와 같은 알려져 있는 헬퍼 바이러스들 중 어느 것으로부터 유래할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. "형질감염"이라는 용어는 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하는 데에 사용되는 것으로써, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입된 경우에 세포는 "형질감염된" 것이다. 수많은 형질감염 기술들이 관련 기술분야에 일반적으로 알려져 있다. 예를 들면 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456], [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York], [Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier] 및 [Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 그와 같은 기술들은 뉴클레오티드 통합 벡터 및 기타 핵산 분자와 같은 하나 이상의 외인성 핵산을 적합한 숙주 세포로 도입하는 데에 사용될 수 있다.
"숙주 세포"는 해당 물질을 함유하거나 함유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 구성체, AAV 미니유전자 플라스미드, 액세서리 기능성 벡터, 또는 재조합 AAV의 제조와 연관되어 있는 다른 이전 DNA의 수용자로 사용될 수 있다. 상기 용어는 형질감염된 기원 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용될 때의 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열에 의해 형질감염된 바 있는 세포를 지칭할 수 있다. 자연적이거나, 우연하거나 또는 고의적인 돌연변이로 인하여, 단일 모체 세포의 자손들이 형태구조 또는 게놈 또는 총 DNA 보체에 있어서 원래의 모체와 반드시 완전히 동일할 필요는 없을 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용될 때, "세포주"라는 용어는 시험관 내에서 연속적이거나 장기간인 성장 및 분할을 할 수 있는 세포 군집을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 선조 세포로부터 유래하는 클론 군집이다. 그와 같은 클론 군집의 저장 또는 이전 동안 핵형에 있어서 자발적이거나 유도된 변화가 발생할 수 있다는 것 또한 관련 기술분야에 알려져 있다. 따라서, 언급되는 세포주로부터 유래하는 세포들은 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일하지는 않을 수 있는데, 언급되는 세포주는 그와 같은 변이체들을 포괄한다.
본원에서 사용될 때, "재조합 세포"라는 용어는 생물학적으로-활성인 폴리펩티드의 전사 또는 생물학적으로 활성인 핵산 예컨대 RNA의 생성으로 이어지는 DNA 분절과 같은 외인성 DNA 분절이 도입되어 있는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "벡터"라는 용어에는 적정한 조절 요소와 결합될 경우 복제를 할 수 있으며 세포들 사이에서 유전자 서열을 이전할 수 있는 임의의 유전자 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등이 포함된다. 따라서, 상기 용어에는 클로닝 및 발현 비히클은 물론, 바이러스 벡터도 포함된다. 일부 실시양태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 분절이 프로모터의 전사 조절하에 배치되는 벡터인 것으로 생각된다. "프로모터"는 유전자의 특이적인 전사를 개시하는 데에 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. "작용가능하게 배치된", "조절하에 있는" 또는 "전사 조절하에 있는"이라는 구는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 조절하는 핵산과 관련하여 올바른 위치 및 배향으로 존재한다는 것을 의미한다. "발현 벡터 또는 구성체"라는 용어는 서열을 코딩하는 핵산의 일부 또는 전체가 전사될 수 있는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 구성체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 발현에는 예를 들면 전사되는 유전자로부터 생물학적으로-활성인 폴리펩티드 생성물 또는 기능성 RNA (예컨대 가이드 RNA)를 생성시키기 위한 핵산의 전사가 포함된다. 본 개시내용의 rAAV를 제조하기 위한 원하는 AAV 캡시드에의 재조합 벡터의 전기한 패키지화 방법이 제한되는 것을 의미하는 것은 아니며, 숙련 기술자라면 다른 적합한 방법이 떠오르게 될 것이다.
일부 실시양태에서는, 서열 목록에서 제공되는 서열을 포함한 본원에서 제공되는 서열 중 임의의 하나 이상 티미딘 (T) 뉴클레오티드 또는 우리딘 (U) 뉴클레오티드가 아데노신 뉴클레오티드와의 염기 쌍형성 (예컨대 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 통함)에 적합한 임의의 다른 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 서열 목록에서 제공되는 서열을 포함한 본원에서 제공되는 서열 중 임의의 하나 이상 티미딘 (T) 뉴클레오티드는 우리딘 (U) 뉴클레오티드로 적합하게 대체될 수 있거나, 또는 그 반대이다.
투여 양식
본 개시내용의 rAAV는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적절한 방법에 따라 조성물 중에서 대상체에게 전달될 수 있다. 예를 들면, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 담체에 현탁된 (즉 조성물 중의) rAAV가 대상체, 즉 숙주 동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니 피그, 햄스터, 닭, 칠면조 또는 비-인간 영장류 (예컨대 마카크)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 숙주 동물에 인간이 포함되지 않는다.
포유동물 대상체에의 rAAV의 전달은 예를 들면 근육내 주사에 의하거나, 또는 포유동물 대상체 혈류로의 투여에 의할 수 있다. 혈류로의 투여는 정맥, 동맥 또는 임의의 다른 혈관에의 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 수술 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 기술인 격리된 사지 관류(isolated limb perfusion)에 의해 혈류로 투여되는데, 상기 방법은 본질적으로 통상의 기술자가 rAAV 비리온의 투여 전에 전신 순환으로부터 사지를 격리하는 것을 가능하게 한다. U.S. 특허 제6,177,403호에 기술되어 있는 격리된 사지 관류 기술의 변형 역시 근육 세포 또는 조직으로의 형질도입을 잠재적으로 강화하기 위하여 격리된 사지의 혈관구조에 비리온을 투여하는 데에 숙련 기술자에 의해 사용될 수 있다. 또한, 어떤 경우에는, 대상체의 CNS로 비리온을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. "CNS"는 척추동물 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직을 의미한다. 따라서, 상기 용어에는 뉴런 세포, 신경아교세포, 별아교세포, 뇌척수액 (CSF), 간질 공간, 골, 연골 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 재조합 AAV는 예컨대 뇌실 영역에의 주사에 의해 직접 CNS 또는 뇌로는 물론, 정위 주사에 의하는 것과 같이 관련 기술분야에 알려져 있는 신경외과적 기술을 사용하여 바늘, 카테터 또는 관련 장치에 의해 선조체 (예컨대 선조체의 미상핵 또는 조가비핵), 척수 및 신경근 이음부 또는 소뇌 소엽으로 전달될 수 있다 (예컨대 문헌 [Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999]; [Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000]; [Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993]; 및 [Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000] 참조). 일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 기술되는 바와 같은 rAAV는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 뇌내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 수막강내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 선조체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 두개내 주사에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 대조(cisterna magna) 주사에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 뇌 외측 뇌실 주사에 의해 전달된다.
본 개시내용의 측면들은 캡시드 단백질 및 트랜스진을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것으로써, 여기서 상기 트랜스진은 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 miRNA는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 또한 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 rAAV는 서열식별번호: 16-19 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열 또는 그의 일부로 표시되는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 추가적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 단독, 또는 하나 이상의 다른 바이러스 (예컨대 하나 이상의 다른 트랜스진을 코딩하여 보유하는 제2의 rAAV)와의 조합으로써 rAAV를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 각각 하나 이상의 서로 다른 트랜스진을 가지는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 이상의 서로 다른 rAAV를 포함한다.
적합한 담체는 rAAV가 가이드되는 지시의 관점에서 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 적합한 담체로는 다양한 완충 용액과 배합될 수 있는 식염수가 포함된다 (예컨대 포스페이트 완충 식염수). 다른 대표적인 담체에는 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 덱스트란, 아가, 펙틴, 땅콩 오일, 참깨 오일 및 물이 포함된다. 담체의 선택이 본 개시내용의 제한이 되는 것은 아니다.
임의적으로, 본 개시내용의 조성물은 rAAV 및 담체(들) 이외에 다른 통상적인 제약용 성분들, 예컨대 보존제 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 대표적인 보존제에는 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화 황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀이 포함된다. 적합한 화학적 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다.
rAAV는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키기에, 그리고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적인 제약상 허용되는 투여 경로에는 선택된 기관으로의 직접 전달 (예컨대 간으로의 문맥내 전달), 경구, 흡입 (비내 및 기관내 전달 포함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 기타 비경구 투여 경로가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 원할 경우, 투여 경로들이 조합될 수도 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하는 데에 필요한 rAAV 비리온의 투여량, 예를 들면 체중 킬로그램 당/게놈 카피수 (GC/kg)로 나타낸 투여량 단위는 비제한적으로 하기를 포함한 몇 가지 인자들을 기준으로 가변적이게 된다: rAAV 비리온 투여의 경로, 치료 효과를 달성하는 데에 필요한 유전자 또는 RNA 발현의 수준, 치료되는 구체적인 질환 또는 장애, 및 유전자 또는 RNA 생성물의 안정성. 관련 기술분야 통상의 기술자라면 상기언급된 인자들은 물론 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 인자들을 기준으로 특정 질환 또는 장애를 가지고 있는 환자들을 치료하기 위한 rAAV 비리온 투여량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
rAAV의 유효량은 원하는 조직을 표적으로 하여 동물을 표적 감염시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, rAAV의 유효량은 안정한 체세포 트랜스제닉 동물 모델을 생성시키기에 충분한 양이다. 유효량은 일차적으로 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 그리고 표적화될 조직과 같은 인자들에 따라 달라지게 되며, 그에 따라 동물 및 조직간에 가변적일 수 있다. 예를 들면, rAAV의 유효량은 일반적으로 약 109 내지 1016개의 게놈 카피를 함유하는 용액 약 1 ml 내지 약 100 ml의 범위이다. 일부 경우에는, 약 1011 내지 1013개 사이 rAAV 게놈 카피의 투약량이 적절하다. 특정 실시양태에서는, 1012 또는 1013개의 rAAV 게놈 카피가 CNS 조직을 표적화하는 데에 효과적이다. 일부 경우에, 안정한 트랜스제닉 동물은 다수의 rAAV 투여에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, rAAV의 투여분은 역일(calendar day) (예컨대 24-시간 기간) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 투여분은 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 역일 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 투여분은 역주(calendar week) (예컨대 7 역일) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 격주 (예컨대 2 역주 기간에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 역월 (calendar month) 당 1회 (예컨대 30 역일에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 6 역월 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 역년(calendar year) (예컨대 365일 또는 윤년의 경우 366일) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, rAAV 조성물은 특히 고농도의 rAAV가 존재하는 경우 (예컨대 ~1013 GC/ml 또는 그 이상) 조성물 중 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 배합된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있는데, 예를 들면 계면활성제의 첨가, pH 조정, 염 농도 조정 등이 포함된다 (예컨대 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178] 참조).
제약상-허용되는 부형제 및 담체 용액의 배합에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는데, 다양한 치료 요법에서의 본원에서 기술되는 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발도 그러하다.
통상적으로, 이러한 배합물은 적어도 약 0.1 % 또는 그 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 상기 백분율은 당연히 가변적일 수 있으며, 편리하게도 총 배합물 중량 또는 부피의 약 1 또는 2 % 내지 약 70 % 또는 80 % 또는 그 초과 사이일 수 있다. 물론, 각 치료상-유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 어떠한 주어진 화합물의 단위 투여분에서도 적합한 투약량이 수득되게 되는 방식으로 준비될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 그와 같은 제약용 배합물을 제조함에 있어서 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명과 같은 인자들은 물론, 다른 약학적 고려사항들을 고려하게 될 것이므로, 말 그대로 다양한 투약량 및 치료 요법들이 바람직할 수 있다.
소정의 상황에서는, 본원에서 개시되는 적합하게 배합된 제약용 조성물 중 rAAV-기반 치료용 구성체를 피하, 췌장내, 비내, 비경구, 정맥내, 근육내, 수막강내 또는 경구, 복강내 중 어느 하나로, 또는 흡입에 의해 전달하는 것이 바람직하게 된다. 일부 실시양태에서는, U.S. 특허 제5,543,158호; 5,641,515호 및 5,399,363호 (각각 그 전체가 구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 바와 같은 투여 양태들이 rAAV를 전달하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 투여 양식은 문맥 주사에 의한 것이다.
주사가능 용도에 적합한 제약용 형태에는 멸균 수용액 또는 분산액, 그리고 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서, 그리고 오일 중에서 제조될 수도 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건하에서, 이러한 조제물들은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 많은 경우에서, 상기 형태는 멸균되며, 용이한 주사성(syringability)이 존재하는 정도까지 유동성이다. 그것은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적정한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균 및 항진균 작용제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들면 당 또는 나트륨 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직하게 된다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 중 사용에 의해 달성될 수 있다.
주사가능 수용액 투여의 경우, 예를 들면 용액은 필요에 따라 적합하게 완충된 것, 및 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스를 사용하여 등장화된 액체 희석제일 수 있다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여서는, 사용될 수 있는 멸균 수성 매체가 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들면, 1 투약량이 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해된 후, 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가되거나, 또는 제안된 주입 부위에 주사되는 것 중 어느 하나일 수 있다 (예를 들면 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 숙주의 조건에 따라 약간의 투약량 변동은 반드시 발생하게 된다. 어떠한 경우에도, 투여를 담당하는 사람이 개별 숙주를 위한 적절한 투여량을 결정하게 된다.
멸균 주사가능 용액은 필요에 따라 본원에서 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 활성 rAAV를 필요한 양으로 적절한 용매에 혼입한 후, 이어서 여과 멸균하는 것에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 상기에서 열거된 것들에 속하는 기본 분산 매체 및 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분들을 혼입하는 것에 의해 제조된다. 멸균 주사가능 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 그들의 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 더하기 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공-건조 및 냉동-건조 기술이다.
본원에서 개시되는 rAAV 조성물은 중성 또는 염 형태로 배합될 수도 있다. 제약상-허용되는 염에는 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)이 포함되는데, 예를 들면 염산 또는 인산과 같은 무기 산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기 산과 형성된다. 유리 카르복실 기를 사용하여 형성되는 염은 예를 들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 히드록시드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 배합시, 용액은 투약 배합물과 상용성인 방식으로, 그리고 치료적으로 유효한 만큼의 양으로 투여되게 된다. 배합물은 주사가능 용액, 약물-방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약 형태로 용이하게 투여된다.
본원에서 사용될 때, "담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매체, 비히클, 코팅, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 제약 활성 물질용으로의 그와 같은 매체 및 작용제들의 사용에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분이 조성물에 혼입될 수도 있다. "제약상-허용되는"이라는 구는 숙주에게 투여되었을 때 알레르기 반응 또는 유사한 원치 않는 반응을 야기하지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다.
적합한 숙주 세포에의 본 개시내용 조성물의 도입을 위하여, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 미세구체, 지질 입자, 소포 등과 같은 전달 비히클이 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터 전달 트랜스진은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구체 또는 나노입자 등 중 어느 하나에의 캡슐화된 전달용으로 제제화될 수 있다.
그와 같은 제제는 본원에서 개시되는 핵산 또는 rAAV 구성체의 제약상 허용되는 배합물의 도입에 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 일반적으로 알려져 있다. 최근에는, 향상된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 가지는 리포좀이 개발되었다 (U.S. 특허 제5,741,516호). 또한, 잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 조제물의 다양한 방법들이 기술되어 있다 (U.S. 특허 제5,567,434호; 5,552,157호; 5,565,213호; 5,738,868호 및 5,795,587호).
