CN115927398A - 一组肝靶向新型腺相关病毒的获得及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组通过定向进化和体内筛选的方法而获得的具有感兴趣特性的腺相关病毒，例如，靶向性特性和/或中和特性。本发明还提供了腺相关病毒衣壳蛋白以及包含所述腺相关病毒衣壳蛋白的病毒粒子，这些病毒粒子具有优良或优异的靶向性和/或中和特性。

Description

一组肝靶向新型腺相关病毒的获得及其应用

本申请是申请日为2020年7月29日，申请号为202010742484.2，发明名称为“一组肝靶向新型腺相关病毒的获得及其应用”发明专利申请的分案申请。

背景技术

迄今以血清型定名的腺相关病毒(AAV)亚型分为AAV1-AAV12(高光平等，2004，JVirolm 78:6381-6388；Mori S等，2004，Virology 330:375-383；Schmidt M等，2008，JVirol82:1399-1406)，主要以人类和灵长类动物为宿主，其中AAV1-6是从人类组织中分离获得，并且具有明确的抗体反应性，因而较为经典并得以公认。AAV7和AAV8是高光平等通过基因工程手段从猕猴心脏组织拯救得到的，疑为在进化中已经绝迹的AAV亚型，这一策略为AAV新亚型的发现和重组病毒的设计改造提供了新的思路和范例(高光平等，2002，ProcNatl Acad Sci USA 99:11854-11859)，而AAV9-12是利用同类技术路线分别从人和短尾猴的组织中制备的。尽管不同AAV血清型的病毒都具有正二十面体的结构，但其衣壳蛋白在序列与空间构象上的多样性，使得其细胞表面的结合受体以及对细胞的感染嗜性存在显著差异(Timpe J等，2005，Curr Gene Ther 5:273-284)。在感染嗜性方面，AAV2的感染谱较广，尤对神经细胞效果最好；AAV1和AAV7在骨骼肌中的转导效率较高；AAV3易于转导巨核细胞；AAV5和AAV6感染呼吸道上皮细胞的优势显著；而AAV8转导肝细胞的效率优于其它亚型。

AAV病毒本身是复制缺陷型的，在没有辅助病毒存在的情况下只能在宿主细胞呈潜伏状态。AAV病毒载体的生产则需要辅助质粒(helper)提供腺病毒(Ad)参与AAV复制的关键基因。这些Ad基因包括：早期基因E1A负责AAV的转录活性，早期基因E1B和E4参与AAVmRNA的成熟化，早期基因E2A和VA增强AAV RNA翻译(Berns等，1984，Adeno-associatedvirus 563–592)。

重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治疗载体，具有非常多的优势，如感染效率高、感染范围广、长期表达和高安全性等(David AF等，2007，BMC Bio 7:75)，已被广泛应用于临床实验。目前以AAV为载体的基因治疗项目进入临床研究的有100多项，治疗的疾病范围扩展到肿瘤、视网膜疾病、关节炎、艾滋病、心力衰竭、肌营养不良症、神经系统疾病及其它一系列基因缺陷疾病。

目前正在开展的基于rAAV载体的眼部疾病基因治疗临床研究，大多数是针对视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白编码基因(RPE65)突变引起的先天性黑蒙(LCA，Leber’scongenital amaurosis)。Spark公司研发的Luxturna药物已于2017年12月通过FDA审批上市，此药物是rAAV2携带hRPE65v2基因治疗LCA及遗传性视网膜发育不良。受试者在注射后的测试结果显示其药物的有效性，并且没有发现明显副作用，尤其是载体相关的副作用(Russell S等，2017，Lancet 390:849-860)。其它进入临床的基因治疗眼科疾病还有无脉络膜症，多数研究处于临床I、II期，其中阿尔伯塔大学利用rAAV2携带Rab护卫蛋白1编码基因(REP1)治疗项目，在2018年公布的I期研究结果显示了药物的安全性及有效性。

目前正在开展的基于rAAV载体的血友病基因治疗临床研究有二十多个，其中以B型血友病研究最多。具有长期表达能力的AAV基因药物是治疗血友病B的理想选择。UniQure公司正在进行临床I/II期研究，用AAV5携带人凝血因子IX编码基因(hFIX)治疗B型血友病，给药后1年的随访数据显示了药物安全性。患者给药后1周出现体液免疫应答，但不影响凝血因子IX的表达水平，使用现在T细胞检测“金标准”系统检测不到T细胞活化。转氨酶有升高但是不影响FIX活性，也没有发现肝毒性反应(Miesbach W等，2018，Blood131:1022-1031)。目前还有一些利用AAV8载体治疗血友病的基因治疗项目，这些都是以肝脏为靶向性的临床研究(Nathwani AC等，2006，Blood.107:2653-2661)，AAV8也是目前公认的肝脏靶向最优的AAV血清型。

脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)系指一类由于以脊髓前角细胞为主的变性导致肌无力和肌萎缩的疾病。AveXis公司的AVXS-101目前已经上市，利用AAV9在神经系统感染的优势，携带运动神经元存活蛋白编码基因(SMN1)治疗SMA取得了很好的效果，并且在临床试验中所有的患者没有出现载体副作用相关的临床症状(Mendell JR等，2017，N Engl J Med 377:1713-1722)。

其它以AAV为载体的罕见病基因治疗项目，例如，利用AAV1携带酸性α-葡萄糖苷酶编码基因(GAA)治疗庞贝氏病(Smith BK等，2013，Hum Gene Ther 24:630-640)，利用改造后的AAV2.5携带微小抗肌萎缩蛋白编码基因(minidystrophin)治疗杜氏肌营养不良(DMD)(Bowles DE等，2012，Mol Ther 20:443-455)，这些临床研究结果均显示出药物的有效性及安全性。

天然AAV靶向性是有限的，尤其是在使用AAV载体进行系统给药时，根据血清型选择的不同，能够有效感染靶细胞组织的比例差异很大，没有使AAV的利用率最大化；另外其它非靶向组织细胞具有被感染的潜在风险。另外，又因为人和其它灵长类动物受AAV自然感染产生了针对天然型AAV的中和抗体，这会大大降低AAV的半衰期，而影响其药物活性的发挥。

目前对于AAV外壳蛋白改造的研究越来越多，改造的目的：一方面能够增强病毒载体的靶向性，另一方面能够降低病毒载体的免疫原性反应。

对于病毒细胞受体机制研究比较明确的载体血清型，可直接针对其细胞受体相关区域的氨基酸进行小范围或定点改造。AAV2在细胞上的受体是目前研究比较明确的。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是AAV2和AAV3型的主要细胞受体，2型AAV外壳蛋白上R484、R487、K532、R585、R588氨基酸位点的改变会影响其与HSPG的结合(Opie,S.R等，2003，J Virol77:6995–7006；Summerford,C等，1999，Nat Med 5:78–82)。

改造后的新型AAV载体已被用于基因治疗临床研究中，例如AAV2.5携带minidystrophin基因治疗DMD(Bowles DE等，2012，Mol Ther 20:443-455)，其I期临床研究已经完成，并且针对新型AAV的安全性进行了大量研究。该项目所使用AAV2.5外壳蛋白为嵌合体，将AAV1外壳蛋白中与骨骼肌靶向相关的5个氨基酸移植到AAV2的外壳蛋白上。此嵌合体不但增强了对骨骼肌的靶向性，而且体液免疫反应明显低于AAV2，这些临床试验证明了改造后的病毒载体的安全性。

另外，病毒的细胞受体机制不明确的情况下，我们也可以利用DNA改组(DNAshuffling)或易错PCR的方法，获得功能优化的新型AAV病毒载体的外壳蛋白。例如Grimm等人利用AAV构建的改组文库，在静脉注射免疫球蛋白的严格筛选情况下，得到一个AAV2，8，9组成的嵌合体AAV-DJ，该载体对成纤维细胞和肺等多种细胞系有更高的转导效率(Grimm D等，2008，J Virol 82：5887-5911)。Jang等人利用DNA改组文库筛选到了一个能高效感染神经干细胞的变体(Jang J H，2011，Mol Ther 19：667-675)。

目前基因治疗药物已日趋成为国内外研究的热点，而且为了使基因治疗药物更好更长久地发挥作用，寻找一种功能优化的新型AAV载体使其更好地满足做为基因治疗载体的需求是亟待解决的问题。

发明内容

基于寻找新型AAV载体的需求，本发明提供了一组通过体内筛选来实现病毒定向进化的方法而获得的包含感兴趣特质AAV衣壳的病毒，例如，靶向性特质和/或中和性特质(例如，逃避中和抗体的能力)。本发明还提供了AAV衣壳和包含AAV衣壳的病毒粒子。

一方面，本发明提供了一种编码AAV衣壳蛋白的核酸，所述核酸包含选自以下组中的AAV衣壳蛋白编码序列：

(a)图3A的核苷酸序列(L1)(SEQ ID NO:1)；

(b)图3C的核苷酸序列(L4)(SEQ ID NO:3)；

(c)图3E的核苷酸序列(L10)(SEQ ID NO:5)；

(d)图3G的核苷酸序列(L52)(SEQ ID NO:7)；

(e)图3I的核苷酸序列(L58)(SEQ ID NO:9)；

(f)图3K的核苷酸序列(L84)(SEQ ID NO:11)；

(g)图3M的核苷酸序列(L37)(SEQ ID NO:13)；

(h)图3O的核苷酸序列(L107)(SEQ ID NO:15)；

(i)图3Q的核苷酸序列(L57)(SEQ ID NO:17)；或

(j)编码由(a)-(i)任一核苷酸编码的AAV衣壳蛋白但由于遗传密码的简并性而不同于(a)-(i)的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了由本发明的核酸编码的AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，或SEQ ID NO:18中的任一种。

本发明进一步提供了包含一种病毒基因组和本发明AAV衣壳蛋白的重组病毒粒子，其中病毒基因组包裹于AAV衣壳蛋白中。本发明进一步提供了一种AAV病毒基因组和本发明AAV衣壳蛋白的重组腺相关病毒粒子，其中病毒基因组包裹于AAV衣壳蛋白中。在具体的实施例中，病毒基因组是一个包含异源核酸的重组载体基因组。

本发明提供了一种细胞，该细胞包含本发明的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子和/或重组腺相关病毒粒子。

本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含一种药学上可接受的载体和本发明的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组腺相关病毒粒子和/或细胞。

本发明提供了本文中所述的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组腺相关病毒粒子、细胞和/或药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。

本发明提供了一种生产包含AAV衣壳蛋白的重组病毒粒子的方法，所述方法包括：在体外向细胞提供本发明的核酸、AAV Rep蛋白编码序列、包含异源核酸的重组载体基因组，以及产生生产性感染的辅助子，允许包含AAV衣壳蛋白的重组病毒粒子的组装，以及重组载体基因组的衣壳化。

本发明提供了一种生产包含AAV衣壳蛋白的重组AAV粒子的方法，所述方法包括：在体外向细胞提供本发明的核酸、AAV Rep蛋白编码序列、包含异源核酸的rAAV基因组，以及产生生产性感染的辅助子，允许包含AAV衣壳蛋白的重组病毒粒子的组装，以及重组载体基因组的衣壳化。

本发明提供了一种将感兴趣的核酸递送给细胞的方法，所述方法包括向细胞提供本发明的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组腺相关病毒粒子和/或药物组合物。

本发明提供了一种向哺乳动物个体递送感兴趣核酸的方法，所述方法包括：将有效剂量本发明的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组腺相关病毒粒子、细胞和/或药物组合物施用于哺乳动物。

本发明还提供了一种识别具有某种感兴趣嗜性特性的病毒载体例如AAV载体或AAV衣壳蛋白的方法，所述方法包括：

(a)提供病毒载体例如AAV载体集合，其中所述集合中的每种病毒载体包括：

(i)一种AAV衣壳蛋白，其包含通过改组两个或多个不同AAV衣壳蛋白编码序列而产生的衣壳蛋白，其中两个或多个不同AAV衣壳蛋白的氨基酸序列至少有两个氨基酸的不同；和(ii)一种病毒载体基因组例如一种AAV病毒基因组，包括一种编码(i)所述AAV衣壳蛋白的编码序列、一种AAV Rep蛋白编码序列、至少一种与AAV Rep蛋白相互作用的末端重复序列(例如5’和/或3’末端重复)，其中病毒载体基因组包裹于AAV衣壳蛋白中。

(b)将病毒载体集合施用于哺乳动物个体，和

(c)从目标组织中回收多个病毒粒子或编码AAV衣壳蛋白的病毒基因组的病毒载体，从而鉴定出具有感兴趣嗜性的病毒载体或AAV衣壳蛋白。

本发明的积极效果在于：

本发明提供了一组通过定向进化和体内筛选的方法而获得的新型AAV病毒载体、AAV衣壳蛋白以及包含所述AAV衣壳蛋白的病毒粒子，相对于现有技术中的AAV病毒载体而言，具有感兴趣特质AAV衣壳的病毒，例如，靶向性特质(更高的肝组织靶向性)和/或中和性特质(例如，逃避中和抗体的能力)。

