JPWO2020026968A1 - Aavベクターによる遺伝子発現を増強する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 目的の発現用遺伝子を含む組換えウイルスベクター、少なくとも40 mMの糖、および水性媒体を含む、遺伝子導入用組成物。
[2] 前記組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、上記[1]に記載の組成物。
[3] 前記組換えウイルスベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV-B1、AAV-PHP.B、またはAAV-PHP.eBに由来する、上記[1]または[2]に記載の組成物。
[4] 前記組換えウイルスベクターが、配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列、または配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列と約90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含むカプシドを含む、上記[1]〜[3]のいずれか1項に記載の組成物。
[5] 前記組成物が0.04〜2 Mの濃度の糖を含む、上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載の組成物。
[6] 前記糖が、単糖、二糖またはその組合せを含む、上記[1]〜[5]のいずれか1項に記載の組成物。
[7] 前記単糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、およびその組合せから選択される少なくとも1種を含む、上記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の組成物。
[8] 前記単糖がD体を60%以上含む、上記[1]〜[7]のいずれか1項に記載の組成物。
[9] 前記二糖が、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも1種を含む、上記[1]〜[8]のいずれか1項に記載の組成物。
[10] 前記水性媒体が注射用水である、上記[1]〜[9]のいずれか1項に記載の組成物。
[11] 注射剤または注入剤の形態の医薬である、上記[1]〜[10]のいずれか1項に記載の組成物。
[12] エキソビボまたはインビトロで使用される薬剤である、上記[1]〜[11]のいずれか1項に記載の組成物。
[13] 前記組成物が、凍結保存されて使用前に解凍される、上記[1]〜[12]のいずれか1項に記載の組成物。
[14] 組換えウイルスベクター、および糖を含む、上記[1]〜[13]のいずれか1項に記載の組成物を調製するためのキット。
[15] (a) 組換えウイルスおよび40 mM以上の濃度の糖を含む組成物を提供する工程、および(b) 糖を終濃度10〜250 mM含む培地中で、前記組成物を培養細胞と接触させる工程を含む、遺伝子導入方法。
[16] (a) 組換えウイルスを含み、糖を含むまたは含まない遺伝子導入用組成物を提供する工程、(b) 前記遺伝子導入用組成物を培養細胞と接触させる工程、および(c) 前記工程(b)の直後〜72時間後に糖を10〜250 mM含む培地中で培養する工程を含む、遺伝子導入方法。
[17] 前記培養細胞が生体より採取された細胞または樹立された細胞である、上記[15]または[16]に記載の方法。
[18] 遺伝子導入対象の臓器、組織またはその一部を隔離する手術において使用するための、上記[1]〜[13]のいずれか1項に記載の遺伝子導入用組成物。
本発明の遺伝子導入用組成物(以下、「本発明の組成物」ともいう)に用いる組換えウイルスベクターは、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞に感染する公知ウイルスベクターを含むことができる。
本発明の組成物に用いることができるウイルスベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター(ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含む)、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ボルナウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであり、より好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターである。
天然のアデノ随伴ウイルス(AAV)は、非病原性ウイルスであること、およびアデノ随伴ウイルスベクター内に含まれるウイルスゲノムが感染した宿主細胞の核内のエピゾームに長期間、存在することを特徴とする。これらの特徴を利用して、種々の組換ウイルスベクターを作製して、遺伝子治療のために所望の遺伝子を送達することが行われている(例えば、WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、薬学雑誌 126(11)1021-1028などを参照のこと)。
文献10. Sorrentino NC, et al.: Mol Ther. 24:276-286, 2016.
文献11. Choudhury SR, et al.: Mol Ther. 24:1247-1257, 2016.
文献12. Chan KY, et al.: Nat Neurosci. 20:1172-1179, 2017.
文献13. Iida A, et al.: Biomed Res Int. 2013:974-819, 2013.