리포좀은 다른 절차에 의한 형질감염에 대해서는 보통 내성인 수많은 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀에는 바이러스-기반 전달 시스템에서 통상적인 DNA 길이 제약이 없다. 리포좀은 다양한 배양 세포주 및 동물에 유전자, 약물, 방사선치료제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테리형 이펙터(allosteric effector)를 도입하는 데에 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀-매개 약물 전달의 효과성을 조사하는 몇 가지 성공적인 임상 시험들이 완료된 바 있다.
리포좀은 수성 매체 중에 분산되어 자발적으로 다층상 동심 이중층 소포 (다층상 소포 (MLV)로도 지칭됨)를 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 ㎛의 직경을 가진다. MLV의 초음파처리는 200 내지 500 Å 범위의 직경을 가지며 코어에 수용액을 함유하는 소형 단층상 소포 (SUV)의 형성을 발생시킨다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제제가 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 방지하기 위하여, 그와 같은 초미세 입자 (0.1 ㎛ 가량의 크기)는 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용 고려된다.
상기한 전달 방법들에 더하여, 하기하는 기술들도 숙주에의 rAAV 조성물의 대안적인 전달 방법으로 고려된다. 초음파영동(sonophoresis) (즉 초음파)이 사용된 바 있는데, 순환 시스템으로의, 그리고 그를 통한 약물 투과의 속도 및 효능을 강화하기 위한 장치로서 U.S. 특허 제5,656,016호에 기술되어 있다. 고려되는 다른 약물 전달 대안으로는 골내 주사 (U.S. 특허 제5,779,708호), 마이크로칩 장치 (U.S. 특허 제5,797,898호), 안구 제제 (문헌 [Bourlais et al., 1998]), 경피 매트릭스 (U.S. 특허 제5,770,219호 및 5,783,208호) 및 피드백(feedback)-조절 전달 (U.S. 특허 제5,697,899호)이 있다.
키트 및 관련 조성물
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 작용제는 치료, 진단 또는 연구 적용분야에서의 그의 사용을 용이하게 하기 위한 제약용 또는 진단용 또는 연구용 키트로 조립될 수 있다. 키트는 본 개시내용의 구성요소들 및 사용 지침을 수용하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 구체적으로, 그와 같은 키트는 해당 작용제의 예정된 적용분야 및 적정한 사용에 대해 기술하는 지침과 함께 본원에서 기술되는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 키트 내의 작용제는 특정 적용분야 및 작용제의 투여 방법에 적합한 제약용 제제 및 투약분으로 존재할 수 있다. 연구 목적의 키트는 다양한 실험을 전개하는 데에 적절한 농도 또는 양으로 구성요소들을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV를 생성시키기 위한 키트에 관한 것으로써, 상기 키트는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하거나 그에 의해 코딩되는 miRNA를 포함하는 단리된 핵산을 수용하는 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 또한 AAV 캡시드 단백질, 예를 들면 AAV9 캡시드 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 수용하는 용기를 포함한다.
키트는 연구자들에 의한 본원에서 기술되는 방법의 사용을 용이하게 하도록 설계될 수 있으며, 많은 형태를 취할 수 있다. 키트 중 조성물 각각은 해당될 경우 액체 형태로 (예컨대 용액 중으로), 또는 고체 형태 (예컨대 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에는, 조성물 중 일부가 예를 들면 키트와 함께 제공될 수 있거나 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종 (예컨대 물 또는 세포 배양 배지)의 첨가에 의해 (예컨대 활성인 형태로) 구성가능하거나 달리 가공가능할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "지침"은 지침 및/또는 홍보물의 구성요소로 정의될 수 있는데, 통상적으로 본 개시내용의 패키지화에 대한 것이거나 그와 연관된 기재된 지침을 포함한다. 지침에는 지침이 키트와 연관되어 있는 것임을 사용자가 분명하게 인식하게 되도록 하는 소정의 방식으로 제공되는 임의의 구두 또는 전자 지침, 예를 들면 시청각 (예컨대 비디오테이프, DVD 등), 인터넷 및/또는 웹-기반 통신 등도 포함될 수 있다. 기재된 지침은 제약용 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 부처에 의해 규정된 형태로 존재할 수 있는데, 상기 지침은 동물 투여용 제조, 사용 또는 판매 부처에 의한 승인을 반영할 수도 있다.
키트는 하나 이상의 용기 내에 본원에서 기술되는 구성요소들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 예로서, 일 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 키트 구성요소들을 혼합하는 것, 및/또는 샘플을 단리하고 혼합하는 것, 및 대상체에게 적용하는 것에 대한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 본원에서 기술되는 작용제를 수용하는 용기를 포함할 수 있다. 상기 작용제는 액체, 젤 또는 고체 (분말)의 형태로 존재할 수 있다. 작용제는 멸균 제조되어, 주사기 내에 포장된 후, 냉동 출하될 수 있다. 대안적으로, 그것은 바이알 또는 다른 저장 용기에 수용될 수 있다. 제2의 용기가 멸균 제조된 다른 작용제를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 키트는 사전혼합되어 주사기, 바이알, 튜브 또는 다른 용기 내로 출하되는 활성 작용제를 포함할 수 있다.
하기 실시예에 의해, 본 발명의 대표적인 실시양태들이 더욱 상세하게 기술될 것이다. 이들 실시양태는 본 발명을 대표하는 것으로써, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 대표적인 실시양태로 제한되는 것은 아님을 알고 있을 것이다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 재료 및 방법
세포 배양 및 스크리닝 검정
DMEM, 10 % 열 불활성화된 FBS를 사용한 고도 글루코스 및 1 % 페니실린 스트렙토마이신 (써모피셔(ThermoFisher) 사) 중에서 헬라 세포를 유지하였다. 형질감염 24-시간 전에, 세포를 6-웰 플레이트상에 0.8-1.0x106 세포/웰로 시딩하였다. 형질감염 일자에, 성장 배지를 1.6 ml의 옵티(Opti)-MEM (써모피셔 사)으로 대체하였다. 2 μl/웰의 다르마펙트 듀오(DharmaFECT Duo) (다르마콘(Dharmacon) 사)를 사용하여 플라스미드를 형질감염시켰다. 각 웰은 0.6 ㎍의 플라스미드 DNA를 수용하였다. 형질감염 48시간 후, 세포를 수확하고, 미르바나(MirVana) RNA 단리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 RNA/올리고-dT 및 수퍼스크립트(Superscript) III (인비트로겐 사)를 사용하는 반응을 사용하여 cDNA를 생성시켰다. 타크만(TaqMan) 검정 (써모피셔 사)을 사용하여 헌팅틴 mRNA를 측정하였다. 하우키핑 유전자(housekeeping gene)로서 인간 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT)를 사용하는 ΔΔC(T)법을 사용하여 상대적인 헌팅틴 mRNA 수준을 계산하였다.
마우스 수용, 주사 및 유지
YAC128 및 야생형 FVB 마우스를 입수하였다. 야생형 수컷 마우스를 YAC128 암컷과 교배시키는 것에 의해 마우스를 FVB 배경에서 사육하였다. 생성되는 이형접합 YAC128 및 야생형 마우스를 12:12 광 일정으로 유지하면서, 임의의 먹이 및 물에 대한 접근권을 주었다. 꼬리 단편 또는 귀 천공물로부터 추출된 DNA의 PCR에 의해 유전형을 검증하였다. UMPC3 또는 UMPC4 미세주사기 (월드 프레시젼 인스트루먼츠(World Precision Instruments) 사, 플로리다 사라소타 소재)의 도움으로 소형 동물 스테레오택스(stereotax) SAS-4100 (ASI 인스트루먼츠(Instruments) 사, 미시간 와렌 소재)에 의해 마우스의 선조체에 직접 선택된 AAV를 주사하였다. 284 mg/kg의 트리브로모에탄올을 사용하여 마우스를 마취한 후, 스테레오택스에 위치시켰다. 정수리점을 0점으로 사용하여 수술을 수행하고, 전방 1.0 mm, 측면 2.0 mm를 측정한 후, 33 게이지 바늘을 선조체로 3.0 mm 내렸다. 125 nl/분의 속도로 3.0 μl를 전달하도록 펌프를 설정하였다. 주사 후, 가온 패드상에서 마우스를 회복시킨 다음, 다시 수용 영역의 해당 케이지에 위치시켰다.
조직 추출
적절한 시점에, 마우스를 희생시키고, RNA 분석 또는 면역조직화학용으로 조직을 추출하였다. RNA 추출의 경우, 마우스를 마취한 후, 경부 탈구에 의해 사망시켰다. 뇌를 제거하고, 선조체를 절제 분리하였다. 가용할 경우, GFP 발현을 사용하여 절제를 가이드함으로써, GFP 양성 조직만을 분석하였다. 조직을 즉시 RNA레이터(RNALater) (암비온(Ambion) 사)에 위치시켰다. 이어서, 그것을 -80 ℃에서 냉동 저장하였다. 실험 종료 시에는, 면역조직화학용으로 예정된 마우스를 깊게 마취하고, 식염수 후 이어서 4 % 파라포름알데히드를 심장내로 관류하였다. 샘플을 저온 2 % 파라포름알데히드에 밤새 후고정한 다음, 4 ℃로 포스페이트 완충 식염수 중에 저장하였다. 레이카(Leica) VT1000s 비브라톰(vibratome)에서 40 마이크로미터 절편을 슬라이싱함으로써, 관상 절편을 제조하였다.
마우스 행동
평균대 보행: (평균대 크기) 평균대를 건너도록 마우스를 훈련시켰다. 훈련 후, 그것이 평균대의 하나의 단부로부터 다른 단부로 건널 때, 마우스를 기록하였다. 마우스 당 3회의 시도를 기록하였다. 기록을 바탕으로, 마우스가 평균대의 하나의 단부상 표시로부터 다른 단부로 건너는 데에 걸리는 시간량을 측정하였다.
거주 케이지 활성: 마우스를 26시간 동안 단독으로 자동화된 거주 케이지 페노타이핑 스캐닝 시스템(phenotyping scanning system) (클레버(Clever) Sys, Inc. 사, 버지니아 레스턴 소재)에 위치시켰다. 시간 당 평균 활성 시간을 계산하기 위하여, 마우스가 새로운 환경에 적응하는 첫 번째 데이터 시간을 삭제한 다음; 총 보행 기록 시간 빼기 1시간으로 나눈 보행에 소요된 총 시간을 계산하였다.
면역조직화학 및 정량
3 % 수소 퍼옥시드를 사용하여 3분 동안 고정된 조직 슬라이스를 블로킹한 다음, 0.5 % 트리톤(triton) x를 사용하여 20분 동안 인큐베이션하였다. 토끼 또는 마우스 유래 항체용 벡터 라보래토리즈 엘리트(Vector Laboratories Elite) ABC 키트 시약을 사용하여 DARPP32 (아브캄(Abcam) 사 ab40801; 1:10,000 희석), Iba1 (와코(Wako) 사 019-19741; 1:1,000 희석), GFP (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사 G10362; 1:1000 희석) 및 NeuN (EMD 밀리포어(Millipore) 사 MAB377; 1:1000 희석)에 대하여 면역조직화학을 수행하였다. 금속 강화 DAB 기재 키트 (피어스(Pierce) 사)를 사용하여 디아미노벤지딘으로 2분 동안 절편을 염색하였다.
소형 RNA 라이브러리 클로닝 및 분석
미르바나 RNA 단리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 15 % 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 5 ㎍의 총 RNA를 사용하여 18-30개 뉴클레오티드 RNA의 크기 선택을 수행하였다. 크기 선택 후, 소형 RNA는 에탄올 침전시키고, 아데닐레이트화-전 3'-어댑터 (5'-rAppTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/-3'; 서열식별번호: 11)에 결찰시켰다. 결찰 생성물을 RT 프라이머 (5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열식별번호: 12)에 어닐링하고, 5'-어댑터 (RNA: 5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3'; 서열식별번호: 13)에 결찰시켰다. AMV 역전사 혼합물 (NEB 사)을 사용하여 역전사를 수행하고, 하나의 범용 프라이머 (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'; 서열식별번호: 14) 및 하나의 바코드화된 프라이머 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열식별번호: 15)와 함께 아큐프라임(AccuPrime) Pfx DNA 폴리머라제 (인비트로겐 사)를 사용하여, PCR 증폭하였다. 라이브러리를 서열분석하고, mm9 게놈 및 AAV 게놈에 대하여 맵핑하였다. miRNA 헤어핀상에서의 5'-말단 맵핑의 위치를 기반으로 miRNA 종을 분류하였는데, 이에 따라 각 종은 공유된 시드 서열을 가지는 모든 소형 RNA로 구성되었다. 종 할당에서 3'-말단은 고려되지 않았다. 엣지(edge)R 패키지를 사용하여 차별적인 내생 miRNA의 발현을 분석하였다.
mRNA 라이브러리 클로닝 및 분석
상기와 같이 RNA를 추출하였다. 표준 방법에 의해 라이브러리를 구축하였다. 탑햇(topHat)2를 사용하여 판독치를 맵핑하고, 데세크(deseq)2 패키지를 사용하여 차등 발현을 계산하였다.
양 실험
헌팅톤병의 트랜스제닉 양 모델 (예컨대 병원성 인간 헌팅틴 단백질을 발현하는 트랜스제닉 양)에 scAAV9-CBA-mir-HTT (mir-155 백본에 miRNA 6433을 포함함), scAAV-U6-mir-HTT (mir-155 백본에 miRNA 6433을 포함함) 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나를 주사하였다. 주사 1개월 후 또는 6개월 후 중 어느 하나에 양을 희생시켰다. 조직 및 핵산 샘플을 제조하고, 정량 PCR 및 면역조직화학에 의해 분석하였다.
실시예 2: 마우스 생체내 실험
헌팅틴 표적화 인공 miRNA의 설계 및 선택
인간 헌팅틴 mRNA를 표적으로 하는 9종의 서열 (표 1, 도 1)을 시험하였다. 9개의 표적으로 하는 서열 위치의 개략적인 도시를 도 4a에 나타내었다. 인공 miRNA의 2개 카피를 동시에 내생 miRNA-155 또는 miR-30을 기반으로 하는 백본에 클로닝하고, 전체 인공 miRNA를 EGFP의 3'-UTR에 삽입하였다 (도 5a, 상단). mir-155-기반 및 mir-30-기반 항-HTT amiRNA의 예상 헤어핀 구조를 각각 도 25a-25b에 나타내었다. 생성되는 플라스미드를 헬라 세포에 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수확하고, 정량 RT-PCR (qRT-PCR)에 의해 내생 헌팅틴 mRNA의 수준을 측정하였다. 9종의 인공 miRNA 중 3종이 50 % 초과만큼 헌팅틴을 감소시켰다 (도 1-2 및 4b-4c).
