CN110520536A - 用于穿过维管结构的基因转移的方法和组合物 - Google Patents

用于穿过维管结构的基因转移的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本公开提供了在氨基酸序列中包含修饰的AAV衣壳蛋白，以及包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒衣壳和病毒载体。本公开还提供了将本公开的病毒载体和病毒衣壳体内施用至细胞或受试者的方法。

Description

用于穿过维管结构的基因转移的方法和组合物
交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年2月15日提交的美国临时申请No.62/459、286的权益，其通过引用以其全部内容并入本文用于所有目的。
政府支持声明
本发明是在国立卫生研究院授予的资金号P01HL112761和R01HL089221的政府支持下完成的。政府拥有本发明的一定的权利。
序列表
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且通过引用并入本说明书中。含有该序列表的文本文件的名称是STRD_004_01WO_SeqListSST25.txt。该文本文件为4KB，创建于2018年2月14日，并通过EFS-Web以电子方式提交。
发明领域
本发明涉及来自腺相关病毒(AAV)的经修饰的衣壳蛋白和包含其的病毒衣壳和病毒载体。特别地，本发明涉及经修饰的AAV衣壳蛋白和包含其的衣壳，其可以掺入病毒载体中以赋予关于感兴趣的靶组织所需的转导谱(profile)。
背景技术
从动物组织和腺病毒原液中分离的新的腺相关病毒(AAV)毒株扩展了可用于治疗性基因转移应用的AAV载体组。目前正在全面努力绘制这些AAV分离株在动物模型中的组织趋向性。将AAV载体的归巢导向至选择性器官的能力对于基因治疗和其他治疗应用是有用的。
本发明解决了本领域对具有所需靶向特征的核酸递送载体的需求。
发明内容
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、A263、S264、T265、A267、S268和H272处的修饰，和在残基G266和A267之间的单个氨基酸残基插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列或AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的AAV衣壳蛋白能够进一步包含在氨基酸残基Q148、E152、S157、T162、T326、D328、V330、T331、V341和S345处的修饰，以及残基E152和P153(VP1编号)之间的单个氨基酸残基插入，其中每个残基的编号基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中的等同氨基酸残基。在进一步的实施方案中，本发明的AAV衣壳蛋白能够进一步包含氨基酸残基L188、S205、N223和A224(VP1编号)的修饰，其中每个残基的编号基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中的等同氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、A263、S264、T265和A267(VP1编号)处的修饰，和在残基S268和N269之间的单个氨基酸残基插入，其中氨基酸残基基于AAV1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列或AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基H272处的修饰。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基Q148、E152、S157、T162、H272、T326、D328、V330、T331、V341和S345处的修饰，以及在残基E152和P153之间的单个氨基酸残基插入。在进一步的实施方案中，AAV衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基L188、S205、N223、A224和H272处的修饰。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中AAV衣壳蛋白包含产生以下氨基酸序列的修饰：在对应于天然AAV1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置262至265(VP1编号)的氨基酸处的X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO:35)，其中X1是除S以外的任意氨基酸；其中X2是除A以外的任意氨基酸；其中X3是S以外的任意氨基酸；其中X4是T以外的任意氨基酸。