TW202208631A - 跨物種相容腺相關病毒組合物及其使用方法 - Google Patents

跨物種相容腺相關病毒組合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供包含共同演化之衣殼變異體蛋白之腺相關病毒(AAV)載體，醫藥組合物，製備方法，及將其遞送至個體之方法。

Description

跨物種相容腺相關病毒組合物及其使用方法
本發明係關於來自腺相關病毒(AAV)之經修飾之衣殼蛋白及包含其之病毒衣殼及病毒載體。特定言之，本發明係關於經修飾之AAV衣殼蛋白及包含其之衣殼，可將該等衣殼蛋白併入病毒載體以使能於哺乳動物個體之任何細胞或組織類型中表現。
腺相關病毒(AAV)載體已變成用於治療各種疾病之基因療法之首要平臺。雖然使用基於AAV之基因療法已存在臨床成功，但是仍存在與此基因遞送平臺之使用相關聯之限制及挑戰。例如，利用載體(病毒或非病毒)之基因療法之功效有時降低，因為個體針對攜帶該基因之載體之免疫反應。此外，投與途徑必須經最佳化以確保遞送至個體之一或多個標靶組織。此點於治療中樞神經系統(CNS)及外周神經系統(PNS)之病症中係尤其真。當全身投與時，血腦屏障可阻礙基於AAV之療法進入CNS組織及向CNS組織之直接投與可涉及侵入式手術。另外，產生標靶CNS及PNS組織之充分轉導所需之基於AAV之療法之高劑量增加副作用及/或非所需免疫反應之風險。此外，對產生高劑量之AAV之需求造成製造負擔。
已知之AAV血清型各具有特異性組織向性，及存在不能容易地使用此等AAV靶向之一些組織(例如，腎)。此外，於在臨床開發期間使用之各種模型生物體(例如，犬、豬、非人類靈長類動物)中及於人類個體中，於系統器官(諸如心臟、肝或肺)中之AAV轉導可針對給定劑量顯著變化。在人類使用之前此無法精確測試動物模型中之基於AAV之療法亦成問題。
因為AAV基因轉移應用之範圍已擴展，包括對CNS及/或PNS病症之基因療法的進展，此項技術中仍存在對解決跨不同物種之AAV向性差異之需求。當自小至大動物模型縮放時，此等差異通常導致非線性載體劑量生物分佈關係，隨後影響臨床轉譯。因而，此項技術中存在未滿足的對開發具有跨多種物種之更大可轉譯性之AAV基因遞送平臺之需求。此外，存在對開發基於AAV之基因療法之需求，該等療法能選擇性且特異性靶向受關注組織，包括使用已知AAV血清型難以靶向之組織。
本發明至少部分提供包含腺相關病毒(AAV)衣殼蛋白之組合物及方法，該AAV衣殼蛋白包含一或多個胺基酸取代，其中該等取代引入包含此等經修飾之衣殼蛋白之AAV載體一或多種改善之功能性，諸如(但不限於)逃避宿主抗體之能力、選擇向性及/或更高轉導效率。
本發明之一態樣提供包含如本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體之重組AAV載體。於一些實施例中，本文中重組AAV載體可包含AAV衣殼蛋白變異體，其中該衣殼蛋白變異體包含具有SEQ ID NO: 2-19中任一項之序列之肽。於一些實施例中，本文中重組AAV載體包含AAV衣殼蛋白變異體，其中該衣殼蛋白變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 20-28中任一者之序列之肽取代。於一些實施例中，本文中重組AAV載體可包含AAV衣殼蛋白變異體，其中該衣殼蛋白變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 29-37中任一者之序列之肽取代。
於一些實施例中，本文中重組AAV載體包含AAV衣殼蛋白變異體，其中該衣殼蛋白變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 20-28中任一者之序列之肽取代；且其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 29-37中任一者之序列之肽取代。
於一些實施例中，本文中重組AAV載體可包含AAV衣殼蛋白變異體，其中該衣殼蛋白變異體具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或與之具有至少90%或至少95%同一性之序列。於一些實施例中，本文中重組AAV載體包含AAV衣殼蛋白變異體，其中該衣殼蛋白變異體具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或相對於其具有1至10、11至20、20至30或30至50個胺基酸取代之序列。
本發明之另一態樣提供如本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體。於一些實施例中，本文中AAV衣殼蛋白變異體包含具有SEQ ID NO: 2-19中任一者之序列之肽。
於一些實施例中，本文中AAV衣殼蛋白變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 20-28中任一者之序列之肽取代。於一些實施例中，本文中AAV衣殼蛋白變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 29-37中任一者之序列之肽取代。
於一些實施例中，本文中AAV衣殼蛋白變異體可具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸可經具有SEQ ID NO: 20-28中任一者之序列之肽取代；且其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸可經具有SEQ ID NO: 29-37中任一者之序列之肽取代。
於一些實施例中，本文中AAV衣殼蛋白變異體可具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或與之具有至少90%或至少95%同一性之序列。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或相對於其具有1至10、11至20、20至30或30至50個胺基酸取代之序列。
本發明之另一態樣提供醫藥組合物，其包含本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體及/或AAV載體中之任一者。於一些實施例中，本文中醫藥組合物可進一步包含至少一種醫藥上可接受之載劑。
本發明之另一態樣提供將重組AAV載體引入標靶細胞之方法。於一些實施例中，本文中將重組AAV載體引入標靶細胞之方法可包括使該標靶細胞與本文中所揭示之重組AAV載體(例如，ccAAV)及/或醫藥組合物中之任一者接觸。於一些實施例中，本文中方法可將一或多個治療性異源分子遞送至個體之標靶細胞，該等方法包括向該個體投與本文中所揭示之重組AAV載體(例如，ccAAV)及/或醫藥組合物中之任一者。於一些實施例中，本文中所揭示之重組AAV載體(例如，ccAAV)及/或醫藥組合物中之任一者可藉由肌肉內注射、靜脈內注射、冠狀動脈內注射、動脈內注射或其任何組合向個體投與。
本發明之另一態樣提供演化出新穎之腺相關病毒株之方法，其包括將AAV衣殼庫跨多種哺乳動物物種繼代。於一些實施例中，本文中方法可利用包含AAV衣殼之AAV衣殼庫，該等AAV衣殼包裝編碼經誘變衣殼基因序列之不同基因組。於一些實施例中，本文中方法可向小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)及其任何組合或重複循環投與本文中AAV衣殼庫。於一些實施例中，本文中方法可藉由將AAV衣殼庫根據本文中所揭示之方法繼代而將本文中腺相關病毒(AAV)衣殼蛋白序列濃化。於一些實施例中，本文中方法可藉由自由以下組成之群收集或衍生之細胞提取AAV衣殼蛋白變異體將編碼本文中衣殼蛋白變異體之序列濃化：脊髓(例如，膠質細胞、神經元、內皮細胞)、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織及其任何組合。於一些實施例中，本文中方法可產生如本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體，其於選自由以下組成之群之任何哺乳動物物種中具有提高之基因轉移效率：小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)及其任何組合或重複循環。於一些實施例中，本文中方法可產生如本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體，其於由以下組成之群之細胞類型或組織中之任一者中具有提高之基因轉移效率：脊髓、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織及其任何組合。於一些實施例中，本文中方法可產生如本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體，其於由以下組成之群之細胞類型或組織中之任一者中具有改善之免疫反應：脊髓、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織及其任何組合。於一些實施例中，本文中方法可產生如本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體，其於由以下組成之群之細胞類型或組織中之任一者中具有改善之向性：脊髓、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織及其任何組合。
本發明之一態樣提供套組，其中套組可包含本文中所揭示之組合物或AAV載體中之任一者及至少一個容器。
聯邦資助說明
本發明係在政府支持下在聯邦補助金第R01HL089221號及第UG3AR075336號(二者均由國立衛生研究院(National Institutes of Health)授予)下進行。聯邦政府具有本發明之某些權利。 相關申請案之交互參照
本申請案主張2020年5月5日申請之美國臨時申請案序列號63/020,062之優先權，出於所有目的，其全文係以引用的方式併入本文中。電子提供之序列表以引用的方式併入
隨本文提交序列表之電子版，該序列表之內容之全文係以引用的方式併入。電子文檔大小為619千字節，及標題為21-2066-WO_SequenceListing_ST25.txt。
腺相關病毒(AAV)載體已變成治療性基因遞送之首要平臺。不幸的是，基於AAV之基因療法有時較期望較不有效，因為(例如)於最佳化投與途徑以靶向受關注細胞或組織中之困難及個體針對攜帶治療性基因(例如，受關注之轉殖基因)之載體之免疫反應。在天然遇到AAV或重組AAV載體後產生之宿主衍生之先已存在之抗體防止首次以及重複投與AAV載體作為疫苗及/或用於基因療法。血清學研究揭示抗體於全世界人類群體中之高流行，其中約67%人類具有針對AAV1之抗體，72%針對AAV2之抗體，及約40%針對AAV5至AAV9之抗體。於基因療法中，個體中之先已存在之抗體引起問題，因為涉及基因沉默或組織變性之某些臨床情境需要多次AAV載體投與以維持轉殖基因之長期表現。
已知AAV血清型各具有特異性組織向性，及存在不能使用容易此等AAV靶向之一些組織(例如，腎)。使用AAV載體遞送治療性基因用於治療中樞神經系統(CNS)及外周神經系統(PNS)之病症係特別困難，因為血腦屏障可阻礙基於AAV之療法進入達到所需標靶。於在臨床開發期間使用之各種模型生物體(例如，犬、豬、非人類靈長類動物)中及於人類個體中，於系統器官(諸如心臟、肝或肺)中之AAV轉導可針對給定劑量顯著變化。
為規避此等問題，需要逃避抗體識別及/或選擇性靶向CNS之組織之重組AAV載體。本發明中提供之態樣將幫助a)擴展適用於基於AAV之基因療法之患者之合格隊組及b)允許基於AAV之基因療法載體之多次重複投與。此外，存在對開發能選擇性且特異性靶向受關注組織(包括使用已知AAV血清型難以靶向之組織，諸如腎)之基於AAV之基因療法的需求。
本發明至少部分基於以下新穎發現：衣殼抗原性及AAV衣殼及衣殼蛋白之功能性質(諸如向性及轉導)於結構背景下重疊且可經修飾以賦予改善之功能性。基於本發明，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白及包含AAV衣殼蛋白之腺相關病毒(AAV)載體可共同演化以誘導跨物種相容性，其為使能使用來自疾病之非人類模型(例如，嚙齒動物、非人類靈長類動物)之給定AAV可靠轉譯至人類的潛在有用特性。因此，本發明提供跨物種相容AAV衣殼蛋白及包含本文中AAV衣殼蛋白之AAV載體，其製備方法及使用方法。如本文中所用，「跨物種相容AAV」可係指包含具有突變及/或取代之胺基酸序列之AAV衣殼蛋白變異體之AAV載體，該變異體經共同演化用於跨物種相容性。 I.定義
出於促進理解本發明之原則之目的，現將提及較佳實施例及將使用特定語言描述該等實施例。然而應瞭解，不意欲由此限制本發明之範圍，考慮如本文中所說明之本發明之此等更改及另外修改為對本發明所相關之熟習此項技術者所通常發生。
如本說明書中所用，本文中使用冠詞「一(a/an)」係指物品之語法對象中之一者或超過一者。舉例而言，「一要素」意指至少一個要素且可包含超過一個要素。
「約」係用於藉由提供給定值可在端點「稍以上」或「稍以下」而不影響所需結果對數值範圍端點提供靈活性。術語「約」與數值結合意指數值可加或減數值之5%或更少變化。
整篇本說明書，除非上下文另有要求，否則單詞「包括」及「包含」及變型(例如，「包括(comprises/comprising)」、「包含(includes/including)」)應理解為暗示納入指定組分、特徵、要素或步驟或組分、特徵、要素或步驟之群但是不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群。
如本文中所用，「及/或」係指包含相關所列條項中之一或多者之任何及所有可能組合，以及缺少以或者(「或」)解釋之組合。
此外，本發明亦考慮於一些實施例中，可排除或省略本文中所闡述之任何特徵或特徵之組合。為說明，若本說明書指定複合物包含組分A、B及C，則其特定旨在可單一或以任何組合省略及否認A、B或C中之任一者或其組合。
除非本文中另有指定，否則本文中值之範圍之詳述僅意欲用作個別提及落入該範圍內之各單獨值之速記法，及各單獨值併入本說明書中，如同本文中個別詳述其般。例如，若指定濃度範圍為1%至50%，則意欲諸如2%至40%、10%至30%或1%至3%等之值於本說明書中明確列舉。存在僅特定意欲之實例，及在列舉之最低值與最高值之間及包含其之數值之所有可能組合視為於本發明中經明確陳述。
如本文中所用，術語「腺相關病毒」 (AAV)包含(但不限於) AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包含3A及3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV rh32.33型、AAV rh8型、AAV rh10型、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV及現在已知或後來發現之任何其他AAV。參見，例如，BERNARD N. FIELDS等人，VIROLOGY ，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。已識別許多AAV血清型及演化支(參見，例如，Gao 等人(2004) J. Virology 78:6381 -6388；Moris等人，(2004) Virology 33-:375-383；及表 1 )。
AAV及自主細小病毒之各種血清型之基因組序列以及天然末端重複(TR)、Rep蛋白及衣殼亞單元之序列係此項技術中已知。此等序列可見於文獻中或公共資料庫(諸如GenBank)中。參見，例如，GenBank寄存編號NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；其揭示內容係以引用的方式併入本文中用於教示細小病毒及AAV核酸及胺基酸序列。亦參見表 1 。表 1.
   GenBank 寄存編號    GenBank 寄存編號    GenBank 寄存編號
完整基因組    演化支C    Rh57 AY530569
腺相關病毒1 NC_00207, AF063497 Hu9 AY530629 Rh50 AY530563
腺相關病毒2 NC 001401 Hu10 AY530576 Rh49 AY530562
腺相關病毒3 NC 001729 Hu11 AY530577 Hu39 AY530601
腺相關病毒3B NC 001863 Hu53 AY530615 Rh58 AY530570
腺相關病毒4 NC 001829 Hu55 AY530617 Rh61 AY530572
腺相關病毒5 Y18065, AF085716 Hu54 AY530616 Rh52 AY530565
腺相關病毒6 NC 001862 Hu7 AY530628 Rh53 AY530566
鳥AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC 004828 Hu18 AY530583 Rh51 AY530564
鳥AAV株系DA-1 NC_006263, AY629583 Hu15 AY530580 Rh64 AY530574
牛AAV NC_005889, AY388617, AAR26465 Hu16 AY530581 Rh43 AY530560
AAV11 AAT46339, AY631966 Hu25 AY530591 AAV8 AF513852
AAV12 AB116639, DQ813647 Hu60 AY530622 Rh8 AY242997
演化支A    Ch5 AY243021 Rh1 AY530556
AAV1 NC_002077, AF063497 Hu3 AY530595 演化支F   
AAV6 NC_001862 Hu1 AY530575 Hu14 (AAV9) AY530579
Hu.48 AY530611 Hu4 AY530602 Hu31 AY530596
Hu 43 AY530606 Hu2 AY530585 Hu32 AY530597
Hu 44 AY530607 Hu61 AY530623 HSC1 M1332400.1
Hu 46 AY530609 演化支D    HSC2 M1332401.1
演化支B    Rh62 AY530573 HSC3 M1332402.1
Hu. 19 AY530584 Rh48 AY530561 HSC4 M1332403.1
Hu. 20 AY530586 Rh54 AY530567 HSC5 M1332405.1
Hu 23 AY530589 Rh55 AY530568 HSC6 M1332404.1
Hu22 AY530588 Cy2 AY243020 HSC7 M1332407.1
Hu24 AY530590 AAV7 AF513851 HSC8 M1332408.1
Hu21 AY530587 Rh35 AY243000 HSC9 M1332409.1
Hu27 AY530592 Rh37 AY242998 HSC11 M1332406.1
Hu28 AY530593 Rh36 AY242999 HSC12 M1332410.1
Hu 29 AY530594 Cy6 AY243016 HSC13 M1332411.1
Hu63 AY530624 Cy4 AY243018 HSC14 M1332412.1
Hu64 AY530625 Cy3 AY243019 HSC15 M1332413.1
Hu13 AY530578 Cy5 AY243017 HSC16 M1332414.1
Hu56 AY530618 Rh13 AY243013 HSC17 M1332415.1
Hu57 AY530619 演化支E    Hu68   
Hu49 AY530612 Rh38 AY530558 純系分離株   
Hu58 AY530620 Hu66 AY530626 AAV5 Y18065, AF085716
Hu34 AY530598 Hu42 AY530605 AAV 3 NC_001729
Hu35 AY530599 Hu67 AY530627 AAV 3B NC_001863
AAV2 NC_001401 Hu40 AY530603 AAV4 NC_001829
Hu45 AY530608 Hu41 AY530604 Rh34 AY243001
Hu47 AY530610 Hu37 AY530600 Rh33 AY243002
Hu51 AY530613 Rh40 AY530559 Rh32 AY243003
Hu52 AY530614 Rh2 AY243007 其他   
Hu T41 AY695378 Bb1 AY243023 Rh74   
Hu S17 AY695376 Bb2 AY243022 髭頰蜥 AAV   
Hu T88 AY695375 Rh10 AY243015 蛇 AAV NC_006148.1
Hu T71 AY695374 Hu17 AY530582      
Hu T70 AY695373 Hu6 AY530621      
Hu T40 AY695372 Rh25 AY530557      
Hu T32 AY695371 Pi2 AY530554      
Hu T17 AY695370 Pi1 AY530553      
Hu LG15 AY695377 Pi3 AY530555      
本文中術語「異源核苷酸序列」及「異源核酸」可互換使用且係指於病毒中非天然產生之序列。一般地，異源核酸包含編碼受關注之多肽或非轉譯RNA之開放閱讀框(例如，用於遞送至細胞或個體)。
如本文中所用，「多核苷酸」係指核苷酸鹼基之序列，及可為RNA、DNA或DNA-RNA雜交序列(包含天然產生及非天然產生之核苷酸二者)，但是於代表性實施例中為單股或雙股DNA序列。
如本文中所用，術語「肽」係指短胺基酸序列。該術語肽可用於係指AAV衣殼胺基酸序列之部分或區域。該肽可為於天然AAV衣殼中天然產生之肽或於天然AAV衣殼中非天然產生之肽。AAV衣殼中之天然產生之AAV肽可經非天然產生之肽取代。例如，非天然產生之肽可經取代至AAV衣殼以提供經修飾之衣殼，使得天然產生之肽經非天然產生之肽置換。如本文中所用，除非另有指定，否則術語「多肽」包含肽及蛋白質二者。
如本文中所用，術語「胺基酸」包含任何天然產生之胺基酸、其修飾形式及合成胺基酸。或者，本文中胺基酸可為經修飾之胺基酸殘基及/或可為藉由轉譯後修飾(例如，乙醯化、醯胺化、甲醯化、羥基化、甲基化、磷酸化或磺化)修飾之胺基酸。天然產生之左旋(L-)胺基酸示於表 2 中。表 2.
