ES2599632T3 - Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso - Google Patents

Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso Download PDF

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Abstract

Un vector viral adeno-asociado de serotipo 2 recombinante (rAAV2) que comprende al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie mutado sobre su proteína de la cápside, el al menos un resto de tirosina mutado seleccionado del grupo que consiste en Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730, Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr720.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de vectores rAAV que tienen protemas de la capside modificadas en tirosina y metodos para su uso CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere generalmente a los campos de la biologfa molecular y la virologfa, y en particular, al desarrollo de vehmulos de administracion genica. Tambien se desvelan composiciones de vectores rAAV mejoradas utiles en expresar una variedad de segmentos de acidos nucleicos, que incluyen aquellos que codifican protemas terapeuticas, polipeptidos, peptidos, oligonucleotidos antisentido y construcciones de ribozima, en diversas pautas de terapia genica. Tambien se proporcionan metodos de preparacion y uso de estas construcciones de vectores basados en rAAV modificados en una variedad de terapias de genes basados en virus, y en particular, tratamiento y prevencion de enfermedades humanas usando enfoques de terapia genica convencionales. La invencion tambien proporciona sistemas de administracion de vectores basados en rAAV que pueden usarse para evaluar la eficiencia e infectividad relativa de una variedad de partmulas de AAV que tienen mutaciones en uno o mas restos de tirosina de protemas de la capside viral.
DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA
Se han logrado avances importantes en el campo de la terapia genica usando virus para administrar material genetico terapeutico. El virus adeno-asociado (AAV) ha atrafdo una atencion considerable como vector viral altamente eficaz para la terapia genica debido a su baja inmunogenicidad y capacidad de transducir eficazmente celulas no divisoras. Se ha mostrado que el AAV infecta una variedad de tipos de celulas y tejidos, y se ha hecho un progreso significativo durante la ultima decada para adaptar este sistema viral para su uso en la terapia genica humana.
En su forma "no mutante" normal, el ADN del AAV recombinante (rAAV) esta encapsidado en la capside viral como una molecula monocatenaria de aproximadamente 4600 nucleotidos (nt) de longitud. Tras la infeccion de la celula por el virus, la maquinaria molecular de la celula convierte la hebra de ADN individual en una forma bicatenaria. Solo la forma de ADN bicatenario es util para los polipeptidos de la celula que transcriben el gen o genes contenidos en el ARN.
El AAV tiene muchas propiedades que favorecen su uso como vehmulo de administracion genica: 1) el virus no mutante no esta asociado a ninguna afeccion humana patologica; 2) la forma recombinante no contiene secuencias codificantes virales nativas; y 3) se ha observado expresion transgenica persistente en muchas aplicaciones.
La eficiencia de transduccion de vectores del virus 2 adeno-asociado (AAV) recombinante vana enormemente en diferentes celulas y tejidos in vitro e in vivo. Se han realizado estudios sistematicos para aclarar las etapas fundamentales del ciclo de vida del AAV. Por ejemplo, se ha documentado que una protema celular, FKBP52, fosforilada en restos de tirosina por la protema tirosina cinasa del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR-PTK) inhibe la smtesis de ADN de la segunda hebra del AAV y, por consiguiente, la expresion transgenica in vitro2425, ademas de in vivo.19,27,28 Tambien se ha demostrado que la senalizacion de EGFR-PTK modula el trafico intracelular mediado por la via de ubiquitina/proteasoma, ademas de la smtesis de ADN de la segunda hebra mediada por FKBP52 de vectores AAV. En aquellos estudios, la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK condujo a una ubiquitinacion reducida de protemas de la capside del AAV, que a su vez facilito el transporte nuclear limitando la degradacion mediada por el proteasoma de vectores AAV, que implican la fosforilacion mediada por EGFR-PTK de restos de tirosina sobre capsides del AAV.
En un primer aspecto de la presente invencion se proporciona un vector viral adeno-asociado de serotipo 2 recombinante (rAAV2) que comprende al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie mutado sobre su protema de la capside, el al menos un resto de tirosina mutado seleccionado del grupo que consiste en Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730, Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr720.
En un segundo aspecto de la invencion se proporciona un metodo de aumento de la eficiencia de transduccion de un vector viral adeno-asociado recombinante (rAAV), comprendiendo el metodo la etapa de mutar al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie en las protemas de la capside, el al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie correspondiente a Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730, Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr72o de la protema de la capside de AAV2 no mutante de forma que la eficiencia de transduccion en una celula de mairnfero del vector que comprende la protema de la capside mutada sea superior a la de un AAV correspondiente que mantiene dichos restos de tirosina expuestos en la superficie en la protema de la capside, en el que la celula huesped de mam^era es la lmea celular cervical humana, HeLa.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion vence las limitaciones y deficiencias inherentes en el estado de la tecnica proporcionando novedosas construcciones geneticas basadas en rAAV que codifican uno o mas agentes terapeuticos utiles en la preparacion de medicamentos para la prevencion, tratamiento y/o mejora de una o mas enfermedades, trastornos o disfunciones resultantes de una deficiencia en uno o mas de tales polipeptidos. En particular, la invencion
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proporciona construcciones geneticas basadas en AAV que codifican uno o mas agentes terapeuticos de mai^ero (incluyendo, por ejemplo, protemas, polipeptidos, peptidos, anticuerpos, fragmentos de union al antigeno, ARNip, iARN, oligo- y poli-nucleotidos antisentido, ribozimas, y variantes y/o fragmentos activos de los mismos), para su uso en el diagnostico, prevencion, tratamiento y/o mejora de smtomas de una variedad de enfermedades de mai^ero, trastornos, disfunciones, traumatismo, lesion, y similares.
Basandose en los ultimos descubrimientos de los inventores, se ha desarrollado una nueva categona de vectores rAAV modificados que proporcionan una transduccion de eficiencia mas alta en celulas seleccionadas que los vectores rAAV convencionales y no mutantes.
Estudiando los analisis de mutaciones dirigidas a sitio de restos de tirosina expuestos en la superficie sobre diversas protemas de la capside del AAV, los inventores han identificado que la eliminacion de uno o mas restos de tirosina que se presentan en la superficie del virion (que proporcionan una senal crucial para la ubiquitinacion de protemas de la capside) da vectores rAAV novedosos y partmulas virales que los comprenden que evitan la etapa de ubiquitinacion, evitando asf la degradacion mediada por el proteasoma, produciendo la transduccion de alta eficiencia. La creacion de estos nuevos vectores reduce espectacularmente el numero de partmulas virales necesarias para las pautas de terapia genica convencionales. Los vectores AAV modificados en tirosina resultantes descritos en el presente documento son mas eficaces, mas estables, menos inmunogenicos y se produjeron a coste mucho menor que los vectores tradicionales actualmente empleados en la terapia genica humana.
Y, lo que es mas importante, los metodos de la presente invencion facilitan la produccion de novedosos vectores AAV con mutacion de uno o mas restos de tirosina expuestos en la superficie sobre protemas de la capside. Estos novedosos vectores mutados evitan la degradacion por el proteasoma, y asf aumentan significativamente la eficiencia de transduccion de estos vectores. Los inventores han demostrado que la mutacion de uno o mas de los restos de tirosina sobre la superficie externa de las protemas de la capside [que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, mutacion de Tyr252 a Phe272 (Y252F), Tyr272 a Phe272 (Y272F), Tyr444 a Phe444 (Y444F), Tyr500 a Phe500 (Y500F), Tyr700 a Phe700 (Y700F), Tyr704 a Phe704 (Y704F) y Tyr730 a Phe730 (Y730F)] produjeron eficiencia de transduccion mejorada de los vectores rAAV cuando se comparo con no mutantes.
En un aspecto, la invencion proporciona composiciones que comprenden vectores virales adeno-asociados (AAV) recombinantes, viriones, partmulas virales, y formulaciones farmaceuticas de los mismos, utiles en metodos de administracion de material genetico que codifica uno o mas producto(s) beneficioso(s) o terapeutico(s) para celulas y tejidos de mairnfero. En particular, las composiciones y metodos de la invencion proporcionan un avance significativo en la materia mediante su uso en el tratamiento, prevencion y/o mejora de los smtomas de una o mas enfermedades de mamffero. Se contempla que terapia genica humana se beneficiara particularmente de las presentes ensenanzas proporcionando construcciones de vectores virales nuevas y mejoradas para su uso en el tratamiento de varias enfermedades, trastornos y disfunciones diversas.
En otro aspecto, la invencion se refiere a vector rAAV modificado que codifica uno o mas agentes terapeuticos de mamffero para la prevencion, tratamiento y/o mejora de uno o mas trastornos en el mamffero en el que se administra la construccion de vector. En particular, la invencion proporciona construcciones de expresion basadas en rAAV que codifican uno o mas agente(s) terapeutico(s) de mamffero (que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, protema(s), polipeptido(s), peptido(s), enzima(s), anticuerpos, fragmentos de union al antfgeno, ademas de variantes, y/o fragmentos activos de los mismos, para su uso en el tratamiento, profilaxis y/o mejora de uno o mas de los smtomas de una enfermedad de mam^era, disfuncion, lesion y/o trastorno.
En otra realizacion, la invencion se refiere a vectores rAAV geneticamente modificados que comprenden al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica uno o mas agentes terapeuticos que alteran, inhiben, reducen, previenen, eliminan o alteran la actividad de uno o mas procesos biologicos endogenos en la celula. En realizaciones particulares, tales agentes terapeuticos pueden ser aquellos que inhiben o reducen selectivamente los efectos de uno o mas procesos metabolicos, disfunciones, trastornos o enfermedades. En ciertas realizaciones, el defecto puede producirse por lesion o traumatismo al mamffero para el que se desea tratamiento. En otras realizaciones, el defecto puede producir la expresion en exceso de un compuesto biologico endogeno, mientras que en todavfa otras realizaciones, el defecto puede producirse por la expresion por defecto o incluso ausencia de uno o mas compuestos biologicos endogenos.
Cuando se contempla el uso de tales vectores para la introduccion de una o mas protemas exogenas, polipeptidos, peptidos, ribozimas, ARNip y/o oligonucleotidos antisentido, a una celula particular transfectada con el vector, pueden emplearse los vectores AAV modificados desvelados en el presente documento incorporando en el vector al menos un primer polinucleotido exogeno operablemente situado en la direccion 3' y bajo el control de al menos un primer promotor heterologo que expresa el polinucleotido en una celula que comprende el vector para producir el agente terapeutico codificado, que incluye, por ejemplo, peptidos, protemas, polipeptidos, anticuerpos, ribozimas, ARNip y oligo- o polinucleotidos antisentido. Tales construcciones pueden emplear uno o mas promotores heterologos para expresar el agente terapeutico de interes. Tales promotores pueden ser constitutivos, inducibles, o incluso espedficos de celula o tejido. Promotores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un promotor del CMV, un promotor de p-actina, un promotor del CMV hfbrido, un promotor de p-actina Idbrido, un promotor de EF1,
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un promotor de U1a, un promotor de U1b, un promotor inducible por Tet, un promotor de VP16-LexA, un promotor espedfico de articulacion y un promotor espedfico de humano.
Los vectores rAAV geneticamente modificados o sistemas de expresion de la invencion pueden tambien comprender ademas un segundo segmento de acido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, uno o mas potenciadores, elementos reguladores, elementos de transcripcion, para alterar o afectar la transcripcion del gen heterologo clonado en los vectores rAAV. Por ejemplo, los vectores rAAV de la presente invencion pueden comprender ademas un segundo segmento de acido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, al menos un primer potenciador del CMV, un potenciador sintetico, o un potenciador espedfico de celula o de tejido. El segundo segmento de acido nucleico puede tambien comprender ademas, consistir esencialmente en, o consistir en una o mas secuencias de intrones, elementos reguladores post-transcripcion, o similares. Los vectores y sistemas de expresion de la invencion pueden tambien comprender opcionalmente ademas un tercer segmento de acido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, uno o mas sitios de policonector o de restriccion multiple / region (regiones) de clonacion para facilitar la insercion de uno o mas elementos geneticos seleccionados, polinucleotidos, y similares en los vectores rAAV en un sitio de restriccion conveniente.
En aspectos de la invencion, los polinucleotidos exogenos que estan comprendidos en uno o mas de los vectores rAAV mejorados desvelados en el presente documento son preferentemente de origen de mairnfero, siendo particularmente preferidos polinucleotidos que codifican polipeptidos y peptidos de origen humano, primate, murino, porcino, bovino, ovino, felino, canino, equino, epino, caprino o lupino.
Como se ha descrito anteriormente, el polinucleotido exogeno codificara preferentemente una o mas protemas, polipeptidos, peptidos, enzimas, anticuerpos, ARNip, ribozimas, o polinucleotidos antisentido, oligonucleotidos, moleculas de PNA, o una combinacion de dos o mas de estos agentes terapeuticos. En realidad, el polinucleotido exogeno puede codificar dos o mas de tales moleculas, o una pluralidad de tales moleculas segun pueda desearse. Cuando se desean terapias genicas combinatorias, pueden producirse dos o mas moleculas diferentes a partir de un unico sistema de expresion de rAAV, o alternativamente, una celula huesped seleccionada puede transfectarse con dos o mas sistemas de expresion de rAAV unicos, cada uno de los cuales puede comprender uno o mas polinucleotidos distintos que codifican un agente terapeutico.
En otras realizaciones, la invencion tambien proporciona vectores rAAV geneticamente modificados que estan comprendidos en una partfcula viral adeno-asociada infecciosa o un virion, o pluralidades de tales partfculas, que ellas mismas tambien pueden estar comprendidas dentro de uno o mas diluyentes, tampones, disoluciones fisiologicas o veldculos farmaceuticos, formulados para administracion a un mamffero tal como un ser humano para pautas de terapia genica terapeutica, y/o profilactica. Tales vectores, partfculas de virus, viriones, y pluralidades de los mismos, tambien pueden proporcionarse en formulaciones de excipiente que son aceptables para administracion veterinaria a ganado seleccionado, animales exoticos o domesticados, animales de comparua (incluyendo mascotas y similares), ademas de primates no humanos, espedmenes de zoologico o de otro modo cautivos, y similares, en los que se indica que el uso de tales vectores y terapia genica relacionada produce un efecto beneficioso tras la administracion a un animal tal.
La invencion tambien se refiere a celulas huesped que comprenden al menos uno de los vectores rAAV desvelados, partfculas de virus, o viriones. Tales celulas huesped son particularmente celulas huesped de mamffero, siendo celulas huesped humanas particularmente altamente preferidas, y pueden estar tanto aisladas, en cultivo de celulas como de tejido. En el caso de modelos animales geneticamente modificados, las celulas huesped transformadas pueden incluso estar comprendidas dentro del propio cuerpo de un animal no humano.
En ciertas realizaciones, la creacion de celulas huesped no humanas recombinantes, y/o celulas huesped humanas recombinantes aisladas que comprenden uno o mas de los vectores rAAV desvelados, tambien se contempla por ser util para una variedad de protocolos de diagnostico, y de laboratorio, que incluyen, por ejemplo, medios para la produccion de cantidades a gran escala de los vectores rAAV descritos en el presente documento. Tales metodos de produccion de virus son particularmente contemplados por ser una mejora con respecto a las metodologfas existentes que incluyen en particular aquellas que requieren tftulos muy altos de las cepas virales con el fin de ser utiles como herramienta de terapia genica. Los inventores contemplan que una ventaja muy significativa de los presentes metodos sera la capacidad de utilizar tftulos de partfculas virales mas bajos en protocolos de transduccion de mamnfero, y sin embargo que retienen las tasas de transfeccion a un nivel adecuado.
Las composiciones que comprenden uno o mas de los vectores rAAV desvelados, sistemas de expresion, partfculas de AAV infecciosas, o celulas huesped, tambien forman parte de la presente invencion, y particularmente aquellas composiciones que comprenden ademas al menos un primer excipiente farmaceuticamente aceptable para su uso en terapia, y para su uso en la fabricacion de medicamentos para el tratamiento de una o mas enfermedades de mamffero, trastornos, disfunciones, o traumatismo. Tales composiciones farmaceuticas pueden comprender opcionalmente ademas uno o mas diluyentes, tampones, liposomas, un lfpido, un complejo de lfpido; o los vectores rAAV modificados en tirosina pueden estar comprendidos en una microesfera o una nanopartfcula. Se prefieren particularmente formulaciones farmaceuticas adecuadas para inyeccion intramuscular, intravenosa o directa en un organo o tejido o una pluralidad de celulas o tejidos de un mamffero humano u otro, sin embargo, las composiciones desveladas en el presente documento pueden tambien encontrar utilidad en la administracion a areas discretas del
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cuerpo del mairnfero, que incluyen, por ejemplo, formulaciones que son adecuadas para inyeccion directa en uno o mas organos, tejidos, o tipos de celulas en el cuerpo. Tales sitios de inyeccion incluyen, pero no se limitan a, el cerebro, una articulacion o capsula articular, un tejido sinovial o subsinovial, tendones, ligamentos, cartflagos, hueso, musculo peri-articular, o un espacio articular de una articulacion de mamnfero, ademas de administracion directa a un organo tal como el corazon, tugado, pulmon, pancreas, intestino, cerebro, vejiga, rinon, u otro sitio dentro del cuerpo del paciente, que incluye, por ejemplo, introduccion de los vectores virales mediante administracion intrabdominal, intratoracica, intravascular, o intracerebroventricular.
Otros aspectos de la invencion se refieren a partmulas de virion de virus adeno-asociado recombinante, composiciones, y celulas huesped que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, uno o mas de los vectores rAAV desvelados en el presente documento, tales como, por ejemplo, formulaciones farmaceuticas de los vectores previstos para administracion a un mamffero mediante medios adecuados tales como por inyeccion intramuscular, intravenosa, intrarticular o directa a una o mas celulas, tejidos u organos de un mamffero seleccionado. Normalmente, tales composiciones pueden formularse con excipientes farmaceuticamente aceptables como se describen en el presente documento mas adelante, y pueden comprender uno o mas liposomas, lfpidos, complejos de lfpido, microesferas o formulaciones de nanopartmulas para facilitar la administracion a los organos, tejidos y celulas seleccionados para los que se desea terapia.
Kits que comprenden uno o mas de los vectores rAAV desvelados, viriones, partmulas virales, celulas huesped transformadas o composiciones farmaceuticas que comprenden tales; e instrucciones para usar el kit en una realizacion terapeutica, de diagnostico, o clmica, tambien representan aspectos preferidos de la presente divulgacion. Tales kits pueden comprender ademas uno o mas reactivos, enzimas de restriccion, peptidos, terapeuticos, compuestos farmaceuticos, o medios para la administracion de la(s) composicion (composiciones) a celulas huesped, o a un animal (por ejemplo, jeringas, inyectables, y similares). Tales kits pueden ser kits terapeuticos para tratar, prevenir o mejorar los smtomas de una enfermedad, deficiencia, disfuncion y/o lesion, y pueden comprender una o mas de las construcciones de vectores rAAV modificados, sistemas de expresion, partmulas de virion, o una pluralidad de tales partmulas, e instrucciones para usar el kit en una pauta medica terapeutica y/o de diagnostico. Tales kits tambien pueden usarse en metodologfas de produccion a gran escala para producir grandes cantidades de los propios vectores virales (con o sin un agente terapeutico codificado en ellos) para venta comercial, o para su uso por otros, que incluyen, por ejemplo, virologos, profesionales medicos, y similares.
Otro aspecto importante de la presente invencion se refiere a metodos de uso de los vectores rAAV desvelados, viriones, sistemas de expresion, composiciones y celulas huesped descritas en el presente documento en la preparacion de medicamentos para prevenir, tratar o mejorar los smtomas de diversas enfermedades, disfunciones o deficiencias en un animal, tal como un mamffero vertebrado. Tales metodos generalmente implican la administracion a un mamffero, o humano en necesidad del mismo, de uno o mas de los vectores desvelados, viriones, partmulas virales, celulas huesped, composiciones, o pluralidades de los mismos, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar o reducir los smtomas de una enfermedad, disfuncion o deficiencia tal en el animal afectado. Los metodos pueden tambien englobar tratamiento profilactico de animales que se sospecha que tienen tales afecciones, o administracion de tales composiciones a aquellos animales en riesgo de desarrollar tales afecciones tanto tras el diagnostico, como antes de la aparicion de los smtomas.
Como se ha descrito anteriormente, el polinucleotido exogeno codificara preferentemente una o mas protemas, polipeptidos, peptidos, ribozimas u oligonucleotidos antisentido, o una combinacion de estos. En realidad, el polinucleotido exogeno puede codificar dos o mas de tales moleculas, o una pluralidad de tales moleculas, segun pueda desearse. Cuando se desean terapias genicas combinatorias, pueden producirse dos o mas moleculas diferentes a partir de un unico sistema de expresion de rAAV, o alternativamente, una celula huesped seleccionada puede transfectarse con dos o mas sistemas de expresion de rAAV unicos, cada uno de los cuales proporcionara polinucleotidos heterologos unicos que codifican al menos dos de tales moleculas diferentes.
En otras realizacion, la invencion tambien se refiere a los vectores rAAV desvelados comprendidos en una partmula viral adeno-asociada infecciosa, comprendidos en uno o mas vehmulos farmaceuticos, y pueden formularse para administracion a un mamffero tal como un ser humano para pautas de terapia genica terapeutica, y/o profilactica. Tales vectores tambien pueden proporcionarse en formulaciones farmaceuticas que son aceptables para administracion veterinaria a ganado seleccionado, animales domesticados, mascotas, y similares.
La invencion tambien se refiere a celulas huesped que comprenden los vectores rAAV desvelados y a sistemas de expresion, particularmente celulas huesped de mamffero, siendo particularmente preferidas celulas huesped humanas.
