JP7371954B2 - ヒト肝臓への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン - Google Patents
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Description
本発明は、血清中の中和抗体の影響を受けにくい組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus: rAAV）ベクターに関する。より詳細には、本発明は、生体の血清中の中和抗体との交差反応性が低減しており、生体（例えば、ヒト）の肝臓に、より高効率の遺伝子導入を可能とする変異型rAAVに関する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)を応用した遺伝子導入用ベクターは、神経細胞、肝細胞（肝実質細胞）、網膜細胞、筋肉細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞などの体内の細胞に遺伝子を導入し、長期間発現させることができる（特許文献１～３）。そのため、血友病、網膜色素変性症、パーキンソン病などの遺伝子治療用ベクターとして臨床応用が進んでいる(非特許文献１、２)。さらに、最近では遺伝子編集におけるsgRNAとCAS9蛋白質の遺伝子を導入するためのベクターとして頻用されている(特許文献３、非特許文献３)。血友病に対しては、第VIII因子またはIX因子を発現するAAVベクターを肝細胞に導入する遺伝子治療で有望な結果が報告されている(特許文献４、非特許文献４、５)。
しかし、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAV3やAAV8は、成人の60％以上が持つAAV2に対する中和抗体に交差反応するため、多くの患者で十分な効果が期待できないことが報告されている(非特許文献６～９)。また、中和抗体を持つため遺伝子治療の対象外であった患者に遺伝子治療を行うこと、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得られなかった患者に再度遺伝子治療を行うこと等が進められている。
Dunber CE, et al., Science 359: eaan4672, 2018.
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そこで、AAV2等に対する血清中の中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3やAAV8に由来する新規のAAVベクターが求められている。
上記の課題を解決するために、本発明者らは、様々な試行錯誤の上、AAVの外被蛋白質（キャプシド）の一部のアミノ酸を改変することによって、血清中の中和抗体に対する交差反応性が低減した、従来にはない新型の改変型AAVベクターを創出した。さらに、この改変ベクターを用いる場合に、培養ヒト肝臓由来細胞に対してより高効率に遺伝子導入可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、血清中の中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えば肝細胞を標的とする遺伝子治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクター、それを含む医薬組成物など、以下に例示される発明を提供する。
［１］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、血清中に存在する２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随伴ウイルスベクター。
［２］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［３］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［４］ 前記キャプシドタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［５］ 前記中和抗体が、AAV3またはAAV8とは異なる型のアデノ随伴ウイルスに対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［６］ 前記中和抗体が、AAV2に対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［７］ 肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBP）のプロモーター、アルブミン、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモーター、および配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と90％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含み、肝臓特異的なプロモーターとして機能する、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ａ］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列と作動可能に結合された治療用遺伝子を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ｂ］ 前記治療用遺伝子が、血液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝細胞増殖因子（HGF）、または肝細胞増殖因子受容体（c-Kit）をコードする、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［９］配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベクター。
［１０］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列
のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
［１０ａ］ 配列番号６～８のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、上記［９］のポリヌクレオチド。
［１１］ 上記［１］～［９］のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含む、生体の肝臓への遺伝子導入のための医薬組成物。
［１２］ 前記生体がヒトである、上記［１１］に記載の医薬組成物。
［１］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、血清中に存在する２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随伴ウイルスベクター。
［２］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［３］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［４］ 前記キャプシドタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［５］ 前記中和抗体が、AAV3またはAAV8とは異なる型のアデノ随伴ウイルスに対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［６］ 前記中和抗体が、AAV2に対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［７］ 肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBP）のプロモーター、アルブミン、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモーター、および配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と90％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含み、肝臓特異的なプロモーターとして機能する、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ａ］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列と作動可能に結合された治療用遺伝子を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ｂ］ 前記治療用遺伝子が、血液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝細胞増殖因子（HGF）、または肝細胞増殖因子受容体（c-Kit）をコードする、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［９］配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベクター。
［１０］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列
のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
［１０ａ］ 配列番号６～８のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、上記［９］のポリヌクレオチド。
［１１］ 上記［１］～［９］のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含む、生体の肝臓への遺伝子導入のための医薬組成物。
［１２］ 前記生体がヒトである、上記［１１］に記載の医薬組成物。
本発明は、AAV2等に対する中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3やAAV8に由来するAAVベクターを提供する。さらに、本発明に係るAAVベクターを用いることにより、元々、中和抗体を持つため遺伝子治療の対象外であった患者への遺伝治療や、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得られなかった患者に再度遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のAAVベクターを用いることにより、特に肝細胞への遺伝子導入を向上させることができる。
本発明は、肝臓の細胞への遺伝子導入の効率を向上させる組換えアデノ随伴ウイルスベクター、そのベクターを含む医薬組成物などを提供する。
１．本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルスベクターについて
１．１．アデノ随伴ウイルスについて
アデノ随伴ウイルスは、公知の多数の血液型のウイルスを含む。肝細胞（肝実質細胞）に対して指向性を示すアデノ随伴ウイルスとしては、例えば、２型、３型（３Ａ及び３Ｂ）、８型の血液型のウイルスが挙げられる。本発明において、生体の肝細胞に送達するためのベクターとしては、例えば、特許文献１（WO 2008/124724）に記載される種々のアデノ随伴ウイルスベクターを用いることができる。
１．１．アデノ随伴ウイルスについて
アデノ随伴ウイルスは、公知の多数の血液型のウイルスを含む。肝細胞（肝実質細胞）に対して指向性を示すアデノ随伴ウイルスとしては、例えば、２型、３型（３Ａ及び３Ｂ）、８型の血液型のウイルスが挙げられる。本発明において、生体の肝細胞に送達するためのベクターとしては、例えば、特許文献１（WO 2008/124724）に記載される種々のアデノ随伴ウイルスベクターを用いることができる。