胺基酸殘基 三字母代碼 一字母代碼
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺 Asn N
天冬胺酸 Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩胺醯胺 Gln Q
麩胺酸 Glu E
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
或者，胺基酸可為經修飾之胺基酸殘基(非限制性實例示於表 3 中)及/或可為藉由轉譯後修飾(例如，乙醯化、醯胺化、甲醯化、羥基化、甲基化、磷酸化或磺化)修飾之胺基酸。表 3.
經修飾之胺基酸殘基 縮略語
2-胺基己二酸 Aad
3-胺基己二酸 bAad
β-丙胺酸，β-胺基丙酸 bAla
2-胺基丁酸 Abu
4-胺基丁酸，哌啶酸 4Abu
6-胺基己酸 Acp
2-胺基庚酸 Ahe
2-胺基異丁酸 Aib
3-胺基異丁酸 bAib
2-胺基庚二酸 Apm
第三丁基丙胺酸 t-BuA
瓜胺酸 Cit
環己基丙胺酸 Cha
2,4-二胺基丁酸 Dbu
鎖鏈素 Des
2,2′-二胺基庚二酸 Dpm
2,3-二胺基丙酸 Dpr
N-乙基甘胺酸 EtGly
N-乙基天冬醯胺 EtAsn
高精胺酸 hArg
高半胱胺酸 hCys
高絲胺酸 hSer
羥基離胺酸 Hyl
異羥基離胺酸 aHyl
3-羥基脯胺酸 3Hyp
4-羥基脯胺酸 4Hyp
異鎖鏈素 Ide
異異白胺酸 aIle
甲硫胺酸亞碸 MSO
N-甲基甘胺酸，肌胺酸 MeGly
N-甲基異白胺酸 MeIle
6-N-甲基離胺酸 MeLys
N-甲基纈胺酸 MeVal
2-萘基丙胺酸 2-Nal
正纈胺酸 Nva
正白胺酸 Nle
鳥胺酸 Orn
4-氯苯基丙胺酸 Phe(4-Cl)
2-氟苯基丙胺酸 Phe(2-F)
3-氟苯基丙胺酸 Phe(3-F)
4-氟苯基丙胺酸 Phe(4-F)
苯基甘胺酸 Phg
β-2-噻吩基丙胺酸 Thi
此外，非天然產生之胺基酸可為「非天然」胺基酸，如由Wang等人，Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)所述。此等非天然胺基酸可有利地用於將受關注分子化學連接至AAV衣殼蛋白。
如本文中所用，術語「病毒載體」、「載體」或「基因遞送載體」係指功能為核酸遞送工具且包含於病毒粒子內包裝之載體基因組(例如，病毒DNA [vDNA])之病毒(例如，AAV)粒子。或者，於一些背景下，術語「載體」可用於係指載體基因組/單獨vDNA。
如本文中所用，「rAAV載體基因組」或「rAAV基因組」為包含一或多個異源核酸序列之AAV基因組(即，vDNA)。rAAV載體一般僅需要以順式之該(等)末端重複(TR)以產生病毒。所有其他病毒序列係可分配及可以反式供應(Muzyczka, (1992)Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97)。通常，rAAV載體基因組將僅保留一或多個TR序列以便最大化可藉由載體有效包裝之轉殖基因之大小。編碼結構及非結構蛋白之序列可以反式(例如，來自載體，諸如質體，或藉由將序列穩定整合至包裝細胞)提供。於本發明之實施例中，該rAAV載體基因組包含至少一個TR序列(例如，AAV TR序列)，視情況兩個TR (例如，兩個AAV TR)，其通常將在該載體基因組之5′及3′端處及側接異源核酸，但是不必與之相鄰。該等TR彼此可係相同或不同。
術語「末端重複」或「TR」包含任何病毒末端重複或合成序列，該序列形成髮夾結構及功能為末端反向重複(即，介導所需功能，諸如複製、病毒包裝、整合及/或前病毒營救及類似者)。該TR可為AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列，諸如其他細小病毒(例如，犬細小病毒(CPV)、小鼠細小病毒(MVM)、人類細小病毒B-19)之彼等或任何其他適宜病毒序列(例如，用作SV40複製之起源之SV40髮夾)可用作TR，其可進一步藉由截短、取代、缺失、插入及/或添加修飾。此外，該TR可係部分或完全合成，諸如「雙D序列」，如頒與Samulski 等人之美國專利第5,478,745號中所述。
「AAV末端重複」或「AAV TR」可係來自任何AAV，包括(但不限於)血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或現在已知或後來發現之任何其他AAV (參見，例如，表1)。AAV末端重複不需要具有天然末端重複序列(例如，天然AAV TR序列可藉由插入、缺失、截短及/或錯義突變更改)，只要該末端重複介導所需功能，例如，複製、病毒包裝、整合及/或前病毒營救及類似者。
AAV載體通常包含蛋白質基衣殼，及由衣殼包裹之核酸。該核酸可為(例如)包含側接有末端反向重複之轉殖基因之載體基因組。AAV「衣殼」為包含個別「衣殼蛋白」或「亞單元」之接近球形蛋白質殼。AAV衣殼通常包含約60個衣殼蛋白亞單元，該等亞單元以T=1二十面體對稱性締合及排列。當本文中描述AAV載體為包含AAV衣殼蛋白時，應瞭解，該AAV載體包含衣殼，其中該衣殼包含一或多種AAV衣殼蛋白(即，亞單元)。本文中亦描述「類病毒粒子(viral-like particles/virus-like particles)」，其係指不包含任何載體基因組或包含轉殖基因之核酸之衣殼。
本發明之病毒載體可進一步為「靶向」病毒載體(例如，具有定向向性)及/或「雜交」細小病毒(即，其中病毒TR及病毒衣殼係來自不同細小病毒)，如國際專利公開案WO 00/28004及Chao等人，(2000)Molecular Therapy 2:619中所述。
本發明之病毒載體可進一步為雙螺旋細小病毒粒子，如國際專利公開案WO 01/92551 (其揭示內容之全文係引用的方式併入本文中)中所述。因此，於一些實施例中，可將雙股(雙螺旋)基因組包裝至本發明之病毒衣殼中。此外，病毒衣殼或基因組元件可含有其他修飾，包括插入、缺失及/或取代。
術語「自補型AAV」或「scAAV」係指重組AAV載體，其形成自發重組之二聚體反向重複DNA分子，導致與習知單股(ss) AAV基因組相比更早且更穩健轉殖基因表現。參見，例如，McCarty, D.M.等人，Gene Therapy 8, 1248- 1254 (2001)。不像習知ssAAV，scAAV可繞過第二股合成，基因表現之速率限制步驟。此外，雙股scAAV於病毒轉導後較少傾向於DNA降解，從而增加穩定附加體之複本數。應注意，scAAV通常可僅具有約2.4 kb (習知AAV載體之一半大小)之基因組。於一些實施例中，本文中所述之AAV載體為自補型AAV。
「治療性多肽」或「治療性蛋白質」為可減輕、減少、預防、延遲及/或穩定自細胞或個體中之蛋白質之不存在或缺陷產生之症狀的多肽或蛋白質及/或為以其他方式對個體賦予效益(例如，抗癌效應或移植存活率之提高)之多肽。
術語「治療(treat/treating/treatment of)」 (及其語法變型)意指個體之病狀之嚴重度降低，至少部分改善或穩定及/或達成至少一種臨床症狀之一些減輕、緩解、減少或穩定及/或存在疾病或病症之進展之延遲。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」 (及其語法變型)係指相對於在不存在本發明方法下發生之情況個體之疾病、病症及/或臨床症狀之發作之預防及/或延遲及/或該(等)疾病、病症及/或臨床症狀之發作之嚴重度的降低。預防可係完全，例如，該(等)疾病、病症及/或臨床症狀之總體不存在。預防亦可係部分，使得個體之該(等)疾病、病症及/或臨床症狀之發生及/或發作之嚴重度小於不存在本發明下發生之情況。
如本文中所用，本文中術語「個體」及「患者」可互換使用及係指人類及非人類動物二者。本發明之術語「非人類動物」包含所有脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物及類似者。於一些實施例中，該個體包括人類。於其他實施例中，該個體包括需要一或多種基因療法之人類。
如本文中所用，「治療有效」量為足以向個體提供一些改善或效益之量。或者指定「治療有效」量為將提供個體之至少一種臨床症狀之一些減輕、緩解、減少或穩定之量。熟習此項技術者應瞭解，治療效應不必係完全或治癒，只要向個體提供一些效益。
如本文中所用，「預防有效」量為相對於在不存在本發明方法下發生之情況足以預防及/或延遲個體之疾病、病症及/或臨床症狀之發作及/或降低及/或延遲個體之疾病、病症及/或臨床症狀之發作之嚴重度的量。熟習此項技術者應瞭解，預防之程度不必係完全，只要向個體提供一些效益。
除非另有指定，否則本文中所用之所有技術術語具有與本發明從屬技術之一般技術者通常所理解相同之含義。II. 跨物種相容 AAV
腺相關病毒(AAV) (細小病毒家族之成員)為小的非包膜病毒。野生型AAV由包裹單股DNA基因組之二十面體蛋白質衣殼組成。於野生型AAV中，針對非結構蛋白(由Rep基因編碼)及結構蛋白(由衣殼基因或Cap基因編碼)，末端反向重複(ITR)側接編碼核苷酸序列(例如，多核苷酸)。Rep基因編碼調節功能(包括AAV基因組之複製)之非結構蛋白。Cap基因編碼組裝以形成衣殼之結構蛋白、VP1、VP2及/或VP3。
本發明提供相對於野生型衣殼蛋白包含胺基酸序列之修改(例如，取代)之重組AAV衣殼蛋白(VP1、VP2及/或VP3)，及包含經修飾之AAV衣殼蛋白之AAV衣殼及AAV載體。本發明者已發現本文中所揭示之修改可對包含本文中經修飾之AAV衣殼蛋白變異體之病毒載體賦予一或多種所需性質，包括(不限於)逃避中和抗體之能力及/或特異性且選擇性靶向受關注細胞或組織之能力。因此，本發明解決與習知AAV載體相關聯之一些限制。
於某些實施例中，本文中AAV載體可經工程改造以包含一或多種衣殼蛋白變異體。於一些實施例中，本文中AAV載體可為跨物種相容載體或「ccAAV」。於一些實施例中，AAV載體(例如，ccAAV)可經工程改造以包含至少一個或多個胺基酸取代，其中該一或多個取代可修改AAV衣殼蛋白上之一或多個抗原位點。一或多個抗原位點之修飾可導致抗體結合至一或多個抗原位點之抑制及/或包含本文中該衣殼蛋白變異體之病毒粒子之感染性之中和之抑制。
因此，本文中於一些實施例中，本發明提供包含一或多個胺基酸修飾(例如，取代及/或缺失)之腺相關病毒(AAV)衣殼蛋白變異體，其中該一或多個修飾修改AAV衣殼蛋白上之一或多個抗原位點。於一些實施例中，一或多個抗原位點之修飾可導致抗體結合至一或多個抗原位點之抑制及/或包含該AAV衣殼蛋白之病毒粒子之感染性之中和之抑制。於一些實施例中，經修飾之抗原位點可防止抗體結合或識別或中和AAV衣殼。於一些實施例中，該抗體可為IgG (包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)、IgM、IgE或IgA。於一些實施例中，經修飾之抗原位點可防止來自不同動物物種之抗體結合、識別或中和AAV衣殼，其中該動物為人類、犬、豬、牛、非人類靈長類動物、嚙齒動物、貓科動物或馬。
於一些實施例中，一或多個抗原位點之修飾可導致本文中AAV載體(例如，ccAAV)對一或多種細胞類型、一或多種組織類型或其任何組合之向性。如本文中所用，「向性」係指病毒優先進入某些細胞或組織，視情況接著由病毒基因組攜帶之序列於細胞中表現(例如，轉錄及視情況轉譯)，例如，針對重組病毒，受關注之異源核苷酸之表現。於一些實施例中，一或多個抗原位點之修飾可產生本文中之AAV載體，該等載體可展示對遍及個體之身體之一或多種細胞類型及/或組織之向性。於一些態樣中，一或多個抗原位點之修飾可產生本文中AAV載體，該等載體可展示對腦組織、肺組織、骨骼肌組織、心臟組織、肝組織、腎組織及/或胰組織之向性。於一些態樣中，一或多個抗原位點之修飾可產生本文中AAV載體，該等載體可展示對一或多種腦細胞、一或多種肺細胞、一或多種骨骼肌細胞、一或多種心臟細胞、一或多種肝細胞、一或多種腎細胞及/或一或多種胰細胞之向性。於一些態樣中，一或多個抗原位點之修飾可產生本文中AAV載體，該等載體可展示對腎之向性。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體內之一或多個胺基酸修飾(例如，取代及/或缺失)可係於藉由含有AAV衣殼蛋白之AAV抗體複合體之肽抗原決定基比對及/或低溫電子顯微鏡研究識別之一或多個抗原足跡中。於一些實施例中，可經受一或多個胺基酸修飾之本文中一或多個抗原位點可為如WO 2017/058892 (其全文係以引用的方式併入本文中)中所述之共用抗原模體(CAM)。
於一些實施例中，可經受一或多個胺基酸修飾之本文中一或多個抗原位點可係於AAV衣殼蛋白之可變區(VR)中。AAV衣殼含有藉由cap基因編碼且具有重疊序列之三個VP (VP1、VP2、VP3)之60個複本(總計)。各VP可含有保存於自主細小病毒衣殼中之八股β-桶模體(βB至βI)及/或α-螺旋(αA)。結構可變區(VR)可於連接β-股之表面環中出現，其聚集以於衣殼表面產生局部變化。於一些實施例中，修改本文中AAV衣殼蛋白變異體中之一或多個抗原位點之本文中一或多個胺基酸修飾可係於VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VI II、VR-IX或其任何組合中。於一些實施例中，一或多個抗原位點可係於本文中AAV衣殼蛋白變異體之HI環中。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可包含(i)本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體，及(ii)藉由衣殼蛋白包裹之貨物核酸。根據此等實施例，包含本文中所述之AAV衣殼蛋白變異體之AAV載體(例如，ccAAV)可具有以下表現型：逃避中和抗體；增強或維持之轉導效率；對一或多種細胞及/或組織類型之選擇性向性；及其任何組合。
本發明提供AAVcc.47，其證實與親本AAV9相比於心臟、骨骼肌及/或腎中之轉導高15至18倍。與AAV9相比於腦中神經元之轉導增加，然而膠質細胞轉導仍相對未更改。AAVcc.81及AAVcc.84將心臟及骨骼肌中之轉導增加4倍，然而與AAV9相比針對任一ccAAV未觀察到肝轉導之顯著增加。與AAV9相比利用ccAAV膠質細胞之轉導顯著減少，然而神經元向性稍微增加。藉由ccAAV之轉導效率之增加可提供治療載體之更低給藥方案。
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體展示與親本AAV9相比於心臟、骨骼肌、腎及腦神經元中之轉導高至少約2倍(例如，約4倍、約5倍、約7倍、約10倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約20倍、約25倍或約30倍，包含位於其間之所有值及子範圍)。
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可包含至少一個或多個胺基酸取代，其中約1個胺基酸殘基至約50個胺基酸殘基(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個)可自包含天然產生之衣殼蛋白之胺基酸序列之胺基酸殘基取代。根據本文中一些實施例，本文中AAV衣殼蛋白變異體可具有自包含天然產生之衣殼蛋白之胺基酸序列之胺基酸殘基取代之約7個胺基酸殘基。
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有與天然產生之衣殼蛋白具有至少約85% (例如，約85%、90%、95%、99%、100%)相似性之胺基酸序列。如本文中所用，「天然產生」或「野生型」意指天然存在，不由人類修改。於一些實施例中，本文中天然產生之衣殼蛋白可源自單個物種。可為本文中天然產生之衣殼蛋白之起源之物種之非限制性實例包括來自一般生物體，諸如人類、小鼠、大鼠、豚鼠、犬、貓、馬、牛、豬或非人類靈長類動物(例如，猴、黑猩猩、狒狒、大猩猩)、鳥、爬行動物、蠕蟲、魚及類似者之彼等。於一些實施例中，可為本文中天然產生之衣殼蛋白之起源之物種可為小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)、智人(人類)及其任何組合。於一些實施例中，如本文中所揭示之具有至少一個胺基酸取代之AAV衣殼蛋白變異體可具有與天然產生之衣殼蛋白具有約85% (例如，約85%、90%、95%、99%、100%)相似性之胺基酸序列，該天然產生之衣殼蛋白具有由GenBank寄存編號：NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704, J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579及其任何組合提及之胺基酸序列。
測定兩個或更多個胺基酸序列之間之序列相似性或同一性之方法係此項技術中已知。序列相似性或同一性可使用包括(但不限於)以下之標準技術來測定：Smith及Waterman，Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)之局部序列同一性演算法，藉由Needleman及Wunsch，J Mol. Biol. 48,443 (1970)之序列同一性比對演算法，藉由搜索Pearson及Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)之相似性方法，藉由此等演算法(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wl中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)之電腦化實施，由Devereux等人，Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)所述之最佳擬合序列程式或藉由檢查。另一適宜演算法為述於Altschul等人，J Mol. Biol . 215, 403-410, (1990)及Karlin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873- 5787 (1993)中之BLAST演算法。特別有用BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其係獲自Altschul等人，Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)。WU-BLAST-2使用若干搜索參數，該等參數視情況經設置為預設值。該等參數為動態值及藉由程式自身根據特定序列之組成及靠其正搜索受關注之序列之特定資料庫的組成建立；然而，可調整該等值以增加靈活性。此外，另外可用演算法為空隙BLAST，如由Altschul等人，(1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402報道。出於本發明之目的，除非另有指定，否則同一性%係使用在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi線上可得之基本局部比對搜索工具(BLAST)計算。熟習技工應瞭解，可酌情取代其他演算法。
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少胺基酸取代，該取代可置換來自下列血清型中之任一者之AAV衣殼蛋白中之任何七個胺基酸：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV、鳥AAV及/或現在已知或後來識別之任何其他AAV。於一些實施例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換來自具有對一或多種所需細胞及/或組織類型之已知向性之血清型之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。於一些實施例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換來自具有對一或多種所需人類細胞及/或組織類型之已知向性之血清型之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。
根據此等實施例，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換來自具有對CNS及/或PNS之向性之血清型之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。AAV可成功靶向CNS及PNS內之許多不同組織類型及細胞類型，包括(但不限於)神經元、星形細胞、寡樹突膠質細胞、小膠質細胞、穆勒(Müller)膠質細胞、施旺(Schwann)細胞及衛星細胞。於一些實例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換具有對星形細胞之向性之任何AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9)之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。於一些其他實例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換具有對寡樹突膠質細胞之向性之任何AAV血清型(例如，AAV8、AAV9)之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。於一些實例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換具有對小膠質細胞之向性之任何AAV血清型(例如，AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9)之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。於一些其他實例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換具有對穆勒膠質細胞之向性之任何AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV4、AAV6、AAV8、AAV9)之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。於一些實例中，本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體可具有至少一個胺基酸取代，該取代可置換具有對施旺細胞/衛星膠質細胞之向性之任何AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9)之AAV衣殼蛋白中的任何七個胺基酸。
