CN117355603A

CN117355603A - 用于肌营养不良的基因治疗的aavrh74载体

Info

Publication number: CN117355603A
Application number: CN202280030472.4A
Authority: CN
Inventors: 阿伦·斯里瓦斯塔瓦; 青可云; 巴里·约翰·伯恩
Original assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2024-01-05

Abstract

本文中提供了经修饰的AAV衣壳蛋白、颗粒、核酸载体、及其组合物，以及它们的使用方法。

Description

用于肌营养不良的基因治疗的AAVRH74载体

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2021年4月23日提交的美国临时专利申请No.63/179,097和于2022年4月5日提交的美国临时专利申请No.63/327,410的权益，其各自的全部内容在此通过引用并入。

参考作为文本文件通过EFS-WEB提交的序列表

本申请包含已通过EFS-Web以ASCII格式提交并且在此通过引用整体并入的序列表。在2022年4月22日创建的所述ASCII拷贝被命名为U120270077WO00-SEQ-COB并且大小为119,114字节。

背景技术

基因治疗具有治疗患有遗传病或处于患有遗传病的风险中的对象的潜力。用于携带遗传载荷的经改进AAV载体将有益于基因治疗的发展，例如用于影响肌肉组织和/或功能的某些疾病的基因治疗的发展。肌肉疾病例如肌营养不良可由许多情况，包括例如先天性或获得性体细胞突变、损伤和暴露于有害化合物而引起。在一些情况下，肌肉疾病导致危及生命的并发症或者导致严重的症状和/或死亡。尽管许多因素与调节肌肉疾病(包括肌营养不良)有关，但有效的治疗仍然有限。

发明内容

本公开内容至少部分基于以下认识：相对于野生型AAVrh74颗粒或由AAVrh74衣壳来衣壳化的未经修饰AAV核酸载体，重组AAVrh74颗粒的一种或更多种衣壳蛋白中的某些氨基酸替换和/或由AAVrh74衣壳来衣壳化的AAV核酸载体的修饰导致了改善的特性(例如，特定类型细胞的转导)。衣壳蛋白的修饰(例如，氨基酸替换)和核酸载体的修饰(例如，D-序列的替换或缺失、和转录调节子结合元件的插入)可赋予AAVrh74颗粒以多种有益特性，例如增强的与特定细胞类型的结合、增强的与细胞和/或其生物机器(biological machinery)的相互作用、增强的细胞转导、增强的细胞内转基因的表达、以及其他特性。多种修饰的组合(例如，多种衣壳蛋白修饰和/或核酸载体修饰的组合)可对将它们并入到其中的AAVrh74颗粒的多种特性具有协同作用。根据一些方面，AAV核酸载体的修饰包含载体的左或右反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)的修饰。在一些实施方案中，AAV核酸载体的修饰包含在该AAV载体的左或右ITR中的D-序列的替换。例如，在一些实施方案中，AAV核酸载体的修饰包含用另外的序列(例如，S-序列或糖皮质激素受体结合元件(glucocorticoidreceptor-binding element，GRE))对AAV核酸载体中的序列(例如，ITR中的D-序列)的替换。用另外的序列(例如，S-序列或GRE)对AAV核酸载体中的序列(例如，ITR中的D-序列)的替换可提高包含AAV核酸载体的AAV颗粒的转导效率和/或转基因表达水平。根据一些方面，本文中公开的重组AAVrh74颗粒包含具有一个或更多个氨基酸替换的衣壳蛋白，在一些实施方案中，除了经修饰的AAV核酸载体之外。相对于包含未经修饰的AAV核酸载体和/或不包含氨基酸替换的衣壳的相应AAV颗粒，含有一个或更多个氨基酸替换的AAVrh74衣壳中的经修饰AAV核酸载体的衣壳化可导致包含经修饰AAV核酸载体和包含含有一个或更多个氨基酸替换的衣壳的AAV颗粒的特性改善。在一些实施方案中，改善的特性是转导效率即AAV颗粒将遗传载荷递送至目的细胞的效率的提高。

根据本公开内容的一些方面，提供了衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，其中所述衣壳蛋白是AAVrh74血清型衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述替换是Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F。

根据一些方面，提供了AAVrh74颗粒。在一些实施方案中，AAVrh74颗粒包含本文中公开的衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAVrh74颗粒还包含核酸载体，其中所述核酸载体包含含有第一D-序列的第一反向末端重复(ITR)和包含含有第二D-序列的第二ITR，其中所述第一D-序列或所述第二D-序列被S-序列替换。在一些实施方案中，S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。

在一些实施方案中，AAVrh74颗粒包含核酸载体，其中所述核酸载体包含含有第一D-序列的第一反向末端重复(ITR)和包含含有第二D-序列的第二ITR，其中所述第一D-序列和/或所述第二D-序列被糖皮质激素受体结合元件(GRE)替换。在一些实施方案中，GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

根据本公开内容的一些方面，提供了包含AAV衣壳蛋白或AAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，本文中公开的组合物包含本文中公开的AAVrh74衣壳蛋白。在一些实施方案中，本文中公开的组合物包含本文中公开的AAVrh74颗粒。

根据一些方面，本文中提供了接触细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括使细胞与包含AAVrh74颗粒的组合物接触，其中所述AAVrh74颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，

(i)其中所述衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，任选地其中所述替换是Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F，和/或

(ii)其中所述核酸载体包含含有第一D-序列的第一反向末端重复(ITR)和包含含有第二D-序列的第二ITR，其中所述第一D-序列或所述第二D-序列被S-序列替换，任选地其中所述S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。

在一些实施方案中，方法包括使细胞与包含AAVrh74颗粒的组合物接触，其中所述AAVrh74颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，

(ii)其中所述核酸载体包含含有第一D-序列的第一反向末端重复(ITR)和包含含有第二D-序列的第二ITR，其中所述第一D-序列和/或所述第二D-序列被糖皮质激素受体结合元件(GRE)替换，任选地其中所述GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

在一些实施方案中，衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，任选地其中所述替换为Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F。

在一些实施方案中，核酸载体包含第一ITR和第二ITR，其中第一D-序列或第二D-序列被S-序列替换，任选地其中所述S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。

在一些实施方案中，核酸载体包含第一ITR和第二ITR，其中第一D-序列和/或第二D-序列被GRE替换，任选地其中所述GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

在一些实施方案中，衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，并且核酸载体包含第一ITR和第二ITR，其中第一D-序列或第二D-序列被S-序列替换，任选地其中所述替换是Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F，并且任选地其中所述S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。

在一些实施方案中，衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，并且核酸载体包含第一ITR和第二ITR，其中第一D-序列和/或第二D-序列被GRE替换，任选地其中所述替换是Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F，并且任选地其中所述GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

在一些实施方案中，衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的以下位置对应的位置处包含氨基酸替换：

(a)Y447和Y733，任选地其中所述替换是Y447F和Y733F；

(b)Y447、Y733和N665，任选地其中所述替换是Y447F、Y733F和N665R；

(c)Y447、Y733和T494，任选地其中所述替换是Y447F、Y733F和T494V；

(d)Y447、Y733和K547，任选地其中所述替换是Y447F、Y733F和K547R；或

(e)Y447、Y733、N665、T494和K547，任选地其中所述替换是Y447F、Y733F、N665R、T494V和K547R。

在一些实施方案中，第一ITR和第二ITR各自为AAV2血清型ITR或AAV3血清型ITR。

在一些实施方案中，第一D-序列被S-序列替换，或第一D-序列被GRE替换。在一些实施方案中，第二D-序列被S-序列替换，或第二D-序列被GRE替换。在一些实施方案中，S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQID NO：17)；或者GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

在一些实施方案中，AAVrh74颗粒的转导效率是野生型AAVrh74颗粒的至少两倍高。在一些实施方案中，AAVrh74颗粒的包装效率相对于野生型AAVrh74颗粒降低。

在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。

在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞。在一些实施方案中，细胞是骨骼肌细胞。在一些实施方案中，细胞是腓肠肌细胞或胫骨前肌细胞。

在一些实施方案中，核酸载体包含调节元件。在一些实施方案中，调节元件包含启动子、增强子、沉默子、绝缘子、响应元件、起始位点、终止信号或核糖体结合位点。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子或合成启动子。

在一些实施方案中，核酸载体包含目的基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，目的基因编码治疗性蛋白质或诊断性蛋白质。

在一些实施方案中，接触是在体内的。

在一些实施方案中，所述方法还包括向对象施用包含AAVrh74颗粒的组合物。

在一些实施方案中，细胞在对象中。

在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象处于肌肉疾病的风险中或患有肌肉疾病，任选地，其中所述肌肉疾病为肌萎缩侧索硬化、夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tooth disease)、多发性硬化、肌营养不良、重症肌无力、肌病、肌炎、周围神经病或脊髓性肌萎缩。在一些实施方案中，肌肉疾病为迪谢内肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy)，任选地，其中对象在肌营养不良蛋白基因中具有突变。在一些实施方案中，肌肉疾病为肢带型肌营养不良。在一些实施方案中，肌肉疾病为X-连锁肌管性肌病，任选地，其中对象在MTM1基因中具有突变。

在一些实施方案中，组合物通过皮下注射、通过肌内注射、通过静脉内注射、通过腹膜内注射、或经口地施用于对象。

在一些实施方案中，接触是在体外或离体的。

附图说明

图1A至1B示出了野生型(wild-type，WT)和Y-F突变体ssAAVrh74载体在人HeLa细胞(图1A)和小鼠C2C12细胞(图1B)中的转导效率。将细胞在37℃下用每种载体以指定的载体基因组拷贝数(vg)/细胞转导2小时，在转导之后72小时在荧光显微镜下使转基因表达显现。使用ImageJ软件对数据进行定量。左图显示了转导之后细胞中的EGFP荧光。图1A的右图中的数据显示了对于WT、Y733F和Y447+733F ssAAVrh74载体中的每一种，用1,000vg/细胞(左，较亮的条)或3,000vg/细胞(右，较暗的条)转导之后转基因表达(像素²/视场)的定量。图1B的右图中的数据显示了对于WT、Y733F和Y447+733F ssAAVrh74载体中的每一种，用3,000vg/细胞(左，较亮的条)或9,000vg/细胞(右，较暗的条)转导之后的转基因表达(像素²/视场)。

图2示出了野生型(“WT”)和Y733+447F+T494V三重突变体(triplemutant，“TM”)ssAAVrh74载体在原代人骨骼肌细胞中的转导效率。将细胞用每种载体以指定的感染复数(vg/细胞)转导，并如上文图1A至1B中所述对转基因表达水平进行定量。左图显示了转导之后骨骼肌细胞中的EGFP荧光。右图显示了分别用1,000vg/细胞(左，较亮的条)或3,000vg/细胞(右，较暗的条)的WT和TMAAVrh74载体转导之后转基因表达(像素2/视场)的定量。