Las composiciones que comprenden uno o mas de los vectores rAAV desvelados, sistemas de expresion, partmulas de AAV infecciosas, celulas huesped, tambien forman parte de la presente invencion, y particularmente aquellas composiciones que comprenden ademas al menos un primer excipiente farmaceuticamente aceptable para su uso en la fabricacion de medicamentos y metodos que implican la administracion terapeutica de tales vectores rAAV. Tales composiciones farmaceuticas pueden opcionalmente comprender ademas liposomas, un lfpido, un complejo de lfpido; o los vectores rAAV pueden estar comprendidos dentro de una microesfera o una nanopartmula. Son
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particularmente preferidas las formulaciones farmaceuticas adecuadas para inyeccion intramuscular, intravenosa o directa en un organo o tejido de un ser humano.
Otros aspectos de la invencion se refieren a partmulas de virion de virus adeno-asociados recombinantes, composiciones, y celulas huesped que comprenden uno o mas de los vectores AAV desvelados en el presente documento, tales como, por ejemplo, formulaciones farmaceuticas de los vectores previstos para administracion a un mairnfero mediante medios adecuados, tales como, por inyeccion intramuscular, intravenosa o directa a las celulas, tejidos u organos de un mamffero seleccionado. Normalmente, tales composiciones pueden formularse con excipientes farmaceuticamente aceptables como se describe en el presente documento mas adelante, y pueden comprender uno o mas liposomas, lfpidos, complejo de lfpidos, microesferas o formulaciones de nanopartmulas para facilitar la administracion a los organos, tejidos y celulas seleccionados para los que se desea terapia.
Kits que comprenden uno o mas de los vectores, viriones, celulas huesped, partmulas virales o composiciones desvelados; y (ii) instrucciones para usar el kit en realizaciones terapeuticas, de diagnostico o clmicas tambien representan aspectos preferidos de la presente divulgacion. Tales kits pueden comprender ademas uno o mas reactivos, enzimas de restriccion, peptidos, terapeuticos, compuestos farmaceuticos, o medios para la administracion de las composiciones a celulas huesped, o a un animal, tales como jeringas, inyectables, y similares. Tales kits pueden ser kits terapeuticos para tratar o mejorar los smtomas de enfermedades particulares, y normalmente comprenderan una o mas de las construcciones de vectores AAV modificados, sistemas de expresion, partmulas de virion, o composiciones terapeuticas descritas en el presente documento, e instrucciones para usar el kit.
Otro aspecto importante de la presente invencion se refiere a metodos de uso de los vectores, viriones, sistemas de expresion, composiciones y celulas huesped desvelados descritos en el presente documento en la preparacion de medicamentos para tratar o mejorar los smtomas de diversas deficiencias de polipeptidos en un mam^era. Tales metodos generalmente implican la administracion a un mam^era, o ser humano en necesidad del mismo, de uno o mas de los vectores, viriones, celulas huesped o composiciones desvelados, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar los smtomas de una deficiencia tal en el mamffero afectado. Los metodos pueden tambien englobar el tratamiento profilactico de animales que se sospecha que tienen tales afecciones, o la administracion de tales composiciones a aquellos animales en riesgo de desarrollar tales afecciones tanto tras el diagnostico, como antes de la aparicion de los smtomas.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invencion. La invencion puede entenderse mejor por referencia a la siguiente descripcion tomada conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que numeros de referencia similares identifican elementos similares, y en los que:
Las FIG. 1A y FIG. 1B muestran la expresion transgenica mediada por AAV2 en celulas HeLa, pre-tratadas con o sin Tyr23, tras la transduccion con tanto vectores ssAAV2-EGFP como scAAV2-EGFP. La FIG. 1A muestra que la expresion transgenica se detecto por microscopfa de fluorescencia 48 h despues de la infeccion. Aumentos originales 100x. La FIG. 1B muestra analisis cuantitativos de eficiencia de transduccion de AAV2. Se analizaron imagenes de cinco campos visuales cuantitativamente por el software de analisis ImageJ®. La expresion transgenica se evaluo como el area total de fluorescencia verde (pixel2) por campo visual (media ± DE). Se uso el analisis de la varianza (ANOVA) para comparar resultados de pruebas con el control y se determino que eran estadfsticamente significativas. *P<0,05 frente a control + ssAAV2-EGFP; # P<0,05 frente a control + scAAV2-EGFP.
Las FIG. 2A y FIG. 2B ilustran la expresion transgenica mediada por AAV en celulas HeLa transfectadas con vector vacfo, o transfectadas establemente con plasmidos de expresion wt-TC-PTP o mutantes para C-S, tras la transduccion con tanto vectores ssAAV2-EGFP como scAAV2-EGFP. La FIG. 2A muestra que la expresion transgenica se detecto por microscopfa de fluorescencia 48 h despues de la infeccion (aumentos originales: 100*). La FIG. 2B ilustra que los analisis cuantitativos de eficiencia de transduccion de AAV2 se evaluaron como se describe en la leyenda para la FIG. 1A y FIG. 1B, y se determino que eran estadfsticamente significativos. *P<0,05 frente a control + ssAAV2-EGFP; # P<0,05 frente a control + scAAV2-EGFP.
Las FIG. 3A y FIG. 3B muestran analisis de transferencia Southern de distribucion citoplasmica y nuclear de genomas de AAV2 en celulas HeLa tras el pre-tratamiento con Tyr23, expresion en exceso de wtTC-PTP, o tratamiento con MG132 (FIG. 3A), y analisis densitometrico de autorradiograffas para la cuantificacion de cantidades relativas de genomas virales (FIG. 3b). Estos resultados son representativos de dos estudios independientes.
Las FIG. 4A y FIG. 4B muestran los analisis comparativos de la eficiencia de transduccion de AAV2 en celulas HeLa con diversos tratamientos. La FIG. 4A muestra celulas HeLa tratadas con vector vacm o tratadas con Tyr23, MG132, o ambos, y celulas transfectadas establemente con el plasmido de expresion wt-TC-PTP se trataron tanto con vector vacfo como se trataron con MG132 seguido de infeccion con vectores AAV-lacZ. Las celulas se fijaron y se tineron con X-Gal. La expresion transgenica se detecto por microscopfa 48 h despues de la infeccion (aumentos originales: 100*). La FIG. 4B muestra los analisis cuantitativos de la eficiencia de transduccion de AAV evaluados como se
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describe en la leyenda para la FIG. 1A y FIG. 1B, y se determino que eran estadfsticamente significativos. *P<0,05 frente a control + ssAAV2-lacZ.
Las FIG. 5A y FIG. 5B muestran los analisis comparativos de eficiencia de transduccion mediada por AAV2 en celulas HeLa con diversos tratamientos, tras la transduccion con vectores de scAAV2-EGFP. La FIG. 5A muestra celulas HeLa tratadas con vector vado o tratadas con Tyr23, MG132, o ambos, y celulas tanto transfectadas con vector vado como transfectadas establemente con los plasmidos de expresion wt- o mTC-PTP se trataron tanto con vector vado como se trataron con MG132. La expresion transgenica se detecto por microscopfa de fluorescencia 48 h despues de la infeccion (aumentos originales 100*). FIG. 5B: Se evaluaron analisis cuantitativos de la eficiencia de transduccion de AAV como se describe en la leyenda para la FIG. 1A y FIG. 1B, y se determino que eran estadfsticamente significativos. *P<0,05 frente a control + scAAV2-EGFP.
La FIG. 6 muestra los analisis de transferencias Western de protemas ubiquitinadas en celulas HeLa tras el tratamiento con MG132 en presencia o ausencia de Tyr23 o TC-PTP. Se sondaron lisados de celulas completas (WCL) preparados a partir de celulas sin tratar (carriles 1 y 6), y tras el tratamiento con MG132 (carriles 2 y 7), Tyr23 (carril 3), o ambos (carril 8), y celulas tanto transfectadas establemente con los plasmidos de expresion wt- como mTC-PTP tras tanto tratamiento con vector vado (carriles 4 y 5) como tratamiento con MG132 (carriles 9 y 10) con anticuerpo monoclonal anti-Ub.
La FIG. 7 muestra los analisis de transferencias Western de protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas en celulas HeLa tratadas con MG132 en presencia o ausencia de Tyr23 o wtTC-PTP, tras la transduccion con vectores ssAAV2-RFP. WCL preparados a partir de celulas HeLa sin tratar o tratadas con MG132 tras infectarse con vector vado (carril 1 y 2), y celulas HeLa sin tratar (carril 3), tratadas con Tyr23 (carril 4), MG132 (carril 5), o ambos (carril 6), o celulas transfectadas establemente con el plasmido de expresion wtTC-PTP tras tanto el tratamiento con vector vado (carril 7) como el tratamiento con MG132 (carril 8), tras la infeccion con vectores ssAAV2-RFP se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-capside de AAV2 A20, seguido de analisis de transferencia Western con anticuerpo monoclonal anti-Ub.
La FIG. 8 muestra un modelo para la interaccion entre la senalizacion de EGFR-PTK y la via de ubiquitina/proteasoma en la regulacion del trafico intracelular, ademas de la smtesis de ADN de la segunda hebra de vectores AAV2. Endosoma temprano (EE); pozos recubiertos de clatrina (CP); endosoma tardfo (LE); FKBP52 (F); restos de fosfotirosina (P).
La FIG. 9 muestra que la desfosforilacion por tirosina de FKBP52, tanto por pre-tratamiento con Tyr23 como expresion en exceso de TC-PTP, no afecta la expresion genica de GFP tras la transfeccion mediada por plasmido en celulas HeLa.
Las FIG. 10A y FIG. 10B muestran que la eficiencia de transduccion de ni vectores ssAAV (FIG. 10A) ni de rAAV (FIG. 10B) en celulas HeLa que expresan en exceso TC-PTP, o tras el pre-tratamiento con Tyr23, mejoro adicionalmente mediante tratamiento con MG132 bajo condiciones no saturantes (1.000 o 2.000 partmulas virales/celula) de transduccion.
Las FIG. 11 muestra que la fosforilacion in vitro de capsides de AAV2 por EGFR-PTK de dos sistemas de encapsidacion diferentes se analizo por transferencia Western usando anticuerpo anti-p-Tyr para la deteccion de protemas de la capside que contienen fosfotirosina. K9: AAV2-adiponectina (sistema de encapsidacion de rAAV heterologo basado en baculovirus); RFP: ssAAV2-RFP (sistema de encapsidacion de rAAV basado en celulas 293); ds-EGFP:scAAV2-CB-EGFP (sistema de encapsidacion de rAAV basado en celulas 293).
Las FIG. 12 muestra que la fosforilacion in vitro de capsides de AAV2 por EGFR-PTK seguido de separacion de viriones intactos y protemas de la capside libres usando dispositivos de filtro centnfugo [(Ultracel™ YM-100 (kDa) y YM-30 (kDa)] se analizo por transferencia Western usando anticuerpo anti-p-Tyr para la deteccion de protemas de la capside que contienen fosfotirosina y anticuerpo anti-capside del AAV (B1) para la deteccion de protemas de la capside totales. K9: AAV2-adiponectina (sistema de encapsidacion de rAAV heterologo basado en baculovirus).
Las FIG. 13 muestra el analisis de transferencia por ranuras para la entrada de AAV2 a celulas HeLa despues de la fosforilacion in vitro de capsides de AAV por EGFR-PTK. Se infectaron celulas HeLa por vectores AAV2-LacZ, que se pre-incubaron con ATP, EGFR-TPK o ambos. Se aislaron muestras de ADN de Mr bajo 2 h despues de la infeccion y se analizaron por hibridacion por transferencia por ranuras usando una sonda de ADN LacZ marcada con
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Las FIG. 14A y FIG. 14B detallan los analisis comparativos de la eficiencia de transduccion mediada por ssAAV2 en celulas HeLa despues de la fosforilacion in vitro de capsides de AAV por EGFR-PTK. FIG. 14A: Se infectaron celulas HeLa por vectores ssAAV2-RFP, que se pre-incubaron con ATP, EGFR-TPK, o ambos. La expresion transgenica se detecto por microscopfa de fluorescencia 48 h despues de la infeccion (aumentos originales: 100*). La FIG. 14B muestra los analisis cuantitativos de la eficiencia de transduccion de AAV2. Se analizaron cuantitativamente imagenes de cinco campos visuales por el software de analisis ImageJ®. La expresion transgenica se evaluo como el area total de fluorescencia roja (pixel2) por campo visual (media ± DE). Se uso analisis de la varianza (ANOVA)
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para comparar los resultados de pruebas con el control y se determino que eran estadfsticamente significativas. *P<0,05 frente a ssAAV2-RFP.
Las FIG. 15A y FIG. 15B ilustran los analisis comparativos de la eficiencia de transduccion mediada por scAAV2 en celulas HeLa despues de la fosforilacion in vitro de capsides de AAV2 por EGFR-PTK. En la FIG. 15A, celulas HeLa se infectaron por vectores de scAAV2-EGFP, que se pre-incubaron con ATP, EGFR-TPK, o ambos. La expresion transgenica se detecto por microscopfa de fluorescencia 48 h despues de la infeccion (aumentos originales: 100*). La FIG. 15B muestra los analisis cuantitativos de eficiencia de transduccion de AAV2 evaluados como se describe en la leyenda para la FIG. 14A y FIG. 14B, y se determino que eran estadfsticamente significativos. *P<0,05 frente a scAAV2-EGFP.
Las FIG. 16A y FIG. 16B representan analisis de hibridacion Southern de la distribucion citoplasmica y nuclear de genomas de AAV2 en celulas HeLa despues de la fosforilacion in vitro de capsides de AAV2 por EGFR-PTK. Se infectaron celulas HeLa por vectores AAV2-LacZ, que se pre-incubaron con ATP, EGFR-TPK, o ambos. Se aislaron muestras de ADN de Mr bajo 18 h despues de la infeccion y se sometieron a electroforesis sobre geles al 1 % de agarosa, seguido de analisis por hibridacion por transferencia Southern usando una sonda de ADN LacZ marcada con 32P (FIG. 16A), y analisis densitometrico de autorradiograffas para la cuantificacion de cantidades relativas de genomas virales (FiG. 16B).
Las FIG. 17A y FIG. 17B muestran transduccion de hepatocitos mediada por AAV2 a partir de ratones C57BL/6 normales inyectados mediante la vena de la cola con vectores de scAAV2-EGFP de capside mutante para tirosina. La FIG. 17A muestra que la expresion transgenica se detecto por microscopfa de fluorescencia 2 semanas despues de la inyeccion de 1 * 1010 partfculas virales/animal mediante la vena de la cola (n = 2 por grupo experimental) (aumentos originales: 50x). La FIG. 17B ilustra la cuantificacion de la eficiencia de transduccion en hepatocitos en ratones C57BL/6. *P<0,01 frente a WT scAAV2-EGFP.
Las FIG. 18A, FIG. 18B, FIG. 18C y FIG. 18D muestran analisis comparativos de la eficiencia de transduccion mediada por AAV2 en celulas HeLa C12 con o sin co-infeccion con adenovirus, y el tratamiento con inhibidores del proteasoma o de EGFR-PTK tras la transduccion con vectores de scAAV2-EGFP de capside mutante para tirosina. La FIG. 18A muestra celulas infectadas con vector vado o infectadas con adenovirus, tras la transduccion con los vectores de AAV2-EGFP WT, Y444F o Y730F (aumentos originales: 100*). La FIG. 18B ilustra la cuantificacion de la eficiencia de transduccion en celulas HeLa C12. Se muestran en la FIG. 18C celulas que fueron tratadas con vector vado o tratadas con Tyr23, o MG132, tras la transduccion con vectores de AAV2-EGFP WT o Y730F (aumentos originales: 100 x). La FIG. 18D ilustra la cuantificacion de la eficiencia de transduccion. *P<0,05 frente a control.
Las FIG. 19 ilustra un analisis de hibridacion Western de protemas de la capside AAV2 ubiquitinadas en celulas HeLa tras la transduccion con vectores de scAAV2-EGFP mutantes para tirosina. Se inmunoprecipitaron lisados de celulas completas (WCL) preparados a partir de celulas, sin tratar o tratadas con MG132, tras la infeccion con vector vado (carriles 1 y 2), o infectadas con vectores de scAAV2-EGFP WT (carriles 3 y 4), Y730F (carriles 5 y 6), o Y444F (carriles 7 y 8) con anticuerpo anti-capside de AAV2 A20, seguido de analisis de transferencia Western con anticuerpo monoclonal anti-Ub P4D1.
Las FIG. 20A y FIG. 20B representan analisis de hibridacion Southern para el trafico intracelular de los vectores de scAAV2-EGFP WT y mutantes para tirosina y la distribucion citoplasmica [C] y nuclear [N] de genomas de AAV2. Se infectaron con vector vado celulas HeLa (carriles 1 y 2) o se infectaron con los vectores de scAAV2-EGFP WT (carriles 2 y 3), Y730F (carriles 5 y 6) o Y444F (carriles 7 y 8). En la FIG. 20A, se obtuvieron fracciones nucleares y citoplasmicas 18 h despues de la infeccion, se aislaron muestras de ADN de Mr bajo y se sometieron a electroforesis sobre geles al 1 % de agarosa, seguido de hibridacion de transferencia Southern usando una sonda de ADN lacZ marcada con 32P. En la FIG. 20B se demuestra la cuantificacion de cantidades relativas de genomas virales. Estos resultados son representativos de dos estudios independientes.
Las FIG. 21A, FIG. 21B, FIG. 21C y FIG. 21D ilustran analisis comparativos de la eficiencia de transduccion mediada por vectores ssAAV2-ApoE/hAAT-hF.IX WT o Y730F en hepatocitos en ratones in vivo. Se determino la expresion de F.IX humano (hF.IX) en plasma en funcion del tiempo despues de la inyeccion de 1 * 1011 partfculas virales/animal en ratones BALB/c (FlG. 21A) y C3H/HeJ (FIG. 21B) mediante la vena de la cola (tv), y 1 * 1010 partfculas virales/animal en ratones C57BL/6 mediante la vena de la cola (tv) (FIG. 21C), o vena porta (pv) (FIG. 21D). Se indica para cada panel el aumento en veces de los niveles pico de hF.lX de vectores Y730F en comparacion con los vectores de la capside WT. Los datos son media ± DE (n = 4 por grupo experimental).
DESCRIPCION DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
Realizaciones ilustrativas de la invencion se describen a continuacion. En interes de la claridad, no todas las caractensticas de una implementacion actual se describen en esta memoria descriptiva. Se apreciara, por supuesto, que en el desarrollo de cualquiera realizacion actual tal deben hacerse numerosas decisiones espedficas de la implementacion para lograr los objetivos espedficos de los desarrolladores, tales como el cumplimiento con los conceptos relacionados con el sistema y relacionados con el negocio, que variara de una implementacion a otra. Ademas, se apreciara que un esfuerzo de desarrollo tal podna ser complejo y requerir tiempo, pero sin embargo
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sena una rutina que se empieza para aquellos expertos habituales en la materia que tienen el beneficio de la presente divulgacion.
El virus adeno-asociado 2 (AAV2) es un parvovirus patogeno no humano que ha atrafdo atencion como una alternativa a los vectores basados en retrovirus y adenovirus mas comunmente usados para transferencia genica y terapia genica. Se ha mostrado que los vectores AAV2 recombinantes transducen una amplia variedad de celulas y tejidos in vitro e in vivo, y estan actualmente en uso en ensayos clmicos de fase I/II para terapia genica de varias enfermedades tales como fibrosis qmstica, deficiencia de a-1-antitripsina, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Batten y distrofia muscular. Se han realizado estudios sistematicos para esclarecer algunas de las etapas fundamentales en el ciclo de vida de los vectores AAV2, que incluyen union y entrada viral, trafico intracelular, denudado, smtesis de ADN de la segunda hebra y expresion transgenica, e integracion del genoma viral en el cromosoma de la celula huesped.
Se ha mostrado que la via de ubiquitina-proteasoma desempena una funcion esencial en el trafico intracelular de AAV2. Tambien se ha observado que perturbaciones en la senalizacion EGFR-PTK afectan la eficiencia de la transduccion de AAV2 por no solo aumentando la smtesis de ADN de la segunda hebra viral, sino tambien facilitando el trafico intracelular del citoplasma al nucleo. Previamente se informo que las capsides de AAV2 intactas podnan ser fosforiladas en restos de tirosina por EGFR-PTK, pero no en restos de serina/treonina por casema cinasa II (CKII) bajo condiciones libres de celulas in vitro, y que la fosforilacion por tirosina de capsides de AAV2 afecta negativamente el trafico intracelular viral y la expresion transgenica en celulas intactas in vivo. Basandose en estos estudios, se planteo la hipotesis de que la fosforilacion mediada por EGFR-PTK de protemas de la capside en restos de tirosina es un requisito previo para la ubiquitinacion de partmulas de AAV2 intactas, y que un numero sustancial de viriones ubiquitinados son reconocidos y degradados por proteasomas citoplasmicos en su camino al nucleo, conduciendo al transporte nuclear ineficaz.