下面结合附图和具体实施方式对本公开做进一步说明，并非对本公开的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利的保护范围。

附图说明

图1.质粒文库随机挑选阳性克隆酶切图谱。1-12分别对应随机挑选阳性克隆样品，M代表5000bp DNA Marker。

图2.两轮体内筛选后，AAV突变体在肝脏、骨骼肌和心脏中出现的次数。经第一次体内筛选后共获得370个阳性克隆，经第二次体内筛选后共获得9组高频靶向肝脏的新型AAV序列。

图3A-3R.新型AAV-Cap序列。其中序列图分为核苷酸序列及编码的氨基酸序列。

图4A-4F.不同体外细胞系感染比较(CAG-EGFP)。不同AAV载体包装成携带CAG-EGFP的相应病毒，在体外通过不同MOI感染不同细胞系，48h后进行流式细胞术检测分析。数值为平均值±标准差。

图5A-5E.不同细胞系体外感染比较(CAG-Luciferase)。不同AAV载体包装成携带CAG-Luciferase的相应病毒，在体外通过MOI 500感染不同细胞系，48h后检测Luciferase活性。数值为平均值±标准差。

图6.系统注射AAV载体后，小鼠不同组织中载体基因组拷贝数。不同AAV载体包装成携带CAG-Luciferase的相应病毒，以1E+11vg剂量尾部静脉注射小鼠2周后，不同组织中载体基因组拷贝数比较。数值为平均值±标准差。

图7A-7E.系统注射AAV载体后，小鼠不同组织中Luciferase活性。不同AAV载体包装成携带CAG-Luciferase的相应病毒以1E+11vg剂量尾部静脉注射小鼠2周后，不同组织中Luciferase活性比较。数值为平均值±标准差。

具体实施方式

本发明提供了一组通过体内筛选来实现病毒定向进化的方法而获得的包含感兴趣特质AAV衣壳的病毒载体，例如，靶向性特质和/或中和性特质(例如，逃避中和抗体的能力)。本发明还提供了AAV衣壳和包含AAV衣壳的病毒粒子。

本发明将在下文中进行更详细的阐述。本说明书并非旨在详细列出实施本发明的所有不同方式，此外，本发明所建议的各种实施例的诸多变化在不背离本发明的前提下对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，以下说明书旨在说明本发明的一些具体实施例，而不是详尽地说明其所有排列、组合和变化。

除非另有定义，否则本发明所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本发明中用于描述本发明的术语仅用于描述特定实施例，并不用于限制本发明。

除另有说明外，本领域技术人员已知的标准方法可用于生产重组和合成多肽、抗体或其抗原结合片段、操纵核酸序列、生产转化细胞、构建重组AAV、修饰衣壳蛋白、包装包含有AAV rep和/或cap编码序列的载体，以及瞬时或稳定地转染包装细胞。这些技术为本领域技术人员所熟知，参见SAMBROOK等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL 2nd Ed.(1989，Cold Spring Harbor,N.Y)；F.M.AUSUBEL等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York)。

本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其它参考文献全部以引用方式并入。

I定义

本发明说明书及其权利要求书中AAV衣壳亚单位中所有氨基酸位置的指定与VP1衣壳亚单位编号有关。

在本发明的说明书及其权利要求书中，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”也包括复数形式。

本发明中，“和/或”指包含一个或多个所述内容的任何和所有可能组合。

如本文所用，术语“基本上包含”与核酸、蛋白质或衣壳结构有关，意指所述核酸、蛋白质或衣壳结构包含任何可显著改变所述感兴趣核酸、蛋白质或衣壳结构功能的元素，例如，所述蛋白质或衣壳或所述核酸编码的蛋白质或衣壳的靶向性特性或中和特性。

本发明上下文中的术语“腺相关病毒(AAV)”，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和羊AAV以及现在已知的或后来发现的任何其它AAV(BERNARD N.FIELDS等,VIROLOGY,volume 2,chapter 69，4th ed.,Lippincott-Raven Publishers)。已经确定的一些额外的AAV血清型和分支，也包括在本发明术语“AAV”中(高光平等，2004，J.Virology 78:6381-6388)。

本领域已知各种AAV和细小病毒的基因组序列，以及ITRS、Rep蛋白和衣壳蛋白亚单位的序列，此类序列可在文献或公共数据库中找到。例如，在GenBank数据库中，Genbank登记号NC 002077、NC 001401、NC 001729、NC 001863、NC 001829、NC 001862、NC000883、NC001701、NC 001510、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC 00135、NC 001540、AF513851、AF5 13852、AY530579、AY63 1965，AY63 1966，这些公开内容通过引用并入本文中。另外，srivistava等，1983，J.Virology45:555；Chiorini等，1998，J.Virology 71:6823；Chiorini等，1999，J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等，1999，J.Virology 73:939；Xiao等，1999，J.Virology 73:3994；Muramatsu等，1996，Virology 221:208；Shade等，1986，J.Virol.58:921；Gao等，2002，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；国际公开专利WO00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；美国专利6156303；这些公开内容也通过引用整体并入本文中。AAV1、AAV2和AAV3末端重复序列的早期描述，参见Xiao,X,1996,"Characterization of Adeno-associated virus(AAV)DNA replication andintegration,"Ph.D.Dissertation,University of Pittsburgh,Pittsburgh,Pa，这些内容通过引用整体并入本文中。

“改组”或“嵌合”的AAV衣壳编码序列或AAV衣壳蛋白是将两个或多个不同的AAV衣壳蛋白序列混合后产生的核酸序列和氨基酸序列结合了两个或多个衣壳序列的部分。一种“改组”或“嵌合”的AAV病毒粒子包含一种被“改组的”或“嵌合的”AAV衣壳蛋白。

此处使用的“靶向性”一词是指病毒优先进入某些细胞或组织类型和/或优先与细胞表面相互作用从而促进其进入某些细胞或组织类型，任选地且优选地在细胞中表达病毒基因组携带的序列，例如，重组病毒表达异源核苷酸序列。在重组AAV基因组的情况下，病毒基因组的基因表达可来自稳定整合的前病毒和/或非整合的附加体，以及病毒核酸可能在细胞内发生的任何其它形式。

术语“靶向性特性”是指一个或多个靶细胞、组织和/或器官的转导模式。例如，一些改组的AAV衣壳可能显示肝脏、性腺和/或生殖细胞的有效转导，一些改组的AAV衣壳对骨骼肌、横膈膜肌和/或心肌组织的只有低水平的转导，典型改组AAV衣壳具有的靶向性特征是肝脏的高转导和骨骼肌的低转导。

如本文所用，由病毒载体对细胞的“转导”是指通过将核酸由病毒载体携带并随后通过病毒载体将遗传物质转移到细胞中。

如本文所用，除非上下文另有说明，否则病毒粒子、载体、衣壳或衣壳蛋白质的“集合”或“多个”意指两个或多个。

除非另有说明，“有效转导”或“有效靶向性”或类似术语可参照合适的对照品，例如，相对于对照品至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的转导或靶向性来确定。

类似地，可通过参考适当的对照来确定病毒对目标细胞或组织是否“非有效地转导”或“非具有有效的靶向性”。在具体实施例中，病毒载体对骨骼肌、心肌细胞非有效地转导，在具体实施例中，组织的非有效性转导是有效转导组织转导水平的20％或更少、10％或更少、5％或更少、1％或更少、0.1％或更少。

如本文所用，除非另有说明，术语"多肽"包括肽和蛋白质。

“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基序列，可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂交序列，包括自然发生和非自然发生的核苷酸，但最好是单链或双链DNA序列。

如本文所用，"分离的"核酸或核酸序列是指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其它成分分离的核酸或核酸序列，所述其它成分，例如，通常与核酸或核酸序列相关的细胞或病毒结构成分或其它多肽或核酸。

同样，“分离的”多肽是指从自然发生的有机体或病毒的至少一些其它成分中分离的多肽，所述其它成分例如细胞或病毒结构成分或通常与该多肽相关联的其它多肽或核酸。

术语“治疗”或语法上等同的术语，是指受试者病情的严重程度降低或至少部分改善或改善，和/或至少达到一种临床症状的缓解或减少，和/或病情进展有延迟和/或预防或延缓疾病或障碍的发生。此处术语“治疗”也包括对受试者的预防性治疗，例如，预防感染、癌症或疾病的发生。如本文所用，术语“预防”及其语法上等同的术语，包括任何类型的预防降低病情发生率、延缓病情发生和/或进展和/或减轻与病情相关症状的治疗。因此，除非上下文另有说明，术语“治疗”或语法等效术语是指预防和治疗方法或方案。

在此使用的"有效的"剂量是足以对受试者获得某种改进或益处的剂量。或者说，"有效的"剂量是使受试者至少一种临床症状缓解或减少的剂量。本领域技术人员将理解，只要受试者获得改进或益处，治疗效果不必是完全的或治愈的。

“异源核苷酸序列”或“异源核酸”通常不是在病毒中自然发生的序列。通常，异源核酸或核苷酸序列包含编码多肽和/或非翻译RNA的开放阅读框。

"治疗性多肽"可以是一种多肽，可以减轻或减少因细胞或受试者中蛋白缺失或缺陷而导致的症状。此外，"治疗性多肽"可以是一种以其它方式给受试者带来益处的多肽，例如抗癌效果或移植存活率的提高。

如本文所用，“载体”、“病毒载体”、“递送载体”通常指作为核酸递送载体的病毒粒子，它包括包装在病毒体内的病毒核酸即载体基因组。根据本发明的病毒载体包括本发明嵌合的AAV衣壳，并且可以包装AAV或重组AAV基因组或包括病毒核酸在内的任何其它核酸。或者，在某些情况下，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”可用于指在没有病毒粒子情况下的载体基因组和/或指作为转运体的病毒衣壳，以传递与衣壳相连或包装在衣壳内的分子。

“重组AAV载体基因组”或“rAAV基因组”是一种AAV基因组，其包含至少一个反向末端重复和一个或多个异源核苷酸序列。rAAV载体通常将145个碱基末端重复序列(TRs)保留在顺式结构中以产生病毒；然而，修饰的AAV-TRs和非AAV-TRs也可用于此目的。所有其它的病毒序列是可有可无的，并且可以反式提供(Muzyczka，1992，curr-topicsmicrobial.Immunol.158:97)。rAAV载体视情况可包含两个TRs，例如AAV TRs，通常位于异源核苷酸序列的5'和3'端，但不必与之相邻。TRs可以是相同的，也可以是不同的。载体基因组也可以在3'或5'端包含一个TR。

术语“末端重复”或“tr”包括形成发夹结构并作为反向末端重复发挥作用的任何病毒末端重复或合成序列，即介导诸如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等所需功能。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列可以是其它细小病毒，例如，犬细小病毒CPV、小鼠细小病毒MVM、人类细小病毒B-19，或作为SV40复制源的SV40发夹，并可以通过截断、替换、删除、插入进一步修改。此外，TR可以部分或完全合成，如美国专利US5478745中所述的“双D序列”。

“AAV-末端重复”或“AAV TR”可来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或任何其它已知或以后发现的AAV。只要末端重复介导所需功能，例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等，则无需具有天然末端重复序列，例如，天然AAV TR序列可通过插入、删除、截断和/或错义突变而改变。

术语“重组AAV粒子”和“重组AAV颗粒”可以互换使用。“重组AAV粒子”或“重组AAV颗粒”包含包装在AAV衣壳内的重组AAV载体基因组。

“基本保留”某种特性，是指至少保留约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的所述特性，例如，活性或其它可测量特性。

II、定向进化和体内筛选法鉴定的嵌合AAV衣壳

发明人已鉴定出具有感兴趣特征的“嵌合”或“改组”AAV衣壳结构，例如，靶向性特性和/或中和特性。在具体实施例中，嵌合AAV衣壳显示肝脏的高效转导和/或骨骼肌和/或心肌的低效转导。

因此，在一些实施例中，本发明提供包含或基本上包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的嵌合AAV衣壳以及包含所述嵌合AAV衣壳的病毒，所述氨基酸序列在图3B、3D、3F、3H、3J、3L、3N、3P或3R中展示。

在具体实施例中，所述嵌合AAV衣壳蛋白可以包含或基本上包含分别由图3B、图3D、图3F、图3H、图3J、图3L、图3N、图3P或图3R所示的氨基酸序列，或由这些图所示的氨基酸序列组成。

