TW202342759A - 重組腺相關病毒載體及其使用方法 - Google Patents

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TW202342759A
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露絲 卡斯特拉諾斯
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美商史崔德生物公司
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Abstract

本發明描述包含胺基酸序列中之修飾的AAV殼體蛋白及包含該經修飾之AAV殼體蛋白的病毒載體。亦描述向細胞或向個體活體內投與該等病毒載體及該等病毒殼體之方法。

Description

重組腺相關病毒載體及其使用方法
本申請案係關於包含重組殼體蛋白之腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，重組AAV載體避開中和抗體而不降低轉導效率。
在天然遭遇AAV或重組AAV載體後產生之宿主來源的預先存在抗體首先預防以及重複投與AAV載體作為疫苗及/或用於基因療法。血清學研究揭示抗體在全世界人群中之高發生率，其中約67%之人具有針對AAV1之抗體，72%具有針對AAV2之抗體，及約40%具有針對AAV5至AAV9之抗體。
在基因療法中，涉及基因靜默或組織變性之某些臨床情形可能需要多次AAV載體投與以維持長期表現轉殖基因。因此，此項技術中需要避開抗體識別之重組AAV載體。此類載體將幫助a)擴大適合於基於AAV之基因療法之符合條件的個體組及b)允許多次重複投與基於AAV之基因療法載體。
本文提供重組AAV載體，其避開抗體識別及/或選擇性地靶向CNS之組織。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含具有SEQ ID NO: 12-20中之任一者之序列的肽。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸451-458處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於原生AAV9殼體蛋白序列中。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸587-594處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於原生AAV9殼體蛋白序列中。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含與SEQ ID NO: 165-187中之任一者至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。
本文亦提供編碼重組殼體蛋白之核酸序列及包含其之表現載體。
亦提供細胞，其包含本文所描述之核酸、表現載體、AAV載體或AAV殼體。
亦提供醫藥組合物，其包含本文所描述之核酸、表現載體、AAV載體、AAV殼體或細胞。
亦提供用於治療有需要之個體之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之AAV載體。
亦提供將核酸分子引入至細胞中之活體外方法，該方法包含使細胞與本文所描述之AAV載體接觸。
亦提供一種本文所描述之AAV載體，其用作藥劑。
亦提供一種本文所描述之AAV載體，其用於治療有需要之個體之方法中。
亦提供一種本文所描述之AAV載體，其用於治療或預防有需要之個體之CNS疾病或病症之方法中。
下文更詳細地描述此等及其他實施例。
相關申請案之交互參考
本申請案主張以下各者之優先權：2022年2月4日申請之美國臨時申請案第63/306,890號、2022年3月8日申請之美國臨時申請案第63/317,948號、及2022年5月6日申請之美國臨時申請案第63/339,366號，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 電子序列表之參考
電子序列表(STRD_027_03WO_SeqList_ST26.xml；大小：855,408位元組；及創建日期：2023年1月27日)之內容以全文引用之方式併入本文中。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬領域者通常所理解相同的含義。本文實施方式中所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且並不意欲為限制性的。
本文中所提及之所有公開案、專利申請案、專利、GenBank或其他寄存編號及其他參考文獻均出於所有目的以全文引用之方式併入。
解釋內容及隨附申請專利範圍中之AAV殼體蛋白中之胺基酸位置之指示係關於VP1殼體次單位編號而言。熟習此項技術者應理解，當將本文所描述之修飾插入至AAV cap基因中時，可得到VP1、VP2及/或VP3殼體次單位中之修飾。或者，可獨立地表現殼體次單位以達成僅在殼體次單位(VP1、VP2、VP3、VP1 + VP2、VP1 + VP3或VP2 +VP3)中之一個或兩個中之修飾。 定義
以下術語用於本文之描述及隨附申請專利範圍中。
除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」亦意欲包括複數形式。
此外，當提及可量測值，諸如聚核苷酸或多肽序列之長度量、劑量、時間、溫度及其類似者時，如本文所用之術語「約」意謂涵蓋規定量之± 20%、± 10%、± 5%、± 1%、± 0.5%或甚至± 0.1%之變化。
亦如本文所用，「及/或」係指且涵蓋相關之所列項目中之一或多者的任何及所有可能組合，以及在替代方案(「或」)中解釋時組合之缺乏。
除非上下文另外指示，否則尤其意欲本文所描述之各種特徵可以任何組合使用。此外，在一些實施例中，可排除或省略本文所闡述之任何特徵或特徵之組合。為了進一步說明，例如在說明書指示特定胺基酸可選自A、G、I、L及/或V時，此措辭亦指示胺基酸可選自此等胺基酸之任何子集，例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；僅L等，如同每一個此類子組合明確地在本文中所闡述一般。此外，此類措辭亦指示可放棄規定胺基酸中之一或多者。舉例而言，在一些實施例中，胺基酸不為A、G或I；不為A；不為G或V等，如同每一個此類可能放棄明確地在本文中所闡述一般。
如本文所用，術語「降低(reduce/reduces/reduction)」及類似術語意謂降低至少約10%、約15%、約20%、約25%、約35%、約50%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或更多。
如本文所用，術語「增加(increase)」、「提高(improve)」、「增強(enhance/enhances/enhancement)」及類似術語指示增加至少約10%、約15%、約20%、約25%、約50%、約75%、約100%、約150%、約200%、約300%、約400%、約500%或更多。
如本文所用，術語「小病毒(parvovirus)」涵蓋小病毒科，包括自主複製性小病毒及依賴病毒。自主小病毒包括原始小病毒( Protoparvovirus)屬、赤小病毒( Erythroparvovirus)屬、博卡小病毒( Bocaparvovirus)屬及濃核病毒( Densovirus)屬亞科之成員。例示性自主小病毒包括(但不限於)小鼠細小病毒、牛小病毒、犬小病毒、雞小病毒、貓泛白血球減少症病毒、貓小病毒、鵝小病毒、H1小病毒、番鴨小病毒、B19病毒及目前已知或後續發現之任何其他自主小病毒。其他自主小病毒為熟習此項技術者已知的。參見例如BERNARD N. FIELDS等人, VIROLOGY, 第2卷, 第69章(第4版, Lippincott-Raven Publishers; Cotmore等人Archives of Virology DOI 10.1007/s00705-013-1914-I)。
如本文所用，術語「腺相關病毒」(AAV)包括(但不限於) AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A及3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV rh32.33型、AAV rh8型、AAV rh10型、AAV rh74型、AAV hu.68型、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、蛇AAV、髭頰蜥AAV、AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B及目前已知或後續發現之任何其他AAV。參見例如BERNARD N.FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。已鑑別多種AAV血清型及分枝系(參見例如Gao等人, (2004) J. Virology 78:6381-6388；Moris等人, (2004) Virology 33-:375-383；及表2)。AAV1-9、AAVrh.10及AAV11之例示性AAV殼體序列提供於SEQ ID NO: 1-11中。
如本文所用，術語「嵌合AAV」係指包含具有來源於兩種或更多種不同AAV血清型之區、域、個別胺基酸之殼體蛋白的AAV。在一些實施例中，嵌合AAV包含含來源於第一AAV血清型之第一區及來源於第二AAV血清型之第二區的殼體蛋白。在一些實施例中，嵌合AAV包含含來源於第一AAV血清型之第一區、來源於第二AAV血清型之第二區及來源於第三AAV血清型之第三區的殼體蛋白。在一些實施例中，嵌合AAV可包含來源於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及/或AAV12之區、域、個別胺基酸。舉例而言，嵌合AAV可包括來自如下文(表1)所示之第一及第二AAV血清型之區、域及/或個別胺基酸，其中AAVX+Y指示包括來源於AAVX及AAVY之序列的嵌合AAV： 表1：嵌合AAV
   第二 AAV 血清型
第一AAV 血清型    AAV1 AAV2 AAV3 AAV4 AAV5 AAV6 AAV7 AAV8 AAV9 AAV10 AAV11 AAV12
AAV1 X AAV1+2 AAV1+3 AAV1+4 AAV1+5 AAV1+6 AAV1+7 AAV1+8 AAV1+9 AAV1+10 AAV1+11 AAV1+12
AAV2 AAV2+1 X AAV2+3 AAV2+4 AAV2+5 AAV2+6 AAV2+7 AAV2+8 AAV2+9 AAV2+10 AAV2+11 AAV2+12
AAV3 AAV3+1 AAV3+2 X AAV3+4 AAV3+5 AAV3+6 AAV3+7 AAV3+8 AAV3+9 AAV3+10 AAV3+11 AAV3+12
AAV4 AAV4+1 AAV4+2 AAV4+3 X AAV4+5 AAV4+6 AAV4+7 AAV4+8 AAV4+9 AAV4+10 AAV4+11 AAV4+12
AAV5 AAV5+1 AAV5+2 AAV5+3 AAV5+4 X AAV5+6 AAV5+7 AAV5+8 AAV5+9 AAV5+10 AAV5+11 AAV5+12
AAV6 AAV6+1 AAV6+2 AAV6+3 AAV6+4 AAV6+5 X AAV6+7 AAV6+8 AAV6+9 AAV6+10 AAV6+11 AAV6+12
AAV7 AAV7+1 AAV7+2 AAV7+3 AAV7+4 AAV7+5 AAV7+6 X AAV7+8 AAV7+9 AAV7+10 AAV7+11 AAV7+12
AAV8 AAV8+1 AAV8+2 AAV8+3 AAV8+4 AAV8+5 AAV8+6 AAV8+7 X AAV8+9 AAV8+10 AAV8+11 AAV8+12
AAV9 AAV9+1 AAV9+2 AAV9+3 AAV9+4 AAV9+5 AAV9+6 AAV9+7 AAV9+8 X AAV9+10 AAV9+11 AAV9+12
AAV10 AAV10+1 AAV10+2 AAV10+3 AAV10+4 AAV10+5 AAV10+6 AAV10+7 AAV10+8 AAV10+9 X AAV10+11 AAV10+12
AAV11 AAV11+1 AAV11+2 AAV11+3 AAV11+4 AAV11+5 AAV11+6 AAV11+7 AAV11+8 AAV11+9 AAV11+10 X AAV11+12
AAV12 AAV12+1 AAV12+2 AAV12+3 AAV12+4 AAV12+5 AAV12+6 AAV12+7 AAV12+8 AAV12+9 AAV12+10 AAV12+11 X
藉由在一種殼體蛋白中包括來自多個AAV血清型之個別胺基酸或區，可得到具有分別來源於多個AAV血清型之多個所需特性的殼體蛋白。
各種AAV血清型及自主小病毒之基因組序列，以及原生末端重複(TR)之序列、Rep蛋白及殼體次單位之序列為此項技術中已知的。此類序列可發現於文獻中或諸如GenBank之公共資料庫中。參見例如GenBank寄存編號NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；其揭示內容出於教示小病毒及AAV核酸及胺基酸序列之目的以引用之方式併入本文中。亦參見例如Srivistava等人, (1983) J. Virology 45:555；Chiorini等人, (1998) J Virology 71:6823；Chiorini等人, (1999) J. Virology 73: 1309；Bantel-Schaal等人, (1999) J Virology 73:939；Xiao等人, (1999) J Virology 73:3994；Muramatsu等人, (1996) Virology 221:208；Shade等人, (1986) J. Virol. 58:921；Gao等人, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；Moris等人, (2004) Virology 33:375-383；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；及美國專利第6,156,303號；其揭示內容出於教示小病毒及AAV核酸及胺基酸序列之目的以引用之方式併入本文中。亦參見表2。自主小病毒及AAV之殼體結構更詳細地描述於BERNARD N. FIELDS等人, VIROLOGY, 第2卷, 第69及70章(第4版, Lippincott-Raven Publishers)中。亦參見AAV2(Xie等人, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10405-10)、AAV9 (DiMattia等人, (2012) J. Virol. 86:6947-6958)、AAV8 (Nam等人, (2007) J. Virol. 81: 12260-12271)、AAV6 (Ng等人, (2010) J. Virol. 84:12945-12957)、AAV5 (Govindasamy等人(2013) J. Virol. 87, 11187-11199)、AAV4 (Govindasamy等人(2006) J. Virol. 80:11556-11570)、AAV3B (Lerch等人, (2010) Virology 403:26-36)、BPV (Kailasan等人, (2015) J. Virol. 89:2603-2614)及CPV (Xie等人, (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520及Tsao等人, (1991) Science 251:1456-64)之晶體結構之描述。 表2：AAV血清型及分枝系
GenBank 寄存編號    GenBank 寄存編號    GenBank 寄存編號
全基因組 分枝系C Rh57 AY530569
腺相關病毒1 NC_002077，AF063497 Hu9 AY530629 Rh50 AY530563
腺相關病毒2 NC_001401 Hu10 AY530576 Rh49 AY530562
腺相關病毒3 NC_001729 Hu11 AY530577 Hu39 AY530601
腺相關病毒3B NC_001863 Hu53 AY530615 Rh58 AY530570
腺相關病毒4 NC_001829 Hu55 AY530617 Rh61 AY530572
腺相關病毒5 Y18065，AF085716 Hu54 AY530616 Rh52 AY530565
腺相關病毒6 NC_001862 Hu7 AY530628 Rh53 AY530566
禽類AAV ATCC VR-865 AY186198，AY629583，NC_004828 Hu18 AY530583 Rh51 AY530564
禽類AAV株DA-1 NC_006263，AY629583 Hu15 AY530580 Rh64 AY530574
牛AAV NC_005889，AY388617，AAR26465 Hu16 AY530581 Rh43 AY530560
AAV11 AAT46339，AY631966 Hu25 AY530591 AAV8 AF513852
AAV12 ABI16639，DQ813647 Hu60 AY530622 Rh8 AY242997
分枝系A    Ch5 AY243021 Rh1 AY530556
AAV1 NC_002077，AF063497 Hu3 AY530595 分枝系F   
AAV6 NC_001862 Hu1 AY530575 Hu14 (AAV9) AY530579
Hu.48 AY530611 Hu4 AY530602 Hu31 AY530596
Hu 43 AY530606 Hu2 AY530585 Hu32 AY530597
Hu 44 AY530607 Hu61 AY530623 HSC1 MI332400.1
Hu 46 AY530609 分枝系D    HSC2 MI332401.1
分枝系B    Rh62 AY530573 HSC3 MI332402.1
Hu. 19 AY530584 Rh48 AY530561 HSC4 MI332403.1
Hu. 20 AY530586 Rh54 AY530567 HSC5 MI332405.1
Hu 23 AY530589 Rh55 AY530568 HSC6 MI332404.1
Hu22 AY530588 Cy2 AY243020 HSC7 MI332407.1
Hu24 AY530590 AAV7 AF513851 HSC8 MI332408.1
Hu21 AY530587 Rh35 AY243000 HSC9 MI332409.1
Hu27 AY530592 Rh37 AY242998 HSC11 MI332406.1
Hu28 AY530593 Rh36 AY242999 HSC12 MI332410.1
Hu 29 AY530594 Cy6 AY243016 HSC13 MI332411.1
Hu63 AY530624 Cy4 AY243018 HSC14 MI332412.1
Hu64 AY530625 Cy3 AY243019 HSC15 MI332413.1
Hu13 AY530578 Cy5 AY243017 HSC16 MI332414.1
Hu56 AY530618 Rh13 AY243013 HSC17 MI332415.1
Hu57 AY530619 分枝系E    Hu68   
Hu49 AY530612 Rh38 AY530558 殖株分離株   
Hu58 AY530620 Hu66 AY530626 AAV5 Y18065，AF085716
Hu34 AY530598 Hu42 AY530605 AAV 3 NC_001729
Hu35 AY530599 Hu67 AY530627 AAV 3B NC_001863
AAV2 NC_001401 Hu40 AY530603 AAV4 NC_001829
Hu45 AY530608 Hu41 AY530604 Rh34 AY243001
Hu47 AY530610 Hu37 AY530600 Rh33 AY243002
Hu51 AY530613 Rh40 AY530559 Rh32 AY243003
Hu52 AY530614 Rh2 AY243007 其他   
Hu T41 AY695378 Bb1 AY243023 Rh74   
Hu S17 AY695376 Bb2 AY243022 髭頰蜥AAV   
Hu T88 AY695375 Rh10 AY243015 蛇AAV NC_006148.1
Hu T71 AY695374 Hu17 AY530582      
Hu T70 AY695373 Hu6 AY530621      
Hu T40 AY695372 Rh25 AY530557      
Hu T32 AY695371 Pi2 AY530554      
Hu T17 AY695370 Pi1 AY530553      
Hu LG15 AY695377 Pi3 AY530555      
術語「自身互補AAV」或「scAAV」係指形成自發黏著之二聚反向重複DNA分子，從而產生相較於習知單股(ss) AAV基因組更早且更穩固轉殖基因表現的重組AAV載體。參見例如McCarty, D.M.等人, Gene Therapy 8, 1248-1254 (2001)。不同於習知ssAAV，scAAV可繞過第二股合成，該第二股合成為基因表現之速率限制步驟。此外，雙股scAAV較低傾於在病毒轉導之後進行DNA降解，從而增加穩定游離基因體之複本數。值得注意的是，scAAV可通常僅保留習知AAV載體之一半大小，約2.4 kb的基因組。在一些實施例中，本文所描述之AAV載體為自身互補型AAV。
如本文所用，術語「肽」係指短胺基酸序列。術語肽可用於指AAV殼體胺基酸序列之部分或區。肽可為天然存在於原生AAV殼體中之肽或不天然存在於原生AAV殼體中之肽。AAV殼體中之天然存在之AAV肽可經非天然存在之肽取代。舉例而言，非天然存在之肽可經取代進入AAV殼體中以得到經修飾之殼體，使得天然存在之肽經非天然存在之肽置換。
如本文所用，術語「向性」係指病毒優先進入至某些細胞或組織中，視情況隨後在細胞中表現(例如轉錄及視情況轉譯)病毒基因組所攜載之序列，例如對於重組病毒而言，表現所關注之轉殖基因。
如此處所使用，「全身性向性」及「全身性轉導」(及等效術語)指示，如本文所描述之病毒殼體或病毒載體分別呈現組織向性或轉導至整個身體(例如大腦、肺、骨骼肌、心臟、肝、腎臟及/或胰臟)中。在一些實施例中，達成肌肉組織(例如骨骼肌、隔膜及心肌)之全身性轉導。在一些實施例中，達成骨骼肌組織之全身性轉導。舉例而言，在一些實施例中，轉導整個身體中之基本上所有骨架肌(儘管轉導效率可根據肌肉類型而變化)。在一些實施例中，達成肢體肌肉、心肌及隔膜肌之全身性轉導。視情況，經由全身性途徑(例如全身性途徑，諸如靜脈內、關節內或淋巴內)投與病毒殼體或病毒載體。
或者，在一些實施例中，局部遞送殼體或病毒載體(例如至腳掌，肌肉內、皮內、皮下、局部)。在一些實施例中，將殼體或病毒載體局部遞送至中樞神經系統(CNS)組織，諸如大腦或脊髓。在一些實施例中，藉由鞘內、大腦內或腦室內注射、大池內(intracisterna magna；ICM)注射、腰椎穿刺注射或其任何組合投與殼體或病毒載體。
除非另外指示，否則「有效轉導」或「有效向性」或類似術語可參考適合對照來判定(例如分別為對照之轉導或向性之至少約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或更多)。在一些實施例中，病毒載體(例如AVV載體)有效地轉導以下或對其具有有效向性：骨骼肌、心肌、隔膜肌、胰臟(包括β-胰島細胞)、脾、胃腸道(例如上皮及/或平滑肌)、中樞神經系統細胞、肺、關節細胞及/或腎臟。適合對照將視各種因素(包括所需向性概況)而定。舉例而言，AAV8及AAV9高效轉導骨骼肌、心肌及隔膜肌，但具有亦高效率轉導肝之缺點。因此，可鑑別證實AAV8或AAV9有效轉導骨架、心臟及/或隔膜肌但以低許多之轉導效率轉導肝的病毒載體。此外，因為所關注向性概況可反映針對多種目標組織之向性，因此應瞭解，適合載體可代表一些權衡。為了說明，病毒載體可比AAV8或AAV9更低效地轉導骨骼肌、心肌及/或隔膜肌，但因為低水準之肝轉導，仍可能為極其需要的。
類似地，參考適合對照，可判定病毒是否「不有效地轉導」目標組織或「不具有」目標組織之「有效向性」或類似術語。在一些實施例中，病毒載體不有效地轉導肝、腎臟、性腺及/或生殖細胞(亦即，不具有導肝、腎臟、性腺及/或生殖細胞之有效向性)。在一些實施例中，組織(例如肝)之非所需轉導為所需目標組織(例如骨骼肌、隔膜肌、心肌及/或中樞神經系統細胞)之轉導水準之約20%或更小、約10%或更小、約5%或更小、約1%或更小、約0.1%或更小。
如本文結合AAV載體(或殼體蛋白或其肽)所用，術語「選擇性結合(selectively binds)」、「選擇性結合(selective binding)」及類似術語係指AAV載體(或殼體蛋白或其肽)以依賴於特定分子結構之存在之方式與目標結合。在一些實施例中，選擇性結合係指AAV主要與特定目標之結合，而與其他目標無實質或顯著結合。在一些實施例中，AAV載體(或殼體蛋白或其肽)與所關注細胞或組織中之受體特異性結合，但不展現與其他受體實質或顯著結合。
「聚核苷酸」為核苷酸鹼基序列，且可為RNA、DNA或DNA-RNA雜交序列(包括天然存在之核苷酸與非天然存在之核苷酸兩者)。在一些實施例中，聚核苷酸為單股或雙股DNA序列。
如本文所用，「經分離之」聚核苷酸(例如「經分離之DNA」或「經分離之RNA」)意謂至少部分地與天然存在之生物體或病毒之至少一些其他組分(例如細胞或病毒結構組分或通常發現與聚核苷酸結合之其他多肽或核酸)分離的聚核苷酸。在一些實施例中，與起始材料相比，「經分離之」核苷酸增濃至少約10倍、約100倍、約1000倍、約10,000倍或更多。
同樣，「經分離之」多肽意謂至少部分地與天然存在之生物體或病毒之至少一些其他組分(例如細胞或病毒結構組分或通常發現與多肽結合之其他多肽或核酸)分離的多肽。在一些實施例中，與起始材料相比，「經分離之」多肽增濃至少約10倍、約100倍、約1000倍、約10,000倍或更多。
如本文所用，「分離」或「純化」(或文法等效者)病毒載體，其意謂病毒載體至少部分地與起始材料中之至少一些其他組分分離。在一些實施例中，與起始材料相比，「經分離之」或「純化的」病毒載體增濃至少約10倍、約100倍、約1000倍、約10,000倍或更多。
「治療性」多肽或蛋白質為可減輕、減少、預防、延遲及/或使由在細胞或個體中不存在或缺乏蛋白質引起之症狀穩定的多肽或蛋白質，及/或另外賦予個體益處(例如抗癌效果或移植存活率提高)的多肽。
術語「治療(treat/treating/treatment of)」(及其文法變化形式)，其意謂個體病狀之嚴重程度降低，至少部分地改善或穩定，及/或達成至少一個臨床症狀之一些緩解、緩和、減少或穩定，及/或延遲疾病或病症之進展。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」(及其文法變化形式)係指預防及/或延遲個體疾病、病症及/或臨床症狀發作，及/或相對於在不存在本文所描述之組合物及/或方法下將發生之疾病、病症及/或臨床症狀發作之嚴重程度降低其嚴重程度。預防可為完全的，例如完全不存在疾病、病症及/或臨床症狀。預防亦可為部分的，使得個體疾病、病症及/或臨床症狀之發生及/或發作嚴重程度小於在不存在本文所描述之組合物及/或方法下將發生的。
如本文所用，「治療有效量」係指當向個體投與以治療疾病或至少一個疾病臨床症狀時足以實現對疾病或其症狀之此類治療的量。「治療有效量」可視例如疾病及/或疾病之症狀、疾病及/或疾病或病症之症狀之嚴重程度、所治療之患者之年齡、體重及/或健康狀況及開處方醫師之判斷而變化。任何既定情況下之適當量對於熟習此項技術者而言可為確定的或能夠藉由常規實驗判定。
如本文所用，術語「病毒載體(virus vector)」、「載體(vector)」或「基因遞送載體」係指充當核酸遞送媒劑之病毒(例如AAV)粒子，且其包含封裝於病毒粒子內之載體基因組(例如病毒DNA [vDNA])。或者，在一些情況下，術語「載體」可用於指單獨載體基因組/vDNA。在一些實施例中，載體基因組(例如AAV載體基因組)可包含於「運載核酸」中。在一些實施例中，載體基因組為自身互補型(亦即，雙股)。在一些實施例中，載體基因組不為自身互補型(亦即，單股)。
「rAAV載體基因組」或「rAAV基因組」為包含一或多個異源核酸序列之AAV基因組(亦即，vDNA)。rAAV載體一般僅需要順式反向末端重複序列(ITR)來產生病毒。所有其他病毒序列為非必需的且可以反式形式供應((Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97)。通常，rAAV載體基因組將僅保留一個或兩個ITR序列，以便使可由載體有效封裝之轉殖基因之大小達到最大。結構及非結構蛋白編碼序列可以反式形式提供(例如來自載體，諸如質體，或藉由將序列穩定地整合至封裝細胞中)。在一些實施例中，rAAV載體基因組包含至少一個ITR序列(例如AAV ITR序列)，視情況兩個ITR (例如兩個AAV ITR)，其通常將在載體基因組之5'及3'端處(亦即，5' ITR及3' ITR)，且側接異源核酸，但不一定與其相鄰。
術語「反向末端重複序列」或「ITR」包括形成髮夾結構且用作反向末端重複序列(亦即，介導所需功能，諸如複製、病毒封裝、整合及/或原病毒解救及其類似者)之任何病毒末端重複或合成序列。ITR可為AAV ITR或非AAV ITR。舉例而言，非AAV ITR序列，諸如其他小病毒(例如犬小病毒(CPV)、小鼠小病毒(MVM)、人類小病毒B-19)之彼等序列或任何其他適合的病毒序列(例如充當SV40複製之起點之SV40髮夾)可用作ITR，其可進一步藉由截短、取代、缺失、插入及/或添加進行修飾。此外，ITR可為部分或完全合成的，諸如如美國專利第5,478,745號中所描述之「雙D序列」。
「AAV反向末端重複序列」或「AAV ITR」可來自任何AAV，包括(但不限於)血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或目前已知或後續發現之任何其他AAV (參見例如表2)。AAV反向末端重複序列不一定具有原生末端重複序列(例如可藉由插入、缺失、截短及/或錯義突變改變原生AAV ITR序列)，只要末端重複介導所需功能，例如複製、病毒封裝、整合及/或原病毒解救及其類似者即可。
本文所描述之病毒載體可進一步為如國際專利公開案WO00/28004及Chao等人, (2000) Molecular Therapy 2:619中所描述之「靶向(targeted)」病毒載體(例如具有定向向性)及/或「雜交」病毒載體(亦即，其中病毒ITR及病毒殼體係來自不同病毒)。在一些實施例中，病毒載體靶向CNS細胞及/或組織。
本文所描述之病毒載體可進一步為如國際專利公開案WO 01/92551 (其揭示內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之雙螺旋病毒粒子。因此，在一些實施例中，可將雙股(雙螺旋)基因組封裝至本文所描述之病毒殼體中。此外，病毒殼體或基因組元件可含有其他修飾，包括插入、缺失及/或取代。
如本文所用，術語「胺基酸」涵蓋任何天然存在之胺基酸、其經修飾形式及合成胺基酸。天然存在之左旋(L-)胺基酸顯示於表3中。 表 3 ： 胺基酸殘基及縮寫 .
