JP2023524291A - 異種間適合性アデノ随伴ウイルス組成物およびその使用方法 - Google Patents

異種間適合性アデノ随伴ウイルス組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、共進化したカプシドバリアントタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、医薬組成物、作製方法、およびそのようなものを対象に送達するための方法を提供する。本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からの改変カプシドタンパク質、ならびにそれを含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターに関する。特に、本開示は、哺乳動物対象の任意の細胞または組織型における発現を可能にするようにウイルスベクターに組み込むことができる改変ＡＡＶカプシドタンパク質およびそれを含むカプシドに関する。

Description

米国連邦政府による資金提供に関する説明文
本発明は、米国連邦政府補助金番号Ｒ０１ＨＬ０８９２２１およびＵＧ３ＡＲ０７５３３６の下で政府支援を受けて行ったものであり、補助金番号は、両方とも、米国国立衛生研究所により付与されたものである。米国連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年５月５日に出願した米国仮出願第６３／０２０，０６２号の優先権を主張するものであり、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
開示分野
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からの改変カプシドタンパク質、ならびにそれを含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターに関する。特に、本開示は、哺乳動物対象の任意の細胞または組織型における発現を可能にするようにウイルスベクターに組み込むことができる改変ＡＡＶカプシドタンパク質およびそれを含むカプシドに関する。
電子的に提出する配列表の参照による組込み
電子版の配列表を本明細書とともに提出する。その内容は、それら全体が参照により組み込まれる。電子ファイルは、サイズが６１１キロバイトであり、ファイル名が２１－２００６－ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、様々な疾患の処置のための遺伝子治療剤の主要なプラットフォームになってきた。ＡＡＶに基づく遺伝子治療剤を使用することは、臨床的に成功しているが、この遺伝子送達プラットフォームの使用に伴う制限および課題が依然としてある。例えば、ベクター（ウイルス性または非ウイルス性）を用いる遺伝子治療剤の有効性は、遺伝子を運ぶベクターに対する対象の免疫応答のせいで低下されることもある。加えて、対象の１つまたは複数の標的組織に確実に送達するために投与経路を最適化しなければならない。これは、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の障害を処置することに当てはまる。血液脳関門によって、全身投与されたときのＡＡＶに基づく治療剤のＣＮＳへの到達が妨げられ得、ＣＮＳ組織への直接投与は、侵襲的手術を必要とし得る。さらに、標的ＣＮＳおよびＰＮＳ組織に対する十分な形質導入を生じさせるために必要な高用量のＡＡＶに基づく治療剤は、副作用のリスク、および／または望ましくない免疫応答を増加させる。加えて、高用量のＡＡＶを生産する要求は、製造負担を課す。
公知のＡＡＶ血清型は、各々が特異的組織親和性を有するが、これらのＡＡＶを使用して容易に標的とすることができないいくつかの組織（例えば、腎臓）がある。加えて、心臓、肝臓または肺などの全身臓器におけるＡＡＶ形質導入は、所与の用量について、臨床開発中に使用される様々なモデル生物（例えば、イヌ、ブタ、非ヒト霊長類）の中で、およびヒト対象の中で、かなり異なり得る。このことからヒトへの使用の前に動物モデルでＡＡＶに基づく治療剤を正確に試験することができないことも、問題である。
ＡＡＶ遺伝子導入の応用の範囲が、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ障害への遺伝子治療剤の進展を含めて拡大するにつれて、異なる種にわたるＡＡＶの親和性の差に対処することへの要求が当技術分野には依然としてある。これらの差は、多くの場合、小型動物モデルから大型動物モデルへ拡大した場合、非線形のベクター用量・生体内分布関係を生じさせる結果となる－その後、臨床解釈に影響を及ぼすことになる。しかるが故に、複数の種にわたってより幅広く解釈できるＡＡＶ遺伝子送達プラットフォームを開発することへの満たされていない要求が当技術分野にはある。加えて、目的の組織を、公知のＡＡＶ血清型を使用して標的とすることが困難とされてきた組織を含めて、選択的かつ特異的に標的とすることができる、ＡＡＶに基づく遺伝子治療剤を開発することへの要求がある。
本開示の簡単な概要
本開示は、少なくとも一部は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を含む方法および組成物であって、置換が、これらの改変カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、１つまたは複数の改善された機能性、例えば、これらに限定されないが、宿主抗体から逃れる能力、選択的親和性、および／またはより高い形質導入効率を導入する、方法および組成物を提供する。
本開示の態様は、本明細書で開示されるようなＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態では、本明細書における組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含み得、カプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１９のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書における組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含み、カプシドタンパク質バリアントは、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸は、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている。一部の実施形態では、本明細書における組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含み得、カプシドタンパク質バリアントは、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸は、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている。
一部の実施形態では、本明細書における組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含み、カプシドタンパク質バリアントは、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸は、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されており、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸は、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている。
一部の実施形態では、本明細書における組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含み得、カプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、本明細書における組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含み、カプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して１～１０、１１～２０、２０～３０、もしくは３０～５０のアミノ酸置換を有する配列を有する。
本開示の別の態様は、本明細書で開示されるようなＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを提供する。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１９のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸は、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸は、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し得、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸は、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されていることがあり、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸は、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されていることがある。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して１～１０、１１～２０、２０～３０、もしくは３０～５０のアミノ酸置換を有する配列を有し得る。
本開示の別の態様は、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントおよび／またはＡＡＶベクターのいずれかを含む、医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書における医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
本開示の別の態様は、組換えＡＡＶベクターを標的細胞に導入する方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書における、組換えＡＡＶベクターを標的細胞に導入する方法は、標的細胞を、本明細書で開示される組換えＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／または医薬組成物のいずれかと接触させるステップを含み得る。一部の実施形態では、本明細書における方法は、１つまたは複数の治療用異種分子を対象における標的細胞に送達することができ、方法は、本明細書で開示される組換えＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／または医薬組成物のいずれかを、対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される組換えＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／または医薬組成物のいずれかを、筋肉内注射、静脈内注射、冠動脈内注射、動脈内注射、またはこれらの任意の組合せにより、対象に投与することができる。
本開示の別の態様は、新規アデノ随伴ウイルス株を進化させる方法であって、複数の哺乳動物種にわたってＡＡＶカプシドライブラリーを継代するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、変異を起こしたカプシド遺伝子配列をコードする異なるゲノムをパッケージングするＡＡＶカプシドを含むＡＡＶカプシドライブラリーを利用し得る。一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書におけるＡＡＶカプシドライブラリーを、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）、およびこれらの任意の組合せまたは反復サイクルに投与することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書で開示される方法に従ってＡＡＶカプシドライブラリーを継代することにより、本明細書におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質配列を富化することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、脊髄（例えば、グリア細胞、ニューロン、内皮細胞）、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せからなる群から収集されたまたはそれらに由来する細胞からＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを抽出することにより、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントをコードする配列を富化することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）、およびこれらの任意の組合せまたは反復サイクルからなる群から選択される任意の哺乳動物種において、改善された遺伝子導入効率で、本明細書で開示されるようなＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、細胞型または組織；脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せからなる群、のいずれかにおいて、改善された遺伝子導入効率で、本明細書で開示されるようなＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、細胞型または組織；脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せからなる群、のいずれかにおいて、改善された免疫応答で、本明細書で開示されるようなＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、細胞型または組織；脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せからなる群、のいずれかにおいて、改善された親和性で、本明細書で開示されるようなＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを産生することができる。
本開示の態様は、本明細書で開示される組成物またはＡＡＶベクターのいずれかと、少なくとも１つの容器とを含み得るキットを提供する。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書で提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってよりよく理解され得る本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。
図１Ａおよび１Ｂは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って新規ペプチド置換を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶのライブラリー多様性、定向進化および富化についての分析を示すバブルプロットを例示する。親ライブラリー（図１Ａ）および３サイクルからの進化ライブラリー（図１Ｂ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用するハイスループットシークエンシングに供した。カスタムＰｅｒｌスクリプトでの分析後、富化されたアミノ酸配列をプロットした。各バブルは、明確に異なるカプシドタンパク質アミノ酸配列を表し、バブルの半径は、それぞれのライブラリー内のそのバリアントのリード数に比例する。ｙ軸は、シークエンシング実行からの全リードのパーセンテージを表す。データは、可視化を容易にするためにｘ軸に沿って広がっている。特有のクローンの低減パーセント（９６．５％）は、多数の「適合しない」配列が第１および／または第２の進化ラウンド後に除去されたことを直接示す。主要な単離物をさらなる分析に選択した。図１Ｂに示されているように、次世代シークエンシングは、ＡＡＶｃｃ４７のカプシドタンパク質が、ＡＡＶ ＶＲ４ライブラリーにおいて３つの異なる種での３サイクルの進化後に最も富化されたアミノ酸配列（すなわち、クローン）であったことを明示した。 図１Ａおよび１Ｂは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って新規ペプチド置換を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶのライブラリー多様性、定向進化および富化についての分析を示すバブルプロットを例示する。親ライブラリー（図１Ａ）および３サイクルからの進化ライブラリー（図１Ｂ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用するハイスループットシークエンシングに供した。カスタムＰｅｒｌスクリプトでの分析後、富化されたアミノ酸配列をプロットした。各バブルは、明確に異なるカプシドタンパク質アミノ酸配列を表し、バブルの半径は、それぞれのライブラリー内のそのバリアントのリード数に比例する。ｙ軸は、シークエンシング実行からの全リードのパーセンテージを表す。データは、可視化を容易にするためにｘ軸に沿って広がっている。特有のクローンの低減パーセント（９６．５％）は、多数の「適合しない」配列が第１および／または第２の進化ラウンド後に除去されたことを直接示す。主要な単離物をさらなる分析に選択した。図１Ｂに示されているように、次世代シークエンシングは、ＡＡＶｃｃ４７のカプシドタンパク質が、ＡＡＶ ＶＲ４ライブラリーにおいて３つの異なる種での３サイクルの進化後に最も富化されたアミノ酸配列（すなわち、クローン）であったことを明示した。
図２Ａ～２Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの心臓におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図２Ａ）またはＡＡＶ．ｃｃ４７（図２Ｂ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の心臓ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図２Ｃは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。図２Ｄは、感染マウスの心臓におけるベクターの生体内分布を描示するグラフを示す。
図３Ａ～３Ｃは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの骨格筋におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図３Ａ）またはＡＡＶ．ｃｃ４７（図３Ｂ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の骨格筋ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図３Ｃは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図４Ａ～４Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの肝臓におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図４Ａ）またはＡＡＶ．ｃｃ４７（図４Ｂ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の肝臓ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図４Ｃは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。図４Ｄは、感染マウスの肝臓におけるベクターの生体内分布を描示するグラフを示す。
図５Ａ～５Ｃは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの腎臓におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図５Ａ）またはＡＡＶ．ｃｃ４７（図５Ｂ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の腎臓ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図５Ｃは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図６Ａ～６Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの心臓におけるＧＦＰレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図６Ａ）またはＡＡＶ．ｃｃ８１（図６Ｂ）またはＡＡＶ．ｃｃ８４（図６Ｃ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の心臓ビブラトーム切片におけるＧＦＰ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図６Ｄは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図７Ａ～７Ｃは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの骨格筋におけるＧＦＰレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図７Ａ）またはＡＡＶ．ｃｃ８１（図７Ｂ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の骨格筋ビブラトーム切片におけるＧＦＰ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図７Ｃは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図８Ａ～８Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの肝臓におけるＧＦＰレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図８Ａ）、ＡＡＶ．ｃｃ４８１（図８Ｂ）またはＡＡＶ．ｃｃ８４（図８Ｃ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の肝臓ビブラトーム切片におけるＧＦＰ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図８Ｄは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図９Ａ～９Ｃは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの腎臓におけるＧＦＰレポーター遺伝子発現を例示する。ＡＡＶ９（図９Ａ）またはＡＡＶ．ｃｃ８１（図９Ｂ）に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の腎臓ビブラトーム切片におけるＧＦＰ発現を示す代表蛍光顕微鏡画像。図９Ｃは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図１０Ａ～１０Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの脳領域における免疫組織化学検査（ＩＨＣ）により評定したときの蛍光レポーター発現を例示する。図１０Ａは、偽感染したマウスからの脳領域を描示し、その一方で、図１０Ｂは、ＡＡＶ９ベクターに感染したマウスからの脳領域を描示し、図１０Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ４７に感染したマウスからの脳領域を描示し、図１０Ｄは、ＡＡＶ．ｃｃ８１に感染したマウスからの脳領域を描示し、図１０Ｅは、ＡＡＶ．ｃｃ８４に感染したマウスからの脳領域を描示する。示されている脳領域は、Ｃｔｘ＝大脳皮質、Ｈｃ＝海馬、Ｃｂ＝小脳、Ｔｈ＝視床、Ｓｔｒ＝線条体、およびｍｂ＝キノコ体を含む。
図１１Ａ～１１Ｇは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってブタの脳領域における免疫組織化学検査（ＩＨＣ）により評定したＡＶＶ．ｃｃ４７形質導入を例示する。図１１Ａは、ブタの前頭皮質におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色を描示する。図１１Ｂは、ブタの頭頂皮質におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色を描示する。図１１Ｃは、ブタの頭頂視床におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色を描示する。図１１Ｄは、ブタの後頭皮質におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色を描示する。図１１Ｅは、ブタの脳幹におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色を描示する。図１１Ｆは、ブタの小脳におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色を描示する。図１１Ｇは、ブタの中脳におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色を描示する。
図１２Ａ～１２Ｇは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってブタの脳領域における免疫組織化学検査（ＩＨＣ）により評定したＡＶＶ．ｃｃ８４形質導入を例示する。図１２Ａは、ブタの前頭皮質におけるＧＦＰについてのＩＨＣ染色を描示する。図１２Ｂは、ブタの頭頂皮質におけるＧＦＰについてのＩＨＣ染色を描示する。図１２Ｃは、ブタの頭頂視床におけるＧＦＰについてのＩＨＣ染色を描示する。図１２Ｄは、ブタの後頭皮質におけるＧＦＰについてのＩＨＣ染色を描示する。図１２Ｅは、ブタの脳幹におけるＧＦＰについてのＩＨＣ染色を描示する。図１２Ｆは、ブタの小脳におけるＧＦＰについてのＩＨＣ染色を描示する。図１２Ｇは、ブタの中脳におけるＧＦＰについてのＩＨＣ染色を描示する。
図１３Ａ～１３Ｆは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってブタの脊髄におけるＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＶＶ．ｃｃ８４形質導入を例示する。ブタの脊髄の切片を、組織内のＡＶＶ．ｃｃ４７（図１３Ａ）およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図１３Ｂ）についてのＩＨＣ染色に供した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を白質（図１３Ｃ）および灰白質（図１３Ｅ）において測定してＡＶＶ．ｃｃ４７について評定した。ＧＦＰ蛍光を白質（図１３Ｄ）および灰白質（図１３ＦＥ）において測定してＡＶＶ．ｃｃ８４の存在について評定した。
図１４Ａ～１４Ｆは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってブタの心臓および肝臓におけるＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＶＶ．ｃｃ８４形質導入を例示する。ＡＶＶ．ｃｃ４７形質導入を、ブタの心臓左室（図１４Ａ）、ブタの心臓右室（図１４Ｂ）、および肝臓（図１４Ｃ）においてｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色により評定した。ＡＶＶ．ｃｃ８４形質導入を、ブタの心臓左室（図１４Ｄ）、ブタの心臓右室（図１４Ｅ）、および肝臓（図１４Ｆ）においてＧＦＰについてのＩＨＣ染色により評定した。
図１５Ａ～１５Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って非ヒト霊長類の心臓および肝臓におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４７形質導入を例示する。ＡＶＶ９形質導入を、非ヒト霊長類の肝臓（図１５Ａ）および心臓（図１５Ｃ）においてｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色により評定した。ＡＶＶ．ｃｃ４７形質導入を、非ヒト霊長類の肝臓（図１５Ｂ）および心臓（図１５Ｄ）においてｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色により評定した。図１５Ｅは、非ヒト霊長類における組換えＡＡＶの生体内分布を示す。
図１６Ａ～１６Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って非ヒト霊長類の脳におけるＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｃｃ４７、およびＡＡＶ．ｃｃ８４形質導入を例示する。非ヒト霊長類の脳において、ＡＶＶ９形質導入をｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色により評定し（図１６Ｂ）、ＡＡＶ．ｃｃ４７形質導入をｍＣｈｅｒｒｙについてのＩＨＣ染色により評定し（図１６Ｃ）、ＡＡＶ．ｃｃ８４形質導入をＧＦＰについてのＩＨＣ染色により評定した（図１６Ｄ）。図１６Ａは、偽注射した対照非ヒト霊長類からの脳スライスを示す。
図１７Ａ～１７Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＡＡＶｃｃ４７心臓形質導入の検証を例示する。図１７Ａは、Ｃｂｈプロモーターにより駆動されるＧＦＰをパッケージングしているＡＡＶ９またはｃｃ４７で形質導入されたヒトｉＰＳＣ心筋細胞を示す。図１７Ｂは、（図１７Ａ）の複数の画像におけるＧＦＰ＋面積パーセントの定量化を示す。図１７Ｃは、ヒト心臓パッチマウスモデルにおけるＩＶ注射されたＣＢｈ：ＧＦＰをパッケージングしているＡＡＶ９またはＡＡＶｃｃ４７を示す。図１７Ｄは、心臓パッチの蛍光イメージングを示す。図１７Ｅは、心筋梗塞後に傷害誘導性プロモーターの制御下でＧＦＰを送達するｉ．ｖ．投与されたＡＡＶ９およびＡＡＶｃｃ４７を示す。トロポニンＴ（赤色）およびＧＦＰ（緑色）についての免疫蛍光。
図１８Ａ～１８Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って模擬処置（図１８Ａ）、ＡＡＶ９（図１８Ｂ）、ＡＶＶ．ｃｃ４７（図１８Ｃ）、およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図１８Ｄ）のｉ．ｖ．投与後のマウスの心臓における固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表画像を例示する。図１８Ｅは、マウスの心臓における組換えＡＡＶの生体内分布を示す。
図１９Ａ～１９Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って模擬処置（図１９Ａ）、ＡＡＶ９（図１９Ｂ）、ＡＶＶ．ｃｃ４７（図１９Ｃ）、およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図１９Ｄ）のｉ．ｖ．投与後のマウスの肝臓における固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表画像を例示する。図１９Ｅは、マウスの肝臓における組換えＡＡＶの生体内分布を示す。
図２０Ａ～２０Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って模擬処置（図２０Ａ）、ＡＡＶ９（図２０Ｂ）、ＡＶＶ．ｃｃ４７（図２０Ｃ）、およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図２０Ｄ）のｉ．ｖ．投与後のマウスの肺における固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表画像を例示する。図２０Ｅは、マウスの肝臓における組換えＡＡＶの生体内分布を示す。