此外，在非限制性实施例中，本发明的嵌合AAV衣壳蛋白可由核酸编码，所述核酸包含或基本上包含分别由图3A、图3C、图3E、图3G、图3I、图3K、图3M、图3O或图3Q所示的核苷酸序列，或由这些图所示的核苷酸序列组成；或编码由上述任何一种核苷酸序列编码的AAV衣壳或衣壳蛋白的核苷酸序列，但由于密码子的简并性而与上述核苷酸序列不同。在本发明说明书和所附权利要求书中的所有氨基酸位置的指定均与VP1编号有关。本领域技术人员将理解，由于AAV衣壳编码序列的重叠，本文所述的修改也可能导致VP2和/或VP3衣壳亚基的改变。

本发明还提供了包含或基本上包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的嵌合AAV衣壳蛋白，评价诸如病毒转导和/或抗体中和等生物学性质的方法在本领域内是众所周知的。

保守氨基酸取代在本领域已知。在具体实施例中，保守氨基酸取代包括以下组中的一个或多个取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和/或苯丙氨酸、酪氨酸。

本领域技术人员显而易见地将图3B、3D、3F、3H、3J、3L、3N、3P、3R所示的嵌合AAV衣壳蛋白的氨基酸序列应用于本领域已知的其它任何修饰，通过进一步修饰以获得所需的特性。例如，对AAV2衣壳序列进行R484E和R585E突变，则改善AAV载体对心脏的转导(Muller等，2006，Cardiovascular Research 70:70-78)。做为进一步非限制性修饰的可能性，对衣壳蛋白进行修饰以纳入靶向序列或有助于纯化和/或检测的序列，例如衣壳蛋白可与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、肝素/硫酸肝素结合域、多聚-HIS、配体和/或报告蛋白、免疫球蛋白Fc片段、单链抗体、血凝素、C-MYC、标签表位等的全部或部分融合以形成融合蛋白。本领域已知的将靶向肽插入AAV衣壳的方法，例如，国际专利WO00/28004；Nicklin等，2001，Molecular Therapy 474-181；White等，2004，Circulation109:513-319；Muller等，2003，Nature Biotech 21:1040-1046。

本发明的病毒可进一步包含如国际专利WO01/92551及美国专利US7465583中所述的双重病毒基因组。

本发明还提供了包含本发明嵌合AAV衣壳蛋白的重组病毒粒子，其中载体基因组包裹于病毒粒子中，优选AAV载体基因组。在具体实施例中，本发明提供了一种重组AAV粒子，其包含本发明的嵌合AAV衣壳蛋白，其中AAV载体基因组包裹于AAV衣壳中。

在具体实施例中，病毒是包含感兴趣异源核酸的重组载体。因此，本发明可用于将核酸在体外和体内递送至细胞。在代表性实施例中，本发明的重组载体用于将核酸递送或转移到动物细胞，优选哺乳动物细胞。

任何异源核苷酸序列均可由本发明病毒载体递送。感兴趣的核酸包括编码多肽的核酸，任选治疗性多肽和/或免疫原性多肽。

治疗性多肽包括但不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素、甲状旁腺激素、生长激素释放因子、卵泡刺激素、黄体激素、人绒毛膜促性腺激素、血管内皮生长因子、促血管生成素、血管抑制素、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生产素、结缔组织生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ、转化生长因子α超家族中的任一个、活化素、抑制素、骨形态发生蛋白中的任一个、神经生长因子、脑衍生神经营养因子、神经营养蛋白NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子、胶质细胞系衍生神经营养因子、聚集蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白家族的任一个、导蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子、肝配蛋白、头蛋白、sonic hedgehog蛋白和酪氨酸羟化酶、血小板生成素、白介素IL-1到1L-25、单核细胞化学诱导物蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明，这些产物包括但不限于免疫球蛋白1gG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、Ⅰ类和Ⅱ类MHC分子以及改造的免疫球蛋白、补体调节蛋白、膜辅因子蛋白、衰变加速因子、CR1、CF2和CD59，低密度脂蛋白受体、高密度脂蛋白受体、极低密度脂蛋白受体和清除受体、糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其它核受体、jun/fos、max、mad、血清效应因子、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌细胞生成蛋白、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、CCAAT-盒结合蛋白、干扰素调节因子、Wilms肿瘤蛋白、ETS-结合蛋白、STAT、GATA-盒结合蛋白和翼状螺旋蛋白的叉头蛋白家族，氨甲酰合成酶1、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚B合成酶、支链酮酸脱羧酶、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰-CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白、抗肌萎缩蛋白、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、溶酶体酶、凝血因子、以及在需要的个体中具有治疗作用的任何其它多肽。

编码多肽的异源核苷酸序列包括编码报告基因多肽的序列。本领域已知的报告基因编码的多肽，包括但不限于绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶等。

另一方面，异源核酸可编码一种反义寡核苷酸，包括核酶、干扰RNA，干扰RNA包括介导基因沉默的小干扰RNA(Sharp等，2000，Science 287:2431)、microRNA、其它非翻译功能RNAs，如“指导”RNAS(Gorman等，1998，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:4929；美国专利US5869248)等。

所属技术领域内已知，反义核酸和抑制性RNA序列可诱导“外显子跳跃”。因此，异源核酸可以编码反义核酸或抑制RNA，诱导适当的外显子跳跃。

核酶是以位点特异性方式裂解核酸的RNA蛋白复合物。核酶具有特定的催化域，具有内切酶活性(Kim等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8788；Gerlach等，1987，Nature328:802；Forster and Symons，1987，Cell 49:211)。

microRNAs是一种天然的细胞RNA分子，通过控制mRNA的稳定性来调节多个基因的表达。特定microRNA的过度表达或减少可用于治疗功能障碍，并已被证明在许多疾病状态和疾病动物模型中有效(Couzin，2008，Science 319：1782-1784)。嵌合AAV可用于将microRNA导入细胞、组织和受试者中，用于治疗遗传病和获得性疾病，或增强某些组织的功能并促进其生长，例如，mir-1、mir-133、mir-206和/或mir-208可用于治疗心脏和骨骼肌疾病(Chen等，2006，Genet 38：228-233；van Rooij等，2008，Trends Genet。24：159-166)，microRNA也可用于基因传递后调节免疫系统(Brown等，2007，Blood 110：4144-4152)。

本文所用术语“反义寡核苷酸”，包括“反义RNA”，是指与特定DNA或RNA序列互补并特异杂交的核酸。反义寡核苷酸和编码相同的核酸可以按照常规技术制造。

本领域技术人员理解，反义寡核苷酸不必与目标序列完全互补，只要序列相似程度足以使反义核苷酸序列特异地与目标序列杂交并减少蛋白质产物的产生，例如，相似度至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。为了确定杂交的特异性，这种寡核苷酸与靶序列的杂交可以在弱、中、甚至严格的条件下进行。

反义寡核苷酸可通过本领域已知的程序化学合成和酶结合反应合成。例如，一个反义寡核苷酸可以用自然产生的核苷酸或各种修饰的核苷酸进行化学合成，其目的是增加分子的生物稳定性和/或增加反义链和正义链之间形成的双链稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。

可用于产生反义寡核苷酸的修饰核苷酸，包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基喹啉、肌苷、N6-异戊烯基赖氨酸、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖基喹啉、5’-甲氧基羧甲基脲嘧啶、5-甲氧基脲嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基胺、脲嘧啶-5-氧乙酸、喹啉、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基脲嘧啶、脲嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、和2,6-二氨基嘌呤等。

反义寡核苷酸可经化学修饰与另一分子共价结合。例如，反义寡核苷酸可以与一种分子结合，这种分子有助于传递到感兴趣的细胞，增强鼻粘膜的吸收、提供可检测的标记物、增加寡核苷酸的生物利用度、提高寡核苷酸的稳定性、或改善制剂或药代动力学特性等。共轭分子包括但不限于胆固醇、脂类、多胺、聚酰胺、聚酯、报告分子、生物素、染料、聚乙二醇、人血清白蛋白、酶、抗体或抗体片段或细胞受体配体。

为提高稳定性、核酸酶抗性、生物利用度、制剂特征和/或药代动力学特性，对核酸进行的其它修饰在本领域内也是已知的。

RNA干扰是转录后基因沉默的一种机制，它将与靶序列相对应的双链RNA(DsRNA)导入细胞或生物体中，导致相应mRNA的降解。RNAi实现基因沉默的机制已在多篇综述文章中报道(Sharp等，2001，Genes Dcv 15:485-490；Hammond等，2001，Nature Rev Gen 2:110-119)。在基因表达恢复之前，RNAi效应在多个细胞分裂中持续存在。因此，RNAi是一种在RNA水平上进行靶向敲除的有效方法。RNAi已被证明在人类细胞，包括人类胚胎肾脏和HeLa细胞中获得成功(Elbashir等，2001，Nature 411:494-498)。现已证明，大约21个核苷酸的短合成dsRNA，也被称为“短干扰RNA”，可以在不触发抗病毒反应的情况下介导哺乳动物细胞的沉默(Elbashir等，2001，Nature 411:494-498；Caplen等，2001，Proc.Nat Acad.Sci.98:9742)。

RNAi分子可以是短发夹RNA(Paddison等，2002，PNAS USA 99:1443-1448)，它在细胞中通过RNaseIII酶切作用加工成20-25长度的sirna分子。ShRNA通常有一个茎环结构，即两个反向重复序列由一个短间隔序列连接。

产生RNAi的方法包括化学合成、体外转录、Dicer体外或体内消化长dsRNA、递送载体在体内表达以及从PCR来源RNAi表达盒在体内表达。

RNAi分子的反义区可以完全与目标序列互补，但只要它与目标序列特异性杂交并减少蛋白质产物的产生，如至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，则不需要与目标序列完全互补。在一些实施例中，所述寡核苷酸与目标序列的杂交可在如上文所定义的弱严格性、中等严格性或甚至高等严格性条件下进行。

在其它实施方案中，RNAi的反义区域与目标序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或更高的序列一致性，并减少蛋白质产物的产生至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施例中，与目标序列相比，反义区域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不匹配。不匹配通常在dsRNA末端比在中心部分更容易接受。RNAi分子可以包含修饰糖、修饰核苷酸、骨架连接以及上述反义寡核苷酸的其它修饰。

本发明还提供表达免疫原性多肽的重组病毒载体。异源核酸可编码本领域已知的任何感兴趣的免疫原，包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒、流感病毒、Gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等。或者，该免疫原可呈现在病毒衣壳中，例如，通过共价修饰与病毒外壳结合。

细小病毒用作疫苗为本领域所公知(US5916563、US5905040、US5882652)。抗原可能存在于病毒衣壳中，或者抗原可以从引入重组载体基因组的异源核酸中表达。

免疫原性多肽或免疫原可以是任何适用于保护受试者免受疾病的多肽，包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和病毒性疾病。免疫原可以是原粘液病毒免疫原，例如，流感病毒免疫原，流感病毒血凝素表面蛋白或流感病毒核蛋白基因；或慢病毒免疫原，例如，马传染性贫血病毒免疫原、猿免疫缺陷病毒免疫原或人类免疫缺陷病毒免疫原；或沙粒病毒免疫原，例如，拉沙热病毒免疫原；或痘病毒免疫原、黄病毒免疫原、丝状病毒免疫原、布尼亚病毒免疫原、冠状病毒免疫原或严重急性呼吸综合征免疫原。免疫原还可以是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎免疫原或本领域已知的任何其它疫苗免疫原。

或者，免疫原可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌抗原表达于癌细胞表面。示例性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、GP100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、3-连环蛋白、MUM-1、caspase-8、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑色素瘤肿瘤抗原、HER-2/neu基因产物、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤抑制蛋白、粘蛋白抗原、端粒酶、核基质蛋白、前列腺酸磷酸酶、乳头瘤病毒抗原、以及与下列癌症包括黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌、食管癌和头颈癌等相关的抗原。

或者，异源核苷酸序列可以编码在体外或体内细胞中产生的任何多肽。例如，可将病毒载体引入培养细胞，并从中分离出表达的蛋白产物。

本领域的技术人员理解，感兴趣的异源核酸可与适当的控制序列进行可操作性连接。例如，异源核酸可能与转录翻译控制信号、复制起源、多聚腺苷酸化信号、内核糖体进入位点、启动子、增强子等表达控制元件相连接。

本领域的技术人员将进一步理解，根据所需的表达水平和组织特异性表达，可以使用各种启动子/增强子元件。启动子/增强子可能是组成型或诱导型，这取决于所需的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外来的，也可以是自然的或合成的序列。

启动子/增强子元件可以是靶细胞或受试者固有的，也可以是异源核酸序列固有的。通常选择启动子/增强子元件，使其在感兴趣的目标细胞中发挥作用。在代表性的实施例中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件，启动子/增强元件可以是组成型或可诱导型。

诱导表达控制元件通常用于那些需要调节异源核酸序列过度表达的应用中。用于基因传递的可诱导启动子/增强子元件可以是组织特异性或组织优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选、神经组织特异性或优选、眼睛(包括视网膜特异性和角膜性)特异性或优选、肝脏特异性或优选、骨髓特异性或优选、胰腺特异性或优选、脾脏特异性或优选、肺特异性或优选。其它可诱导的启动子/增强子元件包括激素诱导和金属诱导元件。示例性诱导启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导启动子、雷帕霉素诱导启动子和金属硫蛋白启动子。