胺基酸殘基 縮寫
三字母代碼 單字母代碼
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺 Asn N
天冬胺酸(Aspartic acid/Aspartate) Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩醯胺酸 Gln Q
麩胺酸(Glutamic acid/Glutamate) Glu E
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
或者，胺基酸可為經修飾之胺基酸殘基(非限制性實例顯示於表4中)，及/或可為藉由轉譯後修飾(例如乙醯化、醯胺化、甲醯化、羥基化、甲基化、磷酸化或硫酸酯化)進行修飾之胺基酸。化學修飾胺基酸之方法為此項技術中已知的(參見例如Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 第1版, Academic Press, 1996)。 表 4 ： 經修飾之胺基酸殘基
經修飾之胺基酸殘基 縮寫
胺基酸殘基衍生物
2-胺基己二酸 Aad
3-胺基己二酸 bAad
β-丙胺酸，β-胺基丙酸 bAla
2-胺基丁酸 Abu
4-胺基丁酸，哌啶酸 4Abu
6-胺基己酸 Acp
2-胺基庚酸 Ahe
2-胺基異丁酸 Aib
3-胺基異丁酸 bAib
2-胺基庚二酸 Apm
第三丁基丙胺酸 t-BuA
瓜胺酸 Cit
環己基丙胺酸 Cha
2,4-二胺基丁酸 Dbu
鎖鏈素(Desmosine) Des
2,21-二胺基庚二酸 Dpm
2,3-二胺基丙酸 Dpr
N-乙基甘胺酸 EtGly
N-乙基天冬醯胺 EtAsn
高精胺酸 hArg
高半胱胺酸 hCys
高絲胺酸 hSer
羥離胺酸 Hyl
別羥離胺酸 aHyl
3-羥脯胺酸 3Hyp
4-羥脯胺酸 4Hyp
異鎖鏈素 Ide
別異白胺酸 aIle
甲硫胺酸亞碸 MSO
N-甲基甘胺酸，肌胺酸 MeGly
N-甲基異白胺酸 MeIle
6-N-甲基離胺酸 MeLys
N-甲基纈胺酸 MeVal
2-萘基丙胺酸 2-Nal
正纈胺酸 Nva
正白胺酸 Nle
鳥胺酸 Orn
4-氯苯丙胺酸 Phe(4-C1)
2-氟苯丙胺酸 Phe(2-F)
3-氟苯丙胺酸 Phe(3-F)
4-氟苯丙胺酸 Phe(4-F)
苯基甘胺酸 Phg
β-2-噻吩基丙胺酸 Thi
此外，非天然存在之胺基酸可為「非天然」胺基酸(如Wang等人, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)所描述)。此等非天然胺基酸可宜用於將所關注之分子與AAV殼體蛋白化學連接。 經修飾之 AAV 殼體蛋白 及包含其之 AAV 載體 AAV 載體
本文另外提供腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由殼體蛋白包裹之運載核酸。在一些實施例中，重組殼體蛋白(VP1、VP2及/或VP3)可在其胺基酸序列中包含不存在於任何原生AAV殼體序列中之肽。本發明人已證實，包含本文所描述之肽之殼體蛋白可賦予病毒載體一或多個所需特性，包括(但不限於)避開中和抗體之能力。因此，本文所描述之AAV載體解決與習知AAV載體相關之限制。
因此，在一些實施例中，本發明提供腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由殼體蛋白包裹之運載核酸；其中殼體蛋白包含具有SEQ ID NO: 12-20中之任一者之序列的肽。在一些實施例中，運載核酸包含5'及3' AAV反向末端重複序列。在一些實施例中，運載核酸包含轉殖基因。在一些實施例中，運載核酸為雙股的。在一些實施例中，運載核酸為單股的。在一些實施例中，轉殖基因編碼治療蛋白或RNA。在一些實施例中，重組殼體蛋白與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV殼體之原生序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些實施例中，重組殼體蛋白與AAV9殼體之原生序列具有至少90%序列一致性。
在一些實施例中，肽係位於對應於原生AAV9殼體之胺基酸451-458或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置處，且該肽係選自SEQ ID NO: 12-18中之任一者。在一些實施例中，肽係位於對應於原生AAV9殼體之胺基酸587-594或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置處，且該肽係選自SEQ ID NO: 19或20。
在一些實施例中，重組殼體蛋白包含a)第一肽，其具有SEQ ID NO: 12-18中之任一者之序列；及b)第二肽，其具有SEQ ID NO: 19-20中之任一者之序列。在一些實施例中，第一肽係在胺基酸位置451-458處，且第二肽係在胺基酸587-594處，其中胺基酸編號係基於原生AAV9殼體或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基。
在一些實施例中，肽抑制至少一種抗體與殼體蛋白之結合。在一些實施例中，肽抑制AAV載體之感染性被抗體中和。
在一些實施例中，肽選擇性地與表現於中樞神經系統(CNS)中之細胞表面上之受體結合。在一些實施例中，細胞係在運動前區皮質、丘腦、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節中。在一些實施例中，肽選擇性地與表現於心臟中之細胞表面上之受體結合。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸451-458處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於原生AAV9殼體蛋白序列中。在一些實施例中，X 1不為I，X 2不為N，X 3不為G，X 4不為S，X 5不為G，X 6不為Q，X 7不為N，及/或X 8不為Q。在一些實施例中，X 1為S、F、Q、G、K或R。在一些實施例中，X 2為C、G、R、D、T或Q。在一些實施例中，X 3為Q、V、G、Y、R、F或D。在一些實施例中，X 4為P、Q、A或R。在一些實施例中，X 5為T、N、A、P或I。在一些實施例中，X 6為V、Q、A或I。在一些實施例中，X 7為M、P、R、Q或N。在一些實施例中，X 8為N、L、F、E、H或A。在一些實施例中，X 1為S，X 2為C，X 3為Q，X 4為P，X 5為T，X 6為V，X 7為M，及X 8為N。在一些實施例中，X 1為F，X 2為G，X 3為V，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。在一些實施例中，X 1為Q，X 2為R，X 3為G，X 4為Q，X 5為A，X 6為A，X 7為P，及X 8為F。在一些實施例中，X 1為G，X 2為D，X 3為Y，X 4為A，X 5為P，X 6為I，X 7為R，及X 8為E。在一些實施例中，X 1為K，X 2為T，X 3為R，X 4為R，X 5為I，X 6為V，X 7為Q，及X 8為H。在一些實施例中，X 1為F，X 2為G，X 3為F，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。在一些實施例中，X 1為R，X 2為Q，X 3為D，X 4為Q，X 5為P，X 6為I，X 7為N，及X 8為A。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸587-594處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於原生AAV9殼體蛋白序列中。在一些實施例中，X 1不為A，X 2不為Q，X 3不為A，X 4不為Q，X 5不為A，X 6不為Q，X 7不為T，及/或X 8不為G。在一些實施例中，X 1為S。在一些實施例中，X 2為K或T。在一些實施例中，X 3為V。在一些實施例中，X 4為E或D。在一些實施例中，X 5為S。在一些實施例中，X 6為W或I。在一些實施例中，X 7為T或A。在一些實施例中，X 8為E或I。在一些實施例中，X 1為S，X 2為K，X 3為V，X 4為E，X 5為S，X 6為W，X 7為T，及X 8為E。在一些實施例中，X 1為S，X 2為T，X 3為V，X 4為D，X 5為S，X 6為I，X 7為A，及X 8為I。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含與SEQ ID NO: 165-187中之任一者至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，殼體蛋白包含SEQ ID NO: 165-187中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，殼體蛋白包含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列。在一些實施例中，殼體蛋白包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV載體將運載核酸選擇性地遞送至中樞神經系統的細胞或組織。在一些實施例中，中樞神經系統組織為運動前區皮質、丘腦、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節。在一些實施例中，AAV載體將運載核酸遞送至大腦，但不將AAV載體遞送至心臟。在一些實施例中，AAV載體將運載核酸遞送至大腦及遞送至心臟。在一些實施例中，遞送至大腦之運載核酸高於遞送至心臟之運載核酸。在一些實施例中，遞送至大腦之運載核酸與遞送至心臟之運載核酸大致相等。 AAV 殼體蛋白
在一些實施例中，本發明提供一種腺相關病毒(AAV)殼體蛋白，其相較於原生AAV殼體蛋白包含一或多個胺基酸修飾(例如取代及/或缺失)，其中該一或多個修飾改變AAV殼體蛋白上之一或多個抗原位點。一或多個抗原位點之修飾引起對抗體與一或多個抗原位點之結合的抑制及/或對包含AAV殼體蛋白之病毒粒子之感染性之中和的抑制。一或多個胺基酸修飾(例如取代及/或缺失)可在藉由含有AAV殼體蛋白之AAV-抗體複合物之肽抗原決定基定位及/或低溫電子顯微研究所鑑別的一或多個抗原足跡中。在一些實施例中，一或多個抗原位點為如WO 2017/058892中所描述之常用抗原基元或CAM，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗原位點係在AAV殼體蛋白之可變區(VR)中，諸如VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII、VR-IX。在一些實施例中，一或多個抗原位點係在AAV殼體蛋白之HI環中。
在一些實施例中，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV或禽類AAV殼體蛋白在下表5中所鑑別之一或多個區中包含胺基酸修飾(例如取代或缺失)。 表 5 ： 各種 AAV 殼體上之可部分或完全被取代 / 置換之例示性抗原或其他區 。顯示原生AAV殼體序列中之殘基之各別VP1編號。
AAV1 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV2 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV3 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV4 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV5 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO
SASTGAS (262-268) 2591 SQSGAS (262-267) 2601 SQSGAS (262-267) 2611 RLGESLQS (253-260) 2621 EIKSGSVDGS (249-258) 2631
VFMIPQYGYL (370-379) 2592 VFMVPQYGYL (369-378) 2602 VFMVPQYGYL (369-378) 2612 VFMVPQYGYC (360-369) 2622 VFTLPQYGYA (360-369) 2632
NQSGSAQNK (451-459) 2593 TPSGTTTQS (450-458) 2603 TTSGTTNQS (451- 459) 2613 GTTLNAGTA (445-453) 2623 STNNTGGVQ (440-448) 2633
SV (472-473) 2594 RD (471-472) 2604 SL (472-473) 2614 SN (466-467) 2624 AN (458-459) 2634
KTDNNNSN (493-500) 2595 SADNNNSE (492-499) 2605 ANDNNNSN (493-500) 2615 ANQNYKIPATGS (487-498) 2625 SGVNRAS (479-485) 2635
KDDEDKF (528-534) 2596 KDDEEKF (527-533) 2606 KDDEEKF (528-534) 2616 GPADSKF (527-533) 2626 LQGSNTY (515-521) 2636
SAGASN (547-552) 2597 GSEKTN (546-551) 2607 GTTASN (547-552) 2617 QNGNTA (545-560) 2627 ANPGTTAT (534-541) 2637
STDPATGDVH (588-597) 2598 NRQAATADVN (587-596) 2608 NTAPTTGTVN (588-597) 2618 SNLPTVDRLT (583-595) 2628 TTAPATGTYN (577-586) 2638
AN (709-710) 2599 VN (708-709) 2609 VN (709-710) 2619 NS (707-708) 2629 QF (697-698) 2639
DNNGLYT (716-722) 2600 DTNGVYS (715-721) 2610 DTNGVYS (716-722) 2620 DAAGKYT (714-720) 2630 DSTGEYR (704-710) 2640
AAV6 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV7 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV8 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV9 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAVrh8 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO
SASTGAS (262-268) 2641 SETAGST (263-269) 2651 NGTSGGAT (263-270) 2661 NSTSGGSS (262-269) 2671 NGTSGGST (262-269) 2681
VFMIPQYGYL (370-379) 2642 VFMIPQYGYL (371-380) 2652 VFMIPQYGYL (372-381) 2662 VFMIPQYGYL (371-380) 2672 VFMVPQYGYL (371-380) 2682
NQSGSAQNK (451-459) 2643 NPGGTAGNR (453-461) 2653 TTGGTANTQ (453-461) 2663 INGSGQNQQ (451-459) 2673 QTTGTGGTQ (451-459) 2683
SV (472-473) 2644 AN (474-475) 2654 AN (474-475) 2664 AV (472-473) 2674 AN (472-473) 2684
KTDNNNSN (493-500) 2645 LDQNNNSN (495-502) 2655 TGQNNNSN (495-502) 2665 VTQNNNSE (493-500) 2675 TNQNNNSN (493-500) 2685
KDDKDKF (528-534) 2646 KDDEDRF (530-536) 2656 KDDEERF (530-536) 2666 KEGEDRF (528-534) 2676 KDDDDRF (528-534) 2686
SAGASN (547-552) 2647 GATNKT (549-554) 2657 NAARDN (549-554) 2667 GTGRDN (547-552) 2677 GAGNDG (547-552) 2687
STDPATGDVH (588-897) 2648 NTAAQTQVVN (589-598) 2658 NTAPQIGTVNS (590-600) 2668 QAQAQTGWVQ (588-597) 2678 NTQAQTGLVH (588-597) 2688
AN (709-710) 2649 TG (710-711) 2659 TS (711-712) 2669 NN (709-710) 2679 TN (709-710) 2689
DNNGLYT (716-722) 2650 DSQGVYS (717-723) 2660 NTEGVYS (718-724) 2670 NTEGVYS (716-722) 2680 NTEGVYS (716-722) 2690
AAVrh10 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV10 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV11 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV12 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAVrh32.33 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO
NGTSGGST (263-270) 2691 NGTSGGST (263-270) 2701 RLGTTSSS (253-260) 2711 RIGTTANS (262-269) 2721 RLGTTSNS (253-260) 2731
VFMIPQYGYL (372-381) 2692 VFMIPQYGYL (372-381) 2702 VFMVPQYGYC (360-369) 2712 VFMVPQYGYC (369-378) 2722 VFMVPQYGYC (360-369) 2732
STGGTAGTQ (453-461) 2693 STGGTQGTQ (453-461) 2703 GETLNQGNA (444-452) 2713 GNSLNQGTA (453-461) 2723 GETLNQGNA (444-452) 2733
SA (474-475) 2694 SA (474-475) 2704 AF (465-466) 2714 AY (474-475) 2724 AF (465-466) 2734
LSQNNNSN (495-502) 2695 LSQNNNSN (495-502) 2705 ASQNYKIPASGG (486-497) 2715 ANQNYKIPASGG (495-506) 2725 ASQNYKIPASGG (486-497) 2735
KDDEERF (530-536) 2696 KDDEERF (530-536) 2706 GPSDGDF (526-532) 2716 GAGDSDF (535-541) 2726 GPSDGDF (526-532) 2736
GAGKDN (549-554) 2697 GAGRDN (549-554) 2707 VTGNTT (544-549) 2717 PSGNTT (553-558) 2727 VTGNTT (544-549) 2737
NAAPIVGAVN (590-599) 2698 NTGPIVGNVN (590-599) 2708 TTAPITGNVT (585-594) 2718 TTAPHIANLD (594-503) 2728 TTAPITGNVT (585-594) 2738
TN (711-712) 2699 TN (711-712) 2709 SS (706-707) 2719 NS (715-716) 2729 SS (706-707) 2739
NTDGTYS (718-724) 2700 NTEGTYS (718-724) 2710 DTTGKYT (713-719) 2720 DNAGNYH (722-728) 2730 DTTGKYT (713-719) 2740
牛AAV ( 胺基酸編號) SEQ ID NO 禽類AAV ( 胺基酸編號) SEQ ID NO
RLGSSNAS (255-262) 2741 RIQGPSGG (265-272) 2751
VFMVPQYGYC (362-371) 2742 IYTIPQYGYC (375-384) 2752
GGTLNQGNS (447-455) 2743 VSQAGSSGR (454-462) 2753
SG (468-469) 2744 AA (475-476) 2754
ASQNYKIPQGRN (489-500) 2745 ASNITKNNVFSV (496-507) 2755
ANDATDF (529-535) 2746 FSGEPDR (533-539) 2756
ITGNTT (547-552) 2747 VYDQTTAT (552-559) 2757
TTVPTVDDVD (588-597) 2748 VTPGTRAAVN (595-604) 2758
DS (709-710) 2749 AD (716-717) 2759
DNAGAYK (716-722) 2750 SDTGSYS (723-729) 2760
在一些實施例中，胺基酸取代置換來自以下血清型中之任一者之AAV殼體蛋白中之任何八個胺基酸：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV或禽類AAV。舉例而言，胺基酸取代可置換以下胺基酸(VP1編號)：以上所列舉之AAV血清型中之任一者中之355-362、363-370、371-378、379-386、387-394、395-402、403-410、411-418、419-426、427-434、435-442、443-450、451-458、459-466、467-474、475-482、483-490、491-498、499-506、507-514、515-522、523-530、531-538、539-546、547-554、555-562、563-570、571-578、579-586、587-594、595-602、603-610、611-618、619-626、627-634、635-642、643-650、651-658、659-666、667-674、675-682、683-690、691-698、699-706、707-714、715-722。
在一些實施例中，胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 19-20中之任一者。在一些實施例中，胺基酸取代與SEQ ID NO: 12-18中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同源性。在一些實施例中，取代係在對應於野生型AAV9殼體之胺基酸587-594之胺基酸處。在一些實施例中，取代係在對應於野生型AAV1殼體之胺基酸587-594之胺基酸處。在一些實施例中，取代係在對應於野生型AAV6殼體之胺基酸587-594之胺基酸處。在一些實施例中，取代係在對應於野生型AAV8殼體之胺基酸589-596之胺基酸處。在一些實施例中，取代係在對應於野生型AAVrh8殼體之胺基酸587-594之胺基酸處。在一些實施例中，取代係在對應於野生型AAVrh10殼體之胺基酸589-596之胺基酸處。
在一些實施例中，胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 18-20中之任一者。在一些實施例中，胺基酸取代與SEQ ID NO: 18-20中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同源性。在一些實施例中，取代係在對應於野生型AAV9殼體之胺基酸451-458之胺基酸處。
在一些實施例中，胺基酸缺失包含相較於野生型殼體缺失至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個胺基酸之缺失。
在一些實施例中，AAV殼體包含一或多個胺基酸取代及一或多個胺基酸缺失。在一些實施例中，殼體包含至少一個胺基酸取代及至少一個胺基酸缺失。在一些實施例中，殼體包含至少一個胺基酸取代及至少一個胺基酸缺失，其中至少一個胺基酸取代及至少一個胺基酸缺失在殼體胺基酸序列中彼此緊鄰。
在一些實施例中，殼體蛋白經修飾以產生當存在於AAV病毒粒子或AAV病毒載體中時具有選擇性地靶向CNS (例如大腦、脊髓)之表型的AAV殼體。在一些實施例中，殼體蛋白經修飾以產生當存在於AAV病毒粒子或AAV病毒載體中時具有避開中和抗體之表型的AAV殼體。除避開中和抗體及/或靶向CNS之表型以外，AAV病毒粒子或載體亦可具有增強或維持轉導效率之表型。
在一些實施例中，一或多個取代可將來自第一AAV血清型之殼體蛋白之一或多個序列引入至不同於第一AAV血清型之第二AAV血清型的殼體蛋白中。
向其添加修飾之基礎AAV殼體蛋白可為選自以下之AAV血清型之殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.32.33、AAVrh74、牛AAV、禽類AAV或目前已知或後續鑑別之任何其他AAV。在一些實施例中，基礎AAV殼體蛋白具有AAV9血清型。在一些實施例中，基礎AAV殼體蛋白為嵌合型。在一些實施例中，基礎AAV殼體蛋白為AAV8/9嵌合體。
本文提供經修飾之AAV殼體蛋白之若干實例。在以下實例中，殼體蛋白可包含所描述之特定取代，且在一些實施例中，可包含比所描述之彼等更少或更多的取代。如本文所用，「取代」可指代單一胺基酸取代或多於一個連續胺基酸之取代。舉例而言，在一些實施例中，殼體蛋白可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等個單胺基酸取代。在一些實施例中，殼體蛋白可包含一或多個多個連續胺基酸之取代，諸如一或多個2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個連續胺基酸之取代。
此外，在本文所描述之其中胺基酸殘基經除存在於野生型或原生胺基酸序列中之胺基酸殘基以外之任何胺基酸殘基取代的一些實施例中，該任何其他胺基酸殘基可為此項技術中已知的任何天然或非天然胺基酸殘基(參見例如表2及3)。在一些實施例中，取代可為保守性取代，且在一些實施例中，取代可為非保守性取代。在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含一或多個胺基酸取代，其中胺基酸取代係各自獨立地選自如表6.1中所示之SEQ ID NO: 12-18。 表 6.1 ： 胺基酸取代
胺基酸取代 SEQ ID NO.
SCQPTVMN 12
FGVPNQPL 13
QRGQAAPF 14
GDYAPIRE 15
KTRRIVQH 16
FGFPNQPL 17
RQDQPINA 18
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含一或多個胺基酸取代，其中胺基酸取代係各自獨立地選自如表6.2中所示之SEQ ID NO: 19-20。 表 6.2 ： 胺基酸取代
胺基酸取代 SEQ ID NO.