本発明において、組換えウイルスベクターが含むタンパク質は、配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列、または配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは85%以上、約90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、生理条件下でウイルスベクターを形成するか、またはウイルスベクターのカプシド(外殻)を形成するタンパク質である。
アデノウイルスを用いた遺伝子治療用ベクター(以下、組換えアデノウイルスベクターともいう)は、これまでの医薬の治験において最も利用されたベクターといえる(特表平08-501686、特表平10-506542、非特許文献1、下記の文献14、15)。また、実用化されたものとして、ヒトのがん抑制遺伝子p53が組み込まれた組換えアデノウイルスベクターが、遺伝子治療薬として2003年に世界で初めて認可され、商品名「Gendicin(ゲンディシン)」として販売されている。組換えアデノウイルスベクターは、宿主範囲(対象となる動物種、細胞腫など)が広いことが公知である。また、アデノウイルスの遺伝子は標的細胞の細胞核内で染色体に組み込まれずに独立して存在するので、この特徴によって組換アデノウイルスベクターは目的遺伝子を一過性に発現できる。具体的には、生体に投与した組換えアデノウイルスベクターは、通常1〜2週間で目的遺伝子の発現が消失し得る。組換えアデノウイルスベクターの欠点としては、生体において免疫原性が高いことが挙げられる。
文献14. Yokoda RT, et al.: Biomedicines. 6:33, 2018.
文献15. Zhang C and Zhou D: Hum Vaccin Immunother. 12:2064-2074, 2016.
本明細書中で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスベクター(またはオンコウイルスベクター)およびレンチウイルスベクターを含むことが意図される。ガンマレトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)に由来するベクターが挙げられる。また、レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV 1)、サル免疫不全ウイルス(SIV)に由来するベクターが挙げられる。
本発明に用いる組換えウイルスベクターは、標的細胞に導入するための目的の発現用遺伝子(ポリヌクレオチド)を、ウイルスベクター内に収容される組換えウイルスゲノム中に含み得る。このような導入される目的の発現用遺伝子としては、遺伝子自体が機能を有する配列、転写物が機能する配列、タンパク質に翻訳されて機能する配列、及びこれら配列の組合せを含む遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、本発明に用いる組換えウイルスベクターが有する目的の発現用遺伝子は、遺伝子サイズなどを考慮して、組換えウイルスベクターに搭載可能なものであれば特には制限されない。
本発明に用いる組換えウイルスベクターは、上記の目的の発現用遺伝子を有する複数のベクターを含んでもよい。また、本発明に用いる組換えウイルスベクターはまた、1種のベクター中に目的の発現用遺伝子を複数種含んでもよい。
本発明において使用可能なプロモーター配列は、上記の目的の発現用遺伝子を標的の細胞内で発現可能であれば特には限定されない。
例えば、本発明において汎用的な哺乳動物由来のプロモーターやウイルス由来のプロモーターを使用できる。このようなプロモーターとしては、PGKプロモーター、EF1−αプロモーター、β−グロビンプロモーター、CMVプロモーター、SV40プロモーター、MMLV−LTRプロモーター、およびHIV−LTRプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
また、本発明において、標的細胞に特異的なプロモーターを使用できる。標的細胞が神経系の細胞である場合、例えば、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター配列、L7プロモーター配列(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)、グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、グルタミン酸受容体デルタ2プロモーター(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)配列、グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD65/GAD67)プロモーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において標的細胞が肝細胞である場合、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子(HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBP)のプロモーター、アルブミンプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモータ、合成プロモーター(HCRhAATプロモーター、WO2018/131551などに記載のもの)が挙げられるが、これらに限定されない。
これらのプロモーター配列は、標的細胞においてプロモーター機能を保持する限り、本発明において用いるために適宜改変され得る。
本発明の組成物を医薬として用いる治療方法としては、遺伝子治療、癌ウイルス療法、ウイルス免疫療法などが挙げられる。遺伝子治療では、先天性の遺伝子疾患、加齢に伴う機能低下に起因する疾患などについて研究されている。癌ウイルス療法としては、癌細胞を標的として、溶解、アポトーシスなどを誘発させるウイルスが研究されている。また、ウイルス免疫療法としては、例えば、CART療法など、対象疾患の治療に有利な免疫応答を誘発させるためのウイルスを用いる治療法が研究されている。