在将异源核酸序列转录并在目标细胞中翻译的实施例中，通常使用特定的起始信号来有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些外源翻译控制序列，可能包括ATG起始密码子和相邻序列，可以起始的多种形式，包括天然的和合成的。

本发明提供包含一种嵌合AAV衣壳和一种AAV基因组的嵌合AAV粒子。本发明还提供了所述嵌合AAV颗粒的集合或库，其中所述集合或库包含2个或更多、10个或更多、50个或更多、10²个或更多、10³个或更多、10⁴或更多、10⁵或更多、或10⁶或更多不同的序列。

本发明还包括“空”衣壳粒子，其包含、组成或基本上由本发明的嵌合AAV衣壳蛋白组成，参见美国专利US5863541所述。本发明的嵌合AAV衣壳可用作“衣壳运载体”，可被共价连接、结合或包装并转移到细胞中的分子包括DNA、RNA、脂质、碳水化合物、多肽、小有机分子或这些分子的组合。此外，分子可以与病毒衣壳的外部相关联，以便将分子转移到宿主的靶细胞中。在本发明的一个实施例中，分子与衣壳蛋白共价连接。共价连接分子的方法已为本领域的技术人员所熟知。

本发明的病毒衣壳还可用于提高针对新的衣壳结构的抗体。作为另一种选择，可以将外源氨基酸序列插入病毒衣壳中，以便将抗原呈递给细胞，例如给受试者施用以产生对外源氨基酸序列的免疫反应。

本发明还提供了编码本发明的嵌合衣壳蛋白的核酸。进一步提供包含所述核酸的载体和包含本发明核酸和/或载体的细胞。例如，所述核酸、载体和细胞可用做产生本文所述病毒载体的试剂。

在示例性实施方案中，本发明提供了编码图3B、3D、3F、3H、3J、3L、3N、3P、或3R所示的AAV衣壳的核酸序列。代表性的核酸序列包含或基本上包含分别由图3A(L1)图3C(L4)、图3E(L10)、图3G(L52)、图3I(L58)、图3K(L84)、图3M(L37)、图3O(L107)或图3Q(L57)所示的核苷酸序列，或由这些图所示的核苷酸序列组成，或编码由上述任何一种核苷酸序列编码的AAV衣壳或衣壳蛋白的核苷酸序列，但由于密码子的简并性而与上述核苷酸序列不同，其允许不同的核酸序列编码相同的AAV衣壳。

本发明还提供编码上述AAV衣壳蛋白的变体和融合蛋白的核酸。在具体实施例中，在本领域技术人员已知的标准条件下，核酸与本文特别公开的核酸序列的互补链杂交，编码变体衣壳蛋白。本文特别公开的核酸序列参见图3A、图3C、图3E、图3G、图3I、图3K、图3M、图3O或图3Q，任选地，所述变体衣壳蛋白实质上保留由图3A、图3C、图3E、图3G、图3I、图3K、图3M、图3O或图3Q所示的核酸序列编码的衣壳蛋白的至少一种性质。例如，变体衣壳蛋白的病毒粒子可以基本上保留包含由如图3A、图3C、图3E、图3G、图3I、图3K、图3M、图3O、图3Q所示的核酸编码序列编码衣壳蛋白的病毒粒子的靶向性特征。这种序列的杂交可以在弱、中甚至严格的条件下进行(Sambrook等，1989，Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2dEd，Cold Spring Harbor Laboratory)。

如本领域所知，可使用许多不同的程序来确定核酸或多肽是否与已知序列具有一致性或相似性百分比。本文所用的百分比标识是指当使用BLASTN与其它核酸比对时，核酸或其片段与另一核酸具有指定的百分比，其中BLASTN程序可通过互联网从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获取。

当提及多肽时，百分比同一性或相似性表明，当与另一种蛋白质或其一部分在使用BLASTP测定的共同长度上进行比较时，所述多肽表现出特定百分比的同一性或相似性。这也可通过互联网从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获取。多肽的一致性或相似性百分比通常用序列分析软件，例如，参见威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包。蛋白质分析软件使用各种替换、缺失和其它修饰的同源性来匹配类似的序列。保守的替换通常包括以下几类中的替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。

在特定实施方案中，核酸可以包含、组成或基本上包含但不限于质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体等载体。病毒载体包含但不限于腺相关病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体或杂合病毒载体。

在一些实施例中，编码嵌合AAV衣壳蛋白的核酸进一步包括AAV Rep蛋白编码序列。

本发明还提供稳定地包含本发明核酸的细胞。例如，核酸可以稳定地转入细胞的基因组中，或者可以稳定地维持在附加体形式，例如，“基于EBV的核附加体”。

核酸可插入递送载体中，例如，病毒递送载体。例如，本发明的核酸可以封装在AAV粒子、腺病毒粒子、疱疹病毒粒子、杆状病毒粒子或任何其它合适的病毒粒子中。

此外，所述核酸可以与启动子元件可操作地连接。

本发明还提供了一种生产本发明病毒载体的方法。在一个有代表性的实施例中，本发明提供了一种生产重组病毒载体的方法，该方法包括在体外向细胞提供，包括异源核酸以及足以将AAV模板包装成病毒粒子的信号序列，例如，AAV末端重复序列；还包括足以将模板复制和包装成病毒粒子的AAV序列，例如AAV Rep序列，和编码本发明的AAV衣壳的序列。该方法还进一步包括从细胞中收集病毒粒子的步骤，病毒颗粒可以从培养基和/或裂解细胞中收集。

在一个说明性的实施方案中，本发明提供了一种制备包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：向体外细胞提供编码本发明的嵌合AAV衣壳的核酸、AAV Rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组，和用于生产感染性AAV的辅助因子，允许AAV载体基因组包封于AAV衣壳中并完成AAV颗粒的组装。

细胞通常是允许AAV病毒复制的细胞。可使用本领域已知的任何适宜细胞，包括但不限于HEK293细胞系、HEK293T细胞系、HEK293A细胞系、HEK293S细胞系、HEK293FT细胞系、HEK293F细胞系、HEK293H细胞系、HeLa细胞系、SF9细胞系、SF21细胞系、SF900细胞系、BHK细胞系中的一种或几种。

AAV复制和衣壳序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前的方法通常在单个质粒上表达AAV rep和cap基因。AAV复制和包装序列不需要一起提供。AAV rep和/或cap基因序列可由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep和/或cap基因序列可由杂交腺病毒或疱疹病毒载体提供。EBV载体也可用于表达AAVcap和/或rep基因序列。作为另一种选择，rep和/或cap基因序列可在细胞内稳定存在，处于游离或整合状态。

通常AAV rep和/或cap基因序列不会被AAV包装序列所包围，以防止对这些序列进行救援和/或包装。

模板或载体基因组可以使用本领域已知的任何方法提供给细胞。模板或载体基因组可由非病毒载体或病毒载体提供。在具体实施例中，模板或载体基因组由疱疹病毒或腺病毒载体提供。杆状病毒载体、EBV载体也可用于传递模板或载体基因组。在另一个代表性实施例中，模板或载体基因组由复制的rAAV病毒提供。在其它实施例中，AAV原病毒稳定地整合到细胞的染色体中。

为了获得最大的病毒滴度，通常向细胞提供辅助病毒，例如腺病毒或疱疹病毒，这些辅助病毒是产生感染性AAV所必需的。本领域已知的用于AAV复制所必需的辅助病毒序列，通常由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。可选择地，腺病毒或疱疹病毒序列可由另一非病毒或病毒载体提供(Ferrari等，1997，Nature Med.3:1295)。此外，辅助病毒功能可由辅助基因整合在包装细胞的染色体中来提供或作为稳定的染色体外元件来维持。

本领域技术人员理解，在单个辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列以及辅助病毒序列可能是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体，也可以选择是包含AAVrep/cap基因序列的杂交腺病毒或杂交疱疹病毒。

在一个具体实施例中，AAV rep和/或cap基因序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。这个载体进一步包含rAAV基因组模板。可将AAV rep和/或cap序列和/或rAAV模板插入腺病毒的删除区域，例如，Ela或E3区域。

在另一个实施例中，AAV rep和/或cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。rAAV基因组模板由质粒提供。在另一个说明性实施例中，AAV rep和/或cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且rAAV基因组模板作为前体整合到细胞中。或者，rAAV模板由作为染色体外元件维持在细胞内的EBV载体提供。在另一个示例性实施例中，AAV rep和/或cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒载体提供。rAAV基因组模板作为单独的复制病毒载体提供。例如，rAAV模板可以由rAAV粒子或第二种重组腺病毒粒子提供。

疱疹病毒也可用作AAV包装方法中的辅助病毒。

作为另一种替代方法，本发明的病毒载体可在昆虫细胞中使用杆状病毒载体来传递rep和/或cap基因和rAAV模板(Urabe等，2002，Human Gene Therapy 13:1935-1943)。

生产AAV的其它方法也可以使用稳定转化的包装细胞(参见美国专US5658785)。

无辅助病毒污染的AAV载体可通过本领域已知的任何方法获得。例如，AAV和辅助病毒可以很容易地根据大小进行区分。也可根据对肝素底物的亲和力将AAV与辅助病毒分离。在代表性实施例中，使用复制缺陷辅助病毒，使得任何污染的辅助病毒都不能复制。作为另一种选择，可以使用缺乏晚期基因表达的辅助腺病毒，因为只有腺病毒早期基因表达介导AAV病毒的包装。本领域已知对晚期基因表达有缺陷的腺病毒突变体，例如，TS100K和TS149腺病毒突变体。

本发明的包装方法可用于生产高滴度病毒粒子。在具体实施例中，病毒储备液的滴度至少为约10⁵Tu/ml、至少约10⁶Tu/ml、至少约10⁷Tu/ml、至少约10⁸Tu/ml、至少约10⁹Tu/ml、至少约10¹⁰Tu/ml。

新型的衣壳蛋白和衣壳结构可用于产生抗体，例如用于诊断或治疗用途或用做研究试剂。因此，本发明还提供了针对本发明的新型衣壳蛋白的抗体。

本文所用术语“抗体”或“抗体片段”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可为单克隆或多克隆，且可为来源于任何物种，包括小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊、鸡、猴、羊驼或人类，或可为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体。抗体可以是重组单克隆抗体、或从噬菌体库、酵母库、哺乳细胞展示库中筛选。

包括在本发明范围内的抗体片段包括Fab、F(ab’)₂和Fc片段，以及从除IgG以外的抗体获得的相应片段。这种片段可以通过已知的技术产生。例如，F(ab’)₂片段可由抗体分子通过胃蛋白酶消化产生，Fab片段可通过减少F(ab’)₂片段的二硫键生成。或者，可以构建Fab表达库，以便快速、容易地识别具有所需特异性的单克隆Fab片段。

多克隆抗体可以通过病毒免疫合适的动物，例如兔、山羊等，从动物收集免疫血清，并从免疫血清中分离所得。

本发明还包括将异源核苷酸序列传递至广泛细胞范围的方法，包括分裂细胞和非分裂细胞。本发明的病毒载体可用于向体外细胞递送感兴趣的核苷酸序列，例如，在体外产生多肽或用于体外基因治疗。载体还可用于将核苷酸序列传递给需要个体的方法中，例如，表达免疫原性或治疗性多肽。

一般而言，本发明病毒载体可用于递送具有生物效应的任何外源核酸以治疗或改善与基因表达相关的任何疾病。此外，本发明可用于治疗递送治疗性多肽可改善的任何疾病。示例性疾病症状包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和肺部其它疾病、血友病A(因子VIII)、血友病B(因子IX)、地中海贫血(β-珠蛋白)、贫血(促红细胞生成素)和其它血液疾病、老年痴呆症(GDF)、多发性硬化症(β-干扰素)、帕金森氏病(神经胶质细胞源性神经营养因子)、亨廷顿氏病(消除重复的抑制性RNA，包括但不限于RNAi，如sirna或shrna、反义RNA或microRNA)、肌萎缩侧索硬化症、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其它神经疾病、癌症(内皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配体、包括干扰素的细胞因子、抑制VEGF的抑制性RNA包括但不限于siRNA、shRNA、反义RNA、microRNA、多重耐药基因产物、癌症免疫原)、糖尿病(胰岛素、PGC-α1、GLP-1、肌抑素前体肽、葡萄糖转运蛋白)、肌营养不良包括杜氏肌营养不良和贝克肌营养不良(例如肌萎缩蛋白、mini-萎缩蛋白、micro-肌萎缩蛋白、胰岛素样生长因子等)、糖原贮积病例如Fabry病(α-半乳糖苷酶)和Pompe病(溶酶体酸α-葡萄糖苷酶)、先天性肺气肿(抗胰蛋白酶)、Lesch-Nyhan综合征(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)、Niemann-Pick病(神经鞘磷脂酶)、视网膜退行性疾病以及眼睛和视网膜的其它疾病(治疗黄斑变性的PDGF、内皮抑素和/或血管抑素)、星形细胞瘤(内皮抑素、血管抑素和/或抑制VEGF的RNAi)、胶质母细胞瘤(内皮生长因子、血管内皮生长因子和/或RNAi抗血管内皮生长因子)、肝脏(用于乙肝和/或丙肝基因的RNAi，例如siRNA或shRNA、microRNA或反义RNA)、充血性心力衰竭或外周动脉疾病(磷酸酶蛋白抑制剂I、磷脂酶、肌浆内网Ca2-ATPase、调节磷脂酶基因的锌指蛋白、磷脂酶抑制剂等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、艾滋病(可溶性CD4)、肌肉萎缩(胰岛素样生长因子I、肌生长抑制素前肽、抗凋亡因子等)、肢体缺血(VEGF、FGF、PGC-Iα、EC-SOD、HIF)、肾虚(促红细胞生成素)、关节炎(IRAP和TNFα等可溶性受体等抗炎因子)、肝炎(α-干扰素)、低密度脂蛋白受体缺乏(LDL受体)、高氨血症(鸟氨酸转氨酶)、苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)、自身免疫性疾病等。