SKVESWTE 19
STVDSIAI 20
在一些實施例中，AAV殼體蛋白可包含選自表6.1中所列舉之序列的第一取代及選自表6.2中所列舉之序列的第二取代。在一些實施例中，AAV殼體蛋白可包含如表6.3及6.4中所示之第一取代、第二取代。 表 6.3 ：胺基酸取代之組合
第一取代 (SEQ ID NO) 第二取代 (SEQ ID NO)
12、13、14、15、16、17或18 19或20
表 6.4 胺基酸取代之組合
第一取代 (SEQ ID NO) 第二取代 (SEQ ID NO)
12 19
12 20
13 19
13 20
14 19
14 20
15 19
15 20
16 19
16 20
17 19
17 20
18 19
18 20
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含胺基酸修飾(例如取代及/或缺失)，其中該胺基酸修飾改變AAV殼體蛋白上之一或多個表面暴露區，諸如抗原區。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含一或多個胺基酸取代，其中至少一個胺基酸取代包含SEQ ID NO: 19-20中之一者。在一些實施例中，取代置換對應於野生型AAV9殼體之胺基酸587-594之胺基酸。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含一或多個胺基酸取代，其中至少一個胺基酸取代包含SEQ ID NO: 12-18中之一者。在一些實施例中，取代置換對應於野生型AAV9殼體之胺基酸451-458之胺基酸。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含取代，該取代包含不存在於原生殼體蛋白序列中之八個胺基酸之序列(X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8) (SEQ ID NO: 158)。在一些實施例中，X 1不為I，X 2不為N，X 3不為G，X 4不為S，X 5不為G，X 6不為Q，X 7不為N，及/或X 8不為Q。在一些實施例中，X 1為S、F、Q、G、K或R。在一些實施例中，X 2為C、G、R、D、T或Q。在一些實施例中，X 3為Q、V、G、Y、R、F或D。在一些實施例中，X 4為P、Q、A或R。在一些實施例中，X 5為T、N、A、P或I。在一些實施例中，X 6為V、Q、A或I。在一些實施例中，X 7為M、P、R、Q或N。在一些實施例中，X 8為N、L、F、E、H或A。在一些實施例中，X 1為S，X 2為C，X 3為Q，X 4為P，X 5為T，X 6為V，X 7為M，及X 8為N。在一些實施例中，X 1為F，X 2為G，X 3為V，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。在一些實施例中，X 1為Q，X 2為R，X 3為G，X 4為Q，X 5為A，X 6為A，X 7為P，及X 8為F。在一些實施例中，X 1為G，X 2為D，X 3為Y，X 4為A，X 5為P，X 6為I，X 7為R，及X 8為E。在一些實施例中，X 1為K，X 2為T，X 3為R，X 4為R，X 5為I，X 6為V，X 7為Q，及X 8為H。在一些實施例中，X 1為F，X 2為G，X 3為F，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。在一些實施例中，X 1為R，X 2為Q，X 3為D，X 4為Q，X 5為P，X 6為I，X 7為N，及X 8為A。
在一些實施例中，X 1不為A，X 2不為Q，X 3不為A，X 4不為Q，X 5不為A，X 6不為Q，X 7不為T，及/或X 8不為G。在一些實施例中，X 1為S。在一些實施例中，X 2為K或T。在一些實施例中，X 3為V。在一些實施例中，X 4為E或D。在一些實施例中，X 5為S。在一些實施例中，X 6為W或I。在一些實施例中，X 7為T或A。在一些實施例中，X 8為E或I。在一些實施例中，X 1為S，X 2為K，X 3為V，X 4為E，X 5為S，X 6為W，X 7為T，及X 8為E。在一些實施例中，X 1為S，X 2為T，X 3為V，X 4為D，X 5為S，X 6為I，X 7為A，及X 8為I。
在一些實施例中，相較於野生型AAV殼體，AAV殼體蛋白包含一或多個胺基酸缺失，其中胺基酸缺失包含至少六個或至少八個胺基酸之缺失。在一些實施例中，相較於原生殼體蛋白序列，AAV殼體蛋白包含八個連續胺基酸之缺失。在一些實施例中，相較於原生殼體蛋白序列，AAV殼體蛋白包含六個連續胺基酸之缺失。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含序列LSKTQTLK (SEQ ID NO: 1374)或序列LSKTDPQTLK (SEQ ID NO: 1375)。在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 1374或1375之AAV殼體蛋白具有選自以下之血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV及牛AAV。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含：第一取代，其包含選自SEQ ID NO: 12-18之序列；及第二取代，其包含選自SEQ ID NO: 19-20之序列。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含胺基酸缺失及取代，其中取代包含選自SEQ ID NO: 12-20之序列。
在一些實施例中，重組殼體蛋白具有與SEQ ID NO: 9 (AAV9)至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之序列，且包含以下一或多個胺基酸取代：I451S、I451F、I451Q、I451G、I451K、I451R、N452C、N452G¸ N452R¸ N452D¸ N452T、N452Q、G453Q、G453V、G453Y、G453R、G453F、G453D、S454P、S454Q、S454A、S454R、G455T、G455N、G455A、G455P、G455I、Q456V、Q456A、Q456I、N457M、N457P、N457R、N457Q、Q458N、Q458L、Q458F、Q458E、Q458H、Q458A、A587S、Q588K、Q588T、A589V、Q590E、Q590D、A591S、Q592W、Q592I、T593A、G594E、G594I。
本文所描述之AAV殼體中之任一者可在HI環中進一步包含修飾(例如取代或缺失)。HI環為一種在AAV殼體表面上之β股βH與βI之間的重要域，從各病毒蛋白質(VP)次單位延伸到與鄰近五倍VP重疊。在一些實施例中，AAV殼體在HI環中包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個胺基酸取代。在一些實施例中，AAV殼體在HI環中包含以下一或多個取代：P661R、T662S、Q666G、S667D，其中編號對應於野生型AAV8殼體(SEQ ID NO: 8)。在一些實施例中，AAV殼體在HI環中包含以下一或多個取代：P659R、T660S、A661T、K664G，其中編號對應於野生型AAV9殼體(SEQ ID NO: 9)。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含一、二、三或四個胺基酸取代，其中各取代修飾AAV殼體蛋白上之不同抗原位點，且其中至少一個胺基酸取代修飾殼體蛋白之HI環。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含第一、第二、第三及第四胺基酸取代。在一些實施例中，至少一個取代修飾殼體蛋白之HI環。在一些實施例中，AAV殼體在HI環中包含以下一或多個取代：P661R、T662S、Q666G、S667D，其中編號對應於野生型AAV8殼體(SEQ ID NO: 8)；或P659R、T660S、A661T、K664G，其中編號對應於野生型AAV9殼體(SEQ ID NO: 9)。在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含SEQ ID NO: 185-187中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，AAV殼體蛋白包含與SEQ ID NO: 165-187中之任一者共通至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
本文亦提供一種編碼本文所描述之AAV殼體蛋白中之一或多者的核苷酸序列，或一種包含該核苷酸序列的表現載體。核苷酸序列可為DNA序列或RNA序列。在一些實施例中，細胞包含一或多個本文所描述之核苷酸序列或表現載體。
在一些實施例中，AAV殼體包含如本文所描述之AAV殼體蛋白。本文進一步提供一種包含AAV殼體之病毒載體以及一種在醫藥學上可接受之載劑中包含AAV殼體蛋白、AAV殼體及/或病毒載體之組合物。
在一些實施例中，一或多個抗原位點之修飾引起對抗體與一或多個抗原位點之結合之抑制。在一些實施例中，一或多個抗原位點之修飾引起對包含AAV殼體蛋白之病毒粒子之感染性之中和的抑制。
如本文中所描述，來自多種AAV之殼體蛋白之核酸及胺基酸序列為此項技術中已知的。因此，對於任何其他AAV而言，「對應」於原生AAV殼體蛋白之胺基酸位置之胺基酸可容易地進行測定(例如藉由使用序列比對)。
經修飾之殼體蛋白可藉由修飾目前已知或後續發現之任何AAV之殼體蛋白來產生。此外，待進行修飾之基礎AAV殼體蛋白可為天然存在之AAV殼體蛋白(例如AAV2、AAV3a或AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11殼體蛋白，或表2中顯示之AAV中之任一者)但不限於此。熟習此項技術者應理解，對於AAV殼體蛋白之各種操縱為此項技術中已知的，且本發明不限於天然存在之AAV殼體蛋白之修飾。舉例而言，與天然存在之AAV (例如其係來源於天然存在之AAV殼體蛋白，例如AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或目前已知或後續發現之任何其他AAV)相比，待進行修飾之殼體蛋白可能已經具有變化。在一些實施例中，殼體蛋白可為嵌合殼體蛋白。在一些實施例中，殼體蛋白可為經工程改造之AAV，諸如AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B。
因此，在一些實施例中，待進行修飾之AAV殼體蛋白可來源於天然存在之AAV，但進一步包含插入至及/或經取代進入殼體蛋白中及/或已藉由缺失一或多個胺基酸改變的一或多個外來序列(例如對於原生病毒為外源性的)。
因此，當本文中提及特定AAV殼體蛋白(例如AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11殼體蛋白，或來自顯示於表2中之AAV中之任一者的殼體蛋白等)時，意欲涵蓋原生殼體蛋白以及具有除本文所描述之修飾以外之變化的殼體蛋白。此類變化包括取代、插入及/或缺失。在一些實施例中，與原生AAV殼體蛋白序列相比，殼體蛋白包含插入其中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20、小於20、小於30、小於40、小於50、小於60或小於70個胺基酸(除本文所描述之插入以外)。在一些實施例中，與原生AAV殼體蛋白序列相比，殼體蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20、小於20、小於30、小於40、小於50、小於60或小於70個胺基酸取代(除本文所描述之胺基酸取代以外)；在一些實施例中，與原生AAV殼體蛋白序列相比，殼體蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20、小於20、小於30、小於40、小於50、小於60或小於70個胺基酸之缺失。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白具有與原生AAV殼體蛋白序列至少約90%、約95%、約97%、約98%或約99%相似或一致之胺基酸序列。
測定兩個或更多個胺基酸序列之間之序列相似性或一致性之方法為此項技術中已知的。可使用標準技術來測定序列相似性或一致性，該等標準技術包括(但不限於) Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)之局部序列一致性演算法；Needleman及Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)之序列一致性比對演算法；Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)之相似性方法之檢索；此等演算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics套裝軟體, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；由Devereux等人, Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)所描述之最佳擬合序列程式；或檢測(inspection)。
另一適合演算法為Altschul等人, J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)及Karlin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)中所描述之BLAST演算法。尤其適用之BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其獲自Altschul等人, Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html。WU-BLAST-2使用若干檢索參數，其視情況設定為預設值。參數為動態值且藉由本身程式視特定序列之組成及所關注序列檢索之特定資料庫之組成而確立；然而可調整該等值以增加敏感性。
此外，額外適用演算法為如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402報導之間隙式BLAST。
在一些實施例中，病毒殼體包含如本文所描述之經修飾之AAV殼體蛋白。在一些實施例中，病毒殼體為小病毒殼體，其可進一步為自主小病毒殼體或依賴病毒殼體。視情況，病毒殼體為AAV殼體。在一些實施例中，AAV殼體為AAV1、AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV殼體、禽類AAV殼體或目前已知或後續鑑別之任何其他AAV。AAV血清型之非限制性清單顯示於表2中。AAV殼體可為表2中所列舉之任何AAV血清型，或藉由一或多個插入、取代及/或缺失衍生於前述中之任一者。可由經修飾之病毒殼體封裝且轉移至細胞中之分子包括運載核酸(例如異源DNA或RNA)、多肽、有機小分子、金屬或其組合。
異源分子定義為不天然存在於AAV感染中之彼等，例如不由野生型AAV基因組編碼之彼等。此外，治療適用分子可與嵌合病毒殼體之外部結合以將該等分子轉移至宿主目標細胞中。此類結合分子可包括DNA、RNA、有機小分子、金屬、碳水化合物、脂質及/或多肽。在一些實施例中，治療適用分子與殼體蛋白共價連接(亦即，結合或化學偶合)。共價連接分子之方法為熟習此項技術者已知的。
經修飾之病毒殼體亦可用於產生針對新穎殼體結構之抗體。作為另外替代方案，可將外源性胺基酸序列插入至用於抗原呈遞至細胞之經修飾之病毒殼體中，以例如用於向個體投與以產生對於外源性胺基酸序列的免疫反應。
在一些實施例中，可在投與遞送編碼多肽之核酸或所關注之功能性RNA之病毒載體之前及/或與其並行(例如彼此之數分鐘或數小時內)，投與病毒殼體以阻斷某些細胞位點。舉例而言，可遞送本發明之殼體以阻斷肝細胞上之細胞受體，且可隨後或並行投與遞送載體，該遞送載體可降低肝細胞之轉導且增強其他目標(例如骨骼肌、心肌及/或隔膜肌)之轉導。
根據一些實施例，可在如本文所描述之經修飾之病毒載體之前及/或與其並行，向個體投與經修飾之病毒殼體。此外，本發明提供組合物及醫藥調配物，其包含本發明之經修飾之病毒殼體；視情況，該組合物亦包括如本文所描述之經修飾之病毒載體。
在一些實施例中，核酸(視情況，經分離之核酸)編碼本文所描述之經修飾之病毒殼體及殼體蛋白。進一步提供包含核酸之載體及包含本文所描述之核酸及/或載體之細胞(活體內或在培養物中)。作為一個實例，病毒載體可包含：(a)如本文所描述之經修飾之AAV殼體；及(b)包含至少一個末端重複序列之核酸，其中核酸由AAV殼體包裹。
其他適合的載體包括(但不限於)病毒載體(例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、牛痘、痘病毒、桿狀病毒、慢病毒、冠狀病毒及其類似者)、質體、噬菌體、YAC、BAC及其類似者。此類核酸、載體及細胞可例如用作用於製造如本文所描述之經修飾之病毒殼體或病毒載體的試劑(例如輔助封裝構築體或封裝細胞)。
本文所描述之病毒殼體可使用此項技術中已知之任何方法，例如藉由使用桿狀病毒系統(Brown等人, (1994) Virology 198:477-488)來產生。
如本文所描述之對於AAV殼體蛋白之修飾為「選擇性」修飾。此方法與利用全部次單位或AAV血清型之間的大域交換之先前研究相反(參見例如國際專利公開案WO 00/28004及Hauck等人, (2003) J. Virology 77:2768-2774)。在一些實施例中，「選擇性」修飾產生小於或等於約20、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4或3個連續胺基酸之插入及/或取代及/或缺失。
本文所描述之經修飾之殼體蛋白及殼體可進一步包含目前已知或後續鑑別之任何其他修飾。舉例而言，AAV殼體蛋白及病毒殼體可嵌合型，此係因為其可包含來自另一病毒，視情況另一小病毒或AAV之殼體次單位之全部或一部分，例如如國際專利公開案WO 00/28004中所描述。
在一些實施例中，病毒殼體可為靶向病毒殼體，其包含引導病毒殼體與存在於所需目標組織上之細胞表面分子相互作用的靶向序列(例如經取代的或插入於病毒殼體中) (參見例如國際專利公開案WO 00/28004及Hauck等人, (2003) J. Virology 77:2768-2774)；Shi等人, Human Gene Therapy 17:353-361 (2006) [描述在AAV殼體次單位之位置520及/或584處插入整合素受體結合基元RGD]；及美國專利第7,314,912號[描述在AAV2殼體次單位之胺基酸位置447、534、573及587後插入含有RGD基元之PI肽])。AAV殼體次單位內容許插入之其他位置為此項技術中已知的(例如由Grifman等人, Molecular Therapy 3:964-975 (2001)所描述之位置449及588)。
舉例而言，如本文所描述之病毒殼體可具有針對某些所關注目標組織(例如肝、骨骼肌、心臟、隔膜肌、腎臟、大腦、胃、腸、皮膚、內皮細胞及/或肺)之相對低效向性。可宜將靶向序列併入至此等低轉導載體中，從而賦予病毒殼體所需向性及視情況針對特定組織的選擇性向性。包含靶向序列之AAV殼體蛋白、殼體及載體描述於例如國際專利公開案WO 00/28004中。作為另一實例，可將如Wang等人, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006))所描述之一或多個非天然產生之胺基酸併入至如本文所描述之AAV殼體次單位中之作為再引導低轉導載體至所需目標組織之手段的正交位點(orthogonal site)處。可宜使用此等非天然胺基酸來將所關注之分子與AAV殼體蛋白化學連接，該等所關注之分子包括(但不限於)：聚糖(靶向甘露糖-樹突狀細胞)；用於靶向遞送至特定癌細胞類型之RGD、鈴蟾素或神經肽；選自靶向特定細胞表面受體(諸如生長因子受體、整合素及其類似者)之噬菌體呈現之RNA適體或肽。
在一些實施例中，靶向序列可為引導感染特定細胞類型之病毒殼體序列(例如自主小病毒殼體序列、AAV殼體序列或任何其他病毒殼體序列)。
作為另一非限制性實例，可將肝素或硫酸乙醯肝素結合域(例如呼吸道合胞病毒肝素結合域)插入至或經取代進入通常不結合HS受體之殼體次單位(例如AAV4、AAV5)中，以賦予肝素及/或硫酸乙醯肝素與所得突變型結合。
使用紅血球糖苷脂作為其受體，B19感染原代紅血球系祖細胞(Brown等人, (1993) Science 262: 114)。B19之結構已測定為8 Å解析(Agbandje-McKenna等人, (1994) Virology 203: 106)。與紅血球糖苷脂結合之B19殼體之區已定位在胺基酸399-406之間(Chapman等人, (1993) Virology 194:419)，一種在β摺疊桶結構E與F之間的環形外區(Chipman等人, (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502)。因此，B19殼體之紅血球糖苷脂受體結合域可經取代進入AAV殼體蛋白中，以將病毒殼體或包含其之病毒載體靶向紅血球細胞。
在一些實施例中，外源性靶向序列可為編碼改變病毒殼體或包含經修飾之AAV殼體蛋白之病毒載體之向性的肽的任何胺基酸序列。在一些實施例中，靶向肽或蛋白質可為天然存在的，或可替代地完全或部分合成的。例示性靶向序列包括與細胞表面受體及醣蛋白結合之配體及其他肽，諸如ROD肽序列、緩激肽、激素、肽生長因子(例如表皮生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子I及II等)、細胞介素、黑素細胞刺激激素(例如α、β或γ)、神經肽及內啡肽及其類似者，及其保留將細胞靶向其同源受體之能力的片段。其他說明性肽及蛋白質包括P物質、角質細胞生長因子、神經肽Y、胃泌素釋放肽、介白素2、雞蛋白溶菌酶、紅血球生成素、促性腺素釋放素、皮質穩定素、β-內啡肽、leu-腦啡肽、強啡肽B (rimorphin)、α-新腦啡肽、血管緊張素、pneumadin、血管活性腸肽、神經調壓素、腸動素及其如上文所描述之片段。作為又另一替代，來自毒素(例如破傷風毒素或蛇毒素，諸如α-環蛇毒素及其類似者)之結合域可經取代進入殼體蛋白中作為靶向序列。在一些實施例中，AAV殼體蛋白可藉由將如Cleves (Current Biology 7:R318 (1997))所描述之「非經典」輸入/輸出信號肽(例如纖維母細胞生長因子-1及-2、介白素1、HIV-1 Tat蛋白、疱疹病毒VP22蛋白及其類似者)取代進入AAV殼體蛋白中來進行修飾。亦涵蓋直接由特定細胞吸收之肽基元，例如觸發肝細胞吸收之FVFLP (SEQ ID NO: 22)肽基元。
可使用噬菌體呈現技術以及此項技術中已知之其他技術來鑑別識別所關注之任何細胞類型的肽。
靶向序列可編碼靶向細胞表面結合位點(包括受體(例如蛋白質、碳水化合物、醣蛋白或蛋白聚糖))之任何肽。細胞表面結合位點之實例包括(但不限於)硫酸乙醯肝素；硫酸軟骨素及其他葡糖胺聚糖；發現於黏蛋白、醣蛋白及神經節苷脂上之唾液酸部分；MHC 1醣蛋白；發現於膜醣蛋白上之碳水化合物組分，包括甘露糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N-乙醯基-葡糖胺、岩藻糖、半乳糖；及其類似者。
在一些實施例中，硫酸乙醯肝素(HS)或肝素結合域經取代進入病毒殼體中(例如另外不與HS或肝素結合之AAV殼體中)。此項技術中已知，HS/肝素結合係由富含精胺酸及/或離胺酸之「鹼性貼片(basic patch)」介導的。在一些實施例中，可採用在基元BXXB (SEQ ID NO: 23)後之序列，其中「B」為鹼性殘基且X為中性及/或疏水性殘基。作為一非限制性實例，BXXB可為RGNR (SEQ ID NO: 24)。作為另一非限制性實例，BXXB取代原生AAV2殼體蛋白中之胺基酸位置262至265或另一AAV血清型之殼體蛋白中之對應位置處。
表7顯示適合靶向序列之其他非限制性實例。 表 7 ： 靶向序列
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HEWSYLAPYPWF 145 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
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AGLGVR 151 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
GTRQGHTMRLGVSDG 152 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
IAGLATPGWSHWLAL 153 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
SMSIARL 154 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
HTFEPGV 155 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
NTSLKRISNKR1RRK 156 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
LRIKRKRRKRKKTRK 157 Newton及Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, 第145-163頁, Springer-Verlag, Berlin (2008)