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、A263、S264、T265、A267和H272处的修饰，和在残基S268和N269之间的单个氨基酸残基插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV1(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ IDNO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、Q263、S264、A266、S267和H271处的修饰，和在残基S261和S262之间的至少一个氨基酸残基的插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、Q263、S264、A266、A267、H271处的修饰，和在残基S261和S262之间的单个氨基酸残基插入，其中每个残基的编号基于AAV3(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S263、S269、A237(VP1编号)处的修饰，其中每个残基的编号基于AAV9(SEQID NO:9)的氨基酸序列或在AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:34中任一个的序列。
本公开另外提供了包含本公开的衣壳蛋白的AAV衣壳，以及包含本公开的AAV衣壳的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包含本公开的AAV衣壳和包含至少一个末端重复序列的核酸，其中所述核酸被AAV衣壳包壳。
本公开另外提供了包含本文公开的AAV衣壳和/或病毒载体的药物组合物。
本文还提供了将核酸分子引入细胞的方法，包括使细胞与本公开的病毒载体接触，以及将核酸分子递送至受试者的方法，包括向受试者施用公开的病毒载体。
此外，本公开提供选择性递送感兴趣的核酸分子至神经元细胞的方法，其包括使所述神经元细胞与本发明的病毒载体接触，其中所述病毒载体包含感兴趣的核酸分子。
在又另一个实施方案中，本公开提供用于治疗受试者的神经障碍或缺陷的方法，其包括向所述受试者施用本公开的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码在治疗神经障碍或缺陷中有效的治疗性蛋白质或治疗性RNA的核酸分子。
在下面阐述的描述中更详细地解决了这些和其他方面。
附图简述
图1.皮质神经元转导的定量。用剂量为5×1011vg(载体基因组)的包装CBh-scGFP的载体(AAV1、AAV1R6或AAV1R7)或作为阴性对照的PBS通过尾静脉注射全身施用至6-8周龄雌性BL6小鼠。注射后21天处死小鼠，并收获组织，将其固定并切片。使用DAB底物对组织进行GFP免疫染色，通过载玻片扫描和ImageScope软件观察GFP表达。在遍及每只小鼠的多个冠状脑切片中，对大脑皮质中的GFP阳性神经元进行人工计数、定量并取平均值。对于AAV1，N＝2；对于AAV1R6和AAV1R7，n＝3。
图2.穿过脑维管结构和神经元表达。将包装Cbh-scGFP转基因的AAV载体以5×1011vg的剂量通过尾静脉注射施用至C57/B16小鼠。在注射后21天处死小鼠，收获组织，将其固定、切片、DAB染色以检测GFP，通过Aperio Scanner成像并用ImageScope软件进行图像处理。缩写：皮质(CTX)，运动皮质(MCT)，纹状体(STR)，海马(HC)，齿状回(DG)。N＝3。
图3.肝脏去靶向。将包装CBA-荧光素酶转基因的AAV载体以1×1011vg的剂量通过尾静脉注射施用至C57/B16小鼠。在注射后14天处死小鼠，收获组织，将其切碎、裂解并进行荧光素酶测定以检测脑、心脏、肝脏和脊髓组织的相对转导水平。将数据归一化为每克组织的相对光单位。N＝3。