Figure 112019039223092-pct00001
최초 스크린으로부터 3종의 서열이 생체내 실험용으로 선택되었다. 공지의 siRNA (E1.4)를 기반으로 하는 인공 miRNA도 시험하였다. 후보 서열들을 자가-상보성 AAV9 벡터에 패키지화한 후, 대략 128개의 폴리글루타민 코딩 반복체의 연장체를 가지는 인간 헌팅틴을 발현하는 트랜스제닉 마우스 (Yac128 마우스)의 선조체에 직접 그것을 주사하였다. 1개월 후, 3종의 상이한 투여량에서 AAV9의 분포 및 GFP 리포터의 발현을 평가하였다. 최고 투여량에서, 선조체 전체에 걸쳐 GFP 염색이 존재하였으며 (도 11a), AAV9-CβA-항-HTT-6433 (p=0.006) 또는 AAV9-CβA-항-HTT-5155 (p=0.013, 도 4c; mir-155 백본을 사용하였음) 중 어느 하나로 처리된 마우스에서 인간 헌팅틴 mRNA가 상당히 감소되었다. 벡터의 투여량을 감소시키는 것은 감소된 GFP 발현 (도 11a)을 발생시켰으며, 1:10 희석에서는 인간 헌팅틴 mRNA의 상당한 감소가 달성되지 않았다 (도 11b). 도 11c는 3종의 상이한 투여량으로 헌팅틴 표적화 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스의 대표적인 사진을 제공한다.
U6 프로모터로부터 인공 miRNA를 발현시키는 것은 헌팅틴의 침묵화를 향상시키지 않는다
가장 강력한 miRNA (HTT-6433)의 단일 카피를 U6 프로모터의 조절하에 AAV9 벡터로 클로닝하였다 (도 5a, 하단). 마우스에 편측으로 원래의 2개 카피 AAV9-CBA-항-HTT-6433 (서열식별번호: XX 포함), AAV9-CBA-항-HTT-5155, AAV9-U6-항-HTT-6433 (서열식별번호: XX 포함) 또는 AAV9-U6-항-HTT-5155 중 어느 하나를 주사하였다. 1개월 후, 선조체를 수확하고, GFP 발현을 확인한 후, qRT-PCR에 의해 헌팅틴 mRNA의 수준을 측정하였다. 인공 miRNA의 서열에 관계없이, AAV9-U6-항-HTT 및 AAV9-CBA-항-HTT로 처리된 마우스 사이에 상당한 녹다운 차이는 관찰되지 않았다. AAV9-U6-항-HTT-6433 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433로 처리된 마우스 둘 다에서, 주사된 측면에서의 헌팅틴 mRNA의 양이 비-주사 측면에서의 것의 대략 50 %였다 (도 5b). 각 동물의 대조로서 반대쪽 (비-주사) 측면을 사용하는 것이 동물 대 동물 가변성을 감소시킨다는 것에 유의한다. 편측으로 AAV9-GFP가 주사된 마우스에서는, 반대쪽 측면에서 종종 적은 수의 GFP 양성 뉴런이 관찰됨으로써, 일부 바이러스가 비-주사 측면으로 확산된다는 것을 표시하였다. 따라서, 반대쪽 측면을 대조로 사용하는 것은 녹다운을 저평가할 수 있다. 대조로서 반대쪽 측면을 사용하는 것의 잠재적인 교란 효과를 제거하기 위하여, 대조로서 PBS만이 주사된 동물 군을 사용하여 실험을 반복하였다. 데이터는 AAV9-U6-항-HTT-6433 및 AAV9-CBA-mir-HTT-6433 둘 다가 대략 50 %까지 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 표시하였다 (도 5c).
U6 프로모터로부터의 mir - HTT -6433의 장기 선조체 발현은 마우스에서 독성이다
AAV9-U6-항-HTT-6433 또는 AAV9-CBA-항-HTT-6433을 Yac128 마우스의 선조체에 직접 편측으로 주사하였다. 주사 6개월 후, AAV9-U6-항-HTT-6433이 주사된 마우스가 보금자리를 틀지 않고 일부가 과다활성 표현형을 나타낸다는 것이 관찰되었다. 이러한 이상을 기록하기 위하여, 각 케이지의 네슬렛(nestlet)을 교체하였다. 24-시간 후, AAV9-U6-항-HTT-6433의 새로운 네슬렛은 사용되지 않은 반면, PBS 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433 주사된 마우스는 예상대로 보금자리를 틀었다 (도 6a). 거주-케이지 모니터링 시스템을 사용하여, 마우스를 24시간 동안 기록하였다. AAV9-U6-항-HTT-6433으로 처리된 마우스는 PBS 또는 AAV9-CBA-항-HTT-6433으로 처리된 마우스에 비해 상당히 더 많은 시간을 그의 거주 케이지 주변으로 움직이면서 소요하였다 (도 6b). 마우스가 평균대를 건너는 데에 걸리는 평균 시간도 측정하였다. 이와 같은 시험에서, 마우스는 평균대 건너기를 3회 완료할 것을 요구받았다. 평균적으로, AAV9-CBA-항-HTT-6433 처리된 마우스는 PBS 주사만을 투여받은 마우스에 비해 더 빠르게 건너는 경향이 있었다 (도 3 및 12a). AAV9-U6-항-HTT-6433 군의 나머지 4마리의 마우스 중, 2마리는 평균대에서 뛰거나 떨어지는 것 중 어느 하나로써, 성공적으로 건널 수 없었다 (도 12a). 더 고령인 Yac128 마우스 (7개월령)에서 수행된 두 번째 실험에서는, 평균대를 건너는 시간의 연령 관련 증가가 관찰되었다. 이와 같은 증가는 나이브 마우스 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433으로 처리된 마우스 양자에서 존재하였으며, AAV9-U6-항-HTT-6433으로 처리된 마우스에서 가속되었다 (도 12b).
신경병리학적 발견들이 상기한 행동 결과와 상관된다. 주사된 측면에서, AAV9-U6-항-HTT-6433 마우스는 뇌실의 확장, DARPP-32 양성 뉴런의 상실 및 선조체 수축을 나타내었다 (도 7a-7b). 나머지 선조체에서, 그들은 증가된 Iba1 염색 (도 8a, 하단), 총 및 활성화 소교세포의 증가, 및 휴지 소교세포 수의 감소 (도 8b-8d)를 나타내었다. 야생형 C57Bl/6 마우스 및 FVB 마우스에 동일한 벡터를 주사하고, 독성이 그와 같은 맥락에서의 돌연변이 헌팅톤의 존재에 대하여 의존성인지를 확인하기 위하여, U6 추진 miR의 결과를 평가하였다. FVB 마우스에서는, 평균대에서의 빠른 퇴행 및 심각하게 확장된 뇌실을 가지는 Yac128 마우스에서의 것과 효과가 유사하였다. 그러나, C57BL6 마우스에서는, 효과가 존재하기는 하였으나, 덜 현저하였다. U6 군에서 평균대를 건너는 시간에 있어서의 최초의 증가가 존재하기는 하였지만, 연구 종료 시에는 군들 사이에 상당한 차이가 존재하지 않았다 (도 13a). 선조체 수축 역시 C57BL6 마우스에서는 덜 심각하였다 (도 13b).
U6 프로모터로부터의 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA의 발현은 헌팅틴 표적화 소형 RNA의 과발현을 발생시킨다
마우스 군에 편측으로 U6 및 CβA 프로모터로부터 인공 miRNA 6433을 발현하는 scAAV9 벡터를 주사하였다. 주사 2주-후에 생성되는 소형 RNA를 클로닝하고, 서열분석하였다. 양 군에서, AAV 게놈에 맵핑되는 서열 중 96 %가 예상 소형 RNA 생성물에 맵핑되었으며, 적은 백분율만이 부정확한 다이서 또는 드로샤 절단을 나타내었다. U6 프로모터 추진 인공 miRNA가 주사된 군에서는, 서열분석 결과 헌팅틴 표적화 서열이 우세해서, 모든 맵핑가능한 서열의 절반 (50 %)에 달했던 반면, CBA 벡터가 주사된 마우스에서는 서열 중 5 %만이 벡터가 코딩하고 있는 소형 RNA와 일치하였다 (도 9a). 이에 따라, 잠재적으로, 센스 가닥 및 미끄러짐(slippage) 생성물을 포함한 대안적인 시드 서열을 가지는 소형 RNA가 기능성인 내생 miRNA의 것과 유사한 수준으로 존재할 수 있다 (도 9a). qPCR에 의해 헌팅틴 표적화 소형 RNA의 상대적인 양을 측정함으로써, 헌팅틴 표적화 서열의 과발현을 확인하였다. U6 프로모터 추진 구성체가 주사된 마우스에서 소형 RNA의 발현이 150 내지 250배 더 높은 것으로 관찰되었다 (도 9b).
내생 miRNA 30 서열은 보통 인공 miRNA용 스캐폴드(scaffold)로 사용된다. 이와 같은 스캐폴드로부터 유래하는 이성질체(isomir) 프로파일이 더 바람직한지를 확인하기 위하여, miR-30 백본에 항-HTT-6433 서열을 삽입한 후, 10주령 Yac128 마우스에 주사하였다 (도 9c). mir-30 스캐폴드는 CβA 프로모터에 의해 산출되는 것과 유사한 성숙한 인공 miRNA의 수준을 산출하였으며 (도 9a), 50 % 가까이까지 인간 헌팅틴을 감소시켰다. mir-155 스캐폴드와 달리, mir-30 스캐폴드는 안티센스 (가이드) 가닥과 유사한 수준으로 성숙한 센스 (패신저) 가닥을 생성시킨다. CβA 프로모터의 mir-155 백본과의 조합은 바탕을 초과하도록 예정된 안티센스 가닥만을 생성시킨다 (도 9a).
샘플 중 판독분의 절반이 넘게 AAV-코딩된 인공 miRNA에 맵핑될 수 있기는 하였지만, 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA의 과발현은 내생 miRNA의 분포에는 최소한의 효과를 가졌다 (도 14a-14b). 사실상, 주사된 군을 비-주사 (반대쪽) 측면과 비교하였을 때 가장 큰 차이가 관찰됨으로써, 주사 자체가 miRNA 프로파일의 국소적인 변화를 생성시킨다는 것을 암시하였다. 이는 시간이 지나면서 해결될 수 있는 손상에 대한 국소적 염증 반응을 반영할 수 있다.
U6 프로모터로부터의 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA의 발현은 다중 mRNA의 발현을 와해한다
헌팅틴 표적화 miRNA 과발현의 결과를 조사하기 위하여, AAV9-U6-항-HTT-6433 또는 AAV9-CBA-항-HTT-6433 중 어느 하나로 처리된 마우스 선조체의 RNAseq 분석을 수행하였다. 주사 2주-후, 주사 및 비-주사 측면에서의 선조체 mRNA 프로파일을 비교하였다. 데이터는 CBA-mirHTT-6433로 처리된 마우스에 상당한 차이가 거의 존재하지 않는다는 것을 표시하였다 (도 14a). AAV9-U6-항-HTT-6433으로 처리된 마우스에서는, 처리에 반응하여 증가된 mRNA 및 감소된 것들 모두가 관찰되었다 (도 14b). 2주에 AAV9-U6-항-HTT-6433 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433의 프로파일을 비교하였을 때, 8종의 mRNA만이 이러한 2개 군 사이에서 상당히 차별적으로 발현되는 것으로 관찰되었다. 인공 miRNA의 예정된 표적 부위의 존재 또는 부재에 따라 RNA를 분류하고, 표적 부위가 존재하거나 부재하는 mRNA에서의 변화의 누적 분포를 플로팅하였다. AAV-U6-6433이 주사된 마우스에서는, 가장 풍부한 AAV-유래 소형 RNA 종과 일치하는 완전한 8량체 표적 부위를 그의 3'-UTR에 포함하는 유전자의 약간의 하향조절로의 이동이 관찰되었다 (도 10b). AAV-CBA-6433 (도 10a)은 물론, 다른 AAV-유래 소형 RNA 종들 중 어느 것 (도 15a-15c)이 주사된 마우스에서도 이와 같은 이동이 분명하지 않았다.
실시예 3: 양 생체내 실험
본 실시예에서는, 인간 헌팅톤병의 양 모델을 사용하였다. 간단하게 말하자면, 인간 헌팅틴 (인간 htt) 단백질을 발현하는 트랜스제닉 양을 생성시켰다. scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나를 선조체내로 양에 주사하였다. 각 구성체는 각각 CBA 프로모터 또는 U6 프로모터와 β-글로불린 폴리아데닐화 서열 사이에 존재하는 인트론 내에 위치하는 mir-155 백본에 삽입된 항-헌팅턴 mir-6433 서열 (서열식별번호: 7)의 단일 카피를 포함하였다. 본 실험에서 투여된 rAAV를 제조하는 데에 사용된 구성체를 서열식별번호: 18 (scAAV9 CBA-mir-HTT) 및 19 (scAAV9 U6-mir-HTT)에 제시하였다.
주사 1개월 또는 6개월-후 중 어느 하나에 양을 희생시켰다. 조직 및 핵산 샘플을 제조하고, 정량 PCR 및 면역조직화학에 의해 분석하였다.
데이터는 1개월 시점에 U6 프로모터하에 발현되는 mir-HTT의 주사가 비-주사 및 빈-scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 양의 중간 미상핵 및 중간 조가비핵 모두에서 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다. 도 16은 scAAV9 U6-mir-HTT 주사 1개월-후의 양의 중간 미상핵에서의 인간 htt 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 도 17은 scAAV9 U6-mir-HTT 주사 1개월-후의 양 모델의 중간 조가비핵에서의 인간 헌팅틴 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 이전 실시예에서 기술된 마우스 모델과 달리, U6 프로모터로부터 발현되는 mir-HTT가 헌팅톤병의 양 모델에서는 독성이 아니었다는 것에 유의한다.
데이터는 6개월 시점에 CBA 프로모터하에 발현되는 mir-HTT의 주사가 비-주사 및 빈 scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 양의 중간 미상핵 및 중간 조가비핵 모두에서 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다.
도 18 및 19는 양 중간 미상핵의 내측 (도 18) 및 외측 (도 19) 측면에서의 인간 htt 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 데이터는 CBA 프로모터로부터 발현되는 mir-HTT가 뇌의 비-주사 측면 및 빈 scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 뇌의 주사된 측면에서 인간 htt 발현의 감소를 야기한다는 것을 표시하였다. 주사 6개월-후, 중간 미상핵에서의 htt 침묵화에 대한 CBA 및 U6 프로모터로부터의 mir-HTT 발현의 효과도 비교하였다. 데이터는 U6 프로모터 또는 CBA 프로모터 중 어느 하나로부터 발현되는 mir-HTT가 비-주사 및 빈 scAAV9-주사 대조 동물과 비교하였을 때 중간 미상핵에서의 인간 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다 (도 20).
