CN105838737A - 用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体 - Google Patents

用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体 Download PDF

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Abstract

用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体。本发明提供了用于制备高度纯化的AAV载体制剂的方法。本文所述非常纯的AAV制剂对于临床用途较优。

Description

用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体
本案是分案申请，其母案的中国申请号是201180016616.2，国际申请号是PCT/US2011/022371，申请日是2011年1月25日。
本申请要求于2010年1月28号提交的美国临时申请第61/299,184号的优先权，其通过引用如同全部陈述那样结合于本文中。
依据35 U.S.C. §202(c)，公认的是本发明在由国立卫生研究所颁发的资助号HHSN268200748203C下的政府支持下作出。美国政府拥有本发明的权利。
发明领域
本发明涉及生产质量管理规范和病毒载体纯化的领域。更特别地，组合物和方法促进用于基因治疗方案的高度纯化的重组AAV的制备。
发明背景
在本说明书各处引用若干出版物和专利文件以描述本发明所从属的领域的状态。这些引用各自通过引用如同全部陈述那样结合于本文中。
基因递送是用于获得性疾病和遗传性疾病的治疗的充满前景的方法。已描述了用于基因转移目的的许多基于病毒的系统，包括基于腺相关病毒(AAV)的系统。AAV为属于依赖病毒属的依赖辅助病毒的DNA细小病毒。AAV需要与无关的辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共感染，以便发生生产性感染。在辅助病毒不存在的情况下，AAV通过将其基因组插入宿主细胞染色体中建立潜伏状态。通过辅助病毒的随后感染拯救整合的病毒基因组，其可接着复制以产生感染性的病毒子代。
AAV具有广泛的宿主范围并且能够在存在合适的辅助病毒下在来自任何物种的细胞中复制。例如，人AAV在与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。AAV不与任何人或动物的疾病相关并且当整合时似乎并不改变宿主细胞的生物学性质。对于AAV的综述，参见例如Berns和Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307。
已描述了感染性重组AAV (rAAV)毒粒的构建。参见，例如，美国专利第5,173,414号和第5,139,941号；国际公布号WO 92/01070(于1992年1月23日公布)和WO 93/03769 (于1993年3月4日公布)；Lebkowski等. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincent等. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129和Kotin, R. M. (1994) Human Gene Trephy 5:793-801。
可改造AAV载体以通过全部或部分缺失AAV基因组的内在部分并将目标DNA序列插入ITR之间来携带异源的目标核苷酸序列(例如编码治疗蛋白的选定基因、反义核酸分子、核酶、miRNA等)。所述ITR在此类载体中仍有功能，允许包含异源的目标核苷酸序列的rAAV的复制和包装。所述异源的核苷酸序列还典型地与能够在某些条件下在患者的靶细胞中驱动基因表达的启动子序列连接。终止信号，例如聚腺苷酸化位点，也可包含于所述载体中。
虽然完全消除病毒载体的免疫原性并非现实的目标，但将制备用于人基因治疗的AAV载体的免疫原性最小化是高度所需的。本发明的一个目标是提供实现该目标的组合物和方法。
发明简述
依照本发明，提供了用于从包含AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质的AAV制备物中纯化包含编码治疗蛋白或其片段的转基因的真正的AAV载体颗粒，从而提供基本不含AAV空衣壳的AAV产物的方法。示例性纯化方案包括：收获转导了AAV的细胞；经由切向流过滤浓缩所述细胞；以及通过微射流裂解所述细胞以形成裂解液。接着将裂解液过滤并澄清。澄清后，AAV颗粒通过离子交换柱层析法纯化并任选通过切向流过滤进一步浓缩。接着将如此产生的洗脱液在等密度梯度上分层并进行超速离心，收获包含病毒颗粒的层并通过切向流过滤进行缓冲液交换。接着纯化的AAV颗粒用表面活性剂配制，并将所得制剂过滤以移除任何残留杂质，从而产生高度纯化的AAV产物，其中所述真正的AAV载体颗粒在所述AAV产物中以至少95%的量，优选大于98%的量存在。
在一个优选的实施方案中，AAV产物包含1015个颗粒/mL浓度的AAV颗粒，更优选颗粒以1016个颗粒/mL浓度存在并且最优选，颗粒以1017个颗粒/mL浓度存在。
如此纯化的AAV载体可为多种血清型的，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9。
在又一个实施方案中，公开了一种AAV载体制剂，其在药学上可接受的载体中包含使用上述方法纯化的AAV颗粒。
本发明的纯化的AAV颗粒包含编码所需基因产物的异源核酸。此类产物包括但不限于siRNA、反义分子、miRNA、核酶等。其它产物包括编码可用于修正先天性代谢缺陷的激素、生长受体、配体和蛋白的核酸。在特别优选的实施方案中，载体编码选自RPE65、因子VIII和因子IX的蛋白。
附图简述
图 1 . 重组AAV产生期间产生的AAV颗粒的类型的图解，包括使用当前工业标准的可扩缩纯化工艺达到的纯化(真正的载体和载体相关杂质的混合物)，和使用我们的可扩缩纯化方法达到的纯化(载体相关杂质的基本移除)的示意图，我们的可扩缩纯化方法掺有梯度超速离心步骤，根据所用纯化步骤的顺序使所述梯度超速离心步骤“可扩缩”。
图 2 . 显示本发明的载体纯化工艺步骤的流程图。
图 3 . 通过梯度超速离心的代表性工业标准可扩缩纯化工艺(genl-Chr)-纯化的AAV载体的分析。显示了表面上‘纯的’载体中的AAV颗粒的相对量和异质性，以及在真正的AAV载体自载体相关杂质的分离中梯度超速离心的有效性。‘genl-Chr’代表了当前“工业标准”可扩缩纯化工艺。
发明详述
本发明提供了一种AAV载体纯化平台，其包含两个将其与当前‘工业标准’的可扩缩AAV载体纯化工艺区别的独特特征：1) 提供高的载体纯度的可用于不同AAV血清型/衣壳变体的纯化的模块化平台方法，所述方法包括载体相关杂质的有效移除；和2) 方法步骤的独特顺序(包括柱层析法、之后的切向流过滤和接着的梯度超速离心的关键‘核心’顺序)，其赋予对重要的超速离心步骤的意外的可扩缩性。
AAV载体产生和纯化方法的最优化确保了载体产物可有效地将其遗传有效负载递送至靶细胞，并使有害的免疫应答的激活的可能性最小化。由于载体相关杂质对于预期的人受者是非自身且免疫刺激的，其应在人胃肠外产品的纯化期间最小化或消除。载体相关杂质在细胞培养中的载体产生期间典型地以比真正的载体高得多的量产生，并且由于它们结构相似在纯化期间难以与载体分离。在载体产生后的粗制细胞收获物中，载体相关杂质通常占>50%，典型地约80%，并且可占生物合成的总AAV颗粒的>80%。这在使用迄今为止开发用于产生AAV载体的各细胞培养系统中已观察到。
纯化作为治疗人类疾病的产品的重组AAV的生产方法的开发必须实现以下目标：1) 一致的载体纯度、效价和安全性；2) 生产方法的可扩缩性；和3) 生产的可接受成本。当前‘工业标准’的可扩缩AAV载体纯化工艺并不足以实现载体相关杂质的移除，其对于满足以上列出的第一目标(一致的载体纯度、效价和安全性)是重要的。此外，已出现使用当前工业标准的可扩缩纯化工艺不能充分地移除载体相关杂质的情况，这是由于：1) 用于除疫苗(其中通常寻求而非避免免疫应答)之外的应用的病毒产物(例如重组AAV)的纯化工艺的开发是相对不成熟的；2) 涉及用于AAV载体的可扩缩纯化工艺的开发的许多小组未意识到载体相关杂质的高水平和/或假定此类杂质不会促进载体免疫原性的临床显著性增加；和3) 开发用于从载体相关杂质中分离真正的载体的可扩缩纯化工艺在技术上有挑战，因为这些AAV颗粒就物理-化学特征(例如粒径、颗粒表面分子拓扑学和静电荷分布)而言彼此极为相似，典型地利用所述特征以实现生物分子在可扩缩方法步骤中的纯化。