本発明の組成物は、上記の組換えウイルスベクターと一緒に糖を含むことを特徴とする。本明細書中、「糖」は「糖類」と記載される場合もある。
本発明の組成物において使用可能な糖は、医薬品分野で利用可能であることが公知の糖である。好ましくは、本発明に使用する糖は、注射剤または注入剤において使用可能なものである。このような糖としては、単糖(トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソースを含む)および二糖のものが挙げられる。
本発明の組成物に使用する糖としては、好ましくは、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
上記の糖は、2種以上の糖を組み合わせてもよい。例えば、グルコースとスクロースとの組合せ、スクロースとマルトースとの組合せ、グルコースとスクロースとマルトースとの組合せ、スクロースとマルトースとの組合せなどが挙げられる。この場合、糖濃度は、例えば、各々の糖の下限〜上限の濃度、各々の糖の合計濃度について1種の糖に対する下限〜上限濃度などを、目的の遺伝子導入のために好適な濃度を用いることができる。
本発明の組成物に関して、エキソビボまたはインビトロでの遺伝子導入の場合の糖の終濃度は、使用する培地量に応じて適宜計算できる。
本発明の組成物に関して、インビボでの遺伝子導入の場合の糖の終濃度は、投与する対象患者の体重、水分量、血液量、遺伝子導入対象となる組織の体積、血液、組織液(例えば髄液)などを考慮して計算することができる。このような計算の際、例えば、体重60kgのヒト成人の場合、水分量としては約60%、血液量としては約8%(約5L)など、公知の量を使用できる。
場合により、本発明の遺伝子導入組成物中の組換えウイルスベクター及び糖の局所濃度を上昇させることを目的とする術式を使用できる。例えば、遺伝子導入対象となる特定の臓器、組織またはその一部を生体から隔離して、一時的により高濃度の糖と接触させることができる。より具体的には、遺伝子導入対象の部位(例えば、臓器、組織またはその一部)の血流、リンパ液、髄液等を、クランプ等を用いて一時的に停止(隔離)させ、医薬学的に利用可能な水性媒体(生理食塩水等)で置換、潅流、フラッシュさせ、次いで、フラッシュさせた部位に対して本発明の組成物を投与することができる。このような手術の具体例として、肝臓において門脈血を生理食塩水で一時的にフラッシュして、そこにAAVベクターを投与する方法が知られている(Mimuroら、Molecular Therapy vol.21 no.2 feb. 2013, 318-323)。この場合の糖の終濃度としては、例えば50〜100 mM、60〜90 mM、70〜80 mMなどの濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、本発明の組成物は、髄腔内投与において使用する場合、髄液の媒体量(例えば、成人で約150mL)を考慮して、血中濃度よりも高い終濃度を使用し得る。この場合の糖の終濃度としては、例えば50〜100 mM、60〜90 mM、70〜80 mMなどの濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明の組成物は、濃縮物の形態で提供されたものを、使用前(例えば、使用直前(5分前以下)、10分前、20分前、30分前など)に希釈して用いてもよい。
あるいは、本発明の組成物は、上記の濃度の糖を含む状態で凍結保存されてもよい。凍結保存される場合、濃縮物の形態であっても濃縮物の形態でなくてもよい。本発明の組成物は、凍結保存される場合、好ましくは、1月以下の間、2月間、3月間、6月間、1年間、2年間、5年間、10年間またはそれ以上の間、保存され得る。その後、使用前(例えば、使用直前(5分前以下)、10分前、20分前、30分前、1晩前など)に解凍され、場合により目的の濃度に希釈される。
この操作において、使用する糖及びその終濃度としては、上記の終濃度、例えば、エキソビボやインビトロ(例えば、培地中の終濃度)でのグルコース 40〜240 mM、スクロース 80〜200 mM、トレハロース 40〜200 mM、マルトース 40〜200 mM、ラクトース 40〜200 mMの濃度、インビボ(例えば血中)での単糖または二糖の10 mMの濃度、を用いることができる。
本発明の組成物は、例えばインビボへの投与の場合に従来使用される投与期間よりも短い期間を設定でき、これによって患者の負担を軽減できる。
3.1.用時調製について
本発明の組成物は、所定の濃度の糖を含む。実際に医薬組成物として利用する場合、患者の健康状態に応じて投与する糖を制限または低減させたい場合が想定される。そのような場合、本発明の組成物を使用前の用時に調製され得る。
また、本発明の組成物は、濃縮物の形態で提供されたものを、使用前(例えば、使用直前(5分前以下)〜12時間前(1晩前)の間、例えば10分前、20分前、30分前など)に希釈して用いてもよい。
あるいは、本発明の組成物は、上記の濃度の糖を含む状態または含まない状態で、例えば1月以下の間、2月間、3月間、6月間、1年間、2年間、5年間、10年間またはそれ以上の間、凍結保存されて、使用前(例えば、使用直前(5分前以下)、10分前、20分前、30分前など)に解凍され、場合により目的の終濃度の糖を含む組成物に希釈され得る。
上記のように調製する場合の温度としては、培養温度以下の温度、例えば周囲温度(室温)であってもよいし、本発明の組成物の溶液が凍結しない程度の低温であってもよい。
本発明の組成物は、培養細胞と接触させることができる。このような細胞としては、樹立された培養細胞、生体より採取した初代細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の組成物により目的の遺伝子が導入された細胞は、治療、研究などの目的の用途に利用できる。
また、本発明の組成物は、末梢投与、筋肉内投与、門脈内投与、髄腔内投与、脳内投与などの公知の投与経路を介して投与することもできる。