於一些實施例中，本文中之AAV衣殼蛋白變異體或其片段可具有與天然產生之VPI衣殼蛋白或其片段具有約85% (例如，約85%、90%、95%、99%、100%)相似性之胺基酸序列。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基262-268 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基370-379 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基451-459 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含AAV1之胺基酸殘基472-473 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基493-500 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基528-534 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基547-552 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基588-597 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含AAV1之胺基酸殘基709-710 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之胺基酸殘基716-722 (VP1編號)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以下的胺基酸取代：AAV1之胺基酸殘基262-268 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基370-379 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基451-459 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基472-473 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基493-500 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基528-534 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基547-552 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基588-597 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基709-710 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；AAV1之胺基酸殘基716-722 (VP1編號)中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處；或以任何組合之其任何組合，或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基處。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之衣殼表面之可變環區域IV (VR4)內之胺基酸殘基或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之衣殼表面之可變環區域VIII (VR8)內之胺基酸殘基或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之衣殼表面之可變環區域IV (VR4)內之胺基酸殘基或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代，及以任何組合之AAV1之衣殼表面之可變環區域VIII (VR8)內之胺基酸殘基或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可具有與AAV9衣殼之天然序列(SEQ ID NO: 1)至少90% (例如，約90%、95%、99%、100%)序列同一性。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV9之衣殼表面之可變環區域IV (VR4)內之胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之衣殼表面之VR4內之胺基酸殘基(452-NGSGQNQ-458 (VP1編號；SEQ ID NO: 38))或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV9之衣殼表面之VR4內之胺基酸殘基(452-NGSGQNQ-458 (VP1編號；SEQ ID NO: 38))中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV9之衣殼表面之可變環區域VIII (VR8)內之胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之衣殼表面之VR8內之胺基酸殘基(586-SAQAQAQ-592 (VP1編號)；SEQ ID NO: 39)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV9之衣殼表面之VR8內之胺基酸殘基(586-SAQAQAQ-592 (VP1編號；SEQ ID NO: 39))中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV9之衣殼表面之可變環區域IV (VR4)內之胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代及以任何組合之AAV9之衣殼表面之可變環區域VIII (VR8)內之胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV1之衣殼表面之VR4內之胺基酸殘基(452-NGSGQNQ-458 (VP1編號；SEQ ID NO: 38))或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代，及以任何組合之AAV1之衣殼表面之VR8內之胺基酸殘基(586-SAQAQAQ-592 (VP1編號；SEQ ID NO: 39))或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含以任何組合之AAV9之衣殼表面之VR4內之胺基酸殘基(452-NGSGQNQ-458 (VP1編號；SEQ ID NO: 38))中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代，及以任何組合之AAV9之衣殼表面之VR8內之胺基酸殘基(586-SAQAQAQ-592 (VP1編號；SEQ ID NO: 39))中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可具有與來自本文中所述血清型中之任一者之天然產生之VP2衣殼蛋白或其片段具有約85% (例如約85%、90%、95%、99%、100%)相似性之胺基酸序列。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含來自本文中所述血清型中之任一者之以任何組合之天然產生之VP2衣殼蛋白或其片段內之胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可具有與來自本文中所述血清型中之任一者之天然產生之VP3衣殼蛋白或其片段具有約85% (例如約85%、90%、95%、99%、100%)相似性之胺基酸序列。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含來自本文中所述血清型中之任一者之以任何組合之天然產生之VP3衣殼蛋白或其片段內之胺基酸殘基中之一或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)處的胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可包含(i) AAV9衣殼蛋白變異體及(ii)藉由衣殼蛋白包裹之貨物核酸。根據此等實施例，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可包含(i) AAV9衣殼蛋白變異體及(ii)藉由衣殼蛋白包裹之貨物核酸，其中該衣殼蛋白包含在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸452-458 (VP1編號)處具有序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 40)之肽，其中該肽於天然AAV9衣殼蛋白序列中不出現。於一些態樣中，本文中AAV載體可包含AAV9衣殼蛋白變異體，該變異體包含在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸452-458 (VP1編號)處具有序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 40)之肽，其中X1 可為除了N之任何胺基酸；X2 可為除了G之任何胺基酸；X3 可為除了S之任何胺基酸；X4 可為除了G之任何胺基酸；X5 可為除了Q之任何胺基酸；X6 可為除了N之任何胺基酸；及/或X7 可為除了Q之任何胺基酸。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於EGGTVHA之胺基酸(SEQ ID NO: 20)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於FYGTDSA之胺基酸(SEQ ID NO: 21)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於HGQSASR之胺基酸(SEQ ID NO: 22)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於DTPTNQA之胺基酸(SEQ ID NO: 23)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於ITRQAYQ之胺基酸(SEQ ID NO: 24)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於RMFKSNQ之胺基酸(SEQ ID NO: 25)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於GVSLGGG之胺基酸(SEQ ID NO: 26)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於KHFLQGE之胺基酸(SEQ ID NO: 27)取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於MGRERAG之胺基酸(SEQ ID NO: 28)取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可與SEQ ID NO: 2-10中所闡述序列中之任一者共用至少約85% (例如，約85%、90%、95%、99%、100%)胺基酸序列相似性。根據本文中一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體包含SEQ ID NO: 2-10中所闡述序列中之任一者。下表 4 中提供天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)及SEQ ID NO 2-10之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可包含(i) AAV9衣殼蛋白變異體及(ii)藉由衣殼蛋白包裹之貨物核酸，其中該衣殼蛋白包含在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸586-592 (VP1編號)處具有序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 125)之肽，其中該肽於天然AAV9衣殼蛋白序列中不出現。於一些態樣中，本文中AAV載體可包含AAV9衣殼蛋白變異體，該變異體包含在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸586-592 (VP1編號)處具有序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 125)之肽，其中X1 可為除了S之任何胺基酸；X2 可為除了A之任何胺基酸；X3 可為除了Q之任何胺基酸；X4 可為除了A之任何胺基酸；X5 可為除了Q之任何胺基酸；X6 可為除了A之任何胺基酸；及/或X7 可為除了Q之任何胺基酸。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於LNSSVPS (SEQ ID NO: 29)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於YMDHQVS (SEQ ID NO: 30)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於TSDSLVS (SEQ ID NO: 31)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於NAVGALS (SEQ ID NO: 32)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於MPISHHE (SEQ ID NO: 33)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於DSGARGA (SEQ ID NO: 34)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於NVALALG (SEQ ID NO: 35)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於GALRMGM (SEQ ID NO: 36)之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於LSGEGAV (SEQ ID NO: 37)之胺基酸取代。
於一些實例中，本文中衣殼蛋白變異體可與SEQ ID NO: 11-19中所闡述序列中之任一者共用至少約85% (例如，約85%、90%、95%、99%、100%)胺基酸序列相似性。根據本文中一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體包含SEQ ID NO: 11-19中所闡述序列中之任一者。下表 4 中提供天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)及SEQ ID NO 11-19之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可包含(i) AAV9衣殼蛋白變異體及(ii)藉由衣殼蛋白包裹之貨物核酸，其中該衣殼蛋白包含在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)及胺基酸586-592 (VP1編號)處具有序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 40)之肽，其中該肽於天然AAV9衣殼蛋白序列中不出現。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可包含(i) AAV9衣殼蛋白變異體及(ii)藉由衣殼蛋白包裹之貨物核酸，其中該衣殼蛋白包含在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)及胺基酸586-592 (VP1編號)處具有序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 125)之肽，其中該肽於天然AAV9衣殼蛋白序列中不出現。
於一些態樣中，本文中AAV載體可包含AAV9衣殼蛋白變異體，該變異體包含具有以下之肽：(1)在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸452-458 (VP1編號)處之序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 40)，其中X1 可為除了N之任何胺基酸；X2 可為除了G之任何胺基酸；X3 可為除了S之任何胺基酸；X4 可為除了G之任何胺基酸；X5 可為除了Q之任何胺基酸；X6 可為除了N之任何胺基酸；及/或X7 可為除了Q之任何胺基酸；及(2)在天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸586-592 (VP1編號)處之序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEQ ID NO: 125)，其中X1 可為除了S之任何胺基酸；X2 可為除了A之任何胺基酸；X3 可為除了Q之任何胺基酸；X4 可為除了A之任何胺基酸；X5 可為除了Q之任何胺基酸；X6 可為除了A之任何胺基酸；及/或X7 可為除了Q之任何胺基酸。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可包含肽，其中對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置452-458 (VP1編號)之胺基酸可經對應於SEQ ID NO: 20-28中任一者之胺基酸取代及對應於天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之胺基酸位置586-592 (VP1編號)之胺基酸可經對應於SEQ ID NO: 29-37中任一者之胺基酸取代。
於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可與SEQ ID NO: 46-123中所闡述序列中之任一者共用至少約85% (例如，約85%、90%、95%、99%、100%)胺基酸序列相似性。根據本文中一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體包含SEQ ID NO: 46-123中所闡述序列中之任一者。下表 4 中提供天然AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)及SEQ ID NO 46-123之胺基酸序列。表 4.
SEQ ID NO AAV9 衣殼蛋白 胺基酸序列
1 AAV9 WT MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
2 AAV.cc41 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIEGGTVHAQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
3 AAV.cc42 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIFYGTDSAQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
4 AAV.cc43 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIHGQSASRQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