Y*為磷酸-Tyr
在一些實施例中，靶向序列可為可用於與靶向進入細胞之另一分子化學偶合的肽(例如可包含可經由其R基進行化學偶合之精胺酸及/或離胺酸殘基)。
在一些實施例中，AAV殼體蛋白或病毒殼體可包含如WO 2006/066066中所描述之突變。舉例而言，殼體蛋白可在原生AAV2殼體蛋白之胺基酸位置263、705、708及/或716處包含選擇性胺基酸取代或來自另一AAV血清型之殼體蛋白中之對應變化。
另外或或者，在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體包含緊接在AAV2殼體蛋白之胺基酸位置264後之選擇性胺基酸插入或來自其他AAV之殼體蛋白中之對應變化。藉由「緊接在胺基酸位置X後」，其意欲，插入緊跟在所指示胺基酸位置後(例如「在胺基酸位置264後」指示在位置265處之點插入或例如自位置265至268之較大插入等)。
此外，在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體可包含諸如PCT公開案第WO 2010/093784號(例如2i8)中及/或PCT公開案第WO 2014/144229號(例如雙聚糖)中所描述之胺基酸修飾。
在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體可具有相對於殼體蛋白、病毒殼體或載體所來源之AAV血清型之轉導效率等效或增強的轉導效率。在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體可具有相對於殼體蛋白、病毒殼體或載體所來源之AAV血清型之轉導效率降低的轉導效率。在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體可具有相對於殼體蛋白、病毒殼體或載體所來源之AAV血清型之向性等效或增強的向性。在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體可具有相對於殼體蛋白、病毒殼體或載體所來源之AAV血清型之向性之改變或不同的向性。在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體可具有腦組織向性或可經工程改造具有腦組織向性。在一些實施例中，殼體蛋白、病毒殼體或載體可具有肝組織向性或可經工程改造具有肝組織向性。
本文所描述之AAV載體可用於將異源核酸遞送至細胞或個體。舉例而言，經修飾之載體可用於治療溶酶體貯積病，諸如黏多糖病(例如斯利症候群(Sly syndrome) [β-葡萄糖醛酸苷酶]、賀勒侯症群(Hurler Syndrome) [α-L-艾杜糖醛酸酶]、沙伊侯症群(Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖醛酸酶]、賀勒-沙伊侯症群(Hurler-Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏症候群(Hunter's Syndrome) [艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、聖菲利波症候群(Sanfilippo Syndrome) (A [乙醯肝素硫酸醯胺酶]、B [N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶]、C [乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷乙醯基轉移酶]、D [N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶])、莫奎症候群(Morquio Syndrome) (A [半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶]、B [β-半乳糖苷酶])、馬洛特-拉米症候群(Maroteaux-Lamy Syndrome) [N-乙醯基半乳胺糖-4-硫酸酯酶]等)、法布立病(Fabry disease) (α-半乳糖苷酶)、戈謝氏病(Gaucher's disease) (葡糖腦苷脂酶)或肝醣貯積病(例如龐培氏病(Pompe disease)；溶酶體酸α-葡糖苷酶)，如本文所描述。
熟習此項技術者應瞭解，對於一些AAV殼體蛋白而言，視對應胺基酸位置是部分或完全存在於病毒中還是完全不存在而定，對應修飾將為插入及/或取代。
在一些實施例中，病毒載體包含本文所描述之經修飾之殼體蛋白及殼體。在一些實施例中，病毒載體為小病毒載體(例如包含小病毒殼體及/或載體基因組)，例如AAV載體(例如包含AAV殼體及/或載體基因組)。在一些實施例中，病毒載體包含含如本文所描述之經修飾之殼體及載體基因組的經修飾之AAV殼體。
舉例而言，在一些實施例中，病毒載體包含：(a)經修飾之病毒殼體(例如經修飾之AAV殼體)，其包含本文所描述之經修飾之殼體蛋白；及(b)核酸，其包含末端重複序列(例如AAV TR)，其中包含末端重複序列之核酸由經修飾之病毒殼體包裹。核酸可視情況包含兩個末端重複序列(例如兩個AAV TR)。
在一些實施例中，病毒載體為包含編碼所關注之多肽或功能性RNA之異源核酸的重組病毒載體。下文更詳細地描述重組病毒載體。
在一些實施例中，病毒載體(i)與無經修飾之殼體蛋白之病毒載體的轉導水準相比，具有降低的肝轉導；(ii)與無經修飾之殼體蛋白之病毒載體所觀測到的水準相比，在動物個體中呈現增強的病毒載體全身性轉導；(iii)與無經修飾之殼體蛋白之病毒載體的移動水準相比，在內皮細胞間呈現增強的移動；及/或(iv)呈現選擇性增強肌肉組織(例如骨骼肌、心肌及/或隔膜肌)之轉導；(v)呈現選擇性增強肝組織之轉導；及/或(vi)與無經修飾之殼體蛋白之病毒載體的轉導水準相比，降低的大腦組織(例如神經元)之轉導。在一些實施例中，病毒載體具有針對肝之全身性轉導。
熟習此項技術者應理解，本文所描述之經修飾之殼體蛋白、病毒殼體及病毒載體排除其原生狀態(亦即，不為突變體)在規定位置處具有指示胺基酸的彼等殼體蛋白、殼體及病毒載體。 製造病毒載體之方法
本文亦提供製造病毒載體之方法。在一些實施例中，製造避開中和抗體之AAV載體之方法包含：a)鑑別在AAV殼體蛋白上形成三維抗原足跡的接觸胺基酸殘基；b)產生包含在(a)中所鑑別之接觸胺基酸殘基之胺基酸取代的AAV殼體蛋白文庫；c)製造包含來自(b)之AAV殼體蛋白文庫之殼體蛋白的AAV粒子；d)使(c)之AAV顆粒與細胞在可藉此發生感染及複製條件下接觸；e)選擇可完成至少一個感染週期且複製至類似於對照AAV粒子之效價的AAV粒子：f)使e)中所選擇之AAV粒子與中和抗體及細胞在藉此可發生感染及複製之條件下接觸；及g)選擇不會被(f)之中和抗體中和的AAV粒子。用於鑑別接觸胺基酸殘基之方法之非限制性實例包括肽抗原決定基定位及/或低溫電子顯微法。
解析及鑑別三維抗原足跡內之抗體接觸殘基允許其隨後經由隨機、合理及/或簡併突變誘發進行之修飾，以產生可經由進一步選擇及/或篩選鑑別之避開抗體的AAV殼體。
因此，在一些實施例中，製造避開中和抗體在AAV載體之方法包含：a)鑑別在AAV殼體蛋白上形成三維抗原足跡的接觸胺基酸殘基；b)藉由隨機、合理及/或簡併突變誘發，產生包含(a)中所鑑別之接觸胺基酸殘基之胺基酸取代的AAV殼體蛋白；c)製造包含來自(b)之AAV殼體蛋白之殼體蛋白的AAV粒子；d)使(c)之AAV粒子與細胞在藉此可發生感染及複製之條件下接觸；e)選擇可完成至少一個感染週期且複製至類似於對照AAV粒子之效價的AAV粒子；f)使(e)中所選擇之AAV粒子與中和抗體及細胞在藉此可發生感染及複製之條件下接觸；及g)選擇不會被(f)之中和抗體中和的AAV粒子。
用於鑑別接觸胺基酸殘基之方法之非限制性實例包括肽抗原決定基定位及/或低溫電子顯微法。藉由隨機、合理及/或簡併突變誘發產生包含接觸胺基酸殘基之胺基酸取代之AAV殼體蛋白之方法為此項技術中已知的。
此綜合方法呈現一種可應用於修飾任何AAV殼體之平台技術。此平台技術之應用得到衍生於初始AAV殼體模板而未損失轉導效率之AAV抗原變體。作為一個優點及益處，此技術之應用將擴大符合用AAV載體進行基因療法之患者組。
在一些實施例中，製造病毒載體之方法包含向細胞提供：(a)包含至少一個TR序列(例如AAV TR序列)之核酸模板，及(b)足以複製核酸模板且包裹至AAV殼體中之AAV序列(例如編碼AAV殼體之AAV rep序列及AAV cap序列)。視情況，核酸模板進一步包含至少一種異源核酸序列。在一些實施例中，核酸模板包含兩個AAV ITR序列，其位於異源核酸序列(若存在)之5'及3'端，但其不一定與其直接相鄰。
在使得在細胞中產生包含封裝在AAV殼體內之核酸模板的病毒載體條件下，提供核酸模板及AAV rep及cap序列。方法可進一步包含自細胞採集病毒載體之步驟。可自培養基及/或藉由裂解細胞收集病毒載體。
細胞可為容許AAV病毒複製之細胞。可採用此項技術中已知之任何適合的細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。作為另一選項，細胞可為提供自複製缺陷型輔助病毒缺失之功能之反式互補封裝細胞株，例如293細胞或其他E1a反式互補細胞。
可藉由此項技術中已知之任何方法提供AAV複製及殼體序列。目前方案通常在單一質體上表現AAV rep/cap基因。AAV複製及封裝序列不一定一起提供，儘管一起提供可為適宜的。AAV rep及/或cap序列可由任何病毒或非病毒載體提供。舉例而言，rep/cap序列可由雜合腺病毒或疱疹病毒載體(例如插入至缺陷腺病毒載體之E1a或E3區中)提供。亦可採用EBV載體來表現AAV cap及rep基因。此方法之一個優點為，EBV載體為游離型，但將在連續細胞分裂期間維持高複本數(亦即，作為染色體外元件穩定地整合於細胞中，稱為「基於EBV之核游離基因體」，參見Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67)。
作為另外替代，可將rep/cap序列穩定地併入至細胞中。
通常AAV rep/cap序列將不側接TR，以防止解救及/或封裝此等序列。
可使用此項技術中已知之任何方法將核酸模板提供至細胞。舉例而言，模板可由非病毒(例如質體)或病毒載體供應。在一些實施例中，核酸模板由疱疹病毒或腺病毒載體(例如插入至缺陷腺病毒之E1a或E3區中)供應。作為另一說明，Palombo等人, (1998) J. Virology 72:5025描述攜帶側接AAV TR之報導基因的桿狀病毒載體。亦可採用EBV載體來遞送模板，如上文關於rep/cap基因所描述。
在一些實施例中，核酸模板由複製性rAAV病毒提供。在一些實施例中，包含核酸模板之AAV原病毒穩定地整合於細胞染色體中。
為了增強病毒效價，可將促進生產性AAV感染之輔助病毒功能(例如腺病毒或疱疹病毒)提供至細胞。AAV複製所必需之輔助病毒序列為此項技術中已知的。通常，此等序列將由輔助腺病毒或疱疹病毒載體提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可由另一非病毒或病毒載體提供，例如作為攜帶促進有效AAV產生之所有輔助基因之非感染性腺病毒微型質體，如Ferrari等人, (1997) Nature Med. 3: 1295及美國專利第6,040,183號與第6,093,570號所描述。
此外，輔助病毒功能可由輔助序列包埋於染色體中或維持為穩定的染色體外元件的封裝細胞提供。一般而言，輔助病毒序列不能封裝至例如不側接TR之AAV病毒粒子中。
熟習此項技術者應瞭解，在單一輔助構築體上得到AAV複製及殼體序列以及輔助病毒序列(例如腺病毒序列)可為有利的。此輔助構築體可為非病毒或病毒構築體。作為一個非限制性說明，輔助構築體可為包含AAV rep/cap基因之雜合腺病毒或雜合疱疹病毒。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列由單一腺病毒輔助載體供應。此載體另外可進一步包含核酸模板。可將AAV rep/cap序列及/或rAAV模板插入至腺病毒之缺失區(例如E1a或E3區)中。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列由單一腺病毒輔助載體供應。根據此實施例，rAAV模板可以質體模板形式提供。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列由單一腺病毒輔助載體提供，且將rAAV模板以原病毒形式整合於細胞中。或者，rAAV模板由以染色體外元件形式(例如以基於EBV之核游離基因體形式)維持在細胞內之EBV載體提供。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列由單一腺病毒輔助者提供。rAAV模板可以單獨複製病毒載體形式提供。舉例而言，rAAV模板可由rAAV粒子或第二重組腺病毒粒子提供。
根據前述方法，雜合腺病毒載體通常包含足以進行腺病毒複製及封裝之腺病毒5'及3'順式序列(亦即，腺病毒末端重複序列及PAC序列)。AAV rep/cap序列及rAAV模板((若存在)包埋於腺病毒主鏈中，且側接5'及3'順式序列，使得此等序列可封裝至腺病毒殼體中。如上文所描述，腺病毒輔助序列及AAV rep/cap序列一般不側接TR，使得此等序列不被封裝至AAV病毒粒子中。Zhang等人, ((2001) Gene Ther. 18:704-12)描述一種包含腺病毒及AAV rep及cap基因兩者之嵌合輔助者。
在AAV封裝方法中亦可將疱疹病毒用作輔助病毒。編碼AAV Rep蛋白之雜合疱疹病毒可有利地促進可調式AAV載體製造方案。已描述表現AAV-2 rep及cap基因之I型雜合單純疱疹病毒(HSV-1)載體(Conway等人, (1999) Gene Therapy 6:986 and WO 00/17377)。
作為另一替代，可使用如例如Urabe等人, (2002) Human Gene Therapy 13: 1935-43所描述之遞送rep/cap基因及rAAV模板之桿狀病毒載體，在昆蟲細胞中產生病毒載體。
可藉由此項技術中已知之任何方法得到不含雜質輔助病毒之AAV載體儲備液。舉例而言，AAV及輔助病毒可容易地根據大小來區分。亦可基於針對肝素受質之親和力，將AAV與輔助病毒分離(Zolotukhin等人(1999) Gene Therapy 6:973)。可使用缺陷複製缺陷型輔助病毒，使得任何雜質輔助病毒不為複製勝任型。作為另外替代，可採用缺乏晚期基因表現之腺病毒輔助者，因為介導AAV病毒之封裝僅需要腺病毒早期基因表現。晚期基因表現缺陷型之腺病毒突變體為此項技術中已知的(例如ts100K及ts149腺病毒突變體)。 重組病毒載體
本文所描述之病毒載體適用於活體外、離體及活體內將核酸遞送至細胞。特定言之，病毒載體可宜用於將核酸遞送或轉移至動物(包括哺乳動物)細胞。因此，在一些實施例中，核酸可由本文所描述之殼體蛋白包裹。在一些實施例中，核酸為運載核酸。在一些實施例中，運載核酸包含載體基因組(例如5' ITR、轉殖基因及3' ITR)。
病毒載體所遞送之運載核酸序列可為所關注之任何異源核酸序列。所關注核酸包括編碼多肽，包括治療性(例如用於醫學或獸醫學用途)或免疫原性(例如用於疫苗)多肽或RNA之核酸。在一些實施例中，運載核酸包含5' ITR及3' ITR。在一些實施例中，運載核酸包含5' ITR、轉殖基因及3' ITR。在一些實施例中，轉殖基因編碼治療蛋白或RNA。
治療多肽包括(但不限於)囊腫性纖維化跨膜調控蛋白(CFTR)；肌縮蛋白(包括小型及微型肌縮蛋白，參見例如Vincent等人, (1993) Nature Genetics 5: 130；美國專利公開案第2003/017131號；國際公開案WO/2008/088895，Wang等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1 3714-13719 (2000)；及Gregorevic等人, Mol. Ther. 16:657-64 (2008))；肌肉抑制素前肽；卵泡抑素；11型活化素可溶性受體；IGF-1；脂蛋白元，諸如apoA (apoA1、apoA2、apoA4、apoA-V)、apoB (apoB100、ApoB48)、apoC (apoCI、apoCII、apoCIII、apoCIV)、apoD、apoE、apoH、apoL、apo(a)；消炎多肽，諸如Ikappa B顯性突變型；澱粉樣蛋白β；tau；sarcospan；肌營養相關蛋白(Tinsley等人, (1996) Nature 384:349)；小型肌營養相關蛋白；凝血因子(例如因子VIII、因子IX、因子X等)；紅血球生成素；血管生長抑素；內皮生長抑素；過氧化氫酶；酪胺酸羥化酶；超氧化歧化酶；瘦素；LDL受體；脂蛋白脂肪酶；顆粒蛋白前體；鳥胺酸胺基甲醯轉移酶；β-血球蛋白；α-血球蛋白；血影蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；腺苷脫胺酶；次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶；β-葡糖腦苷脂酶；battenin；神經磷脂酶；溶酶體己糖苷酶A；分支鏈酮酸脫氫酶；共濟蛋白(frataxin)；RP65蛋白；細胞介素(例如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、介白素-2、介白素-4、α突觸核蛋白、帕金蛋白(parkin)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、淋巴毒素及其類似者)；肽生長因子；神經營養因子及激素(例如促生長素、胰島素、胰島素樣生長因子1及2、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、神經生長因子、神經營養因子-3及-4、腦源性神經營養因子、骨形態形成蛋白[包括RANKL及VEGF]、神經膠質衍生生長因子、轉型生長因子-α及-β及其類似者)；huntingin；溶酶體酸α-葡糖苷酶；艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；N-磺基葡糖胺磺基水解酶；α-半乳糖苷酶A；受體(例如腫瘤壞死生長因子可溶性受體)；S100A1；泛素蛋白質接合酶E3；小白蛋白；6型腺苷酸環化酶；調節鈣操縱之分子(例如SERCA 2A、PP1及其片段之抑制劑1[例如WO 2006/029319及WO 2007/100465])；影響2型G蛋白偶合受體激酶阻斷基因表現之分子，諸如截短的組成性活化bARKct；消炎因子，諸如IRAP；抗肌肉抑制素蛋白質；天冬醯轉移酶；單株抗體(包括單鏈單株抗體；例示性Mab為Herceptin ®Mab)；神經肽及其片段(例如甘丙胺素、神經肽Y (參見U.S. 7,071,172))；血管生成抑制劑，諸如Vasohibin及其他VEGF抑制劑(例如Vasohibin 2 [參見WO JP2006/073052])。其他說明性異源核酸序列編碼自殺基因產物(例如胸苷激酶、胞嘧啶脫胺酶、白喉毒素及腫瘤壞死因子)；增強或抑制宿主因子(例如與轉錄增強子或抑制子元件連接之核酸酶死亡Cas9、與轉錄增強子或抑制子元件連接之鋅指蛋白、與轉錄增強子或抑制子元件連接之轉錄活化因子樣(TAL)效應子)之轉錄的蛋白質；賦予對癌症療法中所使用之藥物之抗性的蛋白質；腫瘤抑制基因產物(例如p53、Rb、Wt-1)；TRAIL；FAS-配體；及在有需要之個體中具有治療效果的任何其他多肽。亦可使用AAV載體來遞送單株抗體及抗體片段，例如針對肌肉抑制素之抗體或抗體片段(參見例如Fang等人, Nature Biotechnology 23:584-590 (2005))。編碼多肽之異源核酸序列包括編碼報導多肽(例如酶)之彼等序列。報導多肽為此項技術中已知的，且包括(但不限於)綠色螢光蛋白、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶及氯黴素乙醯基轉移酶基因。
視情況，異源核酸編碼分泌性多肽(例如其原生狀態為分泌性多肽或已例如藉由與如此項技術中已知之分泌信號序列可操作連接而經工程改造為分泌性的多肽)。
或者，在一些實施例中，異源核酸可編碼反義核酸；核糖核酸酶(例如如美國專利第5,877,022號中所描述)；影響剪接體介導的/ram剪接的RNA (參見Puttaraju等人, (1999) Nature Biotech. 17:246；美國專利第6,013,487號；美國專利第6,083,702號)；干擾RNA (RNAi)，包括介導基因靜默之siRNA、shRNA或miRNA(參見Sharp等人, (2000) Science 287:2431)；及其他非轉譯RNA，諸如「引導」RNA (Gorman等人, (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 :4929；Yuan等人之美國專利第5,869,248號)；及其類似者。例示性非轉譯RNA包括：針對多種藥物抗性(MDR)基因產物之RNAi(例如以治療及/或預防腫瘤及/或用於向心臟投與以預防化學療法損傷)；針對肌肉抑制素之RNAi (例如用於杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy))；針對VEGF之RNAi (例如以治療及/或預防腫瘤)；針對受磷蛋白之RNAi (例如以治療心血管疾病，參見例如Andino等人, J. Gene Med. 10: 132-142 (2008)及Li等人, Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005))；受磷蛋白抑制性或顯性陰性分子，諸如受磷蛋白S16E (例如以治療心血管疾病，參見例如Hoshijima等人Nat. Med. 8:864-871 (2002))；腺苷激酶之RNAi(例如用於癲癇症)；及針對病原性生物體及病毒之RNAi (例如B及/或C型肝炎病毒、人類免疫缺乏病毒、CMV、單純疱疹病毒、人類乳頭狀瘤病毒等)。
此外，可遞送引導替代性剪接之核酸序列。舉例而言，與肌縮蛋白外顯子51之5'及/或3'剪接位點互補之反義序列(或其他抑制序列)可與U1或U7小核(sn) RNA啟動子結合遞送以誘導此外顯子之跳躍。舉例而言，包含位於反義/抑制序列之5'端之U1或U7 snRNA啟動子的DNA序列可封裝於經修飾之殼體中且遞送於該經修飾之殼體中。
在一些實施例中，可遞送引導基因編輯之核酸序列。舉例而言，核酸可編碼引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為包含crRNA序列及tracrRNA序列之單引導RNA (sgRNA)。在一些實施例中，核酸可編碼核酸酶。在一些實施例中，核酸酶為鋅指核酸酶、歸巢核酸內切酶、TALEN (轉錄活化因子樣效應物核酸酶)、NgAgo (agronaute核酸內切酶)、SGN (結構引導的核酸內切酶)或RGN (RNA引導的核酸酶)或其經修飾或截短之其體。在一些實施例中，RNA引導的核酸酶為Cas9核酸酶、Cas12(a)核酸酶(Cpf1)、Cas12b核酸酶、Cas12c核酸酶、TrpB樣核酸酶、Cas13a核酸酶(C2c2)、Cas13b核酸酶或其經修飾或截短之變體。在一些實施例中，Cas9核酸酶係自化膿性鏈球菌( S. pyogenes)或金黃色葡萄球菌( S. aureus)分離出的或來源於其。
在一些實施例中，可遞送引導阻斷基因表現之核酸序列。舉例而言，核酸序列可編碼siRNA、shRNA、微小RNA或反義核酸。病毒載體亦可包含與宿主上之基因座共通同源性且與其重組之異源核酸。舉例而言，可利用此方法來校正宿主細胞中之基因缺陷。
亦提供表現例如用於疫苗接種之免疫原性多肽的病毒載體。該核酸可編碼此項技術中已知之所關注的任何免疫原，包括(但不限於)來自以下之免疫原：人類免疫缺乏病毒(HIV)、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)、流感病毒、HIV或SIV gag蛋白、腫瘤抗原、癌症抗原、細菌抗原、病毒抗原及其類似者。
小病毒用作疫苗載體為此項技術中已知的(參見例如Miyamura el al, (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507；Young等人之美國專利第5,916,563號、Mazzara等人之美國專利第5,905,040號、美國專利第5,882,652號、Samulski等人之美國專利第5,863,541號)。抗原可存在於小病毒殼體中。
或者，可自引入至重組型載體基因組中之異源核酸表現抗原。在一些實施例中，如本文所描述及/或如此項技術中已知之所關注之任何免疫原可由本文所描述之病毒載體提。
免疫原性多肽可為適合於引發免疫反應及/或保護個體免於感染及/或疾病(包括(但不限於)微生物、細菌、原蟲、寄生蟲、真菌及/或病毒性感染及疾病)之任何多肽。舉例而言，免疫原性多肽可為正黏病毒免疫原(例如流感病毒免疫原，諸如流感病毒血球凝集素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白、或馬流感病毒免疫原)或慢病毒免疫原(例如馬感染性貧血病毒免疫原、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)免疫原或人類免疫缺乏病毒(HIV)免疫原，諸如HIV或SIV包封GP 160蛋白、HIV或SIV基質/殼體蛋白、及HIV或SIV gag、pol及env基因產物)。免疫原性多肽亦可為沙粒狀病毒免疫原(例如拉沙熱病毒(Lassa fever virus)免疫原，諸如拉沙熱病毒核殼體蛋白及拉沙熱病包封醣蛋白)、痘病毒免疫原(例如牛痘病毒免疫原，諸如牛痘LI或L8基因產物)、黃病毒免疫原(例如黃熱病病毒免疫原或日本腦炎病毒免疫原)、纖絲病毒免疫原(例如埃博拉病毒(Ebola virus)免疫原或馬堡病毒(Marburg virus)免疫原，諸如NP及GP基因產物)、布尼亞病毒(bunyavirus)免疫原(例如RVFV、CCHF及/或SFS病毒免疫原)或冠狀病毒免疫原(例如感染性人類冠狀病毒免疫原，諸如人類冠狀病毒包封醣蛋白、或豬傳染性胃腸炎病毒免疫原、或禽類感染性支氣管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽可進一步為脊髓灰質炎免疫原、疱疹免疫原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、流行性腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎等)免疫原及/或此項技術中目前已知或後續鑑別為免疫原之任何其他疫苗免疫原。