图3A至3B示出了ssAAV-rh74突变体在HeLa细胞中的转导效率。图3A示出了用3,000vg/细胞的野生型(WT)或衣壳突变体ssAAVrh74载体转导之后72小时的GFP荧光。图3B示出了对GFP荧光转导数据(转基因表达，测量为像素²/视场)的定量。

图4A至4C示出了野生型(“WT”)ssAAVrh74载体或ssAAVrh74载体(其中左ITR的D-序列(“LC1”)或右ITR的D-序列(“LC2”)被替换)的转导效率。图4A示出了HeLa细胞中由WT、LC1或LC2 ssAAVrh74载体介导的转基因表达。左图显示了用1,000vg/细胞、3,000vg/细胞或10,000vg/细胞的每种相应ssAAVrh74载体转导之后HeLa细胞中的hrGFP荧光。右图显示了分别用1,000vg/细胞(每组条的左侧条)、3,000vg/细胞(中间条)或10,000vg/细胞(右侧条)的WT、LC1或LC2 AAVrh74载体转导之后转基因表达(像素²/视场)的定量。图4B示出了用WT、LC1或LC2 ssAAVrh74载体转导的HeLa细胞中的载体基因组拷贝数(拷贝数/每μg DNA×10⁸)。每组三个条显示了用1,000vg/细胞(左侧条)、3,000vg/细胞(中间条)或10,000vg/细胞(右侧条)转导之后的拷贝数。图4C示出了原代人骨骼肌细胞中由WT、LC1或LC2ssAAVrh74载体介导的转基因表达。左图显示了用1,000vg/细胞、3,000vg/细胞或10,000vg/细胞的每种相应ssAAVrh74载体转导之后原代人骨骼肌细胞中的hrGFP荧光。右图显示了分别用1,000vg/细胞(每组条的左侧条)、3,000vg/细胞(中间条)或10,000vg/细胞(右侧条)的WT、LC1或LC2 AAVrh74载体转导之后转基因表达(像素²/视场)的定量。对于图3A和图3B二者，将细胞在37℃下用每种载体以指定的感染复数(vg/细胞)转导2小时，并在转导之后72小时在荧光显微镜下使转基因表达显现。使用ImageJ软件对数据进行定量。

图5示出了使用野生型(“WT”)ssAAVrh74载体、Y447+733F+T494V三重突变体(“TM”)ssAAVrh74载体和具有左ITR之D-序列的另外替换的Y447+733F+T494V三重突变体ssAAVrh74载体(“Opt^X”)的HeLa细胞的转导效率。用1,000vg/细胞转导HeLa细胞，并在转导之后72小时确定转导效率。

图6A至6B示出了通过流式细胞术定量GFP荧光(图6A)和流式细胞术定量平均GFP荧光(图6B)测得的WT、TM和Opt^X ssAAV-rh74载体在HeLa细胞中的转导效率。WT、TM和Opt^X如上图5中所限定。用1,000vg/细胞转导HeLa细胞，并在转导之后72小时确定转导效率。

图7A至7D示出了WT和Opt^X ssAAVrh74载体在C57Bl6小鼠中静脉内施用1×10¹²vg/小鼠之后的体内效力。图7A示出了在静脉内施用载体之后量化的腓肠肌(GA)中的转基因表达，并且图7B示出了在静脉内施用载体之后量化的胫骨前肌(TA)中的转基因表达。图7C示出了在施用载体之后8周收获的多种组织中量化的载体基因组拷贝数。图7D示出了在施用载体之后在肝、GA和TA中测得的相对转基因表达。使用NIH ImageJ软件分析荧光显微术图像来量化转基因表达数据。

图8A至8D示出了WT、GenX和GenY载体在体外的效力。图8A示出了WT(在远离核酸载体末端的ITR末端具有D-序列)、GenX(一个D-序列被替换)和GenY(一个D-序列的一部分被GRE替换)基因组的示意性结构。图8B示出了在不存在或存在酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin，“Tyr.”)的情况下，GenX和GenY AAVrh74载体在小鼠C2C12细胞中的转导效率。图8C示出了WT、GenX和GenY AAVrh74载体在原代人骨骼肌细胞中的转导效率。将细胞在37℃下用每种载体以指定的载体基因组拷贝数/细胞转导2小时，并在转导之后72小时在荧光显微镜下使转基因表达显现。使用NIH ImageJ软件分析荧光显微术图像来量化转基因表达。图8D示出了在用WT、GenX和GenY AAVrh74载体转导的原代人骨骼肌细胞中量化的载体基因组拷贝数。

图9A至9B示出了Opt^X AAVrh74载体的效力。图9A示出了每μg从施用PBS、含有hrGFP转基因的野生型AAVrh74颗粒(“WT”)或含有hrGFP转基因的Opt^X AAVrh74颗粒(“Opt^X”)的小鼠的肝、膈肌和心脏组织中提取的总RNA的hrGFP mRNA拷贝数的逆转录-定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR)测量结果。图9B示出了来自施用含有hrGFP转基因的WT或Opt^X AAVrh74颗粒的小鼠的肝、膈肌和心脏组织样品中hrGFP的相对表达水平。

图10A至10B示出了施用PBS、含有hrGFP转基因的WT或Opt^X AAVrh74颗粒的小鼠的肝、膈肌和心脏组织中基因表达的对照测量结果。图10A示出了通过RT-qPCR测得的β-肌动蛋白的表达。图10B示出了来自β-肌动蛋白RT-qPCR测量结果的循环阈值(cyclethreshold，CT)值。

图11A至11B示出了Opt^Y AAVrh74载体的效力。图11A示出了来自施用含有hrGFP转基因的Y447+733F+T494V三重突变体AAVrh74颗粒(“TM”)或含有hrGFP转基因的Opt^YAAVrh74颗粒(“Opt^Y”)的小鼠的肝、腓肠肌(“GA”)和胫骨前肌(“TA”)组织切片的荧光显微术图像。图11B示出了对来自荧光显微术图像的hrGFP转基因表达的定量。

图12示出了对施用含有hrGFP转基因的Y447+733F+T494V三重突变体AAVrh74颗粒(“TM”)或含有hrGFP转基因的Opt^Y AAVrh74颗粒(“Opt^Y”)的小鼠的肝、心脏、膈肌、腓肠肌(“GA肌”)和胫骨前肌(“TA肌”)组织中的载体基因组拷贝数的定量。

图13示出了对施用含有hrGFP转基因的Y447+733F+T494V三重突变体AAVrh74颗粒(“TM”)或含有hrGFP转基因的Opt^Y AAVrh74颗粒(“Opt^Y”)的小鼠的肝、心脏、膈肌、腓肠肌(“GA肌”)和胫骨前肌(“TA肌”)组织中的每载体基因组拷贝数的hrGFP mRNA表达的定量。

具体实施方式

本公开内容至少部分基于腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)衣壳蛋白、颗粒、基因组、核酸载体和质粒的开发，所述腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白、颗粒、基因组、核酸载体和质粒可用于将多种载物(cargo)递送至特定细胞，促进其中的转基因表达。本公开内容至少部分涉及以下发现：在AAVrh74衣壳蛋白中并入氨基酸替换和/或在AAV核酸载体中并入核苷酸序列修饰(例如，替换或缺失)导致转导效率和/或转基因表达的提高。本文中公开的AAV衣壳蛋白、颗粒、基因组、核酸载体和质粒可用于多种应用，包括但不限于组合物和方法(例如，治疗方法)。本文中公开的治疗方法包括可用于在有此需要的对象中治疗疾病(例如，肌肉病症例如肌营养不良)的方法。

本文中提供了组合物，其包含AAV衣壳蛋白、AAV颗粒、包含在AAV颗粒内的核酸，其中核酸在一个或更多个ITR中包含一个或更多个修饰；以及使用所述组合物用于转导目的细胞(例如，用于在对象中治疗疾病或病症)的方法。

衣壳蛋白质

本文中提供了具有一个或更多个以氨基酸替换为特征的突变的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，本文中公开的AAV衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665或Y733对应的一个或更多个位置处包含氨基酸替换。在一些实施方案中，氨基酸替换选自Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F。在一些实施方案中，本文中公开的AAV衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的以下位置对应的位置处包含氨基酸替换：Y447和Y733；Y447、Y733和N665；Y447、Y733和T494；Y447、Y733和K547；或Y447、Y733、N665、T494和K547。在一些实施方案中，本文中公开的AAV衣壳蛋白在与SEQID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的以下位置对应的位置处包含氨基酸替换：Y447F和Y733F；Y447F、Y733F和N665R；Y447F、Y733F和T494V；Y447F、Y733F和K547R；或Y447F、Y733F、N665R、T494V和K547R。

在一些实施方案中，本文中公开的AAV衣壳蛋白是VP1蛋白、VP2蛋白或VP3蛋白。VP1、VP2和VP3衣壳蛋白各自均由AAV基因组的同一区段编码，并且基于选择性mRNA剪接，它们的N末端不同。

AAVrh74衣壳蛋白的氨基酸序列的一个实例：

编码AAVrh74衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

不同的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3根据全长VP1蛋白的编号来限定。在一些实施方案中，对于AAVrh74衣壳蛋白，VP1衣壳蛋白由SEQ ID NO：1的第1至738位氨基酸限定；VP2衣壳蛋白由SEQ ID NO：1的第138至738位氨基酸限定；以及VP3衣壳蛋白由SEQ ID NO：1的第204至738位氨基酸限定。根据VP1序列提供了AAV衣壳蛋白的编号。例如，Y447是指VP1蛋白中在SEQ ID NO：1的第447位的酪氨酸，或者VP2或VP3蛋白中对应的酪氨酸。类似地，T494、K547、N665和Y733是指VP1蛋白中分别在SEQ ID NO：1的第494位的苏氨酸、第547位的赖氨酸、第665位的天冬酰胺和第733位的酪氨酸，或者VP2或VP3蛋白中对应的氨基酸。

本文中公开的AAV衣壳蛋白可以是任何血清型，或者可以是嵌合衣壳蛋白(即，包含来自两种或更多种血清型的衣壳蛋白的区段)。在一些实施方案中，本文中公开的衣壳蛋白是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10或AAVrh74衣壳蛋白。在一些实施方案中，如本文中提供的AAV衣壳蛋白是血清型rh74。其他AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列是已知的，并且可使用本领域已知的技术与SEQ ID NO：1(AAVrh74衣壳蛋白)进行比对。

野生型AAV1衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV2衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV3衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV4衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV5衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV6衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV7衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV8衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV9衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV10衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV11衣壳蛋白的一个实例