5 AAV.cc44    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIDTPTNQAQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
6 AAV.cc45    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIITRQAYQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
7 AAV.cc46    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIRMFKSNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
8 AAV.cc47    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIGVSLGGGQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
9 AAV.cc48    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKHFLQGEQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
10 AAV.cc49    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIMGRERAGQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
11 AAV.cc81    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQLNSSVPSTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
12 AAV.cc82    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQYMDHQVSTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
13 AAV.cc83    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQTSDSLVSTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
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15 AAV.cc85    MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQMPISHHETGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
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於其中經識別為X1 至X7 之任何胺基酸殘基未經取代之實施例中，在未經取代位置處之胺基酸殘基可為參考胺基酸序列(例如，AAV9 (SEQ ID NO: 1))之野生型胺基酸殘基。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可具有以任何組合之SEQ ID NO: 1之殘基452N、453G、454S、455G、456Q、457N及/或458Q (AAV9衣殼蛋白；VP1編號)處之胺基酸取代。於一些實施例中，本文中衣殼蛋白變異體可具有以任何組合之SEQ ID NO: 1之殘基586S、587A、588Q、589A、590Q、591A及/或592Q (AAV9衣殼蛋白；VP1編號)處之胺基酸取代。
於一些實施例中，本發明之衣殼蛋白變異體可藉由將現在已知或後來發現之任何AAV衣殼蛋白之衣殼蛋白修飾來產生。此外，待根據本發明修飾之AAV衣殼蛋白可為天然產生之AAV衣殼蛋白(例如，AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣殼蛋白或表 1 中所示之AAV中之任一者)，但是非如此限制。熟習此項技術者應瞭解，對AAV衣殼蛋白之各種操作係此項技術中已知且本發明不限於天然產生之AAV衣殼蛋白之修飾。例如，待修飾之衣殼蛋白可已具有一或多個更改，如與天然產生之AAV (例如，源自天然產生之AAV衣殼蛋白，例如，AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或現在已知或後來發現之任何其他AAV)相比。此等AAV衣殼蛋白亦於本發明之範圍內。
本發明之一些態樣提供病毒衣殼，其可具有本文中所揭示之衣殼蛋白變異體中之任一者中之一或多者。於一些實施例中，本文中病毒衣殼可為細小病毒衣殼，其可進一步為自主細小病毒衣殼或依賴病毒衣殼。視情況，本文中病毒衣殼可為AAV衣殼。於一些實施例中，本發明之AAV衣殼可為AAV1、AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV衣殼、鳥AAV衣殼及/或現在已知或後來識別之任何其他AAV。
於一些實施例中，本文中經修飾之病毒衣殼可用作衣殼載體。於一些實施例中，分子可藉由本文中經修飾之病毒衣殼包裝及轉移至細胞，其中該等分子可包括異源DNA、RNA、多肽、有機小分子、金屬或其組合。本文中將異源分子定義為於AAV感染中非天然發現之彼等，例如，非藉由野生型AAV基因組編碼之彼等。此外，本文中使用之治療上可用分子可與將該等分子轉移至一或多個宿主標靶細胞之嵌合病毒衣殼外部締合。此等締合分子可包括DNA、RNA、有機小分子、金屬、碳水化合物、脂質及/或多肽。於一些實施例中，本文中治療上可用分子可與衣殼蛋白共價連接(即，結合或化學偶合)。共價連接分子之方法由熟習此項技術者已知。
於一些實施例中，本文中經修飾之病毒衣殼可用於提升針對本文中所揭示之衣殼蛋白變異體之抗體。作為另一替代，可將外源胺基酸序列插入經修飾之病毒衣殼中用於抗原呈遞至細胞，例如，用於向個體投與以產生對外源胺基酸序列之免疫反應。
於一些實施例中，本文中經修飾之病毒衣殼可為包含靶向序列(例如，於病毒衣殼中取代或插入)之靶向病毒衣殼，該靶向序列可指導病毒衣殼與所需標靶組織上呈遞之細胞表面分子相互作用(參見，例如，國際專利公開案WO 00/28004及Hauck等人，(2003)J. Virology 77:2768-2774；Shi等人，Human Gene Therapy 17:353-361 (2006) [描述整聯蛋白受體結合模體RGD在AAV衣殼亞單元之位置520及/或584處之插入]；及美國專利第7,314,912號[描述含有RGD模體之P1肽於AAV2衣殼亞單元之胺基酸位置447、534、573及587後之插入])。容忍插入之AAV衣殼亞單元內之其他位置係此項技術中已知(例如，由Grifman等人，Molecular Therapy 3:964-975 (2001)所述之位置449及588)。
作為一實例，本發明之病毒衣殼可具有對受關注之某些標靶組織(例如，肝、骨骼肌、心臟、膈肌、腎、腦、胃、腸、皮膚、內皮細胞及/或肺)之相對無效向性。可將靶向序列有利地併入此等低轉導載體中，從而賦予病毒衣殼所需向性及視情況對特定組織之選擇性向性。包含靶向序列之AAV衣殼蛋白、衣殼及載體述於(例如)國際專利公開案WO 00/28004中。作為另一實例，可將如由Wang等人，Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)所述之一或多種非天然產生之胺基酸在正交位點處併入本發明之AAV衣殼亞單元中，作為將低轉導載體重新定向至所需標靶組織之方法。此等非天然胺基酸可有利地用於將受關注分子化學連接至包含(不限於)以下之AAV衣殼蛋白：聚糖(甘露糖-樹突狀細胞靶向)；RGD，用於靶向遞送至特定癌細胞類型之鈴蟾素或神經肽；選自靶向特定細胞表面受體(諸如生長因子受體、整合素及類似者)之噬菌體顯示之RNA適體或肽。化學修飾胺基酸之方法係此項技術中已知(參見，例如，Greg T. Hermanson,Bioconjugate Techniques ，第1版，Academic Press, 1996)。
於一些實施例中，靶向序列可為指導特定細胞類型感染之病毒衣殼序列(例如，自主細小病毒衣殼序列、AAV衣殼序列或任何其他病毒衣殼序列)。
作為另一非限制性實例，可將肝素結合域(例如，呼吸道合胞體病毒肝素結合域)插入或取代至通常不結合HS受體之衣殼亞單元(例如，AAV9)以賦予對所得突變體之肝素結合。於另一非限制性實例中，可將B19衣殼之紅血球糖苷酯受體結合域取代至本發明之AAV衣殼蛋白以將包含該AAV衣殼蛋白之病毒衣殼或病毒載體靶向紅血球系細胞。
於一些實施例中，本文中使用之外源靶向序列可為編碼肽之任何胺基酸序列，該肽改變包含經修飾之AAV衣殼蛋白之病毒衣殼或病毒載體之向性。於一些實施例中，靶向肽或蛋白質可係天然產生或或者完全或部分合成。於一些實例中，靶向序列可包含配位體及結合至細胞表面受體及醣蛋白，諸如RGD肽序列、緩激肽、激素、肽生長因子(例如，表皮生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、血小板源生長因子、類胰島素生長因子I及II等)、細胞激素、黑素細胞刺激激素(例如，α、β或γ)、神經肽及內啡肽及類似者之其他肽，及保留將細胞靶向其同源受體之能力之其片段。其他說明性肽及蛋白質包括物質P、角化細胞生長因子、神經肽Y、胃泌素釋放肽、介白素2、雞蛋清溶菌酶、促紅血球生成素、促性腺素釋放素、皮層抑素、β-內啡肽、白胺酸腦啡肽、強啡肽B、α-新腦啡肽、血管收縮素、肺炎球菌素(pneumadin)、血管活性腸肽、神經降壓素、胃動素及其片段，如上所述。作為又一替代，來自毒素(例如，破傷風毒素或蛇毒素(諸如α-環蛇毒素)及類似者)之結合域可經取代至衣殼蛋白作為靶向序列。於一些其他實施例中，AAV衣殼蛋白可藉由將如由Cleves (Current Biology 7:R318 (1997))所述之「非典型」輸入/輸出信號肽(例如，纖維母細胞生長因子-1及-2、介白素1、HIV-1 Tat蛋白、皰疹病毒VP22蛋白及類似者)取代至AAV衣殼蛋白來修飾。亦包含指導藉由特定細胞攝取之肽模體，例如，FVFLP (SEQ ID NO: 41)肽模體觸發藉由肝細胞之攝取。於一些實施例中，本文中使用之靶向序列可為可用於與靶向進入細胞之另一分子化學偶合之肽(例如，可包含可經由其R基團化學偶合之精胺酸及/或離胺酸殘基)。
於一些實施例中，本文中所揭示之衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或AAV載體(例如，ccAVV)可具有相對於該衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體來源之AAV血清型之轉導效率等效或增強之轉導效率。於一些實施例中，本文中所揭示之衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體(例如，ccAVV)可具有相對於該衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體來源之AAV血清型之轉導效率降低之轉導效率。於一些實施例中，本文中所揭示之衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體(例如，ccAVV)可具有相對於該衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體來源之AAV血清型之向性等效或增強之向性。於一些實施例中，本文中所揭示之衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體(例如，ccAVV)可具有相對於該衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體來源之AAV血清型之向性改變或不同之向性。於一些實施例中，本文中所揭示之衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體(例如，ccAVV)可具有或經工程改造以具有對腦組織之向性。於一些實施例中，本文中所揭示之衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或AAV載體(例如，ccAVV)可產生相對於該衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體來源之AAV血清型之免疫反應衰減之免疫反應。於一些實施例中，本文中所揭示之衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或AAV載體(例如，ccAVV)可以相對於可使用該衣殼蛋白變異體、病毒衣殼及/或載體來源之AAV血清型所投與之劑量數的多個劑量(例如，約2個劑量、約3個劑量、約4個劑量、約5個劑量、約10個劑量、約15個劑量、約20個劑量、約40個劑量，以觀察到一或多個所需反應所需之許多劑量)向個體投與。(A) 衣殼及 ccAVV 工程改造
於一些實施例中，合理工程改造及/或突變方法可用於識別本文中所揭示之AAV載體(例如，ccAAV)之衣殼蛋白變異體。於一些實施例中，本文中方法可用於產生逃避中和抗體之AAV載體。於一些實施例中，本文中方法可用於產生具有提高之基因轉移效率之AAV載體。於一些實施例中，本文中方法可用於產生於超過一種哺乳動物物種中具有提高之基因轉移效率之AAV載體。於一些實施例中，本文中方法可用於產生特異性靶向受關注細胞或組織(例如，腎細胞)之AAV載體。
於一些實施例中，本文中所述之重組AAV相對於具有原本相同但是其缺少一或多個胺基酸取代的衣殼蛋白之重組AAV於一或多個哺乳動物物種中具有提高之基因轉移效率。於一些實施例中，提高之基因轉移效率於下列中之一或多者中發生：小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)。於一些實施例中，提高之基因轉移效率於下列細胞類型或組織中之一或多者中產生：脊髓(例如，膠質細胞、神經元、內皮細胞)、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝。於一些實施例中，提高之基因轉移效率於腎細胞或腎組織中發生。
本發明之態樣提供產生如本文中所揭示之AAV載體之方法。於一些實施例中，方法可包括下列步驟中之一或多者：a)識別接觸胺基酸殘基，該等殘基形成AAV衣殼蛋白上之三維抗原足跡；b)產生AAV衣殼蛋白之庫，該等衣殼蛋白包含於(a)中識別之接觸胺基酸殘基之胺基酸取代；c)產生AAV粒子，該等粒子包含來自(b)之AAV衣殼蛋白之庫之衣殼蛋白；d)在感染及複製可發生之條件下使(c)之AAV粒子與細胞接觸；e)選擇AAV粒子，該等粒子可完成至少一個感染週期及複製至類似於對照AAV粒子之效價；f)在感染及複製可發生之條件下使(e)中所選之AAV粒子與中和抗體接觸；及g)選擇不由(f)之中和抗體中和之AAV粒子。用於識別接觸胺基酸殘基之方法之非限制性實例包括肽抗原決定基比對及/或低溫電子顯微鏡。熟習此項技術者應瞭解，存在可用於產生AAV衣殼蛋白之庫之方法及方案之不斷演化的多樣性(例如，合理設計、條碼、定向演化、電腦模擬發現)。適用於本文中使用之產生領域中已知或待發現之AAV衣殼蛋白之庫之任何方法可根據本文中所揭示之方法使用及/或最佳化使用。
於一些實施例中，產生包含於AAV衣殼蛋白中識別之接觸胺基酸殘基之胺基酸取代之AAV衣殼蛋白之庫可產生親本AAV衣殼蛋白庫。於一些實施例中，本文中產生ccAAV載體之方法可包括向哺乳動物投與親本AAV衣殼蛋白庫。於一些實施例中，向哺乳動物投與親本AAV衣殼蛋白庫可為向哺乳動物全身投與。於一些實施例中，親本AAV衣殼蛋白庫可向具有小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)之物種之哺乳動物投與。於一些實施例中，衣殼蛋白可藉由於投與親本AAV衣殼蛋白庫後自來自哺乳動物之細胞及/或組織收集濃化。於一些實施例中，衣殼蛋白可藉由於投與親本AAV衣殼蛋白庫後自來自哺乳動物之細胞及/或組織收集濃化，其中該細胞及/或組織包括脊髓(例如，膠質細胞、神經元、內皮細胞)、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織，及其任何組合。於一些實施例中，衣殼蛋白可於投與親本AAV衣殼蛋白庫約1天至約1個月(例如，約1天、5天、1週、2週、3週、一個月)後自哺乳動物收集。於一些實施例中，於投與親本AAV衣殼蛋白庫後自哺乳動物收集之衣殼蛋白可用於產生稱作演化之AAV衣殼蛋白庫之另一AAV衣殼蛋白庫。
於一些實施例中，演化之AAV衣殼蛋白庫可向具有小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)之物種之哺乳動物投與，只要該物種與投與親本AAV衣殼蛋白庫之物種不同。於一些實施例中，衣殼蛋白可藉由於投與演化之AAV衣殼蛋白庫後自來自哺乳動物之細胞及/或組織收集濃化。於一些實施例中，衣殼蛋白可藉由於投與演化之AAV衣殼蛋白庫後自來自哺乳動物之細胞及/或組織收集濃化，其中該細胞及/或組織包括脊髓(例如，膠質細胞、神經元、內皮細胞)、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織，及其任何組合。於一些實施例中，衣殼蛋白可於投與演化之AAV衣殼蛋白庫後自哺乳動物收集及識別。於一些實施例中，衣殼蛋白可於投與演化之AAV衣殼蛋白庫約1天至約1個月(例如，約1天、5天、1週、2週、3週、一個月)後自哺乳動物收集及識別。於一些實施例中，於投與演化之AAV衣殼蛋白庫後自哺乳動物收集及識別之衣殼蛋白可用於產生另外第二演化之AAV衣殼蛋白庫。於一些實施例中，第二演化之AAV衣殼蛋白庫可向具有小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)之物種之哺乳動物投與只要該物種與投與第一演化之AAV衣殼蛋白庫之物種不同。於一些實施例中，第二演化之AAV衣殼蛋白庫可向具有小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)之物種之哺乳動物投與只要該物種與投與第一演化之AAV衣殼蛋白庫之物種不同且該物種與投與親本AAV衣殼蛋白庫之物種相同。於一些實施例中，第二演化之AAV衣殼蛋白庫可向具有小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)之物種之哺乳動物投與，只要該物種與投與第一演化之AAV衣殼蛋白庫之物種不同且該物種與投與親本AAV衣殼蛋白庫之物種不同。
於一些實施例中，各代演化之庫可稱作共同演化AAV衣殼蛋白庫之「循環」。於一些實施例中，本文中將AAV衣殼蛋白庫共同演化之方法可涉及約1至約10個(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)循環。於一些實施例中，如本文中所揭示之各循環可於與進行其之循環不同之物種中進行。於一些實例中，本文中將AAV衣殼蛋白庫共同演化之方法可涉及於小鼠中之一個循環，於豬中之第二循環，於小鼠中之第三循環，於豬中之第四循環等等。於一些實例中，本文中將AAV衣殼蛋白庫共同演化之方法可涉及於小鼠中之一個循環，於非人類靈長類動物中之第二循環，於小鼠中之第三循環，於非人類靈長類動物中之第四循環等等。於一些實例中，本文中將AAV衣殼蛋白庫共同演化之方法可涉及於小鼠中之一個循環，於豬中之第二循環，於非人類靈長類動物中之第三循環，於小鼠中之第四循環等等。於一些實例中，本文中將AAV衣殼蛋白庫共同演化之方法可涉及於豬中之一個循環，於小鼠中之第二循環，於非人類靈長類動物(例如，猴)中之第三循環等等。
於一些實施例中，演化出新穎之腺相關病毒株之方法包括將AAV庫跨多個哺乳動物物種繼代，其中該等AAV庫包含複數個重組AAV載體，其中各重組AAV載體包含包含相對於野生型AAV衣殼蛋白之一或多個胺基酸突變之衣殼蛋白變異體。於一些實施例中，AAV庫中之各重組AAV載體包含相對於野生型AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之一或多個胺基酸突變。於一些實施例中，該一或多個胺基酸突變係於對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458或SEQ ID NO: 1之586-592之區域中，或該等突變於對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458及586-592之區域二者中發現。
於一些實施例中，演化出新穎之AAV株之方法包括向第一哺乳動物物種投與第一AAV庫。然後可將來自存在於第一哺乳動物物種之一或多個標靶組織中之第一AAV庫之AAV定序，及用於產生第二AAV庫。隨後可向第二哺乳動物物種投與該第二AAV庫，其中該等第一哺乳動物物種與該第二哺乳動物物種不同。然後可將來自存在於第二哺乳動物物種之一或多個標靶組織中之第二AAV庫之AAV定序。於一些實施例中，該第一哺乳動物物種及該第二哺乳動物物種各獨立地選自由以下組成之群：小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)及智人(人類)。然後可利用第三、第四、第五、第六等物種重複此等步驟。於一些實施例中，第一哺乳動物物種、第二哺乳動物物種(或任何隨後物種)之一或多個標靶組織係選自脊髓(例如，膠質細胞、神經元、內皮細胞)、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織，及其任何組合。(B) AAV 載體