本发明还可在器官移植后用于增加移植的成功率和/或减少器官移植或辅助疗法的副作用，例如，通过给予免疫抑制剂或抑制性核酸来阻断细胞因子产物。

基因转移在认识和治疗疾病方面有着巨大的潜在用途。有许多遗传性疾病中有缺陷的基因是已知的，并且已经被克隆。一般来说，上述疾病状态分为两类：第一为缺陷状态，通常为酶缺陷，通常以隐性方式遗传；第二为不平衡状态，可能涉及调节蛋白或结构蛋白，通常以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病，基因转移可将正常基因带到受影响的组织中进行替代治疗，以及使用抑制性RNA为疾病创建动物模型，抑制性RNA包括siRNA或shRNA、microRNA或反义RNA。对于不平衡的疾病状态，基因转移可用于在模型系统中创建疾病状态，然后可用于治疗疾病状态。因此，根据本发明的病毒载体允许治疗遗传疾病。如本文所用，通过部分或全部补救疾病或使疾病更严重的缺陷或失衡来治疗疾病状态。

此外，本发明的病毒载体在诊断和筛选方法中有进一步用途，其中感兴趣的基因在细胞培养系统或转基因动物模型中短暂或稳定地表达。本发明还可用于递送核酸以用于蛋白质生产，例如用于实验室、工业或商业目的。

或者，可将病毒载体投予细胞并且将改变的细胞投予个体。将异源核酸引入细胞，并将细胞给予受试者，其中任选地表达编码免疫原的异源核酸并诱导受试者对免疫原的免疫反应。在具体实施例中，所述细胞是抗原呈递细胞，例如树突细胞。

“主动免疫反应”或“主动免疫”的特征是“与免疫原接触后宿主组织和细胞的参与”。它涉及到淋巴组织中免疫调节细胞的分化和增殖，从而导致抗体的合成或细胞介导的反应，或两者兼而有之。或者，宿主通过感染或接种疫苗暴露于免疫原后，会产生积极的免疫反应。主动免疫可与被动免疫形成对比，后者是通过“将预先形成的物质，例如抗体、转移因子、胸腺移植物、白细胞介素-2，从主动免疫宿主转移到非免疫宿主”获得的。

本文所用的“保护性”免疫反应或“保护性”免疫表明，免疫反应给予受试者一些益处，因为它可以预防或降低疾病的发生率。或者，保护性免疫反应或保护性免疫可用于治疗疾病，特别是癌症或肿瘤，例如，引起癌症或肿瘤的消退和/或防止转移和/或防止转移结节的生长。只要治疗的益处大于缺点，保护作用可以是完全的或部分的。

本发明病毒载体也可通过投予癌细胞抗原或免疫相似分子或任何其它免疫原来用于癌症免疫治疗，对癌细胞产生免疫反应。举例而言，在治疗癌症患者时，可通过投予包含编码癌细胞抗原异源核苷酸序列的病毒载体来产生针对个体中癌细胞抗原的免疫反应。如本文所述，病毒载体可在体外或通过活体外方法投予个体。

如本文所用，“癌症”一词包括形成肿瘤的癌症。同样，“癌组织”一词也包括肿瘤。“癌细胞抗原”包括肿瘤抗原。

术语“癌症”在本领域中具有其理解的含义，例如，具有扩散或转移到身体遥远部位的不受控制的组织生长。示例性癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、结直肠癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、骨癌、肉瘤、黑色素瘤、头颈部癌、食管癌、甲状腺癌等。在本发明实施例中，本发明实施于治疗和/或预防肿瘤形成癌症。

癌细胞抗原已在上文中进行了描述。术语“治疗癌症”，旨在降低癌症的严重程度，预防或至少部分消除癌症。例如，在特定情况下，这些术语表明癌症的治疗是预防或减少的，或至少部分消除的。在又一代表性实施例中，这些术语表明阻止或减少或至少部分地消除转移结节的生长，例如，在外科切除原发肿瘤后。根据“预防癌症”术语，旨在至少部分地消除或减少癌症的发生率或发病率。或者说，受试者的癌症发病或进展可能被减缓、控制、可能性或概率降低或延迟。

在具体实施例中，细胞可从患有癌症的个体中移出并与本发明的病毒载体接触。然后将修饰后的细胞给予受试者，由此引发对癌细胞抗原的免疫反应。这种方法特别适用于免疫功能低下的受试者，这些受试者在体内不能产生足够的免疫反应，即不能产生足够数量的增强抗体。

本领域已知免疫调节性细胞因子，例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白细胞介素-lα、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8，白细胞介素-9，白细胞介素-10，白细胞介素-11，白细胞介素12，白细胞介素-13，白细胞介素-14，白细胞介素-18，B细胞生长因子，CD40配体，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，单核细胞趋化蛋白-1，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，和淋巴毒素，和免疫调节性细胞因子，例如CTL诱导性细胞因子，可与病毒载体一起给予受试者。

细胞因子可以通过本领域已知的任何方法进行注射。可以将外源性细胞因子注射到受试者体内，或者使用合适的载体将编码细胞因子的核苷酸序列传递给受试者，并在体内产生细胞因子。

根据本发明的重组病毒载体可在兽医和医学中应用。适合的对象包括鸟类和哺乳动物。本文所用术语“鸟类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、野鸡、鹦鹉。本文所用术语“哺乳动物”包括但不限于人类、灵长类、非人类灵长类、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔子、啮齿动物等。人类受试者包括新生儿、婴儿、少年和成人。任选地，所述“需要”本发明方法的个体，例如，因为所述个体具有或被认为具有包括本发明所述的疾病风险，或者将从包括本发明所述的核酸递送中受益。作为进一步的选择，受试者可以是实验室动物和/或疾病的动物模型。

在具体实施例中，本发明提供包含本发明病毒载体的药物组合物，所述病毒载体位于药学上可接受的载体中，并且任选的包括其它药剂、稳定剂、缓冲剂、载体、佐剂、稀释剂等，用于注射的载体通常是液体。对于其它的方法，运输载体既可以是固体的，也可以是液体的。吸入给药时，载体将是可呼吸的，最好是固体或液体微粒形式。

“药学上可接受”是指一种无毒或无其它不需要特性的材料，即，该材料可以给受试者服用而不会产生任何不需要的生物效应。

本发明的一个方面是在体外将核苷酸序列转移到细胞的方法。病毒载体可根据适合特定靶细胞的标准转导方法以适当的感染倍数导入细胞。要施用的病毒载体或衣壳的滴度可根据目标细胞类型和数量以及特定病毒载体或衣壳而变化。在具体实施例中，将至少约10³感染单位、更优选地至少约10⁵感染单位导入细胞。

要导入病毒载体的细胞可以是任何类型的，包括但不限于神经细胞，包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞，例如神经元、寡树突细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞，肺细胞、包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞的眼部细胞、包括肠和呼吸上皮细胞的上皮细胞、包括成肌细胞，肌管和肌纤维的骨骼肌细胞、膈肌细胞、树突细胞、包括胰岛细胞的胰腺细胞、肝细胞、包括平滑肌细胞和上皮细胞的胃肠道细胞、包括心肌细胞的心脏细胞、骨髓细胞、造血干细胞、脾细胞、角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、包括例如软骨、半月板、滑膜和骨髓的关节细胞、生殖细胞等。作为另一种选择，细胞可以是干细胞，例如，神经干细胞、肝干细胞。作为另一种选择，细胞可以是癌症或肿瘤细胞，如上所述的癌症和肿瘤。此外，如上所述，细胞可以来自任何物种的来源。

可将病毒载体引入离体细胞以向个体投予经修饰的细胞。在具体实施例中，将细胞从个体中移出，在其中导入病毒载体，然后将细胞回输回个体中。从受试者身上移出细胞用于活体外治疗，然后再导入受试者的方法为本领域所知，参见例如美国专利US5399346。或者，将重组病毒载体导入来自另一个体的细胞、培养细胞或来自任何其它合适来源的细胞中，并且将细胞给予需要的个体。

适合于体外基因治疗的细胞如上文所述。给予受试者的细胞剂量将随受试者的年龄、条件和种类、细胞类型、细胞表达的核酸、给药方式等而变化。通常，在药学上可接受的载体中，每剂量至少给药10²至10⁸或约10³至约10⁶个细胞。在具体实施例中，将用病毒载体转导的细胞与药物载体组合以有效量给予个体。

本发明的另一方面是向受试者施用本发明病毒载体或衣壳的方法。在具体实施例中，所述方法包括将感兴趣的核酸传递给动物个体的方法，所述方法包括：向动物个体施用有效量的本发明病毒载体。可通过本领域已知的任何方法将本发明病毒载体投予人类个体或需要其的动物。任选地，病毒载体以有效剂量在药学上可接受的载体中递送。

本发明病毒载体可进一步投予个体以引起免疫原性反应，例如，作为疫苗。通常，本发明疫苗包含有效量的病毒与药学上可接受的载体组合。任选地，剂量足以产生保护性免疫反应。只要给予免疫原性多肽的益处大于其任何缺陷，所给予的保护程度就不必是完全的或永久的。受试者和免疫原如上文所述。

给受试者注射的病毒载体的剂量将取决于给药方式、待治疗的疾病或状况、个体的情况、特定的病毒载体和待递送的核酸，并且可以常规方式确定。达到治疗效果的示范性剂量是至少约10⁵，10⁶，10⁷，10⁸，10⁹，10¹⁰，10¹¹，10¹²，10¹³，10¹⁴，10¹⁵Tu或更多的病毒滴度，优选约10⁷或10⁸～10¹²，10¹³或10¹⁴Tu、更优选约10¹²Tu的病毒滴度。

在具体实施例中，可以使用不止一次的给药，例如，两次、三次、四次或更多次给药，可以在不同的时间间隔内来实现所需的基因表达水平。

给药方式的实例包括口服、直肠、粘膜、外用、鼻内、吸入、口腔、阴道、鞘内、眼内、经皮、子宫内、肠外、静脉内、皮下、皮内、肌肉内、皮内、胸膜内、脑内和关节内、皮肤和粘膜表面、内淋巴管内等，以及直接组织或器官注射，例如在肝、骨骼肌、心肌、膈肌或脑内直接注射。也可对肿瘤施用，例如，在肿瘤或淋巴结内或附近注射。在任何给定情况下，最合适的路径将取决于所治疗条件的性质和严重性以及所使用的特定载体的性质。

注射物可以常规形式制备，既可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适合于注射前液体溶液或悬浮液的固体形式，或者是乳状液。或者，可以局部而不是全身性的方式来施用病毒载体，例如，以一种特定的方式，如缓释制剂。此外，病毒载体可以干燥形式输送至外科植入基质，例如骨移植替代物、缝合线、支架等。

适于经口服给药的医药组合物可以离散单位呈现，例如胶囊、缓存剂、含片或片剂，每一单位均包含预定量的本发明组合物。作为粉末或颗粒、作为水性液体或非水性液体的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水乳化液。口服可通过将本发明病毒载体复合到能够抵抗动物肠道内消化酶降解的载体来完成。此类载体的实例包括本领域已知的胶囊或片剂。此类制剂是通过任何合适的药学方法制备的，所述方法包括将所述成分与合适的载体结合起来的步骤，所述载体可包含一种或多种如上文所述的辅料成分。一般而言，根据本发明实施例的药物组合物是通过将所述组合物与液体或细分固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后对所得混合物进行成形来制备的。例如，可以通过压缩或成型含有所述组合物的粉末或颗粒来制备片剂，可以选择使用一种或多种辅料成分。压片是通过在适当的机器中压缩自由流动形式的组合物来制备的，例如任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂混合的粉末或颗粒。通过在适当的机器中用惰性液体粘合剂湿润粉末状化合物来成型片剂。

