JP2023532704A - 超可変領域スワッピングを通じて新規のハイブリッドａａｖカプシドを操作する方法 - Google Patents

超可変領域スワッピングを通じて新規のハイブリッドａａｖカプシドを操作する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、向上された親和性を有する組換えハイブリッドアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質の調製方法及び該方法により得られ得る組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質に関する。本発明はまた、派生された発現ベクター、改変された細胞、及び目的の遺伝子をパッケージングしたハイブリッドカプシドAAVベクター粒子、及び様々な疾患を処置するための組織標的化遺伝子療法におけるその使用に関する。

Description

本発明は、特に筋肉及び/又は中枢神経系に対する向上した親和性(tropism)を有する組換えハイブリッドアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質の調製方法、並びに該方法により得られ得る組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質に関する。本発明はまた、派生された発現ベクター、改変された細胞、並びに目的の遺伝子をパッケージングしたハイブリッドカプシドAAVベクター粒子、並びに様々な疾患、特に筋肉及び/又は中枢神経系疾患を処置するための組織標的化遺伝子療法におけるその使用に関する。
組換えAAV(rAAV)ベクターは、様々なヒト疾患の処置のための広範囲の臓器における遺伝子療法のための先導的なプラットフォームである。rAAVを使用した臨床試験の指数関数的な増大は、このシステムの甚大な潜在能力及びその高い汎用性を反映する(Valdmanis PNら、Hum. Gene Ther.、2017、28、361～372頁;Wang Dら、Nat. Rev. Drug Discov.、2019、18、358～378頁)。
AAVは、パルボウイルス(Parvoviridae)科内のデペンドパルボウイルス(Dependoparvovirus)属に属する非病原性ウイルスである。AAVは、約26nmの直径のカプシド及び4.7kbの一本鎖DNAゲノムから構成される非エンベロープ型ウイルスである。ゲノムは2つの遺伝子、rep及びcapを有し、これらは、ウイルス複製起点及びパッケージングシグナルとして役立つ逆末端反復(ITR)と命名された2つのパリンドローム領域により隣接されている。cap遺伝子は、選択的スプライシング及び異なる開始コドンからの翻訳を通じてAAVカプシドを構成する3つの構造タンパク質VP1、VP2及びVP3をコードする。VP1、VP2及びVP3は同じC末端を共有し、これはVP3の全てである。AAV2を参照として使用すると、VP1は735アミノ酸の配列(GenBank受託番号YP_680426.1;アクセス日2018年8月13日)を有し;VP2(598アミノ酸)はスレオニン138(T138)で開始し、VP3(533アミノ酸)はメチオニン203(M203)で開始する。rep遺伝子は、ウイルス複製のために要求される4つのタンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40をコードする。組換えAAVベクターは、ITR隣接rAAVゲノムをカプシド被包し、該ゲノムにおいて治療用遺伝子発現カセットがAAVタンパク質コーディング配列を置き換えている。
有効なAAVプラットフォームの開発は、カプシド及びベクターゲノム設計の間の協同的なアプローチの結果である。この文脈において、カプシドは、細胞受容体とのその相互作用及び以後の下流の内部移行事象を通じて組織標的化において決定的な役割を果たす。組織親和性及び形質導入効率は、カプシドを構成するVPタンパク質のループアウトされるドメイン(looped-out domain)の配列及びコンホメーションに直接的に関連している。注目すべきことに、異なるAAV血清型のVP配列のアミノ酸可変性は、ループアウトされるドメインに主に対応する12の超可変領域(HVR)においてクラスター化する(Gao Gら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2003、100、6081～6086頁)。
新たなカプシドを開発するための戦略は、4つの主なアプローチ:天然創薬、合理的設計、定方向進化(directed evolution)及びインシリコ創薬にカテゴライズされ得る(Wang Dら、Nat. Rev. Drug Discov. 2019、100、6081～6086頁)。天然創薬は、ヒト及び非ヒト霊長動物を含む、動物に天然に感染する野生型AAVの単離から構成される。顕著なことに、ヒト供給源から単離されたAAV、例えばAAV9は、最も有望な血清型である(Gao Gら、J Virol.、2004、78、6381～6388頁)。
合理的設計戦略は、新たな特性をカプシドに付与する、例えば受容体結合を増加させるか又は免疫学的認識を阻止するペプチドのグラフト化を主に伴う(Chen YHら、Nat. Med.、2009、15、1215～1218頁;Asokan Aら、Nat. Biotechnol.、2010、28、79～82頁)。
定方向進化アプローチは天然の進化をシミュレートする。基本的には、エラープローンPCR又はカプシドシャッフリング戦略を使用することにより、無作為化されたカプシドのライブラリーが生成され、該ライブラリーが、特有の特性を有するカプシドを選択するために選択圧力に供される(Wang Dら、Nat. Rev. Drug Discov.、2019、18、358～378頁)。最後に、ハイスループットシークエンシングの進歩と共に、バイオインフォマティクスはカプシド開発の分野と出会い、このアプローチはインシリコ創薬と命名されている。バイオインフォマティクスツールを使用して、マニピュレーションをより良好に認容するカプシド領域を予測することができるか、又は既知のカプシドの進化的中間体を推測することができ、祖先カプシドAnc80の発見により例示されるアプローチである(Marsic, D.ら、Mol. Ther.、2014、22、1900～1909頁;Zinn Eら、Cell Rep.、2015、12、1056～1068頁)。
しかしながら、各々のアプローチは、rAAVの形質導入効率に影響し得る特有の制限を有する(Wang Dら、Nat. Rev. Drug Discov.、2019、18、358～378頁)。第1に、AAV感染症はヒト集団において風土性であり、したがってrAAVは既存のカプシド免疫に直面しなければならず、これは特に、ヒト供給源から単離されたカプシドを使用する場合に該当する(Boutinら、Human Gene Therapy、2010、Jun;21(6):704～12頁. doi:10.1089/hum.2009.182)。合理的設計アプローチはこの問題の克服を助けることができるが、改変されたカプシドの安定性、AAV受容体結合、内部移行及び細胞トラフィッキングに関する不十分な知識は、大きな制限をこの戦略に課す。追加的に、動物モデルの選択は、ヒトにおける遺伝子療法の応用のために最良の性能を有する新規のカプシドを適正に選択するために決定的である。これは、カプシド選択がモデルシステムに深く根付いている定方向進化のアプローチを使用する場合に特に当てはまる。
遺伝子療法において使用されるAAVベクターを改善するために、既存のアプローチの制限を少なくとも部分的に克服する新規のAAVカプシド操作戦略に対する必要性が存在する。
国際公開第2019/193119号
Valdmanis PNら、Hum. Gene Ther.、2017、28、361～372頁 Wang Dら、Nat. Rev. Drug Discov.、2019、18、358～378頁 Gao Gら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2003、100、6081～6086頁 Wang Dら、Nat. Rev. Drug Discov. 2019、100、6081～6086頁 Gao Gら、J Virol.、2004、78、6381～6388頁 Chen YHら、Nat. Med.、2009、15、1215～1218頁 Asokan Aら、Nat. Biotechnol.、2010、28、79～82頁 Marsic, D.ら、Mol. Ther.、2014、22、1900～1909頁 Zinn Eら、Cell Rep.、2015、12、1056～1068頁 Boutinら、Human Gene Therapy、2010、Jun;21(6):704～12頁. doi:10.1089/hum.2009.182 Melianiら、Hum Gene Ther Methods. 2015 Apr;26(2):45-53. doi:10.1089/hgtb.2015.037 La Bella Tら、Gut、2020、69、737～747頁.doi:10.1136/gutjnk-2019-318281 Lingら、2016 Jul 18、Hum Gene Ther Methods. Vercauterenら、2016、Mol. Ther. Vol. 24(6)、1042頁 Rosarioら、2016、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、16026頁 Michelfelder S.ら、PLoS One. 2009; 4(4): e5122 Girodら、Nat. Med.、1999、5、1052～1056頁 Grifmanら、Molecular Therapy、2001、3、964～975頁 Rabinowitzら、Virology、1999、265、274～285頁 Wuら、J. Virol.、2000、74、8635～8647頁 Aponte-Ubillusら、Applied Microbiology and Biotechnology、2018、102: 1045～1054頁 McCartyら、Gene Therapy、2003、Dec.、10(26)、2112～2118頁 Babi Ramesh Reddy Nallamilliら、Annals of Clinical and Translational Neurology、2018、5、1574～1587頁 Rohrら、J Virol Methods.、2002、106、81～8頁.doi:10.1016/s0166-0934(02)00138-6
本発明者らは、異なるAAV血清型からの超可変領域(HVR)の組合せは、親カプシドの元々の有効性を凌ぐ親カプシドの混合された特色を結果としてもたらすことができることを示した。特に、本発明者らは、少なくとも親アクセプターカプシドと比較して親和性を有利に向上し、同時にアクセプターカプシドの低い血清有病率(seroprevalence)を維持するハイブリッドAAVカプシドを得た。これは驚くべきことであり、その理由は、12個のHVRの配列及びコンホメーションはAAVカプシドの親和性及び血清有病率の両方に直接的に関与し、これらの分子的決定因子は、依然として完全には解明されていないからである。したがって、血清有病率を障害することなく親和性を向上することは予想外である。
したがって、本発明は、筋肉及び/又は中枢神経系に対する向上された親和性を有する組換えハイブリッドアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質の調製方法であって、
a)異なるAAV血清型からの少なくとも2つの組換えAAVカプシドタンパク質、アクセプターAAVカプシドタンパク質及び少なくとも1つのドナーAAVカプシドタンパク質を提供する工程であって;ドナーAAVカプシド血清型がAAV13又はハイブリッドAAV2/13である、工程;
b)アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR1～HVR10及びHVR12配列から選択される少なくとも1つの超可変領域(HVR)配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換えて、少なくとも親アクセプターAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する向上された親和性を有する組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質を得る工程
を含む、方法に関する。
本発明による方法の一部の実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は低い血清有病率を有し、及びドナーAAVカプシド血清型は、アクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有する。本発明による方法の一部の好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有する。
本発明による方法の一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAVrh10、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13、及び配列番号2～30の配列からなる群から選択される。
本発明による方法の一部の実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR配列は、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1とのアライメントにより決定される。
本発明による方法の一部の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の8個未満のHVR配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み;好ましくは工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の6個までのHVR配列、好ましくは4個までのHVR配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む。
本発明による方法の一部の好ましい実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の少なくともHVR5配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質からの異なるHVR5配列で置き換える工程を含み;好ましくはドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5配列は、配列番号175～186からなる群から選択される配列を含み;好ましくは工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5配列を単独で又はHVR6、HVR7、HVR8、HVR9及びHVR10の1つ若しくは複数若しくは全てと組み合わせて置き換える工程を含み;好ましくは工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5配列を単独で又はHVR6、HVR7及びHVR8の1つ若しくは複数若しくは全てと組み合わせて置き換える工程を含む。
本発明による方法の一部の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5～HVR10配列の全てを、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み;好ましくは工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5～HVR8配列の全てを、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む。
本発明による方法の一部の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR1～HVR10、及びHVR12配列のいずれか1つを、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み;好ましくは工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR3、HVR5、HVR9、HVR10又はHVR12配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質からの対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む。一部のより好ましい実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5を、ドナーAAVカプシドタンパク質からの異なるHVR5配列で置き換える工程を含む。
本発明の別の態様は、本開示による方法により得られ得る、向上された親和性を有する組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質に関する。
一部の特定の実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、配列番号33～43、45、47～58及び60～73の配列並びに前記配列と少なくとも85%の同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びにアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
本発明の別の態様は、本開示による組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質を発現可能な形態でコードするポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドに関し;該ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、102、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158のヌクレオチド配列から選択され、最終的に、AAVレプリカーゼタンパク質を発現可能な形態で更にコードする。
本発明の別の態様は、本開示による組換えプラスミドで安定して形質転換された細胞に関する。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの本開示によるハイブリッド組換えAAVカプシドタンパク質を含む、目的の遺伝子をパッケージングしたAAVベクター粒子に関し;好ましくは目的の遺伝子は、治療用遺伝子;治療用タンパク質又はペプチド、例えば治療用抗体又は抗体断片及びゲノム編集酵素をコードする遺伝子;並びに治療用RNA、例えば干渉RNA、ゲノム編集用のガイドRNA及びエクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される。
本発明の別の態様は、治療有効量の本開示によるAAVベクター粒子又は前記AAVベクター粒子により安定して形質導入された細胞を含む、医薬組成物に関する。本発明はまた、特に筋肉及び/又はCNS疾患、好ましくは遺伝学的神経筋疾患における使用のための、医薬としての本開示のAAVベクター粒子、細胞又は医薬組成物を包含する。
ハイブリッドAAVカプシドの調製方法
したがって、本発明は、特に筋肉及び/又はCNSに対する向上された親和性を有する組換えハイブリッドアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質の調製方法であって、
a)異なるAAV血清型からの少なくとも2つの組換えAAVカプシドタンパク質、アクセプターAAVカプシドタンパク質及び少なくとも1つのドナーAAVカプシドタンパク質を提供する工程;
b)アクセプターAAVカプシドタンパク質の少なくとも1つの超可変領域(HVR)配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換えて、少なくとも親アクセプターAAVカプシドタンパク質と比較して、特に筋肉及び/又はCNSに対する向上された親和性を有する組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質を得る工程