或者，免疫原性多肽可為任何腫瘤或癌症細胞抗原。視情況，腫瘤或癌症抗原表現於癌細胞表面上。
例示性癌症及腫瘤細胞抗原描述於S.A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991))中。其他說明性癌症及腫瘤抗原包括(但不限於)：BRCA1基因產物、BRCA2基因產物、gp100、酪胺酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-連環蛋白、MUM-1、半胱天冬酶-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、FRAME、p15、黑素瘤腫瘤抗原(Kawakami等人, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515；Kawakami等人, (1994) J. Exp. Med., 180:347；Kawakami等人, (1994) Cancer Res. 54:3124)、MART-1、gp100、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪胺酸酶(Brichard等人, (1993) J Exp. Med. 178:489)；HER-2/neu基因產物(美國專利第4.968.603號)、CA 125、LK26、FB5 (內皮唾酸蛋白)、TAG 72、AFP、CA 19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN (唾液酸基Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受體、乳脂球蛋白、p53腫瘤抑制蛋白(Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623)；黏蛋白抗原(國際專利公開案第WO 90/05142號)；端粒酶；核基質蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳頭狀瘤病毒抗原；及/或目前已知或後續發現與以下癌症相關之抗原：黑素瘤、腺癌瘤、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、腦癌及目前已知或後續鑑別之任何其他癌症或其惡性病狀或癌轉移(參見例如Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91)。
作為另外替代，異源核酸可編碼理想地在活體外、離體或活體內細胞中產生之任何多肽。舉例而言，可將病毒載體引入至培養細胞中且表現自其分離之基因產物。
熟習此項技術者應理解，所關注之異源核酸可與適當控制序列可操作地連接。舉例而言，異源核酸可與表現控制元件可操作地連接，該等表現控制元件諸如轉錄/轉譯控制信號、複製起點、聚腺苷酸化信號、內部核糖體進入位點(IRES)、啟動子及/或增強子，及其類似者。
此外，所關注之異源核酸之受調控表現可在轉錄後水準達成，例如藉由存在或不存在選擇性地阻斷特定位點處之剪接活性之寡核苷酸、小分子及/或其他化合物調控不同內含子的選擇性剪接(例如如WO 2006/119137中所描述)。
熟習此項技術者應瞭解，視所需水準及組織特異性表現而定，可使用各種啟動子/增強子元件。視所需表現模式而定，啟動子/增強子可為組成性或誘導性的。啟動子/增強子可為原生或外來的，且可為天然或合成序列。藉由外來，意欲轉錄起始區不存在於將轉錄起始區引入其中之野生型宿主中。
在一些實施例中，啟動子/增強子元件可為待治療之目標細胞或個體原生的。在一些實施例中，啟動子/增強子元件可為異源核酸序列原生的。一般選擇啟動子/增強子元件，使得其在所關注之目標細胞中其作用。此外，在一些實施例中，啟動子/增強子元件為哺乳動物啟動子/增強子元件。啟動子/增強子元件可為組成性或誘導性的。
誘導性表現控制元件通常在其中期望提供調控異源核酸序列該表現之彼等應用中為有利的。用於基因遞送之誘導性啟動子/增強子元件可為組織特異性或較佳的啟動子/增強子元件，且包括肌肉特異性或較佳的(包括心臟、骨骼及/或平滑肌特異性或較佳的)啟動子/增強子元件、神經組織特異性或較佳的(包括大腦特異性或較佳的)啟動子/增強子元件、眼睛特異性或較佳的(包括視網膜特異性及角膜特異性)啟動子/增強子元件、肝特異性或較佳的啟動子/增強子元件、骨髓特異性或較佳的啟動子/增強子元件、胰臟特異性或較佳的啟動子/增強子元件、脾特異性或較佳的啟動子/增強子元件及肺特異性或較佳的啟動子/增強子元件。其他誘導性啟動子/增強子元件包括激素誘導性及金屬誘導性元件。例示性誘導性啟動子/增強子元件包括(但不限於) Tet開/關元件、RU486-誘導性啟動子、蛻皮激素(ecdysone)誘導性啟動子、雷帕黴素(rapamycin)誘導性啟動子及金屬硫蛋白啟動子。
在其中在目標細胞中轉錄異源核酸序列且隨後進行轉譯之一些實施例中，一般包括用於有效轉譯所插入之蛋白質編碼序列之特異性起始信號。此等外源性轉譯控制序列(其可包括ATG起始密碼子及相鄰序列)可具有各種天然及合成起點。
本文所描述之病毒載體提供一種用於將異源核酸遞送至廣泛範圍之細胞中的手段，包括分裂及非分裂細胞。可使用病毒載體來將所關注之核酸活體外遞送至細胞，例如以活體外產生多肽或產生用於離體基因療法之多肽。病毒載體另外在將核酸遞送至有需要之個體例如以表現免疫原性或治療性多肽或功能性RNA之方法中適用。以此方式，多肽或功能性RNA可在個體中活體內產生。個體可能需要多肽，因為個體缺乏多肽。另外，可實踐該方法，因為在個體中生產多肽或功能性RNA可賦予一些有益效果。
病毒載體亦可用於在培養細胞或個體中產生所關注多肽或功能性RNA (例如，如結合篩選方法，使用個體作為生物反應器以產生多肽或觀測功能性RNA對個體之影響)。
一般而言，本文所描述之病毒載體可用於遞送編碼多肽或功能性RNA之異源核酸，以治療及/或預防遞送治療性多肽或功能性RNA對於其為有益的任何疾病病況。說明性疾病病況包括(但不限於)：囊腫性纖維化(囊腫性纖維化跨膜調控蛋白質)及其他肺病、A型血友病(因子VIII)、B型血友病(因子IX)、地中海貧血(β-血球蛋白)、貧血(紅血球生成素)及其他血液病症。阿茲海默氏病(GDF；腦啡肽酶)、多發性硬化(β-干擾素)、帕金森氏病(Parkinson's disease) (神經膠質細胞株源性神經營養因子[GDNF])、亨廷頓氏病(Huntington's disease) (移除重複序列之RNAi)、卡納萬氏病(Canavan's disease)、肌肉萎縮性側索硬化、癲癇症(甘丙胺素、神經營養因子)及其他神經病症、癌症(內皮生長抑素、血管生長抑素、TRAIL、FAS-配體、細胞介素(包括干擾素；RNAi (包括針對VEGF或多種藥物抗性基因產物之RNAi)、mir-26a [例如對於肝細胞癌])、糖尿病(胰島素)、肌肉萎縮症(包括杜興氏(Duchenne) (肌縮蛋白、小型肌縮蛋白、胰島素樣生長因子I、肌聚糖[例如α、β、γ]、針對肌肉抑制性肌肉抑制素前肽之RNAi、卵泡抑素、II型活化素可溶性受體、消炎多肽(諸如Ikappa B顯性突變型)、sarcospan、肌營養相關蛋白、小型肌營養相關蛋白、用以誘導外顯子跳躍之針對肌縮蛋白基因中之剪接接合的反義股或RNAi [參見例如WO/2003/095647]、用以誘導外顯子跳躍之針對U7 snRNA的反義股[參見例如WO/2006/021724]、及針對肌肉抑制素或肌肉抑制素前肽的抗體或抗體片段)及貝克爾(Becker)、肌緊張性營養障礙1或2、面肩胛臂肌肉萎縮症(FSHD)、戈謝病(葡糖腦苷脂酶)、賀勒氏病(Hurler's disease)(a-L-艾杜糖醛酸酶)、腺苷脫胺酶缺乏症(腺苷脫胺酶)、肝糖貯積病(例如法布立病(Fabry disease) [a-半乳糖苷酶]及龐培氏病(Pompe disease) [溶酶體酸性α-葡糖苷酶])及其他代謝障礙、先天性肺氣腫(α-1-抗胰蛋白酶)、萊尼症候群(Lesch-Nyhan Syndrome) (次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶)、尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease) (神經磷脂酶)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease) (溶酶體己糖苷酶A)、額顳葉型癡呆、楓糖尿病(Maple Syrup Urine Disease) (分支鏈酮酸脫氫酶)、視網膜退化性疾病(及其他眼睛及視網膜疾病；例如對於黃斑變性，PDGF；及/或vasohibin或VEGF之其他抑制劑或其他血管生成抑制劑，以治療/預防視網膜病症，例如在I型糖尿病中)、實體器官疾病，該等實體器官諸如大腦(包括帕金森氏病[GDNF]、星形細胞瘤[內皮生長抑素、血管生長抑素及/或針對VEGF之RNAi]、神經膠母細胞瘤[內皮生長抑素、血管生長抑素及/或針對VEGF之RNAi])、肝、腎臟、心臟(包括充血性心臟衰竭或外周動脈疾病(PAD)) (例如藉由遞送蛋白質磷酸酶抑制劑I (I-1)及其片段(例如IlC)、serca2a、調控受磷蛋白基因之鋅指蛋白、Barkct、[32-腎上腺素激導性受體、2-腎上腺素激導性受體激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小白蛋白、6型腺苷酸環化酶、影響2型G蛋白偶合受體激酶阻斷基因表現之分子(諸如截短的組成性活化bARKct；calsarcin、針對受磷蛋白之RNAi；受磷蛋白抑制性或顯性陰性分子，諸如受磷蛋白S16E等)、關節炎(胰島素樣生長因子)、接合障礙(胰島素樣生長因子1及/或2)、內膜增生(例如藉由遞送enos、inos)、提高心臟移植存活率(超氧化歧化酶)、AIDS (可溶性CD4)、肌肉萎縮(胰島素樣生長因子I)、腎臟缺陷(紅血球生成素)、貧血(紅血球生成素)、關節炎(消炎因子，諸如I RAP及TNFa可溶性受體)、肝炎(α-干擾素)、LDL受體缺乏(LDL受體)、高胺血症(鳥胺酸胺基甲醯轉移酶)、克臘伯氏病(Krabbe's disease) (半乳糖腦苷脂酶)、貝敦氏病(Batten's disease)、脊椎大腦共濟失調(包括SCA1、SCA2及SCA3)、苯酮尿症(苯丙胺酸羥化酶)、自體免疫疾病及其類似者。本文揭示之組合物及方法可進一步在器官移植之後使用，以提高移植成功率及/或減少器官移植或輔助療法之不良副作用(例如藉由投與免疫抑制劑或抑制性核酸以阻斷細胞介素產量)。作為另一實例，可伴隨同種異體骨移植投與骨形態形成蛋白(包括BNP 2、7等，RANKL及/或VEGF)，例如斷裂或癌症患者手術移除之後投與。
在一些實施例中，可使用本文所描述之病毒載體來遞送編碼多肽或功能性RNA之異源核酸，以治療及/或預防肝疾病或病症。肝疾病或病症可為例如原發性膽汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、自體免疫肝炎、B型肝炎、C型肝炎、酒精性肝疾病、纖維化、黃疸、原發性硬化性膽管炎(PSC)、布加症候群(Budd-Chiari syndrome)、血色素沈著症、威爾森氏病(Wilson's disease)、酒精性纖維化、非酒精性纖維化、肝脂肪變性、吉伯特氏症候群(Gilbert's syndrome)、膽道閉鎖、α-1-抗胰蛋白酶缺陷、艾歐吉勒症候群(alagille syndrome)、進展性家族性肝內膽汁淤積、B型血友病、遺傳性血管性水腫(HAE)、純合家族性高膽固醇血症(HoFH)、雜合家族性高膽固醇血症(HeFH)、馮吉爾克氏病(Von Gierke's Disease，GSD I)、A型血友病、甲基丙二酸酸血症、丙酸酸血症、高胱胺酸尿、苯酮尿症(PKU)、1型酪胺酸血症、精胺酸酶1缺陷、精胺丁二酸裂解酶缺陷、胺甲醯基-磷酸合成酶1缺陷、1型瓜胺酸血症、希特林蛋白(Citrin)缺陷、1型克里格勒-納賈爾症候群(Crigler-Najjar Syndrome)、胱胺酸症、法布立病、肝糖貯積病1b、LPL缺陷、N-乙醯麩胺酸合成酶缺陷、鳥胺酸胺基甲醯轉移酶缺陷、鳥胺酸移位酶缺陷、1型原發性高草酸鹽尿症或ADA SCID。
本文所描述之組合物及方法亦可用於產生誘導性多能幹細胞(iPS)。舉例而言，本文所描述之病毒載體可用於將幹細胞相關核酸遞送至非多能細胞中，該等非多能細胞諸如成年纖維母細胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、脂肪組織細胞、心臟細胞、神經細胞、上皮細胞、內皮細胞及其類似者。
編碼與幹細胞相關之因子之核酸為此項技術中已知的。此類與幹細胞及多能性幹細胞相關之因子之非限制性實例包括Oct-3/4、SOX家族(例如SOX 1、SOX2、SOX3及/或SOX 15)、Klf家族(例如Klfl、KHZ Klf4及/或Klf5)、Myc家族(例如C-myc、L-myc及/或N-myc)、NANOG及/或LIN28。
亦可實踐本文所描述之方法以治療及/或預防代謝病症，諸如糖尿病(例如胰島素)、血友病(例如因子IX或因子VIII)；溶酶體貯積病，諸如黏多糖病(例如斯利症候群(Sly syndrome) [β-葡萄糖醛酸苷酶]、賀勒侯症群[α-L-艾杜糖苷]、沙伊侯症群(Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖苷]、賀勒-沙伊侯症群(Hurler-Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖苷]、亨特氏症候群[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、聖菲利波症候群(Sanfilippo Syndrome ) A [乙醯肝素硫酸醯胺酶]、B[N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶]、C [乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷乙醯基轉移酶]、D [N-乙醯基葡糖胺6-硫酸酯酶]、莫奎症候群(Morquio Syndrome) A [半乳糖-硫酸硫酸酯酶]、B [β-半乳糖]、馬洛特-拉米症候群(Maroteaux-Lamy Syndrome) [N-乙醯基半乳胺糖-4-硫酸酯酶]等)、法布立病(α-半乳糖苷酶)、戈謝氏病(葡糖腦苷脂酶)或肝糖貯積病(例如龐培氏病；溶酶體酸α-葡糖苷酶)。
基因轉移對於瞭解疾病病況及為疾病病況提供療法具有實質性用途。存在其中已知缺陷型基因且已選殖於其中之多種遺傳性疾病。一般而言，以上疾病病況屬於兩個類別：缺乏狀態，通常酶，其一般以隱性方式遺傳；及不平衡狀態，其可涉及調控或結構蛋白且其通常以顯性方式遺傳。對於缺乏狀態疾病，可使用基因轉移來將正常基因帶至受感染組織中以供替換療法，以及以使用反義突變創建該疾病之動物模型。對於不平衡疾病病況，可使用基因轉移以在模型系統中創建疾病病況，隨後可用於抵消疾病病況。因此，如本文所描述之病毒載體准許治療及/或預防遺傳性疾病。
本文所描述之病毒載體亦可用於向活體外或活體內細胞提供功能性RNA。功能性RNA可為例如非編碼RNA。在一些實施例中，細胞中功能性RNA之表現可減輕細胞表現特定目標蛋白。因此，可投與功能性RNA以降低有需要之個體中之特定蛋白質之表現。在一些實施例中，細胞中之功能性RNA之表現可增加細胞表現特定目標蛋白。因此，可投與功能性RNA，以增加有需要之個體中之特定蛋白質之表現。在一些實施例中，功能性RNA之表現可調控細胞中之特定目標RNA之剪接。因此，可投與功能性RNA以調控有需要之個體中之剪接特定RNA。在一些實施例中，細胞中之功能性RNA之表現可調控細胞特定目標蛋白之功能。因此，可投與功能性RNA以調控有需要之個體中之特定蛋白質之功能。亦可向活體外細胞投與功能性RNA，以調控基因表現及/或細胞生理學，例如以最佳化細胞或組織培養系統或篩選方法中。
另外，如本文所描述之病毒載體可用於診斷性及篩選方法中，由此所關注之核酸在細胞培養系統或替代地轉殖基因動物模型中短暫或穩定地表現。
病毒載體亦可用於多種非治療目的，包括(但不限於)在如熟習此項技術者將顯而易見之評定基因靶向、清除、轉錄、轉譯等之方案中使用。病毒載體亦可用於評價安全性(擴散、毒性、免疫原性等)之目的。此類資料例如由美國食品與藥物管理局(the United States Food and Drug Administration)視為在評價臨床功效前之監管批准方法之一部分。
在一些實施例中，病毒載體可用於在個體中產生免疫反應。根據此實施例，可向個體投與包含編碼免疫原性多肽之異源核酸序列之病毒載體，且個體建立針對免疫原性多肽之自動免疫反應。免疫原性多肽如上文所描述。在一些實施例中，引起保護性免疫反應。
或者，可向離體細胞投與病毒載體，且向個體投與改變的細胞。將包含異源核酸之病毒載體引入至細胞中，且向個體投與細胞，其中可表現編碼免疫原之異源核酸且該異源核酸在個體中誘導針對免疫原之免疫反應。在一些實施例中，細胞為抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)。
「自動免疫反應」或「自動免疫」之特徵在於「在遭遇免疫原之後宿主組織及細胞之參與。其涉及淋巴網組織中之免疫勝任細胞之分化及增殖，此引起抗體之合成或細胞介導之反應性之出現或兩者」。Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti編, 1985)。替代地陳述，在暴露於藉由感染或藉由疫苗接種之免疫原之後，宿主建立自動免疫反應。自動免疫可與被動免疫性形成對比，該被動免疫性經由將預先形成物質(抗體、轉移因子、胸腺移植物、介白素-2)自主動免疫接種宿主轉移至非免疫宿主獲得。
如本文所用，「保護性」免疫反應或「保護性」免疫性指示免疫反應賦予個體一些益處，此係因為其預防疾病發生或降低疾病發生率。或者，保護性免疫反應或保護性免疫可適用於治療及/或預防疾病，特定而言癌症或腫瘤(例如藉由預防癌症或腫瘤形成，藉由引起癌症或腫瘤消退及/或藉由預防癌轉移及/或藉由預防轉移性節結之生長)。保護性效果可為完全或部分的，只要治療益處勝過其任何缺點即可。
在一些實施例中，可以免疫原性有效量投與包含異源核酸之病毒載體或細胞，如下文所描述。
在一些實施例中，可藉由投與表現一或多種癌細胞抗原(或免疫學上類似分子)或產生針對癌細胞之免疫反應之任何其他免疫原的病毒載體，投與病毒載體用於癌症免疫療法。舉例而言，藉由投與包含編碼癌細胞抗原之異源核酸之病毒載體，可在個體中產生針對癌細胞抗原之免疫反應，例如以治療患有癌症的患者及/或以預防在個體中發展癌症。可活體內或藉由使用如本文所描述之離體方法，向個體投與病毒載體。
或者，癌症抗原可作為病毒殼體之一部分表現或與病毒殼體(例如如上文所描述)相關。
作為另一替代，可投與此項技術中已知之任何其他治療性核酸(例如RNAi)或多肽(例如細胞介素)以治療及/或預防癌症。
如本文所用，術語「癌症」涵蓋腫瘤形成癌症。同樣，術語「癌組織」涵蓋腫瘤。「癌細胞抗原」涵蓋腫瘤抗原。
術語「癌症」具有其此項技術中所理解含義，例如具有擴散至身體遠距離部位(亦即，轉移)之潛能之不受控制生長的組織。例示性癌症包括(但不限於)黑素瘤、腺癌瘤、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、腦癌及目前已知或後續鑑別之任何其他癌症或惡性病狀。在一些實施例中，提供治療及/或預防腫瘤形成癌症之方法。
術語「腫瘤」在此項技術中亦理解為例如多細胞生物體內之異常未分化細胞塊。腫瘤可為惡性或良性的。在一些實施例中，本文所揭示之方法用於預防及治療惡性腫瘤。
藉由術語「治療癌症(treating cancer/treatment of cancer)」及等效術語，意欲癌症之嚴重程度減輕或至少部分地消除，及/或疾病進展減緩及/或受到控制，及/或使疾病穩定。在一些實施例中，此等術語指示預防或降低或至少部分地消除癌症之癌轉移，及/或預防或降低或至少部分地消除轉移性節結之生長。
藉由術語「預防癌症(prevention of cancer/preventing cancer)」及等效術語，意欲該等方法至少部分地消除癌症或降低癌症之發生率及/或嚴重程度及/或延遲癌症發作。替代地陳述，可降低個體中癌症發作之可能性或機率及/或延遲癌症發作。
在一些實施例中，可自患有癌症之個體移出細胞，且使細胞與如本文所描述之表現癌細胞抗原之病毒載體接觸。隨後，向個體投與經修飾細胞，由此引起針對癌細胞抗原之免疫反應。不能活體內建立足夠免疫反應(亦即，不能產生呈足夠量之增強抗體)之免疫功能不全個體，可宜採用此方法。
此項技術中已知，免疫反應可藉由免疫調節細胞介素(例如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、ω-干擾素、tau-干擾素、介白素-1-α、介白素-1β、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素5、介白素-6、介白素-7、介白素-8、介白素-9、介白素-10、介白素-11、介白素-12、介白素-13、介白素-14、介白素-18、B細胞生長因子、CD40配體、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、單核球化學引誘蛋白-1、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子及淋巴毒素)增強。因此，可結合病毒載體向個體投與免疫調節細胞介素(較佳地，CTL誘導性細胞介素)。細胞介素可藉由此項技術中已知之任何方法來投與。可向個體投與外源性細胞介素，或替代地可使用適合載體將編碼細胞介素之核酸遞送至個體且活體內產生細胞介素。 個體、醫藥調配物及投與模式
如本文所描述之病毒載體及殼體可用於獸醫學及醫學應用兩者中。適合的個體包括禽類及哺乳動物兩者。如本文所用，術語「禽類」包括(但不限於)雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞、野雞、鸚鵡、長尾鸚鵡及其類似者。如本文所用，術語「哺乳動物」包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、牛科動物、綿羊、山羊、馬科動物、貓科動物、犬科動物、兔類動物等。人類個體包括新生兒、嬰兒、青少年、成年及老齡個體。
在一些實施例中，個體「需要」本文所描述之方法。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含於醫藥學上可接受之載劑中之病毒載體及/或殼體及/或殼體蛋白及/或病毒粒子，及視情況，其他藥劑、醫藥劑、穩定劑、緩衝劑、載劑、佐劑、稀釋劑等。對於注射，載劑將通常為液體。對於其他投與方法，載劑可為固體或液體。對於吸入投與，載劑將為可吸入的，且視情況可呈固體或液體顆粒形式。
「醫藥學上可接受」意謂不為毒性或以其他方式非所需的材料，亦即可向個體投與該材料而不會引起任何非所需生物效應。
本文亦提供將核酸轉移至活體外細胞之方法。可根據適合特定目標細胞之標準轉導方法，依適當感染倍率將病毒載體引入至細胞中。視目標細胞類型及數目以及特定病毒載體而定，投與病毒載體之效價可以變化，且可在無需過度實驗之情況下由熟習此項技術者判定。在一些實施例中，將至少約10 3感染單位，視情況至少約10 5感染單位引入至細胞中。
將病毒載體引入其中之細胞可為任何類型，包括(但不限於)神經細胞(包括周邊及中樞神經系統之細胞，特定言之，大腦細胞，諸如神經元及寡樹突神經膠質細胞)、肺細胞、眼睛之細胞(包括視網膜細胞、視網膜色素上皮及角膜細胞)、上皮細胞(例如腸道及呼吸道上皮細胞)、肌肉細胞(例如骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞及/或隔膜肌細胞)、樹突狀細胞、胰臟細胞(包括胰島細胞)、肝細胞、心肌細胞、骨細胞(例如骨髓幹細胞)、造血幹細胞、脾細胞、角質細胞、纖維母細胞、內皮細胞、前列腺細胞、生殖細胞及其類似者。在一些實施例中，細胞可為任何前驅細胞。作為其他可能性，細胞可為幹細胞(例如神經幹細胞、肝幹細胞)。作為又另一替代，細胞可為癌症或腫瘤細胞。此外，細胞可來自任何來源物種，如上文所指示。
可出於向個體投與經修飾之細胞之目的，可將病毒載體引入至活體外細胞中。在一些實施例中，已自個體移出細胞，將病毒載體引入其中，且隨後將細胞投與回個體中。自個體移出細胞以用於離體操縱，隨後引入回個體中之方法為此項技術中已知的(參見例如美國專利第5,399,346號)。或者，可將重組病毒載體引入至來自供體個體之細胞中、引入至培養細胞中、或引入至來自任何其他適合來源之細胞中，且向有需要之個體(亦即，「受體」個體)投與該等細胞。
適合離體核酸遞送之細胞如上文所描述。向個體投與之細胞劑量將根據以下而變化：個體之年齡、病狀及物種；細胞類型；由細胞所表現之核酸；投與模式；及其類似者。通常，每劑量將投與含至少約10 2至約10 8個細胞或至少約10 3至約10 6個細胞之醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，經病毒載體轉導之細胞係與醫藥載劑組合，以治療有效量向個體投與。
