CN114127090A - 在大脑中具有增强的特异性的病毒组合物 - Google Patents

在大脑中具有增强的特异性的病毒组合物 Download PDF

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Abstract

提供了包括重组腺相关病毒(rAAV)的组合物和试剂盒，这些组合物和试剂盒的向性显示出在靶细胞类型，例如大脑和肝脏中的特异性和病毒转导效率增加。还描述了这些rAAV的治疗和生物医学研究应用，包含但不限于使用基于多重Cre重组的AAV靶向进化(M‑CREATE)方法发现rAAV的方法以及通过rAAV介导的转基因疗法治疗各种疾病和病状的方法。

Description

在大脑中具有增强的特异性的病毒组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月11日提交的美国临时专利申请序列号62/832,836的权益和优先权，所述美国临时专利申请的内容以其整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的NS087949、MH117069和OD025535下由政府支持完成的。政府享有本发明的某些权利。
发明内容
重组腺相关病毒(rAAV)由于其能够转导分裂细胞和非分裂细胞、能够以游离DNA的形式长期存在于受感染细胞中和低免疫原性而在基础科学研究和治疗性应用中广泛用作用于基因递送的载体。这些特性使其对于在基础科学和临床方面的应用(如基因疗法)是有吸引力的。然而，需要显著改善现有血清型的性能，以在全身递送到受试者时特异性靶向不同的大脑细胞类型。当AAV必须穿过血脑屏障(BBB)到达中枢神经系统(CNS)时，这种需要尤为迫切。
现有AAV血清型的全身递送显示某些细胞类型和器官的有限转导，而在其它细胞类型和器官中则具有非特异性、重叠的向性。这会在基因疗法应用中导致若干并发症，包含但不限于由于未受影响器官和细胞类型(具体地，肝脏)的转导而引起的脱靶效应，以及需要更大的病毒剂量才能在所关注的组织或器官中达到足够的治疗水平。
本文公开了通过阳性和阴性选择的迭代轮次而在衣壳结构中具有经工程化的特异性的rAAV，从而所产生的变体的向性在CNS中测量时具有增加的特异性和转导效率，并且在一些情况下，在如肝脏等脱靶环境中具有降低的特异性和转导效率。本文描述的rAAVs在全身递送(例如，静脉注射)时实现对受试者体内靶环境(例如，靶细胞类型或组织)的广泛转导。
还提供了使用基于多重Cre重组的AAV靶向进化(M-CREATE)方法工程化本公开的rAAV的方法。M-CREATE方法通过(1)在衣壳蛋白序列中引入变异、(2)体内无偏选择和仅回收那些行进到限定的细胞群的变体、(3)跨细胞膜、(4)行进到细胞核以及(5)解包并表达其基因剂量来产生增强的转导效率和/或特异性。回收并通过深度测序鉴定表现出最期望的向性(例如，对特定体内环境的增强的效率和特异性)的变体衣壳。用于无偏选择和分析的策略包含确定变体的富集评分(通过将靶组织文库相对于起始病毒文库归一化)和通过合成文库构建在选择轮次之间的无偏传播(其中每个变体等同地表示)。还公开了来自测序数据的所得文库的详细表征，其提供了关于针对靶标的变体的选择的有用见解。
本文公开了使用M-CREATE产生的AAV衣壳文库。第一文库，即AAV9中的7聚体肽插入(7聚体i文库)被构建用于跨不同大脑细胞类型(内皮细胞、神经元和星形胶质细胞)进行平行体内选择，并产生AAV9变体的大型池，这些变体具有增强的靶向能力以及跨血脑屏障(BBB)和广泛转导中枢神经系统(CNS)的能力。第二文库，即AAV-PHP.B中的3聚体肽取代(3聚体s文库)通过并入深度测序以回收衣壳而被重新研究。发现AAV-PHP.B变体池，包含以更高特异性转导CNS神经元的变体。本公开的rAAV可以有效地靶向血脑屏障的内皮细胞、可以广泛转导中枢神经系统中不同细胞类型的变体以及对转导神经元表现出更大特异性的变体。
本文公开的方面提供了AAV衣壳，其包括：(a)AAV衣壳蛋白，该AAV衣壳蛋白包括：(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸217到氨基酸736至少98％相同的第一氨基酸序列；以及(ii)插入在SEQ ID NO:1中的氨基酸位置588_589处的与表2-3或图33中提供的氨基酸序列至少57.1％相同的第二氨基酸序列，其中该AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在受试者的中枢神经系统(CNS)中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表2-3或图33中提供的氨基酸序列至少71.4％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表2-3或图33中提供的氨基酸序列至少86.7％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列选自由以下组成的组：TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI、SIERPFK、RYQGDSV和TTLKPFS。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白存在于该AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。在一些实施例中，该AAV衣壳是嵌合的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成该AAV衣壳。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的细胞类型：神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和大脑血管细胞。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的组织：大脑、丘脑、皮质、纹状体、腹侧中脑和脊髓。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代A587D。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代Q588G。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括A589N。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括Q590P。在一些实施例中，在SEQ ID NO:1中的该氨基酸位置588_589处的该第二氨基酸序列不是TLAVPFK、KFPVALT、SVSKPFL、FTLTTPK、MNATKNV、NGGTSSS、TRTNPEA或YTLSQGW。在一些实施例中，该AAV衣壳是分离的和纯化的。在一些实施例中，该AAV衣壳被调配为用于静脉内施用以治疗肝脏的疾病或病状的药物调配物，该药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施例中，该药物调配物进一步包括治疗剂。
本文公开的方面提供了AAV衣壳，其包括AAV衣壳蛋白，该AAV衣壳蛋白包括在SEQID NO:1中提供的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中的氨基酸588与氨基酸589之间的七个氨基酸插入(X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7)，其中X1是选自由以下组成的组的氨基酸：E、D、G、R、S和T。在一些实施例中，X2是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、L、M、N、Q、T和Y。在一些实施例中，X3是选自由以下组成的组的氨基酸：E、K、L、T和Q。在一些实施例中，X4是选自由以下组成的组的氨基酸：G、I、K、L、R、T和V。在一些实施例中，X5是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、G、P、L、Q和V。在一些实施例中，X6是选自由以下组成的组的氨基酸：F、K、N、P、Q、S和V。在一些实施例中，X7是选自由以下组成的组的氨基酸：I、K、L、P和V。在一些实施例中，该七个氨基酸插入选自由以下组成的组：TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI、SIERPFK、RYQGDSV和TTLKPFS。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白存在于该AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。在一些实施例中，该AAV衣壳是嵌合的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成该AAV衣壳。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在受试者的中枢神经系统(CNS)中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的细胞类型：神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的组织：大脑、丘脑、皮质、纹状体、腹侧中脑和脊髓。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括A587D。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括Q588G。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括A589N。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括Q590P。在一些实施例中，该七个氨基酸插入不是TLAVPFK、KFPVALT、SVSKPFL、FTLTTPK、MNATKNV、NGGTSSS、TRTNPEA或YTLSQGW。在一些实施例中，该AAV衣壳是分离的和纯化的。在一些实施例中，该AAV衣壳被调配为用于静脉内施用以治疗肝脏的疾病或病状的药物调配物，该药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施例中，该药物调配物进一步包括治疗剂。
本文提供的方面提供了AAV衣壳，其包括：(a)AAV衣壳蛋白，该AAV衣壳蛋白包括：(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸217到氨基酸736至少98％相同的第一氨基酸序列；以及(ii)位于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置588_589处的与表4或图35中提供的氨基酸序列至少57.1％相同的第二氨基酸序列，其中该AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在受试者的肝脏中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表4或图35中提供的氨基酸序列至少71.4％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表4或图35中提供的氨基酸序列至少86.7％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列选自由以下组成的组：KAYSVQV、PSGSARS和RTANALG。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白存在于该AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。在一些实施例中，该AAV衣壳是嵌合的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成该AAV衣壳。在一些实施例中，该AAV衣壳是分离的和纯化的。在一些实施例中，该AAV衣壳被调配为用于静脉内施用以治疗肝脏的疾病或病状的药物调配物，该药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施例中，该药物调配物进一步包括治疗剂。
本文公开的方面提供了AAV衣壳蛋白，其包括：(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸217到氨基酸736至少98％相同的第一氨基酸序列；以及(ii)插入在SEQ ID NO:1中的氨基酸位置588_589处的与表2-3或图33中提供的氨基酸序列至少57.1％相同的第二氨基酸序列，其中该AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在受试者的中枢神经系统(CNS)中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表2-3或图33中提供的氨基酸序列至少71.4％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表2-3或图33中提供的氨基酸序列至少86.7％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列选自由以下组成的组：TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI、SIERPFK、RYQGDSV和TTLKPFS。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白存在于AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。在一些实施例中，该AAV衣壳是嵌合的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成该AAV衣壳。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的细胞类型：神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和大脑血管细胞。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的组织：大脑、丘脑、皮质、纹状体、腹侧中脑和脊髓。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代A587D。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代Q588G。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括A589N。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括Q590P。在一些实施例中，在SEQ ID NO:1中的该氨基酸位置588_589处的该第二氨基酸序列不是TLAVPFK、KFPVALT、SVSKPFL、FTLTTPK、MNATKNV、NGGTSSS、TRTNPEA或YTLSQGW。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白是分离的和纯化的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白被调配为用于静脉内施用以治疗该肝脏的疾病或病状的药物调配物，该药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施例中，该药物调配物进一步包括治疗剂。
本文公开的方面提供了AAV衣壳蛋白，其包括在SEQ ID NO:1中提供的该AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中的氨基酸588与氨基酸589之间的七个氨基酸插入(X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7)，其中X1是选自由以下组成的组的氨基酸：E、D、G、R、S和T。在一些实施例中，X2是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、L、M、N、Q、T和Y。在一些实施例中，X3是选自由以下组成的组的氨基酸：E、K、L、T和Q。在一些实施例中，X4是选自由以下组成的组的氨基酸：G、I、K、L、R、T和V。在一些实施例中，X5是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、G、P、L、Q和V。在一些实施例中，X6是选自由以下组成的组的氨基酸：F、K、N、P、Q、S和V。在一些实施例中，X7是选自由以下组成的组的氨基酸：I、K、L、P和V。在一些实施例中，该七个氨基酸插入选自由以下组成的组：TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI、SIERPFK、RYQGDSV和TTLKPFS。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白存在于AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。在一些实施例中，该AAV衣壳是嵌合的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成该AAV衣壳。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在受试者的中枢神经系统(CNS)中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的细胞类型：神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞。在一些实施例中，该CNS包括选自由以下组成的组的组织：大脑、丘脑、皮质、纹状体、腹侧中脑和脊髓。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括A587D。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括Q588G。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括A589N。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，该氨基酸取代包括Q590P。在一些实施例中，该七个氨基酸插入不是TLAVPFK、KFPVALT、SVSKPFL、FTLTTPK、MNATKNV、NGGTSSS、TRTNPEA或YTLSQGW。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白是分离的和纯化的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白被调配为用于静脉内施用以治疗该肝脏的疾病或病状的药物调配物，该药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施例中，该药物调配物进一步包括治疗剂。
本文提供的方面提供了AAV衣壳蛋白，其包括：(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸217到氨基酸736至少98％相同的第一氨基酸序列；以及(ii)位于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置588_589处的与表4或图35中提供的氨基酸序列至少57.1％相同的第二氨基酸序列，其中该AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在受试者的肝脏中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表4或图35中提供的氨基酸序列至少71.4％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列与表4或图35中提供的氨基酸序列至少86.7％相同。在一些实施例中，该第二氨基酸序列选自由以下组成的组：KAYSVQV、PSGSARS和RTANALG。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白存在于AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。在一些实施例中，该AAV衣壳是嵌合的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成该AAV衣壳。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白是分离的和纯化的。在一些实施例中，该AAV衣壳蛋白被调配为用于静脉内施用以治疗该肝脏的疾病或病状的药物调配物，该药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施例中，该药物调配物进一步包括治疗剂。
本文公开的方面包括质粒载体，其包括编码本文描述的该AAV衣壳和AAV衣壳蛋白的核酸序列。在一些情况下，该质粒载体是细菌。在一些情况下，该质粒载体衍生自大肠杆菌(Escherichia coli.)。在一些情况下，该核酸序列在5'到3'方向上包括：(1)5'反向末端重复(ITR)序列、(2)复制(Rep)基因、(3)衣壳(Cap)基因和(4)3'ITR，其中该Cap基因编码本文描述的AAV衣壳蛋白。在一些情况下，该质粒载体编码假型AAV衣壳蛋白。在一些情况下，该Cap基因衍生自SEQ ID NO:6-10的任一个中提供的脱氧核糖核酸(DNA)。在一些情况下，包括该Cap基因的该核酸序列与美国申请序列号16/582,635中提供的DNA序列中的任一个DNA序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，该美国申请序列通过引用并入本文。在一些情况下，该5'ITR和该3'ITR衍生自AAV2血清型。在一些情况下，该5'ITR和该3'ITR衍生自AAV5血清型。在一些情况下，该5'ITR和该3'ITR衍生自AAV9血清型。
本文公开的方面提供了治疗受试者疾病或病状的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包括本公开的该AAV衣壳蛋白或该AAV衣壳的药物调配物。在一些实施例中，该疾病或该病状是该受试者的中枢神经系统(CNS)或肝脏的疾病或病状。在一些实施例中，肝脏的疾病或病状选自由以下组成的组：阿拉吉欧综合征(Alagille Syndrome)、酒精相关性肝病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、良性肝脏肿瘤、胆道闭锁、肝硬化、克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler-Najjar Syndrome)、半乳糖血症、吉尔伯特综合征(GilbertSyndrome)、血色病、肝性脑病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝肾综合征、妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(LAL-D)、肝囊肿、肝癌、新生儿黄疸、非酒精性脂肪肝病、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、瑞氏综合征(ReyeSyndrome)、I型糖原贮积病和威尔逊病(Wilson Disease)。在一些实施例中，CNS的疾病或病状选自由以下组成的组：无透明隔、酸性脂肪酶疾病、酸性麦芽糖酶缺乏症、获得性癫痫样失语症、急性弥漫性脑脊髓炎、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、艾迪氏瞳孔(Adie'sPupil)、艾迪氏综合征(Adie's Syndrome)、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不良、认识不能、爱卡迪综合征(Aicardi Syndrome)、爱卡迪-古迪耶斯综合征病症(Aicardi-Goutieres Syndrome Disorder)、AIDS-神经系统并发症、亚历山大病(AlexanderDisease)、阿尔珀斯病(Alpers'Disease)、交替性偏瘫、阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sDisease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、无脑、动脉瘤、天使综合征、血管瘤病、缺氧症、抗磷脂综合征、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿莫德-基亚里畸形(Amold-ChiariMalformation)、动静脉畸形、阿斯伯格综合征(Asperger Syndrome)、共济失调、共济失调毛细血管扩张、共济失调和小脑或脊髓小脑变性、心房颤动和中风、注意力缺陷多动障碍、自闭症谱系障碍、自主神经功能障碍、背痛、巴斯综合征(Barth Syndrome)、巴顿病(BattenDisease)、贝克尔氏肌强直(Becker'sMyotonia)、白塞氏病(Behcet's Disease)、贝尔氏麻痹(Bell's Palsy)、良性原发性眼睑痉挛、良性局灶性肌萎缩症、良性颅内高压、贝姆哈特-罗特综合征(Bemhardt-Roth Syndrome)、宾斯旺格氏病(Binswanger's Disease)、眼睑痉挛、布洛克-苏兹贝格综合征(Bloch-Sulzberger Syndrome)、臂丛神经产伤、臂神经丛损伤、布拉德伯里-埃格莱斯顿综合征(Bradbury-Eggleston Syndrome)、脑和脊柱肿瘤、脑动脉瘤、脑损伤、脊髓侧方压迫-脊髓半断综合征(Brown-Sequard Syndrome)、脊髓延髓性肌肉萎缩症、伴有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病(CADASIL)、卡纳万病(Canavan Disease)、腕管综合征、灼痛、海绵状瘤、海绵状血管瘤、海绵状静脉畸形、中央颈脊髓综合征、脊髓中央综合征、中枢疼痛综合征、脑桥中部髓鞘溶解、脑病症、神经酰胺酶缺乏症、小脑变性、小脑发育不全、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、脑型脚气病、脑海绵状静脉畸形、脑性巨人症、脑缺氧、脑性瘫痪、脑-眼-面-骨骼综合征(Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome，COFS)、夏-马-图病(Charcot-Marie-Tooth Disease)、夏-马-图综合征(Charcot-Marie-Tooth syndrome)、经典肢近端型点状软骨发育不良(RCDP)、小脑扁桃体下疝畸形(Chiari Malformation)、胆固醇酯贮积病、舞蹈病、舞蹈棘状红血球症(Choreoacanthocytosis)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性立位耐力不良、慢性疼痛、II型库卡因综合征、科芬-劳里综合征(Coffin Lowry Syndrome)、空洞脑(Colpocephaly)、昏迷、复杂区域性疼痛综合征、先天性双侧面瘫、先天性肌无力、先天性肌病、先天性血管海绵状畸形、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、克里脑炎(Creeencephalitis)、克鲁兹佛得-雅克病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、累积性创伤病症、库欣综合征(Cushing's Syndrome)、巨细胞包涵体疾病、巨细胞病毒感染、舞蹈眼-舞蹈脚综合征(Dancing Eyes-Dancing Feet Syndrome)、丹迪-沃克综合征(Dandy-WalkerSyndrome)、道森氏病(Dawson Disease)、耳聋、德默西耶氏症(De Morsier's Syndrome)、德热里纳-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumpke Palsy)、痴呆、痴呆-多发梗塞(Dementia-Multi-Infarct)、痴呆-语义(Dementia-Semantic)、痴呆-皮质下(Dementia-Subcortical)、路易体痴呆、齿状小脑共济失调、齿状红核萎缩、皮肌炎、发展性运动障碍、德维奇综合征(Devic's Syndrome)、糖尿病性神经病、弥漫性硬化症、德拉韦综合征(Dravet Syndrome)、杜氏肌营养不良、家族性自主神经异常、书写障碍、诵读困难、吞咽困难、运用障碍、肌阵挛性小脑协调障碍、进行性小脑协同失调、肌张力障碍、早期小儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、嗜睡性脑炎、脑膨出、脑病、脑病(家族性婴儿)、脑三叉神经血管瘤病(Encephalotrigeminal Angiomatosis)、癫痫、癫痫半身不遂、欧勃氏麻痹(Erb'sPalsy)、埃布-杜尚和德热里纳-克隆普克麻痹(Erb-Duchenne and Dejerine-KlumpkePalsies)、原发性震颤、脑桥外髓鞘溶解、法布里病(Fabry Disease)、法尔氏综合征(Fahr's Syndrome)、昏厥、家族性自主神经功能异常、家族性血管瘤、家族性特发性基底神经节钙化、家族性周期性麻痹、家族性痉挛性麻痹、费伯氏肌病(Farber's Disease)、高热惊厥(Febrile Seizures)、肌纤维发育不良、费希尔氏综合征(Fisher Syndrome)、婴儿低肌张力综合征、足下垂、弗里德里希共济失调(Friedreich's Ataxia)、额颞叶痴呆、戈谢病(Gaucher Disease)、广义神经节苷脂沉积症、格斯曼氏综合征(Gerstmann's Syndrome)、格斯特曼-施特劳斯勒-申克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、巨轴索神经病、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体疾病、成胶质细胞瘤、类球状细胞白质营养不良症、舌咽神经痛、糖原贮积病、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、哈勒沃登-斯帕茨病(Hallervorden-Spatz Disease)、头部受伤、头痛、连续性半侧颅痛、半面痉挛、交替偏瘫(Hemiplegia Alterans)、遗传性神经病、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、带状疱疹、耳带状疱疹、平山综合征(Hirayama Syndrome)、福尔摩斯-阿迪综合征(Holmes-Adie syndrome)、前脑无裂畸形、HTLV-1相关性脊髓病、休斯综合征(Hughes Syndrome)、亨廷顿氏病、积水性无脑、脑积水、脑积水-常压、脊髓积水、皮质醇过多症、睡眠过度、张力过强、张力减退、低氧、免疫介导性脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿肌张力过低症、婴儿神经轴索营养不良、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷弗素姆病、婴儿痉挛、枕骨裂露脑畸形、肠脂代谢障碍症、颅内囊肿、颅内高压、艾萨克氏综合征(Isaacs'Syndrome)、朱伯特综合征(Joubert Syndrome)、基恩斯-赛尔综合征(Keams-Sayre Syndrome)、肯尼迪氏病(Kennedy's Disease)、金斯布姆综合征(Kinsboume syndrome)、克莱因-莱文综合征(Kleine-Levin Syndrome)、克莱普尔-菲尔综合征(Klippel-Feil Syndrome)、克莱普尔-特雷纳奈综合征(Klippel-Trenaunay Syndrome，KTS)、克利弗-布西综合征(Kliiver-BucySyndrome)、科萨科夫氏遗忘症(Korsakoffs Amnesic Syndrome)、克拉贝病(KrabbeDisease)、库格伯格-韦兰德病(Kugelberg-Welander Disease)、苦鲁病(Kuru)、莱伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、兰道-克莱夫纳综合征(Landau-Kleffner Syndrome)、股外侧皮神经卡压、延髓外侧综合征、学习障碍、利氏病(Leigh'sDisease)、伦诺克斯-盖斯托综合征(Lennox-Gastaut Syndrome)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan Syndrome)、脑白质营养不良、莱文-克里奇利综合征(Levine-CritchleySyndrome)、路易体痴呆、类脂贮存病、类脂蛋白沉积症、无脑回畸形、闭锁综合征、鲁盖瑞氏症(Lou Gehrig's disease)、狼疮-神经性后遗症、莱姆病-神经系统并发症、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph Disease)、巨脑、巨脑畸形、梅－罗综合征(Melkersson-RosenthalSyndrome)、脑膜炎、脑膜炎和脑炎、门克斯病(Menkes Disease)、感觉异常性股痛、异染性白质营养不良、头小畸型、偏头痛、米勒-费雪综合征(Miller Fisher Syndrome)、小中风、线粒体肌病、莫比斯综合征(Moebius Syndrome)、单肢肌萎缩、运动神经元疾病、烟雾病(Moyamoya Disease)、粘脂贮积病(Mucolipidoses)、黏多糖贮积症、多发性梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化症、多系统萎缩、体位性低血压的多系统萎缩、肌营养不良、肌无力-先天性、重症肌无力、髓鞘破坏性弥漫性硬化、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌病-先天性、肌病-甲状腺毒性、肌强直、先天性肌强直、发作性睡病、神经棘细胞症、伴有脑铁蓄积的神经变性、神经纤维瘤病、抗精神病药物恶性综合征、AIDS的神经系统并发症、莱姆病的神经系统并发症、巨细胞病毒感染的神经系统后果、蓬佩病的神经系统表现、狼疮的神经系统后遗症、视神经脊髓炎、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元迁移病症、神经病-遗传性、神经结节病、神经梅毒、神经毒性、海绵状血管瘤、尼曼-皮克病(Niemann-Pick Disease)、奥沙利文-麦克劳德综合征(O'Sullivan-McLeod Syndrome)、枕神经痛、大田原综合征(Ohtahara Syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、斜视眼阵挛肌阵挛、直立性低血压、过度使用综合征、疼痛-慢性、泛酸激酶相关神经变性、副肿瘤综合征、感觉异常、帕金森氏病、阵发性舞蹈手足徐动症、阵发性偏头痛、帕里-罗姆伯格病(Parry-Romberg)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、佩娜舒凯尔II综合征(Pena Shokeir II Syndrome)、神经周围囊肿、周期性瘫痪、周围神经病变、脑室周围白质软化、持续性植物状态、广泛性发育障碍、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经受压、梨状肌综合征、垂体肿瘤、多肌炎、蓬佩病、孔洞脑、后小儿麻痹综合征、带状疱疹后遗神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、体位性直立性心动过速综合征、体位性心动过速综合征、原发性牙本质萎缩、原发性侧索硬化、原发性进行性失语症、朊病毒病、进行性面部偏侧萎缩、进行性运动性共济失调、进行性多灶性白质脑病、进行性硬化性脊柱营养不良、进行性核上性麻痹、人面失认症、假火炬综合征(Pseudo-Torch syndrome)、假弓形体病综合征、假瘤脑、心因性运动、拉姆齐·亨特综合征I(Ramsay Hunt Syndrome I)、拉姆齐·亨特综合征II、拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen's Encephalitis)、反射性交感神经营养不良综合征、雷弗素姆病、雷弗素姆病-婴儿、重复性运动病症、重复性应激损伤、不安定腿综合征、逆转录病毒相关脊髓病、雷特综合征、瑞氏综合征(Reye's Syndrome)、风湿性脑炎、赖利-戴综合征(Riley-Day Syndrome)、骶神经根囊肿、圣维特斯舞蹈病(Saint Vitus Dance)、唾液腺疾病、桑德霍夫疾病(Sandhoff Disease)、谢耳德氏病(Schilder's Disease)、脑裂畸形、赛特贝格病(Seitelberger Disease)、癫痫发作病症、语义性痴呆、视中隔发育不全、婴儿严重的肌阵挛性癫痫(SMEI)、摇晃婴儿综合征、带状疱疹、香-德综合征(Shy-DragerSyndrome)、修格兰氏综合征(Sjogren's Syndrome)、睡眠呼吸暂停、睡眠病、索托氏综合征(Sotos Syndrome)、痉挛、脊柱裂、脊髓梗死、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩症、脊髓小脑萎缩症、脊髓小脑变性、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基综合征(Steele-Richardson-Olszewski Syndrome)、僵人综合征、纹状体黑质变性、中风、斯特格-韦伯综合征(Sturge-Weber Syndrome)、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、持续时间短、单侧、神经形(SUNCT)头痛、吞咽障碍、西登哈姆舞蹈病、晕厥、梅毒性脊髓硬化症、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、系统性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、塔洛夫囊肿(Tarlov Cyst)、泰-萨二氏病、颞动脉炎、脊髓栓系综合征、汤姆森氏肌强直(Thomsen's Myotonia)、胸廓出口综合征、甲状腺毒性肌病、三叉神经痛、托德氏麻痹(Todd's Paralysis)、妥瑞综合征(TouretteSyndrome)、短暂性脑缺血发作、可传播性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、泰勒综合征(Troyer Syndrome)、结节性硬化症、血管勃起肿瘤、中枢神经系统和外周神经系统血管炎综合征、冯·埃科诺莫病(Von Economo'sDisease)、冯-希珀尔-林道病(Von Hippel-Lindau Disease，VHL)、冯·雷克林豪森氏病(Von Recklinghausen's Disease)、沃伦贝格氏综合征(Wallenberg's Syndrome)、韦德尼格-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman Disease)、韦尼克-科萨科夫综合征(Wemicke-KorsakoffSyndrome)、颈部扭伤、惠普耳氏病(Whipple's Disease)威廉姆斯氏综合征(WilliamsSyndrome)、威尔逊病(Wilson Disease)、沃尔曼氏病(Wolman's Disease)以及X连锁脊髓延髓肌肉萎缩症。