を含む、方法に関する。
本明細書において使用される場合、「AAV血清型」又は「AAVカプシド血清型」は、別の血清型のAAVカプシドと比較して別個の超可変領域(HVR)アミノ酸配列を有するAAVカプシドを指す。異なるAAV血清型は、それらのHVR配列においてアミノ酸バリエーションを有する。AAV血清型という用語は、霊長動物(ヒト若しくは非ヒト)又は非霊長動物種から単離されたAAVカプシドバリアント並びに当技術分野において公知の様々な技術、例えば合理的設計、定方向進化及びインシリコ創薬等により操作されたAAVカプシドバリアントを包含する任意の天然の又は人工的なAAVカプシド血清型を包含する。本明細書において使用される場合、AAV血清型という用語は、細胞、組織又は臓器、特に目的の細胞、組織又は臓器(標的細胞、組織又は臓器)に形質導入して、前記細胞、組織又は臓器、特に標的細胞、組織又は臓器中で導入遺伝子を発現させる組換えAAVウイルス粒子を形成することができる機能的なAAVカプシドを指す。
本明細書において使用される場合、「超可変領域又はHVR」は、AAVカプシドのHVR1～HVR12のいずれか1つを指す。HVRの狭い定義によれば、HVR1は146～153位であり;HVR2は183～187位であり;HVR3は263～267位であり;HVR4は384～386位であり;HVR5は453～477位であり;HVR6は493～498位であり;HVR7は503～507位であり;HVR8は517～525位であり;HVR9は536～559位であり;HVR10は584～597位であり;HVR11は661～670位であり;及びHVR12は708～722位であり;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。当技術分野において周知の標準的なタンパク質配列アライメントプログラム、例えばBLAST、FASTA、CLUSTALW、及びMEGA等を使用する配列番号1との任意の他の血清型の任意の他のAAVカプシド配列の配列アライメント後に、当業者は、他のAAVカプシド血清型における超可変領域の対応する位置を容易に得ることができる。例えばデフォルトのパラメーターにおいてClustalWアライメントアルゴリズムを含むMEGAソフトウェア(バージョンX)を使用して、HVR1～HVR12は、配列番号2のカプシド(#704と命名されている)のそれぞれ位置146～152、182～186、262～264、381～383、450～474、490～495、500～504、514～522、533～556、581～594、658～667及び705～719である。
ドナー又はアクセプターAAVカプシドからのHVR配列の位置は、上記に指し示される位置(HVR参照配列)から数アミノ酸だけ異なることがある。HVRの初期サイズ及び異なるHVR間の距離に依存して、両方のHVR配列(アクセプターカプシドからの置き換えられる配列及びドナーカプシドからの置換え配列)は少なくとも2アミノ酸～約70アミノ酸からなる。例えばドナー又はアクセプターAAVカプシドからのHVR配列は、5アミノ酸までのHVR配列の1つの末端における1アミノ酸の欠失;6～10アミノ酸のHVR配列の1つ又は両方の末端における2アミノ酸まで(1又は2アミノ酸)の欠失;11～25アミノ酸のHVR配列の1つ又は両方の末端における5アミノ酸まで(1、2、3、4又は5アミノ酸)の欠失を有してもよい。代替的に、ドナー又はアクセプターAAVカプシドからのHVR配列は、HVR配列のN又はC末端からの追加の配列、例えばHVR配列のN又はC末端からの10、20、30、40又は50個までのアミノ酸を有してもよい。好ましくは、HVR配列の1つ又は両方の末端におけるアミノ酸欠失又は付加は、ドナー又はアクセプターAAVカプシド配列からの連続するアミノ酸を伴う。
本明細書において使用される場合、「親和性」という用語は、一部の特定の種類の細胞、組織又は臓器に形質導入する、組換えAAVウイルス粒子中に存在するAAVカプシドタンパク質の能力(例えば、細胞又は組織親和性)を指す。特定の種類の細胞、組織又は臓器に対する本発明による組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質(又はハイブリッドAAVカプシド)の親和性は、前記特定の種類の細胞、組織若しくは臓器に形質導入するか又は前記特定の種類の細胞、組織若しくは臓器中で導入遺伝子を発現する、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質を含むAAVベクター粒子(ハイブリッドカプシド血清型AAVベクター粒子)の能力を、当技術分野において周知の標準的なアッセイ、例えば本出願の実施例において開示されるものを使用して測定することによって決定されてもよい。例えば、ベクター形質導入又は導入遺伝子発現は、動物モデル、例えば当技術分野において周知の及び本出願の実施例において開示されるマウスモデルにおけるハイブリッドカプシド血清型AAVベクター粒子の局所又は全身投与により決定される。ドナー又はアクセプターカプシドを含む親AAVベクター血清型は比較のために使用される。ベクター形質導入は、当技術分野において周知の標準的なアッセイ、例えばリアルタイムPCRアッセイにより二倍体ゲノム当たりのベクターゲノムコピー数を測定することにより決定されてもよい。導入遺伝子発現は、有利には、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質(GFP若しくはその他)を使用して当技術分野において周知の標準的なアッセイ、例えばインビボ又はインビトロでのインビボ又はインビトロ定量的生物発光又は蛍光アッセイにより測定される。
ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、細胞、組織又は臓器、特に目的の細胞、組織又は臓器(標的細胞、組織又は臓器)に形質導入して前記細胞、組織又は臓器、特に標的細胞、組織又は臓器中で導入遺伝子を発現させる組換えAAVウイルス粒子を形成することができる機能的なAAVカプシドである。更には、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、その親AAVカプシドタンパク質と比較して向上された親和性を有する。向上された親和性を有するハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、少なくとも親アクセプターAAVカプシドと比較して少なくとも1つの標的細胞、組織若しくは臓器に対する増加した親和性及び/又は少なくとも1つのオフターゲット細胞、組織若しくは臓器に対する減少した親和性(若しくは脱標的化)を有してもよい。増加した親和性は、親AAVカプシドタンパク質と比較して、少なくとも1つの標的細胞、組織又は臓器において少なくとも1.5倍、好ましくは2、3、4、5倍又はより大きく増加した導入遺伝子発現レベルを特に指す。脱標的化は、非脱標的化親AAVカプシドタンパク質と比較して、少なくとも1つのオフターゲット細胞、組織又は臓器において少なくとも3倍、好ましくは5～10倍又はより大きく減少した導入遺伝子発現レベルを特に指す。標的細胞、組織又は臓器においてハイブリッドAAVカプシドタンパク質を用いて達成される導入遺伝子発現レベルは、有利には、筋肉及びCNS組織について参照AAV血清型、例えばAAV9と少なくとも同じ規模(1.5倍未満でより低い;即ち同等)である。その向上された親和性の結果として、本発明によるハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、改善された体内分布を有する。これは、それは有意により良好に、定義された組織(標的組織)、組織の群(例えば骨格筋及び心臓)若しくは臓器(標的組織若しくは臓器)の群を、他の(非標的)組織の標的化を増加させることなく標的化し(例えば改善された特異性)、並びに/又は、それは、通常は望ましくない毒性を低減させるために、特有の組織(非標的若しくはオフターゲット組織若しくは臓器)をより低い有効性で標的化する(組織脱標的化、例えば肝臓脱標的化)ことを意味する。
本明細書において使用される場合、「筋肉」という用語は心筋(即ち心臓)及び骨格筋を指す。「筋肉細胞」という用語は、筋細胞、筋管細胞、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞を指す。骨格筋は、身体中のそれらの解剖学的位置に基づいて異なる群に分類される。異なる筋肉群に対する本発明によるハイブリッドAAVカプシドの親和性は、マウス脛骨(TA)、長指伸筋(EDL)、四頭筋(Qua)、腓腹筋(Ga)、ヒラメ筋(Sol)、三頭筋、二頭筋及び/又は横隔膜;特にマウス長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(Sol)、四頭筋(Qua)、三頭筋及び横隔膜又はヒラメ筋(Sol)、四頭筋(Qua)、三頭筋及び横隔膜筋において測定されてもよい。
本明細書において使用される場合、「中枢神経系又はCNS」という用語は、脳、脊髄、網膜、視神経、及び/又は嗅神経及び上皮を指す。本明細書において使用される場合、CNS細胞という用語は、ニューロン及びグリア細胞(希突起膠細胞、アストロサイト、上衣細胞、ミクログリア)を包含するCNSの任意の細胞を指す。
本明細書において使用される場合、「血清有病率」はヒト血清有病率を指し、これは、ヒト集団中に存在し、血清抗体又は免疫グロブリンとして発現されるAAVカプシド血清型に結合する抗AAV抗体のレベルを意味する。AAVカプシドの血清有病率は、ヒト血清のコホート並びに当技術分野において周知の及び例えば(Melianiら、Hum Gene Ther Methods. 2015 Apr;26(2):45-53. doi:10.1089/hgtb.2015.037)において開示される標準的なアッセイを使用して測定される。アッセイは、本出願の実施例において開示されているELISAアッセイであってもよい。AAVカプシド血清型(又は血清型)の血清有病率は、10μg/mLより高い前記血清型に特異的なIgGのELISA力価を有する個体のパーセンテージとして定義されてもよい。低有病率血清型(low prevalent serotype)は、低血清有病率の参照と考えられるAAV8カプシド(配列番号1)血清有病率と類似した又はそれより低い血清有病率に対応する、血清陽性の個体が約30%未満である血清型として定義されてもよい。高血清有病率AAVカプシド血清型(high-seroprevalent AAV capsid serotype)は、50%より高い血清有病率を有するAAVカプシド血清型を指す。アクセプターAAVカプシドの血清有病率と同等の血清有病率は、約30%の血清有病率を指す。代替的に、血清有病率は、用量応答曲線を使用してODシグナルの50%の低減が観察される希釈(OD50)として定義されてもよい。試験されるAAVカプシドのOD50は、既知の血清有病率の参照AAVカプシドのそれと比較される。
文脈が他に明確に指し示さなければ、「a」、「an」、及び「the」は複数の指示対象を含む。そのため、「a」(若しくは「an」)、「1つ又は複数」又は「少なくとも1つ」という用語は、本明細書において交換可能に使用可能であり;他に指定されなければ、「又は」は「及び/又は」を意味する。
「同一性」という用語は、2つのポリペプチド分子の間又は2つの核酸分子の間の配列類似性を指す。両方の比較される配列中の位置が同じ塩基又は同じアミノ酸残基により占有される場合、それぞれの分子はその位置において同一である。2つの配列の間の同一性のパーセンテージは、2つの配列により共有されるマッチする位置の数を比較される位置の数で割り、100を掛けたものに対応する。一般に、2つの配列がアライメントされて最大同一性を与える場合に比較が行われる。同一性は、例えば、GCG(Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、Version 7、Madison、Wisconsin)パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズムのいずれか、例えばBLAST、FASTA若しくはCLUSTALWを使用してアライメントにより算出されてもよい。
アクセプター及びドナーAAVカプシドは、任意の異なる天然の又は人工的なAAV血清型からのものであってもよい。少なくとも13の異なるAAV血清型(AAV1～13)がヒト及び非ヒト霊長動物において同定されており、様々な霊長動物AAV分離株のVP1配列の系統発生分析に基づいて様々なクレード及びクローンに分類されている:AAV1及びAAV6はクレードAに;AAV2はクレードBに;AAV2-AAV3ハイブリッドはクレードCに;AAV7はクレードDに;AAV8はクレードEに;AAV9はクレードFに対応する一方、AAV3、AAV4及びAAV5はクローンとして開示されている(Gaoら、J. Virol.、2004、78、6381～6388頁)。AAV2バリアント血清型及びAAV2/13ハイブリッドカプシドはヒト肝臓において単離されている(La Bellaら、Gut、2020、69、737～747頁.doi:10.1136/gutjnk-2019-318281;添付された配列表中の配列番号2～30)。他のAAV血清型は、非霊長動物種、例えばブタ、ウシ、トリ及びヤギにおいて同定されている。ブタAAVは、特にAAVpo1、po2.1、po4～6を包含する。様々なAAVカプシドバリアントはまた「合成AAV血清型」と命名されているか、又は新たなAAV血清型は、特に定方向遺伝子進化若しくはインシリコ創薬により操作されており、これは限定なしに例えば、8つのAAV血清型(AAV2、4、5、8、9、トリ、ウシ及びヤギ)AAV-Anc80、AAV2i8、AAV-LK03及びその他からのハイブリッドカプシドである組換えAAV2由来血清型DJ、DJ8及びPHP.Bである。
一部の実施形態において、アクセプターAAVカプシドタンパク質は、「従来型AAV血清型」とも命名される、遺伝子療法において使用されるAAV血清型、例えばAAV1、AAV2、AAV2バリアント(例えばY44+500+730F+T491V変化を有する操作されたカプシドを含む四重変異体カプシド最適化AAV2;Lingら、2016 Jul 18、Hum Gene Ther Methods.において開示されている)、AAV3及びAAV3バリアント(例えば2つのアミノ酸変化、S663V+T492Vを有する操作されたAAV3カプシドを含むAAV3-STバリアント;Vercauterenら、2016、Mol. Ther. Vol. 24(6)、1042頁において開示されている)、-3B及びAAV-3Bバリアント、AAV4、AAV5、AAV6及びAAV6バリアント(例えば三重変異したAAV6カプシドY731F/Y705F/T492V形態を含むAAV6バリアント;Rosarioら、2016、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、16026頁において開示されている)、AAV7、AAV8、AAV9、AAV2G9、AAV10、例えばAAVcy10及びAAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV-DJ、AAVAnc80、AAV-LK03、AAV.PHP、例えばAAV-PHP.B、AAV-PHP.EB、AAV2i8、クレードF AAVHSC、例えばAAVHSC7、AAVHSC15及びAAVHSC17、AAV9.rh74及びAAV9.rh74-P1(国際公開第2019/193119号)、ブタAAV、例えばAAVpo1、AAVpo2.1、AAVpo4及びAAVpo6、並びにAAV血清型のチロシン、リジン及びセリンカプシド変異体等からのものである。
特定の実施形態において、アクセプターAAVカプシドタンパク質は、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、AAV-DJ、AAVAnc80、AAV2i8、AAV-LK03、及びAAV.PHPからなる群から選択されるAAV血清型からのものである。AAV4カプシド(GenBank受託番号NC_001829.1);AAV5カプシド(GenBank受託番号NC_006152.1;アクセス日2018年8月13日);AAV7カプシド(GenBank受託番号NC_006260.1);AAV9カプシド(GenBank受託番号AY530579.1;アクセス日2004年6月24日);;AAVrh10カプシド(GenBank受託番号AY243015.1;アクセス日2003年5月14日);AAV-LK03(配列番号166のアミノ酸配列)、AAVrh74(配列番号160のアミノ酸配列;配列番号161のCDS)、AAV9.rh74(配列番号162のアミノ酸配列;配列番号163のCDS)、AAV9.rh74-P1(配列番号164のアミノ酸配列;配列番号165のCDS)。
特定の実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質は、新たに単離された天然AAVバリアント血清型、例えばAAV2/13ハイブリッド血清型等からのもの、特にヒト組織、例えば肝臓組織から単離されたもの;より好ましくは配列番号2～30の配列からなる群から選択されるものである。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質は、配列番号2～10、18、20～22、29及び30;更により好ましくは配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。
特定の実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質は、遺伝子療法において使用されるAAV血清型からのものである。ドナーAAVカプシドタンパク質はAAV13であってもよい。AAV13カプシド遺伝子(コーディング配列又はCDS)配列は、GenBank受託番号EU285562.1(アクセス日9月23日)のAAV13ゲノム配列の1948～4149位に対応し;AAV13カプシドタンパク質(主要なコートタンパク質又はVP1)アミノ酸配列は、GenBank受託番号ABZ10812.1(アクセス日2008年9月23日)又は配列番号202に対応する。
一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は低い血清有病率を有し、及びドナーAAVカプシド血清型は、アクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有する。低い血清有病率を有するアクセプターAAVカプシド血清型の例は、限定なしに、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh10、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1を包含する。一部のより好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1及びAAVrh10からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシド血清型はAAV13及びハイブリッドAAV2/13から選択される。一部のより好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシド血清型は、AAV13、及び配列番号2～30の配列;好ましくはAAV13並びに配列番号2～10、18、20～22、29及び30の配列;更により好ましくはAAV13並びに配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。
工程b)は、HVR1、HVR2、HVR3、HVR4、HVR5、HVR6、HVR7、HVR8、HVR9、HVR10、及びHVR12から選択されるアクセプターカプシド血清型の1～11(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11)個のHVR配列の、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列での置換えを含む。