도 21 및 22는 주사 6개월-후의 양 중간 조가비핵의 외측 (도 21) 및 내측 (도 22) 측면에서의 인간 htt 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 데이터는 CBA 프로모터로부터 발현되는 mir-HTT가 뇌의 비-주사 측면 및 빈 scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 뇌의 주사된 측면에서 인간 htt 발현의 감소를 야기한다는 것을 표시하였다. 주사 6개월-후, 중간 미상핵에서의 htt 침묵화에 대한 CBA 및 U6 프로모터로부터의 mir-HTT 발현의 효과도 비교하였다. 데이터는 U6 프로모터 또는 CBA 프로모터 중 어느 하나로부터 발현되는 mir-HTT가 비-주사 및 빈 scAAV9-주사 대조 동물과 비교하였을 때 중간 조가비핵에서의 인간 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다 (도 23).
도 24는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 전방 선조체에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다.
실시예 4: 헌팅톤병의 트랜스제닉 양 모델에서 인공 miRNA는 선조체 전체에 걸쳐 인간 돌연변이 헌팅틴을 감소시킨다
동물 및 동물 절차
본 실시예에서는 메리노(merino) 양을 사용하였다. 마취제의 투여 전에, 대략 8시간 동안 밤새 동물들을 굶겼다. 동물들에게 심장 박동수, 호흡수, 온도 및 체중을 포함한 수술-전 신체검사를 제공하였다. 혈청 (5 ml) 및 CSF의 기준선 샘플을 수집하였다.
2개의 서로 다른 양의 군을 사용하여 2개 부분으로 연구를 수행하였다. 첫 번째 연구의 경우, 대략 8개월령인 41 마리의 트랜스제닉 동물 (21 마리의 거세 숫양, 20 마리의 암양)에게 총 3x1012개의 게놈 카피를 위한 1x1013 gc/ml의 역가로 300 μl의 자가-상보성 AAV9 (scAAV9) 벡터를 편측으로 주사하였다. 두 번째 연구의 경우, 14개월령의 14 마리의 동물에게는 이와 같은 벡터를, 그리고 14 마리에게는 대조 벡터를 주사하였다. 주사 확산의 수술-후 영상화를 가능하게 하기 위하여, 벡터 제제에 가돌리늄을 첨가하였다. 동물들을 수술실로 이동시키고, 수술 준비를 하였다. 그들을 사지를 접거나 사지를 결박하여 발포 쿠션상에서 스핑크스 자세로 휴지시켰다. 정위 프레임 (코프(Kopf) 사, 대형 동물)을 사용하여 동물의 두부를 제자리에 고정하였다. 19 게이지 요추 천자 캐뉼러를 사용한 요추 천자를 통하여 뇌척수액을 수집하였다. 속섬유막을 표적으로 하여 선조체에 직접 rAAV를 전달하였다. 동물의 두부를 면도하고, 베타딘으로 준비한 후, 투명한 플라스틱으로 감쌌다. #15 스캘펄(scalpel)을 사용하여 곡선 절개를 수행함으로써, 정수리점을 노출시켰다. 일단 정수리점을 확인하고 나서, 전기 드릴을 사용하여 정수리점의 앞쪽(rostral) 10 mm 및 중심선의 외측 11 mm에 3-4 mm의 천두공(burr hole)을 위치시켰다. 통상적인 강화 전달 (CED) 캐뉼러 (MRI 인터벤션스(MRI Interventions) 사, 캘리포니아 어빈 소재)를 조작장치에 고정하고, 주사될 작용제로 프라이밍하여 라인으로부터 공기를 제거하였다. #11 스캘펄을 사용한 1.5 mm 절개에 의해 경질막을 개방하고, 경질막 표면으로부터 표적 깊이까지 CED 캐뉼러를 25 mm 전진시켰다. 외부 캐뉼러 (1.65 mm)는 경질막 절개부를 밀봉하여 주입 동안의 CSF 누출을 방지한다. 팁 주변의 조직이 안정화되도록 하기 위하여, 주입은 캐뉼러 삽입 5분 후에 개시하였다. 주입 속도는 300 μl의 총 부피가 주사될 때까지 3.33 μl/분으로 설정하였다. 주입이 완료되고 10분 후, 캐뉼러를 천천히 회수하고, 골 왁스 플러그(bone wax plug)를 사용하여 두개골을 복구함으로써 CSF 누출을 방지하였다. 식염수를 사용하여 상처를 세척한 후, 3.0 비크릴 봉합사를 사용하여 폐쇄하였다. 표준 마취 풀림 및 회복 절차에 따랐다. 수술-후 MRI를 수행하여 가돌리늄의 확산을 확인하였다. 첫 번째 연구에서 한 마리의 동물이 수술 후 배제되었는데, 영상화시 가돌리늄이 가시적이지 않았기 때문이었으며, 두 번째 연구에서 두 번째 동물이 배제되며, 가돌리늄이 주로 뇌실에 존재하는 것으로 나타났기 때문이다. 수술 후, 동물들을 3일 동안 관찰하에 유지하였으며, 5일 동안 실내에서 수용하였다. 다음에, 그들을 실외로 옮기고, 나머지 연구 동안 실외 방목지에 수용하였다. 연구 전체에 걸쳐 고충의 징후 및 행동의 변화에 대하여 동물들을 시각적으로 모니터링하였다. 두 마리의 동물이 수술 합병증에 걸림으로써, 부분적인 사지 마비를 초래하였다. 이는 마취하에서의 동물의 배치에 기인하는 것으로 여겨졌다. 한 마리는 조기에 마취되었으며, 한 마리는 6개월 군으로부터 1개월 군으로 이동시켰다. 주사-후 기간 전체에 걸쳐 주기적으로 동물들을 칭량하고, 뇌척수액, 혈액 및 혈청의 샘플을 채취하여, 추가 분석용으로 저장하였다.
세포 계수 및 감별을 위하여, 목정맥 정맥천자를 통해 칼륨 EDTA 혈액 수집 튜브 (라벤더 탑(Lavender top); LT)에 혈액을 수집하고, 감별 (CBE 감별)에 의한 완전 혈액 조사를 수행하였다. 임상 화학용으로, 목정맥 정맥천자를 통해 혈청 수집 튜브 (레드 탑(red top); RT)에 혈액을 수집하였다. 샘플을 다중 생화학 분석(MBA)용으로 제출하였다.
주사 1개월 및 6개월-후, 동물들을 수확한 후, 조직학 또는 생화학 분석 중 어느 하나에 동물들을 사용하였다. 동물들을 수술 테이블로 수송하고, 대략 6 mL의 CSF를 수집하는 동안 배쪽 횡와(ventral recumbency)로 위치시켰다. 동물들을 등쪽 횡와로 재위치시켰다. 목동맥을 노출시키고, 캐뉼러 팁으로부터 4 cm의 깊이로 캐뉼러삽입하였다. 목정맥을 노출시키고, 200-500 U 헤파린/kg을 목정맥에 주사하였다. 헤파린 투여 5분 후, 1 ml/체중2kg의 레타바브(Lethabarb) (325 mg 펜타바르비톤 나트륨/ml) 정맥내 주사에 의해 양을 안락사시켰다. 저온 9 % NaCl을 사용하여 주입 펌프를 프라이밍하고, 목동맥 캐뉼러에 연결하였다. 500 mmHg의 압력으로 대략 8 L의 저온 9 % NaCl을 사용하여 동물들을 관류하였다. 조직학용으로는, 500 mmHg 압력의 8 L 4 % 파라포름알데히드로 주입을 전환하였다. 뇌 및 간을 추출하였다. 조직을 4 ℃에서 24시간 동안 4 % 파라포름알데히드에 후-고정하고, 4 ℃에서 최소 14일 동안 1X 포스페이트 완충된 식염수 중 30 % 수크로스로 옮겼다.
RNA, 단백질 및 DNA 검정용으로는, 상기한 바와 같은 저온 9 % NaCl을 사용하여 양을 관류하였다. 하기의 순서로 말초 조직의 수집을 수행하였다: 간, 부신, 난소 (해당될 경우), 근육 및 심장. 서로 다른 기기의 사용, 그리고 10 % 표백제 및 70 % 에탄올을 사용하여 검시 표면을 세척하는 것에 의해 교차 오염을 방지하였다. 신체로부터 기관을 제거하고, 3 mm 생검 펀치를 사용하여 샘플을 수집하였다. 각 기관으로부터 총 10개의 샘플을 수집하였는데; 2개의 샘플은 액체질소 중에서 급속-냉동하였으며, 8개의 샘플은 4 ℃에서 24시간 동안 RNA 레이터(later) 중에 저장하였다 (간, 근육 및 심장 샘플용으로 300 μl의 RNA 레이터, 부신 및 난소 샘플용으로 500 μl의 RNA 레이터).
원형 톱 및 골 겸자를 사용하여 두개골로부터 뇌를 제거하였다. 추출 후, 뇌를 칭량하고, 맞춤제작 플렉시글라스 뇌 매트릭스에 배측으로 위치시켰다. 4 6 mm 블록에 선조체를 완전히 포함하도록 뇌에 9개의 절단부(cut)를 형성시켰다. 제1 절단부는 후각 망울 부착부의 전방에 형성시켰으며 (매트릭스의 시작으로부터 대략 18 mm), 이어서 6 mm 간격으로 4개의 절단부를 형성시켰다. 선조체를 후방으로부터 전방으로 4개의 6 mm 블록으로 분할하였다: 2p (후방), 2m1 (내측 1), 2m2 (내측 2) 및 2a (전방). 하기의 순서로 선조체 절제를 수행하였다: 2p, 2m1, 2a. 우측 (비-주사) 반구의 선조체를 모든 블록에서 먼저 절제하였는데, 반구들 사이에서는 스캘펄 날을 교체하였다. 절제는 드라이 아이스상의 페트리 접시에서 수행하였는데, 가능한 한 많은 백색질을 선조체 조직으로부터 제거하기 위하여 주의를 기울였다. 일단 절제 분리되고 나서는, 선조체 단편 (미상핵 및 조가비핵)을 절반으로 분할한 후; 내측 단편 (블록의 중심선에 가장 가까움)은 4 ℃에서 1 ml의 RNA 레이터에 저장하고, 외측 단편은 액체 질소 중에서 급속 냉동하였다. CBA 연구에서의 6개월 군의 선조체 절제는 미상핵 및 조가비핵 양자로부터 4개의 선조체 샘플을 생성시키는 방식으로 수행하였다. 등쪽 절편 (내측 및 외측 모두)은 액체 질소 중에서 급속 냉동하였으며, 배쪽 절편 (내측 및 외측 모두)은 4 ℃에서 1 ml의 RNA 레이터에 저장하였다. 24시간 후에 RNA 레이터를 제거하고, 샘플을 -80 ℃에서 저장하였다.
2m2 블록은 OCT를 사용하여 충분하게 덮은 후, 2-메틸부탄 및 드라이 아이스 조에서 냉동시켰다. 2a, 2m1 및 2p 블록 중 나머지는 동일한 방식으로 냉동시켰다. 등쪽 대 배쪽 방식으로 각 블록으로부터 10개의 피질 샘플을 채취하였는데: 2개는 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰으며, 8개는 4 ℃에서 1 ml의 RNA 레이터에 저장하였다.
조직학적 분석용 조직의 절개
조직학적 분석을 위한 조직 절개 전에, 뇌로부터 선조체를 단리하여, OCT에 의해 충분히 덮고, -20 ℃에서 24시간 동안 저장하였다. 전체 선조체를 관통하여 슬라이딩 마이크로톰(sliding microtome) (라이체르트-정 테트란더(Reichert-Jung Tetrander) 슬라이딩 마이크로톰)으로 40 ㎛ 두께로 측정되는 관상 절편을 절단하였다. 절편을 4 ℃에서 1X 포스페이트 완충된 식염수 중 0.01 % 나트륨 아지드에 저장하였다.
벡터 클로닝 및 rAAV9 제조
첫 번째 연구의 경우, 시험 벡터는 내생 mir155 백본을 기반으로 하는 인공 miRNA를 추진하는 U6 프로모터를 포함하였다 (AAV9-U6-miRHTT). 인공 miRNA는 인간은 표적으로 하나, 양 헌팅틴은 표적으로 하지 않는다. AAV 패키지화를 향상시키기 위하여, 키메라 인트론을 추진하는 키메라 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴 (CBA) 프로모터가 포함되었다. 대조 벡터 (AAV9)는 빈 CBA 프로모터 및 인트론만을 포함하였다. 두 번째 연구의 경우, 시험 벡터는 CMV 인핸서 및 CBA 프로모터, 인트론 및 miRNA-155 기반 인공 miRNA를 포함하였다 (AAV9-CBA-miRHTT).
패키지화를 위하여, rAAV 벡터 플라스미드, 패키지화 플라스미드 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 HEK 293 세포에 공동-형질감염시켰다. 패키지화 플라스미드는 rAAV 벡터 플라스미드로부터 AAV 비리온으로의 재조합 게놈의 절제, 복제 및 패키지화로 이어지는 조절 및 AAV9 캡시드 단백질을 발현하였다. 재조합 바이러스는 표준 CsCl 구배 침강 및 투석에 의한 탈염에 의해 정제하였다.
헌팅틴 mRNA 수준의 분석
분지 DNA 검정 (bDNA)을 사용하여 RNA 레이터 보존 샘플 중 RNA 농도를 분석하였다. RNA 레이터 (어피메트릭스 이바이오사이언스(Affymetrix eBioscience) 사, 퀀티진(Quantigene)® 샘플 처리 키트)에 저장된 조직으로부터의 조직 균질물의 제조에 대한 제조자의 지침에 따라 샘플을 처리하였다. bDNA 검정 (퀀티진® 2.0 시약 시스템)에 대한 제조자의 지침에 따라 균질화된 샘플을 분석하였다. 인간 헌팅틴 (인간 HD, 퀀티진의 SA-50339), 양 헌팅틴 (양 헌팅틴, 퀀티진의 SF-10586) 및 하우키핑 유전자로서의 양 칼넥신 (양 칼넥신, 퀀티진의 SF-10622)을 검출하기 위하여, 프로브를 사용하여 샘플을 분석하였다. 검정 결과는 테칸 인피니트(Tecan Infinite) M1000 프로(PRO) 발광측정기를 사용하여 측정하였다 (노출 시간(integration time)은 200 ms로 설정).
miR - Htt 수준의 분석
냉동된 블록에서, 외측 미상핵 및 내측 조가비핵으로부터 생검 펀치 (2 mm)를 샘플링하였다. 일부 변형을 가한 트리졸(TRIzol) 제조자의 지침 (암비온(Ambion) 사)을 사용하여 RNA 추출을 수행하였다. 트리졸 추출에서의 상 분리 후, 수성 상을 RNA 클린 앤 콘센트레이터(Clean & Concentrator) (자이모(Zymo) 사) 컬럼으로 옮기고, 그의 프로토콜에 따랐다. 분석시까지 RNA를 -80 ℃로 저장하였다. 단편 분석기 (어드밴스드 애널리티칼 테크놀로지스(Advanced Analytical Technologies) Inc. 사)에서 RNA 품질 및 농도를 확인하였다. 분석 직전에, RNA를 20 ng/μl로 희석하였다. 타크만(TaqMan) 마이크로RNA 역전사 키트 (Cat# 4366596, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사), 2 μl의 RNA 및 가이드 가닥 특이적 스템-루프 프라이머 (UAAGCAUGGAGCUAGCAGGCU (서열식별번호: 25)를 표적으로 하는 써모피셔 사 맞춤 검정, 또는 검정 id 002407, let7e*)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 인공 miRNA 가이드 가닥을 역-전사하였다. 다중화를 가능하게 하기 위하여, 5 μl의 RT 생성물, 1x 농도의 miR-Htt 검정 및 0.3x 농도의 let-7e* 검정을 사용하여 ddPCR 반응을 구성하였다. QX200 액적 생성기 (Cat# 1864002, 바이오래드(Biorad) 사)를 사용하여 액적을 생성시키고, 종료점 PCR 증폭 (40 주기) 후 양성 신호에 대하여 모니터링하였다. miRHTT 및 let-7e* 사이의 절대 농도 비를 계산하는 것에 의해 miRHTT의 상대적인 발현을 확인하였다.
