BR112019016769A2

BR112019016769A2 - Métodos e composições para transferência genética através da vasculatura

Info

Publication number: BR112019016769A2
Application number: BR112019016769-2A
Authority: BR
Inventors: Asokan Aravind; MURLIDHARAN Giridhar; ALBRIGHT Blake
Original assignee: The University Of North Carolina At Chapel Hill
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2018-02-15
Publication date: 2020-05-26
Also published as: AU2018221738A1; AU2018221738B2; KR20190117571A; US11905312B2; IL268534B2; CA3052829A1; US20190367562A1; JP2023052541A; WO2018152333A1; CN110520536B; MX2019009720A; EA201991911A1; IL268534A; CN110520536A; WO2018152333A9; EP3583220A4; IL312788A; JP2020505936A; EA038695B1; US20240209031A1

Abstract

a presente invenção refere-se a proteínas do capsídeo do aav compreendendo uma modificação na sequência de aminoácidos e capsídeos de vírus e vetores de vírus compreendendo a proteína do capsídeo do aav modificada. a presente invenção também se refere a métodos de administração dos vetores de vírus e capsídeos de vírus da divulgação a uma célula ou a um sujeito in vivo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRANSFERÊNCIA GENÉTICA ATRAVÉS DA VASCULATURA”.

REFERÊNCIA CRUZADA

[0001] Este pedido reivindica o benefício, segundo 35 U.S.C. § 119(e), do Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos U.S. No. 62/459.286 registrado em 15 de fevereiro de 2017, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este pedido de patente, em sua totalidade para todos os fins.

DECLARAÇÃO DE SUPORTE GOVERNAMENTAL

[0002] Esta invenção foi produzida com suporte governamental segundo as Grants (N.T.: Concessões) Nos. P01HL112761 e R01HL089221 concedidas pelo National Institutes of Health. O governo tem determinados direitos na presente invenção.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0003] A Listagem de Sequências associada com este pedido é proporcionada em formato de texto ao invés de em uma cópia em papel, e é por este incorporada por mieo de referência na especificação. O nome do arquivo de texto contendo a Listagem de Sequências é STRD_004_01WO_SeqListSST25.txt. O arquivo de texto tem 4 KB, e foi criado em 14 de fevereiro de 2018, e está sendo submetido eletronicamente via EFS-Web.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0004] A presente invenção refere-se a proteínas do capsídeo modificadas de vírus adeno-associados (AAV) e capsídeos de vírus e vetores de vírus compreendendo as mesmas. E, particular, a invenção se refere a proteínas do capsídeo do AAV modificadas e capsídeos compreendendo as mesmas que possam ser incorporados em vetores de vírus para conferir um perfil de transdução desejável com relação a um ou mais tecidos alvo de interesse.

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ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0005] Novas cepas do vírus adeno-associados (AAV) isoladas a partir de tecidos animais e de estoques adenovirais têm expandido o panei de vetores do AAV disponíveis para aplicações terapêuticas de transferência genética. Atualmente estão em andamento esforços extensivos no intuito de mapear os tropismos teciduais destes isolados do AAV em modelos animais. A capacidade para homing direto de vetores do AAV para órgãos seletivos é útil para terapia genética e outras aplicações terapêuticas.

[0006] A presente invenção aborda uma necessidade na técnica de vetores de liberação de ácido nucleico com características desejáveis de direcionamento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, A267, S268 e H272, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos G266 e A267, (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 1) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV2 (SEQ ID NO:

2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO:

5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV desta invenção pode compreender adicionalmente uma modificação nos resíduos de aminoácidos Q148, E152, S157, T162, T326, D328, V330, T331, V341 e S345, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos E152 e P153 (numeração VP1) em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou o resíduo de aminoácido equivalente nas SEQ ID

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NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em modalidades adicionais, a proteína do capsídeo do AAV desta invenção pode compreender adicionalmente uma modificação dos resíduos de aminoácidos L188, S205, N223 e A224 (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou o resíduo de aminoácido equivalente nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0008] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, e A267 (numeração VP1), e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269, em que os resíduos de aminoácidos são baseados na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 1) ou os resíduos de aminoácidos equivalentes em AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo adicionalmente compreende uma modificação no resíduo de aminoácido H272. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV adicionalmente compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos Q148, E152, S157, T162, H272, T326, D328, V330, T331, V341 e S345, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos E152 e P153. Em modalidades adicionais, a proteína do capsídeo do AAV adicionalmente compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos L188, S205, N223, A224, e H272.

[0009] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação resultando na sequência de aminoácidos: X¹-X²-X³-X⁴ (SEQ ID NO: 35) nos aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 262 a 265

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4/120 (numeração VP1) da proteína do capsídeo do AAV1 nativo (SEQ ID NO: 1), em que X¹ é qualquer aminoácido diferente de S; em que X²é qualquer aminoácido diferente de A; em que X³é qualquer aminoácido diferente de S; e em que X⁴é qualquer aminoácido diferente de T.

[00010] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, A267, e H272, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269, (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 2) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8).

[00011] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, Q263, S264, A266, S267, e H271, e uma inserção de no mínimo um resíduo de aminoácido entre os resíduos S261 e S262, (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO:

5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8).

[00012] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, Q263, S264, A266, A267, H271, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S261 e

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S262, em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV3 (SEQ ID NO: 3) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8).

[00013] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S263, S269, A237 (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV9 (SEQ ID NO: 9) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8).

[00014] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende a sequência de qualquer uma de SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 34.

[00015] A presente divulgação adicionalmente proporciona um capsídeo do AVV compreendendo uma proteína do capsídeo da divulgação, bem como um vetor do vírus compreendendo um capsídeo do AVV da divulgação. Em algumas modalidades, o vetor do vírus compreende um capsídeo do AVV da divulgação e um ácido nucleico compreendendo no mínimo uma sequência de repetição do terminal, em que o ácido nucleico é encapsidado pelo capsídeo do AVV.

[00016] A presente divulgação adicionalmente proporciona composições farmacêuticas compreendendo os capsídeos do AVV e/ou os vetores de vírus revelados aqui, neste pedido de patente.

[00017] Também é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um método de introdução de uma molécula de ácido nucleico dentro

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6/120 de uma célula, compreendendo contactar a célula com um vetor do vírus da divulgação, bem como um método de liberação de uma molécula de ácido nucleico a um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito um vetor do vírus da divulgação.

[00018] Além disso, a presente divulgação proporciona um método de liberar seletivamente uma molécula de ácido nucleico de interesse a uma célula neuronal, compreendendo contactar a célula neuronal com o vetor do vírus desta invenção, em que o vetor do vírus compreende a molécula de ácido nucleico de interesse.

[00019] Em ainda outra modalidade, a presente divulgação proporciona um método de tratamento de um transtorno ou defeito neurológico em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito um vetor do vírus da divulgação, em que o vetor do vírus compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico eficaz no tratamento do transtorno ou defeito neurológico.

[00020] Estes e outros aspectos são abordados em mais detalhes na descrição estipulada abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00021] FIG. 1. Quantificação da transdução de neurônios corticais. Camundongos BL6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram administrados sistemicamente através de injeções na veia da cauda com uma dose de 5 χ 10¹¹ vg (genomas de vetor) de vetores que empacotam CBh-scGFP (AAV1, AAV1R6 ou AAV1R7) ou com PBS como um controle negativo. Os camundongos foram sacrificados 21 dias após a injeção e os tecidos foram coletados, fixados, e seccionados. Os tecidos foram imunocorados para GFP usando um substrato DAB, a expressão de GFP foi visualizada por meio de varredura de lâminas e do software ImageScope. Neurônios positivos para GFP no córtex cerebral foram manualmente contados, quantificados e calculados através de múltiplas seções cerebrais coronais por camundongo. N = 2 para AAV1; n = 3

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7/120 para AAV1R6 e AAV1R7.

[00022] FIG. 2. Cruzamento da vasculatura cerebral e expressão neuronal. Os vectores de AAV que empacotam um transgene CbhscGFP foram administrados a camundongos C57/BI6 através de injeção na veia da cauda em uma dose de 5 χ 10¹¹ vg. Os camundongos foram sacrificados em 21 dias após a injeção, os tecidos foram coletados, fixados, seccionados, corados com DAB para detectar GFP, visualizados através de imagens obtidas via Aperio Scanner e processamento de imagem realizado com o software ImageScope. Abreviações: Córtex (CTX), córtex motor (MOT), estriado (STR), hipocampo (HO), giro dentado (DG). N = 3.

[00023] FIG. 3. Detargeting do fígado. Os vetores de AAV que empacotam um transgene CBA-luciferase foram administrados a camundongos C57/BI6 através de injeção na veia da cauda em uma dose de 1 χ 10¹¹ vg. Os camundongos foram sacrificados em 14 dias após a injeção, os tecidos foram coletados, picados, lisados e foram realizados ensaios de luciferase para detectar os níveis de transdução relativa para os tecidos cerebral, cardíaco, hepático, e da medula espinhal. Os dados foram normalizados como unidades de luz relativas por grama de tecido. N = 3.

[00024] FIGS. 4A a C. Análises filogenética e estrutural da biblioteca de capsídeos de troca do domínio AAV1/rh.10. FIG. 4A. Diagrama esquemático do painel de capsídeos quiméricos AAV1/rh.10 representativos isolados a partir da biblioteca demonstrando diversidade de sequências, no nível de aminoácidos, de permutas de domínios obtidas através de embaralhamento. Capsídeos individuais parentais ou quiméricos são listados verticalmente, enquanto a sequência de capsídeo VP1 com permutas de domínios diferentes é apresentada horizontalmente, a partir do terminal N à esquerda para o terminal C à direita. Os resíduos derivados de AAV1 são mostrados em cinza, os

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8/120 resíduos AAVrh.10 em verde-ciano e os resíduos de consenso entre os dois em preto. FIG. 4B. Filogenia de junção de vizinhos das sequências de capsídeos VP1 de capsídeos quiméricos AAV1/rh.1O. Sequências de aminoácidos de capsídeos foram alinhadas cm ClustalW e a filogenia foi gerada usando um algoritmo de junção de vizinhos. Foi usada uma correção de Poisson para calcular distâncias de aminoácidos, representadas como unidades do número de substituições de aminoácidos por local. A árvore é desenhada em escala, com comprimentos de ramificações nas mesmas unidades que os das distâncias evolucionárias usadas para inferir a árvore. Os valores de Bootstrap foram calculados com 1000 replicatas e a percentagem de árvores em replicata nas quais as taxas associadas agrupadas junto são mostradas próximas às ramificações. FIG. 4C. Modelos tridimensionais da superfície das regiões do trímero de subunidades do capsídeo / eixo de simetria tripla de mutantes de capsídeos do AVV quiméricos parentais e representativos selecionados para triagem in vivo. Os resíduos de aminoácidos derivados de AAV1 são mostrados em cinza, enquanto os resíduos derivados de AAVrh.10 são mostrados em verde-ciano. Modelos estruturais foram visualizados e gerados usando PyMol.

[00025] FIG. 5. Triagem in vivo produz quimeras AAV1/rh.10 capazes de cruzar a barreira hematoencefálica depois de administração intravenosa. Varreduras de seções cerebrais imunocoradas apresentando expressão de GFP no córtex cerebral mediada por vetores parentais ou quiméricos que empacotam um transgene CBh-scGFP em três semanas depois de administração através de injeção na veia da cauda em uma dose de 5 x 10¹¹ vg (ou PBS no caso de tratamento simulado). A seção cerebral coronal global (parte de cima) indica a região em caixa (boxed) do córtex vista nos insetos mostrados para cada vetor parental ou quimérico, representando seus perfis

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9/120 de transdução individuais. Barra de escala = 100 pm.

[00026] FIGS. 6A a G. Triagem in vivo de quimeras AAV1/rh.1O para sua capacidade para cruzar a barreira hematoencefálica e transduzir várias regiões cerebrais depois de administração intravascular. Os camundongos receberam uma dose de 5 x 10¹¹ vg de ou vetor parental (AAV1 ou AAVrh.10) ou quimérico que empacota um transgene CBh-scGFP através de injeção na veia da cauda. Seções cerebrais imunocoradas e estudados por imagens apresentam expressão de GFP, como coloração preta / marrom escura, em 21 dias após a injeção. Barra de escala = 100 pm. A seção cerebral coronal global na parte de cima da figura indica as várias regiões cerebrais mostradas nos insetos: MCT, córtex motor (FIG. 6A); HC, hipocampo (FIG. 6B); DG, giro dentado (FIG. 6C); TH, tálamo (FIG 6D); HY, hipotálamo (FIG. 6E); STR, corpo estriado (FIG. 6F); Amg, amígdala (FIG. 6G). n = 3 para cada.

[00027] FIGS. 7A a H. Perfil de transdução no sistema nervoso central de AAV1R6 e AAV1R7 em comparação com AAV1 e AAVrh.10 parentais no cérebro. São mostrados perfis de transdução em três semanas depois de injeção na veia da cauda de vetores de AAV que empacotam um transgene CBh-scGFP em uma dose de 5 x 10¹¹vg para os sorotipos parentais, AAV1 e AAVrh.10 (colunas à esquerda), e para AAV1R6 e AAV1R7 (colunas à direita) através de várias regiões cerebrais, incluindo o córtex motor (FIG. 7A), o córtex cerebral (somatossensorial) (FIG. 7B), o hipocampo (FIG. 7C), o giro dentado (FIG. 7D), o tálamo (FIG. 7E), o hipotálamo (FIG. 7F), o corpo estriado (FIG. 7G), e a amígdala (FIG. 7H). Barra de escala = 100 pm.

[00028] FIGS. 8A a H. Comparação quantitativa dos níveis de transdução neuronal e glial para variantes de capsídeos parentais e quiméricos. Os n íveis de transdução neuronal relativa em 3 semanas após a administração de vetores que empacotam um transgene CBh

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10/120 scGFP através de injeção na veia da cauda em uma dose de 5x 10¹¹vg foram quantificados contando o número de neurônios e glia transduzidos, identificados com base na morfologia, para cada região cerebral, por 50 pm de seção coronal. É mostrada a transdução dos sorotipos parentais, AAV1 e AAVrh.10, ao lado das variantes quiméricas, AAV1R6 e AAV1R7, através de várias regiões do cérebro, incluindo o córtex motor (FIG. 8A), o córtex cerebral (somatossensorial) (FIG. 8B), o hipocampo (FIG. 8C), o giro dentado (FIG. 8D), o tálamo (FIG. 8E), o hipotálamo (FIG. 8F), o corpo estriado (FIG. 8G), e a amígdala (FIG. 8H). Barras de erro representam o desvio padrão (n > or = 3). Um Tteste bicaudal não pareado com correção de Welch e ANOVA one-way foram usados para demonstrar a significância estatiítica para transdução neuronal e glial por cada grupo em relação a AAV1, e as diferenças entre as médias foram estatisticamente significantes, respectivamente. ns, não significante; *, P < 0,05.

[00029] FIGS. 9A a F. Análise estrutural da variante de capsídeo quimérico AAV1R6. (FIG. 9A) O alinhamento de sequências de AAV1R6 com AAV1 e AAVrh.10 salienta os resíduos de aminoácidos (numeração AAV1R6) que são unicamente derivados de AAVrh.10 (mostrados em letras em preto e salientados em azul). Resíduos conservados estão em letras vermelhas e salientados em amarelo, enquanto que os resíduos equivalentes não conservados em AAV1 são mostrados em texto em preto ou em verde e são salientados quer em verde, quer em branco. O modelo estrutural tridimensional do monômero da subunidade quimérica AAV1R6 VP3 (FIG. 9B) foi gerado usando SWISS-MODEL com a estrutura cristalina da AAV8 servindo com oo modelo para modelagem de homologia (PDB ID: 2QAO). Foram gerados modelos superficiais da subunidade AAV1R6 VP3 (FIG. 9C) trímero dímero / eixo de simetria duplo, (FIG. 9D) trímero / eixo de simetria triplo, (FIG. 9E) pentâmero / eixo de simetria quintuple e (FIG.

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9F) rendering superficial de um capsídeo AAV1R6 intacto (60mero) através do gerador de oligômeros VIPERdb e foram visualizados usando PyMol. Resíduos derivados de AAV1 são coloridos em cinza enquanto resíduos derivados de AAVrh.10, aglomerados na base das protrusões no eixo de simetria tripla, depressão no eixo de simetria duplo e no poro quintuple 5, são coloridos em verde ciano.

[00030] FIGS. 10A a B. Transdução cardíaca e hepática relativa porAAV1R6 eAAV1R7 em comparação com capsídeos parentais. Ou vetores parentais (AAV1 ou AAVrh.10) ou quiméricos (AAV1R6 ou AAV1R7) que empacotam um transgene CBh-scGFP fo11 ram administrados em uma dose de 5 x 10 vg através de injeção na veia da cauda. Em 21 dias após a injeção, seções cardíacas e hepáticas foram imunocoradas para GFP e estudadas por imagens. FIG. 10A. Fluorescência de GFP para tecidos cardíacos (painel superior) e hepáticos (painel inferior) em camundongos tratados cmo ou PBS (Pseudo), AAV1, AAVrh.10, AAV1R6 ou AAV1R7. FIG. 10B. Níveis de transdução para tecido cardíaco (parte de cima) e hepático (parte de baixo) medidos por quantificação da fluorescência relativa através de múltiplas imagens tiradas para cada tratamento. As barras representam o intervalor do menor para o maior valor com a linha central representando a média entre as amostras. A fluorescência relativa foi normalizada para tecidos pseudo tratados. Barras de erro representam o desvio padrão (/? =3). Foram realizados ANOVA one-way e Tteste bicaudal não pareado com correção de Welch para cada grupo e é mostrada a significância em relação a AAVrh.10. ns, não significante. *, P < 0,05.

[00031] FIGS. 11A a H. Esquema racional e mapeamento funcional de uma pegada mínima de AAVrh.10 para cruzar a barreira hematoencefálica. FIG. 11A O alinhamento de sequência de AAV1RX com AAV1 e AAVrh.10 mostra os resíduos de aminoácidos numerados dentro e

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12/120 adjacentes à pegada neurotrópica. Resíduos conservados são salientados em amarelo, os resíduos que compõem a pegada são salientados em ciano e os resíduos não conservados são salientados ou em verde ou em branco. Foram gerados modelos estruturais do capsídeo quimérico AAV1RX manipulado usando o software SWISS-MODEL para modelagem à base de homologia e foi usado VIPERdb para gerar oligômeros. PyMol foi usado para gerar modelos renderizados superficialmente do monômero da subunidade AAV1RX VP3 (FIG. 11B), otrímer dímero / eixo de simetria dupla (FIG. 11C), trímero / eixo de simetria tripla (FIG. 11 D), pentâmero / eixo de simetria quintuple (FIG. 11E) e o capsídeo completo (60-mero) (FIG. 11F). Aminoácidos derivados de AAV1 e os homólogos entre AAV1 e AAVrh.10 são representados em cinza enquanto os resíduos compreendendo a pegada neurotrópica de AAVrh.10 para cruzar a barreira hematoencefálica são representados em verde ciano. FIG. 11G. A projeção do mapa estereográfico mostra a pegada neurotrópica conforme visualizada abaixo do eixo de simetria tripla sobre o capsídeo AAV1RX e foi gerada usando RIVEM. Somente são mostrados resíduos de aminoácidos expostos superficialmente, com os limites entre cada um delineado com linhas pretas. As regiões verdes representam as protrusões topológicas no eixo de simetria triplo enquanto as regiões azuis representam depressões topológicas. Os resíduos de aminoácidos principais desta pegada são de cor magenta (numeração VP1 AAVrh.10). FIG. 11H. Perfil de transdução do sistema nervoso central de AAV1RX que empacota um transgene CBh-scGFP administrado através de injeção na veia da cauda em uma dose de 5 x 10¹¹. vg. Seções tomadas em 21 dias após a injeção foram imunocoradas e estudadas por imagens. Barra de escala = 100 μιτι.

[00032] FIGS. 12A a H. Transdução do tecido periférico e biodistribuição de AAV1R6, AAV1R7 e AAV1RX depois de administração intravenosa. Os camundongos foram injetados através da veia da cauda

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13/120 com PBS ou com os vetores AAV1, AAVrh.10, AAV1R6, AAV1R7 ou AAV1RX que empacotam um transgene reporter CBA-Luc em uma dose de 1 x 10¹¹ vg. Em 2 semanas após a injeção, os níveis de expressão de transgene reporter da luciferase (FIGS. 12A, 12C, 12E, 12G) e biodistribuição de cópias do genoma viral através de vários tecidos (FIG. 12B, 12D, 12F, 12H) foram quantificados. Os os níveis de luciferase foram normalizados para gramas de lisado tecidual e são representads como unidades de luz relativa. Cópias do genoma vetorial (vg) são normalizadas para lamina de camundongo B (mLamB) come um gene housekeeping endógeno e são representadas como cópias de vg por célula. Barras de erro representam o desvio padrão (n = 3 para ensaios de luciferase; n = 4 para biodistribuição). ANOVA One-way e um T-teste bicaudal não pareado com correção de Welch for cada grupo foram realizados e é mostrada a significância em relação a AAVrh.10. ns, não significante. *, P < 0,05.

[00033] FIGS. 13A a H. Quantificação dos níveis de transdução neuronal e glial mediada por AAV1RX em comparação com as variantes de capsídeos parentais e outras quiméricas. Os camundongos re11 ceberam uma dose de 5 x 10 vg de qualquer parental (AAV1 ou AAVrh.10) ou vetor quimérico que empacota um transgene CBh-scGFP através de injeção na veia da cauda. Em 3 semanas após a injeção, os cérebros foram retirados, seccionados, imunocorados para GFP e estudados por imagens. Os níveis de transdução neuronal e glial relativos foram imunocorados para GFP e estudados por imagens. Os níveis de transdução neuronal e glial relativos foram quantificados contando o número de neurônios e glia transduzidos, identificados com base na morfologia, para cada região por 50 pm de seção coronal. Os níveis de transdução de AAV1 RX são mostrados ao lado daqueles para os sorotipos parentais, AAV1 e AAVrh.10, bem como as variantes quiméricas, AAV1R6 e AAV1R7, através de várias regiões, incluindo o

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14/120 córtex motor (FIG. 13A), o córtex cerebral (FIG. 13B), o hppocampo (FIG. 13C), o giro dentado (FIG. 13D), o tálamo (FIG. 13E), o hipotálamo (FIG. 13F), o corpo estriado (FIG. 13G), e a amígdala (FIG. 13H). Barras de erro representam o desvio padrão (n = 3). Um T-teste bicaudal não pareado com correção de Welch foi usado para demonstrar a significância estatiítica de cada grupo em relação a AAV1. ns: não estatisticamente significantes; *, P < 0,05. ANOVA One-way também foi usado para demonstrar que as diferenças entre as médias são estatisticamente significantes. *, P < 0,05 para transdução neuronal e glial através de todas as regiões cerebrais aqui mostradas.

[00034] FIG. 14. Alinhamento sequencial da pegada 1RX, e da Região Variável I (VR-I) entre os sorotipos comuns do AVV. O alinhamento sequencial de AAV1RX com sorotipos comuns do AVV salienta os resíduos de aminoácidos (numeração VP1) da pegada 1RX, dentro do maior contexto da região variável I (VR-I), comparados entre sorotipos comuns naturais do AVV. As linhas pretas acima e abaixo demarcam os resíduos específicos dentro da pegada 1RX. Legenda: Resíduos que são idênticos entre os sorotipos são representados por letras vermelhas sobre um fundo amarelo; resíduos conservadores, letras azuis sobre um fundo ciano; resíduos similares, letras pretas sobre um fundo verde; resíduos fracamente similares, letras verdes sobre um fundo branco; resíduos não similares, letras pretas sobre um fundo branco. Este alinhamento de sequências foi gerado usando o software Vector NTI Advance 11.5.2.

[00035] FIG. 15. Alinhamento de sequências de proteína do capsídeo de AAV1, AAV1R7, e AAVrh.10 VP1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00036] A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na

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15/120 técnica à qual pertence a presente invenção. A terminologia usada aqui, neste pedido de patente, é para o propósito de descrever modalidades particulares somente e não se destina a ser limitantes. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui, neste pedido de patente, são incorporados por meio de referência aqui, a este pedido de patente, em sua totalidade. Definições

[00037] Os termos que se seguem são usados na descrição aqui, neste pedido de patente, e nas reivindicações anexadas:

[00038] As formas no singular “um,” “uma” e “o”, “a” se destinam a incluir também as formas no plural, a menos que o contexto claramente indique de modo diverso.

[00039] Além disso, o termo cerca de, conforme usado aqui, neste pedido de patente, quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade do comprimento de uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo, dose, tempo, temperatura, e semelhantes, se destina a englobar variações de ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5%, ou aind ±0,1% da quantidade especificada.

[00040] Também conforme usado aqui, neste pedido de patente, e/ou se refere a e engloba qualquer uma e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretado na alternativa (ou).

[00041] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, a expressão transicional consistindo essencialmente em significa que o âmbito de uma reivindicação deve ser interpretado como englobando os materiais ou etapas especificados mencionados na reivindicação, e aqueles que não afetam materialmente a uma ou mais catacterísticas básicas e novas da invenção reivindicada. Vide, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (ênfase no original); vide também MPEP § 2111.03. Portanto, o termo consistindo essen

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16/120 cialmente em quando usado em uma reivindicação aqui, neste pedido de patente, não se destina a ser interpretado como sendo equivalente a compreendendo.

[00042] A menos que o contexto indique de modo diverso, pretende-se especificamente que as várias características das proteínas do capsídeo, vetores, composições, e métodos descritos aqui, neste pedido de patente, podem ser usadas em qualquer combinação.

[00043] Além disso, a presente divulgação também contempla que em algumas modalidades, qualquer característica ou combinação de características estipuladas aqui, neste pedido de patente, pode ser excluída ou omitida.

[00044] De modo a ilustrar mais, se, por exemplo, a especificação indicar que um aminoácido em particular pode ser selecionado entre A, G, I, L e/ou V, esta expressão também indica que o aminoácido pode ser selecionado entre qualquer subgrupo destes um ou mais aminoácidos, por exemplo A, G, I ou L; A, G, I ou V; A ou G; somente L; etc. como se cada subcombinação referida fosse expressamente estipulada aqui, neste pedido de patente. Além disso, a expressão referida também indica que um ou mais dos aminoácidos especificados podem ser rejeitados. Por exemplo, em modalidades particulares o aminoácido não é A, G ou I; não é A; não é G ou V; etc. como se cada possível renúncia fosse expressamente estipulada aqui, neste pedido de patente.

[00045] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os termos “reduzir,” “reduz,” “redução” e termos similares indicam uma diminuição de no mínimo cerca de 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou mais, em relação a um controle ou referência.

[00046] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os termos “aumento,” aumenta,” “aumentar,” “reforçar,” “reforça,” “reforço” e termos similares indicam um aumento ou reforço de no mínimo cerca de

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5%, 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em relação a um controle ou referência.

[00047] O termo “parvovirus” conforme usado aqui, neste pedido de patente, engloba a família Parvoviridae, incluindo parvovirus que se replicam autonomamente e dependovírus. Os parvovirus autônomos incluem membros dos gêneros Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus, e Contravirus. Exemplos de parvovirus autônomos incluem, mas não estão limitados a, minute vírus de camundongo, parvovirus bovino, parvovirus canino, parvovirus de galinha, feline panleukopenia vírus, parvovirus felino, parvovirus de ganso, parvovirus H1, parvovirus de pato muscovy, vírus B19, e qualquer outro parvovirus autônomo atualmente conhecido ou descoberto posteriormente. Outros parvovirus autônomos são de conhecimento dos versados na técnica.Vide, por exemplo, BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).

[00048] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo “vírus adeno-associados” (AAV), inclui, mas não está limitado ao, AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluindo types 3A and 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo rh10, AAV tipo 11, AAV tipo 12, AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino, e qualquer outro AAV atualmente conhecido ou descoberto posteriormente. Vide, por exemplo, BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers). Foi identificada uma série de clades e sorotipos do AVV (vide, por exemplo, Gao et al. (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris et al. (2004) Virology 33-:375-383; e a Tabela 1).