图4A-C.AAV1/rh.10结构域交换衣壳文库的系统发育分析和结构分析。图4A.从文库中分离的代表性AAV1/rh.10嵌合衣壳组的示意图，其证明了通过改组(shuffling)获得的结构域交换在氨基酸水平上的序列多样性。单个亲本或嵌合衣壳垂直列出，而具有不同结构域交换的VP1衣壳序列从左侧的N末端到右侧的C末端水平显示。AAV1衍生的残基以灰色显示，AAVrh.10残基以青绿色显示，两者之间的共有残基以黑色显示。图4B.AAV1/rh.10嵌合衣壳的VP1衣壳序列的邻接系统发生。将衣壳氨基酸序列与ClustalW比对，并使用邻接法生成系统发生。使用泊松校正计算氨基酸距离，表示为每个位点的氨基酸置换的数量的单位。该树按比例绘制，分支长度与进化距离的分支长度相同，用于推断该树。使用1000次复制计算Bootstrap值，并且其中相关分类群聚集在一起的复制树的百分比显示在分支旁边。图4C.选择用于体内筛选的亲本和代表性嵌合AAV衣壳突变体的衣壳亚基三聚体/3倍对称轴区域的三维表面模型。源自AAV1的氨基酸残基以灰色显示，而源自AAVrh.10的残基以青-绿色显示。使用PyMol可视化和生成结构模型。
图5.体内筛选产生能够在静脉内施用后穿过血脑屏障的AAV1/rh.10嵌合体。在以5×1011vg的剂量通过尾静脉注射施用后3周，免疫染色的脑切片的扫描显示由亲本或包装CBh-scGFP转基因的嵌合载体(或在模拟物处理的情况下为PBS)介导的大脑皮质中的GFP表达。总体的冠状脑切片(上图)表示在针对每个亲本或嵌合载体显示的插图中看到的皮质的长方体区域，代表它们各自的转导谱。比例尺＝100μm。
图6A-G.AAV1/rh.10嵌合体的体内筛选，以获得它们在血管内施用后穿过血脑屏障并转导各种脑区的能力。小鼠通过尾静脉注射接受剂量为5×1011vg的亲本(AAV1或AAVrh.10)或包装CBh-scGFP转基因的嵌合载体。免疫染色和成像的小鼠脑切片显示注射后21天的GFP表达，如黑色/深棕色染色。比例尺＝100μm。图顶部的总体的冠状脑切片表示插图中显示的各种大脑区域：MCT，运动皮质(图6A)；HC，海马(图6B)；DG，齿状回(图6C)；TH，丘脑(图6D)；HY，下丘脑(图6E)；STR，纹状体(图6F)；Amg，杏仁核(图6G)。对于每种，n＝3。
图7A-H.与亲本AAV1和AAVrh.10相比，AAV1R6和AAV1R7在脑中的CNS转导谱。对于亲本血清型AAV1和AAVrh.10(左栏)，以及对于AAV1R6和AAV1R7(右栏)，以5×1011vg的剂量尾静脉注射包装CBh-scGFP转基因的AAV载体后三周，显示了穿过各种脑区域的转导谱，所述脑区域包括运动皮质(图7A)，大脑(体感)皮质(图7B)、海马(图7C)、齿状回(图7D)、丘脑(图7E)、下丘脑(图7F)、纹状体(图7G)和杏仁核(图7H)。比例尺＝100μm。
图8A-H.对于亲本和嵌合衣壳变体的神经元和神经胶质转导水平的定量比较。以5x1011vg的剂量通过尾静脉注射，将包装CBh-scGFP转基因的载体施用后3周的相对神经元转导水平通过以下进行定量：计数针对每50微米冠状切面的每个脑区域的转导的神经元和神经胶质的数量，其基于形态学鉴定。显示了亲本血清型AAV1和AAVrh.10以及嵌合变体AAV1R6和AAV1R7穿过脑的各个区域的转导，所述脑的各个区域包括运动皮质(图8A)、大脑(体感)皮质(图8B)、海马(图8C)、齿状回(图8D)、丘脑(图8E)、下丘脑(图8F)、纹状体(图8G)和杏仁核(图8H)。误差条表示标准偏差(n>或＝3)。使用具有Welch校正的不成对双尾T检验和单向ANOVA来证明每组相对于AAV1的神经元和神经胶质转导的统计学显著性，并且证明平均值之间的差异分别具有统计学显著性。ns，非显著性的；*，P<0.05。
图9A-F.AAV1R6嵌合衣壳变体的结构分析。(图9A)AAV1R6与AAV1&AAVrh.10的序列比对突出了独特源自AAVrh.10的氨基酸残基(AAV1R6编号)(以黑色字母显示并以蓝色突出显示)。保守残基以红色字母显示，并以黄色突出显示，而AAV1上的非保守等同残基以黑色或绿色文本显示，并以绿色或白色突出显示。嵌合AAV1R6VP3亚基(图9B)单体的三维结构模型使用SWISS-MODEL产生，其中AAV8的晶体结构用作同源建模(PDB ID:2QAO)的模板。AAV1R6VP3亚基(图9C)三聚体二聚体/2倍对称轴，(图9D)三聚体/三倍对称轴，(图9E)五聚体/5倍对称轴和(图9F)呈现完整AAV1R6衣壳(60聚体)的表面的表面模型通过VIPERdb寡聚体发生器产生，并使用PyMol可视化。来源于AAV1的残基以灰色着色，而源自AAVrh.10的残基聚集在3倍对称轴的突起的基部，在2倍对称轴处的凹陷和5倍孔处，是以青绿色着色。
图10A-B.与亲本衣壳相比，AAV1R6和AAV1R7的相对心脏和肝脏转导。通过尾静脉注射以5×1011vg的剂量施用亲本(AAV1或AAVrh.10)或包装CBh-scGFP转基因的嵌合(AAV1R6或AAV1R7)载体。在注射后的21天，对心脏和肝脏切片进行GFP免疫染色并成像。图10A.用PBS(模拟物)、AAV1、AAVrh.10、AAV1R6或AAV1R7处理的小鼠中，心脏(上图)和肝脏(下图)组织的GFP荧光。图10B.对于每种处理，通过量化所拍摄的遍及多个图像的相对荧光，所测量的心脏(顶部)和肝脏(底部)的转导水平。该条表示从最低值到最高值的范围，中心线表示遍及样本的平均值。将相对荧光归一化为模拟物处理的组织。误差条表示标准偏差(n＝3)。对于每组，进行单向ANOVA和具有Welch校正的不成对的双尾T检验，并显示相对于AAVrh.10的显著性。ns，非显著性的。*，P<0.05。