벡터 게놈 분포
젠트라 퓨어진(Gentra Puregene) 조직 키트 (키아젠(Qiagen) 사)를 사용하여, 액체 질소에 급속 냉동시켰던 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 나노드롭 원(NanoDrop ONE)c 분광광도계를 사용하여 게놈 DNA 농도를 측정하였다. 투입분으로서의 50 ng의 DNA, 그리고 벡터-특이적 CB 및 U6 프로모터 및 HPRT 참조 유전자를 검출하는 타크만 검정을 사용하여, 제조자의 권장사항에 따라 액적 디지털 PCR (ddPCR, 바이오래드 사)을 수행하였다. 결과를 이배체 게놈 당 벡터 게놈 (vg/dg)로 나타내었다.
헌팅틴 단백질 수준의 분석 -- mHTT에 대한 중간규모 검출 검정 ( MSD )
선조체 샘플을 10 mM HEPES, 250 mM 수크로스, 1 mM EDTA 및 프로테아제 억제제 (로체(Roche) 사)로 구성되는 완충제 중에서 균질화하고, 10 % 진폭으로 10초 초음파처리하였다. 브래드포드(Bradford) 검정을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 96-웰 퀵플렉스(QuicPlex) 표준 플레이트 (MSD 사)를 PBS 중 토끼 단일클론 항-HTT 프롤린 1220 영역 항체 (D7F7, 세포 신호전달, 1:250)로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. PBST (PBS + 0.05 % 트윈(Tween)20)를 사용하여 3x 10분 동안 플레이트를 세척하고, PBS 중 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 RT에서 2시간 동안 블로킹하였다. PBST로 3x 10분 동안 세척한 후, 25 μL의 균질화 완충제 중에 20 ㎍의 단백질을 포함하는 샘플의 기술적 2반복물, 또는 바탕물 (균질화 완충제)을 플레이트에 분배하고, 궤도 진탕기에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST 중에서 3x 10분 세척하고, 하기와 같이 이차/검출 항체 혼합물 중에서 인큐베이션하였다: mHTT의 검출을 위하여, 마우스 단일클론 항-폴리Q 항체 MW1 (DSHB)을 PBS 중 1 % BSA 중에 각 항체 1 ㎍/mL로 항-마우스 술포태그(SulfoTag) 검출 항체 (MSD 사)와 혼합하였다. 웰 당 30 μL의 검출 항체 혼합물을 적용하고, 궤도 진탕기에서 RT로 3시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST 중에서 3x 10분 세척하고, 퀵플렉스 SQ120 (MSD 사)에서의 판독 직전에 웰 당 150 μL의 2x 판독 완충제 (MSD 사)를 적용하였다.
웨스턴 블러팅
냉동된 블록으로부터 소형 조직 단편을 제거하고, 얼음상에서 200 μl의 10 mM HEPES pH 7.2, 250 mM 수크로스, 1 mM EDTA + 프로테아제 억제제 정제 (미니, 완전, 무-EDTA 로체 사 #11836170001) 중에 균질화하였다. 10초 동안 샘플을 초음파처리한 후, 브래드포드법 (바이오래드 사 #500-0006)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 3-8 % 트리스(Tris)-아세테이트 겔 (라이프 테크놀로지스 사 #EA03785BOX) 상에서의 SDS-PAGE에 의해 동일 농도의 단백질 (25 ㎍)을 분리하고, 트랜스블럿 터보(TransBlot Turbo) (바이오래드 사)를 사용하여 니트로셀룰로스로 옮겼다. 트리스-완충 식염수 + 0.1 % 트윈-20 (TBST) 중 5 % 무-지방 분유 중에서 1시간 동안 블럿을 블로킹하고, 블로킹 용액에 희석된 일차 항체 중에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 사용된 일차 항체는 하기였다: 항-폴리-Q (MW1, 코리엘(Coriell) 사, 1:500 또는 3B5H10, 시그마(Sigma) 사, 1:1000), 항-헌팅틴 (MAB2166, EMD 밀리포어 사, 1:1000 또는 Ab1, 문헌 [DiFiglia et al., 1995], 1:1000), 항-DARPP32 (#ab40801, 아브캄(Abcam) 사, 1:10,000), 항-액틴 (A4700, 시그마 사, 1:1000) 및 항-스펙트린 (MAB1622, EMD 밀리포어 사, 1:4000). TBST 중에서 블럿을 세척하고, 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액 중에 1:5000 희석된 퍼옥시다제 표지 이차 항체 중에서 인큐베이션한 후, TBST 중에서 세척하고, 수퍼시그날 웨스트 피코(SuperSignal West Pico) 화학발광 기질 (피어스(Pierce) 사 #34080) 중에서 인큐베이션하였다. CCD 영상화 시스템 (알파 이노테크(Alpha Innotech) 사) 및 하이퍼필름(Hyperfilm) ECL (GE 헬스케어(Healthcare) 사)을 사용하여 이미지를 수득하였다. 이미지J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 디지털 이미지상에서 농도측정을 수행하였다. 비쌍형 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하고, 결과를 주사된 측면에 대한 평균 값으로 나타내었다.
DARPP32 , NeuN 및 Iba1에 대한 면역조직화학
DARPP32 양성 세포를 정량하기 위하여, 모든 20 번째 절편을 1X PBS 중 3 % 수소 퍼옥시드 중에서 3분, 0.5 % 트리톤(Triton)-X-100 중에서 20분, 그리고 이어서 1X PBS 중 1.5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스(Vector Labs) 사, S-1000) 중에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 1.5 % 표준 염소 혈청 중 항-DARPP32 (아브캄 사, ab40801, 1:1,000 희석) 중에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 다음에, 절편들을 1X PBS 중 바이오티닐화 염소 항-토끼 IgG 항체 (벡터 랩스 사, AP-1000, 1:200 희석) 중에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 1X PBS 중 벡타스타인 엘리트(Vectastain Elite) ABC 키트 (벡터 랩스 사, PK-6100)의 2 % 엘리트 A 및 2 % 엘리트 B 시약과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 금속 강화 DAB 키트 (써모피셔 사이언티픽 사, 34065)를 사용하여 DARPP32 양성 세포를 가시화하였다. 절편들을 안정한 퍼옥시드 완충제 중 1X 3,3'-디아미노벤지딘 중에서 인큐베이션하였다.
NeuN 양성 세포를 정량하기 위하여, 모든 20 번째 절편을 1X PBS 중 3 % 수소 퍼옥시드 중에서 3분, 0.5 % 트리톤-X-100 중에서 20분, 그리고 이어서 4 ℃로 밤새 1X PBS 중 1.5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스 사, S-1000) 중에서 밤새 인큐베이션하였다. 절편들을 1.5 % 표준 염소 혈청 중 항-NeuN (케미콘(Chemicon) 사, MAB377, 1:1,000 희석) 중에서 4 ℃로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음에, 절편들을 형광 AF594 염소 항-마우스 IgG (써모피셔 사이언티픽 사, A-11005, 1:2,000 희석) 중에서 40분 동안 인큐베이션함으로써, NeuN 양성 세포를 가시화하였다.
Iba1 양성 세포를 정량하기 위하여, 모든 20 번째 절편을 1X PBS 중 5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스 사, S-1000), 1 % 소 혈청 알부민 (시그마 사, A-3059), 0.2 % 트리톤-X-100 및 0.03 % 수소 퍼옥시드의 용액 중에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스 사, S-1000) 중 항-Iba1 (와코 케미칼스(Wako Chemicals) 사, 019-19741, 1:1,000 희석) 및 1 % 소 혈청 알부민 (시그마 사, A-3059) 중에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 절편들을 1X PBS 중 바이오티닐화 염소 항-토끼 IgG 항체 (벡터 랩스 사, AP-1000, 1:200 희석) 중에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 1X PBS 중 벡타스타인 엘리트 ABC 키트 (벡터 랩스 사, PK-6100)의 2 % 엘리트 A 및 2 % 엘리트 B 시약과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 금속 강화 DAB 키트 (써모피셔 사이언티픽 사, 34605)를 사용하여 안정한 퍼옥시드 완충제 중 1X 3,3'-디아미노벤지딘 중에서 절편을 인큐베이션하는 것에 의해 반응을 가시화하였다. 각 절편의 니콘 에클립스(Nikon Eclipse) E600 현미경을 사용한 이미지 (DARPP32의 경우 20X 및 Iba1의 경우 40X)를 촬영하는 것에 의해, 뇌의 좌측 및 우측 반구에서의 DARPP32 및 Iba1 양성 세포의 정량을 수행하였다. 서로 다른 절편들 사이에서 일관되게 이미지를 포착하기 위하여, 선조체의 내측 등쪽 가장자리에서 첫 번째 이미지를 포착하고, 스테이지를 배쪽 가장자리를 향하여 0.5 cm 이동하였다. 일단 배쪽 가장자리에 도달하고 나서, 10개의 이미지가 포착될 때까지 스테이지를 0.5 cm 외측 및 0.5 cm 등쪽으로 이동하였다. 각 이미지에는 무작위 번호를 할당함으로써, 세포를 정량할 때의 선입견을 제거하였다. 이미지J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 세포를 계수하였다.
치우 테크니칼 코포레이션(Chiu Technical Corporation) 사의 머큐리(Mercury) 100-W 램프가 구비된 니콘 에클립스 E600을 사용하여 60X로 NeuN 양성 세포의 정량을 수행하였다. DARPP32 및 Iba1 이미지를 포착하는 데에 사용된 입체학적 방법을 NeuN 양성 세포를 정량하는 데에도 사용하였다. 선조체 전체에 걸쳐 모든 20 번째 절편 (동물 측면 당 29-35개 절편)의 주사 및 비-주사 측면에서 이미지J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 DARPP32 염색된 영역에 수동으로 원을 그림으로써, 각 절편에서의 선조체, 미상핵 및 조가비핵의 면적을 측정하였다. 관찰자는 조건에 대하여 맹검처리되었다. 면적에 절편 두께 (40 마이크로미터)를 곱하고 슬라이드들 사이의 절편 수 (20)를 곱한 후, 각 동물에 대하여 서로 더함으로써, 각 영역의 총 부피를 측정하였다. 통계 분석은 마이크로소프트 엑셀, 쌍형성 및 비쌍형 t-검정, 군 당 N = 3 또는 4 마리의 동물을 사용하여 수행하였다.
주사 후 벡터 게놈 및 miRNA 분포
HD의 녹-인(knock-in) 모델에서의 확장된 마우스 헌팅틴 및 HD의 트랜스제닉 마우스 모델에서의 인간 mHTT 트랜스진 mRNA의 침묵화를 관찰하였다. 이와 같은 실시예에서는, 2개 HD 양 군 (연구 1 및 연구 2)의 선조체에 편측으로 주사하였다. 연구 1에서는, 비-코딩 스터퍼(stuffer) 서열이 프로모터와 폴리-A 신호 사이에 삽입되어 있는 scAAV9-U6-miRHTT (AAV9miRHTT) 또는 scAAV9-CBA-빈것 (AAV9)을 8-9개월령의 양에 주사하였다. 연구 2에서는, scAAV9-CBA-miRHTT 또는 scAAV9-CBA-빈것 (AAV9)을 14개월령의 양에 주사하였다. AAV9-miRHTT 투여 1개월 및 6개월 후에, 뇌를 수확하였다.
액적 디지털 PCR (ddPCR, 도 26b)에 의해 영역 하위세트 (도 26a)에서 게놈 카피수를 측정하였다. 게놈 카피수는 비-주사 측면에 비해 주사된 측면의 미상핵 및 조가비핵에서 최고였으며, 주사 1 및 6개월 후 scAAV9-U6-miRHTT 처리 군에서 최고 수준이었다. 피질 및 간에 소량의 벡터 게놈이 존재하였으나, 부신에서는 검출가능하지 않았다 (도 26b).
RNA 품질 번호 (RQN)로 지칭되는 점수를 생성시키는 단편 분석기를 사용하여 RNA 품질을 측정하였다. RQN은 전기-영동도를 분석하고, 28S와 18S 리보좀 피크 선명도 및 기준선 사이의 비와 같은 RNA 완전성의 수많은 서로 다른 척도들을 통합하는 것에 의해 생성된다. 점수는 일반적으로 0 (완전히 분해됨) 내지 10의 범위이다. 5를 초과하는 점수를 가지는 샘플을 사용하여 인공 miRNA 가이드 가닥의 수준을 분석하였다. 낮은 RQN 점수로 인하여, 연구 1로부터 2 마리 및 연구 2로부터 2 마리의 동물을 분석에서 배제하였다. ddPCR을 사용하여 인공 miRNA 가이드 가닥의 수준을 측정하고, 내생 let7e*에 대하여 정규화하였다 (도 27). 인공 miR 안티센스 가닥의 상대적인 품질은 비-주사 측면에 비해 주사된 측면에서 3.5-1000배 더 높았으며, 주사 6개월-후에 비해 1개월-후에서 더 높았다. AAV9-miRHTT를 사용한 주사 반대쪽 측면에서는 miRNA 가이드 가닥이 낮은 수준으로 검출되었다.
scAAV9 - miR HTT 의 단일 투여가 미상핵 및 조가비핵에서 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA를 장기간 감소시킨다
인간 HTT mRNA는 특이적으로 인식하며 양 HTT mRNA는 그렇게 하지 않는 분지 DNA (bDNA) 검정을 사용하여, 전방 및 내측 선조체 중 HTT mRNA를 측정하였다. 이와 같은 검정은 RNA 단리를 필요로 하지 않기 때문에, 모든 샘플을 분석에 포함시켰다. 주사 1개월-후, 내측 블록의 주사에 가장 가까운 곳에서, scAAV9-U6-miRHTT (연구 1)가 미상핵 및 조가비핵 모두에서 50 % 초과까지 인간 HTT mRNA를 감소시켰다 (도 28). 주사 부위로부터 더 멀었던 전방 선조체에서는 상당한 침묵화가 검출되지 않았다 (도 28). 주사 6개월-후, mRNA 침묵화는 미상핵에서 현저하였다 (도 28). scAAV9-CβA-miRHTT 군 (연구 2)에서는, 주사 1개월-후에 내측 조가비핵, 내측 미상핵 및 전방 선조체에서 (도 28), 그리고 주사 6개월-후에 내측 미상핵 및 내측 조가비핵 일부에서 (도 28) HTT mRNA의 현저한 침묵화가 발생하였다. 전방 선조체는 6개월 후에서 상당한 저하를 나타내지 않았다. 내생 양 HTT mRNA의 상당한 침묵화는 존재하지 않았다 (도 29a).