[00049] As sequências genômicas de vários sorotipos de AAV e dos parvovirus autônomos, bem como as sequências das repetições de terminal nativas (TRs), proteínas Rep, e subunidades de capsídeos são conhecidas na técnica. As sequências referidas podem ser enconPetição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 192/335

18/120 tradas na literatura ou em bancos de dados públicos tais como o GenBank® Database. Vide, por exemplo, Números de Acesso no GenBank NC_044927, NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC_001358, NC_001540, AF513851,

AF513852, AY530579; cujas revelações são incorporadas por meio de referência aqui, a este pedido de patente, para ensinar sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de parvovirus e do AAV. Vide também, por exemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 99:11854; Moris et al. (2004) Virology 33-:375-383; as publicações de patente internacional Nos. WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; e a Patente U.S. No. 6.156.303; cujas revelações são incorporadas por meio de referência aqui, a este pedido de patente, para ensinar sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de parvovirus e do AAV. Vide também a Tabela 1.

[00050] As estruturas dos capsídeos do AAV e de parvovirus autônomos são descritas em mais detalhes em BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 and 70 (4th ed., LippincottRaven Publishers). Vide também a descrição da estrutura de cristal de AAV2 (Xie et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sei. 99:10405-10), AAV4 (Padron et al. (2005) J. Virol. 79: 5047-58), AAV5 (Walters et al. (2004) J. Virol. 78: 3361-71) and CPV (Xie et al. (1996) J. Mol. Biol. 6:497520; Tsao et al. (1991) Science 251:1456-64; Drouin et al. (2013) Future Virol. 8(12):1183-1199).

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[00051] O termo “tropismo” conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere ao ingresso preferencial do vírus dentro de determinadas células ou tecidos, opcionalmente seguido pela expressão (por exemplo, transcrição e, opcionalmente, translação) de uma ou mais sequências carregadas pelo genoma viral na célula, por exemplo, para um vírus recombinante, expressão de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos de interesse. Os versados na técnica vão reconhecer que, em algumas modalidades, a transcrição de uma sequência de ácido nucleico heteróloga a partir de um genoma viral não pode ser iniciada na ausência de fatores de trans-ação, por exemplo, para um promotor indutível ou sequência de ácido nucleico regulada de modo diverso. No caso do genoma de um AAV recombinante (rAAV), a expressão genética do genoma viral pode ser a partir de um provírus integrado de modo estávle e/ou a partir de um epissoma não integrado, bem como qualquer outra forma que o vírus possa tomar dentro da célula.

[00052] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, tropismo sistêmico e transdução sistêmicas (e termos equivalentes) indicam que o capsídeo de vírus ou vetor do vírus da divulgação apresenta tropismo para e/ou transduz, respectivamente, tecidos por todo o corpo (por exemplo, cérebro, pulmão, músculo esquelético, coração, fígado, rim e/ou pâncreas). Em modalidades, é observada transdução sistêmica do sistema nervoso central (por exemplo, cérebro, células neuronais, etc.). Em outras modalidades, é realizada transdução sistêmica de tecidos musculares cardíacos.

[00053] A menos que indicado de modo diverso, transdução eficaz ou tropismo eficaz, ou termos similares, pode ser determinada por meio de referência a um controle adequado (por exemplo, no mínimo cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500% ou mais da transdução ou do tropismo, respectivamente, do controle). Em modalidades

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20/120 particulares, o vetor do vírus transduz de maneira eficaz ou tem tropismo eficaz para células neuronais e cardiomiócitos. Controles adequados vão depender de uma variedade de fatores incluindo o perfil de tropismo desejado.

[00054] De modo similar, pode ser determinado se um vírus “não transduz de modo eficaz” ou “não tem tropismo eficaz” para um tecido alvo, ou termos similares, por meio de referência a um controle adequado. Em modalidades particulares, o vetor do vírus não transduz de modo eficaz (isto é, não tem tropismo eficaz) para o fígado, o rim, as gônadas e/ou as células germinativas. Em modalidades particulares, a transdução indesejável de um ou mais tecidos (por exemplo, o fígado) é de 20% ou menos, de 10% ou menos, de 5% ou menos, de 1% ou menos, de 0,1% ou menos em comparação com o nível de transdução do um ou mais tecidos alvo (por exemplo, células do sistema nervoso central; cardiomiócitos).

[00055] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo “polipeptídeo” engloba tanto peptídeos quanto proteínas, a menos que indicado de modo diverso.

[00056] Um “polinucleotídeo” é uma sequência de bases de nucleotídeos, e pode ser sequências de RNA, de DNA ou híbridas de DNARNA (incluindo tanto nucleotídeos que ocorrem naturalmente quanto nucleotídeos que não ocorrem naturalmente), porém em modalidades representativas são ou sequências de DNA de cadeia única ou de cadeia dupla.

[00057] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, um polinucleotídeo “isolado” (por exemplo, um “DNA isolado” ou um “RNA isolado”) significa um polinucleotídeo que é no mínimo parcialmente separado de no mínimo alguns dos outros componentes do organismo ou vírus que ocorre naturalmente, por exemplo, a célula ou componentes estruturais virais ou outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos comu

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21/120 mente encontrados associados com o polinucleotídeo. Em modalidades representativas uma molécula de ácido nucleico isolada é enriquecida por no mínimo cerca de 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou mais em comparação com o material de partida.

[00058] Do mesmo modo, um polipeptídeo “isolado” significa um polipeptídeo que é no mínimo parcialmente separado de no mínimo alguns dos outros componentes do organismo ou vírus que ocorre naturalmente, por exemplo, a célula ou componentes estruturais virais ou outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos comumente encontrados associados com o polipeptídeo. Em modalidades representativas, um polipeptídeo “isolado” é enriquecido por no mínimo cerca de 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou mais em comparação com o material de partida.

[00059] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, por “isolar” ou “purificar” (ou equivalentes gramaticais) um vetor do vírus, se indica que o vetor do vírus é no mínimo parcialmente separado de no mínimo alguns dos outros componentes no material de partida. Em modalidades representativas um vetor do vírus isolado ou purificado é enriquecido por no mínimo cerca de 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou mais em comparação com o material de partida.

[00060] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, “célula neuronal” inclui neurônios sensoriais, neurônios pseudo-unipolares, neurônios motores, neurônios multipolares, interneurônios e/ou neurônios bipolares localizados em sub-estruturas cerebrais, como o córtex, o córtex motor, o hipocampo, o hipotálamo, o corpo estriado, os gânglios basais, a amígdala, o cerebelo, os gânglios da raiz dorsal e/ou a medula espinhal.

[00061] Uma “proteína terapêutica” é uma proteína que pode aliviar, reduzir, prevenir, retardar e/ou estabilizar sintomas que resultam de uma ausência ou defeito de uma proteína em uma célula ou indivíduo

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22/120 e/ou é uma proteína que confere de modo diverso um benefício a um sujeito.

[00062] Uma “molécula de RNA terapêutico” ou “molécula de RNA funcional” conforme usado aqui, neste pedido de patente, pode ser um ácido nucleico anti-sentido, uma ribozima (por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. No. 5.877.022), um RNA que efetua trans-splicing mediada por spliceosome (vide, Puttaraju et al. (1999) Nature Biotech. 17:246; Patente U.S. No. 6.013.487; na Patente U.S. No. 6.083.702), um RNA interferente (RNAi) incluindo siRNA, shRNA ou miRNA, o qual media o silenciamento genético (vide, Sharp et al., (2000) Science 287:2431), e qualquer outro RNA não traduzido, tal como um RNA “guia” (Gorman et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 95:4929; Patente U.S. No. 5.869.248 to Yuan et al.) e semelhantes conforme são conhecidos na técnica.

[00063] Pelos termos “tratar,” “tratando” ou “tratamento de” (e variações garmaticais dos mesmos) se indica que a gravidade da condição do sujeito é reduzida, no mínimo parcialmente melhorada ou estabilizada e/ou que é obtido algum alívio, mitigação, diminuição ou estabilização em no mínimo um sintoma clínico e/ou existe um atraso na progressão da doença ou do transtorno.

[00064] Os termos prevenir, prevenindo e prevenção” (e variações garmaticais dos mesmos) se referem a prevenção e/ou atraso do início de uma doença, transtorno e/ou um ou mais sintomas clínicos em um sujeito e/ou uma redução na gravidade do início da doença, do transtorno e/ou de um ou mais sintomas clínicos em relação ao que ocorrería na ausênceia dos métodos da divulgação. A prevenção pode ser completa, por exemplo, a ausência total da doença, do transtorno e/ou de um ou mais sintomas clínicos. A prevenção também pode ser parcial, de tal modo que a ocorrência da doença, do transtorno e/ou de um ou mais sintomas clínicos no sujeito e/ou a gravidade do início seja

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23/120 menor do que ocorrería na ausência da presente divulgação.

[00065] Uma quantidade “eficaz para tratamento” conforme usado aqui, neste pedido de patente, é uma quantidade que é suficiente para proporcionar alguma melhora ou benefício para o sujeito. Dito de outro modo, uma quantidade “eficaz para tratamento” é uma quantidade que vai proporcionar algum alívio, mitigação, diminuição e/ou estabilização em no mínimo um sintoma clínico no sujeito. Os versados na técnica vão reconhecer que os efeitos terapêuticos não precisam ser completos ou curativos, contanto que seja proporcionado algum benefício para o sujeito.

[00066] Uma quantidade “eficaz para prevenção conforme usado aqui, neste pedido de patente, é uma quantidade que é suficiente para prevenir e/ou atrasar o início de uma doença, transtorno e/ou sintomas clínicos em um sujeito e/ou para reduzir e/ou retardar a gravidade do início de uma doença, transtorno e/ou sintomas em um sujeito em relação ao que ocorrería na ausência dos métodos da divulgação. Os versados na técnica vão reconhecer que o nível de prevenção não precisa ser completo, contanto que seja proporcionado algum benefício para o sujeito.

[00067] Os termos “sequência de nucleotídeos heteróloga” e “molécula de ácido nucleico heteróloga” são usados de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente, e se referem a uma molécula de ácido nucleico e/ou sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente no vírus. De modo geral, a molécula de ácido nucleico heteróloga ou sequência de nucleotídeos heteróloga compreende um frame de leitura aberta que codifica uma proteína ou um RNA não traduzido de interesse (por exemplo, para liberação para uma célula ou sujeito).

[00068] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os termos “vetor do vírus,” “vetor” ou “vetor de liberação de gene” se referem a uma partícula de vírus (por exemplo, AAV) que funciona como um veí

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24/120 culo de liberação de ácido nucleico, e a qual compreende o genoma do vetor (por exemplo, DNA viral [vDNA]) empacotado dentro de urn virion. Alternativamente, em alguns contextos, o termo “vetor” pode ser usado para se referir ao genoma do vetor / vDNA isolado.

[00069] Um “genoma do vetor de rAAV” ou “genoma de rAAV” é um genoma de AAV recombinante (isto é, vDNA) que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogos. Os vetores de rAAV geralmente necessitam somente da uma ou mais repetições de terminais (TR(s)) em cis para gerar vírus. Todas as outras sequências virais são dispensáveis e podem ser supridas em trans (Muzyczka (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). Tipicamente, o genoma do vetor rAAV somente vai conservar a uma ou mais sequências de TR de modo a maximizar o tamanho do transgene que pode ser empacotado de maneira eficaz pelo vetor. As sequências codificantes de proteínas estruturais e não estruturais podem ser proporcionadas em trans (por exemplo, a partir de um vetor, tal como um plasmídeo, e/ou integrando de maneira estável as sequências dentro da célula de empacotamento). Em modalidades, o genoma do vetor rAAV compreende no mínimo uma sequência de repetição de terminal (TR) (por exemplo, sequência AAV TR), opcionalmente duas TRs (por exemplo, duas AAV TRs), as quais tipicamente vão estar nas extremidades 5’ e 3’ do genoma do vetor e flanqueiam a sequência de ácido nucleico heteróloga, mas não precisa ser contígua a essa. As TRs podem ser as mesmas ou diferentes umas das outras.

[00070] O termo “repetição de terminal” ou TR inclui qualquer repetição de terminal viral ou seqüência sintética que forme uma estrutura de grampo de cabelo (hairpin) e funcione como uma repetição de terminal invertido (isto é, medie as funções desejadas tais como replicação, empacotamento de vírus, integração e/ou resgate de provírus, e semelhantes). A TR pode ser uma TR do AAV ou uma TR não AAV.

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Por exemplo, uma sequência de TR não AAV tais como as de outros parvovirus (por exemplo, o parvovirus canino (CPV), o parvovirus de camundongo (MVM), o parvovirus humano B-19) ou qualquer outra sequência de vírus adequada (por exemplo, a hairpin SV40 que serve como a origem de replicação SV40) pode ser usada como uma TR, a qual pode ser posteriormente modificada por truncação, substituição, deleção, inserção e/ou adição. Além disso, a TR pode ser parcialmente ou completamente sintética, tal como a “sequência de duplo D” conforme descrito na Patente US No. 5.478.745 para Samulski et al.

[00071] Uma “repetição de terminal do AAV” ou TR do AAV pode ser de qualquer AAV, incluindo mas não limitado aos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8,9,10,11,12 ou qualquer outro AAV atualmente conhecido ou descoberto posteriormente (vide, por exemplo, a Tabela 1). Uma repetição de terminal do AAV não precisa ter a sequência de repetição de terminal nativa (por exemplo, uma sequência de TR do AAV nativa pode ser alterada por inserção, deleção, substituição, truncação e/ou mutações missense), contanto que a repetição de terminal medie as funções desejadas, por exemplo, replicação, empacotamento de vírus, integração, e/ou resgate de provírus, e semelhantes.

[00072] Os vetores de vírus da divulgação podem ser adicionalmente vetores de vírus “direcionados” (por exemplo, tendo um tropismo direcionado) e/ou um parvovirus “híbrido” (isto é, no qual as TRs virais e o capsídeo viral são de diferentes parvovirus) conforme descrito na publicação de patente internacional WO 00/28004 e em Chao et al. (2000) Molecular Therapy 2:619.

[00073] Os vetores de vírus da divulgação podem ser adicionalmente partículas de parvovirus duplexadas conforme descrito na publicação de patente internacional WO 01/92551 (cuja divulgação é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade). Deste modo, em algumas modalidades, genomas de ca

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26/120 deia dupla (duplex) podem ser empacotados dentro dos capsídeos de vírus da divulgação.

[00074] Além disso, o capsídeo viral ou elementos genômicos podem conter outras modificações, incluindo inserções, deleções e/ou substituições.

[00075] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo “aminoácido” engloba qualquer aminoácido que ocorra naturalmente, formas modificadas do mesmo, e aminoácidos sintéticos.

[00076] Aminoácidos levorrotatório (L-) que ocorrem naturalmente são mostrados na Tabela 3.

[00077] Além disso, o aminoácido que não ocorre naturalmente pode ser um aminoácido não natural conforme descrito por Wang et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)). Estes aminoácidos não naturais podem ser usados vantajosamente para ligar quimicamente moléculas de interesse à proteína do capsídeo do AAV.

Proteínas do Capsídeo do AAV Modificadas e Capsídeos de Vírus e Vetores de Vírus Compreendendo as Mesmas.

[00078] A presente divulgação proporciona proteínas do capsídeo do AAV compreendendo uma mutação (isto é, uma modificação, a qual pode ser uma substituição ou uma inserção ou uma deleção) na sequência de aminoácidos e capsídeos de vírus e vetores de vírus compreendendo a proteína do capsídeo do AAV modificada. As proteínas do capsídeo do AAV mutadas, e os ácidos nucleicos codificando as mesmas, não são encontrados na natureza (isto é, são não naturais) e nem têm a sequência das sequências selvagens encontradas na natureza nem a função daquelas sequências. Ao invés disso, os inventores descobriram que modificações nas posições de aminoácidos descritas aqui, neste pedido de patente, podem conferir uma ou mais propriedades desejáveis para vetores de vírus compreendendo a proteína do capsídeo do AAV modificada incluindo sem limitação: (i) transdução

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27/120 seletiva de células neuronais depois de cruzar a barreira hematoencefálica depois de injeção sistêmica; (ii) transdução simultânea de tecido cardíaco e tecido neuronal depois de injeção sistêmica; e (iii) detargeting a partir do fígado, do baço, do rim e de outros órgãos periféricos. [00079] Em modalidades particulares, a proteína do capsídeo do AAV modificada da divulgação compreende uma ou mais mutações (isto é, modificações) na sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo do AAV1 nativo ou o um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes de uma proteína do capsídeo de outro sorotipo do AAV, incluindo mas não limitado a AAV2, AAV3, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 e AAVrh.10. As posições de aminoácidos em outros sorotipos do AVV ou capsídeos do AVV modificados que correspondem a estas posições na proteína do capsídeo do AAV1 nativo vão ser evidentes para os versados na técnica e podem ser prontamente determinadas usando técnicas de alinhamento de seqüência (vide, por exemplo, Figura 7 do documento de patente internacional No. WO 2006/066066) e/ou estrutura de cristal analysis (Padron et al. (2005) J. Virol. 79:504758).

[00080] Os versados na técnica vão reconhecer que, para algumas proteínas do capsídeo do AAV, a modificação correspondente vai ser uma inserção e/ou uma substituição, dependendo de se as posições de aminoácidos correspondentes estão parcialmente ou completamente presentes no vírus ou, alternativamente, estão completamente ausentes. Do mesmo modo, ao modificar AAV diferentes do AAV1, a uma ou mais posições de aminoácidos específicas podem ser diferentes da posição em AAV1 (usando a numeração VP1. Conforme discutido em outra parte aqui, neste pedido de patente, a uma ou mais posições de aminoácidos correspondenes vão ser prontamente evidentes para os versados na técnica usando técnicas de conhecimento geral.

[00081] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, uma “muta

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28/120 ção” ou “modificação” em uma sequência de aminoácidos inclui substituições, inserções e/ou deleções, cada uma das quais pode envolver um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais aminoácidos. Em modalidades particulares, a modificação é uma substituição. Em outras modalidades, a modificação é uma inserção (por exemplo, de um único resíduo de aminoácido entre dois resíduos de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos.)

[00082] Portanto, em uma modalidade, a presente divulgação proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, A267, e S268, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos 266 e 267 (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 1) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO:

3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO:

6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV pode compreender uma modificação no resíduo de aminoácido H272. Em modalidades particulares, a modificação é S262N, A263G, S264T, T265S, A267S, S268T, H272T, e combinações das mesmas. Em modalidades particulares, a única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos 266 e 267 é G (designada -267G).

[00083] Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV descrita acima pode adicionalmente compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma modificação nos resíduos de aminoácidos Q148, E152, S157, T162, H272, T326, D328, V330, T331, V341 e S345, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos 152 e 153 (numeração VP1), em que a numeração de cada resí

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29/120 duo é baseada na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou o resíduo de aminoácido equivalente nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em modalidades particulares, a modificação é Q148P, E152R, S157T, T162K, H272T, T326Q, D328E, V330T, T331K, V341I e S345T. Em modalidades particulares, a única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos 152 e 153 é S (designada -153S).

[00084] Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV described acima pode adicionalmente compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma modificação dos resíduos de aminoácidos L188, S205, N223, A224, e H272 (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou o resíduo de aminoácido equivalente nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em modalidades particulares, a modificação é L188I, S205A, N223S, A224S, e H272T.

[00085] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, e A267 (numeração VP1), e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269, em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 1) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a modificação é no mínimo uma de S262N, A263G, S264T, T265S, e A267S. Em algumas modalidades, o capsídeo do AVV pode adicionalmente compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma modificação no resíduo de aminoácido H272. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV pode adicionalmente compre

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30/120 ender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma modificação nos resíduos de aminoácidos Q148, E152, S157, T162, H272, T326, D328, V330, T331, V341 e S345, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos E152 e P153. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV adicionalmente compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos L188, S205, N223, A224, e H272. Em algumas modalidades, a modificação é no mínimo uma de L188I, S205A, N223S, A224S e H272T. Em algumas modalidades, a inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269 é uma inserção de um único resíduo T. Em algumas modalidades, a inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos E152 e P153 é uma inserção de um único resíduo S.

[00086] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma modificação resultando na sequência de aminoácidos: X¹-X²-X³-X⁴ (SEQ ID NO: 35) nos aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 262 a 265 (numeração VP1) da proteína do capsídeo do AAV1 nativo (SEQ ID NO: 1), em que X¹ é qualquer aminoácido diferente de S; em que X²é qualquer aminoácido diferente de A; em que X³ é qualquer aminoácido diferente de S; e em que X⁴é qualquer aminoácido diferente de T.

[00087] Em algumas modalidades, o aminoácido X¹ é N, o aminoácido X² é G, o aminoácido X³ é T, ou o aminoácido X⁴ é S. Em algumas modalidades, o aminoácido X¹ é N, o aminoácido X² é G, o aminoácido X³ é T, e o aminoácido X⁴ é S. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV adicionalmente compreende uma modificação no resíduo de aminoácido H272. Em algumas modalidades, a modificação é H272T. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV adicionalmente compreende uma inserção de resíduo de

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31/120 aminoácido entre os resíduos de aminoácidos S268 e N269. Em algumas modalidades, a inserção de resíduo de aminoácido é uma inserção de um único resíduo T.

[00088] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, A267, e H272, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269, (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 2) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a modificação compreende no mínimo uma de S262N, A263G, S264T, T265S, A267G, e H272T. Em algumas modalidades, a única inserção de resíduo de aminoácido natural entre os resíduos S268 e N269 é uma inserção de um único resíduo T.

[00089] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, Q263, S264, A266, S267, e H271, e uma inserção de no mínimo um resíduo de aminoácido entre os resíduos S261 e S262, (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO:

6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a modificação compreende no mínimo uma de S262T,

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Q263S, S264G, A266S, S267T, e H271T. Em algumas modalidades, a inserção entre os resíduos SS61 e S262 é uma inserção de um único resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a inserção entre os resíduos S251 e S252 é uma inserção de mais de um resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a inserção entre os resíduos S251 e S252 é uma inserção de um resíduo N e um G.

[00090] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma modificação nos resíduos de aminoácidos

5262, Q263, S264, A266, A267, H271, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S261 e S262, em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV3 (SEQ ID NO: 3) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a modificação compreende no mínimo uma de S262T, Q263S, S264G, A266S, A267T, H271T. Em algumas modalidades, a inserção entre os resíduos SS61 e S262 é uma inserção de um único resíduo de aminoácido, ou mais de um resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a inserção entre os resíduos S251 e S252 é uma inserção de um resíduo N e um G.

[00091] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma modificação nos resíduos de aminoácidos

5263, S269, A237 (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV9 (SEQ ID NO: 9) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO:

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1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO:

4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a modificação compreende no mínimo uma de S263G, S269T, e A273T.

[00092] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de qualquer uma de SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 34.

[00093] Exemplos não limitantes de modificações para produzir as proteínas do capsídeo desta revelação nos sorotipos do AVV 1,2, 3, 6, 7, 8, e 9, respectivamente, são mostrados na Tabela 2, em que são identificados os resíduos de aminoácidos equivalentes nos respectivos sorotipos do AVV.

[00094] Em modalidades adicionais, as proteínas do capsídeo desta revelação podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir em: a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AAV1RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (AAV2RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (AAV3RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (AAV6RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (AAV7RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (AAV8RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (AAV9RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (AAV1R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (AAV2R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (AAV3R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (AAV6R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (AAV7R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (AAV8R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (AAV9R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (AAV1R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (AAV2R7); a sequên

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34/120 cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (AAV3R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (AAV6R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (AAV7R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (AAV8R7); e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (AAV9R7). Em uma modalidade, uma proteína do capsídeo desta revelação tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AAV1RX). Em uma modalidade, uma proteína do capsídeo desta revelação tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (AAV1R6). Em uma modalidade, uma proteína do capsídeo desta revelação tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (AAV1R7).

[00095] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona proteínas do capsídeo do AAV tendo no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 99%, inclusive de todas as faixas e subfaixas entre as mesmas, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AAV1RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (AAV2RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (AAV3RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (AAV6RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (AAV7RX); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (AAV8RX); e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (AAV9RX).

[00096] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona proteínas do capsídeo do AAV tendo no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 99%, inclusive de todas as faixas e subfaixas entre as mesmas, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (AAV1R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (AAV2R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (AAV3R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (AAV6R6); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (AAV7R6); a sequência de aminoácidos

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35/120 de SEQ ID NO: 21 (AAV8R6); e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (AAV9R6).

[00097] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona proteína do capsídeo do AAV tendo no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 99%, inclusive de todas as faixas e subfaixas entre as mesmas, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (AAV1R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (AAV2R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (AAV3R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (AAV6R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (AAV7R7); a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (AAV8R7); e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (AAV9R7).

[00098] A presente divulgação também proporciona uma proteína do capsídeo dos vírus adeno-associados (AAV), em que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma ou mais substituições em todas as posições ou em qualquer combinação de menos do que todas as posições, resultando na sequência de aminoácidos: X¹-X²-X³-X⁴ (SEQ ID NO: 35). Em algumas modalidades, a modificação da sequência de aminoácidos: X¹-X²-X³-X⁴é nos aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 262 a 265 (numeração VP1) da proteína do capsídeo do AAV1 nativo (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, X¹pode ser qualquer aminoácido diferente de S. Em algumas modalidades, X² pode ser qualquer aminoácido diferente de A. Em algumas modalidades, X³ pode ser qualquer aminoácido diferente de S. Em algumas modalidades, X⁴ pode ser qualquer aminoácido diferente de T. Em uma modalidade, o aminoácido X¹ é N. Em uma modalidade, o aminoácido X² é G. Em uma modalidade, o aminoácido X³ é T. Em uma modalidade, o aminoácido X⁴ é S. Em outra modalidade, X¹ é N, X² é G, X³ é T, e X⁴ é S. Em algumas modalidades, um de X¹ a X⁴ não

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36/120 é substituído, e o resíduo de aminoácido na posição não substituída é o resíduo de aminoácido selvagem.

[00099] Exemplos de resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos pelo aminoácido nativo nas posições respectivas descritas aqui, neste pedido de patente, são estipulados na Tabela 3.

[000100] Deve ser entendido que as substituições e inserções descritas nas proteínas do capsídeo do AAV desta revelação podem incluir substituições e/ou inserções com resíduos de aminoácidos conservadores. As substituições conservadoras referidas são de conhecimento geral na técnica e incluem, por exemplo, os aminoácidos não polares Gly, Ala, Vai, Leu, lie, Met, Phe, Trp e Pro podem ser substituídos uns pelos outros; os aminoácidos polares Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn e Gin podem ser substituídos uns pelos outros; os aminoácidos carregados negativamente Asp e Glu podem ser substituídos um pelo outro; e os aminoácidos carregados positivamente Lys, Arg e His podem ser substituídos uns pelos outros, em qualquer combinação.

[000101] A presente divulgação também proporciona um capsídeo do AVV compreendendo uma proteína do capsídeo desta revelação bem como um vetor do vírus compreendendo um capsídeo do AVV desta revelação. Em algumas modalidades, o vetor do vírus pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em um vetor do vírus compreendendo: um capsídeo do AVV desta revelação; e uma molécula de ácido nucleico compreendendo no mínimo uma sequência de repetição do terminal, em que o ácido nucleico é encapsidado pelo capsídeo do AVV. Em algumas modalidades, a repetição do terminal é uma repetição do terminal do AAV. Em algumas modalidades, a repetição do terminal é uma repetição do terminal não do AAV.

[000102] Também é proporcionada aqui, neste pedido de patente, uma composição compreendendo a proteína do capsídeo e/ou vetor do vírus desta revelação em um veículo farmaceuticamente aceitável.

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[000103] Vários métodos também são proporcionados na presente invenção, incluindo um método de introdução de uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula, compreendendo contactar a célula com o vetor do vírus e/ou composição desta revelação, por exemplo, sob condições por meio das quais o vetor do vírus é levado para dentro da célula ou internalizado pela célula e uma molécula de ácido nucleico introduzida por meio do vetor do vírus é expressa na célula.

[000104] Também é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um método de liberação de uma molécula de ácido nucleico a um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito o vetor do vírus e/ou a composição desta revelação. Em modalidades particulares, o vetor do vírus e/ou composição são administrados ao sistema nervoso central do sujeito. Em modalidades particulares, o vetor do vírus e/ou composição é liberado através da barreira hematoencefálica.

[000105] Em algumas modalidades, o vetor do vírus desta revelação pode compreender uma molécula de ácido nucleico de interesse. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico de interesse pode codificar uma molécula de RNA terapêutico ou uma proteína terapêutica.