一部の実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)のHVR配列は、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び687～738位のHVR12配列;好ましくは134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。本発明による方法において置き換えられないHVR11配列は、621～687位の配列;好ましくは630～682位の配列に対応し;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。これらの位置はHVR配列の広い定義に対応する。
一部の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の8個未満のHVR配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み、例えば、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からの8個未満のHVR配列を含む。一部の好ましい実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の6個までのHVR配列;好ましくは4個までのHVR配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み、例えば、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からの6個までのHVR配列、好ましくは4個までのHVR配列を含む。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13、及び配列番号2～30の配列からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)のHVR配列は、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び687～738位のHVR12配列;好ましくは134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。一部の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5～HVR10配列の1つ又は複数又は全てを、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み、例えば、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5～HVR10配列の1つ又は複数又は全てを含む。一部の好ましい実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5～HVR8配列の1つ又は複数又は全てを、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み、例えば、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5～HVR8配列の1つ又は複数又は全てを含む。一部のより好ましい実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の少なくともHVR5配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR5配列で置き換える工程を含む。HVR5は、単独で又はアクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR6～HVR10の1つ若しくは複数若しくは全てと共に置き換えられてもよい。例えば、工程b)は、HVR5、HVR5～HVR8、HVR5～HVR9又はHVR5～HVR10を置き換える工程を含んでもよい。HVR5は、好ましくは、単独で又はアクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR6～HVR8の1つ若しくは複数若しくは全てと共に置き換えられる。例えば、工程b)は、HVR5又はHVR5～HVR8を置き換える工程を含んでもよい。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13、及び配列番号2～30の配列;好ましくはAAV13並びに配列番号2～10、18、20～22、29及び30の配列;更により好ましくはAAV13並びに配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)の1つ又は複数のHVR5～HVR10配列は、446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;及び576～613位のHVR10配列;より好ましくは446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;及び576～613位のHVR10配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。
一部の特定の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5～HVR8配列を、AAV13及び配列番号2～30のいずれか1つ;好ましくはAAV13、#704(配列番号2);#1704(配列番号10);#3086(配列番号20);#1024(配列番号22);#508(配列番号9);#3142(配列番号21);#2320(配列番号29);#1010(配列番号6);M258(配列番号30);#1570(配列番号18);#1602(配列番号5);#667(配列番号7);#129(配列番号3);及び#767(配列番号8);更により好ましくはAAV13、#704(配列番号2)及びM258(配列番号30)から選択されるドナーAAVカプシド血清型のHVR5～HVR8配列で置き換える工程を含み;好ましくはドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR5配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR5配列)のHVR5配列は446～485位であり;HVR6配列は485～502位であり;HVR7配列は499～516位であり;及びHVR8配列は509～531位であり;より好ましくはHVR5は446～484位であり;HVR6配列は490～500位であり;HVR7配列は501～516位であり;及びHVR8配列は514～529位であり;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1及びAAVrh10からなる群から選択される。
一部の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR1～HVR10及びHVR12のいずれか1つを、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み、例えば、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からの1つのHVR配列を含む。一部の特定の実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドのHVR5、HVR6、HVR7、又はHVR8を、ドナーAAVカプシドタンパク質からの対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含み、例えば、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5、HVR6、HVR7又はHVR8配列を含む。一部の好ましい実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドのHVR1、HVR3、HVR5、HVR6、HVR7、HVR8、HVR9、HVR10及びHVR12のいずれか1つ;好ましくはHVR3、HVR5、HVR9、HVR10又はHVR12の1つを、ドナーAAVカプシドタンパク質からの対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む。一部の好ましい実施形態において、工程b)は、アクセプターAAVカプシドのHVR5を、ドナーAAVカプシドタンパク質からの異なるHVR5配列で置き換える工程を含み、例えば、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5配列を含む。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、AAV5及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13、及び配列番号2～30の配列;好ましくはAAV13並びに配列番号2～10、18、20～22、29及び30の配列;更により好ましくは配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。一部の他の好ましい実施形態において、工程b)は、AAV8のHVR1、HVR3、HVR6、HVR7、HVR8、HVR9、HVR10及びHVR12のいずれか1つ;好ましくはAAV8のHVR3、HVR9、HVR10又はHVR12を、AAV13、及び配列番号2～30の配列;好ましくは配列番号2からなる群から選択されるドナーAAVカプシドタンパク質からの対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)のHVR配列は、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び687～738位のHVR12配列;更により好ましくは、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。
一部の特定の実施形態において、HVR5は、AAV13;#704(配列番号2);#1704(配列番号10);#3086(配列番号20);#508(配列番号9);#3142(配列番号21);#M258(配列番号30);#1570(配列番号18);#2731(配列番号4);#1602(配列番号5);#667(配列番号7);#129(配列番号3);及び#767(配列番号8)からなる群から選択されるドナーAAVカプシド血清型からのものであり;好ましくはHVR5は、配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択されるAAVカプシド血清型からのものである。HVR5配列は、有利には、446～485位;好ましくは446～484位からのものであり;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。一部の好ましい実施形態において、HVR5は、配列番号175～186;好ましくは配列番号175～179からなる群から選択される配列を含む。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、及びAAVrh10からなる群から選択される。
一部の好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する増加した親和性を有する。一部の特定の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して腎臓に対する増加した親和性を有する。一部の特定の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して心臓及び/又は骨格筋に対する増加した親和性を有する。ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、有利には、異なる骨格筋群に対する増加した親和性を有し;特にハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(Sol)、四頭筋(Qua)、三頭筋及び横隔膜又はヒラメ筋(Sol)、四頭筋(Qua)、三頭筋及び横隔膜からなる群から選択されるマウスにおける少なくとも2つの骨格筋群に対する増加した親和性を有する。一部の特定の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、オフターゲット組織、有利には肝臓に対する減少した親和性を有する。
一部の好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有する。一部のより好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する増加した親和性並びにアクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有する。
一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は低い血清有病率を有し、ドナーAAVカプシド血清型は、アクセプターよりも高い血清有病率を有し、及びハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有する。一部のより好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系における増加した親和性を有する。
一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシドタンパク質は、AAV8及びAAV9、更により好ましくはAAV8からなる群から選択されるAAV血清型からのものである。
一部の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、2つのAAVカプシド血清型の間、好ましくは低い血清有病率を有するアクセプターAAVカプシド血清型とアクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有するドナーAAVカプシド血清型との間のハイブリッドである。
一部の他の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、2つより多くのAAVカプシド血清型の間、好ましくは低い血清有病率を有するアクセプターAAVカプシド血清型とアクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有するドナーAAVカプシド血清型との間のハイブリッドである。
一部の実施形態において、方法は、工程(b)において得られたハイブリッドAAVカプシドタンパク質の親和性を少なくともその親アクセプターカプシドタンパク質との比較によりアッセイする工程(c)及び少なくともその親アクセプターカプシドタンパク質と比較して向上された親和性を有するハイブリッドAAVカプシドタンパク質を選択する工程(d)を更に含む。一部の好ましい実施形態において、方法は、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質の血清有病率をアッセイする工程(e)及びアクセプターAAVカプシドの血清有病率と同等の血清有病率を有するハイブリッドAAVカプシドタンパク質を選択する工程(f)を更に含む。
一部の実施形態において、方法は、工程(b)において得られたハイブリッドAAVカプシドタンパク質に細胞標的化ペプチド、特にカプシドの血清有病率を変更しないことが既知であるペプチドを挿入する工程を更に含む。一部の特定の実施形態において、細胞標的化ペプチドはRGDモチーフを含む。ウイルスカプシドへのRGD配列の組込みは、いくつかの細胞種上に広く発現されているインテグリンにベクターを標的化することができる(Michelfelder S.ら、PLoS One. 2009; 4(4): e5122)。特に、AAVカプシドのHVR10へのペプチドRGDLGLSの挿入は、カプシド血清有病率に対するいかなる影響力もなしに増強された筋肉標的化に繋がる(国際公開第2019/193119号)。一部の好ましい実施形態において、ペプチドは、30個までのアミノ酸であり、RGDLGLS(配列番号167)、LRGDGLS(配列番号168)、LGRGDLS(配列番号169)、LGLRGDS(配列番号170)、LGLSRGD(配列番号171)及びRGDMSRE(配列番号172)のいずれか1つ;好ましくは配列番号167を含むか又はからなる。RGDモチーフを含む配列は、それらのN及び/又はC末端において最大5つ又はより多くのアミノ酸により、例えばペプチドのN及びC末端におけるそれぞれGQSG(配列番号173)及びAQAA(配列番号174)により隣接されてもよい。RGDモチーフを含む1つ又は複数のペプチドは、AAVカプシド表面上の露出される部位に挿入されてもよい。カプシド表面上で露出され、ペプチド挿入を忍容する、即ちウイルスカプシドのアセンブリー及びパッケージングに影響しないAAVカプシド上の部位は当技術分野において周知であり、例えばAAVカプシド表面ループ又は抗原性ループを包含し(Girodら、Nat. Med.、1999、5、1052～1056頁;Grifmanら、Molecular Therapy、2001、3、964～975頁);他の部位は、Rabinowitzら、Virology、1999、265、274～285頁;Wuら、J. Virol.、2000、74、8635～8647頁において開示されている。一部の特定の実施形態において、細胞標的化ペプチドは、HVR、特にHVR3、HVR4、HVR5又はHVR10;好ましくはHVR10に挿入される。特に、RGDモチーフを含むペプチドは、配列番号162(AAV9.rh74)における番号付けにしたがって261位、383位、449位、575位又は590位のいずれかの辺り、好ましくは449位又は590位の辺り、より好ましくは590位の辺りに挿入される。位置は、配列番号255を参照することにより指し示され;当業者は、配列番号162とのアライメント後に別の配列中の対応する位置を容易に見出すことができる。挿入部位は、有利には、配列番号162における番号付けにしたがって587～592位又は588～593位、好ましくは587～592位である。ペプチドの挿入は、挿入部位からの残基の一部又は全ての欠失を引き起こしてもよく、又はそうでなくてもよい。ペプチドは、有利には、配列番号162における番号付けにしたがってAAVカプシドタンパク質の587～592位又は588～593位からの全ての残基、好ましくは587～592位からの残基の全てを置き換える。
一部の実施形態において、方法は、ハイスループット方法であり、工程(a)及び工程(b)は、異なるハイブリッドAAVカプシドタンパク質、例えば同じアクセプター及び/又はドナーAAVカプシドタンパク質に由来する異なるハイブリッドAAVカプシドタンパク質を調製するために同時に行われる。ハイスループット方法は、上記に定義されている追加の工程(c)～(d)及び/又は(e)～(f)を含んでもよい。
ハイブリッドAAVカプシド
本発明はまた、本開示の方法により得られる又は得られ得る改善された組織親和性を有する組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質に関する。
組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプター及びドナーAAVカプシド血清型として使用される任意の異なる天然の又は人工的なAAV血清型、例えば特に本開示に記載されるものに由来してもよい。アクセプターAAVカプシド血清型とドナーAAVカプシド血清型との間のハイブリッドである組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターカプシド血清型の対応するHVR配列(置き換えられるHVR配列)を置き換えるHVR1、HVR2、HVR3、HVR4、HVR5、HVR6、HVR7、HVR8、HVR9、HVR10、及びHVR12から選択されるドナーAAVカプシドタンパク質からの1～11(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11)個のHVR配列(置換えHVR配列)を含み;置換えHVR配列は、定義により、置き換えられるHVR配列のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)のHVR配列は、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び687～738位のHVR12配列;好ましくは、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。