웨스턴 블럿 검정 및 전기화학발광 ( MSD 검정)은 scAAV9 - miR HTT 가 미상핵 및 조가비핵에서 인간 돌연변이 헌팅틴 단백질을 감소시킨다는 것을 보여준다
동일한 샘플 조제물에서 웨스턴 블럿 (도 30) 및 전기화학발광 (중간 규모 발견(Meso Scale Discovery) (MSD) (도 30)에 의해 HTT 단백질을 검출하였다. 연구 1에서는, 웨스턴 블럿에 의해, 야생형 HTT에 비교하여 mHTT (돌연변이 HTT)를 우선적으로 검출하는 3BH510 항체를 사용하여 mHTT 단백질을 검출하였다 (도 30). scAAV9-U6-miRHTT를 사용한 처리 1개월 후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서, 그리고 처리 6개월-후에 조가비핵에서 miRHTT가 결핍되어 있는 AAV9를 사용한 처리에 비해 mHTT 단백질의 상당한 감소가 존재하였다. 연구 2 (도 30, 하단)에서, scAAV9-CβA-miRHTT 처리는 주사 1개월-후 조가비핵에서, 그리고 주사 6개월-후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서 mHTT를 상당히 침묵화하였다.
검출에 MW1을 사용한 MSD 검정에 의한 결과는 scAAV9-U6-miRHTT 처리 (연구 1)가 처리 1 및 6개월-후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서 mHTT 단백질 수준을 상당히 낮춘다는 것을 보여주었다. scAAV9-CBA-miRHTT는 주사 1개월-후에 미상핵에서, 그리고 처리 6개월 후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서 mHTT 단백질을 현저하게 침묵화하였다 (도 31). 이러한 결과는 MSD 검정에 의한 결과 (도 31)와 웨스턴 블럿 검정에 의해 수득된 결과 (도 30) 사이에 충분한 일치성이 존재한다는 것을 표시하였다.
표 2: 연구 1 및 2에서의 웨스턴 블럿 및 MSD 검정에 의한 돌연변이 헌팅틴 단백질 저하의 평균 %. 연구 1에서는 항-htt 폴리Q 항체 3B5H10을, 연구 2에서는 항체 3B5H10, 양 HTT는 인식하지 않는 (문헌 [Reid et al., 2013]) MAB2166 (항-HTT443-456) 및 항-폴리Q 단일클론 항체 MW1을 사용한 웨스턴 블럿에 의해 인간 돌연변이 헌팅틴 단백질을 측정하였다. MSD 검정에서는 검출 항체로서 MW1을 사용하였다. 이와 같은 표는 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서의 평균 % mHTT 저하를 기록한다. % 저하는 AAV9miRHTT 처리된 양의 주사된 측면에서의 평균 신호를 AAV9 단독 처리된 동물의 주사된 측면에서의 평균 신호로 나누는 것에 의해 계산하였다.
Figure 112019039223092-pct00002
mHTT를 검출하는 항체들은 서로 다른 민감성을 가질 수 있기 때문에, 웨스턴 블럿, MAB2166 및 MW1에 의해 인간 mHTT 단백질을 검출하는 2종의 다른 항체를 연구 2에 포함시켰다 (표 2). HD 트랜스제닉 양에서, MAB2166은 인간 헌팅틴만을 인식하며, 양 HTT는 인식하지 않는다. MW1은 HTT의 확장된 폴리글루타민 영역을 우선적으로 인식하므로, 역시 MSD 검정에서 mHTT의 검출에 사용하였다. 표 2는 연구 1 및 2에서 3종의 항-mHTT 항체 (3B5H10, 2166 및 MW1)를 사용한 웨스턴 블럿, 그리고 MW1을 사용한 MSD 검정에 의해 검출된 mHTT의 평균 % 저하를 비교한다. 연구 2에서는, 웨스턴 블럿 분석의 3종 전체 항체가 다중 신선조체 영역에서의 상당한 mHTT 저하를 검출하였다 (49 % 내지 81 %). MSD 검정에 의한 mHTT 저하의 결과는 연구 2에서 동일한 선조체 영역으로부터의 2개의 샘플이 분석된 경우, 일치하였다. 연구 2에서의 웨스턴 블럿 및 MW1을 사용한 MSD 검정에 의한 결과의 비교 역시 주목할 만하다. mHTT 저하 크기에 있어서의 이러한 2종의 서로 다른 mHTT 검출 방법 사이에는 충분한 일치가 존재하였다.
웨스턴 블럿 분석에 의하면, AAV9-miRHTT 주사된 선조체를 덮고 있는 피질은 AAV9 주사된 피질에 비해 mHTT 단백질 수준의 감소를 나타내지 않았다 (도 32a). AAV9-miRHTT 주사된 선조체의 반대쪽 측면상의 미상핵 및 조가비핵에서는, 낮은 mRNA 가이드 가닥 수준이 검출되었다. 이들 영역은 웨스턴 블럿 분석에서 감소된 mHTT 단백질 수준을 나타내지 않았다 (도 32b).
인간 HD 유전자에 대항하는 AAV9-miRHTT를 사용한 처리가 내생 양 HTT의 수준에 영향을 주는지를 조사하기 위하여, SDS PAGE에서의 2종 단백질의 이동에 있어서의 차이를 이용하는 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 인간 트랜스진 mHTT의 수준을 내생 양 HTT의 수준과 직접 비교하였다 (도 29b). htt1-17을 인식하는 Ab1 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석은 인간 mHTT와 달리, 내생 양 HTT가 miRHTT를 사용한 처리에 의해 저하되지 않는다는 것을 보여주었다 (도 29b).
DARPP32 표지된 뉴런 및 선조체 부피는 miRNA 처리에 의해 영향을 받지 않는다
AAV 벡터 주사의 안전성을 조사하기 위하여, 중간 가시 뉴런의 마커인 DARPP32에 대한 면역조직화학을 수행하고, DARPP32 양성 세포의 수를 계수하였다. AAV9-miRHTT 처리 및 AAV9 처리 군의 세포수 사이에, 상당한 차이는 존재하지 않았으며 (표 3), 뉴런 세포의 마커인 NeuN의 염색된 세포의 수에 있어서 처리 군들 사이에 상당한 차이는 존재하지 않았다. DARPP32 표지 절편에서의 선조체의 단면적 측정을 사용하여 선조체 부피를 측정하였는데, miRNA 처리 후의 대조에 비해 변화되지 않는다는 것이 발견되었다 (표 4).
표 3: DARPP32 및 NeuN 양성 세포의 수. 쌍형성 t-검정 (주사 대 비-주사 측면)에 의해 데이터를 분석하였다. AAV9-CBA-miRHTT가 주사된 WT 양에서만 주사 6개월 후 쌍형성 t-검정에서 1p=0.002로 주사 및 비-주사 측면 사이에 상당한 차이가 발견되었다.
Figure 112019039223092-pct00003
표 4: 선조체 부피. 부피는 동물 당 측면 당 29-35개 40 ㎛ 절편의 단면적으로부터 측정하였다. 군 당 N=3 마리의 양, 1p=0.01, 2p=0.03, 3p=0.02, 쌍형성 t-검정 사용.
Figure 112019039223092-pct00004
scAAV9를 사용한 직접 주사후에는 활성화된 소교세포의 일시적인 증가가 발생한다
소교세포에 국소화되어 그의 활성화시 상향조절되는 단백질인 Iba1의 면역-조직화학적 국소화를 조사하였다. 표지된 세포들을 형태구조를 기준으로 휴지 또는 활성화 소교세포로서 확인하였다 (표 5). scAAV9-U6-miRHTT 또는 상응하는 대조 벡터의 주사는 주사 1개월-후 주사된 측면에서의 활성화된 소교세포의 수를 증가시켰지만, 주사 6개월 후에는 주사 및 비-주사 측면이 구별불가능하였다. 두 번째 연구에서는, 연구 종료점 (6개월)에만 소교세포 반응을 조사하였는데, 그 시점에 군들 사이의 상당한 차이는 존재하지 않았다. 결과는 활성화된 소교세포의 일시적인 증가가 AAV 적재물과는 무관하며, 임의의 벡터 또는 수술 단독으로도 발생할 수 있다는 것을 암시한다.
표 5: IBA1 양성 세포의 형태구조를 기준으로 한 수 및 분류. 통계 분석은 쌍형성 t-검정 (주사된 측면 대 비-주사 측면)에 의해 수행하였다. 6개월에 AAV9-U6-miRHTT (1p=0.01)가 주사된 HD 양 및 AAV9 (2p=0.006)가 주사된 WT 양에서 비-주사 측면에 비교한 주사된 측면에서의 활성화된 소교세포의 상당한 증가가 발견되었다. 1개월에 AAV9 (3p=0.05) 및 AAV9-U6-miRHTT (4p=0.04) 양자가 주사된 HD 양에서 휴지 소교세포의 상당한 감소가 발견되었으며, 연구 2의 6개월에 AAV9가 주사된 HD 양에서 총 소교세포의 상당한 증가가 발견되었다 (4p=0.04). 모든 분석은 주사 대 비-주사 측면을 비교하는 쌍형성 t-검정에 의해 수행하였다.
Figure 112019039223092-pct00005
scAAV9 - miR HTT 처리가 혈구 계수, 전해질, 또는 간 및 신장 기능에는 영향을 주지는 않는다
하기 4개 시점에 혈액 샘플을 채취하였다: 기준선 (처리전), 처리 후 28 (또는 30)일, 90일 및 180일. 전체 혈구 계수, 전해질을 측정하고, 간 및 신장 기능 시험을 수행하였다 (표 6). 이들 측정 중 어느 것에서도 AAV9-miRHTT 주사 양과 대조 사이에 변화는 발견되지 않았다. 또한, 이들 시점에 체중의 변화는 존재하지 않았다.
표 6. 모든 양들의 임상 병리 및 전체 혈구 계수.
Figure 112019039223092-pct00006
Figure 112019039223092-pct00007
[서열목록]
>서열식별번호: 1 헌팅틴 mRNA; NCBI 참조 서열 NM_002111.8)
Figure 112019039223092-pct00008
Figure 112019039223092-pct00009
Figure 112019039223092-pct00010
Figure 112019039223092-pct00011
Figure 112019039223092-pct00012
Figure 112019039223092-pct00013
>서열식별번호: 2
Figure 112019039223092-pct00014
>서열식별번호: 3
Figure 112019039223092-pct00015
>서열식별번호: 4
Figure 112019039223092-pct00016
>서열식별번호: 5
Figure 112019039223092-pct00017
>서열식별번호: 6
Figure 112019039223092-pct00018
>서열식별번호: 7
Figure 112019039223092-pct00019
>서열식별번호: 8
Figure 112019039223092-pct00020
서열식별번호: 9
Figure 112019039223092-pct00021
>서열식별번호: 10
Figure 112019039223092-pct00022
>서열식별번호: 11
Figure 112019039223092-pct00023
>서열식별번호: 12
Figure 112019039223092-pct00024
>서열식별번호: 13
Figure 112019039223092-pct00025
>서열식별번호: 14
Figure 112019039223092-pct00026
>서열식별번호: 15
Figure 112019039223092-pct00027
>서열식별번호: 16
좌위 dsCB-GFP-mir155- 5483 bp DNA 원형 SYN 11-OCT-2012
정의 dsCB-GFP-mirFlank-폴리A*에의 6433의 결찰
등재 dsCB-GFP-mir155-
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5483)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴(Central), 사이언티픽 앤 에듀케이셔널 소프트웨어(Scientific & Educational Software)에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: dsCB-GFP-mirFlank-폴리A*
단편 단부: BsmBI
단편 크기: 5419
삽입 분자: 6433
단편 단부:
단편 크기: 64
특징 위치/수식어
misc_특징 662..767
/유전자="돌연변이 ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 814..1093
/유전자="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 870..899
/유전자="잠정용"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1100..1126
/유전자="프로브"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1100..1369
/유전자="B-액틴 프로모터"
/생성물="닭"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (1168..1190)
/유전자="rev"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1435..1465
/유전자="SV40_late_19s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1435..1531
/유전자="modSV40_late_16s_int"
/SECDrawAs="영역"
CDS 1605..2314
/유전자="GFP'"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 2341..2357
/유전자="'MCS"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2372..2395
/유전자="5'miR Flank'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2460..2504
/유전자="3'miR Flank"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2573..2699
/유전자="폴리 A 신호"
/생성물="토끼 글로빈 폴리 A"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (2788..2917)
/유전자="3' ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 3680..4537
/유전자="Amp(R)"
/SECDrawAs="유전자"
기원
Figure 112019039223092-pct00028
Figure 112019039223092-pct00029
Figure 112019039223092-pct00030
>서열식별번호: 17
//좌위 pdsU6-Mir-htt-64 5686 bp DNA 원형 SYN 17-SEP-2013
정의 pU6-miRNAFlank-GFP*에의 6433의 결찰
등재 pdsU6-Mir-htt-64
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5686)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴, 사이언티픽 & 에듀케이셔널 소프트웨어에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: pU6-miRNAFlank-GFP*
단편 단부: BsmBI
단편 크기: 5622
삽입 분자: 6433
단편 단부:
단편 크기: 64
특징 위치/수식어
misc_특징 662..767
/유전자="돌연변이 ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 777..1041
/유전자="U6 프로모터"
/SECDrawAs="영역"
misc_신호 1041..1041
/유전자="Pol III 개시"
/생성물="전사 개시 "
/SECDrawAs="표지"
CDS 1042..1065
/유전자="5' miR Flank'"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 1130..1175
/유전자="miR 3' Flank"
/SECDrawAs="유전자"
misc_신호 1176..1181
/유전자="Pol III term"
/생성물="pol III 종료자"
/SECDrawAs="표지"
misc_특징 1199..1478
/유전자="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1255..1284
/유전자="잠정용"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1754
/유전자="B-액틴 프로모터"
/생성물="닭"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1511
/유전자="프로브"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (1553..1575)
/유전자="rev"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1916
/유전자="modSV40_late_16s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1850
/유전자="SV40_late_19s_int"
/SECDrawAs="영역"
CDS 1990..2699
/유전자="GFP'"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 2726..2737
/유전자="'MCS'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2776..2902
/유전자="폴리 A 신호"
/생성물="토끼 글로빈 폴리 A"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (2991..3120)
/유전자="3' ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 3883..4740
/유전자="Amp(R)"
/SECDrawAs="유전자"
기원
Figure 112019039223092-pct00031
Figure 112019039223092-pct00032
Figure 112019039223092-pct00033
>서열식별번호: 18
좌위 pCVscAsaq+-mir64 5155 bp DNA 원형 SYN 17-SEP-2013
정의 pCVscAsaq+-mirFlank*에의 6433의 결찰
등재 pCVscAsaq+-mir64
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5155)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴, 사이언티픽 & 에듀케이셔널 소프트웨어에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: pCVscAsaq+-mirFlank*
단편 단부: BsmBI
단편 크기: 5090
삽입 분자: 6433
단편 단부:
단편 크기: 64
특징 위치/수식어
misc_특징 1..105
/유전자="ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 182..449
/유전자="CMV"
/생성물="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
CDS 448..753
/유전자="CB 프로모터"
/생성물="프로모터 진핵"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 754..1819
/유전자="인트론"
/생성물="인트론"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 1820..1839
/유전자="MCS"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 1843..1847
/유전자=""MCS"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1862..1885
/유전자="5'miR Flank'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1950..1994
/유전자="3'miR Flank"
/SECDrawAs="영역"
CDS 2002..2128
/유전자="RBG pA"
/생성물="폴리A 신호"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 상보체 (2002..2128)
/유전자="RBG\pA"
/SECDrawAs="정보용"
misc_특징 2139..2281
/유전자="3'ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 2317..2509
/유전자="lacZ"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 2510..2965
/유전자="f1 ori"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 3097..3957
/유전자="bla-AmpR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 4117..4731