在一些实施例中，该药物调配物包括编码治疗性基因表达产物的治疗性核酸。在一些情况下，该治疗性基因表达产物有效地调节选自由以下组成的组的靶基因或基因表达产物的活性或表达：肌聚糖α(SGCA)、谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)、CLN2、神经生长因子(NGF)、运动神经元存活基因(Survival Of Motor Neuron)1、端粒(SMN1)、因子X(FIX)、类视黄醇异构水解酶(retinoid isomerohydrolase)(RPE65)、肌浆网/内质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)、β-葡糖脑苷脂酶(GCase)、共济蛋白(Frataxin，FXN)、亨廷顿蛋白(Huntingtin，HTN)、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)、过氧化物酶体生物发生因子(PEX)、颗粒蛋白前体(GRN)、抗微管蛋白剂、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、葡萄糖基神经酰胺酶β(GBA)、NPC细胞内胆固醇转运体1(NPC1)和NLRP3炎性小体。在一些情况下，该治疗性基因表达产物包括基因编辑组件。在一些情况下，基因编辑组件选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、人工位点特异性RNA核酸内切酶(ASRE)、锌指核酸内切酶(ZFN)、CRISPR/Cas和如效应核酸酶(TALEN)等转录因子。
本文公开的方面提供了由本公开的AAV衣壳制造重组AAV颗粒的方法，这些方法包括：(a)将包括以下的核酸引入到细胞中：(i)编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列；(ii)编码重组病毒基因组的第二核酸序列，所述第二核酸序列包括经修饰以表达本公开的AAV衣壳的衣壳(Cap)基因；以及(iii)编码AAV辅助病毒基因组的第三核酸序列；以及(b)组装该重组AAV颗粒，该重组AAV颗粒包括使该第一核酸衣壳化的该AAV衣壳。
本文公开的方面提供了制造方法，其包括：(a)将包括以下的核酸引入到细胞中：(i)编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列，该第一核酸序列由5'和3'反向末端重复(ITR)序列封闭；(ii)编码病毒基因组的第二核酸序列，该第二核酸序列包括5'ITR序列、复制(Rep)基因、衣壳(Cap)基因和3'ITR，其中该Cap基因编码本文描述的AAV衣壳蛋白；以及(iii)编码选自由E4orf6、E2a和VA RNA组成的组的第一辅助病毒蛋白和任选地包括Ela或Elb55k的第二辅助病毒蛋白的第三核酸序列；(b)在该细胞中表达本文描述的AAV衣壳蛋白；(c)组装包括本文公开的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒；以及(d)将该第一核酸序列包装在该AAV颗粒中。在一些情况下，该细胞是哺乳动物类的。在一些情况下，该细胞是永生的。在一些情况下，该永生的细胞是胚胎干细胞。在一些情况下，该胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在一些情况下，该人胚胎干细胞是人胚胎肾293(HEK-293)细胞。在一些情况下，该Cap基因衍生自SEQ ID NO:6-10的任一个中提供的脱氧核糖核酸(DNA)。在一些情况下，包括该Cap基因的该核酸序列与美国申请序列号16/582,635中提供的DNA序列中的任一个DNA序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，该美国申请序列通过引用并入本文。在一些情况下，该5'ITR和该3'ITR衍生自AAV2血清型。在一些情况下，该5'ITR和该3'ITR衍生自AAV5血清型。在一些情况下，该5'ITR和该3'ITR衍生自AAV9血清型。在一些情况下，该第一核酸序列和该第二核酸序列是反式的。在一些情况下，该第一核酸序列和该第二核酸序列是顺式的。在一些情况下，该第一核酸序列、该第二核酸序列和该第三核酸序列是反式的。
本文公开的方面提供了重组AAV颗粒的制造方法，该方法包括：(a)提供重组AAV基因组，该重组AAV基因组包括：(i)AAV衣壳基因，以及(ii)Cre重组酶的识别序列，其中该识别序列促进可检测的重组酶依赖性变化，并且其中该重组酶识别序列包括两个Cre识别位点；(iii)用该重组AAV基因组转染表达该Cre重组酶的细胞群，由此该Cre重组酶诱导重组事件在该重组AAV基因组中产生该重组酶依赖性变化，并且其中该重组酶依赖性变化包括侧接有该Cre识别位点的序列的反转；(iv)检测该细胞群中的靶细胞中的该重组酶依赖性变化的增加速率；(v)检测该细胞群中的脱靶细胞中的该重组酶依赖性变化的降低速率；以及(vi)鉴定由该重组酶依赖性变化产生的重组AAV基因组，其中所述鉴定的rAAV基因组包括该反转，并且其中所述鉴定的重组AAV基因组编码特征在于对靶细胞具有增加的特异性和对脱靶细胞具有降低的特异性的AAV衣壳颗粒。在一些实施例中，该脱靶细胞是肝细胞。在一些实施例中，该靶细胞是选自由以下组成的组的细胞：神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞。
本文公开的方面提供了试剂盒，其包括：(a)第一载体，该第一载体包括本公开的重组载体；(b)第二载体，该第二载体编码辅助病毒蛋白；以及(c)第三载体，该第三载体包括编码治疗性基因表达产物的治疗性核酸。
本文公开的方面提供了试剂盒，其包括：(a)第一载体，该第一载体包括编码病毒基因组的第一核酸序列，该第一核酸序列在5'到3'方向上包括：(i)5'反向末端重复(ITR)序列；(ii)复制(Rep)基因；(iii)编码本文描述的AAV衣壳蛋白的衣壳(Cap)基因；以及(iv)3'ITR；以及(b)任选的第二载体，该第二载体包括编码辅助病毒蛋白的第二核酸序列，该辅助病毒蛋白包括E4orf6、E2a、VA RNA、Ela和Elb55k中的至少一个。在一些情况下，该试剂盒进一步包括细胞。在一些情况下，该细胞是哺乳动物类的。在一些情况下，该细胞是永生的。在一些情况下，该永生的细胞是胚胎干细胞。在一些情况下，该胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在一些情况下，该人胚胎干细胞是人胚胎肾293(HEK-293)细胞。在一些情况下，该试剂盒进一步包括AAV载体，该AAV载体包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该AAV载体是游离体。
通过引用并入
本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。
附图说明
本发明的新颖特征在附属权利要求中具体阐述。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在其附图中：
图1示出了用于鉴定具有特异性和广泛向性的衣壳的多重选择方法。步骤1-6描述了在第1轮(R1)选择中的工作流程，步骤7-9描述了使用合成池方法的第2轮(R2)选择，步骤1a、2a和6a-b示出了在R1和R2选择后合并深度测序以回收衣壳，并且步骤10-11描述了阳性和/或阴性选择标准，随后是变体表征。
图2示出了呈60聚体(左)、三聚体(中)和单聚体(右)形式的AAV9衣壳(PDB3UX1)的结构模型，其中7聚体i文库的插入位点以红色突出显示。
图3分别示出了在Gibson组装和病毒产生后通过深度测序回收的R1 DNA和病毒文库的经验累积分布频率(ECDF)。
图4示出了从来自Tek-Cre、SNAP25-Cre和GFAP-Cre大脑组织的三个R1文库中回收的变体的分布(n＝每个Cre系2个)，其中衣壳文库按富集评分的降序排序。也绘制了AAV-PHP.V2变体的富集评分。
图5是R2合成池(左)和PCR池(右)文库设计的示意图。
图6示出了显示上述文库与其理论组合物之间的文库重叠百分比的重叠条形图。
图7示出了根据两种方法产生的DNA和病毒文库的直方图，其中文库中的变体按其读段计数(以log 10尺度)进行区间化(binned)，并且直方图的高度与变体频率成比例。
图8示出了来自所有Cre转基因系(n＝每个Cre系2只小鼠，标绘了平均值)和两种方法的R2大脑文库的分布，其中文库按照富集评分(log 10尺度)的降序排序。来自这些文库的阳性富集的变体的总数用虚直线突出显示，并且将AAV9的相对富集绘制在合成池图上。
图9示出了来自Tek-Cre大脑文库的8462个变体的两个替代密码子重复的富集评分(log 10尺度)的比较(n＝2只小鼠，标绘了平均值)。虚线将高置信度信号(>0.3)与噪声分开。对于高置信度信号(下图)，在2个密码子与回归线(最佳拟合)之间确定线性最小二乘法回归。示出了决定系数R2。
图10示出了热图，该热图表示在达到统计显著性的情形下在每个位置处给定AA的相对富集或耗竭的量值(log2倍变化)(如果P值≤0.0001，则用方框表示，两侧，两比例z检验，使用邦弗伦尼校正(Bonferroni correction)对p值进行多次比较校正)。将R2 DNA相对于寡核苷酸池归一化(顶图，约9000个AA序列)，将R2病毒相对于R2 DNA归一化(中间图，n＝约9000个序列)，将来自合成池方法的富集超过0.3(高置信度信号)的R2 Tek大脑文库相对于R2病毒归一化(底图，154个序列)(对于大脑文库，n＝2，每只小鼠一个。所有其它文库，n＝1)。
图11示出了在至少一种Cre依赖性合成池选择(较浅的文字，n＝每种细胞类型2只小鼠，标绘了平均值)的脑组织中富集的变体的跨器官的Cre非依赖性相对富集(n＝每个Cre系2只小鼠，标绘了来自3个Cre系的6个样品的平均值)的热图(左图)。放大示出了最富集CNS的变体(中图)和当前研究中表征的变体以及掺入物文库对照(右图)。
图12示出了在Tek-Cre(左图)、GFAP-Cre(中图)以及组合的SNAP-Cre和Syn-Cre(右图)选择中富集后来自合成池大脑文库的变体的聚类分析。节点的大小表示大脑中的相对富集。表示相关程度的边缘(连接线)的厚度。具有对应的AA频率标志的不同家族(黄色)(AA大小表示流行度并且颜色编码AA性质)。
图13示出了AAV9衣壳的AA位置588-589之间的AAV-PHP变体的7聚体插入肽序列。
图14示出了使用ssAAV:CAG-mNeongreen基因组的AAV9(左图)和AAV-PHP.VI(右图)介导的表达(n＝3，用3×1011vg IV剂量/小鼠在C57BL/6J成年小鼠中表达3周)。这些图像是在与大脑矢状切面(顶图)相同的显微镜设置下采集的，其中更高放大率图像来自皮质(底图)。在图像中使用aGLUT1抗体染色来显示脉管系统。
图15示出了通过Tek-Cre成年小鼠(左图)中的ssAAV-PHP.Vl:CAG-DIO-EYFP(n＝2，表达4周，1×1012vg IV剂量/小鼠)和通过Ail4报告小鼠(右图)中的ssAAV-PHP.Vl:Ple261-iCre(n＝2，表达3周，3×1011vg IV剂量/小鼠)进行的血管转导。组织用aGLUT1染色。
图16示出了用与皮质中mNeongreen(XFP)表达重叠的aGLUT1染色的脉管系统的百分比。报告了单因素方差分析非参数Kruskal-Wallis检验(P值0.0036)和使用未校正邓尼特检验(Dunn’s test)(AAV9对PHP.V1的P值为0.0070)的后续多重比较。示出**P≤0.01，未示出P>0.05；数据是平均值±S.E.M，n＝每个AAV变体3只小鼠，根据每只小鼠每种细胞类型的2-4个图像量化细胞。
图17示出了用与皮质中的mNeongreen(XFP)表达重叠的每种细胞类型特异性标记物(αGLUT1、星形胶质细胞的αS100、神经元的αNeuN、少突胶质细胞谱系细胞的αO1ig2)染色的细胞的百分比。报告了Kruskal-Wallis检验(P值为0.0078)和未校正邓尼特检验(神经元对血管细胞以及神经元对星形胶质细胞的P值分别为0.0235和0.0174)。示出*P 0.05，并且未示出P>0.05；数据是平均值±S.E.M，n＝3只小鼠，根据每只小鼠每种细胞类型的2-4个图像量化细胞。
图18示出了Tek-Cre小鼠(n＝2，平均值来自每只小鼠每个大脑区域的3个图像)中的血管转导的效率(如图16所描述)。
图19示出了Ail4小鼠(n＝2，平均值来自每只小鼠每个大脑区域的4个图像)中的血管转导的效率。
图20示出了矢状大脑和肝脏切片中的AAV-PHP.B4-B6和C1变体以及B、eB和AAV9对照的转导。在采集的每组图像(列式)中，显微镜设置与AAV-PHP.eB相匹配。矢状大脑图像上的白色方框标记的是丘脑，而不是右侧图形的精确区域。载体包装有ssAAV:CAG-2xNLS-EGFP基因组(n＝每组3个，1×1011vg IV剂量/成年C57BL/6J小鼠，表达3周)。组织用以下细胞类型特异性标记物染色：神经元的αNeuN、星形胶质细胞的αS100和少突胶质细胞谱系细胞的αOlig2。肝脏组织用DNA染色剂DAPI染色。
图21-23示出了在指示的大脑区域中的具有可检测的核定位EGFP的αNeuN+(图21)、αS100+(图22)和α01ig2+(图23)细胞的百分比(n＝每组3个，l×1011vg剂量)。使用图基检验(Tukey’s test)对多重比较进行校正的双因素方差分析在经调整的P值的情况下报告(绘图示出****p≤0.0001，***P≤0.001，**P≤0.01，*P≤0.05，并且未示出P>0.05；95％CI，数据是平均值±S.E.M。数据集包括每只小鼠每种细胞类型标记物每个区域的2个图像的平均值)。
图24示出了具有AAV-PHP.B的AA 587-597(或AAV9的对应的AA 587-590)之间的三个AA多样化的组合的3聚体s PHP.B文库的设计。与亲本AAV-PHP.B共享的AA同一性与AAV-PHP.N和AAV-PHP.eB的独特基序一起示出。
图25示出了通过富集评分(相对于R2病毒文库归一化，其中变体以富集评分的降序排序)的R2大脑和肝脏文库(在AA水平下)的分布。跨所有文库的AAV-PHP.eB和AAV-PHP.N的富集绘制在绘图上。
图26示出了热图，该热图表示仅当倍数变化达到统计显著性时，跨多样化区域在每个位置处给定AA的相对富集或耗竭的量值(log2倍变化)(如果p值≤0.0001，则用方框表示，两侧，两比例z检验，使用邦弗伦尼校正对p值进行多次比较校正)。绘图包含在大脑中高度富集的变体(>0.5平均富集评分，其中跨Vglut2、Vgat和GFAP取平均值，n＝每种小鼠系1个文库(从每系2只小鼠汇集的样品))和在肝脏中不能完全呈现的变体(<0.0)(32个AA序列)。
图27示出了来自Vgat大脑文库的富集变体的聚类分析，其中节点大小表示肝脏中的阴性富集的程度，并且边缘(连接线)的厚度表示节点之间的相关程度。两个不同家族以黄色突出显示并且其对应的AA频率标志在下面示出(AA大小表示流行度并且颜色编码AA性质)。
图28示出了具有ssAAV-PHP.N:CAG-2xNLS-EGFP的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系细胞在指示的大脑区域中的百分比(n＝3，每只成年C57BL/6J小鼠1×1011vg IV剂量，表达3周，数据是平均值+S.E.M，皮质、丘脑和纹状体的6-8个图像，以及腹侧中脑的2个图像，每只小鼠每种细胞类型标记物使用20倍物镜覆盖整个区域)。使用图基检验对多重比较进行校正的双因素方差分析给出了经调整的P值，其报告为****P≤0.0001，P>0.05的ns，95％CI。
图29示出了通过ssAAV-PHP.N:CAG-NLS-EGFP(n＝2，每只成年C57BL/6J小鼠2×1011vg IV剂量，表达3周)用NeuN染色(品红色)跨三个大脑区(皮质、SNc(黑质致密部)和丘脑)的转导。
图30示出了聚类分析，该聚类分析示出了本文描述的在先前研究(PHP.B-B3、PHP.eB)或当前研究(PHP.B4-B8、PHP.V1-2、PHP.C1-3)中鉴定的所有变体的大脑富集的序列家族。表示节点之间相关程度的边缘(连接线)的厚度。下面示出了所有讨论的变体的在(AAV9衣壳的)588-589之间插入的AA序列。
图31示出了在矢状大脑切片(右图)中跨三种不同小鼠品系：C57BL/6J、BALB/cJ和FVB/NJ的AAV9、AAV-PHP.V1和AAV-PHP.N的转导，以及丘脑大脑区域的更高放大率图像(左图)。
图32示出了矢状大脑切片中的C57BL/6J和BALB/cJ小鼠的AAV-PHP.B、AAV-PHP.C1-C3的转导(右图)，以及丘脑大脑区域的更高放大率图像(左图)。在图31和32中，矢状大脑图像上的白色方框表示丘脑的位置，而不是左侧图中放大的精确区域。所采集图像的显微镜设置在所有矢状切片和所有丘脑区域匹配。AAV-PHP.V1中的插图是具有增强亮度的放大图。指示的衣壳用于包装ssAAV:CAG-mNeongreen(n＝每组2-3个，每6-8周龄成年小鼠1×1011vg IV剂量，表达3周。图31和32中报告的数据来自一项独立试验，其中所有病毒都是新鲜制备的，并且在同一测定中对剂量一致性进行滴定。AAV-PHP.C2和AAV-PHP.C3在BALB/cJ的独立试验中得到进一步验证，n＝每组2个)。
图33提供了在所有细胞系的大脑组织中阳性富集的7聚体和11聚体变体。
图34提供了在一个特异性文库中富集，但在所有其它大脑和肝脏文库中阴性富集的7聚体和11聚体变体。
图35提供了在肝脏组织的所有cre系中阳性富集的11聚体变体。
图36是在M-CREATE中使用的基因开关的示意图。受体载体示出了用于从Cre+细胞中选择性回收衣壳的Lox位点之间的正向和反向引物的位置。除了被设计用于阻止VP1、VP2和VP3蛋白合成的终止密码子之外，Rep-AAPΔCap载体还示出了Cap基因中480bp的缺失。AAP蛋白质翻译不受这些修饰的影响。
图37是用于使用Cre-Lox翻转策略和用于深度测序的样品制剂从目标群体中选择性回收rAAV基因组的方案的示意图。
图38展示了从特定测序深度获得的R1 DNA和病毒文库的文库覆盖率。
图39示出了在采样的DNA和病毒内，或跨组织内不同Cre系，或跨来自R1选择的组织的变体重叠的百分比。
图40示出了R1选择后跨不同Cre转基因小鼠的通过NGS从大脑组织中回收的文库的AAV衣壳读段计数的分布。虚线仅是说明性的，并且粗略地将信号与噪声分开(参见信号与噪声的估计方法)，其中在此情形下，信号表示R2选择的输入。
图41示出了使用不同处理从组织中回收的rAAV基因组，这些不同处理示出了从0.1g肝脏中回收的总rAAV基因组。
图42示出了每ng提取的总DNA回收的rAAV基因组的百分比。
图43示出了用SmaI限制酶处理或未处理的由trizol提取的rAAV基因组的CT值(来自qPCR的循环阈值)。
图44示出了从来自肝脏组织的1ng总DNA中回收的线粒体DNA的CT值(较小基因组回收的内部对照，倍数变化＝10.79(2ACT))。在图41-44中，n＝4只小鼠；2只来自GFAP-Cre系并且2只来自Tek-Cre系，每个数据点取自三个技术重复物的平均值，误差条为平均值±S.E.M.，Mann-Whitney检验，双尾(在图41、42和44中，精确的P值为0.0286(*P≤0.05)，并且在图43中为0.1143(n.s.，P>0.05，CI 95％)。图41、42和44中报告的数据来自一项独立试验，并且图43报告的数据来自三项独立试验。
图45示出了在R1和R2载体产生中每10ng衣壳DNA文库获得的载体产量。
图46示出了由合成池和PCR池方法产生的DNA和病毒文库在NGS读段计数的标准评分下的分布。病毒文库中的变体按标准评分的降序排序，并且将它们来自相应DNA文库的评分绘制到其上。
图47示出了由合成池和PCR池方法产生的DNA和病毒文库(n＝每个文库1个)的读段计数的标准评分之间的相关性是由线性最小二乘法回归和回归线(最佳拟合)以及表示决定系数的R2确定的。
图48示出了由合成池(左图)和PCR池(右图)设计产生的用于每个Cre系选择的两只小鼠大脑组织中的衣壳文库的分布。
合成池文库设计中引入的掺入物文库的分布在中心处示出。
图49展示了来自由合成池和PCR池方法产生的大脑文库(n＝每个Cre系2个，标绘了平均值)的变体的富集评分的相关性由与关于图47描述的方法相同的方法确定。
图50示出了通过线性最小二乘法回归(n＝每个Cre系2个，标绘了平均值)对来自GFAP-Cre(左图)、SNAP-Cre(中图)和Syn-Cre(右图)大脑文库的变体的两个替代密码子重复的富集评分(log10)之间的相关性分析。虚线将高置信度信号与噪声分开。高置信度信号(下图)通过线性回归线(最佳拟合)进行评估，并且R2表示决定系数。
图51示出了跨不同大脑文库的变体的两个密码子重复之间的富集评分的差异，其中在复制物中回收了超过8000个变体。
图52示出了热图，该热图表示相对于“输入”文库2归一化的“输出”文库1中达到统计显著性的AA偏差的量值(log2倍变化)(如果P值≤0.0001，则用方框表示，双侧，两比例z检验，除了在R1 DNA中相对于已知的NNK模板归一化，在该模板中执行单比例z检验，并且使用邦弗伦尼校正对P值进行多重比较校正)。示出了相对于NNK模板归一化的R1 DNA文库(左上图，约900万个序列)、相对于R1 DNA文库归一化的R1病毒(左下图，约1000万个序列)、相对于R2病毒归一化的大脑中富集评分高于1.0的R2 GFAP文库(右上图，20个序列)以及相对于R2病毒归一化的富集评分高于1.2的R2 SNAP文库(右下图，17个序列)(对于DNA、病毒，n＝1，并且对于大脑文库，n＝2)。
图53示出了通过PCR池设计对来自Tek、GFAP和组合神经元大脑文库(SNAP和Syn)的阳性富集的变体的聚类分析，并且通过具有掺入物文库的合成池设计示出了所述聚类分析，其中节点大小表示其在大脑中的相对富集并且边缘(连接线)的厚度表示节点之间共享AA同一性程度。不同家族以黄色突出显示，其中下面具有对应的AA频率标志(AA大小反映流行度并且颜色基于AA性质编码)。
图54示出了包装CAG启动子驱动mNeonGreen的AAV9(顶行)和AAV-PHP.V1(底行)在所有器官中的表达(n＝3，每只成年C57BL/6J小鼠3×1011vg剂量，表达3周)。
图55示出了在IV递送携带驱动核定位的mTurquoise2报告基因表达的GfABC1D启动子的AAV-PHP.V1(左图)和AAV-PHP.eB(右图)衣壳后皮质星形胶质细胞(S100+)中的表达(每只成年小鼠1×1012vg剂量，表达4周)。量化与mTurquoise2表达重叠的皮质S100+细胞的百分比(n＝2，每个数据点是来自每只小鼠的3个图像的平均值)。
图56示出了单链(ss)AAV9、PHP.eB在Ail4-tdTomato报告基因成年小鼠中的表达(n＝每组2-3个，每只成年小鼠3×1011vg剂量，表达3周)。
图57示出了PHP.V1在Ail4-tdTomato报告基因成年小鼠中的表达(n＝每组2-3个，每只成年小鼠3×1011vg剂量，表达3周)。
图58在左侧示出了携带iCre转基因的包装Ple261启动子在Ail4-tdTomato报告基因成年小鼠(n＝每组2-3个，每只成年小鼠3×1011vg剂量，表达3周)中的表达。在右列中，图58示出了自互补(sc)AAV-PHP.V1的表达，该AAV-PHP.V1携带驱动EGFP的CB6普遍存在的启动子(上图)和驱动EGFP的CAG启动子(下图)。还示出了凝集素DyLight 594染色(n＝2-3，每只成年C57BL/6J小鼠3×1011vg剂量，表达2周)。图56、57和图58左列中的实验是从一个独立试验中报告的，该试验根据一批新的病毒并且在同一测定中对剂量一致性进行滴定。图58中的实验在两个独立试验中得到验证(n＝每组2个)。
图59示出了携带驱动mNeonGreen表达的CAG启动子的AAV-PHP.V2变体和对照AAV9对小鼠大脑的转导(n＝3，每只C57BL/6J成年小鼠3×1011vg IV剂量，表达3周)。矢状大脑图像(左图)是使用与图14中的矢状大脑图像的显微镜设置相同的显微镜设置采集的。示出了用αGLUT或αS100或αO1ig2染色的经AAV-PHP.V2转导的大脑切片的更高放大率图像。
图60示出了在Tek-Cre成年小鼠中通过携带CAG-DIO-EYFP的AAV-PHP.V2对大脑脉管系统的转导(左图，每只小鼠1×1012vg IV剂量，表达4周)，并且其效率(右图)由aGLUT 1染色与跨不同大脑区的EYFP表达的重叠确定(n＝2，每只小鼠每个大脑区域的3个图像的平均值)。
图61示出了GFAP-Cre成年小鼠中AAV-PHP.V2对星形胶质细胞的转导(每只小鼠1×1012vg IV剂量，表达4周)。量化与EYFP表达重叠的皮质S100+细胞的百分比(n＝2，每只小鼠的3个图像的平均值)。
图62示出了量化为作为EGFP+的DAPI+细胞的百分比的肝脏肝细胞的转导水平(n＝3，包装有CAG-2xNLS-EGFP的载体，1×1011vg IV剂量/成年C57BL/6J小鼠，表达3周，平均值±S.E.M，每组每只小鼠4个图像。单因素方差分析、非参数Kruskal-Wallis检验给出的近似P值为0.0088)。
图63示出了使用与图14中的AAV9和AAV-PHP.V1的显微镜设置相同的显微镜设置采集由包装CAG-mNeonGreen基因组的AAV-PHP.B4、B7、AAV-PHP.X1(ARQMDLS)和AAV-PHP.X2(TNKVGNI)对大脑组织的转导(n＝3，1×1011vg IV剂量/成年C57BL/6J小鼠，表达3周)。
图64示出了由使用CAG-mRuby2基因组的AAV-PHP.B8对大脑的转导(n＝3，3×1011vg IV剂量/成年C57BL/6J小鼠，表达3周)。
图65示出了包装CAG-2xNLS-EGFP的AAV9(左图)、AAV-PHP.X3(QNVTKGV)(中图)和AAV-PHP.X4(LNAIKNI)(右图)载体的转导(n＝2，1×1011vg IV剂量/成年C57BL/6J小鼠，表达3周)。图62-65中的数据是根据一项独立试验报告的。
图66-67示出了R1(图66)和R2(图67)大脑文库的分布(在AA水平下，按评分降序排序的RC的标准评分(SS))。跨文库的AAV-PHP.N和AAV-PHP.eB的SS绘制在此绘图的放大视图(虚线框)上。
图68示出了来自相对于R2病毒(输入文库)归一化的R2肝脏文库(前100个序列)的阳性富集的变体跨多样化区域的AA分布的热图。
图69示出了来自GFAP和Vglut2大脑文库的阳性富集的变体的聚类分析，其中节点的大小表示它们在肝脏中的相对阴性富集，并且边缘(连接线)的厚度表示它们在节点之间的相对同一性。
图70示出了包装有ssAAV:CAG-mNeonGreen的AAV-PHP.B(顶行)和AAV-PHP.N(底行)跨所有器官的表达(n＝3，每只成年C57BL/6J小鼠3×1011vg IV剂量，表达3周)。
图71示出了携带驱动mNeonGreen表达的CAG启动子的AAV-PHP.N变体对小鼠大脑的转导(n＝3，每只C57BL/6J成年小鼠3×1011vg IV剂量，表达3周)。荧光原位杂交链式反应(FITC-HCR)用于标记具有Vglut1的兴奋性神经元和具有Gad1的抑制性神经元。EGFP表达与特定细胞标记物共定位的一些细胞用星号符号突出显示。
图72示出了AAV9、AAV-PHP.eB和AAV-PHP.V1在人脑微血管内皮细胞培养物(HBMEC)中的转导。载体包装有ssAAV:CAG-mnongreen。量化各组的平均荧光强度(n＝每组0.95cm2表面积的3个组织培养孔，每剂量每组每个孔的3个图像在表达三天后成像，剂量为每0.95cm2表面积1×108vg和1×1010vg)。使用图基检验对多重比较进行校正的双因素方差分析给出的经调整的P值：针对AAV9对PHP.V1，为0.0051；针对PHP.eB对PHP.V1，为0.0096；对于1×108vg，针对AAV9对PHP.eB，为0.8222；以及针对AAV9对PHP.V1，为0.0052；针对PHP.eB对PHP.V1，为0.0049；对于l×1010vg，针对AAV9对PHP.eB，为0.9996(绘图中示出了**P≤0.01并且未示出P>0.05；平均值±S.E.M，95％CI)。
图73示出了AAV-PHP.B、AAV-PHP.C2和AAV-PHP.C3跨两种不同小鼠品系：C57BL/6J和BALB/cJ对皮质大脑区域的转导。载体包装有ssAAV:CAG-mNeongreen(n＝每组2-3个，1×1011vg IV剂量/成年小鼠，表达3周)。所有图像均使用相同的显微镜设置采集。图72和73中报告的数据来自一项独立试验，其中所有病毒都是新鲜制备的并且在同一测定中针对剂量一致性进行滴定，在BALB/cJ的独立试验中对AAV-PHP.C2和AAV-PHP.C3进行了另外的验证。
图74提供了AAV9和约50个另外的变体(及其替代性密码子复制)的掺入物文库的详细信息，这些变体在先前的出版物中已经被鉴定(包含充分表征的变体，如AAV-PHP.B或AAVPHP.eB，以及许多使用先前方法鉴定但未在体内表征的变体)，充当新变体相对性能的内部选择对照和标准。Deverman,B.E.等人Cre依赖性选择产生用于将基因广泛地转移到成人大脑的AAV变体(Cre-dependent selection yields AAV variants for widespreadgene transfer to the adult brain).《自然分子技术(Nat.Biotechnol.)》34,204-209(2016)和Chan,K.Y.等人用于向中枢和外周神经系统高效无创地递送基因的经工程化的AAV(Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the centraland peripheral nervous systems).《自然神经科学(Nat.Neurosci.)》20,1172-1179(2017)；这些文献中的每一个文献的内容通过引用并入本文。掺入物文库是作为合成池文库的一部分产生的。
图75示出了掺入物文库的富集评分。
具体实施方式
尽管本文中已经示出并描述了本公开的优选情况，但对于本领域的技术人员而言显而易见的是此类情况仅通过举例的方式提供。本领域的技术人员现将在不脱离本公开的情况下意识到大量变型、变化和取代。应当理解的是，本文中描述的本公开的情况的各种替代方案可以用于实践本公开。本发明的意图在于以下权利要求限定了本公开的范围以及由此覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