於某些實施例中，本發明提供AAV載體，其包含本文中所揭示之衣殼蛋白變異體中之一或多者。如本文中所用，「載體」係指轉運、轉導或以其他方式充當異源分子之載體之任何分子或部分。「病毒載體」為包含編碼或包含受關注之有效載荷分子(例如，轉殖基因、編碼多肽或多個多肽或調節核酸之多核苷酸)之一或多個多核苷酸區之載體。本發明之病毒載體可使用此項技術中已知方法重組產生。此等技術於文獻中，諸如於Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第2版(Sambrook等人，1989) Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology , Humana Press; andCell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編輯，1989) Academic Press中充分解釋。
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV病毒粒子可具有用於表現本文中所揭示之衣殼蛋白變異體中之一或多者之載體基因組。於一些實施例中，AAV載體之載體基因組可衍生自病毒(諸如AAV)之野生型基因組，藉由使用分子方法以移除來自病毒(例如，AAV)之野生型基因組，及用非天然核酸，諸如異源多核苷酸序列(例如，受關注轉殖基因之編碼序列)置換。通常，針對AAV載體，野生型AAV基因組之一個或兩個末端反向重複(ITR)序列保留於AAV載體中，然而野生型病毒基因組之其他部分經非天然序列(諸如保留之ITR之間之異源多核苷酸序列)置換。本文中所揭示之載體基因組可包含源自AAV基因組之骨幹元件、本文中所揭示之衣殼蛋白變異體之編碼序列及可操作連接至編碼序列之適宜啟動子。於一些實例中，本文中所揭示之載體基因組可進一步包含調節編碼蛋白之表現及/或分泌之調節序列。實例包括(但不限於)增強子、聚腺苷酸化信號位點、內部核糖體進入位點(IRES)、編碼蛋白質轉導域(PTD)之序列、microRNA標靶位點或其組合。
於一些實例中，本文中所述之載體基因組可為單股。於其他實例中，本文中所揭示之載體基因組可為雙股。例如，本文中所述之載體基因組可為能包含其中雙股部分之自補型AAV載體基因組。
(1) AAV- 骨幹元件
於一些實施例中，本文中所揭示之載體基因組可具有源自一或多種AAV基因組之骨幹元件，其係指AAV載體之生物活性所需之最小AAV基因組元件。例如，源自AAV基因組之骨幹元件可包含待組裝至AAV病毒粒子之載體之包裝位點、本文中所揭示之衣殼蛋白變異體中之一或多者、宿主細胞中載體複製及/或其中包含之轉殖基因編碼序列之表現所需之元件。
於一些實例中，本文中所揭示之載體基因組骨幹可包含至少一個末端反向重複(ITR)序列。於一些實例中，本文中載體基因組骨幹可包含兩個ITR序列。於一些實例中，一個ITR序列可為編碼轉殖基因之多核苷酸序列之5’。於一些實例中，一個ITR序列可為編碼轉殖基因之多核苷酸序列之3’。於一些實例中，本文中編碼轉殖基因之多核苷酸序列可在ITR序列之任一側。因此，於一些實施例中，載體基因組包含位於第一ITR與第二ITR之間之轉殖基因。
於一些實施例中，本文中載體基因組可包含源自至少一個不同AAV血清型之序列或組分。於一些實例中，本文中所揭示之AAV載體基因組骨幹可包含至少來自一個不同AAV血清型之ITR序列。於一些實例中，本文中所揭示之AAV載體基因組骨幹可包含至少來自一個不同人類AAV血清型之ITR序列。此人類AAV可源自任何已知血清型，例如，源自血清型1至11中之任一者。於一些實例中，本文中所用之AAV血清型具有對中樞神經系統(CNS)、心臟組織、骨骼肌及/或肝組織之向性。於一些實例中，本文中所揭示之AAV載體基因組骨幹可具有血清型AAV9之ITR序列。
於一些實施例中，本文中AAV載體可為假型AAV載體(即，包含源自至少兩個不同AAV血清型之序列或組分)。於一些實施例中，本文中假型AAV載體可包含源自一個AAV血清型之AAV基因組骨幹，及至少部分源自不同AAV血清型之衣殼蛋白。於一些實例中，本文中假型AAV載體可具有AAV2載體基因組骨幹及源自具有對心臟組織之向性之AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8或AAV9)之衣殼蛋白。
為分析病毒載體介導之基因轉移之成功，能監測載體之分佈及載體介導之基因表現之有效性二者可係重要的。此可藉由將報告基因次選殖至載體基因組骨幹中來達成。於一些實例中，本文中所揭示之AAV載體基因組骨幹可含有報告基因。若干報告基因通常用於此目的及包括(但不限於)各種顏色之螢光蛋白(包括綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP))、大腸桿菌(E. coli) β-半乳糖苷酶(LacZ)及螢光素酶(Luc)之各種形式。於一些實例中，本文中所揭示之AAV載體骨幹可含有GFP。
本文中所揭示之載體構築體可使用已知技術製備。(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel., F.等人編輯，Wiley and Sons, New York 1995)。可選擇片段長度使得重組基因組不超出AAV粒子之包裝能力。若必要，則可將「填充」DNA序列添加至構築體以維持標準AAV基因組大小用於比較目的。此片段可源自此等非病毒來源(例如，lacZ)或為熟習此項技術者已知且可得之其他基因。
(2) 自補型 AAV 病毒載體
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體可為自補型AAV (scAAV)載體。自補型AAV (scAAV)載體含有當進入受感染細胞時能自發退火(自身折疊回以形成雙股基因組)，從而規避使用細胞之DNA複製機器轉化單股DNA載體之需要之互補序列。本文中具有自補型基因組之AAV可憑借其部分互補序列(例如，轉殖基因編碼序列之互補編碼及非編碼股)快速形成雙股DNA分子。
於一些實施例中，本文中所揭示之scAAV病毒載體可包含可形成股內鹼基對之第一異源多核苷酸序列及第二異源多核苷酸序列。於一些實例中，第一異源多核苷酸序列及第二異源多核苷酸序列藉由促進股內鹼基成對之序列連接；例如，以形成髮夾DNA結構。於一些實例中，scAAV載體之二聚體結構在進入細胞後可藉由兩個末端決定位點(trs)中之一者之突變或缺失來穩定。因為trs為含於各ITR內之Rep結合位點，此trs之突變或缺失可防止scAAV載體之二聚體結構藉由AAV Rep蛋白之裂解以形成單體。於一些實施例中，本文中所揭示之scAAV病毒載體可包含截短之5’末端反向重複(ITR)、截短之3’ ITR或二者。於一些實例中，本文中所揭示之scAAV載體可包含截短之3’ ITR，其中D區或其部分(例如，其中末端決定序列)可缺失。此截短之3’ ITR可位於以上指定之第一異源多核苷酸序列與第二異源多核苷酸序列之間。(3) 啟動子
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體包含針對表現所需之另外元件，諸如控制轉殖基因編碼序列之表現之至少一種適宜啟動子。此啟動子可係普遍存在、組織特異性、強、弱、調節、嵌合等以允許蛋白質於受感染組織中之有效且適宜產生。該啟動子可與編碼蛋白質同源或異源，包括細胞、病毒、真菌、植物或合成啟動子。本文中使用之最佳啟動子於人類細胞中可係功能性。普遍存在啟動子之非限制性實例包括病毒啟動子，特定言之CMV啟動子、RSV啟動子、SV40啟動子等及細胞啟動子，諸如PGK (磷酸甘油酸激酶)啟動子。於一些實施例中，本文中病毒啟動子可為CMV啟動子、SV40啟動子或其任何組合。
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體可包含針對表現所需之另外元件，諸如於適宜細胞感染後控制轉殖基因編碼序列之表現之至少一種適宜啟動子。本文中使用之適宜啟動子包括(除了AAV啟動子)例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子或雞β肌動蛋白/巨細胞病毒雜交啟動子(CAG)、內皮細胞特異性啟動子(諸如VE-鈣黏蛋白啟動子)，以及類固醇啟動子及金屬硫蛋白啟動子。於一些實施例中，本文中所揭示之載體中所用之啟動子可為CAG啟動子。
於一些實施例中，根據本發明之轉殖基因編碼序列包含功能上連接至待表現之轉殖基因編碼序列之組織特異性啟動子。因此，根據本發明之載體針對組織(例如，腦、心臟、肌肉、肝)之特異性可進一步增加。於一些實例中，本文中所揭示之載體可具有組織特異性啟動子，其於特定組織中之活性高於非特定組織之組織中之活性至少約2倍、5倍、約10倍、20倍、50倍或100倍。於一些實例中，本文中組織特異性啟動子為人類組織特異性啟動子。於一些實例中，表現盒亦可包含增加待表現之外源蛋白之表現程度之增強子元件。此外，表現盒可進一步包含聚腺苷酸化序列，諸如SV40聚腺苷酸化序列或牛生長激素之聚腺苷酸化序列。(4) 用於基因表現之其他調節元件
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體可包含一或多種習知控制元件，該等元件以許可其於經質體載體轉染或經藉由本發明產生之病毒感染之細胞中轉錄、轉譯及/或表現之方式以可操作方式連接至轉殖基因編碼序列。如本文中所用，「以可操作方式連接」之序列可包含與轉殖基因編碼序列相鄰之表現控制序列及以反式或遠側作用以控制轉殖基因編碼序列之表現控制序列二者。表現控制序列可進一步包括適宜轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化(polyA)信號；穩定細胞質mRNA之序列；增強轉譯效率之序列(例如，科紮克(Kozak)共有序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當所需時，增強編碼產物之分泌之序列。許多表現控制序列(包含天然、構成、可誘導及/或組織特異性啟動子)係此項技術中已知且本文中可利用。
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體可包含經修飾之衣殼(包含非病毒來源或經結構修飾之蛋白質或肽)以改變載體之向性。例如，該衣殼可包含特定受體之配位體或特定配位體之受體以使載體靶向各自表現該受體或配位體之細胞類型。(C) AAV 病毒粒子之血清型
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體可自AAV之各種血清型製備或衍生。術語「血清型」為關於具有衣殼之AAV的區別，與其他AAV血清型在血清學上不同。血清學區別性係基於如與其他AAV相比，對AAV缺少抗體之間之交叉反應性測定。交叉反應性可使用此項技術中已知方法量測。例如，本文中交叉反應性可使用中和抗體檢定量測。針對此檢定，多純系血清於兔或其他適宜動物模型中使用腺相關病毒針對特異性AAV產生。於此檢定中，然後測試針對特異性AAV產生之血清中和相同(同源)或異源AAV之能力。認為達成50%中和之稀釋為中和抗體效價。若針對兩種AAV，異源效價除以同源效價之商的倒數低於16，則認為彼等兩種載體為相同血清型。相反，若異源效價與同源效價之比率的倒數為16或更多，則認為該等兩種AAV為不同血清型。
於一些實施例中，本文中AAV載體可為AAV之至少兩種血清型或與其他類型之病毒之混合物以產生嵌合(例如，假型) AAV病毒。於一些實施例中，本文中AAV載體可為人類血清型AAV載體。此人類AAV可源自任何已知血清型，例如，源自血清型1至11中之任一者。(D) 製備 AAV 粒子之方法
於一些實施例中，本文中所述之AAV載體基因組可經包裝至病毒粒子中，該等病毒粒子可用於遞送用於轉殖基因編碼序列表現之基因組至標靶細胞。於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體基因組可藉由瞬時轉染、使用生產細胞系、將病毒碼合併至Ad-AAV雜交體、使用皰疹病毒系統或使用桿狀病毒(baculoviruse)於昆蟲細胞中產生包裝至粒子。
本文中使用之生成包裝細胞之方法可涉及創建穩定表現用於AAV粒子產生之所有必要組分之細胞系。例如，將包含缺少AAV rep及cap基因之rAAV基因組之質體(或多個質體)、自rAAV基因組分離之AAV rep及cap基因及選擇性標誌物(諸如新黴素(neomycin)抗性基因)整合至細胞之基因組。AAV基因組已藉由諸如GC跟蹤、添加含有限制性內切酶裂解位點之合成連接子或藉由直接平端連接之程序引入細菌質體。然後將包裝細胞系用輔助病毒(諸如腺病毒)感染。此方法之優點為該等細胞係可選擇且適用於rAAV之大規模生產。本文中適宜方法之實例採用腺病毒或桿狀病毒而非質體以引入rAAV基因組及/或rep及cap基因至包裝細胞中。(E) AAV 載體及 AAV 粒子之 特徵
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可具有一或多個改善。如本文中所用，「天然分離之AAV載體」係指不包含本文中所揭示之衣殼蛋白變異體中之一或多者之載體。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可具有增加之細胞中之基因轉移效率。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可具有至少約2倍至約50倍(例如，約2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)增加之細胞中之基因轉移效率。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子可具有一或多個哺乳動物物種之細胞及/或組織中之增加的基因轉移效率。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子可具有小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)及其任何組合中之一或多者之細胞及/或組織中之增加的基因轉移效率。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子可具有哺乳動物脊髓(例如，膠質細胞、神經元、內皮細胞)、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸、肝組織及其任何組合之細胞及/或組織中之增加的基因轉移效率。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可具有更高載體效價。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可具有至少約2倍至約50倍(例如，約2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)更高的載體效價。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可對抗體介導之中和較不易感。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可對抗體介導之中和約2倍至約50倍(例如，約2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)較不易感。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可於向個體投與至少約1小時至約24小時(例如，約1、2、4、8、12、16、20、24小時)後對抗體介導之中和較不易感。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可於向本文中個體至少一次投與後產生更低含量之抗AAV抗體。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子與天然分離之AAV載體相比可於向本文中個體至少一次投與後產生約2倍至約50倍(例如，約2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)更少的抗AAV抗體。於一些實施例中，包含本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子之基因療法可向本文中個體投與約2次至約10次(例如，約2、3、4、5、6、7、8、9、10次)而不對抗體介導之中和易感。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子可於超過一種哺乳動物之任何細胞或組織類型中表現。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子可於超過一種哺乳動物之任何細胞或組織類型中表現，該哺乳動物包括人類、小鼠、大鼠、豚鼠、犬、貓、馬、牛、豬或非人類靈長類動物(例如，猴、黑猩猩、狒狒、大猩猩)。於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)及/或AAV粒子可於人類、小鼠、犬及非人類靈長類動物之任何細胞或組織類型中表現。 III.醫藥組合物
於一些實施例中，本文中所揭示之AAV載體(例如，ccAAV)、病毒衣殼及/或AAV病毒粒子中之任一者可經調配以形成醫藥組合物。於一些實例中，本文中醫藥組合物可進一步包含醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。待用於本發明方法中之醫藥組合物中之任一者可包含呈凍乾調配物或水溶液形式之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。
醫藥組合物中之載劑就其與組合物之活性成分相容及較佳地，能穩定活性成分且不對待治療之個體有害之意義而言必須「可接受」。例如，「醫藥上可接受」可係指組合物之分子實體及其他成分，該等組合物包含生理上耐受且當向哺乳動物(例如，人類)投與時通常不產生非所需反應者。於一些實例中，用於本文中所揭示之醫藥組合物中之「醫藥上可接受」之載劑可為由聯邦管理機構或州政府批准或列於美國藥典或用於哺乳動物及更特定言之人類中之其他公認藥典中之彼等。
醫藥上可接受之載劑(包括緩衝劑)係此項技術中熟知，且可包括磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；胺基酸；疏水性聚合物；單醣；二醣；及其他碳水化合物；金屬錯合物；及/或非離子表面活性劑。參見，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000) Lippincott Williams及Wilkins，編輯K. E. Hoover。
於一些實施例中，醫藥組合物或調配物係用於非經腸投與，諸如靜脈內、腦室內注射、小腦延髓池內注射、薄壁組織內注射或其組合。此等醫藥上可接受之載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之彼等，諸如花生油、大豆油、礦物油及類似者。亦可採用鹽水溶液及水性右旋糖、聚乙二醇(PEG)及甘油溶液作為液體載劑，特定言之用於注射用溶液。本文中所揭示之醫藥組合物可進一步包含另外成分，例如，防腐劑、緩衝劑、張力劑、抗氧化劑及穩定劑、非離子潤濕劑或澄清劑、增黏劑及類似者。本文中所述之醫藥組合物可以單個單位劑型或以多個劑型包裝。
適用於非經腸投與之調配物包括水性及非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及致使調配物與意欲接受者之血液等滲之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑及增稠劑。水性溶液可經適宜緩衝(較佳地至pH 3至9)。適宜非經腸調配物在無菌條件之製備藉由為熟習此項技術者熟知之標準醫藥技術容易實現。
待用於活體內投與之醫藥組合物應係無菌。此藉由(例如)通過無菌過濾膜過濾容易實現。無菌注射用溶液一般藉由將所需量之活性物質(例如，AAV載體(例如，ccAAV)、病毒衣殼及/或AAV病毒粒子)併入具有以上列舉之各種其他成分之適宜溶劑中，視需要，接著過濾滅菌來製備。一般而言，分散液藉由將已滅菌活性成分併入無菌媒劑中來製備，該媒劑含有基本分散介質及來自以上列舉之彼等之所需其他成分。於用於製備無菌注射用溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其產生活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液之任何另外所需成分之粉末。
本文中所揭示之醫藥組合物亦可包含其他成分，諸如稀釋劑及佐劑。可接受之載劑、稀釋劑及佐劑對接受者無毒及較佳地在所採用之劑量及濃度下惰性，及包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；及/或非離子表面活性劑，諸如吐溫(Tween)、普朗尼克(pluronic)或聚乙二醇。 IV.使用方法