提供以下定义以有利于本发明的实践。
至于“载体”意指任何的遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、毒粒等，当与合适的控制元件结合时其能够复制并且其可在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体。
至于“AAV载体”意指来源于腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8。AAV载体可具有一个或多个全部或部分缺失的AAV野生型基因(优选rep和/或cap基因)，但保留了有功能的侧翼ITR序列。有功能的ITR序列对于AAV毒粒的拯救、复制和包装是必需的。因此，本文定义的AAV载体包含至少对于病毒复制和包装顺式所需的那些序列(例如有功能的ITR)。ITR不需要为野生型核苷酸序列，并且只要序列提供有功能的拯救、复制和包装，可例如通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变。同样至于“AAV载体”意指蛋白外壳或衣壳，其提供了载体核酸递送至靶细胞的核的有效载体。
“AAV辅助功能”是指可表达以提供AAV基因产物的AAV衍生的编码序列，所述AAV基因产物反过来对于生产性AAV复制反式起作用。因此，AAV辅助功能包括主要AAV开放阅读框(ORF) rep和cap两者。已显示Rep表达产物具有许多功能，其中包括：DNA复制的AVV起点的识别、结合和切口；DNA解旋酶活性和AAV(或其它异源)启动子的转录的调节。Cap表达产物供应必需的包装功能。AAV辅助功能在本文用于反式补充AAV载体中缺失的AAV功能。
术语“AAV辅助构建体”通常是指包含提供AAV载体中缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，所述AAV载体用于产生用于目标核苷酸序列的递送的转导载体。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep 和/或cap基因的瞬时表达以补充缺失的AAV复制必需的AAV功能；然而，辅助构建体缺少AAV ITR并且自身不可复制或包装。AAV辅助构建体可呈质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或毒粒的形式。已描述了许多AAV辅助构建体，例如编码Rep和Cap表达产物两者的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见例如Samulski 等. (1989) J. Virol. 63:3822-3828；和McCarty 等. (1991) J. Virol. 65:2936-2945。已描述了编码Rep和/或Cap表达产物的许多其它载体。参见，例如，美国专利第5,139,941号和第6,376,237号。
术语“载体相关杂质”是指除真正的重组AAV颗粒之外的AAV颗粒的所有类型。载体相关杂质包括空的AAV衣壳(也被称作“空物”或“空颗粒”)以及包含除预期载体基因组之外的多核苷酸序列的AAV颗粒(也被称作“AAV包衣壳的核酸杂质”或“AAV包衣壳的DNA杂质”)。
术语“附加功能(accessory function)”是指AAV复制所依赖的非AAV来源的病毒功能和/或细胞功能。因此，该术语涵盖AAV复制所需的蛋白和RNA，AAV复制包括涉及AAV基因转录的激活、阶段专一的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的那些部分。基于病毒的附加功能可来源于已知的辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒(除1型单纯疱疹病毒之外)和痘苗病毒)中的任一种。
术语“附加功能载体”通常是指包含提供附加功能的核苷酸序列的核酸分子。附加功能载体可转染至合适的宿主细胞中，其中载体则能够支持AAV毒粒在宿主细胞中产生。该术语中明确除外的是感染性病毒颗粒，因为其存在于自然中，例如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒颗粒。因此，附加功能载体可呈质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。具体而言，已证明腺病毒基因的完全互补物并非为附加的辅助功能所需。例如，已显示不能DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体可供AAV复制。Ito等., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi 等, (1971) Virology 45:317。类似地，已显示出E2B和E3区内的突变体支持AAV复制，提示E2B和E3区很可能不涉及提供附加功能。Carter 等., (1983) Virology 126:505。然而，E1区内缺陷或者具有缺失E4区的腺病毒不能支持AAV复制。因此，E1A和E4区很可能为AAV复制直接或间接所需。Laughlin 等, (1982) J. Virol. 41:868; Janik等, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter等, (1983) Virology 126:505。其它表征的Ad突变体包括：E1B (Laughlin等(1982), 见上文；Janik等(1981),见上文；Ostrove等, (1980) Virology 104:502)；E2A (Handa等, (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss等, (1976) J. Virol. 17:140; Myers等, (1980) J. Virol. 35:665; Jay等, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers等, (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, 载于I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen编辑, 1990))；E3 (Carter等(1983),见上文)和E4 (Carter等(1983),见上文; Carter (1995))。尽管在E1B编码区中有突变的腺病毒提供的附加功能的研究已产生了矛盾的结果，Samulski等, (1988) J. Virol. 62:206-210，但近来报道对于AAV毒粒产生而言E1B55k是需要的，而E1B19k是不需要的。此外，国际公布WO 97/17458和Matshushita等, (1998) Gene Therapy 5:938-945描述了编码不同的Ad基因的附加功能载体。特别优选的附加功能载体包含腺病毒VA RNA编码区、腺病毒E4 ORF6编码区、腺病 E2A 72 kD编码区、腺病毒E1A编码区和缺少完整E1B55k编码区的腺病毒E1B区。此类载体描述于国际公布号WO 01/83797中。
至于“重组病毒”意指已遗传改变的病毒，例如通过异源的核酸构建体添加或插入至颗粒中来进行遗传改变。
至于“AAV毒粒”意指完全的病毒颗粒，例如野生型(wt)AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳蛋白外壳关联的线性、单链AAV核酸基因组)。在该方面，任一互补有义物的单链AAV核酸分子，例如“有义”链或“反义”链，可包装至任一种AAV毒粒中并且两条链是同等感染性的。
术语“重组AAV毒粒”、“rAAV毒粒”、“AAV载体颗粒”、“完全衣壳”和“完全颗粒”在本文定义为感染性的、复制缺陷的病毒，其包含对被AAV ITR在两侧侧接的异源的目标核苷酸序列包衣壳的AAV蛋白外壳。rAAV毒粒在具有规定引入其中的AAV载体、AAV辅助功能和附加功能的序列的合适宿主细胞中产生。以该方式，使宿主细胞能够编码将AAV载体(包含重组的目标核苷酸序列)包装至感染性重组毒粒颗粒用于随后的基因递送所需的AAV多肽。