野生型AAV12衣壳蛋白的一个实例

野生型AAVrh10衣壳蛋白的一个实例

本文中还提供了编码衣壳蛋白的核酸。核酸可包含编码在此公开的衣壳蛋白(例如，包含一个或更多个氨基酸替换的衣壳蛋白)的序列。编码本文中公开的衣壳蛋白的序列可由本领域普通技术人员通过已知方法确定。编码衣壳蛋白的核酸可包含与编码序列可操作地连接的启动子或其他调节序列。编码衣壳蛋白的核酸可以是能够被宿主细胞的机器或酶用于产生衣壳蛋白的另外的核酸或质粒、mRNA的形式。如本文中提供的编码衣壳蛋白的核酸可用于制备AAV颗粒，所述颗粒可用于将基因递送至细胞。制备AAV颗粒的方法是本领域已知的。例如，参见Scientiffc Reports volume 9，Article number：13601(2019)；Methods Mol Biol.2012；798：267-284；和www.thermofisher.com/us/en/home/clinical/cell-gene-therapy/gene-therapy/aav-production-workflow.html。以下提供了编码衣壳蛋白的核酸的序列的实例。

编码AAV1衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV2衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV3衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV4衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV5衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV6衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV7衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV8衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV9衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

编码AAV10衣壳蛋白的核苷酸序列的一个实例：

核酸载体

根据一些方面，本文中提供了可由野生型AAV衣壳或如本文中提供的AAV衣壳(例如，包含一个或更多个氨基酸替换的衣壳蛋白)中的任一种衣壳化的核酸载体。在一些实施方案中，如本文中提供的核酸载体包含第一反向末端重复(ITR)和第二ITR。在一些实施方案中，第一ITR是经修饰的。在一些实施方案中，第二ITR是经修饰的。在一些实施方案中，ITR的修饰包括完整D-序列的替换或D-序列的一部分的替换。在一些实施方案中，ITR的修饰包括完整D-序列(例如，左ITR或右ITR的D-序列)的缺失或D-序列的一部分(例如，相对于核酸载体的末端，ITR的远端10个核苷酸)的缺失。例如，在一些实施方案中，ITR的修饰可包括D-序列的1至20个核苷酸的缺失或替换。在一些实施方案中，相对于核酸载体的末端，D-序列的远端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸被缺失或替换。在一些实施方案中，相对于核酸载体的末端，D-序列的远端10个核苷酸被缺失或替换。在一些实施方案中，在D-序列的中间的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸被缺失或替换(例如，从D-序列的3’或5’末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸开始的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)。在一些实施方案中，相对于核酸载体的末端，D-序列的近端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸被缺失或替换。在一些实施方案中，相对于核酸载体的末端，D-序列的近端10个核苷酸被缺失或替换。在一些实施方案中，D-序列包含SEQ ID NO：16中提供的序列。在一些实施方案中，D-序列由SEQ ID NO：16中提供的序列限定。在其中ITR的D-序列(例如，本文中所述核酸载体的左ITR的D-序列或右ITR的D-序列)的一部分或全部被替换的实施方案中，被替换的序列可以是本文中所述的任何替代序列，例如S-序列或GRE。

核酸载体可包含一个或更多个编码目的基因(例如，目的蛋白质或多肽)的异源核酸序列、和一个或更多个包含位于一个或更多个异源核酸序列侧翼的反向末端重复(ITR)序列(例如，野生型ITR序列或经修饰的ITR序列)的序列。在一些实施方案中，核酸载体在AAV衣壳内被衣壳化以形成AAV颗粒。在一些实施方案中，本文中公开的核酸载体由野生型AAVrh74衣壳或本文中公开的另外的AAV衣壳(例如包含一个或更多个氨基酸替换的AAV衣壳)来衣壳化。

在一些实施方案中，核酸载体包含天然AAV基因或天然AAV核苷酸序列。在一些实施方案中，可将一个或更多个天然AAV基因或天然AAV核苷酸序列从核酸载体中除去。在一些实施方案中，可将一个或更多个天然AAV基因或天然AAV核苷酸序列从核酸载体中除去，并用基因或目的基因替代。

核酸载体可以是任何AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10或AAVrh74，或血清型的组合。在一些实施方案中，在AAV衣壳内衣壳化的核酸载体形成假型AAV颗粒，使得核酸载体具有与该核酸载体在其中衣壳化的AAV衣壳不同的血清型。例如，血清型AAV2的核酸载体可在血清型AAVrh74的衣壳内衣壳化。

在一些实施方案中，核酸载体是单链的并且包含第一反向末端重复(ITR)和第二ITR。如本文中公开的，第一ITR是指在核酸载体5’末端的ITR，并且第二ITR是指在核酸载体3’末端的ITR。以其天然或野生型形式的每种ITR的长度为或为约145个核苷酸(例如，约140个核苷酸、约145个核苷酸、约150个核苷酸、约155个核苷酸、约160个核苷酸或约165个核苷酸)，并且包含D-序列。每种ITR可独立地具有任何AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10或AAVrh74)，或者两种ITR可具有相同的血清型。例如，在Grimm et al.J.Virol.80(1)：426-439(2006)中描述了ITR。以下提供了示例性的左ITR序列。右ITR具有与对应的左ITR反向互补的核苷酸序列(例如，AAV2右ITR具有与AAV2左ITR反向互补的核苷酸序列)。

野生型AAV1左ITR的一个实例：

野生型AAV2左ITR的一个实例：

野生型AAV3左ITR的一个实例：

野生型AAV4左ITR的一个实例：

野生型AAV5左ITR的一个实例：

野生型AAV6左ITR的一个实例：

在一些实施方案中，核酸载体包含ITR的D-序列的修饰(例如，缺失或替换)。在一些实施方案中，核酸载体包含左ITR的D-序列的修饰(例如，缺失或替换)。在一些实施方案中，核酸载体包含右ITR的D-序列的修饰(例如，缺失或替换)。在一些实施方案中，核酸载体包含左ITR和右ITR二者的D-序列的修饰(例如，缺失或替换)。在一些实施方案中，核酸载体包含左ITR或右ITR的修饰(例如，缺失或替换)，但不包含二者的修饰(即，核酸载体包含仅一个ITR的修饰)。

ITR序列包含AAV基因组5’或3’末端处的形成回文双链T形发夹结构的末端序列和保持单链的另外的序列(即，不是T形发夹结构的一部分)，称为D-序列。ITR的D-序列通常为约20(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25)个核苷酸，其位于ITR末端(即，左ITR的3’末端或右ITR的5’末端)的远端(相对于核酸载体的末端)，并对应于SEQ ID NO：12的野生型AAV2左ITR的CTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO：16)的序列。在一些实施方案中，ITR的D-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列CTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO：16)。

在一些实施方案中，本文中公开的核酸载体的ITR(例如，第一ITR或第二ITR)的D-序列被完全或部分除去。在一些实施方案中，本文中公开的核酸载体的两个ITR的D-序列被完全或部分除去。在一些实施方案中，ITR(例如，第一ITR或第二ITR)的D-序列被非AAV序列(即，不是来自AAV核酸的核苷酸序列)完全或部分替换。在一些实施方案中，ITR(例如，第一ITR或第二ITR)的D-序列被S-序列完全或部分替换。在一些实施方案中，S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。在一些实施方案中，S-序列与序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)。在一些实施方案中，S-序列与序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)具有小于95％同一性(例如，小于90％同一性、小于85％同一性、小于80％同一性、小于75％同一性或小于70％同一性)。在一些实施方案中，S-序列与序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)具有约70％至约95％同一性(例如，约95％同一性、约90％同一性、约85％同一性、约80％同一性、约75％同一性或约70％同一性)。在一些实施方案中，S-序列相对于序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)具有少于6个错配(例如，少于5个、少于4个、少于3个、少于2个、1个或没有错配)。在一些实施方案中，S-序列相对于序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)具有1、2、3、4、5或6个错配。在一些实施方案中，S-序列的长度为或为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。

在一些实施方案中，ITR(例如，第一ITR或第二ITR)的D-序列被糖皮质激素受体结合元件(GRE)完全或部分替换。在一些实施方案中，GRE被插入到核酸载体中(即，代替替换ITR的一部分)。例如，可将GRE插入到ITR的D-序列内、ITR的D-序列的上游、或ITR的D-序列的下游。

糖皮质激素受体结合元件也称为糖皮质激素响应性元件或糖皮质激素响应元件。GRE是糖皮质激素受体结合的核苷酸序列，其在其天然基因座中通常位于基因转录起始位点上游约100至2,000个碱基对处。本公开内容部分基于以下发现：AAV2D-序列的一部分与GRE的共有半位点共用部分同源性，并且糖皮质激素受体信号传导途径在AAV2感染或转导之后被激活。在一些实施方案中，用GRE替换AAV ITR的D-序列的一部分或全部提高了由在AAV颗粒内衣壳化的核酸载体编码的转基因的表达。

在一些实施方案中，GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE与以下具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)：序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE与以下具有小于95％同一性(例如，小于90％同一性、小于85％同一性、小于80％同一性、小于75％同一性或小于70％同一性)：序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE与以下具有约70％至约95％同一性(例如，约95％同一性、约90％同一性、约85％同一性、约80％同一性、约75％同一性或约70％同一性)：序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE相对于以下具有少于6个错配(例如，少于5个、少于4个、少于3个、少于2个、1个或没有错配)：序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE相对于以下具有1、2、3、4、5或6个错配：序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE的长度为或为约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，GRE的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

在一些实施方案中，GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A，并且其中Y为T或C。在一些实施方案中，GRE与以下具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)：序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A，并且其中Y为T或C。在一些实施方案中，GRE与以下具有小于95％同一性(例如，小于90％同一性、小于85％同一性、小于80％同一性、小于75％同一性或小于70％同一性)：序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A，并且其中Y为T或C。在一些实施方案中，GRE与以下具有约70％至约95％同一性(例如，约95％同一性、约90％同一性、约85％同一性、约80％同一性、约75％同一性或约70％同一性)：序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A，并且其中Y为T或C。在一些实施方案中，GRE相对于以下具有少于6个错配(例如，少于5个、少于4个、少于3个、少于2个、1个或没有错配)：序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A，并且其中Y为T或C。在一些实施方案中，GRE相对于以下具有1、2、3、4、5或6个错配：序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A，并且其中Y为T或C。在一些实施方案中，GRE的长度为或为约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，GRE的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A，并且其中Y为T或C。

在一些实施方案中，GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列。在一些实施方案中，GRE与以下具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)：序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列。在一些实施方案中，GRE与以下具有小于95％同一性(例如，小于90％同一性、小于85％同一性、小于80％同一性、小于75％同一性或小于70％同一性)：序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列。在一些实施方案中，GRE与以下具有约70％至约95％同一性(例如，约95％同一性、约90％同一性、约85％同一性、约80％同一性、约75％同一性或约70％同一性)：序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)的至少8个连续核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)或者其反向或反向互补序列。在一些实施方案中，GRE相对于以下具有少于6个错配(例如，少于5个、少于4个、少于3个、少于2个、1个或没有错配)：序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)或者其反向或反向互补序列。在一些实施方案中，GRE相对于以下具有1、2、3、4、5或6个错配：序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)或者其反向或反向互补序列。在一些实施方案中，GRE的长度为或为约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，GRE的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核酸序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)或者其反向或反向互补序列。