さらに、本発明の組成物は、遺伝子導入対象の臓器、組織またはその一部を隔離する手術において使用することができる。このような手術において、本発明の組成物中の組換えウイルスベクター及び糖の局所濃度を上昇させる目的で、導入対象の部位(例えば、臓器、組織、臓器または組織の一部など)の血流、リンパ液、髄液等をクランプ等を用いて一時的に隔離させて、医薬学的に利用可能な水性媒体(生理食塩水等)で置換、潅流、フラッシュさせる。その後、隔離した部位に対して本発明の遺伝子導入組成物を投与できる。このような具体例として、肝臓において門脈血を生理食塩水で一時的にフラッシュして、そこにAAVベクターを投与する方法が知られている(Mimuroら、Molecular Therapy vol. 21 no. 2 feb. 2013, 318-323)。
本発明の組成物を医薬組成物として使用する場合、例えば、経口、非経口(静脈内)、髄液、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などですることができるが、非経口的に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1〜20重量%、好ましくは1〜5重量%で組成物中に含有できる。
本発明の組成物は、培養細胞にエキソビボまたはインビトロで用いられる試薬の形態であってもよい。この場合、本発明の組成物は、水性媒体として、上記の注射用水、生理食塩水などの水性媒体に加えて、基礎培地または濃縮培地であってもよい。さらに、本発明の組換えウイルスベクターは、GFPなどの公知のレポーター遺伝子を含むものであってもよい。このようなマーカーは、例えばエキソビボもしくはインビトロにおいて遺伝子導入細胞を選択するため、インビボにおいて導入状態を検証するために用いることができる。
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
(1) GFP発現AAVベクター
3種類のAAVベクター(AAV3B、yf2AAV9、AAVGT4)を使用した。yf2AAV9は、AAV9の外被蛋白VP1の446番目及び731番目のチロシン(Y)をフェニルアラニン(F)で置換している(iidaら、BioMed Research International, Vol. 2013, Article ID 974819)。AAVGT4はAAV3BのVP1の587番目のセリン(S)をアラニン(A)で置換している(配列番号:4)。いずれのAAVベクターも、cytomegalovirus promoter (CMV)プロモーター、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、公知のAAV3Aのinverted terminal repeats (ITR)の間に挿入している。
AAV3A: GenBank Accession # U48704(VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号:1に示す。)
AAV3B: GenBank Accession #AF028705.1(VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号:2に示す。)
AAV9: GenBank Accession # AY530579.1
yf2AAV9:(VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号:3に示す。)
AAVGT4:(VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号:4に示す。)
(b) 細胞培養
1)HEK 293細胞
5×104/well(ウェル)のHEK293細胞を播き、10% ウシ胎仔血清(FCS)-DMEM/F12培地を使用して5% CO2、37℃で培養した。
2)HepG2細胞
5×104/wellのHepG2細胞を播き、10% FCS DMEM low glucose培地(Thermo Scientific)を使用して5% CO2、37℃で培養した。
(c) 糖類
単糖類:グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース
二糖類:スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース
最終濃度が以下になるように培地に添加した。
グルコース:0〜200 mM
その他の単糖類:100 mM、200 mM
スクロース:0〜187 mM
その他の二糖類:100 mM、125 mM、150 mM
(d) ウイルスベクターによる感染
上記(b)の培養細胞に (a)に記載した、GFPを発現するAAV3B-CMV-AcGFPを 6×107〜5×108 vg/well、または、yf2AAV9-CMV-AcGFPを2×109 vg/well 添加し、3〜6日間、培養した。
(e) GFP発現の評価
プレートリーダー(バイオテックジャパン)でGFPの蛍光強度を測定し比較した。また、蛍光顕微鏡 (オリンパスIX83)で代表的な視野の画像を撮影した。
実験1 AAVの感染・発現に及ぼすスクロースの効果
HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom plate (ThermoFisher)に播種し、翌日、AAV3B-CMV-AcGFP 2×108vg/well、またはyf2AAV9-CMV-AcGFP 2×109 vg/well を培地中に加えた。続いて培地中の最終濃度が125 mM となるようスクロース(Wako)を添加した。具体的には培地に溶解した1.25 M スクロース溶液を培地全量の1/10量となるよう添加した。対照のスクロース(-)にはスクロース溶液と同量の培地を添加した。37℃、5% CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダー(バイオテックジャパン)でGFPの蛍光強度を測定し比較した(図1A)。また、蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した(図1B)。
この実験の結果、スクロースの添加((+)で表される)によりAAV3Bは15.4倍、yf2AAV9は19.6倍、GFPの発現が上昇した。
HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種し、翌日、AAV3B-CMV-AcGFP 6×107vg/wellを培地中に加えた。続いて125 mM スクロースと、浸透圧がほぼ同等になる濃度のグルコース (Sigma)、マンニトール (日本製薬)、またはNaCl(Wako)を添加した。最終濃度はそれぞれ125.0 mM、132.3 mM、132.3 mM、71.5 mMである。添加物溶液と同量の培地を添加して対照とした。37℃、5% CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した(図2A)。また、蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した(図2B)。
この実験の結果、スクロース、グルコース、マンニトールの添加により、それぞれ11倍、8倍、2倍の発現上昇がみられた。なお、NaClを添加した場合は発現が極端に低下した。
HepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom plateに播種した。翌日、AAVGT4-CMV-AcGFP 5×108vg/well、またはAAV3B-CMV-AcGFP 5×108 vg/wellを培地中に加えた。続いて培地中の最終濃度が125 mM となるようスクロースを添加した。対照のスクロース (-)にはスクロース溶液と同量の培地を添加した。37℃、5% CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。
この実験の結果、ヒト肝癌由来細胞株のHepG2細胞でも、スクロース添加によってAAV3Bで16.1倍、AAVGT4で19.1倍発現が上昇した。
HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種し、翌日、AAVベクターとスクロースを種々の添加方法で投与した。いずれも37℃、5% CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。AAVベクターはいずれもAAV3B-CMV-AcGFP 1×108 vg/well、スクロースの終濃度は125 mMとした。
第1の手法として、AAVベクター投与直後(5分以下)にスクロースを添加、スクロースをあらかじめ細胞に添加した直後(5分以下)、10分後、または1時間後でのAAVベクターを投与の4種類の方法で投与した。対照のスクロース(-)にはスクロース溶液と同量の培地を添加した。
スクロース添加群ではいずれの方法でも10倍程度の発現上昇効果が見られた(図4A)。
第2の手法として、AAVベクターとスクロースとをあらかじめ混和し、混和直後(5分以下)と室温1時間静置後、AAV3B-CMV-AcGFPが1×108 vg/well、スクロースの終濃度が125 mMとなるように細胞に投与した。スクロース(-)は、スクロース溶液と同量の培地をAAVベクターと混和し室温1時間静置したものを指す。上記と同様に3日後にGPF発現量を測定した。
この実験の結果、AAVベクターをスクロースと混和してから投与する方法の場合も、直後及び1時間後投与のどちらも12倍以上の発現増強効果が得られた(図4B)。
第3の手法として、AAV3B-CMV-AcGFPベクター1×108 vg/wellの投与直後(5分以下)にスクロース(+)培地もしくは(-)培地を添加し、その3時間後に125 mMのスクロース(+)培地又は(-)培地で全量培地交換した。上記と同様に3日後にGPF発現量を測定した。
これらの実験の結果、AAV投与直後からスクロースが存在する状態では4.9倍の増強効果であったが、AAVの感染が完了しているとみられる3時間後にスクロースを添加した場合でも2.8倍の発現増強効果が得られた(図4C)。
自然界に存在せず細胞に利用されない(解糖系に取り込まれない)とされるL-グルコース (Sigma)、または通常存在するD-グルコースをAAV3B-CMV-AcGFPと混和・室温1時間静置後、AAVが1×108vg/well 、各グルコースの終濃度が132 mM となるよう細胞に投与した。37℃、5% CO2インキュベーターで1、2、3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。細胞はHEK293細胞 5×104cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日に用いた。
この実験の結果、投与1日後では、D-グルコース添加により17倍程度の発現増強が見られ、一方、L-グルコースの添加でも11倍の増強が見られた。この理由は、混和した糖によって細胞の代謝が賦活されたのではなく、AAVベクターの感染自体に糖が関与したと推察される(図5A)。
一方、D体とL体の発現強度の差(D/L)が1日後1.5倍であったのに対し3日後には2.1倍に広がっていることから、糖は細胞の活性を高めることによっても発現を増強させている可能性が推察される(図5B)。
AAV3B-CMV-AcGFPと種々の濃度のスクロースをあらかじめ混和し、室温で1時間静置後、細胞に投与した。最終的なAAVベクターの投与量は1×108 vg/well、スクロースの終濃度は80 mM〜160 mMである。スクロース (-)はスクロース溶液と同量の培地を混和した。対照として、スクロース希釈時のバッファーによる細胞傷害を防ぐため、投与3時間後、培地で調整した同濃度のスクロース溶液で培地交換を行った。37℃、5% CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。細胞はHEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日に用いた。
この実験の結果、培地中スクロース濃度 80 mMで5倍以上の増強効果がみられた。効果は濃度依存的に上昇し、145、150、160 mMで30倍程度の高い増強効果が見られた。3日後の至適濃度は150 mMであった(図6)。なお、スクロース濃度をさらに上げ、187 mMにすると細胞が傷害を受けて剥がれ、GFP強度が2割程度と激減した(データは示さず)。