一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、低い血清有病率を有するアクセプターAAVカプシド血清型とアクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有するドナーAAVカプシド血清型との間のハイブリッドである。一部の特定の実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、AAV5及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13及び配列番号2～30の配列;好ましくはAAV13並びに配列番号2～10、18、20～22、29及び30の配列;より好ましくはAAV13並びに配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシド血清型は配列番号2である。
一部の実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からの8個未満のHVR配列を含む。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からの6個まで;好ましくは4個までのHVR配列を含む。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、AAV5及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13及び配列番号2～30の配列;好ましくはAAV13並びに配列番号2～10、18、20～22、29及び30の配列;より好ましくはAAV13並びに配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)のHVR配列は、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び687～738位のHVR12配列;好ましくは134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。
一部の実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5～HVR10配列の1つ又は複数を含む。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5～HVR8配列の1つ又は複数を含む。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR5配列を含む。組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーカプシド血清型からのHVR5を単独で又はHVR6～HVR10の1つ若しくは複数若しくは全てと組み合わせて;好ましくはドナーカプシド血清型からのHVR5を単独で又はHVR6～HVR8の1つ若しくは複数若しくは全てと組み合わせて含んでもよい。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13及び配列番号2～30の配列;好ましくはAAV13並びに配列番号2～10、18、20～22、29及び30の配列;より好ましくはAAV13並びに配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)の1つ又は複数のHVR5～HVR10配列は、446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;より好ましくは446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;及び576～613位のHVR10配列;より好ましくは446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～516位のHVR7配列;及び514～529位のHVR8配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、配列番号33～36、47～58及び60～73;好ましくは配列番号35、36、47、48、50、51、58、67及び73の配列;並びに前記配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなり;より好ましくはアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
一部の特定の実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、AAV13、及び配列番号2～30のいずれか1つ;好ましくはAAV13、#704(配列番号2);#1704(配列番号10);#3086(配列番号20);#1024(配列番号22);#508(配列番号9);#3142(配列番号21);#2320(配列番号29);#1010(配列番号6);M258(配列番号30);#1570(配列番号18);#1602(配列番号5);#667(配列番号7);#129(配列番号3);及び#767(配列番号8);更により好ましくはAAV13、#704(配列番号2)及びM258(配列番号30)からなる群から選択されるAAV血清型(ドナーAAVカプシド血清型)のHVR5～HVR8配列を含む。好ましくは、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR5配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR5配列)のHVR5配列は446～485位であり;HVR6配列は485～502位であり;HVR7配列は499～516位であり;及びHVR8配列は509～531位であり;更により好ましくはHVR5配列は446～484位であり;HVR6配列は490～500位であり;HVR7配列は501～512位であり;及びHVR8配列は514～529位であり;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、AAV5及びAAVrh10からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、配列番号35、58、60～72;好ましくは配列番号35、58、67の配列;及び前記配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなり;より好ましくはアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
一部の実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からの1つのHVR配列(HVR1、HVR2、HVR3、HVR4、HVR5、HVR6、HVR7、HVR8、HVR9、HVR10、又はHVR12)を含む。一部の特定の実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5、HVR6、HVR7又はHVR8配列の1つを含む。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、ドナーAAVカプシドタンパク質からのHVR5配列を含む。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又はドナーAAVカプシド血清型は、AAV13及び配列番号2～30の配列;好ましくはAAV13並びに配列番号2～10、18、20～22、29及び30の配列;更により好ましくは配列番号2、10、20、21及び30の配列からなる群から選択される。一部の他の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、AAV8アクセプターカプシドからのものであり、AAV13、及び配列番号2～30の配列;好ましくは配列番号2からなる群から選択されるドナーAAVカプシド血清型からのHVR1、HVR3、HVR6、HVR7、HVR8、HVR9、HVR10又はHVR12配列の1つを含み;更により好ましくは、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、AAV8アクセプターカプシドからのものであり、AAV13、及び配列番号2～30の配列;好ましくは配列番号2からなる群から選択されるドナーAAVカプシド血清型からのHVR3、HVR9、HVR10又はHVR12配列を含む。一部の好ましい実施形態において、ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR配列)及びアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR配列)のHVR配列は、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～485位のHVR5配列;485～502位のHVR6配列;499～516位のHVR7配列;509～531位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び687～738位のHVR12配列;好ましくは134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、配列番号36～43、45、47～57、73;好ましくは配列番号36、38、42、43、45、47、48、50、51、73の配列、及び前記配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなり;より好ましくはアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
一部の特定の実施形態において、HVR5は、#704(配列番号2);#1704(配列番号10);#3086(配列番号20);#508(配列番号9);#3142(配列番号21);#M258(配列番号30);#1570(配列番号18);#2731(配列番号4);#1602(配列番号5);#667(配列番号7);#129(配列番号3);及び#767(配列番号8)からなる群から選択されるAAVカプシド血清型からのものである。
ドナーAAVカプシドタンパク質(置換えHVR5配列)及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質(置き換えられるHVR5配列)のHVR5配列は、有利には、446～485位;好ましくは446～484位からのものであり;指し示される位置は配列番号1(AAV8又はAAV8カプシドのVP1)とのアライメントにより決定される。一部の好ましい実施形態において、HVR5は、配列番号175～186;好ましくは配列番号175～179からなる群から選択される配列を含む。一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシド血清型は、AAV8、AAV9、AAV5 AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1、及びAAVrh10からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態において、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、配列番号36、47～57、73;好ましくは配列番号36、47、48、50、51、73;3の配列、及び前記配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなり;より好ましくはアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
一部の好ましい実施形態において、アクセプターAAVカプシドタンパク質は、AAV8及びAAV9、更により好ましくはAAV8からなる群から選択されるAAV血清型からのものである。
一部の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、2つのAAVカプシド血清型の間、好ましくは低い血清有病率を有するアクセプターAAVカプシド血清型とアクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有するドナーAAVカプシド血清型との間のハイブリッドである。
一部の他の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、2つより多くのAAVカプシド血清型の間、好ましくは低い血清有病率を有するアクセプターAAVカプシド血清型とアクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有するドナーAAVカプシド血清型との間のハイブリッドである。
一部の好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する増加した親和性を有する。一部の特定の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して腎臓に対する増加した親和性を有する。一部の特定の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、心臓及び/又は骨格筋に対する増加した親和性を有する。ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、有利には、異なる骨格筋群に対する増加した親和性を有し;特にハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(Sol)、四頭筋(Qua)、三頭筋及び横隔膜又はヒラメ筋(Sol)、四頭筋(Qua)、三頭筋及び横隔膜からなる群から選択されるマウスにおける少なくとも2つの骨格筋群に対する増加した親和性を有する。一部の特定の実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、オフターゲット組織、有利には肝臓に対する減少した親和性を有する。特定の実施形態において、アクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する増加した親和性を有するハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、配列番号33～43、45、47～58、60～73;好ましくは配列番号33～36、38、42、43、45、47、48、50、51、58、67、73;33～36の配列及び前記配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなり;より好ましくはアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
一部の好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有する。一部のより好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、低い血清有病率のアクセプターAAVカプシド及びアクセプターAAVカプシドよりも高い血清有病率のドナーAAVカプシドタンパク質に由来する。一部のより好ましい実施形態において、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する増加した親和性並びにアクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有する。特定の実施形態において、アクセプターAAVカプシドタンパク質又はアクセプター及びドナーAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する増加した親和性並びにアクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有するハイブリッドAAVカプシドタンパク質は、配列番号35～43、45、47～58、60～73;好ましくは配列番号35、36、38、42、43、45、47、48、50、51、58、67、73の配列;及び前記配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなり;より好ましくはアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
ポリヌクレオチド、ベクター、及びAAVベクター製造のための使用
本発明の別の態様は、組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質を発現可能な形態でコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA又は合成若しくは半合成核酸であってもよい。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号33～43、45、47～58、60～73;好ましくは配列番号35、36、38、42、43、45、47、48、50、51、58、67、73の配列;及び前記配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を有する組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質をコードし;より好ましくはアミノ酸配列バリアントは、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない。
一部の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、102、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158;好ましくは82、84、88、96、98、102、106、108、112、114、128、146、158の配列、及び前記配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなる。ポリヌクレオチドは機能的なポリヌクレオチド配列であり、これは、ポリヌクレオチドの配列が組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質をコードすることを意味する。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、AAVレプリカーゼ(Rep)タンパク質、好ましくはAAV2からのRepを発現可能な形態で更にコードする。
ポリヌクレオチドは、有利には、組換えベクターに挿入され、組換えベクターは、非限定的な方式で、染色体、非染色体、合成又は半合成核酸からなる直鎖状又は環状DNA又はRNA分子、例えば特にウイルスベクター、プラスミド又はRNAベクターを包含する。目的の核酸分子を、それを真核宿主細胞に導入して該細胞中で維持するために挿入することができる多数のベクターがそれ自体公知であり;適切なベクターの選択は、このベクターのために想定される用途(例えば、目的の配列の複製、この配列の発現、染色体外形態でのこの配列の維持、又は他に宿主の染色体材料への組込み)、そしてまた宿主細胞の性質に依存する。
一部の実施形態において、ベクターはプラスミドである。