図２１Ａ～２１Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってｃｃＡＡＶベクターでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を例示する。図２１Ａは、ＳａＣａｓ９を駆動する短縮型ＣＢプロモーターと１つのｓｇＲＮＡを駆動するＵ６プロモーターとを有する１つのベクター、および第２のｓｇＲＮＡを有する同じ設計の第２のベクターを使用する、本明細書において用いられる二重ベクター戦略を示す。図２１Ｂは、ＡＡＶ９またはｃｃ４７の２ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量での投与後のＡｉ９マウスの肝臓および心臓における固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を示す。図２１Ｃは、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の総数を計数し、ＤＡＰＩ＋細胞の総数で割ることにより決定された、遺伝子編集効率を示す。図２１Ｄは、ＰＣＲ編集アッセイを示し、未編集バンド（＊＊１１６０ｂｐ）および編集バンド（＊２７０ｂｐ）が記されている。ｐ＊＊＜０．０１。
図２２Ａ～２２Ｃは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってｃｃＡＡＶベクターでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の検証を例示する。図２２Ａは、切片を作製してネイティブＴｄＴｏｍａｔｏ発現についてイメージングした、Ａｉ９肝臓を示す。図２２Ｂは、ＴｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の総数を計数し、Ｄａｐｉ＋細胞の総数に正規化することによる、遺伝子編集効率の定量化を描示するグラフを示す。図２２Ｃは、Ａｉ９心臓の切片を作製し、ネイティブＴｄＴｏｍａｔｏ発現についてイメージングしたことを示す。両方の組織の凍結切片を作製して１４μｍ厚の切片にした。
図２３Ａ～２３Ｆは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って蛍光強度を測定することによる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の定量化を例示する。蛍光強度を複数の画像から測定して、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ．ｃｃ４７ベクターのいずれかを注射したＡｉ９マウスにおけるネイティブＴｄＴｏｍａｔｏ発現を定量化した。図２３Ａは、注射した全てのＡｉ９マウスの肝臓における補正された全細胞蛍光のグラフを示す。図２３Ｂは、注射した全ての雌Ａｉ９マウスの肝臓における補正された全細胞蛍光のグラフを示す。図２３Ｃは、注射した全てのＡｉ９マウスの心臓における補正された全細胞蛍光のグラフを示す。図２３Ｄは、注射した全ての雌Ａｉ９マウスの心臓における補正された全細胞蛍光のグラフを示す。図２３Ｅは、注射した全ての雄Ａｉ９マウスの肝臓における補正された全細胞蛍光のグラフを示す。図２３Ｆは、注射した全ての雄Ａｉ９マウスの心臓における補正された全細胞蛍光のグラフを示す。Ｐ値＊＜０．０５；ｎｓ＝非有意
図２４Ａおよび２４Ｂは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って相対ＰＣＲバンド強度を測定することによる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の定量化を例示する。図２４Ａは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ．ｃｃ４７ベクターのいずれかを注射したＡｉ９マウスからの肝臓組織のＰＣＲ編集アッセイの結果として生じたＰＣＲバンドについてのＰＣＲバンド強度（模擬の未編集バンドに対する）のグラフを示す。図２４Ｂは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ．ｃｃ４７ベクターのいずれかを注射したＡｉ９マウスからの心臓組織のＰＣＲ編集アッセイの結果として生じたＰＣＲバンドについてのＰＣＲバンド強度（模擬の未編集バンドに対する）のグラフを示す。
図２５Ａおよび２５Ｂは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って肝臓および心臓におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集効率の定量化を例示する。図２５Ａは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ．ｃｃ４７ベクターのいずれかを注射したＡｉ９マウスからの肝臓組織の遺伝子編集効率のパーセンテージのグラフを示す。図２５Ｂは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ．ｃｃ４７ベクターのいずれかを注射したＡｉ９マウスからの心臓組織の遺伝子編集効率のパーセンテージのグラフを示す。
図２６Ａおよび２６Ｂは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの心臓におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。図２６Ａは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｃｃ４４に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の心臓ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す、代表蛍光顕微鏡画像を示す。図２６Ｂは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。図２６Ｃおよび２６Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの骨格筋におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。図２６Ｃは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｃｃ４４に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の骨格筋ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す、代表蛍光顕微鏡画像を示す。図２６Ｄは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図２７Ａおよび２７Ｂは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの肝臓におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。図２７Ａは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｃｃ４４に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の肝臓ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す、代表蛍光顕微鏡画像を示す。図２７Ｂは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。図２７Ｃおよび２７Ｄは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの腎臓におけるｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子発現を例示する。図２７Ｃは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｃｃ４４に感染したマウスにおける４％ＰＦＡでの固定の２４時間後の腎臓ビブラトーム切片におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す、代表蛍光顕微鏡画像を示す。図２７Ｄは、一連の複数の画像の補正された全細胞蛍光を描示するグラフを示す。
図２８Ａ～２８Ｃは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＣ５７／Ｂ６マウスの脳領域における免疫組織化学検査（ＩＨＣ）により評定したときの蛍光レポーター発現を例示する。図２８Ａは、偽感染したマウスからの脳領域を描示し、その一方で、図２８Ｂは、ＡＡＶ９ベクターに感染したマウスからの脳領域を描示し、図２８Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ４４に感染したマウスからの脳領域を描示する。示されている脳領域は、Ｃｔｘ＝大脳皮質、Ｈｃ＝海馬、Ｃｂ＝小脳、Ｔｈ＝視床、Ｓｔｒ＝線条体、およびｍｂ＝キノコ体を含む。
図２９Ａおよび２９Ｂは、本明細書におけるある特定の実施形態に従って投与に使用したＡＡＶベクターの概要図を例示する。図２９Ａは、強調されているカプシド表面に可変領域４（ＶＲ４）を有する完全カプシド（上のパネル）およびＣＢｈ－ｍＣｈｅｒｒｙをパッケージングしているベクター（ＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＡＶ．ｃｃ４４）として産生された組換えカプシドタンパク質（下のパネル）を描示する。図２９Ｂは、強調されているカプシド表面に可変領域８（ＶＲ８）を有する完全カプシド（上のパネル）およびＣＢｈ－ｅＧＦＰをパッケージングしているベクター（ＡＡＶ．ｃｃ８１およびＡＡＶ．ｃｃ８４）として産生された組換えカプシドタンパク質（下のパネル）を描示する。
図３０Ａ～３０Ｆは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＡＡＶベクターの脳室内（ＩＣＶ）注射時にマウスの脳に発現されたｍＣｈｅｒｒｙまたはｅＧＦＰの代表画像を例示する。図３０Ａは、ＡＡＶ９ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＩＣＶ注射後のマウスの全脳、および選択された脳領域を描示する。図３０Ｂは、ＡＡＶ．ｃｃ４４ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＩＣＶ注射後のマウスの全脳、および選択された脳領域を描示する。図３０Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ４７ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＩＣＶ注射後のマウスの全脳、および選択された脳領域を描示する。図３０Ｄは、ＡＡＶ９ベクター（ｅＧＦＰ）のＩＣＶ注射後のマウスの全脳、および選択された脳領域を描示する。図３０Ｅは、ＡＡＶ．ｃｃ８１ベクター（ｅＧＦＰ）のＩＣＶ注射後のマウスの全脳、および選択された脳領域を描示する。図３０Ｆは、ＡＡＶ．ｃｃ８４ベクター（ｅＧＦＰ）のＩＣＶ注射後のマウスの全脳、および選択された脳領域を描示する。示されている脳領域は、Ｃｔｘ＝大脳皮質、Ｈｃ＝海馬、およびＣｂ＝小脳を含む。
図３１Ａ～３１Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＡＡＶベクターの脳室内（ＩＣＶ）注射時にマウスの脳に発現されたｅＧＦＰの代表画像およびグラフを例示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９ベクター（ｅＧＦＰ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。図３１Ｂは、ＡＡＶ．ｃｃ８４ベクター（ｅＧＦＰ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮ両方の染色を有するニューロンの数を、小脳（ＣＢ、図３１Ｃ）、海馬（ＨＣ、図３１Ｄ）および大脳皮質（ＣＴＸ、図３１Ｅ）において定量化した。
図３１Ａ～３１Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＡＡＶベクターの脳室内（ＩＣＶ）注射時にマウスの脳に発現されたｅＧＦＰの代表画像およびグラフを例示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９ベクター（ｅＧＦＰ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。図３１Ｂは、ＡＡＶ．ｃｃ８４ベクター（ｅＧＦＰ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮ両方の染色を有するニューロンの数を、小脳（ＣＢ、図３１Ｃ）、海馬（ＨＣ、図３１Ｄ）および大脳皮質（ＣＴＸ、図３１Ｅ）において定量化した。
図３２Ａ～３２Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＡＡＶベクターの脳室内（ＩＣＶ）注射時にマウスの脳に発現されたｍＣｈｅｒｒｙの代表画像およびグラフを例示する。図３２Ａは、ＡＡＶ９ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。図３２Ｂは、ＡＡＶ．ｃｃ４７ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。ｍＣｈｅｒｒｙおよびＮｅｕｒＮ両方の染色を有するニューロンの数を、小脳（ＣＢ、図３２Ｃ）、海馬（ＨＣ、図３２Ｄ）および大脳皮質（ＣＴＸ、図３２Ｅ）において定量化した。
図３２Ａ～３２Ｅは、本明細書におけるある特定の実施形態に従ってＡＡＶベクターの脳室内（ＩＣＶ）注射時にマウスの脳に発現されたｍＣｈｅｒｒｙの代表画像およびグラフを例示する。図３２Ａは、ＡＡＶ９ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。図３２Ｂは、ＡＡＶ．ｃｃ４７ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＩＣＶ注射後に採取され処理された脳組織におけるＤＡＰＩ、ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮについての免疫蛍光（ＩＦ）染色後の選択された脳領域からの画像を描示する。３つ全ての染色からの画像を、共局在化を示すために統合した。ｍＣｈｅｒｒｙおよびＮｅｕｒＮ両方の染色を有するニューロンの数を、小脳（ＣＢ、図３２Ｃ）、海馬（ＨＣ、図３２Ｄ）および大脳皮質（ＣＴＸ、図３２Ｅ）において定量化した。
詳細な説明
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、治療用遺伝子の送達のための主要なプラットフォームになってきた。残念なことに、ＡＡＶに基づく遺伝子治療剤は、例えば、目的の細胞または組織を標的とするための投与経路および治療用遺伝子（例えば、目的の導入遺伝子）を運ぶベクターに対する対象の免疫応答の最適化が困難であるため、所望される効果に満たないことがある。ＡＡＶまたは組換えＡＡＶベクターの自然な遭遇時に生成される宿主由来の既存の抗体は、ワクチンとしてのおよび／または遺伝子治療剤のためのＡＡＶベクターの初回および反復投与を妨げる。血清学的研究は、人々の約６７％がＡＡＶ１に対する、７２％がＡＡＶ２に対する、約４０％がＡＡＶ５からＡＡＶ９までに対する抗体を有する、世界中のヒト個体群における高い抗体保有率を明らかにする。遺伝子治療剤では、遺伝子サイレンシングまたは組織変性を伴うある特定の臨床シナリオは、導入遺伝子の長期発現を持続するために複数のＡＡＶベクター投与を必要とするため、対象における既存の抗体が問題を引き起こす。
公知のＡＡＶ血清型は、各々が特異的な組織親和性を有するが、これらのＡＡＶを使用して容易に標的とすることができないいくつかの組織（例えば、腎臓）がある。中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の障害を処置するためにＡＡＶベクターを使用する治療用遺伝子の送達は、血液脳関門がＡＡＶに基づく治療剤の所望の標的への到達を妨げ得るので、特に困難である。心臓、肝臓または肺などの全身臓器におけるＡＡＶ形質導入は、所与の用量について、臨床開発中に使用される様々なモデル生物（例えば、イヌ、ブタ、非ヒト霊長類）の中で、およびヒト対象の中で、かなり異なり得る。
これらの問題を回避するには、抗体認識から逃れるおよび／またはＣＮＳの組織を選択的に標的とする組換えＡＡＶベクターが必要である。本開示で提供される態様は、ａ）ＡＡＶに基づく遺伝子治療剤に好適な患者の適格なコホートを拡大するのに、およびｂ）ＡＡＶに基づく遺伝子治療用ベクターの複数の反復投与を可能にするのに、役立つことになる。加えて、目的の組織を、腎臓などの公知のＡＡＶ血清型を使用して標的とすることが困難である／困難とされている組織を含めて、選択的かつ特異的に標的とすることができる、ＡＡＶに基づく遺伝子治療剤を開発する必要がある。
本開示は、ＡＡＶカプシドおよびカプシドタンパク質のカプシド抗原性および機能特性、例えば、親和性および形質導入が、構造的状況の点でオーバーラップしており、それらを改変して改善された機能性を付与することができるという新規発見に、少なくとも一部は基づく。本開示に基づいて、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質、およびＡＡＶカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、異種間適合性を誘導するように共進化させることができ、これは、非ヒト疾患モデル（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類）からの所与のＡＡＶをヒトに使用する上での信頼性のある解釈を可能にする潜在的に有用な特質である。それに基づいて、本開示は、異種間適合性ＡＡＶカプシドタンパク質および本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクター、それらの作製方法および使用方法を提供する。本明細書で使用される場合、「異種間適合性ＡＡＶ」は、異種間適合性のために共進化される、変異したおよび／または置換されたアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含むＡＡＶベクターを指すことができる。
Ｉ．定義
本開示の原理の理解を促す目的で、好ましい実施形態を次に参照し、特定の言葉を使用してそれを説明することとする。とは言うものの、それによって本開示の範囲が制限されることを意図しておらず、本明細書で例証されるような本開示についての、本開示が関連する技術分野の当業者が普通に思い付くような、変更およびさらなる改変を企図していることは、理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書では使用される。例として、「エレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、少なくとも１つのエレメントを意味し、１つより多くのエレメントを含み得る。
「約」は、所望の結果に影響を与えることなく所与の値が終点より「わずかに上」または「わずかに下」であり得ることを規定することによって数値範囲の終点に自由度を与えるために使用される。数値に付随している用語「約」は、数値にその数値のプラスまたはマイナス５％またはそれ未満の幅があり得ることを意味する。
本明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および語尾変化形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）は、述べられている構成要素、特色、エレメントもしくはステップ、または構成要素、特色、エレメントもしくはステップの群の包含を含意するが、任意の他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群の除外を含意しないように解されることになる。
本明細書で使用される場合、「および／または」は、付随する列挙されている事柄の１つまたは複数についての任意のおよび全ての可能な組合せはもちろん、選択的に（「または」）と解釈される場合には組合せの欠如も指し、それらを包含する。
さらに、本開示は、一部の実施形態では、本明細書で示される任意の特色または特色の組合せが除外または削除され得ることも企図している。例を挙げて説明すると、本明細書で複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと述べられている場合、具体的には、Ａ、ＢもしくはＣのいずれかまたはこれらの組合せが単独でまたは任意の組合せで削除および放棄され得ることが意図されている。
本明細書における値の範囲の記述は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に含まれる各別々の値に個々に言及する省略表現方法として役立つことを目的としたものに過ぎず、各別々の値は、それがあたかも本明細書において個々に挙げられたかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が、１％～５０％と述べられている場合、例えば、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値が本明細書に明確に列挙されていることが意図されている。これらは、具体的に意図されているものの単なる例であり、列挙されている最低値と最高値の間の、これらの値を含む、数値の全ての可能な組合せが、本開示で明確に述べられているとみなされるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型（３Ａおよび３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、ＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ １１型、ＡＡＶ １２型、ＡＡＶ １３型、ＡＡＶ ｒｈ３２．３３型、ＡＡＶ ｒｈ８型、ＡＡＶ ｒｈ１０型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69（4th ed., Lippincott-Raven Publishers）を参照されたい。いくつかのＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Gao et al, (2004) J. Virology 78:6381 -6388；Moris et al, (2004) Virology 33-:375-383；および表１を参照されたい）。
ＡＡＶおよび自律的パルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献において、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見つけることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたく、これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列の教示について参照により本明細書に組み込まれる。表１も参照されたい。
Figure 2023524291000001
Figure 2023524291000002
Figure 2023524291000003
用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書では同義で使用され、ウイルスに天然に存在しない配列を指す。一般に、異種核酸は、目的の（例えば、細胞または対象への送達のための）ポリペプチドまたは非翻訳ＲＮＡをコードする、オープンリーディングフレームを含む。
「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド塩基の配列を指し、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖ＤＮＡ配列または二本鎖ＤＮＡ配列のどちらかである。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、短いアミノ酸配列を指す。ペプチドという用語は、ＡＡＶカプシドアミノ酸配列の一部分または領域を指すために使用され得る。ペプチドは、ネイティブＡＡＶカプシドに天然に存在するペプチドでも、ネイティブＡＡＶカプシドに天然に存在しないペプチドであってもよい。ＡＡＶカプシド内の天然に存在するＡＡＶペプチドを、天然に存在しないペプチドによって置換することができる。例えば、天然に存在するペプチドが天然に存在しないペプチドに置き換えられるように、天然に存在しないペプチドをＡＡＶカプシドに置換により組み込んで、改変カプシドを得ることができる。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドとタンパク質の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その改変形態、および合成アミノ酸を包含する。あるいは、本明細書におけるアミノ酸は、改変アミノ酸残基であり得、および／または翻訳後改変（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）により改変されるアミノ酸であり得る。天然に存在する左旋性（Ｌ－）アミノ酸が、表２で示される。
Figure 2023524291000004
あるいは、アミノ酸は、改変アミノ酸残基であり得（非限定的な例は、表３で示される）、および／または翻訳後改変（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）により改変されるアミノ酸であり得る。
Figure 2023524291000005
Figure 2023524291000006
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)により記載されているような「非天然」アミノ酸であり得る。これらの非天然アミノ酸は、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結させるために有利に使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」、または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指す。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、単独でのベクターゲノム／ｖＤＮＡを指すために使用され得る。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生成するためにシスでの末端反復（ＴＲ）のみを必要とする。全ての他のウイルス配列は、重要でなく、トランスで供給されることもある（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大にするために１つまたは複数のＴＲ配列のみを保持することになる。構造および非構造タンパク質コード配列は、トランスで（例えば、プラスミドなどのベクターから、または配列をパッケージング細胞に安定的に組み込むことにより）提供されることもある。本発明の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）を、必要に応じて、２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、これら２つのＴＲは、典型的には、ベクターゲノムの５’および３’末端にあり、異種核酸に隣接することになるが、異種核酸と連続している必要はない。ＴＲは、互いに同じであっても、異なっていてもよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し、逆方向末端反復として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの、所望の機能を媒介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲ、または非ＡＡＶ ＴＲであり得る。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもの、または任意の他の好適なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点としての機能を果たすＳＶ４０ヘアピン）などの、非ＡＡＶ ＴＲ配列を、ＴＲとして使用することができ、それを、短縮、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変することができる。さらに、ＴＲは、部分的にまたは完全に合成のもの、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載されているような「二重Ｄ配列」であることもある。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または現在公知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶを含むがこれらに限定されない、任意のＡＡＶからのものであり得る（例えば、表１を参照されたい）。ＡＡＶ末端反復は、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどを媒介するのであれば、ネイティブ末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブＡＡＶ ＴＲ配列が、挿入、欠失、短縮および／またはミスセンス変異により変更されていてもよい）。
ＡＡＶベクターは、典型的には、タンパク質に基づくカプシド、およびカプシドに包まれている核酸を含む。核酸は、例えば、逆方向末端反復と隣接している導入遺伝子を含むベクターゲノムであり得る。ＡＡＶ「カプシド」は、個々の「カプシドタンパク質」または「サブユニット」を含む、ほぼ球形のタンパク質シェルである。ＡＡＶカプシドは、会合しており、Ｔ＝１の正二十面体対称で配置されている、約６０のカプシドタンパク質サブユニットを典型的に含む。ＡＡＶベクターが、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むと本明細書に記載される場合、ＡＡＶベクターがカプシドを含み、カプシドが１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質（すなわち、サブユニット）を含むと解されることになる。導入遺伝子を含むいずれのベクターゲノムも核酸も含まないカプシドを指す、「ウイルス性粒子」または「ウイスル様粒子」も、本明細書に記載される。
本開示のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ００／２８００４およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されているような「標的化」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた親和性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲとウイルスカプシドが、異なるパルボウイルスからのものである）であり得る。
本開示のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような二重パルボウイルス粒子であり得る。したがって、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムを本発明のウイルスカプシドにパッケージングすることができる。さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含めた他の改変を含有し得る。