适用于口腔给药的药物组合物包括含片，其在调味基中包含本发明的成分，调味基通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶，以及包含如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶惰性基成分的锭剂。

适于非经肠给药的药物组合物可包含本发明组合物的无菌水性和非水性注射溶液，所述制剂任选地与预期受体的血液等渗。这些制剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使成分与预期受体的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液、溶液和乳剂可包括悬浮剂和增稠剂。非水溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道药物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉注射的载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的补充剂等。防腐剂和其它添加剂例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等也可存在。

这些成分可以单位剂量或多剂量容器表示，例如，在密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥条件下，只需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如，盐水或注射用水。

临时注射溶液和悬浮液可由上述无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，可以在密封容器中以单位剂量形式提供本发明的可注射、稳定、无菌的组合物。所述组合物可以冻干物的形式提供，所述冻干物可以用合适的药学上可接受的载体重组，以形成适于注射到个体中的液体组合物。单位剂型可为本发明组合物的约1μg至约10g。当所述组合物基本上不溶于水时，可以加入生理上可接受的足够量的乳化剂，以使所述组合物在水性载体中乳化。其中一种有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。

适用于直肠给药的药物成分可以用单位剂量栓剂表示。这些可以通过将该组分与一种或多种传统固体载体混合，然后形成所得到的混合物来制备。

本发明的适合局部应用于皮肤的药物组合物可以采取软膏、乳膏、乳液、糊剂、凝胶、喷雾、气雾剂或油的形式。可使用的载体包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类、透皮增强剂和其两种或两种以上的组合。例如，在一些实施例中，局部递送可通过将本发明的药物组合物与能够进入皮肤的亲脂性试剂混合来执行。

适合经皮给药的药物成分可以是离散的贴片形式，适合与受试者的表皮长时间保持密切接触。适合经皮给药的组合物也可以通过离子导入递送，并且通常采用本发明组合物的任选缓冲水溶液的形式。适宜调配物可包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲液或乙醇/水，且可含有0.1至0.2M活性成分。

本文所揭示之病毒载体可通过任何适宜方法投予个体之肺，例如投予由该个体吸入的病毒载体组成的可呼吸粒子的悬浮液。可吸入颗粒物可以是液体或固体。包含病毒载体的液体粒子的气溶胶可以通过任何适当的方法产生，例如使用本领域技术人员已知的压力驱动气溶胶雾化器或超声波雾化器。包含病毒载体的固体颗粒的气溶胶同样可以通过医药领域已知的技术与任何固体颗粒药物气溶胶发生器一起产生。

III嵌合AAV衣壳病毒载体的定向进化和体内筛选方法

本发明还包括一种方法，用于制备包含嵌合AAV衣壳的病毒库，然后在体内筛选具有一种或多种所需特性的嵌合AAV衣壳或病毒。所需特性的非限制性例子包括靶向性特征、逃避中和抗体的能力以及改善细胞内运输等。

在代表性的实施方案中，本发明提供了一种识别感兴趣特性的病毒载体的方法，例如，一种识别感兴趣特性的AAV载体或AAV衣壳的方法，该方法包括：

第一，提供病毒载体例如AAV颗粒的集合，其中该集合内的每个AAV载体包括：包含通过对两种或多种不同AAV的衣壳编码序列进行改组而产生的衣壳蛋白，其中所述两种或多种不同AAV的衣壳氨基酸序列相差至少两个氨基酸；和病毒载体基因组，例如AAV载体基因组，所述病毒载体基因组包含前述改组产生的AAV衣壳蛋白编码序列、一种AAV Rep的编码序列以及至少一个末端重复例如AAV的5’和/或3’末端重复，其中所述病毒载体基因组包裹于AAV衣壳中。

第二，向受试者施用病毒载体的集合；

第三，从目标组织中回收多个作为病毒粒子或作为编码AAV衣壳的病毒载体基因组的病毒载体,从而鉴定具有感兴趣特性的病毒载体或AAV衣壳。

本发明还可用于识别一种在体内具有逃避中和抗体能力的嵌合AAV衣壳或病毒颗粒，例如，在人血清中发现的中和抗体。例如，可通过向受试者注射人类免疫球蛋白来进行对中和抗体抗性的体内筛选。例如，向非人类哺乳动物受试者注射IVIG。IVIG天然含有针对人类所有常见AAV的抗体混合物。或者，可以给受试者注射特定的中和抗体，然后将嵌合病毒库注射到受试者中，对进入感兴趣的目标组织(例如心脏、骨骼肌、肝脏等)的病毒基因组进行选择，从目标组织分离出的基因组与能够逃避中和的衣壳相对应。

因此，在具有代表性的实施例中，本发明提供了一种识别具有逃避中和IgGs能力的嵌合AAV衣壳或病毒载体的方法，所述方法包括：

第一，向哺乳动物个体施用IgGs；

第二，提供病毒载体例如AAV颗粒的集合，其中该集合内的每个AAV载体包括：包含由通过对两种或多种不同AAV的衣壳编码序列进行改组而产生的衣壳蛋白，其中所述两种或多种不同AAV的衣壳氨基酸序列相差至少两个氨基酸；和病毒载体基因组，例如AAV载体基因组，所述病毒载体基因组包含前述改组产生的AAV衣壳蛋白编码序列、一种AAV Rep的编码序列以及至少一个末端重复例如AAV的5’和/或3’末端重复，其中所述病毒载体基因组包裹于AAV衣壳中。

第三，向受试者施用病毒载体的集合；

第四，从目标组织中回收多个作为病毒粒子或作为编码AAV衣壳的病毒载体基因组的病毒载体，从而鉴定具有逃避中和抗体特性的病毒载体或AAV衣壳。

“逃避”中和抗体，意指与适当的对照组相比，中和至少部分减少，但只要中和程度与对照组相比有所降低，并且只要一些载体能够到达并转导目标组织，则“逃避”的程度就不需要完全。

在具体实施例中，目标组织是肝脏、骨骼肌、心肌、横膈膜肌、肾脏、胰腺、脾脏、胃肠道、肺、关节组织、舌头、卵巢、睾丸、生殖细胞、癌细胞或上述的组合。

两个或多个AAV衣壳的任意组合的序列，无论是自然发生的还是修改的，无论是现在已知的还是以后发现的，都可以被“改组”来产生包含嵌合衣壳的AAV载体集合。在代表性实施例中，AAV载体的集合包含通过从以下两个或多个衣壳序列改组而生成嵌合衣壳，所述AAV衣壳包括：AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、鹅AAV或蛇AAV。如上所述，AAV衣壳的集合可以进一步包含目前已知或后来发现的非自然发生的AAV衣壳。这种修饰包括替换，包括修饰核酸和/或氨基酸的替换，以及删除和/或插入。

通过本领域已知的将突变引入核酸和/或氨基酸序列的任何方法，例如使用化学诱变剂、易错的PCR、盒式突变等，可以实现嵌合衣壳的进一步多样性。

任选地，可将体内筛选方法与一轮或多轮体外筛选组合以进一步优化载体。例如，可以进行体内选择，以识别具有所需特性的嵌合AAV衣壳，然后体外选择可用于识别具有逃避抗体中和能力的AAV衣壳。

AAV颗粒的集合可以通过任何合适的方法给受试者服用。在具体实施例中，将集合物投予受试者的血液，例如静脉或关节内。

给药方式和受试者如本文其它地方所述。

本发明可用于在体内识别具有所需特性的嵌合病毒或病毒衣壳。因此，在具体实施例中，本发明的方法包括从两个或多个目标组织中回收AAV粒子或编码相同AAV粒子的病毒基因组，并识别对所述两个或多个目标组织具有所需特性的嵌合病毒或嵌合AAV衣壳。例如，在具体实施例中，识别对骨骼肌和/或心肌具有低效靶向性和或对肝脏具有高效靶向性的嵌合病毒或嵌合AAV衣壳。

目标细胞或组织或其之一也可以是癌细胞或肿瘤组织。例如，可以对癌症的动物模型施用嵌合病毒，并且从癌细胞或肿瘤中分离编码该病毒的嵌合病毒外壳或病毒基因组。在具有代表性的实施例中，动物模型可以是具有增加形成癌症或肿瘤可能性的模型，或者可以是将人类肿瘤细胞移植到动物中的异种移植模型。

DNA“改组”或“嵌合“的示例性方法，也称为“分子育种”、“快速强制进化”等，在本领域是已知的(US5605793、US6165793、US6117679，Stemmer,1994，Proc.Nati.Acad.Sci91:10747-10751，和Soong等,2000，Nature Genetics 25:436-439)。这种方法也被应用于病毒的定向进化(美国专利US6096548，美国专利US6596539)。在一个代表性实施例中，通过同源和/或非同源重组将AAV衣壳蛋白编码序列的集合在体外片段化和重组，以形成“嵌合”AAV衣壳蛋白的集合。每个嵌合衣壳包裹一种包含相应衣壳编码序列的核酸，例如AAV基因组，从而生成嵌合病毒。嵌合病毒集合被施用于受试者，并根据感兴趣的特性进行体内选择。例如，可以从一个或多个靶组织中分离出嵌合病毒，以识别具有所需特性的优化的衣壳蛋白。

Ⅳ具体实施方式

在一方面，本发明提供了一种编码AAV衣壳蛋白的核酸，所述核酸包含选自以下组中任一核苷酸序列：

(a)核苷酸序列SEQ ID NO:1；

(b)核苷酸序列SEQ ID NO:3；

(c)核苷酸序列SEQ ID NO:5；

(d)核苷酸序列SEQ ID NO:7；

(e)核苷酸序列SEQ ID NO:9；

(f)核苷酸序列SEQ ID NO:11；

(g)核苷酸序列SEQ ID NO:13；

(h)核苷酸序列SEQ ID NO:15；

(i)核苷酸序列SEQ ID NO:17；或

(j)由(a)-(i)任一核苷酸序列编码的AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其因遗传密码的简并性而与(a)-(i)的核苷酸序列不同。

所述核酸为质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体、酵母人工染色体，优选包含有编码序列的AAV载体，更优选地所述核酸还包含一种AAV Rep蛋白的编码序列。

在一方面，本发明还提供一种由以上所述核酸编码的AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，或SEQ ID NO:18中的任一种。优选地，所述AAV衣壳共价连接、结合或包裹一种组合物，所述组合物选自DNA分子、RNA分子、多肽、碳水化合物、脂质体和小的有机分子中的一种或几种。

在另一方面，本发明提供了一种重组病毒粒子，其包含前面所述的核酸和/或衣壳蛋白。所述重组病毒粒子选自重组AAV病毒粒子，重组腺病毒粒子，重组疱疹病毒粒子、重组杆状病毒粒子，或重组杂合病毒粒子。

在另一方面，本发明提供了一种重组AAV病毒粒子，其包含AAV载体基因组和前述AAV衣壳蛋白，其中AAV载体基因组包裹于AAV衣壳中。所述AAV载体基因组中包含异源核酸序列。所述异源核酸序列编码选自反义RNA、microRNA、shRNA、多肽和免疫原中一种或几种。优选地，所述异源核酸序列编码的多肽为治疗性多肽或报告基因，其中所述异源核酸编码的治疗性多肽选自胰岛素、胰高血糖素、生长激素、生长激素释放因子、促红细胞生成素、胰岛素生长因子、转化生长因子α、肝细胞生长因子、酪氨酸羟化酶、血小板生成素、白介素1-白介素25、低密度脂蛋白受体、糖皮质激素受体、维生素D受体、干扰素调节因子、Ⅷ因子、Ⅸ因子、葡萄糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰-CoA羧化酶、β-葡糖苷酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶和溶酶体酶所组成组中的一种或几种。

在一方面，本发明提供一种细胞，其包含前述的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子和/或重组AAV病毒粒子。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含一种药学上可接受载体或辅料和选自权前述的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组AAV病毒粒子和/或前述细胞中的一种或几种。

在另一方面，本发明还提供了前述的核酸、AAV衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组AAV病毒粒子、细胞和/或前述药物组合物中的一种或几种在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自由囊性纤维化和肺部其它疾病、血友病A、血友病B、地中海贫血、贫血和其它血液疾病、老年痴呆症、多发性硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症、癫痫、癌症、糖尿病、肌营养不良、糖原贮积病和其它代谢缺陷、先天性肺气肿、Lesch-Nyhan综合征、Niemann-Pick病、艾滋病、肝炎、高氨血症和脊髓性脑共济失调所组成组中的一种或几种。