天然のアデノ随伴ウイルスは非病原性ウイルスである。この特徴を利用して、所望の遺伝子を保持する種々の組換ウイルスベクターが作製されて、遺伝子治療のために利用されている（例えば、WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、薬学雑誌 126(11)1021-1028などを参照のこと）。野生型AAVゲノムは、全長が約５kbのヌクレオチド長を有する一本鎖DNA分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。AAVゲノムは、一般に、ゲノムの５'側および３'側の両末端に約145ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート（ITR）配列を有する。このITRは、AAVゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている（例えば、上記の文献である薬学雑誌 126(11)1021-1028などを参照のこと）。ITRに挟まれた野生型AAVゲノムの内部領域（以下、内部領域）は、AAV複製（rep）遺伝子及びキャプシド（cap）遺伝子を含む。これらrep遺伝子及びcap遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質(Rep)、及び正20面体構造の外殻であるウイルス粒子を形成するキャプシドタンパク質（例えば、VP1、VP2及びVP3の少なくとも１つ）をコードする。さらなる詳細については、例えば、Human Gene Therapy, 13, pp.345-354, 2002、Neuronal Development 45, pp.92-103, 2001、実験医学 20,pp.1296-1300, 2002、薬学雑誌 126(11)1021-1028、Hum Gene Ther,16,541-550, 2005などを参照のこと。
本発明のrAAVベクターは、天然のアデノ随伴ウイルス１型（AAV1）、２型（AAV2）、３型（AAV3A/AAV3B）、４型（AAV4）、５型（AAV5）、６型（AAV6）、７型（AAV7）、８型（AAV8）、９型（AAV9）、１０型（AAV10）、ＲＨ１０型（AVVrh10；Hu,C.ら、Molecular Therapy vol. 22 no. 10 oct. 2014, 1792-1802）に由来するベクターであるが、これに限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、GenBank登録番号：AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729(AAV3)、NC_001829.1（AAV4）、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7）、NC_006261.1（AAV8）、AY530579（AAV9）、AY631965.1(AAV10)のヌクレオチド配列を参照できる。
本発明において、特に肝細胞への指向性のために、AAV2、AAV3B（AF028705.1）、AAV8、またはAAV9に由来するキャプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3など）を利用することが好ましい。これら各キャプシドタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、各AAVに対応する上記のGenBank登録番号に登録された配列を参照できる。
本発明において、特に肝細胞への指向性のために、AAV2、AAV3B（AF028705.1）、AAV8、またはAAV9に由来するキャプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3など）を利用することが好ましい。これら各キャプシドタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、各AAVに対応する上記のGenBank登録番号に登録された配列を参照できる。
１．２．本発明に係るキャプシドタンパク質について
本発明に用いるrAAVベクターは、変異されたキャプシドタンパク質を含む。このような変異体キャプシドタンパク質としては、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが他のアミノ酸で置換され、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、キャプシドタンパク質として機能できる変異体タンパク質を含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合わせを同時に含んでもよい。
また、本発明に用いるrAAVベクターは、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリンが、587番目のセリン及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、好ましくはアラニンで置換された配列（例えば配列番号４のアミノ酸配列）であって、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含む。
上記のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加の数としては、例えば、1～50個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個または１個の数が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。
本発明に用いるrAAVベクターの変異体キャプシドタンパク質は、好ましくは、上記配列番号２～４のいずれかのアミノ酸配列に対して約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキャプシドタンパク質として機能できるタンパク質であり得る。
本発明においてキャプシドタンパク質として機能するとは、標的細胞に対する感染能を有するウイルスベクターを形成可能であるタンパク質を指す。本発明に用いるキャプシドタンパク質は、単独で又は他のキャプシドタンパク質メンバー（例えば、VP2、VP3など）と一緒になってウイルスベクターを形成できる。当該ウイルスベクター内には、標的細胞、例えば肝臓細胞に送達されるための目的の治療用遺伝子などを含むポリヌクレオチドがパッケージングされる。
好ましくは、変異体キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと同等の感染能を有するものであり、具体的には、野生型のウイルスゲノム重量当たりの感染能と比較して、好ましくは50%、60%、70%、80％、85％、90%、91％、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上であることを意味する。感染能の測定には、当該分野において公知の方法、例えばレポーターアッセイを用いることができる。
本発明に用いるrAAVベクターは、変異されたキャプシドタンパク質を含む。このような変異体キャプシドタンパク質としては、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが他のアミノ酸で置換され、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、キャプシドタンパク質として機能できる変異体タンパク質を含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合わせを同時に含んでもよい。
また、本発明に用いるrAAVベクターは、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリンが、587番目のセリン及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、好ましくはアラニンで置換された配列（例えば配列番号４のアミノ酸配列）であって、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含む。
上記のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加の数としては、例えば、1～50個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個または１個の数が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。
本発明に用いるrAAVベクターの変異体キャプシドタンパク質は、好ましくは、上記配列番号２～４のいずれかのアミノ酸配列に対して約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキャプシドタンパク質として機能できるタンパク質であり得る。
本発明においてキャプシドタンパク質として機能するとは、標的細胞に対する感染能を有するウイルスベクターを形成可能であるタンパク質を指す。本発明に用いるキャプシドタンパク質は、単独で又は他のキャプシドタンパク質メンバー（例えば、VP2、VP3など）と一緒になってウイルスベクターを形成できる。当該ウイルスベクター内には、標的細胞、例えば肝臓細胞に送達されるための目的の治療用遺伝子などを含むポリヌクレオチドがパッケージングされる。
好ましくは、変異体キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと同等の感染能を有するものであり、具体的には、野生型のウイルスゲノム重量当たりの感染能と比較して、好ましくは50%、60%、70%、80％、85％、90%、91％、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上であることを意味する。感染能の測定には、当該分野において公知の方法、例えばレポーターアッセイを用いることができる。
本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
C群：アスパラギン、グルタミン；
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；
E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
F群：セリン、トレオニン、ホモセリン；
G群：フェニルアラニン、チロシン。
目的のアミノ酸残基置換を含むタンパク質は、通常の遺伝子操作技術、化学合成など、当業者に公知の手法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2012、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-2018(ISSN:1934-3647等)などを参照することができる。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
C群：アスパラギン、グルタミン；
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；
E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
F群：セリン、トレオニン、ホモセリン；
G群：フェニルアラニン、チロシン。
目的のアミノ酸残基置換を含むタンパク質は、通常の遺伝子操作技術、化学合成など、当業者に公知の手法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2012、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-2018(ISSN:1934-3647等)などを参照することができる。