用語「自己相補的ＡＡＶ」または「ｓｃＡＡＶ」は、自発的にアニールする二量体逆方向反復ＤＮＡ分子を形成し、その結果、従来の一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶゲノムと比較して、より早く、よりロバストな導入遺伝子発現を生じさせることになる、組換えＡＡＶベクターを指す。例えば、McCarty, D.M., et al., Gene Therapy 8, 1248- 1254 (2001)を参照されたい。従来のｓｓＡＡＶとは異なり、ｓｃＡＡＶは、遺伝子発現の律速段階である第２鎖合成を回避することができる。さらに、二本鎖ｓｃＡＡＶは、ウイルス形質導入後にＤＮＡが分解する傾向が低く、それによって、安定なエピソームのコピー数が増加する。注目すべきことに、ｓｃＡＡＶは、典型的には、従来のＡＡＶベクターのサイズの半分の約２．４ｋｂであるゲノムのみを保持し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶである。
「治療用ポリペプチド」または「治療用タンパク質」は、細胞もしくは対象におけるタンパク質の非存在もしくは欠損の結果として生じる症状を緩和、軽減、予防、遅延および／もしくは安定化することができるポリペプチドもしくはタンパク質であり、ならびに／または別様に対象に恩恵、例えば、抗がん効果、もしくは移植片の生存率の向上、をもたらすポリペプチドである。
用語「処置する」、「処置すること」、または「の処置」（およびこれらの文法的変化形）とは、対象の状態の重症度を低下させる、少なくとも部分的に改善するもしくは安定化すること、および／または少なくとも１つの臨床症状の何らかの緩和、軽減、減少もしくは安定化を達成すること、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延があることを意味する。
用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」（およびこれらの文法的変化形）は、本発明の方法の非存在下で起こるものと比べて、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の予防および／もしくはその遅延、ならびに／または疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の重症度の低下を指す。予防は、完全な予防、例えば、疾患、障害および／または臨床症状の全くの非存在、であることがある。予防は、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の出現、ならびに／または発症の重症度が、本発明の非存在下で起こるものに満たないような、部分的な予防であることもある。
本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、本明細書では同義で使用され、ヒトと非ヒト動物の両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。一部の実施形態では、対象は、ヒトを含む。他の実施形態では、対象は、１つまたは複数の遺伝子治療剤を必要とするヒトを含む。
「処置有効」量は、本明細書で使用される場合、対象に何らかの改善または恩恵をもたらすのに十分である量である。別の言い方をすれば、「処置有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状の何らかの緩和、軽減、減少または安定化をもたらすことになる量である。何らかの恩恵が対象にもたらされるのであれば、治療効果が完全である必要も、治癒的である必要もないことは、当業者には理解されるであろう。
「予防有効」量は、本明細書で使用される場合、本発明の方法の非存在下で起こるものと比べて、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症を予防するおよび／もしくは遅延させるのに、ならびに／または対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症の重症度を低下および／もしくは遅延させるのに、十分である量である。何らかの恩恵が対象にもたらされるのであれば、予防レベルが完全である必要がないことは、当業者には理解されるであろう。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
ＩＩ．異種間適合性ＡＡＶ
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小さい、エンベロープを有さないウイルスである。野生型ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡゲノムを封入する正二十面体タンパク質カプシドで構成されている。野生型ＡＡＶでは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造タンパク質（Ｒｅｐ遺伝子によりコードされる）および構造タンパク質（カプシド遺伝子またはＣａｐ遺伝子によりコードされる）についてのコードヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド）に隣接する。Ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶゲノムの複製を含む機能を調節する非構造タンパク質をコードする。Ｃａｐ遺伝子は、集合してカプシドを形成する構造タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３をコードする。
本開示は、野生型カプシドタンパク質と比べてアミノ酸配列の改変（例えば、置換）を含む組換えＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）、ならびに改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドおよびＡＡＶベクターを提供する。本発明者らは、本明細書で開示される改変が、本明細書における改変ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含むウイルスベクターに、中和抗体から逃れる能力および／または目的の細胞もしくは組織を特異的かつ選択的に標的とする能力を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の望ましい特性を付与することができることを発見した。したがって、本開示は、従来のＡＡＶベクターに付随する制限の一部に対処する。
ある特定の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクターを、１つまたは複数のカプシドタンパク質バリアントを含むように操作することができる。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクターは、異種間適合性ベクター、すなわち「ｃｃＡＡＶ」であり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）を、少なくとも１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように操作することができ、１つまたは複数の置換によってＡＡＶカプシドタンパク質上の１つまたは複数の抗原部位が改変され得る。１つまたは複数抗原部位の改変は、１つもしくは複数の抗原部位への抗体による結合の阻害、および／または本明細書における前記カプシドタンパク質バリアントを含むウイルス粒子の感染力の中和の阻害をもたらすことができる。
したがって、本明細書における一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換および／または欠失）を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質バリアントであって、１つまたは複数の改変によってＡＡＶカプシドタンパク質上の１つまたは複数の抗原部位が改変されている、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数抗原部位の改変は、１つもしくは複数の抗原部位への抗体による結合の阻害、および／または前記ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染力の中和の阻害をもたらすことができる。一部の実施形態では、改変された抗原部位は、抗体によるＡＡＶカプシドの結合または認識または中和を防止することができる。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む）、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＡであり得る。一部の実施形態では、改変された抗原部位は、異なる動物種からの抗体によるＡＡＶカプシドの結合、認識または中和を防止することができ、動物は、ヒト、イヌ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類、げっ歯類、ネコまたはウマである。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原部位の改変は、１つもしくは複数の細胞型、１つもしくは複数の組織型、またはこれらの任意の組合せへの、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）の親和性を生じさせる結果となり得る。本明細書で使用される場合、「親和性」は、ある特定の細胞または組織へのウイルスの優先的侵入を指し、必要に応じてその後、細胞においてウイルスゲノムにより運ばれた配列の発現（例えば、転写、および必要に応じて翻訳）、例えば、組換えウイルスの場合は目的の異種核酸の発現が生じる。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原部位の改変は、対象の全身の１つまたは複数の細胞型および／または組織に対する親和性を示し得る本明細書におけるＡＡＶベクターを生じさせる結果となり得る。一部の態様では、１つまたは複数の抗原部位の改変は、脳組織、肺組織、骨格筋組織、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織および／または膵臓組織への親和性を示し得る本明細書におけるＡＡＶベクターを生じさせる結果となり得る。一部の態様では、１つまたは複数の抗原部位の改変は、１つもしくは複数の脳細胞、１つもしくは複数の肺細胞、１つもしくは複数の骨格筋細胞、１つもしくは複数の心臓細胞、１つもしくは複数の肝臓細胞、１つもしくは複数の腎臓細胞および／または１つもしくは複数の膵臓細胞への親和性を示し得る本明細書におけるＡＡＶベクターを生じさせる結果となり得る。一部の態様では、１つまたは複数の抗原部位の改変は、腎臓への親和性を示し得る本明細書におけるＡＡＶベクターを生じさせる結果となり得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアント内の１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換および／または欠失）は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶ－抗体複合体のペプチドエピトープマッピングおよび／または低温電子顕微鏡法研究により同定される１つまたは複数の抗原フットプリントに存在し得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を受け得る本明細書における１つまたは複数の抗原部位は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０５８８９２に記載されているような共通抗原モチーフ（ＣＡＭ）であり得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を受け得る本明細書における１つまたは複数の抗原部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質の可変領域（ＶＲ）に存在し得る。ＡＡＶカプシドは、３つのＶＰ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の６０コピー（合計で）を含有し、これらのＶＰは、ｃａｐ遺伝子によりコードされており、オーバーラップ配列を有する。各ＶＰは、自律的パルボウイルスカプシドに保存された８本鎖βバレルモチーフ（βＢ～βＩ）および／またはαヘリックス（αＡ）を含有し得る。構造可変領域（ＶＲ）は、β鎖を接続する表面ループ内に存在し得、これらがクラスター化してカプシド表面に局所的なばらつきを生じさせる。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアント内の１つまたは複数の抗原部位を改変する、本明細書における１つまたは複数のアミノ酸改変は、ＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＩ、ＶＲ－ＩＩＩ、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩ、ＶＲ－ＶＩ ＩＩ、ＶＲ－ＩＸ、またはこれらの任意の組合せにおいてであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原部位は、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントのＨＩループ内に存在し得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、（ｉ）本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントと、（ｉｉ）カプシドタンパク質によってカプシドに包まれているカーゴ核酸とを含み得る。これらの実施形態に従って、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含むＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、中和抗体の回避、形質導入効率の向上または維持、１つまたは複数の細胞型および／または組織型への選択的親和性、ならびにこれらの任意の組合せ、の表現型を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、心臓、骨格筋、腎臓および脳ニューロンにおいて、親ＡＡＶ９と比較して少なくとも約２倍（例えば、約４倍、約５倍、約７倍、約１０倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約２０倍、約２５倍、または約３０倍、これらの間にある全ての値および部分範囲を含む）多い形質導入を示す。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、一部の組織型（例えば、心臓、骨格筋、腎臓、脳ニューロンなど）では親ＡＡＶ９よりも高い形質導入効率を、一部の細胞型（例えば、グリア細胞）では親ＡＡＶ９と比べて同様のまたは減少した形質導入効率を示す。
本開示は、心臓、骨格筋、腎臓においてＡＡＶ９と比較して約１５倍～約１８倍多い形質導入を明示したＡＡＶｃｃ．４７を提供する。ニューロンにおけるＡＡＶｃｃ．４７の形質導入は、脳ではＡＡＶ９と比較してより多かったが、グリア細胞形質導入は、相対的に変わらないままであった。ＡＡＶｃｃ．８１およびＡＡＶｃｃ．８４は、心臓および骨格筋では形質導入を４倍増加させたが、いずれのｃｃＡＡＶについてもＡＡＶ９と比較して肝臓形質導入の大幅な増加は観察されなかった。グリア細胞の形質導入は、ｃｃＡＡＶを用いるとＡＡＶ９と比較して大幅に減少したが、ニューロン親和性はわずかに増加した。ｃｃＡＡＶによる形質導入効率の増加は、治療用ベクターのより低い投薬レジメンをもたらし得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、少なくとも１つまたは複数のアミノ酸置換を含み得、約１個のアミノ酸残基～約５０個のアミノ酸残基（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）は、天然に存在するカプシドタンパク質のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基から置換されていることがある。本明細書における一部の実施形態に従って、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、天然に存在するカプシドタンパク質のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基から置換された約７個のアミノ酸残基を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、天然に存在するカプシドタンパク質に対して約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。本明細書で使用される場合、「天然に存在する」または「野生型」は、人間による改変を伴わずに自然界に存在することを意味する。一部の実施形態では、本明細書における天然に存在するカプシドタンパク質は、単一の種に由来し得る。本明細書における天然に存在するカプシドタンパク質の起源となり得る種の非限定的な例としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ヒヒ、ゴリラ）、トリ、爬虫類、蠕虫、魚類などの、一般的な生物からのものが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書における天然に存在するカプシドタンパク質の起源となり得る種は、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）、およびこれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるような少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９、およびこれらの任意の組合せにより参照されるアミノ酸配列を有する天然に存在するカプシドタンパク質に対して約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。
２つまたはそれより多くのアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当技術分野において公知である。配列類似性または同一性は、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズムを含むがこれに限定されない標準的な技法を使用して、Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによるインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)により記載されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムにより、または検査により、決定することができる。［０１１５］別の好適なアルゴリズムは、Altschul et al., J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873- 5787 (1993)に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)から得られたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、必要に応じてデフォルト値に設定される、いくつかの検索パラメーターを使用する。パラメーターは、動的値であり、プログラム自体によって、特定の配列の組成、および目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に依存して確立されるが、値を、感度を高めるように調整することができる。さらに、追加の有用なアルゴリズムは、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402により報告されているようなギャップ付きＢＬＡＳＴである。本開示では、別段の指示がない限り、同一性パーセントは、オンラインでblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいて入手可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使用して算出される。他のアルゴリズムを適宜代用することができることは、当業者には理解されるであろう。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、次の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ウシＡＡＶ、トリＡＡＶ、および／または現在公知のもしくは後に同定される任意の他のＡＡＶ、のうちのいずれか１つからのＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくともアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、１つまたは複数の所望の細胞および／または組織型への公知の親和性を有する血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、１つまたは複数の所望のヒト細胞および／または組織型への公知の親和性を有する血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。
これらの実施形態に従って、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳに対する親和性を有する血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。ＡＡＶは、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア、ミュラーグリア、シュワン細胞、およびサテライト細胞を含むがこれらに限定されない、ＣＮＳおよびＰＮＳ内のいくつかの異なる組織型および細胞型を首尾よく標的とすることができる。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、星状膠細胞に対する親和性を有する任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）のＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。一部の他の例では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、乏突起膠細胞に対する親和性を有する任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）のＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、ミクログリアに対する親和性を有する任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）のＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。一部の他の例では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、ミュラーグリアに対する親和性を有する任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）のＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、シュワン細胞／サテライトグリアに対する親和性を有する任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）のＡＡＶカプシドタンパク質における任意の７つのアミノ酸を置き換えることができる、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントまたはそれらの断片は、天然に存在するＶＰ１カプシドタンパク質またはその断片に対して約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基２６２～２６８（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基３７０～３７９（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基４５１～４５９（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ＡＡＶ１のアミノ酸残基４７２～４７３（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基４９３～５００（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基５２８～５３４（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基５４７～５５２（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基５８８～５９７（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ＡＡＶ１のアミノ酸残基７０９～７１０（ＶＰ１番号付け）の１つまたは複数（例えば、２つ）に、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のアミノ酸残基７１６～７２２（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ＡＡＶ１のアミノ酸残基２６２～２６８（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基３７０～３７９（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基４５１～４５９（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、アミノ酸置換を；ＡＡＶ１のアミノ酸残基４７２～４７３（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基４９３～５００（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基５２８～５３４（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基５４７～５５２（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基５８８～５９７（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基７０９～７１０（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２つ）に、ＡＡＶ１のアミノ酸残基７１６～７２２（ＶＰ１番号付け）の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、または任意の組合せでのこれらの任意の組合せ、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を、含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面の可変ループ領域ＩＶ（ＶＲ４）内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面の可変ループ領域ＶＩＩＩ（ＶＲ８）内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面の可変ループ領域ＩＶ（ＶＲ４）内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基にアミノ酸置換を、および任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面の可変ループ領域ＶＩＩＩ（ＶＲ８）内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基にアミノ酸置換を、含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ＡＡＶ９カプシドのネイティブ配列（配列番号１）に対して少なくとも９０％（例えば、約９０％、９５％、９９％、１００％）の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ９のカプシド表面の可変ループ領域ＩＶ（ＶＲ４）内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）にアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面のＶＲ４（４５２－ＮＧＳＧＱＮＱ－４５８（ＶＰ１番号付け；配列番号３８））内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ９のカプシド表面のＶＲ４（４５２－ＮＧＳＧＱＮＱ－４５８（ＶＰ１番号付け；配列番号３８））内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）に置換を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ９のカプシド表面の可変ループ領域ＶＩＩＩ（ＶＲ８）内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）にアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面のＶＲ８（５８６－ＳＡＱＡＱＡＱ－５９２（ＶＰ１番号付け）；配列番号３９）内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ９のカプシド表面のＶＲ８（５８６－ＳＡＱＡＱＡＱ－５９２（ＶＰ１番号付け；配列番号３９））内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）にアミノ酸置換を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ９のカプシド表面の可変ループ領域ＩＶ（ＶＲ４）内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）にアミノ酸置換を、および可変ループ領域ＶＩＩＩ（ＶＲ８）内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）にアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面のＶＲ４（４５２－ＮＧＳＧＱＮＱ－４５８（ＶＰ１番号付け；配列番号３８））内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基にアミノ酸置換を、および任意の組合せでＡＡＶ１のカプシド表面のＶＲ８（５８６－ＳＡＱＡＱＡＱ－５９２（ＶＰ１番号付け；配列番号３９））内のアミノ酸残基の１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、もしくは７つ）、またはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶもしくはトリＡＡＶにおける等価のアミノ酸残基にアミノ酸置換を、含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せでＡＡＶ９のカプシド表面のＶＲ４（４５２－ＮＧＳＧＱＮＱ－４５８（ＶＰ１番号付け；配列番号３８））内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）に置換を、および任意の組合せでＡＡＶ９のカプシド表面のＶＲ８（５８６－ＳＡＱＡＱＡＱ－５９２（ＶＰ１番号付け；配列番号３９））内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）にアミノ酸置換を、含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、本明細書に記載される血清型のいずれか１つからの天然に存在するＶＰ２カプシドタンパク質またはその断片に対して約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、本明細書に記載される血清型のいずれか１つからの天然に存在するＶＰ２カプシドタンパク質またはその断片内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）にアミノ酸置換を任意の組合せで含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、本明細書に記載される血清型のいずれか１つからの天然に存在するＶＰ３カプシドタンパク質またはその断片に対して約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の類似性を有するアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、本明細書に記載される血清型のいずれか１つからの天然に存在するＶＰ３カプシドタンパク質またはその断片内のアミノ酸残基の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）にアミノ酸置換を任意の組合せで含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、（ｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントと、（ｉｉ）カプシドタンパク質によってカプシドに包まれているカーゴ核酸とを含み得る。