在一方面，本发明提供了一种制备重组AAV病毒粒子的方法，所述方法包括在体外给细胞提供一种前述的核酸、一种AAV Rep蛋白的核酸编码序列、一种携带异源核酸序列的AAV载体基因组、有助于产生感染性AAV的辅助因子，以及允许AAV载体基因组包裹于前述核酸编码的AAV衣壳中，并实现重组AAV病毒粒子的组装，所述方法为AAV载体制备系统，包括两质粒包装系统、三质粒包装系统、杆状病毒包装系统和以Ad或HSV为辅毒的AAV包装系统等。

在一方面，本发明还提供了一种在体外向细胞递送异源核酸的方法，所述方法包括向细胞施用前述的核酸、病毒衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组AAV病毒粒子和/或药物组合物，所述细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞，优选人干细胞或肝细胞。

在另一方面，本发明还提供了一种向哺乳动物递送异源核酸的方法，所述方法包括向哺乳动物个体施用有效剂量前述的核酸、病毒衣壳蛋白、重组病毒粒子、重组AAV病毒粒子、前述细胞和/或前述的药物组合物，其中所述哺乳动物为人类个体或灵长类个体。

在描述本发明之后，将在以下实施例中更详细地阐述本发明，这些实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

实施例

下面的实施例描述了通过定向进化和体内筛选方法对AAV衣壳基因进行改组，以产生一组对肝脏靶向性优良或优异的载体。采用DNA改组技术对AAV衣壳基因进行改组并构建AAV衣壳基因库，用于小鼠模型体内筛选。分离小鼠肝脏富集的AAV突变体，并通过对AAV突变体外壳的体外和体内活性测试来对其靶向性进行确定。

实施例1嵌合AAV质粒文库构建

为了获得嵌合的AAV外壳基因Cap，首先利用上游引物primerA和下游引物primerB，分别从不同血清型AAV母本扩增外壳全长基因，选择的母本AAV外壳基因包括AAV1外壳(NCBI SequenceID:AF063497.1，Cap的核酸编码序列2223-4433)、AAV2外壳(NCBISequenceID:AF043303.1，Cap的核酸编码序列2203-4410)、AAV3B外壳(NCBI SequenceID:AF028705.1，Cap的核酸编码序列2208-4418)、AAV7外壳(NCBI SequenceID:AF513851.1，Cap的核酸编码序列2222-4435)、AAV8外壳(NCBI SequenceID:AF513852.1，Cap的核酸编码序列2121-4337)、AAV9外壳(NCBI SequenceID:530579.1，Cap的核酸编码序列1-2211)。上游引物primerA为5’-CCCAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA-3’，下游引物primerB为5’-ATAAGAATGCGGCCGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3’，在primeSTAR Max DNA polymerase(TaKaRa公司，货号R045A)作用下进行PCR扩增，扩增条件：95℃5min 1个循环；98℃8s，60℃5s，72℃15s，35个循环；72℃5min，1个循环。

将扩增获得的Cap基因等质量混合，获得总质量为4ug的DNA模板，用0.04U的DNaseI进行随机破碎消化，通常条件下22℃消化6-8min后，75℃灭活DNaseI酶10min。琼脂糖凝胶电泳获得弥散性的DNA条带，其长度大部分集中在500-1000bp，回收这部分长度范围的DNA片段。

回收的DNA片段首先互为引物进行随机的无引物扩增，为增加其多样性及扩增效率，采用非常规单一退火PCR模式(94℃60s，65℃90s，72℃90s，10个循环；94℃60s，62℃90s，72℃90s，10个循环；94℃60s，59℃90s，72℃90s，10个循环；94℃60s，56℃90s，72℃90s，10个循环；94℃60s，53℃90s，72℃90s，10个循环；94℃60s，50℃90s，72℃90s，10个循环；94℃60s，47℃90s，72℃90s，10个循环)。

以无引物PCR产物为模板，利用上游引物T-primerA(5’-ACGCCTGCCGTTCGACGATTCCCAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA-3’)和下游引物T-primerB(5’-ACGCGCGGATCTTCCAGAGATAAGAATGCGGCCGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3’)，在HiFi DNA聚合酶(TransGenBiotech公司，货号AS131-22)作用下，进行嵌合Cap基因的全长扩增。扩增程序94℃30s，62℃30s，72℃2.5min，共40循环。获得长度约为2500bp的嵌合全长Cap DNA片段，用HindIII和NotI进行双酶切，与经过同样双酶切处理的pSNAV2.3载体(含有单链AAV2基因组ITR及聚合酶Rep基因序列，缺失Cap基因)连接，连接产物电击转化到E.coli HST08细胞中，制备了一个库容大于1E+6个克隆的嵌合型AAV质粒文库。PCR鉴定为阳性克隆的质粒分别进行PstI、HaeIII、TaqI酶切鉴定，观察每个质粒酶切形态差异(图1)，以判定质粒文库的多样性。

实施例2新型AAV病毒文库的包装及滴度检测

上述嵌合质粒文库在helper辅助下进行自我包装复制，包装方法为两步法，首先用文库质粒、R2C2、helper质粒以质量比1:1:2的比例进行转染，包装成AAV中间病毒库，此时组成病毒库的AAV为杂合型AAV，即病毒外壳蛋白不一定是由其包装的基因组表达，收获液进行氯仿抽提纯化后，检测基因组滴度；第二步以感染指数MOI为100感染293T细胞，保证每个细胞感染的病毒基因组拷贝数＜10，此时产生的最终AAV病毒库为纯合型，收获液进行氯仿抽提纯化后，检测基因组滴度(参见Muller等，2003，Nature Biotechnology，21:1040-1046)。在包装时使用文库质粒质量非常低，用来保证每一个新型AAV基因组能够被包装于其自身表达的Cap蛋白形成的外壳内。包装的病毒颗粒能够正常表达外壳蛋白，证明其能够形成完整的病毒外壳，具备感染能力。

取适量纯化AAV样品，按下表(表1)配制DNase I消化反应混合液，37℃孵育30min，75℃孵育10min，失活DNase I。

表1

AAV样品	5μl
		10×Dnase I缓冲液	5μl
Dnase I	1μl
		无Rnase的水	39μl
合计	50μl

处理后的AAV纯化样品稀释适当的倍数后，参照下表(表2)配置Q-PCR反应体系，并按照下列程序进行检测。

表2

其中使用的引物参见下表(表3)：

表3

正向引物(5’-3’)	AAGGTGGTGGATGAGTGCTACA
		反向引物(5’-3’)	TGGAGCTCAGGCTGGGTTT
探针引物	CCCCAATTACTTGCTCC

包装产量结果参见下表(表4)：

表4

病毒载体名称	基因组滴度(vg/ml)
		新型AAV病毒库	2.5E+11

实施例3新型AAV载体在小鼠体内筛选与富集

新型AAV载体包装而成的病毒以1.5E+11vg/只剂量通过尾部静脉注射到8周龄C57BL/6J小鼠体内，进行肝脏靶向筛选与富集。注射三天后处死小鼠，收集全部肝脏组织，液氮匀浆后提取总DNA。再次用T-primerA/T-primerB这对引物进行扩增，扩增后的新型AAV全长Cap基因混合而成的DNA用上述方法构建到pSNAV2.3载体上。通过PCR鉴定获得370个阳性单克隆进行等质量混合，形成第二次的质粒文库。再包装成病毒文库，再次以1.5E+11vg/只尾部静脉注射到8周龄C57BL/6J小鼠体内，注射三天后处死小鼠，收集全部肝脏组织、心脏组织及骨骼肌。分别从以上组织随机挑选100、50、50个阳性克隆进行测序。测序后的阳性克隆用BioEdit，VectorNTI，ClustalX2及TreeViewX进行序列比对分析。

选择肝脏高频出现，心脏和骨骼肌低频出现或不出现的新型AAV载体。共获得9组高频肝脏靶向新型AAV突变体(图2)，分析以上9种新型AAV-Cap突变体的核苷酸序列和氨基酸序列(图3)。由于其它4种包装滴度低，不适合工业化需要。所以，选择其中5种新型AAV，即L37、L57、L58、L107、L10进行后续感染活性测试实验。

实施例4新型AAV对体外人肝细胞系感染活性

4.1采用绿色荧光蛋白检测系统测试新型AAV对体外人肝细胞系感染活性

为了初步测试新型AAV对肝脏靶向性感染活性，首先对6种人正常肝脏或肝癌细胞系进行体外感染活性测试。将获得的新型AAV Cap基因L57、L58、L107、L10分别构建到含有2型AAV Rep的RC质粒载体上，该质粒携带CAG-EGFP外源基因，包装出的病毒命名为AAV2/57、AAV2/58、AAV2/107、AAV2/10，并检测病毒滴度(结果未显示)。

将上述4种携带绿色荧光蛋白的重组新型AAV病毒和携带相同绿色荧光蛋白的AAV2/8重组病毒分别同时感染人多种肝细胞系，感染48小时后，流式检测感染活性。为了避免病毒载体在某一种细胞系上感染效率过低或过饱和，每种细胞系至少使用两种感染指数(MOI)进行感染，从图(4A-4F)可看出，当使用2-3种感染指数感染人肝脏细胞系7721、HepG2、Huh7、L02时，新型AAV2/10、AAV2/57、AAV2/58、AAV2/107对人肝脏细胞系的感染均表现出明显的剂量依赖关系。接下来以其中一种MOI针对每种细胞的感染结果进行描述，其余MOI结果详见图4。

当上述4种重组病毒以感染指数(MOI)为2500感染人肝脏细胞系7402，感染48h后进行流式细胞术检测分析，结果(图4A)显示：在此MOI下，AAV2/10感染效率是AAV2/8感染效率的4.6倍，AAV2/57感染效率是AAV2/8感染效率的2.2倍，AAV2/58感染效率是AAV2/8感染效率的3.9倍，AAV2/107感染效率是AAV2/8感染效率的1.6倍。

当上述4种重组病毒以感染指数(MOI)为2500感染人肝脏细胞系7721，感染48h后进行流式细胞术检测分析，结果(图4B)显示，在此MOI下，AAV2/10感染效率最高，AAV2/107感染效率与其接近，AAV2/10感染效率是AAV2/8感染效率的23.4倍，AAV2/107感染效率是AAV2/8感染效率的21.8倍，AAV2/57感染效率是AAV2/8感染效率的4.6倍，AAV2/58感染效率是AAV2/8感染效率的15.9倍。

当上述4种重组病毒以感染指数(MOI)为2500感染人肝脏细胞系HepG2，感染48h后进行流式细胞术检测分析，结果(图4C)显示，在此MOI下，AAV2/10感染效率最高，AAV2/107感染效率与其接近，AAV2/10感染效率是AAV2/8感染效率的14.8倍，AAV2/107感染效率是AAV2/8感染效率的13.5倍。AAV2/57感染效率是AAV2/8感染效率的5.5倍，AAV2/58感染效率是AAV2/8感染效率的10.9倍。

当上述4种重组病毒以感染指数(MOI)为2500感染人肝脏细胞系Huh7，感染48h后进行流式细胞术检测分析，结果(图4D)显示，在此MOI下AAV2/10感染效率最高，是AAV2/8的31.8倍。AAV2/57感染效率是AAV2/8的1.4倍，AAV2/58感染效率是AAV2/8的6.6倍，AAV2/107感染效率是AAV2/8的19.5倍。

当上述4种重组病毒以感染指数(MOI)为10000感染人肝脏细胞系Huh6，感染48h后进行流式细胞术检测分析，结果(图4E)显示，在此MOI下AAV2/10感染效率最高，AAV2/107感染效率与其接近，AAV2/10感染效率是AAV2/8感染效率的2.9倍，AAV2/107感染效率是AAV2/8感染效率的2.7倍。AAV2/57感染效率是AAV2/8感染效率的1.8倍，AAV2/58感染效率是AAV2/8感染效率的2.6倍。

当上述4种重组病毒以感染指数(MOI)为50000感染人肝脏细胞系L02，感染48h后进行流式细胞术检测分析，结果(图4F)显示，在此MOI下，AAV2/10感染效率最高，是AAV2/8感染效率的42倍，AAV2/107感染效率是AAV2/8感染效率的26.8倍，AAV2/57感染效率是AAV2/8感染效率的2.5倍，AAV2/58感染效率是AAV2/8感染效率的10.8倍。

由以上结果可知，这4种重组新型AAV对人肝细胞或肝癌细胞系感染活性均高于阳性对照AAV2/8。

4.2采用荧光素酶检测系统测试新型AAV对体外人肝细胞系感染活性

将获得的新型AAV Cap基因L37、L57、L58、L107、L10构建到含有2型AAV Rep的RC质粒载体上，该质粒上携带有CAG-Luciferase外源基因，包装出的病毒命名为AAV2/37、AAV2/57、AAV2/58、AAV2/107、AAV2/10，并检测病毒滴度(结果未显示)。上述重组新型AAV病毒以感染指数MOI为500对5种正常肝脏或肝癌细胞系进行感染，48小时后，采用荧光素酶检测系统检测感染活性。在每个检测值上扣除NC背景值之后进行感染活性的比较。