本発明における使用のための組換えベクターは、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質、及び好ましくはまたAAV Repタンパク質の発現のための適切な手段を含む発現ベクターである。通常は、各々のコーディング配列(ハイブリッドAAV Cap及びAAV Rep)は、同じベクター中又は別々のいずれかで別々の発現カセットに挿入される。各々の発現カセットは、AAV産生細胞中での対応するタンパク質の発現を可能とする調節配列、例えば特にプロモーター、プロモーター/エンハンサー、イントロン、開始コドン(ATG)、停止コドン、転写終結シグナルに機能的に連結されたコーディング配列(オープンリーディングフレーム又はORF)を含む。代替的に、ハイブリッドAAV Cap及びAAV Repタンパク質は、2つのコーディング配列又はウイルス2Aペプチドの間に挿入された内部リボソーム進入部位(IRES)を使用して独特の発現カセットから発現されてもよい。追加的に、ハイブリッドAAV Cap、及び存在する場合にAAV Repをコードするコドン配列は、有利には、AAV産生細胞、特にヒト産生細胞中での発現のために最適化される。
本発明の別の態様は、ハイブリッドAAVカプシドタンパク質、及び好ましくはまたAAV Repタンパク質の発現用の組換えベクターで安定して形質転換された細胞である。細胞は、ハイブリッドAAVカプシド及びAAV Repタンパク質を安定して発現する(産生細胞株)。産生細胞は有利にはヒト細胞である。
ベクター、好ましくは組換えプラスミド、及び産生細胞株は、当技術分野において周知の標準的なAAV製造方法(Aponte-Ubillusら、Applied Microbiology and Biotechnology、2018、102: 1045～1054頁中の総説)を使用して、本発明のハイブリッドAAVカプシドタンパク質を含むハイブリッドAAVベクターを製造するために有用である。
簡潔に述べれば、ハイブリッドAAVカプシド及びAAV Repタンパク質を安定して発現する産生細胞株への、AAV ITRにより隣接された、発現カセット中に挿入された目的の遺伝子を含む組換えAAVベクターゲノムを含有するプラスミドの、AAVカプシド粒子へのrAAVベクターゲノムのパッケージングを可能にするための十分なヘルパー機能の存在下での共トランスフェクション後に、細胞は、AAVベクター粒子の製造を可能とするために十分な時間にわたりインキュベートされ、細胞は次に採取され、溶解され、AAVベクター粒子は、標準的な精製方法、例えばアフィニティークロマトグラフィー又はイオジキサノール若しくは塩化セシウム密度勾配超遠心分離により精製される。
AAV粒子、細胞
本発明の別の態様は、本発明のハイブリッド組換えAAVカプシドタンパク質を含むAAV粒子である。好ましくは、AAV粒子は、組換えAAV(rAAV)ベクター粒子であり、これはハイブリッドカプシド血清型rAAVベクター粒子又はハイブリッド血清型rAAVベクター粒子とも命名される。AAVベクター粒子は、個体における標的組織又は細胞、特に筋肉、及び/又はCNS細胞若しくは組織又は他の細胞若しくは組織に方向付けられた遺伝子療法のために好適である。rAAVベクター粒子は、目的の遺伝子をパッケージングしている。rAAVベクターのゲノムは、一本鎖ゲノム又は自己相補的二本鎖ゲノムのいずれかであってもよい(McCartyら、Gene Therapy、2003、Dec.、10(26)、2112～2118頁)。自己相補的なベクターは、AAV末端反復の1つから末端分解部位(terminal resolution site; trs)を欠失させることにより生成される。その複製性ゲノムが野生型AAVゲノムの半分の長さであるこれらの改変されたベクターは、DNA二量体をパッケージングする傾向を有する。AAVゲノムはITRにより隣接される。特定の実施形態において、AAVベクターはシュードタイプベクターであり、即ちそのゲノム及びカプシドは、異なる血清型のAAVに由来する。一部の好ましい実施形態において、シュードタイプベクターのゲノムはAAV2に由来する。rAAVベクター粒子は、本発明の組換えAAVベクター粒子を製造する方法を使用して得られ得る。
「目的の遺伝子」により、特定の適用、例えば限定なく、診断、レポート(報告)、改変、療法及びゲノム編集のために有用な遺伝子が意味される。
例えば、目的の遺伝子は、治療用遺伝子、レポーター遺伝子又はゲノム編集酵素であってもよい。
「療法のための目的の遺伝子」、「治療的に目的の遺伝子」、又は「目的の異種遺伝子」により、治療用遺伝子又は治療用タンパク質、ペプチド若しくはRNAをコードする遺伝子が意味される。
目的の遺伝子は、標的臓器、特に筋肉及び/又はCNS、又は目的の他の標的臓器の細胞中の、標的遺伝子又は標的細胞経路を改変する能力を有する任意の核酸配列である。例えば、遺伝子は、標的遺伝子又は細胞経路の発現、配列又は調節を改変してもよい。一部の実施形態において、目的の遺伝子は、遺伝子又はその断片の機能的なバージョンである。前記遺伝子の機能的なバージョンは、野生型遺伝子、バリアント遺伝子、例えば同じファミリーに属するバリアント及びその他、又はコードされるタンパク質の機能性を少なくとも部分的に保存する切断されたバージョンを包含する。遺伝子の機能的なバージョンは、患者において欠損しているか又は非機能的な遺伝子を置き換えるための置換又は付加的な遺伝子療法のために有用である。他の実施形態において、目的の遺伝子は、常染色体優性遺伝子疾患を引き起こす優性アレルを不活性化する遺伝子である。遺伝子の断片は、ゲノム編集酵素と組み合わせた使用のための組換え鋳型として有用である。
代替的に、目的の遺伝子は、特定の応用のための目的のタンパク質(例えば抗体若しくは抗体断片、ゲノム編集酵素)又はRNAをコードしてもよい。一部の実施形態において、タンパク質は、治療用抗体若しくは抗体断片、又はゲノム編集酵素を含む治療用タンパク質である。一部の実施形態において、RNAは治療用RNAである。
一部の実施形態において、目的の遺伝子の配列は、処置される個体、好ましくはヒト個体における発現のために最適化される。配列最適化は、核酸配列中のいくつかの変化を含んでもよく、これは、コドン最適化、GC含有量の増加、CpGアイランドの数の減少、選択的オープンリーディングフレーム(ARF)の数の減少並びに/又はスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の数の減少を包含する。
目的の遺伝子は、疾患の標的細胞、特に筋肉細胞及び/又はCNS若しくは目的の他の標的細胞の細胞中でコードされるタンパク質、ペプチド又はRNAを産生することができる機能的な遺伝子である。一部の実施形態において、目的の遺伝子はヒト遺伝子である。AAVウイルスベクターは、標的臓器の細胞、特に心筋及び骨格筋細胞を包含する筋肉細胞、並びに/又はCNSの細胞又は目的の他の標的細胞中で発現可能な形態で目的の遺伝子を含む。特に、目的の遺伝子は、個体の標的細胞、組織又は臓器中での導入遺伝子の発現のための適切な調節配列に作動可能に連結している。当技術分野において周知のそのような配列は、特にプロモーター、及び導入遺伝子の発現を更に制御する能力を有する更なる調節配列、例えば限定なく、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、サイレンサー、特に組織特異的サイレンサー、及びmicroRNAを包含する。目的の遺伝子は、標的臓器、特に筋肉及び/又はCNSの細胞中で機能的である遍在的、組織特異的又は誘導性プロモーターに作動可能に連結している。目的の遺伝子は、上記に開示されている追加の調節配列を更に含む発現カセットに挿入されてもよい。
遍在性プロモーターの例は、CAGプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター(CMV)、SV40初期プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、及びEF1プロモーターを包含する。筋肉特異的プロモーターは、限定なく、デスミン(Des)プロモーター、筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、CK6プロモーター、アルファ-ミオシン重鎖(アルファ-MHC)プロモーター、ミオシン軽鎖2(MLC-2)プロモーター、心臓トロポニンC(cTnC)プロモーター、合成筋肉特異的SpC5-12プロモーター、ヒト骨格アクチン(HSA)プロモーターを包含する。CNS発現用のプロモーターは、遍在的な発現を駆動するプロモーター及びニューロンでの発現を駆動するプロモーターを包含する。遍在的な発現を駆動する代表的なプロモーターは、限定なく、CAGプロモーター(サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータアクチンプロモーター、ニワトリベータ-アクチン遺伝子の第1エクソン及び第1イントロン並びにウサギベータ-グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを包含する);PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ1)プロモーター;β-アクチンプロモーター;EF1aプロモーター;CMVプロモーターを包含する。ニューロンでの発現を駆動する代表的なプロモーターは、限定なく、運動ニューロン由来因子として公知の、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)のプロモーターを包含する。他のニューロン選択的プロモーターは、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、シナプシン、Hb9のプロモーター、ニューロン制限的サイレンサーエレメント(Neuron-Restrictive Silencer Element; NRSE)を包含する遍在性プロモーターを包含する。グリア細胞中での選択的な発現を駆動する代表的なプロモーターは、グリア線維性酸性タンパク質遺伝子(GFAP)のプロモーターを包含する。
RNAは、有利には、標的DNA若しくはRNA配列に相補的であるか、又は標的タンパク質に結合する。例えば、RNAは、干渉RNA、例えばshRNA、microRNA、Cas酵素若しくはゲノム編集用の類似した酵素と組み合わせた使用のためのガイドRNA(gRNA)、エクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNA、例えば改変された核内低分子RNA(snRNA)又は長鎖非コーディングRNAである。干渉RNA又はmicroRNAは、筋肉疾患に関与する標的遺伝子の発現を調節するために使用されてもよい。Cas酵素又はゲノム編集用の類似した酵素と複合状態のガイドRNAは、標的遺伝子の配列を改変するため、特に変異型/欠損型遺伝子の配列を矯正するため又は疾患、特に神経筋疾患に関与する標的遺伝子の発現を改変するために使用されてもよい。エクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNAは、特に、リーディングフレームを矯正し、妨害されたリーディングフレームを有する欠損型遺伝子の発現を回復させるために使用される。一部の実施形態において、RNAは治療用RNAである。
本発明によるゲノム編集酵素は、特に筋肉細胞中の、標的遺伝子又は標的細胞経路を改変する能力を有する任意の酵素又は酵素複合体である。例えば、ゲノム編集酵素は、標的遺伝子又は細胞経路の発現、配列又は調節を改変してもよい。ゲノム編集酵素は、有利には、人工ヌクレアーゼ、例えば限定なく、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化された規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート(clustered regularly interspaced palindromic repeats:CRISPR)-CasシステムからのCas酵素及び類似した酵素である。ゲノム編集酵素、特に人工ヌクレアーゼ、例えばCas酵素及び類似した酵素は、標的ゲノム座位中に二本鎖切断(DSB)又は一本鎖DNA切断を生成し(ニッカーゼ、例えばCas9(D10A))、限定なく遺伝子矯正、遺伝子置換、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、変異誘発、染色体転座、及び染色体欠失等を包含する、部位特異的なゲノム編集応用のために使用される機能的なヌクレアーゼであってもよい。部位特異的なゲノム編集応用のために、ゲノム編集酵素、特に人工ヌクレアーゼ、例えばCas酵素及び類似した酵素は、二本鎖切断(DSB)に誘導された相同組換えにより標的ゲノム座位を改変する相同組換え(HR)マトリックス又は鋳型(DNAドナー鋳型とも命名されている)と組み合わせて使用されてもよい。特に、HR鋳型は、目的の導入遺伝子を標的ゲノム座位に導入するか、又は筋肉若しくは中枢神経系(CNS)障害、例えば神経筋疾患等を引き起こす標的ゲノム座位中、好ましくは異常な若しくは欠損型遺伝子中の変異を修復するものであってもよい。代替的に、ゲノム編集酵素、例えばCas酵素及び類似した酵素は、ヌクレアーゼ欠損型となるように操作されてもよく、様々なゲノム操作応用、例えば限定なく、転写活性化、転写抑制、エピゲノム修飾、ゲノムイメージング、及びDNA又はRNAプルダウン等のためのDNA結合タンパク質として使用されてもよい。
本発明はまた、本発明のrAAVベクター粒子で安定して形質導入された、単離された細胞、特に個体からの細胞に関する。個体は、有利には、処置されるべき患者である。一部の実施形態において、細胞は、本開示による筋肉及び/若しくはCNS細胞、前記細胞の前駆細胞又は多能性幹細胞、例えば人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞、胎性幹細胞及び成体幹細胞である。
医薬組成物及び治療的使用
本発明の別の態様は、本発明のAAVベクター粒子又は細胞から選択される活性剤、及び医薬的に許容される担体を少なくとも含む医薬組成物である。
本発明の核rAAVベクター粒子(nucleic rAAV vector particle)、細胞及び派生された医薬組成物は、遺伝子療法、特に筋肉及び/又はCNS細胞又は組織に方向付けられた標的化された遺伝子療法により疾患を処置するために使用されてもよい。本発明の細胞及び派生された医薬組成物は、細胞療法、特に筋肉及び/若しくはCNS細胞又は目的の他の標的細胞に方向付けられた細胞療法により疾患を処置するために使用されてもよい。
本明細書において使用される場合、「遺伝子療法」は、疾患を処置する目的のために個体の細胞への目的の核酸の送達を伴う個体の処置を指す。核酸の送達は、一般に、ベクターとしても公知の、送達媒体を使用して達成される。本発明のrAAVベクター粒子は、患者の細胞に遺伝子を送達するために用いられてもよい。
本明細書において使用される場合、「細胞療法」は、本発明のrAAVベクター粒子により安定して形質導入された細胞が、任意の適切な手段により、例えば静脈内注射(注入)、又は目的の組織への注入(埋込み若しくは移植)により、それを必要とする個体に送達されるプロセスを指す。特定の実施形態において、細胞療法は、個体から細胞を収集する工程、本発明のrAAVベクター粒子を用いて個体の細胞への形質導入を行う工程、安定して形質導入された細胞を患者に戻すように投与する工程を含む。本明細書において使用される場合、「細胞」は、単離された細胞、天然の又は人工的な細胞凝集物、バイオ人工細胞スキャフォールド及びバイオ人工臓器又は組織を指す。
遺伝子療法は、核中に、ミトコンドリア中に又は共生核酸、例えば限定なく、細胞中に含有されるウイルス配列として含まれるものを包含する、細胞における任意のコーディング又は調節配列の遺伝子移入、遺伝子編集、エクソンスキッピング、RNA干渉、トランス-スプライシング又は任意の他の遺伝子改変により行われ得る。
遺伝子療法の2つの主な種類は以下である:
- 欠損型/異常遺伝子のための機能的な置換え遺伝子を提供することを目的とする療法:これは置換又は付加遺伝子療法である;
- 遺伝子又はゲノム編集を目的とする療法:そのような場合において、目的は、配列を矯正するか又は欠損型/異常遺伝子の発現若しくは調節を改変するために必要なツールを細胞に提供し、その結果、機能的な遺伝子が発現されるか又は異常な遺伝子が抑制(不活性化)されるようにすることである:これは遺伝子編集療法である。
付加遺伝子療法において、目的の遺伝子は、例えば遺伝子疾患の場合に該当するように、患者において欠損型又は変異型である遺伝子の機能的なバージョンであってもよい。そのような場合において、目的の遺伝子は、機能的な遺伝子の発現を回復させる。そのため、遺伝子編集又は遺伝子置換えによりこの遺伝子の正確なバージョンが、標的細胞、特に罹患した患者の筋肉及び/若しくはCNS細胞又は他の標的細胞中に提供され、これは、疾患に対する有効な療法に寄与し得る。
遺伝子又はゲノム編集は、1つ又は複数の目的の遺伝子、例えば
- 上記に定義されている治療用RNA、例えば干渉RNA、例えばshRNA若しくはmicroRNA、Cas酵素若しくは類似した酵素と組み合わせた使用のためのガイドRNA(gRNA)、又はエクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNA、例えば改変された核内低分子RNA(snRNA)をコードする遺伝子;及び
- 上記に定義されているゲノム編集酵素、例えば人工ヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、Cas酵素若しくは類似した酵素をコードする遺伝子;又はそのような遺伝子の組合せであり、そしてまた、上記に定義されている、組換え鋳型としての使用のための遺伝子の機能的なバージョンの断片であってもよい
を使用する。
遺伝子療法は、標的組織、特に、骨格筋若しくは心筋、脳又は脊髄を包含する、筋肉及び/又はCNSの構造又は機能に影響する様々な遺伝性(遺伝子)又は後天性疾患又は障害を処置するために使用される。疾患は、外傷、感染症、変性、構造若しくは代謝障害、腫瘍、自己免疫障害、卒中又はその他により引き起こされるものであってもよい。遺伝子療法により処置され得る疾患の非限定的な例は、神経筋遺伝性障害、例えば筋肉遺伝性障害;がん;神経変性疾患及び自己免疫疾患を包含する。
一部の実施形態において、遺伝子療法(付加遺伝子療法又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、神経筋疾患の原因となる遺伝子である。神経筋遺伝性障害は、特に、筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、遠位型ミオパチー、他のミオパチー、ミオトニー症候群、イオンチャネル筋肉疾患、悪性高熱症、代謝性ミオパチー、遺伝性心筋症、先天性筋無力症候群、運動ニューロン疾患、遺伝性対麻痺、遺伝性運動感覚ニューロパチー及び他の神経筋障害を包含する。一部の好ましい実施形態において、遺伝子療法(付加遺伝子療法又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD遺伝子)、肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)(CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5遺伝子及びその他)、脊髄筋萎縮症(SMN1遺伝子)、ミオチュブラーミオパチー(MTM1遺伝子)、ポンペ病(GAA遺伝子)並びにグリコーゲン貯蔵病III(GSD3)(AGL遺伝子)を含む群から選択される神経筋疾患の原因となる遺伝子である。
ジストロフィノパチーは、タンパク質ジストロフィンをコードするDMD遺伝子における病原性バリアントにより引き起こされるX連鎖性筋肉疾患のスペクトルである。ジストロフィノパチーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)及びDMD関連拡張型心筋症を含む。
肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)は、DMDに臨床的に類似しているが、常染色体劣性及び常染色体優性遺伝の結果として両方の性別において起こる障害の群である。肢帯型ジストロフィーは、サルコグリカン、及びジストロフィンと相互作用する筋肉細胞膜と会合した他のタンパク質をコードする遺伝子の変異により引き起こされる。LGMD1という用語は、優性遺伝(常染色体優性)を示す遺伝子型を指す一方、LGMD2は、常染色体劣性遺伝を伴う型を指す。50より多くの座位における病原性バリアントが報告されている(LGMD1A～LGMD1G;LGMD2A～LGMD2W)。カルパイノパチー(LGMD2A)は、450より多くの病原性バリアントが記載されている遺伝子CAPN3の変異により引き起こされる。LGMD表現型に対する寄与遺伝子は、アノクタミン5(ANO5)、血管心外膜物質(blood vessel epicardial substance; BVES)、カルパイン3(CAPN3)、カベオリン3(CAV3)、CDP-L-リビトールピロホスホリラーゼA(CRPPA)、ジストログリカン1(DAG1)、デスミン(DES)、DnaJ熱ショックタンパク質ファミリー(Hsp40)ホモログ、サブファミリーB、メンバー6(DNAJB6)、ジスフェリン(DYSF)、フクチン関連タンパク質(FKRP)、フクチン(FKT)、GDP-マンノースピロホスホリラーゼB(GMPPB)、ヘテロ核内リボ核タンパク質D様(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D like; HNRNPDL)、LIMジンクフィンガードメイン含有2(LIM zinc finger domain containing 2; LIMS2)、ラミンA:C(LMNA)、ミオチリン(MYOT)、プレクチン(PLEC)、タンパク質O-グルコシルトランスフェラーゼ1(PLOGLUT1)、タンパク質O結合型マンノースN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1(ベータ1,2-)(POMGNT1)、タンパク質O-マンノースキナーゼ(POMK)、タンパク質O-マンノシルトランスフェラーゼ1(POMT1)、タンパク質O-マンノシルトランスフェラーゼ2(POMT2)、サルコグリカンアルファ(SGCA)、サルコグリカンベータ(SGCB)、サルコグリカンデルタ(SGCD)、サルコグリカンガンマ(SGCG)、タイチン-cap(TCAP)、トランスポーチン3(TNPO3)、トルシン1A相互作用タンパク質(TOR1AIP1)、トラフィッキングタンパク質粒子複合体11(TRAPPC11)、トリパータイトモチーフ含有32(tripartite motif containing 32; TRIM 32)及びタイチン(TTN)を包含する。LGMD表現型に対する主要な寄与遺伝子は、CAPN3、DYSF、FKRP及びANO5を包含する(Babi Ramesh Reddy Nallamilliら、Annals of Clinical and Translational Neurology、2018、5、1574～1587頁)。
脊髄筋萎縮症は、運動のために使用される筋肉における虚弱及び消耗症(萎縮症)により特徴付けられる生存運動ニューロン1(SMN1)遺伝子における変異により引き起こされる遺伝的障害である。
X連鎖性ミオチュブラーミオパチーは、運動のために使用される筋肉(骨格筋)に影響し、ほぼ排他的に男性において起こるミオチューブラリン(MTM1)遺伝子における変異により引き起こされる遺伝的障害である。この状態は、筋肉衰弱(ミオパチー)及び筋緊張の減少(筋緊張低下)により特徴付けられる。
ポンペ病は、酸アルファ-グルコシダーゼ(GAA)遺伝子における変異により引き起こされる遺伝的障害である。GAA遺伝子における変異は、酸アルファ-グルコシダーゼがグリコーゲンを有効に分解することを予防し、これはこの糖をリソソーム中に毒性レベルまで蓄積させる。この蓄積は、身体の全体を通じた臓器及び組織、特には筋肉を損傷し、ポンペ病の進行性の徴候及び症状に繋がる。
グリコーゲン貯蔵病III(GSD3)は、グリコーゲン脱分枝酵素をコードし、短い外側鎖を有する異常なグリコーゲンの蓄積と関連付けられるアミロ-アルファ-1,6-グルコシダーゼ、4-アルファ-グルカノトランスフェラーゼ(AGL)遺伝子におけるホモ接合性又は複合ヘテロ接合性変異により引き起こされる常染色体劣性代謝障害である。臨床的に、GSD IIIを有する患者は、乳児期又は幼児期において肝腫大、低血糖症、及び成長遅延を示す。IIIaを有する者における筋肉衰弱は小児期において最小であるが、成人においてより重症となることがあり;一部の患者は心筋症を発症する。
置換又は付加遺伝子療法は、がん、特に横紋筋肉腫を処置するために使用されてもよい。がんにおける目的の遺伝子は、腫瘍細胞の細胞周期若しくは代謝及び遊走を調節し得るか、又は腫瘍細胞の死を誘導し得る。例えば、誘導性カスパーゼ-9は、好ましくは永続性のある抗腫瘍免疫応答を誘発するための併用療法において、筋肉細胞中で発現されて細胞死のトリガーとなり得る。
遺伝子編集を使用して、自己免疫若しくはがんの場合に、標的細胞、特に筋肉及び/若しくはCNS細胞における遺伝子発現を改変するか、又はそのような細胞中でのウイルスのサイクルを撹乱させてもよい。そのような場合において、好ましくは、目的の遺伝子は、ガイドRNA(gRNA)、部位特異的エンドヌクレアーゼ(TALEN、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Casヌクレアーゼ)、DNA鋳型並びにRNAi成分、例えばshRNA及びmicroRNAをコードするものから選択される。ツール、例えばCRISPR/Cas9がこの目的のために使用されてもよい。
一部の実施形態において、遺伝子療法は、標的組織、特に、筋肉及び/又はCNS組織における治療用遺伝子の発現により、他の組織に影響する疾患を処置するために使用される。これは、特に同時発生的な肝臓障害、例えば肝炎を有する患者において、肝臓における治療用遺伝子の発現を回避するために有用である。治療用遺伝子は、好ましくは、筋肉細胞から血流に分泌されて、そこにおいて他の標的組織、例えば肝臓等に送達され得る治療用タンパク質、ペプチド又は抗体をコードする。治療用遺伝子の例は、限定なく、第VIII因子、第IX因子及びGAA遺伝子を包含する。
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物は、治療有効量のrAAVベクター粒子又は細胞を含む。本発明の文脈において、治療有効量は、そのような用語が適用される障害若しくは状態を逆転させるか、軽減するか若しくはその進行を阻害するため、又はそのような用語が適用される障害若しくは状態の1つ若しくは複数の症状を逆転させるか、軽減するか若しくはその進行を阻害するために十分な用量を指す。「有効用量」又は「有効投薬量」という用語は、所望される効果を達成するか、又は少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。
有効用量は、要因、例えば使用される組成物、投与の経路、考慮されている個体の身体的特徴、例えば性別、年齢及び体重、同時的な医薬品、並びに当業者が認識する他の要因に依存して決定及び調整される。
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物は、医薬的に許容される担体及び/又は媒体を含む。
「医薬的に許容される担体」は、適切なように、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応を生じない媒体を指す。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、被包性材料又は製剤助剤を指す。
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のために医薬的に許容される媒体を含有する。これらは、特に、等張の、無菌の、食塩水溶液(リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等若しくはそのような塩の混合物)、又は、場合に依存して、滅菌水若しくは生理食塩水の添加で、注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥、特にフリーズドライ組成物であってもよい。
注射可能な用途のために好適な薬学的形態は、無菌水性溶液又は懸濁液を包含する。溶液又は懸濁液は、ウイルスベクターと適合性であり、及びウイルスベクター粒子が標的細胞に侵入することを予防しない添加剤を含んでもよい。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流体でなければならない。それは、生産及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用から保護されなければならない。適切な溶液の例は、緩衝剤、例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)又はリンゲル乳酸塩である。
本発明はまた、標的組織、特に筋肉及び/又はCNS組織中での治療用遺伝子の発現により疾患を処置する方法であって、患者に治療有効量の上記されている医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
本発明の別の態様は、特に本開示による筋肉又はCNS障害、特に神経筋遺伝子疾患の処置における使用のための、医薬としての本開示によるrAAVベクター粒子、細胞、医薬組成物に関する。
本発明はまた、筋肉又はCNS障害を処置する方法であって、本発明のAAVベクター粒子又は細胞から選択される活性剤、及び医薬的に許容される担体を少なくとも含む、治療有効量の上記されている医薬組成物を患者に投与する工程を含む、方法を提供する。
本発明の更なる態様は、筋肉又はCNS障害、特に神経筋遺伝子疾患の処置のための医薬の生産における、本開示によるrAAVベクター粒子、細胞の使用に関する。
本発明の別の態様は、本開示による筋肉又はCNS障害、特に神経筋遺伝子疾患の処置のための本開示のrAAVベクター粒子又は細胞の使用に関する。
本発明の更なる態様は、活性成分として本開示のAAVベクター粒子又は細胞を含む、本開示による筋肉又はCNS障害、特に神経筋遺伝子疾患の処置のための医薬組成物に関する。
本発明の更なる態様は、本開示による筋肉又はCNS障害、特に神経筋遺伝子疾患の処置のための本開示のAAVベクター粒子又は細胞を含む医薬品に関する。
本明細書において使用される場合、「患者」又は「個体」という用語は、予防的処置又は治療的処置のいずれかを与えられるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。好ましくは、本発明による患者又は個体はヒトである。
「処置」、又は「処置する」は、本明細書において使用される場合、疾患、又は疾患の任意の症状の治癒、回復、軽減、緩和、変更、治療、寛解、改善又は影響を目的とした、患者への治療剤若しくは治療剤の組合せの適用若しくは投与、又は疾患、特に筋肉若しくはCNS障害を有する患者からの単離された組織若しくは細胞株への前記治療剤の適用若しくは投与として定義される。特に、「処置する」又は「処置」という用語は、疾患と関連付けられる少なくとも1つの有害な臨床症状を低減させるか又は軽減することを指す。
「処置」又は「処置する」という用語はまた、治療剤を予防的に投与する文脈において本明細書において使用される。
本発明の医薬組成物は、一般に、公知の手順にしたがって、患者において治療効果を誘導するために有効な投薬量及び時間的期間において投与される。医薬組成物は、任意の好都合な経路により投与されてもよく、これは例えば、非限定的な方式において、注入又はボーラス注射によるもの、上皮又は粘膜皮膚裏(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等)を通じた吸収によるものである。投与は、全身、局所又は局所と組み合わせた全身のものであることができ;全身は非経口及び経口を包含し、局所は局所及び局所領域を包含する。全身投与は、好ましくは、非経口、例えば皮下(SC)、筋肉内(IM)、血管内、例えば静脈内(IV)若しくは動脈内;腹腔内(IP);皮内(ID)、硬膜外又はその他である。非経口投与は、有利には、注射又は灌流による。局所投与は、好ましくは、脳内、脳室内、大槽内、及び/又は髄腔内投与である。投与は、例えば、注射又は灌流によるものであってもよい。一部の好ましい実施形態において、投与は、非経口、好ましくは血管内、例えば静脈内(IV)又は動脈内である。一部の他の好ましい実施形態において、投与は、単独での又は非経口投与、好ましくは血管内投与と組み合わせた、脳内、脳室内、大槽内、及び/又は髄腔内投与である。一部の他の好ましい実施形態において、投与は、単独での又は脳内、脳室内、大槽内、及び/若しくは髄腔内投与と組み合わせた非経口、好ましくは血管内投与である。
本開示の様々な実施形態は互いと組合せ可能であり、本開示は本開示の実施形態の様々な組合せを包含する。
本発明の実施は、他に指し示されなければ、当技術分野の技術的範囲内である従来技術を用いる。そのような技術は文献において十分に説明されている。
本発明はこれより、添付の図面を参照して、限定的ではない以下の実施例を用いて例示される。
AAVハイブリッド及び親カプシドの表現 上に、12個のHVR(黒ボックス)の局在性と共にAAV8のVP1アミノ酸配列の図式的な表現。各々のHVRの番号は、対応するボックス上に指し示される。アミノ酸座標は、HVR置換のために使用される位置を指し示す。下に、AAV8、#704及び6個のハイブリッドカプシドの図式的な表現。VP1アミノ酸配列を、ClustalWアルゴリズムを使用して多重アライメントし、AAV8配列(黒)と比較した。灰色は、#704カプシドに特有の及び変異体中に存在するアミノ酸バリエーションを指し示す。 ハイブリッドカプシドの特異的な組織標的化。 対照及び新たなハイブリッドカプシドのルシフェラーゼ活性。各々のカラムは、AAV8と比較した倍数変化として表現された少なくとも3匹のマウスにおける活性の平均を表す。標準偏差を示している。倍数変化に関する統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均を対照の平均と比較した(* #704との比較、#AAV8との比較)。*、#=p<0.05;**、##=p<0.01;***、###=p<0.001。 新たなハイブリッドカプシドの血清有病率 46のヒト血清のコホートにおいてELISAにより評価されたハイブリッド及び親カプシドにおける抗AAVカプシド抗体のレベル。各々のカプシドについて、血清を、抗AAV IgGのレベルにしたがって3つの群にカテゴライズしている。統計分析は、モンテカルロシミュレーションと共にχ2検定を使用して行っている。 新たなハイブリッドカプシドに対する抗AAVカプシド抗体の存在。 ヒトIVIgのプールにおいてELISAにより評価された抗AAVカプシド抗体の存在。親カプシドにおける抗体のレベルをA)変異体1、B)変異体2、C)変異体3、D)変異体4及びE)変異体5と比較している。X軸はIVIgの段階希釈を表し、y軸は、抗AAV抗体の存在に関する正規化されたOD値を表す。各々のカプシドのOD50をグラフ中に示す。F)2つの独立した実験の結果としてもたらされた親及びハイブリッドカプシドのOD50。標準偏差を示している。統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均を対照の平均と比較した(* AAV8との比較、# #704との比較)。*、#=p<0.05;**、##=p<0.01;***、###=p<0.001。 単一のHVR置換を有する変異体の特異的な組織標的化。 6つの異なる臓器におけるAAV8及び新たなハイブリッドカプシドのルシフェラーゼ活性。各々のカラムは、AAV8と比較した倍数変化として表現される少なくとも3匹のマウスにおける活性の平均を表す。標準偏差を示している。倍数変化に関する統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均をAAV8の平均と比較した。*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001。 単一のHVR置換を有する変異体における抗AAVカプシド抗体。 ヒトIVIgのプールにおいてELISAにより評価された抗AAVカプシド抗体の存在。親カプシドにおける抗体のレベルをA)AAV8-mut.HVR1、B)AAV8-mut.HVR3、C)AAV8-mut.HVR6、D)AAV8-mut.HVR7、E)AAV8-mut.HVR8、F)AAV8-mut.HVR9、G)AAV8-mut.HVR10、H)AAV8-mut.HVR11及びI)AAV8-mut.HVR12と比較している。X軸はIVIgの希釈を表し、y軸は、抗AAV抗体の存在に関する正規化されたOD値を表す。各々のカプシドのOD50をグラフ中に示す。J)2つの独立した実験の結果としてもたらされた親及びハイブリッドカプシドのOD50。標準偏差を示している。統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均を対照の平均と比較した(* AAV8との比較、# #704との比較)。*、#=p<0.05;**、##=p<0.01;***、###=p<0.001。 異なるHVR5置換を有する変異体の特異的な組織標的化。 6つの異なる臓器におけるAAV8及び新たなハイブリッドカプシドのルシフェラーゼ活性。各々のカラムは、AAV8と比較した倍数変化として表現される少なくとも3匹のマウスにおける活性の平均を表す。標準偏差を示している。倍数変化に関する統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均をAAV8の平均と比較した。*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001。 異なるHVR5～8の組合せを有する変異体の特異的な組織標的化。 5つの異なる臓器におけるAAV8及び新たなハイブリッドカプシドのルシフェラーゼ活性。各々のカラムは、AAV8と比較した倍数変化として表現される少なくとも3匹のマウスにおける活性の平均を表す。標準偏差を示している。倍数変化に関する統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均をAAV8の平均と比較した。*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001。 AAV9変異体の特異的な組織標的化。 6つの異なる臓器におけるAAV9及びAAV9-R5-704カプシドのルシフェラーゼ活性。各々のカラムは、AAV9と比較した倍数変化として表現される少なくとも3匹のマウスにおける活性の平均を表す。標準偏差を示している。倍数変化に関する統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均をPBSの平均と比較した。*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001。 AAV9ハイブリッドカプシドにおける抗AAVカプシド抗体のレベル。 ヒトIVIgのプールにおいてELISAにより評価された抗AAVカプシド抗体の存在。A)親カプシドの抗体のレベルをAAV9-R5-704と比較している。X軸はIVIgの段階希釈を表し、y軸は、抗AAV抗体の存在に関する正規化されたOD値を表す。各々のカプシドのOD50をグラフ中に示す。B)2つの独立した実験の結果としてもたらされた親及びハイブリッドカプシドのOD50。標準偏差を示している。統計分析を、一元配置ANOVAを使用して行った。ダネットの多重比較検定を使用して、各々のカプシドの平均を対照の平均と比較した(* AAV8との比較、# #704との比較)。*、#=p<0.05;**、##=p<0.01;***、###=p<0.001。
材料及び方法
1.新たなハイブリッドカプシドのためのプラスミド構築
AAV2 Rep配列及び新たなハイブリッドCap遺伝子を含有するプラスミドを構築するために、カプシド配列を合成した(GENEWIZ社)。断片を、AAV2 Rep及びAAV2 Capを含有するプラスミドpAAV2に挿入して、AAV2 Capを対応する新たなCap配列で置き換えた。
2.AAV製造
HEK293T細胞を50mLの無血清培地中で懸濁状態で増殖させた。細胞を3つのプラスミド:i)発現カセットに隣接するAAV2 ITRを含有する導入遺伝子プラスミド、ii)AAV製造のために必要なアデノウイルス配列を含有するヘルパープラスミドpXX6、及びiii)AAVの血清型を定義するAAV Rep及びCap遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、細胞を溶解させてAAV粒子を放出させた。