これらの実施形態に従って、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、（ｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントと、（ｉｉ）カプシドタンパク質によってカプシドに包まれているカーゴ核酸とを含み得、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８（ＶＰ１番号付け）に配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号４０）を有するペプチドを含み、ペプチドは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列には存在しない。一部の態様では、本明細書におけるＡＡＶベクターは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８（ＶＰ１番号付け）に配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号４０）を有するペプチドを含むＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントを含み得、ここで、Ｘ１は、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ２は、Ｇ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ３は、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ４は、Ｇ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ５は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ６は、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり得、および／またはＸ７は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＥＧＧＴＶＨＡ（配列番号２０）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＦＹＧＴＤＳＡ（配列番号２１）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＨＧＱＳＡＳＲ（配列番号２２）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＤＴＰＴＮＱＡ（配列番号２３）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＩＴＲＱＡＹＱ（配列番号２４）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＲＭＦＫＳＮＱ（配列番号２５）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＧＶＳＬＧＧＧ（配列番号２６）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＫＨＦＬＱＧＥ（配列番号２７）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＭＧＲＥＲＡＧ（配列番号２８）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１０で示される配列のいずれか１つと少なくとも約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列類似性を共有し得る。本明細書における一部の実施形態に従って、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、配列番号２～１０で示される配列のいずれか１つを含む。ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）および配列番号２～１０のアミノ酸配列は、下の表４で提供される。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、（ｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントと、（ｉｉ）カプシドタンパク質によってカプシドに包まれているカーゴ核酸とを含み得、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２（ＶＰ１番号付け）に配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号１２５）を有するペプチドを含み、ペプチドは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列には存在しない。一部の態様では、本明細書におけるＡＡＶベクターは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２（ＶＰ１番号付け）に配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号１２５）を有するペプチドを含むＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントを含み得、ここで、Ｘ１は、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ２は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ３は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ４は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ５は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ６は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり得、および／またはＸ７は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＬＮＳＳＶＰＳ（配列番号２９）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＹＭＤＨＱＶＳ（配列番号３０）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＴＳＤＳＬＶＳ（配列番号３１）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＮＡＶＧＡＬＳ（配列番号３２）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＭＰＩＳＨＨＥ（配列番号３３）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＤＳＧＡＲＧＡ（配列番号３４）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＮＶＡＬＡＬＧ（配列番号３５）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＧＡＬＲＭＧＭ（配列番号３６）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、ＬＳＧＥＧＡＶ（配列番号３７）に対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、配列番号１１～１９で示される配列のいずれか１つと少なくとも約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列類似性を共有し得る。本明細書における一部の実施形態に従って、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、配列番号１１～１９で示される配列のいずれか１つを含む。ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）および配列番号１１～１９のアミノ酸配列は、下の表４で提供される。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、（ｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントと、（ｉｉ）カプシドタンパク質によってカプシドに包まれているカーゴ核酸とを含み得、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に、およびアミノ酸５８６～５９２（ＶＰ１番号付け）に、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号４０）を有するペプチドを含み、ペプチドは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列には存在しない。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、（ｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントと、（ｉｉ）カプシドタンパク質によってカプシドに包まれているカーゴ核酸とを含み得、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に、およびアミノ酸５８６～５９２（ＶＰ１番号付け）に、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号１２５）を有するペプチドを含み、ペプチドは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列には存在しない。
一部の態様では、本明細書におけるＡＡＶベクターは、（１）ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８（ＶＰ１番号付け）に、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号４０）（配列中、Ｘ１は、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ２は、Ｇ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ３は、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ４は、Ｇ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ５は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ６は、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり得、および／またはＸ７は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得ると、（２）ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２（ＶＰ１番号付け）に、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号１２５）（配列中、Ｘ１は、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ２は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ３は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ４は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ５は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得、Ｘ６は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり得、および／またはＸ７は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり得る）とを有するペプチドを含む、ＡＡＶ９カプシドタンパク質バリアントを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸４５２～４５８位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つに対応するアミノ酸で置換されていることがあり、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）のアミノ酸５８６～５９２位（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つに対応するアミノ酸で置換されていることがある、ペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、配列番号４６～１２３で示される配列のいずれか１つと少なくとも約８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列類似性を共有し得る。本明細書における一部の実施形態に従って、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、配列番号４６～１２３で示される配列のいずれか１つを含む。ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質、（配列番号１）および配列番号４６～１２３のアミノ酸配列は、下の表４で提供される。
Figure 2023524291000007
Figure 2023524291000008
Figure 2023524291000009
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Ｘ１からＸ７までとして同定されるいずれのアミノ酸残基も置換されていない実施形態では、非置換位置におけるアミノ酸残基は、参照アミノ酸配列（例えば、ＡＡＶ９（配列番号１））の野生型アミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せで配列番号１（ＡＡＶ９カプシドタンパク質；ＶＰ１番号付け）の残基４５２Ｎ、４５３Ｇ、４５４Ｓ、４５５Ｇ、４５６Ｑ、４５７Ｎ、および／または４５８Ｑにアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるカプシドタンパク質バリアントは、任意の組合せで配列番号１（ＡＡＶ９カプシドタンパク質；ＶＰ１番号付け）の残基５８６Ｓ、５８７Ａ、５８８Ｑ、５８９Ａ、５９０Ｑ、５９１Ａ、および／または５９２Ｑにアミノ酸置換を有し得る。
一部の実施形態では、本開示のカプシドタンパク質バリアントを、現在公知のまたは後に発見される任意のＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドタンパク質を改変することにより産生することができる。さらに、本開示に従って改変されることになるＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０もしくはＡＡＶ１１カプシドタンパク質、または表１に示されているＡＡＶのいずれか）であり得るが、そのように限定されない。ＡＡＶカプシドタンパク質に対する様々な操作が当技術分野において公知であり、本発明が、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の改変に限定されないことは、当業者には理解されるであろう。例えば、改変されることになるカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶと比較して１つまたは複数の変更を既に有することもある（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、または現在公知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶから誘導される）。そのようなＡＡＶカプシドタンパク質も、本開示の範囲内である。
本開示の一部の態様は、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアントのいずれかの１つまたは複数を有し得るウイルスカプシドを提供する。一部の実施形態では、本明細書におけるウイルスカプシドは、パルボウイスルカプシドであり得、パルボウイスルカプシドは、さらに、自律的パルボウイルスカプシドまたはデペンドウイルスカプシドであり得る。必要に応じて、本明細書におけるウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシドであり得る。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶカプシド、トリＡＡＶカプシド、および／または現在公知のもしくは後に同定される任意の他のＡＡＶであり得る。
一部の実施形態では、本明細書における改変ウイルスカプシドをカプシドビヒクルとして使用することができる。一部の実施形態では、分子を本明細書における改変ウイルスカプシドによりパッケージングし、細胞に移入することができ、分子は、異種ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、小有機分子、金属、またはこれらの組合せを含み得る。異種分子は、ＡＡＶ感染の際に自然に見られないもの、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによりコードされていないものと、本明細書では定義される。さらに、本明細書における使用のための治療に有用な分子を、１つまたは複数の宿主標的細胞への分子の移入のためにキメラウイスルカプシドの外側と会合させることができる。そのような会合分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小有機分子、金属、炭水化物、脂質および／またはポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本明細書における治療に有用な分子をカプシドタンパク質に共有結合で連結させる（すなわち、コンジュゲートさせる、または化学的にカップリングさせる）ことができる。分子を共有結合で連結させる方法は、当業者には公知である。
一部の実施形態では、本明細書における改変ウイルスカプシドを、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアントに対する抗体を生じさせるために使用することができる。さらなる代替案として、外来性アミノ酸配列を、細胞に対する抗原提示のために、例えば、外来性アミノ酸配列に対する免疫応答を生じさせるための対象への投与のために、改変ウイルスカプシドに挿入することができる。
一部の実施形態では、本明細書における改変ウイルスカプシドは、ウイルスカプシドを所望の標的組織上に存在する細胞表面分子と相互作用するように方向付けることができる標的化配列（例えば、ウイルスカプシド内に置換または挿入された）を含む、標的化されたウイルスカプシドであり得る（例えば、国際特許公開ＷＯ００／２８００４およびHauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774）；Shi et al., Human Gene Therapy 17:353-361 (2006)［ＡＡＶカプシドサブユニットの５２０および／または５８４位におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を記載している］；ならびに米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸４４７、５３４、５７３および５８７位の後にＲＧＤモチーフを含有するＰ１ペプチドの挿入を記載している］を参照されたい）。挿入を許容するＡＡＶカプシドサブユニット内の他の位置は、当技術分野において公知である（例えば、Grifman et al., Molecular Therapy 3:964-975 (2001)により記載されている４４９および５８８位）。
一例として、本開示のウイルスカプシドは、目的の、ある特定の標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞、および／または肺）に対して比較的非効率的な親和性を有し得る。標的化配列を、これらの低形質導入ベクターに有利に組み込んで、それによって所望の親和性、および必要に応じて特定の組織に対する選択的親和性をウイルスカプシドに付与することができる。標的化配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシドおよびベクターは、例えば、国際特許公開ＷＯ００／２８００４に記載されている。別の例として、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)により記載されているような１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸を、本発明のＡＡＶカプシドサブユニットの直交部位に、低形質導入ベクターを所望の標的組織に向け直す手段として組み込むことができる。これらの非天然アミノ酸を有利に使用して、目的の分子を、グリカン（マンノース－樹状細胞標的化）；特定のがん細胞型への標的送達のためのＲＧＤ、ボンベシンまたは神経ペプチド；例えば、増殖因子受容体、インテグリンなどの、特定の細胞表面受容体に標的化されたファージディスプレイから選択されるＲＮＡアプタマーまたはペプチドを含むがこれらに限定されない、ＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結させることができる。アミノ酸を化学的に改変する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1st edition, Academic Press, 1996を参照されたい）。
一部の実施形態では、標的化配列は、特定の細胞型に感染を方向付けるウイルスカプシド配列（例えば、自律的パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列、または任意の他のウイルスカプシド配列）であり得る。
別の非限定的な例として、ヘパリン結合ドメイン（例えば、呼吸器合胞体ウイルスヘパリン結合ドメイン）を、ＨＳ受容体を通常は結合しないカプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶ９）に挿入してまたは置換により組み込んで、結果として生じる変異体にヘパリン結合を付与することができる。別の非限定的な例では、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインを本発明のＡＡＶカプシドタンパク質に置換により組み込んで、それを含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターを、赤血球系細胞に標的化することができる。
一部の実施形態では、本明細書における使用のための外来性標的化配列は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターの親和性を変更するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態では、標的化ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するか、または代替的に、完全に、もしくは部分的に合成のものであり得る。一部の例では、標的化配列は、細胞表面受容体および糖タンパク質に結合するリガンドおよび他のペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来の増殖因子、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩなど）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、神経ペプチドおよびエンドルフィンなど、ならびにそれらの同族受容体に細胞を標的化する能力を保持するそれらの断片を含み得る。他の説明に役立つペプチドおよびタンパク質としては、サブスタンスＰ、ケラチノサイト増殖因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β－エンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン、α－ネオ－エンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン、血管作動性腸管ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、および上で記載されたようなこれらの断片が挙げられる。さらに、さらなる代替案として、毒素（例えば、破傷風毒素またはヘビ毒、例えばα－ブンガロトキシンなど）からの結合ドメインを、カプシドタンパク質に標的化配列として置換により組み込むことができる。一部の他の実施形態では、Cleves(Current Biology 7:R318 (1997)）により記載されたような「非古典的」インポート／エクスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子－１および－２、インターロイキン１、ＨＩＶ－１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）の置換によるＡＡＶカプシドタンパク質への組込みによって、ＡＡＶカプシドタンパク質を改変することができる。特定の細胞による取込みを指示するペプチドモチーフも包含され、例えば、ＦＶＦＬＰ（配列番号４１）ペプチドモチーフは、肝臓細胞による取込みを誘発する。一部の実施形態では、本明細書における使用のための標的化配列は、細胞への侵入を標的とする別の分子への化学的カップリングに使用することができる（例えば、それらのＲ基によって化学的にカップリングされ得るアルギニンおよび／またはリシン残基を含み得る）ペプチドであり得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＶＶ）は、カプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクターが得られたＡＡＶ血清型の形質導入効率と比べて同等のまたは向上した形質導入効率を有することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクター（例えば、ｃｃＡＶＶ）は、カプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクターが得られたＡＡＶ血清型の形質導入効率と比べて低下した形質導入効率を有することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクター（例えば、ｃｃＡＶＶ）は、カプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクターが得られたＡＡＶ血清型の親和性と比べて同等のまたは向上した親和性を有することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクター（例えば、ｃｃＡＶＶ）は、カプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクターが得られたＡＡＶ血清型の親和性と比べて変更されたまたは異なる親和性を有することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクター（例えば、ｃｃＡＶＶ）は、脳組織に対する親和性を有するか、または有するようにそれらを操作することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＶＶ）は、カプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクターが得られたＡＡＶ血清型の免疫学的応答と比べて減弱された免疫学的応答を生じさせることができる。一部の実施形態では、対象に、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＶＶ）を、カプシドタンパク質バリアント、ウイルスカプシドおよび／またはベクターが得られたＡＡＶ血清型を使用して投与され得る投与回数と比べて、複数回の投薬で（例えば、約２回、約３回、約４回、約５回、約１０回、約１５回、約２０回、約４０回、１つまたは複数の所望の応答を観察するために必要に応じて何回でも）投与することができる。
（Ａ）カプシドおよびｃｃＡＡＶの操作
一部の実施形態では、合理的な操作および／または変異方法を使用して、本明細書で開示されるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）のカプシドタンパク質バリアントを同定することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法を使用して、中和抗体から逃れるＡＡＶベクターを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法を使用して、改善された遺伝子導入効率を有するＡＡＶベクターを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法を使用して、１つより多くの哺乳動物種において改善された遺伝子導入効率を有するＡＡＶベクターを産生することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法を使用して、目的の細胞または組織（例えば、腎臓細胞）を特異的に標的とするＡＡＶベクターを産生することができる。
一部実施形態では、本明細書に記載される組換えＡＡＶは、１つまたは複数の哺乳動物種において、１つまたは複数のアミノ酸置換を欠いていることを除いて他の点では同一であるカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶと比べて、改善された遺伝子導入効率を有する。一部の実施形態では、改善された遺伝子導入効率は、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）のもう１つにおいて存在する／生じる。一部の実施形態では、改善された遺伝子導入効率は、次の細胞型または組織：脊髄（例えば、グリア細胞、ニューロン、内皮細胞）、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓の、１つまたは複数において生じる。一部の実施形態では、改善された遺伝子導入効率は、腎臓細胞または腎臓組織において生じる。