根据本公开内容可用的GRE序列的另一个实例是5’-GGCACAGTGTGGTCT-3’(SEQ IDNO：21)。可使用其他GRE序列，包括例如本领域已知的GRE序列。

在一些实施方案中，D-序列的替换包含用不同的核苷酸序列(例如，S-序列或其一部分、或者GRE或其一部分)对D-序列的至少5个核苷酸(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)的替换。在一些实施方案中，D-序列的替换包含D-序列的10个核苷酸的替换。在一些实施方案中，D-序列的替换包含D-序列的最3’端的10个核苷酸的替换。在一些实施方案中，D-序列的替换包含D-序列的最5’端的10个核苷酸的替换。在一些实施方案中，D-序列的替换包含D-序列内部部分(即不包含末端核苷酸)的替换，例如D-序列内部部分的10个核苷酸的替换。

在一些实施方案中，D-序列的缺失包含D-序列的至少5个核苷酸(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)的缺失。在一些实施方案中，D-序列的缺失包含D-序列的10个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，D-序列的缺失包含D-序列的最3’端的10个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，D-序列的缺失包含D-序列的最5’端的10个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，D-序列的缺失包含D-序列内部部分(即不包含末端核苷酸)的缺失，例如D-序列内部部分的10个核苷酸的缺失。

在一些实施方案中如本文中公开的核酸载体包含一种或更多种调节元件。调节元件是指核酸载体的核苷酸序列或结构组分，其参与调节核酸载体的组分(例如，其中包含的目的基因)的表达。调节元件包括但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子、响应元件、起始位点、终止信号和核糖体结合位点。

启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子和合成启动子。例如，本文中公开的核酸载体可包含病毒启动子或来自哺乳动物基因的启动子，其通常在促进转录中具有活性。组成型病毒启动子的一些非限制性实例包括单纯疱疹病毒(Herpes Simplex virus，HSV)、胸苷激酶(thymidine kinase，TK)、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)、猿猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(Mouse Mammary Tumor Virus，MMTV)、Ad E1A和巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子。组成型哺乳动物启动子的一些非限制性实例包括多种持家基因启动子，例如β-肌动蛋白启动子。

诱导型启动子或其他诱导型调节元件也可用于实现目的基因(例如，目的蛋白质或多肽)的期望的表达水平。合适的诱导型启动子的一些非限制性实例包括来自基因例如细胞色素P450基因、热休克蛋白基因、金属硫蛋白基因和激素诱导型基因的那些，例如雌激素基因启动子。诱导型启动子的另一个实例是对四环素有响应的tetVP16启动子。

本文中还考虑了组织特异性启动子或其他组织特异性调节元件。可使用的这样的启动子的一些非限制性实例包括肌肉特异性启动子。

本文中还考虑了合成启动子。合成启动子可包含例如已知的启动子、调节元件、转录因子结合位点、增强子元件、阻遏子元件等的区域。

在一些实施方案中，本文中提供的核酸包含编码产物(例如，蛋白质或多肽产物)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列包含目的基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，目的基因编码治疗性或诊断性蛋白质或多肽。在一些实施方案中，治疗性或诊断性蛋白质或多肽是抗体、肽体(peptibody)、生长因子、凝血因子、激素、膜蛋白、细胞因子、趋化因子、作用于细胞表面受体或离子通道的激活或抑制性肽、靶向胞内过程的细胞渗透肽、溶血栓剂、酶、骨形态发生蛋白、核酸酶、用于基因编辑的蛋白质、Fc融合蛋白、抗凝剂、或者可使用实验室测试来检测的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，本文中提供的核酸包含编码指导RNA或用于基因编辑的其他核酸(任选地除了用于基因编辑的蛋白质之外)的核苷酸序列。

在一些实施方案中，由本文中公开的核酸编码的产物是可检测分子。可检测分子是(例如，使用肉眼、在显微镜下或使用光检测装置例如照相机)可显现的分子。在一些实施方案中，可检测分子是荧光分子、生物发光分子或提供颜色的分子(例如，β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或球状菌素(spheroidenone))。在一些实施方案中，可检测分子是荧光、生物发光或酶促蛋白或者其功能性肽或多肽。

在一些实施方案中，荧光蛋白为蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或者其功能性肽或多肽。蓝色荧光蛋白可以是azurite、EBFP、EBFP2、mTagBFP或Y66H。青色荧光蛋白可以是ECFP、AmCyan1、Cerulean、CyPet、mECFP、Midori-ishi Cyan、mTFP1或TagCFP。绿色荧光蛋白可以是AcGFP、AzamiGreen、EGFP、Emarald、GFP、或GFP的突变形式(例如，GFP-S65T、mWasabi、Stemmer、超折叠GFP、TagGFP、TurboGFP或ZsGreen)。黄色荧光蛋白可以是EYFP、mBanana、mCitrine、PhiYFp、TagYFP、Topaz、Venus、YPet或ZsYellow1。橙色荧光蛋白可以是DsRed、RFP、DsRed2、DsRed-Express、Ds-Red-单体、Tomato、tdTomato、Kusabira Orange、mKO2、mOrange、mOrange2、mTangerine、TagRFP或TagRFP-T。红色荧光蛋白可以是AQ142、AsRed2、dKeima-Tandem、HcRed1、tHcRed、Jred、mApple、mCherry、mPlum、mRasberry、mRFP1、mRuby或mStrawberry。

在一些实施方案中，可检测分子是生物发光蛋白或者其功能性肽或多肽。生物发光蛋白的一些非限制性实例是萤火虫萤光素酶、叩头虫(click-beetle)萤光素酶、海肾(Renilla)萤光素酶和来自Oplophorus gracilirostris的萤光素酶。

在一些实施方案中，可检测分子可以是可使用本领域已知方法检测出的任何多肽或蛋白质。一些非限制性检测方法为荧光成像、发光成像、明场成像，并且包括通过免疫荧光或免疫组织化学染色促进的成像。

美国专利公开No.2017/0356009中描述了AAV颗粒、核酸载体和衣壳蛋白的另外的特征，其内容通过引用整体并入本文。

AAV颗粒

根据一些方面，本文提供了AAV颗粒。AAV颗粒是60个单独衣壳蛋白亚基的超分子组装体，形成能够保护4.7kb单链DNA基因组的无包膜T-1二十面体晶格。成熟的AAV颗粒直径为约20nm，并且其衣壳由三种结构衣壳蛋白VP1、VP2和VP3形成，VP1、VP2和VP3分子量分别为87、73和62kDa，比率为约1∶1∶18。这60个衣壳蛋白以反平行β链桶状排列来排列，导致明确的向性和对降解的高抗性。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含空衣壳(例如，无载物的衣壳)。在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳化核酸(例如，包含目的基因的核酸载体，例如本文公开的核酸载体)的衣壳。在一些实施方案中，在AAV衣壳内衣壳化以产生AAV颗粒的核酸包含本文公开的核酸载体。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒包含衣壳蛋白，该衣壳蛋白包含一个或更多个突变，例如一个或更多个氨基酸替换。

本文预期本文公开的任何衣壳蛋白突变(例如，氨基酸替换)可与本文公开的任何核酸载体修饰(例如，序列缺失或替换)组合。例如，本文所述的AAV颗粒可具有AAVrh74衣壳蛋白(例如，野生型AAVrh74衣壳蛋白或者包含一个或更多个氨基酸替换的衣壳蛋白)和AAV核酸载体(例如，AAV2核酸载体)，其包含修饰(例如，D-序列的缺失或替换，和/或者非AAV序列如GRE的插入)。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒包含在对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和Y733的一个或更多个位置处含有氨基酸替换的衣壳蛋白。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒包含这样的衣壳蛋白，所述衣壳蛋白含有对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F、T494V、K547R、N665R和Y733F的一个或更多个氨基酸替换。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒包含衣壳蛋白并且还包含核酸载体，所述衣壳蛋白在对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和Y733的一个或更多个位置处含有氨基酸替换，所述核酸载体包含ITR的D-序列的修饰(例如，缺失或替换)(例如，右ITR、左ITR或右ITR和左ITR二者的D-序列的修饰)。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，所述衣壳蛋白在对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和Y733的一个或更多个位置处包含氨基酸替换，所述核酸载体包含用S-序列对ITR的D-序列的替换。在一些实施方案中，氨基酸替换对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F、T494V、K547R、N665R和Y733F。在一些实施方案中，S-序列包含核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ IDNO：17)、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部(例如，左ITR的D-序列)被S-序列替换。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，所述衣壳蛋白包含对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F和Y733F的氨基酸替换，所述核酸载体包含用S-序列对ITR的D-序列的替换。在一些实施方案中，S-序列包含核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部(例如，左ITR的D-序列)被S-序列替换。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，所述衣壳蛋白包含对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F、T494V和Y733F的氨基酸替换，所述核酸载体包含用S-序列对ITR的D-序列的替换。在一些实施方案中，S-序列包含核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部(例如，左ITR的D-序列)被S-序列替换。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，所述衣壳蛋白在对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和Y733的一个或更多个位置处包含氨基酸替换，所述核酸载体包含核酸载体的ITR的D-序列的全部或部分缺失。在一些实施方案中，氨基酸替换对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F和Y733F。在一些实施方案中，氨基酸替换对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F、T494V和Y733F。在一些实施方案中，氨基酸替换对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F、T494V、K547R、N665R和Y733F。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，所述衣壳蛋白在对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和Y733的一个或更多个位置处包含氨基酸替换，所述核酸载体包含用GRE对ITR的D-序列的替换。在一些实施方案中，氨基酸替换对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F、T494V、K547R、N665R和Y733F。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)或者GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成，其中每个N独立地是T、C、G或A，并且其中Y是T或C。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成，其中每个N独立地是T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)或者AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部(例如，左ITR的D-序列)被GRE替换。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，所述衣壳蛋白包含对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F和Y733F的氨基酸替换，所述核酸载体包含用GRE对ITR的D-序列的替换。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列GGTACANNNTGTYCT(SEQID NO：19)或者GGTACANNNTGTYCT(SEQ INO：19)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成，其中每个N独立地是T、C、G或A，并且其中Y是T或C。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成，其中每个N独立地是T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)或者AGAACAGGATGTTCT(SEQ IDNO：20)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部(例如，左ITR的D-序列)被GRE替换。