本発明において用いられるrAAVウイルスベクターは、内包するゲノム中またはヘルパーウイルスのゲノム中に、複製のためのRepタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。そのようなRepタンパク質は、本発明のrAAVを複製させるために、ITR配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内に野生型AAVゲノム（又はrAAVゲノム）をパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能を、野生型と同程度に有する限り、好ましくは約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、60残基以下、50残基以下、40残基以下、30残基以下、20残基以下、15残基以下、10残基以下、又は5残基以下のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含んでいてもよい。ここで、野生型と同程度に有するとは、野生型に対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であることを意味する。本発明において、好ましくは、公知のAAV3由来のRepタンパク質、例えばAAV3A、AAV3BのRepタンパク質、あるいはこれらの融合タンパク質（配列番号８のアミノ酸配列）などが使用されるがこれらに限定されない。
本発明の１実施形態において、上記の野生型AAVゲノムの内部領域にコードされるキャプシドタンパク質VP1など（VP1、VP2および／またはVP3）、およびRepタンパク質は、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチドがAAVヘルパープラスミドに組込まれて、本発明のrAAVを得るために用いられる。本発明で用いるキャプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）、ならびにRepタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種またはそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのキャプシドタンパク質およびRepタンパク質のうちの1種以上がAAVゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、キャプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）およびRepタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、AAVヘルパープラスミドとして提供される。
１．３．ウイルスゲノムについて
（１）rAAVウイルスゲノムについて
本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）は、野生型ゲノムの5'側および3'側に位置するITRの間に位置する内部領域（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ゲノム編集手段、及び/又は修復用遺伝子）およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することにより作製できる。好ましくは、5'側および3'側に位置するITRは、それぞれAAVゲノムの5’末端および3’末端に位置する。好ましくは、本発明のrAAVゲノムにおいて、5’末端および3’末端に位置するITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8、またはAAV9のゲノムに含まれる5'側ITRおよび3'側ITRを含むが、これら特定のAAVに限定されない。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(flip and flop structure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転していてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチド（すなわち、ゲノム編集手段及び/又は修復用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全長である5kbと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。本発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーションなどを含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１～1.5kbと仮定する場合）を差し引くと、好ましくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb、さらに好ましく約0.01～2kbであるが、これに限定されない。さらに、公知のinternal ribosome entry site (IRES)配列、T2A配列等を介在させるなどの公知の手法を用いて、rAAVゲノムの全長が上記の範囲内である限り、二種類以上の治療用遺伝子を同時に組み込むことが可能である。本発明のrAAVが二種以上のタンパク質を発現する場合、各々のタンパク質をコードする遺伝子は、同じ方向に配置されても、異なる方向に配置されてもよい。
（１）rAAVウイルスゲノムについて
本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）は、野生型ゲノムの5'側および3'側に位置するITRの間に位置する内部領域（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ゲノム編集手段、及び/又は修復用遺伝子）およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することにより作製できる。好ましくは、5'側および3'側に位置するITRは、それぞれAAVゲノムの5’末端および3’末端に位置する。好ましくは、本発明のrAAVゲノムにおいて、5’末端および3’末端に位置するITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8、またはAAV9のゲノムに含まれる5'側ITRおよび3'側ITRを含むが、これら特定のAAVに限定されない。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(flip and flop structure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転していてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチド（すなわち、ゲノム編集手段及び/又は修復用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全長である5kbと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。本発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーションなどを含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１～1.5kbと仮定する場合）を差し引くと、好ましくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb、さらに好ましく約0.01～2kbであるが、これに限定されない。さらに、公知のinternal ribosome entry site (IRES)配列、T2A配列等を介在させるなどの公知の手法を用いて、rAAVゲノムの全長が上記の範囲内である限り、二種類以上の治療用遺伝子を同時に組み込むことが可能である。本発明のrAAVが二種以上のタンパク質を発現する場合、各々のタンパク質をコードする遺伝子は、同じ方向に配置されても、異なる方向に配置されてもよい。
一般的に、組換えアデノ随伴ウイルスベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドが一本鎖である場合、目的の遺伝子（治療用遺伝子など）は発現されるまでに時間（数日）を要し得る。この場合、導入される目的の遺伝子を自己相補性（self-complementary：sc)型となるように設計して、発現までの時間をより短くできる。具体的には、例えば、Foust K.D.ら(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59-65)などに記載されている。本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチドは、非sc型であってもよいしsc型であってもよい。好ましくは、本発明のrAAVベクター中にパッケージングされているポリヌクレオチドは非sc型である。
本発明に用いるキャプシドタンパク質は、例えば、宿主細胞におけるコドン優先度に基づき適宜改変されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明に用いられる好ましいキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２～４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～50個、1～40個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号２～４のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２～４のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みキャプシドタンパク質として機能する（キャプソメアを形成可能である）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合わせを同時に含んでもよい。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。また、本願発明において好ましいポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２～４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであって、配列番号２～４のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２～４のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2012）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、対照のポリヌクレオチド配列と比較して、例えば、70%以上、80%以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性または相同性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990； Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばExpect threshold＝100、Word size＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばExpect threshold＝50、Word size＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、好ましくは各プログラムのデフォルトパラメーターを用いるが、これらパラメーターは当業者に公知の範囲内で適宜変更されてもよい。
２．中和抗体の交差反応性について
本発明に係るアデノ随伴ウイルスベクターは、血清中に存在する２型AAV（AAV2）または８型AAV（AAV8）に対する中和抗体と交差反応しないものである。