术语“空衣壳”和“空颗粒”是指这样的AAV毒粒，其包含AAV蛋白外壳但全部或部分地缺少包含被AAV ITR在两侧侧接的异源的目标核苷酸序列的多核苷酸构建体。因此，所述空衣壳并不起转移目标基因至宿主细胞的功能。
术语“宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可为或已用作AAV辅助构建体、AAV载体质粒、附加功能载体或其它的转移DNA的受体。术语包括已转染的原始细胞的子代。因此，本文所用“宿主细胞”通常是指已转染外源DNA序列的细胞。应理解的是由于自然的、偶然的或刻意的突变，单个亲代细胞的子代可能不一定与原始亲代在形态学或基因组DNA互补物或总DNA互补物方面完全相同。
术语“转染”用于指外来DNA被细胞的摄取，并且当外源DNA已引入细胞膜内时细胞已被“转染”。许多转染技术为本领域通常已知的。参见，例如Graham等(1973) Virology, 52 :456, Sambrook等(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis等(1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier,和Chu等(1981) Gene 13:197。此类技术可用于引入一种或多种外源DNA部分至合适的宿主细胞中。
本文所用术语“细胞系”是指能够在体外持续或延长生长和分裂的一群细胞。细胞系往往为来源于单个祖细胞的克隆群体。本领域还已知的是在此类克隆群体的储藏或转移期间染色体组型中可发生自发或诱导的变化。因此，来源于所提及的细胞系的细胞可能不为与祖细胞或培养物精确相同，并且所提及的细胞系包括此类变体。
当储液中存在的毒粒的至少约50%-99%或更多为具有包装基因组(即AAV载体颗粒)的rAAV毒粒时，包含AAV载体颗粒(包装的基因组)的rAAV毒粒的储液或制备物“基本不含”AAV空衣壳。优选地，AAV载体颗粒占储液中存在的毒粒的至少约75%-85%、更优选约90%，甚至更优选储液中存在的毒粒的重量的至少约95%、或甚至99%或更多，或这些范围之间的任何整数。因此，当所得储液中的约40%-约1%或更少、优选约25%-约15%或更少、更优选约10%或更少、甚至更优选约5%-约1%或更少包含空衣壳时，储液基本不含AAV空衣壳。
当储液中存在的毒粒的至少约90%-99%或更多为具有包装的真正基因组(即AAV载体颗粒)的rAAV毒粒时，包含AAV载体颗粒(包装的基因组)的rAAV毒粒的储液或制备物“基本不含 “AAV包衣壳的核酸杂质”。优选地，AAV载体颗粒占储液中存在的毒粒的至少约95%-98%、更优选约99%，甚至更优选储液中存在的毒粒的重量的至少约>99%或更多，或这些范围之间的任何整数。因此，当所得储液中的约10%-约1%或更少、优选约2%或更少、更优选约1%或更少、甚至更优选约0.5%或更少包含AAV包衣壳的核酸杂质时，储液基本不含AAV包衣壳的核酸杂质。
“核酸”序列是指DNA序列或RNA序列。该术语涵盖包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述碱基类似物例如但不限于：4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、吖丙啶胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶-、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辫苷(β-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、Buracil-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
“编码序列”或“编码”所选多肽的序列为一种核酸分子，其当置于合适的调节序列控制下时在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的范围通过5'(氨基)端的起始密码子和3'(羧基)端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可位于编码序列的3'。
术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，其共同供用于受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。并非全部这些控制序列需要始终存在，只要所选编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译即可。
术语“启动子”在本文以其普通含义使用，是指包含DNA调节序列的核苷酸区，其中所述调节序列来源于能够结合RNA聚合酶并起始下游(3’-方向)编码序列转录的基因。转录启动子可包括“诱导型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“阻抑型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。
“可操作地连接的”是指元件的排列，其中配置如此描述的组分以便执行其通常的功能。因此，与编码序列可操作地连接的控制序列能够影响编码序列的表达。控制序列不需要与编码序列邻接，只要其起指导其表达的功能即可。因此，例如，插入的不翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间并且启动子序列仍可被认为与编码序列“可操作地连接”。
出于描述本申请书各处特定的核酸分子中核苷酸序列的相对位置的目的，例如当特定的核苷酸序列被描述为位于相对于另一序列的“上游”、“下游”、“3”或“5”时，应理解的是，其是在如本领域常规地提及的DNA分子的“有义”链或“编码”链中的序列位置。
术语“异源的”在其涉及核酸序列例如编码序列和控制序列时，表示通常不连接在一起的序列，和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区为另一核酸分子内或与另一核酸分子连接的核酸区段，所述另一核酸分子在自然中未发现与其它分子相关。例如，核酸构建体的异源区可包含被在自然中未发现与编码序列相关的序列侧接的编码序列。异源的编码序列的另一实例为这样的构建体，其中编码序列本身不存在于自然中(例如具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。类似地，对于本发明的目的而言，转化了通常不存在于细胞中的构建体的细胞可被认为是异源的。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生本文所用的异源DNA。
包含异源核酸的转基因可编码许多有用的产物。这些可包括例如siRNA、反义分子和miRNA。或者，转基因可编码激素和生长和分化因子，包括但不限于：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、制管张素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α (TGFα)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II (IGF-I和IGF-II)、转化生长因子β超家族中的任何一种(包括TGFβ)、激活蛋白、抑制素、或者骨形态发生蛋白(BMP)中的任何一种(BMP 1-15)、生长因子的调蛋白(heregluin)/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族中的任何一种、神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神养蛋白、聚集蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白家族中的任何一种、导蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音感刺猬蛋白(sonic hedgehog)和酪氨酸羟化酶。