[000106] A presente divulgação também proporciona um método de liberar seletivamente uma molécula de ácido nucleico de interesse a uma célula neuronal, compreendendo contactar a célula neuronal com o vetor do vírus desta revelação, em que o vetor do vírus compreende a molécula de ácido nucleico de interesse. Em modalidades adicionais, o método pode compreender adicionalmente liberar seletivamente uma molécula de ácido nucleico de interesse para um cardiomiócito, por exemplo, quando o método é realizado em um sujeito (por exemplo, um sujeito humano). Em algumas modalidades, a composição é liberada seletivamente para uma célula neuronal. Em algumas modalidades, a composição é liberada seletivamente para um cardiomiócito.

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[000107] Em modalidades adicionais, a presente divulgação proporciona um método de tratamento de um transtorno ou defeito neurológico em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito o vetor do vírus desta revelação, em que o vetor do vírus compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico eficaz no tratamento do transtorno ou defeito neurológico.

[000108] Adicionalmente é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um método de tratamento de um transtorno ou defeito neurológico e cardiovascular em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito o vetor do vírus desta revelação, em que o vetor do vírus compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico eficaz no tratamento do transtorno ou defeito neurológico e cardiovascular.

[000109] Nos métodos descritos aqui, neste pedido de patente, o vetor do vírus e/ou composição desta revelação podem ser administrados / liberados para um sujeito desta revelação através de uma via sistêmica (por exemplo, por via intravenosa, por via intra-arterial, por via intraperitoneal, etc.). Em algumas modalidades, o vetor do vírus e/ou composição podem ser administrados para o sujeito através de uma via intracerebroventrical, intracisternal, intraparenquimal, intracranial e/ou intratecal.

[000110] Em algumas modalidades, a administração sistêmica do vetor do vírus e/ou composição ao sujeito resulta em menor transdução em tecidos fora do alvo (por exemplo, difefentes do sistema nervoso central). Em algumas modalidades desta revelação, o vetor do vírus é detargeted do baço, do fígado, e/ou do rim. Em algumas modalidades, o vetor do vírus é detargeted a partir dos esplenócitos, dos hepatócitos e/ou células renais. Em algumas modalidades, o vetor do vírus transduz o fígado, o baço, e/ou o rim em um nível que é reduzido por no

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39/120 mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% comparado a transdução por AAVrh.10, em que a transdução viral é opcionalmente determinada por expressão de luciferase ou de GFP. De modo preferencial, o vetor do vírus transduz o fígado, o baço, e/ou o rim em um nível que é reduzido por no mínimo 50% a 100%, ou 80 a 90% comparado a transdução por AAVrh.10, em que a transdução viral é opcionalmente determinada por expressão de luciferase ou de GFP.

[000111] Em algumas modalidades, o vetor do vírus transduz o cérebro em um nível que é aumentado por no mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% comparado com transdução por AAV1, em que a transdução viral é opcionalmente determinada por expressão de luciferase ou de GFP. De modo preferencial, o vetor do vírus transduz o cérebro em um nível que é aumentado por no mínimo 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes, 5,5 vezes, 6 vezes, 6,5 vezes, 7 vezes, 7,5 vezes, 8 vezes, 8,5 vezes, 9 vezes, 9,5 vezes, or 10 vezes comparado com transdução por AAV1, em que a transdução viral é opcionalmente determinada por expressão de luciferase ou de GFP. Em algumas modalidades, o vetor do vírus seletivamente transduz neurônios.

[000112] A presente invenção contempla que as proteínas do capsídeo modificadas da divulgação podem ser produzidas modificando a proteína do capsídeo de qualquer AAV atualmente conhecido ou descoberto posteriormente. Além disso, a proteína do capsídeo do AAV que deve ser modificada pode ser uma proteína do capsídeo do AAV que ocorre naturalmente (por exemplo, um AAV2, AAV3a or 3b, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.10 ou qualquer um dos sorotipos do AVV mostrados na Tabela 1), mas não é limitado a estes. Os versados na técnica vão entender que uma variedade de manipulações para as

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40/120 proteínas do capsídeo do AAV são conhecidas na técnica e a presente invenção não é limitada a modificações de proteínas do capsídeo do AAV que ocorrem naturalmente. Por exemplo, a proteína do capsídeo a ser modificada já pode ter modificações em comparação com AAV que ocorre naturalmente (por exemplo, é derivada a partir de uma proteína do capsídeo do AAV que ocorre naturalmente, por exemplo, AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e/ou AAV12 ou qualquer outro AAV atualmente conhecido ou descoberto posteriormente). As proteínas do capsídeo do AAV referidas também estão dentro do âmbito da presente divulgação.

[000113] Portanto, em modalidades particulares, a proteína do capsídeo do AAV a ser modificada pode ser derivada a partir de um AAV que ocorre naturalmente mas pode compreender adicionalmente uma ou mais sequências estranhas (por exemplo, que são exógenas para o vírus nativo) que são inseridas e/ou substituídas dentro da proteína do capsídeo e/ou que tenham sido alteradas por deleção de um ou mais aminoácidos.

[000114] Por conseguinte, ao referir aqui, neste pedido de patente, a uma proteína do capsídeo do AAV específica (por exemplo, uma proteína do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou AAV12 ou uma proteína do capsídeo de qualquer um dos sorotipos do AVV mostrados na Tabela 1, etc.), se destina a englobar a proteína do capsídeo nativa bem como proteínas do capsídeo que tenham alterações diferentes das modificações da divulgação. As alterações referidas incluem substituições, inserções e/ou deleções. Em modalidades particulares, a proteína do capsídeo pode compreender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, menos de 20, menos de 30, menos de 40 menos de 50, menos de 60, ou menos de 70 aminoácidos inseridos na mesma (diferentes das inserções da presente divulgação) em comparação com a sePetição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 215/335

41/120 quência de proteína do capsídeo do AAV nativa. Em modalidades da divulgação, a proteína do capsídeo pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, menos de 20, menos de 30, menos de 40 menos de 50, menos de 60, ou menos de 70 substituições de aminoácidos (diferentes das substituições de aminoácidos de acordo com a presente invenção) em comparação com a sequência de proteína do capsídeo do AAV nativa. Em modalidades, a proteína do capsídeo pode compreender uma deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, menos de 20, menos de 30, menos de 40 menos de 50, menos de 60, ou menos de 70 aminoácidos (diferente das deleções de aminoácidos da divulgação) em comparação com a sequência de proteína do capsídeo do AAV nativa.

[000115] Em modalidades particulares, a proteína do capsídeo do AAV tem a sequência de proteína do capsídeo do AAV nativa ou tem uma sequência de aminoácidos que é no mínimo cerca de 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% similar ou idêntica a uma sequência de proteína do capsídeo do AAV nativa. Por exemplo, em modalidades particulares, uma proteína do capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, etc. engloba a sequência de proteína do capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 nativa bem como sequências que são no mínimo cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% similares ou idênticas à sequência de proteína do capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 nativa.

[000116] Métodos de determinação de similaridade ou identidade de sequências entre duas ou mais sequências de aminoácidos são conhecidos na técnica. A similaridade ou identidade de sequências pode ser determinada usando técnicas de rotina conhecidas na técnica, in

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42/120 cluindo, mas não limitadas a, o algoritmo de identidade de sequência local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981), pelo algoritmo de de alinhamento de identidade de sequência de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48,443 (1970), pelo método de estudo para similaridade de Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wl), o programa de sequência Best Fit descrito por Devereux et al. Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984), ou por inspeção.

[000117] Outro algoritmo adequado é o algoritmo BLAST, descrito em Altschul et al. J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) e Karlin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2, o qual foi obtido de Altschul et al. Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html. WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de pesquisa, os quais são opcionalmente determinados para os valores default.

[000118] Além disso, um algoritmo útil adicional é BLAST com intervalo (gapped) conforme reportado por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.

[000119] Os capsídeos de vírus modificados podem ser usados como “veículos de capsídeos,” conforme foram descritos, por exemplo, na Patente US No. 5.863.541. Moléculas que podem ser empacotadas pelo capsídeo de vírus modificado e transferidas para dentro de uma célula incluem DNA heterólogo, RNA, polipeptídeos, moléculas orgânicas pequenas, metais, ou combinações dos mesmos.

[000120] Moléculas heterólogas são definidas como as que não são encontradas naturalmente em uma infecção pelo AAV, por exemplo, as não codificadas por um genoma do AAV selvagem. Além disso, molé

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43/120 cuias terapeuticamente úteis podem ser associadas com o exterior do capsídeo de vírus quimérico para transferência das moléculas pêra dentro de células alvo hospedeiras. As moléculas associadas referidas podem incluir DNA, RNA, moléculas orgânicas pequenas, metais, carboidratos, lipídeos e/ou polipeptídeos. Em uma modalidade da divulgação, uma molécula terapeuticamente útil é ligada de modo covalente (isto é, conjugada ou acoplada quimicamente) às proteínas do capsídeo. Métodos de ligação de modo covalente das moléculas são conhecidos pelos versados na técnica.

[000121] Os capsídeos de vírus modificados da divulgação também encontram uso como modelos para modificação adicional de antigenicidade para evitar anticorpos neutralizantes em qualquer soro de mamífero, conforme descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Serial Internacional PCT No. PCT/2016/054143.

[000122] Os capsídeos de vírus modificados da divulgação também encontram uso em criação de anticorpos contra as novas estruturas dos capsídeos. Como uma alternativa adicional, uma sequência de aminoácidos exógena pode ser inserida dentro do capsídeo de vírus modificado para apresentação de antígeno a uma célula, por exemplo, para administração a um sujeito para produzir uma resposta imune à sequência de aminoácidos exógena.

[000123] Em outras modalidades, os capsídeos de vírus podem ser administrados para bloquear alguns sítios celulares antes de e/ou concomitantemente com (por exemplo, dentro de minutos ou horas um do outro) administração de um vetor do vírus liberando uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo, peptídeo e/ou RNA funcional de interesse. Por exemplo, os capsídeos da invenção podem ser liberados para bloquear receptores celulares sobre células particulares e um vetor de liberação pode ser administrado em seguida ou concomitantemente, o qual pode reduzir a transdução das células bloquea

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44/120 das, e reforçar a transdução de outros alvos.

[000124] De acordo com modalidades representativas, capsídeos de vírus modificados podem ser administrados a um sujeito antes de e/ou concomitantemente com um vetor do vírus modificado de acordo com a presente divulgação. Além disso, a presente invenção proporciona composições e formulações farmacêuticas compreendendo os capsídeos de vírus modificados da invenção; opcionalmente, a composição também compreende um vetor do vírus modificado da divulgação.

[000125] A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleicos (opcionalmente, moléculas de ácido nucleico isoladas) codifiocado os capsídeos de vírus modificados e proteínas do capsídeo da divulgação. São adicionalmente proporcionados vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico e células (in vivo ou em cultura) compreendendo as moléculas de ácido nucleico e/ou vetores da divulgação. Vetores adequados incluem sem limitação vetores virais (por exemplo, adenovirus, AAV, herpes vírus, alfavírus, vaccinia, poxvirus, baculovírus, e semelhantes), plasmídeos, fago, YACs, BACs, e semelhantes. As moléculas de ácido nucleico, os vetores e as células referidos podem ser usados, por exemplo, como reagentes (por exemplo, constructos de auxiliar de empacotamento ou células de empacotamento) para a produção de capsídeos de vírus modificados ou vetores de vírus conforme descrito aqui, neste pedido de patente.

[000126] Capsídeos de vírus de acordo com a presente invenção podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por expressão de um baculovírus (Brown et al. (1994) Virology 198:477-488).

[000127] As modificações para a proteína do capsídeo do AAV de acordo com a presente divulgação são modificações seletivas. Esta abordagem está em contraste com trabalho prévio com subunidade inteira ou permutas de grande domínio entre sorotipos do AVV (vide, por

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45/120 exemplo, publicação de patente internacional No. WO 00/28004; Hauck et al. (2003) J. Virology 77:2768-2774; Shen et al. (2007) Mol Ther. 15(11):1955-62: e Mays et al. (2013) J Virol. 87(17):9473-85). As proteínas do capsídeo do AAV desta revelação são, para o conhecimento dos inventores, os primeiros exemplos de modificações de aminoácidos específicas para permitir cruzar a barreira hematoencefálica. [000128] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo do AAV contém modificações de aminoácidos específicas que permitem cruzar a barreira hematoencefálica. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV compreende substituições de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos, em que os aminoácidos substituídos são derivados de AAVrh.10, em que as substituições de aminoácidos permitem cruzar a barreira hematoencefálica. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV é derivada de uma proteína do capsídeo do AAV1, e compreende substituições de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos, em que os aminoácidos substituídos são derivados de AAVrh.10, em que as substituições de aminoácidos permitem cruzar a barreira hematoencefálica. Em algumas modalidades, os aminoácidos específicos que permitem cruzar a barreira hematoencefálica são 262N, 263G, 264T, 265S, 267G, 268S, 269T e 273T (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 30.

[000129] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo do AAV contém modificações de aminoácidos específicas que permitem detargeting a partir do fígado, do rim, e/ou do baço. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV compreende substituições de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos, em que os aminoácidos substituídos são derivados de AAVrh.10, em que as substituições de aminoácidos permitem detargeting a partir

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46/120 do fígado, do rim, e/ou do baço. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo do AAV é derivada de uma proteína do capsídeo do AAV1, e compreende 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos, em que os aminoácidos substituídos são derivados de AAVrh.10, em que as substituições de aminoácidos permitem detargeting a partir do fígado, do rim, e/ou do baço.

[000130] Em algumas modalidades, os aminoácidos substituídos estão localizados na região VR-I do capsídeo. Em algumas modalidades, os aminoácidos substituídos estão localizados sobre a superfície do capsídeo. Em algumas modalidades, os aminoácidos substituídos estão localizados na base das protrusões em um eixo triplo de simetria do capsídeo. Em algumas modalidades, os aminoácidos substituídos estão localizados na depressão em um eixo duplo de simetria do capsídeo. Em algumas modalidades, os aminoácidos substituídos estão localizados dentro da região VR-II da proteína do capsídeo, dentro do loop DE. Em algumas modalidades, os aminoácidos substituídos estão localizados dentro da cadeia beta E do capsídeo.

[000131] Em modalidades particulares, uma modificação “seletiva” resulta na inserção e/ou substituição e/ou deleção de menos de cerca de 20, 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 aminoácidos contíguos.

[000132] As proteínas do capsídeo modificadas e capsídeos da divulgação podem compreender adicionalmente qualquer outra modificação, atualmente conhecida ou identificada posteriormente.

[000133] Por exemplo, as proteínas do capsídeo do AAV e capsídeos de vírus da divulgação podem ser quiméricos pelo fato de que podem compreender toda ou uma porção de uma subunidade de capsídeo de outro vírus, opcionalmente outro parvovirus ou outro sorotipo do AAV, por exemplo, conforme descrito na publicação de patente internacional No. WO 00/28004.

[000134] O capsídeo de vírus pode compreender uma sequência de

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47/120 direcionamento (por exemplo, substituída e/ou inserida no capsídeo viral) que direciona o capsídeo de vírus para interagire com moléculas da superfície celular presentes sobre um ou mais tecidos alvo desejados (vide, por exemplo, a Publicação de patente internacional WO 00/28004 e Hauck et al. (2003) J. Virology 77:2768-2774); Shi et al. Human Gene Therapy 17:353-361 (2006) [descrevendo a inserção do motivo RGD de ligação ao receptor de integrina nas posições 520 e/ou 584 da subunidade do capsídeo do AVV]; Patente US No. 7.314.912 [descrevendo a inserção do peptídeo P1 contendo um motivo RGD depois das posições de aminoácidos 447, 534, 573 e 587 da subunidade do capsídeo AAV2] e a Publicação de patente internacional No. WO 2015038958 [descrevendo a recuperação seletiva de vetores do AAV contendo sequências de peptídeos apresentando aumento da transdução do sistema nervoso central]). Outras posições dentro da subunidade do capsídeo do AVV que toleram inserções são conhecidas na técnica (por exemplo, as posições 449 e 588 descritas por Grifman et al. Molecular Therapy 3:964-975 (2001)).

[000135] Por exemplo, alguns dos capsídeos de vírus da divulgação têm tropismo relativamente ineficaz em direção aos principais tecidos alvo de interesse (por exemplo, fígado, músculo esquelético, coração, músculo diafragma, rim, cérebro, estômago, intestinos, pele, células endoteliais, e/ou pulmões). Uma sequência de direcionamento vantajosamente pode ser incorporada dentro destes vetores de baixa transdução para deste modo conferir ao capsídeo de vírus um tropismo desejado e, opcionalmente, tropismo seletivo para um ou mais tecidos particulares. Proteínas do capsídeo do AAV, capsídeos e vetores compreendendo sequências de direcionamento são descritos, por exemplo na publicação de patente internacional WO 00/28004. Como outra possibilidade, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmenet conforme descrito por Wang et al. (Annu Rev Biophys Biomol Struct.

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35:225-49 (2006)) podem ser incorporados dentro da subunidade do capsídeo do AVV em um sítio ortogonal como um meio de redirecionamento de um vetor de baixa transdução para um ou mais tecidos alvo desejados. Estes aminoácidos não naturais podem ser usados vantajosamente para encadear quimicamente moléculas de interesse à proteína do capsídeo do AAV incluindo sem limitação: glicanos (manose - direcionamento de células dendríticas); RGD, bombesina ou um neuropeptídeo para liberação direcionada para tipos específicos de células cancerígenas; aptâmeros de RNA ou peptídeos selecionados entre display de fago direcionado para receptores da superfície celular específicos tais como receptores de fatores de crescimento, integrinas, e semelhantes. Métodos de modificar quimicamente aminoácidos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Greg T. Hermanson, Bioconjuqate Techniques, 1^st edition, Academic Press, 1996).

[000136] Em modalidades representativas, a sequência de direcionamento pode ser uma sequência de capsídeo de vírus (por exemplo, sequência de capsídeos de parvovirus autônomos, sequência de capsídeos do AVV, ou qualquer outra sequência de capsídeos virais) que direciona infecção para um ou mais tipos celulares particulares.

[000137] Como outro exemplo não limitante, um domínio de ligação de heparina (por exemplo, o domínio de ligação de heparina do vírus sincicial respiratório) pode ser inserido ou substituído dentro de uma subunidade do capsídeo que não se ligue tipicamente a receptores de sulfato de heparano (HS) (por exemplo, AAV 4, AAV5) de modo a conferir ligação à heparina para o mutante resultante.

[000138] Como outro exemplo não limitante, pegadas de aminoácidos que podem permitir a ligação a glicanos tais como galactose, ácido siálico, manose, lactose, sulfo-N-lactosamina, galactosamina, glicose, glucosamina, frutose, fucose, gangliosídeos, quitotriose, sulfato de condroitina, sulfato de queratina, sulfato de dermatano podem ser en

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49/120 xertadas sobre uma subunidade do capsídeo que não se ligue tipicamente a um ou mais dos açúcares listados acima [por exemplo, a Publicação de Patente US No. US20160017005, intitulada Methods and compositions for dual glycan binding AAV vectors].

[000139] B19 infecta células progenitoras eritróides primárias usando globosídeo como seu receptor (Brown et al. (1993) Science 262:114). A estrutura de B19 foi determinada até uma resolução de 8 Á (Agbandje-McKenna et al. (1994) Virology 203:106). A região do capsídeo B19 que se liga a globosídeo foi mapeada entre os aminoácidos 399 a 406 (Chapman et al. (1993) Virology 194:419), uma região em loop entre as estruturas de β-barrei E e F (Chipman et al. (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502). Por conseguinte, o domínio de ligação ao receptor de globosídeo do capsídeo B19 pode ser substituído dentro da proteína do capsídeo do AAV para direcionar um capsídeo de vírus ou vetor do vírus compreendendo o mesmo para células eritróides.

[000140] Em modalidades representativas, a sequência de direcionamento exógena pode ser qualquer sequência de aminoácidos codificando um peptídeo que altere o tropismo de um capsídeo de vírus ou vetor do vírus compreendendo a proteína do capsídeo do AAV modificada. Em modalidades particulares, o peptídeo ou a proteína de direcionamento pode ser que ocorre naturalmente ou, alternativamente, completamente ou parcialmente sintético. Exemplos de sequências de direcionamento incluem ligantes e outros peptídeos que se ligam a receptores da superfície celular e glicoproteínas, tais como sequências de peptídeo RGD, bradicinina, hormônios, fatores de crescimento peptídicos (por exemplo, fator de crescimento epidermal, fator de crescimento nervoso, fator de crescimentode fibroblastos, fator de crescimento derivado de plaquetas, fatores de crescimento semelhantes a insulina I e II, etc.), citocinas, hormônio estimulante de melanócitos (por exemplo, α, β ou γ), neuropeptídeos e endorfinas, e semelhantes,

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50/120 e fragmentos dos mesmos que conservam a capacidade para direcionar as células para seus receptores cognates. Outros peptídeos e proteínas ilustrativos incluem substância P, fator de crescimento de queratinócitos, neuropeptídeo Y, peptídeo de liberação de gastrina, interleucina 2, lisozima da clara de ovo de galinha, eritropoietina, gonadoliberina, corticostatina, β-endorfina, leu-encefalina, rimorfina, a-neoencefalina, angiotensina, pneumadina, peptídeo intestinal vasoativo, neurotensina, motilina, e fragmentos dos mesmos conforme descrito acima. Como ainda uma alternativa adicional, o domínio de ligação de uma toxina (por exemplo, toxina tetânica ou toxinas de cobra, tais como α-bungarotoxina, e semelhantes) pode ser substituído dentro da proteína do capsídeo como uma sequência de direcionamento. Em ainda uma modalidade representativa adicional, a proteína do capsídeo do AAV pode ser modificada por substituição de um peptídeo de sinalização de importação / exportação “não clássico” (por exemplo, fator de crescimento de fibroblastos 1 e 2, interleucina 1, proteína Tat do HIV-1, proteína VP22 do herpes vírus, e semelhantes) conforme descrito por Cleves (Current Biology 7:R318 (1997)) dentro da proteína do capsídeo do AAV. Também são englobados motivos peptídicos que direcionam a captação por células específicas, por exemplo, um motivo peptídico FVFLP aciona a captação por células do fígado.

[000141] Técnicas de display de fago, bem como outras técnicas conhecidas na técnica, podem ser usadas para identificar peptídeos que reconhecem qualquer tipo celular de interesse.

[000142] A sequência de direcionamento pode codificar qualquer peptídeo que que direciona para um sítio de ligação à superfície celular, incluindo receptores (por exemplo, proteína, carboidrato, glicoproteína ou proteoglicano). Exemplos de sítios de ligação à superfície celular incluem, mas não estão limitados a, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, e outros glicosaminoglicanos, porções de ácido siálico,

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51/120 porções de ácido polisiálico, glicoproteínas, e gangliosídeos, glicoproteínas MHC I, componentes de carboidratos encontrados sobre glicoproteínas da membrana, incluindo, manose, N-acetil-galactosamina, Nacetil-glucosamina, fucose, galactose, e semelhantes.

[000143] Como ainda uma alternativa adicional, a sequência de direcionamento pode ser um peptídeo que pode ser usado para ligação química (por exemplo, pode compreender resíduos de arginina e/ou lisina que podem ser quimicamente ligados através de seus grupos R) a outra molécula que direciona a entrada dentro de uma célula.

[000144] As modificações descritas acima podem ser incorporadas dentro das proteínas do capsídeo ou capsídeos da divulgação em combinação umas com as outras e/ou com qualquer outra modificação atualmente conhecida ou descoberta posteriormente.

[000145] A divulgtação também engloba vetores de vírus compreendendo as proteínas do capsídeo modificadas e capsídeos da divulgação. Em modalidades particulares, o vetor do vírus é um vetor de parvovirus (por exemplo, compreendendo um capsídeo de parvovirus e/ou genoma do vetor), por exemplo, um vetor do AAV (por exemplo, compreendendo um capsídeo do AVV e/ou genoma do vetor). Em modalidades representativas, o vetor do vírus compreende um capsídeo do AVV modificado compreendendo uma subunidade de capsídeo modificado da divulgação e um genoma do vetor.

[000146] Por exemplo, em modalidades representativas, o vetor do vírus compreende: (a) um capsídeo de vírus modificado (por exemplo, um capsídeo do AVV modificado) compreendendo uma proteína do capsídeo modificada da divulgação; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de repetição de terminal (por exemplo, uma TR do AAV), em que o ácido nucleico compreendendo a sequência de repetição do terminal é encapsidada pelo capsídeo de vírus modificado. O ácido nucleico opcionalmente pode compreender duas repeti

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52/120 ções de terminal (por exemplo, duas TRs do AAV).

[000147] Em modalidades representativas, o vetor do vírus é um vetor do vírus recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico heteróloga codificando uma proteína ou RNA funcional de interesse. Vetores de vírus recombinantes são descritos em mais detalhes abaixo.

[000148] Será entendido pelos versados na técnica que as proteínas do capsídeo modificadas, capsídeos de vírus e vetores de vírus da divulgação excluem as proteínas do capsídeo, capsídeos e vetores de vírus que têm os aminoácidos indicados nas posições especificadas em seu estado nativo (isto é, não são mutantes).

Métodos de Produção de Vetores de Vírus

[000149] A presente divulgação adicionalmente proporciona métodos de produção dos vetores de vírus da invenção. Em uma modalidade representativa, a presente divulgação proporciona um método de produção de um vetor do vírus, o método compreendendo proporcionar para uma célula: (a) um modelo de ácido nucleico compreendendo no mínimo uma sequência de TR (por exemplo, uma sequência de TR do AAV), e (b) sequências de AAV suficientes para replicação do modelo de ácido nucleico e encapsidação dentro de capsídeos do AVV (por exemplo, sequências rep do AAV e sequências cap do AAV codificando os capsídeos do AVV da presente invenção). Opcionalmente, o modelo de ácido nucleico adicionalmente compreende no mínimo uma sequência de ácido nucleico heteróloga. Em modalidades particulares, o modelo de ácido nucleico compreende duas sequências de ITR do AAV, as quais estão localizadas 5’ e 3’ para a sequência de ácido nucleico heteróloga (caso presente), embora não precisem estar diretamente contíguas a essa.

[000150] O modelo de ácido nucleico e as sequências rep e cap do AAV são proporcionados sob condições tais que o vetor do vírus com

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53/120 preendendo o modelo de ácido nucleico empacotado dentro do capsídeo do AVV é produzido na célula. O método pode compreender adicionalmente a etapa de coletar o vetor do vírus da célula. O vetor do vírus pode ser coletado do meio e/ou por lise das células.

[000151] A célula pode ser uma célula que seja permissiva para replicação do AAV viral. Pode ser empregada qualquer célula adequada conhecida na técnica. Em modalidades particulares, a célula é uma célula de mamífero. Como outra opção, a célula pode ser uma linhagem celular de empacotamento trans-complementar que proporcione funções deletadas de um vírus auxiliar defeituoso para replicação, por exemplo, células 293 ou outras células E1a trans-complementares.

[000152] As sequências do AAV de replicação e de capsídeo podem ser proprcionadas por qualquer método conhecido na técnica. Os protocolos correntes tipicamente expressam os genes do AAV rep/cap sobre um único plasmídeo. As sequências do AAV de replicação e de empacotamento não precisam ser proporcionadas juntas, embora possa ser conveniente fazer isso. As sequências do AAV rep e/ou cap podem ser proporcionadas por qualquer vetor viral ou não viral. Por exemplo, as sequências rep/cap podem ser proporcionadas por um vetor híbrido de adenovirus ou de herpesvirus (por exemplo, inserido dentro das regiões E1a ou E3 de um vetor de adenovirus deletado). Vetores do EBV também podem ser empregados para expressar os genes cap e rep do AAV. Uma vantagem deste método é que os vetores do EBV são epissômicos, e vão manter um alto número de cópias através de divisões celulares sucessivas (isto é, são integrados de modo estável dentro da célula como elementos extracromossômicos, designados como um “epissoma nuclear à base de EBV,” vide Margolski (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67).

[000153] Como uma alternativa adicional, as sequências rep/cap podem ser incorporadas de modo estável dentro de uma célula.

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[000154] Tipicamente as sequências rep/cap do AAV não vão ser flanqueadas pelas TRs, para prevenir resgate e/ou empacotamento destas sequências.