本開示の態様は、本明細書で開示されるようなＡＡＶベクターを産生する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、以下のステップの１つまたは複数を含み得る：ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上に三次元抗原フットプリントを形成する接触アミノ酸残基を同定するステップ；ｂ）（ａ）で同定された接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーを生成するステップ；ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーからのカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を産生するステップ；ｄ）（ｃ）のＡＡＶ粒子を細胞と、感染および複製が起こり得る条件下で接触させるステップ；ｅ）少なくとも１つの感染サイクルを完了し、対照ＡＡＶ粒子と同様の力価に複製することができる、ＡＡＶ粒子を選択するステップ；ｆ）（ｅ）で選択されたＡＡＶ粒子を中和抗体および細胞と、感染および複製が起こり得る条件下で接触させるステップ；ならびにｇ）（ｆ）の中和抗体により中和されないＡＡＶ粒子を選択するステップ。接触アミノ酸残基を同定するための方法の非限定的な例としては、ペプチドエピトープマッピングおよび／または低温電子顕微鏡法が挙げられる。ＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーを生成するために使用することができる、絶え間なく進化し続ける様々な方法およびプロトコール（例えば、合理的設計、バーコーディング、直接進化、コンピュータでの発見）があることは、当業者には理解されるであろう。本明細書における使用に好適である、当分野で公知のまたは発見されることになる、ＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーを生成する任意の方法を、本明細書で開示される方法に従って使用する、および／または使用のために最適化することができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質において同定された接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーを生成するステップは、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを生じさせることができる。一部の実施形態では、本明細書におけるｃｃＡＡＶベクターを産生する方法は、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを哺乳動物に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを哺乳動物に投与するステップは、哺乳動物への全身投与であり得る。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）種、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）種、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）種、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）種、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）種を有する哺乳動物に投与することができる。一部の実施形態では、カプシドタンパク質を、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後に哺乳動物からの細胞および／または組織から収集することにより、富化することができる。一部の実施形態では、カプシドタンパク質を、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後に哺乳動物からの細胞および／または組織から収集することにより、富化することができ、細胞および／または組織は、脊髄（例えば、グリア細胞、ニューロン、内皮細胞）、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質を、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後、約１日～約１カ月（例えば、約１日、５日、１週間、２週間、３週間、１カ月）後に哺乳動物から収集することができる。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後に哺乳動物から収集されたカプシドタンパク質を使用して、進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーと呼ばれる別のＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを生成することができる。
一部の実施形態では、進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）種、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）種、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）種、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）種、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）種を有する哺乳動物に投与することができるが、ただし、これらの種が、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを投与した種と同じでないことを条件とする。一部の実施形態では、カプシドタンパク質を、進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後に哺乳動物からの細胞および／または組織から収集することにより、富化することができる。一部の実施形態では、カプシドタンパク質を、進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後に哺乳動物からの細胞および／または組織から収集することにより、富化することができ、細胞および／または組織は、脊髄（例えば、グリア細胞、ニューロン、内皮細胞）、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質を、進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後に哺乳動物から収集し、同定することができる。一部の実施形態では、カプシドタンパク質を、進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後、約１日～約１カ月（例えば、約１日、５日、１週間、２週間、３週間、１カ月）後に哺乳動物から収集し、同定することができる。一部の実施形態では、進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーの投与後に哺乳動物から収集され、同定されたカプシドタンパク質を使用して、追加の、第２の進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを生成することができる。一部の実施形態では、第２の進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）種、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）種、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）種、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）種、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）種を有する哺乳動物に投与することができるが、ただし、これらの種が、第１の進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを投与した種と同じでないことを条件とする。一部の実施形態では、第２の進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）種、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）種、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）種、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）種、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）種を有する哺乳動物に投与することができるが、ただし、これらの種が、第１の進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを投与した種と同じでないこと、およびこれらの種が、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを投与した種と同じであることを条件とする。一部の実施形態では、第２の進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）種、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）種、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）種、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）種、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）種を有する哺乳動物に投与することができるが、ただし、これらの種が、第１の進化したＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを投与した種と同じでないこと、およびこれらの種が、親ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを投与した種と同じでないことを条件とする。
一部の実施形態では、進化したライブラリーの各世代を、ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを共進化させる「サイクル」と呼ぶことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを共進化させる本明細書における方法は、約１～約１０（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）サイクルを含み得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるような各サイクルを、先行するサイクルとは異なる種で行うことができる。一部の例では、ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを共進化させる本明細書における方法は、マウスにおける１つのサイクル、ブタにおける第２のサイクル、マウスにおける第３のサイクル、ブタにおける第４のサイクルなどを含み得る。一部の例では、ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを共進化させる本明細書における方法は、マウスにおける１つのサイクル、非ヒト霊長類における第２のサイクル、マウスにおける第３のサイクル、非ヒト霊長類における第４のサイクルなどを含み得る。一部の例では、ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを共進化させる本明細書における方法は、マウスにおける１つのサイクル、ブタにおける第２のサイクル、非ヒト霊長類における第３のサイクル、マウスにおける第４のサイクルなどを含み得る。一部の例では、ＡＡＶカプシドタンパク質ライブラリーを共進化させる本明細書における方法は、ブタにおける１つのサイクル、マウスにおける第２のサイクル、非ヒト霊長類（例えば、サル）における第３のサイクルなどを含み得る。
一部の実施形態では、新規アデノ随伴ウイルス株を進化させる方法であって、複数の哺乳動物種にわたってＡＡＶライブラリーを継代するステップを含み、ＡＡＶライブラリーが、複数の組換えＡＡＶベクターを含み、各組換えＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて１つまたは複数のアミノ酸変異を含むカプシドタンパク質バリアントを含む、方法。一部の実施形態では、ＡＡＶライブラリー内の各組換えＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１）と比べて１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸変異は、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８、もしくは配列番号１の５８６～５９２に対応する領域にあるか、または変異は、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８および５８６～５９２に対応する両方の領域に見られる。
一部の実施形態では、新規ＡＡＶ株を進化させる方法は、第１のＡＡＶライブラリーを第１の哺乳動物種に投与するステップを含む。次いで、第１の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織に存在する第１のＡＡＶライブラリーからのＡＡＶをシークエンシングし、第２のＡＡＶライブラリーを生成するために使用することができる。その後、第２のＡＡＶライブラリーを第２の哺乳動物種に投与することができ、第１の哺乳動物種と前記第２の哺乳動物種は異なる。次いで、第２の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織に存在する第２のＡＡＶライブラリーからのＡＡＶをシークエンシングすることができる。一部の実施形態では、第１の哺乳動物種および第２の哺乳動物種は、各々独立して、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）からなる群から選択される。次いでこれらのステップを、第３、第４、第５、第６などの種で、反復することができる。一部の実施形態では、第１の哺乳動物種、第２の哺乳動物種（または任意の後続の種）の１つまたは複数の標的組織は、脊髄（例えば、グリア細胞、ニューロン、内皮細胞）、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せから選択される。
（Ｂ）ＡＡＶベクター
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアントの１つまたは複数を含むＡＡＶベクターを提供する。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、異種分子を輸送する、形質導入する、またはその担体として別様に作用する、任意の分子または部分を指す。「ウイルスベクター」は、目的のペイロード分子、例えば、導入遺伝子、ポリペプチドもしくは複数ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または調節核酸、をコードするかまたは含む１つまたは複数のポリヌクレオチド領域を含む、ベクターである。本発明のウイルスベクターは、当技術分野において公知の方法を使用して組換えにより産生することができる。そのような技法は、文献で、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；およびCell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Pressで、十分に説明されている。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶウイルス粒子は、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアントの１つまたは複数を発現するためのベクターゲノムを有することができる。ＡＡＶベクターのベクターゲノムは、一部の実施形態では、分子法を使用してウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去し、非ネイティブ核酸、例えば、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、目的の導入遺伝子のコード配列）で置き換えることにより、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムから誘導することができる。典型的には、ＡＡＶベクターの場合、野生型ＡＡＶゲノムの一方または両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、ＡＡＶベクター内に保持されるが、保持されたＩＴＲの間の野生型ウイルスゲノムの他の部分は、異種ポリヌクレオチド配列などの非ネイティブ配列と置き換えられる。本明細書で開示されるベクターゲノムは、ＡＡＶゲノム由来の骨格エレメントと、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアントのコード配列と、コード配列に作動可能に連結されている好適なプロモーターとを包含し得る。一部の例では、本明細書で開示されるベクターゲノムは、コードされたタンパク質の発現および／または分泌を調節する調節配列をさらに含み得る。例としては、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列、マイクロＲＮＡ－標的部位、またはこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
一部の例では、本明細書に記載されるベクターゲノムは、一本鎖状であり得る。他の例では、本明細書に開示されるベクターゲノムは、二本鎖状であり得る。例えば、本明細書に記載されるベクターゲノムは、その中に二本鎖部分を含むことができる自己相補的ＡＡＶベクターゲノムであり得る。
（１）ＡＡＶ－骨格エレメント
一部の実施形態では、本明細書で開示されるベクターゲノムは、１つまたは複数のＡＡＶ－ゲノム由来の骨格エレメントを有することができ、このエレメントは、ＡＡＶベクターの生物活性に必要な最小限のＡＡＶゲノムエレメントを指す。例えば、ＡＡＶ－ゲノム由来の骨格エレメントは、ベクターをＡＡＶウイルス粒子に組み立てるためのパッケージング部位と、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアントの１つまたは複数と、ベクターの複製に必要なおよび／またはその中に含まれている導入遺伝子コード配列の宿主細胞における発現に必要なエレメントとを含み得る。
一部の例では、本明細書で開示されるベクターゲノム骨格は、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の例では、本明細書におけるベクターゲノム骨格は、２つのＩＴＲ配列を含み得る。一部の例では、１つのＩＴＲ配列は、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の５’であり得る。一部の例では、１つのＩＴＲ配列は、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の３’であり得る。一部の例では、本明細書における導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、両側にＩＴＲ配列が隣接していることもある。したがって、一部の実施形態では、ベクターゲノムは、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲの間に位置する導入遺伝子を含む。
一部の実施形態では、本明細書におけるベクターゲノムは、少なくとも１つの明確に異なるＡＡＶ血清型に由来する配列または構成要素を含み得る。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターゲノム骨格は、１つの明確に異なるＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列を少なくとも含み得る。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターゲノム骨格は、１つの明確に異なるヒトＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列を少なくとも含み得る。そのようなヒトＡＡＶは、任意の公知の血清型に、例えば、血清型１～１１のいずれか１つに、由来し得る。一部の例では、本明細書で使用されるＡＡＶ血清型は、中枢神経系（ＣＮＳ）、心臓組織、骨格筋、および／または肝臓組織に対する親和性を有する。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターゲノム骨格は、血清型ＡＡＶ９のＩＴＲ配列を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクターは、シュードタイプ化ＡＡＶベクターであり得る（すなわち、少なくとも２つの明確に異なるＡＡＶ血清型に由来する配列または構成要素を含む）。一部の実施形態では、本明細書におけるシュードタイプ化ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノム骨格と、明確に異なるＡＡＶ血清型に少なくとも一部は由来するカプシドタンパク質とを含み得る。一部の例では、本明細書におけるシュードタイプ化ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ベクターゲノム骨格と、心臓組織に対して親和性を有するＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９）に由来するカプシドタンパク質とを有し得る。
ウイルスベクター媒介遺伝子導入の成功を分析するためには、ベクターの分布とベクター媒介遺伝子発現の有効性の両方をモニターすることができることが重要であり得る。これは、レポーター遺伝子をベクターゲノム骨格にサブクローニングすることにより達成することができる。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターゲノム骨格は、レポーター遺伝子を含有し得る。いくつかのレポーター遺伝子は、このために一般に使用されており、様々な色の蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む）、Ｅ．ｃｏｌｉ β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、および様々な形態のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を含むが、これらに限定されない。一部の例では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター骨格は、ＧＦＰを含有し得る。
本明細書で開示されるベクター構築物は、公知の技法を使用して調製することができる。（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel., F. et al., eds, Wiley and Sons, New York 1995を参照されたい）。組換えゲノムがＡＡＶ粒子のパッケージング能力を超えないように、断片長を選ぶことができる。必要に応じて、「スタッファー」ＤＮＡ配列を構築物に付加させて、比較のための標準的なＡＡＶゲノムサイズを維持することができる。そのような断片は、そのような非ウイルス源、例えば、ｌａｃＺ、または当業者に公知であり、利用可能である他の遺伝子、に由来し得る。
（２）自己相補的ＡＡＶウイルスベクター
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターであり得る。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、相補配列を含有し、これらの相補配列は、感染細胞への侵入時に自発的にアニールする（折り重なって二本鎖ゲノムを形成する）ことができ、したがって、細胞のＤＮＡ複製機構を使用して一本鎖ＤＮＡベクターを変換する必要をなくすことができる。自己相補ゲノムを有する本明細書におけるＡＡＶは、その部分相補配列（例えば、導入遺伝子コード配列の相補コードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成することができる。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＡＡＶウイルスベクターは、鎖内塩基対を形成することができる、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列を含み得る。一部の例では、第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対合を助長する配列により、例えば、ヘアピンＤＮＡ構造を形成するように、連結されている。一部の例では、細胞に侵入するとｓｃＡＡＶベクターの二量体構造は、２つの末端分解部位（ｔｒｓ）の一方の変異または欠失により安定化され得る。ｔｒｓは、各ＩＴＲ内に含有されるＲｅｐ結合部位であるので、そのようなｔｒｓの変異または欠失は、単量体を形成するようなＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によるｓｃＡＡＶベクターの二量体構造の切断を防止することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＡＡＶウイルスベクターは、短縮型５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、短縮型３’ＩＴＲ、または両方を含み得る。一部の例では、本明細書で開示されるｓｃＡＡＶベクターは、Ｄ領域またはその一部分（例えば、その中の末端分解配列）が欠失され得る短縮型３’ＩＴＲを含み得る。そのような短縮型３’ＩＴＲは、上述の第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列の間に位置し得る。
（３）プロモーター
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、発現に必要なさらなるエレメント、例えば、導入遺伝子コード配列の発現を制御する少なくとも１つの好適なプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、感染組織におけるタンパク質の効率的かつ好適な産生を可能にするために、普遍的、組織特異的、強い、弱い、調節されている、キメラなどであり得る。プロモーターは、コードされたタンパク質と同種であっても、異種であってもよく、細胞、ウイルス、真菌、植物または合成プロモーターを含む。本明細書における使用に最も好ましいプロモーターは、ヒト細胞において機能性であり得る。普遍的プロモーターの非限定的な例としては、ウイルスプロモーター、特に、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、および細胞プロモーター、例えば、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書におけるウイルスプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはこれらの任意の組合せであり得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、発現に必要なさらなるエレメント、例えば、適切な細胞の感染後の導入遺伝子コード配列の発現を制御する少なくとも１つの好適なプロモーターを含み得る。本明細書における使用に好適なプロモーターは、ＡＡＶプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはニワトリベータアクチン／サイトメガロウイルスハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）に加えて、内皮細胞特異的プロモーター、例えば、ＶＥ－カドヘリンプロモーター、ならびにステロイドプロモーターおよびメタロチオネインプロモーターを含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるベクターにおいて使用されるプロモーターは、ＣＡＧプロモーターであり得る。
一部の実施形態では、本発明による導入遺伝子コード配列は、発現されることになる導入遺伝子コード配列に機能的に連結されている組織特異的プロモーターを含む。したがって、組織（例えば、脳、心臓、筋肉、肝臓）に対する本開示によるベクターの特異性をさらに増加させることができる。一部の例では、本明細書で開示されるベクターは、特異的組織における活性が、特異的組織でない組織におけるよりも少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍高い、組織特異的プロモーターを有し得る。一部の例では、本明細書における組織特異的プロモーターは、ヒト組織特異的プロモーターである。一部の例では、発現カセットは、発現されることになる外来性タンパク質の発現レベルを上昇させるためのエンハンサーエレメントも含み得る。さらに、発現カセットは、ポリアデニル化配列、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列をさらに含み得る。
（４）遺伝子発現のための他の調節エレメント
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、プラスミドベクターがトランスフェクトされた細胞または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞においてその転写、翻訳および／または発現を可能にするように導入遺伝子コード配列に作動可能に連結されている、１つまたは複数の従来の制御エレメントを含み得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結されている」配列は、導入遺伝子コード配列と連続している発現制御配列、および導入遺伝子コード配列を制御するためにトランスでまたは少し離れて作用する発現制御配列の両方を含み得る。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびに所望される場合、コードされた産物の分泌を増進する配列を、さらに含み得る。ネイティブ、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターを含む、多数の発現制御配列が、当技術分野において公知であり、本明細書で利用され得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターは、ベクターの親和性を変更するために、非ウイルス由来のまたは構造的に改変されたタンパク質またはペプチドを含む、改変カプシドを含み得る。例えば、カプシドは、特定の受容体のリガンド、または特定のリガンドの受容体を、前記受容体またはリガンドをそれぞれ発現する細胞型にベクターを標的化するために含み得る。
（Ｃ）ＡＡＶウイルス粒子の血清型
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターを、様々な血清型のＡＡＶから調製または誘導することができる。用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に明確に異なるカプシドを有するＡＡＶについての明確な差異である。血清学的な明確な差異は、他のＡＡＶと比較したときのそのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。交差反応性は、当技術分野において公知の方法を使用して測定することができる。例えば、本明細書における交差反応性を、中和抗体アッセイを使用して測定することができる。このアッセイのために、アデノ随伴ウイルスを使用して、ウサギまたは他の好適な動物モデルにおいて、特定のＡＡＶに対するポリクローナル血清が生成される。このアッセイでは、次いで、特定のＡＡＶに対して生成された血清が、同じ（同種）ＡＡＶまたは異種ＡＡＶのいずれかを中和するその能力に関して試験される。５０％中和を達成する希釈度が中和抗体力価とみなされる。２つのＡＡＶについて、異種の力価を同種の力価で割った商が相反的に１６未満である場合、それら２つのベクターは、同じ血清型とみなされる。逆に言えば、異種の力価の同種の力価に対する比が相反的に１６またはそれより大きい場合、２つのＡＡＶは、明確に異なる血清型とみなされる。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクターは、ＡＡＶの少なくとも２つの血清型が混合されるか、またはキメラ（例えば、シュードタイプ化）ＡＡＶウイルスを産生するために他のタイプのウイルスと混合されたものであり得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクターは、ヒト血清型ＡＡＶベクターであり得る。そのようなヒトＡＡＶは、任意の公知の血清型に、例えば、血清型１～１１のいずれか１つに、由来し得る。