在一些實施例中，將病毒載體引入至細胞中，且向個體投與該細胞以引起針對所遞送多肽(例如表現為轉殖基因或於殼體中表現)之免疫原性反應。通常，由表現免疫原性有效量之多肽的細胞量與醫藥學上可接受之載劑組合投與。「免疫原性有效量」為所表現多肽足以在向其投與醫藥調配物之個體中誘發針對多肽之自動免疫反應的量。在一些實施例中，該劑量足以產生保護性免疫反應(如上文所定義)。所賦予之保護程度不一定為完全或永久性的，只要投與免疫原性多肽之益處勝過其任何缺點即可。
因此，在一些實施例中，將核酸投與至細胞之方法包含使細胞與如本文所描述之病毒載體、病毒粒子及/或組合物接觸。
本文亦提供一種向個體投與如本文所描述之病毒載體、病毒粒子及/或病毒殼體之方法。在一些實施例中，向個體遞送核酸之方法包含向個體投與如本文所描述之病毒粒子、病毒載體及/或組合物。向有需要之人類個體或動物投與病毒載體、病毒粒子及/或殼體可藉由此項技術中已知之任何手段。視情況，以治療有效劑量遞送含病毒載體、病毒粒子及/或殼體之醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，遞送治療有效量之病毒載體、病毒粒子及/或殼體。
可進一步投與本文所描述之病毒載體及/或殼體，以引起免疫原性反應(例如作為疫苗)。通常，免疫原性組合物包含免疫原性有效量之病毒載體及/或殼體以及醫藥學上可接受之載劑。視情況，劑量足以產生保護性免疫反應(如上文所定義)。所賦予之保護程度不一定為完全或永久性的，只要投與免疫原性多肽之益處勝過其任何缺點即可。個體及免疫原如上文所描述。
向個體投與病毒載體及/或殼體之劑量視投與模式、待治療及/或預防之疾病或病狀、個別個體之病狀、特定病毒載體或殼體及所遞送之核酸及其類似者而定，且可以常規方式測定。用於達成治療效果之例示性劑量為至少約10 5、約10 6、約10 7、約10 8、約10 9、約10 10、約10 11、約10 12、約10 13、約10 14或約10 15轉導單位，視情況約10 8-10 13轉導單位之效價。在一些實施例中，AAV之劑量可為約2.0 × 10 13vg/kg個體之體重至約4.0 × 10 13vg/kg個體之體重，諸如約2.0 × 10 13vg/kg、約2.1 × 10 13vg/kg、約2.2 × 10 13vg/kg、約2.3 × 10 13vg/kg、約2.4 × 10 13vg/kg、約2.5 × 10 13vg/kg、約2.6 × 10 13vg/kg、約2.7 × 10 13vg/kg、約2.8 × 10 13vg/kg、約2.9 × 10 13vg/kg、約3.0 × 10 13vg/kg、約3.1 × 10 13vg/kg、約3.2 × 10 13vg/kg、約3.3 × 10 13vg/kg、約3.4 × 10 13vg/kg、約3.5 × 10 13vg/kg、約3.6 × 10 13vg/kg、約3.7 × 10 13vg/kg、約3.8 × 10 13vg/kg、約3.9 × 10 13vg/kg或約4.0 × 10 13vg/kg。在一些實施例中，AAV之劑量可為約2 × 10 13vg至約4.0 × 10 13vg，諸如約2.0 × 10 13vg、約2.1 × 10 13vg、約2.2 × 10 13vg、約2.3 × 10 13vg、約2.4 × 10 13vg、約2.5 × 10 13vg、約2.6 × 10 13vg、約2.7 × 10 13vg、約2.8 × 10 13vg、約2.9 × 10 13vg、約3.0 × 10 13vg、約3.1 × 10 13vg、約3.2 × 10 13vg、約3.3 × 10 13vg、約3.4 × 10 13vg、約3.5 × 10 13vg、約3.6 × 10 13vg、約3.7 × 10 13vg、約3.8 × 10 13vg、約3.9 × 10 13vg或約4.0 × 10 13vg。
在一些實施例中，可採用多於一次投與(例如兩次、三次、四次或更多次投與)來達成在各種時間間隔(例如每天一次、每週一次、每月一次、每年一次等)時段內所要程度之基因表現。
例示性投與模式包括經口、經直腸、經黏膜、鼻內、吸入(例如經由噴霧劑)、經頰(例如舌下)、經陰道、鞘內、眼內、經皮、子宮內(或在卵內)、非經腸(例如靜脈內、皮下、皮內、肌肉內[包括向骨骼、隔膜及/或心肌投與]、皮內、胸膜內、腦內及關節內)、局部(例如至皮膚及黏膜表面，包括呼吸道表面及經皮投與)、淋巴管內及其類似者，以及引導組織或器官注入(例如至肝、骨胳肌、心肌、隔膜肌或大腦)。亦可投與至腫瘤(例如在腫瘤或淋巴結中或附近)。在任何既定情況下，最適合之途徑將視所治療及/或預防之病狀之性質及嚴重程度及正使用之特定載體之性質而定。
向骨骼肌之投與包括(但不限於)向肢體(例如上臂、下臂、大腿及/或小腿)、背部、頸部、頭部(例如舌)、胸部、腹部、骨盆/會陰及/或趾中之骨骼肌投與。適合的骨骼肌包括(但不限於)小趾外展肌(手中)、小趾外展肌(腳中)、拇趾外展肌、第五趾趾骨外展肌、外展拇短肌、外展拇長肌、內收短肌、內收拇趾肌、內收長肌、內收大肌、內收拇肌、肘肌、前斜角肌、膝關節肌、肱二頭肌、股二頭肌、肱肌、肱橈肌、頰肌、喙肱肌、皺眉肌、三角肌、降口角肌、降下唇肌、二腹肌、背側骨間肌(手中)、背側骨間肌(腳中)、橈側伸腕短肌、橈側伸腕長肌、尺側伸腕肌、伸小趾肌、伸趾肌、伸趾短肌、伸趾長肌、伸拇趾短肌、伸拇趾長肌、伸食指肌、伸拇短肌、伸拇長肌、橈側腕屈肌、尺側腕屈肌、屈小趾短肌(手中)、屈小趾短肌(腳中)、屈趾短肌、屈趾長肌、屈趾深肌、屈趾淺肌、屈拇趾短肌、屈拇趾長肌、屈拇短肌、屈拇長肌、額肌、髂肋肌、頦舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、項髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、髂肌、孖下肌、下斜肌、下直肌、棘下肌、棘間肌、橫突間肌、翼外肌、外直肌、背闊肌、口角提肌、上唇提肌、上唇鼻翼提肌、上瞼提肌、肩胛骨提肌、長旋肌、頭最長肌、項最長肌、胸最長肌、頭長肌、頸長肌、蚓狀肌(手中)、蚓狀肌(腳中)、嚼肌、翼內肌、內直肌、中斜角肌、多裂肌、下頜舌骨肌、頭下斜肌、頭上斜肌、閉孔外肌、閉孔內肌、枕肌、肩舌肌、小趾對掌肌、拇對掌肌、眼輪匝肌、口輪匝肌、手掌骨間肌、掌短肌、掌長肌、恥骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨長肌、第三腓骨肌、梨狀肌、足底骨間肌、蹠肌、闊肌、膕肌、後斜角肌、旋前方肌、旋前圓肌、腰大肌、股方肌、足底方肌、頭前直肌、頭外側直肌、大頭後直肌、小頭後直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、縫匠肌、小斜角肌、半膜肌、頭半棘肌、項半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、鋸前肌、短旋肌、比目魚肌、頭棘肌、項棘肌、胸棘肌、頭夾肌、項夾肌、胸鎖乳頭肌、胸舌肌、胸盾肌、莖突舌骨肌、鎖骨下肌、肩胛下肌、孖上肌、上斜肌、上直肌、旋後肌、棘上肌、顳肌、闊筋膜張肌、大圓肌、小圓肌、胸肌(thoracis)、盾舌肌、脛前肌、脛後肌、斜方肌、肱三頭肌、股中肌、股外肌、股內肌、大顴肌及小顴肌，以及如此項技術中已知之任何其他適合的骨骼肌。
病毒載體及/或殼體可藉由靜脈內投與、動脈內投與、腹膜內投與、肢體灌注(視情況，腿及/或手臂之肢體隔離灌注；參見例如Arruda等人, (2005) Blood 105: 3458-3464)及/或直接肌肉內注射來遞送至骨骼肌。在一些實施例中，藉由肢體灌注、視情況之肢體隔離灌注(例如藉由靜脈內或關節內投與)，向個體(例如患有肌肉萎縮症，諸如杜興氏肌肉失養症(DMD)或肢帶肌肉萎縮症(LGMD)之個體)之肢體(手臂及/或腿)，投與病毒載體及/或殼體。在一些實施例中，可宜在不採用「流體動力學」技術之情況下投與病毒載體及/或殼體。現有技術載體之組織遞送(例如至肌肉)常常藉由流體動力學技術(例如以大容量進行之靜脈內/靜脈內投與)增強，該等流體動力學技術增加血管中之壓力且促進載體穿過內皮細胞障壁之能力。在一些實施例中，可在不存在流體動力學技術下投與病毒載體及/或殼體，該等流體動力學技術諸如高容量輸注及/或高血管內壓力(例如大於正常收縮壓，例如相比於正常收縮壓，血管內壓力增加小於或等於5%、10%、15%、20%、25%)。此類方法可降低或避免與流體動力學技術相關之副作用，諸如水腫、神經損傷及/或區室症候群。向心肌投與包括向左心房、右心房、左心室、右心室及/或隔膜投與。可藉由靜脈內投與、動脈內投與(諸如主動脈內投與)、直接心臟注射(例如至左心房、右心房、左心室、右心室中)及/或冠狀動脈動脈灌注，將病毒載體及/或殼體遞送至心肌。
向隔膜肌投與可藉由任何適合的方法，包括靜脈內投與、動脈內投與及/或腹膜內投與。
亦可藉由遞送包含病毒載體及/或殼體之儲槽來達成遞送至目標組織。在一些實施例中，包含病毒載體及/或殼體之儲槽被植入骨骼肌、心肌及/或隔膜肌組織中，或可使組織與包含病毒載體及/或殼體之膜或其他基質接觸。此類可植入基質或受質描述於美國專利第7,201,898號中。
在一些實施例中，向骨骼肌、隔膜肌及/或心肌投與相應病毒載體及/或病毒殼體(例如以治療及/或預防肌肉萎縮症、心臟病[例如PAD或充血性心臟衰竭])。
在一些實施例中，使用本文所描述之組合物及方法來治療及/或預防骨骼肌、心肌及/或隔膜肌之疾病或病症。肌肉之疾病或病症可為例如肌肉萎縮症、肌病變、運動神經元疾病及心肌病變。肌肉之疾病或病症可為例如抗肌萎縮蛋白病、杜興氏肌肉失養症、貝克爾肌肉萎縮症、肌緊張性營養不良(例如肌緊張性營養障礙1及2)、面肩胛臂肌肉萎縮症(FDHD)、艾德二氏肌肉萎縮症(Eimery-Dreifuss muscular dystrophy)、肢帶疾病、面肩胛臂肌肉萎縮症、眼咽肌肉萎縮症、遠端肌肉萎縮症、先天性肌肉萎縮症、幼年型黃斑變性、中央核肌病變、中央核心肌病變及包涵體肌炎。
在一些實施例中，提供一種治療及/或預防有需要之個體之肌肉萎縮症之方法，該方法包含：向哺乳動物個體投與治療或預防有效量之病毒載體，其中病毒載體包含編碼肌縮蛋白、小型肌縮蛋白、微型肌縮蛋白、肌肉抑制素前肽、卵泡抑素、II型活化素可溶性受體、IGF-1、消炎多肽(諸如Ikappa B顯性突變型、sarcospan、肌營養相關蛋白、微型肌縮蛋白、Iaminin-a2、α-肌聚糖、β-肌聚糖、γ-肌聚糖、δ-肌聚糖、IGF-1、針對肌肉抑制素或肌肉抑制素前肽之抗體或抗體片段、及/或針對肌肉抑制素之RNAi)的異源核酸。在一些實施例中，可向骨骼肌、隔膜肌及/或心肌投與病毒載體，如本文其他地方所描述。
或者，可實踐本文所描述之方法以將核酸遞送至骨骼肌、心肌或隔膜肌，該核酸用作用於生產通常在血液中循環之多肽(例如酶)或功能性RNA (例如RNAi、微小RNA、反義RNA)、或用於全身遞送至其他組織以治療及/或預防病症(例如代謝病症，諸如糖尿病[例如胰島素]、血友病[例如因子IX或因子Vlll]、黏多糖病症[例如斯利症候群、賀勒侯症群、沙伊侯症群、賀勒-沙伊侯症群、亨特氏症候群、聖菲利波症候群A、B、C、D、莫奎症候群、馬洛特-拉米症候群等]或溶酶體貯積病(諸如戈謝氏病[葡糖腦苷脂酶]或法布立病[α-半乳糖苷酶A])或肝醣貯積病(諸如龐培氏病[溶酶體酸性α葡萄糖苷酶]))的平台。本文中描述其他適合用於治療及/或預防代謝障礙之蛋白質。使用肌肉作為表現所關注核酸之平台在美國專利公開案US 2002/0192189中描述。
在一些實施例中，治療及/或預防有需要之個體之代謝病症之方法包含向個體之骨骼肌投與治療或預防有效量之病毒載體，其中病毒載體包含編碼多肽之異源核酸，其中代謝病症為多肽缺乏及/或缺陷之結果。在本文中描述說明性代謝障礙及編碼多肽之異源核酸。視情況，多肽為分泌性多肽(例如其原生狀態為分泌性多肽或已例如藉由與如此項技術中已知之分泌信號序列可操作連接而經工程改造為分泌性的多肽)。不受任何特定理論限制，根據此實施例，向骨骼肌投與可引起分泌多肽至全身循環中且遞送至目標組織。本文更詳細地描述將病毒載體遞送至骨骼肌之方法。
亦可實踐本文所描述之方法以產生用於全身遞送之非編碼RNA，諸如反義RNA、RNAi或其他功能性RNA (例如核糖核酸酶)。
在一些實施例中，治療及/或預防有需要之個體之先天性心衰竭或PAD之方法包含向哺乳動物個體投與治療或預防有效量之病毒載體，其中病毒載體包含編碼例如以下之異源核酸：肌質內質網Ca 2+-ATP酶(SERCA2a)、血管生成因子、磷酸酶抑制劑I (I-1)及其片段(例如I1C)、針對受磷蛋白之RNAi；受磷蛋白抑制性或顯性-陰性分子，諸如受磷蛋白S16E、調控受磷蛋白基因之鋅指蛋白、β-2-腎上腺素激導性受體、β-2-腎上腺素激導性受體激酶(BARK)、PI3激酶、calsarcan、β-腎上腺素激導性受體激酶抑制劑(PARKct)、蛋白質磷酸酶1之抑制劑1及其片段(例如I1 C)、S100A1、小白蛋白、6型腺苷酸環化酶、影響2型G蛋白偶合受體激酶阻斷基因表現之分子(諸如截短的組成性活化bARKct)、Pim-1、PGC-Iα、SOD-1、SOD-2、EC-SOD、激肽釋放酶、HIF、胸腺素-p4、mir-1、mir-133、mir-206、mir-208及/或mir-26a。
可注射劑可以習知形式製備，呈液體溶液或懸浮液形式或適合於在注射前在液體中形成溶液或懸浮液之固體形式或呈乳液形式。或者，吾人可局部而非全身性方式，例如以儲槽或持續釋放調配物形式投與病毒載體及/或病毒殼體。此外，可黏附於可以手術方式植入的基質來遞送病毒載體及/或病毒殼體(例如如美國專利公開案第US-2004-0013645-A1號中所描述)。
可藉由任何適合的手段，視情況藉由投與包含個體吸入之病毒載體及/或病毒殼體之可吸入粒子之噴霧劑懸浮液，向個體之肺投與本文所揭示之病毒載體及/或病毒殼體。可吸入粒子可為液體或固體。包含病毒載體及/或病毒殼體之液體粒子噴霧劑可藉由任何適合手段產生，諸如用如熟習此項技術者已知之壓力驅動的噴霧劑噴霧器或超音波噴霧器。參見例如美國專利第4,501,729號。包含病毒載體及/或殼體之固體粒子噴霧劑可同樣用任何固體粒子藥劑噴霧劑產生器藉由醫藥技術中已知之技術產生。
可向CNS組織(例如大腦、眼睛)投與病毒載體及病毒殼體，且可有利地產生比將在不存在本文所描述之組合物及方法下所觀測到的更廣泛的病毒載體或殼體分佈。
在一些實施例中，可投與本文所描述之遞送載體以治療CNS疾病，包括遺傳病症、神經變性病症、精神病症及腫瘤。說明性CNS疾病包括(但不限於)：腎上腺脊髓神經病(AMN)、阿茲海默氏病、安格爾曼氏症候群(Angelman Syndrome)、額顳葉型癡呆、帕金森氏病、亨廷頓氏病、X脆折症候群、卡納萬病、萊氏病(Leigh's disease)、雷夫蘇姆病(Refsum disease)、妥瑞氏症候群(Tourette syndrome)、原發性側索硬化、肌肉萎縮性側索硬化、進展性肌肉萎縮、匹克病(Pick's disease)、肌肉萎縮症、多發性硬化、重症肌無力、賓斯萬格氏病(Binswanger's disease)、歸因於脊髓或頭部損傷之創傷、泰-薩克斯病(GM2神經節苷脂貯積病)、萊尼病(Lesch-Nyhan disease)、MC4R肥胖症、異染性腦白質營養不良(MLD)、MPS I (賀勒/謝氏)、MPS IIIA (聖菲利波A)、尼曼匹克C1、雷特氏症候群、脊髓性肌萎縮(SMA)、AADC缺乏、單基因性肌萎縮性側索硬化(ALS)、α甘露糖苷貯積病、天冬胺醯葡萄糖胺尿症、德拉韋症候群(Dravet syndrome)、巨軸突神經病、球狀細胞腦白質營養不良(克拉培(Krabbe))、Glut 1缺乏、GM1神經節苷脂貯積病、幼稚型神經元蠟樣質脂褐質沈積(INCL，貝敦氏)、幼年型神經元蠟樣質脂褐質沈積(JNCL，貝敦氏)、晚期幼稚型神經元蠟樣質脂褐質沈積(LINCL，貝敦氏)、MPS II (亨特)、MPS IIIB (聖菲利波B)、MPS IIIC (聖菲利波C)、MPS IVA (莫奎症候群)、MPS VI (馬洛特-拉米)、過氧化體生物發生病症(澤爾韋格症候群譜系)、桑多霍夫病(GM2神經節苷脂貯積病)、癲癇症、大腦梗塞、精神病症(包括情緒障礙(例如抑鬱、雙向情感障礙、持久性情感障礙、二級情緒障礙)、精神分裂症、藥物依賴性(例如酒精中毒及其他物質依賴性)、神經症(例如焦慮、強迫症、類軀體化症精神障礙、分裂症、哀傷、產後抑鬱症)、精神病(例如幻覺及妄想)、癡呆、偏狂症、注意力不足症、性心理障礙、睡眠障礙、疼痛障礙、飲食或體重障礙(例如肥胖症、惡病體質、神經性厭食症及易餓症)及CNS癌症及腫瘤(例如垂體腫瘤)。
CNS病症包括涉及視網膜、後索及視神經之眼科病症(例如色素性視網膜炎、糖尿病性視網膜病變及其他視網膜退化性疾病、葡萄膜炎、老年性黃斑變性、青光眼)。
大部分(若並非全部)眼科疾病及病症與以下三種類型之適應症中之一或多者相關：(1)血管生成、(2)發炎及(3)變性。本文所描述之病毒載體可用於遞送抗血管生成因子；消炎因子；延緩細胞變性、促進細胞減量或促進細胞生長之因子；及前述之組合。
舉例而言，糖尿病性視網膜病變之特徵在於血管生成。糖尿病性視網膜病變可藉由眼內(例如玻璃體中)或眼周(例如中Tenon氏區下)遞送一或多種抗血管生成因子來治療。亦可眼內(例如玻璃體內)或眼周共遞送一或多種神經營養因子。
葡萄膜炎涉及發炎。可藉由眼內(例如玻璃體或前部腔室)投與遞送載體來投與一或多種消炎因子。
藉由比較，色素性視網膜炎之特徵在於視網膜變性。在一些實施例中，色素性視網膜炎可藉由眼內(例如玻璃體投與)編碼一或多種神經營養因子之遞送載體來治療。
老年性黃斑變性涉及血管生成及視網膜變性兩者。此病症可藉由眼內(例如玻璃體)投與本發明之編碼一或多種神經營養因子的遞送載體及/或眼內或眼周(例如Tenon氏區下)投與一或多種抗血管生成因子來治療。
青光眼之特徵在於眼部壓力增加及視網膜神經節細胞缺失。針對青光眼之治療包括投與保護細胞免於使用本發明之遞送載體之激發毒性損傷的一或多種神經保護劑。此類藥劑包括眼內，視情況玻璃體內遞送之N-甲基-D-天冬胺酸(NMDA)拮抗劑、細胞介素及神經營養因子。
在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於治療癲癇，例如以降低癲癇發作、癲癇之發生率或嚴重程度。癲癇之治療性治療之功效可藉由行為(例如眼睛或口部之振顫、滴落(ticks))及/或電子圖手段(大部分癲癇具有標誌性電子圖異常)來評定。因此，亦可治療癲癇，其特徵為隨著時間推移多次發生癲癇。
在一些實施例中，治療有需要之個體之方法包含向個體投與包含殼體蛋白之AAV載體，其中殼體蛋白包含SEQ ID NO: 165-187中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，AAV載體包含含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列或與其至少95%一致之序列的殼體蛋白。在一些實施例中，AAV載體包含含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列或與其至少95%一致之序列的殼體蛋白。在一些實施例中，個體患有德拉韋症候群。在一些實施例中，個體患有雷特氏症候群(Rett syndrome)。在一些實施例中，個體患有安格爾曼氏症候群(Angelman syndrome)。在一些實施例中，個體患有尼曼-匹克病。在一些實施例中，個體患有X脆折症候群。在一些實施例中，個體患有阿茲海默氏症。在一些實施例中，個體患有戈謝氏病。在一些實施例中，個體患有亨廷頓氏病。在一些實施例中，個體患有帕金森氏病。在一些實施例中，個體患有弗里德希氏運動失調(Friedrich's ataxia)。在一些實施例中，藉由腦室內(ICV)注射，向個體投與AAV載體。在一些實施例中，藉由鞘內(IT)注射，向個體投與AAV載體。在一些實施例中，藉由靜脈內(IV)注射，向個體投與AAV載體。
在一些實施例中，治療有需要之個體之方法包含向個體投與包含殼體蛋白之AAV載體，其中殼體蛋白包含SEQ ID NO: 175或180之胺基酸序列，其中個體患有德拉韋症候群、雷特氏症候群、安格爾曼氏症候群、尼曼-匹克疾病或X脆折症候群，且其中藉由ICV或IT注射向個體投與AAV載體。
在一些實施例中，治療有需要之個體之方法包含向個體投與包含殼體蛋白之AAV載體，其中殼體蛋白包含SEQ ID NO: 175或180之胺基酸序列，其中個體患有戈謝氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病或弗里德希氏運動失調，且其中藉由ICV或IT注射向個體投與AAV載體。
在一些實施例中，使用遞送載體向大腦投與生長抑素(或其活性片段)，以治療垂體腫瘤。根據此實施例，藉由微輸注至垂體中，投與編碼生長抑素(或其活性片段)之遞送載體。同樣，此類治療可用於治療肢端肥大症(自垂體之異常生長激素分泌)。生長抑素之核酸(例如Genbank寄存編號J00306)及胺基酸(例如Genbank寄存編號P01166；含有經處理之活性肽生長抑素-28及生長抑素-14)序列為此項技術中已知的。
在一些實施例中，載體可包含如美國專利第7,071,172號中所描述之分泌信號。
在一些實施例中，向CNS (例如向大腦或向眼睛)投與病毒載體及/或病毒殼體。可將病毒載體及/或殼體引入至以下中：脊髓、腦幹(延髓、腦橋)、中腦(下丘腦、丘腦、上丘腦、腦下腺、黑質、松果體腺)、小腦、端腦(紋狀體；大腦，包括枕骨、顳葉、腔壁及前葉、皮質、基底神經節、海馬區及杏仁核門(portaamygdala))、邊緣系統、新皮質、紋狀體、大腦及下丘。亦可向眼睛之不同區(諸如視網膜、角膜及/或視神經)投與病毒載體及/或殼體。
可將病毒載體及/或殼體遞送至腦脊髓液(例如藉由腰椎穿刺)中，以用於更分散投與遞送載體。在其中已擾動血腦障壁之情況下(例如腦瘤或大腦梗塞)，可進一步向CNS血管內投與病毒載體及/或殼體。
可藉由此項技術中已知之任何途徑，向CNS之所需區投與病毒載體及/或殼體，該途徑包括(但不限於)鞘內、眼內、腦內、心室內、靜脈內(例如在糖(諸如甘露醇)存在下)、鼻內、耳內、眼內(例如玻璃體內、視網膜下、前部腔室)及眼周(例如Tenon氏區下)遞送以及伴隨逆行遞送至運動神經元之肌肉內遞送。在一些實施例中，藉由直接注射(例如立體定向注射)至CNS中之所需區或區室，以液體調配物形式投與病毒載體及/或殼體。在一些實施例中，可藉由局部施用至所需區或藉由鼻內投與噴霧劑調配物，來提供病毒載體及/或殼體。可藉由局部施用液滴來投與至眼睛。作為另外替代，可投與呈固體緩釋調配物形式之病毒載體及/或殼體(參見例如美國專利第7,201,898號)。
在一些實施例中，病毒載體可用於逆行運輸以治療及/或預防涉及運動神經元之疾病及病症(例如肌肉萎縮性側索硬化(ALS)；脊髓性肌萎縮(SMA)等)。舉例而言，可將病毒載體遞送至肌肉組織，病毒載體可自該肌肉組織遷移至神經元中。 能夠位於大腦之不同區域之重組AAV
在不同的直接CNS給藥途徑之後在小鼠及NHP模型中表徵封裝不同單股(single strand；ss)及自身互補(self-complementary；sc)報導轉殖基因卡匣之AAV-STRD.101。首先，直接雙側注射至新生P1小鼠中之腦室(ICV)中顯示與AAV9類似的載體基因體複本數(VCN)，其中神經元轉導主要係自吻端至尾端區域。在吻端區域中觀測到最高VCN，其中朝向尾端區域逐漸降低(~1至2-log降低)。
當相較於單獨雙側ICV時，P5小鼠中評估不同劑量及體積之雙重投與途徑雙側ICV及大池內(ICM)顯示尾端以及較深大腦區域中之VCN增加。接著吾人在NHP中獨立地評估兩種投與途徑腦室內(ICV)及大池內(ICM)。此等研究揭露，相較於ICV途徑，AAV-STRD.101在ICM注射後與AAV9一樣有效地擴散。儘管不同大腦區域中之VCN一般相當，但藉由ELISA對蛋白質表現進行之定量顯示，相較於AAV9載體，AAV-STRD.101在運動前區皮質中增加5倍且在小腦中增加10倍。
此外，使用細胞標記NeuN及mCherry抗體之雙重免疫組織化學，吾人顯示與運動前區皮質、海馬及丘腦中mCherry表現共定位之NeuN之陽性細胞數目顯著變化。在AAV-STRD.101之情況下，使用Zeiss成像軟體進行之初始定量顯示~26%之NeuN陽性細胞。
因此，在一些實施例中，本文所揭示之AAV載體將運載核酸選擇性地遞送至大腦或其區域中。在一些實施例中，大腦之區域為吻端(rostral)區域、尾端(caudal)區域、運動前區皮質及/或小腦。在一些實施例中，本文所揭示之AAV載體能夠在運動前區皮質及/或小腦中表現運載核酸。在一些實施例中，相較於野生型AAV9載體，本文揭示之AAV載體能夠在運動前區皮質及/或小腦中表現較高含量之運載核酸。在一些實施例中，AAV載體能夠在有絲分裂後神經元中表現運載核酸。在一些實施例中，相較於野生型AAV9，AAV載體能夠在有絲分裂後神經元中表現較高含量之運載核酸。在一些實施例中，有絲分裂後神經元為NeuN陽性細胞。
在一些實施例中，本文揭示之AAV載體係經由腦室內(ICV)注射(例如雙側ICV注射)、大池內(ICM)注射、腰椎穿刺注射或其任何組合投與。在一些實施例中，經由腦室內(ICV)注射及/或大池內(ICM)注射將治療有效量之本文所揭示之AAV載體投與至個體。在一些實施例中，運載核酸在個體之運動前區皮質及/或小腦中表現。在一些實施例中，相較於投與包含運載核酸之野生型AAV9載體之對照個體，運載核酸在個體之運動前區皮質及/或小腦中之表現量較高。在一些實施例中，運載核酸在個體之有絲分裂後神經元中表現。在一些實施例中，相較於投與包含運載核酸之野生型AAV9載體之對照個體，運載核酸在個體之有絲分裂後神經元中之表現量較高。 編號實施例
不管隨附申請專利範圍，本發明闡述以下編號實施例：
1.一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含具有SEQ ID NO: 12-20中之任一者之序列的肽。