本文提供了经修饰的腺相关(AAV)病毒衣壳组合物，这些经修饰的腺相关(AAV)病毒衣壳组合物可用于当全身(例如，静脉内、鼻内)施用于受试者时将转基因整合到该受试者的靶细胞或环境(例如，细胞类型或组织)中。本公开的经修饰的AAV衣壳蛋白在对应的亲本AAV衣壳蛋白中包括氨基酸的至少一个插入或取代，其赋予了期望的向性，如与参考AAV衣壳蛋白相比增加或降低的特异性，或者与参考AAV衣壳蛋白相比增加或降低的转基因转导效率。
本文公开了AAV衣壳，所述AAV衣壳经工程化具有期望的向性，如在如组织或细胞等靶体内环境中的增加的病毒转导特异性。在一些实施例中，本公开的AAV衣壳被工程化以特异性靶向受试者的中枢神经系统(CNS)。在一些实施例中，本公开的AAV衣壳被工程化以特异性靶向受试者的肝脏。AAV衣壳可以使具有编码例如治疗性基因表达产物的异源核酸的病毒载体衣壳化。异源核酸在靶体内环境(例如，大脑、肝脏)中的高度特异性转导可以通过将使异源核酸衣壳化的本公开的AAV衣壳全身递送到受试者来实现。本文公开的AAV衣壳在如诊断和/或治疗大脑的单基因疾病(例如，GLUT 1缺陷综合征、ⅢC型粘多糖病)、产生过继细胞疗法和生物医学研究应用等许多应用中是有利的。
AAV衣壳包括AAV衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和VP3)，所述衣壳蛋白各自在亲本AAV衣壳蛋白结构(AAV9 VP1编号)的588环中的氨基酸处具有至少一个氨基酸的插入或取代。588环含有结合AAV2并且适合肽展示的硫酸乙酰肝素位点。AAV9的唯一已知受体是N连接的末端半乳糖和AAV受体(AAVR)，但许多迹象表明还存在其它受体。与啮齿动物模型中的参考AAV相比，本文示出了对AAV9 588环的修饰，以在靶体内环境中赋予增加的特异性和转基因转导。在一些情况下，亲本AAV衣壳蛋白具有AAV血清型9(又称AAV9)。
最常见的AAV介导的转基因递送方法是直接注射到靶体内环境，与低创方法相比，由于许多原因，包含受伤或死亡的风险、疼痛和更高的成本，这是不利的。例如，颅内注射可以引起大脑出血。先前通过静脉内施用进行的AAV介导的递送避免了对直接注射的需要，但是对靶体内环境(例如，组织或细胞)的特异性降低，从而导致脱靶转导事件，并且需要更大的病毒载量才能在靶体内环境中实现足够的治疗水平。当AAV必须穿过血脑屏障(BBB)时，这尤其明显。
公开了包括全身施用本公开的AAV衣壳的方法，该AAV衣壳使包括转基因(例如，治疗性核酸)的病毒载体衣壳化，与参考AAV衣壳蛋白相比，该AAV衣壳具有增加的特异性。本公开的AAV衣壳在受试者中能够穿过BBB并且在特定靶细胞类型(例如，神经元、内皮细胞)中转导转基因。因此，本公开的AAV衣壳蛋白适合用于治疗人类疾病，特别是影响靶体内环境的疾病的转基因疗法。
本文还提供了包含在重组AAV(rAAV)载体中并由本公开的AAV衣壳蛋白衣壳化的转基因。本文公开的转基因出于各种目的递送到受试者，如以治疗受试者的疾病或病状。转基因可以是调节靶基因或基因表达产物的活性或表达的基因编辑组件。可替代地，转基因是编码治疗性基因表达产物的基因，该基因有效地调节其自身或另一靶基因或基因表达产物的活性或表达。
本文提供了鉴定7聚体或3聚体肽插入的方法，该方法包括基于多重Cre重组的AAV靶向进化(M-CREATE)。本公开的M-CREATE方法支持(1)通过使用深度测序来校正选择前病毒产生中的偏差来计算每个变体的真实富集评分，(2)通过创建具有相等变体表示的第1轮后合成池文库来减少连续几轮选择中偏差的传播，(3)通过在池中包含每个所选变体的两个密码子重复来减少假阳性，以及(4)借助于比较多个靶(细胞类型或器官)中回收的衣壳文库的深度测序的阳性和阴性选择标准。这些特征允许对值得体内验证和表征的变体进行知情、自信的选择。
本文公开了产生包括AAV衣壳蛋白和编码治疗性核酸的病毒载体的AAV衣壳的方法。通过将编码转基因(例如，含有治疗性核酸)的第一载体、编码具有AAV衣壳蛋白的AAV基因组的第二载体和编码AAV衣壳结构的组装和转基因在AAV衣壳中的包装所必需的辅助病毒蛋白的第三载体引入到细胞(例如，永生的干细胞)中来产生AAV衣壳蛋白。可以使用本领域已知的合适方法从细胞中分离并纯化组装的AAV衣壳。
本文还提供了包括编码本公开的AAV衣壳蛋白的核酸序列的重组AAV载体。例如，本公开的病毒载体包括核酸序列，该核酸序列包括编码VP1、VP2和VP3的AAV病毒Cap(衣壳)，其中至少一个被修饰以产生本公开的AAV衣壳蛋白。所提供的重组AAV载体可以衍生自AAV血清型(例如，AAV9)。
I.组合物
重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因递送利用病毒转导的AAV机制用于游离异源核酸(例如，转基因、治疗性核酸)的核表达。在递送到宿主体内环境后，rAAV将(1)结合或附着到靶细胞上的细胞表面受体，(2)内吞，(3)行进到细胞核，(4)使病毒脱壳以释放经衣壳化的异源核酸，(5)将异源核酸从单链DNA转换为双链DNA，作为在细胞核中转录的模板，并且(6)在宿主细胞的细胞核中转录游离异源核酸(“转导”)。被工程化以具有增加的特异性(与靶细胞上的细胞表面受体结合)和转导效率(宿主细胞中的游离异源核酸的转录)的rAAV对于基因疗法应用来说是理想的。
rAAV包括可以被工程化以使异源核酸(例如，治疗性核酸、基因编辑机器)衣壳化的AAV衣壳。AAV衣壳由三种AAV衣壳蛋白单体VP1、VP2和VP3构成。这三种VP蛋白的六十个拷贝以1:1:10的比率相互作用形成病毒衣壳(图2)。除了～137氨基酸N末端区域(VP1u)外，VP1还覆盖整个VP2蛋白，除了～65氨基酸N末端区域(VP1/2公共区域)之外，VP2还覆盖整个VP3。这三种衣壳蛋白共享VP3的保守氨基酸序列，在一些情况下，该保守氨基酸序列是从氨基酸位置138开始的区域(例如，AA139-736)。
AAV VP3结构含有所有血清型共有的高度保守的区域，一个核心的八链β-桶基序(βB-βI)和一个小的α-螺旋(αA)。插入β链之间的环区域由β链H与I之间的独特HI环、β链D与E之间的DE环以及形成环的顶部的九个可变区(VR)组成。如AA588环等这些VR存在于衣壳表面上并且可以与AAV生命周期中的特定功能作用(包含受体结合、转导和抗原特异性)相关。
本文公开了AAV衣壳，这些AAV衣壳包括在588环处具有取代的AAV衣壳蛋白，这些AAV衣壳蛋白赋予了期望的向性，该向性的特征在于对特定细胞类型，包含例如大脑细胞类型(例如，大脑内皮细胞、神经元、星形胶质细胞)和肝脏细胞类型的转导具有更高的特异性。具体地，本文公开的AAV衣壳蛋白能够在受试者的大脑或肝脏中进行rAAV介导的异源核酸(例如，转基因)转导。本公开的AAV衣壳或AAV衣壳蛋白可以被调配为药物组合物。另外，AAV衣壳或AAV衣壳蛋白可以被分离和纯化以用于多种应用。
A.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白
本文公开了重组AAV(rAAV)衣壳，该重组AAV衣壳包括被工程化成具有经修饰的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2、VP3)的AAV衣壳蛋白。在一些实施例中，使用本文公开的方法(例如，M-CREATE)产生本公开的rAAV衣壳蛋白。在一些实施例中，在将治疗性核酸(例如，转基因)递送到受试者的方法中使用AAV衣壳蛋白。在一些情况下，rAAV衣壳蛋白具有期望的AAV向性，使得其特别适合于某些治疗应用，例如，如本文所公开的受试者的疾病或病症的治疗。
rAAV衣壳蛋白经工程化以在向受试者全身施用rAAV时优化进入和穿过受试者的血脑屏障(BBB)，如表2-3和图33中提供的那些。AAV介导的将治疗性转基因递送到大脑的现有方法需要颅内注射。颅内注射是一种侵入性程序，其会引起受试者不适，并且在一些情况下还会引起疼痛。例如，颅内注射可以引起大脑出血。另外，颅内递送的扩散有限并且高度异质。表2-4和图33中提供的这些rAAV衣壳蛋白被工程化以具有向性，该向性消除了对颅内注射的需要，同时还实现了经衣壳化的转基因的广泛且高效的转导。具体地，与参考AAV相比，该向性包括在受试者的中枢神经系统(CNS)中的增加的(例如，病毒转导)特异性和效率中的至少一个。
在一些情况下，本文描述的经工程化的AAV衣壳蛋白在588环中的氨基酸位置处具有与亲本AAV衣壳蛋白异源的氨基酸的插入。在一些实施例中，在插入的氨基酸位置处，该氨基酸对于亲本AAV衣壳蛋白而言不是内源的。该氨基酸可以是与不同AAV衣壳蛋白中取代的插入相同或等效的氨基酸位置中的天然存在的氨基酸。
本文提供的方面提供了氨基酸插入，其包括在AA588_589处插入的7个氨基酸聚合物(7聚体)，并且可以另外地包含在侧接7聚体序列的氨基酸位置(例如，AA587-588和/或AA589-590)处的一个或两个氨基酸的取代，以在亲本AAV衣壳蛋白的588环处产生11个氨基酸聚合物(11聚体)。本文描述的7聚体有利地利用简并引物使用聚合酶链反应(PCR)来产生，其中七个氨基酸中的每个氨基酸由脱氧核糖核酸(DNA)序列N-N-K编码。“N”是四个DNA核苷酸中的任一个核苷酸，并且K是鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。这种产生随机7聚体氨基酸序列的方法可以在蛋白质水平上实现12.8亿种可能的组合。由于开发的7聚体是随机的，因此7聚体中的一些氨基酸可以天然存在于AAC衣壳蛋白中的该氨基酸位置处，而其它氨基酸可以有所不同。
产生了各自在588环处具有独特的7聚体或11聚体并且各自使报告基因衣壳化的重组AAV(rAAV)，该rAAV当全身施用于多个转基因动物中时能够选择性地扩增和回收将报告基因有效地转导在转基因动物的靶体内环境中的序列。本文提供了发现在靶体内环境(例如，中枢神经系统、肝脏)中阳性富集的7聚体和11聚体。“富集”是与给定的7聚体或11聚体在施用于转基因动物的病毒文库中的流行度的相比，该给定的7聚体或11聚体在体内环境组织中的流行度。富集评分高于0指示阳性富集。富集评分小于0指示阴性富集。在体内分别测试了具有期望富集谱的rAAV的子集，以确定确切的全身表达(例如，特异性和转导效率)。来自此子集的表现出期望的向性(该向性包括增加的病毒转导特异性，并且在一些情况下，包括增加的转导效率)的rAAV被认为独特地适合于可用于多种目的(例如，治疗、诊断、科学发现)的靶向rAAV介导的转基因递送。
本文描述的具有7聚体或11聚体的rAAV颗粒在靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中具有增加的转导效率。在一些情况下，增加的转导效率包括相对于参考AAV增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、75倍或100倍或更多倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少30倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少40倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少50倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少60倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少80倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少90倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少100倍。
与参考AAV相比，本文描述的具有7聚体或11聚体的rAAV颗粒在靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中具有增加的特异性。检测rAAV对靶体内环境的特异性比参考AAV对靶体内环境的特异性是更多还是更少包含：测量由rAAV衣壳化的异源核酸表达的基因表达产物(例如，RNA或蛋白质)在获自受试者的靶体内环境的组织样品中的水平；并且将测得的水平与对照水平(例如，由参考AAV(例如，AAV9)衣壳化的异源核酸表达的基因表达产物)进行比较。用于测量基因表达产物的表达的合适方法荧光素酶报告基因测定和定量聚合酶链式反应(qPCR)。
增加的特异性与在靶体内环境中的增加的富集相关，在一些情况下，该富集用图33-35中本文提供的富集评分来表示。作为非限制性实例，与参考AAV9(约0％)相比，在本文中示出在大脑中阳性富集(富集评分为约2.51)的AAV-PHP.V2(TTLKPFL)还在大脑(约60％的皮质大脑脉管系统细胞和约60％的用报告基因转导的皮质星形胶质细胞)中表现出报告基因表达的增加(例如，通过荧光报告基因测定测量)。在不受特定理论的束缚的情况下，本公开的发明人将针对本文公开的所有rAAV预期这种相关性，并且进一步地预期更显著的富集评分(无论是阴性还是阳性)将与对体内环境具有更显著的特异性(如通过基因表达产物在体内环境中的所测得水平所指示的)相关。
本文公开的转导效率可以通过以下中的至少一种来测量：(1)靶体内环境或脱靶体内环境中表达由本文公开的经修饰的AAV衣壳蛋白衣壳化的异源核酸的细胞的数量，以及(2)异源核酸在单个细胞中的表达量。当与参考AAV相比时，观察到靶体内环境中rAAV介导的转导的存在或水平增加时，可以推断出对靶体内环境的特异性。当与参考AAV相比时，观察到脱靶体内环境中不存在rAAV介导的转导或rAAV介导的转导的水平降低时，可以推断出对脱靶体内环境缺乏特异性或对脱靶体内环境的特异性降低。
参考AAV可以是选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或其变体。例如，参考AAV可以具有选自由以下组成的组的血清型：AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB和AAV-PHP.S。
本公开的rAAV衣壳蛋白包括在AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中的氨基酸插入。产生本公开的经工程化的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳被称为“亲本”AAV衣壳。在一些情况下，亲本AAV具有选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,《病毒学期刊(J.Virol.)》,45:555-564(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,《病毒学期刊》,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在《分子疗法(Mol.Ther.)》,13(1):67-76(2006)中提供；AAV-11基因组在《病毒学(Virology)》,330(2):375-383(2004)中提供；AAV-12基因组的部分在Genbank登录号DQ813647中提供；AAV-13基因组的部分在Genbank登录号EU285562中提供。
在一些情况下，亲本AAV衍生自具有选自由以下组成的组的血清型的AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。“衍生”自另一种血清型的AAV衣壳蛋白可以是变体AAV衣壳蛋白。变体可以包含例如AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中的异源氨基酸。异源氨基酸可以非天然存在于AAV衣壳蛋白中。异源氨基酸可以天然存在于不同的AAV衣壳蛋白中。在一些情况下，亲本AAV衣壳在美国专利申请序列号62/736,904；16/582,635；62/832,812；和62/832,826中有描述；这些文献中的每一个文献的内容并入本文。例如，亲本AAV衣壳可以在AAV衣壳蛋白的455环处被修饰(例如，在AA452-458处的7聚体的取代，AAV9 VP1编号)。
在一些情况下，亲本AAV是AAV9。在一些情况下，AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO：1。AAV9 VP1衣壳蛋白(＞trlQ6JC40IQ6JC40_9VIRU衣壳蛋白VP1 OS＝腺相关病毒9 OX＝235455GN＝cap PE＝1 SV＝1)的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中提供(MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYTPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL)。在一些情况下，亲本AAV衣壳蛋白序列与SEQ ID NO：1 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源。
本文公开了在氨基酸588与氨基酸589之间的氨基酸位置处的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中的氨基酸(或氨基酸序列)的插入。如本文所使用的，“AA588589”指示氨基酸(或氨基酸序列)的插入紧接在亲本AAV VP衣壳蛋白(VP1编号)的氨基酸序列中的位置588处的氨基酸(AA)之后，并且紧接在位置589处的AA之前。氨基酸587-591包含包括如SEQ ID NO：1中所示的“AQAQA”的基序。示例性AAV衣壳蛋白序列在表1中提供。例如，QAVRTSL插入在AAV9衣壳氨基酸序列中的AA588589处，并在SEQ ID NO：3中提供。在另一个实例中，TLAVPFK插入在AAV9衣壳氨基酸序列中的AA588589处，并在SEQ ID NO：2中提供。可以设想，本文公开的7聚体插入(图33-35，表2-4)可以插入在亲本AAV9衣壳蛋白、其变体或不同血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3等)的亲本AAV的等同氨基酸位置的氨基酸序列中的AA588589处。
在一些情况下，本文描述的11聚体可以包括在AA588589处的7聚体插入以及在氨基酸位置AA587-590处的一个或多个氨基酸的取代。在一些情况下，氨基酸587-590在该位置被对于亲本AAV衣壳蛋白而言内源性的氨基酸取代。在一些情况下，AA587被D(例如，A587D)取代。在一些情况下，AA587被A(例如，Q587A)取代。在一些情况下，AA587被S(例如，Q587S)取代。在一些情况下，AA587被G(例如，Q587G)取代。在一些情况下，AA588被G(例如，Q588G)取代。在一些情况下，AA589被N(例如，A589N)取代。在一些情况下，AA590被P(例如，A590)取代。在非限制性实例中，SEQ ID NO:4(PHP-AAV.eB)包括在AA588_AA589处TLAVPFK的插入以及A587D和Q588G的取代。在另一个非限制性实例中，SEQ ID NO:5(PHP-AAV.N)包括在AA588_AA589处TTLKPFS的插入以及A587D、Q588G、A589N和Q590P的取代。可以设想，除了在氨基酸位置587-590处被任何氨基酸取代之外，本文公开的任何7聚体插入可以包括11聚体。
表1.示例性AAV衣壳蛋白序列
Figure BDA0003406068610000301
Figure BDA0003406068610000311
本文描述的rAAV衣壳蛋白可以是分离的和纯化的。AAV可以通过本领域标准方法，如通过柱色谱法或氯化铯梯度来分离和纯化。用于从辅助病毒中纯化AAV的方法是本领域已知的，并且可以包含在例如以下中描述的方法：Clark等人,《人类基因疗法(Hum.GeneTher.)》,10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,《分子医学方法(MethodsMol.Med.)》,69:427-443(2002)；美国专利第6,566,118号和WO 98/09657。
rAAV衣壳蛋白可以缀合到纳米颗粒、第二分子或病毒衣壳蛋白。在一些情况下，纳米颗粒或病毒衣壳蛋白将使本文描述的治疗性核酸衣壳化。在一些情况下，第二分子是治疗剂，例如小分子、抗体、抗原结合片段、肽或蛋白质，如本文描述的那些。在一些情况下，第二分子是可检测部分。例如，缀合到可检测部分的经修饰的AAV衣壳蛋白可以用于体外、离体或体内生物医学研究应用，该可检测部分用于可视化经修饰的衣壳蛋白。与可检测部分缀合的经修饰的AAV衣壳蛋白也可以用于诊断目的。
靶向中枢神经系统的AAV衣壳蛋白
本文公开了在亲本AAV衣壳蛋白中的上述氨基酸位置处具有至少一个氨基酸的取代或插入的AAV衣壳蛋白，其赋予对受试者的中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的增加的特异性，即使当全身递送时也是如此。本文描述的AAV衣壳蛋白的许多优点之一是其能够靶向CNS并穿透血脑屏障(BBB)。
体内环境可以是细胞。该细胞可以是选自由中枢神经系统(CNS)细胞和外周神经系统(PNS)细胞组成的组的细胞类型。CNS细胞的非限制性实例包含神经元和胶质细胞。胶质细胞可以选自由少突胶质细胞、室管膜细胞和星形胶质细胞组成的组。PNS细胞的非限制性实例包含神经元或胶质细胞。该胶质细胞可以选自由雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞组成的组。
体内环境可以是组织。组织可以是大脑或脊髓。该组织可以是器官的区域，例如，大脑、小脑、脑干、皮质、纹状体、丘脑、侧脑室、壳核、下丘脑、延髓、脑桥、海马体、杏仁核、运动皮质或其组合。
本文公开了在亲本AAV衣壳蛋白中具有至少一个氨基酸插入或取代的AAV衣壳蛋白。该插入或取代可以是至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸或更多个氨基酸的插入或取代。在一些情况下，氨基酸是连续的。在一些情况下，氨基酸不是连续的。
在一些情况下，插入是表2-3或图6中的任一个中提供的序列中的任一个序列中提供的至少一个氨基酸的插入。在一些情况下，插入是表2-3或图6中的任一个中提供的序列中的任一个序列中提供的至少两个氨基酸的插入。在一些情况下，插入是表2-3或图6中的任一个中提供的序列中的任一个序列中提供的至少三个氨基酸的插入。在一些情况下，插入是表2-3或图6中的任一个中提供的序列中的任一个序列中提供的至少四个氨基酸的插入。在一些情况下，插入是表2-3或图6中的任一个中提供的至少五个氨基酸的插入。在一些情况下，插入是表2-3或图6中的任一个中提供的至少六个氨基酸的插入。在一些情况下，插入是表2-3或图6中的任一个中提供的至少七个氨基酸的插入。
本文公开了具有至少一个氨基酸X1的插入的AAV衣壳蛋白，其中X1选自由以下组成的组：A、E、D、G、R、S和T。在一些情况下，插入进一步包括两个氨基酸，其中X2选自由以下组成的组：A、G、I、L、M、N、Q、R、T和Y。在一些情况下，插入进一步包括三个氨基酸，其中X3选自由以下组成的组：E、K、L、T和Q。在一些情况下，插入进一步包括至少四个氨基酸，其中X1选自由以下组成的组：A、E、D、G、R、S和T，X2选自由以下组成的组：A、G、I、L、M、N、Q、R、T和Y，X3选自由以下组成的组：E、K、L、T和Q，并且X4选自由以下组成的组：G、I、K、L、M、R、T和V。在一些情况下，插入进一步包括五个氨基酸，其中选择X5选自由以下组成的组：A、D、G、P、L、Q和V。在一些情况下，插入进一步包括至少六个氨基酸，其中X6选自由以下组成的组：F、K、L、N、P、Q、S和V。在一些情况下，插入进一步包含至少七个氨基酸，其中X7选自由以下组成的组：I、K、L、P、S和V。
在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是连续的(X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7)。在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的任何两个是连续的。在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的任何三个是连续的。在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的任何四个是连续的。在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的任何五个是连续的。在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的任何六个是连续的。在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的任何七个是连续的。在一些实施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7不是连续的。在一些实施例中，插入不是TLAVPFK。
本文公开的7聚体在一些情况下共享共同的基序。7聚体(X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7)在一些情况下可以有利地在位置X1具有T，在位置X2具有F，在阳性X5具有P，在位置X6具有F并且在位置X7具有K或F。在一些实施例中，7聚体包括T-F-X3-X4-P-F-K，其中X3和X4是任何氨基酸。在一些实施例中，7聚体包括T-F-X3-X4-P-F-F，其中X3和X4是任何氨基酸。在一些情况下，X3不是A。在一些情况下，X3是A、S、Q或E或F。在一些情况下，X4不是V。在一些情况下，X4是R、K、V或Q。
在一些情况下，7聚体可以是：X1-F-A-V-P-F-K，其中X1是除T、S或N之外的任何氨基酸；X1-X2-A-V-P-F-K，其中X1是除T、S或N之外的任何氨基酸，并且X2是除F或V之外的任何氨基酸；或X1-X2-X3-V-P-F-K，其中X1是除T、S或N之外的任何氨基酸，X2是除F或V之外的任何氨基酸，并且X3是除A、S、Q、P或T之外的任何氨基酸；或X1-X2-X3-X4-P-F-K，其中X1是除T、S或N之外的任何氨基酸，X2是除F或V之外的任何氨基酸，X3是除A、S、Q、P或T之外的任何氨基酸，并且X4是除V、T、Q、N、F或M之外的任何氨基酸。在一些情况下，7聚体是T-F-A-X4-P-F-K，其中X是除V之外的任何氨基酸。在一些情况下，7聚体是T-L-A-X4-P-F-K，其中X是除T、Q、N、L或M之外的任何氨基酸。
在一些情况下，7聚体(X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7)包括TALKPFL。在一些情况下，7聚体包括TTLKPFL。在一些情况下，7聚体包括TLQIPFK。在一些情况下，7聚体包括TMQKPFI。在一些情况下，7聚体包括SIERPFK。在一些情况下，7聚体包括RYQGDSV。
在一些情况下，AAV衣壳蛋白包括在亲本AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置588_589处的氨基酸序列T-X2-L-K-P-F-L的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的插入，其中X2是A或T。在一些情况下，与参考AAV(例如，AAV9)相比，AAV衣壳蛋白对大脑血管细胞(GLUT1+)中的病毒转导具有增加的特异性。在一些情况下，与参考AAV(例如，AAV9)相比，AAV衣壳蛋白对星形胶质细胞中的病毒转导具有增加的特异性。
在一些情况下，AAV衣壳蛋白包括在亲本AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置588_589处的氨基酸序列T-X2-Q-X4-P-F-X7的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的插入，其中X2是L或M；X4是I、K或L；X7是K或I。在一些情况下，与参考AAV(例如，AAV9)相比，AAV衣壳蛋白对神经元和星形胶质细胞中的病毒转导具有增加的特异性。在一些情况下，氨基酸序列是TLQIPFK。在一些情况下，氨基酸序列是TMQKPFI。在一些情况下，氨基酸序列是TLQLPFK。
在一些情况下，AAV衣壳蛋白包括在亲本AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置588_589处的氨基酸序列S-I-E-R-P-F-K的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的插入。在一些情况下，与参考AAV(例如，AAV9)相比，AAV衣壳蛋白对神经元和星形胶质细胞中的病毒转导具有增加的特异性。
在一些情况下，AAV衣壳蛋白包括在亲本AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置588_589处的氨基酸序列R-Y-Q-G-D-S-V的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的插入。在一些情况下，与参考AAV(例如，AAV9)相比，AAV衣壳蛋白对星形胶质细胞中的病毒转导具有增加的特异性。
表2：可以以更高的效率和特异性靶向CNS的7聚体靶向肽的列表
Figure BDA0003406068610000361
Figure BDA0003406068610000371
Figure BDA0003406068610000381
Figure BDA0003406068610000391
Figure BDA0003406068610000401
Figure BDA0003406068610000411
Figure BDA0003406068610000421
Figure BDA0003406068610000431
Figure BDA0003406068610000441
Figure BDA0003406068610000451
Figure BDA0003406068610000461
Figure BDA0003406068610000471
表3：可以靶向CNS的11聚体靶向肽
Figure BDA0003406068610000472
靶向肝脏的AAV衣壳蛋白
本文公开了在亲本AAV衣壳蛋白中的上述氨基酸位置处具有至少一个氨基酸的取代或插入的AAV衣壳蛋白，其赋予对肝脏增加的特异性。在一些情况下，插入包括表4和/或图35中提供的序列中的任一个序列中提供的至少一个氨基酸。在一些情况下，插入包括表4和/或图35中提供的序列中的任一个序列中提供的至少两个氨基酸。在一些情况下，插入包括表4和/或图35中提供的序列中的任一个序列中提供的至少三个氨基酸。在一些情况下，插入包括表4和/或图35中提供的序列中的任一个序列中提供的至少四个氨基酸。在一些情况下，插入包括表4和/或图35中提供的至少五个氨基酸。在一些情况下，插入包括表4和/或图35中提供的至少六个氨基酸。在一些情况下，插入包括表4和/或图35中提供的至少七个氨基酸。在一些情况下，氨基酸是连续的。在一些情况下，氨基酸不是连续的。在一些情况下，插入是在亲本AAV衣壳蛋白的氨基酸位置588_589处。在一些情况下，亲本衣壳蛋白是SEQ ID NO:1中提供的AAV9衣壳蛋白。
表4.靶向肝脏的7聚体靶向肽的列表
Figure BDA0003406068610000481
Figure BDA0003406068610000491
Figure BDA0003406068610000501
在一些实施例中，本文公开的AAV衣壳和AAV衣壳蛋白是分离的。在一些情况下，本文公开的AAV衣壳和AAV衣壳蛋白是分离的和纯化的。另外，本文公开的AAV衣壳和AAV衣壳蛋白，无论是否为分离的和纯化的，都可以调配成药物调配物，在一些情况下，该药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。
B.异源核酸
本文公开了治疗性核酸，这些治疗性核酸可用于治疗或预防本文所公开的疾病或病状或该疾病或病状的症状。在一些实施例中，这些治疗性核酸编码治疗性基因表达产物。基因表达产物的非限制性实例包含用于治疗、预防和/或改善疾病或病状、或疾病或病状的症状的蛋白质、多肽、肽、酶、抗体、抗原结合片段、核酸(RNA、DNA、反义寡核苷酸、siRNA等)以及基因编辑组件。在一些情况下，这些治疗性核酸通过如本文公开的那些rAAV放置在生物体、受试者的细胞、组织或器官中。
本文公开了rAAV，这些rAAV各自包括病毒载体(例如，单链DNA分子(ssDNA))。在一些情况下，病毒载体包括各自约145个碱基的两个反向末端重复(ITR)序列，该两个ITR序列侧接转基因。在一些实施例中，转基因包括治疗性核酸，并且在一些情况下，包括与开放阅读框(ORF)中的治疗性核酸顺式排列的启动子。启动子能够在靶细胞的细胞核中启动治疗性核酸的转录。ITR序列可以来自任何AAV血清型。AAV血清型的非限制性实例包含AV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在一些情况下，ITR来自AAV2。在一些情况下，ITR来自AAV9。
本文公开了可以包括任何数量的核苷酸的转基因。在一些情况下，转基因可以包括少于约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约200个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约300个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约400个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约500个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约1000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约5000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约10,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约20,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约30,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约40,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约50,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括约500到约5000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括约5000到约10,000个核苷酸。在本文公开的任何情况下，转基因可以包括DNA、RNA或DNA和RNA的杂合体。在一些情况下，转基因可以是单链的。在一些情况下，转基因可以是双链的。
本文公开了可用于调节靶基因或其基因表达产物的表达或活性的转基因。在一些情况下，转基因由本文描述的rAAV颗粒的rAAV衣壳蛋白衣壳化。在一些情况下，将rAAV颗粒递送到受试者以治疗受试者的本文公开的疾病或病状。在一些情况下，递送是全身性的(例如，静脉内、鼻内)。