/유전자="rep-pMB1"
/SECDrawAs="영역"
기원
Figure 112019039223092-pct00034
Figure 112019039223092-pct00035
>서열식별번호: 19
좌위 U6-mir6433-BGHpA 5223 bp DNA 원형 SYN 12-SEP-2013
정의 U6-MiRBA-6433-GFP**에의 dsAAV CB MCS**의 결찰
등재 U6-mir6433-BGHpA
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5223)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴, 사이언티픽 & 에듀케이셔널 소프트웨어에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: U6-MiRBA-6433-GFP**
단편 단부: 둔단 및 EagI
단편 크기: 4954
삽입 분자: dsAAV CB MCS**
단편 단부: EagI 및 둔단
단편 크기: 269
특징 위치/수식어
misc_특징 662..767
/유전자="돌연변이 ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 777..1041
/유전자="U6 프로모터"
/SECDrawAs="영역"
misc_신호 1041..1041
/유전자="Pol III 개시"
/생성물="전사 개시 "
/SECDrawAs="표지"
CDS 1042..1065
/유전자="5' miR Flank'"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 1130..1175
/유전자="miR 3' Flank"
/SECDrawAs="유전자"
misc_신호 1176..1181
/유전자="Pol III term"
/생성물="pol III 종료자"
/SECDrawAs="표지"
misc_특징 1199..1478
/유전자="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1255..1284
/유전자="잠정용"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1511
/유전자="프로브"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1754
/유전자="B-액틴 프로모터"
/생성물="닭"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (1553..1575)
/유전자="rev"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1850
/유전자="SV40_late_19s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1916
/유전자="modSV40_late_16s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2034..2230
/유전자="BGHpA"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2263..2274
/유전자="'MCS'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2313..2439
/유전자="폴리 A 신호"
/생성물="토끼 글로빈 폴리 A"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (2528..2657)
/유전자="3' ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 3420..4277
/유전자="Amp(R)"
/SECDrawAs="유전자"
기원
Figure 112019039223092-pct00036
Figure 112019039223092-pct00037
Figure 112019039223092-pct00038
>서열식별번호: 20 AAV9 캡시드 단백질
Figure 112019039223092-pct00039
>서열식별번호: 21
Figure 112019039223092-pct00040
>서열식별번호: 22
Figure 112019039223092-pct00041
SEQUENCE LISTING <110> University of Massachusetts <120> AAV TREATMENT OF HUNTINGTON'S DISEASE <130> U0120.70084WO00 <140> Not Yet Assigned <141> 2017-09-22 <150> US 62/398,487 <151> 2016-09-22 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13498 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctgccggga cgggtccaag atggacggcc gctcaggttc tgcttttacc tgcggcccag 60 agccccattc attgccccgg tgctgagcgg cgccgcgagt cggcccgagg cctccgggga 120 ctgccgtgcc gggcgggaga ccgccatggc gaccctggaa aagctgatga aggccttcga 180 gtccctcaag tccttccagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca 240 gcagcagcag cagcagcagc aacagccgcc accgccgccg ccgccgccgc cgcctcctca 300 gcttcctcag ccgccgccgc aggcacagcc gctgctgcct cagccgcagc cgcccccgcc 360 gccgcccccg ccgccacccg gcccggctgt ggctgaggag ccgctgcacc gaccaaagaa 420 agaactttca gctaccaaga aagaccgtgt gaatcattgt ctgacaatat gtgaaaacat 480 agtggcacag tctgtcagaa attctccaga atttcagaaa cttctgggca tcgctatgga 540 actttttctg ctgtgcagtg atgacgcaga gtcagatgtc aggatggtgg ctgacgaatg 600 cctcaacaaa gttatcaaag ctttgatgga ttctaatctt ccaaggttac agctcgagct 660 ctataaggaa attaaaaaga atggtgcccc tcggagtttg cgtgctgccc tgtggaggtt 720 tgctgagctg gctcacctgg ttcggcctca gaaatgcagg ccttacctgg tgaaccttct 780 gccgtgcctg actcgaacaa gcaagagacc cgaagaatca gtccaggaga ccttggctgc 840 agctgttccc aaaattatgg cttcttttgg caattttgca aatgacaatg aaattaaggt 900 tttgttaaag gccttcatag cgaacctgaa gtcaagctcc cccaccattc ggcggacagc 960 ggctggatca gcagtgagca tctgccagca ctcaagaagg acacaatatt tctatagttg 1020 gctactaaat gtgctcttag gcttactcgt tcctgtcgag gatgaacact ccactctgct 1080 gattcttggc gtgctgctca ccctgaggta tttggtgccc ttgctgcagc agcaggtcaa 1140 ggacacaagc ctgaaaggca gcttcggagt gacaaggaaa gaaatggaag tctctccttc 1200 tgcagagcag cttgtccagg tttatgaact gacgttacat catacacagc accaagacca 1260 caatgttgtg accggagccc tggagctgtt gcagcagctc ttcagaacgc ctccacccga 1320 gcttctgcaa accctgaccg cagtcggggg cattgggcag ctcaccgctg ctaaggagga 1380 gtctggtggc cgaagccgta gtgggagtat tgtggaactt atagctggag ggggttcctc 1440 atgcagccct gtcctttcaa gaaaacaaaa aggcaaagtg ctcttaggag aagaagaagc 1500 cttggaggat gactctgaat cgagatcgga tgtcagcagc tctgccttaa cagcctcagt 1560 gaaggatgag atcagtggag agctggctgc ttcttcaggg gtttccactc cagggtcagc 1620 aggtcatgac atcatcacag aacagccacg gtcacagcac acactgcagg cggactcagt 1680 ggatctggcc agctgtgact tgacaagctc tgccactgat ggggatgagg aggatatctt 1740 gagccacagc tccagccagg tcagcgccgt cccatctgac cctgccatgg acctgaatga 1800 tgggacccag gcctcgtcgc ccatcagcga cagctcccag accaccaccg aagggcctga 1860 ttcagctgtt accccttcag acagttctga aattgtgtta gacggtaccg acaaccagta 1920 tttgggcctg cagattggac agccccagga tgaagatgag gaagccacag gtattcttcc 1980 tgatgaagcc tcggaggcct tcaggaactc ttccatggcc cttcaacagg cacatttatt 2040 gaaaaacatg agtcactgca ggcagccttc tgacagcagt gttgataaat ttgtgttgag 2100 agatgaagct actgaaccgg gtgatcaaga aaacaagcct tgccgcatca aaggtgacat 2160 tggacagtcc actgatgatg actctgcacc tcttgtccat tgtgtccgcc ttttatctgc 2220 ttcgtttttg ctaacagggg gaaaaaatgt gctggttccg gacagggatg tgagggtcag 2280 cgtgaaggcc ctggccctca gctgtgtggg agcagctgtg gccctccacc cggaatcttt 2340 cttcagcaaa ctctataaag ttcctcttga caccacggaa taccctgagg aacagtatgt 2400 ctcagacatc ttgaactaca tcgatcatgg agacccacag gttcgaggag ccactgccat 2460 tctctgtggg accctcatct gctccatcct cagcaggtcc cgcttccacg tgggagattg 2520 gatgggcacc attagaaccc tcacaggaaa tacattttct ttggcggatt gcattccttt 2580 gctgcggaaa acactgaagg atgagtcttc tgttacttgc aagttagctt gtacagctgt 2640 gaggaactgt gtcatgagtc tctgcagcag cagctacagt gagttaggac tgcagctgat 2700 catcgatgtg ctgactctga ggaacagttc ctattggctg gtgaggacag agcttctgga 2760 aacccttgca gagattgact tcaggctggt gagctttttg gaggcaaaag cagaaaactt 2820 acacagaggg gctcatcatt atacagggct tttaaaactg caagaacgag tgctcaataa 2880 tgttgtcatc catttgcttg gagatgaaga ccccagggtg cgacatgttg ccgcagcatc 2940 actaattagg cttgtcccaa agctgtttta taaatgtgac caaggacaag ctgatccagt 3000 agtggccgtg gcaagagatc aaagcagtgt ttacctgaaa cttctcatgc atgagacgca 3060 gcctccatct catttctccg tcagcacaat aaccagaata tatagaggct ataacctact 3120 accaagcata acagacgtca ctatggaaaa taacctttca agagttattg cagcagtttc 3180 tcatgaacta atcacatcaa ccaccagagc actcacattt ggatgctgtg aagctttgtg 3240 tcttctttcc actgccttcc cagtttgcat ttggagttta ggttggcact gtggagtgcc 3300 tccactgagt gcctcagatg agtctaggaa gagctgtacc gttgggatgg ccacaatgat 3360 tctgaccctg ctctcgtcag cttggttccc attggatctc tcagcccatc aagatgcttt 3420 gattttggcc ggaaacttgc ttgcagccag tgctcccaaa tctctgagaa gttcatgggc 3480 ctctgaagaa gaagccaacc cagcagccac caagcaagag gaggtctggc cagccctggg 3540 ggaccgggcc ctggtgccca tggtggagca gctcttctct cacctgctga aggtgattaa 3600 catttgtgcc cacgtcctgg atgacgtggc tcctggaccc gcaataaagg cagccttgcc 3660 ttctctaaca aacccccctt ctctaagtcc catccgacga aaggggaagg agaaagaacc 3720 aggagaacaa gcatctgtac cgttgagtcc caagaaaggc agtgaggcca gtgcagcttc 3780 tagacaatct gatacctcag gtcctgttac aacaagtaaa tcctcatcac tggggagttt 3840 ctatcatctt ccttcatacc tcaaactgca tgatgtcctg aaagctacac acgctaacta 3900 caaggtcacg ctggatcttc agaacagcac ggaaaagttt ggagggtttc tccgctcagc 3960 cttggatgtt ctttctcaga tactagagct ggccacactg caggacattg ggaagtgtgt 4020 tgaagagatc ctaggatacc tgaaatcctg ctttagtcga gaaccaatga tggcaactgt 4080 ttgtgttcaa caattgttga agactctctt tggcacaaac ttggcctccc agtttgatgg 4140 cttatcttcc aaccccagca agtcacaagg ccgagcacag cgccttggct cctccagtgt 4200 gaggccaggc ttgtaccact actgcttcat ggccccgtac acccacttca cccaggccct 4260 cgctgacgcc agcctgagga acatggtgca ggcggagcag gagaacgaca cctcgggatg 4320 gtttgatgtc ctccagaaag tgtctaccca gttgaagaca aacctcacga gtgtcacaaa 4380 gaaccgtgca gataagaatg ctattcataa tcacattcgt ttgtttgaac ctcttgttat 4440 aaaagcttta aaacagtaca cgactacaac atgtgtgcag ttacagaagc aggttttaga 4500 tttgctggcg cagctggttc agttacgggt taattactgt cttctggatt cagatcaggt 4560 gtttattggc tttgtattga aacagtttga atacattgaa gtgggccagt tcagggaatc 4620 agaggcaatc attccaaaca tctttttctt cttggtatta ctatcttatg aacgctatca 4680 ttcaaaacag atcattggaa ttcctaaaat cattcagctc tgtgatggca tcatggccag 4740 tggaaggaag gctgtgacac atgccatacc ggctctgcag cccatagtcc acgacctctt 4800 tgtattaaga ggaacaaata aagctgatgc aggaaaagag cttgaaaccc aaaaagaggt 4860 ggtggtgtca atgttactga gactcatcca gtaccatcag gtgttggaga tgttcattct 4920 tgtcctgcag cagtgccaca aggagaatga agacaagtgg aagcgactgt ctcgacagat 4980 agctgacatc atcctcccaa tgttagccaa acagcagatg cacattgact ctcatgaagc 5040 ccttggagtg ttaaatacat tatttgagat tttggcccct tcctccctcc gtccggtaga 5100 catgctttta cggagtatgt tcgtcactcc aaacacaatg gcgtccgtga gcactgttca 5160 actgtggata tcgggaattc tggccatttt gagggttctg atttcccagt caactgaaga 5220 tattgttctt tctcgtattc aggagctctc cttctctccg tatttaatct cctgtacagt 5280 aattaatagg ttaagagatg gggacagtac ttcaacgcta gaagaacaca gtgaagggaa 5340 acaaataaag aatttgccag aagaaacatt ttcaaggttt ctattacaac tggttggtat 5400 tcttttagaa gacattgtta caaaacagct gaaggtggaa atgagtgagc agcaacatac 5460 tttctattgc caggaactag gcacactgct aatgtgtctg atccacatct tcaagtctgg 5520 aatgttccgg agaatcacag cagctgccac taggctgttc cgcagtgatg gctgtggcgg 5580 cagtttctac accctggaca gcttgaactt gcgggctcgt tccatgatca ccacccaccc 5640 ggccctggtg ctgctctggt gtcagatact gctgcttgtc aaccacaccg actaccgctg 5700 gtgggcagaa gtgcagcaga ccccgaaaag acacagtctg tccagcacaa agttacttag 5760 tccccagatg tctggagaag aggaggattc tgacttggca gccaaacttg gaatgtgcaa 5820 tagagaaata gtacgaagag gggctctcat tctcttctgt gattatgtct gtcagaacct 5880 ccatgactcc gagcacttaa cgtggctcat tgtaaatcac attcaagatc tgatcagcct 5940 ttcccacgag cctccagtac aggacttcat cagtgccgtt catcggaact ctgctgccag 6000 cggcctgttc atccaggcaa ttcagtctcg ttgtgaaaac ctttcaactc caaccatgct 6060 gaagaaaact cttcagtgct tggaggggat ccatctcagc cagtcgggag ctgtgctcac 6120 gctgtatgtg gacaggcttc tgtgcacccc tttccgtgtg ctggctcgca tggtcgacat 6180 ccttgcttgt cgccgggtag aaatgcttct ggctgcaaat ttacagagca gcatggccca 6240 gttgccaatg gaagaactca acagaatcca ggaatacctt cagagcagcg ggctcgctca 6300 gagacaccaa aggctctatt ccctgctgga caggtttcgt ctctccacca tgcaagactc 6360 acttagtccc tctcctccag tctcttccca cccgctggac ggggatgggc acgtgtcact 6420 ggaaacagtg agtccggaca aagactggta cgttcatctt gtcaaatccc agtgttggac 6480 caggtcagat tctgcactgc tggaaggtgc agagctggtg aatcggattc ctgctgaaga 6540 tatgaatgcc ttcatgatga actcggagtt caacctaagc ctgctagctc catgcttaag 6600 cctagggatg agtgaaattt ctggtggcca gaagagtgcc ctttttgaag cagcccgtga 