2.如實施例1之AAV載體，其中該運載核酸包含5'及3' AAV反向末端重複序列。
3.如實施例1或2之AAV載體，其中該運載核酸包含轉殖基因。
4.如實施例3之AAV載體，其中該轉殖基因編碼治療蛋白或RNA。
5.如實施例1至4中任一項之AAV載體，其中該重組殼體蛋白與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV殼體具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
6.如實施例5之AAV載體，其中該重組殼體蛋白與該AAV9殼體之原生序列具有至少90%序列一致性。
7.如實施例1至6中任一項之AAV載體，其中該肽係位於對應於原生AAV9殼體之胺基酸451-458或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置處，且其中該肽係選自SEQ ID NO: 12-18中之任一者。
8.如實施例1至6中任一項之AAV載體，其中該肽係位於對應於原生AAV9殼體之胺基酸587-594或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置處，且其中該肽係選自SEQ ID NO: 19或20。
9.如實施例1之AAV載體，其中該重組殼體蛋白包含：a)第一肽，其具有SEQ ID NO: 12-18中之任一者之序列；及b)第二肽，其具有SEQ ID NO: 19-20中之任一者之序列。
10.如實施例9之AAV載體，其中該第一肽係在胺基酸位置451-458處，且該第二肽係在胺基酸587-594處，其中胺基酸編號係基於原生AAV9殼體或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基。
11.如實施例1至10中任一項之AAV載體，其中該肽抑制至少一種抗體與該殼體蛋白之結合。
12.如實施例11之AAV載體，其中該肽抑制該AAV載體之感染性被該抗體中和。
13.如實施例1至12中任一項之AAV載體，其中該肽選擇性地與表現於中樞神經系統(CNS)中之細胞表面上之受體結合。
14.如實施例13之AAV載體，其中該細胞係在運動前區皮質、丘腦、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節中。
15.如實施例1至14中任一項之AAV載體，其中該肽選擇性地與表現於心臟中之細胞表面上之受體結合。
16.如實施例1至15中任一項之AAV載體，其中該殼體蛋白進一步包含修飾該殼體之HI環之肽。
17.一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在該原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸451-458處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於該原生AAV9殼體蛋白序列中。
18.如實施例17之AAV載體，其中X 1不為I，X 2不為N，X 3不為G，X 4不為S，X 5不為G，X 6不為Q，X 7不為N，及/或X 8不為Q。
19.如實施例18之AAV載體，其中X 1為S、F、Q、G、K或R。
20.如實施例18或19之AAV載體，其中X 2為C、G、R、D、T或Q。
21.如實施例18至20中任一項之AAV載體，其中X 3為Q、V、G、Y、R、F或D。
22.如實施例18至21中任一項之AAV載體，其中X 4為P、Q、A或R。
23.如實施例18至22中任一項之AAV載體，其中X 5為T、N、A、P或I。
24.如實施例18至23中任一項之AAV載體，其中X 6為V、Q、A或I。
25.如實施例18至24中任一項之AAV載體，其中X 7為M、P、R、Q或N。
26.如實施例18至25中任一項之AAV載體，其中X 8為N、L、F、E、H或A。
27.如實施例17之AAV載體，其中X 1為S，X 2為C，X 3為Q，X 4為P，X 5為T，X 6為V，X 7為M，及X 8為N。
28.如實施例17之AAV載體，其中X 1為F，X 2為G，X 3為V，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。
29.如實施例17之AAV載體，其中X 1為Q，X 2為R，X 3為G，X 4為Q，X 5為A，X 6為A，X 7為P，及X 8為F。
30.如實施例17之AAV載體，其中X 1為G，X 2為D，X 3為Y，X 4為A，X 5為P，X 6為I，X 7為R，及X 8為E。
31.如實施例17之AAV載體，其中X 1為K，X 2為T，X 3為R，X 4為R，X 5為I，X 6為V，X 7為Q，及X 8為H。
32.如實施例17之AAV載體，其中X 1為F，X 2為G，X 3為F，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。
33.如實施例17之AAV載體，其中X 1為R，X 2為Q，X 3為D，X 4為Q，X 5為P，X 6為I，X 7為N，及X 8為A。
34.一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在該原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸587-594處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於該原生AAV9殼體蛋白序列中。
35.如實施例34之AAV載體，其中X 1不為A，X 2不為Q、X 3不為A，X 4不為Q，X 5不為A，X 6不為Q，X 7不為T，及/或X 8不為G。
36.如實施例35之AAV載體，其中X 1為S。
37.如實施例35或36之AAV載體，其中X 2為K或T。
38.如實施例35至37中任一項之AAV載體，其中X 3為V。
39.如實施例35至38中任一項之AAV載體，其中X 4為E或D。
40.如實施例35至39中任一項之AAV載體，其中X 5為S。
41.如實施例35至40中任一項之AAV載體，其中X 6為W或I。
42.如實施例35至41中任一項之AAV載體，其中X 7為T或A。
43.如實施例35至42中任一項之AAV載體，其中X 8為E或I。
44.如實施例34之AAV載體，其中X 1為S，X 2為K，X 3為V，X 4為E，X 5為S，X 6為W，X 7為T，及X 8為E。
45.如實施例34之AAV載體，其中X 1為S，X 2為T，X 3為V，X 4為D，X 5為S，X 6為I，X 7為A，及X 8為I。
46.一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含與SEQ ID NO: 165-187中之任一者至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。
47.如實施例46之AAV載體，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 165-187中之任一者之胺基酸序列。
48.如實施例47之AAV載體，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列。
49.如實施例47之AAV載體，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列。
50.如實施例46至49中任一項之AAV載體，其中該AAV載體將該運載核酸選擇性地遞送至該中樞神經系統之細胞或組織。
51.如實施例50之AAV載體，其中該中樞神經系統組織為運動前區皮質、丘腦、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節。
52.如實施例46至49中任一項之AAV載體，其中該AAV載體將該運載核酸遞送至大腦，但不將該AAV載體遞送至心臟。
53.如實施例46至49中任一項之AAV載體，其中該AAV載體將該運載核酸遞送至大腦及遞送至心臟。
54.如實施例53之AAV載體，其中遞送至大腦之運載核酸遞高於遞送至心臟之運載核酸。
55.如實施例53之AAV載體，其中遞送至大腦之運載核酸與遞送至心臟之運載核酸大致相等。
56.一種核酸序列，其編碼如實施例1至55中任一項之AAV載體之重組殼體蛋白。
57.如實施例56之核酸序列，其中該核酸序列為DNA序列。
58.如實施例56之核酸序列，其中該核酸序列為RNA序列。
59.一種表現載體，其包含如實施例56至58中任一項之核酸序列。
60.一種細胞，其包含如實施例56至58中任一項之核酸序列。
61.一種細胞，其包含如實施例59之表現載體。
62.一種醫藥組合物，其包含如實施例1至55中任一項之AAV載體。
63.如實施例62之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
64.一種醫藥組合物，其包含如實施例60或61之細胞。
65.如實施例64之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
66.一種治療有需要之個體之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如實施例1至55中任一項之AAV載體。
67.如實施例66之方法，其中該個體患有中樞神經系統疾病或病症。
68.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為德拉韋症候群。
69.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為雷特氏症候群。
70.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為安格爾曼氏症候群。
71.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為尼曼-匹克病。
72.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為X脆折症候群。
73.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為戈謝氏病。
74.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為亨廷頓氏病。
75.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為帕金森氏病。
76.如實施例67之方法，其中該中樞神經系統疾病或病症為弗里德希氏運動失調。
77.如實施例66至76中任一項之方法，其中AAV載體包含殼體蛋白，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 165-187中之任一者之胺基酸序列。
78.如實施例66至76中任一項之方法，其中AAV載體包含殼體蛋白，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列。
79.如實施例66至76中任一項之方法，其中AAV載體包含殼體蛋白，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列。
80.如實施例66至79中任一項之方法，其中該AAV載體係藉由腦室內(ICV)注射向該個體投與。
81.如實施例66至79中任一項之方法，其中該AAV載體係藉由鞘內(IT)注射向該個體投與。
82.如實施例66至79中任一項之方法，其中該AAV載體係藉由靜脈內(IV)注射向該個體投與。
83.如實施例66至82中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
84.如實施例83之方法，其中該個體為人類。
85.一種將核酸分子引入至細胞中之活體外方法，其包含使該細胞與如實施例1至55中任一項之AAV載體接觸。
86.一種如實施例1至55中任一項之AAV載體，其用作藥劑。
87.一種如實施例1至55中任一項之AAV載體，其用於治療有需要之個體之方法中。
88.一種如實施例1至55中任一項之AAV載體，其用於治療或預防有需要之個體之CNS疾病或病症之方法中。 實例
僅出於說明之目的在本文中包括之以下實例並不意欲為限制性的。如本文所用，術語STRD.101及STRD.102用於描述殼體蛋白序列，且AAV-STRD.101及AAV-STRD.102用於描述包含該等殼體蛋白之AAV載體。然而，術語STRD.101及STRD.102可在一些情況下用於描述包含所提及殼體之AAV載體，如對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。 實例1. 組合性工程改造及選擇避開抗體之AAV載體
用於產生避開抗體之AAV突變體之方法如下。第一步驟涉及例如使用低溫電子顯微法鑑別AAV殼體表面上之構形3D抗原抗原決定基。隨後，使用簡併引子，使抗原基元內之所選擇殘基經受突變誘發，其中各密碼子經核苷酸NNK取代且基因片段藉由Gibson組裝及/或多步PCR組合在一起。將含有突變型抗原基元簡併文庫之編碼殼體之基因選殖至野生型AAV基因組中，以置換初始編碼Cap之DNA序列，得到質體文庫。隨後，利用腺病毒輔助質體，將質體文庫轉染至293生產細胞株中，以產生AAV殼體文庫，該等AAV殼體文庫隨後可經受選擇。經由DNA定序確認成功產生AAV文庫。
為了選擇可避開中和抗體(NAb)及/或靶向中樞神經系統(CNS)之新穎AAV株系，使AAV文庫在非人類靈長類動物中經受多輪感染。在每一階段，自動物個體分離所關注之組織。對自所關注組織收穫之細胞裂解物進行定序，以鑑別避開抗體中和之AAV分離株。在非人類靈長類動物中多輪感染之後，將自各突變誘發區分離之序列以所有排列及組合方式組合。
作為一特定實例，使AAV殼體蛋白上之常用抗原基元(VP1)經受如上文所描述之突變誘發。隨後，使簡併文庫(圖1A)在非人類靈長類中經受第一輪感染(靜脈內注射)。在感染後第7天收穫組織且進行定序，以鑑別單一AAV分離株。
鑑別包括以下之組織樣本中之各種重組AAV分離株：脊髓、背根神經節、額葉、顳葉、枕骨葉、殼、蒼白球、丘腦、扁桃體、海馬區、黑質、腦橋、小腦、髓質。此第一輪進化之結果顯示於圖1B中。
隨後，將在第一輪進化期間所分離之重組AAV (圖1B)再引入至第二非人類靈長類中。在感染後第7天收穫組織且進行定序，以鑑別單一AAV分離株。此第二輪進化之結果顯示於圖1C中。
對最高頻率之重組AAV進行定序。存在於此等AAV中之取代顯示於表6.1及6.2中。此等資料表明，具有包含表6.1及6.2中所列舉之取代之殼體蛋白的重組AAV病毒粒子活體內避開非人類靈長類動物中的中和抗體且具有針對所需目標組織的向性。 實例 2 ： 重組 AAV 載體 之可製造性
為了判定實例1中所鑑別之各種重組AAV是否可以大規模系統製造，根據標準方法製造AAV，且將產量與野生型AAV載體之產量進行比較。
根據標準三重轉染方案，在HEK293細胞中生產AAV。簡言之，用以下轉染細胞：(i)包含野生型AAV9殼體序列、STRD.101殼體變體序列(SEQ ID NO: 180)或STRD.102殼體變體序列(SEQ ID NO: 175)的質體；(ii)包含5'ITR、轉殖基因及3' ITR序列的質體；及(iii)包含AAV生產必需之輔助基因的質體。在自身互補型構築體中，將兩個不同轉殖基因與各殼體一起使用。隨後，使細胞裂解，且使用親和管柱、CsCl密度超速離心及透析純化病毒粒子。隨後，使用基於PCR之定量方法來量測各AAV之產量。
如圖2中所示，包含STRD.101及STRD.102殼體之重組AAV載體具有與野生型AAV9之產量類似的產量。此資料確認，包含重組殼體蛋白之重組AAV適合於商業製造。 實例 3 ： 使用重組 AAV 病毒載體進行活體外轉導
為了確認實例1之重組AAV載體是否一般為感染性的且能夠轉導培養物中之細胞，根據標準方案製備各種AAV載體。
使用標準TCID50分析，測試重組AAV之感染性。簡言之，在腺病毒(Ad5)存在下，以跨越5個數量級之劑量，用重組AAV粒子感染HeLaRC32細胞。在72小時之後，提取DNA，且藉由qPCR量化載體基因組複製。
計算粒子:感染性比率以測定感染性。如圖3中所示，相較於野生型AAV9之感染性比率，AAV-STRD.101載體之感染性比率更低。因為更低感染性比率轉化為更高效能，所以AAV-STRD.101比野生型AAV9更具感染性。
單獨地，亦測定在各種細胞株中之感染性。產生封裝螢光素酶轉殖基因之重組AAV，且以每個細胞10,000載體基因組(vg)之劑量，使其與在培養物中之細胞接觸。感染48小時後，裂解細胞。使裂解物與生物發光受質接觸，且量測相對螢光單位(RFU)。如圖4A-4D中所示，AAV-STRD.101載體以與野生型AAV9相當之水準感染U87細胞(人類神經膠母細胞瘤細胞株，圖4A)、N2A細胞(小鼠神經脊源性細胞株，圖4B)、SY5Y細胞(人類神經母細胞瘤細胞株，圖4C)及U2OS細胞(人類骨肉瘤細胞株，圖4D)。
因此，此資料表明，實例1之重組AAV載體可有效地轉導培養物中之細胞。 實例 4 ： 靶向中樞神經系統之重組 AAV 之活體內特徵
選擇兩種重組殼體蛋白STRD.101及STRD.102以進行活體內表徵。產生包含此等殼體蛋白且封裝天然tdTomato螢光轉殖基因之重組AAV。在第0天，藉由腦室內注射，向新生小鼠投與重組AAV。在注射三週後，收穫大腦組織且固定，以藉由視覺評定tdTomato螢光來評價表現。圖5提供顯示用4% PFA固定24小時後冠狀面振盪切片機切片中之tdTomato表現的代表性影像。亦使用免疫組織化學觀測此等相同切片(圖6)。如圖5及圖6之影像中所示，AAV9、AAV-STRD.102及AAV-STRD.101載體在大腦組織中各自具有不同分佈，其中最高轉殖基因表現位於注射位點附近。總之，此資料顯示，在腦室內注射之後，所測試之重組AAV成功地將轉殖基因活體內遞送至目標細胞。
亦藉由靜脈內注射，以5.5 × 10 13vg/kg之劑量，向四隻成年小鼠投與封裝tdTomato之AAV-STRD.101及AAV-STRD.102載體。注射三週後，收穫肝及心臟且固定，以藉由視覺評定tdTomato螢光來評價表現圖譜。
在圖7中提供顯示在用4% PFA固定24小時後振盪切片機肝切片中之TdTomato表現之來自一隻小鼠的代表性影像。值得注意的是，相較於野生型AAV9，對於肝，AAV-STRD.102及AAV-STRD.101載體脫靶。由於在進化期間未進行肝臟中反篩選，此所需特性為出人意料的。
在圖8中提供顯示在用4% PFA固定24小時後振盪切片機心臟切片中之TdTomato表現之來自一隻小鼠的代表性影像。值得注意的是，所測試載體具有不同的心臟向性。具體言之，相較於AAV-STRD.101，AAV-STRD.102載體在心臟中具有較低感染性。因為在進化期間未進行心臟篩選，此差異性轉導為完全出人意料的。
總之，此資料指示，AAV-STRD.102及AAV-STRD.101載體可成功地用於活體內靶向CNS組織，避免被肝清除，且為基因療法之強力工具。鑒於其不同向性(亦即，在心臟中，AAV-STRD.101比AAV-STRD.102更具感染性)，此等載體將為將基因療法治療靶向特定所需組織的強力工具。 實例 5 ： 非人類靈長類動物中之重組 AAV 之生物分佈
向非人類靈長類動物投與重組AAV，以便測定生物分佈。藉由靜脈內(IV)及腦血管內(ICV)注射，投與重組AAV (圖9)。藉由IV注射以2.9 × 10 13vg/kg之劑量，及藉由ICV注射以2.1 × 10 13vg之劑量，投與AAV-STRD.101 (黑色圓點)。藉由IV注射以2.8 × 10 13vg/kg之劑量，及藉由ICV注射以3.0 × 10 13vg之劑量，投與AAV-STRD.102 (白色圓點)。在30天之後，處死動物，且藉由qPCR來量測各種CNS組織中之病毒負荷。
如圖9中所示，AAV-STRD.102及AAV-STRD.101兩者均感染各種CNS組織。另外，因為AAV顯示高水準之轉導，此資料表明，此等AAV有可能避免活體內中和AAV。 實例 6 ： 用於治療有需要之個體之細胞治療方法
使用AAV載體離體轉導細胞。出於一些目的，細胞可為自體(亦即，來源於待治療之個體)或同種異體(亦即，來源於不同個體/供體)的。在使用AAV轉導細胞之後，及在已驗證轉殖基因之表現之後，使用標準臨床方法向個體投與細胞。
可向個體投與細胞一次，或可以治療有效時間間隔多次重複投與。所投與之細胞數目根據例如待治療之疾病或病狀、個體疾病/病況之嚴重程度及個體之身高與體重而變化。 實例 7 ： 用於治療有需要之個體之基因治療方法
向有需要之個體投與本文所描述之AAV載體(例如包含具有SEQ ID NO: 175或180之序列之殼體的AAV載體)，其中個體患有CNS疾病或病症。向個體投與AAV載體一次，或可以治療有效時間間隔多次重複投與。投與係藉由一或多種治療有效途徑，諸如靜脈內(IV)、腦室內(ICV)或鞘內(IT)注射。AAV載體之劑量根據例如待治療之疾病或病狀、個體疾病/病況之嚴重程度及個體之身高與體重而變化。舉例而言，當藉由IV注射投與AAV載體時，向個體所投與之AAV之劑量可為2.8 × 10 13vg/kg或2.9 × 10 13vg/kg。當藉由ICV注射投與AAV載體時，劑量可為2.1 × 10 13vg或3.0 × 10 13vg。在一些方案中，可藉由IV及ICV注射兩者向個體投與AAV載體。 實例8：重組AAV在大腦之不同區域中之分佈
在不同的直接CNS給藥途徑之後在小鼠及NHP模型中表徵封裝不同單股(ss)及自身互補(sc)報導轉殖基因卡匣之AAV-STRD.101。首先，直接雙側注射至新生P1小鼠中之腦室(ICV)中顯示與AAV9類似的載體基因體複本數(VCN)，其中神經元轉導主要係自吻端至尾端區域(圖15A至圖15C，及圖16A至圖16C)。在吻端區域中觀測到最高VCN，其中朝向尾端區域逐漸降低(~1至2-log降低)。
當相較於單獨雙側ICV時，P5小鼠中評估不同劑量及體積之雙重投與途徑雙側ICV及大池內(ICM)顯示尾端以及較深大腦區域中之VCN增加。
接著吾人在NHP中獨立地評估兩種投與途徑腦室內(ICV)及大池內(ICM)。此等研究揭露，相較於ICV途徑，AAV-STRD.101在ICM注射後與AAV9一樣有效地擴散。儘管不同大腦區域中之VCN一般相當，但藉由ELISA對蛋白質表現進行之定量顯示，相較於AAV9載體，AAV-STRD.101在運動前區皮質中增加5倍且在小腦中增加10倍(圖17A至圖17B及圖18A至圖18B)。
星形膠質細胞與神經元轉導之比率的劇烈變化亦見於AAV-STRD.101。AAV-STRD.101轉導神經元比星形膠質細胞至更大程度，而AAV9轉導星形膠質細胞及神經元兩者(圖19)。
在給藥後第21+4天(組1及2)或第15天(組3)提交所有動物以用於屍體剖檢。進行屍體剖檢，且由測試機構人員收集器官重量。對顯微評估所需組織進行修整，常規地加工，包埋於石蠟中，且用蘇木精及伊紅染色。對組1及2之組織進行針對血球凝集素及mCherry主要目標之免疫組織化學染色，且對於組3之組織進行mCherry染色。由委員會認證之獸醫病理學家對所有組之所有動物之所有方案指定組織進行顯微評估。藉由光學顯微術評估組織。
使用細胞標記NeuN及mCherry抗體之雙重免疫組織化學，可見與運動前區皮質、海馬及丘腦中之mCherry表現共定位之NeuN之陽性細胞之數目顯著變化。在AAV-STRD.101之情況下，使用Zeiss成像軟體進行之初始定量顯示~26%之NeuN陽性細胞。如圖20中所示，在所偵測到之132,193個細胞中，約26%之DAB陽性細胞亦為NeuN陽性。 實例9：在雙重投與途徑於PN5新生兒中後，AAV-STRD.101之改良的擴散及轉導概況；且較高體積影響在雙重投與途徑於PN5新生兒中後之擴散及表現
在BALB/cNctr-Npc1m1N/J小鼠中評估雙重CNS投與途徑(雙側ICV及大池內(ICM)之組合)，目標為增加小鼠之小腦轉導。在出生後第5天，使用雙側ICV + ICM投與包含eGFP轉殖基因之AAV-STRD.101載體，且研究小鼠在注射後持續3週時段。隨後，進行分子分析(包括qPCR、RT-qPCR及ELISA)；及以下組織之免疫組織化學分析：大腦區域(諸如吻端、中間及尾端)、脊髓及肝臟，以評估AAV-STRD.101之擴散及轉導概況(載體複本數)，以及在雙重途徑投與後轉殖基因之表現。
該實驗亦評定各投與途徑所使用之體積在所有3個大腦區域中之生物分佈及表現概況中之作用。如下表X中所示，測試兩種效價： 低及高；且評估兩種體積，對於ICV， 低：1.5 μL，或 高：2.5 μL；對於ICM， 低：6 μL，或 高：10 μL。 表X：
編號 N 治療方案 群組 效價 總劑量(ICV) 體積 每腦室注射體積(μL) 總劑量(ICM) 注射體積(μL) 每動物最終劑量
1 5 媒劑 -    N/A    N/A N/A N/A N/A
2 4 AAV-STRD.101 -GFP LDLV 低效價 1.33E+10 低 1.5 2.66E+10 6 4.00E+10
3 3 AAV-STRD.101 -GFP LDHV 1.33E+10 高 2.5 2.66E+10 10 4.00E+10
4 3 AAV-STRD.101 -GFP HDLV 高效價 4.00E+10 低 1.5 8.00E+10 6 1.20E+11
5 4 AAV-STRD.101 -GFP HDHV 4.00E+10 高 2.5 8.00E+10 10 1.20E+11
* LDLV，低劑量及低體積；LDHV，低劑量及高體積；HDLV，高劑量及低體積；HDHV，高劑量及高體積
實驗方法如下：
程序 1 ：組織處理
自組織分離 DNA
在Maxwell RSC 48儀上，使用Maxwell RSC 48組織DNA套組，自大致50 mg組織分離DNA。使用NanoDrop 2000來量測DNA濃度及品質。