在一些实施方案中，AAV颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，所述衣壳蛋白包含对应于SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447F、T494V和Y733F的氨基酸替换，所述核酸载体包含用GRE对ITR的D-序列的替换。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)或者GGTACANNNTGTYCT(SEQ ID NO：19)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成，其中每个N独立地是T、C、G或A，并且其中Y是T或C。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成，其中每个N独立地是T、C、G或A。在一些实施方案中，GRE包含核酸序列AGAACAGGATGTTCT(SEQID NO：20)或者AGAACAGGATGTTCT(SEQ ID NO：20)的反向或反向互补序列、基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部(例如，左ITR的D-序列)被GRE替换。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒是复制型的。复制型AAV颗粒能够在宿主细胞(例如，对象体内的宿主细胞或培养物中的宿主细胞)中复制。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒是非复制型的。非复制型AAV颗粒不能在宿主细胞(例如，对象体内的宿主细胞或培养物中的宿主细胞)中复制，但可以感染宿主并将遗传组分整合到宿主基因组中以进行表达。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒能够感染宿主细胞。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒能够促进遗传组分稳定整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒不能促进遗传组分整合到宿主细胞的基因组中。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒包含核酸载体。在一些实施方案中，核酸载体包含邻近编码目的基因的序列末端的两个末端反向重复(ITR)。在一些实施方案中，核酸载体包含在AAV的ssDNA基因组中。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒包含一条单链DNA。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒包含两条互补DNA链，形成自身互补AAV(scAAV)。

在一些实施方案中，可包含在AAV颗粒(例如，WT颗粒或包含含有本文公开的任何一个或更多个突变的衣壳的颗粒)中的核酸载体包含含有ITR的D-序列的一部分或全部的修饰(例如，缺失或替换)的ITR。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部被S-序列或其一部分替换。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部被GRE或其一部分替换。在一些实施方案中，ITR的D-序列的一部分或全部被缺失。这样的修饰(例如，缺失和替换)的进一步描述在本文别处提供。

本文公开的AAV颗粒可以是任何AAV血清型(例如，AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)，包括任何衍生物(包括血清型的非天然存在的变体)或假型。衍生物和假型的非限制性实例包括

AAV2-AAV3杂合体，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAV-HSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV克隆32/83，AAVShH10，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，和AAVr3.45。

这样的AAV血清型和衍生物/假型，以及产生这样的衍生物/假型的方法是本领域已知的(参见例如Mol.Ther.2012Apr；20(4)：699-708.doi：10.1038/mt.2011.287.Epub2012 Jan 24.The AAV vector toolkit：poised at the clinical crossroads.AsokanA，Schaffer DV，Samulski RJ.)。在一些实施方案中，AAV颗粒是假型AAV颗粒，其包含核酸载体和衣壳，所述核酸载体包含来自一种血清型(例如，AAV2或AAV3)的ITR，所述衣壳包含来源于另一种血清型(即，分别不同于AAV2或AAV3的血清型)的衣壳蛋白。用于产生和使用假型rAAV载体的方法是本领域已知的(参见例如，Duan et al.，J.Virol.，75：7662-7671(2001)；Halbert et al.，J.Virol.，74：1524-1532(2000)；Zolotukhin et al.，Methods，28：158-167(2002)；和Auricchio et al.，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081(2001))。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒，例如包含重组核酸或转基因。

本文所述修饰(例如，衣壳蛋白修饰、D-序列的缺失或替换和/或者非AAV序列插入AAV基因组中)的任何组合可导致累加或协同效应，其中所得组合的有益特性分别等于或大于单独修饰的效应的总和。例如，包含经修饰衣壳蛋白和经修饰基因组的AAV颗粒相对于相应的野生型AAV颗粒在转导效率、转基因表达和/或包装效率方面可具有提高，所述提高等于单独的衣壳蛋白修饰和基因组修饰所赋予的提高的总和，或者大于单独的修饰所赋予的提高的总和。

转导效率

根据一些方面，本文公开的AAV颗粒的转导效率相对于相应的野生型AAV颗粒被改变。AAV颗粒的转导效率可以例如通过比较使细胞与AAV颗粒接触之后细胞中目的基因的表达，或通过测量使细胞群与AAV颗粒接触之后每个细胞的病毒基因组拷贝数来确定。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒(例如，包含经修饰衣壳蛋白(例如，包含一个或更多个氨基酸替换)、经修饰核酸载体(例如，通过D-序列的缺失和/或替换进行修饰)、或包含经修饰衣壳蛋白(例如，包含一个或更多个氨基酸替换)和经修饰核酸载体(例如，通过D-序列的缺失和/或替换进行修饰)二者的AAV颗粒)的转导效率高于相应的野生型AAV颗粒的转导效率。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒的转导效率比相应野生型AAV颗粒的转导效率高至少5％(例如，高至少10％、高至少15％、高至少20％、高至少25％、高至少30％、高至少35％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少150％、高至少200％、高至少250％或更多)。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒的转导效率是相应野生型AAV颗粒的转导效率的至少1.5倍高(例如，至少2倍高、至少2.5倍高、至少3倍高、至少3.5倍高、至少4倍高、至少4.5倍高、至少5倍高、至少5.5倍高、至少6倍高、至少6.5倍高、至少7倍高、至少7.5倍高、至少8倍高、至少8.5倍高、至少9倍高、至少9.5倍高、至少10倍高、至少10.5倍高、至少11倍高、至少11.5倍高、至少12倍高、至少12.5倍高、至少13倍高、至少13.5倍高、至少14倍高、至少14.5倍高、至少15倍高、至少15.5倍高、至少16倍高、至少16.5倍高、至少17倍高、至少17.5倍高、至少18倍高、至少18.5倍高、至少19倍高、至少19.5倍高、至少20倍高或更多)。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒的转导效率相对于相应的野生型AAV颗粒没有被改变。

转基因表达

根据一些方面，相对于由不包含修饰的核酸载体编码的转基因的表达，由本文公开的包含修饰(例如，序列(如D-序列)的缺失或替换)的核酸载体编码的转基因的表达被改变。在一些实施方案中，转基因表达的这样的改变是基于每个核酸载体拷贝数的(例如，当归一化为细胞中核酸载体的总量时，细胞中的转基因表达被改变)。例如，在一些实施方案中，相对于不包含相同修饰但向细胞递送相当数量的病毒基因组的相应AAV颗粒，本文公开的经修饰AAV颗粒导致更高的转基因表达。相对的转基因表达水平可以通过以下确定：例如在将细胞与包含编码转基因的经修饰核酸载体的AAV颗粒接触之后通过用本领域已知的方法测量细胞中转基因的表达，并比较与包含不含修饰的核酸载体的AAV颗粒接触的另一细胞中的等同测量结果。

在一些实施方案中，来自如本文公开的经修饰核酸载体(例如，通过D-序列的缺失和/或替换而修饰)的转基因表达高于来自不包含修饰的相应核酸载体的转基因表达。在一些实施方案中，来自如本文公开的经修饰核酸载体的转基因表达比来自不包含修饰的相应核酸载体的转基因表达高至少5％(例如，高至少10％、高至少15％、高至少20％、高至少25％、高至少30％、高至少35％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少150％、高至少200％、高至少250％或更多)。

在一些实施方案中，来自本文公开的经修饰核酸载体的转基因表达是来自不包含修饰的相应核酸载体的转基因表达的至少1.5倍高(例如，至少2倍高、至少2.5倍高、至少3倍高、至少3.5倍高、至少4倍高、至少4.5倍高、至少5倍高、至少5.5倍高、至少6倍高、至少6.5倍高、至少7倍高、至少7.5倍高、至少8倍高、至少8.5倍高、至少9倍高、至少9.5倍高、至少10倍高、至少10.5倍高、至少11倍高、至少11.5倍高、至少12倍高、至少12.5倍高、至少13倍高、至少13.5倍高、至少14倍高、至少14.5倍高、至少15倍高、至少15.5倍高、至少16倍高、至少16.5倍高、至少17倍高、至少17.5倍高、至少18倍高、至少18.5倍高、至少19倍高、至少19.5倍高、至少20倍高，或更多)。

在一些实施方案中，相对于来自不包含修饰的相应核酸载体的转基因表达，来自本文公开的经修饰核酸载体的转基因表达没有改变。

包装效率

根据一些方面，本文公开的AAV颗粒的包装效率相对于相应的野生型AAV颗粒而言被改变。AAV颗粒的包装效率是指特定AAV衣壳衣壳化特定病毒基因组的能力。本领域普通技术人员可以测得包装效率，例如通过量化衣壳与病毒基因组的比率来进行(参见例如，Grimm，et al.Gene Ther.6：1322-1330(1999))。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒(例如，包含经修饰衣壳蛋白、经修饰核酸载体或包含经修饰衣壳蛋白和经修饰核酸载体二者的AAV颗粒)的包装效率高于相应的野生型AAV颗粒的包装效率。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒的包装效率比相应的野生型AAV颗粒的包装效率高至少5％(例如，高至少10％、高至少15％、高至少20％、高至少25％、高至少30％、高至少35％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少150％、高至少200％、高至少250％或更多)。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒的包装效率是相应的野生型AAV颗粒的包装效率的至少1.5倍高(例如，至少2倍高、至少2.5倍高、至少3倍高、至少3.5倍高、至少4倍高、至少4.5倍高、至少5倍高、至少5.5倍高、至少6倍高、至少6.5倍高、至少7倍高、至少7.5倍高、至少8倍高、至少8.5倍高、至少9倍高、至少9.5倍高、至少10倍高、至少10.5倍高、至少11倍高、至少11.5倍高、至少12倍高、至少12.5倍高、至少13倍高、至少13.5倍高、至少14倍高、至少14.5倍高、至少15倍高、至少15.5倍高、至少16倍高、至少16.5倍高、至少17倍高、至少17.5倍高、至少18倍高、至少18.5倍高、至少19倍高、至少19.5倍高、至少20倍高或更多)。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒(例如，包含经修饰衣壳蛋白、经修饰核酸载体或包含经修饰衣壳蛋白和经修饰核酸载体二者的AAV颗粒)的包装效率低于相应的野生型AAV颗粒的包装效率。在一些实施方案中，如本文公开的AAV颗粒的包装效率相对于相应的野生型AAV颗粒的包装效率降低了至少5％(例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％或更多)。

在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒的包装效率相对于相应的野生型AAV颗粒没有被改变。

在一些实施方案中，相对于相应的未经修饰或野生型AAV颗粒(例如，具有相同血清型的)，本文公开的AAV颗粒的转导效率和包装效率均被改变(即，提高或降低)。在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒的免疫原性相对于相应的未经修饰或野生型AAV颗粒(例如，具有相同血清型的)被改变。

药物组合物

本文公开的AAV颗粒、衣壳蛋白或核酸中的任一者可包含在包含可药用载体的药物组合物中，或可包含在可药用载体中。术语“载体”是指稀释剂、辅料、赋形剂或载剂，AAV颗粒、衣壳蛋白或核酸与它们一起被包含或施用于对象。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括以下那些：石油，例如矿物油；植物油，例如花生油、大豆油和芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体。可药用载体的非限制性实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚丙烯酸、润滑剂(例如滑石、硬脂酸镁和矿物油)、润湿剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂(如甲基-羟基-苯甲酸盐/酯、乙基-羟基-苯甲酸盐/酯和丙基-羟基-苯甲酸盐/酯)、和pH调节剂(如无机和有机酸和碱)、及其溶液或组合物。载体的另一些实例包括磷酸盐缓冲盐水、HEPES缓冲盐水和注射用水，其中任何一种可以任选地与氯化钙二水合物、无水磷酸二钠、氯化镁六水合物、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠或蔗糖中的一种或更多种组合。可以使用的载体的另一些实例包括盐水(例如，灭菌的、无热原的盐水)、盐水缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、脲、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。USP级载体和赋形剂特别可用于将AAV颗粒递送至人对象。