本文公开的转基因可用于以与健康或正常个体的水平类似的水平表达内源基因。这在治疗与基因表达产物的低表达或表达不足有关的疾病或病状中特别有用。在一些实施例中，本文公开的转基因可用于过表达内源基因，使得内源基因的表达水平高于健康或正常个体的表达水平。另外，转基因可以用于表达外源基因(例如，如抗体、肽、核酸或基因编辑组件等活性剂)。在一些实施例中，治疗性基因表达产物能够改变、增强、增加或诱导细胞中一种或多种内源生物学过程的活性。在一些实施例中，本文公开的转基因可用于减少表达内源基因，例如，显性负基因。在一些实施例中，治疗性基因表达产物能够改变、抑制、减少、预防、消除或削弱细胞中一种或多种内源生物学过程的活性。在一些方面，基因表达的增加是指增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。在一方面，靶基因的蛋白质产物可以增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。在一些方面，基因表达的降低是指增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。在一方面，靶基因的蛋白质产物可以降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。
当内源序列(内源或部分转基因)与转基因一起表达时，内源序列可以是全长序列(野生型或突变体)或部分序列。内源序列可以是功能性的。这些全长或部分序列的功能的非限制性实例包含增加由转基因(例如，治疗性基因)表达和/或充当载体的多肽的血清半衰期。
可以将转基因插入到内源基因中，使得表达内源基因的全部、一些或者不表达内源基因。例如，可以将本文描述的转基因插入到内源性基因座中，使得内源序列中的一些(到转基因的N末端和/或C末端)内源序列或没有任何内源序列被表达为例如与转基因的融合体。在其它情况下，将转基因(例如，具有或不具有内源基因的另外的编码序列)整合到任何内源基因座中，例如安全港基因座。例如，可以将共济蛋白(FXN)转基因插入到内源FXN基因中。可以将转基因插入到任何基因(例如，本文描述的基因)中。
本公开的至少一个优点是实际上任何治疗性核酸均可以用于表达任何治疗性基因表达产物。在一些情况下，治疗性基因表达产物是治疗性蛋白或肽(例如，抗体、抗原结合片段、肽或蛋白质)。在一个实施例中，由治疗性核酸编码的蛋白质的长度介于50-5000个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-2000个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-1000个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-1500个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-800个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-600个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-400个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-200个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质长度介于50-100个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的肽的长度介于4-50个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质是四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽。在一些实施例中，编码的蛋白质包括2-30个氨基酸(例如，5-30、10-30、2-25、5-25、10-25或10-20个氨基酸)的肽。在一些实施例中，编码的蛋白质包括至少11、12、13、14、15、17、20、25或30个氨基酸的肽或不超过50个氨基酸(例如，不超过35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10个氨基酸)的肽。
治疗性蛋白质或肽的非限制性实例包含肾上腺素能激动剂、抗凋亡因子、凋亡抑制剂、细胞因子受体、细胞因子、细胞毒素、促红细胞生成剂、谷氨酸脱羧酶、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、激酶、激酶抑制剂、神经生长因子、轴突导向因子(netrin)、神经活性肽、神经活性肽受体、神经源性因子、神经源性因子受体、神经纤毛蛋白、神经营养因子、神经营养蛋白、神经营养蛋白受体、N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂、神经丛蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白质脱羧酶、蛋白质激酶、蛋白质激酶抑制剂、蛋白水解蛋白、蛋白水解蛋白抑制剂、臂板蛋白、臂板蛋白受体、5-羟色胺转运蛋白、5-羟色胺摄取抑制剂、5-羟色胺受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂受体和肿瘤抑制剂。在某些实施例中，治疗性蛋白质或肽选自由以下组成的组：脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、巨噬细胞集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、促性腺激素、干扰素-γ(IFN)、胰岛素样生长因子1(IFG-1)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、色素上皮源性因子(PEDF)、转化生长因子(TGF)、转化生长因子-β(TGF-B)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、催乳素、生长激素、X连锁凋亡抑制蛋白1(XIAP1)、白介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10、病毒性IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17和IL-18。
治疗性基因表达产物可以包括基因编辑组件。基因编辑组件的非限制性实例包含CRISPR/Cas、人工位点特异性RNA核酸内切酶(ASRE)、锌指核酸内切酶(ZFN)和转录因子(如效应子核酸酶(TALEN))所需的那些。在非限制性实例中，鉴定了患有亨廷顿氏病(Huntington's disease)的受试者。然后，向该受试者全身性施用第一量的rAAV，该rAAV使编码ZFN的病毒载体衣壳化，该ZFN被工程化以抑制亨廷顿蛋白(HTT)基因的转录。在一些情况下，施用途径是静脉内。rAAV将包含经修饰的AAV衣壳蛋白，该经修饰的AAV衣壳蛋白包含表2-3或图33中的任一个中提供的氨基酸序列，从而允许ZFN正确靶向神经系统，同时重新靶向如肝脏等脱靶器官。如果需要，向该受试者施用第二或第三剂量的rAAV，直到在该受试者的神经系统中表达治疗有效量的ZFN。在另一个非限制性实例中，鉴定了患有囊性纤维化的受试者。然后，向该受试者全身性施用第一量的rAAV，该rAAV使编码ZFN的病毒载体衣壳化，该ZFN被工程化以抑制囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)基因的转录。在一些情况下，施用途径是鼻内(例如，鼻内喷雾)。rAAV将包含经修饰的AAV衣壳蛋白，该经修饰的AAV衣壳蛋白包含图33或表2-3中提供的氨基酸序列，以便允许ZFN适当地靶向肺。如果需要，向该受试者施用第二或第三剂量的rAAV，直到在该受试者的肺中表达治疗有效量的ZFN。
治疗性核酸可以包括非蛋白质编码基因，例如，编码反义RNA、RNAi、shRNA和微小RNA(miRNA)、miRNA海绵(sponge)或诱饵(decoy)的序列，用于条件性基因缺失的重组酶递送、条件性(重组酶相关的)表达包含本文描述的基因编辑组件所需的那些。非蛋白质编码基因还可以编码tRNA、rRNA、tmRNA、piRNA、双链RNA、snRNA、snoRNA和/或长非编码RNA(IncRNA)。在一些情况下，非蛋白质编码基因可以调节靶基因或基因表达产物的表达或活性。例如，本文描述的RNA可以用于抑制靶细胞(例如，中枢神经系统(CNS)或外周器官(例如，肺)中的细胞)中的基因表达。在一些情况下，基因表达的抑制是指抑制至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。在一些情况下，靶基因的蛋白质产物可以被抑制至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。该基因可以是野生型基因或具有至少一个突变的基因。靶蛋白可以是野生型蛋白质或具有至少一个突变的蛋白质。
治疗性核酸可以调节与大脑疾病或病症有关的基因或由该基因表达的基因表达产物的表达或活性。例如，在一些情况下，治疗性核酸是本文描述的基因或该基因的经修饰的版本。在另一个实例中，治疗性核酸包括效应子基因表达产物，如对靶向其中的基因具有特异性的基因编辑组件。基因的非限制性实例包含肌聚糖α(SGCA)、谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)、CLN2基因、神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素(neurturin)、运动神经元存活基因1、端粒(SMN1)、β-葡萄糖脑苷脂酶(GCase)、共济蛋白(FXN)、亨廷顿蛋白(HTN)、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)、过氧化物酶体生物发生因子(PEX)、颗粒蛋白前体(GRN)、抗微管蛋白剂、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、葡萄糖基神经酰胺酶β(GBA)、NPC细胞内胆固醇转运体1(NPC1)和NPS3。在一些实施例中，过氧化物酶体生物发生因子(PEX)选自由以下组成的组：PEX1、PEX2、PEX3、PEX4、PEX5、PEX6、PEX7、PEX10、PEX11β、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19和PEX26。在一些情况下，基因或基因表达产物被抑制。在一些情况下，基因或基因表达产物被增强。
治疗性核酸调节与特定器官(例如，肺、心脏、肝脏、肌肉、眼睛)的疾病或病症有关的基因或由该基因表达的基因表达产物的表达或活性。基因的非限制性实例包含囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)、因子X(FIX)、RPE65、类视黄醇异构水解酶(RPE65)、肌聚糖α(SGCA)和肌浆网/内质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)。在一些实施例中，治疗性基因表达产物源自人、鼠、鸟类、猪、牛、绵羊、猫、犬、马、epine、山羊、狼或灵长类动物。在一些情况下，基因或基因表达产物被抑制。在一些情况下，基因或基因表达产物被增强。
C.AAV载体
本文公开了包括遗传信息的腺相关病毒(AAV)载体。本文描述的AAV载体可用于rAAV的组装和异源核酸的病毒包装。另外，AAV载体可以编码包括异源核酸的转基因。在一些情况下，该AAV载体来自选自由以下组成的组的AAV血清型：AV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在一些情况下，该AAV载体来自选自由AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB和AAV-PHP.S组成的组的经修饰的AAV血清型。
AAV载体可以包括转基因，该转基因在一些情况下编码异源基因表达产物(例如，治疗性基因表达产物、重组衣壳蛋白等)。转基因与侧接该转基因的两个反向末端重复序列(ITR)是顺式的。转基因可以包括编码治疗性基因表达产物的治疗性核酸。由于rAAV的包装能力有限(约2.5kB)，在一些情况下，较长的转基因可以会在两个AAV载体之间分裂，第一个具有3'剪接供体并且第二个具有5'剪接受体。在细胞共感染后，形成串联体，将该串联体剪接在一起以表达全长转基因。
通常插入转基因，使得其表达由整合位点处的内源启动子(即驱动转基因插入其中的内源基因的表达的启动子)驱动。在一些情况下，转基因包括启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织/细胞特异性启动子。作为非限制性实例，启动子可以是CMV启动子、CMV-β-肌动蛋白-内含子-β-球蛋白杂交启动子(CAG)、CBA启动子、FRDA或FXN启动子、UBC启动子、GUSB启动子、NSE启动子、突触蛋白启动子、MeCP2启动子、GFAP启动子、H1启动子、U6启动子、NFL启动子、NFH启动子、SCN8A启动子或PGK启动子。作为非限制性实例，启动子可以是组织特异性表达元件，包含但不限于人延伸因子lα亚基(EF1α)、即刻早期巨细胞病毒(CMV)、鸡β-肌动蛋白(CBA)和其衍生的CAG、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)和泛素C(UBC)。转基因可以包含用于神经元的组织特异性表达元件，如但不限于神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板源性生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、NFL、NFH、np32、PPE、Enk和EAAT2启动子。转基因可以包括用于星形胶质细胞的组织特异性表达元件，如但不限于胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和EAAT2启动子。转基因可以包括用于少突胶质细胞的组织特异性表达元件，如但不限于髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。
在一些实施例中，该启动子小于1kb。该启动子的长度可以为200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或大于800。该启动子的长度可以介于200-300之间、介于200-400之间、介于200-500之间、介于200-600之间、介于200-700之间、介于200-800之间、介于300-400之间、介于300-500之间、介于300-600之间、介于300-700之间、介于300-800之间、介于400-500之间、介于400-600之间、介于400-700之间、介于400-800之间、介于500-600之间、介于500-700之间、介于500-800之间、介于600-700之间、介于600-800之间或介于700-800之间。该启动子可以在靶组织(如但不限于中枢神经系统和外周器官(例如，肺))中提供治疗性基因表达产物的表达持续一定时间段。治疗性基因表达产物的表达可以持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或多于65年。有效载荷的表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年、或5-10年、或10-15年、或15-20年、或20-25年、或25-30年、或30-35年、或35-40年、或40-45年、或45-50年、或50-55年、或55-60年、或60-65年。
AAV载体可以包括辅助病毒的基因组。重组AAV(rAAV)的组装和将含有异源核酸的转基因包装到rAAV中需要辅助病毒蛋白。辅助病毒基因是在细胞中表达时辅助AAV复制的腺病毒基因E4、E2a和VA。在一些实施例中，AAV载体包括E2。在一些实施例中，AAV载体包括E4。在一些实施例中，AAV载体包括VA。在一些情况下，AAV载体包括辅助病毒蛋白之一或任何组合。
AAV载体可以包括病毒基因组，该病毒基因组包括编码本文描述的重组AAV(rAAV)衣壳蛋白的核酸。病毒基因组可以在第一开放阅读框(ORF1)中包括编码Rep蛋白的复制(Rep)基因和编码AAP蛋白的衣壳(Cap)基因或者在第二开放阅读框(ORF2)中包括Cap蛋白。Rep蛋白选自由以下组成的组：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。在一些情况下，修饰Cap基因以编码本文描述的经修饰的AAV衣壳蛋白。野生型Cap基因编码三种蛋白VP1、VP2和VP3。在一些情况下，VP1被修饰。在一些情况下，VP2被修饰。在一些情况下，VP3被修饰。在一些情况下，所有三个VP1-VP3被修饰。AAV载体可以包括编码野生型Rep78、Rep68、Rep52、Rep40和AAP蛋白的核酸。
本文公开了包括SEQ ID NO:10-434、860-863、868-949、1068-5661、14841-14880和14961-15053(其是编码本公开的AAV衣壳蛋白的经修饰部分的DNA序列)中的任一个的AAV载体。在一些情况下，AAV载体包括SEQ ID NO:10-434和868-949中的任一个提供的核酸序列，其编码7聚体修饰的AAV衣壳蛋白部分。本公开的AAV载体可以包括VP1 Cap基因，其包括表5中提供的SEQ ID NO:6-9中的任一个。AAV载体可以包括SEQ ID NO:6-9中的任一个的70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些情况下，将表5中提供的SEQ ID NO:6提供的AAV9 VP1基因修饰为包含SEQID NO:10-434、860-863、868-949、1068-5661、14841-14880和14961-15053中的任一个。在一些情况下，将也在表5中提供的AAV-PHP.eB VP1(SEQ ID NO:9)修饰为包含SEQ ID NO:10-434、860-863、868-949、1068-5661、14841-14880和14961-15053中的任一个。本文描述的AAV载体可以用于通过本文描述的方法产生变体AAV衣壳。
表5.VP1衣壳蛋白核酸序列
Figure BDA0003406068610000571
Figure BDA0003406068610000581
Figure BDA0003406068610000591
Figure BDA0003406068610000601
Figure BDA0003406068610000611
Figure BDA0003406068610000621
II.方法
A.产生AAV的方法
本文公开了如本文公开的那些鉴定重组AAV(rAAV)的方法。使用基于多重Cre重组的AAV靶向进化(M-CREATE)来鉴定对靶体内环境具有特异性的AAV肽。图1提供了使用M-CREATE的工作流程。M-CREATE使用rAAV衣壳基因组(如下实例2所描述的rAAV-Cap-in-cis-lox或rAAV-ΔCap-in-cis-lox2)，该基因组将由来自AAV Rep基因的调控元件控制的全长AAV Cap基因与Cre可逆开关偶联。rAAV-ΔCap-in-cis-lox2主链具有侧接两个lox位点(lox71和lox66)的双向polyA。ΔCap主链是无功能的，因为它缺失了衣壳基因的一部分。在特定位点处将具有诱变的文库片段插入衣壳后，它就会变成功能齐全的载体。在表达Cre重组酶的细胞中，除了将Lox位点翻转为Lox72和LoxP之外，Cre-Lox重组还促进polyA的反转。(参见图1和36)本文公开的随机化7聚体和11聚体是使用PCR产生的，然后将其插入rAAV-ΔCap-in-cis-lox中以在衣壳蛋白序列(例如，在AA588_589处)中产生具有随机化插入或取代的病毒文库。(图1)。在第一轮体内选择中，将病毒文库注射到表达Cre重组酶的转基因动物的血流中(例如，静脉内)。在体内环境(例如，大脑/肝脏)中注射后从转基因动物中获得的组织。使用报告基因表达产物的选择性扩增表达来检测反向报告基因表达盒。分离组织中的rAAV，并且对插入位点周围的病毒基因组进行测序并与AAV9模板DNA片段进行比对。将回收的7聚体和11聚体在靶体内环境中富集并克隆到另一个rAAV-ΔCap-in-cis-lox2主链中，并进行另一轮体内选择。使用合适的方法对在靶体内环境中富集的7聚体和11聚体以及在脱靶体内环境中阴性富集的7聚体和11聚体进行如下一代测序等测序。图33-35提供了使用本文提供的方法鉴定的DNA序列。
方法包括提供包括AAV衣壳基因和Cre重组酶的识别序列的rAAV基因组。在一些情况下，rAAV基因组具有两个侧接报告基因表达盒的Cre重组酶的识别序列。Cre重组酶(例如，LoxP)的识别序列被朝向成使得在细胞中存在Cre重组酶的情况下促进报告基因盒的反转。方法包括用rAAV基因组转染表达Cre重组酶的细胞群。Cre重组酶诱导反转(例如，将报告基因“翻转”到转基因动物的基因组中)。在一些情况下，可以使用如定量聚合酶链式反应或免疫组织化学等任何合适的方法来测量反转速率(例如，靶细胞中报告基因的表达水平)。将报告基因的表达水平与参考值进行比较，该参考值在一些情况下是参考AAV(例如，AAV9)的反转速率。本文公开的方法提供了与参考AAV的反转速率相比，在靶体内环境中检测到反转速率的增加。在一些情况下，与参考AAV的反转速率相比，在脱靶细胞中检测到反转速率的降低。使用本文描述的方法回收的rAAV基因组编码AAV衣壳颗粒(例如，衣壳蛋白、衣壳)，该AAV衣壳颗粒对靶细胞具有增加的特异性，而对脱靶细胞具有降低的特异性。
本文公开了产生本文公开的rAAV的方法。在一些情况下，使用本领域已知的合适方法将在靶细胞(例如，HEK293细胞)中产生AAV所需的所有元件瞬时转染到靶细胞中。例如，本公开的rAAV可以通过共转染三个质粒载体(具有含ITR质粒的携带转基因(例如，治疗性核酸)的第一载体；携带AAV Rep和Cap基因的第二载体；以及(3)提供从腺病毒分离的辅助基因的第三载体)产生。本文描述的方法产生不含腺病毒的高滴度AAV载体。此处公开的Cap基因包括SEQ ID NO:10-434、860-863、868-949、1068-5661、14841-14880和14961-15053中的任一个，其是编码本公开的经修饰的AAV衣壳蛋白的DNA序列。在一些情况下，本公开的rAAV是使用以下中描述的方法产生的：Challis,R.C等人用于在啮齿动物中广泛和靶向基因递送的全身性AAV载体(Systemic AAV vectors for widespread and targetedgene delivery in rodents).《自然实验手册(Nat.Protoc.)》14,379(2019)，该文献通过全文引用的方式特此并入。简而言之，使用聚乙烯亚胺(PEI)执行HEK293T细胞(ATCC)的三重转染，在120小时后从细胞裂解液和培养基中收集病毒并通过碘克沙醇纯化。
本文公开的方法包括：(a)将包括以下的核酸引入到细胞中：(1)编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列；(2)编码病毒基因组组件的第二核酸序列，该第二核酸序列包括：(i)复制(Rep)基因，该复制基因编码Rep蛋白；以及(ii)编码本文描述的经修饰的AAV衣壳蛋白的经修饰的衣壳(Cap)基因；以及(3)编码AAV辅助病毒的基因组的第三核酸序列；以及(b)组装使第一核酸衣壳化的重组AAV(rAAV)衣壳，相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白的向性，该rAAV衣壳包括对受试者的靶体内环境具有增加的特异性并对脱靶体内环境具有降低的特异性的向性。在一些情况下，这些方法进一步包括包装编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列，使得其由经修饰的AAV衣壳蛋白衣壳化。在一些实施例中，使用合适的病毒纯化方法(如本文所述的那些)分离、浓缩和纯化rAAV颗粒。
在非限制性实例中，通过使用标准转染方案(例如，用PEI)对前体细胞(例如，HEK293T)细胞进行三重转染来产生rAAV。在一定时间段后(例如，转染后72小时)从培养基中收获病毒颗粒，并且在稍后的时间点(例如，转染后120小时)从细胞和培养基中收获病毒颗粒。培养基中存在的病毒通过用8％聚(乙二醇)和500mM氯化钠沉淀进行浓缩，并且将沉淀的病毒添加到由收集的细胞制备的裂解物中。通过碘克沙醇(Optiprep，西格马(Sigma))逐步梯度(15％、25％、40％和60％)纯化病毒。将病毒浓缩并在PBS中调配。通过使用qPCR和作为对照的线性化的基因组质粒测量DNasel抗性载体基因组拷贝(VG)的数量来确定病毒滴度。
Rep蛋白可以选自由以下组成的组：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV辅助病毒的基因组包括选自由E2、E4和VA组成的组的AAV辅助基因。第二核酸和第一核酸可以是反式的。第二核酸和第一核酸可以是顺式的。
该细胞可以选自由以下组成的组：人、灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊和狼宿主细胞。在一些情况下，该细胞是祖细胞或前体细胞，如干细胞。在一些情况下，该干细胞是间充质细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、成纤维细胞或其它组织特异性干细胞。该细胞可以是永生的。在一些情况下，该永生的细胞是HEK293细胞。在一些情况下，该细胞是分化的细胞。基于所提供的公开，预期此系统可以与任何转基因株系结合使用，该转基因株系在所关注的靶细胞类型中表达重组酶，以开发更高效地转导该靶细胞群的AAV衣壳。
B.rAAV介导的异源核酸递送方法
本文公开了向有需要的受试者递送异源核酸(例如，本文公开的治疗性核酸或转基因)的方法。转基因可以由重组AAV(rAAV)衣壳蛋白或rAAV颗粒(如本文描述的那些)衣壳化。
方法可以是离体的，例如科学研究目的或用于产生过继性细胞疗法。受试者可以是人原代细胞或成熟细胞或细胞系。受试者可以是来自猴、仓鼠或小鼠的细胞。在任一种情况下，递送可以包含使组合物与细胞或细胞系接触。
方法可以是体内的，例如治疗有需要的受试者的疾病或病状。在一些情况下，受试者可以是哺乳动物，如人或非人灵长类动物，在该情况下，组合物的递送可以包括将组合物施用于受试者。在一些实施例中，异源核酸的递送包括使用本文描述的施用途径中的任一种施用途径向受试者施用该组合物。
在一些实施例中，增加靶体内环境中异源核酸转导的方法包括递送本文描述的rAAV颗粒，该rAAV被工程化以在靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中具有增加的转导效率。在一些情况下，增加的转导效率包括相对于参考AAV增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、75倍或100倍或更多倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少30倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少40倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少50倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少60倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少80倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少90倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少100倍。
还提供了将异源核酸递送到靶体内环境的方法，这些方法包括递送本文描述的rAAV颗粒，该rAAV颗粒被工程化以与参考AAV相比在靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中具有增加的特异性。在一些情况下，方法包括检测rAAV对靶体内环境的特异性是否比参考AAV对靶体内环境的特异性高，其包含测量由rAAV衣壳化的异源核酸表达的基因表达产物(例如，RNA或蛋白质)在获自受试者的靶体内环境的组织样品中的水平；并且将测得的水平与对照水平(例如，由参考AAV(例如，AAV9)衣壳化的异源核酸表达的基因表达产物)进行比较。用于测量基因表达产物的表达的合适方法荧光素酶报告基因测定和定量聚合酶链式反应(qPCR)。
在一些情况下，参考AAV具有选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或其变体。例如，参考AAV可以具有选自由以下组成的组的血清型：AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB和AAV-PHP.S。
递送到CNS
本文提供了将异源核酸递送到靶体内环境的方法，这些方法包括将组合物递送到受试者的选自由中枢神经系统(CNS)组成的组的靶体内环境，该组合物包括具有rAAV衣壳蛋白的rAAV颗粒，该rAAV衣壳蛋白使编码异源核酸(例如，治疗性核酸)的病毒载体衣壳化。在一些实施例中，使异源核酸衣壳化的rAAV颗粒包括rAAV衣壳蛋白，该rAAV衣壳蛋白被工程化为与参考AAV相比具有增加的特异性，并且在一些情况下，当在受试者的CNS或PNS中测量时，具有增加的转导效率，即使当全身施用于受试者时也是如此。
方法包括递送包括rAAV衣壳蛋白的rAAV颗粒，与参考AAV(例如，AAV9)相比，当在受试者的CNS中测量时，该rAAV衣壳蛋白具有增加的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，递送是全身性的。可替代地，递送是直接的(例如，递送到CNS的受感染区中)。
rAAV衣壳蛋白可以包括在亲本AAV的氨基酸序列中表2-3中的任一个中提供的氨基酸序列中提供的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的取代。在一些情况下，X1选自由以下组成的组：A、E、D、G、R、S和T。在一些情况下，插入进一步包括两个氨基酸，其中X2选自由以下组成的组：A、G、I、L、M、N、Q、R、T和Y。在一些情况下，插入进一步包括三个氨基酸，其中X3选自由以下组成的组：E、K、L、T和Q。在一些情况下，插入进一步包括至少四个氨基酸，其中X1选自由以下组成的组：A、E、D、G、R、S和T，X2选自由以下组成的组：A、G、I、L、M、N、Q、R、T和Y，X3选自由以下组成的组：E、K、L、T和Q，并且X4选自由以下组成的组：G、I、K、L、M、R、T和V。在一些情况下，插入进一步包括五个氨基酸，其中选择X5选自由以下组成的组：A、D、G、P、L、Q和V。在一些情况下，插入进一步包括至少六个氨基酸，其中X6选自由以下组成的组：F、K、L、N、P、Q、S和V。在一些情况下，插入进一步包括至少七个氨基酸，其中X7选自由以下组成的组：I、K、L、P、S和V。
本文公开了包括将使异源核酸衣壳化的rAAV颗粒递送到受试者的CNS的方法，该rAAV颗粒包括(i)异源核酸对CNS的增强的特异性和/或转导效率，其中该rAAV颗粒具有rAAV衣壳蛋白，该rAAV衣壳蛋白在亲本AAV衣壳蛋白中的氨基酸位置588_589处包括氨基酸序列TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI或RYQGDSV或表2-3或图33中提供的任何氨基酸序列的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的插入。在一些实施例中，递送是全身性的。在一些实施例中，递送是直接的(例如，注射到体内环境中)。在一些实施例中，亲本AAV衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白(例如，在SEQ ID NO:1中提供)。在一些实施例中，递送比通过参考AAV(例如，AAV9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内)。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是人。
递送到肝脏
在一些情况下，递送异源核酸的方法包括向受试者的靶体内环境递送组合物，该组合物包括具有rAAV衣壳蛋白的rAAV颗粒，该rAAV衣壳蛋白使编码异源核酸(例如，治疗性核酸)的病毒载体衣壳化。在一些情况下，靶体内环境是肝脏。在一些实施例中，使异源核酸衣壳化的rAAV颗粒包括rAAV衣壳蛋白，该rAAV衣壳蛋白被工程化具有增加的特异性，并且在一些情况下，当在受试者的靶体内环境中测量时，具有增加的转导效率，即使当全身施用于受试者时也是如此。
在一些实施例中，方法包括递送包括rAAV衣壳蛋白的rAAV颗粒，与参考AAV(例如，AAV9)相比，该rAAV衣壳蛋白针对受试者的肝脏具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向肝脏的rAAV具有包括在SEQ ID NO:950-1031和15054-15146(图35)中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。
适合于将异源核酸递送到肝脏的rAAV衣壳蛋白可以包括亲本AAV衣壳蛋白中的至少一个氨基酸的插入。在一些情况下，插入包括表4或图35中提供的氨基酸序列中提供的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸。
本文公开了包括将使异源核酸衣壳化的rAAV颗粒递送到选自由受试者肝脏组成的组的靶体内环境的方法，该rAAV颗粒包括异源核酸对靶体内环境的增加的特异性和/或转导效率，其中该rAAV颗粒具有包括表4或图35中提供的氨基酸序列的至少或大约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入的rAAV衣壳蛋白。在一些实施例中，递送比通过参考AAV(例如，AAV9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，方法进一步包括与参考AAV相比减少或消除异源核酸递送在如肝脏等脱靶体内环境中。在一些实施例中，递送的特征在于与参考AAV在靶体内环境中的转导效率相比，在靶体内环境中的(例如，异源核酸的)转导效率增加。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内)。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物。在一些情况下，该哺乳动物是人。
C.治疗方法
本文公开了治疗受试者的疾病或病状或该疾病或病状的症状的方法，这些方法包括向该受试者施用治疗有效量的本文公开的一种或多种组合物(例如，rAAV颗粒、AAV载体、药物组合物)。在一些实施例中，该组合物是本文描述的rAAV衣壳蛋白。在一些实施例中，该组合物是本文描述的分离和纯化的rAAV衣壳蛋白。在一些实施例中，该rAAV颗粒使包括转基因(例如，治疗性核酸)的AAV载体衣壳化。在一些实施例中，该组合物是本文描述的与本文公开的治疗剂缀合的rAAV衣壳蛋白。在一些实施例中，该组合物是包括该rAAV颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中，将该一种或多种组合物单独施用到受试者(例如，独立疗法)。在一些实施例中，将该一种或多种组合物与另外的药剂组合施用。在一些实施例中，该组合物是用于该疾病或病状的第一线疗法。在一些实施例中，该组合物是用于该疾病或病状的第二线、第三线或第四线疗法。
本文提供了治疗受试者的疾病或病状或该疾病或病状的症状的方法，这些方法包括：(a)诊断患有影响靶体内环境的疾病或病状的受试者；以及(b)通过向该受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物(例如，rAAV颗粒、AAV载体、药物组合物)来治疗该疾病或病状，其中该组合物被工程化以对靶体内环境的具有增加的特异性。