La sustitucion de restos de tirosina expuestos en la superficie sobre capsides de AAV2 permite asf que los vectores escapen de la ubiquitinacion y, asf, la degradacion mediada por el proteasoma. Los inventores han demostrado que las capsides de AAV pueden ser fosforiladas en restos de tirosina por EGFR-PTK en un ensayo de fosforilacion in vitro, y que las capsides de AAV fosforiladas retienen su integridad estructural. Aunque los vectores AAV fosforilados podnan entrar en celulas tan eficientemente como su homologo sin fosforilar, su eficiencia de transduccion se redujo significativamente. Esta reduccion no fue debida a la smtesis de ADN de la segunda hebra viral alterada, ya que la eficiencia de transduccion de tanto vectores AAV monocatenarios (ssAAV) como AAV auto-complementarios (rAAV) se redujo ~68 % y ~74 %, respectivamente. El trafico intracelular de vectores AAV fosforilados en tirosina del citoplasma al nucleo tambien disminuyo significativamente, lo mas probablemente condujo a ubiquitinacion de capsides de AAV, seguido de degradacion mediada por el proteasoma.
El vector rAAV puede opcionalmente comprender ademas al menos una secuencia potenciadora que esta operativamente enlazada al segmento de acido nucleico.
Secuencias potenciadoras a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una o mas seleccionadas del grupo que consiste en un potenciador del CMV, un potenciador sintetico, un potenciador espedfico del Idgado, un potenciador espedfico de vascular, un potenciador espedfico del cerebro, un potenciador espedfico de celulas neurales, un potenciador espedfico de pulmon, un potenciador espedfico de musculo, un potenciador espedfico de rinon, un potenciador espedfico de pancreas y un potenciador espedfico de celulas de los islotes.
Promotores a modo de ejemplo incluyen uno o mas promotores constitutivos o inducibles heterologos espedficos de tejido, que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor del cMv, un promotor de p-actina, un promotor de insulina, un promotor de enolasa, un promotor de BDNF, un promotor de NGF, un promotor de EGF, un promotor del factor de crecimiento, un promotor espedfico de axones, un promotor espedfico de dendritas, un promotor espedfico del cerebro, un promotor espedfico del hipocampo, un promotor espedfico de rinon, un promotor de elafina, un promotor de citocinas, un promotor de interferon, un promotor del factor de crecimiento, un promotor de alfa-1-antitripsina, un promotor espedfico del cerebro, un promotor espedfico de celulas neurales, un promotor espedfico de celulas del sistema nervioso central, un promotor espedfico de celulas del sistema nervioso periferico, un promotor de interleucina, un promotor de serpina, un promotor del CMV Idbrido, un promotor de p-actina Idbrido, un promotor de EF1, un promotor de U1a, un promotor deU1b, un promotor inducible por Tety un promotor de VP16-LexA. En realizaciones a modo de ejemplo, un promotor es un promotor de p-actina de marnffero o aviar.
El primer segmento de acido nucleico puede tambien comprender ademas una secuencia reguladora post- transcripcional o una senal de poliadenilacion, que incluye, por ejemplo, pero no se limita a, un elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de la marmota, o una secuencia senal de poliadenilacion.
Agentes terapeuticos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un agente seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido, un peptido, un anticuerpo, un fragmento de union al antfgeno, una ribozima, un acido nucleico peptfdico, un ARNip, una iARN, un oligonucleotido antisentido y un polinucleotido antisentido.
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En realizaciones a modo de ejemplo, los vectores rAAV de la invencion codificaran una protema terapeutica o polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un agonista adrenergico, un factor antiapoptosis, un inhibidor de la apoptosis, un receptor de citocinas, una citocina, una citotoxina, un agente eritropoyetico, una acido glutamico descarboxilasa, una glucoprotema, un factor de crecimiento, un receptor del factor de crecimiento, una hormona, un receptor de hormona, un interferon, una interleucina, un receptor de interleucina, una cinasa, un inhibidor de cinasas, un factor de crecimiento nervioso, una netrina, un peptido neuroactivo, un receptor de peptido neuroactivo, un factor neurogenico, un receptor de factor neurogenico, una neuropilina, un factor neurotrofico, una neurotrofina, un receptor de neurotrofina, un antagonista de N-metil-D-aspartato, una plexina, una proteasa, un inhibidor de la proteasa, una protema descarboxilasa, una protema cinasa, un inhibidor de protema cinasa, una protema proteolftica, un inhibidor de protema proteolftica, una semaforina, un receptor de semaforina, una protema de transporte de serotonina, un inhibidor de la captacion de serotonina, un receptor de serotonina, una serpina, un receptor de serpina y un supresor tumoral.
En ciertas aplicaciones, los vectores de alta eficiencia de transduccion modificados pueden comprender un segmento de acido nucleico que codifica un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GM-CSF, gonadotropina, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, TGF-B2, TNF, VEGF, prolactina, somatotropina, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10(I87A), IL-10 viral, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, lL-15, IL-16, IL-17 e IL-18. Tales agentes terapeuticos pueden ser de origen humano, murino, aviar, porcino, bovino, ovino, felino, canino, equino, epino, caprino, lupino o de primate.
En realizaciones a modo de ejemplo, la mutacion puede hacerse en uno o mas de los siguientes restos de aminoacidos: Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730; Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr720. Mutaciones a modo de ejemplo son mutaciones de tirosina a fenilalanina que incluyen, pero no se limitan a, Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F.
Los vectores rAAV de la presente invencion puede estar comprendidos dentro de una partmula viral adeno-asociada o virion de rAAV infeccioso, que incluye, por ejemplo, viriones seleccionados del grupo que consiste en un serotipo 1 de AAV, un serotipo 2 de AAV, un serotipo 3 de AAV, un serotipo 4 de AAV, un serotipo 5 de AAV y un serotipo 6 de AAV.
Los vectores rAAV de la presente invencion tambien pueden estar comprendidos dentro de una celula huesped de mamftero aislada, que incluyen, por ejemplo, celulas huesped humanas, de primate, murinas, felinas, caninas, porcinas, ovinas, bovinas, equinas, epinas, caprinas y lupinas. Los vectores rAAV pueden estar comprendidos dentro de una celula huesped de mamftero aislada tal como una celula humana endotelial, epitelial, vascular, de tftgado, pulmon, corazon, pancreas, intestinal, rinon, musculo, hueso, neural, sangumea o de cerebro .
En realizaciones relacionadas, la invencion tambien proporciona una composicion que comprende uno o mas de los vectores rAAV modificados en tirosina desvelados comprendidos dentro de un kit para diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar uno o mas smtomas de una enfermedad de mamftero, lesion, trastorno, traumatismo o disfuncion. Tales kits pueden ser utiles en el diagnostico, profilaxis y/o terapia, y particularmente utiles en el tratamiento, prevencion y/o mejora de uno o mas smtomas del cancer, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad renal, enfermedad cardiovascular, enfermedad pancreatica, enfermedad intestinal, enfermedad del tftgado, enfermedad neurologica, trastorno neuromuscular, deficit neuromotor, alteracion neuroesqueletica, incapacidad neurologica, disfuncion neurosensorial, accidente cerebrovascular, isquemia, trastorno de la alimentacion, deficiencia de ai-antitripsina (AAT), enfermedad de Batten, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad esqueletica, traumatismo o enfermedad pulmonar.
La invencion tambien proporciona el uso de una composicion desvelada en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar los smtomas de una enfermedad, trastorno, disfuncion, lesion o traumatismo, que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento, prevencion y/o profilaxis de una enfermedad, trastorno o disfuncion, y/o la mejora de uno o mas smtomas de una enfermedad, trastorno o disfuncion tal.
Afecciones a modo de ejemplo para las que la terapia genica basada en virus rAAV puede encontrar utilidad
particular incluyen, pero no se limitan a, cancer, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad renal, enfermedad cardiovascular, enfermedad pancreatica, enfermedad intestinal, enfermedad del tftgado, enfermedad neurologica, trastorno neuromuscular, deficit neuromotor, alteracion neuroesqueletica, incapacidad neurologica, disfuncion neurosensorial, accidente cerebrovascular, deficiencia de ai-antitripsina (AAT), enfermedad de Batten, isquemia, un trastorno de la alimentacion, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad esqueletica y enfermedad pulmonar.
La invencion tambien proporciona un metodo de tratamiento o mejora de los smtomas de una enfermedad, lesion, trastorno o disfuncion tal en un mamftero. Tales metodos generalmente implican al menos la etapa de administrar a un mamftero en necesidad del mismo uno o mas de los vectores rAAV modificados en tirosina como se ha
desvelado en el presente documento, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar los
smtomas de una enfermedad, lesion, trastorno o disfuncion tal en el mamftero.
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Tales pautas de tratamiento son particularmente contempladas en la terapia humana, mediante la administracion de una o mas composiciones tanto por v^a intramuscular, por via intravenosa, por via subcutanea, por via intratecal, por via intraperitoneal, como por inyeccion directa en un organo o un tejido del mai^ero en cuidado.
La invencion tambien proporciona un metodo para proporcionar a un mairnfero en necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente eficaz de las composiciones de rAAV de la presente invencion, en una cantidad y durante un tiempo eficaces para proporcionar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz del (de los) agente(s) terapeutico(s) deseado(s) codificado(s) por uno o mas segmentos de acidos nucleicos comprendidos en el vector rAAV. Preferentemente, el agente terapeutico esta seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido, un peptido, un anticuerpo, un fragmento de union al antigeno, una ribozima, un acido nucleico peptfdico, un ARNip, una iARN, un oligonucleotido antisentido y un polinucleotido antisentido.
COMPOSICIONES DE VECTORES AAV
Un aspecto importante de la presente metodologfa es el hecho de que los vectores rAAV mejorados descritos en el presente documento permitan la administracion de tttulos mas pequenos de partfculas virales con el fin de lograr la misma eficiencia de transduccion que la obtenida usando niveles mas altos de vectores rAAV no modificados en la capside superficial convencionales. Para este fin, la cantidad de composiciones de AAV y el tiempo de administracion de tales composiciones estaran dentro del alcance del experto que tiene beneficio de las presentes ensenanzas. En realidad, los inventores contemplan que la administracion de cantidades terapeuticamente eficaces de las composiciones desveladas puede lograrse por una unica administracion tal como, por ejemplo, una inyeccion unica de numeros suficientes de partfculas infecciosas para proporcionar beneficio terapeutico al paciente que recibe tal tratamiento. Alternativamente, en algunas circunstancias, puede desearse proporcionar multiples administraciones, o sucesivas, de las composiciones de vectores AAV, tanto durante un periodo de tiempo relativamente corto, como uno relativamente prolongado, como puede determinarse por el profesional medico que supervisa la administracion de tales composiciones. Por ejemplo, el numero de partfculas infecciosas administradas
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a un mamffero puede ser del orden de aproximadamente 10, 10, 10, 10 , 10 , 10 , 10 , o incluso mayor, partfculas infecciosas/ml administradas bien como una dosis unica, o bien divididas en dos o mas administraciones como pueden requerirse para lograr la terapia de la enfermedad o trastorno particular que esta tratandose. En realidad, en ciertas realizaciones, puede ser deseable administrar dos o mas composiciones de vectores AAV diferentes, tanto solas como en combinacion con uno o varios de otros farmacos terapeuticos para lograr los efectos deseados de una pauta de terapia particular. En la mayona de las pautas de terapia genica basadas en rAAV, los inventores creen que se requerira un tftulo mas bajo de partfculas infecciosas si se usan los vectores rAAV de capside modificados en comparacion con protocolos de terapia genica convencionales.
Como se usa en el presente documento, los terminos celulas "manipuladas por ingeniena" y "recombinantes" pretenden referirse a una celula en la que se ha introducido un segmento de polinucleotido exogeno (tal como el segmento de ADN que conduce a la transcripcion de un agente terapeutico biologicamente activo). Por tanto, las celulas manipuladas por ingeniena son distinguibles de las celulas que existen de forma natural, que no contienen un segmento de ADN exogeno recombinantemente introducido. Las celulas manipuladas por ingeniena son, por tanto, celulas que comprenden al menos uno o mas segmentos de polinucleotido heterologo introducidas mediante la mano del hombre.
Para expresar un agente terapeutico segun la presente invencion puede prepararse un vector de expresion de rAAV modificado en tirosina que comprende un segmento de acido nucleico que codifica un agente terapeutico bajo el control de uno o mas promotores. Para poner una secuencia "bajo el control de" un promotor, se pone el extremo 5' del sitio de iniciacion de la transcripcion del marco de lectura transcripcional generalmente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleotidos "aguas abajo" (es decir, 3') del promotor elegido. El promotor "en la direccion 5'" estimula la transcripcion del ADN y promueve la expresion del polipeptido codificado. Esto es el significado de "expresion recombinante" en este contexto. Construcciones de vectores recombinantes particularmente preferidas son aquellas que comprenden un vector rAAV. Tales vectores se describen en detalle en el presente documento.
Cuando se contempla el uso de tales vectores para la introduccion de una o mas protemas exogenas, polipeptidos, peptidos, ribozimas y/u oligonucleotidos antisentido, a una celula particular transfectada con el vector, pueden emplearse los vectores rAAV o los vectores rAAV modificados en tirosina desvelados en el presente documento modificando geneticamente los vectores para comprenden ademas al menos un primer polinucleotido exogeno operablemente situado en la direccion 3' y bajo el control de al menos un primer promotor heterologo que expresa el polinucleotido en una celula que comprende el vector para producir el peptido codificado, protema, polipeptido, ribozima, ARNip, iARN u oligonucleotido antisentido. Tales construcciones pueden emplear promotores heterologos que son constitutivos, inducibles, o incluso promotores espedficos de celula. A modo de ejemplo, tales promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores virales, de marnffero y aviares, que incluyen, por ejemplo, un promotor del CMV, un promotor de p-actina, un promotor del CMV fubrido, un promotor de p-actina fubrido, un promotor de EF1, un promotor de U1a, un promotor de U1b, un promotor inducible por Tet, un promotor de VP16-LexA, y similares.
Los vectores o sistemas de expresion pueden tambien comprender ademas uno o mas potenciadores, elementos reguladores, elementos de transcripcion, para alterar o afectar la transcripcion del gen heterologo clonado en los vectores rAAV. Por ejemplo, los vectores rAAV de la presente invencion pueden comprender ademas al menos un
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primer potenciador del CMV, un potenciador sintetico, o un potenciador espedfico de celulas o de tejidos. El polinucleotido exogeno tambien puede comprender ademas una o mas secuencias de intrones.
COMPOSICIONES FARMACEUTICAS
Las construcciones geneticas de la presente invencion pueden prepararse en una variedad de composiciones, y tambien pueden formularse en vehuculos farmaceuticos apropiados para administracion a sujetos humanos o animales. Las moleculas de rAAV de la presente invencion y las composiciones que las comprenden proporcionan terapeuticos nuevos y utiles para el tratamiento, control y mejora de smtomas de una variedad de trastornos, y en particular, enfermedades articulares, trastornos y disfunciones, que incluyen, por ejemplo, osteoartritis, artritis reumatoide y trastornos relacionados. Ademas, las composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de los compuestos de acido nucleico desvelados en el presente documento proporcionan ventajas significativas con respecto a las terapias convencionales existentes - concretamente, (1) sus efectos secundarios reducidos, (2) su elevada eficacia durante periodos de tiempo prolongados, (3) su capacidad para aumentar el cumplimiento del paciente debido a su capacidad para proporcionar efectos terapeuticos tras tan solo una unica administracion de la composicion de rAAV terapeutica seleccionada para individuos afectados. Composiciones farmaceuticas a modo de ejemplo y metodos para su administracion se tratan en detalle significativo en el presente documento mas adelante.
La invencion tambien proporciona composiciones que comprenden uno o mas de los vectores rAAV desvelados, sistemas de expresion, viriones, partfculas virales; o celulas de mairnfero. Como se describe en el presente documento mas adelante, tales composiciones pueden comprender ademas un excipiente farmaceutico, tampon o diluyente, y pueden formularse para administracion a un animal, y particularmente un ser humano. Tales composiciones pueden comprender adicionalmente opcionalmente un liposoma, un lfpido, un complejo de lfpido, una microesfera, una micropartfcula, una nanoesfera, o una nanopartfcula, o pueden formularse de otro modo para administracion a las celulas, tejidos, organos o cuerpo de un mamffero en necesidad de las mismas. Tales composiciones pueden formularse para su uso en una variedad de terapias tales como, por ejemplo, en la mejora, prevencion y/o tratamiento de afecciones tales como deficiencia de peptidos, deficiencia de polipeptidos, expresion en exceso de peptidos, expresion en exceso de polipeptidos, que incluyen, por ejemplo, afecciones que producen enfermedades o trastornos tales como canceres, tumores, u otros crecimientos malignos, disfuncion por deficit neurologico, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades articulares, enfermedades cardfacas o pulmonares, isquemia, ictus apopletico, accidentes cerebrovasculares, ataques isquemicos transitorios (TIA); diabetes y/u otras enfermedades del pancreas; enfermedad o disfuncion cardiocirculatoria (incluyendo, por ejemplo, hipotension, hipertension, aterosclerosis, hipercolesterolemia, dano o enfermedad vascular; enfermedades neurales (incluyendo, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, de Huntington, de Tay-Sach y de Parkinson, perdida de memoria, traumatismo, alteracion motora, neuropatfa y trastornos relacionados); enfermedad o disfuncion biliar, renal o hepatica; enfermedades musculoesqueleticas o neuromusculares (incluyendo, por ejemplo, artritis, paralisis, fibrosis qmstica (CF), esclerosis lateral amiotrofica (ALS), esclerosis multiple (MS), distrofia muscular (MD) y similares).
En ciertas realizaciones, la presente invencion se refiere a la formulacion de una o mas composiciones basadas en rAAV desveladas en el presente documento en disoluciones farmaceuticamente aceptables para administracion a una celula o un animal, tanto solas como en combinacion con una o varias de otras modalidades de terapia, y en particular, para terapia de celulas humanas, tejidos y enfermedades que afectan al hombre.
Tambien se entendera que, si se desea, pueden administrarse segmentos de acidos nucleicos, composiciones de ARN, ADN o PNA que expresan uno o mas de los productos genicos terapeuticos en combinacion con otros agentes tambien, tales como, por ejemplo, protemas o polipeptidos o diversos agentes farmaceuticamente activos, que incluyen una o mas administraciones sistemicas o topicas de polipeptidos terapeuticos, fragmentos biologicamente activos, o variantes de los mismos. En realidad, practicamente no hay lfmite a otros componentes que tambien pueden incluirse, dado que los agentes adicionales no producen un efecto adverso significativo tras el contacto con las celulas diana o tejidos huesped. Las composiciones geneticas basadas en rAAV pueden asf administrarse junto con diversos otros agentes segun se requiera en el caso particular. Tales composiciones pueden purificarse de celulas huesped u otras fuentes biologicas, o alternativamente pueden sintetizarse qmmicamente como se describe en el presente documento. Asimismo, tales composiciones pueden comprender ademas ARN sustituido o derivatizado, ADN, ARNip, ARNm, ARNt, ribozima, moleculas de ARN cataltticas, o composiciones de PNA, y similares.
La formulacion de excipientes farmaceuticamente aceptables y disoluciones de vehuculo es muy conocida para aquellos expertos en la materia, ya que es el desarrollo de dosificaciones adecuadas y pautas de tratamiento para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una variedad de pautas de tratamiento, que incluyen, por ejemplo, administracion y formulacion oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intrarticular, intramuscular.
Normalmente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente el 0,1 % del compuesto activo o mas, aunque el porcentaje de principio(s) activo(s) puede, por supuesto, variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 1 o el 2 % y aproximadamente el 70 % o el 80 % o mas del peso o volumen de la formulacion total. Naturalmente, la cantidad de compuesto(s) activo(s) que puede prepararse en cada composicion terapeuticamente util es de tal forma que se obtendra una dosificacion adecuada en cualquier dosis unitaria dada del
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compuesto. Factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biologica, via de administracion, estabilidad en almacen del producto, ademas de otras consideraciones farmacologicas, se contemplaran por un experto en la materia de la preparacion de tales formulaciones farmaceuticas, y como tales, puede ser deseable una variedad de dosificaciones y pautas de tratamiento.
En ciertas circunstancias sera deseable administrar las construcciones terapeuticas basadas en vectores AAV en las composiciones farmaceuticas adecuadamente formuladas desveladas en el presente documento tanto por via subcutanea, intraocular, intravttrea, parenteral, subcutanea, intravenosa, intracerebro-ventricular, intramuscular, intratecal, oral, intraperitoneal, por inhalacion oral o nasal, como por inyeccion directa a una o mas celulas, tejidos u organos por inyeccion directa. Los metodos de administracion tambien pueden incluir aquellas modalidades como se describen en la patente de EE.UU. 5.543.158; patente de EE.UU. 5.64l.515 y patente de EE.UU. 5.399.363 (cada una espedficamente incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad). Pueden prepararse disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables en agua esteril y tambien pueden mezclarse adecuadamente con uno o mas tensioactivos, tales como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmaceuticas de las composiciones virales basadas en AAV adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles (patente de EE.UU. 5.466.468, espedficamente incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad). En todos los casos la forma debe ser esteril y debe ser fluida hasta el punto de que exista facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe preservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El veldculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y por el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede provocarse por diversos agentes antibacterianamente antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administracion de una disolucion acuosa inyectable, por ejemplo, la disolucion puede ser adecuadamente tamponada, si fuera necesario, y el diluyente lfquido convertirse primero en isotonico con solucion salina suficiente o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso esteril que puede emplearse sera conocido para aquellos expertos en la materia en vista de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosificacion puede disolverse en 1 ml de disolucion isotonica de NaCl y tanto anadirse a 1000 ml de lfquido de hipodermoclisis como inyectarse en el sitio de infusion propuesto (vease, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edicion, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variacion en la dosificacion se producira necesariamente dependiendo de la afeccion del sujeto que esta tratandose. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Ademas, para administracion humana, las preparaciones deben cumplir esterilidad, pirogenicidad, y las normas generales de seguridad y pureza como se exige por las normas de la Oficina de Biologfa de la FDA.