本発明において、中和抗体とは、ある抗原が生体に対して毒性や感染力などの活性をもつとき、その抗原に結合して活性を減退または消失させる抗体を指す。本発明において、抗体の活性に関する文脈において「中和」とは、例えば血清中の抗アデノ随伴ウイルス中和抗体（例えば、IgG、IgM、IgA）が、抗原であるAAVベクターと結合した結果、そのAAVベクターの遺伝子導入能力を低下または喪失させることをいう。この中和反応は、抗原（例えばAAVベクター）と抗体との結合、抗体のFc部分と補体第１成分（C1）との結合などの一連の補体反応等を含み、結果的にそのAAVベクターは標的細胞への感染能（遺伝子導入能）を低下または喪失する。また、本発明において、中和抗体は、血清成分を伴うこと、すなわち補体などの抗体と結合して抗原の不活性化や除去などの中和反応に直接的に関係する成分も含むことが意図される。
本発明に係るアデノ随伴ウイルスベクターは、血清中に存在する２型AAV（AAV2）または８型AAV（AAV8）に対する中和抗体と交差反応しないものである。
本発明において、中和抗体とは、ある抗原が生体に対して毒性や感染力などの活性をもつとき、その抗原に結合して活性を減退または消失させる抗体を指す。本発明において、抗体の活性に関する文脈において「中和」とは、例えば血清中の抗アデノ随伴ウイルス中和抗体（例えば、IgG、IgM、IgA）が、抗原であるAAVベクターと結合した結果、そのAAVベクターの遺伝子導入能力を低下または喪失させることをいう。この中和反応は、抗原（例えばAAVベクター）と抗体との結合、抗体のFc部分と補体第１成分（C1）との結合などの一連の補体反応等を含み、結果的にそのAAVベクターは標的細胞への感染能（遺伝子導入能）を低下または喪失する。また、本発明において、中和抗体は、血清成分を伴うこと、すなわち補体などの抗体と結合して抗原の不活性化や除去などの中和反応に直接的に関係する成分も含むことが意図される。
本発明において、中和抗体の交差反応とは、中和抗体が、本来の標的抗原（例えば、AAV2）とは異なる標的物質（例えば、AAV3）と結合する反応を指す。また、本発明において「中和抗体と交差反応しない」とは、中和抗体が本来の標的抗原ではない標的物質との結合反応において、十分には機能しないこと、好ましくは検出可能には結合しないことを指すが、または検出可能であっても本来の標的抗原と比較する場合に標的物質の結合量（モル比または質量比）が有意に低減されることを指す。このような低減される標的物質の量としては、本来の標的抗原の結合量と比較して、数％（約5％）、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％の結合量が挙げられる。この割合は、抗体に結合したタンパク質量を測定する方法などの公知の方法を用いて取得できる。あるいは、中和抗体の交差反応は、組換えウイルス内にコードされるタンパク質（レポーター遺伝子など）を用いて間接的に測定して比較することもできる。
本発明に係る中和抗体は、好ましくは哺乳動物由来ものであり、より好ましくは霊長類由来のもの、最も好ましくはヒト由来のものである。本発明に用いる中和抗体は、特に記載されない場合、AAV2に対する中和抗体である。通常、ヒトはAAV2に対する抗体を所持している可能性が高いが、その大部分は中和能力を有する抗体ではなく、中和能力を有するものは18～32％との報告もある（Chirmule N. et al., Gene Ther 6: 1574-1583, 1999；Moskalenko M, et al., J Virol 74: 1761-1766, 2000）。さらに、AAV2に対する中和抗体を含むヒト血清の多くは、AAV3AやAAV3Bに対する中和抗体を含むことが公知である（Fu Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;13:341-346）。このことはAAV2のVP1タンパク質（配列番号１）とAAV3AまたはAAV3BのVP1タンパク質（配列番号２または３）とのアミノ酸同一性が比較的高いこと（具体的には約87～88％）によっても示唆される。
さらに、本発明に用いる中和抗体は、複数のアイソタイプ（例えば、IgG、IgM、IgAなど）を含み得る。したがって、本発明に係るAAV2に対する中和抗体は、事前に抗体濃度もしくは抗体力価などの性能について検証する必要がある。そのような検証手段は公知であり、例えば、Itoらの文献（Ito et al., Ann Clin Biochem 46: 508-510, 2009）に記載される手段を用いることができる。具体的には、中和抗体の力価（抗体価）を、HEK293細胞に対してβガラクトシダーゼのレポーター遺伝子を含むAAV2ベクターを導入する場合の阻害能力を評価することによって分析することが記載されている（Ito et al.,メソッド）。
さらに、本発明に用いる中和抗体は、複数のアイソタイプ（例えば、IgG、IgM、IgAなど）を含み得る。したがって、本発明に係るAAV2に対する中和抗体は、事前に抗体濃度もしくは抗体力価などの性能について検証する必要がある。そのような検証手段は公知であり、例えば、Itoらの文献（Ito et al., Ann Clin Biochem 46: 508-510, 2009）に記載される手段を用いることができる。具体的には、中和抗体の力価（抗体価）を、HEK293細胞に対してβガラクトシダーゼのレポーター遺伝子を含むAAV2ベクターを導入する場合の阻害能力を評価することによって分析することが記載されている（Ito et al.,メソッド）。
本発明に用いる中和抗体は、抗体価が4～640であり、好ましくは20～640、40～320、より好ましくは40～160である（Ito et al., Ann Clin Biochem, 46: 508-510, 2009）。本発明における抗体価の具体的な測定方法については、実施例中の「(e) 血清中のAAV2中和抗体の抗体価の測定」、「(3) AAV2中和抗体の抗体価の測定」の記載ならびに図５Ａ及び５Ｂ等を参照のこと。
また、中和抗体の交差反応性を確認するためのアッセイ方法の具体的な手順として、Li C, et al., Gene Ther 19: 288-294, 2012、Meliani A, et al., Hum Gene Ther Methos 26:45-53, 2015などの文献に記載の方法を用いることができる。
また、中和抗体の交差反応性を確認するためのアッセイ方法の具体的な手順として、Li C, et al., Gene Ther 19: 288-294, 2012、Meliani A, et al., Hum Gene Ther Methos 26:45-53, 2015などの文献に記載の方法を用いることができる。
本願発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、野生型のものと比較して、血清中の中和抗体の影響を受けにくいものである。具体的には、本発明のウイルスベクター（例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、血清中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を少なくとも60%、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、さらに好ましくは80％以上、85%以上、90%以上、95%以上維持するものである。ここで、遺伝子導入能力の比較には、例えばレポーターアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、ラジオアイソトープ標識などの公知のアッセイを利用することができる。一方、野生型のウイルスベクター（例えば、配列番号２または３のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、同様に血清中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を約60％未満、約50%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満保持し得る。
あるいは、本発明のウイルスベクターは、野生型のウイルスベクターと比較して、血清中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に対して1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは1.75倍以上、さらに好ましくは2倍以上の量の遺伝子を導入できるものである。
あるいは、本発明のウイルスベクターは、野生型のウイルスベクターと比較して、血清中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に対して1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは1.75倍以上、さらに好ましくは2倍以上の量の遺伝子を導入できるものである。
本発明において、AAV2中和抗体は、交差反応によってAAV3に対しても中和活性を有し得る。また、AAV2中和抗体を含む血清は、他の血液型のAAVに対しても交差反応性を有し得る（Fu Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;13:341-346, Mimuro J, et al., J Med Virol 86: 1990-1997, 2014.）。ここで、AAV2のキャプシドタンパク質VP1とAAV3A VP1との間のアミノ酸配列の同一性は87％、AAV2 VP1とAAV3B VP1との同一性は88％と計算される（これら同一性はBlastpのウェブサイト（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を利用して得た結果）。さらに、抗AAV2中和抗体のエピトープマッピングに関する研究が、Moskalenko, M.ら（J Virol 74: 1761-1766, 2000）に記載されている。
また、AAVの細胞への感染に関する細胞外レセプターとして、以下のものが知られている（Summerfold et al., Mol Ther 24: 2016；Pillay et al., Nature 530:108-112, 2016）。
一次レセプター
AAV2、3、6：ヘパラン硫酸プロテオグリカン
AAV9：N末端ガラクトース
AAV1、4、5、6：特定のN連結型またはO連結型シアル酸部分
二次レセプター
AAV2：線維芽細胞増殖因子レセプター及びインテグリン
AAV2、3：肝細胞増殖因子レセプター（c-Met）
AAV5：血小板由来増殖因子（これはシアル酸によって修飾され得る）
本出願の開示内容と上記の受容体に関する知見に基づいて、本発明に係る組換えウイルスベクターに基づいて、AAV2等に対する生体の中和抗体による阻害をより一層受けにくい組換えベクターを設計、スクリーニング、取得することも考えられる。
また、AAVの細胞への感染に関する細胞外レセプターとして、以下のものが知られている（Summerfold et al., Mol Ther 24: 2016；Pillay et al., Nature 530:108-112, 2016）。
一次レセプター
AAV2、3、6：ヘパラン硫酸プロテオグリカン
AAV9：N末端ガラクトース
AAV1、4、5、6：特定のN連結型またはO連結型シアル酸部分
二次レセプター
AAV2：線維芽細胞増殖因子レセプター及びインテグリン
AAV2、3：肝細胞増殖因子レセプター（c-Met）
AAV5：血小板由来増殖因子（これはシアル酸によって修飾され得る）
本出願の開示内容と上記の受容体に関する知見に基づいて、本発明に係る組換えウイルスベクターに基づいて、AAV2等に対する生体の中和抗体による阻害をより一層受けにくい組換えベクターを設計、スクリーニング、取得することも考えられる。
３．本発明のウイルスベクターが含む遺伝子について