本文中所述組合物(例如，AAV載體(例如，ccAAV)、病毒衣殼及/或AAV病毒粒子)中之任一者可用於減輕及/或治療疾病或病狀。因此，於一些態樣中，本發明提供藉由本文中所揭示之組合物以及包含其之醫藥組合物減輕一或多種症狀及/或治療需要此治療之個體之疾病或病狀之方法。於一些實施例中，本文中方法之個體可為人類個體。於一些實施例中，該個體可為先前尚未暴露於野生型AAV或重組(rAAV)載體之個體。於一些實施例中，該個體可為先前尚未投與rAAV載體之個體。於一些實施例中，該個體可為先前已投與rAAV載體(例如，本文中所述之rAAV載體)之個體。已暴露或投與AAV或rAAV之個體可使用此項技術中已知方法，例如，藉由病毒DNA之PCR檢測或藉由量測對AAV或rAAV (衣殼或轉殖基因)之抗體效價來識別。於一些實施例中，該個體可為尚未投與酶替代療法(例如，藉由投與酶蛋白)之個體。已經投與酶替代療法之個體可使用此項技術中已知方法，例如，藉由量測對酶之抗體效價來識別。然而，於一些實施例中，個體先前已利用酶替代療法治療。於一些實施例中，該個體為已經歷清除中和抗體(NAb)之一或多種方法(例如，血漿除去術、免疫抑制、酶促降解)之個體。於一些實施例中，適於本文中使用方法之個體可不必在投與本文中所述組合物(例如，AAV載體(例如，ccAAV)、病毒衣殼及/或AAV病毒粒子)中之任一者之前清除中和抗體(NAb)。
於一些實施例中，該個體患有或疑似患有可利用基因療法治療之疾病。可使用本文中所揭示之方法治療之說明性疾病或病狀可包括(但不限於)：囊性纖維化(囊性纖維化跨膜調節蛋白)及肺之其他疾病、A型血友病(因子VIII)、B型血友病(因子IX)、地中海貧血(β-球蛋白)、貧血(促紅血球生成素)及其他血液病症、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease) (GDF；腦啡肽酶)、多發性硬化(β-干擾素)、帕金森氏病(Parkinson's disease) (膠質細胞系源性神經營養因子[GDNF])、亨廷頓氏病(Huntington's disease) (移除重複之RNAi)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、癲癇(甘丙肽，神經營養因子)及其他神經學病症、癌症(內皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配位體、包括干擾素之細胞激素；RNAi (包含針對VEGF之RNAi)或耐多種藥物性基因產品mir-26a [例如，用於肝細胞癌])、糖尿病(胰島素)、包括杜氏營養不良症(Duchenne)之肌肉萎縮症(肌營養不良蛋白、小型肌營養不良蛋白、類胰島素生長因子I、肌聚糖[例如，a、β、γ]、針對肌肉生長抑素之RNAi、肌肉生長抑素前肽、卵泡抑素、啟動素II型可溶性受體、抗發炎性多肽(諸如Iκ B顯性突變體)、肌長蛋白(sarcospan)、抗萎縮蛋白相關蛋白(utrophin)、小型抗萎縮蛋白相關蛋白、針對誘導外顯子跳躍之肌營養不良蛋白基因中之剪接點之反義或RNAi (參見，例如，WO/2003/095647)、針對誘導外顯子跳躍之U7 snRNA之反義(參見，例如，WO/2006/021724)及針對肌肉生長抑素或肌肉生長抑素前肽之抗體或抗體片段)及貝克爾(Becker)、戈謝氏病(Gaucher disease) (葡糖腦苷酯酶)、赫爾勒氏病(Hurler's disease) (α-L-艾杜糖醛酸酶)、腺苷脫胺酶缺乏(腺苷脫胺酶)、糖原貯積病(例如，法布裡氏病(Fabry disease) [α-半乳糖酐酶]及龐貝氏病(Pompe disease) [溶酶體酸性α-葡糖苷酶])及其他代謝病症、先天性肺氣腫(al-抗胰蛋白酶)、勒-奈二氏(Lesch- Nyhan)症候群(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶)、尼曼-匹克氏病(Niemann-Pick disease) (鞘磷脂酶)、泰伊-薩克斯二氏病(Tay Sachs disease) (溶酶體己糖胺酶A)、楓糖尿病(Maple Syrup Urine Disease) (分支鏈酮酸脫氫酶)、視網膜變性疾病(及其他眼部及視網膜病；例如，用於黃斑變性之PDGF及/或血管生成抑制蛋白(vasohibin)或VEGF之其他抑制劑或治療或預防視網膜病症(例如，I型糖尿病)之其他血管生成抑制劑)、實體器官(諸如腦)之疾病(包括帕金森氏病[GDNF]、星形細胞瘤[內皮抑素、血管抑素及/或針對VEGF之RNAi]、膠質母細胞瘤[內皮抑素、血管抑素及/或針對VEGF之RNAi])、肝、腎、心臟之疾病(包括充血性心臟衰竭或外周動脈疾病(PAD)) (例如，藉由遞送蛋白質磷酸酶抑制劑I (I-l)及其片段(例如，IIC)、serca2a、調節受磷蛋白基因之鋅指蛋白、Barkct、P2-腎上腺素能受體、p2-腎上腺素能受體激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小清蛋白、腺苷酸環化酶6型、影響G-蛋白偶聯受體激酶2型敲下之分子，諸如截短之構成活性bARKct；calsarcin，針對受磷蛋白之RNAi；受磷蛋白抑制性或顯性負性分子，諸如受磷蛋白S16E等)、關節炎(類胰島素生長因子)、關節病(類胰島素生長因子1及/或2)、內膜增生(例如，藉由遞送enos、inos)、改善之心臟移植生存(超氧化物歧化酶)、AIDS (可溶性CD4)、肌肉萎縮(類胰島素生長因子I)、腎虛(促紅血球生成素)、關節炎(抗發炎性因子，諸如IRAP及TNFa可溶性受體)、肝炎(α-干擾素)、LDL受體缺乏(LDL受體)、高血胺症(鳥胺酸轉胺甲醯酶)、克利伯氏病(Krabbe's disease) (半乳糖腦苷酯酶)、巴騰氏病(Batten's disease)、脊髓腦性共濟失調(包括SCA1、SCA2及SCA3)、苯丙酮尿症(苯丙胺酸羥化酶)、自體免疫性疾病及類似者。
於一些實施例中，本文中所述之AAV載體、組合物及方法可用於治療腎病(kidney disease/kidney disorder)，諸如奧爾波特(Alport)症候群、良性家族性血尿、多囊性腎病(例如，1型或2型)、馮利波爾-林道氏病(VonLippel-Lindau disease)、腎性尿崩症、家族性低鈣血症、腎結石症、低磷酸鹽血症性佝僂病、法佈雷氏病(Fabray disease)、腎炎或類固醇抗性腎病症候群。
為進行本文中所揭示之方法，有效量之組合物(例如，AAV載體(例如，ccAAV)、病毒衣殼及/或AAV病毒粒子)或包含此之醫藥組合物可經由適宜途徑(例如，肌肉內、靜脈內、腦室內注射、小腦延髓池內注射、玻璃體內注射、視網膜下、結膜下、眼球後、前房內、脈絡膜上、冠脈內注射、動脈內注射及/或薄壁組織內注射)以如本文中所揭示之適宜量向需要治療之個體投與。
於某些實施例中，本發明亦提供將一或多種AAV載體(例如，ccAAV)引入細胞之方法，其包括使該細胞與本文中所揭示之組合物接觸。於一些實施例中，本文中方法可包括將本文中一或多種AAV載體(例如，ccAAV)遞送至細胞，包括使該細胞或層與病毒載體接觸，其中該病毒載體包含本文中所揭示之AAV衣殼蛋白變異體。於此方法之一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可將一或多個異源分子遞送至細胞。根據此等實施例，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可將一或多個治療性異源分子遞送至細胞。於一些實例中，使用本文中方法遞送至細胞之一或多個治療性異源分子可為治療性蛋白質、治療性DNA及/或治療性RNA。於一些實施例中，該治療性蛋白質可為單株抗體或融合蛋白。於一些實施例中，該治療性DNA及/或RNA可為反義寡核苷酸、siRNA、shRNA、mRNA、DNA寡核苷酸及類似者。
於某些實施例中，本發明亦提供將AAV載體(例如，ccAAV)引入CNS組織、心臟組織、腎組織、肝組織、骨骼肌組織或其任何組合之方法，其包括使細胞與本文中所揭示之病毒載體及/或組合物接觸。於一些實施例中，本文中AAV載體可藉由投與具有本文中所揭示之一或多種AAV衣殼蛋白變異體之AAV粒子遞送至特定組織，該等變異體具有對CNS組織、心臟組織、腎組織、肝組織、骨骼肌組織或其任何組合增強之向性。
於一些實施例中，向組織投與具有本文中一或多個核酸分子之至少一種AAV載體(例如，ccAAV)、病毒衣殼及/或AAV病毒粒子之方法實質上調節至少一種蛋白質及/或基因之表現，如與基線相比。如本文中所用，「基線」係指至少一種轉殖基因(及轉殖基因之編碼產物)在投與本文中AAV載體(例如，ccAAV)之前之表現。如本文中所用，「實質上調節表現」係指表現之至少1倍改變(例如，增加之表現、減少之表現)，如與基線相比。於一些實施例中，向組織投與具有本文中所揭示之一或多種AAV衣殼蛋白變異體之至少一種AAV粒子或AAV載體(例如，ccAAV)之方法如與基線相比至少約2倍至約50倍(例如，2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)調節至少一種蛋白質及/或基因之表現。於一些實施例中，當將至少一種AAV粒子或AAV載體(例如，ccAAV)遞送至CNS組織、腎組織、心臟組織、肝組織、骨骼肌組織或其任何組合時，向組織投與具有本文中所揭示之一或多種AAV衣殼蛋白變異體之至少一種AAV粒子或AAV載體之方法如與基線相比至少約2倍至約50倍(例如，2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)地調節至少一種蛋白質及/或基因之表現。
於本文中所揭示之方法中之任一者中，有效量之本文中所述組合物(例如，AAV載體、病毒衣殼、AAV粒子、AAV基因組、ccAAV)可向有需要個體提供以減輕與疾病或病狀相關聯之一或多種症狀。如本文中所用，「有效量」係指足以賦予對患有疾病或病狀之個體之治療效應之所揭示組合物的劑量。於一些實施例中，有效量可為減少個體之疾病或病狀之至少一種症狀的量。
於一些實施例中，投與如本文中所揭示之至少一種AAV載體(例如，ccAAV)之方法與天然分離之AAV載體相比可於細胞中具有增加之基因轉移效率。於一些實施例中，投與如本文中所揭示之至少一種AAV載體之方法與天然分離之AAV載體相比可於細胞中具有至少約2倍至約50倍(例如，2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)增加之基因轉移效率。於一些實施例中，投與如本文中所揭示之至少一種AAV載體之方法與天然分離之AAV載體相比可於組織中具有增加之基因轉移效率。於一些實施例中，投與如本文中所揭示之至少一種AAV載體之方法與天然分離之AAV載體相比可於組織中具有至少約2倍至約50倍(例如，2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)增加之基因轉移效率。於一些實施例中，投與如本文中所揭示之至少一種AAV載體之方法與天然分離之AAV載體相比可於個體中具有增加之基因轉移效率。於一些實施例中，投與如本文中所揭示之至少一種AAV載體之方法與天然分離之AAV載體相比可於個體中具有至少約2倍至約50倍(例如，2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)增加之基因轉移效率。
於一些實施例中，本文中方法可包括向個體投與至少一種AAV載體(例如，ccAAV)至少一次。於一些實施例中，本文中方法可包括向個體投與至少一種AAV粒子及/或至少一種AAV載體超過一次。於一些實施例中，本文中方法可包括向個體投與本文中至少一種AAV載體至少一次至至少10次(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次)。於一些實施例中，本文中方法可包括向個體投與本文中至少一種AAV載體至少2次、至少3次、至少4次或至少5次。於一些實施例中，本文中方法可包括每天一次、每隔一天一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次、每隔一個月一次、每三個月一次、每四個月一次、每年一次或每年兩次向個體投與本文中至少一種AAV載體。於一些實施例中，本文中方法可包括向個體投與本文中至少一種AAV載體視見到所需反應所需的多次。於一些實例中，所需反應可為於投與本文中AAV載體之劑量後與在投與AAV載體之前相比個體之疾病及/或病狀之至少一種症狀的衰減。熟習此項技術者應瞭解，給藥方案可根據疾病/病狀、疾病/病狀嚴重度、個體之特徵(例如，年齡、性別、體重)及類似者最佳化。
於一些實施例中，本文中AAV載體(例如，ccAAV)可用於遞送CRISPR-Cas系統。「CRISPR/Cas9」系統或「CRISPR/Cas9介導之基因編輯」係指已經修飾用於基因組編輯/工程改造之II型CRISPR/Cas系統。其通常包含「引導」 RNA (gRNA)及非特異性CRISPR相關核酸內切酶(Cas9)。本文中「引導RNA (gRNA)」與「短引導RNA (sgRNA)」或「單引導RNA (sgRNA)」可互換使用。sgRNA為由Cas9結合所需之「支架」序列及定義待修飾之基因組標靶之使用者定義之約20個核苷酸「間隔子」或「靶向」序列組成之短合成RNA。Cas9之基因組標靶可藉由改變存在於sgRNA中之靶向序列改變。
於一些實施例中，AAV載體包含載體基因組，其中該載體基因組編碼基因編輯分子。於一些實施例中，該基因編輯分子為核酸酶。於一些實施例中，該核酸酶為Cas9核酸酶。於一些實施例中，該核酸酶為Cas12a核酸酶。於一些實施例中，該基因編輯分子為sgRNA。 V.套組
本發明亦提供用於製備如本文中所述組合物(例如，AAV載體、AAV粒子、AAV基因組、病毒衣殼、ccAAV)中之任一者之套組及具有如本文中所述之一或多種治療用途之套組。用於如本文中所述用途之套組可包含一或多個容器，該等容器進一步包含以醫藥組合物調配之如本文中所述之組合物(例如，AAV載體、AAV粒子、AAV基因組、病毒衣殼、ccAAV)。
於一些實施例中，該套組可另外包含組合物(例如，AAV載體、AAV粒子、AAV基因組、病毒衣殼、ccAAV)於本文中所述方法中之任一者中之使用說明。包含之說明可包含向個體投與組合物或包含此之醫藥組合物以於個體中達成預期活性之描述。該套組可進一步包含基於識別個體是否需要治療來選擇適用於治療之個體之描述。與使用如本文中所述組合物相關之說明一般包含關於劑量、給藥方案及針對意欲治療之投與途徑之資訊。
容器可為單位劑量、散裝包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本發明套組中提供之說明通常為標籤或包裝插入物上之書寫說明。標籤或包裝插入物指示醫藥組合物係用於治療、延遲發作及/或減輕個體之疾病或病症。
本文中提供之套組係於適宜包裝中。適宜包裝包括(但不限於)小瓶、瓶、罐、撓性包裝及類似者。亦考慮與特定裝置，諸如吸入器、鼻投與裝置或輸注裝置組合使用之包裝。套組可具有無菌入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針穿透之塞子之小瓶)。容器亦可具有無菌入口。
套組視情況可提供另外組分，諸如緩衝液及解釋資訊。正常地，該套組包含容器及容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插入物。於一些實施例中，本發明提供製品，其包含上述套組之內容物。實例
雖然已參考本發明之特定實施例描述本發明，但是熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之真正精神及範圍下作出各種改變及可取代等效物。此外，可作出許多修改以使特定情況、材料、物質之組成、製程、一個或多個製程步驟適應於本發明之目標、精神及範圍。所有此等修改意欲於本發明之範圍內。 實例1.AAV 衣殼之跨物種演化
用於產生共同演化之AAV衣殼蛋白變異體之方法係如下。第一步涉及使用低溫電子顯微鏡識別AAV9衣殼表面上之構象3D抗原決定基。然後將AAV9庫通過於表面環內識別之胺基酸殘基之飽和誘變工程改造。具體而言，選擇可變區IV(452-NGSGQNQ-458；SEQ ID NO: 38)及可變區VIII (586-SAQAQAQ-592；SEQ ID NO: 39)內之胺基酸殘基用於飽和誘變及產生兩個不同AAV庫-可變區IV (VR4) AAV親本庫及可變區VIII (VR8)親本庫。抗原模體內之所選殘基經受使用簡併引子之誘變，其中各密碼子經核苷酸NNK取代及基因片段藉由Gibson組裝(基於序列重疊之方法)組合在一起。具體而言，為產生AAV VR4 (可變區IV)及VR8 (可變區VIII)庫，通過整合DNA技術合成含有21聚體(NNRNNRNNRNNRNNRNNRNNR；SEQ ID NO: 124)及AAV9 Cap基因之同源臂之寡核苷酸，其中「N」對應於任何核苷酸(A、T、G、C)及「R」對應於G或C以防止衣殼庫中之提前終止密碼子生成。
將所得含有突變抗原模體之變性庫之衣殼編輯基因選殖至野生型AAV基因組以置換原始Cap編碼DNA序列，產生質體庫。具體而言，質體含有編碼AAV2 Rep及AAV9 Cap側接AAV2 ITR之基因，其中AAV9 Cap中之胺基酸突變成終止密碼子以減少野生型AAV9質體污染。
然後將VR4及VR8親本質體庫轉染至具有腺病毒輔助質體之HEK 293生產細胞系以產生AAV VR4衣殼及AAV VR8衣殼親本庫。簡言之，將HEK293細胞在與聚乙烯亞胺70至80%匯合率下利用等莫耳比率之pTR-AAV9庫及腺病毒輔助質體pXX680轉染。將HuH7 (人類肝細胞癌)細胞培養至約75%匯合率及利用AAV9庫以5,000個病毒基因組/細胞感染過夜。第二天，在0.5之感染倍率(MOI)下，將培養基用含有Ad5之培養基替換。在50%至75%細胞病變效應下，收集上清液及在55℃下培育30分鐘以使Ad5失活。將培養基中之DNA酶I抗性病毒基因組定量及用作後續輪感染之接種物。
跨物種 活體 內 AAV 衣殼篩選 。 為選擇可逃避中和抗體(NAb)、靶向中樞神經系統(CNS)及/或以較天然產生之AAV9更強效方式作用之新穎AAV9株系，使如上所述製備之AAV庫經受多輪或「循環」感染於三個不同哺乳動物物種中。於第一循環中，將如上所述製備之AAV VR4衣殼親本庫或AAV VR8衣殼親本庫以約3 x 1013 至5 x 1013 vg/kg (病毒基因組/公斤)經靜脈內(i.v.)注射至4週齡小豬。於注射6天後將豬處死及將來自自各個腦區域(小腦、額葉、顳葉、頂葉、枕葉皮層、海馬體、丘腦及中腦)提取之基因組DNA之病毒DNA經由PCR擴增，使用靶向VR4或VR8側接DNA序列之寡核苷酸將AAV庫序列擴增。簡言之，為將來自此第一循環之演化之AAV庫擴增，將DNA酶I抗性病毒基因組自收穫之豬腦組織分離及使用針對可變區IV及VIII之引子5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGTACCTGTACTACTTGTCTCG-3′ (SEQ ID NO: 42)及5′-GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNAGACCATACCGGGTAAG-3′ (SEQ ID NO: 43)藉由Q5聚合酶擴增10至18個循環。
於使用Q5聚合酶與引子之第二輪PCR中添加用於多路複用之Illumina MiSeq定序適體。於各輪PCR後，將產物使用PureLink PCR Micro套組(Invitrogen)純化。使用Bioanalyzer (Agilent)驗證擴增子之品質，及使用Qubit分光儀(Invitrogen)定量濃度。然後將如由桑格(Sanger)定序所測定之含有VR4或VR8庫之PCR擴增子匯集在一起及用於產生下個庫製劑。
然後使用與產生親本質體庫相同之方法，不同之處在於代之以使用Gibson組裝，將擴增子使用多-重疊延伸PCR組裝將所得擴增子選殖回載體以產生演化之質體庫。然後使用上述相同方法將VR4及VR8親本質體庫轉染至具有腺病毒輔助質體之HEK 293生產細胞系以產生AAV VR4衣殼及AAV VR8衣殼演化庫。將培養基中之DNA酶I抗性病毒基因組定量及用作後續輪感染之接種物。
於於豬中演化後之第二循環中，將如上所述製備之AAV VR4衣殼親本庫或AAV VR8衣殼演化庫以約3 x 1013 至5 x 1013 vg/kg經靜脈內(i.v.)注射至8週C57/B6小鼠中。於注射6天後將小鼠處死及將來自自各個腦區域(小腦、額葉、顳葉、頂葉、枕葉皮層、海馬體、丘腦及中腦)提取之基因組DNA之病毒DNA經由PCR擴增，使用靶向VR4或VR8側接DNA序列之寡核苷酸將如上所述之AAV庫序列擴增。然後使用與產生以上第一演化之質體庫相同之方法將所得擴增子選殖回載體以產生另一演化之質體庫。此時將培養基中之病毒基因組定量及用作第三循環之接種物。
於豬及小鼠中演化後，將演化之VR4及VR8庫以約1 x 1013 至3 x 1013 vg/kg經靜脈內(i.v.)注射至2歲非人類靈長類動物(NHP)中。將來自自NHP之各個腦區域提取之基因組DNA之病毒DNA擴增，如上所述。使經擴增之病毒DNA經受使用lllumina MiSeq平臺之高通量定序及如下分析所得資料。
使多路讀數經受使用FastQC (v.0.11.5)之品質控制檢查，其中未標記品質不良的序列，及經由定製Perl程式碼使用類似於Tse等人，PNAS , 2017年6月13日;114(24):E4812-E4821 (其揭示內容之全文係以引用的方式併入本文中)中所述彼等之方法分析。簡言之，針對受關注之誘變區域探查原始定序文檔，及將此區域中之不同核苷酸序列之頻率計數及針對各庫排序。亦將核苷酸序列轉譯，及將此等胺基酸序列相似計數及排序。然後將跨庫之胺基酸序列頻率於R圖形包v3.5.2中繪圖。使用第二Perl程式碼計算各庫中之各位置處之胺基酸代表，考慮庫中之各突變體之貢獻。
使此等庫經受多輪三個物種(豬、小鼠及NHP (即，猴))之間之演化產生若干AAV9衣殼變異體。將具有最高頻率之自跨物種活體內篩選產生之AAV9衣殼變異體定序。氣泡圖顯示親本庫(圖 1A )與於三個不同物種之間之三個循環後演化庫(圖 1B )之間之VR8區域及VR4區域中之新穎抗原足跡的庫多樣性、定向演化及濃化。存在於區域IV (452-NGSGQNQ-458；SEQ ID NO: 38)或區域VIII (586-SAQAQAQ-592；SEQ ID NO: 39)中之此等AAV中之取代示於表 5 中。表 5 .