本文公开了治疗受试者的患及靶体内环境的疾病或病状或该疾病或病状的症状的方法，这些方法包括：(a)向该受试者施用组合物(例如，rAAV颗粒、AAV载体、药物组合物)；以及(b)与参考AAV相比，以增加的特异性和/或转导效率将治疗性核酸表达到该受试者的靶体内环境中。在一些情况下，参考AAV是AAV9或其变体。
治疗影响中枢神经系统(CNS)的疾病或病状的方法包括向受试者的CNS施用rAAV颗粒，该rAAV颗粒包括rAAV衣壳蛋白，该rAAV衣壳蛋白在亲本AAV衣壳蛋白中的氨基酸位置588_589处包括氨基酸序列TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI、RYQGDSV或TTLKPFS或表2-3或图33中提供的任何氨基酸序列的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些情况下，插入不是TLAVPFK、KFPVALT、SVSKPFL、FTLTTPK、MNATKNV、NGGTSSS、TRTNPEA或YTLSQGW。在一些实施例中，亲本AAV衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白(例如，在SEQ ID NO:1中提供)。在一些情况下，亲本AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO:1至少95％、96％、96.1、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100.0％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，递送比通过参考AAV(例如，AAV9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内)。在一些实施例中，受试者是人或非人灵长类动物。
治疗患及包括肝脏的靶体内环境的疾病或病状的方法包括向受试者的靶体内环境施用rAAV颗粒，该rAAV颗粒包括rAAV衣壳蛋白，该rAAV衣壳蛋白包括SEQ ID NO:950-1031和15054-15146(图35)中的任一个中提供的氨基酸序列的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的取代。在一些实施例中，方法包括递送包括rAAV衣壳蛋白的rAAV颗粒，与参考AAV(例如，AAV9)相比，该rAAV衣壳蛋白对受试者的肝脏具有增加的特异性。在一些实施例中，经优化用于靶向肝脏的rAAV的氨基酸序列在亲本AAV衣壳蛋白中的氨基酸位置588_589处具有氨基酸序列KAYSVQV、PSGSARS和RTANALG。在一些实施例中，亲本AAV衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白(例如，在SEQ ID NO:1中提供)。在一些情况下，亲本AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO:1至少95％、96％、96.1、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100.0％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，递送比通过参考AAV(例如，AAV9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内或鼻内)。在一些实施例中，受试者是人或非人灵长类动物。
还提供了调节靶基因表达产物的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用本文公开的组合物(例如，rAAV颗粒、AAV载体、药物组合物)。例如，本文提供的方法包括向受试者施用具有rAAV衣壳蛋白的rAAV，该rAAV衣壳蛋白使病毒载体衣壳化，该病毒载体包括调节靶基因表达产物的表达或活性的异源核酸。在一些实施例中，与正常个体相比，疾病或病状的特征在于基因或其基因表达产物的增加或增强的表达或活性。在一些情况下，施用治疗有效量的组合物使基因或其基因表达产物的表达或活性恢复到正常个体中典型的水平。术语“正常个体”是指不患有以该基因或其基因表达产物的表达或活性的变化为特征的疾病或病状的个体。
与中枢神经系统(CNS)疾病或病状有关的基因的非限制性实例包含肌聚糖α(SGCA)、谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)、CLN2基因、神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素(neurturin)、运动神经元存活基因1、端粒(SMN1)、β-葡萄糖脑苷脂酶(GCase)、共济蛋白(FXN)、亨廷顿蛋白(HTN)、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)、过氧化物酶体生物发生因子(PEX)、颗粒蛋白前体(GRN)、抗微管蛋白剂、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、葡萄糖基神经酰胺酶β(GBA)、NPC细胞内胆固醇转运体1(NPC1)和NPS3。在一些实施例中，过氧化物酶体生物发生因子(PEX)选自由以下组成的组：PEX1、PEX2、PEX3、PEX4、PEX5、PEX6、PEX7、PEX10、PEX11β、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19和PEX26。与特定器官(例如，肺、心脏、肝脏、肌肉、眼睛)的疾病或病状有关的基因的非限制性实例包含囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)、因子X(FIX)、RPE65、类视黄醇异构水解酶(RPE65)、肌聚糖α(SGCA)和肌浆网/内质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)。在一些情况下，通过将该组合物施用于受试者来抑制基因的表达或基因表达产物的表达或活性。在一些情况下，通过将该组合物施用于受试者来增强基因的表达或基因表达产物的表达或活性。
在一些情况下，该组合物以在足以每天、一天一次或多次递送约0.0001mg/kg到约100mg/kg、约0.001mg/kg到约0.05mg/kg、约0.005mg/kg到约0.05mg/kg、约0.001mg/kg到约0.005mg/kg、约0.05mg/kg到约0.5mg/kg、约0.01mg/kg到约50mg/kg、约0.1mg/kg到约40mg/kg、约0.5mg/kg到约30mg/kg、约0.01mg/kg到约10mg/kg、约0.1mg/kg到约10mg/kg或约1mg/kg到约25mg/kg受试者体重的剂量水平下施用以获得期望的治疗效果。
在一些情况下，所施用的组合物的病毒基因组(vg)浓度介于1.0×1011vg/千克(kg)与1.0×1016vg/kg之间。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为至少或约107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016或1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为2×107、2×108、2×109、2×1010、2×1011、2×1012、2×1013、2×1014、2×1015、2×1016或2×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度3×107、3×108、3×109、3×1010、3×1011、3×1012、3×1013、3×1014、3×1015、3×1016或3×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度4×107、4×108、4×109、4×1010、4×1011、4×1012、4×1013、4×1014、4×1015、4×1016或4×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011、5×1012、5×1013、5×1014、5×1015、5×1016或5×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度6×107、6×108、6×109、6×1010、6×1011、6×1012、6×1013、6×1014、6×1015、6×1016或6×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度7×107、7×108、7×109、7×1010、7×1011、7×1012、7×1013、7×1014、7×1015、7×1016或7×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度8×107、8×108、8×109、8×1010、8×1011、8×1012、8×1013、8×1014、8×1015、8×1016或8×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度9×107、9×108、9×109、9×1010、9×1011、9×1012、9×1013、9×1014、9×1015、9×1016或9×1017。
在一些实施例中，将施用步骤执行一次。可替代地，将施用步骤重复至少两次。施用步骤可以每天执行一次。在一些情况下，施用步骤包括静脉内施用。在一些情况下，施用包括肺部施用。在一些情况下，施用包括鼻内施用(如喷雾)。在一些情况下，施用步骤包括将该组合物注射到靶体内环境中。在一些情况下，施用步骤不包括将该组合物注射到靶体内环境中。
受试者
本文公开了将AAV颗粒和病毒载体中的至少一个递送到受试者例如以治疗或预防受试者的疾病或病状的方法。在一些情况下，受试者是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包含小鼠、大鼠、豚鼠、兔、黑猩猩或农场动物。在一些情况下，哺乳动物是非人灵长类动物。在一些情况下，受试者是人。本公开的受试者可能未被诊断出患有疾病或病状。可替代地，受试者可以是被诊断出患有疾病或病状或被怀疑患有疾病或病状的患者。
疾病或病状
本文公开了通过施用包括如本文公开的rAAV等rAAV的组合物来治疗受试者的疾病或病状的方法。本文公开的rAAV的至少一个优点是rAAV可以用于治疗将从转基因疗法中受益的几乎任何疾病或病状，包含但不限于脊髓性肌萎缩症(SMA)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、蓬佩病(Pompe disease)、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、巴滕斯氏病(Battens disease)、溶酶体贮积病症、多形性成胶质细胞瘤、雷特综合征、雷伯氏先天性黑内障、晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症(LINCL)、慢性疼痛、中风、脊髓损伤、创伤性脑损伤和溶酶体贮积病症。
在一些实施例中，该疾病或病状的特征可以在于，与正常个体相比，基因或其基因表达产物的表达或活性降低或消除。在一些实施例中，与正常个体相比，该疾病或病状的特征在于基因或其基因表达产物的表达或活性增加或增强。
在一些情况下，该疾病或病状局限于受试者的特定体内环境，例如，大脑或肝脏。本公开的组合物在治疗本文描述的疾病或病状方面特别有用，因为这些组合物特异性地靶向体内环境并递送经工程化以调节与该疾病或病状的发病机理或病理相关的靶基因表达产物的活性或表达的治疗性核酸。
在一些情况下，该疾病或病状包括中枢神经系统(CNS)的疾病或病状。CNS的疾病的非限制性实例包含：无透明隔、酸性脂肪酶疾病、酸性麦芽糖酶缺乏症、获得性癫痫样失语症、急性弥漫性脑脊髓炎、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、艾迪氏瞳孔、艾迪氏综合征、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不良、认识不能、爱卡迪综合征、爱卡迪-古迪耶斯综合征病症、AIDS-神经系统并发症、亚历山大病、阿尔珀斯病、交替性偏瘫、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、无脑、动脉瘤、天使综合征、血管瘤病、缺氧症、抗磷脂综合征、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿莫德-基亚里畸形、动静脉畸形、阿斯伯格综合征、共济失调、共济失调毛细血管扩张、共济失调和小脑或脊髓小脑变性、心房颤动和中风、注意力缺陷多动障碍、自闭症谱系障碍、自主神经功能障碍、背痛、巴斯综合征、巴顿病、贝克尔氏肌强直、白塞氏病、贝尔氏麻痹、良性原发性眼睑痉挛、良性局灶性肌萎缩症、良性颅内高压、贝姆哈特-罗特综合征、宾斯旺格氏病、眼睑痉挛、布洛克-苏兹贝格综合征、臂丛神经产伤、臂神经丛损伤、布拉德伯里-埃格莱斯顿综合征、脑和脊柱肿瘤、脑动脉瘤、脑损伤、脊髓侧方压迫-脊髓半断综合征、脊髓延髓性肌肉萎缩症、伴有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病(CADASIL)、卡纳万病、腕管综合征、灼痛、海绵状瘤、海绵状血管瘤、海绵状静脉畸形、中央颈脊髓综合征、脊髓中央综合征、中枢疼痛综合征、脑桥中部髓鞘溶解、脑病症、神经酰胺酶缺乏症、小脑变性、小脑发育不全、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、脑型脚气病、脑海绵状静脉畸形、脑性巨人症、脑缺氧、脑性瘫痪、脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)、夏-马-图病、夏-马-图综合征、经典肢近端型点状软骨发育不良(RCDP)、小脑扁桃体下疝畸形、胆固醇酯贮积病、舞蹈病、舞蹈棘状红血球症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性立位耐力不良、慢性疼痛、II型库卡因综合征、科芬-劳里综合征、空洞脑、昏迷、复杂区域性疼痛综合征、先天性双侧面瘫、先天性肌无力、先天性肌病、先天性血管海绵状畸形、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、克里脑炎、克鲁兹佛得-雅克病、累积性创伤病症、库欣综合征、巨细胞包涵体疾病、巨细胞病毒感染、舞蹈眼-舞蹈脚综合征、丹迪-沃克综合征、道森氏病、耳聋、德默西耶氏症、德热里纳-克隆普克麻痹、痴呆、痴呆-多发梗塞、痴呆-语义、痴呆-皮质下、路易体痴呆、齿状小脑共济失调、齿状红核萎缩、皮肌炎、发展性运动障碍、德维奇综合征、糖尿病性神经病、弥漫性硬化症、德拉韦综合征、杜氏肌营养不良、家族性自主神经异常、书写障碍、诵读困难、吞咽困难、运用障碍、肌阵挛性小脑协调障碍、进行性小脑协同失调、肌张力障碍、早期小儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、嗜睡性脑炎、脑膨出、脑病、脑病(家族性婴儿)、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、癫痫半身不遂、欧勃氏麻痹、埃布-杜尚和德热里纳-克隆普克麻痹、原发性震颤、脑桥外髓鞘溶解、法布里病、法尔氏综合征、昏厥、家族性自主神经功能异常、家族性血管瘤、家族性特发性基底神经节钙化、家族性周期性麻痹、家族性痉挛性麻痹、费伯氏肌病、高热惊厥、肌纤维发育不良、费希尔氏综合征、婴儿低肌张力综合征、足下垂、弗里德里希共济失调、额颞叶痴呆、戈谢病、广义神经节苷脂沉积症、格斯曼氏综合征、格斯特曼-施特劳斯勒-申克病、巨轴索神经病、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体疾病、成胶质细胞瘤、类球状细胞白质营养不良症、舌咽神经痛、糖原贮积病、格林-巴利综合征、哈勒沃登-斯帕茨病、头部受伤、头痛、连续性半侧颅痛、半面痉挛、交替偏瘫、遗传性神经病、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、带状疱疹、耳带状疱疹、平山综合征、福尔摩斯-阿迪综合征、前脑无裂畸形、HTLV-1相关性脊髓病、休斯综合征、亨廷顿氏病、积水性无脑、脑积水、脑积水-常压、脊髓积水、皮质醇过多症、睡眠过度、张力过强、张力减退、低氧、免疫介导性脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿肌张力过低症、婴儿神经轴索营养不良、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷弗素姆病、婴儿痉挛、枕骨裂露脑畸形、肠脂代谢障碍症、颅内囊肿、颅内高压、艾萨克氏综合征、朱伯特综合征、基恩斯-赛尔综合征、肯尼迪氏病、金斯布姆综合征、克莱因-莱文综合征、克莱普尔-菲尔综合征、克莱普尔-特雷纳奈综合征(KTS)、克利弗-布西综合征、科萨科夫氏遗忘症、克拉贝病、库格伯格-韦兰德病、苦鲁病、莱伯特-伊顿肌无力综合征、兰道-克莱夫纳综合征、股外侧皮神经卡压、延髓外侧综合征、学习障碍、利氏病、伦诺克斯-盖斯托综合征、莱施-奈恩综合征、脑白质营养不良、莱文-克里奇利综合征、路易体痴呆、类脂贮存病、类脂蛋白沉积症、无脑回畸形、闭锁综合征、鲁盖瑞氏症、狼疮-神经性后遗症、莱姆病-神经系统并发症、马查多-约瑟夫病、巨脑、巨脑畸形、梅－罗综合征、脑膜炎、脑膜炎和脑炎、门克斯病、感觉异常性股痛、异染性白质营养不良、头小畸型、偏头痛、米勒-费雪综合征、小中风、线粒体肌病、莫比斯综合征、单肢肌萎缩、运动神经元疾病、烟雾病、粘脂贮积病、黏多糖贮积症、多发性梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化症、多系统萎缩、体位性低血压的多系统萎缩、肌营养不良、肌无力-先天性、重症肌无力、髓鞘破坏性弥漫性硬化、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌病-先天性、肌病-甲状腺毒性、肌强直、先天性肌强直、发作性睡病、神经棘细胞症、伴有脑铁蓄积的神经变性、神经纤维瘤病、抗精神病药物恶性综合征、AIDS的神经系统并发症、莱姆病的神经系统并发症、巨细胞病毒感染的神经系统后果、蓬佩病的神经系统表现、狼疮的神经系统后遗症、视神经脊髓炎、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元迁移病症、神经病-遗传性、神经结节病、神经梅毒、神经毒性、海绵状血管瘤、尼曼-皮克病、奥沙利文-麦克劳德综合征、枕神经痛、大田原综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、斜视眼阵挛肌阵挛、直立性低血压、过度使用综合征、疼痛-慢性、泛酸激酶相关神经变性、副肿瘤综合征、感觉异常、帕金森氏病、阵发性舞蹈手足徐动症、阵发性偏头痛、帕里-罗姆伯格病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、佩娜舒凯尔II综合征、神经周围囊肿、周期性瘫痪、周围神经病变、脑室周围白质软化、持续性植物状态、广泛性发育障碍、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经受压、梨状肌综合征、垂体肿瘤、多肌炎、蓬佩病、孔洞脑、后小儿麻痹综合征、带状疱疹后遗神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、体位性直立性心动过速综合征、体位性心动过速综合征、原发性牙本质萎缩、原发性侧索硬化、原发性进行性失语症、朊病毒病、进行性面部偏侧萎缩、进行性运动性共济失调、进行性多灶性白质脑病、进行性硬化性脊柱营养不良、进行性核上性麻痹、人面失认症、假火炬综合征、假弓形体病综合征、假瘤脑、心因性运动、拉姆齐·亨特综合征I、拉姆齐·亨特综合征II、拉斯穆森氏脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷弗素姆病、雷弗素姆病-婴儿、重复性运动病症、重复性应激损伤、不安定腿综合征、逆转录病毒相关脊髓病、雷特综合征、瑞氏综合征、风湿性脑炎、赖利-戴综合征、骶神经根囊肿、圣维特斯舞蹈病、唾液腺疾病、桑德霍夫疾病、谢耳德氏病、脑裂畸形、赛特贝格病、癫痫发作病症、语义性痴呆、视中隔发育不全、婴儿严重的肌阵挛性癫痫(SMEI)、摇晃婴儿综合征、带状疱疹、香-德综合征、修格兰氏综合征、睡眠呼吸暂停、睡眠病、索托氏综合征、痉挛、脊柱裂、脊髓梗死、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩症、脊髓小脑萎缩症、脊髓小脑变性、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基综合征、僵人综合征、纹状体黑质变性、中风、斯特格-韦伯综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、持续时间短、单侧、神经形(SUNCT)头痛、吞咽障碍、西登哈姆舞蹈病、晕厥、梅毒性脊髓硬化症、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、系统性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、塔洛夫囊肿、泰-萨二氏病、颞动脉炎、脊髓栓系综合征、汤姆森氏肌强直、胸廓出口综合征、甲状腺毒性肌病、三叉神经痛、托德氏麻痹、妥瑞综合征、短暂性脑缺血发作、可传播性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、泰勒综合征、结节性硬化症、血管勃起肿瘤、中枢神经系统和外周神经系统血管炎综合征、冯·埃科诺莫病、冯-希珀尔-林道病(VHL)、冯·雷克林豪森氏病、沃伦贝格氏综合征、韦德尼格-霍夫曼病、韦尼克-科萨科夫综合征、颈部扭伤、惠普耳氏病、威廉姆斯氏综合征、威尔逊病、沃尔曼氏病以及X连锁脊髓延髓肌肉萎缩症。
在一些情况下，该疾病或病状包括肝脏疾病或病症或者与肝脏疾病或病症相关。非限制性实例包含胆汁酸合成病症(例如，威尔逊病、进行性家族性肝内胆汁淤积症3型)、碳水化合物代谢病症(例如，遗传性果糖不耐症、糖原贮积病IV型)、氨基酸代谢病症(例如，I型酪氨酸血症)、尿素循环病症(例如，精氨琥珀酸裂解酶缺乏症、柠檬素缺乏症(CTLN2、NICCD))、脂质代谢病症(例如，胆固醇酯沉积病)和其它病症，包含但不限于α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化、遗传性血色素沉着症、阿尔斯特雷姆综合征(Alstrom syndrome)和先天性肝纤维化。
在一些情况下，该疾病或病状是肝脏的疾病或病状。肝脏疾病或病症的非限制性实例包含：阿拉吉欧综合征、酒精相关性肝病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、良性肝脏肿瘤、胆道闭锁、肝硬化、克里格勒-纳贾尔综合征、半乳糖血症、吉尔伯特综合征、血色病、肝性脑病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝肾综合征、妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(LAL-D)、肝囊肿、肝癌、新生儿黄疸、非酒精性脂肪肝病、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、瑞氏综合征、I型糖原贮积病和威尔逊病。
此处提供了治疗与靶基因或其基因表达产物的异常表达或活性相关的疾病或病状的方法，该方法包括通过施用使本公开的异源核酸衣壳化的rAAV来调节靶基因或基因表达产物在受试者体内的表达或活性。在一些情况下，施用是全身性施用。在一些情况下，相对于正常(未患病)个体中的表达或活性，靶基因或基因表达产物的表达或活性降低；并且向受试者施用rAAV足以使靶基因或基因表达产物的活性表达增加到正常个体的活性表达。在一些情况下，相对于正常个体中的表达或活性，基因或基因表达产物的表达或活性增加；并且向受试者施用rAAV足以使靶基因或基因表达产物的表达或活性降低。在非限制性实例中，向被诊断出患有阿尔茨海默氏病(在某些情况下由早老素1和/或早老素2(分别由基因PSEN1和PSEN2编码)的功能获得引起)的受试者施用本文公开的rAAV，该rAAV使治疗性核酸衣壳化，该治疗性核酸是对PSEN 1mRNA具有功能丧失作用的沉默RNA(siRNA)或其它RNAi。
还提供了治疗或预防受试者的本文公开的疾病或病状的方法，这些方法包括向该受试者施用治疗有效量的AAV载体，该AAV载体包括编码本文描述的治疗性基因表达产物的核酸序列。AAV载体可以被衣壳化在本文描述的经修饰的衣壳蛋白或AAV病毒颗粒中。在一些情况下，治疗性基因表达产物有效地调节靶基因或基因表达产物的活性或表达。
调配物、剂量和施用途径
一般而言，本文公开的方法包括通过全身施用来施用治疗性rAAV组合物。在一些情况下，方法包括通过口服施用来施用治疗性rAAV组合物。在一些情况下，方法包括通过腹膜内注射施用治疗性rAAV组合物。在一些情况下，方法包括以肛门栓剂的形式施用治疗性rAAV组合物。在一些情况下，方法包括通过静脉内(“i.v.”)施用来施用治疗性rAAV组合物。可想象的是，也可以通过其它途径来施用本文公开的治疗性rAAV组合物，这些其它途径如皮下注射、肌内注射、皮内注射、经皮注射、经皮施用、鼻内施用、淋巴内注射、直肠内施用、胃内施用、眼内施用、脑室内施用、鞘内施用或任何其它合适的肠胃外施用。在一些情况下，方法包括通过局部施用，例如通过将rAAV组合物刷涂到受试者的区域(例如，鼓膜、膀胱)或以其它方式使rAAV组合物与该区域接触来施用治疗性rAAV组合物。在一些实施例中，与全身性途径相比，更接近损伤或炎症部位的局部递送途径是优选的。可以调整施用治疗剂的途径、剂量、时间点和持续时间。在一些实施例中，在疾病或病状的急性和慢性症状中的任一者或两者的发作之前或之后施用治疗剂。
用于预防或治疗本文所公开的疾病或病状的药物组合物的有效剂量和剂量由与该疾病或病状或该疾病或病状的症状相关的观察到的有益应答来限定。有益应答包括预防、减轻、阻止或治愈该疾病或病状或该疾病或病状的症状。在一些实施例中，可以通过检测受试者中生物标志物、转录组风险谱或肠道微生物组的存在、水平或活性的可测量改善来测量有益应答。如本文所使用的“改善”是指存在、水平或活性向在正常个体(例如，未患有该疾病或病状的个体)中观察到的存在、水平或活性的转变。在其中治疗性rAAV组合物在治疗上无效或未充分减轻疾病或病状或疾病或病状的症状的情况下，则可以改变施用的剂量和/或途径，或者可以将另外的药剂与治疗性rAAV组合物一起施用于受试者。在一些实施例中，当患者开始进行治疗性rAAV组合物的方案时，该患者也逐渐停止进行(例如，剂量逐步降低)第二治疗方案。
在一些实施例中，根据本公开的药物组合物可以以在足以每天、一天一次或多次递送约0.0001mg/kg到约100mg/kg、约0.001mg/kg到约0.05mg/kg、约0.005mg/kg到约0.05mg/kg、约0.001mg/kg到约0.005mg/kg、约0.05mg/kg到约0.5mg/kg、约0.01mg/kg到约50mg/kg、约0.1mg/kg到约40mg/kg、约0.5mg/kg到约30mg/kg、约0.01mg/kg到约10mg/kg、约0.1mg/kg到约10mg/kg或约1mg/kg到约25mg/kg受试者体重的剂量水平下施用以获得期望的治疗、诊断或预防效果。应当理解，本领域技术人员可以将上述剂量浓度转化为每千克vg或病毒基因组或转化为总病毒基因组。
在一些情况下，药物组合物的剂量可以包括的感染性颗粒的浓度为至少或约107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016或1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为2×107、2×108、2×109、2×1010、2×1011、2×1012、2×1013、2×1014、2×1015、2×1016或2×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为3×107、3×108、3×109、3×1010、3×1011、3×1012、3×1013、3×1014、3×1015、3×1016或3×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为4×107、4×108、4×109、4×1010、4×1011、4×1012、4×1013、4×1014、4×1015、4×1016或4×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011、5×1012、5×1013、5×1014、5×1015、5×1016或5×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为6×107、6×108、6×109、6×1010、6×1011、6×1012、6×1013、6×1014、6×1015、6×1016或6×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为7×107、7×108、7×109、7×1010、7×1011、7×1012、7×1013、7×1014、7×1015、7×1016或7×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为8×107、8×108、8×109、8×1010、8×1011、8×1012、8×1013、8×1014、8×1015、8×1016或8×1017。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为9×107、9×108、9×109、9×1010、9×1011、9×1012、9×1013、9×1014、9×1015、9×1016或9×1017。
在一些实施例中，本文公开了适合于递送本文描述的rAAV组合物的药学上可接受的赋形剂和载体溶液的调配物，以及用于在多种治疗方案中使用本文描述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案。在一些实施例中，每种在治疗上有用的组合物中的治疗性基因表达产物的量可以是以这样的方式来制备，该方式使得在化合物的任何给定的单位剂量中将获得适合的剂量。制备此类药物调配物的本领域的技术人员将考虑如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其它药理学因素等因素，并且如此，多种剂量和治疗方案可以是期望的。在一些情况下，rAAV组合物是本文公开的合适调配的药物组合物，这些药物组合物眼内、玻璃体内、肠胃外、皮下、静脉内、脑室内、肌肉内、鞘内、口服、腹膜内、经口或经鼻吸入或通过直接注射而递送到一个或多个细胞、组织或器官。
在一些实施例中，适用于注射用途的基于AAV的病毒组合物的药物形式包含无菌水溶液或分散体以及无菌粉剂，这些无菌粉剂在临用时再调配成无菌可注射溶液或分散体。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持。可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂阻止微生物作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收剂延长可注射组合物的吸收，例如单硬脂酸铝和明胶。
在一些情况下，对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要，该溶液可以被适合地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。取决于被治疗的受试者的病状，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体受试者的适当的剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、产热原性以及一般的安全性和纯度标准。
本文公开了包括本文公开的rAAV组合物的无菌可注射溶液，这些无菌可注射溶液通过将本文公开的rAAV组合物以所需的量根据需要与以上枚举的若干其它成分一起并入适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备分散体，该无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。可注射溶液对于全身性施用，例如通过静脉内施用可以是有利的。
本文还提供了中性或盐形式的调配物。药学上可接受的盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与例如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。与游离羧基形成的盐还可以源自如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱。在调配后，溶液将以与剂量调配物相容的方式并以治疗上有效的量施用。调配物容易地以多种剂型施用，如可注射溶液、药物释放胶囊等。
通过经颊施用可以有利地实现肺部施用。在一些实施例中，调配物可以包括包含活性成分的干燥颗粒。在此类实施例中，干燥颗粒的直径可以在约0.5nm到约7nm或约1nm到约6nm的范围内。在一些实施例中，调配物可以呈干燥粉末的形式，以用于使用包括干燥粉末贮存器的装置施用，将推进剂流可以被引导到该装置以将此类粉末分散。在一些实施例中，可以使用自推进溶剂/粉末分配容器。在此类实施例中，活性成分可以溶解和/或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中。此类粉末可以包括颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5nm的直径并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7nm的直径。可替代地，按重量计至少95％的颗粒具有大于1nm的直径并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6nm的直径。干粉组合物可以包括一种固体精细粉末稀释剂如糖并且合宜地呈一种单位剂量形式提供。低沸推进剂通常包括在大气压力下具有低于65°F的沸点的液体推进剂。通常，推进剂可以构成50％到99.9％(w/w)的该组合物，并且活性成分可以构成0.1％到20％(w/w)的该组合物。推进剂可以进一步包括另外的成分，如液体非离子型和/或固体阴离子型表面活性剂和/或固体稀释剂(该固体稀释剂可以具有与包括活性成分的颗粒相同的数量级的颗粒尺寸)。
调配用于肺递送的药物组合物可以提供呈溶液和/或悬浮液的液滴形式的活性成分。此类调配物可以以任选地无菌的、包含活性成分的水性和/或稀释醇溶液和/或悬浮液形式进行制备、包装和/或出售，并且可以合宜地使用任何喷雾化和/或雾化装置来施用。