图11A-H.用于穿过BBB的最小AAVrh.10足迹的合理设计和功能映射(functionalmapping)。图11A AAV1RX与AAV1和AAVrh.10的序列比对显示了在向神经的足迹之内和附近的编号氨基酸残基。保守残基以黄色突出显示，构成足迹的残基以青色突出显示，非保守残基以绿色或白色突出显示。使用SWISS-MODEL软件生成工程改造的AAV1RX嵌合衣壳的结构模型用于基于同源性的建模，并且使用VIPERdb产生寡聚体。PyMol用于产生AAV1RX VP3亚基单体(图11B)、三聚体二聚体/2倍对称轴(图11C)、三聚体/三倍对称轴(图11D)、五聚体/5倍对称轴(图11E)和完整衣壳(60聚体)(图11F)的呈现表面的模型。源自AAV1的氨基酸和AAV1和AAVrh.10之间同源的氨基酸以灰色表示，而包含来自AAVrh.10的用于穿过BBB的向神经足迹的残基以绿色青色表示。图11C.立体路线图投影显示了在AAV1RX衣壳上沿三重对称轴向下观察到的向神经足迹，并使用RIVEM生成。仅显示表面暴露的氨基酸残基，其各自之间的边界用黑线描绘。绿色区域描绘了在三重对称轴上的拓扑突起，而蓝色区域代表拓扑凹陷。该足迹的关键氨基酸残基重新着色为品红色(AAVrh.10VP1编号)。图11H.包装CBh-scGFP转基因的AAV1RX的CNS转导谱，其中所述AAV1RX以5×1011.vg的剂量通过尾静脉注射施用。将注射后21天的切片进行免疫染色并成像。比例尺＝100μm。
图12A-H.静脉内施用后AAV1R6、AAV1R7和AAV1RX的外周组织转导和生物分布。用PBS或包装CBA-Luc报告基因转基因的AAV1、AAVrh.10、AAV1R6、AAV1R7或AAV1RX载体以1×1011vg的剂量通过尾静脉注射小鼠。在注射后2周，定量荧光素酶报告基因转基因表达水平(图12A、12C、12E、12G)和病毒基因组拷贝在各种组织中的生物分布(图12B、12D、12F、12H)。将荧光素酶表达水平归一化至组织裂解物的克数，并表示为相对光单位。将载体基因组(vg)拷贝标准化至作为内源管家基因的小鼠核纤层蛋白B(mLamB)，并表示为每个细胞的vg拷贝。误差条代表标准偏差(对于荧光素酶测定，n＝3；对于生物分布，n＝4)。对于每组，进行单向ANOVA和具有Welch校正的不成对的双尾T检验，并显示相对于AAVrh.10的显著性。ns，非显著性的。*，P<0.05。
图13A-H.与亲本和其他嵌合衣壳变体相比，AAV1RX介导的神经元和神经胶质转导水平的定量。小鼠通过尾静脉注射接受剂量为5×1011vg的亲本(AAV1或AAVrh.10)或包装CBh-scGFP转基因的嵌合载体。在注射后3周，取脑，将其切片、GFP免疫染色并成像。对相对神经元和神经胶质转导水平进行GFP免疫染色并成像。通过以下来定量相对神经元和神经胶质转导水平：计数针对每50μm冠状切片的每个区域的转导神经元和神经胶质的数量，其基于形态学鉴定。显示了AAV1RX与亲本血清型AAV1和AAVrh.10以及嵌合变体AAV1R6和AAV1R7的穿过各个区域的转导水平，所述区域包括运动皮质(图13A)、大脑皮质(图13B)、海马(图13C)、齿状回(图13D)、丘脑(图13E)、下丘脑(图13F)、纹状体(图13G)和杏仁核(图13H)。误差条表示标准偏差(n＝3)。使用具有Welch校正的未配对双尾T检验来证明每组相对于AAV1的统计学显著性。ns：统计学非显著性的；*，P<0.05。也使用单向ANOVA证明平均值之间的差异是统计学显著的。对于本文所示的穿过所有脑区域的神经元和神经胶质转导，*，P<0.05。
图14.遍及常见AAV血清型的1RX足迹和可变区I(VR-1)的序列比对。在可变区I(VR-1)的较大环境中，与常见的天然AAV血清型进行比较，AAV1RX与常见AAV血清型的序列比对突出显示1RX足迹的氨基酸残基(VP1编号)。上方和下方的黑线标记1RX足迹内的特定残基。关键：遍及血清型的相同的残基用黄色背景上的红色字母表示；保守残基，用青色背景上的蓝色字母表示；类似的残基，用绿色背景上的黑色字母表示；弱相似残基，用白色背景上的绿色字母表示；不相似的残基，用白色背景上的黑色字母表示。该序列比对使用Vector NTI Advance 11.5.2软件产生。
图15.AAV1、AAV1R7和AAVrh.10VP1衣壳蛋白的序列比对。