ウイルス溶解液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ウイルスゲノムを、AAVベクターゲノムのITRに対応するプライマー及びプローブを使用してTaqManリアルタイムPCRアッセイにより定量化した(Rohrら、J Virol Methods.、2002、106、81～8頁.doi:10.1016/s0166-0934(02)00138-6)。
3.インビボ研究
全てのマウス研究は、動物の世話及び実験に関するフランス及び欧州の法制(2010/63/EU)にしたがって行い、地方機関の倫理委員会(プロトコール番号2016-002C)により承認された。AAVベクターを6週齢雄C57Bl6/Jマウスの静脈内に尾静脈を介して投与した。PBSを注射された同腹仔を対照として使用した。ベクター注射の15日後に、組織を採取し、Fastprepチューブを使用してDNAse/RNAse非含有水中でホモジナイズした(6.5m/s;60秒)。
4.ルシフェラーゼ活性
ルシフェラーゼアッセイを使用して、導入遺伝子として使用されたレポーター遺伝子の発現を測定した。組織溶解液を10000rpmで10分間遠心分離し、上清を白色不透明96ウェルプレート中の溶解緩衝液中に希釈した。EnSpire(PerkinElmer社)を使用してATP及びルシフェリンを含有するアッセイ緩衝液の逐次的な注入を通じてルシフェラーゼ活性を測定した。
タンパク質量に対してRLU(相対発光単位)を正規化するためにBCAアッセイを使用して試料に関するタンパク質定量化を行った。最終結果をタンパク質1mg当たりのRLUとして表現し、AAV8対照と比較した倍数変化として正規化した。
5.カプシドの血清有病率
ELISAを行って、バッチ当たり1000～1500ドナーの血清から調製された、ヒト血清のコホート及びヒト静脈内免疫グロブリン(IVIg)の商用のプールにおける抗AAVカプシド抗体(Ab)の存在を評価した。AAVカプシドを1×10E9vg/ウェルでMaxisorp(商標)プレート(Nunc社)上に被覆し、4℃で終夜インキュベートした。プレートを、6%のミルクを含有するPBSで3回洗浄し、室温で2時間インキュベートした。プレートを、0.05%のTweenを含有するPBS(PBS-T)で3回洗浄し、血清希釈液と37℃で1時間インキュベートした。各々の血清試料を、4つの対数段階希釈液(1:10～1:10000)を使用して分析した一方、IVIgのプールを、8つの片対数段階希釈液(1:10～1:316000)を使用して分析した。プレートをPBS-Tで3回洗浄し、HRPを共役したヤギ抗ヒトIgG(1:10000希釈)と37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBS-Tで3回洗浄し、TMB基質を加えた。反応をH2SO4で停止させ、プレートの光学密度(OD)を492nmで読み取った。ヒト血清の分析のために、IVIgの標準曲線を使用して、各々の試験された血清中の抗AAVカプシドIgGのレベルを決定した。結果を血清1ml当たりの抗AAVカプシドIgGのμgとして表現している。10μg/mlより低いELISA IgG力価を有する血清を血清陰性と考えた。IVIg試料の分析のために、各々のカプシドのOD値をシグナルのパーセンテージとして表現し、Prism上で分析した。用量応答曲線のモデルを使用して、ODシグナルの50%の低減が観察されたIVIg希釈(OD50)を決定した。ハイブリッドカプシドのOD50を親カプシドのOD50と比較した。
(実施例1)
他のAAV血清型からの超可変領域を有するAAV8からのハイブリッドカプシドの製造及びインビボ試験
ここに記載されるカプシドの設計は、2つの選択された親カプシド:周知のAAV8血清型及び新たに単離されたAAV2/13配列の超可変領域(HVR)の組合せに基づく。合理的シャッフリング戦略の目的は、カプシド特性をドナーカプシドからアクセプターカプシドへとアクセプターカプシド血清有病率の変更なしに移すことである。AAV2/13からのVP1配列を、ヒト肝臓から単離された全てのAAV2/13配列をアライメントすることにより得(La Bella Tら、Gut、2020、69、737～747頁.doi:10.1136/gutjnl-2019-318281)、結果としてもたらされたアミノ酸コンセンサス配列は、ヒトにおいて単離された配列#704に等しい。コンセンサスAAV2/13配列は以下において#704(配列番号2)と呼ばれる。AAV8カプシドは配列番号1に対応する。
本発明者らは、HVRの可変番号に対応する6つのハイブリッドカプシドを開発した(図1):
- アミノ酸1～446のAAV8及びaa 447～739の#704により構成されるAAV8-704。このハイブリッドはAAV8のHVR1～4及び#704の5～12を含む。AAV8-704は配列番号31のアミノ酸配列を有し、配列番号74のポリヌクレオチドによりコードされる。
- アミノ酸1～446のAAV8、aa 447～687の#704及び688～739のAAV8により構成される変異体1。このハイブリッドは、AAV8のHVR1、2、3、4及び12並びに#704の5～11を含む。変異体1は配列番号32のアミノ酸配列を有し、配列番号76のポリヌクレオチドによりコードされる。
- アミノ酸1～446のAAV8、aa 447～613の#704及び614～739のAAV8により構成される変異体2。このハイブリッドは、AAV8のHVR1、2、3、4、11及び12並びに#704の5～10を含む。変異体2は配列番号33のアミノ酸配列を有し、配列番号78のポリヌクレオチドによりコードされる。
- アミノ酸1～446のAAV8、aa 447～570の#704及び571～739のAAV8により構成される変異体3。このハイブリッドは、AAV8のHVR1、2、3、4、10、11及び12並びに#704の5～9を含む。変異体3は配列番号34のアミノ酸配列を有し、配列番号80のポリヌクレオチドによりコードされる。
- アミノ酸1～446のAAV8、aa 447～531の#704及び532～739のAAV8により構成される変異体4。このハイブリッドは、AAV8のHVR1、2、3、4、9、10、11及び12並びに#704の5～8を含む。変異体4は配列番号35のアミノ酸配列を有し、配列番号82のポリヌクレオチドによりコードされる。
- アミノ酸1～446のAAV8、aa 447～485の#704及び486～739のAAV8により構成される変異体5。このハイブリッドは、#704からのHVR5を除いてAAV8の全てのHVRを含む。変異体5は配列番号36のアミノ酸配列を有し、配列番号84のポリヌクレオチドによりコードされる。
カプシドの製造、インビボ体内分布及び血清有病率
組換えAAVベクターを、上記される変異型Cap遺伝子をAAVベクター製造のために好適なプラスミドにクローニングすることにより製造した。AAV2 ITRにより隣接され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する導入遺伝子発現カセットを、そのように派生されたAAVベクターにおいてカプシド被包させた。HEK293細胞の三重トランスフェクションを使用してベクターを製造し、続いて免疫アフィニティーカラム精製を行った。以下のインビボ分析から除外されたAAV8-704を除いて、全てのカプシド配列はAAVベクターとして効率的に製造された。
ベクターを野生型C57Bl6/Jマウスにおいて1×1011vg/マウスの用量での異なるベクターの静脈内注射を通じて試験した。注射後15日目に、動物を屠殺し、導入遺伝子の発現のレベルを、単離された組織(肝臓、脾臓、四頭筋、三頭筋、横隔膜、心臓、腎臓、脳、ヒラメ筋、脊髄)において測定した。結果をタンパク質1mg当たりのRLU(相対発光単位)として表現し、AAV8対照と比較した倍数変化として正規化した(Table 2(表2)及び図2)。
肝臓において(図2A)、AAV8のルシフェラーゼ活性は、全ての他の試験されたカプシドよりも有意に高かった。親カプシド#704は肝臓を完全に脱標的化した。変異体カプシドを注射されたマウスの肝臓におけるルシフェラーゼ活性は、AAV8からのより多くのHVRを含有するカプシドにおいて漸増的に増加し、カプシド#704のHVR5を有する変異体5において最も高いレベルに達した。
全ての試験された筋肉において(図2B～図2F)、変異体1を除く全ての変異体カプシドは親カプシド#704を凌ぎ、AAV8に対してより高い効率を示した。
増加した形質導入レベルはまた、親カプシドと比較して全ての変異体、特に変異体2及び4について脊髄において観察された一方(図2G)、非常に低いルシフェラーゼ活性が#704及び変異体1について観察された。
脳において(図2H)、AAV8、#704及び変異体1のルシフェラーゼ活性はPBS注射マウスと同等であった。興味深いことに、変異体2、3、4及び5は、AAV9、AAV8及び#704よりも高い効率で脳を標的化することができた(Table 2(表2))。
最後に、#704及び変異体1とは対照的に、変異体5は、AAV8よりも高いルシフェラーゼ発現と共に腎臓を標的化することができた(図2I)。
以上を合わせると、これらの結果は、新規のAAV変異型カプシドは、それらの親カプシドと比較して筋肉及びCNSに対する増加した親和性を呈することを示し、AAV8及び野生型#704からの超可変領域の組合せは、新規のカプシドの開発のための有望な戦略となり得ることを示唆した。
本発明者らは、カプシド血清有病率に影響することなくカプシド中で改変され得るHVR領域の最小の数の同定を試みた。ハイブリッドカプシドの血清有病率を2つの親カプシド、AAV8及び#704と並行して試験した。ELISAを行って、46のヒト血清のコホートにおいて抗AAVカプシド抗体(Ab)の存在を評価した。予想されたように、このカプシドのヒト起源から、血清陽性個体の数は野生型#704について最も多かった(n=25;図3)。血清陽性個体の数の減少が全ての変異体について観察された。特に、変異体4及び5は、親カプシド#704よりも有意に低い血清陽性試料を示した(それぞれn=10及びn=13)。包括的に、血清陽性個体の頻度は、AAV8よりも少ない数の#704のHVRを含有するハイブリッドカプシドにおいて徐々に減少し、変異体4及び5においてそれぞれ22%及び28%に達した。親AAV8カプシドは試験されたコホートにおいて30%の血清陽性を示したことを考慮すると、これらのデータは、HVR5、6、7及び8の改変はカプシドの免疫原性プロファイルを改変しないことを示唆する。類似した結果はまた、ヒトIVIgのプールにおいて抗AAVカプシド抗体のレベルを分析することにより確認された(図4)。ODシグナルの50%の低減が観察されるIVIg希釈として定義されるOD50を使用して、ハイブリッド及び親カプシドに対する抗AAV抗体のレベルを比較した。400及び3370のOD50がそれぞれAAV8及び#704について得られた。変異体1、2及び3は、アクセプターカプシドよりも有意に高いOD50を示した一方(図4A、図4B、図4C及び図4F)、変異体4及び5は、OD50におけるいかなる有意な差異もなくAAV8プロファイルと全く同等であった(図4D、図4E及び図4F)。全ての変異体は、ドナーカプシドよりも有意に低いOD50を示した(図4F)。
これらの結果は、そのため、合理的なシャッフリングが、複数の親カプシドのカプシド特性を組み合わせるための方法として使用され得ることを実証する。更には、これらの結果は、一緒になって、合理的なシャッフリングが、カプシド特性をドナーカプシドからアクセプターカプシドへとアクセプターカプシド血清有病率の変更なしに移すための方法として使用され得ることを実証する。
(実施例2)
単一のHVR置換を有するAAV8からのハイブリッドカプシドの製造、インビトロ及びインビボ試験
#704からの12のHVRの特性をより良好に特徴付けるために、AAV8のHVRを野生型#704カプシドの対応するHVRで1つずつ置換する。#704のHVR2及び4のアミノ酸配列はAAV8と同一であり、したがって単一のHVR置換を有する10個のAAV8カプシドが分析される:
- 配列番号86のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR1(配列番号37);
- 配列番号88のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR3(配列番号38);
- 配列番号90のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR6(配列番号39);
- 配列番号92のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR7(配列番号40);
- 配列番号94のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR8(配列番号41);
- 配列番号96のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR9(配列番号42);
- 配列番号98のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR10(配列番号43);
- 配列番号100のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR11(配列番号44);及び
- 配列番号102のポリヌクレオチドによりコードされるAAV8-mut.HVR12(配列番号45)。
組換えAAVベクターを、改変型Cap遺伝子をベクター製造のために好適なプラスミドにクローニングすることにより製造する。AAV2 ITRにより隣接され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する導入遺伝子発現カセットを、そのように派生されたAAVベクターにおいてカプシド被包させる。HEK293細胞の三重トランスフェクションを使用してベクターを製造し、続いて免疫アフィニティーカラム精製を行う。ベクターをインビトロで細胞株及び商用の供給元から得られた初代細胞において試験する。並行して、ベクターを野生型C57Bl6/Jマウスにおいて1×1011vg/マウスの用量での異なるベクターの静脈内注射を通じて試験する。注射後15日目に、動物を屠殺し、導入遺伝子の発現のレベルを単離された組織において測定する。変異体カプシドの血清有病率を、実施例1に示されるようにELISAにより試験する。
全ての試験された筋肉、脳及び脊髄において、AAV8-mut.HVR11を除く全ての変異体カプシドはAAV8よりも高い効率を示した(図5)。特に、AAV8-mut.HVR3及び12のルシフェラーゼ活性は、少なくとも1つの筋肉においてAAV8よりも有意に高かった。CNSに関して、AAV8-mut.HVR3、AAV8-mut.HVR9、AAV8-mut.HVR10及びAAV8-mut.HVR12は、脊髄及び/又は脳においてAAV8よりも有意に効率的であった。全ての変異体は、ドナーカプシド#704よりも有意に低い及びアクセプターカプシドAAV8と同等の血清有病率を示した(図6)。AAV8-mut.HVR6における抗AAV抗体のレベルはアクセプターカプシドよりも有意に低かった一方(OD50:変異体及びAAV8においてそれぞれ145及び400)、AAV8-mut.HVR12は低い血清有病率(OD50:631)を示したが、依然としてAAV8よりも有意に高かった。これらの結果は、単一のHVRの置換は、その血清有病率を変更することなくアクセプターの親和性を向上できることを示唆する。
(実施例3)
野生型AAVからの異なるHVR5を有するAAV8からのハイブリッドカプシドの製造、インビトロ及びインビボ試験
ヒト肝臓において最近単離された野生型カプシド(La Bella Tら、Gut、2020、69、737～747頁.doi:10.1136/gutjnl-2019-318281)は、天然の感染の文脈におけるAAVの可変性を表す。これらの59のカプシドは、HVR5も伴う特有のアミノ酸バリエーションにより特徴付けられる。2つの異なる遺伝子型、AAV2及びAAV2/13、AAV13(GenBank受託番号ABZ10812.1)及びAAV2(GenBank受託番号YP_680426.1)からの野生型AAVカプシドのアライメントは、AAV2血清型からの4個(野生型AAV2;野生型カプシド#2102、#1343、#3013)、AAV2/13血清型からの14個(野生型カプシド#1704、#3086、#1591、#3142、#985、#M258、#1570、#2806、#2731、#1602、#667、#129、#217、#767)及びAAV13血清型からの1個(野生型カプシド#508)を含む19の独特のHVR5配列の同定を可能とした。実施例1における変異体5と類似して、新たなAAV変異体の特性を特徴付けるために12の異なるHVR5置換を含有する新たなAAV8変異体を生成する。
配列番号201のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号187のHVR5を含む、配列番号104のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-AAV2(配列番号46)。
変異体5-AAV13:
- 配列番号200のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号186のHVR5を含む、配列番号110のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#508(配列番号49)。配列番号186はAAV13のHVR5配列である。
変異体5-AAV2/13:
- 配列番号190のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号176のHVR5を含む、配列番号106のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#1704(配列番号47)。
- 配列番号191のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号177のHVR5を含む、配列番号108のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#3086(配列番号48)。
- 配列番号192のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号178のHVR5を含む、配列番号112のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#3142(配列番号50)。
- 配列番号193のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号179のHVR5を含む、配列番号114のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#M258(配列番号51)。
- 配列番号194のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号180のHVR5を含む、配列番号116のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#1570(配列番号52)。
- 配列番号195のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号181のHVR5を含む、配列番号118のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#2731(配列番号53)。
- 配列番号196のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号182のHVR5を含む、配列番号120のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#1602(配列番号54)。
- 配列番号197のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号183のHVR5を含む、配列番号122のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#667(配列番号55)。