此类调配物可以进一步包括一种或多种另外的成分，该一种或多种另外的成分包含但不限于如糖精钠等调味剂、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂和/或如羟基苯甲酸甲酯等防腐剂。通过此施用途径提供的液滴可以具有在约0.1nm到约200nm范围内的平均直径。本文描述的可用于肺部递送的调配物也可用于鼻内递送。在一些实施例中，用于鼻内施用的调配物包括粗糙粉末，该粗糙粉末包括活性成分并且具有约0.2μm到500μm的平均粒度。此类调配物以吸用鼻烟的方式施用，即通过从保持在鼻部附近的粉末容器迅速吸入鼻腔中。
适用于经鼻施用的调配物可以例如包括约少至0.1％(w/w)并且多至100％(w/w)的活性成分，并且可以包括本文描述的一种或多种另外的成分。药物组合物可以以适合于经颊施用的调配物制备、封装和/或销售。此类调配物可以例如是呈使用常规方法制备的片剂和/或锭剂的形式，并且可以包括例如0.1％到20％(w/w)活性成分，其余量包括口服可溶解和/或可降解的组合物以及可任选的本文描述的一种或多种另外的成分。可替代地，适用于经颊施用的调配物可以包括粉剂和/或气雾化的和/或雾化的溶液和/或悬浮液，这些粉剂和/或这些气雾化的和/或雾化的溶液和/或悬浮液包括活性成分。此类粉状气雾化的和/或气雾化的调配物当分散时可以包括约0.1nm到约200nm范围内的平均颗粒和/或液滴尺寸，并且可以进一步包括本文描述的一种或多种另外的成分。
施用到受试者的合适剂量和剂量由包含但不限于以下的因素来确定：特定治疗性rAAV组合物、疾病状况及其严重性、需要治疗的受试者的身份(例如，体重、性别、年龄)，并且可以根据病例周围的具体情况(包含例如所施用的特定药剂、施用途径、所治疗的病状以及所治疗的受试者或宿主)来确定。
AAV组合物的量和此类组合物的施用时间将在受益于本教导的技术人员的能力范围内。然而，很可能可以通过单次施用来实现治疗有效量的所公开的组合物的施用，例如，单次注射足够数量的感染性颗粒以向接受这种治疗的患者提供治疗益处。至少部分地由于某些靶细胞(例如，神经元)不分裂这一事实使得这成为可能，从而消除了对多次或长期给药的需要。
可替代地，在一些情况下，可能期望的是，在相对较短或相对较长的时间段(这可以由监督此类组合物的施用的医生确定)内提供AAV载体组合物的多次或连续施用。例如，施用到哺乳动物的感染性颗粒的数量可以在约107、108、109、1010、1011、1012、1013或甚至更高的感染性颗粒/ml的数量级，如实现对所治疗的特定疾病或病状的治疗可能需要以单次剂量给予或分为两次或更多次施用。实际上，在某些实施例中，可能期望的是，单独或与一种或多种其它治疗药物组合施用两种或更多种不同的AAV载体组合物以获得特定治疗方案的期望效果。在各个实施例中，日剂量和单位剂量根据许多变量而变化，这些变量包含但不限于所使用的治疗性rAAV组合物的活性、待治疗的疾病或病状、施用方式、个体受试者的需求、所治疗的疾病或病状的严重性以及从业者的判断。
在一些实施例中，治疗性rAAV组合物的施用是每小时一次、每2小时一次、每3小时一次、每4小时一次、每5小时一次、每6小时一次、每7小时一次、每8小时一次、每9小时一次、每10小时一次、每11小时一次、每12小时一次、每13小时一次、每14小时一次、每15小时一次、每16小时一次、每17小时一次、每18小时一次、每19小时一次、每20小时一次、每21小时一次、每22小时一次、每23小时一次、每1天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每7天一次、每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次、每15天一次、每1个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月、每1年一次、每2年一次、每3年一次、每4年一次、或每5年一次、或每10年一次。可以根据受试者对治疗的应答来调整有效剂量范围。与其它途径相比，一些施用途径将需要更高浓度的有效量的治疗剂。
尽管鉴于本公开的优点并未预料到，但是在其中根据医生的判定，患者的病状没有改善的某些实施例中，可以长期施用治疗性rAAV组合物的施用，即，在很长一段时间内，包含在患者的整个生命的持续时间内，以减轻或以其它方式控制或限制患者的疾病或病状的症状。在患者状况确实得到改善的某些实施例中，可以暂时减少或暂时中止所施用的治疗性rAAV组合物的剂量一定时间长度(即，“药物假期”)。在特定实施例中，药物假期的长度介于2天与1年之间，仅通过实例的方式包含2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅通过实例的方式，药物假期期间的剂量减少可以为10％-100％，仅通过实例的方式包含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在一些实施例中，可以暂时减少或暂时中止所施用的药物剂量一定时间长度(即，“药物转移”)。在特定实施例中，药物转移的长度介于2天与1年之间，仅通过实例的方式包含2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅通过实例的方式，药物转移期间的剂量减少可以为10％-100％，仅通过实例的方式包含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在一段适当的时间后，任选地恢复正常的给药时间表。
在一些实施例中，一旦患者的状况发生了改善，就在必要时施用维持剂量。随后，在具体实施例中，根据症状将施用的剂量或频率或两者降低至保留改善的疾病、病症或病状的水平。然而，在某些实施例中，在症状出现任何复发时，患者需要长期的间歇性治疗。
通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定此类治疗方案的毒性和治疗效果，包含但不限于确定LD50和ED50。毒性与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且该治疗指数表示为LD50和ED50之比。在某些实施例中，将从细胞培养测定和动物研究中获得的数据用于调配用于哺乳动物(包含人)的治疗有效日剂量范围和/或治疗有效单位剂量。在一些实施例中，本文描述的治疗性rAAV组合物的剂量在循环浓度的范围内，该循环浓度包含具有最小毒性的ED50。在某些实施例中，日剂量范围和/或单位剂量在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。
另外的治疗剂
治疗性核酸可以单独使用或与另外的治疗剂(一起称为“治疗剂”)组合使用。在一些情况下，如本文所使用的“另外的治疗剂”是单独施用的。治疗剂可以在组合疗法中一起或依次施用。组合疗法可以在同一天内施用，或者可以相隔一天或多天、数周、数月或数年施用。在一些情况下，如果确定受试者对一线疗法无反应，则施用本文提供的治疗性核酸。
另外的治疗剂可以包括小分子。另外的治疗剂可以包括抗体或抗原结合片段。另外的治疗剂可以包括基于细胞的疗法。示例性的基于细胞的疗法包含但不限于免疫效应细胞疗法、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法、自然杀伤细胞疗法和嵌合抗原受体自然杀伤(NK)细胞疗法。NK细胞或CAR-NK细胞或NK细胞和CAR-NK细胞的组合可以与本文公开的方法组合使用。在一些实施例中，NK细胞和CAR-NK细胞衍生自人类诱导多能干细胞(iPSC)、脐带血或细胞系。NK细胞和CAR-NK细胞可以包括细胞因子受体和自杀基因。基于细胞的疗法可以包括干细胞疗法。干细胞疗法可以是胚胎干细胞或体细胞干细胞。干细胞可以从供体分离(同种异体)或从受试者分离(自体)。干细胞可以是扩增的脂肪衍生干细胞(eASC)、造血干细胞(HSC)、间充质干(基质)细胞(MSC)或衍生自受试者细胞的诱导多能干细胞(iPSC)。
III.试剂盒
本文公开了包括本文公开的组合物的试剂盒。本文还公开了用于治疗或预防中枢神经系统(CNS)或靶器官或环境(例如，肝脏)的疾病或病状的试剂盒。在一些情况下，该疾病或病状是癌症、病原体感染、肺部疾病或病状、神经系统疾病、肌肉疾病或免疫病症，如本文描述的那些。在一个实施例中，试剂盒可以包含治疗性或预防性组合物，该治疗性或预防性组合物含有有效量的rAAV颗粒和本公开的重组AAV(rAAV)衣壳蛋白的组合物，该rAAV颗粒使编码治疗性核酸的重组AAV载体(例如，治疗性核酸)衣壳化。在另一个实施例中，试剂盒可以包含治疗性或预防性组合物，该治疗性或预防性组合物含有有效量的表达治疗性核酸的呈单位剂型的由本文描述的rAAV修饰的细胞(“经修饰的细胞”)。在一些实施例中，试剂盒包括无菌容器，该无菌容器可以含有治疗性组合物；此类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。此类容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合于容纳药物的其它材料制成。
在一些情况下，将rAAV与用于向患有疾病或病状(例如，CNS、PNS、肝脏等的疾病)或有罹患该疾病或病状的风险的受试者施用rAAV的说明书一起提供。说明书通常可以包含有关组合物用于治疗或预防疾病或病状的使用的信息。
在一些情况下，试剂盒可以包含同种异体细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含可以包括基因组修饰的细胞。在一些情况下，试剂盒可以包括“现成的(off-the-shelf)”细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含可以扩展用于临床使用的细胞。在一些情况下，试剂盒可以含有用于研究目的的内容物。
在一些情况下，这些说明书包含以下中的至少一个：治疗性rAAV组合物的描述；用于治疗或预防本文公开的疾病或病状的剂量方案和施用；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。这些说明书可以直接打印在容器上(如果存在的话)，或者作为施加到容器上的标签或者作为与容器一起提供或提供在容器中的单独的纸页、小册子、卡片或文件夹打印。在一些情况下，说明书提供了用于向受试者单独施用rAAV的程序。在一些情况下，说明书提供了用于在施用本文公开的另外的治疗剂之后或之前至少约1小时(hr)、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时或至多2天、3天、4天、5天、6天或7天向受试者施用rAAV的程序。在一些情况下，这些说明书提供了rAAV被调配用于静脉内注射。
IV.定义
本文所使用的术语仅出于描述特定情况的目的，而不旨在进行限制。如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/一种(a、an)”和“该(the)”旨在也包含复数形式。此外，在详细描述和/或权利要求书中使用了术语“包含(including/include)”、“具有(having/has/with)”或其变体的情况下，此类术语旨在以类似于术语“包括(comprising)”的方式是包含性的。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于所述值是如何测量或确定的，例如，测量系统的局限性。例如，根据给定值的实践，“约”可以意指在1或大于1个标准偏差内。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另外说明，否则术语“约”应被假定为意指该特定值在可接受的误差范围之内。
当用来定义组合物和方法时，如本文使用的“基本上由...组成”应该表示排除对于所陈述的目的的组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除对所要求保护的公开的一个或多个基本和新颖特性不具有实质影响的其它材料或步骤，如用于治疗如痤疮、湿疹、牛皮癣和酒渣鼻等皮肤病症的组合物。
本文使用的术语“同源的”、“同源性”或“同源性百分比”通常是指与参考序列具有相同或相似序列的氨基酸序列或核酸序列。截至本申请提交之日，可以使用最新版本的BLAST确定序列的同源性百分比。
术语“增加的”或“增加”在本文中用于通常意指增加统计上显著的量。在一些实施例中，术语“增加的”或“增加”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平、标准或对照相比增加至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多到并且包含100％增加，或在10％-100％之间的任何增加。“增加”的其它实例包含与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍。
术语“减少的”或“减少”在本文中通常用来表示减少统计学上显著的量。在一些实施例中，“减少”意指与参考水平相比减少了至少10％，例如，与参考水平相比减少了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达且包含100％的减少(例如，与参考样品相比不存在的水平或无法检测到的水平)或介于10-100％之间的任何减少。在标记物或症状的上下文中，这些术语是指此水平的统计上显著的减少。减少可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地降至作为不患有给定疾病的个体的正常范围内所接受的水平。
术语“受试者”是任何生物。在一些情况下，该生物是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包含哺乳动物类别的任何成员：人、如黑猩猩等非人灵长类动物以及其它猿类和猴类；如牛、马、绵羊、山羊、猪等农场动物；如兔子、狗和猫等家养动物；实验动物，包含如大鼠、小鼠和豚鼠等啮齿动物。在一方面，哺乳动物是人。如本文中所使用的，术语“动物”包括人类和非人动物。在一个实施例中，“非人类动物”是哺乳动物，例如啮齿动物，如大鼠或小鼠。在一些情况下，受试者是患者，如本文所使用的，其可以指被诊断出患有特定疾病或病症的受试者。
如本文所使用的，术语“基因”是指任选地与如启动子、操作子、终止子等相关的调控区一起的编码单个蛋白质或RNA的核酸片段(也称为“编码序列”或“编码区”)，
所述调控区可以定位于编码序列的上游或下游。
如本文所使用的，术语“腺相关病毒”或“AAV”是指腺相关病毒或其衍生物。AAV的非限制性实例包含AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)、AAV类型9(AAV9)、AAV类型10(AAV10)、AAV类型11(AAV11)、AAV类型12(AAV12)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV。在一些情况下，AAV被描述为“灵长类动物AAV”，其是指感染灵长类动物的AAV。同样，AAV可以感染牛属动物(例如，“牛AAV”等)。在一些情况下，AAV是野生型或天然存在的。在一些情况下，AAV是重组的。
如本文所使用的术语“AAV衣壳”是指腺相关病毒的衣壳蛋白或肽。在一些情况下，AAV衣壳蛋白被配置成使遗传信息(例如，转基因、治疗性核酸、病毒基因组)衣壳化。在一些情况下，相对于对应的亲本AAV衣壳蛋白，本公开的AAV衣壳是经修饰的AAV衣壳。
如本文所使用的术语“向性”是指AAV衣壳的一种质量或特性，该质量或特性可以包含相对于第二体内环境对将经衣壳化的遗传信息表达到体内环境中的一者中的特异性，和/或相对于第二体内环境对将经衣壳化的遗传信息表达到体内环境中的一者中的效率增加或降低。在一些情况下，体内环境是细胞类型。在一些情况下，体内环境是器官或器官系统。
如本文所使用的术语“AAV载体”是指编码与病毒有关的遗传信息的核酸聚合物。AAV载体可以是重组AAV载体(rAAV)，其是指使用重组遗传学方法产生的AAV载体。在一些情况下，rAAV载体包括至少一种异源多核苷酸(例如，除了野生型或天然存在的AAV基因组之外的多核苷酸，如转基因)。
如本文所使用的术语“AAV颗粒”是指AAV病毒、病毒体、AAV衣壳蛋白或其组件。在一些情况下，相对于亲本AAV颗粒，AAV颗粒被修饰。
术语“基因表达产物”的“基因产物”是指多核苷酸序列的表达产物，例如，多肽、肽、蛋白质或RNA，包含干扰RNA(例如，siRNA、miRNA、shRNA)和信使RNA(mRNA)。
术语“操作性地连接”或“可操作地连接”是指两个或更多个元件靠近定位，并且在一些情况下与实现这两个或更多个元件之间的功能关系的另一个元件(例如，遗传元件，如启动子、增强子、终止信号序列、聚腺苷酸化序列等)紧邻定位。在一个非限制性实例中，操作性地连接到编码区的启动子能够启动编码序列的转录。
如本文所使用的术语“异源的”是指从在基因型上不同于与其比较的实体的其余部分的实体衍生的遗传元件(例如，编码区)或基因表达产物(例如，RNA、蛋白质)。
如本文所使用的术语“内源的”是指天然存在于生物体或生物体内的特定细胞中或与之相关的遗传元件(例如，编码区)或基因表达产物(例如，RNA、蛋白质)。
如本文所使用的“可检测部分”是指可以共价或非共价连接到化合物或生物分子的部分，该化合物或生物分子可以例如使用本领域已知的技术进行检测。在实施例中，可检测部分是共价连接的。可检测部分可以提供对连接的化合物或生物分子的成像。可检测部分可以指示两种化合物之间的接触。示例性可检测部分是荧光团、抗体、反应性染料、放射性标记的部分、磁性造影剂和量子点。示例性荧光团包含荧光素、若丹明、GFP、香豆素、FITC、Alexa荧光体(Alexa fluor)、Cy3、Cy5、BODIPY和花青染料。示例性放射性核素包含氟-18、镓-68和铜-64。示例性磁性造影剂包含钆、氧化铁和铁铂矿以及锰。
如本文所使用的术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指减轻或消除病状、疾病或病状；或与病症、疾病或病状相关的症状中的一种或多种症状；或减轻或消除病症、疾病或病状本身的原因。治疗的期望的效果可以包含但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。
术语“治疗有效量”是指化合物或疗法在施用时足以预防病症、疾病的症状中的一种或多种症状或疾病的病状的发展或在一定程度上对其进行减轻的量；或者化合物的足以引起研究人员、兽医、医生或临床医生寻求的细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的量。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”、或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。组分在与药物调配物的其它成分相容的意义上可以是药学上可接受的。它还可以适用于以合理的受益/风险比率与人类和动物的组织或器官相接触，而不产生过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症。参见《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第21版；利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins):宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA),2005；《药物赋形剂手册(Handbook of PharmaceuticalExcipients)》,第5版；Rowe等人编辑,药物出版社和美国药物协会(The PharmaceuticalPress and the American Pharmaceutical Association):2005；以及《药物添加剂手册(Handbook of Pharmaceutical Additives)》,第3版；Ash和Ash编辑,高尔出版公司(GowerPublishing Company):2007；《药物预调配物和调配物(Pharmaceutical Preformulationand Formulation)》,Gibson编辑,CRC出版社有限公司(CRC Press LLC):佛罗里达州波卡拉顿(Boca Raton,FL),2004。
术语“药物组合物”是指本文公开的化合物与如稀释剂或载体等其它化学组分的混合物。药物组合物可以促进将化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包含但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和局部施用。
“样品”的非限制性实例包含可以从其获得核酸和/或蛋白质的任何材料。作为非限制性实例，这包含全血、外周血、血浆、血清、唾液、粘液、尿液、精液、淋巴液、粪便提取物、颊拭子、细胞或其它体液或组织，包含但不限于通过手术活检或手术切除获得的组织。在各个实施例中，样品包括来自大肠和/或小肠的组织。在各个实施例中，大肠样品包括盲肠、结肠(升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠)、直肠和/或肛管。在一些实施例中，小肠样品包括十二指肠、空肠和/或回肠。可替代地，样品可以通过原代患者来源的细胞系获得，或者可以是呈保存样品或新鲜冷冻样品的形式的归档患者样品。
术语“体内”用于描述在受试者体内发生的事件。
术语“离体”用于描述在受试者体外发生的事件。不对受试者进行离体测定。相反，在与受试者分离的样品上进行离体测定。对样品进行的离体测定的实例是“体外”测定。
术语“体外”用于描述在用于容纳实验室试剂的容器中发生的事件，使得材料与材料所获自的生物源分离。体外测定可以涵盖基于细胞的测定，其中采用活细胞或死细胞。体外测定可以涵盖无细胞测定，其中不采用完整的细胞。
在此使用的小节标题仅是为了编排的目的并且不应该被解释为对所述主题进行限制。
V.实例
实例1.产生rAAV的方法
产生了重组AAV(rAAV)。使用标准转染方案(例如，利用PEI)将三个质粒载体三重转染到永生的HEK293中。第一载体含有侧接有来自亲本AAV病毒的反向末端重复(ITR)序列的转基因盒。该转基因盒具有启动子序列，并且驱动靶细胞的细胞核中异源核酸的转录。第二载体含有编码AAV Rep基因以及经修饰的Cap基因的核酸(例如，AAV2/9REP-AAP-ΔCap)。经修饰的Cap基因包括图33-35中提供的DNA序列中的任一个，其是编码本公开的经修饰的AAV衣壳蛋白的DNA序列。第三载体含有编码病毒组装和将异源核酸包装到经修饰的衣壳结构中所需的辅助病毒蛋白的核酸。
在转染后72小时从培养基中收获病毒颗粒，并且在转染后120小时从细胞和培养基中收获病毒颗粒。培养基中存在的病毒通过用8％聚(乙二醇)和500mM氯化钠沉淀进行浓缩，并且将沉淀的病毒添加到由收集的细胞制备的裂解物中。通过碘克沙醇(Optiprep，西格马(Sigma))逐步梯度(15％、25％、40％和60％)纯化病毒。将病毒浓缩并在PBS中调配。通过使用qPCR和作为对照的线性化的基因组质粒测量DNasel抗性载体基因组拷贝(VG)的数量来确定病毒滴度。
实例2.鉴定变体AAV衣壳蛋白的方法
质粒
文库产生。rAAV-ΔCap-in-cis-Lox2质粒(图36)是rAAV-ΔCap-in-cis-Lox质粒的修饰。对于7聚体i文库片段产生，使用pCRII-9Cap-XE质粒作为模板。AAV2/9REP-AAP-ΔCap质粒(图36)由AAV2/9REP-AAP质粒修饰而成。
rAAV-ΔCap-in-cis-Lox2质粒由三个侧接AAV2 ITR的主要元件组成。(i)驱动荧光蛋白mNeongreen的表达的UBC普遍存在的启动子，随后是合成的聚腺苷酸化序列。先前版本的质粒的mCherry表达盒被mNeonGreen盒替换，(ii)具有剪接序列和AAV5 p41启动子(GenBank AF085716.1的1680-1974个残基)的AAV2 rep基因的一部分，随后是AAV9 cap基因。该质粒的先前版本rAAV-ΔCap-in-cis-Lox在AAV9 Cap基因的AA 450和592处的限制性位点XbaI与AgeI之间具有短的12bp序列。在较新版本的质粒中，这被mRuby2基因框内(充当填充DNA)的723bp序列替换，(iii)SV40聚腺苷酸化序列，其侧接lox71和lox66位点。向先前版本的质粒引入细微的改变，以促进克隆的简便性并可视化哺乳动物细胞转染。这些rAAV质粒中的Lox位点显示出中等水平的Cre非依赖性翻转。在基于PCR的衣壳回收期间，这通过将扩增循环的次数降低到无法从被注射文库的野生型小鼠(即，缺乏Cre表达)中提取的对照DNA中回收任何rAAV衣壳的程度而被最小化。pCRII-9Cap-XE质粒含有来自AA450-592的AAV9衣壳基因序列，并且侧接XbaI和AgeI限制性位点。
除了AAV9衣壳序列的AA450-592缺失之外，AAV2/9REP-AAP-ΔCap质粒还具有AAV2/9REP-AAP的五个先前存在的终止密码子。这些修饰不影响载体产生。REP-AAP质粒与rAAV-ΔCap-in-cis-Lox2质粒之间的重叠片段的缺失使质粒之间的重组最小化，该重组可能在载体产生中的共转染期间产生AAV9野生型衣壳。
衣壳表征
AAV衣壳。使用pUCmini-iCAP-PHP.B主链(Addgene ID：103002)制备在AAV-PHP.B衣壳的位置587-597之间具有7聚体插入或11聚体取代的AAV衣壳变体。
ssAAV基因组。为了表征AAV衣壳变异体，使用单链(ss)rAAV基因组。使用如pAAV:CAG-mNeonGreen27(等效质粒，pAAV:CAG-eYFP35；Addgene ID：104055)、pAAV:CAG-NLS-EGFP26(具有一个NLS的等效版本位于Addgene ID 104061上)、pAAV:CAG-DIO-EYFP35(Addgene ID:104052)、pAAV:GfABC 1D-2xNLS-mTurquoise235(Addgene ID:104053)和pAAV-Ple261-iCre30(Addgene ID 49113)等基因组。
pAAV:CAG-mNeonGreen2基因组由驱动荧光蛋白mNeonGreen的表达的普遍存在的CMV-β-肌动蛋白-内含子-β-珠蛋白(CAG)杂交启动子(等效质粒，pAAV:CAG-eYFP3；AddgeneID：104055)组成。pAAV:CAG-NLS-EGFP1由位于EGFP的N末端和C末端处的NLS序列组成并且由CAG启动子驱动。具有一个NLS的等效版本位于Addgene(ID 104061)上。pAAV:CAG-DIO-EYFP3(Addgene ID:104052)由在CAG启动子的反向方向上构建的EYFP基因组成，并且其两侧侧接一对Cre-Lox位点(Lox P和Lox 2272)。
在表达Cre的细胞中，Cre-lox对反转EYFP，从而实现转录和翻译，随后在lox位点切除以防止重新反转。pAAV：GfABC 1D-2xNLS-mTurquoise23，在别处称为pAAV：GFAP-2xNLS-mTurquoise2(Addgene ID：104053)，由位于mTurquoise2的N末端和C末端处的NLS序列组成，并且由星形胶质细胞特异性启动子GfABC1D4驱动。pAAV：Ple261-iCre5(AddgeneID49113)含有驱动iCre表达的内皮细胞特异性启动子。
pAAV：CAG-XFP(mNeongreen)被包装用于表征AAV变体。然而，在对细胞类型：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞进行量化时，CAG-NLS-EGFP用于将表达限制在细胞核中，以便更容易地使用显微镜图像进行量化。GFAP-NLS-mTurq2用于量化星形胶质细胞。CAG-DIO-EYFP用于Cre驱动系，因为此质粒中存在lox位点。
来自高广平博士(Dr.Guangping Gao)的自互补基因组scAAV：CB6-EGFP基因组具有驱动EGFP的表达的杂交的普遍存在的CB6启动子(975bp)，该启动子包括CMV增强子(巨细胞病毒立即早期增强子)、鸡-β-肌动蛋白启动子和杂交内含子。该基因组在EGFP基因之后具有兔珠蛋白polyA(127bp)。scAAV：CAG-EGFP(Addgene ID：83279)载体使用普遍存在的CMV-β-肌动蛋白-内含子-β-珠蛋白(CAG)杂交启动子来驱动EGFP的表达。
第1轮AAV衣壳文库产生
诱变策略。7聚体随机化插入是使用NNK饱和诱变策略设计的，该策略涉及含有混合碱基的简并引物(来自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies，Inc.))。N可以是A、C、G或T碱基，并且K可以是G或T。使用此策略，获得了在使用33个密码子的7聚体肽的每个位置处的所有20个AA的组合，从而使得在AA组合水平上的文库大小为12.8亿。在以下中描述了3聚体sPHP.B文库的诱变策略：Chan，K.Y.等人用于向中枢和外周神经系统高效无创地递送基因的经工程化的AAV(EngineeredAAVs for efficient noninvasive genedelivery to the central and peripheral nervous systems).《自然神经科学》20，1172-1179(2017)。
文库克隆。通过常规PCR方法使用混合碱基简并引物产生在AA 588与589之间具有7聚体随机化插入的480bp AAV衣壳片段(AA 450-592)。使用正向引物XF：5′-ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC-3′和反向引物7xMNN-588i：5′-GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTG-3’，通过Q5热启动高保真2X主混合物(Q5Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix)(NEB；M0494S)从pCRII-9Cap-XE模板扩增文库片段。为了避免由点突变、重组和模板切换引起的PCR引起的PCR诱导的偏差，PCR扩增被限制在15-20个循环内，并且按比例放大反应以获得所需的产量。所得PCR产物在1％琼脂糖凝胶上运行，并且用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo研究公司(Zymo Research)；D4007)提取。在此步骤期间，通过采取预防措施，如使用洁净凝胶运行盒和新鲜制备的l×TAE缓冲液来避免AAV污染至关重要。
按照NEB推荐的双消化方案，将rAAV-ΔCap-in-cis-Lox2质粒(6960bp)用限制酶AgeI和XbaI线性化。将消化的质粒在0.8％-1％琼脂糖凝胶上运行，以使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒提取线性化主链(6237bp)。
使用NEBuilder HiFi DNA组装主混合物(NEB；E2621S)和1:2摩尔比的载体与插入物将扩增的文库片段组装到线性化的载体中以在50℃下组装60分钟。
文库纯化。然后对组装的文库进行质粒安全(PS)DNase(Epicentre公司(Epicentre)；E3105K)处理，以通过降解来自混合物的未组装的DNA片段来纯化组装的产物。对于R1文库，每10μg的输入DNA使用大约3U的PS DNase在37℃下进行30分钟的反应。可替代地，按照NEB推荐的方案(NEB；M0345S)使用外切核酸酶V(RecBCD)。两种程序都产生了可比较的结果。所得混合物用DNA清洁和浓缩剂(DNA Clean and Concentrator)试剂盒(Zymo研究公司；D4013)进一步纯化。
文库产量。在PS处理后的组装效率为15％-20％的情况下，每20μL反应每100ng的输入DNA获得约15-20ng的产量。为了构建7聚体i DNA文库，使用约5-6μg的输入DNA来获得约800ng的组装的文库。
质量控制。为了验证文库的成功组装，将1ng的最终组装的文库转化到大肠杆菌(E.coli)SURE 2超感受态细胞(整合科学；200152)中。鉴定在37℃下温育过夜后在含有羧苄青霉素抗生素的LB/琼脂板上的菌落。在插入位点周围对DNA文库进行测序(Laragen；桑格测序(Sanger Sequencing))。非偏向文库跨多样化区域的每个碱基位置上显示出相同多样性的多个核苷酸峰(A、T、G、C各25％)。为了检验ITR是完整的，按照NEB推荐的方案(NEB；R0141S)进行Smal消化。为了验证成功转染并评估每150mm培养皿的载体产生产量，使用10ng的7聚体i文库转染HEK293生产细胞。观察到mNeonGreen蛋白在HEK细胞中的均匀表达，并且每150mm培养皿获得0.1-1×1011vg的平均产量。使用每个培养皿的平均产量，用于体内选择的载体产生按比例增加(参见图45)。
第2轮AAV衣壳DNA文库
PCR池设计。为了保持按比例池化，需要基于单个文库的多样性池化的每个样品/文库的级分是通过数学方法确定的。此过程涉及通过确定落在较高RC范围内的高置信度变体的区间的曲线下面积来估计排除噪声的多样性以及考虑在样品之间放大此多样性。曲线下面积(AUC)是使用复合辛普森法则(Simpson’s rule)通过将文库中所有回收的变体(X坐标)相对于其读段计数(来自深度测序数据的RC或拷贝数，Y坐标)绘制来估计的(参见图40)。为了确定AUC的限定区间，将数据基于RC的降序进行排序。值得注意的是，分布具有两个阶段，在较高的RC范围内，变体的斜率更稳定，随后曲线斜率急剧下降(较低的RC为约50-1000倍)。通过观察，曲线的此更陡峭的一侧在测序错误/PCR突变中占主导地位，因此从AUC估计中排除了此错误主导斜率，否则称为噪声。当将复合辛普森法则与如复合梯形法则等另一个函数进行比较时，差异很小。
然后使用公式：[曲线下面积/池化的文库总数]使用此面积来确定需要池化到PCR池文库中的单个文库的级分。
池化的样品用作模板，用于使用引物588-R21ib-F：5'-CACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCT-3'和588-R21ib-R：5'-GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCG-3'通过Q5聚合酶进行在98℃下10秒、在60℃下20秒和在72℃下30秒的12个循环的进一步扩增。与R1文库产生类似，将PCR产物组装到rAAV-ΔCap-in-cis-Lox2质粒中并产生病毒。
用于构建R2的R1文库是来自一半小鼠大脑(约0.3g)的Cre-Lox翻转的rAAV DNA和来自所有Cre系的部分脊髓(0.1-0.2g)。这里处理的组织量足以完成衣壳文库回收。使用gibson组装和后续PS或外切核酸酶V处理(如R1文库产生中所描述的)组装差异池化的和扩增的文库(通过PCR池或合成池)。成功的文库产生通过转化、桑格测序和ITR Smal消化进行验证。
对于载体产生，将约10ng纯化的和组装的文库用于转染每个150mm培养皿中的293T细胞，并且获得每150mm培养皿约6×1011vg的产量(即，R2产量是R1产量的六倍，鉴于这些序列已经产生了足以在R1选择中存活的产量，这是意料之中的)。