发明详述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文使用的技术仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用的方式以其整体并入本文。
定义
以下术语在本文的说明书和所附权利要求中使用：
除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”旨在也包括复数形式。
进一步地，当提及诸如多核苷酸或多肽序列的长度的量、剂量、时间、温度等可测量值时，本文所用的术语“约”意指涵盖特定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或更多个相关所列项目的任意和所有可能的组合，以及当在备选方案(“或”)中解释时组合的缺少。
如本文所用，过渡短语“基本上由......组成”是指权利要求的范围应被解释为涵盖权利要求中所记载的指定物质或步骤，“以及那些实质上不影响要求保护的发明的基本 的和新颖的特征的那些”。参见In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA1976)(在原文的重点强调)；还参见MPEP§2111.03。因此，当在本文的权利要求中使用时，术语“基本上由......组成”并不旨在被解释为等同于“包含”。
除非上下文另有说明，否则其尤其是意指本文所述的衣壳蛋白、载体、组合物和方法的各种特征可以任何组合使用。
此外，本公开还预期(contemplate)在一些实施例中，可排除或省略本文所阐述的任何特征或特征组合。
为了进一步说明，例如，如果说明书指出特定氨基酸可以选自A、G、I、L和/或V，则这个句子还表明氨基酸可以选自这些氨基酸的任何子集，(例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；仅L；等)，如同每个这样的子组合在本文中明确阐述。此外，这样的句子还表明可以放弃保护一个或更多个指定的氨基酸。例如，在特定的实施方案中，氨基酸不是A、G或I；不是A；不是G或V；等，如果每个这样的可能的放弃在此明确阐述。
如本文所用，术语“减少”和类似术语意为相对于对照或参照至少约25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更多的下降。
如本文所用，术语“增加”、“增强”和类似术语表示相对于对照或参照至少约5％、10％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的增加或增强。
如本文所用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科，包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括细小病毒属、红病毒属、浓核病毒(Densovirus)属、艾特拉病毒(Iteravirus)属和康特拉病毒(Contravirus)属的成员。示例性自主细小病毒包括但不限于，小鼠的微小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、番鸭细小病毒、B19病毒以及现在已知的或以后发现的任何其他自主细小病毒。其他自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见，例如，BERNARDN.FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven出版)。
如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAVrh10型、AAV 11型、AAV 12型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV和现在已知的或后来被发现的任何其他AAV。参见，例如，BERNARD N.FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven出版)。已经鉴定了许多AAV血清型和进化枝(参见，例如，Gao等人(2004)J.Virology 78:6381-6388；Moris等人(2004)Virology 33-:375-383；和表1)。