6660 ggtgactctg gcccgtgtga gcggcaccgt gcagcagctc cctgctgtcc atcatgtctt 6720 ccagcccgag ctgcctgcag agccggcggc ctactggagc aagttgaatg atctgtttgg 6780 ggatgctgca ctgtatcagt ccctgcccac tctggcccgg gccctggcac agtacctggt 6840 ggtggtctcc aaactgccca gtcatttgca ccttcctcct gagaaagaga aggacattgt 6900 gaaattcgtg gtggcaaccc ttgaggccct gtcctggcat ttgatccatg agcagatccc 6960 gctgagtctg gatctccagg cagggctgga ctgctgctgc ctggccctgc agctgcctgg 7020 cctctggagc gtggtctcct ccacagagtt tgtgacccac gcctgctccc tcatctactg 7080 tgtgcacttc atcctggagg ccgttgcagt gcagcctgga gagcagcttc ttagtccaga 7140 aagaaggaca aataccccaa aagccatcag cgaggaggag gaggaagtag atccaaacac 7200 acagaatcct aagtatatca ctgcagcctg tgagatggtg gcagaaatgg tggagtctct 7260 gcagtcggtg ttggccttgg gtcataaaag gaatagcggc gtgccggcgt ttctcacgcc 7320 attgctaagg aacatcatca tcagcctggc ccgcctgccc cttgtcaaca gctacacacg 7380 tgtgccccca ctggtgtgga agcttggatg gtcacccaaa ccgggagggg attttggcac 7440 agcattccct gagatccccg tggagttcct ccaggaaaag gaagtcttta aggagttcat 7500 ctaccgcatc aacacactag gctggaccag tcgtactcag tttgaagaaa cttgggccac 7560 cctccttggt gtcctggtga cgcagcccct cgtgatggag caggaggaga gcccaccaga 7620 agaagacaca gagaggaccc agatcaacgt cctggccgtg caggccatca cctcactggt 7680 gctcagtgca atgactgtgc ctgtggccgg caacccagct gtaagctgct tggagcagca 7740 gccccggaac aagcctctga aagctctcga caccaggttt gggaggaagc tgagcattat 7800 cagagggatt gtggagcaag agattcaagc aatggtttca aagagagaga atattgccac 7860 ccatcattta tatcaggcat gggatcctgt cccttctctg tctccggcta ctacaggtgc 7920 cctcatcagc cacgagaagc tgctgctaca gatcaacccc gagcgggagc tggggagcat 7980 gagctacaaa ctcggccagg tgtccataca ctccgtgtgg ctggggaaca gcatcacacc 8040 cctgagggag gaggaatggg acgaggaaga ggaggaggag gccgacgccc ctgcaccttc 8100 gtcaccaccc acgtctccag tcaactccag gaaacaccgg gctggagttg acatccactc 8160 ctgttcgcag tttttgcttg agttgtacag ccgctggatc ctgccgtcca gctcagccag 8220 gaggaccccg gccatcctga tcagtgaggt ggtcagatcc cttctagtgg tctcagactt 8280 gttcaccgag cgcaaccagt ttgagctgat gtatgtgacg ctgacagaac tgcgaagggt 8340 gcacccttca gaagacgaga tcctcgctca gtacctggtg cctgccacct gcaaggcagc 8400 tgccgtcctt gggatggaca aggccgtggc ggagcctgtc agccgcctgc tggagagcac 8460 gctcaggagc agccacctgc ccagcagggt tggagccctg cacggcgtcc tctatgtgct 8520 ggagtgcgac ctgctggacg acactgccaa gcagctcatc ccggtcatca gcgactatct 8580 cctctccaac ctgaaaggga tcgcccactg cgtgaacatt cacagccagc agcacgtact 8640 ggtcatgtgt gccactgcgt tttacctcat tgagaactat cctctggacg tagggccgga 8700 attttcagca tcaataatac agatgtgtgg ggtgatgctg tctggaagtg aggagtccac 8760 cccctccatc atttaccact gtgccctcag aggcctggag cgcctcctgc tctctgagca 8820 gctctcccgc ctggatgcag aatcgctggt caagctgagt gtggacagag tgaacgtgca 8880 cagcccgcac cgggccatgg cggctctggg cctgatgctc acctgcatgt acacaggaaa 8940 ggagaaagtc agtccgggta gaacttcaga ccctaatcct gcagcccccg acagcgagtc 9000 agtgattgtt gctatggagc gggtatctgt tctttttgat aggatcagga aaggctttcc 9060 ttgtgaagcc agagtggtgg ccaggatcct gccccagttt ctagacgact tcttcccacc 9120 ccaggacatc atgaacaaag tcatcggaga gtttctgtcc aaccagcagc cataccccca 9180 gttcatggcc accgtggtgt ataaggtgtt tcagactctg cacagcaccg ggcagtcgtc 9240 catggtccgg gactgggtca tgctgtccct ctccaacttc acgcagaggg ccccggtcgc 9300 catggccacg tggagcctct cctgcttctt tgtcagcgcg tccaccagcc cgtgggtcgc 9360 ggcgatcctc ccacatgtca tcagcaggat gggcaagctg gagcaggtgg acgtgaacct 9420 tttctgcctg gtcgccacag acttctacag acaccagata gaggaggagc tcgaccgcag 9480 ggccttccag tctgtgcttg aggtggttgc agccccagga agcccatatc accggctgct 9540 gacttgttta cgaaatgtcc acaaggtcac cacctgctga gcgccatggt gggagagact 9600 gtgaggcggc agctggggcc ggagcctttg gaagtctgcg cccttgtgcc ctgcctccac 9660 cgagccagct tggtccctat gggcttccgc acatgccgcg ggcggccagg caacgtgcgt 9720 gtctctgcca tgtggcagaa gtgctctttg tggcagtggc caggcaggga gtgtctgcag 9780 tcctggtggg gctgagcctg aggccttcca gaaagcagga gcagctgtgc tgcaccccat 9840 gtgggtgacc aggtcctttc tcctgatagt cacctgctgg ttgttgccag gttgcagctg 9900 ctcttgcatc tgggccagaa gtcctccctc ctgcaggctg gctgttggcc cctctgctgt 9960 cctgcagtag aaggtgccgt gagcaggctt tgggaacact ggcctgggtc tccctggtgg 10020 ggtgtgcatg ccacgccccg tgtctggatg cacagatgcc atggcctgtg ctgggccagt 10080 ggctgggggt gctagacacc cggcaccatt ctcccttctc tcttttcttc tcaggattta 10140 aaatttaatt atatcagtaa agagattaat tttaacgtaa ctctttctat gcccgtgtaa 10200 agtatgtgaa tcgcaaggcc tgtgctgcat gcgacagcgt ccggggtggt ggacagggcc 10260 cccggccacg ctccctctcc tgtagccact ggcatagccc tcctgagcac ccgctgacat 10320 ttccgttgta catgttcctg tttatgcatt cacaaggtga ctgggatgta gagaggcgtt 10380 agtgggcagg tggccacagc aggactgagg acaggccccc attatcctag gggtgcgctc 10440 acctgcagcc cctcctcctc gggcacagac gactgtcgtt ctccacccac cagtcaggga 10500 cagcagcctc cctgtcactc agctgagaag gccagccctc cctggctgtg agcagcctcc 10560 actgtgtcca gagacatggg cctcccactc ctgttccttg ctagccctgg ggtggcgtct 10620 gcctaggagc tggctggcag gtgttgggac ctgctgctcc atggatgcat gccctaagag 10680 tgtcactgag ctgtgttttg tctgagcctc tctcggtcaa cagcaaagct tggtgtcttg 10740 gcactgttag tgacagagcc cagcatccct tctgcccccg ttccagctga catcttgcac 10800 ggtgacccct tttagtcagg agagtgcaga tctgtgctca tcggagactg ccccacggcc 10860 ctgtcagagc cgccactcct atccccaggc caggtccctg gaccagcctc ctgtttgcag 10920 gcccagagga gccaagtcat taaaatggaa gtggattctg gatggccggg ctgctgctga 10980 tgtaggagct ggatttggga gctctgcttg ccgactggct gtgagacgag gcaggggctc 11040 tgcttcctca gccctagagg cgagccaggc aaggttggcg actgtcatgt ggcttggttt 11100 ggtcatgccc gtcgatgttt tgggtattga atgtggtaag tggaggaaat gttggaactc 11160 tgtgcaggtg ctgccttgag acccccaagc ttccacctgt ccctctccta tgtggcagct 11220 ggggagcagc tgagatgtgg acttgtatgc tgcccacata cgtgaggggg agctgaaagg 11280 gagcccctcc tctgagcagc ctctgccagg cctgtatgag gcttttccca ccagctccca 11340 acagaggcct cccccagcca ggaccacctc gtcctcgtgg cggggcagca ggagcggtag 11400 aaaggggtcc gatgtttgag gaggccctta agggaagcta ctgaattata acacgtaaga 11460 aaatcaccat tccgtattgg ttgggggctc ctgtttctca tcctagcttt ttcctggaaa 11520 gcccgctaga aggtttggga acgaggggaa agttctcaga actgttggct gctccccacc 11580 cgcctcccgc ctcccccgca ggttatgtca gcagctctga gacagcagta tcacaggcca 11640 gatgttgttc ctggctagat gtttacattt gtaagaaata acactgtgaa tgtaaaacag 11700 agccattccc ttggaatgca tatcgctggg ctcaacatag agtttgtctt cctcttgttt 11760 acgacgtgat ctaaaccagt ccttagcaag gggctcagaa caccccgctc tggcagtagg 11820 tgtcccccac ccccaaagac ctgcctgtgt gctccggaga tgaatatgag ctcattagta 11880 aaaatgactt cacccacgca tatacataaa gtatccatgc atgtgcatat agacacatct 11940 ataattttac acacacacct ctcaagacgg agatgcatgg cctctaagag tgcccgtgtc 12000 ggttcttcct ggaagttgac tttccttaga cccgccaggt caagttagcc gcgtgacgga 12060 catccaggcg tgggacgtgg tcagggcagg gctcattcat tgcccactag gatcccactg 12120 gcgaagatgg tctccatatc agctctctgc agaagggagg aagactttat catgttccta 12180 aaaatctgtg gcaagcaccc atcgtattat ccaaattttg ttgcaaatgt gattaatttg 12240 gttgtcaagt tttgggggtg ggctgtgggg agattgcttt tgttttcctg ctggtaatat 12300 cgggaaagat tttaatgaaa ccagggtaga attgtttggc aatgcactga 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Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 21 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 21 gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc 60 actgactgac agcctgctct cctagcttac aggacacaag gcctgttact agcactcaca 120 taacaaatgg ccctttt 137 <210> 22 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 22 gctcgagtga gcgcagcctg ctagctccat gcttactgta aagccaccag atgggtaagc 60 atggagctag caggcttcgc ctactagttt t 91 <210> 23 <211> 139 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 23 gccuggaggc uugcugaagg cuguaugcug uaagcaugga gcuagcaggc uguuuuggcc 60 acugacugac agccugcucu ccuagcuuac aggacacaag gccuguuacu agcacucaca 120 uggaacaaau ggcccuuuu 139 <210> 24 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 24 gcucgaguga gcgcagccug cuagcuccau gcuuacugua aagccaccag auggguaagc 60 auggagcuag caggcuucgc cuacuaguuu u 91 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 25 uaagcaugga gcuagcaggc u 21

Claims (27)

  1. 하나 이상의 성숙한 단일-가닥 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산이며, 여기서 각각의 성숙한 단일-가닥 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 핵산 서열은 서열식별번호: 7에 제시되어 있는 서열로 구성되고 이종 miRNA 백본 서열에 의해 플랭킹되어 있는 것인 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 이종 miRNA 백본 서열이 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열인 단리된 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 트랜스진이 프로모터를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 프로모터가 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터인 단리된 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 트랜스진이 서열식별번호: 21 또는 22에 제시되어 있는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 트랜스진에는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR) 또는 그의 변이체가 플랭킹되어 있는 것인 단리된 핵산.
  7. 제6항에 있어서, ITR 변이체에는 기능성 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있는 것인 단리된 핵산.
  8. 제7항에 있어서, TRS가 결핍되어 있는 ITR 변이체가 ΔTRS ITR인 단리된 핵산.
  9. 하나 이상의 성숙한 단일-가닥 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터이며, 여기서 각각의 성숙한 단일-가닥 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 핵산 서열은 서열식별번호: 7에 제시되어 있는 서열로 구성되고 이종 miRNA 백본 서열에 의해 플랭킹되어 있는 것인 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 각각의 이종 miRNA 백본 서열이 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열인 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 트랜스진이 프로모터를 포함하는 것인 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 프로모터가 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터인 벡터.
  14. 제10항에 있어서, 트랜스진이 서열식별번호: 21 또는 22에 제시되어 있는 서열을 포함하는 것인 벡터.
  15. 제10항에 있어서, 트랜스진에는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR) 또는 그의 변이체가 플랭킹되어 있는 것인 벡터.
  16. 제15항에 있어서, ITR 변이체에는 기능성 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있는 것인 벡터.
  17. 제16항에 있어서, TRS가 결핍되어 있는 ITR 변이체가 ΔTRS ITR인 벡터.
  18. (i) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 하나 이상의 성숙한 단일-가닥 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산으로서, 여기서 각각의 성숙한 단일-가닥 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 핵산 서열은 서열식별번호: 7에 제시되어 있는 서열로 구성되고 이종 miRNA 백본 서열에 의해 플랭킹되어 있는 것인 단리된 핵산
    을 포함하는 재조합 AAV (rAAV).
  19. 제18항에 있어서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 서열이 플랭킹되어 있는 것인 rAAV.
  20. 제18항에 있어서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 및 ΔTRS ITR이 플랭킹되어 있는 것인 rAAV.
  21. 제18항에 있어서, 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질인 rAAV.
  22. 제21항에 있어서, 캡시드 단백질이 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함하는 것인 rAAV.
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