自組織分離 RNA
在Maxwell RSC 48儀上，使用Maxwell RSC 48簡化RNA組織套組，自大致10 mg組織分離RNA。使用NanoDrop 2000來量測RNA濃度及品質。
自組織之蛋白質裂解
藉由均質化於含有1×PBS及蛋白酶抑制劑之400 μL緩衝液中自大致50 mg分離蛋白質。藉由BCA分析，使用BSA標準曲線來測定總蛋白質濃度。
程序 2 ： 載體基因體複本數之絕對定量
標準 DNA 之製備及載體基因體 qPCR
一等分試樣之CBh-eGFP (P-T070)質體用BshTI及NotI FastDigest限制酶消化，且在瓊脂糖凝膠上進行電泳以分離所關注之片段。自凝膠切下此DNA條帶，且按照製造商說明書使用NucleoSpin Gel萃取PCR清潔套組純化。使用NanoDrop 2000對DNA進行定量，且使用以下方程式計算每µL之DNA複本： 複本數= (DNA之量* 6.022x10 23) / (片段之長度* 1×10 9* 650)
此純化的DNA片段在載體基因體複本數評定中用作標準DNA。在各盤上，以每反應10 7、10 6、10 5、10 4、10 3、10 2及10個複本，將標準DNA連續稀釋於三個重複孔中且分析。藉由將標準DNA稀釋於基質DNA中製備在以下4個濃度下的兩組QC樣本：QC-H (10 6)、QC-M (10 4)、QC-L (10 3)及QC-UL (10 2)複本/反應，且在兩個重複孔中進行分析。將所有樣本DNA稀釋至25 ng/µL，且以總計100 ng在三個重複孔中分析。分析組分及熱循環條件可見於下表A及B中。該程序之其他細節可見於附錄中之協定鏈接(protocol link)中。 表 A ： qPCR 分析組分
組分 最終濃度
正向引子 1 200 nM
反向引子 1 200 nM
探針 1 300 nM
TaqMan快速高級主混合物 1X
總DNA 100 ng
水 補足至10 µL最終體積
1引子及探針序列可見於附錄中 表 B ：熱循環條件
溫度 時間 循環
保持50℃ 2 min 1
保持95℃ 2 min 1
95℃ 1 s 40
60℃ 20 s
程序 3 ： 載體來源之 mRNA 之定量
互補 DNA ( 逆轉錄 ) 及 qPCR 之合成
總共1000 ng RNA使用等體積DNaseI/10×緩衝液及在37℃下培育2 min來進行DNA酶處理。在處理之後，使用寡聚(dT)引子及SuperScript™IV第一股合成系統套組，將500 ng RNA逆轉錄成cDNA。剩餘500 ng之非轉錄總RNA保留作為無RT對照。引子黏著及逆轉錄反應之細節可見於下表4中。使用上表A及B中詳述之相同分析組分及熱循環條件完成qPCR反應，但使用10 ng cDNA。如載體基因體qPCR方法中所詳述使用相同標準DNA及QC樣本。對於載體來源之mRNA/cDNA之絕對定量以及小鼠管家基因GAPDH之相對定量而言，均以10 ng在兩個重複孔中分析所有樣本cDNA。對於各樣本而言，在單一孔中分析10 ng非轉錄RNA，以監測載體/基因體DNA之潛在污染。 表 4 ：逆轉錄反應
引子黏著組分： 組分 體積 (µL)/ 反應
寡聚(dT) (50 μM) 1.0
dNTP混合物(10 mM) 1.0
總RNA 100 ng
水 補足至13 μL最終體積
引子黏著條件： 65℃持續5分鐘 保持在4℃
逆轉錄組分： 組分 體積 (µL)/ 反應
5X SSIV RT緩衝液 4.0
100 mM DTT 1.0
 RNA酶抑制劑 1.0
逆轉錄酶 1.0
黏著RNA 13.0
逆轉錄條件： 1. 55℃持續10分鐘 2. 85℃持續10分鐘 3. 保持在4℃ 使用無核酸酶之水將cDNA及非轉錄RNA稀釋至2.5 ng/µL之測試濃度。將反應混合物冷凍儲存在−10℃至−30℃下。
RNA 酶 處理： 為了移除RNA，添加1 µL大腸桿菌RNA酶H，且在37℃下培育20分鐘。
程序 4 ： GFP 蛋白表現之定量
GFP ELISA 方法
使用市售ELISA套組(abcam；ab171581)來定量組織溶解物中之GFP表現。根據製造商說明書製備所有試劑及標準材料。使用1×PBS，將蛋白質裂解物初始地稀釋至40 µg/ml之總蛋白質濃度，以用1及0.5 µg/孔分析。根據製造商說明書完成分析之剩餘部分。使用分子裝置SoftMax Pro軟體來記錄以pg/孔為單位之標準濃度。藉由針對標準曲線材料回歸OD 450 nm值，使用4參數邏輯式曲線來測定樣本中GFP蛋白之濃度。基於孔中裝載之總蛋白質，將每孔所得蛋白質濃度標準化為pg GFP蛋白/µg總蛋白質之最終結果。使用2個所分析之濃度之平均值來報導GFP蛋白表現。若樣本OD 450nm不在標準曲線範圍內，則將樣本進一步稀釋且再分析。
結果顯示，雙重投與引起在整個大腦中之生物分佈，其中吻端區中具有最大GFP表現(圖10A及圖12A)。值得注意的是，雙重投與引起對肝臟組織之去靶向(圖10B及圖12B)。注射體積影響報導基因生物分佈及表現，其中當在所有3個所評估之大腦區域中投與高劑量而非低劑量時，體積增加為有益的。此外，在所有3個大腦區域中，在較低劑量下之較低體積增加生物分佈及GFP表現。參見圖11A至圖11C、圖13A至圖13C以及圖14A至圖14D。
另外，報導基因生物分佈研究之結果概述如下： 報導基因生物分佈： ● 載體基因體複本數： ○  吻端＞中間＞尾端 ○  脊髓=中間 ○  大腦＞肝臟=心臟 ● mRNA表現： ○  吻端=中間=尾端 ○  脊髓=大腦 ○  腦=心臟＞肝臟 ● 蛋白質表現： ○  吻端＞中間＞尾端 ○  脊髓=尾端 ○  大腦＞心臟＞肝臟 所注射體積之影響 ●  HDHV ＞ HDLV ＞ LDLV ＞ LDHV
雙重投與(雙側ICV + ICM)在AAV投與後3週之後在整個大腦中成功引起生物分佈及表現，其中周邊組織中AAV-STRD.101之表現降低。總體而言，觀測到給藥反應，其中載體基因體複本數及mRNA複本數與蛋白質表現相關。當相較於高劑量及較低體積(HDLV)時，高劑量與高體積(HDHV)組顯示最大載體基因體複本數及表現量，但低劑量及較高體積(LDHV)組始終顯示最低載體基因體複本數及表現。此表明體積確實會影響載體擴散及表現概況，其中在較低劑量與較低體積下具有較大生物分佈及表現量，但趨勢與高劑量組不相同。
前述內容說明本發明，且不應被解釋為其限制。藉由以下申請專利範圍限定本發明，申請專利範圍之等效物包括在其中。
圖 1A-1C. 顯示文庫多樣性、定向進化及新穎抗原足跡之增濃之分析的氣泡圖。使用Illumina MiSeq平台，使親本(圖1A)文庫及來自第一輪(圖1B)及第二輪(圖1C)進化之進化文庫經受高通量定序。在常規Perl腳本分析之後，繪製增濃的胺基酸序列。每一氣泡表示不同的殼體胺基酸序列，其中氣泡之半徑與彼變體在各別文庫中之讀段數成比例。y軸表示來自定序運行之總讀段之百分比。資料沿x軸散佈以易於觀測。獨特殖株之百分比降低(96.5%)直接表明，在第一輪及第二輪進化之後移除多個「不合適(un-fit)」序列。選擇優勢分離株用於進一步分析。
圖 2.相較於野生型AAV9，包含AAV殼體變體STRD.101及STRD.102之AAV載體之體積產量。條柱表示平均值+/- 95%信賴區間。
圖 3.使用標準TCID50分析所測定之AAV-STRD.101及野生型AAV9之感染值。資料圖示為產單位所需之粒子數(P:I比率)的自然對數。誤差槓表示標準誤差。
圖 4A-4D.相較於類似地封裝螢光素酶序列之野生型AAV9載體，利用包含STRD.101殼體且封裝螢光素酶轉殖基因之重組AAV載體對U87細胞(圖4A)、N2A細胞(圖4B)、Sy5Y細胞(圖4C)及U2OS細胞(圖4D)進行的轉導。誤差槓表示標準誤差。
圖 5.顯示用4% PFA固定24小時後冠狀面振盪切片機切片中之tdTomato表現的代表性螢光顯微影像。各切片為25 μm厚。上圖顯示使用4×接物鏡所得到之具有天然tdTomato螢光的影像。下圖顯示使用10×接物鏡所得到之具有天然tdTomato螢光的影像。
圖 6.顯示用4% PFA固定24小時後冠狀面振盪切片機切片中之tdTomato表現的代表性免疫組織化學影像。各切片為25 μm厚。
圖 7.顯示用4% PFA固定24小時後振盪切片機肝切片中之TdTomato表現的代表性螢光顯微影像。各切片為25 μm厚。圖顯示用DAPI複染色之天然tdTomato螢光。
圖 8.顯示用4% PFA固定24小時後振盪切片機心臟切片中之TdTomato表現的代表性螢光顯微影像。各切片為50 μm厚。圖顯示用DAPI複染色之天然tdTomato螢光。
圖 9.非人類靈長類動物中之重組AAV之生物分佈。水平線顯示偵測極限。
圖 10A 及圖 10B顯示在使用雙重投與投與AAV-STRD.101-GFP後，來自小鼠大腦切片( 圖 10A)及小鼠肝臟切片( 圖 10B)中GFP表現之免疫組織化學分析的影像。
圖 11A顯示使用雙重投與，投與AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝臟中藉由qPCR對載體基因體進行的絕對定量。 圖 11B顯示使用雙重投與，投與AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝中藉由RT-qPCR對載體來源之mRNA的定量。 圖 11C顯示使用雙重投與，投與AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝臟中藉由ELISA對GFP蛋白表現進行的定量。
圖 12A 及圖 12B顯示在使用雙重投與投與AAV-STRD.101-GFP後，來自小鼠大腦切片( 圖 12A)及小鼠肝臟切片( 圖 12B)中GFP表現之免疫組織化學分析的影像。
圖 13A顯示使用雙重投與，投與高或低體積之AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝臟中藉由qPCR對載體基因體進行的絕對定量。 圖 13B顯示使用雙重投與，投與高或低體積之AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝臟中藉由RT-qPCR對載體來源之mRNA進行的定量。 圖 13C顯示使用雙重投與，投與高或低體積之AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝臟中藉由ELISA對GFP蛋白表現進行的定量。細節參見實例9。
圖 14A顯示使用雙重投與，投與指示劑量及體積之AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝臟中藉由qPCR對載體基因體進行的絕對定量。 圖 14B顯示使用雙重投與，投與指示劑量及體積之AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦或肝臟中藉由RT-qPCR對載體來源之mRNA進行的定量。 圖 14C顯示使用雙重投與，投與指示劑量及體積之AAV-STRD.101-GFP之小鼠之大腦中藉由ELISA對GFP蛋白表現進行的定量。 圖 14D顯示使用雙重投與，投與指示劑量及體積之AAV-STRD.101-GFP之小鼠之肝臟中藉由ELISA對GFP蛋白表現進行的定量。細節參見實例9。
圖 15A顯示在直接雙側注射至新生P1小鼠中之心室(ICV)中後，自AAV-STRD.101載體之tdTomato轉殖基因的表現。 圖 15B顯示在靜脈內(IV)投與後，肝臟組織中自AAV-STRD.101載體或AAV9載體之tdTomato轉殖基因的表現，指示肝臟去靶向。 圖 15C顯示大腦及肝臟中AAV9及AAV-STRD.101載體之載體基因體複本數(VCN)。
圖 16A顯示在直接雙側注射AAV-STRD.101載體至新生P1小鼠中之大腦室(ICV)中後，大腦的免疫組織化學影像。 圖 16B顯示藉由qPCR量測之大腦之不同區域中AAV-STRD.101載體的載體基因體複本數(VCN)。 圖 16C顯示藉由qRT-PCR量測，大腦、心臟及肝臟中由AAV-STRD.101載體表現之mRNA複本的定量。
圖 17A顯示在ICM注射於非人類靈長類動物(NHP)大腦中後，自AAV9或AAV-STRD.101表現之轉殖基因蛋白質的定量。 圖 17B顯示在ICM注射AAV-STRD.101載體或AAV9後，非人類靈長類動物大腦之免疫組織化學影像。
圖 18A顯示相較於AAV9，在經由ICM注射及靜脈內(IV)注射投與後，AAV-STRD.101對非人類靈長類動物肝臟去靶向。 圖 18B顯示在經由ICM注射AAV-STRD.101載體或AAV9投與後，非人類靈長類動物肝臟中mCherry轉殖基因之免疫組織化學影像。
圖 19顯示在經由ICM注射AAV-STRD.101載體或AAV9投與後，非人類靈長類動物神經元及星形膠質細胞中mCherry轉殖基因之免疫組織化學影像。
圖 20顯示mCherry及細胞標記NeuN之雙重免疫組織化學(IHC)影像，顯示NeuN及mCherry共定位於運動前區皮質、海馬及丘腦之細胞中。在AAV-STRD.101之情況下，使用Zeiss成像軟體進行之初始定量顯示~26%之NeuN陽性細胞。
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Claims (85)

  1. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含具有SEQ ID NO: 12-20中之任一者之序列的肽。
  2. 如請求項1之AAV載體，其中該運載核酸包含5'及3' AAV反向末端重複序列。
  3. 如請求項1或2之AAV載體，其中該運載核酸包含轉殖基因。
  4. 如請求項3之AAV載體，其中該轉殖基因編碼治療蛋白或RNA。
  5. 如請求項1至4中任一項之AAV載體，其中該重組殼體蛋白與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV殼體之原生序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
  6. 如請求項5之AAV載體，其中該重組殼體蛋白與該AAV9殼體之原生序列具有至少90%序列一致性。
  7. 如請求項1至6中任一項之AAV載體，其中該肽係位於對應於該原生AAV9殼體之胺基酸451-458或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置處，且其中該肽係選自SEQ ID NO: 12-18中之任一者。
  8. 如請求項1至6中任一項之AAV載體，其中該肽係位於對應於該原生AAV9殼體之胺基酸587-594或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置處，且其中該肽係選自SEQ ID NO: 19或20。
  9. 如請求項1之AAV載體，其中該重組殼體蛋白包含： a) 第一肽，其具有SEQ ID NO: 12-18中之任一者之序列；及 b) 第二肽，其具有SEQ ID NO: 19-20中之任一者之序列。
  10. 如請求項9之AAV載體，其中基於該原生AAV9殼體之胺基酸編號，該第一肽係在胺基酸位置451-458處，且該第二肽係在胺基酸587-594處，或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基。
  11. 如請求項1至10中任一項之AAV載體，其中該肽抑制至少一種抗體與該殼體蛋白之結合。
  12. 如請求項11之AAV載體，其中該肽抑制該AAV載體之感染性被該抗體中和。
  13. 如請求項1至12中任一項之AAV載體，其中該肽選擇性地與表現於中樞神經系統(CNS)中之細胞表面上之受體結合。
  14. 如請求項13之AAV載體，其中該細胞係在運動前區皮質、丘腦、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節中。
  15. 如請求項1至14中任一項之AAV載體，其中該肽選擇性地與表現於心臟中之細胞表面上之受體結合。
  16. 如請求項1至15中任一項之AAV載體，其中該殼體蛋白進一步包含修飾該殼體之HI環之肽。
  17. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在該原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸451-458處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於該原生AAV9殼體蛋白序列中。
  18. 如請求項17之AAV載體，其中X 1不為I，X 2不為N，X 3不為G，X 4不為S，X 5不為G，X 6不為Q，X 7不為N，及/或X 8不為Q。
  19. 如請求項18之AAV載體，其中X 1為S、F、Q、G、K或R。
  20. 如請求項18或19之AAV載體，其中X 2為C、G、R、D、T或Q。
  21. 如請求項18至20中任一項之AAV載體，其中X 3為Q、V、G、Y、R、F或D。
  22. 如請求項18至21中任一項之AAV載體，其中X 4為P、Q、A或R。
  23. 如請求項18至22中任一項之AAV載體，其中X 5為T、N、A、P或I。
  24. 如請求項18至23中任一項之AAV載體，其中X 6為V、Q、A或I。
  25. 如請求項18至24中任一項之AAV載體，其中X 7為M、P、R、Q或N。
  26. 如請求項18至25中任一項之AAV載體，其中X 8為N、L、F、E、H或A。
  27. 如請求項17之AAV載體，其中X 1為S，X 2為C，X 3為Q，X 4為P，X 5為T，X 6為V，X 7為M，及X 8為N。
  28. 如請求項17之AAV載體，其中X 1為F，X 2為G，X 3為V，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。
  29. 如請求項17之AAV載體，其中X 1為Q，X 2為R，X 3為G，X 4為Q，X 5為A，X 6為A，X 7為P，及X 8為F。
  30. 如請求項17之AAV載體，其中X 1為G，X 2為D，X 3為Y，X 4為A，X 5為P，X 6為I，X 7為R，及X 8為E。
  31. 如請求項17之AAV載體，其中X 1為K，X 2為T，X 3為R，X 4為R，X 5為I，X 6為V，X 7為Q，及X 8為H。
  32. 如請求項17之AAV載體，其中X 1為F，X 2為G，X 3為F，X 4為P，X 5為N，X 6為Q，X 7為P，及X 8為L。
  33. 如請求項17之AAV載體，其中X 1為R，X 2為Q，X 3為D，X 4為Q，X 5為P，X 6為I，X 7為N，及X 8為A。
  34. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)突變型AAV9殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含在該原生AAV9殼體蛋白序列之胺基酸587-594處具有序列X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8(SEQ ID NO: 158)之肽，其中該肽不存在於該原生AAV9殼體蛋白序列中。
  35. 如請求項34之AAV載體，其中X 1不為A，X 2不為Q、X 3不為A，X 4不為Q，X 5不為A，X 6不為Q，X 7不為T，及/或X 8不為G。
  36. 如請求項35之AAV載體，其中X 1為S。
  37. 如請求項35或36之AAV載體，其中X 2為K或T。
  38. 如請求項35至37中任一項之AAV載體，其中X 3為V。
  39. 如請求項35至38中任一項之AAV載體，其中X 4為E或D。
  40. 如請求項35至39中任一項之AAV載體，其中X 5為S。
  41. 如請求項35至40中任一項之AAV載體，其中X 6為W或I。
  42. 如請求項35至41中任一項之AAV載體，其中X 7為T或A。
  43. 如請求項35至42中任一項之AAV載體，其中X 8為E或I。
  44. 如請求項34之AAV載體，其中X 1為S，X 2為K，X 3為V，X 4為E，X 5為S，X 6為W，X 7為T，及X 8為E。
  45. 如請求項34之AAV載體，其中X 1為S，X 2為T，X 3為V，X 4為D，X 5為S，X 6為I，X 7為A，及X 8為I。
  46. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)重組殼體蛋白及(ii)由該殼體蛋白包裹之運載核酸，其中該殼體蛋白包含與SEQ ID NO: 165-187中之任一者至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。
  47. 如請求項46之AAV載體，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 165-187中之任一者之胺基酸序列。
  48. 如請求項47之AAV載體，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列。
  49. 如請求項47之AAV載體，其中該殼體蛋白包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列。
  50. 如請求項46至49中任一項之AAV載體，其中該AAV載體將該運載核酸選擇性地遞送至中樞神經系統的細胞或組織。
  51. 如請求項50之AAV載體，其中該中樞神經系統組織為運動前區皮質、丘腦、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節。
  52. 如請求項1至51中任一項之AAV載體，其中該AAV載體將該運載核酸選擇性地遞送至該大腦或其區域中。
  53. 如請求項52之AAV載體，其中該大腦之該區域為吻端區域、尾端區域、運動前區皮質及/或小腦。
  54. 如請求項1至53中任一項之AAV載體，其中該AAV載體能夠在該運動前區皮質及/或小腦中表現該運載核酸。
  55. 如請求項54之AAV載體，其中相較於該野生型AAV9載體，該AAV載體能夠在該運動前區皮質及/或小腦中表現較高含量之該運載核酸。
  56. 如請求項1至55中任一項之AAV載體，其中該AAV載體能夠在有絲分裂後神經元中表現該運載核酸。
  57. 如請求項56之AAV載體，其中相較於野生型AAV9，該AAV載體能夠在有絲分裂後神經元中表現較高含量之該運載核酸。
  58. 如請求項56或57之AAV載體，其中該有絲分裂後神經元為NeuN陽性細胞。
  59. 如請求項46至58中任一項之AAV載體，其中該AAV載體將該運載核酸遞送至大腦，但不將該AAV載體遞送至心臟。
  60. 如請求項46至58中任一項之AAV載體，其中該AAV載體將該運載核酸遞送至大腦及遞送至心臟。
  61. 如請求項60之AAV載體，其中遞送至大腦之運載核酸高於遞送至心臟之運載核酸。
  62. 如請求項60之AAV載體，其中遞送至大腦之運載核酸與遞送至心臟之運載核酸大致相等。
  63. 一種核酸序列，其編碼如請求項1至62中任一項之AAV載體之重組殼體蛋白。
  64. 如請求項63之核酸序列，其中該核酸序列為DNA序列。
  65. 如請求項63之核酸序列，其中該核酸序列為RNA序列。
  66. 一種表現載體，其包含如請求項63至65中任一項之核酸序列。
  67. 一種細胞，其包含如請求項63至65中任一項之核酸序列。
  68. 一種細胞，其包含如請求項66之表現載體。
  69. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至62中任一項之AAV載體。
  70. 如請求項69之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  71. 一種醫藥組合物，其包含如請求項67或68之細胞。
  72. 如請求項71之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  73. 一種治療有需要之個體之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至62中任一項之AAV載體。
  74. 如請求項73之方法，其中該個體患有中樞神經系統疾病或病症。
  75. 如請求項73或74之方法，其中該個體為哺乳動物。
  76. 如請求項75之方法，其中該個體為人類。
  77. 如請求項73至76中任一項之方法，其中該治療有效量之該AAV載體係經由腦室內(ICV)注射及/或大池內(ICM)注射投與至該個體。
  78. 如請求項73至77中任一項之方法，其中該運載核酸係表現在該個體之該運動前區皮質及/或小腦中。
  79. 如請求項78之方法，其中相較於投與包含該運載核酸之野生型AAV9載體之對照個體，該運載核酸在該個體之該運動前區皮質及/或小腦中之表現量較高。
  80. 如請求項73至79中任一項之方法，其中該運載核酸係表現在該個體之該有絲分裂後神經元中。
  81. 如請求項80之方法，其中相較於投與包含該運載核酸之野生型AAV9載體之對照個體，該運載核酸在該個體之該有絲分裂後神經元中之表現量較高。
  82. 一種將核酸分子引入至細胞中之活體外方法，其包含使該細胞與如請求項1至62中任一項之AAV載體接觸。
  83. 如請求項1至62中任一項之AAV載體，其用作藥劑。
  84. 如請求項1至62中任一項之AAV載體，其用於治療有需要之個體之方法中。
  85. 如請求項1至62中任一項之AAV載體，其用於治療或預防有需要之個體之CNS疾病或病症之方法中。
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