上述5种重组新型AAV病毒对人肝细胞系Huh7感染活性比较，结果(图5A)显示，感染活性由高到低依次为AAV2/10＞AAV2/107＞AAV2/58＞AAV2/37＞AAV2/57。

上述5种重组新型AAV病毒对人肝细胞系7402感染活性比较，结果(图5B)显示，AAV2/10的活性最高，AAV2/107与其接近，AAV2/58与AAV2/37感染活性接近，感染活性由高到低依次是AAV2/10＞AAV2/107＞AAV2/58＞AAV2/37＞AAV2/57。

上述5种重组新型AAV病毒对人肝细胞系7721感染活性比较，结果(图5C)显示，AAV2/10的活性最高，AAV2/58与AAV2/37感染活性接近，感染活性由高到低依次是AAV2/10＞AAV2/107＞AAV2/58＞AAV2/37＞AAV2/57。

上述5种重组新型AAV病毒对人肝细胞系HepG2感染活性比较，结果(图5D)显示，AAV2/10的活性最高，感染活性由高到低依次是AAV2/10＞AAV2/37＞AAV2/107＞AAV2/58＞AAV2/57。

上述5种重组新型AAV病毒在人肝细胞系L02感染活性比较，结果(图5E)显示，AAV2/10的活性最高，感染活性由高到低依次是AAV2/10＞AAV2/107＞AAV2/37＞AAV2/58＞AAV2/57。

由以上结果可知，在上述几种新型AAV中，AAV2/10活性相对最高，AAV2/57活性相对较低。

实施例5新型AAV体内活性测试

5种新型AAV Cap外壳基因L37、L57、L58、L107、L10分别构建到含有2型AAV Rep的RC质粒载体上，该质粒携带CAG-Luciferase外源基因，包装出的病毒命名为AAV2/37、AAV2/57、AAV2/58、AAV2/107、AAV2/10，检测病毒滴度(结果未显示)，并将这些新型AAV病毒进行体内感染活性比较。选择6-8周C57BL/6J小鼠以1E+11vg/只的剂量进行尾部静脉注射，2周后处死小鼠，提取组织DNA，测试肝脏、心脏、骨骼肌中AAV载体基因组拷贝数，并分别测试这3种组织中荧光素酶表达情况。

载体基因组拷贝数检测结果(图6)显示，AAV2/58相较于其它新型AAV在肝脏中的载体基因组拷贝数最高，且与同组的心脏和骨骼肌相比，肝脏中的基因组拷贝数显著升高；虽然AAV2/37、AAV2/57、AAV2/107和AAV2/10载体基因组拷贝数比AAV2/58载体基因组拷贝数低，但相较于同组的心脏和骨骼肌中的基因拷贝数来比，肝脏中的基因组拷贝数较高。

荧光素酶表达情况检测结果(图7A-E)显示，AAV2/37、AAV2/57、AAV2/58、AAV2/107、AAV2/10在肝脏中的荧光素酶表达情况比其在同组的心脏和骨骼肌中荧光素酶的表达水平高。

这些结果表明这5种新型AAV载体都具有优良的肝脏靶向性，且AAV2/10相较于其它新型AAV载体在肝脏中的荧光素酶表达水平最高，其次是AAV2/58，之后是AAV2/37和AAV2/107在肝脏中荧光素酶表达水平接近，AAV2/57相对最低。

实施例6猴血清或人血清中新型AAV中和抗体检测

因为AAV自然被人和其他灵长类感染，产生的针对天然型AAV的中和抗体，会大大降低AAV的半衰期。这里检测新型AAV的中和抗体水平。

6.1猴血清中新型AAV和AAV2/8中和抗体的检测与比较

本实验采用病毒感染，固定其MOI值，将血清进行稀释，检测食蟹猴血清中新型AAV载体与AAV2/8的中和抗体水平。在一系列血清稀释度中找到血清病毒混合物感染细胞效率为病毒无血清感染细胞效率的50％，以此稀释度的倒数作为中和抗体量，针对每种病毒载体评价其中和抗体(参见Lochrie MA等，2006，Virology 353：68-82；Mori S等，2006，Jpn JInfect Dis 59：285-293等)。本实验共对10只食蟹猴血清进行检测，血清系列稀释后，分别判定并比较每个样品中新型AAV的中和抗体与AAV2/8的中和抗体。

具体步骤如下：将获得的新型AAV Cap基因L37、L57、L58、L107、L10分别构建到含有2型AAV Rep的RC质粒载体上，该质粒携带CAG-EGFP外源基因，包装出的病毒命名为AAV2/37、AAV2/57、AAV2/58、AAV2/107、AAV2/10，并检测病毒滴度(结果未显示)。7402细胞接种24孔板，食蟹猴血清样品进行系列稀释，新型AAV病毒AAV2/37、AAV2/57、AAV2/58、AAV2/107、AAV2/10和携带相同绿色荧光蛋白的AAV2/8重组病毒感染指数MOI为2000，稀释的血清样品与病毒液1:1进行混合，混合后37℃共孵育1h，然后细胞中加入血清样品与病毒液的混合液。48h后收获细胞，流式细胞术检测感染效率。

中和抗体检测结果如表5所示，中和抗体量低于5时，视为针对该种病毒中和抗体为阴性。10份血清样本分别编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#，其中7#针对所有病毒载体中和抗体均为阴性；1#、9#针对新型AAV载体中和抗体均为阴性，而针对AAV2/8的中和抗体均为阳性；2#、3#、4#、5#、6#、8#、10#样品的新型AAV中和抗体均明显低于AAV2/8。

因此通过对食蟹猴血清中新型AAV和AAV2/8中和抗体的综合比较，在猴群体中新型AAV的中和抗体明显低于AAV2/8的中和抗体，新型AAV作为药物递送载体，具有更低的免疫原性。

表5食蟹猴10份血清中和抗体检测结果

6.2人血清中新型AAV和AAV2/8中和抗体的检测与比较

本实验采用固定病毒感染指数MOI，将血清进行稀释，检测个体人血清中新型AAV的中和抗体的水平与AAV2/8中和抗体水平。在一系列血清稀释度中找到血清病毒混合物感染细胞效率为病毒无血清感染细胞效率的50％，以此稀释度的倒数作为中和抗体量，针对每种病毒载体评价其中和抗体。本实验共进行10人份血清检测，对血清进行了一系列稀释，分别比较每个样品中新型AAV的中和抗体与AAV2/8的中和抗体。

具体步骤如同6.1中具体步骤所示，不同之处在于，所选用的血清为正常人血清。本实验随机挑选10份正常人血清进行中和抗体实验，分别比较每个样品中新型AAV中和抗体和AAV2/8中和抗体。中和抗体检测结果如表6所示，其中3#样品针对所有病毒中和抗体均表现为阴性；2#样品针对新型AAV中和抗体均为阴性，而针对AAV2/8中和抗体为阳性；1#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#样品针对新型AAV的中和抗体均明显低于AAV2/8的中和抗体。实验结果证明在人类群体中，针对新型AAV的中和抗体与AAV2/8的中和抗体相比较，新型AAV更适合作为药物递送载体，能够降低反应原性。

表6 10份人血清中和抗体检测结果

综合以上结果，通过新型AAV与AAV2/8的血清中中和抗体的比较，新型AAV相比AAV2/8载体具有更低的免疫原性，更适合作为基因治疗载体。

Claims (25)

1.一种核酸，其特征在于，所述核酸包含：

用于编码腺相关病毒衣壳蛋白的由SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；或

由SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列编码的腺相关病毒衣壳蛋白的核苷酸序列，其因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列不同。

2.权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸为质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。

3.权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸为包含有编码序列的腺相关病毒载体。

4.权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸进一步包含一种腺相关病毒Rep蛋白的编码序列。

5.权利要求1所述的由SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列编码的腺相关病毒衣壳蛋白。

6.权利要求5所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

7.权利要求5或6所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白共价连接、结合或包裹一种组合物，所述组合物选自DNA、RNA、多肽、碳水化合物、脂质体和小的有机分子中的一种或几种。

8.一种重组病毒粒子，其特征在于，所述重组病毒粒子包含权利要求1-4中任一所述的核酸和/或权利要求5-7中任一所述的衣壳蛋白。

9.权利要求8所述的重组病毒粒子，其特征在于，所述重组病毒粒子为重组腺相关病毒粒子，重组腺病毒粒子，重组疱疹病毒粒子、重组杆状病毒粒子，或重组杂合病毒粒子。

10.一种重组腺相关病毒粒子，其特征在于，所述重组腺相关病毒粒子包含腺相关病毒载体基因组和权利要求5或6所述的腺相关病毒衣壳蛋白，其中腺相关病毒载体基因组包裹于腺相关病毒衣壳蛋白中。

11.权利要求10所述的重组腺相关病毒粒子，其特征在于，所述腺相关病毒载体基因组中包含异源核酸序列。

12.权利要求11所述的重组腺相关病毒粒子，其特征在于，所述异源核酸序列编码选自反义RNA、microRNA、shRNA、多肽和免疫原中一种或几种。

13.权利要求12所述的重组腺相关病毒粒子，其特征在于，所述异源核酸序列编码的多肽为治疗性多肽或报告基因。

14.权利要求13所述的重组腺相关病毒粒子，其特征在于，所述异源核酸编码的治疗性多肽选自胰岛素、胰高血糖素、生长激素、生长激素释放因子、促红细胞生成素、胰岛素生长因子、转化生长因子α、肝细胞生长因子、酪氨酸羟化酶、血小板生成素、白介素1-白介素25、低密度脂蛋白受体、糖皮质激素受体、维生素D受体、干扰素调节因子、Ⅷ因子、Ⅸ因子、葡萄糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰-CoA羧化酶、β-葡糖苷酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶和溶酶体酶所组成组中的一种或几种。

15.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-4中任一所述的核酸、权利要求5-7中任一所述的腺相关病毒衣壳蛋白、权利要求8-9中任一所述的重组病毒粒子和/或权利要求10-14中任一所述的重组腺相关病毒粒子。

16.权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自大肠杆菌、HEK293细胞系、HEK293T细胞系、HEK293A细胞系、HEK293S细胞系、HEK293FT细胞系、HEK293F细胞系、HEK293H细胞系、HeLa细胞系、SF9细胞系、SF21细胞系、SF900细胞系、BHK细胞系中的一种或几种。

17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含一种药学上可接受载体或辅料和选自权利要求1-4中任一所述的核酸、权利要求5-7中任一所述的腺相关病毒衣壳蛋白、权利要求8-9中任一所述的重组病毒粒子、权利要求10-14中任一所述的重组腺相关病毒粒子和/或权利要求15所述的细胞中的一种或几种。

18.权利要求1-4中任一所述的核酸、权利要求5-7中任一所述的腺相关病毒衣壳蛋白、权利要求8-9中任一所述的重组病毒粒子、权利要求10-14中任一所述的重组腺相关病毒粒子、权利要求15所述的细胞和/或权利要求17所述的药物组合物中的一种或几种在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。

19.权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病选自由囊性纤维化和肺部其它疾病、血友病A、血友病B、贫血和其它血液疾病、多发性硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症、癫痫、癌症、糖尿病、肌营养不良、糖原贮积病和其它代谢缺陷、先天性肺气肿、Lesch-Nyhan综合征、Niemann-Pick病、艾滋病、肝炎、高氨血症和脊髓性脑共济失调所组成组中的一种或几种。

20.一种制备重组腺相关病毒粒子的方法，其特征在于，所述方法包括在体外给细胞提供一种权利要求1所述的核酸、一种腺相关病毒Rep蛋白的核酸编码序列、一种携带异源核酸序列的腺相关病毒载体基因组、有助于产生感染性腺相关病毒的辅助因子，以及允许腺相关病毒载体基因组包裹于权利要求1所述的核酸编码的腺相关病毒衣壳蛋白中，并实现重组腺相关病毒粒子的组装。

21.权利要求20所述的重组腺相关病毒粒子的制备方法，其特征在于，所述方法为腺相关病毒载体制备系统，包括两质粒包装系统、三质粒包装系统、杆状病毒包装系统和以腺病毒或单纯疱疹病毒为辅毒的腺相关病毒包装系统等。

22.一种在体外向细胞递送异源核酸的方法，其特征在于，所述方法包括向细胞施用权利要求1-4中任一所述的核酸、权利要求5-7中任一所述的腺相关病毒衣壳蛋白、权利要求8或9所述的重组病毒粒子、权利要求10-14中任一所述的重组腺相关病毒粒子和/或权利要求17所述的药物组合物。

23.权利要求22所述的向细胞递送异源核酸的方法，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。

24.权利要求23所述的向细胞递送异源核酸的方法，其特征在于，所述细胞是人细胞。

25.权利要求24所述的向细胞递送异源核酸的方法，其特征在于，所述细胞是人干细胞或人肝细胞。

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