（Ｄ）ＡＡＶ粒子を作製する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターゲノムをウイルス粒子にパッケージングすることができ、これらのウイルス粒子を使用して、標的細胞における導入遺伝子コード配列の発現のためにゲノムを送達することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクターゲノムを、一過性トランスフェクション、産生細胞系の使用、Ａｄ－ＡＡＶハイブリッドへのウイルスの特色の統合、ヘルペスウイルス系の使用、またはバキュロウイルスを使用する昆虫細胞における産生により、粒子にパッケージングすることができる。
本明細書における使用のためのパッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な構成要素の全てを安定的に発現する細胞系を作出するステップを含み得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子を、細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加などの手順により、または直接、平滑末端ライゲーションにより、細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞系をアデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が、選択可能であり、ｒＡＡＶの大量生産に好適であることである。本明細書における好適な方法の例は、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
（Ｅ）ＡＡＶベクターおよびＡＡＶ粒子の特徴
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して１つまたは複数の改善を有し得る。本明細書で使用される場合、「天然単離ＡＡＶベクター」は、本明細書で開示されるカプシドタンパク質バリアントの１つまたは複数を含まないベクターを指す。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して細胞における遺伝子導入効率の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して細胞における遺伝子導入効率の少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）の増加を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、１つまたは複数の哺乳動物種の細胞および／または組織において遺伝子導入効率の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）、およびこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の細胞および／または組織において遺伝子導入効率の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、哺乳動物の脊髄（例えば、グリア細胞、ニューロン、内皮細胞）、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、肝臓組織、およびこれらの任意の組合せの細胞および／または組織において遺伝子導入効率の増加を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較してより高いベクター力価を有し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）高いベクター力価を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して、抗体媒介中和を受けにくい可能性がある。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して、抗体媒介中和を約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）受けにくい可能性がある。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して、対象への投与後少なくとも約１時間～約２４時間（例えば、約１、２、４、８、１２、１６、２０、２４時間）、抗体媒介中和を受けにくい可能性がある。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、本明細書における対象への少なくとも１回の投与後に、天然単離ＡＡＶベクターと比較してより低いレベルの抗ＡＡＶ抗体を生じさせ得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、本明細書における対象への少なくとも１回の投与後に、天然単離ＡＡＶベクターと比較して約２分の１～約５０分の１（例えば、約２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１）の抗ＡＡＶ抗体を生じさせ得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子を含む遺伝子治療剤を、本明細書における対象に、抗体媒介中和を受けやすくなることなく、約２回～約１０回（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、投与することができる。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、１種より多くの哺乳動物の任意の細胞または組織型に発現し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ヒヒ、ゴリラ）を含む１種より多くの哺乳動物の任意の細胞または組織型に発現し得る。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）および／またはＡＡＶ粒子は、ヒト、マウス、イヌおよび非ヒト霊長類の任意の細胞または組織型に発現し得る。
ＩＩＩ．医薬組成物
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）、ウイルスカプシド、および／またはＡＡＶウイルス粒子のいずれかを製剤化して、医薬組成物を形成することができる。一部の例では、本明細書における医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。本方法で使用されることになる医薬組成物のいずれかは、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を凍結乾燥製剤または水溶液の形態で含み得る。
医薬組成物中の担体は、それが組成物の活性成分と相溶性であり、好ましくは、活性成分を安定化することができ、処置されることになる対象に対して有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。例えば、「薬学的に許容される」は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されたときに生理学的に許容され、不都合な反応を概して生じさせないようなものを含む組成物の分子実体および他の成分を指し得る。一部の例では、本明細書で開示される医薬組成物において使用される「薬学的に許容される」担体は、哺乳動物における、とりわけ、ヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の監督機関により認可された、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に列挙されているものであり得る。
緩衝剤を含む、薬学的に許容される担体は、当技術分野において周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存薬；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖類；二糖類；ならびに他の炭水化物；金属錯体；ならびに／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。
一部の実施形態では、医薬組成物または製剤は、非経口投与、例えば、静脈内、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、またはこれらの組合せのためのものである。そのような薬学的に許容される担体は、滅菌液、例えば、水および油であり得、この油には、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油などが含まれる。食塩溶液、ならびにデキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に、用いることができる。本明細書で開示される医薬組成物は、追加の成分、例えば、保存薬、緩衝剤、等張剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤または清澄剤、粘度上昇剤などをさらに含み得る。本明細書に記載される医薬組成物を、単回単位投薬量でまたは複数剤形で包装することができる。
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を所期のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る、水性および非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る、水性および非水性滅菌懸濁液を含む。水溶液は、好適に（好ましくは、３～９のｐＨに）緩衝され得る。滅菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技法によって容易に果たされる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、無菌であるべきである。これは、例えば滅菌濾過膜による濾過によって、容易に果たされる。滅菌注射用溶液は、一般に、必要量の活性物質（例えば、ＡＡＶベクター（例えばｃｃＡＡＶ）、ウイルスカプシド、および／またはＡＡＶウイルス粒子）を、上に列挙されている様々な他の成分を必要に応じて有する適切な溶媒に添合し、続いて濾過滅菌することにより、調製される。一般に、分散液は、塩基性分散媒と上に列挙されたものからの他の必要成分とを含有する滅菌ビヒクルに滅菌活性成分を添合することにより、調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末を、事前に滅菌濾過されたその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥技法である。
本明細書で開示される医薬組成物は、希釈剤およびアジュバントなどの、他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で不活性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、もしくは他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）もしくはポリエチレングリコールを含む。
ＩＶ．使用方法
本明細書に記載される組成物（例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）、ウイルスカプシド、および／またはＡＡＶウイルス粒子）のいずれかを、疾患または状態を緩和および／または処置するために使用することができる。したがって、一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される組成物により、処置を必要とする対象における、１つもしくは複数の症状を緩和するためのおよび／または疾患もしくは状態を処置するための方法、ならびにそのような組成物を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書における方法の対象は、ヒト対象であり得る。一部の実施形態では、対象は、以前に野生型ＡＡＶまたは組換え（ｒＡＡＶ）ベクターに曝露されたことがない対象であり得る。一部の実施形態では、対象は、以前にｒＡＡＶベクターを投与されたことがない対象であり得る。一部の実施形態では、対象は、以前にｒＡＡＶベクター、例えば、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを投与されたことがある対象である。ＡＡＶもしくはｒＡＡＶに曝露されたことがあるまたはそれを投与されたことがある対象は、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ検出により、またはカプシドもしくは導入遺伝子のどちらかであるＡＡＶもしくはｒＡＡＶに対する抗体力価を測定することにより、同定することができる。一部の実施形態では、対象は、酵素補充療法（例えば、酵素タンパク質の投与による）を投与されたことがない対象であり得る。酵素補充療法を投与されたことがある対象は、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、酵素に対する抗体力価を測定することにより、同定することができる。しかし、一部の実施形態では、対象は、以前に酵素補充療法で処置されたことがある。一部の実施形態では、対象は、中和抗体（ＮＡｂ）を取り除くための１つまたは複数の手法（例えば、プラスマフェレーシス、免疫抑制、酵素分解）を受けたことがある対象である。一部の実施形態では、本明細書における使用方法の好適な対象は、本明細書に記載される組成物（例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）、ウイルスカプシド、および／またはＡＡＶウイルス粒子）のいずれかの投与の前に中和抗体（ＮＡｂ）を取り除く必要がない場合がある。
一部の実施形態では、対象は、遺伝子治療剤で処置され得る疾患を有するか、または有する疑いがある。本明細書で開示される方法を使用して処置され得る説明に役立つ疾患または状態としては、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されない：嚢胞性線維症（嚢胞性線維症性膜貫通調節タンパク質）および他の肺疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞系由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復配列を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経障害、がん（エンドスタチン、アンギオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド；インターフェロンを含む、サイトカイン；ＶＥＧＦもしくは多剤耐性遺伝子産物、ｍｉｒ－２６ａに対する［例えば、肝細胞癌のための］ＲＮＡｉを含む、ＲＮＡｉ）、糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型を含む筋ジストロフィー（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、ａ、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩカッパＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子におけるスプライス部位に対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ（例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照されたい）、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス（例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照されたい）、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベーカー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（ａ－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリー病［ａ－ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸性ａ－グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（アルアンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸脱水素酵素）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性のためのＰＤＧＦ、および／または例えばＩ型糖尿病の際の、網膜障害を処置／予防するためのバソヒビンもしくは他のＶＥＧＦ阻害剤もしくは他の血管新生阻害剤）、脳などの固形臓器の疾患（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞種［エンドスタチン、アンギオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽細胞腫［エンドスタチン、アンギオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肝臓、腎臓、心臓（うっ血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む）（例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－ｌ）およびその断片（例えば、ＩＩＣ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、Ｐ２－アドレナリン受容体、ｐ２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、例えば、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン（calsarcin）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅなどを送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、内皮型ＮＯ合成酵素、誘導型ＮＯ合成酵素を送達することによる）、移植心の生存率を向上させる（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠損症（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗炎症因子、例えば、ＩＲＡＰおよびＴＮＦａ可溶性受容体）、肝炎（ａ－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病；ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症；フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患など。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクター、組成物および方法を使用して、腎臓疾患もしくは腎臓障害、例えば、アルポート症候群、良性家族性血尿、多発性嚢胞腎（例えば、１型もしくは２型）、フォンヒッペル（VonLippel）・リンドウ病、腎性尿崩症（diabetes insipidius）、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、腎結石症（nephrolithiasais）、低リン血症性くる病、ファブリー病、ネフロン癆（nephronophytis）、またはステロイド抵抗性ネフローゼ症候群を処置することができる。
本明細書で開示される方法を行うために、組成物（例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）、ウイルスカプシド、および／またはＡＡＶウイルス粒子）またはそのような組成物を含む医薬組成物の有効量を、処置を必要とする対象に、好適な経路（例えば、筋肉内、静脈内、脳室内注射、大槽内注射、硝子体内、網膜下、結膜下、球後、前房内、上脈絡膜、冠動脈内注射、動脈内注射、および／または実質内注射）によって、本明細書で開示されるような好適な量で投与することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）を細胞に導入する方法であって、細胞を本明細書で開示される組成物と接触させるステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書における１つまたは複数のＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）を細胞に送達するステップであって、細胞または層をウイルスベクターと接触させることを含み、ウイルスベクターが、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む、ステップを含み得る。この方法の一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、１つまたは複数の異種分子を細胞に送達することができる。これらの実施形態に従って、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、１つまたは複数の治療用異種分子を細胞に送達することができる。一部の例では、本明細書における方法を使用して細胞に送達される１つまたは複数の治療用異種分子は、治療用タンパク質、治療用ＤＮＡ、および／または治療用ＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、モノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、治療用ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどであり得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）をＣＮＳ組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはこれらの任意の組合せに導入する方法であって、細胞を本明細書で開示されるウイルスベクターおよび／または組成物と接触させるステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、ＣＮＳ組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、骨格筋組織またはこれらの任意の組合せへの親和性が増強された本明細書で開示される１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを有するＡＡＶ粒子を投与することにより、本明細書におけるＡＡＶベクターを特定の組織に送達することができる。
一部の実施形態では、本明細書における１つまたは複数の核酸分子を有する少なくとも１つのＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）、ウイスルカプシドおよび／またはＡＡＶウイルス粒子を組織に投与する方法は、ベースラインと比較して少なくとも１つのタンパク質および／または遺伝子の発現を実質的にモジュレートする。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）が投与される前の少なくとも１つの導入遺伝子（および導入遺伝子のコード産物）の発現を指す。本明細書で使用される場合、「発現を実質的にモジュレートする」は、ベースラインと比較して発現の少なくとも１倍の変化（例えば、発現増加、発現減少）を指す。一部の実施形態では、本明細書で開示される１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを有する少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）を組織に投与する方法は、少なくとも１つのタンパク質および／または遺伝子の発現をベースラインと比較して少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）モジュレートする。一部の実施形態では、本明細書で開示される１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを有する少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはＡＡＶベクターを組織に投与する方法は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）が、ＣＮＳ組織、腎臓組織、心臓組織、肝臓組織、骨格筋組織、またはこれらの任意の組合せに送達されるとき、少なくとも１つのタンパク質および／または遺伝子の発現をベースラインと比較して少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）モジュレートする。
本明細書で開示される方法のいずれかにおいて、本明細書に記載される組成物（例えば、ＡＡＶベクター、ウイルスカプシド、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム、ｃｃＡＡＶ）の有効量を、疾患およびまたは状態に関連する１つまたは複数の症状を緩和するために、それを必要とする対象に与えることができる。「有効量」は、本明細書で使用される場合、疾患およびまたは状態を有する対象に対する治療効果を付与するのに十分である開示組成物の用量を指す。一部の実施形態では、有効量は、対象における疾患または状態の少なくとも１つの症状を低減させる量であり得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示されとおりの少なくとも１つのＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）を投与する方法は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して細胞における遺伝子導入効率の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるとおりの少なくとも１つのＡＡＶベクターを投与する方法は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して細胞における遺伝子導入効率の少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるとおりの少なくとも１つのＡＡＶベクターを投与する方法は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して組織における遺伝子導入効率の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるとおりの少なくとも１つのＡＡＶベクターを投与する方法は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して組織における遺伝子導入効率の少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるとおりの少なくとも１つのＡＡＶベクターを投与する方法は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して対象における遺伝子導入効率の増加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるとおりの少なくとも１つのＡＡＶベクターを投与する方法は、天然単離ＡＡＶベクターと比較して対象における遺伝子導入効率の少なくとも約２倍～約５０倍（例えば、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍）の増加を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、少なくとも１つのＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）を対象に少なくとも１回投与することを含み得る。一部の実施形態では、本明細書における方法は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子および／または少なくとも１つのＡＡＶベクターを対象に１回より多く投与することを含み得る。一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書における少なくとも１つのＡＡＶベクターを、対象に、少なくとも１回～少なくとも１０回の間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回）投与することを含み得る。一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書における少なくとも１つのＡＡＶベクターを、対象に、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回投与することを含み得る。一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書における少なくとも１つのＡＡＶベクターを、対象に、１日１回、隔日、週１回、２週間に１回、３週間に１回、月１回、隔月、３カ月に１回、４カ月に１回、年１回、または年２回、投与することを含み得る。一部の実施形態では、本明細書における方法は、本明細書における少なくとも１つのＡＡＶベクターを、対象に、所望の応答が見られるまで必要に応じて何度も投与することを含み得る。一部の例では、所望の応答は、本明細書におけるＡＡＶベクターの用量の投与後の対象における疾患および／または状態の少なくとも１つの症状についてのＡＡＶベクターの投与前と比較しての減弱であり得る。疾患／状態、疾患／状態の重症度、対象の特徴（例えば、年齢、性別、体重）などに従って、投薬レジメンを最適化することができることは、当業者には理解されるであろう。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）をｃｒｅ－リコンビナーゼの送達に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）をｃｒｅ－リコンビナーゼの送達に使用して、細胞、組織および／または対象における１つまたは複数の遺伝子の条件付き活性化、条件付き不活性化、活性化、不活性化、またはこれらの任意の組合せをもたらすことができる。これらの実施形態の一部に従って、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）は、１つまたは複数の特定の細胞および／または組織型にｃｒｅ－リコンビナーゼを送達する。