１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的なプロモーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む（すなわち、そのようなポリヌクレオチドがパッケージングされている）。本発明に用いるプロモーター配列としては、肝臓中の細胞に特異的なプロモーター配列、例えば、肝実質細胞、肝非実質細胞（星状細胞等）などに特異的なプロモーター配列を用いることができる。このようなプロモーター配列としては、具体的には、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBPなど）のプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター（Ran FA, et al., Nature 520(7546):186-91, 2015）、その他の肝臓特異的タンパク質（アルブミンなど）のプロモーター、これらプロモーターを組み合わせた合成プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、これらのプロモーターはさらに、公知のエンハンサー配列、好ましくは肝臓特異的なエンハンサー配列と組み合わせることができる。このようなエンハンサー配列としては、ApoEエンハンサー配列などが挙げられる。これらプロモーター配列およびエンハンサー配列は、単独または任意の複数を組み合わせて用いることができる。さらにまた、上記の肝臓特異的なプロモーター及びエンハンサーを利用した合成プロモーターを用いることもできる。本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的、より好ましくは肝細胞（肝実質細胞）特異的なApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、TBGプロモーター、または公知のHCRhAAT合成プロモーターの配列を含み得る。
１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的なプロモーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む（すなわち、そのようなポリヌクレオチドがパッケージングされている）。本発明に用いるプロモーター配列としては、肝臓中の細胞に特異的なプロモーター配列、例えば、肝実質細胞、肝非実質細胞（星状細胞等）などに特異的なプロモーター配列を用いることができる。このようなプロモーター配列としては、具体的には、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBPなど）のプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター（Ran FA, et al., Nature 520(7546):186-91, 2015）、その他の肝臓特異的タンパク質（アルブミンなど）のプロモーター、これらプロモーターを組み合わせた合成プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、これらのプロモーターはさらに、公知のエンハンサー配列、好ましくは肝臓特異的なエンハンサー配列と組み合わせることができる。このようなエンハンサー配列としては、ApoEエンハンサー配列などが挙げられる。これらプロモーター配列およびエンハンサー配列は、単独または任意の複数を組み合わせて用いることができる。さらにまた、上記の肝臓特異的なプロモーター及びエンハンサーを利用した合成プロモーターを用いることもできる。本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的、より好ましくは肝細胞（肝実質細胞）特異的なApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、TBGプロモーター、または公知のHCRhAAT合成プロモーターの配列を含み得る。
また、本発明において用いる肝臓特異的なプロモーター配列は、上記のプロモーターのポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～100個、1～50個、1～40個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、肝臓特異的なプロモーター配列として機能し得るものを用いることもできる。本明細書中、肝臓特異的なプロモーター配列として機能し得ることは、例えば、肝臓由来の細胞と肝臓に由来しない細胞とをレポーターアッセイにおいて比較した場合、肝臓に由来しない細胞では、検出の閾値程度のレポーターを発現するか、または肝臓由来の細胞と比較して約25％以下、約20％以下、約15％以下、約10％以下もしくはそれ以下のレポーターを発現することをいう。また、上記の欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドは、元のプロモーター配列に対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であることを意味する。上記の変異の数は少ないほど好ましい。
本発明のAAVベクターを用いる治療対象となる疾患として、肝細胞のゲノム障害と関連する血友病、急性間欠性ポルフィリア症、オルニチントランスコバラミン欠損症、Wilson病、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症などが挙げられる。例えば、血友病は、血友病Ａが血液凝固VIII因子（FVIIIともいう）の欠乏や異常に起因し、血友病Ｂが血液凝固IX因子（FIXともいう）の欠乏や異常に起因するので、血液凝固VIII因子またはIX因子を遺伝子治療によって補充する方針を検討できる。
上記の治療を行うために、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、様々な治療用遺伝子を含み得る。そのような治療用遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、血液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝細胞増殖因子（HGF）、肝細胞増殖因子受容体（c-Kit）などのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明に用いる治療用遺伝子は、標的の機能を阻害するための遺伝子（アンチセンスヌクレオチド、CAS9等）であってもよい。そのような遺伝子としては、例えば、トロンビン、プロテインＣ、またはプロテインＳをコードする遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いる場合、アンチセンスヌクレオチドとは、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるためのポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させるためのポリヌクレオチドを指す。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)、sgRNAが挙げられるが、これらに限定されない。二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。さらに、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、１種以上の治療用遺伝子を含んでもよい。
上記の治療を行うために、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、様々な治療用遺伝子を含み得る。そのような治療用遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、血液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝細胞増殖因子（HGF）、肝細胞増殖因子受容体（c-Kit）などのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明に用いる治療用遺伝子は、標的の機能を阻害するための遺伝子（アンチセンスヌクレオチド、CAS9等）であってもよい。そのような遺伝子としては、例えば、トロンビン、プロテインＣ、またはプロテインＳをコードする遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いる場合、アンチセンスヌクレオチドとは、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるためのポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させるためのポリヌクレオチドを指す。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)、sgRNAが挙げられるが、これらに限定されない。二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。さらに、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、１種以上の治療用遺伝子を含んでもよい。
４．医薬組成物について
本発明のさらなる実施形態において、本発明のrAAVベクター（rAAVビリオン）を含む医薬組成物が提供される。本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物という）を利用することによって、被検体の肝臓の細胞に高い効率で治療用遺伝子を導入可能であり、導入される治療用遺伝子が発現することによって目的の疾患を治療できる医薬組成物を提供する。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のようなゲノム編集手段、ゲノム修復手段などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のさらなる実施形態において、本発明のrAAVベクター（rAAVビリオン）を含む医薬組成物が提供される。本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物という）を利用することによって、被検体の肝臓の細胞に高い効率で治療用遺伝子を導入可能であり、導入される治療用遺伝子が発現することによって目的の疾患を治療できる医薬組成物を提供する。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のようなゲノム編集手段、ゲノム修復手段などが挙げられるが、これらに限定されない。
１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは肝臓の細胞に特異的なプロモーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された遺伝子を含む。本発明のrAAVベクターは、血友病などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができ、それら遺伝子を、肝臓の細胞、好ましくは肝実質細胞に組込むことができる。
本発明の医薬組成物を使用する場合、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などで投与することができるが、非経口的に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～99.9重量％含有することができる。
本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、力価が105～1016 vg/mL（900 fg/mL～90 mg/mL）、力価が10６～1015 vg/mL（9.0 pg/mL～9.0 mg/mL）、力価107～1014 vg/mL（90 pg/mL～900 μg/mL）、力価108～1013 vg/mL（900 pg/mL～90 μg/mL）、力価109～1012 vg/mL（9 ng/mL～9 μg/mL）、力価1010～1011 vg/mL（90 ng/mL～900 ng/mL）の量を含有することができる。また、製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤等を用いることができる。