Las disoluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los fragmentos de ADN que codifican polipeptidos terapeuticos administrados en vectores aAv activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros componentes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un veldculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado a vado y liofilizacion que dan un polvo del principio activo mas cualquier componente deseado adicional de una disolucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.
Las composiciones de vectores AAV desveladas en el presente documento tambien pueden formularse en una forma neutra o de sal. Sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorddrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y similares. Sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivarse de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares. Tras la formulacion, las disoluciones se administraran de un modo compatible con la formulacion de dosificacion y en tal cantidad que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion tales como disoluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmacos, y similares.
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La cantidad de composiciones de AAV y el tiempo de administracion de tales composiciones estara dentro del ambito del experto que tiene beneficio de las presentes ensenanzas. Es probable, sin embargo, que la administracion de cantidades terapeuticamente eficaces de las composiciones desveladas pueda lograrse por una administracion unica, tal como, por ejemplo, una inyeccion unica de numeros suficientes de partfculas infecciosas para proporcionar beneficio terapeutico al paciente que recibe tal tratamiento. Alternativamente, en algunas circunstancias, puede desearse proporcionar multiples administraciones, o sucesivas, de las composiciones de vectores AAV, tanto durante un periodo de tiempo relativamente corto, como uno relativamente prolongado, como puede determinarse por el profesional medico que supervisa la administracion de tales composiciones. Por ejemplo, el numero de partfculas infecciosas administradas a un mairnfero puede ser del orden de aproximadamente 107, 108,
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10 , 10 , 10 , 10 , 10 , o incluso mas alto, partfculas infecciosas/ml administradas bien como una dosis unica, o bien dividida en dos o mas administraciones como puedan requerirse para lograr la terapia de la enfermedad o trastorno particular que esta tratandose. En realidad, en ciertas realizaciones, puede ser deseable administrar dos o mas composiciones de vectores AAV diferentes, tanto solas, como en combinacion con uno o varios de otros farmacos terapeuticos para lograr los efectos deseados de una pauta de terapia particular.
VECTORES DE EXPRESION
La presente invencion contempla una variedad de sistemas de expresion basados en AAV, y vectores. En una realizacion, los vectores de expresion de AAV preferidos comprenden al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica un peptido terapeutico, protema, o polipeptido. En otra realizacion, los vectores de expresion de AAV preferidos desvelados en el presente documento comprenden al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica una molecula antisentido. En otra realizacion, un promotor esta operativamente enlazado a una region de secuencia que codifica un ARNm funcional, un ARNt, una ribozima o un ARN antisentido.
La eleccion de que vector de expresion y, por ultimo lugar, a que promotor esta operativamente enlazada una region codificante de polipeptido, dependen directamente de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la localizacion y el momento preciso de la expresion de protemas, y la celula huesped que va a transformarse. Estas son limitaciones muy conocidas inherentes en la materia de la construccion de moleculas de ADN recombinantes. Sin embargo, un vector util en la practica de la presente invencion es capaz de dirigir la expresion del ARN funcional al que esta operativamente enlazado.
La ARN polimerasa transcribe una secuencia de ADN codificante mediante un sitio en el que se produce la poliadenilacion. Normalmente, las secuencias de ADN localizadas algunos cientos de pares de bases en la direccion 3' del sitio de poliadenilacion sirven para terminar la transcripcion. Aquellas secuencias de ADN se denominan en el presente documento regiones de terminacion de la transcripcion. Aquellas regiones se requieren para la eficaz poliadenilacion de ARN mensajero (ARNm) transcrito.
Se ha desarrollado una variedad de metodos para enlazar operativamente el ADN a vectores mediante extremos cohesivos complementarios o extremos romos. Por ejemplo, pueden anadirse tractos homopolimericos complementarios al segmento de ADN que va a insertarse y al ADN de vector. El vector y el segmento de ADN se unen entonces por enlace de hidrogeno entre las colas complementarias y homopolimericas para formar moleculas de ADN recombinantes.
KITS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO
La invencion tambien engloba una o mas de las composiciones de vectores rAAV geneticamente modificadas descritas en el presente documento junto con uno o mas excipientes, vetuculos, diluyentes, adyuvantes y/u otros componentes farmaceuticamente aceptables, como pueden emplearse en las formulaciones de administracion de polinucleotido de rAAV particulares, y en la preparacion de agentes terapeuticos para administracion a un marnffero, y en particularmente, a un ser humano. En particular, tales kits pueden comprender una o mas de las composiciones de rAAV desveladas en combinacion con instrucciones para usar el vector viral en el tratamiento de tales trastornos en un mamffero, y pueden normalmente incluir adicionalmente receptores preparados para el envasado comercial conveniente.
Como tales, animales preferidos para la administracion de las composiciones farmaceuticas desveladas en el presente documento incluyen mamfferos, y particularmente seres humanos. Otros animales preferidos incluyen murinos, bovinos, equinos, porcinos, caninos y felinos. La composicion puede incluir composiciones de rAAV parcialmente o significativamente purificadas, tanto solas como en combinacion con uno o mas principios activos adicionales, que pueden obtenerse de fuentes naturales o recombinantes, o que pueden ser obtenidas naturalmente como tanto sintetizarse qmmicamente, o producirse alternativamente in vitro a partir de celulas huesped recombinantes que expresan segmentos de ADN que codifican tales principios activos adicionales.
Tambien pueden prepararse kits terapeuticos que comprenden al menos una de las composiciones desveladas en el presente documento e instrucciones para usar la composicion como agente terapeutico. El recipiente significa que tales kits pueden normalmente comprender al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otros medios de recipiente, en los que pueden disponerse las composiciones de rAAV desveladas, y preferentemente separadas en alfcuotas adecuadamente. Si tambien se proporciona una segunda composicion de polipeptido terapeutica, el kit
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tambien puede contener un segundo medio de recipiente distinto en el que esta segunda composicion puede disponerse. Alternativamente, la pluralidad de composiciones biologicamente activas terapeuticas puede hacerse en una unica composicion farmaceutica, y pueden envasarse en un unico medio de receptor, tal como un vial, matraz, jeringa, botella, u otros medios de recipiente individual adecuado. Los kits de la presente invencion tambien incluiran normalmente un medio para contener el (los) vial(es) en estrecho confinamiento para venta comercial, tal como, por ejemplo, inyeccion o envases de plastico moldeado por soplado en los que son guardados el (los) vial(es) deseado(s).
PROTEfNAS DE LA CAPSIDE DE rAAV
El ensamblaje supramolecular de 60 subunidades individuales de protema de la capside en una reticula icosaedrica T-1 no envuelta capaz de proteger un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb es una etapa cntica en el ciclo de vida del parvovirus humano dependiente de auxiliar, el virus adeno-asociado 2 (AAV2). La partmula madura de AAV2 de 20 nm de diametro esta compuesta por tres protemas estructurales designadas VP1, VP2 y VP3 (masas moleculares de 87, 73 y 62 kDa respectivamente) en una relacion de 1:1:18. Basandose en su simetna y estas estimaciones de peso molecular, de las 60 protemas de la capside que comprenden la partmula, tres son protemas VP1, tres son protemas VP2, y cincuenta y cuatro son protemas VP3. El empleo de tres protemas estructurales hace los serotipos de AAV unicos entre los parvovirus, ya que todos los otros conocidos encapsidan sus genomas dentro de partmulas icosaedricas compuestas de solo dos protemas de la capside. La disposicion barreloide de la hebra p antiparalela de estas 60 protemas de la capside produce una partmula con un tropismo definido que es altamente resistente a la degradacion. Se ha mostrado por los inventores que la modificacion de uno o mas restos de tirosina en una o mas de las protemas de la capside logra transfeccion superior a dosis mas bajas y coste mas bajo que los protocolos convencionales. Modificando de forma espedfica de sitio uno o mas restos de tirosina sobre la superficie de la capside, los inventores han logrado una mejora significativa en la eficiencia de transduccion.
AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS
En ciertas realizaciones, puede ser necesario emplear una o mas tecnicas de amplificacion de acidos nucleicos para producir los segmentos de acidos nucleicos de la presente invencion. Diversos metodos son muy conocidos para los expertos en el campo, que incluyen, por ejemplo, aquellas tecnicas descritas en el presente documento: El acido nucleico, usado como molde para amplificacion, puede aislarse de celulas contenidas en la muestra biologica segun metodologfas estandar (Sambrook et al., 1989). El acido nucleico puede ser ADN genomico o ARN de celulas fraccionadas o completas. Si se usa ARN, puede desearse convertir el ARN en un ADN complementario. En una realizacion, el ARN es ARN de celulas completas y se usa directamente como molde para la amplificacion.
Pares de cebadores que se hibridan selectivamente con acidos nucleicos correspondientes a las ribozimas o regiones flanqueantes conservadas se ponen en contacto con el acido nucleico aislado en condiciones que permiten la hibridacion selectiva. Se indica que el termino "cebador", como se define en el presente documento, engloba cualquier acido nucleico que sea capaz de cebar la smtesis de un acido nucleico naciente en un proceso dependiente de molde. Normalmente, los cebadores son oligonucleotidos de diez a veinte pares de bases en longitud, pero pueden emplearse secuencias mas largas. Los cebadores pueden proporcionarse en forma bicatenaria o monocatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria. Una vez hibridado, el complejo acido nucleico:cebador se pone en contacto con una o mas enzimas que facilitan una smtesis de acidos nucleicos dependiente de molde. Se realizan multiples rondas de amplificacion, tambien denominadas "ciclos", hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificacion.
A continuacion, se detecta el producto de amplificacion. En ciertas aplicaciones, la deteccion puede realizarse por medios visuales. Alternativamente, la deteccion puede implicar la identificacion indirecta del producto mediante quimioluminiscencia, escintigraffa radiactiva de radiomarca incorporada o marca fluorescente, o incluso mediante un sistema usando senales de impulso electricas o termicas (por ejemplo, tecnologfa Affymax®). Estan disponibles varios procesos dependientes de molde para amplifican las secuencias de marcador presentes en una muestra de molde dada. Uno de los metodos de amplificacion mejor conocidos es la reaccion en cadena de la polimerasa (denominada PCR™), que se describe en detalle en la patente de EE.UU. N.° 4.683.195, la patente de Ee.UU. N.° 4.683.202 y la patente de EE.UU. N.° 4.800.159.
Brevemente, en PCR™, se preparan dos secuencias de cebador que son complementarias a regiones en hebras complementarias opuestas de la secuencia de marcador. Se anade un exceso de trifosfatos de desoxinucleosido a una mezcla de reaccion junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, Taq polimerasa. Si las secuencias de marcador estan presentes en una muestra, los cebadores se uniran al marcador y la polimerasa hara que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia de marcador anadiendo nucleotidos. Aumentando y reduciendo la temperatura de la mezcla de reaccion, los cebadores extendidos se disociaran del marcador para formar productos de reaccion, el exceso de cebadores se unira al marcador y a los productos de reaccion y el proceso se repite.
Puede realizarse un procedimiento de amplificacion por PCR™ con transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificada. Metodos de transcripcion inversa de ARN en ADNc son muy conocidos y se describen en Sambrook et al. (1989). Metodos alternativos para la transcripcion inversa utilizan ADN polimerasas
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dependientes de ARN termostables. Estos metodos se describen en la publicacion de solicitud de patente internacional N.° WO 90/07641.
Las metodologfas de reaccion en cadena de la polimerasa son muy conocidas en la tecnica.
Otro metodo para la amplificacion es la reaccion en cadena de la ligasa ("LCR"), desvelado en el documento EPA No. 320 308, e incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad. En LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de la secuencia diana, cada par se unira a hebras complementarias opuestas de la diana de forma que sean contiguas. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se enlazaran para formar una unica unidad. Por ciclado de temperatura, como en PCR™, las unidades enlazadas unidas se disocian de la diana y entonces sirven de "secuencias diana" para la ligacion del exceso de pares de sondas. La patente de EE.UU. 4.883.750 describe un metodo similar a LCR para la union de pares de sondas a una secuencia diana.
La Qp-replicasa (QpR), descrita en la solicitud de patente internacional N.° PCT/US87/00880, tambien puede usarse como todavfa otro metodo de amplificacion en la presente invencion. En este metodo, una secuencia de ARN replicativa que tiene una region complementaria a la de una diana se anade a una muestra en presencia de una aRn polimerasa. La polimerasa copiara la secuencia replicativa que puede entonces detectarse.
Tambien puede ser util un metodo de amplificacion isotermica, en el que se usan endonucleasas y ligasas de restriccion para lograr la amplificacion de moleculas diana que contienen 5'-[a-tio]-trifosfatos de nucleotido en una hebra de un sitio de restriccion, en la amplificacion de acidos nucleicos en la presente invencion.
La amplificacion por desplazamiento de hebras (SDA), descrita en las patentes de EE.UU. N.° 5.455.166, 5.648.211, 5.712.124 y 5.744.311, es otro metodo para llevar a cabo la amplificacion isotermica de acidos nucleicos que implica multiples rondas de desplazamiento y smtesis de hebras, es decir, traduccion en mellas. Un metodo similar, llamado reaccion en cadena de reparacion (RCR), implica hibridar varias sondas en toda una region elegida como diana para la amplificacion, seguido de una reaccion de reparacion en la que solo dos de las cuatro bases estan presentes. Las otras dos bases pueden anadirse como derivados biotinilados para la facil deteccion. Un enfoque similar se usa en SDA. Tambien pueden detectarse secuencias espedficas de sonda usando una reaccion de sondas dclicas (CPR). En CPR, una sonda que tiene secuencias de 3' y 5' de ADN no espedfico y una secuencia central de ARN espedfico se hibrida con ADN que esta presente en una muestra. Tras la hibridacion, la reaccion se trata con RNasa H, y los productos de la sonda identificados como productos distintivos son liberados despues de la digestion. El molde original se hibrida con otra sonda de ciclado y se repite la reaccion.
Todavfa pueden usarse otros metodos de amplificacion descritos en la solicitud GB N.° 2 202 328, y en la solicitud de patente internacional N.° PCT/US89/01025 segun la presente invencion. En la primera solicitud, cebadores "modificados" se usan en una smtesis similar a PCR™, dependiente de molde y de enzima. Los cebadores pueden modificarse por marcado con un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, enzima). En la ultima solicitud, un exceso de sondas marcadas se anade a una muestra. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y se escinde cataltticamente. Despues de la escision, la secuencia diana se libera intacta para unirse por sonda en exceso. La escision de la sonda marcada senaliza la presencia de la secuencia diana.
Otros procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos incluyen sistemas de amplificacion basados en transcripcion (TAS), que incluyen amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos (NASBA) y 3SR Gingeras et al., publicacion de solicitud de patente internacional N.° WO 88/10315, incorporada en el presente documento por referencia. En NASBA, los acidos nucleicos pueden prepararse para la amplificacion por extraccion en fenol/cloroformo convencional, desnaturalizacion termica de una muestra clmica, tratamiento con tampon de lisis y columnas minispin para el aislamiento de ADN y ARN o extraccion con cloruro de guanidinio de ARN. Estas tecnicas de amplificacion implican hibridar un cebador que tiene secuencias espedficas de diana. Tras la polimerizacion, los hforidos de ADN/aRn se digieren con RNasa H, mientras que las moleculas de ADN bicatenario se desnaturalizan nuevamente por calor. En cualquier caso, el ADN monocatenario se hace completamente bicatenario mediante la adicion del segundo promotor espedfico de diana, seguido de polimerizacion. Las moleculas de ADN bicatenario se transcriben entonces de forma multiple por una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. En una reaccion dclica isotermica, los ARN se transcriben de forma inversa en ADN monocatenario, que luego se convierte en ADN bicatenario, y luego se transcribe una vez mas con una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, tanto truncados como completos, indican secuencias espedficas de diana.
Davey et al., documento EPA N.° 329 822, desvelan un proceso de amplificacion de acidos nucleicos que implica sintetizar dclicamente ARN monocatenario ("ARNmc"), ADNmc y ADN bicatenario (ADNbc), que puede usarse segun la presente invencion. El ARNmc es un molde para un primer oligonucleotido de cebador, que se alarga por transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). Entonces, el ARN se elimina del duplex de ADN:ARN resultante por la accion de ribonucleasa H (RNasa H, una RNasa espedfica para ARN en el duplex con tanto ADN como ARN). El ADNmc resultante es un molde para un segundo cebador, que tambien incluye las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (ejemplificado por la ARN polimerasa T7) 5' con respecto a su homologfa con el molde. Este cebador se extiende entonces por ADN polimerasa (ejemplificado por el fragmento de "Klenow" grande de ADN polimerasa I de E. coli), produciendo una molecula de ADN bicatenario ("ADNbc"), que tiene una secuencia identica
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a la del ARN original entre los cebadores y que tiene adicionalmente, en un extremo, una secuencia promotora. Esta secuencia promotora puede usarse por la ARN polimerasa apropiada para preparar muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden entonces volver a entrar en el ciclo que conduce a una amplificacion muy rapida. Con la apropiada eleccion de enzimas, esta amplificacion puede hacerse isotermicamente sin adicion de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza dclica de este proceso, la secuencia de partida puede elegirse para estar en forma de tanto ADN como ARN.
Miller et al., publicacion de solicitud de patente internacional N.° WO 89/06700, desvela un esquema de amplificacion de secuencias de acidos nucleicos basado en la hibridacion de una secuencia de promotor/cebador con un ADN monocatenario ("ADNmc") diana, seguido de la transcripcion de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es dclico, es decir, no se producen nuevos moldes a partir de los transcritos de ARN resultantes. Otros metodos de amplificacion incluyen "RACE" y "PCR™ de un lado" (Frohman, 1990, espedficamente incorporado en el presente documento por referencia).
Tambien pueden usarse metodos basados en ligacion de dos (o mas) oligonucleotidos en presencia de acido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleotido" resultante, amplificando asf el di-oligonucleotido, en la etapa de amplificacion de la presente invencion.
Tras cualquier amplificacion, puede desearse separar el producto de amplificacion del molde y el exceso de cebador con el fin de determinar si se ha producido amplificacion espedfica. En una realizacion, los productos de amplificacion se separan por agarosa, agarosa-acrilamida o electroforesis en gel de poliacrilamida usando metodos convencionales (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989).
Alternativamente, pueden emplearse tecnicas cromatograficas para efectuar la separacion. Hay muchos tipos de cromatograffa que pueden usarse en la presente invencion: adsorcion, reparto, intercambio ionico y tamiz molecular, y muchas tecnicas especializadas para usarlas que incluyen cromatograffa en columna, papel, capa fina y de gases.
Los productos de amplificacion deben visualizarse con el fin de confirmar la amplificacion de las secuencias de marcador. Un metodo de visualizacion ffpico implica tincion de un gel con bromuro de etidio y visualizacion bajo luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificacion estan mtegramente marcados con nucleotidos marcados con radio o fluorometricamente marcados, los productos de amplificacion pueden entonces exponerse a peffcula de rayos X o visualizarse bajo los espectros de estimulacion apropiados, tras la separacion.
En una realizacion, la visualizacion se logra indirectamente. Tras la reparacion de los productos de amplificacion, una sonda de acido nucleico marcada se pone en contacto con la secuencia de marcador amplificada. La sonda esta preferentemente conjugada con un cromoforo, pero puede radiomarcarse. En otra realizacion, la sonda esta conjugada con un componente de union, tal como un anticuerpo o biotina, y el otro miembro del par de union lleva un resto detectable.
En una realizacion, la deteccion es por transferencia Southern y la hibridacion con una sonda marcada. Las tecnicas implicadas en la transferencia Southern son muy conocidas para aquellos expertos en la materia y pueden encontrarse en muchos libros estandar sobre protocolos moleculares. Vease Sambrook et al., 1989. Brevemente, los productos de amplificacion se separan por electroforesis en gel. El gel se pone en contacto entonces con una membrana, tal como nitrocelulosa, permitiendo la transferencia del acido nucleico y la union no covalente. Posteriormente, la membrana se incuba con una sonda conjugada con cromoforo que es capaz de hibridarse con un producto de amplificacion diana. La deteccion es por exposicion de la membrana a peffcula de rayos X o dispositivos de deteccion emisores de iones.
Un ejemplo de lo anterior se describe en la patente de EE.UU. N.° 5.279.721, que desvela un aparato y metodo para la electroforesis automatizada y la transferencia de acidos nucleicos. El aparato permite la electroforesis y la transferencia sin manipulacion externa del gel y es idealmente adecuado para llevar a cabo metodos segun la presente invencion.
EQUIVALENTES FUNCIONALES BIOLOGICOS
Modificacion y cambios a la estructura de los polinucleotidos y polipeptidos de vectores rAAV no mutantes para proporcionar los viriones de rAAV mejorados como se describe en la presente invencion para obtener vectores virales funcionales que poseen caracteffsticas deseables, particularmente con respecto a la administracion mejorada de construcciones de genes terapeuticos para celulas, tejidos y organos de mairfffero seleccionados para el tratamiento, prevencion y profilaxis de diversas enfermedades y trastornos, ademas de como medios para la mejora de smtomas de tales enfermedades, y para facilitar la expresion de polipeptidos terapeuticos y/o profilacticos exogenos de interes mediante terapia genica mediada por vectores rAAV. Como se ha mencionado anteriormente, uno de los aspectos clave de la presente invencion es la creacion de una o mas mutaciones en secuencias de polinucleotidos espedficas que codifican uno o mas de los agentes terapeuticos codificados por las construcciones de rAAV desveladas. En ciertas circunstancias, la secuencia de polipeptidos resultante se altera por estas mutaciones, o en otros casos, la secuencia del polipeptido no vaffa por una o mas mutaciones en el polinucleotido codificante para producir vectores modificados con propiedades mejoradas para efectuar la terapia genica en sistemas de mairfffero.