[000155] O modelo de ácido nucleico pode ser proporcionado para a célula usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, o modelo pode ser suprido por um vetor não viral (por exemplo, plasmídeo) ou viral. Em modalidades particulares, o modelo de ácido nucleico é suprido por um vetor de herpesvirus ou de adenovirus (por exemplo, inserido dentro das regiões E1a ou E3 de um adenovirus deletado). Como outra ilustração, Palombo et al. (1998) J. Virology 72:5025, descrevem um vetor de baculovírus carregando um gene reporter flanqueado pelas TRs do AAV. Vetores do EBV também podem ser empregados para liberar o modelo, conforme descrito acima com respeito aos genes rep/cap.

[000156] Em outra modalidade representativa, o modelo de ácido nucleico é proporcionado por um vírus rAAV replicante. Em ainda outras modalidades, um provírus AAV compreendendo o modelo de ácido nucleico é integrado de modo estável dentro do cromossoma da célula.

[000157] Para aumentar os títulos de vírus, funções de vírus auxiliar (por exemplo, adenovirus ou herpesvirus) que promovem uma infeção produtiva do AAV podem ser proporcionadas para a célula. Sequências de vírus auxiliar necessárias para replicação do AAV são conhecidas na técnica. Tipicamente, estas sequências vão ser proporcionadas por um vetor de adenovirus ou de herpesvirus auxiliar. Alternativamente, as sequências de adenovirus ou herpesvirus podem ser proporcionadas por outro vetor não viral ou viral, por exemplo, como um miniplasmídeo de adenovirus não infeccioso que carregue todos os genes auxiliares que promovem produção do AAV eficaz conforme descrito por Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295, e nas Patentes U.S. Nos.

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6.040.183 e 6.093.570.

[000158] Além disso, as funções de vírus auxiliares podem ser proporcionadas por uma célula de empacotamento com as sequências auxiliares embutidas no cromossoma ou mantidas como um elemento extracromossômico estável. Geralmente, as sequências de vírus auxiliares não podem ser empacotadas em viriões de AAV, por exemplo, não são flanqueadas por TRs.

[000159] Os versados na técnica vão reconhecer que pode ser vantajoso proporcionar as sequências de replicação e de capsídeo do AAV e as sequências de vírus auxiliar (por exemplo, sequências de adenovirus) sobre um único constructo auxiliar. Este constructo auxiliar pode serum constructo não viral ou viral. Como uma ilustração não limitante, o constructo auxiliar pode ser um adenovirus híbrido ou um herpesvirus híbrido compreendendo os genes do AAV rep/cap.

[000160] Em uma modalidade particular, as sequências rep/cap do AAV e as sequências de auxiliar de adenovirus são supridas por um único vetor de auxiliar de adenovirus. Este vetor adicionalmente pode compreender adicionalmente o modelo de ácido nucleico. As sequências rep/cap do AAV e/ou o modelo de rAAV podem ser inseridas dentro de uma região deletada (por exemplo, as regiões E1a ou E3) do adenovirus.

[000161] Em uma modalidade adicional, as sequências rep/cap do AAV e as sequências de auxiliar do adenovirus são supridas poir um único vetor auxiliar de adenovirus. De acordo com esta modalidade, o modelo de rAAV pode ser propocionado como um modelo de plasmídeo.

[000162] Em outra modalidade ilustrativa, as sequências rep/cap do AAV e as sequências de auxiliar do adenovirus são proporcionadas por um único vetor de auxiliar do adenovirus, e o modelo de rAAV é integrado dentro da célula como um provírus. Alternativamente, o mo

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56/120 delo de rAAV é proporcionado por um vetor do EBV que é mantido dentro da célula como um elemento extracromossômico (por exemplo, como um epissoma nuclear à base de EBV).

[000163] Em uma modalidade de exemplo adicional, as sequências rep/cap do AAV e as sequências de auxiliar do adenovirus são proporcionadas por um único auxiliar do adenovirus. O modelo de rAAV pode ser proporcionado como um vetor viral de replicação separada. Por exemplo, o modelo de rAAV pode ser proporcionado por uma partícula de rAAV oupor uma segunda partícula de adenovirus recombinante.

[000164] De acordo com os métodos precedentes, o vetor do adenovirus híbrido tipicamente compreende as sequências de adenovirus 5’ e 3’ cis suficientes para replicação e empacotamento do adenovirus (isto é, as repetições de terminais do adenovirus e sequência PAC). As sequências rep/cap do AAV e, caso presente, o modelo de rAAV são embutidos na estrutura do adenovirus e são flanqueados pelas sequências 5' e 3' cis, de modo que estas sequências podem ser empacotadas dentro dos capsídeos de adenovirus. Conforme descrito acima, as sequências auxiliares de adenovirus e as sequências rep/cap do AAV geralmente não são flanqueadas por TRs de modo que estas sequências não são empacotadas dentro dos virions do AAV.

[000165] Zhang et al. ((2001) Gene Ther. 18:704-12) descrevem um auxiliar quimérico compreendendo tanto adenovirus quanto os genes rep e cap do AAV.

[000166] Herpes vírus também podem ser usados como um vírus auxiliar em métodos de empacotamento do AAV. Herpes vírus híbridos codificando a(s) proteína(s) Rep do AAV vantajosamente podem facilitar esquemas escalonáveis de produção de vetores do AAV. Foi descrito um vetor do vírus herpes simplex híbrido tipo I (HSV-1) expressando os genes rep e cap do AAV-2 (Conway et al. (1999) Gene Therapy 6:986 eWO 00/17377.

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[000167] Como uma alternativa adicional, os vetores de vírus da divulgação podem ser produzidos em células de insetos usando vetores de baculovírus para liberar os genes rep / cap e modelo de rAAV conforme descrito, por exemplo, por Urabe et al. (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43.

[000168] Estoques de vetores do AAV livres de vírus auxiliar contaminante podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, o AAV e vírus auxiliar podem ser prontamente diferenciados com base no tamanho. O AAV também pode ser separado do vírus auxiliar com base em cromatografia de afinidade [por exemplo, para um substrato de heparina (Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973) ou usando resina de afinidade (Wang et al., (2015), Mol Ther Methods Clin Dev 2:15040) ou, por exemplo, por outros métodos (revisados em Qu et al. (2015) Curr Pharm Biotechnol. 16(8):684-95)]. Vírus auxiliares defeituosos para replicação deletados podem ser usados de modo que qualquer vírus auxiliar contaminante não seja competente para replicação. Como uma alternativa adicional, pode ser empregado um auxiliar de adenovirus carecendo de late expressão genética tardia, uma vez que somente é requerida expressão genética precoce de adenovirus para mediar o empacotamento do vírus AAV. Mutantes de adenovirus defeituosos para expressão genética tardia são conhecidos na técnica (por exemplo, mutantes de adenovirus tslOOK e ts149).

Vetores de Vírus Recombinantes

[000169] Os vetores de vírus da presente divulgação são úteis para a liberação de ácidos nucleicos para as células in vitro, ex vivo, e in vivo. Em particular, os vetores de vírus podem ser empregados vantajosamente para liberar ou transferir ácidos nucleicos para células animais, incluindo de mamífero.

[000170] Qualquer uma ou mais sequências de ácidos nucleicos he

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58/120 terólogo de interesse podem ser liberadas nos vetores de vírus da presente divulgação. Os ácidos nucleicos de interesse incluem ácidos nucleicos codificando polipeptídeos, incluindo proteínas terapêuticas (por exemplo, para usos médicos ou veterinários) ou imunogênicas (por exemplo, para vacinas) e/ou moléculas de RNA funcionais ou terapêuticas.

[000171] Os polipeptídeos terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, proteína reguladora transmembrana da fibrose cística (CFTR), distrofina (incluindo mini- e micro- distrofinas, vide, por exemplo, Vincent et al. (1993) Nature Genetics 5:130; Publicação de Patente U.S. No. 2003/017131; Publicação de Patente Internacional WO/2008/088895, Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:1371413719 (2000); e Gregorevic et al. Mol. Ther. 16:657-64 (2008)), propeptídeo miostatina, folistatina, receptor solúvel de activina tipo II, IGF1, polipeptídeos anti-inflamatórios tais como o mutante dominante Ikappa B, sarcospan, utrofina (Tinsley et al. (1996) Nature 384:349), mini-utrofina, fatores de coagulação (por exemplo, Fator VIII, Fator IX, Fator X, etc.), eritropoietina, angiostatina, endostatina, catalase, tirosina hidroxilase, superoxide dismutase, leptina, o receptor do LDL, lipoproteína lipase, ornitina transcarbamilase, β-globina, α-globina, espectrina, ai-antitripsina, adenosina desaminase, hipoxantina guanina fosforibosil transferase, β-glucocerebrosidase, esfingomielinase, hexosaminidase A lisossômica, ceto ácido desidrogenase de cadeia ramificada, proteína RP65, citocinas (por exemplo, a-interferon, β-interferon, interferon-γ, interleucina-2, interleucina-4, fator estimulante de colônias de macrófagos granulócitos, linfotoxina, e semelhantes), fatores de crescimento peptídico, fatores neurotróficos e hormônios (por exemplo, somatotropina, insulina, fatores de crescimento semelhantes à insulina 1 e 2, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epidermal, fator de crescimento de fibroblastos, fator de crescimento

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59/120 nerveso, fator neurotrófico 3 e 4, fator neurotrófico derivado do cérebro, proteínas morfogênicas ósseas [incluindo RANKL e VEGF], fator de crescimento glial derivado, fator de crescimento transformante α e β, e semelhantes), ácido lisossômico α-glucosidase, a-galactosidase A, receptores (por exemplo, o receptor solúvel do fator de crescimento de necrose tumoral a), S100A1, parvalbumina, adenilil ciclase tipo 6, uma molécula que modula o manuseio do cálcio (por exemplo, SERCA2a, Inibidor 1 de PP1 e fragmentos do mesmo [por exemplo, WO 2006/029319 e WO 2007/100465]), uma molécula que efetua o knockdown de receptor quinase tipo 2 acoplado a proteína G tal como um bARKct constitutivamente ativo truncado, fatores anti-inflamatórios tais como IRAP, proteínas anti-miostatina, aspartoacilase, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de cadeia única; um Mab exemplar é o Mab Herceptin®), neuropeptídeos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, galanina, Neuropeptídeo Y (vide, a patente U.S. No. 7.071.172), inibidores da angiogênese tais como Vasohibinas e outros inibidores do VEGF (por exemplo, Vasohibina 2 [vide, WO JP2006/073052]). Outras sequências de ácidos nucleicos heterólogos ilustrativas codificam produtos genéticos suicidas (por exemplo, timidina quinase, citosina desaminase, toxina diftérica, e fator de necrose tumoral), proteínas conferindo resistência a um fármaco usado na terapia do câncer, produtos genéticos supressores tumorais (por exemplo, p53, Rb, Wt-1), TRAIL, ligante de FAS, e qualquer outro polipeptídeo que tenha um efeito terapêutico em um sujeito que necessite do mesmo. Os vetores do AAV também podem ser usados para liberar anticorpos monoclonais e fragmentos de anticorpos, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo direcionado contra miostatina (vide, por exemplo, Fang et al. Nature Biotechnology 23:584-590 (2005)). [000172] Sequências de ácidos nucleicos heterólogos codificando polipeptídeos incluem as sequências codificando polipeptídeos repor

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60/120 ter (por exemplo, uma enzima). Os polipeptídeos Reporter são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidase, fosfatase alcalina, luciferase, e o gene da cloranfenicol acetiltransferase.

[000173] Opcionalmente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar um polipeptídeo secretado (por exemplo, um polipeptídeo que seja um polipeptídeo secretado em seu estado nativo ou que tenha sido manipulado para ser secretado, por exemplo, por associação operável com uma sequência de sinal secretora conforme é conhecido na técnica).

[000174] Alternativamente, em modalidades particulares desta revelação, o ácido nucleico heterólogo pode codificar um ácido nucleico antissenso, uma ribozimea(por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. No. 5.877.022), RNAs que efetuam trans-splicing mediado por spliceosome (vide, Puttaraju et al. (1999) Nature Biotech. 17:246; Patente U.S. No. 6.013.487; Patente U.S. No. 6.083.702), RNAs interferentes (RNAi) incluindo siRNA, shRNA ou miRNA que mediam silenciamento genético (vide, Sharp et al. (2000) Science 287:2431), e outros RNAs não traduzidos, tais como RNAs “guia” (Gorman et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; Patente U.S. No. 5.869.248 para Yuan et al.), e semelhantes. Exemplos de RNAs não traduzidos incluem RNAi contra um produto genético de resistência a múltiplas drogas (MDR) (por exemplo, para tratar e/ou prevenir tumores e/ou para administração ao coração para prevenir dano por quimioterapia), RNAi contra miostatina (por exemplo, para a distrofia muscular de Duchenne), RNAi contra VEGF (por exemplo, para tratar e/ou prevenir tumores), RNAi contra frosfolamban (por exemplo, para tratar doença cardiovascular, vide, por exemplo, Andino et al. J. Gene Med. 10:132-142 (2008) and Li et al. Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005)); moléculas inibidoras de fosfolamban ou dominante-negativas tais como fosfolam

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61/120 ban S16E (por exemplo, para tratar doença cardiovascular, vide, por exemplo, Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002)), RNAi para adenosina quinase (por exemplo, para epilepsia), e RNAi direcionado contra organismos e vírus patogênicos (por exemplo, o vírus da hepatite B e/ou C, o vírus da imunodeficiência humana, o CMV, o vírus do herpes simplex, o papiloma vírus humano, etc.).

[000175] Além disso, pode ser liberada uma sequência de ácido nucleico que direcione emenda alternativa. De modo a ilustrar, uma sequência antissenso (ou outra sequência inibitória) complementar ao sítio de emenda 5' e/ou 3' do éxon 51 de distrofina pode ser liberada em conjunto com um promotor de RNA nuclear pequeno (sn) U1 ou U7 para induzir pular este éxon. Por exemplo, uma sequência de DNA compreendendo uma promotor de snRNA U1 ou U7 localizado 5' para a uma ou mais sequências antissenso / inibitórias pode ser empacotada e liberada em um capsídeo modificado da divulgação.

[000176] O vetor do vírus também pode compreender uma molécula de ácido nucleico heteróloga que compartilhe homologia e recombine com um locus sobre um cromossoma hospedeiro. Esta abordagem pode ser utilizada, por exemplo, para corrigir um defeito genético na célula hospedeira.

[000177] A presente divulgação também proporciona vetores de vírus que expressam um polipeptídeo imunogênico, por exemplo, para vacinação. A molécula de ácido nucleico pode codificar qualquer imunogênio de interesse conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a, imunogênios do vírus da imunodeficiência humana (HIV), do vírus da imunodeficiência dos símios (SIV), influenza vírus, proteínas gag do HIV ou do SIV, antígenos tumorais, antígenos cancerígenos, antígenos bacterianos, antígenos virais, e semelhantes.

[000178] Um polipeptídeo imunogênico pode ser qualquer polipeptídeo adequado para provocar uma resposta imune e/ou proteger o su

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62/120 jeito contra uma infecção e/ou doença, incluindo, mas não limitadas a, infecções e doenças microbianas, bacterianas, por protozoários, parasitárias, fúngicas e/ou virais. Por exemplo, o polipeptídeo imunogênico pode ser um imunogênio de ortomixovírus (por exemplo, um imunogênio do influenza vírus, tal como a proteína da superfície hemaglutinina (HA) do influenza vírus ou a nucleoproteína do influenza vírus, ou um imunogênio do influenza vírus equino) ou um imunogênio do lentivírus (por exemplo, um imunogênio do vírus da anemia infecciosa equina, um imunogênio do Vírus da Imunodeficiência dos Símios (SIV), ou um imunogênio do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), tal como a proteína GP160 do envelope do HIV ou do SIV, as proteínas da matriz / do capsídeo do HIV ou do SIV, e os produtos genéticos gag, pol e em/do HIV ou do SIV). O polipeptídeo imunogênico também pode ser um imunogênio do arenavirus (por exemplo, o imunogênio do vírus da febre de Lassa, tal como a proteína do nucleocapsídeo do vírus da febre de Lassa e a glicoproteína do envelope da febre de Lassa), um imunogênio do poxvirus (por exemplo, um imunogênio do vírus vaccinia, tais como os produtos genéticos vaccinia L1 ou L8), um imunogênio do flavivírus (por exemplo, um imunogênio do vírus da febre amarela ou um imunogênio do vírus da encefalite japanesa), um imunogênio do filovírus (por exemplo, um imunogênio do vírus Ebola, ou um imunogênio do vírus Marburg, tais como os produtos genéticos NP e GP), um imunogênio do bunyavírus (por exemplo, imunogênios dos vírus RVFV, CCHF, e/ou SFS), ou um imunogênio do coronavirus (por exemplo, um imunogênio do coronavirus humano infeccioso, tal como a glicoproteína do envelope do coronavirus humano, ou um imunogênio do vírus da gastroenterite transmissível porcina, ou um imunogênio do vírus da bronquite infecciosa aviária). O polipeptídeo imunogênico pode ser ainda um imunogênio da polio, um imunogênio da herpes (por exemplo, imunogênios do CMV, do EBV, do HSV) um imunogênio

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63/120 da caxumba, um imunogênio do sarampo, um imunogênio da rubéola, uma toxina diftérica ou outro imunogênio da difteria, um antígeno pertussis, um imunogênio da hepatite (por exemplo, hepatite A, hepatite B, hepatite C, etc.), e/ou qualquer outro imunogênio de vacina atualmente conhecido na técnica ou posteriormente identificado como um imunogênio.

[000179] Alternativamente, o polipeptídeo imunogênico pode ser qualquer antígeno celular tumoral ou cancerígeno. Opcionalmente, o antígeno tumoral ou cancerígeno é expresso sobre a superfície da célula cancerígena. Exemplos de antígenos celulares cancerígenos ou tumorais estão descritos em S.A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991)). Outros antígenos cancerígenos e tumorais ilustrativos incluem, mas não estão limitados a: o produto genético BRCA1, o produto genético BRCA2, gp100, tirosinase, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO1, CDK-4, β-catenina, MUM-1, Caspase-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, antígenos tumorais de melanoma (Kawakami et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515; Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347; Kawakami et al. (1994) Cancer Res. 54:3124), MART-1, gp100 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P15, tirosinase (Brichard et al. (1993) J. Exp. Med. 178:489); o produto genético HER-2/neu (Pat. U.S. No. 4.968.603), CA 125, LK26, FB5 (endosialina), TAG 72, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN (antígeno sialil Tn), proteínas c-erbB-2, PSA, LCanAg, receptor estrogênico, globulina da gordura do leite, proteína supressora tumoral p53 (Levine (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); antígenos mucina (Publicação de patente internacional No. WO 90/05142); telomerases; proteínas da matriz nuclear; fosfatase ácida prostática; antígenos do papilloma vírus; e/ou antígenos atualmente conhecidos ou descobertos posteriormente a serem associados com os seguintes cânceres: melanoma, adenocarcinoma, timoma, linfoma

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64/120 (por exemplo, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin), sarcoma, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de cólon, leucemia, câncer uterino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de bexiga, câncer do rim, câncer pancreático, câncer cerebral e qualquer outro câncer ou condição maligna atualmente conhecida ou posteriormente identificada (vide, por exemplo, Rosenberg (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91).

[000180] Como uma alternativa adicional, o ácido nucleico heterólogo pode codificar qualquer polipeptídeo que seja produzido desejávelmente em uma célula in vitro, ex vivo, ou in vivo. Por exemplo, os vetores de vírus podem ser introduzidos dentro de células cultivadas e o produto genético expressado isolado a partir das mesmas.

[000181] Em modalidades adicionais, o ácido nucleico heterólogo pode codificar (a) um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio baseado em nucleases de dedo de zinco ou meganucleases ou endonucleases ou nucleases à base de sistema TALENs ou CRISPR/Cas que contêm uma porção de ligação ao RNA que interage com uma molécula de RNA tendo por alvo DNA (gRNA), ou um mRNA codificando o polipeptídeo referido; (b) uma ou mais moléculas de RNA guia (gRNAs) compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência em um DNA alvo, e um segundo segmento que interaghe com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio; e/ou (c) uma ou mais moléculas modelo de doador de DNA compreendendo uma sequência de DNA de cadeia única ou dupla designada para recombinação homóloga dentro do sítio alvo de um genoma de mamífero. Por exemplo, os vetores de vírus podem ser introduzidos dentro de células-tronco e/ou linfócitos T ex vivo, células cultivadas, tecidos e/ou organismos inteiros in vivo e o produto genético expressado permitir edição, disrupçãoi, ativação transcricional e/ou repressão de genes alvo no hospedeiro.

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[000182] Será entendido pelos versados na técnica que a uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogo de interesse podem ser associadas operacionalmente com sequências de controle apropriadas. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico heterólogo pode ser associada operacionalmente com elementos de controle de expressão, tais como sinais de controle de transcrição / translação, origens de replicação, sinais de poliadenilação, sítios de entrada de ribossoma internos (IRES), promotores, e/ou reforçadores, e semelhantes.

[000183] Além disso, pode ser obtida expressão regulada da uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogo de interesse no nível pós-transcricional, por exemplo, regulando a emenda seletiva de diferentes introns pela presença ou ausência de um oligonucleotídeo, molécula pequena e/ou outro composto que bloqueie seletivamente a atividade de emenda em sítios específicos (por exemplo, conforme descrito em WO 2006/119137).

[000184] Os versados na técnica vão reconhecer que pode ser usada uma variedade de elementos promotores / reforçadores dependendo do nível e da expressão tecidual específica desejados. O promotor / reforçador pode ser constitutivo ou indutível, dependendo do padrão de expressão desejado. O promotor / reforçador pode ser nativo ou estranho e pode ser uma sequência natural ou uma sequência sintética. Por estranho, se indica que a região de iniciação transcricional não é encontrada bi hospedeiro selvagem no qual a região de iniciação transcricional é introduzida.

[000185] Em modalidades particulares, os elementos promotores / reforçadores podem ser nativos para a célula alvo ou para o sujeito a ser tratado. Em modalidades representativas, o elemento promotor / reforçador pode ser nativo para a sequência de ácido nucleico heterólogo. O elemento promotor/ reforçador geralmente é escolhido de modo que funcione na(s) célula(s) alvo de interesse. Além disso, em mo

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66/120 dalidades particulares o elemento promotor I reforçador pode ser um elemento promotor / reforçador de mamífero. O elemento promotor / reforçador pode ser constitutivo ou indutível.

[000186] Elementos de controle de expressão indutíveis são tipicamente vantajosos nas aplicações nas quais é desejável proporcionar regulação sobre a expressão da(s) sequência(s) de ácido nucleico heterólogo. Elementos promotores / reforçadores indutíveis para liberação genética podem ser elementos promotores / reforçadores teciduais-específicos ou -preferenciais, e incluem elementos promotores / reforçadores específicos ou preferenciais para músculos (incluindo específicos ou preferenciais para músculos cardíacos, esqueléticos e/ou lisos), específicos ou preferenciais para o tecido neural (incluindo específicos ou preferenciais para o cérebro), específicos ou preferenciais para os olhos (incluindo específicos para a retina e específicos para a córnea), específicos ou preferenciais para o fígado, específicos ou preferenciais para a medula óssea, específicos ou preferenciais para o pâncreas, específicos ou preferenciais para o baço, e específicos ou preferenciais para os pulmões. Outros elementos promotores / reforçadores indutíveis incluem elementos indutíveis por hormônios e indutíveis por metais. Exemplos de elementos promotores / reforçadores indutíveis incluem, mas não estão limitados a, um elemento Tet on/off, um promotor indutível por RU486, um promotor indutível por ecdisona, um promotor indutível por rapamicina, e um promotor indutível por metalotioneína.

[000187] Em modalidades em que a(s) sequência(s) de ácido nucleico heterólogo é transcrita e em seguida traduzida nas células alvo, sinais de iniciação específicos são geralmente incluídos para translação eficaz de sequências codificantes de proteínas inserdias. Estas sequências de controle translacional exógenas, as quais podem incluir o códon de iniciação de ATG e sequências adjacentes, podem ser de

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67/120 uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas.

[000188] Os vetores de vírus de acordo com a presente divulgação proporcionam um meio para a liberação de ácidos nucleicos heterólogos dentro de uma ampla gama de células, incluindo células em divisão e não em divisão. Os vetores de vírus podem ser empregados para liberar um ácido nucleico de interesse para uma célula in vitro, por exemplo, para produzir um polipeptídeo in vitro ou para terapia genética ex vivo. Os vetores de vírus são adicionalmente úteis em um método de liberação de um ácido nucleico a um sujeito que necessite do mesmo, por exemplo, para expressar um polipeptídeo imunogênico ou terapêutico ou um RNA funcional. Desta maneira, o polipeptídeo ou RNA funcional pode ser produzido in vivo no sujeito. O sujeito pode estar necessitando do polipeptídeo porque o sujeito tem uma deficiência do polipeptídeo. Além disso, o método pode ser praticado porque a produção do polipeptídeo ou RNA funcional no sujeito pode conferir algum efeito benéfico.

[000189] Os vetores de vírus também podem ser usados para produzir um polipeptídeo de interesse ou RNA funcional em células cultivadas ou em um sujeito (por exemplo, usando o sujeito como um biorreator para produzir o polipeptídeo ou para observar os efeitos do RNA funcional sobre o sujeito, por exemplo, em conexão com métodos de triagem).