非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等が挙げられる。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日当たり1～5000 mg、好ましくは10～1000 mgであるが、これらに限定されない。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてvg（vector genome）を利用する場合、例えば、体重1kgあたり、106～1014 vg、好ましくは108～1013 vg、さらに好ましくは109～1012 vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。
５．本発明のウイルスベクターの投与
本発明のウイルスベクターは、好ましくは、対象に末梢投与によってより安全かつ容易に投与される。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。
本発明のウイルスベクターは、好ましくは、対象に末梢投与によってより安全かつ容易に投与される。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。
本発明のウイルスベクターは、対象に投与されて、肝臓の細胞に感染し、感染した細胞においてウイルスによって送達された上記のゲノム編集手段を提供し、ゲノム編集をもたらすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、肝実質細胞に感染してゲノム編集をもたらすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、投与された対象の肝臓の肝実質細胞のうちゲノム編集を受ける細胞の割合が、好ましくは、70%以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上、または100％である。
６．本発明のrAAVベクターの調製キット
本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、(a)キャプシドタンパク質VP1等を発現するための第１のポリヌクレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号：のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺伝子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。
本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、(a)キャプシドタンパク質VP1等を発現するための第１のポリヌクレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号：のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺伝子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。
本発明のrAAVビリオンを作製するためのキットは、本明細書中に記載されるいずれの構成（例えば、AdVヘルパーなど）もさらに含むことができる。本発明のキットはまた、本発明のキットを使用してrAAVビリオンを作製するためのプロトコルを記載した指示書もさらに含み得る。
７．本明細書中のその他の用語について
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスベクター」、「ウイルスビリオン」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。また、「アデノ随伴ウイルスベクター」は、遺伝子組換えを含むアデノ随伴ウイルスを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチドは各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、rAAVゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。また、本明細書中、文脈より明らかな場合、組換えを表す「r」は省略されることもある。
特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、rAAVゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。また、本明細書中、文脈より明らかな場合、組換えを表す「r」は省略されることもある。
本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、本明細書において、用語「rAAVベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、rAAVベクターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明において使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
本明細書中において使用される場合、用語「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプシドで包むこと（encapsidation）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立てられ、培養物中に分泌される。
本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。
A. 材料及び方法
(a) AAVベクター
６種類のAAVベクター（AAV2、AAV3B、AAVGT5、AAV8、SPARK100、AAVhu37）を使用した。
AAVGT5は、AAV3Aおよび3Bの外被蛋白VP1の3か所のアミノ酸置換、すなわち472番目のセリン(S)をアラニン(A)に、587番目のセリン(S)をアラニン(A)に、706番目のアスパラギン(N)をアラニン(A)に置換したアミノ酸配列を含む。
いずれのAAVベクターも、cytomegalovirus promoter (CMV)プロモーター、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、AAV3Aのinverted terminal repeats (ITR)の間に挿入した。AAV2ベクターでは、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNAの代わりに、β-GalactosidaseをコードするLacZ配列を挿入した発現カセットも使用し、それぞれAAV2-CMV-AcGFPとAAV2-CMV-LacZベクターを作製した。
AAV2: GenBank Accession # NC_001401.2（全ゲノム配列）
（AAV2 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。）
AAV3A: GenBank Accession # U48704（ゲノム配列）
（AAV3A キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。）
AAV3B: GenBank Accession # AF028705.1（ゲノム配列）
（AAV3B キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。）
AAVGT5:（本出願において作製したもの）
（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。）
AAV8: GenBank Accession # NC_006261（ゲノム配列） （AAV8 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。）
SPARK100: （SPARK100 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：９に示す。）
AAVhu37: GenBank Accession # AY530600.1（ゲノム配列）
（AAVhu37 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。）
(a) AAVベクター
６種類のAAVベクター（AAV2、AAV3B、AAVGT5、AAV8、SPARK100、AAVhu37）を使用した。
AAVGT5は、AAV3Aおよび3Bの外被蛋白VP1の3か所のアミノ酸置換、すなわち472番目のセリン(S)をアラニン(A)に、587番目のセリン(S)をアラニン(A)に、706番目のアスパラギン(N)をアラニン(A)に置換したアミノ酸配列を含む。
いずれのAAVベクターも、cytomegalovirus promoter (CMV)プロモーター、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、AAV3Aのinverted terminal repeats (ITR)の間に挿入した。AAV2ベクターでは、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNAの代わりに、β-GalactosidaseをコードするLacZ配列を挿入した発現カセットも使用し、それぞれAAV2-CMV-AcGFPとAAV2-CMV-LacZベクターを作製した。
AAV2: GenBank Accession # NC_001401.2（全ゲノム配列）
（AAV2 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。）
AAV3A: GenBank Accession # U48704（ゲノム配列）
（AAV3A キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。）
AAV3B: GenBank Accession # AF028705.1（ゲノム配列）
（AAV3B キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。）
AAVGT5:（本出願において作製したもの）
（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。）
AAV8: GenBank Accession # NC_006261（ゲノム配列） （AAV8 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。）
SPARK100: （SPARK100 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：９に示す。）
AAVhu37: GenBank Accession # AY530600.1（ゲノム配列）
（AAVhu37 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。）
(b) 細胞培養
１）HEK 293細胞
5×104 cells/wellのHEK293細胞を播き、10% ウシ胎仔血清（FCS）- DMEM/F12培地(Thermo Fisher Scientific)を使用して5% CO2、37℃で培養した。
２）HepG2細胞
5×104 cells/wellのHepG2細胞を播き、10% FCS- DMEM Low glucose培地 (Thermo Fisher Scientific)を使用して5%CO2、37℃で培養した。
３）PXB細胞（フェニックスバイオ社）
PXBマウス肝臓から採取した細胞であり、ヒト肝細胞が90%以上を占める。7×104cells/wellの細胞を播き、専用のｄHCGM培地（フェニックスバイオ社）を使用して5% CO2、37℃で培養した。
１）HEK 293細胞
5×104 cells/wellのHEK293細胞を播き、10% ウシ胎仔血清（FCS）- DMEM/F12培地(Thermo Fisher Scientific)を使用して5% CO2、37℃で培養した。
２）HepG2細胞