Cuando se desea alterar la secuencia de aminoacidos de un polipeptido para crear un equivalente, o incluso una molecula de segunda generacion mejorada, pueden lograrse cambios de aminoacido cambiando uno o mas de los codones de la secuencia de ADN codificante, segun la Tabla 1.
Por ejemplo, ciertos aminoacidos pueden ser sustituidos con otros aminoacidos en una estructura de protema sin 5 perdida apreciable de la capacidad de union interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de union al antigeno de anticuerpos o sitios de union sobre moleculas de sustrato. Como es la capacidad y naturaleza interactiva de una protema la que define esa actividad funcional biologica de la protema, pueden hacerse ciertas sustituciones de secuencias de aminoacidos en una secuencia de protemas, y, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una protema con propiedades similares. Asf, se contempla 10 por los inventores que pueden hacerse diversos cambios en las secuencias de polinucleotidos desveladas en el presente documento, sin perdida apreciable de su utilidad o actividad biologica.
TABLA 1
Aminoacidos
Codones
Alanina
Ala A GCA GCC GCG GCU
Cistema
Cys C UGC UGC
Acido aspartico
Asp D GAC GAU
Acido glutamico
Glu E GAA GAG
Fenilalanina
Phe F UUC UUU
Glicina
Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidina
His H CAC CAU
Isoleucina
Ile I AUA AUC AUU
Lisina
Lys K AAA AAG
Leucina
Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina
Met M AUG
Asparagina
Asn N AAC AAU
Prolina
Pro P CCA CCC CCG CCU
Glutamina
Gln Q CAA CAG
Arginina
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina
Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina
Thr T ACA ACC ACG ACU
Valina
Val V GUA GUC GUG GUU
Triptofano
Trp W UGG
Tirosina
Tyr Y UAC UAU
Al hacer tales cambios, puede considerarse el mdice hidropatico de los aminoacidos. La importancia del mdice 15 hidropatico de los aminoacidos en conferir funcion biologica interactiva a una protema se entiende generalmente en la materia (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado en el presente documento por referencia). Es aceptado que el caracter hidropatico relativo del aminoacido contribuye a la estructura secundaria de la protema resultante, que a su vez define la interaccion de la protema con otras moleculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antfgenos y similares. A cada aminoacido se le ha asignado un mdice hidropatico basandose en sus 20 caractensticas de hidrofobia y carga (Kyte y Doolittle, 1982), estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina
(+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
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Se conoce en la tecnica que ciertos aminoacidos pueden estar sustituidos con otros aminoacidos que tienen un mdice hidropatico o puntuacion similar y todavfa producir una protema con actividad biologica similar, es decir, todavfa obtener una protema funcionalmente equivalente biologica. Al hacer tales cambios, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos indices hidropaticos estan dentro de ± 2, son particularmente preferidos aquellos que estan dentro de ± 1, y son incluso mas particularmente preferidos aquellos dentro de ± 0,5. Tambien se entiende en la materia que la sustitucion de aminoacidos similares puede hacerse eficazmente basandose en la hidrofilia. La patente de EE.UU. 4.554.101, incorporada en el presente documento por referencia, establece que la mayor hidrofilia promedio local de una protema, como esta dominado por la hidrofilia de sus aminoacidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biologica de la protema.
Como se detalla en la patente de EE.UU. 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilia se han asignado a restos de aminoacidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cistema (-1,0); metionina (-1,3); solucion salina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (3,4). Se entiende que un aminoacido puede estar sustituido con otro que tiene un valor de hidrofilia similar y todavfa obtener una protema biologicamente equivalente, y en particular, una inmunologicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos valores de hidrofilia estan dentro de ± 2, son particularmente preferidos aquellos que estan dentro de ±1, y son incluso mas particularmente preferidos aquellos dentro de ± 0,5.
Como se explica resumidamente anteriormente, las sustituciones de aminoacidos se basan generalmente, por tanto, en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoacido, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamano, y similares. Sustituciones a modo de ejemplo que tienen varias de las anteriores caractensticas en consideracion son muy conocidas para aquellos expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
DEFINICIONES A MODO DE EJEMPLO
Segun la presente invencion, los polinucleotidos, segmentos de acidos nucleicos, secuencias de acidos nucleicos, y similares, incluyen, pero no se limitan a, ADN (que incluyen y no se limitan a ADN genomicos o extragenomicos), genes, acidos nucleicos peptfdicos (PNAs), aRn (que incluyen, pero no se limitan a, ARNr, ARNm y ARNt), nucleosidos, y segmentos de acidos nucleicos adecuados tanto obtenidos a partir de fuentes naturales, qmmicamente sintetizados, modificados, como preparados o sintetizados de otro modo por completo o en parte por la mano del hombre.
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comunmente es entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque cualquier metodo y composicion similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento puede usarse en la practica o prueba de la presente invencion, en el presente documento se describen metodos y composiciones preferidos. Para los fines de la presente invencion, los siguientes terminos se definen a continuacion:
Un, una: Segun el antiguo convenio de leyes de patentes, las palabras "un" y "una", cuando se usan en la presente solicitud, que incluyen las reivindicaciones, indican "uno o mas".
Expresion: La combinacion de procesos intracelulares, que incluyen la transcripcion y traduccion experimentada por un polinucleotido tal como un gen estructural para sintetizar el peptido o polipeptido codificado.
Promotor: Un termino usado para describir generalmente la region o regiones de una secuencia de acidos nucleicos que regula la transcripcion.
Elemento regulador: Un termino usado para describir generalmente la region o regiones de una secuencia de acidos nucleicos que regula la transcripcion. Elementos reguladores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, potenciadores, elementos post-transcripcion, secuencias de control de la transcripcion, y similares.
Gen estructural: Un polinucleotido, tal como un gen, que se expresa para producir un peptido codificado, polipeptido, protema, ribozima, molecula de ARN catalftica, ARNip, o molecula antisentido.
Transformacion: Un proceso de introduccion de una secuencia de polinucleotidos exogena (por ejemplo, un vector viral, un plasmido, o una molecula de ADN recombinante o de ARN) en una celula huesped o protoplasto en la que el polinucleotido exogeno se incorpora en al menos un primer cromosoma o es capaz de replicacion autonoma dentro de la celula huesped transformada. La transfeccion, electroporacion y captacion de acido nucleico "desnudo" representan todos ejemplos de tecnicas usadas para transformar una celula huesped con uno o mas polinucleotidos.
Celula transformada: Una celula huesped cuyo complemento de acido nucleico ha sido alterado por la introduccion de uno o mas polinucleotidos exogenos en esa celula.
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Celula transgenica: Cualquier celula derivada o regenerada a partir de una celula transformada o derivada de una celula transgenica, o de la progenie o descendencia de cualquier generacion de una celula huesped transformada tal.
Vector: Una molecula de acido nucleico (normalmente compuesta de ADN) capaz de replicacion en una celula huesped y/o con la que otro segmento de acido nucleico puede enlazarse operativamente de manera que se produzca la replicacion del segmento unido. Un plasmido, cosmido o un virus es un vector a modo de ejemplo.
Los terminos "se corresponde sustancialmente con", "sustancialmente homologo" o "identidad sustancial", como se usan en el presente documento, indican una caractenstica de una secuencia de acidos nucleicos o de aminoacidos, en el que una secuencia de acidos nucleicos o de aminoacidos seleccionada tiene al menos aproximadamente el 70 o aproximadamente el 75 por ciento de identidad de secuencias en comparacion con una secuencia de acidos nucleicos o de aminoacidos de referencia seleccionada. Mas normalmente, la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia tendran al menos aproximadamente el 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o incluso el 85 por ciento de identidad de secuencias, y mas preferentemente al menos aproximadamente el 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 o el 95 porcentaje de identidad de secuencias. Mas preferentemente todavfa, secuencias altamente homologas frecuentemente comparten mas de al menos aproximadamente el 96, 97, 98 o el 99 por ciento de identidad de secuencias entre la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia con la que se comparo.
El porcentaje de identidad de secuencias puede calcularse a lo largo de la longitud entera de las secuencias que van a compararse, o puede calcularse excluyendo pequenas deleciones o adiciones cuyo total es menos de aproximadamente el 25 por ciento o asf de la secuencia de referencia elegida. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mas grande, tal como una porcion de un gen o secuencia flanqueante, o una porcion repetitiva de un cromosoma. Sin embargo, en el caso de homologfa de secuencias de dos o mas secuencias de polinucleotidos, la secuencia de referencia normalmente comprendera al menos aproximadamente 18-25 nucleotidos, mas normalmente al menos aproximadamente 26 a 35 nucleotidos, e incluso mas normalmente al menos aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, o incluso 100 o asf de nucleotidos.
Deseablemente, cuando se desean fragmentos altamente homologos, el grado de identidad en porcentaje entre las dos secuencias sera al menos aproximadamente el 80 %, preferentemente al menos aproximadamente el 85 %, y mas preferentemente aproximadamente el 90 % o el 95 % o mayor, como se ha determinado facilmente por uno o mas de los algoritmos de comparacion de secuencias muy conocidos para aquellos expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el analisis del programa FASTA descrito por Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(8):2444-8, Apr. 1988).
El termino "que existe de forma natural", como se usa en el presente documento como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptidos o de polinucleotidos que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por la mano del hombre en un laboratorio existe de forma natural. Como se usa en el presente documento, cepas de laboratorio de roedores que pueden haber sido criadas selectivamente segun genetica clasica se consideran animales que existen de forma natural.
Como se usa en el presente documento, "heterologo" se define en relacion con una secuencia de genes referenciada predeterminada. Por ejemplo, con respecto a una secuencia de genes estructural, un promotor heterologo se define como un promotor que no se produce naturalmente adyacente al gen natural referenciado estructural, pero que se posiciona por manipulacion de laboratorio. Asimismo, un gen heterologo o segmento de acido nucleico se define como un gen o segmento que no se produce naturalmente adyacente al promotor referenciado y/o elementos potenciadores.
"Elemento regulador de la transcripcion" se refiere a una secuencia de polinucleotidos que activa la transcripcion solo o en combinacion con una o varias de otras secuencias de acidos nucleicos. Un elemento regulador de la transcripcion puede, por ejemplo, comprender uno o mas promotores, uno o mas elementos de respuesta, uno o mas elementos reguladores negativos, y/o uno o mas potenciadores.
Como se usa en el presente documento, un "sitio de reconocimiento del factor de transcripcion" y un "sitio de union del factor de transcripcion" se refieren a una secuencia(s) de polinucleotidos o motivo(s) de secuencia que se identifican por ser sitios para la interaccion espedfica de secuencia de uno o mas factores de transcripcion, frecuentemente tomando la forma de union directa de protema-ADN. Normalmente, los sitios de union de factor de transcripcion pueden identificarse por huella de ADN, ensayos de desplazamiento por movilidad del gel, y similares, y/o pueden predecirse basandose en motivos de secuencia consenso conocidos, o por otros metodos conocidos para aquellos expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, el termino "operativamente enlazado" se refiere a un enlace de dos o mas polinucleotidos o dos o mas secuencias de acidos nucleicos en una relacion funcional. Un acido nucleico esta "operativamente enlazado" cuando se pone en una relacion funcional con otra secuencia de acidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta operativamente enlazado a una secuencia codificante si afecta la transcripcion de la secuencia codificante. "Operativamente enlazadas" significa que las secuencias de acidos
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nucleicos que se enlazan normalmente son contiguas, o sustancialmente contiguas, y, si es necesario unir dos regiones codificantes de protema, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, como los potenciadores generalmente funcionan cuando se separan de un promotor por varias kilobases y las secuencias intronicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos de polinucleotidos pueden estar operativamente enlazados, pero no ser contiguos.
"Unidad transcripcional" se refiere a una secuencia de polinucleotidos que comprende al menos un primer gen estructural operativamente enlazado a al menos una primera secuencia promotora que actua en cis y opcionalmente enlazada operablemente a una o varias de otras secuencias de acidos nucleicos que actuan en cis necesarias para la eficiente transcripcion de las secuencias de genes estructurales, y al menos un primer elemento regulador distal como puede requerirse para la transcripcion espedfica de tejido y de desarrollo apropiada de la secuencia de genes estructural operablemente puesta bajo el control de un promotor y/o elementos potenciadores, ademas de cualquier secuencia en cis adicional que es necesaria para la eficiente transcripcion y traduccion (por ejemplo, sitio(s) de poliadenilacion, secuencia(s) de control de la estabilidad del ARNm, etc.).
El termino "sustancialmente complementaria", cuando se usa para definir tanto secuencias de aminoacidos como de acidos nucleicos, significa que una secuencia particular objeto, por ejemplo, una secuencia de oligonucleotidos, es sustancialmente complementaria a toda o una porcion de la secuencia seleccionada, y asf se unira espedficamente a una porcion de un ARNm que codifica la secuencia seleccionada. Como tales, normalmente las secuencias seran altamente complementarias a la secuencia "diana" de ARNm, y no tendran mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 desapareamientos de bases en toda la porcion complementaria de la secuencia. En muchos casos, puede ser deseable que las secuencias sean apareamientos exactos, es decir, sean completamente complementarias a la secuencia a la que se une espedficamente el oligonucleotido, y por tanto tengan cero desapareamientos a lo largo del estiramiento complementario. Como tales, secuencias altamente complementarias normalmente se uniran bastante espedficamente con la region de la secuencia diana del ARNm y, por tanto, seran altamente eficientes en la reduccion, y/o incluso inhibicion, de la traduccion de la secuencia de ARNm diana en producto de polipeptido.
Secuencias de oligonucleotidos sustancialmente complementarias seran mas de aproximadamente el 80 por ciento complementarias (o '% de apareamientos exactos') a la secuencia diana de ARNm correspondiente a la que el oligonucleotido se une espedficamente a, y seran mas preferentemente mas de aproximadamente el 85 por ciento complementarias a la secuencia diana de ARNm correspondiente a la que el oligonucleotido se une espedficamente. En ciertas aspectos, como se ha descrito anteriormente, se deseara tener secuencias de oligonucleotidos incluso mas sustancialmente complementarias para su uso en la practica de la invencion, y en tales casos, las secuencias de oligonucleotidos seran mas de aproximadamente el 90 por ciento complementarias a la secuencia diana de ARNm correspondiente a la que el oligonucleotido se une espedficamente, y en ciertas realizaciones pueden ser mas de aproximadamente el 95 por ciento complementarias a la secuencia diana de ARNm correspondiente a la que el oligonucleotido se une espedficamente, e incluso hasta e incluyendo el 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, e incluso el 100 % de apareamiento exacto complementario a toda o una porcion del ARNm diana a la que se une espedficamente el oligonucleotido disenado.
El porcentaje de similitud o porcentaje de complementariedad de cualquiera de las secuencias desveladas puede determinarse, por ejemplo, comparando la informacion de secuencias usando el programa informatico GAP, version 6.0, disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el metodo de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 48(3):443-53, 1970). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el numero de sfmbolos alineados (es decir, nucleotidos o aminoacidos) que son similares, dividido entre el numero total de sfmbolos en la mas corta de las dos secuencias. Los parametros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparacion unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleotidos, y la matriz de comparacion ponderada de Gribskov y Burgess (Nucl. Acids Res., 14:6745-6763, 1986), (2) una penalizacion de 3,0 para cada hueco y una penalizacion de 0,10 adicional para cada sfmbolo en cada hueco; y (3) sin penalizacion para huecos terminales.
Como se usa en el presente documento, "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, vedculos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y que retrasan la absorcion, tampones, disoluciones de vedculo, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmaceuticas es muy conocido en la tecnica. Excepto en la medida de que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas. Tambien pueden incorporarse principios activos suplementarios en las composiciones.
La frase "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion alergica o inapropiada similar cuando se administran a un ser humano, y en particular, cuando se administran al ojo humano. La preparacion de una composicion acuosa que contiene una protema como principio activo es bien entendida en la materia. Normalmente, tales composiciones se preparan como inyectables, tanto como disoluciones como suspensiones lfquidas; tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para disolucion en, o suspension en, lfquido antes de la inyeccion. La preparacion tambien puede emulsionarse.
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Como se usa en el presente documento, el termino "operativamente enlazado" significa que un promotor esta conectado a un ARN funcional de tal forma que la transcripcion de ese ARN funcional este controlada y regulada por ese promotor. Medios para enlazar operativamente un promotor a un ARN funcional son muy conocidos en la tecnica.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos estan incluidos para demostrar realizaciones preferidas de la invencion. Debe apreciarse por aquellos expertos en la materia que las tecnicas desveladas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas por el inventor por funcionar bien en la practica de la invencion, y asf puede considerarse que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, aquellos expertos en la materia deben apreciar, en vista de la presente divulgacion, que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones espedficas que se desvelan y todavfa obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del esprntu y alcance de la invencion.
EJEMPLO 1 -- TRANSFERENCIA GENICA MEDIADA POR AAV2: UNA FUNCION DOBLE DE LA SENALIZACION DE LA PROTEfNA TIROSINA CINASA DE EGFR EN LA UBIQUITINACION DE CAPSIDES VIRALES Y SfNTESIS DE ADN DE LA SEGUNDA HEBRA VIRAL
El virus adeno-asociado 2 (AAV2), un parvovirus patogeno no humano, ha atrafdo atencion como una alternativa a los vectores basados en retrovirus y adenovirus mas comunmente usados para transferencia genica y terapia genica1'2. Los vectores AAV2 recombinantes estan actualmente en uso en ensayos clmicos de fase I/II para terapia genica de varias enfermedades tales como fibrosis qmstica, deficiencia de a-1-antitripsina, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Batten y distrofia muscular,3,4,5 y se ha mostrado que transducen una amplia variedad de celulas y tejidos in vitro e in vivo.2'6'8 Se han aprovechado estudios sistematicos para esclarecer algunas de las etapas fundamentales en el ciclo de vida de los vectores AAV, que incluyen union viral, entrada,9'13 trafico
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intracelular, ' denudado, ’ smtesis de ADN de la segunda hebra ' e integracion del genoma viral en el cromosoma de la celula huesped.29, 30
Dos laboratorios independientes han descrito que la smtesis de ADN de la segunda hebra viral es una etapa limitante de la velocidad, que explica la ineficiente transduccion de ciertos tipos de celulas por vectores AAV.20, 21 Los inventores tambien han demostrado que una protema celular (designada FKBP52), que interacciona con la secuencia D monocatenaria en la repeticion terminal invertida (ITR) de AAV2, es fosforilada en restos de tirosina por la protema tirosina cinasa del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR-PTK), e inhibe la smtesis de ADN de la segunda hebra viral que conduce a una expresion transgenica ineficiente.24 Tambien se ha documentado que FKBP52 es desfosforilada en restos de tirosina por la protema tirosina fosfatasa de linfocitos T (TC-PTP), que regula negativamente la senalizacion de EGFR-PTK, conduciendo a la eficiente smtesis de ADN de la segunda hebra viral.25 La desfosforilacion por tirosina de FKBP52 en ratones transgenicos para TC-PTP (TC-PTP TG) y la eliminacion de FKBP52 en ratones inactivados en FKBP52 (FKBP52-KO) tambien conducen a una transduccion de AAV2 eficiente de hepatocitos murinos in vivo.27
Tambien ha sido evidente una etapa limitante de la velocidad adicional en la transduccion mediada por AAV, trafico intracelular viral, y esta siendo estudiada ampliamente. Se ha mostrado que la via de ubiquitina-proteasoma desempena una funcion esencial en esta etapa. Es probable que AAV2 sea degradado si fracasa en escapar del endosoma tardm. Si el virus escapa en el citoplasma perinuclearmente, puede ser ubiquitinado y degradado por el proteasoma citoplasmico.16, 31-32 En estudios previos con fibroblasto murino,14, 15 se documento que los vectores AAV2 dejaron de transportar al nucleo eficazmente, pero la expresion en exceso de TC-PTP en ratones TC-PTP-TG facilito este proceso.19 Estos estudios sugirieron que la senalizacion de TC-PTP y/o EGFR-PTK participo en el trafico intracelular de AAV2.
En los presentes estudios, la funcion de la senalizacion de EGFR-PTK en la ubiquitinacion, trafico intracelular y expresion transgenica mediada por AAV se examino sistematicamente. Se demostro que ademas de aumentar la smtesis de ADN de la segunda hebra viral, las perturbaciones en la senalizacion de EGFR-PTK afectan la eficiencia de transduccion de AAV2, facilitando el trafico intracelular del citoplasma al nucleo. Como el contenido de ubiquitina libre dentro de una celula que regula la degradacion lisosomica de EGFR, con inhibidores del proteasoma que afectan la endocitosis del receptor,33 los inhibidores del proteasoma aumentan la transduccion de AAV, 16, 31-35 y la fosforilacion de protemas modula la ubiquitinacion de protemas celulares y virales,36-42 se presenta evidencia que documenta que la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK disminuye la ubiquitinacion de protemas de la capside de AAV2, sugiriendo que la ubiquitinacion seguida de la degradacion mediada por el proteasoma de protemas de la capside de AAV2 tambien esta afectada por EGFR-PTK. Estos estudios sugieren que interacciones complejas entre la senalizacion de EGFR-PTK y la via de ubiquitina/proteasoma desempenan una funcion en la transduccion mediada por AAV, que es probable que sea importante en dar nuevos entendimientos en el uso optimo de vectores AAV recombinantes en terapia genica humana.