AAV9 突變體衣殼蛋白 胺基酸取代之區域 胺基酸取代序列
AAV.cc41 IV (452-458) EGGTVHA (SEQ ID NO: 20)
AAV.cc42 IV (452-458) FYGTDSA (SEQ ID NO: 21)
AAV.cc43 IV (452-458) HGQSASR (SEQ ID NO: 22)
AAV.cc44 IV (452-458) DTPTNQA (SEQ ID NO: 23)
AAV.cc45 IV (452-458) ITRQAYQ (SEQ ID NO: 24)
AAV.cc46 IV (452-458) RMFKSNQ (SEQ ID NO: 25)
AAV.cc47 IV (452-458) GVSLGGG (SEQ ID NO: 26)
AAV.cc48 IV (452-458) KHFLQGE (SEQ ID NO: 27)
AAV.cc49 IV (452-458) MGRERAG (SEQ ID NO: 28)
AAV.cc81 VIII (586-592) LNSSVPS (SEQ ID NO: 29)
AAV.cc82 VIII (586-592) YMDHQVS (SEQ ID NO: 30)
AAV.cc83 VIII (586-592) TSDSLVS (SEQ ID NO: 31)
AAV.cc84 VIII (586-592) NAVGALS (SEQ ID NO: 32)
AAV.cc85 VIII (586-592) MPISHHE (SEQ ID NO: 33)
AAV.cc86 VIII (586-592) DSGARGA (SEQ ID NO: 34)
AAV.cc87 VIII (586-592) NVALALG (SEQ ID NO: 35)
AAV.cc88 VIII (586-592) GALRMGM (SEQ ID NO: 36)
AAV.cc89 VIII (586-592) LSGEGAV (SEQ ID NO: 37)
實例 2. 小鼠中之重組 AAV 之活體內表徵
選擇四種重組衣殼蛋白AAV.cc47 (SEQ ID NO: 8)、AAV.cc44 (SEQ ID NO: 5)、AAV.cc81 (SEQ ID NO: 11)及AAV.cc84 (SEQ ID NO: 14)-此實例中統稱為「ccAAV載體」用於小鼠之活體內表徵。接下來，產生包含此等衣殼蛋白或天然AAV9及螢光轉殖基因之包裝之重組AAV。簡言之，重組衣殼蛋白作為包裝CBh-GFP (AAV.cc81及AAV.cc84)或CBh-mCherry (AAV.cc47及AAV.cc44)之載體產生。簡言之，重組AAV載體藉由使用三質體轉染方案，將HEK293細胞在與聚乙烯亞胺70至80%匯合率下轉染。使用此方法產生包裝單股基因組之重組載體，該等基因組編碼由雜交雞β-肌動蛋白啟動子(CBh-eGFP)驅動之綠色螢光蛋白、由雜交雞β-肌動蛋白啟動子(CBh-mCherry)驅動之cherry (紅色)螢光蛋白或由CBh-eGFP或CBh-mCherry驅動之自補型AAV9。進行涉及收穫重組AAV載體及下游純化之隨後步驟。簡言之，使用碘克沙醇(iodixanol)梯度超離心方案、緩衝液交換及使用vivaspin2 100 kDa分子量截斷(MWCO)離心管柱(F-2731-100 Bioexpress)濃縮進行載體純化。重組AAV載體效價藉由定量PCR與擴增AAV2末端反向重複區域(ITR) 5′-AACATGCTACGCAGAGAGGGAGTGG-3′ (SEQ ID NO: 44)及5′-CATGAGACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG-3′ (SEQ ID NO: 45)之引子測定。
將C57/BL6小鼠利用自補型AAV9或ccAAV載體中之一者以5 x 1013 vg/kg/小鼠之劑量靜脈內注射。於注射4週後將小鼠處死及藉由本體螢光或免疫組織化學(IHC)評價收穫之多個器官及轉導。圖 2A 至 2B 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後心臟之振動切片機切片中之AAV9 (圖 2A )及AAV.cc47 (圖 2B )之mCherry表現的代表圖像。圖 2C 提供經校正之總螢光之定量分析，其中經AAV.cc47感染之小鼠與經AVV9載體感染之小鼠相比具有心臟組織中之mCherry之更穩健表現。圖 2D 提供AAV9及AAV.cc47於小鼠之心臟組織中之載體生物分佈。圖 6A 至 6C 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後心臟之振動切片機切片中之AAV9 (圖 6A )、AAV.cc81 (圖 6B )及AAV.cc84 (圖 6C )之GFP表現的代表圖像。圖 6D 提供經校正之總螢光之定量分析，其中經AAV.cc84感染之小鼠與經AAV.cc81或AVV9載體感染之小鼠相比具有心臟組織中之GFP之更穩健表現。圖 26A 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後心臟之振動切片機切片中之AAV9及AAV.cc44之mCherry表現的代表圖像，及圖 26B 提供經校正之總螢光之定量分析。
圖 3A 至 3B 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後骨骼肌之振動切片機切片中之AAV9 (圖 3A )及AAV.cc47 (圖 3B )之mCherry表現的代表圖像。圖 3C 提供經校正之總螢光之定量分析，其中經AAV.cc47感染之小鼠與經AVV9載體感染之小鼠相比具有骨骼肌中之mCherry之更穩健表現。圖 7A 至 7B 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後骨骼肌之振動切片機切片中之AAV9 (圖 7A )及AAV.cc81 (圖 7B )之GFP表現的代表圖像。圖 7C 提供經校正之總螢光之定量分析，其中經AAV.cc81感染之小鼠與經AVV9載體感染之小鼠相比具有骨骼肌中之GFP之更穩健表現。圖 26C 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後骨骼肌之振動切片機切片中之AAV9及AAV.cc44之mCherry表現的代表圖像，及圖 26D 提供經校正之總螢光之定量分析。
圖 4A 至 4B 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後肝之振動切片機切片中之AAV9 (圖 4A )及AAV.cc47 (圖 4B )之mCherry表現的代表圖像。圖 4C 提供經AAV.cc47及AVV9載體感染之小鼠之肝中之經校正之總螢光的定量分析。圖 4D 提供AAV9及AAV.cc47於小鼠之肝組織中之載體生物分佈。圖 8A 至 8C 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後肝之振動切片機切片中之AAV9 (圖 8A )、AAV.cc81 (圖 8B )及AAV.cc84 (圖 8C )之GFP表現的代表圖像。圖 8D 提供經校正之總螢光之定量分析，其中經AAV.cc84、AAV.cc81及AVV9載體感染之小鼠不顯示肝中之GFP之穩健表現。圖 27A 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後肝之振動切片機切片中之AAV9及AAV.cc44之mCherry表現的代表圖像，及圖 27B 提供經校正之總螢光之定量分析。
圖 5A 至 5B 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後腎組織之振動切片機切片中之AAV9 (圖 5A )及AAV.cc47 (圖 5B )之mCherry表現的代表圖像。圖 5C 提供經校正之總螢光之定量分析，其中經AAV.cc47感染之小鼠與經AVV9載體感染之小鼠相比具有腎中之mCherry之更穩健表現。圖 9A 至 9B 提供顯示於利用4% PFA固定24小時後骨骼肌之振動切片機切片中之AAV9 (圖 9A )及AAV.cc81 (圖 9B )之GFP表現的代表圖像。圖 9C 提供經校正之總螢光之定量分析，其中經AAV.cc81感染之小鼠與經AVV9載體感染之小鼠相比具有骨骼肌中之GFP之更穩健表現。
於利用自補型AAV9或ccAAV載體中之一者以5 x 1013 vg/kg/小鼠之劑量靜脈內注射4週後自小鼠收穫腦片及使用免疫組織化學檢查腦之特定部分中之AAV載體表現以定向mCherry或GFP。如圖 10A 至 10E 中所示，所有載體顯示於腦組織中之定位，然而，ccAAV載體表現之穩健性藉由腦區域變化，取決於變異體類型而定。
總之，本文中此實例中之資料顯示針對CNS組織濃化之演化之衣殼變異體蛋白具有對腦之提高之向性，甚至於全身注射至小鼠中後。此外，演化之ccAAV載體顯示於其他非CNS組織(包括心臟、骨骼肌及在一定程度上肝)中之強的表現。出人意料發現為僅在VR4處具有胺基酸取代之演化之AVV.cc47載體顯示mCherry於腎中之高程度之轉導表現。迄今為止，不存在能於腎中具有高轉導效率之已知AAV載體，及在所測試之ccAAV載體中，僅AAV.cc47顯示此表現型(AAV.cc81及AAVcc.84 (均於VR8內具有胺基酸取代)於腎中轉導表現失敗)。 實例3.重組 AAV 於豬中之活體內表徵
用於本文中實例2中之包裝螢光報告基因之ccAAV載體亦用於實例3中。於此，將體重約7 kg之剛離乳之小豬利用自補型AAV9或ccAAV載體以3 x 1013 vg/kg之劑量藉由鞘內輸注在3週齡時注射。於注射4週後將小豬處死及收穫腦、脊髓、心臟及肝。藉由本體螢光或藉由如本文中所述進行之IHC評價轉導。
將豬腦切片切開及儲存於4% PFA中，之後使該組織經受IHC以評估AVV.cc47 (圖 11A 至 11G )及AVV.cc84 (圖 12A 至 12G )於額葉皮層、頂葉皮層、丘腦、枕葉皮層、腦幹、小腦及中腦中之轉導效率。亦收穫豬脊髓部分及經受IHC以評估AVV.cc47 (圖 13A )及AVV.cc84 (圖 13B )於該組織中之轉導效率。為了更仔細檢查，亦檢查豬脊髓之白質及灰質之AVV.cc47 (圖 13C 及 13E )及AVV.cc84 (圖 13D 及 13F )轉導效率，此時藉由在放大下各自觀察mCherry或GFP螢光。
在處死時亦收穫豬心臟及肝組織及經受IHC以評估AVV.cc47 (圖 14A 至 14C )及AVV.cc84 (圖 14D 至 14F )之轉導效率。 實例4.重組 AAV 於非人類靈長類動物 (NHP) 中之活體內表徵
用於本文中實例2及3中之包裝螢光報告基因之ccAAV載體亦用於實例4中。於此，將體重約3 kg之2歲恆河獼猴(NHP)利用自補型AAV9、AAV.cc47或AAV.cc84載體以3.5 x 1012 vg/kg之劑量在小腦延髓池內注射。於注射2週後將NHP解僱及收穫腦、肝、心臟及脊髓。針對肝( 圖 15A )及心臟( 圖 15C )中之AAV9及針對肝( 圖 15B) 及心臟( 圖 15D) 中之AAV.cc47進行mCherry之IHC分析。圖15E 顯示AAV9及AAV.cc47載體於肝及心臟中之載體生物分佈。
接下來，於NHP腦中評估針對AAV9及AAV.cc47之mCherry及針對AAV.cc84之GFP之IHC分析。與假處理之腦切片(圖 16A )相比，AAV9、AAV.cc47及AAV.cc84均顯示於腦組織中在一定程度上之轉導(圖 16B 至 16D )。資料表明：(1)跨物種衣殼具有獨特生物分佈譜且與AAV9不同；(2) AAV.cc47似乎於腦組織中傳播更深及轉導更多細胞；及(3) AAV.cc84亦於組織中傳播良好，但是轉導更少(更特異性)細胞。 實例5.AAVcc47 心臟轉導
為驗證AAVcc47心臟轉導，將人類iPSC心肌細胞用包裝由Cbh啟動子驅動之GFP之AAV9或AAV.cc47轉導(圖 17A )。接下來，將多個圖像中之GFP+細胞面積%定量(圖 17B )。將包裝CBh:GFP之AAV9或AAVcc47於人類心臟補片小鼠模型中i.v.注射(圖 17C )及進行心臟補片之螢光成像(圖 17D )。再次藉由i.v.向人類心臟補片小鼠模型中投與AAV9及AAV.cc47，此時在可誘導損傷之啟動子之控制下於心肌梗塞後遞送GFP。於自感染後小鼠收穫之心臟組織中進行肌鈣蛋白T (紅色)及GFP (綠色)之免疫螢光(圖 17E )。 實例6. 利用ccAAV載體之Cre重組
將Ai9雄性及雌性小鼠利用單股AAV9或ccAAV載體以1 x 1012 vg/kg (N=3)之劑量靜脈內注射。於注射4週後將動物處死及收穫多個器官及藉由本體螢光或IF評價轉導。圖 18A 至 18D 顯示於i.v.投與AAV9或ccAAV載體後於小鼠心臟中之本體tdTomato螢光之代表圖像及圖 18E 顯示AAV9、AAV.cc47及AAV.cc84載體於心臟組織中之生物分佈。圖 19A 至 19D 顯示於i.v.投與AAV9或ccAAV載體後於小鼠肝中之本體tdTomato螢光之代表圖像及圖 19E 顯示AAV9、AAV.cc47及AAV.cc84載體於肝組織中之生物分佈。圖 20A 至 20D 顯示於i.v.投與AAV9或ccAAV載體後於小鼠肺中之利用DAPI (細胞核標誌物)及SPC共同染色之本體tdTomato螢光的代表圖像及圖 20E 顯示AAV9、AAV.cc47及AAV.cc84載體於肺組織中之生物分佈。 實例7. 利用ccAAV載體之CRISPR/Cas9基因編輯
採用雙載體策略，其使用具有驅動之SaCas9之經截短之CB啟動子及驅動一個sgRNA之U6啟動子之一種載體及利用第二sgRNA具有相同設計之第二載體(圖 21A )。將雄性及雌性Ai9小鼠利用由與AAV9或ccAAV 50:50混合之sgRNA1及sgRNA2組成之雙單股載體以2 x 1012 vg/kg (N=6)之劑量靜脈內注射。於注射4週後將動物處死及收穫多個器官及藉由本體螢光或IF評價轉導。
於投與AAV9或AAV.cc47後於Ai9小鼠肝及心臟中評估本體tdTomato螢光(圖 21B )。藉由將tdTomato +細胞之總數目計數及除以DAPI+細胞之總數目來測定基因編輯效率(圖 21C )。在肝及心臟組織上進行PCR編輯檢定(圖 21D )。
使用與驅動SaCas9表現之CB啟動子相同之雙載體策略驗證圖 21A 至 21D 之結果且各載體具有靶向Rosa26基因座之一個引導。將此等載體以等量混合及以1 x 1014 vg/kg之劑量i.v.注射至Ai9小鼠中。將Ai9肝切片及成像用於本體TdTomato表現(圖 22A )。藉由將TdTomato+細胞之總數目計數及標準化至Dapi+細胞之總數目進行基因編輯效率之定量(圖 22B )。將Ai9心臟切片及成像用於本體TdTomato表現(圖 22C )。
作為將CRISPR/Cas9 CB定量之方式，自多個圖像量測螢光強度以將雄性及雌性Ai9小鼠之心臟及肝組織中之本體TdTomato表現定量。(圖 23A 至 23F )。此外，於圖 24A 及 24B 中量測相對PCR譜帶強度(模擬未經編輯相對於經編輯之實驗樣品)。及於圖 25A 及 25B 中，使用下列公式定量編輯效率：編輯效率(%) =紅血球數(計數之w/圖像j (肝)或用手(心臟)) /經DAPI染色之細胞核之數目。
熟習此項技術者容易瞭解，本發明經充分調適以實施目標及獲得所提及之終端及優點，以及其中固有彼等。本文中所述之本發明目前代表較佳實施例，係示例性，且不意欲作為對本發明範圍之限制。其中變化及其他用途對熟習此項技術者而言將出現，該等變化及用途包含於如由申請專利範圍之範圍所定義的本發明之精神內。
不承認任何參考文獻(包含本說明書中引用之任何非專利或專利文件)構成先前技術。特定言之，應瞭解，除非另有指定，否則本文中對任何文件之提及不構成承認此等文件中之任一者於美國或任何其他國家形成此項技術中公共常識之部分。參考文獻之任何討論聲明其作者主張，且申請者保留挑戰本文中引用之文件中之任一者之準確性及針對性的權利。除非另有明確指定，否則本文中引用之所有參考文獻係以引用的方式完全併入。
於所引用參考文獻中發現之任何定義及/或描述之間存在任何不一致之事件中，應以本發明為準。
下列圖示形成本說明書之一部分且包含在內以進一步證實本發明之某些態樣，藉由參考該等圖示結合本文中呈現之特定實施例之詳細描述可更佳理解本發明。
圖1A 及 1B 說明顯示根據本文中某些實施例之包含具有新穎肽取代之衣殼蛋白之AAV之庫多樣性、定向演化及濃化之分析的氣泡圖。親本(圖 1A )及來自三個循環之演化庫(圖 1B )經受使用lllumina MiSeq平臺之高通量定序。於利用定製Perl程式碼分析後，將濃化之胺基酸序列繪圖。各氣泡表示獨特衣殼蛋白胺基酸序列，其中氣泡半徑與各自庫中之該變異體之讀取次數成比例。y-軸表示來自定序運行之總讀數%。為了便於可視化，數據沿著x-軸分佈。獨特純系之減少% (96.5%)直接證實許多「不適配」序列於第一輪及/或第二輪演化後移除。選擇顯性分離株用於進一步分析。如圖 1B 中所示，下一代定序揭示於三個不同物種中三個演化循環之後，AAVcc47之衣殼蛋白為AAV VR4庫中之最濃化胺基酸序列(即，純系)。
圖2A 至 2D 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠心臟中之mCherry報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 2A )或AAV.cc47 (圖 2B )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後心臟振動切片機切片中之mCherry表現。圖 2C 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。圖 2D 顯示描繪經感染小鼠之心臟中之載體生物分佈的圖。
圖3A 至 3C 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠骨骼肌中之mCherry報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 3A )或AAV.cc47 (圖 3B )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後骨骼肌振動切片機切片中之mCherry表現。圖 3C 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖 4A 至 4D 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠肝中之mCherry報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 4A )或AAV.cc47 (圖 4B )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後肝振動切片機切片中之mCherry表現。圖 4C 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。圖 4D 顯示描述經感染小鼠之肝中之載體生物分佈的圖。