通常来说，这样的组合物可包含至少约0.1％的治疗剂(例如，AAV颗粒)或者更多，但活性成分的百分比当然可变化并且可适宜地占总制剂重量或体积的约1％或2％至约70％或80％或者更多。当然，可制备每种治疗上可用的组合物中的治疗剂(例如，AAV颗粒)的量，使得将在任何给定单位剂量的化合物中获得合适的剂量。制备这样的药物制剂领域的技术人员将考虑以下因素，例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素，并且因此可设计多种剂量和治疗方案。

接触细胞的方法

根据一些方面，本文提供了使细胞与AAV颗粒接触的方法。接触细胞的方法可以包括，例如，使培养物中的细胞与包含AAV颗粒的组合物接触。在一些实施方案中，接触细胞包括将包含AAV颗粒的组合物添加至细胞培养物(例如，组织培养板或培养皿上的细胞培养物)的上清液中，或将包含AAV颗粒的组合物与细胞培养物(例如，混悬细胞培养物)混合。在一些实施方案中，接触细胞包括将包含AAV颗粒的组合物与另一种溶液(例如细胞培养基)混合，并将细胞与混合物一起孵育。

在一些实施方案中，使细胞与AAV颗粒接触包括向细胞所在的对象或装置施用包含AAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，接触细胞包括将包含AAV颗粒的组合物注射到细胞所在的对象中。在一些实施方案中，接触细胞包括将包含AAV颗粒的组合物直接施用至细胞，或施用至存在细胞的对象的组织中或基本上邻近该组织。

在一些实施方案中，“施用”意指以药理学上可用的方式向对象提供物质。在一些实施方案中，rAAV颗粒肠内施用于对象。在一些实施方案中，必需金属元素的肠内施用是经口的。在一些实施方案中，rAAV颗粒肠胃外施用于对象。在一些实施方案中，rAAV颗粒皮下、眼内、玻璃体内、视网膜下、静脉内(intravenously，IV)、脑室内、肌内、鞘内(intrathecally，IT)、脑池内、腹膜内、通过吸入、经表面或通过直接注射至一个或更多个细胞、组织或器官而施用于对象。在一些实施方案中，rAAV颗粒通过注射到肝动脉或门静脉中而施用于对象。

在一些实施方案中，向对象施用AAV颗粒的组合物以治疗疾病或病症。“治疗”疾病如该术语在本文所用，意指降低对象经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。上文或本文中其他地方描述的组合物通常以有效量(即能够产生所期望结果的量)施用于对象。期望结果将取决于所施用的活性剂。例如，rAAV颗粒的有效量可以是能够将表达构建体转移至宿主器官、组织或细胞的颗粒的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病(例如肌营养不良)的量。如医学和兽医学领域中公知的，针对任一个对象的剂量取决于许多因素，包括对象的大小、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、总体健康和同时施用的其他药物。

在一些实施方案中，本文公开的细胞是从对象分离或来源于对象的细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞(例如，从哺乳动物分离或来源于哺乳动物的细胞)。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是从对象的特定组织(如肌肉组织)中分离或来源于其的。在一些实施方案中，细胞是肌肉细胞。在一些实施方案中，细胞是骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，细胞是体外的。在一些实施方案中，细胞是离体的。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，细胞在对象体内(例如，在对象的组织或器官内)。在一些实施方案中，细胞是原代细胞。在一些实施方案中，细胞来自细胞系(例如，永生化细胞系)。在一些实施方案中，细胞是癌细胞或永生化细胞。

在一些实施方案中，“施用”意指以药理学上可用的方式向对象提供物质。

在某些情况下，期望经皮下、眼内、玻璃体内、视网膜下、肠胃外、静脉内(IV)、脑室内、肌内、鞘内(IT)、脑池内、经口、腹膜内、经口或经鼻吸入，或者通过直接注射来直接注射至一种或更多种细胞、组织或器官，来递送在适当配制的本文公开的药物组合物中的本文公开的AAV颗粒。在一些实施方案中，施用是适合用于全身递送的途径，例如通过静脉内注射。在一些实施方案中，施用是适合用于局部递送的途径，例如通过肌内注射。在一些实施方案中，“施用”意指以药理学上可用的方式向对象提供物质。

在一些实施方案中，施用于对象的AAV颗粒的浓度可以是以下数量级：10⁶至10¹⁴个颗粒/ml或10³至10¹⁵个颗粒/ml，或者两范围中任一范围其间的任何值，例如如约10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个颗粒/ml。在一些实施方案中，施用浓度高于10¹³个颗粒/ml的AAV颗粒。在一些实施方案中，施用于对象的AAV颗粒的浓度可以是以下数量级：10⁶至10¹⁴个载体基因组(vector genome，vg)/ml或10³至10¹⁵vg/ml，或两范围中任一范围其间的任何值(例如10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴vg/ml)。在一些实施方案中，施用浓度高于10¹³vg/ml的AAV颗粒。AAV颗粒可以作为单个剂量施用，或者根据可能的需要分成两次或更多次施用，以实现对所治疗的特定疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，将0.0001ml至10ml递送至对象。在一些实施方案中，施用于对象的AAV颗粒的数量可以是以下数量级：10⁶至10¹⁴vg/kg对象体重，或其间的任何值(例如，10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴vg/kg)。在一些实施方案中，施用于对象的AAV颗粒的剂量可以是以下数量级：10¹²至10¹⁴vg/kg。在一些实施方案中，递送至对象(例如，通过本文所述的一种或更多种施用途径)的AAVrh74组合物的体积为0.0001ml至10ml。

在一些实施方案中，将本文公开的组合物(例如，包含AAV颗粒)施用于对象一次。在一些实施方案中，组合物被多次(例如，两次、三次、四次、五次、六次或更多次)施用于对象。根据治疗(例如，提高或缓解)对象中疾病、障碍或病症的一种或更多种症状的需要，可以定期(例如，每天、每隔一天、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次、每六个月一次、每年一次或者更少或更多次)向对象进行重复施用。

对象

本公开内容的方面涉及这样的方法，该方法：用于对象，所述对象例如人或非人灵长类对象；用于对象体内的原位宿主细胞；或者用于来源于对象的宿主细胞(例如，离体或体外)。非人灵长类对象的非限制性实例包括猕猴(例如，食蟹猴或恒河猴)、狨猴、绢毛猴、蜘蛛猴、枭猴、长尾黑颚猴(vervet monkey)、松鼠猴、狒狒、大猩猩、黑猩猩和猩猩。在一些实施方案中，对象是人对象。其他示例性对象包括家养动物，例如狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

在一些实施方案中，对象患有或被怀疑患有可通过基因治疗来治疗的疾病或病症。在一些实施方案中，对象患有或被怀疑患有肌肉疾病或病症。肌肉疾病或病症的典型特征在于基因组中的一个或更多个突变，其导致与肌肉发育、健康、维持和/或功能相关的一种或更多种蛋白质的异常结构或功能。示例性的肌肉疾病和病症包括肌萎缩侧索硬化、夏科-马里-图思病、多发性硬化、肌营养不良(例如，迪谢内肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、贝克肌营养不良或肢带型肌营养不良(LGMD)(例如LGMD 1型或LGMD 2型)、重症肌无力、肌病(例如，X-连锁肌管性肌病)、肌炎、周围神经病或脊髓性肌萎缩。肌肉疾病和病症可以例如通过实验室测试和/或临床医生的评价来表征和鉴定。在一些实施方案中，对象患有或被怀疑患有涉及肌肉细胞的疾病(例如，由一种或更多种肌肉细胞或与其相关的基因中的缺陷(如遗传突变)引起的疾病)。在一些实施方案中，通过测序(例如Sanger或下一代测序)鉴定从对象分离或来源于对象的核酸(例如，来自对象的基因组DNA、mRNA或cDNA)包含突变(例如，在与肌肉发育、健康、维持或功能相关的基因中)。

在一些实施方案中，与肌肉发育、健康、维持或功能相关的基因为肌营养不良蛋白/DMD、SCN4A、DMPK、ACTA、TPM3、TPM2、TNNT1、CFL2、KBTBD13、KLHL30、KKLHL3、KLHL41、LMOD3、MYPN、MTM1、伴肌动蛋白、DNM2、TTN、RYR1、MYH7、TK2、GAA(α-葡糖苷酶)、ClC1、LMNA、CAV3、DNAJB6、TRIM32、结蛋白、LAMA2、COL6A1、COL6A2、COL6A3或DUX4。在一些实施方案中，基因是肌营养不良蛋白(DMD)或MTM1。在一些实施方案中，基因是其中突变已被证明导致肢带型肌营养不良的基因(例如，LGMD1或LGMD2)，例如MYOT、LMNA、CAV3、DNAJB6、DES、TNP03、HNRNPDL、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、FKRP、TTN、POMT1、ANO5、FKTN、POMT2、POMGnT1、DAG1、PLEC1、DES、TRAPPC11、GMPPB、ISPD、GAA、LIMS2、BVES或TOR1A1P1。在一些实施方案中，对象包含与肌肉发育、健康、维持或功能相关的一种或更多种基因的突变体形式。在一些实施方案中，本文公开的方法为对象的细胞(例如，肌肉细胞)提供了与肌肉发育、健康、维持或功能相关的功能形式的基因。

实施例

包含以下实施例以表明本发明的举例说明性实施方案，且不视为限制性的。本领域的普通技术人员应该理解，这些实施例中公开的技术代表了在本发明的实践中发现良好地发挥作用的技术，并因此可以认为构成了其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案做出许多变化并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1.开发在原代入骨骼肌细胞中转导效率提高的衣壳修饰的下一代AAVrh74载体：对肌营养不良基因治疗的意义