其它有用的转基因产物包括调节免疫系统的蛋白，包括但不限于：细胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白细胞介素 (IL-1至IL-17)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β、干扰素 α、干扰素β和干扰素γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些包括但不限于：免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、MHC I类分子和MHC II类分子，以及改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括调节蛋白例如：补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
其它可用的基因产物包括可修正先天性代谢缺陷的那些。此类转基因可编码例如：氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子V、因子VIII、因子IX、胱硫醚(cystathione) β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸酯(pyruvate carboxylate)、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)序列和肌营养蛋白cDNA序列。
当指核苷酸序列时“分离的”意指在相同类型的其它生物大分子基本不存在的情况下存在所指分子。因此，“编码特定多肽的分离的核酸分子”是指基本不含不编码主题多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包含不会有害地影响组合物的基本特征的一些另外的碱基或部分。
本发明涉及包含于AAV毒粒的纯化储液内的AAV载体相关杂质(例如空衣壳和AAV包衣壳的核酸杂质)的数量的减少或消除，且使其中包含的AAV载体颗粒损失最小化。不管其中产生rAAV毒粒的方法如何，都可使用本发明的方法。
存在本领域熟知的用于产生rAAV毒粒的数种方法：例如，利用载体和AAV辅助序列的转染结合与AAV辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)之一的共感染或用重组AAV载体、AAV辅助载体和附加功能载体的转染。关于产生rAAV毒粒的方法的详细描述，参见美国专利第6,001 ,650号和第6,004,797号，两者通过引用以其整体结合于本文中。
rAAV毒粒的纯化
重组AAV复制(即细胞培养系统中的载体产生)之后，rAAV毒粒可使用许多常规的纯化方法例如柱层析法、氯化铯梯度法等从宿主细胞中纯化出来。例如可使用多个柱层析步骤，例如在阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱上纯化。参见，例如，国际公布号WO 02/12455。此外，若利用感染以表达附加功能，残留的辅助病毒可使用已知方法灭活。例如，腺病毒可通过加热至约60℃的温度达例如20分钟或更久来灭活。该处理仅使辅助病毒有效地灭活，因为AAV极其热稳定而辅助腺病毒是热不稳定的。
包含许多报告基因的重组AAV载体可用于确定感染效价。例如可使用碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、绿色荧光蛋白或萤光素酶。在收获转染的宿主细胞后，通过使用适合大规膜生产的技术(例如微射流)破碎转染的宿主细胞来形成裂解液。接着过滤裂解液(例如通过0.45 μm滤器)，并使用如本文所述的柱层析法纯化。也已报道其它技术以确定任何AAV载体的感染效价。参见例如Zhen等, "An Infectious Titer Assay for Adeno-associated Virus (AAV) Vectors with Sensitivity Sufficient to Detect Single Infectious Events." Hum. Gene Ther. (2004) 15:709-715。将澄清的细胞裂解液使用柱层析技术进行一个或多个纯化工艺步骤技术以纯化AAV颗粒(包含真正的载体和载体相关杂质)。在优选方法中，AAV颗粒使用涉及阳离子和/或阴离子交换层析的一个或多个序贯步骤来纯化。在本发明特别优选的方法中，rAAV制备物通过经由易于可扩缩的方法裂解转染的细胞得到粗制细胞裂解液而获得。接着粗制细胞裂解液可通过本领域熟知的技术(例如过滤、离心等)澄清以移除细胞碎片，从而提供澄清的细胞裂解液。粗制细胞裂解液或澄清的细胞裂解液，包含AAV颗粒(真正的AAV载体、AAV空衣壳和AAV载体相关杂质)和一系列非AAV载体相关杂质(例如来自感染的宿主细胞的可溶性细胞组分)两者。这些可包含非所需的细胞蛋白、脂类和/或核酸，以及细胞培养基组分(例如牛血清)。将裂解液上样至第一阳离子交换柱上。所述第一阳离子交换柱起将AAV颗粒与细胞裂解液制备物中存在的细胞组分和其它组分进一步分离的作用。用于进行细胞裂解液的最初纯化的方法是已知的。一种代表性方法描述于美国专利第6,593,123号中，其通过引用以其整体结合于本文中。
柱层析法的使用可实现AAV颗粒自在重组AAV载体于细胞培养中产生之后的粗制收获物中存在的大多数其它杂质的有效纯化。例如一个或多个离子交换层析步骤可顺序使用以将AAV颗粒与杂质逐步分离。阴离子交换层析树脂和阳离子交换层析树脂以及层析树脂的其它类型可以不同的组合使用，视特定的目标AAV血清型优化不同的组合。可在用于以下重组AAV血清型的纯化的单个层析步骤中使用以下层析树脂：
在一些情况下，两个或更多个序贯的层析步骤可用于实现更高的AAV颗粒纯度并确保外来病毒污染物的移除，外来病毒污染物的移除是用于人受试者以治疗疾病的重组AAV生产的必要条件。序贯的层析步骤可使用以不同的顺序序贯地进行的不同树脂，所述顺序针对不同的重组AAV血清型进行优化。例如通过两个序贯层析步骤实现的载体颗粒纯化可应用以下形式：
用于第一阳离子交换柱和第二阳离子交换柱两者的合适的阳离子交换剂若使用的话包括本领域已知的大范围的物质。特别优选的是能够在宽的pH范围内结合rAAV毒粒的强阳离子交换剂。例如羧甲基化阳离子交换基质和磺化阳离子交换基质尤其可用于本文。可用的基质物质包括但不限于纤维素基质，例如纤维基质、微粒状基质和珠状基质；琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅和聚醚基质；和复合物。本文特别优选的是含有功能性配体R--SO3 -的基质，优选磺丙基树脂或磺乙基树脂。代表性基质包括但不限于：POROS HS、POROS SP、POROS S(可获自Applied Biosystems, Foster City, Calif.的所有强阳离子交换剂)、POROS CM(可获自Applied Biosystems, Foster City, Calif.的弱阳离子交换剂)、TOSOHAAS TOYOPEARL SP550C和MERCK FRACTOGEL EMD SO3-650(m)，以及SOURCE 15S、SOURCE 30S、SEPHAROSE SP FF、SEPHAROSE SP XL(全部可获自Amersham Bioscience, Piscataway, N.J.)。
对于以下给出的所有柱层析方案，可利用本领域已知的标准方案用适当的缓冲溶液制备柱。接着上样。对于使用的第一阳离子交换柱，条件为这样的条件，其使得所有AAV颗粒结合柱树脂并接着一起洗脱，但从细胞裂解液中存在的其它的细胞组分和碎片中分离出来。例如AAV颗粒使用适当离子强度的缓冲液洗脱。合适的缓冲液包括例如10-50 mM磷酸钠，优选15-40，例如15、20、25、30、35、40等mM的磷酸钠，其包含例如在100-700 mM，例如200-400 mM，例如200、300、325、350、370、380、400等浓度或这些范围之内的任何浓度的盐例如NaCl或KCl的。缓冲液的pH可为约3-约9.5，例如4-8，例如pH 4、4.5、5、5.5、6等或这些范围之内的任何pH。收集流分，接着可在分离条件下在阴离子交换柱和/或第二阳离子交换柱上运行。