圖5A 至 5C 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠腎中之mCherry報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 5A )或AAV.cc47 (圖 5B )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後腎振動切片機切片中之mCherry表現。圖 5C 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖 6A 至 6D 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠心臟中之GFP報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 6A )或AAV.cc81 (圖 6B )或AAV.cc84 (圖 6C )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後心臟振動切片機切片中之GFP表現。圖 6D 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖7A 至 7C 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠骨骼肌中之GFP報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 7A )或AAV.cc81 (圖 7B )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後骨骼肌振動切片機切片中之GFP表現。圖 7C 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖 8A 至 8D 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠肝中之GFP報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 8A )、AAV.cc81 (圖 8B )或AAV.cc84 (圖 8C )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後肝振動切片機切片中之GFP表現。圖 8D 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖9A 至 9C 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠腎中之GFP報告基因表現。代表性螢光顯微鏡圖像顯示於經AAV9 (圖 9A )或AAV.cc81 (圖 9B )感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後腎振動切片機切片中之GFP表現。圖 9C 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖 10A 至 10E 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠腦區域中之螢光報告基因表現，如由免疫組織化學(IHC)所評估。圖 10A 描述來自模擬感染之小鼠之腦區域，然而圖 10B 描述來自經AAV9載體感染之小鼠之腦區域，圖 10C 描述來自經AAV.cc47感染之小鼠之腦區域，圖 10D 描述來自經AAV.cc81感染之小鼠之腦區域，及圖 10E 描述來自經AAV.cc84感染之小鼠之腦區域。顯示之腦區域包含：Ctx =大腦皮層；Hc =海馬體；Cb =小腦；Th =丘腦；Str =紋狀體；及mb =蕈形體。
圖 11A 至 11G 說明根據本文中某些實施例之豬腦區域中之藉由免疫組織化學(IHC)評估之AVV.cc47轉導。圖 11A 描述豬額葉皮層中之mCherry之IHC染色。圖 11B 描述豬頂葉皮層中之mCherry之IHC染色。圖 11C 描述豬頂葉丘腦中之mCherry之IHC染色。圖 11D 描述豬枕葉皮層中之mCherry之IHC染色。圖 11E 描述豬腦幹中之mCherry之IHC染色。圖 11F 描述豬小腦中之mCherry之IHC染色。圖 11G 描述豬中腦中之mCherry之IHC染色。
圖 12A 至 12G 說明根據本文中某些實施例之豬腦區域中之藉由免疫組織化學(IHC)評估之AVV.cc84轉導。圖 12A 描述豬額葉皮層中之GFP之IHC染色。圖 12B 描述豬頂葉皮層中之GFP之IHC染色。圖 12C 描述豬頂葉丘腦中之GFP之IHC染色。圖 12D 描述豬枕葉皮層中之GFP之IHC染色。圖 12E 描述豬腦幹中之GFP之IHC染色。圖 12F 描述豬小腦中之GFP之IHC染色。圖 12G 描述豬中腦中之GFP之IHC染色。
圖 13A 至 13F 說明根據本文中某些實施例之豬脊髓中之AAV.cc47及AVV.cc84轉導。使豬脊髓之切片經受針對組織中之AVV.cc47 (圖 13A )及AVV.cc84 (圖 13B )之IHC染色。於白質(圖 13C )及灰質(圖 13E )中量測mCherry螢光以評估AVV.cc47。於白質(圖 13D )及灰質(圖 13F )中量測GFP螢光以評估AVV.cc84之存在。
圖 14A 至 14F 說明根據本文中某些實施例之豬心臟及肝中之AAV.cc47及AVV.cc84轉導。AVV.cc47轉導藉由豬左心室(圖 14A )、豬右心室(圖 14B )及肝(圖 14C )中之針對mCherry之IHC染色來評估。AVV.cc84轉導藉由豬左心室(圖 14D )、豬右心室(圖 14E )及肝(圖 14F )中之針對GFP之IHC染色來評估。
圖 15A 至 15E 說明根據本文中某些實施例之非人類靈長類動物心臟及肝中之AAV9及AAV.cc47轉導。AVV9轉導藉由非人類靈長類動物肝(圖 15A )及心臟(圖 15C )中之針對mCherry之IHC染色來評估。AVV.cc47轉導藉由非人類靈長類動物肝(圖 15B )及心臟(圖 15D )中之針對mCherry之IHC染色來評估。圖 15E 顯示非人類靈長類動物中之重組AAV之生物分佈。
圖 16A 至 16D 說明根據本文中某些實施例之非人類靈長類動物腦中之AAV9、AAV.cc47及AAV.cc84轉導。AVV9轉導藉由針對mCherry之IHC染色來評估(圖 16B )，AAV.cc47轉導藉由針對mCherry之IHC染色來評估(圖 16C )，及AAV.cc84轉導藉由非人類靈長類動物腦中之針對GFP之IHC染色來評估(圖 16D )。圖 16A 顯示來自模擬注射之對照非人類靈長類動物之腦切片。
圖 17A 至 17E 說明根據本文中某些實施例之AAVcc47心臟轉導之驗證。圖 17A 顯示經AAV9或cc47轉導之人類iPSC心肌細胞，其包裝藉由Cbh啟動子驅動之GFP。圖 17B 顯示(圖17A)之多個圖像中之GFP+面積%的定量。圖 17C 顯示於人類心臟補片小鼠模型中IV注射之包裝CBh:GFP之AAV9或AAVcc47。圖 17D 顯示心臟補片之螢光圖像。圖 17E 顯示於心肌梗塞後在可誘導損傷之啟動子之控制下，靜脈內投與之遞送GFP之AAV9及AAVcc47。免疫螢光針對肌鈣蛋白T (紅色)及GFP (綠色)。
圖 18A 至 18E 說明根據本文中某些實施例之於靜脈內投與模擬治療(圖 18A )、AAV9 (圖 18B )、AVV.cc47 (圖 18C )及AVV.cc84 (圖 18D )後小鼠心臟中之天然tdTomato螢光的代表性圖像。圖 18E 顯示重組AAV於小鼠心臟中之生物分佈。
圖 19A 至 19E 說明根據本文中某些實施例之於靜脈內投與模擬治療(圖 19A )、AAV9 (圖 19B )、AVV.cc47 (圖 19C )及AVV.cc84 (圖 19D )後小鼠肝中之天然tdTomato螢光的代表性圖像。圖 19E 顯示重組AAV於小鼠肝中之生物分佈。
圖 20A 至 20E 說明根據本文中某些實施例之於靜脈內投與模擬治療(圖 20A )、AAV9 (圖 20B )、AVV.cc47 (圖 20C )及AVV.cc84 (圖 20D )後小鼠肺中之天然tdTomato螢光的代表性圖像。圖 20E 顯示重組AAV於小鼠肺中之生物分佈。
圖 21A 至 21D 說明根據本文中某些實施例之利用ccAAV載體編輯之CRISPR/Cas9基因。圖 21A 顯示本文中所採用之雙重載體策略，其使用具有驅動SaCas9之截短CB啟動子及驅動一個sgRNA之U6啟動子之一個載體及與第二sgRNA相同設計之第二載體。圖 21B 顯示於以2e12 vg/kg之劑量投與AAV9或cc47後Ai9小鼠肝及心臟中之天然tdTomato螢光。圖 21C 顯示藉由將tdTomato+細胞之總數目計數及除以DAPI+細胞之總數目測定之基因編輯效率。圖 21D 顯示PCR編輯檢定，其中指出未經編輯之譜帶(** 1160bp)及經編輯之譜帶(*270bp)。p**＜0.01。
圖 22A 至 22C 說明根據本文中某些實施例之利用ccAAV載體編輯之CRISPR/Cas9基因的驗證。圖 22A 顯示用於天然TdTomato表現之經切片及成像之Ai9肝。圖 22B 顯示描繪藉由將TdTomato+細胞之總數目計數及標準化至Dapi+細胞之總數目定量基因編輯效率的圖。圖 22C 顯示用於天然TdTomato表現之經切片及成像之Ai9心臟。將兩種組織低溫切成14 µm厚的切片。
圖 23A 至 23F 說明根據本文中某些實施例之藉由量測螢光強度之定量CRISPR/Cas9。自多個圖像量測螢光強度以定量注射AAV9載體或AAV.cc47載體之Ai9小鼠中之天然TdTomato表現。圖 23A 顯示所有注射Ai9小鼠之肝中之經校正之總細胞螢光的圖。圖 23B 顯示所有注射雌性Ai9小鼠之肝中之經校正之總細胞螢光的圖。圖 23C 顯示所有注射Ai9小鼠之心臟中之經校正之總細胞螢光的圖。圖 23D 顯示所有注射雌性Ai9小鼠之心臟中之經校正之總細胞螢光的圖。圖 23E 顯示所有注射雄性Ai9小鼠之肝中之經校正之總細胞螢光的圖。圖 23F 顯示所有注射雄性Ai9小鼠之心臟中之經校正之總細胞螢光的圖。P-值*＜ 0.05；ns=不顯著
圖 24A 及 24B 說明根據本文中某些實施例之藉由量測相對PCR譜帶強度之定量CRISPR/Cas9。 圖 24A 顯示自注射AAV9載體或AAV.cc47載體之Ai9小鼠之肝組織之PCR編輯檢定產生之PCR譜帶之PCR譜帶強度(相對於模擬，未經編輯之譜帶)的圖。圖 24B 顯示自注射AAV9載體或AAV.cc47載體之Ai9小鼠之心臟組織之PCR編輯檢定產生之PCR譜帶之PCR譜帶強度(相對於模擬，未經編輯之譜帶)的圖。
圖 25A 及 25B 說明根據本文中某些實施例定量肝及心臟中之CRISPR/Cas9基因編輯效率。圖 25A 顯示來自注射AAV9載體或AAV.cc47載體之Ai9小鼠之肝組織之基因編輯效率%的圖。圖 25B 顯示來自注射AAV9載體或AAV.cc47載體之Ai9小鼠之心臟組織之基因編輯效率%的圖。
圖 26A 及 26B 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠心臟中之mCherry報告基因表現。圖 26A 顯示顯示於經AAV9或AAV.cc44感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後心臟振動切片機切片中之mCherry表現的代表性螢光顯微鏡圖像。圖 26B 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖 26C 及 26D 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠骨骼肌中之mCherry報告基因表現。圖 26C 顯示顯示於經AAV9或AAV.cc44感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後骨骼肌振動切片機切片中之mCherry表現的代表性螢光顯微鏡圖像。圖 26D 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖 27A 及 27B 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠肝中之mCherry報告基因表現。圖 27A 顯示顯示於經AAV9或AAV.cc44感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後肝振動切片機切片中之mCherry表現的代表性螢光顯微鏡圖像。圖 27B 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
圖 27C 及 27D 說明根據本文中某些實施例之C57/B6小鼠腎中之mCherry報告基因表現。圖 27C 顯示顯示於經AAV9或AAV.cc44感染之小鼠中於利用4% PFA固定24小時後腎振動切片機切片中之mCherry表現的代表性螢光顯微鏡圖像。圖 27D 顯示描述一系列多個圖像之經校正之總細胞螢光的圖。
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Claims (49)

  1. 一種包含AAV衣殼蛋白變異體之重組AAV載體，其中該衣殼蛋白變異體包含具有SEQ ID NO: 2-19中之任一者之序列之肽。
  2. 一種包含AAV衣殼蛋白變異體之重組AAV載體，其中該AAV衣殼變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 20-28中之任一者之序列之肽取代。
  3. 一種包含AAV衣殼蛋白變異體之重組AAV載體，其中該AAV衣殼變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 29-37中之任一者之序列之肽取代。
  4. 一種包含AAV衣殼蛋白變異體之重組AAV載體，其中該AAV衣殼變異體具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性， a.其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 20-28中之任一者之序列之肽取代；且 b.其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 29-37中之任一者之序列之肽取代。
  5. 一種包含AAV衣殼蛋白變異體之重組AAV載體，其中該AAV衣殼變異體具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或與之具有至少90%或至少95%同一性之序列。
  6. 一種包含AAV衣殼蛋白變異體之重組AAV載體，其中該AAV衣殼變異體具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或相對於其具有1至10、11至20、20至30或30至50個胺基酸取代之序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之重組AAV載體，其中該AAV載體包含載體基因組。
  8. 如請求項7之重組AAV載體，其中該載體基因組藉由包含該AAV衣殼蛋白變異體之AAV衣殼包裹。
  9. 如請求項7或8之重組AAV載體，其中該載體基因組包含第一末端反向重複(ITR)及第二ITR。
  10. 如請求項9之重組AAV載體，其中該載體基因組包含位於該第一ITR與該第二ITR之間之轉殖基因。
  11. 如請求項10之重組AAV載體，其中該轉殖基因編碼治療性RNA。
  12. 如請求項10之重組AAV載體，其中該轉殖基因編碼治療性蛋白質。
  13. 如請求項10之重組AAV載體，其中該轉殖基因編碼基因編輯分子。
  14. 如請求項13之重組AAV載體，其中該基因編輯分子為核酸酶。
  15. 如請求項14之重組AAV載體，其中該核酸酶為Cas9核酸酶。
  16. 如請求項14之重組AAV載體，其中該核酸酶為Cas12a核酸酶。
  17. 如請求項13之重組AAV載體，其中該基因編輯分子為單引導RNA (sgRNA)。
  18. 一種AAV衣殼蛋白變異體，其包含具有SEQ ID NO: 2-19中任一者之序列之肽。
  19. 一種AAV衣殼蛋白變異體，其具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 20-28中任一者之序列之肽取代。
  20. 一種AAV衣殼蛋白變異體，其具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性，其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 29-37中任一者之序列之肽取代。
  21. 一種AAV衣殼蛋白變異體，其具有與SEQ ID NO: 1之序列之至少90%同一性， a.其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 20-28中任一者之序列之肽取代；且 b.其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸586-592之該等胺基酸經具有SEQ ID NO: 29-37中任一者之序列之肽取代。
  22. 一種AAV衣殼蛋白變異體，其具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或與之具有至少90%或至少95%同一性之序列。
  23. 一種AAV衣殼蛋白變異體，其具有SEQ ID NO: 2-19、46-123中任一者之序列或相對於其具有1至10、11至20、20至30或30至50個胺基酸取代之序列。
  24. 一種AAV衣殼，其包含如請求項18至23中任一項之AAV衣殼蛋白變異體。
  25. 如請求項24之AAV衣殼，其中該AAV衣殼包含該AAV衣殼蛋白變異體或其片段之約60個複本。
  26. 如請求項25之AAV衣殼，其中該AAV衣殼蛋白變異體以T=1二十面體對稱性排列。
  27. 一種重組AAV載體，其包含如請求項18至23中任一項之AAV衣殼變異體或如請求項24至26中任一項之AAV衣殼。
  28. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至17及27中任一項之重組AAV載體，及至少一種醫藥上可接受之載劑。
  29. 一種將重組AAV載體引入標靶細胞之方法，該方法包括使標靶細胞與如請求項1至17及27中任一項之重組AAV載體或如請求項28之醫藥組合物接觸。
  30. 一種將轉殖基因遞送至個體之標靶細胞之方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至17及27中任一項之重組AAV載體或如請求項28之醫藥組合物。
  31. 如請求項29及30中任一項之方法，其中該標靶細胞為腎細胞。
  32. 一種演化出新穎之腺相關病毒株之方法，其包括將AAV庫跨多種哺乳動物物種繼代。
  33. 如請求項32之方法，其中該等AAV庫包含複數個重組AAV載體，其中各重組AAV載體包含衣殼蛋白變異體，該衣殼蛋白變異體包含相對於野生型AAV衣殼蛋白之一或多個胺基酸突變。
  34. 如請求項33之方法，其中該等AAV庫中之各重組AAV載體包含相對於野生型AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 1)之一或多個胺基酸突變。
  35. 如請求項34之方法，其中該一或多個胺基酸突變係於對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458或SEQ ID NO: 1之586-592之區中，或該等突變於對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸452-458及586-592之兩個區中發現。
  36. 如請求項31至35中任一項之方法，其中該方法包括向第一哺乳動物物種投與第一AAV庫。
  37. 如請求項36之方法，其中將來自存在於該第一哺乳動物物種之一或多個標靶組織中之該第一AAV庫之AAV定序，及用於產生第二AAV庫。
  38. 如請求項37之方法，其中向第二哺乳動物物種投與該第二AAV庫，其中該第一哺乳動物物種與該第二哺乳動物物種係不同。
  39. 如請求項38之方法，其中將來自存在於該第二哺乳動物物種之一或多個標靶組織中之該第二AAV庫之該等AAV定序。
  40. 如請求項36至39中任一項之方法，其中該第一哺乳動物物種及該第二哺乳動物物種各獨立地選自由以下組成之群：小家鼠(Mus Musculus ) (小鼠)、野豬(Sus scrofa ) (豬)、家犬(Canis Familiaris ) (犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬(Macaca )，獼猴)及智人(Homo sapiens ) (人類)。
  41. 如請求項40之方法，其中該第一哺乳動物物種之該一或多個標靶組織係選自脊髓、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織及其任何組合。
  42. 如請求項40之方法，其中該第二哺乳動物物種之該一或多個標靶組織係選自脊髓、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝組織及其任何組合。
  43. 一種重組腺相關病毒(AAV)，其包含使用如請求項31至42中任一項之方法演化之衣殼蛋白變異體。
  44. 如請求項43之重組AAV，其中該AAV具有相對於具有原本相同但是其缺少該一或多個胺基酸取代之衣殼蛋白之重組AAV於一或多個哺乳動物物種中提高之基因轉移效率。
  45. 如請求項44之重組AAV，其中該提高之基因轉移效率於以下之一或多者中發生：小家鼠(小鼠)、野豬(豬)、家犬(犬)、非人類靈長類動物(獼猴屬，獼猴)或智人(人類)。
  46. 如請求項43至45之重組AAV ，其中該提高之基因轉移效率於下列細胞類型或組織之一或多者中發生：脊髓、背根神經節、腦、心臟、肺、腎、骨骼肌、脾、胰、小腸、大腸或肝。
  47. 如請求項46之重組AAV，其中該提高之基因轉移效率於腎細胞或腎組織中發生。
  48. 一種治療有需要個體之方法，其包括：向該個體投與治療上有效量之如請求項1至17、27及43至47中任一項之重組AAV載體或如請求項28之醫藥組合物。
  49. 如請求項48之方法，其中該個體患有腎病(kidney disease/kidney disorder)。
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