越来越清楚的是，对AAV的宿主免疫应答与施用的AAV载体剂量直接相关。例如，虽然多至1×10¹⁴vg/kg的AAV8载体的剂量已被证明是安全的，但在X-连锁肌管性肌病的基因治疗试验中，3×10¹⁴vg/kg的剂量与3名患者的严重并发症相关，所述并发症被证明对其中两名患者是致命的(Hum.Gene Ther.，31：787，2020)。虽然2×10¹⁴vg/kg的AAVrh74载体的剂量已被证明在患有迪谢内肌营养不良的患者中耐受良好(JAMA Neurol.，77：1122-1131，2020)，但期望在显著较低的载体剂量下达到临床效力。以前曾有报道，将特定表面暴露的酪氨酸(Y)残基定点诱变为苯丙氨酸(F)产生了下一代(“NextGen”)AAV2载体，其在降低的剂量下显著更有效(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105：7827-7832，2008；Mol.Ther.，18：2048-2056，2010)，并且免疫原性更低(Blood，8：121：2224-2233，2013)。因为大多数(如果不是全部的话)暴露于表面的Y残基在AAVrh74中是保守的，所以产生了相应的Y733F单突变体(“SM”)和Y733+447F双重突变体(DM)AAVrh74载体。这些表达EGFP报道基因的载体的转导效率分别是HeLa细胞中常规野生型(“WT”)AAVrh74载体的高至约12倍和约16倍高(图1A)。Y-F突变体载体在转导C2C12细胞系的永生化小鼠成肌细胞中也显著更有效(图1B)。先前报道了包含表面暴露的苏氨酸(T)至缬氨酸(V)残基的定点诱变进一步增强了AAV2载体的转导效率(PLoS One，8：e59142，2013)，因此另外产生了Y733+Y447F+T494V三重突变体(“TM”)ssAAVrh74载体，其效率是原代人骨骼肌细胞中第一代ssAAVrh74载体的多至约5倍高(图2)。此外，产生了单突变体T494V、K547R和N665R、三重突变体Y447+733F+N665R和Y447+733F+K547R以及五重突变体Y447+733F+N665R+T494V+K547R ssAAVrh74载体，并测试了它们的转导效率。相对于野生型ssAAVrh74载体，三重突变体中的每一个都显示出HeLa细胞的转导效率提高，五重突变体也是如此，并且这些多重突变体中的每一种的转导效率与Y733+447F+T494V三重突变体的转导效率相似(图3A和3B)。目前正在进行研究以评价体内鼠模型中骨骼肌中突变体ssAAVrh74载体的效力。综上所述，这些研究表明，使用NextGen AAVrh74载体可能会导致在降低的剂量下对人肌营养不良的潜在安全且有效的基因治疗，而不需要免疫抑制。

实施例2.开发在原代人骨骼肌细胞中转基因表达提高的基因组修饰的x代单链AAVrh74载体

天然存在的AAV包含单链DNA基因组，并且很少表达病毒基因，因为ssDNA是无转录活性的，并且没有能够转录ssDNA的RNA聚合酶。类似地，重组ssAAV载体的转基因表达水平也受到负面影响。以前有报道称，载体基因组3’末端的AAV末端反向重复(ITR)中的D-序列在限制来自ssAAV载体的转基因表达中发挥重要作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：10879-10884，1997)。在AAV-ITR的D-序列中识别了NF-κB负调节因子(negativeregulatory factor，NRF)的结合位点，已知其抑制转录。用左ITR(LC1)或者右ITR(LC2)中的S-序列替换D-序列产生了X代(“GenX”)ssAAV载体，其介导了高至8倍的转基因表达提高(J.Virol.，89：952-961，2015)。在本研究中，评价了这些经修饰的ssAAV基因组在AAVrh74衣壳中的衣壳化是否也会导致转基因表达的提高。将HeLa细胞用表达hrGFP报道基因的WT、LC1和LC2载体以1000、3000和10000vg/细胞的感染复数转导，并在转导之后72小时定量hrGFP荧光。如图4A中所示，这些结果记录了，相对于衣壳化没有D-序列替换的基因组的ssAAVrh74载体，由LC1和LC2载体介导的转基因表达分别提高了约5倍和约2.5倍(p＜0.01)。所观察到的转基因表达的提高不是由于LC1和LC2载体进入的提高，如通过qPCR分析从用这些载体中的每一个的转导细胞中分离的低分子量DNA样品定量的近似相似数量的载体基因组所记录的(图4B)。还在以这些载体的每一种以1000、3000和10000vg/细胞的感染复数进行转导的原代人骨骼肌细胞中评价了来自这些载体的转基因表达的程度。荧光图像的定量表明，与常规ssAAVrh74载体相比，ssLC1-AAVrh74载体的转基因表达平均提高约13倍，并且ssLC2-AAVrh74载体的转基因表达平均提高约5倍(图4C)。基于先前发表的关于NextGen AAV2和AAV3血清型载体的研究(Hum.Gene Ther.Meth.，27：143-149，2016)，预期将LC1和LC2GenX AAV基因组衣壳化至NextGen AAVrh74衣壳中将是可行的，以在体内鼠模型中实现显著更高水平的转基因表达。为了测试这样的载体的效力，产生了包含用S-序列替换左ITR的D-序列的Y733+Y447F+T494V三重突变体(“TM”)ssAAVrh74载体，并将其与未进行基因组修饰的TM ssAAVrh74和WT ssAAVrh74载体进行比较。图5和图6A至6B中的结果示出，如通过从载体表达的hrGFP的荧光显微术成像(图5)和流式细胞术(图6A至6B)测得的，TM/D-序列组合的突变体ssAAVrh74载体(“Opt^X”)在HeLa细胞中的转基因表达是WTssAAVrh74载体的约4倍高，并且是TM ssAAVrh74(没有D-序列替换)的转基因表达的约2倍高。这些观察结果在GenX AAVrh74载体在进一步降低的剂量下在肌营养不良的基因治疗中的潜在用途具有重要意义。

实施例3.开发在全身性施用之后在体内小鼠肌肉中和在体外原代人骨骼肌细胞中的转导效率提高的优化的(Opt^X)AAVrh74载体

在一项使用AAV9载体的I/II期临床试验中，报告了严重的不良事件，如导致肾损害和心肺功能不全的补体激活和血小板减少症。在另一项也使用了AAV9载体的试验中，也报告了数个严重的不良事件，如涉及非典型溶血尿毒症综合征和血小板减少症的急性肾损伤，以及最近的一名患者死亡。Sarepta Therapeutics报告了使用AAVrh74载体的I/II期试验的结果，呕吐是唯一的不良事件，表明AAVrh74载体更安全，即使在使用2×10¹⁴vg/kg的高剂量时也是如此。

如前述实施例中所述，衣壳修饰的下一代(“NextGen”)AAVrh74载体和基因组修饰的X代(“GenX”)AAVrh74载体比它们的野生型(WT)对应物显著更有效(还参见Mol.Ther.，29：159-160，2021；Mol.Ther.，29：184-185，2021)。在本实施例中，将两种修饰组合起来产生优化的(“Opt^X”)AAVrh74载体。在体外原代人骨骼肌细胞中评价了Opt^X AAVrh74载体的转导效率。结果表明，这些细胞的转导效率是野生型AAVrh74载体的高至约5倍高。在全身性施用之后，还在体内小鼠肌肉中评价了WT和Opt^X AAVrh74载体的效力。图7A至7D表明了Opt^XAAVrh74载体在腓肠肌(GA；图7A)和胫骨前肌(TA；图7B)中的转导效率为约5倍高。令人感兴趣的是，在GA、TA、膈肌和心肌中的WT或Opt^X AAVrh74载体的总基因组拷贝数彼此之间没有显著差异(图7C)，这表明观察到的Opt^X AAVrh74的载体转导效率的提高可能是由于这些载体的胞内运输和核转运的提高。

综上所述，这些研究表明，使用Opt^X AAVrh74载体可产生在降低剂量的情况下的对人肌营养不良的安全且有效的基因治疗。

实施例4.开发在小鼠骨骼肌细胞系和原代人骨骼肌细胞中转基因表达提高的基因组修饰的Y代(GenY)AAVrh74载体

由于ssDNA无转录活性，因此重组ssAAV载体的转基因表达水平通常相对较低。在AAV载体的左反向末端重复(ITR)中替换D-序列以形成“X代”(“GenX”)AAV载体产生了介导高至8倍的转基因表达提高的AAV载体(J.Virol.，89：952-961，2015)。来自GenX AAVrh74载体的转基因表达程度也是野生型(WT)AAVrh74载体的约5倍高(Mol.Ther.，29：184-185，2021)。AAV2D-序列中的远端10个核苷酸与糖皮质激素受体结合元件(GRE)的共有半位点具有部分同源性，并且糖皮质激素受体信号传导途径在AAV2感染或AAV2载体转导之后被激活(Mol.Ther.，24：S6，2016)。在当前的实施例中，评价了用确定的(authentic)GRE替换D-序列中的远端(相对于核酸载体的末端)10个核苷酸提高来自AAVrh74载体(称为“Y代”(“GenY”)载体)的转基因表达的能力，如图8A中示意性示出。在C2C12小鼠骨骼肌细胞中评价了来自WT和GenY AAVrh74载体的转基因表达。与WT AAVrh74载体相比，GenY AAVrh74载体的转基因表达平均提高约2至3倍(图8B)。在用细胞表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的特异性抑制剂即酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)预处理之后，转基因表达进一步提高了约4至5倍(图8B)。还在原代人骨骼肌细胞中评价了WT、GenX和GenY载体。与WT AAVrh74载体相比，来自GenX和GenY AAVrh74载体的转基因表达分别为约4倍高和约6倍高(图8C)。通过qPCR对从用WT、GenX或GenY AAVrh74载体转导的原代人骨骼肌细胞中分离的低分子量DNA样品的分析示出，用每种载体转导的细胞中具有相似的载体基因组拷贝数(图8D)，表明所观察到的转基因表达的提高不是由于GenX或GenY载体进入的提高。

这些研究表明，衣壳修饰的NextGen+GenY(Opt^Y)AAVrh74载体的组合使用可进一步减少对使用高载体剂量的需要，这对于Opt^Y AAVrh74载体在人中的肌营养不良的安全且有效基因治疗中的潜在用途具有重要意义。

实施例5.Opt^X和Opt^Y AAVrh74载体的体内效力

在该实施例中，测试了包含Y733+Y447F+T494V三重突变体(TM)衣壳和GenX(用左ITR中的S-序列替换D-序列)或GenY(用左ITR中的GRE序列替换替代D-序列的一部分)二者之一修饰的基因组的AAVrh74载体的效力。TM+GenX载体称为“Opt^X”，并且TM+GenY载体称为“Opt^Y”。

为了测试Opt^X载体，向C57BL/6小鼠静脉内施用PBS、一剂野生型AAVrh74颗粒(“WT”)或一剂Opt^X AAVrh74颗粒(“Opt^X”)。WT和Opt^X颗粒的剂量相当于1×10¹²个病毒基因组。在施用颗粒之后八周，收集多种组织并提取RNA。对载体表达的hrGFP mRNA进行逆转录定量PCR(RT-qPCR)。图9A示出了肝(斜条纹柱)、膈肌(实心柱)和心脏(空心柱)中每μg总RNA的hrGFP mRNA的量。结果表明，当在测试的组织中合计值时，Opt^X AAVrh74载体在小鼠组织中实现了相对于WT AAVrh74的约2倍高的hrGFP表达。图9B示出了，当相对于内源性β-肌动蛋白基因表达计算时，在膈肌和心脏中而非肝中的来自Opt^X AAVrh74载体的转基因表达显著高于来自WT AAVrh74载体的转基因表达。