5×104 cells/wellのHepG2細胞を播き、10% FCS- DMEM Low glucose培地 (Thermo Fisher Scientific)を使用して5%CO2、37℃で培養した。
３）PXB細胞（フェニックスバイオ社）
PXBマウス肝臓から採取した細胞であり、ヒト肝細胞が90%以上を占める。7×104cells/wellの細胞を播き、専用のｄHCGM培地（フェニックスバイオ社）を使用して5% CO2、37℃で培養した。
AAV2に対する中和抗体の活性を、 Ito Tら、Ann Clin Biochem. 46(Pt 6):508-510, 2009に記載の方法により測定し、原液（培地中では10倍希釈となる）でLacZの発現を完全に阻害した血清4人分を使用した。
(c) ベクター感染
(a)に記載した、GFPを発現する各種のAAVベクター（AAV2-CMV-AcGFP、AAV8-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFP、あるいはAAVGT5-CMV-AcGFP）またはβ-Galactosidaseを発現するAAVベクター（AAV2-CMV-LacZ）1～5×108vg/wellを各培養細胞に添加し、2～７日間、培養した。
また、(a)に記載したGFPを発現する各種のAAVベクター（AAVGT5-CMV-AcGFP、SPARK100-CMV-AcGFP、あるいはAAVhu37-CMV-AcGFP）を5×108、1×109、2×109vg/wellの濃度にて各培養細胞に添加し、2～10日間、培養した。
(a)に記載した、GFPを発現する各種のAAVベクター（AAV2-CMV-AcGFP、AAV8-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFP、あるいはAAVGT5-CMV-AcGFP）またはβ-Galactosidaseを発現するAAVベクター（AAV2-CMV-LacZ）1～5×108vg/wellを各培養細胞に添加し、2～７日間、培養した。
また、(a)に記載したGFPを発現する各種のAAVベクター（AAVGT5-CMV-AcGFP、SPARK100-CMV-AcGFP、あるいはAAVhu37-CMV-AcGFP）を5×108、1×109、2×109vg/wellの濃度にて各培養細胞に添加し、2～10日間、培養した。
(d) GFPまたはβ-Galactosidase発現の評価
プレートリーダー（バイオテックジャパン）を用いて、各種AAVベクターによって発現されたGFPの蛍光強度またはβ-Galactosidase assayによる吸光度を測定し比較した。また、GFP発現細胞を蛍光顕微鏡 (オリンパスIX83)で代表的な視野の画像を撮影した。
プレートリーダー（バイオテックジャパン）を用いて、各種AAVベクターによって発現されたGFPの蛍光強度またはβ-Galactosidase assayによる吸光度を測定し比較した。また、GFP発現細胞を蛍光顕微鏡 (オリンパスIX83)で代表的な視野の画像を撮影した。
(e) 血清中のAAV2中和抗体の抗体価の測定
AAV2に対する中和抗体の抗体価を、 Ito Tら、Ann Clin Biochem. 46(Pt 6):508-510, 2009に記載の方法により予め測定して、血清原液（培地中では10倍希釈となる）の濃度でAAV2ベクターによるLacZの発現を完全に阻害した血清4人分（Serum 1～4）を使用した。
HEK293細胞 5×104 cells/wellを96 well Plate (Thermo Fisher Scientific)に播種し、37℃、５％ CO2 インキュベーターで1日間培養した。被検血清（Serum 1～4）は原液から128倍まで順次2倍の希釈系列を調整した。希釈にはウシ胎仔血清（FCS）を用いた。
AAV2-CMV-LacZを50 mM Hepes, 150 mM NaCl(HN)緩衝液で1×108vg/μLに希釈し、前述の希釈血清と１：２（AAV：血清volume/volume)で混和した。対照（Sample (-) ）には、被検血清を含まないFCSとAAV2-CMV-LacZとを混和したものを用いた。具体的には、1ウェル当り2×107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを室温で1時間反応後、85μLの培地を含む細胞ウェルに15μL/well添加した。この時点での培地中の血清希釈率は10倍から1280倍である（図５Ａ、５Ｂ）。
37℃、5％ CO2 インキュベーターで2日間培養した後、β-Gal assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用い、プレートリーダーで吸光度を測定することによりβ-Galactosidaseの発現を評価した。
Sample(-)のウェルが示す吸光度の50%未満を示す最高の希釈率を抗体価とし、培地中における血清の希釈倍率で表した。
AAV2に対する中和抗体の抗体価を、 Ito Tら、Ann Clin Biochem. 46(Pt 6):508-510, 2009に記載の方法により予め測定して、血清原液（培地中では10倍希釈となる）の濃度でAAV2ベクターによるLacZの発現を完全に阻害した血清4人分（Serum 1～4）を使用した。
HEK293細胞 5×104 cells/wellを96 well Plate (Thermo Fisher Scientific)に播種し、37℃、５％ CO2 インキュベーターで1日間培養した。被検血清（Serum 1～4）は原液から128倍まで順次2倍の希釈系列を調整した。希釈にはウシ胎仔血清（FCS）を用いた。
AAV2-CMV-LacZを50 mM Hepes, 150 mM NaCl(HN)緩衝液で1×108vg/μLに希釈し、前述の希釈血清と１：２（AAV：血清volume/volume)で混和した。対照（Sample (-) ）には、被検血清を含まないFCSとAAV2-CMV-LacZとを混和したものを用いた。具体的には、1ウェル当り2×107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを室温で1時間反応後、85μLの培地を含む細胞ウェルに15μL/well添加した。この時点での培地中の血清希釈率は10倍から1280倍である（図５Ａ、５Ｂ）。
37℃、5％ CO2 インキュベーターで2日間培養した後、β-Gal assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用い、プレートリーダーで吸光度を測定することによりβ-Galactosidaseの発現を評価した。
Sample(-)のウェルが示す吸光度の50%未満を示す最高の希釈率を抗体価とし、培地中における血清の希釈倍率で表した。
(f) 中和抗体の交差反応性の検証
AAV2の中和抗体に対するAAV3またはAAV GT5の交差反応性を比較するため、これらAAV3ベクターまたはAAV GT5ベクターを中和抗体を含む血清と予め反応させた後、これらベクターの遺伝子導入能を、HEK293細胞におけるGFP発現によって比較した。細胞はHEK293細胞 5×104 cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日に用いた。
中和抗体陽性血清は、上記(e)で測定した結果からAAV2の発現を完全に阻止するヒト血清4種を用いた。AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFPをこれらの血清と１：２ (volume/volume)で混和し、室温で1時間反応後、細胞に投与した。具体的には、1ウェル当り2×107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを混和・反応させ、85μLの培地を含む細胞ウェルに投与した。FCSのみとAAVを混和・反応して対照（No Serum）とした。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダー（バイオテックジャパン）でGFPの蛍光強度を測定し、対照の値に対する相対値で比較した。
AAV2の中和抗体に対するAAV3またはAAV GT5の交差反応性を比較するため、これらAAV3ベクターまたはAAV GT5ベクターを中和抗体を含む血清と予め反応させた後、これらベクターの遺伝子導入能を、HEK293細胞におけるGFP発現によって比較した。細胞はHEK293細胞 5×104 cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日に用いた。
中和抗体陽性血清は、上記(e)で測定した結果からAAV2の発現を完全に阻止するヒト血清4種を用いた。AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFPをこれらの血清と１：２ (volume/volume)で混和し、室温で1時間反応後、細胞に投与した。具体的には、1ウェル当り2×107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを混和・反応させ、85μLの培地を含む細胞ウェルに投与した。FCSのみとAAVを混和・反応して対照（No Serum）とした。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダー（バイオテックジャパン）でGFPの蛍光強度を測定し、対照の値に対する相対値で比較した。
B. 結果
(1) 変異体AAVGT5の作製
アデノ随伴ウイルスAAV3AとAAV3Bとの融合Rep配列、およびAAV3BのVP配列を含むDNAを人工合成した。その際にAAV3BのVP1においてS472A、S587A、N706Aの変異を生じるように遺伝子操作し、アデノ随伴ウイルス変異体AAVGT5を得た。
AAV3A、AAV3B及びAAVGT5のそれぞれのVP1タンパク質アミノ酸配列（配列番号２～４）及びRepタンパク質アミノ酸配列（配列番号６～８）のアラインメントを図１Ａ～図１Ｄに示す。
(1) 変異体AAVGT5の作製
アデノ随伴ウイルスAAV3AとAAV3Bとの融合Rep配列、およびAAV3BのVP配列を含むDNAを人工合成した。その際にAAV3BのVP1においてS472A、S587A、N706Aの変異を生じるように遺伝子操作し、アデノ随伴ウイルス変異体AAVGT5を得た。
AAV3A、AAV3B及びAAVGT5のそれぞれのVP1タンパク質アミノ酸配列（配列番号２～４）及びRepタンパク質アミノ酸配列（配列番号６～８）のアラインメントを図１Ａ～図１Ｄに示す。
(2) AAVGT5のヒト肝臓由来細胞HepG2及びPXBに対する感染能の確認
上記で作製したAAVGT5のヒト肝臓由来細胞への感染能を確認した。
ヒト肝臓由来細胞株であるHepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFP 5×108vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図２Ａ)、このときの細胞の様子を図２Ｂに示す。
同様に実施した、PXBマウス肝臓から採取した、ヒト肝細胞が90%以上をしめるPXB細胞に対する遺伝子導入の結果を図3に示した。PXB細胞（フェニックスバイオ社）7×104 cell/wellを96well Plateに播種した6日後、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFP 5×108vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図３Ａ)。このときの細胞の様子を図３Ｂに示す。
HepG2細胞、PXB細胞いずれにおいてもAAVGT5-CMV-AcGFPのGFP発現量はAAV3の約1.1倍であった。AAVGT5はこれらヒト肝臓由来細胞に対してAAV3と同等以上の遺伝子導入が可能と考えられる。一方、AAV8とAAV2は、AAV3、AAVGT5に比べてヒト肝細胞への遺伝子導入効率は低かった（図２、図３）。
上記で作製したAAVGT5のヒト肝臓由来細胞への感染能を確認した。