MATERIALES Y METODOS
Celulas, virus, plasmidos, anticuerpos y productos qumicos. Se obtuvo la lmea de celulas de carcinoma cervical humano, HeLa, de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.), y se mantuvo
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como cultivos en monocapa en medio Dulbecco modificado con Iscove (IMDM) complementado con 10 % de suero de ternero recien nacido (NCS) y 1 % (en volumen) de 100* disolucion madre de antibioticos (10.000 U de penicilina + 10.000 |jg de estreptomicina). Se generaron disoluciones madre altamente purificadas de vectores ssAAV2 recombinante que conteman el gen indicador de p-galactosidasa (lacZ), o el gen de la protema de fluorescencia roja (RFP), o vectores ss- y sc-AAV2 recombinantes que conteman el gen de la protema de fluorescencia verde (EGFP) mejorado conducido por el promotor inmediato-temprano del citomegalovirus (CMV) (ssAAV2-lacZ, ssAAV2-RFP, ssAAV2-EGFP o scaAv2-eGfP) como se ha descrito previamente.49
Se determinaron los tftulos de partmulas ffsicas de disoluciones madre de vectores recombinantes por analisis de transferencia en ranuras de ADN cuantitativo. Se compraron anticuerpo conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) espedfico para ubiquitina (Ub) (inmunoglobulina G1 monoclonal de raton [IgG1], clon P4D1) e IgG1 de raton normal de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos espedficos para partmulas de AAV2 intactas (IgG1 monoclonal de raton, clon A20) se obtuvieron de Research Diagnostics, Inc., (Flanders, NJ, EE.UU.). Se compro MG132 de Calbiochem (La Jolla, CA, EE.UU.), y todos los otros productos qmmicos usados se compraron de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO. EE.UU.).
Ensayo de transduccion de vectores AAV recombinante. Se sembraron aproximadamente 1 * 105 celulas HeLa en cada pocillo en placas de 12 pocillos y se incubaron a 37 °C durante 12 h. Las celulas se lavaron una vez con IMDM y luego se infectaron a 37 °C durante 2 h con 5 * 103 partmulas por celula de vectores AAV2-lacZ, ssAAV2-
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EGFP o scAAV2-EGFP recombinantes como se ha descrito previamente. ’ Las celulas se incubaron en IMDM completo que contema 10 % de NCS y 1 % de antibioticos durante 48 h. Para le expresion de lacZ, las celulas se fijaron y se tineron con X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosido). La eficiencia de transduccion se midio por obtencion de imagenes de GFP usando un microscopio de fluorescencia DM IRB/E de LEICA (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Alemania). Se analizaron cuantitativamente las imagenes de tres campos visuales de celulas HeLa infectadas con vector vado e infectadas con vector 48 h despues de la inyeccion por el software de analisis ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). La expresion transgenica se evaluo como el area total de fluorescencia verde (pixel2) por campo visual (media ± DE). Se uso analisis de la varianza (ANOVA) para comparar entre resultados de pruebas y el control y se determino que eran estadfsticamente significativos.
Aislamiento de fracciones nucleares y citoplasmicas de celulas HeLa. Se aislaron fracciones nucleares y citoplasmicas de celulas HeLa como se ha descrito previamente.19 Las celulas se infectaron con vector vado o se infectaron con vectores AAV2-lacZ recombinantes, se lavaron dos veces con PBS 12 h despues de la infeccion. Las celulas se trataron con 0,01 % de tripsina y se lavaron ampliamente con PBS para eliminar cualquier partmula de virus adsorbida y no adsorbida. Se resuspendieron suavemente sedimentos de celulas en 200 jl de tampon hipotonico (HEPES 10 mM, pH 7,9. MgCh 1,5 mM, KCl 10 mM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM) y se incubaron sobre hielo durante 5 min, despues de lo que anadieron 10 jl de 10% de NP-40 a cada tubo durante ~3 min, y se observaron bajo un microscopio optico. Las muestras se mezclaron suavemente y se centrifugaron durante 5 min a 500 rpm a 4 °C. Se decantaron los sobrenadantes (fracciones citoplasmicas) y se guardaron sobre hielo. Se lavaron los sedimentos (fracciones nucleares) dos veces con 1 ml de tampon hipotonico y se guardaron sobre hielo. Se determino que la pureza de cada fraccion era > 95 %, como se mide por la ausencia de actividad de fosfatasa acida (fracciones nucleares) y la ausencia de histona H3 (fracciones citoplasmicas) como se ha descrito previamente.14,19
Analisis de transferencia Southern para el trafico de AAV. Se aislaron muestras de ADN de Mr bajo de fracciones nucleares y citoplasmicas y se sometieron a electroforesis sobre geles al 1 % de agarosa, seguido de hibridacion de transferencia Southern usando una sonda de ADN lacZ marcada con 32P como se ha descrito previamente.14,19 El analisis densitometrico de autorradiograffas para la cuantificacion se evaluo con el software de analisis ImageJ® (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU.).
Preparacion de lisados de celulas completas (WCL) y co-inmunoprecipitacion. Se prepararon WCL como se ha descrito previamente,17, 26, 50 con las siguiente modificaciones: brevemente, se trataron 2 * 106 celulas HeLa tanto con vector vado, como se trataron con Tyr23 500 mM, MG132 4 mM, o ambos (tratamiento con MG132 durante 2 h y luego con Try23 durante 2 h adicionales) durante 4 h. Las celulas se infectaron con vector vado o se infectaron con vectores ssAAV-RFP a 104 partmulas/celula durante 2 ha 37 °C. Las celulas transfectadas con vector vado y las celulas transfectadas establemente con plasmidos de expresion wt- o mTC-PTP se trataron con MG132 y tambien se sometieron a infeccion con vector vado o infeccion con vectores ssAAV-RFP.
Para el analisis de protema celular, celulas tratadas o tratadas con vector vado se lisaron sobre hielo en tampon de lisis de celulas (1 % de Triton X-100®, 10 % de glicerol, HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCh 1,5 mM, EDTA 1 mM) que contema DTT 1 mM, NaF 10 mM, Na3VO4 2 mM, PMSF 0,5 mM, 10 mg/ml de aprotinina, 10 mg/ml de leupeptina y 10 mg/ml de pepstatina. Para la inmunoprecipitacion, las celulas se trataron con 0,01 % de tripsina y se lavaron ampliamente con PBS para eliminar cualquier partmula de virus adsorbida y no absorbida despues del tratamiento o 4 h despues de la infeccion y luego se resuspendieron en 2 ml de tampon hipotonico (HEPES 20 mM a pH 7,5, KCl 5 mM, MgCh 0,5 mM) que contema DTT 1 mM, NaF 10 mM, Na3VO4 2 mM, PMSF 0,5 mM, 10 mg/ml de aprotinina, 10 mg/ml de leupeptina y 10 mg/ml. Se prepararon WCL mediante homogeneizacion en un molinillo de tejido Duall ensamblado a la perfeccion hasta que se logro aproximadamente el 95 % de la lisis de celulas como se monitoriza por el ensayo de exclusion del colorante azul de tripano. Los WCL se limpiaron de union no espedfica por
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incubacion con 0,25 mg de IgGi de raton normal junto con 20 ml de protema G-perlas de agarosa durante 60 min a 4 °C en un agitador orbital.
Despues de la limpieza previa, se anadieron 2 mg de anticuerpo de la capside contra partmulas de AAV2 intactas (A20) (IgGi de raton) o 2 mg de IgGi de raton normal (como control negativo) y se incubaron a 4 °C durante 1 h, seguido de precipitacion con protema G-perlas de agarosa a 4 °C durante 12 h en un agitador. Los sedimentos se recogieron por centrifugacion a 2.500 rpm durante 5 min a 4 °C y se lavaron cuatro veces con PBS. Despues del lavado final, los sobrenadantes se aspiraron y se desecharon, y los sedimentos se resuspendieron en un volumen igual de 2X tampon de muestra sDs. Se usaron veinte ml de disoluciones de sedimento resuspensas para transferencia Western con anticuerpo anti-Ub conjugado con HRP como se describe mas adelante.
Analisis de transferencia Western. Se realizo transferencia Western como se ha descrito previamente.17, 26, 50 Para los analisis de protemas celulares, se separaron cantidades equivalentes (~5 mg) de muestras de WCL por electroforesis en gel al 10% de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas Immobilon-P® (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Para la inmunoprecipitacion, las disoluciones de sedimento resuspensas se hirvieron durante 2-3 min y se usaron 20 ml de muestras para SDS-PAGE. Las membranas se bloquearon a 4 °C durante 12 h con 5 % de leche desnatada en 1X solucion salina tamponada con Tris (TBS, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM). Las membranas se trataron con anticuerpo anti-Ub monoclonal conjugado con HRP (dilucion 1:2.000). Se visualizaron bandas inmunorreactivas usando quimioluminiscencia (ECL-Plus™, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.).
RESULTADOS
La inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK aumenta la expresion transgenica de EGFP tras la
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transduccion con tanto vectores ssAAV2 como scAAV2. En estudios previamente publicados, ' ' ' los
inventores y sus colaboradores han documentado que la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK conduce a la desfosforilacion de FKBP52 en restos de tirosina, y facilita la smtesis de ADN de la segunda hebra viral produciendo la eficiente expresion transgenica. Como los vectores de scAAV2 bicatenarios,44, 45 que sortean el requisito de la smtesis de aDn de la segunda hebra, logran eficiencia de transduccion mucho mas alta, se evaluo el siguiente predicamento: la expresion transgenica mediada por scAAV2 no debe influirse por la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK si la smtesis de ADN de la segunda hebra viral no es el unico mecanismo implicado. En el primer conjunto de estudios, se trataron celulas HeLa con Tyr23, un inhibidor espedfico de EGFR-PTK43, se tradujeron con vectores ssAAV2-EGFP o scAAV2-EGFP recombinantes, y se determino la expresion transgenica 48 h despues de la transduccion.
A partir de los resultados mostrados en la FIG. 1A, es evidente que mientras que las celulas HeLa infectadas con vector vado no mostraron fluorescencia verde, solo ~3 % de las celulas HeLa transducidas con el vector ssAAV2- EGFP fueron positivas para EGFP, y el tratamiento con Tyr23 condujo a aumentos de ~12 veces en la eficiencia de
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transduccion de ssAAV (FIG. 1B), de acuerdo con resultados previos ' ' . Aunque la eficiencia de transduccion
de vectores rAAV fue ~4 veces mayor en comparacion con la de sus homologos monocatenarios, como era de esperar, pero sorprendentemente, el tratamiento con Tyr23 tambien condujo a otro aumento de ~10 veces en la eficiencia de transduccion de vectores rAAV (FIG. 1B).
Este aumento no fue debido a la contaminacion de vectores rAAV con vectores ssAAV, cuya generacion se ha documentado recientemente46. Estos datos, sin embargo, sugirieron que perturbaciones en la senalizacion de EGFR afectan aspectos adicionales de la transduccion mediada por AAV mas alla de la smtesis de ADN de la segunda hebra viral.
Como la transfeccion estable con un plasmido de expresion TC-PTP conduce a la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK y la eficiente expresion transgenica mediada por vectores ssAAV25, se razono que la expresion en exceso intencionada de TC-PTP tambien conducira a un aumento significativo en la eficiencia de transduccion de vectores de scAAV2. Celulas HeLa fueron tanto transfectadas con vector vado como transfectadas establemente con el plasmido de expresion no mutante (wt)-TC-PTP o mutante para C-S (m)-TC-PTP, y se infectaron con vectores ssAAV2-EGFP o scAAV2-EGFP, y la expresion transgenica se visualizo 48 h despues de la infeccion. Como puede apreciarse en la FIG. 2A, mientras que las celulas HeLa infectadas con vector vado no mostraron fluorescencia verde, y solo ~3 % de las celulas transfectadas con vector vado transducidas con el vector ssAAV-EGFP fueron positivas para EGFP, se obtuvo un aumento significativo (~15 veces) en la eficiencia de transduccion de vectores ssAAV2 en celulas transfectadas establemente con el plasmido de expresion wt-TC-PTP, de acuerdo con informes previamente publicados22, 27 Este aumento no se observo cuando se uso el plasmido de expresion mTC-PTP.
Es de notar que, aunque la eficiencia de transduccion de vectores de scAAV2 en celulas HeLa es ~8 veces mas alta en comparacion con sus homologos ss, la transfeccion estable con el plasmido de expresion wtTC-PTP conduce a otro aumento de ~10 veces (FIG. 2B). Estos datos corroboran que la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK por pre-tratamiento con Tyr23 o la expresion en exceso de TC-PTP aumenta la transduccion de AAV2 implica otro(s) mecanismo(s), ademas de facilitar la smtesis de ADN de la segunda hebra viral.
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El transporte nuclear de AAV mejora tras el pre-tratamiento con Tyr23, la expresion en exceso de wtTC-PTP, o inhibidor del proteasoma, MG132. Se documento previamente que la expresion en exceso de TC-PTP en ratones TC-PTP-Tg facilito el transporte del vector AAV2 al nucleo en celulas hematopoyeticas murinas primarias,19 que sugirio que la senalizacion de EGFR-PTK podna tambien estar implicada en el trafico de AAV. Para examinar adicionalmente esta hipotesis, el destino del ADN viral de entrada se examino en celulas tratadas con Tyr23, o transfectadas establemente con wtTC-PTP. Se usaron celulas tratadas con vector vado, celulas transfectadas
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establemente con mTC-PTP, y celulas tratadas con MG132, un inhibidor espedfico del proteasoma, ' conocidas por aumentar el transporte nuclear de AAV,16, 34, 35 como controles apropiados. Se obtuvieron fracciones nucleares y citoplasmicas 12 h despues de la infeccion, se aislo ADN de Mr bajo de estas fracciones, y se sometio a electroforesis sobre geles al 1 % de agarosa, seguido de analisis de transferencia Southern (FIG. 3A) y analisis densitometrico de autorradiograffas (FIG. 3B).
Como es evidente, ~64 % del ADN de ssAAV de entrada estuvo presente en la fraccion citoplasmica en celulas de control (carril 1). De acuerdo con estudios previamente publicados,16, 34, 35 el pre-tratamiento con MG132 mejoro el trafico de AAV2 al nucleo hasta ~62 % (carril 10). De forma interesante, en celulas pre-tratadas con Tyr23, o transfectadas establemente con wtTC-PTP, el ADN de ssAAV2 de entrada en la fraccion nuclear aumento a ~52 % y ~54 %, respectivamente (carriles 4 y 8). En celulas transfectadas con mTC-PTP, por otra parte, solo ~38 % del ADN de ssAAV de entrada estuvo presente en la fraccion nuclear (carril 6), que fue similar a aquella en celulas de control (carril 2). La posibilidad de que Tyr23 y TC-PTP afectaran los eventos transcripcionales y traduccionales para aumentar la expresion transgenica, y que no mejoraran la administracion nuclear de AAV, ademas de MG132, se descarto por transfeccion mediada por ADN de plasmido de celulas HeLa en las que ni el tratamiento con Tyr23, ni la expresion en exceso de TC-PTP, mostraron aumento en la expresion transgenica (FIG. 9). Estos resultados documentan adicionalmente que la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK facilita el transporte nuclear de vectores AAV.
La eficiencia de transduccion de tanto vectores ssAAV como de rAAV en celulas que expresan en exceso TC-PTP, o tras el pre-tratamiento con Tyr23, no se potencia adicionalmente por MG132. Entonces se examino si la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK mediante tratamiento con Tyr23, o la expresion en exceso de TC- PTP, modula la via de ubiquitina/proteasoma implicada en la transduccion de AAV2, debido a que el contenido de ubiquitina libre dentro de una celula que regula la degradacion lisosomica de EGFR, e inhibidores del proteasoma participan en la regulacion de la endocitosis de EGFR,33 se ha mostrado que los inhibidores del proteasoma
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aumentan la transduccion de AAV, ' y la fosforilacion de protemas participa en la regulacion de la
ubiquitinacion de celular y protemas virales.36-42 Se trataron celulas con vector vado o se trataron con Tyr23, MG132, o ambos, o tanto establemente transfectadas con plasmidos de expresion wt-TC-PTP como mTC-PTP, tanto se trataron con vector vado como se trataron con MG132. Todas las celulas tratadas y los controles apropiados se infectaron con vectores ssAAV2-lacZ o scAAV2-EGFP recombinantes, y se determino la expresion transgenica 48 h despues de la transduccion. Estos resultados se muestran en la FIG. 4A.
De acuerdo con estudios previamente publicados, ' ' >5 % de las celulas transducidas con vectores ssAAV2
fueron positivas para lacZ, mientras que en celulas que expresan en exceso wtTC-PTP, o tras el pre-tratamiento con Tyr23, hubo ~13 veces y ~20 veces de aumento, respectivamente, en la eficiencia de transduccion de vectores ssAAV (FIG. 4B). El tratamiento con MG132 durante 4 h (2 h para el pretratamiento y 2 h para el tratamiento junto con infeccion de AAV2) condujo a ~6 veces de aumento en la eficiencia de transduccion de vectores ssAAV2 (FIG. 4B). Sorprendentemente, sin embargo, la eficiencia de transduccion de vectores ssAAV2 tras el pretratamiento con Tyr23, o expresion en exceso de TC-PTP, no se potencio adicionalmente por MG132. Se obtuvieron resultados similares cuando se usaron los vectores rAAV-EGFP bajo condiciones identicas. Como puede apreciarse en la FIG. 5A, mientras que las celulas infectadas con vector vado no mostraron fluorescencia verde, y ~15 % de las celulas tratadas con vector vado transducidas con vectores de scAAV2 fueron positivas para EGFP, la expresion en exceso de TC-PTP, o el pre-tratamiento con Tyr23, condujo a ~5 veces y ~9 veces de aumento, respectivamente, en la eficiencia de transduccion de vectores de scAAV2 (FIG. 5B). El tratamiento con MG132 condujo a ~5 veces de aumento en la eficiencia de transduccion de scAAV2 (FIG. 5B). Este aumento no se observo cuando se uso el plasmido de expresion mTC-PTP.
Es de notar que la eficiencia de transduccion de vectores de scAAV2 tras el pre-tratamiento con Tyr23, o expresion en exceso de TC-PTP, no se potencio adicionalmente por MG132 (FIG. 5B). Se obtuvieron resultados similares cuando se usaron relaciones de partmulas virales/celula (1.000 y 2.000) mas bajas (FIG. 9). Estos datos sugieren adicionalmente que la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK modula la via de ubiquitina/proteasoma, que afecta aspectos del trafico intracelular, ademas de la smtesis de ADN de la segunda hebra de vectores AAV2.
La inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK disminuye la ubiquitinacion de protemas de la capside de AAV2, ademas de protemas celulares totales. La via de ubiquitina-proteasoma desempena una funcion importante en la celula degradando espedficamente tanto protemas endogenas como extranas.47 Un estudio previo48 informo que las protemas de la capside de AAV2 inmunoprecipitadas de lisados de celulas infectadas estan conjugadas con ubiquitina (Ub) y particulas de virus desnaturalizadas con calor son sustratos para la ubiquitinacion in vitro. Un estudio mas reciente42 documento que la fosforilacion inducida por casema cinasa II del resto de serina 301 promueve la ubiquitinacion y degradacion de la protema E2 del virus del papiloma bovino por la via del proteasoma. Para examinar adicionalmente si la senalizacion de EGFR participa en la ubiquitinacion de protemas de
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la capside de AAV2, se realizaron los dos siguientes conjuntos de estudios: en el primer estudio, las celulas tanto se trataron con vector vacm como se trataron con MG132, Tyr23, o ambos, y las celulas tanto establemente transfectadas con los plasmidos de expresion wt-TC-PTP como mTC-PTP tanto se trataron con vector vacm como se trataron con MG132 como se describe arriba. Se prepararon WCL y cantidades equivalentes de protemas se sometieron a analisis de transferencia Western con anticuerpo monoclonal anti-Ub. Estos resultados se muestran en la FIG. 6. Mientras que el nivel total de protemas celulares ubiquitinadas manchadas fue bajo en celulas sin tratar (carriles 1 y 6), y siguieron sin cambiar en celulas tratadas con Tyr23 (carril 3), ademas de en celulas tanto transfectadas establemente con plasmidos de expresion wt-TC-PTP como mTC-PTP (carriles 4 y 5), debido a que estas moleculas son rapidamente degradadas por el proteasoma tras la ubiquitinacion, se observo la significativa acumulacion de protemas ubiquitinadas manchadas en celulas HeLa tras la inhibicion de la actividad del proteasoma mediante tratamiento con MG132 como era de esperar (carriles 2 y 7). De forma interesante, sin embargo, el tratamiento con Tyr23, o la expresion en exceso de wtTC-PTP, disminuyo significativamente la acumulacion de protemas ubiquitinadas inducidas por MG132 (carriles 8 y 10), mientras que la expresion en exceso de mTC-PTP no tuvo efecto (carril 9). En el segundo conjunto, todas las celulas tratadas con vector vacm y tratadas se infectaron con AAV2 durante 2 h a 37 °C. Se prepararon WCL 4 h despues de la infeccion y se inmunoprecipitaron cantidades equivalentes de protemas primero con anticuerpo anti-capside de AAV2 A20, seguido de analisis de transferencia Western con anticuerpo monoclonal anti-Ub.