- 配列番号198のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号184のHVR5を含む、配列番号124のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#129(配列番号56)。
- 配列番号199のポリヌクレオチドによりコードされる配列番号185のHVR5を含む、配列番号126のポリヌクレオチドによりコードされる変異体5-#767(配列番号57)。
変異体5(実施例1)は、配列番号189のポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号175の配列としての#704からのHVR5を含む。
#704からのHVR5(配列番号175)は、ハイブリッド血清型2/13の他の野生型カプシド(#1010(配列番号6);#2112、#1350、#668、#367、#1020、#1158、#2107(配列番号11～17)、#714(配列番号19)、#790、#976、#1286、#163、#685、#442、#2320(配列番号22～29))中に存在する。
AAV13からのHVR5(配列番号186)は、野生型カプシド#1024(配列番号22)及び#508(配列番号9)中に存在する。
組換えAAVベクターを、改変型Cap遺伝子をベクター製造のために好適なプラスミドにクローニングすることにより製造する。AAV2 ITRにより隣接され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する導入遺伝子発現カセットを、そのように派生されたAAVベクターにおいてカプシド被包させる。HEK293細胞の三重トランスフェクションを使用してベクターを製造し、続いて免疫アフィニティーカラム精製を行う。ベクターをインビトロで細胞株及び商用の供給元から得られた初代細胞において試験する。並行して、ベクターを野生型C57Bl6/Jマウスにおいて1×1011vg/マウスの用量での異なるベクターの静脈内注射を通じて試験する。注射後15日目に、動物を屠殺し、導入遺伝子の発現のレベルを単離された組織において測定する。変異体カプシドの血清有病率を実施例1に示されるようにELISAにより試験する。
AAV13(変異体5-#508)又はハイブリッドAAV2/13血清型のHVR5を有する全ての変異体カプシドは、筋肉、脳、及び脊髄の1つ又は複数においてAAV8よりも高い効率を示した。特に、Mut5-#1704、Mut5-#3086及びMut5-#M258のルシフェラーゼ活性は、少なくとも1つの筋肉においてAAV8よりも有意に高かった。Mut5-#1704、Mut5-#3086及びMut5-#3142は、脊髄標的化においてAAV8よりも有意に効率的であった。対照的に、AAV2血清型のHVR5を有する変異体カプシドは、全ての試験された筋肉、脳及び脊髄においてAAV8と比較して向上を示さなかった(図7)。
これらの結果は、AAV13及びAAV2/13血清型は、合理的なシャッフリングを使用するAAV8のHVR5の置換のためのドナーカプシドとして使用され得ることを示唆する。
(実施例4)
野生型AAVからの異なるHVR5～8を有するAAV8からのハイブリッドカプシドの製造、インビトロ及びインビボ試験
実施例1における変異体4に類似して、野生型AAVカプシド中に天然に存在するHVR5、6、7及び8の組合せを含有する新たなAAV8変異体を設計する。ヒト肝臓において最近単離された野生型カプシド(La Bella Tら、Gut、2020、69、737～747頁.doi:10.1136/gutjnl-2019-318281)、AAV13(GenBank受託番号ABZ10812.1)、AAV2(GenBank受託番号YP_680426.1)を多重アライメントして、HVR5、6、7及び8の27個の独特の組合せの同定を可能とし、これらは、AAV13血清型からの1個(野生型AAV13)、AAV2血清型からの7個(野生型AAV2;#2497、#2102、#2087、#1449、#1343、#3013)及びAAV2/13血清型からの19個(#1704、#3086、#1024、#1591、#508、#3142、#2320、#1010、#985、#M258、#1570、#2806、#2731、#2112、#1602、#667、#129、#217、#767)を含む。新たなAAV変異体の特性を特徴付けるために15個の組合せをAAV8カプシドに含めた。
- 配列番号128のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-AAV13(配列番号58);
- 配列番号130のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-AAV2(配列番号59);
- 変異体4-AAV2/13血清型:
- 配列番号132のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-1704(配列番号60);
- 配列番号134のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-3086(配列番号61);
- 配列番号136のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-1024(配列番号62);
- 配列番号138のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-508(配列番号63);
- 配列番号140のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-3142(配列番号64);
- 配列番号142のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-2320(配列番号65);
- 配列番号144のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-1010(配列番号66);
- 配列番号146のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-M258(配列番号67);
- 配列番号148のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-1570(配列番号68);
- 配列番号150のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-1602(配列番号69);
- 配列番号152のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-667(配列番号70);
- 配列番号154のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-129(配列番号71);
- 配列番号156のポリヌクレオチドによりコードされる変異体4-767(配列番号72)。
変異体4(実施例1)は、カプシド#704(配列番号2)からのHVR5、HVR6、HVR7及びHVR8を含む。カプシド#704からのHVR5、HVR6、HVR7及びHVR8は、ハイブリッド血清型2/13の他の野生型カプシド(#2112、#1350、#668、#367、#1020、#1158、#2107(配列番号11～17)、#714(配列番号19)、#790、#976、#1286、#163、#685、#442(配列番号22～28))中に存在する。
組換えAAVベクターを、改変型Cap遺伝子をベクター製造のために好適なプラスミドにクローニングすることにより製造する。AAV2 ITRにより隣接され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する導入遺伝子発現カセットを、そのように派生されたAAVベクターにおいてカプシド被包させる。HEK293細胞の三重トランスフェクションを使用してベクターを製造し、続いて免疫アフィニティーカラム精製を行う。ベクターをインビトロで細胞株及び商用の供給元から得られた初代細胞において試験する。並行して、ベクターを野生型C57Bl6/Jマウスにおいて1×1011vg/マウスの用量での異なるベクターの静脈内注射を通じて試験する。注射後15日目に、動物を屠殺し、導入遺伝子の発現のレベルを単離された組織において測定する。変異体カプシドの血清有病率を実施例1に示されるようにELISAにより試験する。
AAV2/13血清型のHVR5～HVR8を有する変異体カプシドの大部分は、筋肉、脳、及び/又は脊髄においてAAV8よりも高い効率を示した。Mut4-AAV13及びmut4-#M258は、それぞれヒラメ筋及び脊髄においてAAV8よりも有意に高いルシフェラーゼ活性を示した。対照的に、AAV2血清型のHVR5を有する変異体カプシドは、全ての試験された筋肉及び脳においてAAV8と比較して向上を示さなかった(図8)。
これらの結果は、ドナーカプシドとしてAAV13又はAAV2/13血清型を用いたAAV8のHVR5～8の置換は、アクセプターカプシドの筋肉及び/又はCNS標的化を増強できることを示唆する。
(実施例5)
異なる参照カプシドにおける野生型HVR5の製造、インビトロ及びインビボ試験
#704のHVR5を、遺伝子療法において既に使用されている異なるAAV参照カプシド、AAV9(GenBank受託番号:AY530579.1)においてクローニングする。AAV9-R5-704(配列番号73)は配列番号158のポリヌクレオチドによりコードされる。
組換えAAVベクターを、改変型Cap遺伝子をベクター製造のために好適なプラスミドにクローニングすることにより製造する。AAV2 ITRにより隣接され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する導入遺伝子発現カセットを、そのように誘導されたAAVベクターにおいてカプシド被包させる。HEK293細胞の三重トランスフェクションを使用してベクターを製造し、続いて免疫アフィニティーカラム精製を行う。ベクターをインビトロで細胞株及び商用の供給元から得られた初代細胞において試験する。並行して、ベクターを野生型C57Bl6/Jマウスにおいて1×1011vg/マウスの用量での異なるベクターの静脈内注射を通じて試験する。注射後15日目に、動物を屠殺し、導入遺伝子の発現のレベルを単離された組織において測定する。変異体カプシドの血清有病率を実施例1に示されるようにELISAにより試験する。
変異体カプシドAAV9-R5-704は、筋肉、脳、及び脊髄においてAAV8よりも高い効率を示した(図9)。変異体カプシドAAV9-R5-704は、ドナーカプシド#704よりも有意に低い及びアクセプターカプシドAAV9と同等の血清有病率を示した(図10)。
これらの結果は、合理的なシャッフリングを使用するHVR5の置換は、AAV9のような他のアクセプターカプシドの筋肉及び/又はCNS標的化を向上するための価値のある方法であることを示す。

Claims (28)

  1. 筋肉及び/又は中枢神経系に対する向上された親和性を有する組換えハイブリッドアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質の調製方法であって、
    a)異なるAAV血清型からの少なくとも2つの組換えAAVカプシドタンパク質、アクセプターAAVカプシドタンパク質及び少なくとも1つのドナーAAVカプシドタンパク質を提供する工程であって、ドナーAAVカプシド血清型がAAV13又はハイブリッドAAV2/13である、前記工程;
    b)前記アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR1～HVR10及びHVR12配列から選択される少なくとも1つの超可変領域(HVR)配列を、ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換えて、少なくとも親アクセプターAAVカプシドタンパク質と比較して筋肉及び/又は中枢神経系に対する向上された親和性を有する組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質を得る工程
    を含む、方法。
  2. 前記アクセプターAAVカプシド血清型が低い血清有病率を有し、及び前記ドナーAAVカプシド血清型が、前記アクセプターAAVカプシド血清型よりも高い血清有病率を有する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記アクセプターAAVカプシド血清型が、AAV8、AAV9、AAV5、AAV-LK03、AAVrh74、AAV9.rh74、AAV9.rh74-P1及びAAVrh10からなる群から選択され、並びに/又は前記ドナーAAVカプシド血清型が、AAV13及び配列番号2～30の配列からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
  4. 前記アクセプターAAVカプシド血清型が、AAV8及びAAV9からなる群から選択され、並びに前記ドナーAAVカプシド血清型が、AAV13及び配列番号2～30の配列からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
  5. 前記ハイブリッドAAVカプシドタンパク質が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質の血清有病率と同等の血清有病率を有する、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ドナーAAVカプシドタンパク質及び/又はアクセプターAAVカプシドタンパク質の前記HVR配列が、134～165位のHVR1配列、176～192位のHVR2配列;259～278位のHVR3配列;379～395位のHVR4配列;446～484位のHVR5配列;490～500位のHVR6配列;501～512位のHVR7配列;514～529位のHVR8配列;531～570位のHVR9配列;576～613位のHVR10配列;及び705～736位のHVR12配列からなる群から選択され;指し示される位置が配列番号1とのアライメントにより決定される、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質の8個未満のHVR配列を、前記ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質の6個までのHVR配列を、前記ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む、請求項7に記載の方法。
  9. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質の4個までのHVR配列を、前記ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む、請求項7に記載の方法。
  10. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質の少なくともHVR5配列を、前記ドナーAAVカプシドタンパク質からの異なるHVR5配列で置き換える工程を含む、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ドナーAAVカプシドタンパク質からの前記HVR5配列が、配列番号175～186からなる群から選択される配列を含む、請求項10に記載の方法。
  12. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5配列を単独で又はHVR6、HVR7、HVR8、HVR9及びHVR10の1つ若しくは複数若しくは全てと組み合わせて置き換える工程を含む、請求項10又は11に記載の方法。
  13. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5配列を単独で又はHVR6、HVR7及びHVR8の1つ若しくは複数若しくは全てと組み合わせて置き換える工程を含む、請求項10～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5～HVR10配列の全てを、前記ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む、請求項12又は13に記載の方法。
  15. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR5～HVR8配列の全てを、前記ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む、請求項12又は13に記載の方法。
  16. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR1～HVR10及びHVR12配列のいずれか1つを、前記ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の方法。
  17. 工程b)が、前記アクセプターAAVカプシドタンパク質のHVR3、HVR5、HVR9、HVR10又はHVR12配列のいずれか1つを、前記ドナーAAVカプシドタンパク質の対応するHVRからの異なるHVR配列で置き換える工程を含む、請求項16に記載の方法。
  18. 請求項1～17のいずれか一項に記載の方法により得られ得る、向上された親和性を有する組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質。
  19. 配列番号33～43、45、47～58及び60～73の配列並びに前記配列と少なくとも85%の同一性を有するバリアント配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに前記バリアント配列が、ドナーAAVカプシドタンパク質からの少なくともHVR配列中又は全てのHVR配列中に変異を有しない、請求項18に記載の組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質。
  20. 請求項18又は19に記載の組換えハイブリッドAAVカプシドタンパク質を発現可能な形態でコードし、最終的に、AAVレプリカーゼタンパク質を発現可能な形態で更にコードするポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミド。
  21. 配列番号78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、102、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156及び158のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項20に記載の組換えプラスミド。
  22. 請求項20又は21に記載の組換えプラスミドで安定して形質転換された細胞。
  23. 少なくとも1つの請求項18又は19に記載のハイブリッド組換えAAVカプシドタンパク質を含む、目的の遺伝子をパッケージングしたAAVベクター粒子。
  24. 前記目的の遺伝子が、治療用遺伝子;治療用タンパク質又はペプチド、例えば治療用抗体又は抗体断片及びゲノム編集酵素をコードする遺伝子;並びに治療用RNA、例えば干渉RNA、ゲノム編集用のガイドRNA及びエクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項23に記載のAAVベクター粒子。
  25. 治療有効量の請求項23若しくは24に記載のAAVベクター粒子又は前記AAVベクター粒子により安定して形質導入された細胞を含む、医薬組成物。
  26. 医薬としての、請求項23～25のいずれか一項に記載のrAAVベクター粒子、細胞、医薬組成物。
  27. 筋肉及び/又は中枢神経系疾患の処置における使用のための、請求項23～25のいずれか一項に記載のrAAVベクター粒子、細胞、医薬組成物。
  28. 前記疾患が神経筋遺伝子疾患である、請求項27に記載のrAAVベクター粒子、細胞、医薬組成物。
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