若使用第二阳离子交换柱在随后步骤中进一步纯化AAV颗粒，可使用两种洗脱缓冲液，一种低盐缓冲液和一种高盐缓冲液。具体而言，使用合适的缓冲液将另外的杂质从AAV颗粒中分离出来，所述合适的缓冲液处于约pH 6-pH 12的pH，优选pH 7-pH 10的pH并且甚至更优选pH 7.5-pH 9.5的pH，例如pH 7.5、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5的pH或所述范围之间的任何pH。适当的缓冲液为本领域熟知的并且包括但不限于具有以下缓冲离子的缓冲液：醋酸；丙二酸；MES；磷酸盐；HEPES、BICINE等。为了洗脱样品，起始缓冲液的离子强度使用盐例如NaCl、KCl、硫酸铵或包含硫酸盐、甲酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐和/或磷酸盐的任何其它盐来增加。在本发明的一个实施方案中，柱首先用低盐浓度(例如10-200 mM的醋酸铵，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65-100 mM或这些范围内的任何浓度)处理。该处理导致AAV载体颗粒从柱树脂上的洗脱。接着柱用较高盐浓度处理以洗脱AAV空衣壳。用作第二缓冲液的一个实例为100-800 mM浓度的醋酸铵，优选500-700 mM，例如500、550、600、650、700、800 mM浓度的醋酸铵或这些所述范围内的任何浓度的醋酸铵。使用这些条件，AAV载体颗粒在早期流分中洗脱下来而空衣壳在较晚流分中洗脱下来。
如上所解释，在本发明的备选方法中，将来自第一阳离子交换柱的制备物上样至代替第二阳离子交换柱或加上第二阳离子交换柱的阴离子交换柱。若除使用第二阳离子交换柱外还使用阴离子交换柱，其可于第二阳离子交换柱之前或之后使用。此外，第二阴离子交换柱可于第一阴离子交换柱之后使用。本发明使用的许多合适的阴离子交换剂已知并且包括但不限于MACRO PREP Q (可获自BioRad, Hercules, Calif.的强阴离子-交换剂); UNOSPHERE Q (可获自BioRad, Hercules, Calif.的强阴离子-交换剂); POROS 50HQ(可获自Applied Biosystems, Foster City, Calif.的强阴离子-交换剂)；POROS 50D(可获自Applied Biosystems, Foster City, Calif.的弱阴离子-交换剂)；POROS 50PI(可获自Applied Biosystems, Foster City, Calif.的弱阴离子交换剂)；SOURCE 30Q(可获自Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.的强阴离子交换剂)；DEAE SEPHAROSE(可获自Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.的弱阴离子交换剂)；Q SEPHAROSE(可获自Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.的强阴离子交换剂)。
阴离子交换柱首先用标准的缓冲液并依照生产商的说明书来平衡。例如，柱可用例如5-50 mM，优选7-20 mM，例如10 mM的磷酸钠缓冲液来平衡。接着上样并使用两种洗脱缓冲液，一种低盐缓冲液和一种高盐缓冲液。在低盐和高盐各自洗涤后收集流分并使用标准技术例如监测260和280 nm处的UV吸光度值来检测流分中的蛋白。使用阴离子交换剂，来自较低盐洗脱液的蛋白峰包含AAV空衣壳，较高盐流分包含AAV载体颗粒。
具体而言，在阴离子交换柱上，AAV颗粒可使用合适的缓冲液进一步纯化，所述合适的缓冲液处于约pH 5-pH 12的pH，优选pH 6-pH 10的pH，并且甚至更优选pH 7-pH 9.5的pH，例如pH 7.1、7.2、7.3、7.4-8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5-9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5的pH或所述范围之间的任何pH。与阴离子交换柱一起使用的合适的缓冲液为本领域熟知的，通常在性质上为阳离子的或两性离子的。此类缓冲液包括但不限于，具有以下缓冲离子的缓冲液：N-甲基哌嗪；哌嗪；Bis-Tris；Bis-Tris丙烷；三乙醇胺；Tris；N-甲基二乙醇胺；1,3-二氨基丙烷；乙醇胺；乙酸等。为了洗脱样品，起始缓冲液的离子强度用适当pH的盐例如NaCl、KCl、硫酸盐、甲酸盐或醋酸盐来增加。
在本发明的一个实施方案中，阴离子交换柱首先用低盐浓度例如10-100 mM的NaCl, 例如10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65-100 mM的NaCl或这些范围内的任何浓度的NaCl处理。在最初处理后，接着柱用较高盐浓度例如较高的NaCl浓度或用更高离子强度的另一种缓冲液处理以洗脱杂质。用作第二缓冲液的一个实例为100-300 mM浓度、优选125-200 mM浓度(例如125、130、140、150、160、170、180、190、200 mM浓度或这些所述范围内的任何浓度)的醋酸钠缓冲液或基于Tris的缓冲液。在从柱中洗脱另外的杂质后，AAV颗粒可用较高浓度的盐回收。用作洗脱缓冲液的一个实例为包含100-500 mM浓度、优选130-300 mM浓度(例如100、130、150、200、250、300、350、400、450、500 mM浓度或这些所述范围内的任何浓度)的醋酸钠的10 mM Tris缓冲液。
阳离子交换层析树脂或阴离子交换层析树脂的使用、所用树脂的性质(即强离子交换剂或弱离子交换剂)和盐浓度、所用缓冲液以及pH的条件，视AAV衣壳变体(即AAV衣壳血清型或假型)而变化。尽管已知的AAV衣壳变体均共享特征例如大小和形状，但其在分子拓扑学和表面电荷分布的精细细节方面有区别。因此，尽管期望所有的衣壳变体易于通过离子交换层析来纯化，并且可以系统方式用层析树脂和缓冲液筛选实验来确定相关方法，但对于各AAV衣壳变体需要不同的条件以实现有效的AAV颗粒纯化。此类条件对技术人员而言是显而易见的。
柱层析步骤非常适于有效纯化共享远离其它物类(例如杂质)的共同分子形状和相似的电荷分布的分子物类，所述其它物类具有不同的分子形状和电荷分布。在在生产细胞培养系统中制得的重组AAV载体的情况下，粗制的生物合成收获物的已知特征在于大量类型的AAV载体存在于其中。这些各种各样的颗粒包含真正的AAV载体(即里面包含预期DNA片段的载体衣壳)；空衣壳(即里面没有任何物质的载体衣壳)和其它的载体相关杂质(例如里面具有DNA的其它(非预期)片段的载体衣壳)。除这些各种各样的AAV颗粒(即真正的载体和载体相关杂质)之外，大量存在其它类型的杂质(例如宿主细胞蛋白、脂类和/或核酸和/或细胞培养基组分)。柱层析法尤其非常适合从非所需杂质中纯化AAV颗粒。梯度超速离心，尽管难以用大体积物质进行，但非常适合基于这些各自颗粒密度的差别从真正的AAV载体中分离大部分AAV载体相关杂质。到目前为止梯度超速离心通常被认为并非可扩缩的，因此此前不是用于大规模生产方法的合适的生产方法步骤。梯度超速离心步骤的该感知的非可扩缩性部分地因本领域加工相对大体积物质以回收相对少量的重组AAV的需要所致。然而，已通过如上所述的一个或多个柱层析步骤纯化的AAV颗粒可通过切向流过滤(例如使用与100 kDa分子量截止值相应的标称孔径的中空纤维膜)有效浓缩至高浓度，使得可在单个标准超速离心运行上制备大量载体，所述运行可处理约400mL的包含纯化的载体颗粒的溶液。例如，包含10%真正的AAV载体(因此90%载体相关杂质例如空衣壳)的层析纯化的AAV颗粒，可浓缩至1014个颗粒/mL(每mL包含1013个AAV载体颗粒和9×1013个颗粒的载体相关杂质)，可在单个超速离心运行中处理，例如每个批次约400mL，使用Beckman Ti50 Rotor，导致产生约4×1015个真正的AAV载体颗粒(1013 vg/mL×400mL = 4×1015vg)。AAV载体的该产率足以提供用于很多临床应用的很多剂量，实现从大多数AAV载体相关杂质中AAV载体颗粒的有效分离。