Resultados similares, mostrados en la FIG. 7, indican que mientras que las protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas (Cap. de Ub-AAV, corchete) fueron indetectables en celulas infectadas con vector de control (carriles 1 y 2), la senal de protemas de la capside de AAV2 ubiquitinada fue mas debil a aquella en celulas sin tratar (carril 3), y siguio sin cambiar en celulas tratadas con Tyr23 (carril 4), ademas de en celulas transfectadas establemente con el plasmido de expresion wtTC-PTP (carril 7), se produjo una acumulacion significativa de protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas tras el tratamiento con MG132 (carril 5). Sin embargo, el tratamiento con Tyr23, o la expresion en exceso de wtTC-PTP, inhibio espectacularmente el grado de acumulacion de protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas inducida por MG132 (carriles 6 y 8). Estos resultados confirman que la inhibicion de la senalizacion de protema tirosina cinasa de EGFR tambien disminuye la ubiquitinacion de protemas celulares totales, ademas de protemas de la capside de AAV2.
DISCUSION
En estudios publicados19 los inventores y sus colaboradores han documentado que el trafico intracelular de AAV2 del citoplasma al nucleo mejora en celulas madre hematopoyeticas murinas de ratones transgenicos TC-PTP. Estos datos sugirieron que, ademas de su funcion crucial en la smtesis de ADN de la segunda hebra viral, la senalizacion de EGFR-PTK tambien participaba en el trafico intracelular y/o el transporte nuclear de AAV2. La via de ubiquitina- proteasoma desempena una funcion esencial en el trafico intracelular de AAV2, e inhibidores del proteasoma
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pueden promover el transporte nuclear deAAV2, conduciendo al aumento de la transduccion deAAV2. ’ Se ha presentado evidencia directa de la ubiquitinacion de protemas de la capside de AAV2 en celulas HeLa y en ensayos de ubiquitinacion in vitro,48 en las que solo capsides de AAV2 desnaturalizadas, pero no AAV2 intactos, podnan ser ubiquitinados in vitro, que indico que la capside de AAV2 intacta requirio un cambio conformacional o una modificacion, tal como fosforilacion antes de su ubiquitinacion. Varios estudios han informado de que se requiere la fosforilacion de protemas celulares por tirosina o serina/treonina protema cinasa para la eficaz ubiquitinacion y degradacion de estas protemas.36'42 Por ejemplo, la fosforilacion de KBa inhibidor (kBa) en el resto de serina N.° 32 (Ser32) y el resto de serina N.° 36 (Ser36) es un requisito previo para la ubiquitinacion de iKBa inducida por citocinas y la degradacion.36, 37
Se ha mostrado que la activacion de tirosina cinasa mediada por receptor es un requisito para la ubiquitinacion de receptores del antfgeno de linfocitos T38 y la ubiquitinacion de la cadena Z de CD16 en celulas NK humanas tras la interaccion del receptor es dependiente de tirosina cinasa.39 Se redujo la modificacion de la protema del transactivador del virus del papiloma bovino E2 por ubiquitinacion por mutacion del resto de serina N.° 301 (Ser301), que indico que la fosforilacion de este residuo se requirio para la eficaz ubiquitinacion y degradacion de esta protema por la via de ubiquitina-proteasoma.41 Ademas, la fosforilacion inducida por casema cinasa II de Ser301 en la protema E2 indujo un cambio conformacional y disminuyo la estabilidad termodinamica local de esta region, promoviendo la ubiquitinacion y degradacion dirigida de la protema E2 por la via del proteasoma.42
Los presentes estudios han demostrado que la senalizacion de EGFR-PTK esta de hecho implicada en la via de ubiquitina/proteasoma para la modulacion del transporte nuclear de vectores AAV2, ademas de regular la smtesis de ADN de la segunda hebra viral en celulas HeLa. Tambien se obtuvieron resultados similares con la lmea celular de fibroblastos murinos NIH3T3, lmea celular de hepatocitos de raton adultos H2.35 y lmea celular de hepatocitos de raton fetales FL83B. Basandose en los datos disponibles, se ha postulado un modelo (mostrado esquematicamente en la FIG. 8), que ayuda a explicar las interacciones entre la senalizacion de EGFR-PTK y la via de ubiquitina/proteasoma en modular el trafico intracelular de vectores AAV2, ademas de la smtesis de ADN de la segunda hebra viral. En este modelo, tras la infeccion mediante la union a su receptor celular primario, proteoglicano de sulfato de heparano (HSPG), y la entrada mediada por un co-receptor(es), tal como FGFR1, AAV2 entra en el endosoma temprano (EE) mediante endocitosis mediada por pozos recubiertos de clatrina (CP). El EE madura entonces en el endosoma tardm (LE), en el que el AAV es degradado por enzimas lisosomales, si fracasa en el
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escape del LE. Si AAV2 escapa en el citoplasma perinuclearmente, se ubiquitina. Se supone que la fosforilacion mediada por EGFR-PTK de protemas de la capside en restos de tirosina es un requisito previo para la ubiquitinacion.
Entonces son reconocidos un numero sustancial de viriones ubiquitinados y degradados por proteasomas citoplasmicos en su camino al nucleo, conduciendo al transporte nuclear ineficaz (flecha abierta). En presencia de inhibidores del proteasoma, se reduce la degradacion de vector, conduciendo a transporte nuclear mas eficiente de AAV. La inhibicion de la fosforilacion de la capside de AAV2 en restos de tirosina por inhibidores de EGFR-PTK produce una disminucion de la ubiquitinacion de viriones intactos, que a su vez escapan de la degradacion mediada por el proteasoma, un efecto similar al que se observa con inhibidores del proteasoma. El resultado neto es que los viriones intactos entran en el nucleo mas eficientemente (flecha cerrada). Tras el denudado en el nucleo, la secuencia D en la ITR de AAV2 forma un complejo con FKBP52 [F], que es fosforilado en restos de tirosina [P] por EGFR-PTK, e inhibe la smtesis de ADN de la segunda hebra viral. Los inhibidores de EGFR-PTK previenen la fosforilacion de FKBP52 en restos de tirosina, y FKBP52 desfosforilado ya no se une a la secuencia D de AAV2, que a su vez facilita la smtesis de ADN de la segunda hebra viral y resulta expresion transgenica eficaz.
De acuerdo con este modelo, se observo que las capsides de AAV2 pueden de hecho fosforilarse en restos de tirosina por EGFR-PTK en ensayos de fosforilacion in vitro, y que los viriones de AAV2 fosforilados transducen celulas mucho menos eficientemente.
EJEMPLO 2 -- TRANSFERENCIA GENICA MEDIADA POR AAV2: FOSFORILACION POR TIROSINA DE
proteJnas de la capside y sus consecuencias sobre la expresion transgenica
La eficiencia de transduccion de vectores de virus recombinante adeno-asociado 2 (AAV) vana enormemente en diferentes celulas y tejidos in vitro e in vivo. Datos de estudios a modo de ejemplo se ilustran en la FIG. 11, FIG. 12, FIG. 13, FIG. 14 y FlG. 15. Se realizaron estudios sistematicos para aclarar las etapas fundamentales en el ciclo de vida del AAV. Por ejemplo, los inventores han mostrado que una protema celular, FKBP52, fosforilada en restos de tirosina por la protema tirosina cinasa del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR-PTK), inhibe la smtesis de ADN de la segunda hebra de AAV y, por consiguiente, la expresion transgenica in vitro24' 25, ademas de in vivo.19, 27, 28
Los inventores tambien han demostrado que la senalizacion de EGFR-PTK modula el trafico intracelular mediado por la via de ubiquitina/proteasoma, ademas de la smtesis de ADN de la segunda hebra mediada por FKBP52 de vectores AAV. En aquellos estudios, la inhibicion de la senalizacion de EGFR-PTK condujo a ubiquitinacion reducida de protemas de la capside de AAV, que a su vez facilito el transporte nuclear limitando la degradacion mediada por el proteasoma de vectores AAV, que implica la fosforilacion mediada por EGFR-PTK de restos de tirosina sobre capsides de AAV.
El presente ejemplo muestra que las capsides de AAV pueden de hecho fosforilarse en restos de tirosina por EGFR- PTK en ensayos de fosforilacion in vitro, y que las capsides de AAV fosforiladas retuvieron su integridad estructural. Sin embargo, aunque los vectores AAV fosforilados pudieron entrar en celulas tan eficientemente como sus homologos sin fosforilar, se redujo su eficiencia de transduccion. Esta reduccion no fue debida a la smtesis de ADN de la segunda hebra viral alterada, ya que la eficiencia de transduccion de tanto vectores AAV monocatenarios (ssAAV) como AAV auto-complementarios (rAAV) disminuyo ~68 % y ~74 %, respectivamente. El trafico intracelular de vectores AAV fosforilados en tirosina del citoplasma al nucleo tambien disminuyo significativamente, que lo mas probablemente condujo a la ubiquitinacion de capsides de AAV, seguido de la degradacion mediada por el proteasoma.
Las capsides de AAV pueden fosforilarse en restos de tirosina por EGFR-PTK en el ensayo de fosforilacion in vitro y las capsides de AAV fosforiladas retuvieron su integridad estructural. Aunque los vectores AAV fosforilados pudieron entrar en las celulas tan eficientemente como sus homologos sin fosforilar, su eficiencia de transduccion se redujo significativamente. Esta reduccion no fue debida a la smtesis de ADN de la segunda hebra viral alterada, ya que la eficiencia de transduccion de tanto vectores AAV monocatenarios (ssAAV) como AAV auto-complementarios (rAAV) disminuyo ~68 % y ~74 %, respectivamente. El trafico intracelular de vectores AAV fosforilados por tirosina del citoplasma al nucleo tambien disminuyo significativamente, lo mas probablemente condujo a ubiquitinacion de capsides de AAV, seguido de la degradacion mediada por el proteasoma. Tomados conjuntamente, estos datos ilustran que las complejas interacciones que se producen entre la senalizacion de EGFR-PTK y la via de ubiquitina/proteasoma afectan a diversos aspectos del trafico intracelular, ademas de a la smtesis de ADN de la segunda hebra de vectores AAV.
EJEMPLO 3 -- VECTORES rAAV2 DE LA SIGUIENTE GENERACION: MUTACIONES PUNTUALES EN TIROSINAS CONDUCEN A LA TRANSDUCCION DE ALTA EFICIENCIA A DOSIS MAS BAJAS
El presente ejemplo demuestra que las mutaciones de restos de tirosina expuestos en la superficie sobre capsides de AAV2 sortean la etapa de ubiquitinacion, evitando asf la degradacion mediada por el proteasoma, y produciendo transduccion de alta eficiencia por estos vectores en celulas humanas in vitro y hepatocitos murinos in vivo, conduciendo a la produccion de niveles terapeuticos de factor de coagulacion humano a dosis de vector reducidas. El aumento de la eficiencia de transduccion observada para mutantes para vectores de tirosina es debido a la
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ausencia de ubiquitinacion, y al trafico intracelular mejorado al nucleo. Ademas de dar conocimiento de la funcion de la fosforilacion de tirosina de la capside de AAV2 en diversas etapas en el ciclo de vida de AAV2, estos estudios han producido el desarrollo de novedosos vectores AAV2 que son capaces de transduccion de alta eficiencia a dosis mas bajas.
MATERIALES Y METODOS
Vectores AAV2 recombinantes. Se generaron disoluciones madre altamente purificadas de vectores scAAV2 que contienen el gen de la protema de fluorescencia verde (EGFP) potenciado conducido por el promotor de la p-actina de pollo (CBA) (scAAV2-EGFP) y vectores scAAV2 que contienen el gen del factor IX (F.IX) bajo el control del potenciador de apolipoprotema/promotor de a-1-antitripsina humana (ApoE/hAAT) (ssAAV2-F.lX) como se ha descrito previamente.
Localizacion de tirosinas superficiales sobre la superficie de la capside de AAV2. Se uso la estructura cristalina de AAV2 (numero de acceso de PDB 1lp3) para localizar los restos de tirosina sobre la superficie de la capside de AAV2. Se generaron monomeros VP3 dos, tres y cinco veces relacionados icosaedricos aplicando operadores de simetria icosaedrica a un monomero de referencia usando Program O en una estacion de trabajo Silicon graphics Octane. Entonces se visualizo la posicion de los restos de tirosina y se analizo en el contexto de una unidad asimetrica viral usando el programa COOT, y se presento graficamente usando el programa PyMOL Molecular Graphics System (DeLano Scientific, San Carlos, cA, EE.UU.).
Construccion del plasmido de la capside de AAV2 mutante del resto de tirosina expuesto en la superficie. Se
realizo un procedimiento de dos etapas, basado en la mutagenesis dirigida al sitio QuikChange II® (Stratagene, La Jolla, CA) usando el plasmido pACG-2. Brevemente, en la etapa uno, se realizaron dos reacciones de extension por PCR en tubos separados para cada mutante. Un tubo contuvo el cebador de PCR directo y el otro contuvo el cebador inverso (Tabla 2). En la etapa dos, se mezclaron las dos reacciones y se llevo a cabo un ensayo de mutagenesis de PCR estandar segun las instrucciones del fabricante. Los cebadores de PCR se disenaron para introducir cambios del resto de tirosina a fenilalanina, ademas de un cambio silencioso para crear un nuevo sitio de endonucleasa de restriccion para fines de cribado (Tabla 2). Todos los mutantes se cribaron con la enzima de restriccion apropiada y se secuenciaron antes de uso.
TABLA 2
SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DE CEBADORES USADOS PARA MUTAGENESIS DIRIGIDA AL SITIO
Mutante
SEQ ID NO:
Y252F
SEQ ID NO: 1
Y272F
SEQ ID NO:2
Y444F
SEQ ID NO:3
Y500F
SEQ ID NO:4
Y700F
SEQ ID NO:5
Y704F
SEQ ID NO:6
Y730F
SEQ ID NO:7
Secuencias de cebadores (5' a 3')
CCCTGCCCACCTTCAACAACCACCTGTACAAACAAATTTCCAGCC
Tyr-Phe BsrGI
CC AATC AGGAGCTTCGAACGAC AAT CACT TC TTT GGCT AC AG BstBI Tyr-Phe
CGACCAGTACCTGTATTTCTTAAGCAGAACAAACACTCCAAG Tyr-Phe Aflll
CAACAACAGTGAATTCTCGTGGACCGGTGCTACCAAGTACC Tyr-Phe Agel
GGAATCCCGAAATTCAGTTCACTTCGAACTACAACAAGTCTG Tyr-Phe BstBI
GGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCGAACTTCAACAAGTCTG
BstBI
Tyr-Phe
CCTCGCCCCATTGGTACCAGATTCCTGACTCGTAATC Acc65I Tyr-Phe
Preparacion de lisados de celulas completas (WCL) y co-inmunoprecipitaciones. Se prepararon WCL como se ha descrito. Tambien se sometieron aproximadamente 2 x 106 celulas HeLa, tratadas con vector vado o tratadas con MG132, a infeccion con vector vado o infeccion con los vectores scAAV2-EGFP WT o mutante Y730F a 5 x 103
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partfculas/celula durante 2 ha 37 °C. Para inmunoprecipitaciones, las celulas se trataron con 0,01 % de tripsina y se lavaron ampliamente con PBS. Los WCL se limpiaron de union no espedfica por incubacion con 0,25 mg de IgG de raton normal junto con 20 jl de protema G-perlas de agarosa. Despues de la limpieza previa, se anadieron 2 |jg de anticuerpo de la capside contra parftculas de AAV2 intactas (IgG3 monoclonal de raton, clon A20; Research Diagnostics, Inc. (Flanders, NJ), o 2 jg de IgG de raton normal (como control negativo) y se incubaron a 4 °C durante 1 h, seguido de precipitacion con protema G-perlas de agarosa. Para inmunoprecipitaciones, se usaron disoluciones de sedimento resuspenso para SDS-PAGE. Las membranas se trataron con anticuerpo anti-Ub monoclonal conjugado con HRP (dilucion 1:2.000) espedfico para ubiquitina (Ub) (inmunoglobulina Gi monoclonal de raton □IgGi], clon P4D1; Santa Cruz, CA). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron usando quimioluminiscencia (ECL-Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Aislamiento de fracciones nucleares y citoplasmicas de celulas HeLa. Se aislaron fracciones nucleares y citoplasmicas de celulas HeLa y se usaron celulas infectadas con vector vado o con vector wt scAAV2-EGFP recombinante o Y700F para aislar las fracciones citoplasmicas y nucleares. Se determino que la pureza de cada fraccion era >95 %.
Analisis de transferencia Southern para el trafico de AAV2. Se aislaron muestras de ADN de Mr bajo de fracciones nucleares y citoplasmicas y se sometieron a electroforesis sobre geles al 1 % de agarosa o geles al 1 % de agarosa alcalinos, seguido de hibridacion por transferencia Southern usando una sonda de ADN espedfica de EGFP marcada con 32P.
Ensayos de transduccion de vectores AAV2 recombinantes in vitro. Se usaron aproximadamente 1 x 105 celulas HeLa para las transducciones con vectores AAV2 recombinantes. La eficiencia de transduccion se midio 48 h despues de la transduccion por obtencion de imagenes de EGFP usando microscopfa de fluorescencia. Se analizaron imagenes de tres a cinco campos visuales cuantitativamente por el software de analisis ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). Se evaluo la expresion transgenica como el area total de fluorescencia verde (pixel2) por campo visual (media ± DE). Se uso analisis de la varianza (ANOVA) para comparar entre resultados de pruebas y el control y se determino que eran estadfsticamente significativos.
Estudios de transduccion de vectores AAV2 recombinantes in vivo. Se inyectaron vectores de scAAV2-EGFP por via intravenosa mediante la vena de la cola en ratones C57BL/6 a 1 * 1010 partmulas de virus por animal. Se montaron sobre portaobjetos secciones de tngado de tres lobulos hepaticos de los ratones inyectados con vector vado e inyectados 2 semanas despues de la inyeccion. La eficiencia de transduccion se midio por obtencion de imagenes de EGFP como se describe. Se inyectaron vectores de ssAAV2-FI.X por via intravenosa (mediante la vena de la cola) o en la vena porta de ratones C57BL/6, BALB/c y C3H/HeJ a 1 * 1010 o 1 * 1011 partmulas de virus por animal. Se obtuvieron muestras de plasma por sangrado retro-orbital y se analizaron para la expresion de hF.IX por ELISA.
RESULTADOS
Mutaciones en restos de tirosina expuestos en la superficie mejoran significativamente la eficiencia de transduccion de vectores AAV2 en celulas HeLa in vitro. Para demostrar que la fosforilacion de capsides de AAV2 por tirosina conduce a una elevada ubiquitinacion y produce trafico intracelular alterado, y, es, por tanto, desfavorable para la transduccion viral, se modificaron restos de tirosina expuestos en la superficie sobre las capsides de aAV2. La inspeccion de la superficie de la capside de la estructura de AAV2 revelo un total de 7 restos de tirosina expuestos en la superficie (Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 y Y730). Se realizo mutagenesis dirigida al sitio para cada uno de los 7 restos de tirosina, que se sustituyeron conservativamente con restos de fenilalanina (tirosina-fenilalanina, Y-F) (Tabla 2). Se encapsidaron satisfactoriamente genomas de scAAV2-EGFP encapsidados en cada uno de los mutantes para capsides de tirosina (Tabla 3), y las mutaciones de los restos de tirosina expuestos en la superficie no condujeron a estabilidad del vector reducida.
TABLA 3
TITULOS DE VECTORES AAV2 NO MUTANTES (WT) Y MODIFICADOS EN TIROSINA (MUTANTES Y-F)
Vectores AAV
Tftulos de la 1a encapsidacion (vgs/ml) Tftulos de la 2a encapsidacion (vgs/ml) Tftulos de la 3a encapsidacion (vgs/ml) Tftulos de la 4a encapsidacion (vgs/ml)
WT scAAV2-EGFP
3,4 * 10'1'1 1,0 * 1012 3,2 * 10" 3,0 * 10"
Y252F scAAV2-EGFP
3,8 * 10'1'1 4,0 * 10" ND ND
Y272 scAAV2-EGFP
7,7 * 10'1'1 1,0 *10" ND ND
Y444F scAAV2-EGFP
9,7 * 10'IU 4,0 * 10'm 6,0 * 109 5,0 * 10'm
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TITULOS DE VECTORES AAV2 NO MUTANTES (WT) Y MODIFICADOS EN TIROSINA (MUTANTES Y-F)
Vectores AAV
Tftulos de la 1a encapsidacion (vgs/ml) Tftulos de la 2a encapsidacion (vgs/ml) Tftulos de la 3a encapsidacion (vgs/ml) Tftulos de la 4a encapsidacion (vgs/ml)
Y500F scAAV2-EGFP
8,8 x 10'IU 2,0 x 109 4,0 x 1010 6,0 x 1010
Y700F scAAV2-EGFP
1,0 x 10'1'1 4,0 x 10" ND ND
Y704F scAAV2-EGFP
6,0 x 1011 2,0 x 10" ND ND
Y730F scAAV2-EGFP
1,2 x 10" 5,0 x 10" 1,2 x 10" 4,0 x 10"
ND = No hecho.
La eficiencia de transduccion de cada uno de los vectores mutantes para tirosina se analizo y se comparo con el vector WT scAAV2-EGFP en celulas HeLa in vitro bajo condiciones identicas. A partir de los resultados fue evidente que mientras que las celulas infectadas con vector vado no mostraron fluorescencia verde, la eficiencia de transduccion de cada uno de los vectores mutantes para tirosina fue significativamente mas alta en comparacion con el vector WT scAAV2-EGFP a 2.000 partmulas virales/celula. Espedficamente, la eficiencia de transduccion de los vectores Y444F, Y500F, Y730F fue ~8 a 11 veces superior al vector WT.