[000190] Em geral, os vetores de vírus da presente divulgação podem ser empregados para liberar um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo ou RNA funcional para tratar e/ou prevenir qualquer estado de doença para o qual seja benéfico liberar um polipeptídeo terapêutico ou RNA funcional. Estados de doença ilustrativos incluem, mas não estão limitados a: fibrose cística (proteína reguladora transmembrana da fibrose cística) e outras doenças do pulmão, hemofilia A (Fator VIII), hemofilia B (Fator IX), talassemia (β-globina), ane

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68/120 mia (eritropoietina) e other distúrbios do sangue, doença de Alzheimer (GDF; neprilisina), esclerose múltipla (β-interferon), doença de Parkinson (fator neurotrófico derivado da linhagem de células da glia [GDNF]), doença de Huntington (RNAi para remover repetições), esclerose lateral amiotrófica, epilepsia (galanina, fatores neurotróficos), e outros transtornos neurológicos, câncer (endostatina, angiostatina, TRAIL, ligante de FAS, citocinas incluindo interferons; RNAi incluindo RNAi contra VEGF ou o produto genético de resistência a múltiplas drogas, mir-26a [por exemplo, para carcinoma hepatocelular]), diabetes mellitus (insulina), distrofias musculares incluindo a distrofia de Duchenne (distrofina, mini-distrofina, fator de crescimento semelhante a insulina I, um sarcoglicano [por exemplo, α, β, γ], RNAi contra miostatina, propeptídeo miostatina, folistatina, receptor solúvel da activina tipo II, polipeptídeos anti-inflamatórios tais como o mutante dominante Ikappa B, sarcospan, utrofina, mini-utrofina, antissenso ou RNAi contra junções de emendas no gene da distrofina para induzir pular éxons [vide, por exemplo, WO/2003/095647], antissenso contra U7 snRNAs para induzir pular éxons [vide, por exemplo, WO/2006/021724], e anticorpos ou fragmentos de anticorpos contra miostatina ou propeptídeo miostatina) e Becker, doença de Gaucher (glucocerebrosidase), doença de Hurler (α-L-iduronidase), deficiência da adenosina desaminase (adenosina desaminase), doenças do armazenamento de glicogênio (por exemplo, doença de Fabry [α-galactosidase] e doença de Pompe [ácido lisossômico α-glucosidase]) e outros distúrbios metabólicos, enfisema congênito (a1-antitripsina), Síndrome de Lesch-Nyhan (hipoxantina guanina fosforibosil transferase), doença de Niemann-Pick (esfingomielinase), doença de Tay Sachs (hexosaminidase lisossômica A), doença da urina do xarope de bordo (ceto ácido desidrogenase de cadeia ramificada), doenças degenerativas da retina (e outras doenças dos olhos e da retina; por exemplo, PDGF para degeneração macular

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69/120 e/ou vasohibina ou outros inibidores do VEGF ou outros inibidores da angiogênese para tratar / prevenir distúrbios da retina, por exemplo, no diabetes Tipo I), doenças de órgãos sólidos tais como o cérebro (incluindo a Doença de Parkinson [GDNF], astrocitomas [endostatina, angiostatina e/ou RNAi contra VEGF], glioblastomas [endostatina, angiostatina e/ou RNAi contra VEGF]), fígado, rim, coração incluindo falência cardíaca congestiva ou doença arterial periférica (PAD) (por exemplo, por liberação de inibidor da proteína fosfatase I (1-1) e fragmentos do mesmo (por exemplo, 11C), serca2a, proteínas de dedo de zinco que regulam o gene fosfolamban, Barkct, receptor p2-adrenérgico, receptor p2-adrenérgico quinase (BARK), fosfoinositídeo-3 quinase (quinase PI3), S100A1, parvalbumina, adenilil ciclase tipo 6, uma molécula que efetua knockdown da proteína G acoplada ao receptor quinase tipo 2 tal como uma bARKct constitutivamente ativa truncada; calsarcina, RNAi contra fosfolamban; moléculas inibitórias de fosfolamban ou dominante-negativas tais como fosfolamban S16E, etc.), artrite (fatores de crescimento semelhantes a insulina), transtornos articulares (fator de crescimento semelhante a insulina 1 e/ou 2), hiperplasia da íntima (por exemplo, por liberação de enos, inos), melhora da sobrevida em transplantes do coração (superóxido dismutase), AIDS (CD4 solúvel), perda de massa muscular (fator de crescimento semelhante a insulina I), deficiência renal (eritropoietina), anemia (eritropoietina), artrite (fatores anti-inflamatórios tais como receptor solúvel de IRAP e TNFa), hepatite (a-interferon), deficiência do receptor de LDL (receptor de LDL), hiperamonemia (ornitina transcarbamilase), doença de Krabbe (galactocerebrosidase), atrofia muscular espinhal (SMA), doença de Batten, ataxias cerebrais espinhais incluindo ataxia de Friedreich, SCA1, SCA2 e SCA3, fenilcetonúria (fenilalanina hidroxilase), doenças autoimunes, e semelhantes. A presente invenção pode ser adicionalmente usada depois de transplante de órgãos para aumentar o sucesso do

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70/120 transplante e/ou para reduzir os efeitos colaterais negativos do transplante de órgãos ou terapias adjuntas (por exemplo, por administração de agentes imunossupressores ou ácidos nucleicos inibitórios para bloquear a produção de citocinas). Como outro exemplo, proteínas morfogênicas ósseas (incluindo BMP 2, 7, etc., RANKL e/ou VEGF) podem ser administraads com um aloenxerto ósseo, por exemplo, depois de uma ruptura ou remoção cirúrgica em um paciente com câncer. [000191] A presente invenção também pode ser usada para produzir células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). Por exemplo, um vetor do vírus da divulgação pode ser usado para liberar um ou mais ácidos nucleicos associados com células-tronco para dentro de uma célula não pluripotente, tais como fibroblastos adultos, células de pele, células do fígado, células renais, células adiposas, células cardíacas, células neurais, células epiteliais, células endoteliais, e semelhantes. Ácidos nucleicos codificando fatores associados com células-tronco são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de semelhantes fatores associados com células-tronco e pluripotência incluem Oct-3/4, a família SOX (por exemplo, SOX1, SOX2, SOX3 e/ou SOX15), a família Klf (por exemplo, Klf 1, Klf2, Klf4 e/ou Klf5), a família Myc (por exemplo, Cmyc, L-myc e/ou N-myc), NANOG e/ou LIN28.

[000192] A presente invenção também pode ser praticada para tratar e/ou prevenir epilepsia, derrame, lesão cerebral traumática, transtornos cognitivos, transtornos comportamentais, transtornos psiquiátricos, doença de Huntington, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ALS), bem como qualquer outra condição neurodegenerativa que possa se beneficiar de ou necessitar de regeneração ou reparo axonal / neuronal.

[000193] Em modalidades particulares, a presente divulgação pode ser praticada para promover regeneração axonal e reparo neuronal, restaurar circuitos e/ou repor neurônios perdidos como uma terapia

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71/120 corretora, por exemplo, por regulação direcionada ou superexpressão de células-tronco, fatores de diferenciação e reprogramação tais como FoxJ1, Fox2, NeuroD2, NG2 ou Olig2 e/ou microRNAs tais como miR137, MÍR124, bem como quaisquer outros fatores ou miRNAs implicados no desenvolvimento e na diferenciação neuronais.

[000194] A transferência genética tem substancial utilidade potencial para o entendimento e para proporcionar terapiar para estados de doença. Existe uma série de doenças hereditárias nas quais genes defeituosos são conhecidos e foram clonados. Em geral, os estados de doença acima estão dentro de duas classes: estados de deficiência, geralmente de enzimas, os quais geralmente são hereditários em uma maneira recessiva, e estados desequilibrados, os quais podem envolver proteínas reguladoras ou estruturais, e os quais são tipicamente hereditários em uma maneira dominante. Para estados de doenças de deficiência, a transferência genética pode ser usada para trazer um gene normal para dentro de tecidos afetados para terapia de reposição, bem como para criar modelos animais para a doença usando mutações antissenso. Para estados de doença desequilibrados, a transferência genética pode ser usada para criar um estado de doença em um sistema de modelo, o qual pode ser em seguida usado em esforços para neutralizar o estado de doença. Portanto, os vetores de vírus de acordo com a presente divulgação permitem o tratamento e/ou a prevenção de doenças genéticas.

[000195] Os vetores de vírus de acordo com a presente divulgação também podem ser empregados para proporcionar um RNA funcional para uma célula in vitro ou in vivo. A expressão do RNA funcional na célula, por exemplo, pode diminuir a expressão de uma proteína alvo em particular pela célula. Por conseguinte, o RNA funcional pode ser administrado para diminuir a expressão de uma proteína em particular em um sujeito que necessite do mesmo. O RNA funcional também po

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72/120 de ser administrado a células in vitro para regular a expressão genética e/ou a fisiologia celular, por exemplo, para otimizar sistemas de cultura celular ou tecidual ou em métodos de triagem.

[000196] Além disso, os vetores de vírus de acordo com a presente invenção encontram uso em métodos de diagnóstico e de triagem, por meio dos quais um ácido nucleico de interesse é expresso de modo transitório ou de modo estável em um sistema de cultura celular, ou alternativamente, um modelo animal transgênico.

[000197] Os vetores de vírus da presente divulgação também podem ser usados para vários fins não terapêuticos, incluindo mas não limitados a uso em protocolos para avaliar o direcionamento genético, clearance, transcrição, translação, etc., conforme seria evidente para um versado na técnica. Os vetores de vírus também podem ser usados para o propósito de avaliar a segurança (disseminação, toxicidade, imunogenicidade, etc.). Os dados referidos, por exemplo, são considerados pela agência americana FDA (United States Food and Drug Administration) come parte do processo de aprovação regulatório antes de avaliação da eficácia clínica.

[000198] Como um aspecto adicional, os vetores de vírus da presente divulgação podem ser usados para produzir uma resposta imune em um sujeito. De acordo com esta modalidade, um vetor do vírus compreendendo uma sequência de ácido nucleico heteróloga codificando um polipeptídeo imunogênico pode ser administrada a um sujeito, e uma resposta imune ativa é montada pelo sujeito contra o polipeptídeo imunogênico. Polipeptídeos imunogênicos são conforme descritos acima. Em algumas modalidades, é provocada uma resposta imune protetora.

[000199] Alternativamente, o vetor do vírus pode ser administrado a uma célula ex vivo e a célula alterada é administrada ao sujeito. O vetor do vírus compreendendo o ácido nucleico heterólogo é introduzido

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73/120 dentro da célula, e a célula é administrada ao sujeito, onde o ácido nucleico heterólogo codificando o imunogênio pode ser expresso e induzir uma resposta imune no sujeito contra o imunogênio. Em modalidades particulares, a célula é uma célula de apresentação ao antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica).

[000200] Uma “resposta imune ativa” ou “imunidade ativa” é caracterizada por “participação de tecidos e células hospedeiros depois de um encontro com o imunogênio. Envolve diferenciação e proliferação de células imunocompetentes em tecidos linforreticulares, os quais levam à síntese de anticorpo ou ao desenvolvimento de reatividade mediada por células, ou ambos.” Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Dito de outro modo, uma resposta imune ativa é montada pelo hospedeiro depois de exposição a um imunogênio por infecção ou por vacinação. A imunidade ativa pode ser contrastada com a imunidade passiva, a qual é adquirida através da “transferência de substâncias preformadas (anticorpo, fator de transferência, enxerto tímico, interleucina-2) de um hospedeiro ativamente imunizado para um hospedeiro não imune.” Id.

[000201] Uma resposta imune “protetora” ou imunidade “protetora” conforme usado aqui, neste pedido de patente, indica que a resposta imune confere algum benefício para o sujeito pelo fato de que previne ou reduz a incidência de doença. Alternativamente, uma resposta imune protetora ou imunidade protetora pode ser útil no tratamento e/ou na prevenção de doença, em particular câncer ou tumores (por exemplo, por prevenção do câncer ou da formação de tumor, causando a regressão de um câncer ou tumor e/ou prevenindo metástase e/ou prevenindo o crescimento de nódulos metastáticos). Os efeitos protetores podem ser completos ou parciais, contanto que os benefícios do

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74/120 tratamento superem quaisquer desvantagens do mesmo.

[000202] Em modalidades particulares, o vetor do vírus ou célula compreendendo o ácido nucleico heterólogo pode ser administrado em uma quantidade imunogenicamente eficaz, conforme descrito abaixo.

[000203] Os vetores de vírus da presente divulgação também podem ser administrados para imunoterapia do câncer por administração de um vetor do vírus expressando um ou mais antígenos de células cancerosas (ou uma molécula imunologicamente similar) ou qualquer outro imunogênio que produza uma resposta imune contra uma célula cancerosa. Para ilustrar, pode ser produzida uma resposta imune contra um antígeno de célula cancerosa em um sujeito por administração de um vetor do vírus compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando o antígeno de célula cancerosa, por exemplo para tratar um paciente com câncer e/ou para evitar se desenvolva câncer no sujeito. O vetor do vírus pode ser administrado a um sujeito in vivo ou usando métodos ex vivo, conforme descrito aqui, neste pedido de patente. Alternativamente, o antígeno cancerígeno pode ser expresso com parte do capsídeo de vírus ou pode ser associado de modo diverso com o capsídeo de vírus (por exemplo, conforme descrito acima).

[000204] Como outra alternativa, qualquer outro ácido nucleico terapêutico (por exemplo, RNAi) ou polipeptídeo (por exemplo, citocina) conhecido na técnica pide ser administrado para tratar e/ou prevenir câncer.

[000205] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo “câncer” engloba cânceres formadores de tumores. Do mesmo modo, o termo “tecido canceroso” engloba tumores. Um “antígeno de célula cancerosa” engloba antígenos tumorais.

[000206] O termo “câncer” tem seu significado entendido na técnica, por exemplo, um crescimento de tecido descontrolado que tem o potencial de se espalhar para sítios distantes do corpo (isto é, metastati

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75/120 zar). Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a melanoma, adenocarcinoma, timoma, linfoma (por exemplo, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin), sarcoma, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de cólon, leucemia, câncer uterine, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de bexiga, câncer de rim, câncer pancreático, câncer cerebral e qualquer outro câncer ou condição maligna atualmente conhecida ou posteriormente identificada. Em modalidades representativas, a presente invenção proporciona um método de tratamento de e/ou prevenção de cânceres formadores de tumores.

[000207] O termo “tumor” também é entendido na técnica, por exemplo, como uma massa anormal de células indiferenciadas dentro de um organismo multicelular. Os tumores podem ser malignos ou benignos. Em modalidades representativas, os métodos revelados aqui, neste pedido de patente, são usados para prevenir e tratar tumores malignos.

[000208] Pelos termos “tratar câncer,” “tratamento de câncer” e termos equivalentes se pretende que a gravidade do câncer é reduzida ou no mínimo parcialmente eliminada e/ou a progressão da doença é retardada e/ou controlada e/ou a doença é estabilizada. Em modalidades particulares, estes termos indicam que metástase do câncer é prevenida ou reduzida ou no mínimo parcialmente eliminada e/ou que o crescimento de nódulos metastáticos é prevenido ou reduzido ou no mínimo parcialmente eliminado.

[000209] Pelos termos “prevenção de câncer” ou “prevenir câncer” e termos equivalentes se pretende que os métodos no mínimo parcialmente eliminam ou reduzem e/ou adiam a incidência e/ou gravidade do início do câncer. Dito de outro modo, o início do câncer o sujeito pode ser reduzido em possibilidade ou probabildiade e/ou retardado. [000210] Em modalidades particulares, as células podem ser remo

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76/120 vidas de um sujeito com câncer e postas em contato com um vetor do vírus expressando um antígeno de célula cancerosa de acordo com a presente invenção. A células modificada é em seguida administrada ao sujeito, por meio do que é provocada uma resposta imune contra o antígeno de célula cancerosa. Este método pode ser empregado vantajosamente com sujeitos imunocomprometidos que não possam montar uma resposta imune suficiente in vivo (isto é, não possam produzir aumento de anticorpos em quantidades suficientes).

[000211] É sabido na técnica que as respostas imunes podem ser reforçadas por citocinas imunomoduladoras (por exemplo, a-interferon, β-interferon, γ-interferon, ω-interferon, τ-interferon, interleucina-1a, interleucina-1 β, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina 5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-9, interleucina-10, interleucina-11, interleucina 12, interleucina-13, interleucina14, interleucina-18, Fator de crescimento de células B, Ligante de CD40, fator de necrose tumoral -α, fator de necrose tumoral -β, proteína quimioatraente de monócitos -1, fator estimulante de colônias de macrófagos granulócitos, e linfotoxina). Por conseguinte, citocinas imunomoduladoras (de modo preferencial, citocinas indutivas de CTL) podem ser administradas a um sujeito em conjunto com o vetor do vírus.

[000212] As citocinas podem ser administradas por qualquer método conhecido na técnica. Citocinas exógenas podem ser administradas ao sujeito, ou alternativamente, um ácido nucleico codificando uma citocina pode ser liberado para o sujeito usando um vetor adequado, e a citocina produzida in vivo.

Sujeitos, Formulações Farmacêuticas, e Modos de Administração [000213] Vetores de vírus e capsídeos de acordo com a presente divulgação encontram uso tanto em aplicações veterinárias quanto médicas. Sujeitos adequados incluem tanto aviários quanto mamíferos.

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O termo “aviários” conforme usado aqui, neste pedido de patente, inclui, mas não está limitado a, frangos, patos, gansos, codorna, perus, faisão, papagaios, periquitos, e semelhantes. O termo “mamíferos” conforme usado aqui, neste pedido de patente, inclui, mas não está limitado a, seres humanos, primatas não humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Sujeitos humanos incluem indivíduos neonatos, bebês, juvenis, adultos e geriátricos.

[000214] Em modalidades representativas, o sujeito necessita” dos métodos da divulgação.

[000215] Em modalidades particulares, a presente divulgação proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um vetor do vírus e/ou capsídeo da divulgação em um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, agentes estabilizantes, tampões, veículos, adjuvantes, diluentes, etc. Para injeção, o veículo tipicamente vai ser um líquido. Para outros métodos de administração, o veículo pode ser ou sólido ou líquido. Para administração por inhalação, o veículo vai ser respirável, e opcionalmente pode estar em forma de particulado sólido ou líquido.

[000216] Por “farmaceuticamente aceitável” se indica um material que não é nóto ou indesejável de modo diverso, isto é, o material pode ser administrado a um sujeito sem provocar quaisquer efeitos biológicos iindesejáveis.

[000217] Um aspecto da presente divulgação é um método de transferência de um ácido nucleico para uma célula in vitro. O vetor do vírus pode ser introduzido dentro das células na multiplicidade de infecção apropriada de acordo com métodos de transdução de rotina adequados para as células alvo em particular. Os títulos do vetor do vírus a administrar podem variar, dependendo do tipo e número de células alvos, e do vetor do vírus em particular, e podem ser determinados pelos versados na técnica sem indevida experimentação. Em modalidades

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78/120 representativas, no mínimo cerca de 10³ unidades infecciosas, opcionalmente no mínimo cerca de 10⁵ unidades infecciosas são introduzidas na célula

[000218] A uma ou mais células nas quais o vetor do vírus é introduzido podem ser de qualquer tipo, incluindo mas não limitadas a células neurais (incluindo células dos sistemas nervosos periférico e central, em particular, células cerebrais tais como neurônios e oligodendrócitos), células pulmonares, células do olho (incluindo células da retina, epitélio de pigmento da retina, e células da córnea), células epiteliais (por exemplo, células epiteliais intestinais e respiratórias), células musculares (por exemplo, células musculares esqueléticas, células musculares cardíacas, células musculares lisas e/ou células do músculo diafragm), células dendríticas, células pancreáticas (incluindo células das ilhotas), células hepáticas, células do miocárdio, células ósseas (por exemplo, células-tronco da mecula óssea), células-tronco hematopoiéticas, células do baço, queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais, células da próstata, células germinativas, e semelhantes. Em modalidades representativas, a célula pode ser qualquer célula progenitora. Como uma possibilidade adicional, a célula pode ser uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco neural, uma célulatronco hepática). Como ainda uma alternativa adicional, a célula pode ser uma célula cancerosa ou tumoral. Além disso, a célula pode ser de qualquer espécie de origem, conforme indicado acima.

[000219] O vetor do vírus pode ser introduzido dentro de células in vitro para o fim de administração da célula modificada a um sujeito. Em modalidades particulares, as células foram removidas de um sujeito, o vetor do vírus é introduzido no mesmo, e as células são em seguida administradas de volta no cujeito. Métodos de remoção de células de um sujeito para manipulação ex vivo, seguida por introdução de volta no sujeito são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, a patente

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U.S. No. 5.399.346). Alternativamente, o vetor do vírus recombinante pode ser introduzido dentro de células de um sujeito doador, dentro de células cultivadas, ou dentro de células de qualquer outra origem adequada, e as células são administradas a um sujeito que necessite do mesmo (isto é, um sujeito receptor).

[000220] Células adequadas para liberação de ácido nucleico ex vivo são conforme descritas acima. As dosagens das células a administrar a um sujeito vão variar dependendo da idade, da condição e da espécie do sujeito, do tipo de célula, do ácido nucleico sendo expresso pela célula, do modo de administração, e semelhantes. Tipicamente, no mínimo cerca de 10² a cerca de 10⁸ células ou no mínimo cerca de 10³ a cerca de 10⁶ células vão ser administradas por dose em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades particulares, as células transduzidas com o vetor do vírus são administradas ao sujeito em uma quantidade eficaz para tratamento ou eficaz para prevenção em combinação com um veículo farmacêutico.

[000221] Em algumas modalidades, o vetor do vírus é introduzido dentro de uma célula e a célula pode ser administrada a um sujeito para provocar uma resposta imunogênica contra o polipeptídeo liberado (por exemplo, expresso como um transgene ou no capsídeo). Tipicamente, é administrada uma quantidade de células expressando uma quantidade imunogenicamente eficaz do polipeptídeo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma “quantidade imunogenicamente eficaz” é uma quantidade do polipeptídeo expresso que é suficiente para provocar uma resposta imune ativa contra o polipeptídeo no sujeito ao qual a formulação farmacêutica é administrada. Em modalidades particulares, a dosagem é suficiente para produzir uma resposta imune protetora (conforme definido acima). O grau de proteção conferido não precisa ser completo ou permanente, contanto que os benefícios da administração do polipeptídeo imunogênico supe

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80/120 rem quaisquer desvantagens da mesma.

[000222] Um aspecto adicional da divulgação é um método de administração do vetor do vírus e/ou capsídeo de vírus aos sujeitos. A administração dos vetores de vírus e/ou capsídeos de acordo com a presente divulgação a um sujeito humano ou a um animal que necessite da mesma pode ser por qualquer meio conhecido na técnica. Opcionalmente, o vetor do vírus e/ou capsídeos é liberado em uma dose eficaz para tratamento ou eficaz para prevenção em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[000223] Os vetores de vírus e/ou capsídeos da divulgação podem ser adicionalmente administrados para provocar uma resposta imunogênica (por exemplo, como uma vacina). Tipicamente, as composições imunogênicas da presente divulgação compreendem uma quantidade imunogenicamente eficaz de vetor do vírus e/ou capsídeo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, a dosagem é suficiente para produzir uma resposta imune protetora (conforme definido acima). O grau de proteção conferida não precisa ser completo ou permanente, contanto que os benefícios da administração do polipeptídeo imunogênico superem quaisquer desvantagens do mesmo. Os sujeitos e imunogênios são conforme descritos acima.

[000224] As dosagens do vetor do vírus e/ou capsídeo a serem administradas a um sujeito dependem do modo de administração, da doença ou condição a ser tratada e/ou prevenida, da condição do sujeito individual, do vetor do vírus ou capsídeo em particular, e do ácido nucleico a ser liberado, e semelhantes, e podem ser determinadas em uma maneira de rotina. Exemplos de doses para atingir efeitos terapêuticos são títulos de no mínimo cerca de 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵ unidades de transdução, opcionalmente cerca de 10⁸ a 10¹³ unidades de transdução.

[000225] Em modalidades particulares, pode ser empregada mais de

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81/120 uma administração (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) para atingir o nível desejado de expressão genética ao longo de um período de vários intervalos, por exemplo, diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente, etc.

[000226] Exemplos de modos de administração incluem oral, retal, transmucosa, intranasal, inalação (por exemplo, por meio de um aerosol), bucal (por exemplo, sublingual), vaginal, intratecal, intraocular, transdérmica, in utero (ou in ovo), parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intradermal, intrapleural, intracerebral, e intraarticular), tópica (por exemplo, tanto nas superfícies das mucosas quanto na pele, incluindo as superfícies das vias aéreas, e administração transdérmica), intralinfática, e semelhantes, bem como injeção direta em tecido ou órgão (por exemplo, no fígado, músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo diafragma ou cérebro). Em algumas modalidades, intramuscular inclui administração no músculo esquelético, diafragma e/ou cardíaco. A administração também pode ser em um tumor (por exemplo, em ou próximo a um tumor ou a um linfonodo). A via mais adequada em qualquer caso dado vai depender da natureza e da gravidade da condição sendo tratada e/ou prevenida e da natureza do vetor em particular que estiver sendo usado.

[000227] A liberação para um tecido alvo também pode ser realizada liberação de um depósito compreendendo o vetor do vírus e/ou capsídeo. Em modalidades representativas, um depósito compreendendo o vetor do vírus e/ou capsídeo é implantado dentro do tecido muscular esquelético, cardíaco e/ou diafragma ou o tecido pode ser posto em contato com um filme ou outra matriz compreendendo o vetor do vírus e/ou capsídeo. As matrizes ou substratos implantáveis referidos são descritos na Patente U.S. No. 7.201.898.

[000228] Em modalidades particulares, um vetor do vírus e/ou capsí

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82/120 deo de vírus de acordo com a presente divulgação é administrado ao músculo esquelético, ao músculo diafragma e/ou ao músculo cardíaco (por exemplo, para tratar e/ou prevenir distrofia muscular, doença do coração). Em algumas modalidades, um vetor do vírus e/ou capsídeo de vírus de acordo com a presente divulgação é administrado para tratar PAD ou falência cardíaca congestiva.

[000229] Os métodos da divulgação também podem ser praticados para produzir RNA antissenso, RNAi ou outro RNA funcional (por exemplo, uma ribozima) para liberação sistêmica

[000230] Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, quer como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para soluções ou suspensões em líquido antes da injeção, ou com oemulsões. Alternativamente, pode-se administrar o vetor do vírus e/ou capsídeos de vírus da divulgação em um local ao invés de administração de maneira sistêmica, por exemplo, em um depósito ou em uma formulação de liberação gradual. Além disso, o vetor do vírus e/ou capsídeo de vírus pode ser liberado aderido a uma matriz implantável cirurgicamente (por exemplo, conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US-2004-0013645-A1).

[000231] Os vetores de vírus e capsídeos de vírus podem ser administrados aos tecidos do sistema nervoso cerebral (por exemplo, cérebro, olhos) e podem vantajosamente resultar em uma distribuição mais ampla do vetor ou capsídeos de vírus do que a que seria observada na ausência da presente divulgação.

[000232] Em modalidades particulares, os vetores de liberação da divulgação podem ser administrados para tratar doenças do sistema nervoso central, incluindo transtornos genéticos, transtornos neurodegenerativos, transtornos psiquiátricos e tumores.

[000233] Doenças ilustrativas do sistema nervoso central incluem, mas não estão limitadas a doença de Alzheimer, doença de Parkinson,

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83/120 doença de Huntington, doença de Canavan, doença de Leigh, doença de Refsum, síndrome de Tourette, esclerose lateral primária, esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular progressiva, doença de Pick, distrofia muscular, esclerose múltipla, miastenia gravis, doença de Binswanger, trauma devido a lesão da cabeça e/ou da medula espinhal (por exemplo, lesão cerebral traumática), doença de Tay Sachs, doença de Lesch-Nyan, epilepsia, derrame, enfartes cerebrais, transtornos psiquiátricos incluindo transtornos do humor (por exemplo, depressão, transtorno afetivo bipolar, transtorno afetivo persistente, transtorno do humor secundário), esquizofrenia, dependência de drogas (por exemplo, alcoolismo e dependências de outras substâncias), neuroses (por exemplo, ansiedade, transtorno obsessivo, transtorno somatoforme, transtorno dissociative, luto, depressão pós-parto), psicose (por exemplo, alucinações e delírios), demência, paranóia, transtorno de déficit de atenção, transtornos psico-sexuais, qualquer condição neurodegenerativa que possa se beneficiar de ou necessitar de regeneração e/ou reparo axonais / neuronais, transtornos cognitivos, transtornos comportamentais, transtornos do sono, distúrbios de dor, distúrbios alimentares ou do peso (por exemplo, obesidade, caquexia, anorexia nervosa, e bulimia) e cânceres e tumores (por exemplo, tumores da pituitária) do sistema nervoso central.

[000234] Transtornos do sistema nervoso central incluem distúrbios oftálmicos envolvendo a retina, o trato posterior, e o nervo ótico (por exemplo, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e outras doenças degenerativas da retina, uveíte, degeneração macular relacionada com a idade, glaucoma).

[000235] A maioria, se não todas, das doenças e dos transtornos oftálmicos são associados com um ou mais de três tipos de indicações: (1) angiogênese, (2) inflamação, e (3) degeneração. Os vetores de liberação da presente divulgação podem ser empregados para liberar

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84/120 fatores anti-angiogênicos; fatores anti-inflamatórios; fatores que retardam a degeneração celualr, promovem a economia celular, ou promovem o crescimento celular e combinações dos precedentes.

[000236] A retinopatia diabética, por exemplo, é caracterizada por angiogênese. A retinopatia diabética pode ser tratada por liberação de um ou mais fatores anti-angiogênicos quer por via intraocular (por exemplo, no vítreo) ou por via periocular (por exemplo, na região subTenon). Um ou mais fatores neurotróficos também podem ser liberados concomitantemente, quer por via intraocular (por exemplo, por via intravítrea) ou por via periocular.

[000237] A uveíte envolve inflamação. Um ou mais fatores antiinflamatórios podem ser administrados por administração intraocular (por exemplo, câmara vítrea ou anterior) de um vetor de libração da divulgação.

[000238] A retinite pigmentosa, em comparação, é caracterizada por degeneração da retina. Em modalidades representativas, a retinite pigmentosa pode ser tratada por administração intraocular (por exemplo, administração no vítreo) de um vetor de liberação codificando um ou mais fatores neurotróficos.

[000239] A degeneração macular relacionada com a idade envolve tanto angiogênese quanto degeneração da retina. Este distúrbio pode ser tratado por administração dos vetores de liberação da invenção codificando um ou mais fatores neurotróficos por via intraocular (por exemplo, no vítreo) e/ou um ou mais fatores antiangiogênicos por via intraocular ou por via periocular (por exemplo, na região sub-Tenon).

[000240] O glaucoma é caracterizado por aumento da pressão ocular e perda de células ganglionares da retina. Os tratamentos para o glaucoma incluem a administração de um ou mais agentes neuroprotetores que protegem as células contra dano excitotóxico usando os vetores de liberação da invenção. Os agentes referidos incluem antagonistas

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85/120 do N-metil-D-aspartato (NMDA), citocinas, e fatores neurotróficos, liberados por via intraocular, opcionalmente por via intravitreal.