一部の実施形態では、本明細書におけるＡＡＶベクター（例えば、ｃｃＡＡＶ）をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に使用することができる。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」系または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集」は、ゲノム編集／操作用に改変されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を指す。この系は、典型的には、「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）から構成される。「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」は、本明細書では「短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」または「一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と同義で使用される。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９結合に必要な「足場」配列と、改変されることになるゲノム標的を定義するユーザー定義の約２０ヌクレオチド「スペーサー」または「標的化」配列とで構成されている、短鎖合成ＲＮＡである。ｓｇＲＮＡ中に存在する標的化配列を変えることにより、Ｃａｓ９のゲノム標的を変えることができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ベクターゲノムを含み、ベクターゲノムは、遺伝子編集分子をコードする。一部の実施形態では、遺伝子編集分子は、ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼである。一部の実施形態では、遺伝子編集分子は、ｓｇＲＮＡである。
Ｖ．キット
本開示は、本明細書に記載の組成物（例えば、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム、ウイルスカプシド、ｃｃＡＡＶ）のいずれか１つの調製における使用のためのキット、および本明細書に記載の１つまたは複数の治療上の使用を有するキットも提供する。本明細書に記載の使用のためのキットは、医薬組成物に配合される、本明細書に記載の組成物（例えば、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム、ウイルスカプシド、ｃｃＡＡＶ）をさらに含む１つまたは複数の容器を含み得る。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおける組成物（例えば、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶゲノム、ウイルスカプシド、ｃｃＡＡＶ）の使用説明書をさらに含み得る。含まれる説明書は、対象において所期の活性を実現するための対象への組成物またはそのような組成物を含む医薬組成物の投与についての記述を含み得る。キットは、対象が処置を必要としているかどうかを特定することに基づく処置に好適な対象を選択することについての記述をさらに含み得る。本明細書に記載の組成物の使用に関する説明書は、一般に、所期の処置のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。
容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数用量包装）、または部分単位用量であり得る。本開示のキットに供給される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書に書かれた説明書である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が対象における疾患もしくは障害を処置する、その発症を遅延する、および／またはそれを緩和するために使用されることを示す。
本明細書で提供されるキットは、好適な包装材の中に存在する。好適な包装材としては、バイアル、ビン、ジャー、可撓性包装材などが挙げられるが、それらに限定されない。吸入器、経鼻投与デバイスまたは注入デバイスなどの、特定のデバイスと組み合わせて使用するための、包装材も企図される。キットは、無菌取出口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により穴を空けることが可能なストッパーを有する静脈内注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器も無菌取出口を有し得る。
キットは、必要に応じて、追加の構成要素、例えば、緩衝剤および解釈情報を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上にまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む。一部の実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製造物品を提供する。
本開示を、その具体的な実施形態を参照して説明してきたが、本開示の真の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を加えることができ、同等のものを代用することができることを当業者は理解されたい。加えて、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、プロセスのステップ（単数または複数）を本開示の目的、趣旨および範囲に適応させるために、多くの改変を加えることができる。そのような改変形態は全て、本開示の範囲内であることが意図される。
（実施例１）
ＡＡＶカプシドの異種間進化
共進化ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを生成するための方法は、以下のとおりである。第１のステップは、低温電子顕微鏡法を使用するＡＡＶ９カプシド表面の立体構造３Ｄ抗原エピトープの同定を含んだ。次いで、表面ループ内の同定されたアミノ酸残基の飽和変異誘発によってＡＡＶ９ライブラリーを操作した。具体的には、可変領域ＩＶ（４５２－ＮＧＳＧＱＮＱ－４５８；配列番号３８）内および可変領域ＶＩＩＩ（５８６－ＳＡＱＡＱＡＱ－５９２；配列番号３９）内のアミノ酸残基を、飽和変異誘発、および２つの異なるＡＡＶライブラリー－可変領域ＩＶ（ＶＲ４）ＡＡＶ親ライブラリーおよび可変領域ＶＩＩＩ（ＶＲ８）親ライブラリー－の生成に選択した。抗原モチーフ内の選択された残基を、縮重プライマーを使用する変異誘発に供し、各コドンをヌクレオチドＮＮＫにより置換し、遺伝子断片をギブソンアセンブリー（配列オーバーラップに基づく方法）により互いに結合させた。具体的には、ＡＡＶ ＶＲ４（可変領域ＩＶ）およびＶＲ８（可変領域ＶＩＩＩ）ライブラリーを生成するための、２１－ｍｅｒ（ＮＮＲＮＮＲＮＮＲＮＮＲＮＮＲＮＮＲＮＮＲ；配列番号１２４）を含有するオリゴヌクレオチド、およびＡＡＶ９ Ｃａｐ遺伝子に対する相同アームは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成されたものであり、この場合、「Ｎ」は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）に対応し、「Ｒ」は、カプシドライブラリーにおける未成熟停止コドン生成を防止するためにＧまたはＣのどちらかに対応する。
変異抗原モチーフの縮重ライブラリーを含有する得られたカプシドコード遺伝子を野生型ＡＡＶゲノムにクローニングして元のＣａｐコードＤＮＡ配列を置き換え、プラスミドライブラリーを得た。具体的には、プラスミドは、ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接しているＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＡＡＶ９ Ｃａｐをコードする遺伝子を含有し、ＡＡＶ９ Ｃａｐ中のアミノ酸を停止コドンに変異させて野生型ＡＡＶ９プラスミドの夾雑を低減させた。
次いで、ＶＲ４およびＶＲ８親プラスミドライブラリーをアデノウイルスヘルパープラスミドとともにＨＥＫ２９３産生細胞系にトランスフェクトして、ＡＡＶ ＶＲ４カプシドおよびＡＡＶ ＶＲ８カプシド親ライブラリーを生成した。手短に言えば、ＨＥＫ２９３細胞に、ポリエチレンイミンおよび当モル比のｐＴＲ－ＡＡＶ９－ライブラリーとアデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６８０を、７０～８０％コンフルエンスでトランスフェクトした。ＨｕＨ７（ヒト肝細胞癌）細胞を約７５％コンフルエンスまで培養し、一晩、細胞あたり５，０００ウイルスゲノムでＡＡＶ９ライブラリーに感染させた。翌日、培養培地を、０．５の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄ５を含有する培地と交換した。５０％～７５％細胞変性効果で、上清を収集し、５５℃で３０分間インキュベートしてＡｄ５を不活性化した。培地中のデオキシリボヌクレアーゼＩ耐性ウイルスゲノムを定量化し、後続の感染ラウンドの接種材料として役立てた。
異種間ｉｎ ｖｉｖｏ ＡＡＶカプシドスクリーニング。中和抗体（ＮＡｂ）を逃避すること、中枢神経系（ＣＮＳ）を標的とすること、および／または天然に存在するＡＡＶ９よりも強力に作用することができる、新しいＡＡＶ９株を選択するために、上で説明したように調製したＡＡＶライブラリーを、３つの異なる哺乳動物種における複数の感染ラウンドまたは「サイクル」に供した。第１のサイクルでは、上で説明したように調製したＡＡＶ ＶＲ４カプシド親ライブラリーまたはＡＡＶ ＶＲ８カプシド親ライブラリーを、４週齢の仔ブタに、約３×１０１３～５×１０１３ｖｇ／ｋｇ（ウイルスゲノム／キログラム）で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。注射の６日後にブタを屠殺し、様々な脳領域（小脳、前頭、側頭、頭頂、後頭皮質、海馬、視床、および中脳）から抽出したゲノムＤＮＡからウイルスＤＮＡを、ＤＮＡ配列に隣接するＶＲ４またはＶＲ８を標的とするオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲによって増幅し、それを使用してＡＡＶライブラリー配列を増幅した。手短に言えば、この第１のサイクルからの進化ＡＡＶライブラリーを増幅するために、採取したブタ脳組織からデオキシリボヌクレアーゼＩ耐性ウイルスゲノムを単離し、プライマー５’－ＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧ－３’（配列番号４２）および５’－ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＡＧＡＣＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＡＡＧ－３’（配列番号４３）を使用してＱ５ポリメラーゼにより可変領域ＩＶおよびＶＩＩＩについて１０～１８サイクル増幅した。
第２のＰＣＲラウンドで、プライマーとともにＱ５ポリメラーゼを使用して、多重化用のＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシークエンシングアダプターを付加させた。各ＰＣＲラウンド後に、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して産物を精製した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してアンプリコンの品質を検証し、Ｑｕｂｉｔ分光計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して濃度を定量化した。次いで、サンガーシークエンシングにより決定したＶＲ４またはＶＲ８ライブラリーを含有するＰＣＲアンプリコンを一緒にプールし、次のライブラリー調製物を生成するために使用した。
次いで、得られたアンプリコンをベクターにクローニングして戻して、ギブソンアセンブリーを使用する代わりに多重オーバーラップ伸長ＰＣＲを使用してアンプリコンを構築したことを除いて親プラスミドライブラリーを生成したのと同じ方法を使用して、進化プラスミドライブラリーを生成した。次いで、ＶＲ４およびＶＲ８親プラスミドライブラリーをアデノウイルスヘルパープラスミドとともにＨＥＫ２９３産生細胞系にトランスフェクトして、上で説明したのと同じ方法を使用してＡＡＶ ＶＲ４カプシドおよびＡＡＶ ＶＲ８カプシド進化ライブラリーを生成した。培地中のデオキシリボヌクレアーゼＩ耐性ウイルスゲノムを定量化し、後続の感染ラウンドの接種材料として役立てた。
第２のサイクルでは、ブタでの進化後、上で説明したように調製したＡＡＶ ＶＲ４カプシド親ライブラリーまたはＡＡＶ ＶＲ８カプシド進化ライブラリーを、８週Ｃ５７／Ｂ６マウスに、約３×１０１３～５×１０１３ｖｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。注射の６日後にマウスを屠殺し、様々な脳領域（小脳、前頭、側頭、頭頂、後頭皮質、海馬、視床、および中脳）から抽出したゲノムＤＮＡからウイルスＤＮＡを、ＤＮＡ配列に隣接するＶＲ４またはＶＲ８を標的とするオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲによって増幅し、それを使用して、上で説明したようにＡＡＶライブラリー配列を増幅した。次いで、得られたアンプリコンをベクターにクローニングして戻して、上記の第１の進化プラスミドライブラリーを生成したのと同じ方法を使用して別の進化プラスミドライブラリーを生成した。今回は、培地中のウイルスゲノムを定量化し、第３のサイクルのための接種材料として役立てた。
ブタおよびマウスでの進化後、進化ＶＲ４およびＶＲ８ライブラリーを、２歳の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に、約１×１０１３～３×１０１３ｖｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。上で説明したようにＮＨＰの様々な脳領域から抽出したゲノムＤＮＡからウイルスＤＮＡを増幅した。増幅されたウイルスＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用するハイスループットシークエンシングに供し、得られたデータを以下のように分析した。
逆多重化リードを、ＦａｓｔＱＣ（ｖ．０．１１．５）を使用する品質管理チェックに供し、低品質のフラグの付いた配列を用いずに、その開示が、その全体が本明細書に組み込まれる、Tse et al., PNAS, 2017 Jun 13;114(24):E4812-E4821に記載されたものに類似した方法を使用するカスタムＰｅｒｌスクリプトによって分析した。手短に言えば、生シークエンシングファイルを目的の変異誘発領域について探索し、この領域内の異なるヌクレオチド配列の頻度を計数し、ライブラリーごとにランク付けした。ヌクレオチド配列も翻訳し、これらのアミノ酸配列を同様に計数し、ランク付けした。次いで、ライブラリーにわたってのアミノ酸配列頻度をＲグラフィックスパッケージｖ３．５．２でプロットした。第２のＰｅｒｌスクリプトを使用して、ライブラリーにおける各変異体の寄与を考慮に入れて各ライブラリー内の各位置におけるアミノ酸提示を算出した。
これらのライブラリーを３種（ブタ、マウスおよびＮＨＰ（すなわち、サル））間での複数の進化ラウンドに付すことによって、いくつかのＡＡＶ９カプシドバリアントを得た。異種間ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングから得られた、最高頻度を有するＡＡＶ９カプシドバリアントを、シークエンシングした。バブルプロットは、親ライブラリー（図１Ａ）と３つの異なる種間の３サイクル後の進化ライブラリー（図１Ｂ）との間で、ライブラリー多様性、定向進化、ならびにＶＲ８領域およびＶＲ４領域における新規抗原フットプリントの富化を示した。これらのＡＡＶの領域ＩＶ（４５２－ＮＧＳＧＱＮＱ－４５８；配列番号３８）または領域ＶＩＩＩ（５８６－ＳＡＱＡＱＡＱ－５９２；配列番号３９）のどちらかに存在する置換を表５に示す。
Figure 2023524291000031
Figure 2023524291000032
 （実施例２）
マウスにおける組換えＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏ特徴付け
３つの組換えカプシドタンパク質、ＡＡＶ．ｃｃ４７（配列番号８）、ＡＡＶ．ｃｃ４４（配列番号５）、ＡＡＶ．ｃｃ８１（配列番号１１）、およびＡＡＶ．ｃｃ８４（配列番号１４）－本実施例では、まとめて「ｃｃＡＡＶベクター」と呼ぶ－を、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ特徴付けに選択した。次に、これらのカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶまたはネイティブＡＡＶ９、および蛍光導入遺伝子のパッケージングを生じさせた。手短に言えば、組換えカプシドタンパク質は、ＣＢｈ－ＧＦＰ（ＡＡＶ．ｃｃ８１およびＡＡＶ．ｃｃ８４）またはＣＢｈ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＡＶ．ｃｃ４４）のどちらかをパッケージングしているベクターとして産生した。手短に言えば、ポリエチレンイミンを、トリプルプラスミドトランスフェクションプロトコールを使用して、ＨＥＫ２９３細胞に７０～８０％コンフルエンスでトランスフェクトすることにより、組換えＡＡＶベクターを産生した。ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーターにより駆動される緑色蛍光タンパク質（ＣＢｈ－ｅＧＦＰ）、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーターにより駆動されるチェリー（赤色）蛍光タンパク質（ＣＢｈ－ｍＣｈｅｒｒｙ）、またはＣＢｈ－ｅＧＦＰもしくはＣＢｈ－ｍＣｈｅｒｒｙのどちらかにより駆動される自己相補的ＡＡＶ９、をコードする一本鎖ゲノムをパッケージングしている組換えベクターを、この方法を使用して生成した。一般に、図２９Ａ～２９Ｂを参照されたい。組換えＡＡＶベクターの回収および下流の精製を含む後続のステップを行った。手短に言えば、イオジキサノール勾配超遠心プロトコール、緩衝液交換、およびｖｉｖａｓｐｉｎ２ １００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心分離カラム（Ｆ－２７３１－１００ Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ）を使用する濃縮を使用して、ベクター精製を行った。ＡＡＶ２逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）５’－ＡＡＣＡＴＧＣＴＡＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧ－３’（配列番号４４）および５’－ＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ－３’（配列番号４５）を増幅するプライマーを用いる定量的ＰＣＲにより、組換えＡＡＶベクターの力価を決定した。
自己相補的ＡＡＶ９、またはｃｃＡＡＶベクターのうちの１つの、いずれかを、マウスあたり５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに静脈内注射した。注射の４週間後にマウスを屠殺し、複数の臓器を採取し、形質導入を固有蛍光または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）により評価した。図２Ａ～２Ｂは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の心臓のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図２Ａ）およびＡＡＶ．ｃｃ４７（図２Ｂ）のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供する。図２Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ４７に感染したマウスが、ＡＶＶ９ベクターに感染したマウスと比較して心臓組織におけるｍＣｈｅｒｒｙのよりロバストな発現を有した、補正された全蛍光の定量分析を提供する。図２Ｄは、マウスの心臓組織におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４７のベクターの生体内分布を提供する。図６Ａ～６Ｃは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の心臓のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図６Ａ）、ＡＡＶ．ｃｃ８１（図６Ｂ）、およびＡＡＶ．ｃｃ８４（図６Ｃ）のＧＦＰ発現を示す代表画像を提供する。図６Ｄは、ＡＡＶ．ｃｃ８４に感染したマウスが、ＡＡＶ．ｃｃ８１またはＡＶＶ９ベクターに感染したマウスと比較して心臓組織におけるＧＦＰのよりロバストな発現を有した、補正された全蛍光の定量分析を提供する。図２６Ａは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の心臓のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４４のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供し、図２６Ｂは、補正された全蛍光の定量分析を提供する。
図３Ａ～３Ｂは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の骨格筋のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図３Ａ）およびＡＡＶ．ｃｃ４７（図３Ｂ）のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供する。図３Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ４７に感染したマウスが、ＡＶＶ９ベクターに感染したマウスと比較して骨格筋におけるｍＣｈｅｒｒｙのよりロバストな発現を有した、補正された全蛍光の定量分析を提供する。図７Ａ～７Ｂは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の骨格筋のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図７Ａ）およびＡＡＶ．ｃｃ８１（図７Ｂ）のＧＦＰ発現を示す代表画像を提供する。図７Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ８１に感染したマウスが、ＡＶＶ９ベクターに感染したマウスと比較して骨格筋におけるＧＦＰのよりロバストな発現を有した、補正された全蛍光の定量分析を提供する。図２６Ｃは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の骨格筋のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４４のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供し、図２６Ｄは、補正された全蛍光の定量分析を提供する。
図４Ａ～４Ｂは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の肝臓のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図４Ａ）およびＡＡＶ．ｃｃ４７（図４Ｂ）のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供する。図４Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＶＶ９ベクターに感染したマウスの肝臓における補正された全蛍光の定量分析を提供する。図４Ｄは、マウスの肝臓組織におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４７のベクターの生体内分布を提供する。図８Ａ～８Ｃは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の肝臓のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図８Ａ）、ＡＡＶ．ｃｃ８１（図８Ｂ）、およびＡＡＶ．ｃｃ８４（図８Ｃ）のＧＦＰ発現を示す代表画像を提供する。図８Ｄは、ＡＡＶ．ｃｃ８４、ＡＡＶ．ｃｃ８１またはＡＶＶ９ベクターのいずれかに感染したマウスが肝臓におけるＧＦＰのロバストな発現を示さなかった、補正された全蛍光の定量分析を提供する。図２７Ａは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の肝臓のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４４のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供し、図２７Ｂは、補正された全蛍光の定量分析を提供する。
図５Ａ～５Ｂは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の腎臓組織のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図５Ａ）およびＡＡＶ．ｃｃ４７（図５Ｂ）のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供する。図５Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ４７に感染したマウスが、ＡＶＶ９ベクターに感染したマウスと比較して腎臓におけるｍＣｈｅｒｒｙのよりロバストな発現を有した、補正された全蛍光の定量分析を提供する。図９Ａ～９Ｂは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の骨格筋のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９（図９Ａ）およびＡＡＶ．ｃｃ８１（図９Ｂ）のＧＦＰ発現を示す代表画像を提供する。図９Ｃは、ＡＡＶ．ｃｃ８１に感染したマウスが、ＡＶＶ９ベクターに感染したマウスと比較して骨格筋におけるＧＦＰのよりロバストな発現を有した、補正された全蛍光の定量分析を提供する。図２７Ｃは、４％ＰＦＡでの固定後、２４時間後の腎臓組織のビブラトーム切片におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４７のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す代表画像を提供し、図２７Ｄは、補正された全蛍光の定量分析を提供する。
マウスから、自己相補的ＡＡＶ９、またはｃｃＡＡＶベクターのうちの１つの、いずれかを、マウスあたり５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した４週間後に脳スライスを採取し、免疫組織化学検査を使用して脳の特定の切片におけるＡＡＶベクター発現を調査してｍＣｈｅｒｒｙまたはＧＦＰのいずれかを検出した。図１０Ａ～１０Ｅ、および図２８Ａ～２８Ｃに示されているように、全てのベクターは、脳組織における局在化を示したが、ｃｃＡＡＶベクター発現のロバスト性は、バリアント型に依存して脳領域によって異なった。
まとめると、本明細書における本実施例におけるデータは、ＣＮＳ組織に富化された進化カプシドバリアントタンパク質が、マウスへの全身注射後であっても、脳への改善された親和性を有することを示した。加えて、進化ｃｃＡＡＶベクターは、心臓、骨格筋、およびある程度、肝臓を含む、他の非ＣＮＳ組織において強い発現を示した。驚くべき発見は、ＶＲ４のみにアミノ酸置換を有する進化ＡＶＶ．ｃｃ４７ベクターが、腎臓において高いレベルのｍＣｈｅｒｒｙの形質導入発現を示したことであった。これまでのところ、腎臓において高い形質導入効率を有することができるＡＡＶベクターは知られておらず、試験したｃｃＡＡＶベクターのうち、ＡＡＶ．ｃｃ４７のみがこの表現型を示した（ＡＡＶ．ｃｃ８１およびＡＡＶｃｃ．８４－両方ともＶＲ８内にアミノ酸置換を有する－は、腎臓における発現を形質導入することができなかった）。
（実施例３）
ブタにおける組換えＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏ特徴付け
本明細書における実施例２で使用した蛍光レポーター遺伝子をパッケージングしているｃｃＡＡＶベクターを、実施例３でも使用した。ここでは、３週齢で、体重おおよそ７ｋｇの、乳離れしたばかりの仔ブタに、自己相補的ＡＡＶ９またはｃｃＡＡＶベクターを、約７ｋｇのブタあたり３×１０１３ｖｇの用量で（２ｍｌで）髄腔内注入により注射した。仔ブタを注射の４週間後に屠殺し、脳、脊髄、心臓および肝臓を採取した。固有蛍光により、または本明細書で説明するように行ったＩＨＣにより、形質導入を評価した。
ブタの脳切片を切除し、４％ＰＦＡ中で保管した後、組織をＩＨＣに供して、前頭皮質、頭頂皮質、視床、後頭皮質、脳幹、小脳および中脳におけるＡＶＶ．ｃｃ４７（図１１Ａ～１１Ｇ）およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図１２Ａ～１２Ｇ）の形質導入効率を評定した。ブタの脊髄の切片も採取し、ＩＨＣに供して、組織におけるＡＶＶ．ｃｃ４７（図１３Ａ）およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図１３Ｂ）の形質導入効率を評定した。精密検査のために、ブタの脊髄の白質および灰白質も、ＡＶＶ．ｃｃ４７（図１３Ｃおよび１３Ｅ）およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図１３Ｄおよび１３Ｆ）形質導入効率について、今回はｍＣｈｅｒｒｙまたはＧＦＰ蛍光のどちらかをそれぞれ拡大して観察することにより、調査した。
ブタの心臓および肝臓組織も屠殺時に採取し、ＩＨＣに供してＡＶＶ．ｃｃ４７（図１４Ａ～１４Ｃ）およびＡＶＶ．ｃｃ８４（図１４Ｄ～１４Ｆ）の形質導入効率を評定した。
（実施例４）
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における組換えＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏ特徴付け
本明細書における実施例２および３で使用した蛍光レポーター遺伝子をパッケージングしているｃｃＡＡＶベクターを、実施例４でも使用した。本明細書では、体重おおよそ３ｋｇの２歳のアカゲザル（ＮＨＰ）の大槽内に自己相補的ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｃｃ４７、またはＡＡＶ．ｃｃ８４ベクターを３．５×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量で注射した。ＮＨＰを注射の２週間後にサックし、脳、肝臓、心臓および脊髄を採取した。肝臓（図１５Ａ）および心臓（図１５Ｃ）におけるＡＡＶ９について、ならびに肝臓（図１５Ｂ）および心臓（図１５Ｄ）におけるＡＡＶ．ｃｃ４７について、ｍＣｈｅｒｒｙのＩＨＣ分析を行った。図１５Ｅは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４７ベクターについての、肝臓および心臓におけるベクターの生体内分布を示す。
次に、ＮＨＰの脳におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４７についてのｍＣｈｅｒｒｙならびにＡＡＶ．ｃｃ８４についてのＧＦＰのＩＨＣ分析を評定した。偽処置された脳スライス（図１６Ａ）と比較して、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＡＶ．ｃｃ８４は全て、脳組織における形質導入をある程度示した（図１６Ｂ～１６Ｄ）。データは、（１）異種間カプシドが、特有の生体内分布プロファイルを有し、ＡＡＶ９とは異なること；（２）ＡＡＶ．ｃｃ４７が、脳組織のより深部に拡散し、より多くの細胞に形質導入するように見えること；および（３）ＡＡＶ．ｃｃ８４も組織に十分に拡散するが、より少ない（より特異的な）細胞に形質導入することを示唆した。
（実施例５）
ＡＡＶｃｃ４７心臓形質導入
ＡＡＶｃｃ４７心臓形質導入を検証するために、ヒトｉＰＳＣ心筋細胞に、Ｃｂｈプロモーターにより駆動されるＧＦＰをパッケージングしているＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｃｃ４７を形質導入した（図１７Ａ）。次に、複数の画像内の面積におけるＧＦＰ＋細胞のパーセントを定量化した（図１７Ｂ）。ＣＢｈ：ＧＦＰをパッケージングしているＡＡＶ９またはＡＡＶｃｃ４７をヒト心臓パッチマウスモデルにｉ．ｖ．注射し（図１７Ｃ）、心臓パッチの蛍光イメージングを行った（図１７Ｄ）。ＡＡＶ９およびＡＡＶ．ｃｃ４７をヒト心臓パッチマウスモデルに再度ｉ．ｖ．により投与し、今回は、心筋梗塞後に傷害誘導性プロモーターの制御下でＧＦＰを送達した。トロポニンＴ（赤色）およびＧＦＰ（緑色）についての免疫蛍光を、注射後のマウスから採取した心臓組織において行った（図１７Ｅ）。