ヒト肝臓由来細胞株であるHepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFP 5×108vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図２Ａ)、このときの細胞の様子を図２Ｂに示す。
同様に実施した、PXBマウス肝臓から採取した、ヒト肝細胞が90%以上をしめるPXB細胞に対する遺伝子導入の結果を図3に示した。PXB細胞（フェニックスバイオ社）7×104 cell/wellを96well Plateに播種した6日後、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFP 5×108vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図３Ａ)。このときの細胞の様子を図３Ｂに示す。
HepG2細胞、PXB細胞いずれにおいてもAAVGT5-CMV-AcGFPのGFP発現量はAAV3の約1.1倍であった。AAVGT5はこれらヒト肝臓由来細胞に対してAAV3と同等以上の遺伝子導入が可能と考えられる。一方、AAV8とAAV2は、AAV3、AAVGT5に比べてヒト肝細胞への遺伝子導入効率は低かった（図２、図３）。
(3) AAVGT5のヒト肝臓由来細胞HepG2及びPXBに対する感染能の確認
上記で作製したAAVGT5のヒト肝臓由来細胞への感染能を確認した。
ヒト肝臓由来細胞株であるHepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、AAVGT5-CMV-AcGFP、SPARK100-CMV-AcGFP、およびAAVhu37-CMV-AcGFP 2×109vg/well （4×104 vg/cell）を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで9日間培養し、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図４Ａ)。投与7日後の細胞の様子を図４Ｂに示す。
上記で作製したAAVGT5のヒト肝臓由来細胞への感染能を確認した。
ヒト肝臓由来細胞株であるHepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、AAVGT5-CMV-AcGFP、SPARK100-CMV-AcGFP、およびAAVhu37-CMV-AcGFP 2×109vg/well （4×104 vg/cell）を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで9日間培養し、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図４Ａ)。投与7日後の細胞の様子を図４Ｂに示す。
同様に実施した、PXBマウス肝臓から採取した、ヒト肝細胞が90%以上をしめるPXB細胞に対する遺伝子導入の結果を図４Ｃに示した。PXB細胞（フェニックスバイオ社）7×104cell/wellを96well Plateに播種した6日後、AAVGT5-CMV-AcGFP、SPARK100-CMV-AcGFP、およびAAVhu37-CMV-AcGFP 3.5×109vg/well （5×104 vg/cell）を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで9日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図４Ｃ)。10日間培養後の細胞の様子を図４Ｄに示す。
HepG2細胞におけるAAVGT5-CMV-AcGFPのGFP発現量はSPARK100-CMV-AcGFPの22倍、PXB細胞においては、この差は86倍であった。AAVGT5はこれらヒト肝臓由来細胞に対して高効率で遺伝子導入が可能と考えられる。
(4) AAV2中和抗体の抗体価の測定
上記(e)の手順（図５Ａ）に従って、被検血清（Serum 1～4）中のAAV2抗体の抗体価を測定した。
その結果、Serum 1～4の抗体価をそれぞれ40、160、80、160とした（図５Ｂ、下記の表３）。これらSerum 1～4を交差反応性に関する実験に使用した。
上記(e)の手順（図５Ａ）に従って、被検血清（Serum 1～4）中のAAV2抗体の抗体価を測定した。
その結果、Serum 1～4の抗体価をそれぞれ40、160、80、160とした（図５Ｂ、下記の表３）。これらSerum 1～4を交差反応性に関する実験に使用した。
(5) AAV2に対する中和抗体陽性血清と反応させたAAVの発現比較
AAV2の発現を完全に阻止する中和抗体を含む４種の血清（Serum 1～Serum 4）と、AAV3-CMV-AcGFPあるいはAAVGT5-CMV-AcGFPとを反応させた後、各AAVベクターをHEK293細胞に感染させてGFPの発現を比較した（図６Ａ）。
HEK293細胞 5×104cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日にGFP活性の測定に用いた。対照（No Serum）に対する相対値で比較した。
高力価の中和抗体を含む血清（Serum 1～Serum 4）との反応によりAAV3のGFP発現量は対照の53～28％に下がったのに対し、AAVGT5の発現量は85～75％の高いレベルに維持された（図６Ａ）。このときの細胞の様子を図６Ｂに示す。
したがって、AAV3ベクターは、AAV GT5ベクターへの変異によって、4種全ての血清中の中和抗体に対する抵抗性が高まった（すなわち、交差反応性が低下した）結果、細胞への遺伝子導入量を向上させることができた。
AAV2の発現を完全に阻止する中和抗体を含む４種の血清（Serum 1～Serum 4）と、AAV3-CMV-AcGFPあるいはAAVGT5-CMV-AcGFPとを反応させた後、各AAVベクターをHEK293細胞に感染させてGFPの発現を比較した（図６Ａ）。
HEK293細胞 5×104cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日にGFP活性の測定に用いた。対照（No Serum）に対する相対値で比較した。
高力価の中和抗体を含む血清（Serum 1～Serum 4）との反応によりAAV3のGFP発現量は対照の53～28％に下がったのに対し、AAVGT5の発現量は85～75％の高いレベルに維持された（図６Ａ）。このときの細胞の様子を図６Ｂに示す。
したがって、AAV3ベクターは、AAV GT5ベクターへの変異によって、4種全ての血清中の中和抗体に対する抵抗性が高まった（すなわち、交差反応性が低下した）結果、細胞への遺伝子導入量を向上させることができた。
本発明の組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、生体の中和抗体からの攻撃を低減させて、例えば、標的細胞により高効率で遺伝子導入できる。よって、本発明の組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、例えば、肝臓特異的プロモーターや、肝細胞のゲノム障害と関係する遺伝性疾患、例えば血友病、血栓、血小板減少症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、遺伝性肝臓代謝異常症、肝細胞癌などの治療用の遺伝子（例えば血友病に対する第VIII因子またはIX因子の遺伝子治療、高脂血症に対するコレステロール代謝酵素）を有する場合、より効率的な遺伝子治療が可能になる。
配列番号１：AAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：AAV3Aキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：AAV3Bキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：AAVGT5変異キャプシドタンパク質（S472A、S587A、N706A）のアミノ酸配列
配列番号５：AAV8キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：AAV3AのRepタンパク質（ARep）のアミノ酸配列
配列番号７：AAV3BのRepタンパク質（BRep）のアミノ酸配列
配列番号８：AAVGT5のRepタンパク質（baRep）のアミノ酸配列
配列番号９：SPARK100キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：AAVhu37キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：AAV3Aキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：AAV3Bキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：AAVGT5変異キャプシドタンパク質（S472A、S587A、N706A）のアミノ酸配列
配列番号５：AAV8キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：AAV3AのRepタンパク質（ARep）のアミノ酸配列
配列番号７：AAV3BのRepタンパク質（BRep）のアミノ酸配列
配列番号８：AAVGT5のRepタンパク質（baRep）のアミノ酸配列
配列番号９：SPARK100キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：AAVhu37キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
Claims (6)
- 配列番号４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、472番目、587番目及び706番目の他の残基位置において1～3個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、血清中に存在する２型AAVに対する中和抗体と交差反応しないアデノ随伴ウイルスベクター
を含む、医薬組成物。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号４に記載のアミノ酸配列において472番目、587番目及び706番目のアミノ酸残基の他の残基位置において1～3個のアミノ酸残基が置換されている、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号４に記載のアミノ酸配列において472番目、587番目及び706番目のアミノ酸残基の他の残基位置において1個のアミノ酸残基が置換されている、請求項１または２に記載の医薬組成物。
- 肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/EBP、DBP）のプロモーター、アルブミン、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモーター、およびHCRhAAT合成プロモーターからなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
- 配列番号４に記載のアミノ酸配列において、472番目、587番目及び706番目のアミノ酸残基の他の残基位置において1～3個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、
配列番号４に記載のアミノ酸配列において、472番目、587番目及び706番目のアミノ酸残基の他の残基位置において1～3個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
配列番号４に記載のアミノ酸配列において、472番目、587番目及び706番目のアミノ酸残基の他の残基位置において1個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベクターは、血清中に存在する２型ＡＡＶに対する中和抗体と交差反応しないことを特徴とする、ポリヌクレオチド
を含む、医薬組成物。
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