[000241] Em outras modalidades, a presente divulgação pode ser usada para tratar convulsões, por exemplo, para reduzir o início, a incidência ou a gravidade das convulsões. A eficácia de um tratamento terapêutico para convulsões pode ser avaliada por meios comportamentais (por exemplo, estremecimentos, tiques do olho ou da boca) e/ou eletrográficos (a maioria das convulsões têm assinatura de anormalidades eletrográficas). Portanto, a presente invenção também pode ser usada para tratar epilepsia, a qual é marcada por múltiplas convulsões ao longo do tempo.

[000242] Em uma modalidade representativa, somatostatina (ou um fragmento ativo da mesma) é administrada ao cérebro usando um vetor de libração da divulgação para tratar um tumor da pituitária. De acordo com esta modalidade, o vetor de libração codificando somatostatina (ou um fragmento ativo da mesma) é administrado por microinfusão para dentro da pituitária. Do mesmo modo, o tratamento referido pode ser usado para tratar acromegalia (secreção anormal de hormônio do crescimento a partir da pituitária). As sequências de ácidos nucleicos (por exemplo, GenBank Acesso No. J00306) e de aminoácidos (por exemplo, GenBank Acesso No. P01166; contém os peptídeos ativos processados somatostatina-28 e somatostatina-14) de somatostatinas são conhecidas na técnica.

[000243] Em modalidades particulares, o vetor pode compreender um sinal secretor conforme descrito na Patente U.S. No. 7.071.172.

[000244] Em modalidades representativas da divulgação, o vetor do vírus e/ou capsídeo de vírus é administrado ao sistema nervoso central (por exemplo, ao cérebro ou ao olho). O vetor do vírus e/ou capsídeo pode ser introduzido dentro da medula espinhal, do tronco cerebral (medula oblongata, ponte), mesencéfalo (hipotálamo, tálamo, epitála

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86/120 mo, glândula pituitária, substantia nigra, glândula pineal), cerebelo, telencéfalo (corpo estriado, cérebro incluindo os lobos occipital, temporais, parietais e frontal, córtex, gânglios basais, hipocampo e portaamygdala), sistema límbico, neocórtex, corpo estriado, cérebro, e colículo inferior. O vetor do vírus e/ou capsídeo também pode ser administrado em diferentes regiões do olho tais como a retina, a córnea e/ou o nervo ótico.

[000245] O vetor do vírus e/ou capsídeo pode ser liberado para dentro do líquido cefalorraquidiano (por exemplo, por punção lombar) para mais administração dispersa do vetor de liberação. O vetor do vírus e/ou capsídeo pode ser adicionalmente administrado por via intravascular ao sistema nervoso central em situações nas quais a barreira hematoencefálica tenha sido perturbada (por exemplo, tumor cerebral ou enfarte cerebral).

[000246] O vetor do vírus e/ou capsídeo pode ser administrado a uma ou mais regiões desejadas do sistema nervoso central por qualquer via conhecida na técnica, incluindo, mas não limitada a, liberação intracerebroventricular, intracisternal, intraparenquimal, intracranial, intratecal, intraocular, intracerebral, intraventricular, intravenosa (por exemplo, na presença de um açúcar tal como manitol), intranasal, intra-aural, intraocular (por exemplo, intravítrea, sub-retinal, câmara anterior) e periocular (por exemplo, região sub-Tenon) bem como liberação intramuscular com liberação retrógrada para os neurônios motores.

[000247] Em modalidades particulares, o vetor do vírus e/ou capsídeo é administrado em uma formulação líquida por injeção direta (por exemplo, injeção estereotáctica) para a região ou compartimento desejado no sistema nervoso central. Em outras modalidades, o vetor do vírus e/ou capsídeo pode ser provido por aplicação tópica para a região desejada ou por administração intranasal de uma formulação de ae

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87/120 rosol. A administração ao olho pode ser por aplicação tópica de gotículas líquidas. Como uma alternativa adicional, o vetor do vírus e/ou capsídeo podem ser administrados como uma formulação sólida e de lenta liberação (vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 7.201.898).

[000248] Em ainda modalidades adicionais, o vetor do vírus pode ser usado para transporte retrógrado para tratar e/ou prevenir doenças e transtornos envolvendo neurônios motores (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica (ALS); atrofia muscular espinhal (SMA), etc.). Por exemplo, o vetor do vírus pode ser liberado para o tecido muscular a partir do qual pode migrar para dentro dos neurônios.

[000249] Os exemplos que se seguem são incluídos aqui, neste pedido de patente, para fins de ilustração somente, e não se destinam a ser limitantes

EXEMPLOS EXEMPLO 1. DESCOBERTA DE UMA PEGADA NEUROTRÓPICA QUE POSSIBILITA TRANSPORTE DO AAV ATRAVÉS DA BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA

[000250] Os vírus adeno-associados (AAV) são parvovirus não patogênicos compostos por um capsídeo icosaédrico pequeno, de 25 nm que empacota um genoma de DNA de cadeia única de aproximadamente 4,7 kb. Uma ampla gama de sequências de capsídeos do AVV foi isolada a partir de tecidos humanos e de primatas, os quais foram categorizados em várias clades distintas com base na sequência e na diversidade estrutural. Entre estas clades, diferentes sorotipos apresentam amplo tropismo nos níveis de espécie, tecido e celular. Estes diversos fenótipos são determinados pela estrutura do capsídeo. O capsídeo do AVV é montado a partir de 60 subunidades de proteína viral (VP). O monômero VP do núcleo (VP3) tem uma estutura de rolo de geleia, e m barril beta composta por 7 cadeias beta antiparalelas conectadas por regiões de loop interdigitantes. Porções

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88/120 destes loops altamente variáveis são expostas na superfície e definem a topologia do capsídeo do AVV, a qual por sua vez determina o tropismo tecidual, a antigenicidade e o uso de receptores através dos vários sorotipos do AVV. Os resíduos de loop superficiais sobre o capsídeo do AVV são altamente plásticos e suscetíveis à modificação, proporcionando controle sobre a antigenicidade, o perfil de transdução e o tropismo tecidual.

[000251] A primeira etapa no ciclo de vida do AAV é reconhecimento e fixação a receptores de glicano da superfície celular. Estes incluem sulfato de heparano (HS) para AAV2, AAV3 e AAV6, ácido siálico ligado a a2,3- e a2,6-N (Sia) para AAV1, AAV5 e AAV6, ácido siálico ligado a O para AAV4, e galactose (Gal) para AAV9. Secundária à ligação ao glicano, a captação celular de AAV implica correceptores secundários, incluindo vários receptores de fatores de crescimento bem como integrinas. Recentemente, uma proteína transmembrana, KIAA0319L (AAVR) foi identificada como um receptor universal para múltiplos sorotipos do AVV. Estes fatores, junto com padrões de glicosilação tecidual, contribuem para os tropismos teciduais variáveis de diferentes sorotipos do AVV. Particularmente com respeito ao sistema nervoso central, diferentes sorotipos do AVV apresentam um espectro de perfis de transdução e tropismos celulares, dependendo da via de administração. Por exemplo, quando diretamente administrados no sistema nervoso central de camundongos através de ou injeções diretas intraparenquimais ou intralíquido cefalorraquidiano (CSF), os capsídeos do AVV sofrem transporte axonal e disseminação transináptica nas direções anterógrada e/ou retrógrada, dependendo do sorotipo. Além disso, recentemente mostramos que o (glinfático) transporte linfático associado à glia de líquido cefalorraquidiano influencia a disseminação do AAV derntro do parênquima cerebral do camundongo e o clearance do sistema nervoso central.

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[000252] De modo a realizar transferência genética no sistema nervoso central, os vetores do AAV administrados por via intravenosa primeiro devem cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) de modo a ganhar a entrada dentro do cérebro. Composta de firmes junções de células endotelialis junto com end-feet astrocíticos e pericitos associados, a barreira hematoencefálica bloqueia a difusão e o fluxo paracelular de macromoléculas / partículas e regula o transporte de outras moléculas. A maioria dos vírus os quais infectam o cérebro, o fazem através de disrupção ou enfraquecimento da barreira hematoencefálica; no entanto, alguns vírus têm criados estratégias para ganhar entrada dentro do sistema nervoso central por métodos tais como pegando carona dentro de células imunes hospedeiras (por exemplo, o HIV), infectando células endoteliais cerebrais ou infectando os nervos periféricos e explorando o transporte axonal (por exemplo, o vírus da raiva). No caso do AAV, a barreira hematoencefálica previne a entrada da maioria dos sorotipos dentro do cérebro com umas poucas exceções notáveis. Por exemplo, a administração intravascular dos sorotipos do AVV 1-6 e 8 resulta em baixa transdução do sistema nervoso central, ao passo que foi demonstrado que isolados de AAV9, AAVrh.8 e AAVrh.10, entre outros, atravessam de modo eficaz a barreira hematoencefálica em diferentes modelos animais.

[000253] De modo a obter níveis terapêuticos de expressão de transgene no sistema nervoso central, altas doses de vetores (por exemplo, 1 χ 10¹⁴ vg/kg na prova de atrofia muscular espinhal NCT02122952) são frequentemente requeridas. Além da carga associada com o aumento de escala e custos, também foi demonstrado que altas doses de vetores causam efeitos colaterais indesejáveis tais como toxicidade hepática. De modo a melhorar a especificidade / eficiência da transferência genética para o sistema nervoso central e reduzir a dose de vetor eficaz, é necessário um melhor entendimento das

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90/120 características estruturais que permitem que os capsídeos do AVV penetrem na barreira hematoencefálica.

[000254] Para dissecar correlações de estrutura e função para cruzar a barreira hematoencefálica, foi gerada uma biblioteca combinatorial de genes de capsídeos variantes usando somente dois sorotipos AAV1, o qual não atravessa a vasculatura, e AAVrh.10, o qual é conhecido por cruzar de modo eficaz a barreira hematoencefálica. Ao invés de desenvolver novas variantes, foram selecionadas variantes individuais por análises computacionais, filogenéticas e estruturais para triagem adicional em camundongos.

Produção de um painel de capsídeos do AA V quiméricos.

[000255] Uma biblioteca de capsídeos de permutas de domínios AAV1/rh.10 foi gerada através de embaralhamento de DNA. Em resumo, os genes Cap de AAV1 e AAVrh.10 foram fragmentados aleatoriamene por breve digestão por DNase e remontados usando PCR primerless (sem primer) com DNA polimerase Phusion High-Fidelity (NEB Cat no. M0530L) na qual a homologia parcial dos fragmentos curtos (< 400 bp) possibilita o autopriming dos fragmentos. Uma etapa secundária de PCR usando primers conservados específicos flanqueando o gene Cap foi em seguida usada para amplificar a biblioteca de sequências Cap remontadas de comprimento total e simultaneamente inserir sítios de restrição flanqueantes para facilitar a subsequente clonagem dentro de uma estrutura de plasmídeo pTR usada para produção do vírus.

Análises filogenéticas e de sequências

[000256] As sequências de aminoácidos de diferent es isolados de capsídeos do AVV foram alinhadas usando ClustalW e foram geradas árvores filogenéticas usando o pacote de software MEGAv7.0.21. A filogenia foi produzida usando o algoritmo de união de vizinhos e as distâncias entre aminoácidos foram calculadas usando uma correção

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91/120 de Poisson. Foi realizado teste estatístico por bootstrapping com 1.000 replicatas para testar a confiança da análise filogenética e para gerar a árvore de consenso de bootstrap. Ramificações correspondentes a partições reproduzidas em menos de 50% das replicatas de bootstrap são colapsadas. A percentagem de árvores em replicata nas quais taxa associada agrupou junto no teste de bootstrap é apresentada próxima às ramificações. Todos os alinhamentos de sequências foram realizados usando o software Vector NTI Advance 11.5.2 da Invitrogen.

Produção de vírus e títulos

[000257] Foi usado um protocolo de transfecção de plasmídeos triplos atualizado para produzir vetores do AAV recombinantes. Especificamente, os plasmídeos transfectados incluem (i) um plasmídeo auxiliar pXR específico para capsídeos (isto é, pXR1, pXRrh.10, ou vários plasmídeos codificando os vários genes Cap quiméricos usados neste estudo), (ii) o plasmídeo auxiliar adenoviral pXX680, e (iii) ou plasmídeos pTR-CBh-scGFP ou pTR-CBA-Luc (codificando ou um transgene reporter de proteína fluorescente verde (GFP) autocomplementar controlado pelo promotor híbrido de beta actina de galinha (CBh) ou um transgene de luciferase reporter (Luc) controlado pelo promotor de beta actina de galinha (CBA), respectivamente, flanqueado por repetições de terminal (TRs) invertidas derivadas do genoma do AAV2. Vetores virais foram purificados usando ultracentrifugação de gradiente de densidade de iodixanol. Os vetores que empacotam um transgene CBh-scGFP foram em seguida submetidos a permuta de tampão e concentração usando colunas de centrifugação de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa Sartorius Vivaspin2 (F-2731-100 Bioexpress, Kaysville, UT). Os vetores que empacotam um transgene CBA-Luc foram submetidos à permuta de tampão e dessalgamento usando colunas de dessalgamento Zeba Spin

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92/120 (Zeba Spin Desalting Columns), 40K MWCO (Thermo Scientific, Cat no. 87770). Depois de purificação, os títulos de genomas virais foram determinados por meio de PCR quantitativo usando um Roche Lightcycler 480 (Roche Applied Sciences, Pleasanton, CA). Primers de PCR quantitativo foram designados para reconhecerem especificamente as repetições de terminal invertido do AAV2 (forward, 5’- AACATGCTACGCAGAGAGGGAGTGG -3’; (SEQ ID NO: 36) reverso, 5’CATGAGACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG -3’) (SEQ ID NO: 37) (IDT Technologies, Ames IA).

Estudos com animais

[000258] Todos os experimentos com animais foram realizados usando camundongos C57/BL6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade adquiridos dos Jackson Laboratories (BAR Harbor, ME). Estes camundongos foram mantidos e tratados em conformidade com as diretrizes do NIH e conforme aprovado pelo comitê Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da UNC (IACUC, Institutional Animal Care and Use Committee). De modo a investigar a capacidade dos vetores do AAV para cruzar a barreira hematoencefálica e transduzir as populações celulares do sistema nervoso central, os vetores do AAV que empacotam um transgene CBh-scGFP ou 1x PBS (como tratamento simulado) foram administrados por via intravenosa (i.v.) através de injeção na veia da cauda em uma dose de 5 x 10¹¹ vg. Para testar para expressão de transgene reporter GFP, os animais foram sacrificados 21 dias após a injeção com tribromoetanol (Avertin) (0,2 ml de solução a 1,25%) seguido por perfusão transcardial com 30 ml de 1x PBS seguida por 30 ml de paraformaldeído a 4% em PBS. Os tecidos, incluindo o cérebro, o coração e o fígado, foram removidos e pós fixados por 24 h, e foram obtidas seções de 50 pm de espessura para cada tecido usando um micrótomo com lâmina vibratória Leica VT 1200S (Leica Biosystems, IL). As seções de cérebro de camundongo foram

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93/120 em seguida imunocoradas conforme descrito abaixo. Para transdução de luciferase in vivo e experimentos de biodistribuição do genoma viral, os camundongos foram injetados ou com 1x PBS ou com vetores virais que empacotam um transgene de CBA-Luciferase em uma dose de 1 x 10¹¹ vg. Os camundongos foram sacrificados, conforme descrito acima, em 14 dias após a injeção e vários tecidos foram removidos. Para estes experimentos, não foi realizada nenhuma fixação com paraformaldeído a 4% em 1x PBS e ao invés os tecidos foram dissecados e congelados a -80°C antes de usar.

[000259] Para quantificar a expressão de luciferase, os camundongos injetados com 1 x 10¹¹ genomas virais que empacotam um transgene CBA-Luc foram sacrificados em 14 dias após a injeção e os tecidos foram coletados e congelados a -80°C. Os tecidos foram posteriormente descongelados, pesados e lisados adicionando 150 μΙ de tampão de lise passiva 2x (Promega, Madison Wl) antes de lise mecânica usando um instrumento Tissue Lyser II 352 (Qiagen, Valencia, CA) seguida por centrifugação para remover quaisquer detritos de tecido remanescentes. Para medir a expressão do transgene de luciferase, 50 μΙ de sobrenadante de cada lisado foi em seguida carregado para uma placa de teste junto com 50 μΙ de luciferina e foi realizada análise luminométrica usando um luminômetro Victor2 (PerkinElmer, Waltham, MA). As unidades de luz relativa obtidas para cada amostra foram em seguida normalizadas para o peso do tecido de entrada para cada amostra, medido em gramas. Os dados foram grafados e foram realizada análises estatísticas usando um T-teste bicaudal não pareado com correção de Welch bem como ANOVA seguida por teste de múltiplas comparações de Tukey onde indicado. Estas análises estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism 6®.

Processamento dos tecidos e análise histológica

[000260] Para experimentos com camundongos usando empaco

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94/120 tamento de virus de um transgene reporter de GFP, seções coronais cerebrais de flutuantes de 50 pm de espessura foram coradas em placas de 24 cavidades. As seções foram incubadas em tampão de bloqueio contendo 10% de soro de cabra e 1% de Triton X (SigmaAldrich) em 1x PBS por 1 hora em temperatura ambiente. As seções foram em seguida incubadas a 4°C de um dia para o outro com um anticorpo monoclonal primário de coelho α-GFP (Life-Technologies-G10, 362 1:750) diluído em tampão de bloqueio. No dia seguinte, foram realizadas três lavagens de 10 minutos com 1x PBS. A análise histoquímica subsequente da expressão de GFP foi realizada usando um kit Vectastain ABC (Rabbit IgG PK-4001 kit, Vector biolabs, Burlingame, CA) e os tecidos foram montados sobre lâminas de microscopia. As seções imunocoradas foram estudadas por imagens digitalmente em campo brilhante (objetiva de 20x) usando um instrumento Aperio ScanScope XT (Aperio Technologies, Vista, CA) pelo UNC Translational Pathology Laboratory e foram obtidas imagens usando Leica eSlide Manager (software de armazenamento de imagens e manejo de dados centralizados) e analisadas usando Aperio ImageScope e o software WebViewer. As quantificações foram calculadas contando o número de células GFP+ neuronais ou gliais, determinado com base na morfologia, por 50 pm de seção cerebral coronal. Os dados foram grafados e foram realizadas análises estatísticas conforme resumido acima. Regiões cerebrais específicas foram identificadas com base em comparação com uma referência de cérebro de camundongo coronal obtida do Allen Mouse Brain Atlas. Para testar para expressão de GFP no coração e no fígado, os tecidos foram corados para GFP com o anticorpo primário anti-GFP conforme descrito acima; no entanto, um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado a Alexa-488 foi usado como o anticorpo secundário em uma diluição de 1:500 (Abeam anticoelho - 96.883). GFP imunocorada nestes tecidos foi em seguida es

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95/120 tudada por imagens usando um sistema de imagiologia celular de epifluorescência EVOS FL (AMC/Life Technologies) usando o cubo de luz GFP (excitação 470 nm, emissão 510 nm). Foram realizadas análises estatísticas conforme resumido anteriormente.

Biodistribuição de genomas vetoriais

[000261] Os estudos com animais foram realizados conforme descrito acima. Em 21 dias após a injeção, os camundongos foram sacrificados e os tecidos foram congelados a -80°C. Em seguida os tecidos foram descongelados e os genomas virais foram extraídos dos lisados de tecido usando o kit DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Em seguida foram determinados os números de cópias de genomeas virais para cada tecido usando PCR quantitative com primers específios para o transgene de luciferase (forward, 5'- AAAAGCACTCTGATTGACAAATAC-3' (SEQ ID NO: 38); e reverso, 5'CCTTCGCTTCAAAAAATGGAAC-3' (SEQ ID NO: 39)). Estes números de cópias dos genomas virais foram em seguida normalizados para o gene housekeeping lamina B2 de camundongo usando os primers (forward, 5'-GGACCCAAGGACTACCTCAAGGG-3' (SEQ ID NO: 40); e reverso, 5'-AGGGCACCTCCATCTCGGAAAC -3' (SEQ ID NO: 41)). A biodistribuição de genomas virais é representada como a proporção de genomas de vetor por célula recuperados para cada tecido. Os dados são grafados e foram realizadas análises estatísticas conforme descrito anteriormente.

Modelagem molecular

[000262] Foram usadas coordenadas previamente publicadas (PDB ID, 3NG9) para gerar estruturas tridimensionais do trímero do AAV1 VP3 / eixo de simetria tripla. Modelos de homologia de AAVrh.10 e várias estruturas dos capsídeos quiméricos AAV1/rh.10 foram obtidos usando o servidor SWISS-Model (swissmodel.exDasv.org), com a estrutura cristalina de AAV8 VP3 (PDB ID, 2QA0) usada como um mo

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96/120 delo e foi gerado um alinhamento baseado na estrutura usando a aplicação de correspondência de estrutura secundária (SSM) no software WinCoot, com o monômero AAV1 VP3 (PDB ID 3NG9) sendo usado como um modelo. Os trímeros VP3 / eixos de simetria tripla, trímero dímeros VP3 / eixos de simetria dupla, pentâmeros VP3 / eixos de simetria quintuple, e capsídeos completos foram gerados usando a utilidade do gerador de oligômero VIPERd (vl· Derdb.scriDDs.edu/oliqomer multi.php). Representações renderizadas superficiais destes modelos foram visualizadas usando PyMOL (o PyMOL Molecular Graphics System, SchrÕdinger LLC, www.pymol.org)· Projeções de mapas estereográficos da superfície do capsídeo AAV1RX salientando resíduos de aminoácidos expostos à superfície dentro da pegada neurotrópica derivada do AAVrh.10 foram geradas usando o software RIVEM (Radial Interpretation of Viral Electron Density Maps).

Geração de uma biblioteca de permuta de domínios AAV1/rh. 10 e isolamento de variantes de capsídeos quiméricos

[000263] Foi realizada uma análise comparativa de diferentes domínios de capsídeos para determinar correlações de estrutura e função para atravessar a barreira hematoencefálica. Foi gerada uma biblioteca de permutas de domínios AAV1/rh.1O através de embaralhamento de DNA. Foram selecionados AAV1 e AAVrh.10 como sequências de capsídeos parentais para embaralhamento de DNA uma vez que diferem acentuadamente em suas capacidades para cruzar a barreira hematoencefálica e devido à homologia de sequência (85%) compartilhada por seus genes do capsídeo (Cap). Trinta e seis sequências de capsídeos quiméricos foram em seguida isoladas clonalmente e sequenciadas. As variantes geradas a partir desta biblioteca apresentaram substancial diversidade no nível de DNA e de aminoácidos. Alinhamento de sequência revelou um espectro de permutas de

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97/120 domínios, as quais foram então organizadas de modo a aumentar a homologia de AAV1 para AAVrh.10 (FIG. 4A, de cima para baixo). Este painel de clones foi adicionalmente caracterizado filogeneticamente construindo uma árvore de união de vizinhos, a qual amplamente categorizou estas variantes como ou mais semelhantes a AAV1 (Clade A) ou mais semelhantes a AAVrh.10 (Clade E) (FIG. 4B). Em seguida foi usada produção de vetor em pequena escala para estabelecer títulos relativos para excluir capsídeos defeituosos na montagem ou no empacotamento do estudo. Foram gerados modelos estruturais, com base na homologia, dos trímeros de capsídeos quiméricos parentais e representativos salientando domínios / resíduos chave da superfície no eixo de simetria tripla (FIG. 4C) para estreitar mais a lista de variantes de capsídeos quiméricos para triagen inicial in vivo. Dez variantes de capsídeos quiméricos foram selecionadas com base em análises estruturais, das quais seis produziram vetores recombinantes (que empacotam cassetes de transgene scGFP ou ssLuc) em títulos similares aos vetores de AAV1 e AAVrh.10 parentais. Estas variantes foram em seguida tríadas adicionalmente.

Triagem in vivo identifica dois capsídeos quiméricos AAV1/rh. 10 capazes de cruzar a barreira hematoencefálica depois de administração intravenosa em camundongos adultos

[000264] Foi em seguida testado se o painel selecionado de variantes de capsídeos diferiría em sua capacidade para cruzar a barreira hematoencefálica e transduzir o sistema nervoso central depois de administração I.V. É importante notar que nossa abordagem não envolve evolução direcionada, uma vez que esta estratégia geralmente é aplicável para a seleção de capsídeos ótimos e menos convenientes para o estudo de relações de estrutura e função. Foram injetados camundongos de 6 a 8 semanas de idade com uma dose de 5 x 10¹¹genomas virais (vg) por camundongo de AAV1, AAVrh.10, ou um de

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98/120 seis vetores de AAV quiméricos diferentes que empacotam um cassete reporter CBh-GFP autocomplementar através de injeção na veia da cauda.

[000265] Neurônios positivos para GFP no córtex cerebral foram manualmente contados, quantificados e foi feita a média através de múltiplas seções cerebrais coronais por camundongo. n = 2 para AAV1; n = 3 para AAV1R6 e AAV1R7 (FIG. 1). Imunocoloração de seções cerebrais coronais em três semanas após a injeção revelaram que a transdução do AAV1 no córtex cerebral foi limitada à vasculatura ao passo que AAVrh.10 demonstrou robusta transdução de várias populações celulares, incluindo os neurônios, células da glia e endoteliais, conforme determinado morfologicamente (FIG. 2, FIG. 5). Avaliação morfológica posterior de células GFP+ indica fenótipos diferentes para as variantes quiméricas. AAV1R19.1 e AAV1R20 transduzem predominantemente células endoteliais microvasculares no córtex, enquanto baixa a modesta transdução de células neuronais e gliais é evidente para os vetores AAV1R8 e AAV1 R19d (FIG. 5). Em contraste, AAV1R6 e AAV1R7 demonstram robusta transdução de neurônios corticais com modesta transdução da glia e pouca, ou nenhuma, transdução da vasculatura dentro do córtex. São mostradas imagens representativas da área somatossensorial do córtex em alta ampliação. Uma tendência similar para estas quimeras foi observada de maneira consistente através de outras regiões do cérebro (FIG. 6). Estas observações indicam que os capsídeos quiméricos AAV1R6 e AAV1R7 provavelmente possuem a capacidade para cruzar a barreira hematoencefálica, similar ao vetor parental AAVrh.10, embora o mecanismo seja desconhecido. No entanto, diferentemente de qualquer parental, AAV1 ou AAVrh.10, nenhuma quimera transduz de modo eficaz a vasculatura.

Capsídeos quiméricos AAV1R6 e AAV1R7 liberados por via intravenosa cruzam a barreira hematoencefálica e transduzem os neurônios

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99/120 preferencial mente por todo o cérebro.

[000266] Foram em seguida caracterizados adicionalmente os perfis de transdução destas variantes através de múltiplas estruturas funcionalmente relevantes do cérebro. Para cada uma das regiões cerebrais discutidas abaixo, foram obtidas imagens representativas em maior ampliação de seções coronais do cérebro de camundongo imunocoradas para GFP e escaneadas em campo brilhante em ampliação de 20x. Além disso, dados quantitativos para transdução neuronal e glial para cada região foram determinados contando as células neuronais e gliais GFP+, respectivamente, com base na morfologia celular.