Las mutaciones en restos de tirosina expuestos en la superficie mejoran espectacularmente la eficiencia de transduccion de vectores AAV2 en hepatocitos murinos in vivo. La eficacia de vectores de scAAV2-EGFP WT y mutantes para tirosina tambien se evaluo en un modelo de raton in vivo. Como puede apreciarse en la FIG. 17A, la eficiencia de transduccion de vectores mutantes para tirosina fue significativamente mas alta, y oscilo entre 4-29 veces, en comparacion con el vector WT (FIG. 17B). Cuando otros tejidos, tales como corazon, pulmon, rinon, bazo, pancreas, tubo digestivo (yeyuno, colon), testfculo, musculo esqueletico y cerebro se recogieron de ratones inyectados con 1 x 1010 partmulas de los vectores mutantes para tirosina y se analizaron, no se observo evidencia de expresion genica de EGFP. Asf, las mutaciones en los restos de tirosina expuestos en la superficie no parecieron alterar el tropismo del dgado tras la inyeccion en la vena de la cola de estos vectores in vivo.
La elevada eficiencia de transduccion de vectores mutantes para tirosina es debida a la ausencia de ubiquitinacion, y trafico intracelular mejorado al nucleo. Para confirmar adicionalmente la hipotesis de que la fosforilacion mediada por EGFR-PTK de protemas de la capside en restos de tirosina es un requisito previo para la ubiquitinacion de capsides de AAV2, y que los viriones ubiquitinados son reconocidos y degradados por el proteasoma citoplasmico en su camino al nucleo, conduciendo a transporte nuclear ineficiente, se realizaron una serie de experimentos del siguiente modo.
En el primer conjunto de estudios, celulas HeLa C12, que llevan genes rep y cap de AAV2 inducible por adenovirus, se infectaron con vector vado o se infectaron con vectores de scAAV2-EGFP WT, Y444F o Y730F. Como se muestra en la FIG. 18A y FIG 18B, mientras que las celulas infectadas con vector vado no mostraron fluorescencia verde, y ~15 % de las celulas se transdujeron con los vectores de scAAV2-EGFP WT en ausencia de co-infeccion con adenovirus, la eficiencia de transduccion de vectores de scAAV2-EGFP Y444F y Y730F aumento ~9 y ~18 veces, respectivamente, en comparacion con el vector WT. De forma interesante, mientras que la co-infeccion con adenovirus condujo a ~11 veces de aumento (vease la FIG 18B), la eficiencia de transduccion de vectores de scAAV2-EGFP Y444F y Y730F no mejoro adicionalmente por co-infeccion con adenovirus. Como el adenovirus puede mejorar el transporte nuclear del vector de AAV2 en celulas HeLa, estos datos sugieren que los restos de tirosina expuestos en la superficie desempenan una funcion en el trafico intracelular de AAV2, y que su eliminacion conduce al transporte nuclear eficiente de vectores AAV2.
En el segundo conjunto de estudios, celulas HeLa, tanto tratadas con vector vado como tratadas con Tyr23, un inhibidor espedfico de EGFR-PTK, o MG132, un inhibidor del proteasoma, ambos conocidos por aumentar la eficiencia de transduccion de vectores AAV, se infectaron con vector vado o se infectaron con los vectores de scAAV2-EGFP WT o Y730F. Estos datos se muestran en la FIG 18C. Mientras que las celulas infectadas con vector vado no mostraron fluorescencia verde, y ~5 % de las celulas se transdujeron con los vectores de scAAV2-EGFP WT en celulas tratadas con vector vado, el pretratamiento con Tyr23 o MG132 condujo a un aumento de ~9 veces y ~6 veces en la eficiencia de transduccion, respectivamente (FIG 18D). Aunque la eficiencia de transduccion de vectores de scAAV2-EGFP Y730F aumento ~14 veces en comparacion con los vectores WT, no mejoro adicionalmente por pretratamiento con tanto Tyr23 como MG132 (FIG 18D). Estos datos sugieren encarecidamente que la ausencia de restos de tirosina expuestos en la superficie, que previno la fosforilacion de los vectores mutantes, previno probablemente la ubiquitinacion de las protemas de la capside, y estos vectores en su camino al
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nucleo no podnan ser reconocidos y degradados por el proteasoma, que condujo a su translocalizacion nuclear eficiente.
En el tercer conjunto de estudios, celulas HeLa, tanto tratadas con vector vado como tratadas con MG132, se infectaron con vector vado o se infectaron con los vectores de scAAV2-EGFP WT, Y730F o Y444F. Se prepararon WCL 4 h despues de la infeccion y cantidades equivalentes de protemas se inmunoprecipitaron primero con anticuerpo anti-capside de AAV2 (A20) seguido de analisis de transferencia Western con anticuerpo monoclonal anti- Ub. Estos resultados se muestran en la FIG. 19. Como puede apreciarse, mientras que las protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas (Cap. de Ub-AAV2) fueron indetectables en celulas infectadas con vector vado (carriles 1,2), la senal de protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas fue mas debil en celulas sin tratar (carriles 3, 5), y se produjo una acumulacion significativa de protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas tras el tratamiento con MG132 (carril 4). De forma interesante, las infecciones con vectores Y730F o Y444F disminuyeron espectacularmente el grado de acumulacion de protemas de la capside de AAV2 ubiquitinadas inducidas por MG132 (carriles 6, 8). Estos resultados confirman que la mutacion en restos de tirosina sortea la degradacion mediada por el proteasoma de los vectores.
En el cuarto conjunto de estudios, se determino el destino del ADN viral de vector WT, Y444F y Y730F de entrada en celulas HeLa. El analisis de transferencia Southern de muestras de ADN de Mr bajo aisladas de fracciones citoplasmicas [C] y nucleares [N] (FIG. 5A) y el analisis densitometrico de autorradiograffas (FIG. 20B) revelaron que ~36 % del ADN de scAAV2 de entrada estaba presente en la fraccion nuclear en celulas infectadas con el vector WT (FIG. 20A, carril 4 y FIG. 20B), de acuerdo con estudios previos. De forma interesante, sin embargo, la cantidad de AdN de vector de scAAV2 Y730F y Y444F de entrada en la fraccion nuclear aumento al ~72 % y ~70 %, respectivamente (FIG. 20B). Estos resultados documentan adicionalmente que las mutaciones en los restos de tirosina expuestos en la superficie previenen la ubiquitinacion de capsides de aAV2, produciendo una disminucion de la degradacion mediada por el proteasoma, y a su vez facilitan el transporte nuclear de vectores AAV2.
Vectores mutantes para tirosina expresan niveles terapeuticos de proteina del factor IX humano a dosis de vector ~10 veces reducida en ratones. Fue importante examinar si vectores AAV2 mutantes para tirosina eran capaces de administrar un gen terapeutico eficientemente a una dosis de vector deducida in vivo. Para este fin, se encapsido un casete de expresion de factor IX humano (h.FIX) monocatenario espedfico de hepatocitos en el vector Y730F, y la eficacia de este vector se probo en 3 cepas de ratones diferentes (BALB/c, C3H/HeJ y C57BL/6). Coherentemente en las 3 cepas, el Y730F logro niveles ~10 veces mayores de hF.IX circulante en comparacion con el vector WT tras la administracion en la vena de la cola o vena porta, siendo la ultima la via mas eficaz. Estos
resultados, mostrados en la FIG. 21A, FIG. 21B, FIG. 21C y FIG. 21D, indican claramente que los vectores Y730F
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expresaron niveles terapeuticos de protema F.IX humana (~50 ng/ml) a dosis de vector ~10 veces reducida (10 partmulas/raton) en ratones C57BL/6 por inyeccion de la vena porta. Debe observarse que la transferencia genica viral hepatica en ratones C57BL/6 es generalmente mas eficiente que en las otras dos cepas.
Estos resultados demostrados aqrn estan de acuerdo con la interpretacion de que la fosforilacion de tirosina inducida por EGFR-PTK de protemas de la capside de AAV2 promueve la ubiquitinacion y degradacion de AAV2, conduciendo asf a la alteracion del transporte nuclear viral y la disminucion en la eficiencia de transduccion. El analisis de mutaciones de cada uno de los siete restos de tirosina expuestos en la superficie da vectores AAV2 con eficiencia de transduccion significativamente elevada in vitro, ademas de in vivo. Espedficamente, los vectores mutantes Y444F y Y730F sortean la etapa de ubiquitinacion, que produce un trafico intracelular significativamente mejorado y la administracion del genoma viral al nucleo.
A pesar de la expresion terapeutica a largo plazo lograda en modelos animales preclmicos por vectores AAV2 compuestos de las protemas de la capside WT, en un reciente ensayo de terapia genica, dos pacientes con hemofilia B grave desarrollaron transaminitis dependiente de la dosis de vector que limitaron la duracion de la expresion de hF.IX derivado de hepatocitos a <8 semanas. Analisis posteriores demostraron la presencia de linfocitos T CD8+ de memoria para capsides de AAV en seres humanos y una respuesta de linfocitos T citotoxicos (CTL) espedfica de la capside limitada a MHC I en uno de los pacientes con hemofilia B, que reprodujeron el transcurso de tiempo de la transaminitis. Se llego a la conclusion de que la respuesta de linfocitos T cD8+ a la capside de entrada elimino los hepatocitos transducidos por AAV2. Los presentes estudios muestran que una dosis de antfgeno de la capside mas baja es suficiente para la eficiente transferencia genica con el vector Y730F. Los datos tambien muestran ubiquitinacion de AAV-Y730F muy reducida en comparacion con la capside WT, un requisito previo para la presentacion de MHC I. Asf, la respuesta de linfocitos T a la capside de AAV2 (un grave obstaculo para la transferencia genica terapeutica en el Idgado) puede evitarse usando los vectores AAV2 mutantes para tirosina expuestos en la superficie.
La eficiencia de transduccion espectacularmente elevada de vectores mutantes para tirosina tambien se ha observado en celulas madre neuronales y hematopoyeticas humanas primarias in vitro y en diversos tejidos y organos en ratones in vivo. Tambien se han construido mutantes de tirosina dobles, triples y cuadruples para examinar si tales mutantes multiples son viables, y si la eficiencia de transduccion de estos vectores puede aumentarse adicionalmente. Es de notar que con algunas excepciones (Y444 posicionado equivalente a una glicina en AAV4 y arginina en AAV5; Y700 posicionado equivalente a fenilalanina en AAV4 y AAV5; y Y704 posicionado
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equivalente a una fenilalanina en AAV7), estos restos de tirosina estan altamente conservados en los serotipos 1 a 10 de AAV.
EJEMPLO 4 --ANALISIS DE POSICIONES DE TIROSINA SOBRE LA CAPSIDE DE AAV2
El siguiente resumen es una lista de todos los residuos de Tyr en la region estructuralmente ordenada de VP3 (217735):
Estos residuos de Tyr se clasifican basandose en si estan expuestos, parcialmente escondidos, o no expuestos: EXPUESTOS EN LA SUPERFICIE
Tyr2521- Expuesto en la superficie - suelo del canon
Tyr272 - Expuesto en la superficie - region elevada entre las depresiones 2 y 5 veces
Tyr444 - Expuesto en la superficie - pared de salientes triples
Tyr500 - Expuesto en la superficie - pared de salientes triples
Tyr700 - Expuesto en la superficie - eje doble
Tyr7042 - Expuesto en la superficie - eje doble
Tyr730 - Expuesto en la superficie - eje doble
1Tyr252 se ha mutado y confirmado por secuenciacion parcial, 2Tyr704 se ha mutado y secuenciado completamente. Todos los otros enumerados tambien se han mutado, realizandose analisis de secuencias para confirmar cada uno.
RESTOS DE TIROSINA EN LA SUPERFICIE, PERO PRINCIPALMENTE ESCONDIDOS
Residuos de tirosina Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 y Tyr720.
NO EXPUESTOS
Tyr257, Tyr348, Tyr352, Tyr375, Tyr377, Tyr393, Tyr397, Tyr413, Tyr424, Tyr441, Tyr443 y Tyr48 REFERENCIAS
Las siguientes preferencias, hasta el punto que proporcionen detalles de procedimiento a modo de ejemplo u otros detalles suplementarios a aquellos expuestos en el presente documento:
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78. Patente de Estados Unidos 5.567.434.
79. Patente de Estados Unidos 5.580.579
80. Patente de Estados Unidos 5.602.306.
81. Patente de Estados Unidos 5.631.359.
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83. Patente de Estados Unidos 5.639.940
84. Patente de Estados Unidos 5.641.515
85. Patente de Estados Unidos 5.646.020.
86. Patente de Estados Unidos 5.646.031.
87. Patente de Estados Unidos 5.648.211.
88. Patente de Estados Unidos 5.656.016.
89. Patente de Estados Unidos 5.697.899.
90. Patente de Estados Unidos 5.712.124.
91. Patente de Estados Unidos 5.720.936.
92. Patente de Estados Unidos 5.725.871.
93. Patente de Estados Unidos 5.738.868.
94. Patente de Estados Unidos 5.741.516.
95. Patente de Estados Unidos 5.744.311.
96. Patente de Estados Unidos 5.756.353.
97. Patente de Estados Unidos 5.770.219.
98. Patente de Estados Unidos 5.779.708
99. Patente de Estados Unidos 5.780.045
100. Patente de Estados Unidos 5.783.208
101. Patente de Estados Unidos 5.789.655.
102. Patente de Estados Unidos 5.792.451.
103. Patente de Estados Unidos 5.795.587.
104. Patente de Estados Unidos 5.797.898.
105. Patente de Estados Unidos 5.804.212.
106. Patente de Estados Unidos 5.863.736.
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Todas las composiciones y metodos desvelados y reivindicados en el presente documento pueden hacerse y ejecutarse sin excesiva experimentacion en vista de la presente divulgacion. Mientras que las composiciones y metodos de la presente invencion se han descrito en terminos de realizaciones preferidas, sera evidente para aquellos expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y metodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del metodo descrito en el presente documento dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Mas espedficamente, sera evidente que ciertos agentes que estan tanto qdmicamente como fisiologicamente relacionados pueden ser sustituidos con los agentes descritos en el presente documento, mientras que se logren los mismos resultados o similares. Se considera que todos aquellos sustitutos similares y modificaciones evidentes para aquellos expertos en la materia estan dentro del esprntu, alcance y concepto de la invencion como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un vector viral adeno-asociado de serotipo 2 recombinante (rAAV2) que comprende al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie mutado sobre su protema de la capside, el al menos un resto de tirosina mutado seleccionado del grupo que consiste en Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730, Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr720.
  2. 2. El vector rAAV segun la reivindicacion 1, en el que el al menos un resto de tirosina mutado es uno o mas de Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704 o Tyr730.
  3. 3. El vector rAAV segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende ademas al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica al menos un agente terapeutico.
  4. 4. El vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie mutado se sustituye con fenilalanina.
  5. 5. El vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas una secuencia potenciadora, en el que el potenciador esta seleccionado preferentemente del grupo que consiste en un potenciador del CMV, un potenciador sintetico, un potenciador espedfico del fugado, un potenciador espedfico de vascular, un potenciador espedfico del cerebro, un potenciador espedfico de celulas neurales, un potenciador espedfico de pulmon, un potenciador espedfico de musculo, un potenciador espedfico de rinon, un potenciador espedfico de pancreas y un potenciador espedfico de celulas de los islotes.
  6. 6. El vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la expresion del agente terapeutico esta controlada por un promotor en el que un promotor es un promotor constitutivo o inducible heterologo espedfico de tejido, y preferentemente uno seleccionado del grupo que consiste en un promotor del CMV, un promotor de p- actina, un promotor de insulina, un promotor de enolasa, un promotor de BDNf, un promotor de NGF, un promotor de EGF, un promotor del factor de crecimiento, un promotor espedfico de axones, un promotor espedfico de dendritas, un promotor espedfico del cerebro, un promotor espedfico del hipocampo, un promotor espedfico de rinon, un promotor de elafina, un promotor de citocinas, un promotor de interferon, un promotor del factor de crecimiento, un promotor de alfa-1-antitripsina, un promotor espedfico del cerebro, un promotor espedfico de celulas neurales, un promotor espedfico de celulas del sistema nervioso central, un promotor espedfico de celulas del sistema nervioso periferico, un promotor de interleucina, un promotor de serpina, un promotor del CMV fubrido, un promotor de p-actina fubrido, un promotor de EF1, un promotor de U1a, un promotor de U1b, un promotor inducible por Tet y un promotor de VP16-LexA.
  7. 7. El vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el al menos un primer segmento de acido nucleico esta adicionalmente operativamente enlazado a una secuencia reguladora post-transcripcional o una senal de poliadenilacion, y preferentemente a un elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de la marmota.
  8. 8. El vector rAAV segun una cualquiera de la reivindicacion 3 a 7, en el que el agente terapeutico esta seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido, un peptido, un anticuerpo, un fragmento de union al antfgeno, una ribozima, un acido nucleico peptfdico, un ARNip, una iARN, un oligonucleotido antisentido y un polinucleotido antisentido; preferentemente, en el que el agente terapeutico es una protema o polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un agonista adrenergico, un factor antiapoptosis, un inhibidor de la apoptosis, un receptor de citocinas, una citocina, una citotoxina, un agente eritropoyetico, una acido glutamico descarboxilasa, una glucoprotema, un factor de crecimiento, un receptor del factor de crecimiento, una hormona, un receptor de hormona, un interferon, una interleucina, un receptor de interleucina, una cinasa, un inhibidor de cinasas, un factor de crecimiento nervioso, una netrina, un peptido neuroactivo, un receptor de peptido neuroactivo, un factor neurogenico, un receptor de factor neurogenico, una neuropilina, un factor neurotrofico, una neurotrofina, un receptor de neurotrofina, un antagonista de N-metil-D-aspartato, una plexina, una proteasa, un inhibidor de la proteasa, una protema descarboxilasa, una protema cinasa, un inhibidor de protema cinasa, una protema proteolttica, un inhibidor de protema proteolttica, una semaforina, un receptor de semaforina, una protema de transporte de serotonina, un inhibidor de la captacion de serotonina, un receptor de serotonina, una serpina, un receptor de serpina y un supresor tumoral; y mas preferentemente, en el que el agente terapeutico es un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GMCSF, gonadotropina, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, TGF-B2, TNF, VEGF, prolactina, somatotropina, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL10(I87A), IL-10 viral, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 e IL-18.
  9. 9. El vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que el primer segmento de acido nucleico comprende una region de secuencia que codifica un peptido, polipeptido, anticuerpo, o fragmento de union al antfgeno de origen humano, murino, aviar, porcino, bovino, ovino, felino, canino, equino, epino, caprino, lupino o de primate no humano.
  10. 10. Una celula huesped de mamffero aislada que comprende el vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, preferentemente una celula huesped de mairnfero aislada seleccionada del grupo que consiste en una celula huesped humana, de primate no humano, murina, felina, canina, porcina, ovina, bovina,
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    equina, epina, caprina y lupina; y mas preferentemente una celula endotelial humana aislada, epitelial, vascular, de fugado, pulmon, corazon, pancreas, intestinal, rinon, musculo, hueso, neural, sangumea o de cerebro.
  11. 11. El vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en terapia.
  12. 12. El vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el diagnostico, prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas smtomas de una enfermedad, lesion, trastorno, traumatismo o disfuncion en un mairnfero, y adicionalmente preferentemente para su uso en el tratamiento de, prevencion o mejora de uno o mas smtomas de cancer, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad renal, enfermedad cardiovascular, enfermedad pancreatica, enfermedad intestinal, enfermedad del fugado, enfermedad neurologica, trastorno neuromuscular, deficit neuromotor, alteracion neuroesqueletica, incapacidad neurologica, disfuncion neurosensorial, accidente cerebrovascular, isquemia, trastorno de la alimentacion, deficiencia de a-i-antitripsina (AAT), enfermedad de Batten, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad esqueletica, traumatismo, o enfermedad pulmonar en un mam^era.
  13. 13. El uso del vector rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricacion de un medicamento para su uso en el diagnostico, prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas smtomas de una enfermedad, lesion, trastorno, traumatismo o disfuncion en un mam^era, y adicionalmente preferentemente para su uso en el tratamiento de, prevencion o mejora de uno o mas smtomas de cancer, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad renal, enfermedad cardiovascular, enfermedad pancreatica, enfermedad intestinal, enfermedad del fugado, enfermedad neurologica, trastorno neuromuscular, deficit neuromotor, alteracion neuroesqueletica, incapacidad neurologica, disfuncion neurosensorial, accidente cerebrovascular, isquemia, trastorno de la alimentacion, deficiencia de a-i-antitripsina (AAT), enfermedad de Batten, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad esqueletica, traumatismo, o enfermedad pulmonar en un mam^era.
  14. 14. Un metodo para aumentar la eficiencia de transduccion de un vector viral adeno-asociado recombinante (rAAV), comprendiendo el metodo la etapa de mutar al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie en las protemas de la capside, correspondiendose el al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie a Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730, Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr720 de la protema de la capside de AAV2 no mutante de forma que la eficiencia de transduccion en una celula de mamffero del vector que comprende la protema de la capside mutada sea superior a la de un AAV correspondiente que mantiene dichos restos de tirosina expuestos en la superficie en la protema de la capside, en el que la celula huesped de mam^era es la lmea celular cervical humana, HeLa.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 14, en el que el al menos un resto de tirosina mutado es uno o mas de Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704 o Tyr730.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 14 o 15, en el que el al menos un resto de tirosina expuesto en la superficie mutado se sustituye con fenilalanina.
  17. 17. El metodo de la reivindicacion 14, 15 o 16, en el que el vector viral adeno-asociado recombinante (rAAV) esta seleccionado del grupo que consiste en un serotipo 1 de AAV, un serotipo 2 de AAV, un serotipo 3 de AAV, un serotipo 4 de AAV, un serotipo 5 de AAV y un serotipo 6 de AAV.
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