合成池设计。如PCR池策略中所描述的，从文库分布图中选择RC高于错误主导噪声斜率的高置信度变体(参见图40)。这从所有Cre系的所有大脑和脊髓样品中得到约9000个序列。使用了Rl文库产生的描述中提到的类似引物设计。引物XF：5'-ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC-3'和ll聚体588i：5'-GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCXXXXXXMNNMNNMNNMNNM NNMNNMNNXXXXXXACTCTGGTGGTTTGTG-3'，其中“XXXXXXMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNXXXXXX”被7聚体组织回收变体(7xMNN)的独特核苷酸序列以及7聚体插入位点(6xX)任一端侧接的两个相邻密码子的修饰替换，该两个相邻密码子为AAV9衣壳上的残基587-588“AQ”和残基589-590“AQ”。为了选择用于合成的序列，选择R1大脑和脊髓文库并使用与PCR池策略中所描述的相同的RC阈值限制。这从所有Cre系的所有大脑和脊髓样品中得到约9000个序列。由于掺入物文库具有11聚体突变变体，因此相同的引物设计，其中“XXXXXXMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNXXXXXX”被替换为11聚体变体的特定核苷酸序列。此文库中每个序列的副本被设计为具有针对哺乳动物优化的不同密码子。引物是使用定制的基于python的脚本设计的(代码将在Github中提供)。定制设计的寡核苷酸池由Twist生物科学(TwistBioscience)以等摩尔比合成。寡核苷酸池用于在98℃下10秒、在60℃下20秒和在72℃下30秒的13个循环中扩增pCRII-XE Cap9模板。为了在大规模文库制备中获得更高的产量，使用引物XF和588-R21ib-R(如上所述)将第一PCR的产物用作第二PCR的模板，并扩增13个循环。如R1文库产生的描述中所述，PCR产物被组装到rAAV主链中，并且经过加工和纯化以用于病毒产生。每150mm培养皿中约10ng的HEK293细胞产生约6×1011vg的病毒文库。
AAV病毒文库的产生和纯化
为了防止在HEK293生产细胞中形成7聚体i文库的衣壳嵌合体，每150mm培养皿仅转染10ng组装文库以及AAV载体产生所需的其它试剂。除了每150mm培养皿的293T生产细胞转染10ng文库之外，还以1:1:2的比率转染三种质粒：AAV2/9REP-AAP-ΔCap、pUC18和pHelper(编码用于AAV复制的腺病毒蛋白的基因)。质粒pUC18作为填充DNA用于补偿低量的文库DNA，以维持使用聚乙烯亚胺(PEI，波利塞斯公司(Polysciences)；24765-1)转染进行最佳转染所需的N:P比率。在转染后60小时收获细胞和培养基以收集病毒颗粒。按照协议进行rAAV收获和纯化。每个板的少量文库DNA和早期细胞收获时间对于减少载体产生期间嵌合衣壳组装的可能性至关重要(类似的考虑参见之前的报告)。
对于7聚体i文库，产量按比例增加到60个培养皿(约1.8×107个细胞/培养皿)并用文库转染了约10％，产生约1×108个总转化体。对于总转化体为约1×108的NNK7聚体文库，独特变体的数量为9.99×107。
对于从纯化的rAAV病毒文库中提取rAAV DNA，约10％的纯化的病毒文库用于通过蛋白酶K处理来提取病毒基因组。为了降解纯化文库中的任何污染DNA，将其用含DNase I酶(5μl，10U/μl)(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；4716728001)的100μl DNase I缓冲液处理并在37℃下温育1小时。通过在70℃下添加5μl的0.5M EDTA10分钟使酶失活。DNase I处理后，通过添加120μl含有5μl的20μg/μl蛋白酶K的蛋白酶溶液消化衣壳蛋白壳，并在50℃下温育过夜。为了使蛋白酶K失活，将混合物在95℃下煮沸。然后使用苯酚氯仿和乙醇浓缩和纯化提取的rAAV文库DNA。添加等体积的苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1，pH 8.0(约250μl；赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)；15593031)并涡旋30秒。将混合物在室温(RT)下温育5分钟，然后在4℃下以15,000rpm离心10分钟。分离上层水相并将其与等体积的氯仿混合，并涡旋30秒。在室温下温育5分钟后，在4℃下以15,000rpm离心10分钟。将上层水相分离并且添加十分之一体积的3M乙酸钠(pH 5.2)以及2μl Co-PrecipitantPink(比奥立公司(Bioline)；BIO-37075)和2.5体积的冰冷的100％乙醇，然后涡旋30秒。将混合物在-20℃下温育至少1小时，然后在4℃下以15,000rpm离心15分钟。将团粒空气干燥并且重悬于TE缓冲液中。DNA浓度使用Qubit ssDNA测定来确定。
动物
此研究中执行的所有动物程序均得到了加州理工学院机构动物护理和使用委员会(California Institute of Technology Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)的批准。此研究中使用的C57BL/6J(000664)、Tek-Cre(8863)、SNAP25-Cre(23525)、GFAP-Cre(012886)、Synl-Cre(3966)和Ail4(007908)小鼠系购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(JAX)。对于体内文库选择，向6至8周龄的成年雄性和雌性小鼠静脉内注射病毒文库。两种性别都用于衣壳选择以回收具有最小性别偏差的衣壳变体。将rAAV IV注射到成年小鼠的眶后窦中。为了测试rAAV的转导表型，随机分配了6至8周龄的C57BL/6J或Tek-Cre或Ail4成年雄性小鼠。对此研究中进行的任何实验，未对实验者设盲。
体内选择
在不同系的Cre转基因成年小鼠中进行7聚体i病毒文库选择：Tek-Cre、SNAP25-Cre和GFAP-Cre用于R1选择，并且这三种加上Synl-Cre用于R2选择。对于R1选择，向雄性和雌性成年小鼠静脉内施用的病毒载体剂量为2×1011vg/小鼠，对于R2选择，剂量为1×1012vg/小鼠。剂量是基于跨选择轮次而不同的病毒产量来确定的(图45)。两种性别都用于回收具有最小性别偏差的衣壳变体。注射后两周，将小鼠安乐死并收集包含大脑在内的所有器官，在干冰上快速冷冻，并储存在-80℃下。
从组织中提取rAAV基因组
优化。对于从组织中提取rAAV基因组，根据制造商的推荐方案使用Trizol方法(生命技术公司(Life Technologies；15596)和QIAprep Spin小量制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen,Inc)；27104)，并且发现Trizol方法更有效。从0.1g小鼠肝脏中回收的总rAAV基因组是使用与ssAAV-ΔCap-in-cis-lox2基因组的mNeonGreen基因结合的引物mNeonGreen-F：5'-CGACACATGAGTTACACATCTTTGGCTC-3'和mNeonGreen-R：5'-GGAGGTCACCCTTGGTGGACTTC-3'通过定量PCR进行定量的。作为内部对照，线粒体DNA的量(较小基因组回收的量度)是使用引物Mito-F：5'-CCCAGCTACTACCATCATTCAAGT-3'和Mito-R：5'-GATGGTTTGGGAGATTGGTTGATGT-3'进行定量的。尽管使用QIAprep试剂盒提取的每1ng总DNA中病毒DNA的百分比比使用Trizol方法高约1.5倍，但使用QIAprep试剂盒的总回收率较低。
提取的病毒基因组用如Smal(在ITR中发现)等限制酶消化，以通过PCR提高rAAV基因组回收率。这通过用Cre+引物CapF-56：5'-ATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAA-3'、Cre+R-58：5'-CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG-3'和Cre-引物CapF-56(参见上文)和Cre-R-57：5'-GTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG-3'进行的定量PCR来分析。
使用Trizol方法提取rAAV基因组。用2ml玻璃均质机(西格玛奥德里奇公司；D8938)或电动塑料杵(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)；12-141-361、12-141-363)(对于较小的组织)将半个冷冻大脑半球(大约0.3g)均质化并按照先前工作中的描述进行处理。然后用3-6μl的10μg/μl RNase Cocktail Enzyme混合物(赛默飞世尔科技公司；AM2286)处理提取的DNA以去除RNA并用Smal限制酶消化。然后用Zymo DNA清洁和浓缩剂试剂盒(D4033)纯化经处理的混合物。从深度测序数据分析中观察到为rAAV基因组回收而处理的组织量是足够的。
通过Cre依赖性PCR进行的rAAV基因组回收。具有通过Cre重组翻转的Lox位点的rAAV基因组被选择性地回收并使用PCR和引物进行扩增，该引物仅在Lox位点翻转时产生PCR产物(参见图37)。使用引物7IF：5'-CTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAAC-3'和CDF/R：5'-CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG-3'并在98℃下10秒、在58℃下30秒和在72℃下1分钟的25个循环中使用Q5 DNA聚合酶扩增Cre重组基因组。
通过PCR(Cre非依赖性)进行的总rAAV基因组回收。为了从组织中回收所有rAAV基因组，引物XF(5'-ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC-3')和588-R21ib-R(5'-GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCG-3')用于在98℃下10秒、在60℃下30秒和在72℃下30分钟的25个循环中使用Q5 DNA聚合酶扩增基因组。
NGS的样品制备
为了使用深度测序分析选择，对在体内选择后的DNA文库、病毒文库和组织文库进行处理，以在多样化的7聚体插入区周围添加流动细胞接合体(参见图37)。
rAAV DNA和病毒DNA文库的制备。Gibson组装的rAAV DNA文库和从病毒文库中提取的DNA通过Q5 DNA聚合酶使用引物588i-lib-PCRl-6bpUID-F：5'-CACGACGCTCTTCCGATCTAANNNNNNAGTCCTATGGACAAGTGGCCACA-3'和588i-lib-PCRl-R：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTTGGTTTTGAACCCAACC G-3'进行扩增，这些引物定位于来自衣壳上的随机化7聚体插入的50个碱基周围并且在5'末端含有Read1和Read2流动细胞序列。
用于最低限度地扩增NGS的DNA和病毒文库的引物588i-lib-PCRl-6bpUID-F：5'CACGACGCTCTTCCGATCTAANNNNNNAGTCCTATGGACAAGTGGCCACA-3'具有6个核苷酸长的UID(唯一标识符)“NNNNNN”，该“NNNNNN”位于NGS中使用的Read-1序列的19个核苷酸“5'-CACGACGCTCTTCCGATCT”和接头“AA”之后。UID之后的序列“AGTCCTATGGACAAGTGGCCACA”是与AAV9衣壳退火的区域。UID是用于鉴定潜在的PCR扩增错误的NGS数据分析的任选特征。然而，在此研究的NGS数据分析中，没有利用此特征来保持与从缺乏此UID特征的组织中回收rAAV基因组中使用的引物(引物71F：5'-CTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAAC-3'和CDF/R：5'-CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG-3')的一致性。UID或任何类型的突出部似乎会影响从组织进行的基于PCR的回收。据推测，引物的热稳定性在从组织中提取的非常少量的rAAV基因组中起着关键作用。
在50μl反应中使用5-10ng的模板DNA，在98℃下10秒、在60℃下30秒和在72℃下10秒的4个循环中最低限度地扩增DNA。然后用PCR纯化试剂盒纯化混合物。然后，将洗脱的DNA用作第二PCR中的模板以在使用与上述相同的温度循环的12次循环反应中通过推荐的引物(NEB；E7335S、E7500S、E7600S)添加独特的标记体(单或双)。在另外的处理和验证之后，将样品输送以进行深度测序。
将添加标记体后的PCR产物在新鲜制备的2％低熔点琼脂糖凝胶(赛默飞世尔科技公司；16520050)上运行，以更好地分离和回收凝胶上的大约120bp DNA条带。在针对NGS输送样品之前，通过桑格测序检验随机化7聚体位置处的核苷酸多样性。如果需要，进行任选的PCR以输送足够的样品，用于使用在98℃下10秒、在60℃下30秒和在72℃下10秒的15-20个循环和引物NGS-QC-F：5'-AATGATACGGCGACCACCGAG-3'和NGS-QC-R：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'进行桑格测序。验证后，使用Illumina HiSeq 2500系统(加利福尼亚理工学院米勒德和穆里尔·雅各布斯遗传学和基因组学实验室(Millard andMuriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory,Caltech)；希望之城整合基因组学核心(Integrative Genomics Core,City of Hope))将文库输送以进行深度测序。
rAAV组织DNA文库的制备。将来自组织的PCR扩增的rAAV DNA文库(参见部分：体内选择(i)(c))以作为模板的该DNA的1:100稀释进一步扩增到引物1527：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGACAAGTGGCCACAAACCACCA G-3'和1532：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTGGTTTTGAACCCAACCG-3'，这些引物定位于衣壳上的随机化7聚体插入的50个碱基周围并且在5'末端含有Read1和Read2序列。通过Q5热启动高保真2X主混合物或NEBNext Ultra II Q5主混合物(NEB；M0544)将DNA在98℃下10秒、在59℃下30秒和在72℃下10秒的10个循环中扩增。用PCR纯化试剂盒纯化混合物。然后，将洗脱的DNA用作第二PCR中的模板以在使用与以上(针对DNA和病毒文库制备)所述相同的温度循环的10次循环反应中使用推荐的引物(NEB；E7335S、E7500S、E7600S)添加独特的标记体(单或双)。提取的DNA通过桑格测序进行验证并输送以如先前部分所述进行深度测序。
AAV载体的体内表征
克隆AAV衣壳变体。使用具有11聚体取代的重叠正向和反向引物(在7聚体i变体的情况下，使来自AAV9衣壳AA587-588“AQ”和AA589-590“AQ”的侧接氨基酸经受密码子修饰)将AAV衣壳变体克隆到pUCmini-iCAP-PHP.B主链(Addgene ID：103002)中，该11聚体取代从pUCmini质粒上的MscI位点(在位置581AA处)跨越到AgeI位点(在位置600AA处)。引物是使用定制python脚本为所有衣壳变体设计的(代码将在github上提供)，并且由于这些引物覆盖了整个片段插入，因此这些引物是自退火的，并且使用PCR扩增以创建dsDNA片段，而不使用模板DNA。它们由Q5热启动高保真2X主混合物在98℃下10秒、在60℃下30秒和在72℃下10秒的20个循环中扩增。然后通过Gibson组装方法将此片段组装到MscI/AgcI消化的pUCmini-iCAP-PHP.B主链中。主链上存在第二MscI位点；然而，此第二MscI位点被甲基化阻断。然后将组装的质粒转化到NEB稳定感受态大肠杆菌(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs,Inc)；C3040H)中，并在羧苄青霉素/氨苄青霉素-LB琼脂板上选择菌落。
用于克隆AAV-PHP变体的引物的列表：来自7聚体i和3聚体s文库的变体被克隆为11聚体取代。
表6.AAV-PHP变体的引物
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AAV载体产生。使用优化的方案，从5-10个150mm板中产生AAV载体，这产生了足以施用于成年小鼠的量。
AAV载体施用。以1-10×1011vg的剂量通过眶后注射将AAV载体静脉内施用于成年雄性小鼠(6-8周龄)。AAV剂量由实验需要确定。CAG-NLS-GFP相关的定量实验是在l×1011vg的中等剂量下进行的，因为这是先前为AAV-PHP.eB表征确定的剂量。否则，非NLS基因组相关的实验以3×1011vg进行，除了Cre驱动系(GFAP-Cre或Tek-Cre)或含有基因组的低强度启动子(GFAP-NLS-mTurq)，其中剂量为1×1012vg。选择高剂量以了解这些系统中新载体的全部潜力。
使用携带CAG(一种强大的普遍存在的启动子)的载体进行的所有实验均温育3周。4周温育是那些涉及来自Cre驱动系或细胞类型特异性启动子的表达的温育，其中通常建议等待更长时间。2周温育是那些载体携带具有强普遍存在的启动子的自互补基因组的温育。
组织处理。表达3周后(除非另有说明)，用Euthasol(戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液，Virbac AH)对小鼠实施安乐死，并经心脏灌注有30-50mL的0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)，然后灌注30-50ml的含4％多聚甲醛(PFA)的0.1M PBS。在此程序之后，收获所有器官并在4℃下在4％PFA中后固定过夜。然后将组织洗涤并在4℃下储存在0.1M PBS和0.05％叠氮化钠中。用于此程序的所有溶液都是新鲜制备的。对于大脑和肝脏，在Leica VT1200振动切片机上切割100μm厚的切片。
对于血管标记，对小鼠实施安乐死并经心脏灌注有20mL冰冷的PBS，然后灌注有10mL含有德克萨斯红标记番茄(Texas Red-labeled Lycopersicon Esculentum)(西红柿)凝集素(1:100，载体实验室(Vector Laboratories)，TL-1176)的冰冷的PBS，并且然后放置在30mL冰冷的4％PFA中进行固定。
免疫组织化学。首先将厚度通常为100μm的组织切片在封闭缓冲液(含10％正常驴血清、0.1％Triton X-100和0.01％叠氮化钠的0.1M PBS，pH 7.4)中与适当稀释的一级抗体在室温下在摇床上温育24小时。此研究中使用的一级抗体是兔S100(1:400，艾博抗(Abeam)，ab868)、兔Olig2(1:400；艾博抗，abl09186)、兔NeuN(1:400，艾博抗，abl77487)和兔GLUT-1(1:400；密理博西格玛(Millipore Sigma)，07-1401)。在一级抗体温育后，在总共5-6小时的时间段内用洗涤缓冲液1(含0.1％Triton X-100的0.1M PBS缓冲液，pH 7.4)将组织洗涤1-3次。然后将组织与在适当稀释度下的二级抗体在封闭缓冲液中在室温下温育12-24小时，然后在5-6小时的总持续时间内在0.1MPBS pH 7.4中洗涤三次。此研究中使用的二级抗体是Alexa Fluor 647AffiniPure驴抗兔IgG(H+L)(杰克逊免疫研究所实验室(Jackson ImmunoResearch Lab)，711-605-152)。当进行核染色时，将4',6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI，西格玛奥德里奇公司，10236276001)以1:1000稀释度用于0.1M PBS，pH 7.4中，并与组织一起温育15分钟，然后在0.1m PBS，pH 7.4中单次洗涤10分钟。DAPI和/或抗体染色的组织切片用ProLong Diamond防褪色封固剂(赛默飞世尔科技公司，P36970)封固。
组织中基于杂交链式反应(HCR)的RNA标记。荧光原位杂交链反应(FITC-HCR)用于标记具有VGLUT1的兴奋性神经元和具有GAD1的抑制性神经元，以使用适配的第三代HCR协议来表征大脑组织中的AAV衣壳变体AAV-PHP.N。为了表征大脑组织中的AAV衣壳变体AAV-PHP.N，寻求HCR方法来标记兴奋性和抑制性神经元。荧光原位杂交链式反应(FITC-HCR)用于标记具有VGLUT1的兴奋性神经元和具有GAD1的抑制性神经元。适配第三代HCR，使用定制的软件(https://github.com/GradinamLab/HCRprobe)为每个靶表设计13个探针组。表达3周后，如前所述对小鼠进行经心脏灌注和固定(部分D.组织处理)。为了最小化固定组织中RNase酶的暴露，在4％PFA中固定过夜后，将组织洗涤并在4℃下储存在0.1M无RNase PBS和0.05％叠氮化钠中。此后，使用如RNAlater稳定溶液/无RNase PBS/RNaseZap(赛默飞世尔科技公司，AM7021、AM9624、AM9780)等试剂小心处理收获的大脑，以避免暴露于RNase。一旦收获的大脑被矢状地切成100μm厚的切片，就进行FITC-HCR以检测这两种基因。组织切片在室温下用含0.1％Triton X-100的0.1M无RNase PBS渗透1小时，并在杂交溶液(含10％硫酸葡聚糖和10％碳酸乙烯酯的2xSSC缓冲液(盐水-柠檬酸钠))中在37℃下预杂交>30分钟。将设计的探针在杂交溶液中稀释至终浓度为2nM。然后将组织切片与探针在37℃下杂交过夜。此后，用预热的洗涤缓冲液(含10％碳酸乙烯酯的2xSSC)在37℃下洗涤切片30分钟两次，然后在室温下用2xSSC洗涤30分钟两次。在扩增缓冲液(含10x硫酸葡聚糖的2xSSC)中使用发夹对(分子技术(Molecular Technologies)，CA)进行扩增；将发夹在95℃下快速冷却90秒，随后在室温下保持30分钟，并用扩增缓冲液(60nM)稀释。然后将组织在此扩增缓冲液中与发夹在室温下温和搅拌温育过夜。一旦扩增完成，就将样品用2xSSC进行简单洗涤并安装在Prolong Diamond中以进行成像。
成像和图像处理。此研究中的所有图像都是利用蔡司LSM 880共聚焦显微镜(使用Fluar 5倍0.25M27物镜、10倍0.45M27平面复消色差物镜(工作距离2.0mm)和25倍0.8ImmCorr DIC M27多重浸没平面复消色差物镜)；或利用Keyence BZ-X700显微镜采集的。采集的图像在Zen Black 2.3SP1(蔡司)、BZ-X分析仪(基恩士公司(Keyence))、Illustrator CC2018(Adobe)、Photoshop CC 2018(Adobe)和Imaris(Bitplane)中进行处理。为了防止由多重荧光光谱重叠导致的任何成像伪影，根据推荐的单个颜色的线性未混合采集，荧光激发和发射光谱保持不同。选择远红色荧光染料用于任何另外的标记物染色，以保持成像参数不同于体内荧光表达，从而防止跨检测器通道的任何光谱重叠。在采集前对组织进行自动荧光或成像伪影的定期监测，并根据需要调整成像参数。将成像参数与缺乏体内转导的组织进行交叉检查，以避免任何成像伪影。用于图像的区域在实验组之间紧密匹配，以最小化比较期间的偏差。
厚组织的组织清除和成像。为了证明PHP.V1在如小鼠大脑半球的一半或股骨等较厚的组织中转换脉管系统的能力，在表达4周后评估了来自Tek-Cre小鼠的组织。
将大脑半球用一级抗体抗GFP(Aves Labs，GFP-1020)和二级抗体山羊抗鸡IgY，Alexa Fluor 633(赛默飞世尔科技公司，A-21103)染色，并通过iDISCO方案38清除。对于成像，使用带有定制物镜(4倍)的商用光片显微镜(LaVision生物技术公司(LavisionBioTec))。生成的图像文件由定制的MATLAB脚本重新组织，以允许使用TeraStitcher进行拼接。对于3D可视化，使用Imaris(Bitplane)。
为了对小鼠股骨进行成像，将骨头切片成300μm厚以进行抗体渗透，并用一级抗体抗GFP和二级抗体Alexa Fluor 488驴抗鸡IgY(杰克逊免疫研究所实验室，703-545-155)进行染色，然后通过TDE(2-2'-硫代二乙醇)清除法41进行清除。这些图像是用共焦显微镜(蔡司LSM 880)采集的，并在Imaris软件中可视化。
用于量化体内rAAV转导的组织处理和成像。为了量化rAAV转导，向6至8周龄的雄性小鼠静脉内注射病毒，使该病毒表达3周(除非另有说明)。将小鼠随机分配到各组，并且未对实验者设盲。对小鼠进行灌注并将器官固定在PFA中。如上所述，将大脑和肝脏切成100μm厚的切片，并用不同的细胞类型特异性抗体进行免疫染色。这些图像是用蔡司LSM 880共焦显微镜上的25倍物镜或Keyence BZ-X700显微镜采集的；直接跨组比较的图像是用相同的显微镜和设置采集和处理的。
对于组织中的PHP.B家族变体转导的量化，在蔡司LSM 880共聚焦显微镜上使用25倍物镜和1倍数字变焦采集图像。在n＝每个变体3只小鼠的情况下，采集跨4个大脑区域——皮质、纹状体、腹侧中脑和丘脑的图像，并用3种细胞类型标记物(NeuN、01ig2和S100)对组织进行染色。对于每只小鼠，每种细胞类型标记物每个大脑区域采集2个图像，并标绘了平均值。
对于PHP.N转导分析，图像是在Keyence BZ-X700显微镜上使用20倍物镜采集的。在n＝3只小鼠的情况下，采集跨4个大脑区域——皮质、纹状体、腹侧中脑和丘脑的图像，以覆盖3种细胞类型标记物(NeuN、01ig2和S100)的整个大脑区域。这涉及了6-8个图像以覆盖皮质、丘脑和纹状体，以及2个图像以覆盖每种细胞类型标记物每只小鼠的腹侧中脑。对于每只小鼠，跨每个区域，标绘了来自图像的平均值。
对于PHP.V GLUT1+转导分析，在蔡司LSM 880共聚焦显微镜上使用25倍物镜和1倍数字变焦采集图像。具有GLUT1+染色和XFP表达的图像中的每个不同的血管被确定为转导阳性。来自CAG-mNeonGreen载体的表达量化在整个皮质上进行(n＝每组3个)。每个数据点取自每只小鼠3-2个图像的平均值。对于n＝每组2个的Tek-Cre和Ail4小鼠实验，量化了不同的大脑区域。对于皮质、小脑、纹状体和腹侧中脑，标绘了来自每只小鼠每个区域3-4个图像的平均值。
AAV载体的体外表征
按照供应商提供的说明培养人脑微血管内皮细胞(HBMEC)(科学细胞研究实验室(ScienCell Research Laboratories)，目录1000)。使用内皮细胞培养基(目录1001)在纤连蛋白包被的T-75烧瓶(7000-9000个细胞/cm2接种密度)中从冷冻原液小瓶中培养HBMEC。将细胞在纤连蛋白包被的48孔板(0.95cm2生长面积)中以推荐的接种密度传代培养，并在37℃下温育约24-48小时，直到细胞以约70-80％汇合度完全粘附。将包装pAAV-CAG-mNeongreen的病毒载体以每孔1×108或1×1010vg的剂量添加到细胞培养物中(每个载体每剂量3个孔)。24小时后更换培养基，并在感染后3天评估培养物的荧光表达。根据供应商的建议，每隔一天更换培养基以维持细胞培养物。
数据分析
小鼠组织中rAAV载体转导的量化。使用Adobe Photoshop CC 2018计数工具对表达和/或抗体染色覆盖整个细胞形态的细胞类型进行手动计数。使用了Keyence杂交细胞计数软件(BZ-H3C)，该软件可以可靠地检测整个数据集中的不同的细胞。为了保持跨不同标记物和组计数的一致性，指定一个人在所有大脑区域中跨所有组进行量化。
对GLUT-1染色的血管和ssAAV:CAG-mNeonGreen和ssAAV:CAG-DIO-EYFP的表达进行手动计数，其中效率计算为XFP+血管相对于GLUT-1染色的百分比。还进行了手动计数以量化核或体细胞染色的细胞，包含NeuN、Olig2和S100染色的细胞。效率计算为XFP+细胞相对于细胞标记物+细胞的百分比。
Keyence杂交细胞计数软件(BZ-H3C)用于量化与DNA染色剂DAPI共定位的肝脏肝细胞中的核定位AAV基因组的表达；并且还用于涉及具有S100细胞标记物的ssAAV:GFAP-2xNLS-mTurquoise2基因组的研究。
使用ImageJ软件量化跨显微图像的平均荧光强度。对图像进行背景扣除处理，并使用阈值操作，测量平均荧光强度。
NGS数据比对和处理。将来自NGS运行的原始fastq文件用定制的脚本(代码将在Github上提供)进行处理，该脚本将数据与含有多样化区域7xNNK(对于R1)或11xNNN(对于R2，因为它被合成为11xNNN)的AAV9模板DNA片段比对。用于处理这些数据集的方案涉及通过使用每个序列的深度测序质量评分来过滤数据集以去除低质量读段。然后通过搜索侧接模板序列并提取多样化区域的核苷酸(完美字符串匹配算法)从测序读段中回收变体序列。进一步研究比对的数据的质量以去除任何错误序列(如具有终止密码子的序列)。标绘原始数据(如补充图1e所示)以研究每个文库的回收质量。基于RC分布，采用阈值化方法来去除可能由基于PCR或NGS的错误导致的似是而非的错误突变。假设如果在回收的亲本序列上存在PCR突变或NGS错误，则亲本必须比错误序列早至少一轮存在，因此RC中应该存在差异。
对于R1组织文库，在低计数序列的长尾之后观察到分布曲线的斜率急剧下降，并且发现在较高计数范围中富含作为亲本的变化的序列。手动设置RC的阈值以去除此类错误的突变体。然后使用定制的基于Python的脚本，基于实验需求对阈值数据进行不同的处理，如其它地方所述。
对于来自PCR池和合成池的R2组织文库，考虑到与R1相比更小的文库大小，将数据以两个步骤进行阈值化。仅考虑存在于相应输入DNA和病毒文库中的回收的组织序列(按照与R1组织文库相同的原则，从输入文库中去除较低计数的变体之后)。此步骤部分地去除了低计数读段的长尾。作为第二步骤，应用针对R1组织文库描述的阈值化。
虽然在阈值化期间可能会丢失真正的变体是合理的，但此方法最大限度地减少了假阳性，因为组织和病毒文库中的低计数突变体通常似乎具有非常高的富集评分(因为RC相对于输入文库归一化)。换句话说，阈值化允许对在其NGS RC中具有更高置信度的阳性和阴性富集变体进行选择性调查。
作为手动阈值化方法的替代方案，构建了一种称为“折叠(Collapsing)”的任选纠错方法，以进一步验证来自过滤数据集的结果。此方法从计数最低的变体(计数为1的变体)开始，并且搜索偏离一个核苷酸但具有至少高2倍的计数(倍数变化＝(2ΔCT)，其中CT是PCR循环阈值)的潜在亲本变体。然后，此纠错方法将这些潜在错误序列的计数转移到它们的原始序列中，并递归地重复，直到考虑了所有序列。在对阈值化数据应用此纠错时，捕获了另外的约0.002-0.03％的序列(与通过阈值化捕获的>19％的序列相比)，从而证实阈值化策略在很大程度上是成功的。
NGS数据分析。然后，通过定制数据处理方案，用Python编写的脚本(可在Github上获得)进一步处理比对的数据。根据以下公式从读段计数(RC)计算跨不同文库的变体(总数＝N)的富集分评分：富集评分＝logl0[(组织文库1中的变体1RC/文库1中的变体N RC的总和)/(病毒文库中的变体1RC/病毒文库中的变体N RC的总和)]
为了一致地表示R1与R2选择的变体之间的文库回收，估计了R1选择中的变体的富集评分。使用以下公式计算特异性文库中变体的标准评分：标准评分＝(读段计数_i-平均值)/标准偏差。其中读段计数_i是变体i的原始拷贝数，平均值是特异性文库中所有变体的读段计数的平均值，标准偏差是特异性文库中所有变体的读段计数的标准偏差。
由于与组织文库不同，DNA和病毒文库没有完全采样，因此为输入文库中不存在但输出文库中存在的变体分配了估计的RC。例如，R1病毒文库是R1组织文库的输入文库。估计的RC被定义为低于文库中最低RC的数字，其中假设发现这些变体的丰度比从深度测序中回收的变体的丰度低。在病毒文库中，由于1.0的RC是最低的，所以为所有缺失的变体分配了0.9的估计RC。使用此方法来计算相对于R1病毒文库归一化的R1组织文库的富集评分(图1d)。这样做是为了在两轮选择中一致地表示文库。尽管如此，R1变体中的个体富集评分并没有为选择用于R2选择的变体增加显著值，如使用RC分离R1信号与噪声的标准中所述。
热图产生。多样化区域的相对AA分布被绘制为热图。这些图是使用Python Plotly绘制文库产生的。热图值是使用定制“pepars”Python包中的函数，从用Python编写的定制脚本中产生的。每个热图都使用氨基酸序列的预期(输入)分布和输出分布。输出分布必须是序列及其计数的列表，并且输入分布可以是序列及其计数的列表，也可以是来自如NNK等模板的预期的氨基酸频率。对于输入和输出两者，根据每个序列的计数计算每个位置的氨基酸总数，然后将该总数除以计数的总和，给出每个位置处每个氨基酸的频率。然后，计算输出与输入之间的log2倍数变化。对于在输入或输出中计数为0的氨基酸，不执行计算。为了区分统计上显著的氨基酸偏差，使用statsmodels Python文库进行统计学测试。对于存在两个氨基酸计数的情况，进行两侧、两比例z检验；为了将输出氨基酸计数与来自模板的预期的输入频率进行比较，进行了单比例z检验。然后使用邦弗伦尼校正对所有p值进行校正，以进行多次比较。然后仅将低于1e-4的显著性阈值的偏差差异描绘在热图上；所有其它(不显著)方块都留空。
聚类分析。使用以MATFAB(版本R2017b；MathWorks)编写的定制脚本，确定了表示两个肽之间共享的AA的数量的反向汉明距离(Hamming distance)。然后使用Cytoscape(版本3.7.153)软件对变体进行聚类。表示突出显示的集群的AA频率图是使用Weblogo(版本2.8.2)创建的。在R2选择后，测定计数大于10和富集大于2.5倍的所有独特的衣壳变体的反向汉明距离(表示两个肽之间共享的AA的数量)。此过程迭代地将每个变体与组内的所有其它变体进行比较。然后使用Cytoscape通过它们的反向汉明距离对衣壳变体进行聚类。用于可视化的最小反向汉明距离是基于序列相似性手动选择的。
对于氨基酸频率图，底部的数字表示从1开始的多样化基序的位置。堆叠中氨基酸的大小反映了AA出现在基序中的该特定位置处的独特克隆的比例。颜色代码基于AA性质。带正电荷的残基K、R和H呈蓝色。带负电荷的残基D和E呈红色。含有极性残基Q和N的酰胺呈品红色。极性残基T和S呈绿色。疏水残基A、L、V、I、P、F、M和W呈黑色。
实例3.多重CREATE允许在第1轮选择期间对衣壳文库进行详细的表征。
为了鉴定在特定细胞类型或器官中富集的变体，进行了跨多个靶标的平行选择，并绘制了跨这些靶标的每个衣壳变体的富集或耗竭。
在DNA和病毒文库产生期间，可能会积累过度代表某些衣壳变体的偏差，从而在体内选择期间掩盖它们的真正富集。这些偏差可能源于DNA文库中的PCR扩增偏差或在以下各个步骤中病毒产生效率的序列偏差：衣壳组装、基因组包装和纯化期间的稳定性。这是用7聚体i文库研究的，该文库是插入在rAAV-ΔCap9-in-cis-Lox2质粒(图36)中的AAV9(图1和2)的位置588-589之间的随机化7聚体文库。在DNA组装和病毒纯化到1000-2000万(M)读段深度后对文库进行测序足以捕获病毒产生期间变体之间的偏差(图3；尽管这些文库之间的变体重叠为约1％；图38和39)，从而证明即使是像588-589这样的许可位点也会对采样序列空间施加生物学限制。DNA文库在约10M总读段内具有9.6M独特变体的均匀分布(读段计数(RC)平均值＝1.0，S.D.＝0.074)，表明偏差最小。相比之下，病毒文库在约20M深度内具有3.6M独特变体(RC平均值＝4.59，S.D.＝11.15)，表明在病毒生产期间变体的子集富集。