[000267] Córtex Cerebral. AAVrh.10 apresenta robusta transdução de células endoteliais neuronais, gliais e vasculares por todo o córtex e, no caso de AAV1 liberado por via intravascular, foi observada transdução vascular acompanhada pela ausência de expressão neuronal e baixos níveis de expressão na glia (FIG. 7 e FIG. 8). Foi também observado que os vetores AAV1R6 e AAV1R7 (AAV1R6/7) administrados por via intravenosa mediam robusta expressão de GFP nos neurônios corticais e reduzida expressão na glia por todas as áreas amigdalar, piriforme, entorrinal, de associação temporal, auditiva, somatossensorial, motora, parietal posterior e retroesplenial do córtex, mas variadas em níveis consistentemente tendendo através das seções analisadas. Imagens representativas de regiões corticais transduzidas são mostradas para o córtex motor (FIG. 7A) e a área somatossensoria do córtex (FIG. 7B). Além disso, AAV1R6/7 parecem apresentar um tropismo celular preferencialmente neuronal através de todo o córtex, apresentando moderada transdução glial e transdução vascular notavelmente reduzida. Este perfil está em distinto contraste com o AAV1 vasculotrópico bem como o AAVrh.10, o qual transduz células endoteliais neuronais, gliais, e vasculares com alta eficiência (FIG. 7A e 7B). Apesar de que AAV1R6/7 mediam robusta

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100/120 expressão neuronal e moderada glial por todo o córtex, seus níveis de expressão são não obstante menores do que os obtidos pelo AAVrh.10. Estas tendências são corroboradas por quantificação de nossa análise morfológica de células GFP+ (FIG. 8A e 8B), as quais apresentam uma diferença estatisticamente significativa na transdução cortical em relação ao AAV1 para AAVrh.10, AAV1R6 e AAV1R7. Uma última diferença a notar é que a transdução de AAVrh.10 através do córtex tem uma tendência a ser concentrada nas periferias do tecido, em torno das camadas corticais 1 a 3, particularmente dentro das áreas corticais retroesplenial, motora, somatossensorial e visual. Apesar disto poder ser atribuído a imunocoloração diferencial, foi observado este fenômeno com alta consistência através das seções de AAVrh.10 coradas em nossa análise. Esta tendência não se mantém para AAV1R6/7, os quais parecem mediar uma expressão distribuída mais uniformemente através das camadas corticais.

[000268] Hipocampo. Depois de liberação intravenosa, os vetores quiméricos AAV1R6/7 parecem mediar robusta expressão de GFP nos neurônios por todo o hipocampo, bilateralmente através dos hemisférios cerebrais. Neurônios do hipocampo GFP+ são observados dentro das camadas piramidais CA1, CA2 e CA3 (FIG. 7C, mostradas CA2 e CA1 parcial). AAV1R6/7 também parecem ser eficazes na transdução de neurônios dentro do giro dentado, apresentando um grande número de neurônios GFP+ os quais parecem ser células granulares com base na morfologia (FIG. 7D). O perfil de transdução neuronal apresentado por AAV1R6/7 no hipocampo é similar ao visto para AAVrh.10. No entanto, em contraste com AAVrh.10, AAV1R6/7 não parece transduzir quer a glia ou células endoteliais em qualquer região em qualquer nível apreciável, sem nenhuma diferença significativa em células gliais GFP+ observada entre AAV1 e AAV1R6/7 (FIG. 8C e 8D). Novamente a transdução do AAV1 observada no hipocam

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101/120 po é limitada à vasculatura. Além disso, estas tendências qualitativas são corroboradas por dados quantitativos para transdução de células neuronais e gliais no hipocampo (FIG. 8C) e no giro dentado (FIG. 8D). [000269] Tálamo. Neurônios GFP+ foram detectados no tálamo para AAV1R6/7 em níveis comparáveis a AAVrh.10 (FIG. 7E). Além disso, AAV1R6/7 demonstram mínima transdução do endotélio e níveis dramaticamente reduidos de transdução glial no tálamo em comparação com AAVrh.10. Estas tendências são adicionalmente corroboradas por dados quantitativos (FIG. 8E) nos quais a transdução de neurônios talâmicos foi considerada significativamente diferente para AAVrh.10, AAV1R6 e AAV1R7, em relação a AAV1. De modo contrário, não foi vista nenhuma diferença significativa para transdução glial talâmica para AAV1R6/7 em relação a AAV1.

[000270] Hipotálamo. Embora um tanto variável, foram observados níveis consistentemente baixos de expressão de GFP, independente do tipo celular, dentro do hipotálamo para vetores parentais e quiméricos quando administrados sistemicamente (FIG. 7F). Foi observada variação nos níveis de transdução neuronal no hipotálamo para AAVrh.10, revelando números altos bem como baixos de neurônios GFP+ entre os camundongos. Este perfil de transdução é ilustrado pelo desvio mostrado para transdução de AAVrh.10 em nossos dados quantitativos (FIG. 8F). AAV1 apresenta moderada transdução hipotalâmica que é restrita à vasculatura. Os vetores AAV1R6/7 demonstram baixos números de células gliais e neurônios GFP+ no hipotálamo, e um pequeno número de células endoteliais GFP+ (FIG. 7F e FIG.8F).

[000271] Corpo estriado. AAV1R6/7 transduzem neurônios no corpo estriado (especificamente, o putamen caudado) tão eficazmente quanto AAVrh.10 (FIG. 7G), conforme corroborado adicionalmente opr nossos dados quantitativos demonstrando uma diferença significativa para

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102/120 cada um em relação ao AAV1; no entanto, estes vetores transduzem células gliais ~2 vezes menos e números menores de células endoteliais no corpo estriado (FIG. 8G) apesar de alguma variação observada. [000272] Amígdala. Os perfis de transdução amigdalar para AAV1R6/7 apresentam robusta expressão de GFP neuronal, significativamente diferente em comparação com AAV1. Foram detectadas poucas células gliais GFP+, as quais não foram significativamente diferentes em comparação com AAV1 (FIG. 7H e FIG. 8H), e mal foram observadas células endoteliais GFP+ detectáveis, de modo similar a outras regiões cerebrais tais como o corpo estriado e o tálamo.

[000273] Tomadas juntas, a avaliação morfológica de regiões cerebrais imunocoradas derivadas de camundongos depois de liberação intravenosa de AAV1R6 e AAV1R7 demonstra transdução neuronal robusta e seletiva comparável com o AAVrh.10 parental. Além disso, estas quimeras apresentam reduzida transdução glial e sua capacidade para transduzir as células endoteliais da microvasculatura cerebral parece diminuída. Além disso, estes resultados parecem ser consistentes através de várias regiões cerebrais, com a exceção do hipotálamo, onde são observados baixos níveis de transdução em geral.

AAV1R6 e AAV1R7 são de-targeted do fígado enquanto retendo perfis de transdução cardíaca parentais

[000274] Foi analisada a transdução relativa cardíaca e hepática destas variantes em comparação com sorotipos parentais por imunocoloração de seções cardíacas e hepáticas. Camundongos BL6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram administrados sistemicamente através de injeções na veia da cauda com uma dose de 5 x 10¹¹vg de vetores que empacotam um promotor de beta actina de galinha híbrido (CBh) ligado a uma sequência codificante (CBh-scGFP) de proteína fluorescente verde (GFP) (ou AAV1, AAV1R6 ou AAV1R7) ou

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103/120 com PBS como um controle negativo. Os camundongos foram sacrificados 21 dias após a injeção e os tecidos foram coletados, fixados, e seccionados. Foi usada microscopia para visualizar a transdução de GFP reporter. A expressão de GFP foi quantificada pela média da fluorescência relativa para múltiplas imagens por camundongo usando o software ImageJ. n = 1 para pseudo, n = 2 para AAV1 e n = 3 para AAV1R6 e AAV1R7.

[000275] Conforme mostrado na FIG 10, ambos os vetores quiméricos demonstram níveis comparáveis de expressão de GFP no coração em relação aos sorotipos parentais, AAV1 e AAVrh.10, sem diferença significativa encontrada para AAVrh.10, AAV1R6 ou AAV1R7, em relação a AAV1; no entanto, os níveis de expressão de AAVrh.10 no tecido cardíaco mostraram substancial variação entre os camundongos (FIG. 10Ae 10B). No fígado, AAV1 demonstrou níveis de transdução moderados ao passo que AAVrh.10 teve performance excepcionalmente boa, demonstrando uma transdução logaritmamente maior. Em contraste, AAV1R6 e AAV1R7 mediaram expressão de GFP desprezível no fígado em níveis de fundo comparáveis a camundongos pseudo-tratados (FIG. 10B) que foram significativamente reduzidos em relação a AAVrh.10. Portanto, foi concluído que AAV1R6 e AAV1R7 são de-targeted do fígado em relação a seus sorotipos parentais.

[000276] Separadamente, vetores do AAV que empacotam um promotes de beta actina de galinha (CBA) ligado a uma sequência codificante de luciferase para produzir um transgene de CBA-luciferase foram administrados a camundongos C57/BI6 através de injeção na veia da cauda em uma dose de 1 x 10¹¹ vg. Os camundongos foram sacrificados em 14 dias após a injeção, os tecidos foram coletados, picados, lisados e foram realizados ensaios de luciferase para detectar os níveis de transdução relativa para os tecidos cerebral, cardíaco, hepático, e

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104/120 da medula espinhal. Os dados foram normalizados como unidades de luz relativas por grama de tecido. No cérebro, AAV1R6, AAV1R7 e AAV1RX apresentam níveis de transdução consideráveis, apesar de não tão elevados quanto AAVrh.10 (FIG. 3). Os capsídeos quiméricos adicionalmente apresentam níveis de transdução comparáveis aos capsídeos parentais AAV1 e AAVrh.10 no coração. Na medula espinhal, os níveis de transdução para as quimeras parecem ser intermediários entre os parentais. De maneira marcante, estes dados adicionalmente demonstram que AAV1R6, AAV1R7 e AAV1RX são todos detargeted do fígado. N = 3.

Análise estrutural do capsídeo quimérico AAV1R6 identifica três domínios potenciais de AAVrh. 10 que podem permitir cruzar a barreira hematoence[álica

[000277] Análise de sequência revelou que AAV1R6 é 97 a 98% idêntico a AAV1 com 18 resíduos de aminoácidos únicos derivados de AAVrh.10. AAV1R7 também é em grande parte idêntico a AAV1, mas com um total de 22 resíduos derivados de AAVrh.10, incluindo os 18 presentes em AAV1R6. Dos 4 resíduos adicionais únicos para AAV1R7, dois estão localizados dentro da região N-terminal única VP1 (VP1u) (1891, 206A) e os outros dois estão localizados na região N-terminal VP3 enterrada (224S e 225S). Como estes resíduos não estão expostos sobre a superfície do capsídeo e como os dados in vivo sugerem que os perfis de transdução apresentados por AAV1R6 e AAV1R7 são equivalentes (FIG. 7 e 8), foi excluído AAV1R7 do restante de análises e focalizado sobre AAV1R6 somente.

[000278] AAV1R6 possui 3 trechos de resíduo não consecutivos derivados da cepa parental AAVrh.10. O primeiro grupo de resíduos (grupo i) inclui três aminoácidos (148P, 152R e 153S) dentro da região VP1u (FIG. 9A). Especificamente, um resíduo está localizado adjacente à região básica 1 (BR1), a qual contém o primeiro sinal de locaPetição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 279/335

105/120 lização nuclear (NLS) de VP1. Além disso, o grupo i contém dois resíduos (158T e 163K) também próximos à NLS localizada dentro da região N-terminal VP2 (FIG. 9A). Conforme mencionado anteriormente, estes resíduos não são expostos na superfície e ao invés permanecem internalizados dentro do capsídeo até posteroirmente na via de tráfico intracelular.

[000279] O segundo grupo de resíduos derivados de AAVrh.10 sobre AAV1R6 (grupo ii) consiste em 8 aminoácidos compreendendo o loop BC, localizado dentro da região variávle I (VR-I) (FIG. 9A e 9B). Estes resíduos estão expostos sobre a superfície do capsídeo na base das protrusões no eixo de simetria tripla (FIG. 9D e 9F) e também estão localizados para a depressão no eixo de simetria dupla (FIG. 9C e 9F). Também é importante notar que este grupo de resíduos de aminoácidos sobre AAVrh.10 é substituído com resíduos AAV1 nos capsídeos quiméricos AAV1R8/19/20 que são incapazes de penetrar no sistema nervoso central depois de administração sistêmica.

[000280] O terceiro grupo de resíduos derivados de AAVrh.10 presentes em AAV1R6 (grupo iii) inclui um total de 6 aminoácidos. Quatro destes resíduos (328Q, 330E, 332T e 333K) estão localizados em VRII, dentro do loop DE, o qual contribui para a formação do poro no eixo de simetria quintuple (FIG. 9A, 9B, 9E, 9F). Os dois últimos resíduos remanescentes dentro deste grupo (343I e 347T) estão localizados dentro da cadeia β E, posicionada dentro do interior do capsídeo (FIG. 9A e 9B). Embora estes resíduos difiram entre AAV1 e AAVrh.10, deve ser notado que são relativamente conservados entre diferentes sorotipos do AVV.

Esquema racional de AAV1RX, um capsídeo quimérico com uma pegada mínima de AA Vrh. 10 para cruzar a barreira hematoencefálica [000281] Usando uma abordagem racional, foi estreitado o número mínimo de resíduos de aminoácidos derivados de AAVrh.10 na pega

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106/120 da 1R6 que permitem cruzar a barreira hematoencefálica e conferem tropismo para o sistema nervoso central. Primeiro foram excluídos quaisquer aminoácidos que não estavam expostos sobre a superfície do capsídeo, eliminando trechos de resíduos localizados dentro das regiões N-terminais VP1/2 da sequência de capsídeo (148P, 152R, 153S, 158T e 163K). Usando o mesmo raciocínio, foram também excluídos resíduos dentro da cadeia β conservada E (343I e 347T) bem como os resíduos residindo dentro de VR-II, que é o loop de formação de poro conectando as cadeias β D e E (328Q, 330E, 332T e 333K). Através desta abordagem, a pegada contendo 8 aminoácidos (263N, 264G, 265T, 266S, 268G (uma inserção em relação à sequência do AAV1), 269S, 270T e 274T) encontrada dentro de VR-I, o loop ligando as cadeias β B e C, em AAV1R6 foi escolhida para avaliação posterior (FIG. 11A e 11B). Estes resíduos expostos à superfície estão localizados próximos à depressão no eixo de simetria dupla (FIG. 11Ce11F) ena base das protrusões triplas (FIG. 11D e 11F). A projeção de mapa estereográfico de resíduos expostos à superfície no eixo de simetria tripla salienta a orientação topológica destes 8 resíduos em relação aos aminoácidos em torno na superfície do capsídeo (FIG. 11G). Conforme mencionado anteriormente, foi também levado em conta ue estes aminoácidos estavam ausentes nas variantes AAV1R8/19/20 que foram incapazes de transduzir o parênquima cerebral depois de administração sistêmica.

[000282] Foi em seguida produzido um capsídeo quimérico enxertando os 8 resíduos de aminoácido de AAVrh.10 sobre o sorotipo AAV1, nomeando esta quimera AAV1RX. Foram administrados camundongos C57/BI6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade com vetores AAV1 RX-CBh-scGFP em uma dose de 5 x 10^ vg por camundongo por injeção da veia da cauda. A expressão de GFP reporter no cérebro foi avaliada por imunocoloração em 21 dias após a injeção. Conforme

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107/120 visto na FIG. 11H, AAV1RX transduz neurônios dentro do córtex motor e neurônios corticais através de todo o córtex enquanto demonstrando limitada transdução da glia e reduzida transdução vascular, conforme visto anteriormente com os capsídeos quiméricos AAV1R6 e AAV1R7. Continuando esta tendência, numerosos neurônios piramidais GFP+ são observados no hipocampo junto com uma abundância de células granulares GFP+ no giro dentado. Notavelmente, células gliais e endoteliais GFP+ nestas regiões estão em grande parte ausentes. No tálamo, AAV1RX demonstra robusta transdução neuronal em níveis comparáveis a AAV1R6 e AAV1R7 com modesta transdução de células gliais e endoteliais, embora em níveis maiores do que para outras regiões cerebrais. No hipotálamo, os neurônios GFP+ são esparsos e são observadas poucas células endoteliais gliais e vasculares GFP+. Por último, o perfil de transdução neuronal preferencialmente apresentado por AAV1RX também é visto dentro do corpo esfriado (especificamente, o putamen caudado) e na amígdala (FIG. 11H). Análises quantitativas destas regiões cerebrais e comparaçõçes com as vistas para AAV1, AAVrh.10 e os vetores quiméricos AAV1R6 e AAV1R7 sugerem que esta pegada mínima de 8 resíduos de aminoácidos de AAVrh.10 é crucial para cruzar a barreira hematoencefálica (FIG. 13).

AAV1R6, AAV1R7 e AAV1RX mediam baixos níveis de transdução e biodistribuição nos tecidos periféricos.

[000283] De modo a realizar uma análise comparativa de diferentes capsídeos quiméricos com sorotipos parentais, camundongos C57/BI6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram injetados através da veia da cauda com ou vetores AAV1, AAVrh.10, AAV1R6, AAV1R7 ou AAV1RX que empacotam um transgene reporter de luciferase de cadeia única controlado por um promotor de beta actina de galinha (ssCBA-Luc) em uma dose de 1 x 10^ vg por animal. Em 2 semanas após a injeção, os camundongos foram sacrificados e os tecidos foram

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108/120 coletados. Foram realizados ensaios da atividade de luciferase sobre lisados teciduais bem como análises de qPCR para determinar a biodistribuição vetorial (FIG. 12). Todos os três vetores quiméricos mediam maior expressão do transgene de luciferase e um aumento correspondente em cópias do genoma viral, para cada um, é observado dentro do cérebro em comparação com AAV1 (FIG. 12A e 12B). No entanto, seus níveis de expressão de transgene e números de cópias do genoma viral foram ~2 a 3 vezes menores no cérebro em comparação com AAVrh.10, os quais foram todos considerados estatisticamente significantes, com a exceção da biodistribuição de AV1RX (FIG. 12A e 12B). Foram observados níveis de transdução e números de cópias do genoma viral similares para AAV1R6, AAV1R7 e AAV1 RX no coração, comparáveis aos vistos para AAV1, apesar de alguma variação nos níveis de transdução cardíaca observados para AAV1RX (FIG. 12C e 12D). AAVrh.10 media expressão de luciferase cardíaca ~2 a 4 vezes maior e correspondentemente cópias do genoma viral ~2 vezes maior no coração em comparação com os outros vetores (FIG. 12C e 12D). Conforme demonstrado por outros grupos, AAVrh.10 apresentou níveis de expressão de transgene da luciferase várias vezes maiores e consistentemente elevadas cópias do genoma viral no fígado. Em contraste, foram detectados níveis baixos para de fundo de expressão de luciferase e cópias do genoma viral significativamente reduzidas no fígado para AAV1, 1R6, 1R7 e 1 RX (FIG. 12E e 12F). É digno de nota mencionar que foram detectadas expressão de luciferase e uma tendência correspondente em números de cópias de genomas virais para AAVrh.10 no rim (FIG. 12G e 12H). Embora os três vetores quiméricos tenham apresentado níveis de números de cópias do genoma viral similares, estava ausente a expressão de luciferase no rim. Tomados em conjunto, estes dados parecem sugerir que os vetores quiméricos AAV1R6, 1R7 e 1 RX são de-targeted do fígado e podem ser clareados

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109/120 da circulação sanguínea pelo rim.

[000284] Depois de administração intravenosa, foi identificado um subgrupo de capsídeos quiméricos capazes de cruzar a barreira hematoencefálica e transduzir de modo eficaz o sistema nervoso central. Foi visto que a capacidade para cruzar a barreira hematoencefálica se correlaciona inversamente com a infectividade na cultura celular e a sensibilidade para a neuraminidase. Modelagem estrutural e análise de mapa adicionalmente ajudaram a identificar vários aglometados chave de resíduos em AAVrh.10 que permitem o transporte através da vasculatura cerebral e transdução neuronal disseminada. Subsequentemente, foi estreitado mais o tamanho desta pegada através de uma abordagem de mutagênese racional, a qual foi em seguida validada funcionalmente in vivo. Em conclusão, foi identificada uma pegada mínima do AAVrh.10 a qual, quando enxertada sobre outras cepas do AAV, permite o transporte através da barreira hematoencefálica e possibilita um perfil de transdução do sistema nervoso central mais direcionado em comparação com o AAVrh.10. Além disso, os capsídeos resultantes são detargeted da vasculatura cerebral, do fígado e out4ros tecidos periféricos. O mapeamento funcional desta nova pegada neurotrópica proporciona um mapara para a engenharia de capsídeos do AVV sintéticos para transporte genético eficaz do sistema nervoso central com um perfil de segurança aprimorado.

[000285] AAV1 e AAVrh.10, os sorotipos parentais usados para gerar a biblioteca de capsídeos quiméricos neste estudo, são ambos isolados de primatas não humanos que pertencem a duas clades diferentes - AAV1 pertence à clade A ao passo que AAVrh.10 está dentro da Clade E. Apesar da distância evolucionária entre os mesmos, eles compartilham -85% de homologia de sequência entre seus genes Cap. AAV1 é conhecido por reconhecer ácido siálico ligado a N (Sia) e os resíduos chave compondo a pegada de reconhecimento de Sia so

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110/120 bre o capsídeo AAV1 foram recentemente reportados. O estudo corrente identificou 262N, 263G, 264T, 265S, 267G, 268S, 269T e 273T como resíduos chave sobre o capsídeo quimérico AAV1RX, derivado de AAVrh.10, que são essenciais para cruzar a barreira hematoencefálica. Apesar de nenhum dos resíduos de contato de Sia para AAV1 estarem localizados dentro da pegada quimérica 1RX, os átomos de oxigênio da carbonila da estrutura dos resíduos S268, D271, e N272 têm sido implicados em possivelmente estabilizar interações de capsídeo-glicano e aumentar a afinidade de ligação a Sia. Além disso, resíduos nesta posição (D271 e N272) estão localizados dentro da pegada de ligação a galactose sobre AAV9. Portanto, o presente estudo corrobora a noção de que resíduos dentro de VR-I são cruciais.

[000286] O alinhamento das sequências de VP3 de isolados de AAV naturais revels que os 8 resíduos de aminoácidos que conferem o fenótipo do sistema nervoso central para AAV1RX são conservados em AAVrh.8 e AAVrh.39, outros capsídeos neurotrópicos na Clade E (FIG. 14). De modo similar, AAV8 e AAVrh.43, também localizados dentro da Clade E, demonstram a capacidade para cruzar a barreira hematoencefálica, embora de modo menos eficaz. Ambos possuem 7 dos 8 resíduos nesta pegada; portanto, a introdução da pegada completa sobre estes capsídeos provavelmente vai reforçaro sua capacidade para cruzar a barreira hematoencefálica.

[000287] Fenotipicamente, AAV1 e AAVrh.10 diferem noravelmente em sua capacidade para cruzar a barreira hematoencefálica e transduzir os neurônios e a glia no cérebro. Qunado liberado por via intravenosa, AAV1 demonstra captação preferencial e transdução em células endoteliais vasculares. Em contraste, AAVrh.10 parece não somente ser captado por e transduzir células endoteliais vasculares, mas também atravessar a vasculaturea e transduzir o tecido subjacente, tal como o sistema nervoso central ou o músculo esquelético. O presente

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111/120 estudo identifica um conjunto mínimo de resíduos sobre o capsídeo AAVrh.10 que confere parcialmente estes traços para capsídeos AAV1. Embora esta pegada mínima sobre a quimera AAV1RX pareça essencial para atravessar a barreira hematoencefálica e transduzir os neurônios, a transdução nos tecidos periféricos, tais como o fígado, é notavelmente reduzida, enquanto a expressão cardíaca permanece similar à do AAV1. Estas diferenças sugerem que outros domínios estruturais sobre o capsídeo AAVrh.10 podem ter um papel em conferir um perfil de transdução sistêmica. Com respeito ao parênquima cerebral, é importante notar que depois de entrar no sistema nervoso central, o perfil de transdução pós-entrada do AAV1RX é preferencialmente neuronal com reduzida transdução glial em comparação com o AAVrh.10. Isto provavelmente pode ser atribuído ao fato de que a maior parte do capsídeo é derivada de AAV1, o qual é conhecido por mediar uma transdução preferencialmente neuronal depois de injeções intracerebroventriculares. Também é possível que o mecanismo desconhecido pelo qual 1 RX cruza a barreira hematoencefálica medie captação neuronal preferencial ou que motivos / resíduos de aminoácidos adicionais sobre o capsídeo AAVrh.10 possam mediar etapas pós-entrada na transdução glial.

[000288] De uma perspectiva clínica, capsídeos que podem atravessar a barreira hematoencefálica, preferencialmente transduzem neurônios dentro do cérebro e que são simultaneamente de-targeted do fígado podem demonstrar um perfil de segurança aprimorado para aplicações de transferência de gene direcionadas para o sistema nervoso central a partir de uma via sistêmica de administração. A captação de vetor reduzida nos órgãos periféricos, particularmente no fígado, pode reduzir a potencial ameaça de hepatotoxicidade, conforme evidenciado pela elevação transitória nas transaminases no soro do paciente depois de injeção sistêmica de alguns sorotipos do AVV.

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[000289] Os vetores AAV1R6/7/X podem ser amplamente usados para transferência genética global no sistema nervoso central e em particular, para o desenvolvimento de estratégias de terapia genética para tratar transtornos neurológicos tais como a Ataxia de Friedreich ou atrofia muscular espinhal.

Tabela 1.

	Número de Acesso no Gen- Bank		Número de Acesso no GenBank		Número de Acesso no GenBank
Genomas Completos		Hu S17	AY695376	Hu66	AY530626
Vírus adenoassociados 1	NC_002077, AF063497	Hu T88	AY695375	Hu42	AY530605
Vírus adenoassociados 2	NC_001401	Hu T71	AY695374	Hu67	AY530627
Vírus adenoassociados 3	NC_001729	Hu T70	AY695373	Hu40	AY530603
Vírus adenoassociados 3B	NC_001863	Hu T40	AY695372	Hu41	AY530604
Vírus adenoassociados 4	NC_001829	Hu T32	AY695371	Hu37	AY530600
Vírus adenoassociados 5	Y18065, AF085716	Hu T17	AY695370	Rh40	AY530559
Vírus adenoassociados 6	NC_001862	Hu LG15	AY695377	Rh2	AY243007
AAV Aviário ATCC VR-865	AY186198, AY629583, NC_004828	Clade C		Bb1	AY243023
AAV Aviário cepa DA-1	NC_006263, AY629583	Hu9	AY530629	Bb2	AY243022
AAV Bovino	NC_005889, AY388617, AAR26465	Hu10	AY530576
AAV11	AAT46339, AY631966	Hu11	AY530577	Rh10	AY243015
AAV12	ABI16639, DQ813647			Hu17	AY530582
Clade A		Hu53	AY530615	Hu6	AY530621
AAV1	NC_002077, AF063497	Hu55	AY530617	Rh25	AY530557
AAV6	NC_001862	Hu54	AY530616	Pi2	AY530554
Hu.48	AY530611	Hu7	AY530628	Pi1	AY530553
Hu 43	AY530606	Hu18	AY530583	Pi3	AY530555
Hu 44	AY530607	Hu15	AY530580	Rh57	AY530569
Hu 46	AY530609	Hu16	AY530581	Rh50	AY530563

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Clade B		Hu25	AY530591	Rh49	AY530562
Hu. 19	AY530584	Hu60	AY530622	Hu39	AY530601
Hu. 20	AY530586	Ch5	AY243021	Rh58	AY530570
Hu 23	AY530589	Hu3	AY530595	Rh61	AY530572
Hu22	AY530588	Hu1	AY530575	Rh52	AY530565
Hu24	AY530590	Hu4	AY530602	Rh53	AY530566
Hu21	AY530587	Hu2	AY530585	Rh51	AY530564
Hu27	AY530592	Hu61	AY530623	Rh64	AY530574
Hu28	AY530593	Clade D		Rh43	AY530560
Hu 29	AY530594	Rh62	AY530573	AAV8	AF513852
Hu63	AY530624	Rh48	AY530561	Rh8	AY242997
Hu64	AY530625	Rh54	AY530567	Rh1	AY530556
Hu13	AY530578	Rh55	AY530568	Clade F
Hu56	AY530618	Cy2	AY243020	Hu14 (AAV9)	AY530579
Hu57	AY530619	AAV7	AF513851	Hu31	AY530596
Hu49	AY530612	Rh35	AY243000	Hu32	AY530597
Hu58	AY530620	Rh37	AY242998	Isolado Clonal
Hu34	AY530598	Rh36	AY242999	AAV5	Y18065, AF085716
Hu35	AY530599	Cy6	AY243016	AAV 3	NC_001729
AAV2	NC_001401	Cy4	AY243018	AAV3B	NC_001863
Hu45	AY530608	Cy3	AY243019	AAV4	NC_001829
Hu47	AY530610	Cy5	AY243017	Rh34	AY243001
Hu51	AY530613	Rh13	AY243013	Rh33	AY243002
Hu52	AY530614	Clade E		Rh32	AY243003
Hu T41	AY695378	Rh38	AY530558

TABELA 2. Modificações do AAV1R7 nos sorotipos do AAV 1, 2, 3,

6, 7, 8, 9, e rh10.