AAV3B-CMV-AcGFPと種々の濃度のグルコースをあらかじめ混和し、室温に1時間静置後、細胞に投与した。最終的なAAVの投与量は1×108 vg/well、グルコースの最終濃度は40mM〜200 mMである。グルコース(-)はグルコース溶液と同量の培地を混和した。グルコース希釈時のバッファーによる細胞障害を防ぐため、投与3時間後に培地で調整した同濃度のグルコース溶液で培地交換を行った。37℃、5% CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。細胞はHEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日に用いた。
この実験の結果、培地中グルコース濃度 80 mMで3倍以上の増強効果がみられた。この増強効果は濃度依存的に上昇し、200 mMで60倍近い増強効果が得られた(図7)。
HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、4種の二糖類、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース(スクロース以外すべてSigma)、100、125、150 mMを含む培地で培地交換したのち、AAV3B-CMV-AcGFP 1×108 vg/well を投与した。対照には糖液と同量の培地を添加した。37℃、5% CO2インキュベーターで1、2、3、6日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した(図8A)。また、蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した(図8B)。
この実験の結果、投与3日後には何れの糖も濃度依存的に2〜6倍の増強効果を示した。
HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、AAV3B-CMV-AcGFP を2種の濃度の単糖類、グルコース、ガラクトース、フルクトース、及びマンノース(全てSigma)と混和し室温に1時間静置後、細胞に投与した。最終的なAAVの投与量は1×108 vg/well、糖の濃度は100および200 mMである。対照には糖液と同量の培地を混和した。37℃、5% CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した(図9A)。また、投与3日後に蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した(図9B)。
この実験の結果、これらグルコース、ガラクトース、フルクトース、及びマンノースの単糖の中ではグルコースが圧倒的に高い増強効果を示し、その効果は200 mMで120倍であった。フルクトース及びマンノースの効果はスクロースと同程度であった。ガラクトースは他の糖より効果が低かった。
配列番号2:AAV3B VP1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:yf2AAV9 VP1タンパク質(Y446F/Y731F 変異体)のアミノ酸配列
配列番号4:AAV GT4 VP1タンパク質のアミノ酸配列
Claims (15)
- 目的の発現用遺伝子を含む組換えウイルスベクター、少なくとも40 mMの糖、および水性媒体を含む、遺伝子導入用組成物。
- 前記組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記組換えウイルスベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV-B1、AAV-PHP.B、またはAAV-PHP.eBに由来する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記組換えウイルスベクターが、配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列、または配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列と約90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含むカプシドを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が0.04〜2 Mの濃度の糖を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記糖が、単糖、二糖またはその組合せを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記単糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、およびその組合せから選択される少なくとも1種を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記単糖がD体を60%以上含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記二糖が、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも1種を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記水性媒体が注射用水である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 注射剤または注入剤の形態の医薬である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- エキソビボまたはインビトロで使用される薬剤である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、凍結保存されて使用前に解凍される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 組換えウイルスベクター、および糖を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物を調製するためのキット。
- (a) 組換えウイルスおよび40 mM以上の濃度の糖を含む組成物を提供する工程、および
(b) 糖を終濃度10〜250 mM含む培地中で、前記組成物を培養細胞と接触させる工程、
を含む、遺伝子導入方法。
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