图10A和10B示出了来自施用PBS、WT AAVrh74颗粒或Opt^X AAVrh74颗粒的小鼠的样品中β-肌动蛋白mRNA的表达。结果表明，不同样品之间的β-肌动蛋白表达没有差异，表明在来自Opt^X颗粒处理的小鼠的样品中测得的hrGFP表达提高是由于颗粒特性的改善。

为了测试Opt^Y载体，对C57BL/6小鼠静脉内施用PBS、一剂具有TM衣壳蛋白的AAVrh74颗粒(“TM”)或一剂Opt^Y AAVrh74颗粒(“Opt^Y”)。AAVrh74颗粒的剂量相当于1×10¹²个病毒基因组。在施用颗粒之后八周，收集多种组织。制备组织切片并提取RNA。组织切片的荧光显微术表明，相对于施用仅TM的颗粒，在施用Opt^Y颗粒之后，肝、腓肠肌(“GA”)和胫骨前肌(“TA”)中的hrGFP荧光增加(图11A；图11B中量化了荧光)。

图12中示出的结果表明在用仅TM的AAVrh74颗粒(“TM”)处理的小鼠中与用Opt^Y颗粒(“Opt^Y”)处理的小鼠之间，肝(斜条纹柱)、心脏(空心柱)、膈肌(实心柱)、腓肠肌(“GA肌”；方形图案柱)和胫骨前肌(“TA肌”；水平条纹柱)中的载体基因组拷贝数没有显著差异。相比之下，来自AAVrh74载体的hrGFP mRNA表达在某些组织中是不同的。如图13所示，相对于用仅TM的颗粒处理的小鼠，在经Opt^Y颗粒处理的小鼠中，hrGFP表达在肝中降低、在膈肌中提高、在腓肠肌中提高、并且在胫骨前肌中略微提高。

本实施例中呈现的结果表明，在向小鼠进行静脉内施用之后，Opt^X和Opt^Y AAVrh74载体能够实现体内转基因表达谱的提高。

等同方案和范围

虽然本文中已对数个本发明实施方案进行了描述和举例说明，但是本领域普通技术人员将容易想到多种其他方法和/或结构来实现本文中所述功能和/或获得本文中所述结果和/或一个或更多个优点，并且认为这样的变化和/或修改中的每一个均在本文中所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易认识到，本文中所述的所有参数、尺寸、材料和构型均意在是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构型将取决于采用发明教导的一种或更多种特定应用。本领域技术人员将认识或者能够仅使用常规实验就能确定针对本文中描述的具体发明实施方案的许多等同方案。因此，应该理解，前述实施方案仅作为示例示出，并且在所附权利要求书及其等同方案的范围内，本发明实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的其他方式实践。本公开内容的发明实施方案涉及本文中所述的每一个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合均包含在本公开内容的本发明范围内。

如本文中所定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的一般含义。

本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其各自被引用的主题通过引用并入，在一些情况下，其可涵盖文件的全部内容。

除非明确相反地指出，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。

如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解成意指如此连接的要素中的“之一或两者”，即在一些情况下要素共同存在，而在另一些情况下要素分别存在。用“和/或”列举的多个要素应以相同方式理解，即所连接要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体地所指明的要素之外，其他要素可任选地存在，不管与具体地所指明的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与例如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以在一个实施方案中仅指代A(任选地包含除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指代B(任选地包含除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指代A和B二者(任选地包含其他要素)；等。

本文说明书和权利要求书中使用的“或/或者”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应理解为包含性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括其中的多于一个，并且任选地包括另外的未列举项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当用于权利要求书时“由其组成”将是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当前面有排他性术语(例如“任一”、“其一”、“仅其一”或“恰好其一”)时，如本文中使用的术语“或/或者”仅应理解为表示排他性替选方案(即，“一个/种或另一个/种，但并非二者”)。“基本上由其组成”当在权利要求书使用中时其应具有在专利法领域中所使用的一般含义。

如在本文说明书和权利要求中使用的短语“至少一者”在提及一个或更多个要素的列表时应理解为意指从要素列表中的任一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但并不一定包括要素列表中具体列举的每个要素中的至少一者，也不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许可以任选地存在除在短语“至少一个”所提及的要素列表中具体标识的要素之外的要素，无论其与具体指出的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一者”(或等同地，“A或B中的至少一者”，或等同地，“A和/或B中的至少一者”)在一个实施方案中可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，而不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个B，任选地包括多于一个B，而不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，以及至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其它要素)；等等。

还应当理解，除非明确指出相反，在本文中要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于所记载的方法的步骤或动作的顺序。

在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所述，仅过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭式或半封闭式的过渡性短语。应当理解，在本文件中使用开放式过渡性短语(例如，“包含/包括”)描述的实施方案也在替代实施方案中考虑为“由该开放式过渡性短语描述的特征组成”和“基本上由该开放式过渡性短语描述的特征组成”。例如，如果本公开内容描述“包含A和B的组合物”，则本公开内容还涵盖替代实施方案“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。

Claims

1.衣壳蛋白，其在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，其中所述衣壳蛋白是AAVrh74血清型衣壳蛋白，

任选地，其中所述替换是Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F。

2.AAVrh74颗粒，其包含权利要求1所述的衣壳蛋白。

3.权利要求2所述的AAVrh74颗粒，其还包含核酸载体，其中所述核酸载体包含含有第一D-序列的第一反向末端重复(ITR)和包含含有第二D-序列的第二ITR，其中所述第一D-序列或所述第二D-序列被S-序列替换，

任选地，其中所述S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。

4.权利要求2所述的AAVrh74颗粒，其还包含核酸载体，其中所述核酸载体包含含有第一D-序列的第一反向末端重复(ITR)和包含含有第二D-序列的第二ITR，其中所述第一D-序列和/或所述第二D-序列被糖皮质激素受体结合元件(GRE)替换，

任选地，其中所述GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

5.组合物，其包含权利要求1所述的衣壳蛋白。

6.组合物，其包含权利要求2至4中任一项所述的AAVrh74颗粒。

7.方法，其包括使细胞与包含AAVrh74颗粒的组合物接触，其中所述AAVrh74颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，

(ii)其中所述核酸载体包含含有第一D-序列的第一反向末端重复(ITR)和包含含有第二D-序列的第二ITR，其中所述第一D-序列和/或所述第二D-序列被S-序列替换，任选地其中所述S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。

8.方法，其包括使细胞与包含AAVrh74颗粒的组合物接触，其中所述AAVrh74颗粒包含衣壳蛋白和核酸载体，

9.权利要求7或8所述的方法，其中所述衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，任选地其中所述替换是Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F。

10.权利要求7所述的方法，其中所述核酸载体包含所述第一ITR和所述第二ITR，其中所述第一D-序列或所述第二D-序列被所述S-序列替换，任选地其中所述S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)。

11.权利要求8所述的方法，其中所述核酸载体包含所述第一ITR和所述第二ITR，其中所述第一D-序列和/或所述第二D-序列被所述GRE替换，任选地其中所述GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

12.权利要求7所述的方法，其中所述衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，并且

其中所述核酸载体包含所述第一ITR和所述第二ITR，其中所述第一D-序列或所述第二D-序列被所述S-序列替换，

任选地，其中所述替换是Y447F、T494V、K547R、N665R和/或Y733F，并且

13.权利要求8所述的方法，其中所述衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的Y447、T494、K547、N665和/或Y733对应的位置处包含氨基酸替换，并且

其中所述核酸载体包含所述第一ITR和所述第二ITR，其中所述第一D-序列和/或所述第二D-序列被所述GRE替换，

14.权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述衣壳蛋白在与SEQ ID NO：1的野生型AAVrh74衣壳蛋白的以下位置对应的位置处包含氨基酸替换：

(a)Y447和Y733，任选地其中所述替换是Y447F和Y733F；

(b)Y447、Y733和N665，任选地其中所述替换是Y447F、Y733F和N665R；

(c)Y447、Y733和T494，任选地其中所述替换是Y447F、Y733F和T494V；

15.权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR各自为AAV2血清型ITR或AAV3血清型ITR。

16.权利要求7至15中任一项所述的方法，其中所述第一D-序列被所述S-序列替换，或其中所述第一D-序列被所述GRE替换。

17.权利要求7至15中任一项所述的方法，其中所述第二D-序列被所述S-序列替换，或其中所述第二D-序列被所述GRE替换。

18.权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述S-序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列TATTAGATCTGATGGCCGCT(SEQ ID NO：17)，或者

其中所述GRE包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：核苷酸序列AGAACANNNTGTTCT(SEQ ID NO：18)或者其反向或反向互补序列，其中每个N独立地为T、C、G或A。

19.权利要求7至18中任一项所述的方法，其中所述AAVrh74颗粒的转导效率是野生型AAVrh74颗粒的至少两倍高。

20.权利要求7至19中任一项所述的方法，其中所述AAVrh74颗粒的包装效率相对于野生型AAVrh74颗粒降低。

21.权利要求7至20中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含可药用载体。

22.权利要求7至21中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

23.权利要求7至22中任一项所述的方法，其中所述细胞是肌细胞。

24.权利要求7至23中任一项所述的方法，其中所述细胞是骨骼肌细胞。

25.权利要求7至23中任一项所述的方法，其中所述细胞是腓肠肌细胞或胫骨前肌细胞。

26.权利要求7至25中任一项所述的方法，其中所述核酸载体包含调节元件。

27.权利要求26所述的方法，其中所述调节元件包含启动子、增强子、沉默子、绝缘子、响应元件、起始位点、终止信号或核糖体结合位点。

28.权利要求27所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子。

29.权利要求27所述的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。

30.权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子或合成启动子。

31.权利要求7至30中任一项所述的方法，其中所述核酸载体包含目的基因的核苷酸序列。

32.权利要求31所述的方法，其中所述目的基因编码治疗性蛋白质或诊断性蛋白质。

33.权利要求7至32中任一项所述的方法，其中所述接触是在体内的。

34.权利要求33所述的方法，其还包括向对象施用所述包含所述AAVrh74颗粒的组合物。

35.权利要求34所述的方法，其中所述细胞在所述对象中。

36.权利要求34或35所述的方法，其中所述对象是人。

37.权利要求34、35或36所述的方法，其中所述对象处于肌肉疾病的风险中或患有肌肉疾病，任选地，其中所述肌肉疾病为肌萎缩侧索硬化、夏科-马里-图思病、多发性硬化、肌营养不良、重症肌无力、肌病、肌炎、周围神经病或脊髓性肌萎缩。

38.权利要求37所述的方法，其中所述肌肉疾病为迪谢内肌营养不良，任选地，其中所述对象在肌营养不良蛋白基因中具有突变。

39.权利要求37所述的方法，其中所述肌肉疾病为肢带型肌营养不良。

40.权利要求37所述的方法，其中所述肌肉疾病为X-连锁肌管性肌病，任选地，其中所述对象在MTM1基因中具有突变。

41.权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述组合物通过皮下注射、通过肌内注射、通过静脉内注射、通过腹膜内注射、或经口地施用于所述对象。

42.权利要求7至32中任一项所述的方法，其中所述接触是在体外或离体的。