Modificações do Resíduo AAV1R7

AAV1	AAV2	AAV3	AAV6	AAV7	AAV8	AAV9	AAVrh.10
Q148P	H148P	Q148P	Q148P	P148P	P148P	Q148P	P148P
-	-151Q	-151Q	-	-	-	-151Q	-
E152R	V151R	Q152R	E152R	Q152R	R152R	Q152R	R152R
-153S	E152S	E153S	-153S	S153S	S153S	E153S	S153S
S157T	S158T	S158T	S157T	T158T	T158T	A158T	T158T
T162K	A163K	S163K	T162K	K163K	K163K	S163K	K163K
L188I	L189I	L189I	L188I	L189I	L189I	11891	11891
S205A	T206A	S206A	S205A	A206A	A206A	S206A	A206A
N223S	N224S	N224S	N223S	N224S	S224S	S224S	S224S
A224S	S225S	S225S	A224S	A225S	S225S	S225S	S225S
S262N	S263N	S263N	S262N	S263N	S263N	N263N	N263N
A263G	Q264G	Q264G	A263G	E264G	G264G	S264G	G264G
S264T	S265T	S265T	S264T	T265T	T265T	T265T	T265T
T265S	-266S	G266S	T265S	A266S	T266S	S266S	S266S

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-267G	-267G	-267G	-267G	-267G	G267G	G267G	G267G
-	-	-268G	-	-	-	-	-
A267S	A269S	A269S	A267S	S269S	A269S	S269S	S269S
S268T	S270T	S270T	S268T	T270T	T270T	S270T	T270T
H272T	H274T	H274T	H272T	T274T	T274T	A274T	T274T
T326Q	Q328Q	Q328Q	T326Q	T328Q	Q328Q	D328Q	Q328Q
D328E	D330E	D330E	D328E	D330E	E330E	N330E	E330E
V330T	T332T	T332T	V330T	V332T	T332T	V332T	T332T
T331K	T333K	T333K	T331K	T333K	K333K	K333K	K333K
V341I	V343I	V343I	V341I	I343I	I343I	V343I	I343I
S345T	T347T	T347T	S345T	S347T	T347T	T347T	T347T

*A numeração é relativa à selvagem.

TABELA 3. Resíduos de aminoácidos e abreviações.

Resíduo de aminoácido	Abreviação
Código de Três Letras	Código de Uma Letra
Alanina	Ala	A
Arginina	Arg	R
Asparagina	Asn	N
Ácido Aspártico (Aspartato)	Asp	D
Cisteina	Cys	C
Glutamina	Gin	Q
Ácido glutâmico (Glutamato)	Glu	E
Glicina	Gly	G
Histidina	His	H
Isoleucina	lie	I
Leucina	Leu	L
Lisina	Lys	K
Metionina	Met	M
Fenilalanina	Phe	F
Prolina	Pro	P
Serina	Ser	s
Treonina	Thr	T
Triptofano	Trp	w
Tirosina	Tyr	Y
Valina	Vai	V

REFERENCIAS

[000290] As referências que se seguem são incorporadas por meio de referência aqui, a este pedido de patente, em suas totalidades para todos os fins.

1. Berns, K and Parrish, C (2007). Parvoviridae. Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, Lamb PA, Martin MA, Roizman B, Straus SE (ed),

Petição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 289/335

115/120

Fields Virol. 5th ed, vol 11., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA: pp 2437-2477.

2. Gao, G, Vandenberghe, LH, Alvira, MR, Lu, Y, Calcedo, R, Zhou, X, et al. (2004). Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J. V/ro/. 78: 6381-8.

3. Gao, G, Alvira, MR, Somanathan, S, Lu, Y, Vandenberghe, LH, Rux, JJ, et al. (2003). Adeno-associated viruses undergo substantial evolution in primates during natural infections. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:6081-6086.

4. Agbandje-McKenna, M and Kleinschmidt, J (2011). AAV capsid structure and cell interactions. Methods Mol. Biol. 807: 47-92.

5. Madigan, VJ and Asokan, A (2016). Engineering AAV receptor footprints for gene therapy. Curr. Opin. Virol. 18: 89-96.

6. Huang, LY, Halder, S and Agbandje-McKenna, M (2014). Parvovirus glycan interactions. Curr. Opin. Virol. 7C: 108-118.

7. Kashiwakura, Y, Tamayose, K, Iwabuchi, K, Hirai, Y, Shimada, T, Matsumoto, K, et al. (2005). Hepatocyte Growth Factor Receptor Is a Coreceptor for Adeno-Associated Virus Type 2 Infection. J. Virol. 79: 609-614.

8. Weller, ML, Amornphimoltham, P, Schmidt, M, Wilson, PA, Gutkind, JS and Chiorini, JA (2010). Epidermal growth factor receptor is a co-receptor for adeno-associated virus 26 serotype 6. Nat. Med. 16:662-4.

9. Di Pasquale, G, Davidson, BL, Stein, CS, Martins, I, Scudiero, D, Monks, A, et al. (2003). Identification of PDGFR as a receptor for AAV5 transduction. Nat. Med. 9:1306-12.

10. Asokan, A, Hamra, JB, Govindasamy, L, Agbandje-McKenna, M and Samulski, RJ (2006). Adeno-associated virus type 2 contains an integrin alpha5beta1 binding domain essential for viral cell entry. J. Virol. 80: 8961-9.

Petição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 290/335

116/120

11. Pillay, S, Meyer, NL, Puschnik, AS, Davulcu, O, Diep, J, Ishikawa, Y, et al. (2016). An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature 530:108-112.

12. Murlidharan, G, Samulski, RJ and Asokan, A (2014). Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Front. Mol. Neurosci. 7:1-9.

13. Murlidharan, G, Crowther, A, Reardon, RA, Song, J and Asokan, A (2016). Glymphatic fluid transport controls paravascular clearance of AAV vectors from the brain. JCI Insight 1: 1-11.

14. Ballabh, P, Braun, A and Nedergaard, M (2004). The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol. Dis. 16:1-13.

15. Williams, DW, Eugenin, EA, Calderon, TM and Berman, JW (2012). Monocyte maturation, HIV susceptibility, and transmigration across the blood brain barrier are critical in HIV neuropathogenesis. J. Leukoc. Biol. 91·. 401-15.

16. Salinas, S, Schiavo, G and Kremer, EJ (2010). A hitchhiker’s guide to the nervous system: the complex journey of viruses and toxins. Nat. Rev. Microbiol. 8: 645-655.

17. Yang, B, Li, S, Wang, H, Guo, Y, Gessler, DJ, Cao, C, et al. (2014). Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Mol. Ther. 22. 1299-1309.

18. Rosenberg, JB, Sondhi, D, Rubin, DG, Monette, S, Chen, A, Cram, S, et al. (2014). Comparative Efficacy and Safety of Multiple Routes of Direct CNS Administration of Adeno-Associated Virus Gene Transfer Vector Serotype rh.1O Expressing the Human Arylsulfatase A cDNA to Nonhuman Primates. Hum. Gene Ther. Dev.doi:10.1089/humc.2013.239 [doi].

19. Gray, SJ, Matagne, V, Bachaboina, L, Yadav, S, Ojeda, SR and

Petição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 291/335

117/120

Samulski, RJ (2011). Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol. Ther. 19:1058-1069.

20. Zhang, H, Yang, B, Mu, X, Ahmed, SS, Su, Q, He, R, etal. (2011). Several rAAV vectors efficiently cross the blood-brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. Mol. Ther. 19:1440-1448.

21. Cearley, CN, Vandenberghe, LH, Parente, MK, Garnish, ER, Wilson, JM and Wolfe, JH (2008). Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Mol. Ther. 16: 1710-8.

22. Grieger, JC, Snowdy, S and Samulski, RJ (2006). Separate Basic Region Motifs within the Adeno-Associated Virus Capsid Proteins Are Essential for Infectivity and Assembly. J. Virol. 80: 5199-5210.

23. Sonntag, F, Bieker, S, Leuchs, B, Fischer, R and Kleinschmidt, JA (2006). Adeno-associated virus type 2 capsids with externalized VP1/VP2 trafficking domains are generated prior to passage through the cytoplasm and are maintained until uncoating occurs in the nucleus. J. Virol. 80: 11040-11054.

24. Bowles, DE, McPhee, SW, Li, C, Gray, SJ, Samulski, JJ, Camp, AS, et al. (2012). Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20: 443455.

25. Li, C, Diprimio, N, Bowles, DE, Hirsch, ML, Monahan, PE, Asokan, A, et al. (2012). Single amino acid modification of adenoassociated virus capsid changes transduction and humoral immune profiles. J. Virol. 86: 7752-7759.

26. Bieker, S, Sonntag, F and Kleinschmidt, JA (2005). Mutational analysis of narrow pores at the fivefold symmetry axes of adenoassociated virus type 2 capsids reveals a dual role in genome packag

Petição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 292/335

118/120 ing and activation of phospholipase A2 activity. J. Virol. 79: 2528-2540.

27. Wu, Z, Miller, E, Agbandje-McKenna, M and Samulski, RJ (2006). Alpha2,3 and alpha2,6 N-linked sialic acids facilitate efficient binding and transduction by adeno-associated virus types 1 and 6. J. Virol. 80: 9093-103.

28. Huang, L-Y, Patel, A, Ng, R, Miller, EB, Halder, S, Mckenna, R, et al. Characterization of the Adeno-Associated Virus 1 and 6 Sialic Acid Binding Sitedoi:10.1128/JVI.00161 -16.

29. Bell, CL, Gurda, BL, Vliet, K Van, Agbandje-McKenna, M and Wilson, JM (2012). Identification of the galactose binding domain of the AAV9 capsid. J. Virol. 86: 7326-7333.

30. Rosenberg, JB, Sondhi, D, Rubin, DG, Monette, S, Chen, A, Cram, S, et al. (2014). Comparative efficacy and safety of multiple routes of direct CNS administration of adeno-associated virus gene transfer vector serotype rh.1O expressing the human arylsulfatase A cDNA to nonhuman primates. Hum. Gene Ther. Clin. Dev. 25:164-77.

31. Cearley, CN and Wolfe, JH (2006). Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain. Mol. Ther. 13:528-37.

32. Hadaczek, P, Forsayeth, J, Mirek, H, Munson, K, Bringas, J, Pivirotto, P, et al. (2009). Transduction of nonhuman primate brain with adeno-associated virus serotype 1: vector trafficking and immune response. Hum. Gene Ther. 20: 225-237.

33. Chen, S, Kapturczak, M, Loiler, SA, Zolotukhin, S, Glushakova, OY, Madsen, KM, et al. (2005). Efficient Transduction of Vascular Endothelial Cells with Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 1 and 5 Vectors. Hum. Gene Ther. 16: 235-247.

34. Pulicherla, N, Shen, S, Yadav, S, Debbink, K, Govindasamy, L, Agbandje-McKenna, M, et al. (2011). Engineering \jver-detargeted AAV9 Vectors for Cardiac and Musculoskeletal Gene Transfer. Mol.

Petição 870190078272, de 13/08/2019, pág. 293/335

119/120

Ther. 19: 1070-1078.

35. Asokan, A, Conway, JC, Phillips, JL, Li, C, Hegge, J, Sinnott, R, et al. (2010). Reengineering a receptor footprint of adeno-associated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat. Biotech nol . 28: 79-82.

36. Nathwani, AC, Reiss, UM, Tuddenham, EGD, Rosales, C, Chowdary, P, McIntosh, J, et al. (2014). Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia Β. N. Engl. J. Med. 371: 19942004.

37. Mingozzi, F and High, KA (2013). Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood 122: 2336.

38. Kumar, S, Stecher, G and Tamura, K (2016). MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol. Biol. Evol. 33: 1870-4.

39. Saitou, N and Nei, M (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 40625.

40. Felsenstein, J (1985). CONFIDENCE LIMITS ON PHYLOGENIES: AN APPROACH USING THE BOOTSTRAP. Evolution (NY). 39: 783791.

41. Murlidharan, G, Sakamoto, K, Rao, L, Corriher, T, Wang, D, Gao, G, et al. (2016). CNS-restricted Transduction and CRISPR/Cas9mediated Gene Deletion with an Engineered AAV Vector. Mol. Ther. Nucleic Acids 5: e338.

42. Lein, ES, Hawrylycz, MJ, Ao, N, Ayres, M, Bensinger, A, Bernard, A, et al. (2007). Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature 445'. 168-176.

43. Miller, EB, Gurda-Whitaker, B, Govindasamy, L, McKenna, R, Zolotukhin, S, Muzyczka N, et al. (2006). Production, purification and pre

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120/120 liminary X-ray crystallographic studies of adeno-associated virus serotype 1. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 62: 1271-1274.

44. Bordoli, L, Kiefer, F, Arnold, K, Benkert, P, Battey, J and Schwede, T (2008). Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nat. Protoc. 4: 1-13.

45. Nam, HJ, Lane, MD, Padron, E, Gurda, B, McKenna, R, Kohlbrenner, E, et al. (2007). Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81:12260-12271.

46. Krissinel, E and Henrick, K (2004). Secondary-structure matching (SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 60: 2256-2268.

47. Emsley, P, Lohkamp, B, Scott, WG and Cowtan, K (2010). Features and development of Coot. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66:486-501.

48. Carrillo-Tripp, M, Shepherd, CM, Borelli, IA, Venkataraman, S, Lander, G, Natarajan, P, et al. (2009). VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucleic Acids Res. 37: D436-42.

49. Xiao, C and Rossmann, MG (2007). Interpretation of electron density with stereographic roadmap projections. J. Struct. Biol. 158: 182— 187.

Claims

1. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, A267, S268 e H272, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos G266 e A267, (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 1) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8).

2. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma modificação nos resíduos de aminoácidos Q148, E152, S157, T162, T326, D328, V330, T331, V341 e S345, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos E152 e P153 (numeração VP1) em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou o resíduo de aminoácido equivalente nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

3. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma modificação dos resíduos de aminoácidos L188, S205, N223 e A224 (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou o resíduo de aminoácido equivalente nas SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

4. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a modificação é no mínimo uma de S262N, A263G, S264T, T265S, A267S, S268T e H272T.

5. Capsídeo do AVV de acordo com qualquer uma das rei

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2/19 vindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a modificação é no mínimo uma de Q148P, E152R, S157T, T162K, T326Q, D328E, V330T, T331K, V3411 e S345T.

6. Capsídeo do AVV de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a modificação é no mínimo uma de L188I, S205A, N223S e A224S.

7. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em:

a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AAV1RX);

b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (AAV2RX);

c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (AAV3RX);

d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (AAV6RX);

e) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (AAV7RX);

f) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (AAV8RX); e

g) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (AAV9RX).

8. Capsídeo do AVV de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em:

a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (AAV1R6);

b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (AAV2R6);

c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (AAV3R6);

d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (AAV6R6);

e) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (AAV7R6);

f) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (AAV8R6); e

g) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (AAV9R6).

9. Capsídeo do AVV de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em:

a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (AAV1R7);

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3/19

b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (AAV2R7);

c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (AAV3R7);

d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (AAV6R7);

e) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (AAV7R7);

f) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (AAV8R7); e

g) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (AAV9R7).

10. Capsídeo do AVV caracterizado pelo fato de que compreende a proteína do capsídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Vetor do vírus caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) o capsídeo do AVV como definido na reivindicação 10; e (b) um ácido nucleico compreendendo no mínimo uma sequência de repetição do terminal, em que o ácido nucleico é encapsidado pelo capsídeo do AVV.

12. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o vetor do vírus como definido na reivindicação 11 em um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Método de introdução de uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a célula com o vetor do vírus como definido na reivindicação 11 e/ou a composição como definida na reivindicação 12.

14. Método de liberação de uma molécula de ácido nucleico a um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito o vetor do vírus como definido na reivindicação 11 e/ou a composição como definida na reivindicação 12.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus e/ou composição é administrado ao sistema nervoso central do sujeito.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza

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4/19 do pelo fato de que o vetor do vírus e/ou composição é liberado através da barreira hematoencefálica.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus compreende uma molécula de ácido nucleico de interesse.

18. Método de liberação seletivamente de uma molécula de ácido nucleico de interesse a uma célula neuronal, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a célula neuronal com o vetor do vírus como definido na reivindicação 11, em que o vetor do vírus compreende a molécula de ácido nucleico de interesse.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda liberação seletivamente de uma molécula de ácido nucleico de interesse a um cardiomiócito.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico de interesse codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18, 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a célula neuronal e o cardiomiócito estão em um sujeito.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é detargeted a partir dos esplenócitos, dos hepatócitos ou das células renais.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um sujeito humano.

24. Método de tratamento de um transtorno ou defeito neurológico em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito o vetor do vírus como definido na reivindicação 11, em que o vetor do vírus compreende uma molécula de ácido nu

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5/19 cleico que codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico eficaz no tratamento do transtorno ou defeito neurológico.

25. Método de tratamento de um transtorno ou defeito neurológico e cardiovascular em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito o vetor do vírus como definido na reivindicação 11, em que o vetor do vírus compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico eficaz no tratamento do transtorno ou defeito neurológico e cardiovascular.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou composição é administrado ao sujeito por via intravenosa, por via intra-arterial, ou por via intraperitoneal.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou composição é administrado ao sujeito através de uma via intracerebroventrical, intracisternal, intraparenquimal, intracranial e/ou intratecal.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a administração do vetor do vírus e/ou composição ao sujeito sistemicamente resulta em menor transdução em tecidos fora do alvo.

29. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, e A267 (numeração VP1), e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269, em que os resíduos de aminoácidos são baseados na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 1) ou os resíduos de aminoácidos equivalentes em AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4),

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6/19

AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8).

30. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo compreende ainda uma modificação no resíduo de aminoácido H272.

31. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende ainda uma modificação nos resíduos de aminoácidos Q148, E152, S157, T162, H272, T326, D328, V330, T331, V341 e S345, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos E152 e P153.

32. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende ainda uma modificação nos resíduos de aminoácidos L188, S205, N223, A224, e H272.

33. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizada pelo fato de que a modificação é no mínimo uma de S262N, A263G, S264T, T265S, e A267S.

34. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizada pelo fato de que a modificação é no mínimo uma de Q148P, E152R, S157T, T162K, H272T, T326Q, D328E, V330T, T331K, V341I e S345T.

35. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 24, caracterizada pelo fato de que a modificação é no mínimo uma de L188I, S205A, N223S, A224S e H272T.

36. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 35, caracterizada pelo fato de que a inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269 é uma inserção de um único resíduo T.

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37. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizada pelo fato de que a inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos E152 e P153 é uma inserção de um único resíduo S.

38. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo é selecionada entre o grupo consistindo em:

a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (AAV1RX);

b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (AAV2RX);

c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (AAV3RX);

d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (AAV6RX);

e) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (AAV7RX);

f) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (AAV8RX); e

g) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (AAV9RX).

39. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo é SEQ ID NO: 9 (AAV1 RX).

40. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo é selecionada entre o grupo consistindo em:

a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (AAV1R6);

b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (AAV2R6);

c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (AAV3R6);

d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (AAV6R6);

e) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (AAV7R6);

f) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (AAV8R6); e

g) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (AAV9R6).

41. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo é SEQ ID NO: 16 (AAV1R6).

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8/19

42. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo é selecionada entre o grupo consistindo em:

a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (AAV1R7);

b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (AAV2R7);

c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (AAV3R7);

d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (AAV6R7);

e) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (AAV7R7);

f) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (AAV8R7); e

g) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (AAV9R7).

43. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo é SEQ ID NO: 23 (AAV1R7).

44. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação resultando na sequência de aminoácidos:

X¹-X²-X³-X⁴ nos aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 262 a 265 (numeração VP1) da proteína do capsídeo do AAV1 nativo (SEQ ID NO: 1), em que X¹ é qualquer aminoácido diferente de S; em que X²é qualquer aminoácido diferente de A;

em que X³é qualquer aminoácido diferente de S; e em que X⁴é qualquer aminoácido diferente de T.

45. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o aminoácido X¹ é N.

46. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o aminoácido X² é G.

47. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o aminoácido X³ é T.

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9/19

48. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o aminoácido X⁴ é S.

49. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o aminoácido X¹ é N, X² é G, X³ é T, e X⁴ é S.

50. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo compreende ainda uma modificação no resíduo de aminoácido H272.

51. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a modificação é H272T.

52. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 51, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende ainda uma inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos de aminoácidos S268 e N269.

53. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a inserção de resíduo de aminoácido é uma inserção de um único resíduo T.

54. Vetor do vírus adeno-associado (AAV) caracterizado pelo fato de que compreende a proteína do capsídeo do AAV como definida em qualquer uma das reivindicações 29 a 53.

55. Vetor do AAV de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

um ácido nucleico compreendendo no mínimo uma sequência de repetição do terminal, em que o ácido nucleico é encapsidado pela proteína do capsídeo do AAV.

56. Vetor do vírus AVV de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a sequência de repetição do terminal é uma repetição do terminal do AAV.

57. Vetor do vírus AVV de acordo com a reivindicação 55,

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10/19 caracterizado pelo fato de que a sequência de repetição do terminal é uma repetição do terminal não do AAV.

58. Vetor do vírus AVV de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma sequência codificando uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico.

59. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o vetor do vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 54 a 58.

60. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

61. Método de introdução de uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a célula com o vetor do vírus AVV como definido em qualquer uma das reivindicações 54 a 59.

62. Método de introdução de uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a célula com a composição farmacêutica como definida na reivindicação 59 ou 60.

63. Método de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é administrado ao sistema nervoso central de um sujeito.

64. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é liberado através da barreira hematoencefálica.

65. Método de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é Retargeted do fígado.

66. Método de acordo com a reivindicação 61 ou 62, carac

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11/19 terizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do rim.

67. Método de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do baço.

68. Método de liberação seletivamente de uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico a uma célula neuronal em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a célula neuronal com o vetor do vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 54 a 58 ou a composição como definida nas reivindicações 59 a 60, em que o vetor do vírus ou a composição compreende a proteína terapêutica ou o RNA terapêutico.

69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do fígado.

70. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do rim.

71. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do baço.

72. Método de tratamento de um transtorno ou defeito neurológico em um sujeito, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao sujeito o vetor do vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 54 a 58 ou a composição como definida nas reivindicações 59 a 60, em que o vetor do vírus ou a composição compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico eficaz no tratamento do transtorno neurológico.

73. Método de acordo com a reivindicação 72, caracteriza

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12/19 do pelo fato de que compreende ainda o tratamento de um transtorno ou defeito cardiovascular no sujeito.

74. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é liberado seletivamente para uma célula neuronal.

75. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é liberado seletivamente para um cardiomiócito.

76. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do fígado, do rim e/ou do baço.

77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 76, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero.

78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 77, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

79. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 78, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou composição é liberado para o sujeito através da via de administração selecionada entre o grupo consistindo em intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intracerebroventrical, intracisternal, intraparenquimal, intracranial, e intratecal.

80. Método de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou composição é liberado para o sujeito através de administração intravenosa.

81. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, A263, S264, T265, A267, e H272, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269, (numeração VP1), em que a

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13/19 numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV1 (SEQ ID NO: 2) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8).

82. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende no mínimo uma de S262N, A263G, S264T, T265S, A267G, e H272T.

83. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizada pelo fato de que a única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S268 e N269 é uma inserção de um único resíduo T.

84. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 83, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende a sequência de SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 33.

85. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, Q263, S264, A266, S267, e H271, e uma inserção de no mínimo um resíduo de aminoácido entre os resíduos S261 e S262, (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 8).

86. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende no mínimo uma de S262T, Q263S, S264G, A266S, S267T, e H271T.

87. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindi

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14/19 cação 85 ou 86, caracterizada, pelo fato de que a inserção entre os resíduos SS61 e S262 é uma inserção de um único resíduo de aminoácido.

88. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizada, pelo fato de que a inserção entre os resíduos S251 e S252 é uma inserção de mais de um resíduo de aminoácido.

89. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 88, caracterizada pelo fato de que a inserção entre os resíduos S251 e S252 é uma inserção de um resíduo N e um G.

90. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 89, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende a sequência de SEQ ID NO:

31.

91. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S262, Q263, S264, A266, A267, H271, e uma única inserção de resíduo de aminoácido entre os resíduos S261 e S262, em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV3 (SEQ ID NO: 3) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), AAV9 (SEQ ID NO: 7) ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8).

92. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende no mínimo uma de S262T, Q263S, S264G, A266S, A267T, H271T.

93. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizada pelo fato de que a inserção entre os resíduos SS61 e S262 é uma inserção de um único resíduo de aminoá

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15/19 cido.

94. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizada pelo fato de que a inserção entre os resíduos S251 e S252 é uma inserção de mais de um resíduo de aminoácido.

95. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 94, caracterizada pelo fato de que a inserção entre os resíduos S251 e S252 é uma inserção de um resíduo N e um G.

96. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 95, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende a sequência de SEQ ID NO:

32.

97. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos S263, S269, A237 (numeração VP1), em que a numeração de cada resíduo é baseada na sequência de aminoácidos de AAV9 (SEQ ID NO: 9) ou o resíduo de aminoácido equivalente em AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3 (SEQ ID NO: 3), AAV6 (SEQ ID NO: 4), AAV7 (SEQ ID NO: 5), AAV8 (SEQ ID NO: 6), ou AAVrhW (SEQ ID NO: 8).

98. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 97, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende no mínimo uma de S263G, S269T, e A273T.

99. Proteína do capsídeo do AAV de acordo com a reivindicação 97 ou 98, caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende a sequência de SEQ ID NO: 34.

100. Proteína do capsídeo do vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que a proteína do capsídeo do AAV compreende a sequência de qualquer uma de SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 34.

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101. Vetor do vírus adeno-associado (AAV) caracterizado pelo fato de que compreende a proteína do capsídeo do AAV como definida em qualquer uma das reivindicações 81 a 100.

102. Vetor do AAV de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

103. Vetor do vírus AVV de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que a sequência de repetição do terminal é uma repetição do terminal do AAV.

104. Vetor do vírus AVV de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que a sequência de repetição do terminal é uma repetição do terminal não do AAV.

105. Vetor do vírus AVV de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 104, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma sequência codificando uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico.

106. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o vetor do vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 101 a 105.

107. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 106, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

108. Método de introdução de uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a célula com o vetor do vírus AVV como definido em qualquer uma das reivindicações 101 a 105.

109. Método de introdução de uma molécula de ácido nucleico dentro de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreen

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17/19 de contactar a célula com a composição farmacêutica como definida na reivindicação 106 ou 107.

110. Método de acordo com a reivindicação 108 ou 109, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é administrado ao sistema nervoso central de um sujeito.

111. Método de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é liberado através da barreira hematoencefálica.

112. Método de acordo com a reivindicação 108 ou 109, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do fígado.

113. Método de acordo comm a reivindicação 108 ou 109, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeteddo rim.

114. Método de acordo com a reivindicação 108 ou 109, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do baço.

115. Método de liberar seletivamente uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico a uma célula neuronal em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a célula neuronal com o vetor do vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 101 a 105 ou a composição como definida nas reivindicações 106 a 107, em que o vetor do vírus ou a composição compreende a proteína terapêutica ou o RNA terapêutico.

116. Método de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do fígado.

117. Método de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do rim.

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118. Método de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do baço.

119. Método de tratamento de um transtorno ou defeito neurológico em um sujeito, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao sujeito o vetor do vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 101 a 105 ou a composição como definida nas reivindicações 106 a 107, em que o vetor do vírus ou a composição compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico eficaz no tratamento do transtorno neurológico.

120. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o tratamento de um transtorno ou defeito cardiovascular no sujeito.

121. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é liberado seletivamente para uma célula neuronal.

122. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é liberado seletivamente para um cardiomiócito.

123. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou a composição é detargeted do fígado, do rim e/ou do baço.

124. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108 a 123, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um um mamífero.

125. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 108 a 124, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

126. Método de acordo com qualquer uma das reivindica

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19/19 ções 108 a 125, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou composição é liberado para o sujeito através da via de administração selecionada entre o grupo consistindo em intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intracerebroventrical, intracisternal, intraparenquimal, intracranial, e intratecal.

127. Método de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que o vetor do vírus ou composição é liberado para o sujeito através de administração intravenosa.