对于需要载体的更高剂量的临床应用，包含10%真正的AAV载体的纯化的AAV颗粒可通过切向流过滤(TFF)浓缩至1015个颗粒/mL，并且接着可在单个超速离心运行中处理以导致产生约4x1016个载体基因组(真正的AAV载体)。对于需要载体的甚至更大剂量的其它临床应用，包含10%真正AAV载体的纯化的AAV颗粒可通过TFF浓缩至1016个颗粒/mL，并且接着可在单个超速离心运行中处理以导致产生约4x1017个载体基因组(真正的AAV载体)。纯化的AAV颗粒浓缩至1016个颗粒/mL是可行的。这对应于约100毫克/毫升的质量浓度，即对于其它的纯化生物分子(例如单克隆抗体)可达到的浓度。此类高浓度对于配制需要加以合适的注意以避免非所需的稳定性问题例如聚集(Wright等, 2005)。通过以下方法从澄清的宿主细胞裂解液中纯化AAV颗粒的新型组合提供了大量高度纯化的重组AAV载体：柱层析法，通过已知的可扩缩生产步骤(例如切向流过滤)浓缩纯化的AAV颗粒(若需要的话)，联合等密度梯度超速离心。梯度超速离心的运用提供了更大的灵活性(例如对来源于不同AAV血清型的载体的适用性)和纯度(例如载体相关杂质的有效去除)、成本效益的关键考虑和人临床应用中的长期功效。有效的柱层析和切向流过滤(两者均为易于可扩缩的生物药剂工业标准生产方法步骤)的组合，使得随后的密度梯度超速离心步骤可扩缩。如上概述进行的这些步骤的新型组合，提供了通常适用于所有AAV衣壳变体的纯化平台，该平台是灵活的、可扩缩的并且关键地，提供了足够高的纯度(即不含一般杂质和载体相关杂质)以显著提高了基因转移效率并使在将基因治疗给予人受试者后限制疗效的宿主免疫反应的可能性最小化。
用于测定空衣壳和具有包装的基因组的AAV载体颗粒的方法为本领域已知的。参见例如Grimm等., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer等, Molec. Ther. (2003) 7: 122- 128。为了检测变性的衣壳，方法包括将经处理的AAV储液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述凝胶由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶例如缓冲液中含3-8% Tris-醋酸盐的梯度凝胶组成；接着跑胶直至样品物质分离，并将凝胶印迹至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，优选尼龙膜上。接着抗-AAV衣壳抗体用作结合变性的衣壳蛋白的一抗，优选抗-AAV衣壳的单克隆抗体，最优选B1抗-AAV-2单克隆抗体(Wobus等, J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。接着使用二抗，一种结合一抗并包含用于检测与一抗的结合的工具，更优选包含与其共价结合的检测分子的抗-IgG抗体，最优选与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。用于检测结合的方法用于半定量地确定一抗和二抗之间的结合，优选能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选化学发光检测试剂盒。
为了检测感染效价，方法包括接种约100,000个宿主细胞(优选人来源的宿主细胞，最优选Hela细胞)至经组织培养处理的平板，优选24孔经组织培养处理的平板中，并在腺病毒(优选腺病毒-2血清型)和处理的rAAV储液加至宿主细胞后孵育约24小时。宿主细胞、腺病毒和 rAAV 储液允许孵育24小时，之后固定宿主细胞，优选用甲醛和戊二醛进行固定，并用合适的试剂染色，所述试剂检测rAAV表达的转基因，例如用rAAV-LacZ时，考虑X-gal作为染色剂。用于其它报告基因的其它试剂为本领域熟知的。用于确定包含任何转基因的载体的感染性效价的更普遍方法也为本领域已知，参见例如Zhen等, (2004) "An Infectious Titer Assay for Adeno-associated Virus(AAV) Vectors with Sensitivity Sufficient to Detect Single Infectious Events." Hum. Gene Ther. (2004) 15:709-715。
基于病毒的载体提供了用于治疗性基因转移的巨大益处，因为其相对于非病毒方法为基因递送至靶细胞赋予高度效率。然而，当使用基于病毒的载体时内在风险是免疫毒性的潜在可能性。已知所有的病毒抗原引起不同类型和不同严重性的免疫应答。例如在对其进行暴露的人中，此类抗原以及与这些抗原相关的细胞成为免疫效应子功能(例如抗体和细胞毒性T淋巴细胞)的靶标。在已知的病毒中，AAV是免疫原性最小的病毒之一，具有明显免疫毒性的最小潜在可能性，提供了与基因转移载体的给予相关的公认益处。然而，AAV衣壳蛋白仍代表病毒抗原的来源，所述抗原可引起非所需的免疫应答。假定通过AAV衣壳蛋白在接受AAV载体的人受试者中导致的免疫毒性的严重性与给予AAV衣壳蛋白的量呈比例，是合理的。因此，AAV衣壳的更高剂量可与明显的免疫毒性的更高风险相关。为了确保此类载体最安全地用于人受试者的给予，与载体基因组的有效剂量相关的AAV衣壳蛋白的量应最小化。有效移除载体相关杂质(特别地典型地占典型的细胞培养载体生产中产生的AAV颗粒的50-90%，并且可占所述AAV颗粒的>90%的AAV空衣壳)的纯化AAV载体的方法，显著减少人受者中免疫毒性的风险。据报道接受2x1012 vg/kg(总体重)剂量(肝给予)的基本不含载体相关杂质(即基本不含空衣壳的载体)的重组AAV载体的人受者，自载体给予后起始约3周经历通过升高的肝酶所示的显著的、中度的、自限的免疫毒性(Manno等, 2006, Nature Medicine)。评价支持该中度并且瞬时的免疫毒性的性质是诱导AAV衣壳特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，所述细胞消除表达来源于AAV衣壳的肽的肝细胞(Manno等, 2006, Nature Medicine)。若使用不会基本上移除载体相关杂质的方法制备相同载体基因组剂量(2x1012 vg/kg)的重组AAV (例如载体制备物中AAV颗粒的约80%为空衣壳)，此类制备物会与加大的严重免疫毒性(如通过显著更高的肝酶所示)相关。
本文所述的纯化方法以可扩缩的方式经由载体相关杂质(例如空衣壳)的有效移除提供了具有提高的安全性概况的载体，即以有成本效益的方式制备大量的AAV载体目前是可能的。
提供以下实施例以阐述本发明的某些实施方案。其并不旨在以任何方式限制本发明。
实施例 1
已针对六种常见并临床上有希望的AAV血清型(AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AVV9)的AAV载体放大本方法。该纯化方法似乎适用于基于大多数(若非全部的话)的AAV血清型和衣壳变体的载体的纯化。对于各血清型或衣壳变体，可变化柱层析的细节(即层析树脂的特性和AAV颗粒纯化的特定条件)。下表提供了作为AAV血清型的函数的已成功用于实现AAV颗粒的纯化的树脂
。
可可靠地限定条件以实现有效的AAV颗粒的捕获、大多数非载体杂质的移除(即在其中AAV颗粒保持与树脂结合的条件下杂质的洗去)，和接着AAV颗粒的洗脱。在从层析步骤回收后，纯化的AAV颗粒(即真正的AAV载体、空衣壳和其它的载体相关杂质)可通过切向流过滤，用升高的离子强度缓冲液(Wright等(2005) Mol Therapy)或防止颗粒聚集必需的其它缓冲液条件典型地浓缩至lxl012-lxl016个AAV颗粒/毫升(对应于约0.1-100毫克/毫升)的浓度。接下来，进行实验室规模的氯化铯梯度超速离心步骤，例如用包含12管(各自包含约40 mL)的Ti50转子。该步骤从大部分载体相关和其它非载体相关的残留杂质中有效分离真正的AAV载体。以方法步骤的这种组合和顺序实现载体的可扩缩、有效、正交的纯化，所述方法步骤包含以下关键的核心顺序：1) 柱层析；2) 通过切向流过滤的浓缩(若需要减少包含载体的柱洗脱液的体积则使用)和3) 梯度超速离心。以该顺序配置时，在单个实验室规模的超速离心运行中从载体相关杂质中常规分离> l×l015高度纯化的AAV载体。