对于体内选择，以每只在不同大脑细胞类型中表达Cre的成年转基因小鼠2×1011vg的剂量静脉内注射7聚体i病毒文库：对于星形胶质细胞，GFAP-Cre小鼠，对于神经元，SNAP25-Cre小鼠；以及对于内皮细胞，Tek-Cre小鼠(n＝每个Cre转基因系2只小鼠，参见方法)。静脉内(IV)注射后两周，收获大脑和肝脏组织，后者作为对照器官，因为AAV9对其进行了高效转导。从组织中提取rAAV基因组并且选择性扩增转导Cre表达性细胞的衣壳(图40-44)。深度测序后，跨转基因系观察到从大脑组织中回收的约8×104个独特的核苷酸变体和脊髓中的<50个变体(其中约48％在病毒文库中鉴定)，
设计参数 合成池设计 PCR池设计
并且每个变体都用反映了大脑与起始病毒文库之间的相对丰度的变化的富集评分表示(图4)。
此数据集具有两个突出的特征。首先，在大脑组织中回收的变体在病毒产生后通过测序观察到的转化衣壳文库的级分中不成比例地表示，这证明了产生偏差如何扭曲选择结果。其次，衣壳读段计数(RC)的分布揭示，在选择后超过一半的独特的回收的变体出现在非常低的读段计数下。这些变体可以是来自实验操纵的非预期突变体或具有CNS转导的低基础水平的AAV9样变体(图40)。
实例4.新颖的第2轮文库设计改善了选择结果
考虑到尽管进行了事后富集评分，病毒产生和回收期间的序列偏差仍会在选择轮次间传播，基于通过寡核苷酸池(Twist生物科学)的第1轮(R1)输出设计了无偏文库(合成池文库)。将此文库与从回收的R1 DNA直接扩增的文库PCR(PCR池文库)进行比较(图5，表7)。
表7：两种R2选择方法之间的比较。该表总结了通过合成池和PCR池R2选择方法的选择设计参数的优缺点。
变体之间R1选择偏差的遗留 否，假阳性的可能性很低 是，可能通过归一化来最小化
R1选择诱导的突变体的遗留 否 是
文库性能的置信度 高，使用替代密码子重复 低
定制文库或添加内部对照 是，以无偏的方式 是，具有更大的偏差风险
对照文库大小 是，不减少文库或池化 是，进行池化的文库减少
R2文库产生的成本 高 低
合成池文库设计包括：(1)等摩尔量的约8950个衣壳变体以高读段计数存在于来自大脑和脊髓的至少一个R1选择中(图40)；(2)那些约8950个变体的替代性密码子重复(针对哺乳动物密码子优化)以减少假阳性；以及(3)对照的“掺入物”文库(图74和75)，其使得总文库大小为18,000个核苷酸变体。
正如预期的那样，第2轮(R2)病毒文库产生了高滴度(每150mm培养皿每10ng R2DNA文库约6×1011vg；图45)，并且来自R2 DNA的约99％的变体是在病毒产生后发现的(图6)。然而，来自两种设计的DNA和病毒文库的分布有显著差异。PCR池文库具有R1选择偏差(图7、46和47)，其中丰度反映了在R1中跨组织的先前富集以及来自病毒产生和样品混合的偏差。比较地，合成池DNA文库分布更均匀，从而最大限度地减少了选择轮次间的偏差放大。
对于体内选择，将每只成年转基因小鼠1×1012vg的剂量施用到三个先前使用的系(n＝每个Cre转基因系2只小鼠——GFAP、SNAP25、Tek)以及Syn-Cre系(用于神经元)中。IV注射后两周，从大脑样品中提取rAAV基因组，选择性扩增，并进行深度测序(如在R1中)。合成池文库产生比PCR池大脑文库更多的阳性富集的衣壳变体(例如，GFAP-Cre中的氨基酸(AA)水平的约1700对约700个变体/组织文库)(图8和48)。在合成池中，来自掺入物文库的约90％的变体如预期的那样被阳性地富集(图48，中图；图74)。
从PCR和合成池文库两者中回收的变体的富集评分的相关程度在每个Cre转基因系中不同，证明了实验中噪声的存在(图49)。合成池的密码子重复特征通过精确定位每个选择中所需的富集水平以上升高于噪声来解决此困境(图9、50和51)。与PCR池设计相比，这是一个显著的优势，使得研究人员自信地解释给定选择中的富集评分。
相关性失效的富集程度似乎随Cre系而变化。PCR池的缺点在于无法判断其或合成池是否具有更“真实”的富集评分，或者甚至可能无法判断某些富集值是否值得关注。发现两种方法之间阳性富集的变体之间的相关性随着阳性富集的量值而改善。对于每个实验，存在富集水平，低于该富集水平，评分变得不可再现或嘈杂。图50表明，无论是PCR池还是合成池在较低的富集评分下本质上都不是更“真实”的。这是因为具有密码子重复的合成池方法具有独立的控制来确定富集水平，低于该水平富集值没有进一步的预测能力。术语“噪声”在本文中已经用于指特定实验中的富集区域，低于该区域，值会失去其再现性和预测能力。能够通过实验确定高于噪声的富集信号使得研究人员能够将其注意力和数据分析集中在内部可再现的富集水平上，从而避免选择假阳性变体或得出无效结论。
因此，如果只对特定组织的最高富集变体感兴趣，那么对于体内选择的子集(如Tek-Cre或SNAP-Cre)的另外一轮选择，与相对于病毒文库的富集归一化偶联的PCR池设计可能与合成池设计没有显著差异。然而，在没有另外的验证的情况下，很难预测给定的体内系统是否会像Tek-Cre那样执行。这在多重选择研究中变得至关重要，其中靶特异性变体可能不会在一个特定体内选择中获得最高的富集。
实例5.第2轮选择后AAV衣壳文库的分析
虽然DNA文库的AA分布与寡核苷酸池设计非常匹配，但病毒产生是针对具有位于位置2处的Asn(N)、位于位置4处的P分支的AA(I、T、V)以及位于位置5处的带正电荷的AA(K、R)的基序而选择的(图10、52)。BBB穿越的适应性导致了非常不同的模式。与R2病毒文库相比，高度富集的变体共享偏好，例如，在位置5的脯氨酸(P)和在位置6的苯丙氨酸(F)。
然后确定来自大脑的阳性富集的变体在所有外周器官中的分布(图11，左图)。约60个在大脑中高度富集的变体在所有其它器官中相对耗竭(图11，中图)。受到掺入物控制变体(AAV9、PHP.B、PHP.eB)的预期行为的鼓舞，选择了十一个新变体进行进一步验证(图11，右图)，包含几个如果选择基于PCR池或CREATE(表8)则会被忽略的变体。
表8：不同方法中AAV-PHP衣壳的排序。通过合成池富集评分(表示M-CREATE)、PCR池富集评分(表示更接近M-CREATE)或PCR池读段计数(表示CREATE)，从R2 Tek-Cre选择中回收的所有衣壳中所选变体的等级，其中最高等级从1开始，并且“未回收”表示R2测序数据中不存在变体。
Figure BDA0003406068610001111
Figure BDA0003406068610001121
选择这些变体是因为它们的富集和它们在序列空间中的位置。发现阳性富集的变体基于序列相似性聚类成不同的家族。与上面讨论的热图一致，最富集的变体在共享共同基序的选择中形成了不同的家族：位置1中的T、位置2中的L、阳性5中的P、位置6中的F以及位置7中的K或L(图12、53)。此AA模式与先前鉴定的变体AAV-PHP.B-TLAVPFK非常相似。鉴于成员之间的序列相似性，预测它们可能类似地穿过BBB并靶向中枢神经系统。
从完全独立构建和选择的文库中两次回收AAV-PHP.B序列家族的能力证实了病毒文库的序列空间覆盖范围广泛，足以回收共享共同基序的变体的家族。与仅鉴定一个变体AAV-PHP.B的CREATE不同，M-CREATE产生了暗示此基序的重要化学特征的多样化的PHP.B样家族。此家族内的序列多样性表明，在先前的实验中(考虑到理论起始文库大小为约13亿)分离AAV-PHP.B不仅仅是幸运的，而且这是此特定实验的显著的家族。
实例6.从第2轮选择中回收的衣壳产生具有增强的BBB进入和CNS转导的AAV9变体 池
鉴于PHP.B家族在此特定选择中的优势，测试了最富集的成员：TALKPFL(图12和13)，此后称为AAV-PHP.V1。鉴于其与AAV.PHP.B的序列相似性，AAV-PHP.V1的向性偏向于转导大脑血管细胞，这有些令人惊讶(图14、54)。当静脉内递送时，与AAV-PHP.eB转导约20％而AAV9几乎没有转导相比，在普遍存在的CAG启动子的控制下的携带荧光报告基因的AAV-PHP.V1转导约60％的GLUT1+皮质大脑脉管系统(图14和16)。除了脉管系统之外，AAV-PHP.V1还转导了约60％的皮质S100+星形胶质细胞(图17)。然而，AAV-PHP.V1对星形胶质细胞转导的效率不如先前报道的AAV-PHP.eB(当与星形胶质细胞特异性GfABCID启动子一起包装时，图55)。
对于需要通过静脉内递送内皮细胞限制性转导的应用，AAV-PHP.V1载体可以用于三种不同的系统：(1)具有Cre依赖性表达载体的内皮细胞类型特异性Tek-Cre小鼠(图15(左图)和图18)，(2)荧光报告基因小鼠，其中Cre与内皮细胞类型特异性迷你启动子(Ple261)一起递送(图15(右图)和图19和56至图58的左列)和(3)野生型小鼠，通过包装含有普遍存在的启动子的自互补基因组(scAAV)(图58的右列)。通过AAV-PHP.V1使用scAAV基因组进行内皮细胞特异性转导的机制尚不清楚，但据报道，当另一种衣壳包装scAAV基因组时，载体向性发生了变化。
鉴于AAV-PHP.V1与AAV-PHP.B/eB之间在向性上的巨大差异，测试了PHP.B样家族中的几个另外的变体。一种变体AAV-PHP.V2-TTLKPFL与AAV-PHP.V1仅相差一个AA，具有类似的向性(图59-61)。发现AAV-PHP.V2在跨所有大脑文库的R1选择中具有高丰度，并且在R2中高度富集(图4、11(右图)、12、13和40)。鉴于其序列相似性，预期与AAV-PHP.V1的向性相似。这在C57BL/6J成年小鼠(ssAAV-PHP.V2:CAG-mNeongreen基因组，每只成年小鼠3×1011vg剂量，n＝3，图59)、Tek-Cre小鼠(ssAAV-PHP.V2:CAG-DIO-EYFP基因组，每只成年小鼠1×1012vg剂量，n＝2，图60)和GFAP-Cre小鼠(ssAAV-PHP.V2:CAG-DIO-EYFP，每只成年小鼠1×1012vg剂量，n＝2，图61)体内得到了验证。
具有与AAV.PHP.V1和AAV.PHP.B两者偏差大致相等的序列的其它三个变体AAV-PHP.B4-TLQIPFK、AAV-PHP.B7-SIERPFK和AAV-PHP.B8-TMQKPFI(图12、13、20和21)具有PHP.B样向性，该向性具有偏向神经元和星形胶质细胞的转导(图21和62-64)。掺入物文库中的类似变体AAV-PHP.B5-TLQLPFK和AAV-PHP.B6-TLQQPFK也共享此向性(图13、20、21和62)。
为了评估掺入物文库的性能，选择了两个类似地放置在序列空间中的高度富集的变体：AAV-PHP.B6-TLQLPFK和AAV-PHP.B7-TLQQPFK(图48(中图)和53)，这些变体先前在3聚体s PHP.B文库中鉴定但从未在体内验证过。在C57BL/6J成年小鼠中以1×1011vg的适度剂量下，这些变体也显示出PHP.B样向性(图20-21和62)。
然后研究了一系列被选择来检验M-CREATE在此家族之外的预测能力的变体：(1)与来自B家族的其它测试变体相比，具有完全不相关序列的高度富集变体AAV-PHP.C1-RYQGDSV(图12、13、20和21)以相似的效率转导星形胶质细胞而以较低的效率转导神经元(图21)。(2)在R2合成池病毒文库中发现的高丰度并在大脑中阴性富集的两种变体(两个密码子重复一致)AAV-PHP.X1-ARQMDLS和AAV-PHP.X2-TNKVGNI(图46，右图)对CNS的转导不良(图63)。(3)在来自PCR池R2的大脑文库中发现的更高丰度的两种变体AAV-PHP.X3-QNVTKGV和AAV-PHP.X4-LNAIKNI在大脑中的表现也未能超过AAV9(图65)。
总体来说，这些AAV变体的表征表明了几个关键点。首先，在不同的序列家族中，存在功能冗余和新向性出现的空间。其次，显著的家族之外的高度富集的序列也可能具有增强的功能。第三，在合成池中的密码子重复一致性的支持下，变体跨组织的富集可以是预测性的。第四，虽然合成池R2文库含有PCR池R2中的序列的子集并且因此可能缺乏一些增强的变体，但排除的PCR池群体以假阳性富集。
从18,000个跨小鼠的变体的池中确信地预测体内转导的能力是选择过程中的重大进步，并证明了M-CREATE对单个载体进化的影响力。
实例7：产生AAV.PHP.eB的衣壳选择的重新研究揭示了特异性转导神经元的变体
使用NGS，重新研究了由产生AAV-PHP.eB的先前CREATE方法产生的3聚体s(s取代)PHP.B文库(图24)。使用Cre依赖性的PCR和来自野生型小鼠的R2肝脏文库对大脑文库进行深度测序(通过PCR处理所有衣壳序列，而不考虑Cre介导的反转)，并鉴定大脑组织中150-200个阳性富集的衣壳(图25、66和67)。简而言之，重新研究的3聚体s PHP.B文库使AAV-PHP.B衣壳的位置587-597(相当于AAV9上的587-590AA)在三个连续AA的部分中多样化(约40,000个变体)(图24)。在以下三个Cre转基因系中进行选择：用于谷氨酸能神经元的Vglut2-IRES-Cre、用于GABA能神经元的Vgat-IRES-Cre和用于星形胶质细胞的GFAP-Cre。
在大脑中阳性富集而在肝脏中阴性富集的变体显示出对某些AA的显著的偏差：在位置1处的G、D、E；在位置2处的G、S(包含AAV-PHP.eB基序、DG)；和在位置9、10、11处的S、N、P(图26和68)。在大脑中阳性富集的变体根据它们的序列相似性进行聚类，并根据它们在肝脏中的阴性富集(由集群中的节点大小表示)进行排序。在PHP.B主链上的位置9-11处出现了具有共同基序“SNP”的称为N的独特家族(图27和69)。
与GFAP相比，N家族集群的核心变体：AQTLAVPFSNP在R1和R2选择中被发现具有高丰度，在Vglut2和Vgat大脑组织中具有更高的富集评分，并且在肝脏组织中具有阴性富集(图25和66-69)。与AAV-PHP.eB不同的是，此变体(AAV-PHP.N)即使与普遍存在的CAG启动子一起包装，也能特异性地转导NeuN+神经元，尽管转导效率因大脑区域而异(在NeuN+神经元中为约10％到70％，包含VGFUT1+兴奋性和GAD1+抑制性神经元两者，图28、29、70和71)。
因此，通过重新检查3聚体s文库，鉴定了几种新颖变体，包含具有显著的细胞类型特异性向性的变体。虽然Vglut2-Cre和Vgat-Cre小鼠用于体内选择，但从对NGS数据集的初步研究来看，兴奋性和抑制性群体的神经元亚型特异性转导没有明显的变体。文库中可能不存在针对此(严格的)选择的生物学解决方案。
实例8.C57BL/6.T小鼠品系以外的衣壳家族的研究
小鼠品系的子集中不存在AAV-PHP.eB的增强的CNS向性。其在C57BL/6J、FVB/NCrl、DBA/2和SJL/J中高效，在129Sl/SvimJ中有中等增强，并且在BALB/cJ和几个另外的品系中没有增强。此模式适用于来自PHP.B家族的两个新鉴定的变体AAV-PHP.V1和AAV-PHP.N(图30，表9)，该两个新鉴定的变体不转导BALB/cJ中的CNS，但转导了FVB/NJ品系(图31)。然而，与AAV9和AAV-PHP.eB相比，AAV-PHP.V1转导人脑微血管内皮细胞(HBMEC)培养物，从而产生增加的平均荧光强度(图72)，这表明可能存在机械复杂性。
表9：由CREATE和M-CREATE鉴定的AAV-PHP载体。该表提供了迄今为止使用CREATE和M-CREATE鉴定的变体的汇总，以及它们的向性和从涉及它们的发现的亲本衣壳开始的进化步骤。
Figure BDA0003406068610001161
重要的是，M-CREATE揭示了许多非PHP.B样序列家族，这些序列家族通过针对CNS中的细胞的转导的选择而富集。测试了前面提到的AAV-PHP.C1：RYQGDSV以及AAV-PHP.C2：WSTNAGY和AAV-PHP.C3：ERVGFAQ(图30)。无论小鼠品系如何，这些都示出了增强的BBB穿越，其中在BALB/cJ和C57BL/6J中具有大致相等的CNS转导(图32和73)。总体来说，这些初步研究表明，M-CREATE能够发现具有不同BBB进入机制但缺乏品系特异性的衣壳变体。
实例8.变体AAV衣壳蛋白序列的示例性插入
在AAV衣壳中插入7氨基酸肽的展示：肽序列“TLQIPFK”(SEQ ID:435)定位在AAV衣壳的AA588-589之间。插入序列加下划线和粗体。
Figure BDA0003406068610001171
在AAV衣壳中插入11氨基酸肽的展示：
肽序列“DGTTLKPFLAQ”(SEQ ID:867)通过替换AAV衣壳的AA 587-590来定位。插入的序列加下划线并突出显示。
Figure BDA0003406068610001172
实例9.治疗亨廷顿氏病(HD)
鉴定了患有亨廷顿氏病的受试者。然后，向该受试者全身性施用第一量的病毒载体，该病毒载体包含编码锌指蛋白(ZFP)的多核苷酸，该锌指蛋白被工程化以抑制亨廷顿蛋白(HTT)基因的转录。载体将被具有图33中提供的或表2-4中提供的氨基酸序列的经修饰的AAV衣壳蛋白衣壳化，以便允许ZFP适当地靶向神经系统以及其它器官。如果需要，向该受试者施用第二或第三剂量的载体，直到在该受试者的神经系统中表达治疗有效量的ZFP。
实例10.1A期临床试验
执行1A期临床试验以评估在患有亨廷顿氏病(HD)晚期的受试者中一次性静脉内注射测试组合物的安全性、耐受性、药代动力学和药效学，该测试组合物包括病毒载体，该病毒载体由经修饰的AAV衣壳蛋白衣壳化，该经修饰的AAV衣壳蛋白具有图33或表2-4中提供的氨基酸序列中的任何氨基酸序列。符合条件的受试者是21岁与65岁之间的男性和女性。
纳入标准：符合条件的受试者是21岁与65岁之间的男性和女性。(i)在国际功能、残疾与健康分类(International Classification of Functioning,Disability andHealth)(ICF)上签名并注明日期的受试者；(2)年龄≥21岁且≤65岁的男性或女性参与者；(3)提交证明亨廷顿氏病的医学报告(PCR)的参与者，其中在4号染色体上具有多个CAG重复序列，大于或等于40且小于或等于50(如果参与者未进行检查和/或如果参与者没有可用的报告，则应进行新的检查)；(4)登记时在运动评估UHDRS量表(统一的亨廷顿氏病量表(Unified Huntington's Disease Rating Scale))中获得5分或以上的评分；(5)登记时在UHDRS量表的功能能力评分介于8分与11分之间。
排除标准：(1)医学研究认为如果登记进行研究，则会对受试者造成风险的任何医学观察数据(临床和物理)；(2)医学研究认为如果登记进行研究，则会对受试者造成风险的任何实验室检查数据；(4)癫痫病史；(5)诊断出重大认知障碍；(6)主动失代偿性精神病；(7)当前或先前的瘤形成病史；(8)胃肠、肝脏、肾、内分泌、肺、血液、免疫、代谢病理或严重且不受控制的心血管疾病的当前病史；(8)诊断出任何活动性感染，无论是病毒性、细菌性、真菌性还是由另一种病原体引起的；(9)具有参加本研究执行的测试中的任何测试的禁忌症的参与者，例如，具有起搏器或手术夹；(10)酗酒或非法吸毒者的病史；(11)在访问V-4之前的两年中有1次或多次自杀事件的历史；(12)积极吸烟者或在登记前不到六个月停止吸烟；(13)在以下血清学测试中的至少一个呈阳性的测试：HIV 1和2(抗HIV-1,2)、HTLV I和II、HBV(HBsAg、抗HBc)、HCV(抗HCV-Ab)和VDRL(梅毒螺旋体)；(14)药物过敏史，包含成像造影剂或牛制品；(15)在首次施用研究产品后的头三个月内，正在使用或预期使用免疫抑制性药物或违禁药物；(16)医学研究人员认为对参与者登记存在风险的任何临床变化。
实验：
安慰剂。在第0周一次性注射安慰剂。
测试高剂量。在第0周一次性注射2×10^10vg的测试组合物。
测试中间剂量。在第0周一次性注射6×10^9vg的测试组合物。
测试低剂量。在第0周一次性注射2×10^9vg的测试组合物。
测试最低剂量。在第0周一次性注射2×10^8vg的测试组合物。
主要结果量度：通过定期监测不良事件、生命体征、实验室测试、ECG以及良性和恶性肿瘤发生率的变化来进行的测试组合物的安全性[时间范围：五年]。将通过定期评估来详细评估研究产品的安全性，这些定期评估考虑了监测以下方面的变化：(1)不良事件，包含类型、频率、强度、严重度、严重性和与研究产品研究有关的所采取的行动；(2)生命体征(BP、HR、腋窝温度)、身体和医学检查(BMI、体重、身高、医疗状况-心血管、肺、消化系统、肌肉骨骼和外周(其中重点是神经学评估)及其它方面)；(2)实验室测试包含血液学、生化、泌尿学和血清学分析；(3)12导联心电图(ECG)；(4)通过实验室测试、磁共振成像、计算机断层扫描和超声检查获得的以下器官/系统中良性和恶性肿瘤的发生率和分类：CNS、肺、肝脏、脾脏、胰腺、前列腺、睾丸、泌尿、血液和骨骼系统。
次要结果量度：通过全局临床应答(CIBIS)和UHDRS改善度量的Cellavita HD的初步功效[时间范围：五年]将通过对每个UHDRS量表组成：运动、认知和行为的结果进行统计比较来评估。全局临床应答将通过在Cellavita HD治疗之前和之后由研究者观察到的基线评分之间的统计比较来评估。通过比较炎性标志物度量的Cellavita HD的初步功效[时间范围：一年]将通过对包含IL-4、IF-6、IF-10(白介素IF)和TNF-α(肿瘤坏死因子α)在内的炎性标志物进行统计比较来评估。Cellavita HD的免疫应答[时间范围：一年]。由CellavitaHD诱导的免疫应答将通过CD4+和CD8+增殖和其它评估时间的基线结果之间的统计比较来评估。通过比较CNS评估的Cellavita HD的初步功效[时间范围：一年]。将借助于在皮质厚度测量时的磁共振图像、不同大脑结构(尤其是基底神经节)的体积，通过CNS评估的统计比较来进行评估，其中特别注意质子波谱中鉴定的尾状和代谢变化。通过汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Rating Scale，HDRS)度量的自杀意念的风险[时间范围：五年]将通过自杀域进行评估。分类标点符号可以对应于轻度抑郁(评分：8到13)、中度抑郁(评分：19-22)和重度抑郁(评分：>23)。
尽管本文中已经示出并描述了本实例的优选情况，但对于本领域的技术人员而言显而易见的是此类情况仅通过举例的方式提供。本领域的技术人员现将在不脱离本公开的情况下意识到大量变型、变化和取代。应当理解的是，本文中描述的本公开的情况的各种替代方案可以用于实践本公开。本发明的意图在于以下权利要求限定了本公开的范围以及由此覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员来说将明显的是，此类实施例仅通过举例方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将想到许多变化、改变和取代。应当理解的是，本文所描述的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实践本发明。本发明的意图在于以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。

Claims (50)

1.一种AAV衣壳，其包括：
a)AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白包括：
i.与SEQ ID NO:1的氨基酸217到氨基酸736至少98％相同的第一氨基酸序列；以及
ii.插入在SEQ ID NO:1中的氨基酸位置588_589处的与表2-3或图33中提供的氨基酸序列至少57.1％相同的第二氨基酸序列，其中所述AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在所述受试者的中枢神经系统(CNS)中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述第二氨基酸序列与表2-3或图33中提供的所述氨基酸序列至少71.4％相同。
3.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述第二氨基酸序列与表2-3或图33中提供的所述氨基酸序列至少86.7％相同。
4.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述第二氨基酸序列选自由以下组成的组：TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI、SIERPFK、RYQGDSV和TTLKPFS。
5.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白存在于所述AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。
6.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是嵌合的。
7.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成所述AAV衣壳。
8.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白，其中所述CNS包括选自由以下组成的组的细胞类型：神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和大脑血管细胞。
9.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述CNS包括选自由以下组成的组的组织：大脑、丘脑、皮质、纹状体、腹侧中脑和脊髓。
10.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代A587D或Q588G。
11.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代A589N或Q590P。
12.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其中在SEQ ID NO:1中的所述氨基酸位置588_589处的所述第二氨基酸序列不是TLAVPFK、KFPVALT、SVSKPFF、FTLTTPK、MNATKNV、NGGTSSS、TRTNPEA或YTFSQGW。
13.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其是分离的和纯化的。
14.根据权利要求1所述的AAV衣壳，其被调配为用于静脉内施用以治疗所述CNS的疾病或病状的药物调配物，所述药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。
15.根据权利要求14所述的AAV衣壳，其中所述药物调配物进一步包括治疗剂。
16.一种AAV衣壳，其包括AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白包括SEQ ID NO:1中提供的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中的氨基酸588与氨基酸589之间的七个氨基酸插入(X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7)，其中：
X1是选自由以下组成的组的氨基酸：E、D、G、R、S和T；
X2是选自由以下组成的组的氨基酸：A、G、I、L、M、N、Q、T和Y；
X3是选自由以下组成的组的氨基酸：E、K、L、T和Q；并且
X4是选自由以下组成的组的氨基酸：G、I、K、L、R、T和V。
17.根据权利要求16所述的AAV衣壳蛋白，其中X5是选自由以下组成的组的氨基酸：A、D、G、P、L、Q和V。
18.根据权利要求17所述的AAV衣壳蛋白，其中X6是选自由以下组成的组的氨基酸：F、K、N、P、Q、S和V。
19.根据权利要求18所述的AAV衣壳蛋白，其中X7是选自由以下组成的组的氨基酸：I、K、L、P和V。
20.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其中所述七个氨基酸插入选自由以下组成的组：TALKPFL、TTLKPFL、TLQIPFK、TMQKPFI、SIERPFK、RYQGDSV和TTLKPFS。
21.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白存在于所述AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。
22.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是嵌合的。
23.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成所述AAV衣壳。
24.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在所述受试者的中枢神经系统(CNS)中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。
25.根据权利要求24所述的AAV衣壳蛋白，其中所述CNS包括选自由以下组成的组的细胞类型：神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞。
26.根据权利要求24所述的AAV衣壳，其中所述CNS包括选自由以下组成的组的组织：大脑、丘脑、皮质、纹状体、腹侧中脑和脊髓。
27.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，所述氨基酸取代包括A587D或Q588G。
28.根据权利要求16所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白进一步包括氨基酸取代，所述氨基酸取代包括A589N或Q590P。
29.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其中所述七个氨基酸插入不是TLAVPFK、KFPVALT、SVSKPFL、FTLTTPK、MNATKNV、NGGTSSS、TRTNPEA或YTLSQGW。
30.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其是分离的和纯化的。
31.根据权利要求16所述的AAV衣壳，其被调配为用于静脉内施用以治疗所述CNS的疾病或病状的药物调配物，所述药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。
32.根据权利要求31所述的AAV衣壳，其中所述药物调配物进一步包括治疗剂。
33.一种AAV衣壳，其包括：
a)AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白包括：
i.与SEQ ID NO:1的氨基酸217到氨基酸736至少98％相同的第一氨基酸序列；以及
ii.位于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置588_589处的与表4或图35中提供的氨基酸序列至少57.1％相同的第二氨基酸序列，其中所述AAV衣壳蛋白的特征在于：当在全身地递送给受试者的情况下在所述受试者的肝脏中测量时，相对于SEQ ID NO:1中提供的天然AAV衣壳蛋白，特异性增加和转导效率增加中的至少一个。
34.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其中所述第二氨基酸序列与表4或图35中提供的所述氨基酸序列至少71.4％相同。
35.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其中所述第二氨基酸序列与表4或图35中提供的所述氨基酸序列至少86.7％相同。
36.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其中所述第二氨基酸序列选自由以下组成的组：KAYSVQV、PSGSARS和RTANALG。
37.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白存在于所述AAV衣壳的VP1、VP2和VP3中。
38.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是嵌合的。
39.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳蛋白的60个拷贝组装成所述AAV衣壳。
40.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其是分离的和纯化的。
41.根据权利要求33所述的AAV衣壳，其被调配为用于静脉内施用以治疗所述肝脏的疾病或病状的药物调配物，所述药物调配物进一步包括药学上可接受的载体。
42.根据权利要求41所述的AAV衣壳，其中所述药物调配物进一步包括治疗剂。
43.一种重组载体，其包括编码根据权利要求1到42中任一项所述的AAV衣壳蛋白的核酸。
44.一种试剂盒，其包括：
a)第一载体，所述第一载体包括根据权利要求43所述的重组载体；
b)第二载体，所述第二载体编码辅助病毒蛋白；以及
c)第三载体，所述第三载体包括编码治疗性基因表达产物的治疗性核酸。
45.一种治疗受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包括根据权利要求1到42中任一项所述的AAV衣壳蛋白的药物调配物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述疾病或所述病状是所述受试者的中枢神经系统或肝脏的疾病或病状。
47.一种由根据权利要求1到42中任一项所述的AAV衣壳制造重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：
a)将包括以下的核酸引入到细胞中：
i.编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列；
ii.编码重组病毒基因组的第二核酸序列，所述第二核酸序列包括经修饰以表达根据权利要求1到42中任一项所述的AAV衣壳的衣壳(Cap)基因；以及
iii.编码AAV辅助病毒基因组的第三核酸序列；以及
b)组装所述重组AAV颗粒，所述重组AAV颗粒包括使所述第一核酸衣壳化的所述AAV衣壳。
48.一种制造重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：
a)提供重组AAV基因组，所述重组AAV基因组包括：
i.AAV衣壳基因，以及
ii.Cre重组酶的识别序列，其中所述识别序列促进能检测的重组酶依赖性变化，并且其中所述重组酶识别序列包括两个Cre识别位点；
b)用所述重组AAV基因组转染表达所述Cre重组酶的细胞群，由此所述Cre重组酶诱导重组事件以在所述重组AAV基因组中产生所述重组酶依赖性变化，并且其中所述重组酶依赖性变化包括侧接有所述Cre识别位点的序列的反转；
c)检测所述细胞群中的靶细胞中的所述重组酶依赖性变化的增加速率；
d)检测所述细胞群中的脱靶细胞中的所述重组酶依赖性变化的降低速率；以及
e)鉴定由所述重组酶依赖性变化产生的重组AAV基因组，其中所述鉴定的rAAV基因组包括所述反转，并且其中所述鉴定的重组AAV基因组编码特征在于对所述靶细胞具有增加的特异性和对所述脱靶细胞具有降低的特异性的AAV衣壳颗粒。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述脱靶细胞是肝细胞。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述靶细胞是选自由以下组成的组的细胞：神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞。
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