（実施例６）
ｃｃＡＡＶベクターでのＣｒｅ組換え
Ａｉ９雄および雌マウスに、一本鎖ＡＡＶ９またはｃｃＡＡＶベクターを１×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量（Ｎ＝３）で静脈内注射した。注射の４週間後に動物を屠殺し、複数の臓器を採取し、形質導入を固有蛍光またはＩＦにより評価した。図１８Ａ～１８Ｄは、マウスの心臓におけるＡＡＶ９またはｃｃＡＡＶベクターのｉ．ｖ．投与後の固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表画像を示し、図１８Ｅは、心臓組織におけるＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＡＶ．ｃｃ８４ベクターの生体内分布を示す。図１９Ａ～１９Ｄは、マウスの肝臓におけるＡＡＶ９またはｃｃＡＡＶベクターのｉ．ｖ．投与後の固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表画像を示し、図１９Ｅは、肝臓組織におけるＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＡＶ．ｃｃ８４ベクターの生体内分布を示す。図２０Ａ～２０Ｄは、マウスの肺におけるＡＡＶ９またはｃｃＡＡＶベクターのｉ．ｖ．投与後の、ＤＡＰＩ（核マーカー）およびＳＰＣで共染色された固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表画像を示し、図２０Ｅは、肺組織におけるＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｃｃ４７およびＡＡＶ．ｃｃ８４ベクターの生体内分布を示す。
（実施例７）
ｃｃＡＡＶベクターでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集
ＳａＣａｓ９を駆動する短縮型ＣＢプロモーターと１つのｓｇＲＮＡを駆動するＵ６プロモーターとを有する１つのベクター、および第２のｓｇＲＮＡを有する同じ設計の第２のベクターを使用する、二重ベクター戦略を用いた（図２１Ａ）。ＡＡＶ９またはｃｃＡＡＶと５０：５０で混合されたｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２からなる二重一本鎖ベクターを、２×１０１２ｖｇの用量（Ｎ＝６）で、雄および雌Ａｉ９マウスに静脈内注射した。注射の４週間後に動物を屠殺し、複数の臓器を採取し、形質導入を固有蛍光または免疫蛍光（ＩＦ）により評価した。
ＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｃｃ４７の投与後にＡｉ９マウスの肝臓および心臓において固有ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を評定した（図２１Ｂ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の総数を計数してＤＡＰＩ＋細胞の総数で割ることにより、遺伝子編集効率を決定した（図２１Ｃ）。ＰＣＲ編集アッセイを肝臓および心臓組織に関して行った（図２１Ｄ）。
図２１Ａ～２１Ｄにおける結果を、ＳａＣａｓ９発現を駆動するＣＢプロモーターを用いる同じ二重ベクター戦略を使用して検証した。各ベクターは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に標的化された１つのガイドを有する。これらのベクターを等量で混合し、Ａｉ９マウスに１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量でｉ．ｖ．注射した。Ａｉ９の肝臓の切片を作製し、ネイティブＴｄＴｏｍａｔｏ発現についてイメージングした（図２２Ａ）。ＴｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の総数を計数し、Ｄａｐｉ＋細胞の総数に正規化することにより、遺伝子編集効率の定量化を行った（図２２Ｂ）。Ａｉ９の心臓の切片を作製し、ネイティブＴｄＴｏｍａｔｏ発現についてイメージングした（図２２Ｃ）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＣＢを定量化するための手段として、複数の画像から蛍光強度を測定して雄および雌Ａｉ９マウスの心臓および肝臓組織におけるネイティブＴｄＴｏｍａｔｏ発現を定量化した。（図２３Ａ～２３Ｆ）。さらに、図２４Ａおよび２４Ｂでは相対ＰＣＲバンド強度（編集された実験試料に対する未編集の模擬試料）を測定した。そして、図２５Ａおよび２５Ｂでは、次の式を使用して編集効率を定量化した：編集効率（％）＝赤色細胞の数（ｉｍａｇｅ ｊを用いて計数した（肝臓）または手作業で計数した（心臓））／ＤＡＰＩ染色核の数。
（実施例８）
脳室内（ＩＣＶ）注射によるｃｃＡＡＶの投与
ｐ０ Ｃ５７／ＢＬ６マウス新生仔に、自己相補的ＡＡＶ９またはｃｃＡＡＶベクター（これらの構築物を図２９Ａおよび図２９Ｂに描示する）を１×１０１０ｖｇの用量（Ｎ＝４）で脳室内（ＩＣＶ）注射した。動物を注射の４週間後に屠殺した。
レポーター発現を固有蛍光により検出した。図３０Ａ～３０Ｆは、ＡＡＶ９ ｍＣｈｅｒｒｙ（図３０Ａ）、ＡＡＶ．ｃｃ４４（図３０Ｂ）、ＡＡＶ．ｃｃ４７（図３０Ｃ）、ＡＡＶ９ ｅＧＦＰ（図３０Ｄ）、ＡＡＶ．ｃｃ８１（図３０Ｅ）、またはＡＡＶ．ｃｃ８４（図３０Ｆ）のＩＣＶ注射後にマウスの脳に発現されたｍＣｈｅｒｒｙまたはｅＧＦＰの代表画像を示す。
免疫蛍光（ＩＦ）を、感染の４週間後のマウスから採取した脳組織に関しても行った。核ＤＮＡを可視化するＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）；ニューロン核を特異的に可視化する抗ＮｅｕｒＮ抗体（α－ＮｅｕｒＮ）；および注射されたＡＡＶベクターのレポーター発現を可視化する抗ｍＣｈｅｒｒｙ（α－ｍＣｈｅｒｒｙ）または抗ｅＧＦＰ（α－ＧＦＰ）抗体のどちらかを用いて、組織を染色した。抗体ごとに得られたＩＦについての画像を収集し、統合して共局在化を検出した。図３１Ａ～３１Ｂおよび図３２Ａ～３２Ｂは、ＡＡＶ９ ｅＧＦＰ（図３１Ａ）、ＡＡＶ．ｃｃ８４（図３１Ｂ）、ＡＡＶ９ ｍＣｈｅｒｒｙ（図３２Ａ）、またはＡＡＶ．ｃｃ４７（図３２Ｂ）のいずれかの注射の４週間後に採取したマウスの脳組織に関してＩＦを行った後の、脳の小脳、海馬および大脳皮質領域の代表画像を示す。ｅＧＦＰおよびＮｅｕｒＮについて陽性染色であったニューロンの数を、ＡＡＶ９（ｅＧＦＰ）またはＡＡＶ．ｃｃ８４のどちらかを注射したマウスの小脳（図３１Ｃ）、海馬（図３１Ｄ）および大脳皮質（図３１Ｅ）において定量化した。ｍＣｈｅｒｒｙおよびＮｅｕｒＮについて陽性染色であったニューロンの数を、ＡＡＶ９（ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＡＡＶ．ｃｃ４７のどちらかを注射したマウスの小脳（図３２Ｃ）、海馬（図３２Ｄ）および大脳皮質（図３２Ｅ）において定量化した。
本開示が、述べた目的を実行すること、結果および利点を獲得すること、ならびにこれらについてまわることに、よく適応していることは、当業者には容易に理解されるであろう。本明細書に記載する本開示は、好ましい実施形態を現在代表するものであり、好例であり、本開示の範囲を制限することを意図するものではない。特許請求の範囲により定義されるような本開示の趣旨に包含される、それらの変更および他の使用が、当業者の心に浮かぶであろう。
本明細書に引用する一切の非特許または特許文献を含むいずれの参考文献も先行技術を構成することを認めない。特に、別段の記述がない限り、本明細書におけるいずれの文献への言及も、これらの文献のいずれかが米国または任意の他の国の当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することを認めることを構成するものではないことが理解される。参考文献のいずれの論述も、それらの著者が強く主張していることを述べるものであり、本出願人は、本明細書に引用するいずれの文献についてもその正確さおよび適切性に対して異議を申し立てる権利を留保する。本明細書に引用する全ての参考文献は、別段の明確な指示がない限り、参照により完全に組み込まれる。
引用参考文献に見られるいずれかの定義および／または記述の間に何らかの相違点がある場合には、本開示が優先されるものとする。
番号付き実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、以下の番号付き実施形態も、本明細書で企図され、本開示の一部を形成する。
１．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、カプシドタンパク質バリアントが、配列番号２～１９のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、組換えＡＡＶベクター。
２．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、組換えＡＡＶベクター。
３．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、組換えＡＡＶベクター。
４．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されており、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、組換えＡＡＶベクター。
５．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、組換えＡＡＶベクター。
６．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して１～１０、１１～２０、２０～３０、もしくは３０～５０のアミノ酸置換を有する配列を有する、組換えＡＡＶベクター。
７．ベクターゲノムを含む、実施形態１～６のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
８．ベクターゲノムが、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含むＡＡＶカプシドに包まれている、実施形態７の組換えＡＡＶベクター。
９．ベクターゲノムが、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）および第２のＩＴＲを含む、実施形態７または８の組換えＡＡＶベクター。
１０．ベクターゲノムが、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲの間に位置する導入遺伝子を含む、実施形態９の組換えＡＡＶベクター。
１１．導入遺伝子が、治療用ＲＮＡをコードする、実施形態１０の組換えＡＡＶベクター。
１２．導入遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、実施形態１０の組換えＡＡＶベクター。
１３．導入遺伝子が、遺伝子編集分子をコードする、実施形態１０の組換えＡＡＶベクター。
１４．遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、実施形態１３の組換えＡＡＶベクター。
１５．ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１４の組換えＡＡＶベクター。
１６．ヌクレアーゼが、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼである、実施形態１４の組換えＡＡＶベクター。
１７．遺伝子編集分子が、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１３の組換えＡＡＶベクター。
１８．配列番号２～１９のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
１９．配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントであって、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
２０．配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントであって、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
２１．配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントであって、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されており、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
２２．配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
２３．配列番号２ １９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して１～１０、１１～２０、２０～３０、もしくは３０～５０のアミノ酸置換を有する配列を有する、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
２４．実施形態１８～２３のいずれか１つのＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む、ＡＡＶカプシド。
２５．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントまたはその断片の約６０コピーを含む、実施形態２４のＡＡＶカプシド。
２６．ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントが、Ｔ＝１の正二十面体対称で配置されている、実施形態２５のＡＡＶカプシド。
２７．実施形態１８～２３のいずれか１つのＡＡＶカプシドバリアント、または実施形態２４～２６のいずれか１つのＡＡＶカプシドを含む、組換えＡＡＶベクター。
２８．実施形態１～１７、および２７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
２９．組換えＡＡＶベクターを標的細胞に導入する方法であって、標的細胞を、実施形態１～１７、および２７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター、または実施形態２８の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
３０．対象における標的細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、実施形態１～１７、および２７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター、または実施形態２８の医薬組成物を、対象に投与するステップを含む方法。
３１．標的細胞が腎臓細胞である、実施形態２９および３０のいずれか１つの方法。
３２．新規アデノ随伴ウイルス株を進化させる方法であって、複数の哺乳動物種にわたってＡＡＶライブラリーを継代するステップを含む方法。
３３．前記ＡＡＶライブラリーが、複数の組換えＡＡＶベクターを含み、各組換えＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて１つまたは複数のアミノ酸変異を含むカプシドタンパク質バリアントを含む、実施形態３２による方法。
３４．ＡＡＶライブラリー内の各組換えＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１）と比べて１つまたは複数のアミノ酸変異を含む、実施形態３３による方法。
３５．１つまたは複数のアミノ酸変異が、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８、もしくは配列番号１の５８６～５９２に対応する領域にあるか、または変異が、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８および５８６～５９２に対応する両方の領域に見られる、実施形態３４による方法。
３６．第１のＡＡＶライブラリーを第１の哺乳動物種に投与するステップを含む、実施形態３１～３５のいずれか１つによる方法。
３７．第１の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織に存在する第１のＡＡＶライブラリーからのＡＡＶが、シークエンシングされ、第２のＡＡＶライブラリーを生成するために使用される、実施形態３６による方法。
３８．第２のＡＡＶライブラリーが、第２の哺乳動物種に投与され、第１の哺乳動物種と第２の哺乳動物種が異なる、実施形態３７による方法。
３９．第２の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織に存在する第２のＡＡＶライブラリーからのＡＡＶが、シークエンシングされる、実施形態３８による方法。
４０．第１の哺乳動物種および第２の哺乳動物種が、各々独立して、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）からなる群から選択される、実施形態３６～３９のいずれか１つによる方法。
４１．第１の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織が、脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せから選択される、実施形態４０による方法。
４２．第２の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織が、脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せから選択される、実施形態４０による方法。
４３．実施形態３１～４２のいずれか１つの方法を使用して進化されたカプシドタンパク質バリアントを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
４４．１つまたは複数の哺乳動物種において、１つまたは複数のアミノ酸置換を欠いていることを除いて他の点では同一であるカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶと比べて、改善された遺伝子導入効率を有する、実施形態４３による組換えＡＡＶ。
４５．改善された遺伝子導入効率が、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）のもう１つにおいて存在する／生じる、実施形態４４の組換えＡＡＶ。
４６．改善された遺伝子導入効率が、次の細胞型または組織：脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓の、１つまたは複数において生じる、実施形態４３～４５の組換えＡＡＶ。
４７．改善された遺伝子導入効率が、腎臓細胞または腎臓組織において生じる、実施形態４６の組換えＡＡＶ。
４８．それを必要とする対象を処置する方法であって、実施形態１～１７、２７、および４３～４７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターまたは実施形態２８の医薬組成物の有効量を、対象に投与するステップを含む方法。
４９．対象が、腎疾患または腎障害を有する、実施形態４８の方法。

Claims (49)

  1. ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドタンパク質バリアントが、配列番号２～１９のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、組換えＡＡＶベクター。
  2. ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、組換えＡＡＶベクター。
  3. ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、組換えＡＡＶベクター。
  4. ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、
    ａ．配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されており、
    ｂ．配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、
    組換えＡＡＶベクター。
  5. ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、組換えＡＡＶベクター。
  6. ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶカプシドバリアントが、配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して１～１０、１１～２０、２０～３０、もしくは３０～５０のアミノ酸置換を有する配列を有する、組換えＡＡＶベクター。
  7. ベクターゲノムを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  8. 前記ベクターゲノムが、前記ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含むＡＡＶカプシドに包まれている、請求項７に記載の組換えＡＡＶベクター。
  9. 前記ベクターゲノムが、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）および第２のＩＴＲを含む、請求項７または８に記載の組換えＡＡＶベクター。
  10. 前記ベクターゲノムが、前記第１のＩＴＲと前記第２のＩＴＲの間に位置する導入遺伝子を含む、請求項９に記載の組換えＡＡＶベクター。
  11. 前記導入遺伝子が、治療用ＲＮＡをコードする、請求項１０に記載の組換えＡＡＶベクター。
  12. 前記導入遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項１０に記載の組換えＡＡＶベクター。
  13. 前記導入遺伝子が、遺伝子編集分子をコードする、請求項１０に記載の組換えＡＡＶベクター。
  14. 前記遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、請求項１３に記載の組換えＡＡＶベクター。
  15. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１４に記載の組換えＡＡＶベクター。
  16. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼである、請求項１４に記載の組換えＡＡＶベクター。
  17. 前記遺伝子編集分子が、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１３に記載の組換えＡＡＶベクター。
  18. 配列番号２～１９のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
  19. 配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントであって、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
  20. 配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントであって、配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
  21. 配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＡＡＶカプシドタンパク質バリアントであって、
    ａ．配列番号１のアミノ酸４５２～４５８に対応するアミノ酸が、配列番号２０～２８のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されており、
    ｂ．配列番号１のアミノ酸５８６～５９２に対応するアミノ酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つの配列を有するペプチドで置換されている、
    ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
  22. 配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
  23. 配列番号２～１９、４６～１２３のいずれか１つの配列、またはそれに対して１～１０、１１～２０、２０～３０、もしくは３０～５０のアミノ酸置換を有する配列を有する、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント。
  24. 請求項１８から２３のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを含む、ＡＡＶカプシド。
  25. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントまたはその断片の約６０コピーを含む、請求項２４に記載のＡＡＶカプシド。
  26. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントが、Ｔ＝１の正二十面体対称で配置されている、請求項２５に記載のＡＡＶカプシド。
  27. 請求項１８から２３のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドバリアント、または請求項２４から２６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドを含む、組換えＡＡＶベクター。
  28. 請求項１～１７、および２７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  29. 組換えＡＡＶベクターを標的細胞に導入する方法であって、標的細胞を、請求項１から１７、および２７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、または請求項２８に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
  30. 対象における標的細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、請求項１から１７、および２７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、または請求項２８に記載の医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法。
  31. 前記標的細胞が、腎臓細胞である、請求項２９および３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 新規アデノ随伴ウイルス株を進化させる方法であって、複数の哺乳動物種にわたってＡＡＶライブラリーを継代するステップを含む方法。
  33. 前記ＡＡＶライブラリーが、複数の組換えＡＡＶベクターを含み、各組換えＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて１つまたは複数のアミノ酸変異を含むカプシドタンパク質バリアントを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＡＡＶライブラリー内の各組換えＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１）と比べて１つまたは複数のアミノ酸変異を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記１つまたは複数のアミノ酸変異が、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８、もしくは配列番号１の５８６～５９２に対応する領域にあるか、または前記変異が、配列番号１のアミノ酸４５２～４５８および５８６～５９２に対応する両方の領域に見られる、請求項３４に記載の方法。
  36. 第１のＡＡＶライブラリーを第１の哺乳動物種に投与するステップを含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記第１の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織に存在する前記第１のＡＡＶライブラリーからのＡＡＶが、シークエンシングされ、第２のＡＡＶライブラリーを生成するために使用される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第２のＡＡＶライブラリーが、第２の哺乳動物種に投与され、前記第１の哺乳動物種と前記第２の哺乳動物種が異なる、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記第２の哺乳動物種の１つまたは複数の標的組織に存在する前記第２のＡＡＶライブラリーからのＡＡＶが、シークエンシングされる、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記第１の哺乳動物種および前記第２の哺乳動物種が、各々独立して、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）からなる群から選択される、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記第１の哺乳動物種の前記１つまたは複数の標的組織が、脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第２の哺乳動物種の前記１つまたは複数の標的組織が、脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓組織、およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項４０に記載の方法。
  43. 請求項３１から４２のいずれか一項に記載の方法を使用して進化されたカプシドタンパク質バリアントを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  44. １つまたは複数の哺乳動物種において、１つまたは複数のアミノ酸置換を欠いていることを除いて他の点では同一であるカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶと比べて、改善された遺伝子導入効率を有する、請求項４３に記載の組換えＡＡＶ。
  45. 前記改善された遺伝子導入効率が、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）、Ｃａｎｉｓ Ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ、マカク）、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）の１つまたは複数において生じる、請求項４４に記載の組換えＡＡＶ。
  46. 前記改善された遺伝子導入効率が、次の細胞型または組織：脊髄、後根神経節、脳、心臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、膵臓、小腸、大腸、または肝臓の、１つまたは複数において生じる、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
  47. 前記改善された遺伝子導入効率が、腎臓細胞または腎臓組織において生じる、請求項４６に記載の組換えＡＡＶ。
  48. それを必要とする対象を処置する方法であって、請求項１から１７、２７、および４３から４７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項２８に記載の医薬組成物の有効量を、前記対象に投与するステップを含む方法。
  49. 前記対象が、腎疾患または腎障害を有する、請求項４８に記載の方法。
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