基于氯化铯中的合理的蛋白浓度负载联合真正的AAV载体和大多数载体相关杂质之间的密度差异，我们预测在单个实验室规模的超速离心运行中可从载体相关杂质中有效分离4×l016个AAV载体，其为用大规模超速离心设备每次运行分离的量的至少10倍。本文所用短语“真正的AAV载体”是指能够感染靶细胞的包含目标转基因的载体。该短语不包括空载体，以及缺少完全插入物的载体或包含宿主细胞核酸的那些载体。因此，离心步骤对于治疗人疾病的许多可预知的AAV载体产物的商业规模生产是可扩缩的且不受限的。假定实验室规模的超速离心(即约400mL的柱纯化的AAV颗粒)和柱纯化的AAV颗粒通过切向流过滤浓缩至l×l015个AAV颗粒/毫升的浓度(包含l×l014个真正的AAV载体/毫升)，可制备以下数目的剂量：1) 假定表达治疗失明的转基因的l×l011个AAV载体的剂量给予眼睛，在单个梯度运行中可产生多至400,000个剂量；2) 假定表达用于帕金森氏病的转基因的l×l012个AAV载体的剂量给予CNS，在单个梯度运行中可产生多至40,000个剂量；3) 假定表达用于血友病的转基因的l×l014个AAV载体的剂量给予肝，在单个梯度运行中可产生多至400个剂量。我们预测在梯度超速离心步骤之前AAV颗粒可进一步浓缩10倍(至1016个AAV颗粒/mL——对应于约100 mg/mL，对于其它生物分子例如单克隆抗体常规达到的生物物质的浓度)，并且该高但合理可实现的浓度导致来自各标准超速离心运行(每批能够处理约400mL)的真正载体10倍更高的产量，即多至4×1017个载体基因组。此外，可合理地预期更大规模的超速离心仪处理至少10倍更大体积的浓缩的AAV颗粒，导致至少4×l018个载体基因组(即4×l018个高度纯化的、真正的AAV载体)，后者对应于40,000个剂量的l×l014个载体基因组/血友病B的人受试者。这些计算提示氯化铯超速离心步骤，当在本文所述的新型纯化平台中进行时，易于扩大规模以满足AAV载体的生产的所有预期需求。出人意料地，至少依照现有常规的生物工艺工业相信梯度超速离心并非可扩缩的，新型生物工艺步骤(并且重要地其进行的顺序)提示梯度超速离心步骤并非AAV载体纯化的限制步骤。
我们的纯化方法相对于当前使用的‘工业标准’可扩缩AAV载体纯化方法的一个优点是其经由包括设计以有效移除产物相关杂质的步骤来实现更高纯度的能力。参见图1和图2。AAV衣壳特异的免疫应答的临床意义已显示于Manno等(2006: Nature Med)的研究中，并且存在大量的非必需的过多衣壳抗原(例如AAV空衣壳)和潜在地免疫刺激的AAV包衣壳核酸即载体相关杂质，描述于科学文献中(Smith等(2003)Mol Therapy(摘要)；Chadeuf等(2005)Mol Therapy；European Medicines Agency (2005)Report from the CHMP Gene Therapy Expert Group Meeting；Hauck等(2009)Mol Therapy)。用于翻译研究和临床产品开发的大规模产生和纯化重组AAV的其它小组的数据提供于图3中(来自Hauck等(2009)Mol Therapy)。
实施例 2
使用该方法纯化的AAV载体(AAV2-hRPE65)已给予患者并且在对于利伯先天性黑矇的临床研究中表现出长期功效(Maguire等(2008) N Engl J Med)。值得注意的是，通过未能去除载体相关杂质的生产方法纯化的由其它小组使用的相似的AAV2-RPE65载体，显示了效能明显较弱的证据，甚至当以更高剂量给予时亦是如此(Bainbridge等(2008)N Engl J Med和Hauswirth等(2008)Human Gene Ther)。
下表1提供了该数据的总结
表1RPE65-LCA临床试验的结果的对比
缩写：LCA，利伯先天性黑矇；L，局部；G，全身麻醉；M，包含黄斑的中央凹；ST，颞上视网膜；SN，鼻上视网膜；T，颞半侧视网膜；MH，黄斑裂孔；FT，中央凹变薄；NC，无变化；NM，未测量；+, 患者报告的改善
a两次基线测量的平均值。屈光不正: P1=-0.25+1.50 × 090；P2 = -1.50+0.50 × 075；P3=-2.70+1.75 × 100
b异卵双生。
AAV2载体，AAV2.hRPE65v2包含1.6 kb人RPE65 cDNA4-6，具有在翻译起始位点改造的修饰的Kozak序列。所述cDNA在杂合鸡β肌动蛋白(CBA)启动子的控制下。使用本文报道的载体纯化方法在费城儿童医院利用合适的现行生产质量管理规范(cGMP)生产生产AAV2-hRPE65 (特别地，AAV2-hRPE65v2)。具体而言，AAV2-RPE65通过HEK293细胞的瞬时转染产生。收获的细胞和细胞培养上清通过切向流过滤使用100kDa分子量截止值中空纤维膜浓缩。浓缩的收获物进行三轮微射流化以裂解细胞并释放AAV颗粒。将细胞裂解液进行过滤(使用Sartorius 0.2微米过滤筒)并将澄清的细胞裂解液用Poros 50HS树脂进行阳离子交换柱层析。特别地，将澄清的细胞裂解液上样至约200mM NaCl盐浓度的中性缓冲盐水中的树脂，用约100mM NaCl盐浓度的包含5mM肌氨酰(表面活性剂)的中性缓冲盐溶液洗涤(即使树脂接受去除杂质而不是结合的AAV颗粒的溶液)，用中性缓冲盐溶液进一步洗涤以去除残留的肌氨酰，在包含100单位/mL浓度的核酸酶(Benozonase)的中性缓冲盐溶液中孵育以消化并去除核酸杂质，并用中性缓冲盐溶液进一步洗涤以去除残留的核酸酶。最后用约400mM NaCl盐浓度的中性缓冲盐溶液洗脱AAV颗粒，所述浓度提供足够提高的离子强度以破坏AAV颗粒与层析树脂的结合。从阳离子交换层析柱中洗脱的纯化的AAV颗粒用高纯度氯化铯盐补充至与约1.35 gm/mL密度对应的终浓度，通过无菌的0.2微米膜过滤，并接着在实验室规模的Beckman超速离心机中用固定角转头以50,000 rpm进行等密度超速离心。离心后，用无菌针和注射器从各离心管中回收AAV2-RPE65对应的可见带。合并AAV2-RPE65对应的收集的带并通过切向流过滤用100 kDa分子量截止值中空纤维进行渗滤，导致自包含AAV2-RPE65载体的溶液中移除氯化铯。接着将载体配制于180mM NaCl、20mM磷酸钠和0.001% Pluronic F68 (也被称作泊洛沙姆188)，pH7.3中。给予适当稀释的这些载体至缺少人RPE65基因的完整形式(并因此遭受利伯先天性黑矇，失明的一种形式)的人受试者。接受这些载体的人受试者实现的益处已被Maguire等(2008, 2009)和Simonelli等(2009)报道。其它两队同时用AAV2-RPE65 (即包含人RPE65基因的重组AAV2 载体)进行临床研究，并且已报道他们研究的结果。这些其它队通过运用柱层析但缺少梯度超速离心步骤的纯化方法纯化他们的AAV2-RPE65载体。如Hauswirth等(2008)所概况的，用本文报道的方法(即联合柱层析和梯度超速离心的平台AAV载体纯化方法，该步骤以使梯度超速离心可扩缩的方式结合)制备的AAV2-RPE65，以低剂量给予人受试者(为其它两队给予人的剂量的约1/4-1/7)仍产生最佳结果。具体而言，Maguire等(2008)观察到视敏度的最显著改善(3/3，参见表1)。相比之下，Bainbridge等(0/3)和Hauswirth等(0/3)两者报道其治疗的受试者中任一个的视敏度都无显著改善。尽管其它因素可促成这些临床试验观察到的差异，但清楚的是，Maguire报道的试验所用的AAV2-RPE65纯化方法是说明观察到的优越功效的重要因素。
修饰该研究中使用的载体以通过两种机制优化对靶细胞的递送：1) 将表面活性剂加入终制剂中以防止载体与注射设备的结合，其是假定递送相对低剂量的载体时的重要考虑因素和2) 载体相关杂质的消除，其确保了靶细胞摄取的每个载体颗粒具有导致RPE65表达的潜能。无移除空衣壳的步骤的情况下纯化的标准的载体制备物，典型地为>80%空衣壳，而这些研究中使用的制备物为>95%充满的衣壳。
如上所提及的，通过视网膜下注射接受AAV2.hRPE65v2的具有LCA2的所有三名患者显示出视网膜功能明显的改善。通过客观生理试验在瞳孔光反射中的改善伴随主观心理物理测量中的改善值。试验在6周时显示视敏度；之后，改善的速度变慢。眼球震颤的减少，例如我们之前在犬研究中报道的减少可说明患者2的左眼(未注射眼)的改善的视敏度。接受了注射的眼睛的改善超过了测试-再测试变率的界限，具有被认为具有有功能重要性的幅度。
对AAV载体的暴露没有引发明显的局部或全身不良事件。在视网膜下注射2周后患者2的右眼中发生的黄斑裂孔似乎不与AAV2.hRPE65v2的给予相关，因为没有观察到炎症或急性视网膜毒性的体征。我们假设黄斑裂孔是由经由手术操作刺激的预先存在的膜的收缩引起的，尽管可能的是这是手术操作本身的直接结果。然而，并不预期黄斑裂孔的形成影响具有与我们的患者相似的中心视力缺失的患者的视网膜功能，其可严重影响视网膜变性程度较轻的那些患者的视力。
自患者1中LCA2的实验性治疗的6个月期间维持对患者的临床益处。清楚地，本文所述的改善的纯化方法(其从待给予的制剂中移除空衣壳)有助于该临床益处。
尽管已详细地并参考其特定实施例描述本发明，但对本领域的技术人员显而易见的是，可在不背离其精神和范围的情况下，在其中进行各种变化和修改。

Claims (17)

1.一种制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，所述方法包括如下步骤：
a) 收获包含重组AAV载体颗粒的细胞和细胞培养上清；
b) 经由切向流过滤浓缩步骤a)中收获的所述细胞和所述细胞培养上清，以制备浓缩的收获物；
c) 通过微射流裂解步骤b)中制备的所述浓缩的收获物以制备裂解液；
d) 过滤步骤c)中制备的所述裂解液，以制备澄清的裂解液；
e) 使步骤d)中制备的所述澄清的裂解液通过离子交换柱层析法，以制备包含纯化的AAV载体颗粒的柱洗脱液，并任选通过切向流过滤浓缩所述柱洗脱液，以制备浓缩的柱洗脱液；
f) 混合所述柱洗脱液或在步骤e)中制备的所述浓缩的柱洗脱液和氯化铯以制备混合物，并将所述混合物进行离心以从空衣壳AAV载体颗粒和其它载体相关的杂质中基本分离真正的AAV载体颗粒；
g) 收集在步骤f)中分离的所述真正的AAV载体颗粒，并将所述收集的真正的AAV载体颗粒通过切向流过滤进行缓冲液交换；
h) 用表面活性剂配制步骤g)中得到的所述真正的AAV载体颗粒以制备AAV载体制剂；
i) 过滤在步骤h)中制备的所述AAV载体制剂以制备高度纯化的AAV载体制剂，其中所述高度纯化的AAV载体制剂中至少90%的AAV载体颗粒是真正的AAV颗粒。
2.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中存在于在步骤i)中制备的所述高度纯化的AAV载体制剂中所述真正的AAV载体颗粒以约100 mg/mL的浓度存在。
3.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中存在于在步骤i)中制备的所述高度纯化的AAV载体制剂中的所述真正的AAV载体颗粒的浓度为1015个颗粒/mL。
4.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中存在于步骤i)中制备的所述高度纯化的AAV载体制剂中的所述真正的AAV载体颗粒的浓度是1016个颗粒/mL。
5.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中存在于步骤i)中制备的所述高度纯化的AAV载体制剂中的所述真正的AAV载体颗粒的浓度是1017个颗粒/mL。
6.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中步骤a)的所述重组AAV载体颗粒来源于选自以下的AAV：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9。
7.一种根据权利要求1的方法制备的高度纯化的AAV载体制剂，其包含在药学上可接受的载体。
8.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中所述真正的AAV载体颗粒包含转基因，该转基因编码选自以下的核酸：siRNA、反义分子、miRNA、核酶和shRNA。
9.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中所述真正的AAV载体颗粒包含转基因，该转基因编码选自以下的基因产物：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、制管张素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α (TGFα)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II (IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活蛋白、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神养蛋白、聚集蛋白、导蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音感刺猬蛋白和酪氨酸羟化酶。
10.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中所述真正的AAV载体颗粒包含转基因，该转基因编码选自以下的基因产物：血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL1至IL-17)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β、干扰素α、干扰素β和干扰素γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、MHC I类分子和MHC II类分子。
11.权利要求1的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中所述真正的AAV载体颗粒包含转基因，该转基因编码可用于修正先天性代谢缺陷的蛋白的核酸，所述蛋白选自：氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子V、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸酯、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、RPE65、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)序列和肌养蛋白cDNA序列。
12.权利要求11的制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，其中所述基因产物为因子VIII或因子IX。
13.根据权利要求1的方法，其中步骤f)中的所述离心在单一步骤中进行。
14.根据权利要求1的方法，其中步骤f)中的所述离心是密度梯度超离心。
15.根据权利要求1的方法，其中步骤e)中的所述柱洗脱液通过切向流过滤浓缩以制备浓缩的柱洗脱液。
16.根据权利要求1的方法，还包含在步骤c)中制备的裂解液中加入核酸酶。
17.一种制备高度纯化的AAV载体制剂的方法，所述方法包括如下步骤：
a) 收获包含重组AAV载体颗粒的细胞和细胞培养上清；
b) 经由切向流过滤浓缩步骤a)中收获的所述细胞和所述细胞培养上清，以制备浓缩的收获物；
c) 通过微射流裂解步骤b)中制备的所述浓缩的收获物以制备裂解液；
d) 过滤步骤c)中制备的所述裂解液，以制备澄清的裂解液；
e) 使步骤d)中制备的所述澄清的裂解液通过离子交换柱层析法，以制备包含纯化的AAV载体颗粒的柱洗脱液，并任选通过切向流过滤浓缩所述柱洗脱液，以制备浓缩的柱洗脱液；
f) 混合所述柱洗脱液或在步骤e)中制备的所述浓缩的柱洗脱液和氯化铯以制备混合物；
g) 在单一步骤中将步骤f)中的所述混合物进行梯度超离心以从空衣壳AAV载体颗粒和其它载体相关的杂质中基本分离真正的AAV载体颗粒；
h) 收集在步骤g)中分离的所述真正的AAV载体颗粒，并将所述收集的真正的AAV载体颗粒通过切向流过滤进行缓冲液交换；
i) 用表面活性剂配制步骤h)中得到的所述真正的AAV载体颗粒以制备AAV载体制剂；和
j) 过滤在步骤i)中制备的所述AAV载体制剂以制备高度纯化的AAV载体制剂，其中所述高度纯化的AAV载体制剂中至少90%的AAV载体颗粒是真正的AAV颗粒，且其中所述高度纯化的AAV载体制剂中的所述真正的AAV载体颗粒的浓度为1015个颗粒/mL。
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