各种血清型的AAV和自主细小病毒的基因组序列，以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可以在文献中或在诸如数据库的公共数据库中找到。参见，例如，GenBank登录号NC_044927、NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；其公开在本文中通过引入并入用于教导细小病毒和AAV的核酸和氨基酸序列。还参见，例如，Srivistava等人(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人(1998)J.Virology 71:6823；Chiorini等人(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人(1999)J.Virology 73:939；Xiao等人(1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996)Virology 221:208；Shade等人(1986)J.Virol.58:921；Gao等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人(2004)Virology 33-:375-383；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；和美国专利No.6,156,303；其公开在本文中通过引用并入用于教导细小病毒和AAV的核酸和氨基酸序列。还参见表1。
自主细小病毒和AAV的衣壳结构在BERNARD N.FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69和70章(第4版，Lippincott-Raven出版)中有更详细的描述。还参见，AAV2(Xie等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405-10),AAV4(Padron等人(2005)J.Virol.79:5047-58),AAV5(Walters等人(2004)J.Virol.78:3361-71)和CPV(Xie等人(1996)J.Mol.Biol.6:497-520；Tsao等人(1991)Science 251:1456-64；Drouin等人(2013)Future Virol.8(12):1183-1199)的晶体结构的描述。
如本文所用的术语“趋向性”是指病毒优先进入某些细胞或组织，任选地在之后表达(例如，转录和，任选地翻译)由细胞中病毒基因组携带的序列，例如，对于重组病毒，表达感兴趣的异源核酸。本领域技术人员会理解，在一些实施方案中，在不存在反式作用因子的情况下，来自病毒基因组的异源核酸序列的转录不会启动，例如，对于诱导型启动子或其他被调节的核酸序列。在重组AAV(rAAV)基因组的情况下，来自病毒基因组的基因表达可以来自稳定整合的原病毒和/或来自非整合的游离基因，以及病毒可以在细胞内采取的任何其他形式。
如本文所用，“全身性趋向性”和“全身性转导”(和等同术语)表明本公开的病毒衣壳或病毒载体分别对于全身组织(例如，脑、肺、骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏和/或胰腺)表现出趋向性和/或转导。在实施方案中，中枢神经系统(例如脑、神经细胞等)的全身转导被观察到。在其他实施方案中，心肌组织的全身转导被实现。
除非另有说明，否则“有效的转导”或“有效的趋向性”或类似术语，可通过参考合适的对照(例如，分别为对照的至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、500％或更多的转导或趋向性)来确定。在特定实施方案中，病毒载体对于神经元细胞和心肌细胞有效地转导或具有有效的趋向性。合适的对照将取决于多种因素，所述因素包括所需的趋向性谱。
类似地，通过参考合适的对照，可以确定病毒针对靶组织“不能有效地转导”或“不具有有效的趋向性”或类似术语。在特定的实施方案中，病毒载体针对肝脏、肾脏、性腺和/或生殖细胞不能有效转导(即，不具有有效的趋向性)。在特定实施方案中，与期望的靶组织(例如，中枢神经系统的细胞；心肌细胞)的转导水平相比，组织(例如肝脏)的不期望转导是20％或更低、10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.1％或更低。
除非另有说明，本文所用的术语“多肽”涵盖肽和蛋白质两者。
“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂合序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸)，但是在代表性的实施方案中是单链或双链DNA序列。
如本文所用，“分离的”多核苷酸(例如，“分离的DNA”或“分离的RNA”)意为至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如，通常发现的与多核苷酸相关联的细胞或病毒结构组分或或其他多肽或核酸)分离的多核苷酸。在代表性实施方案中，与起始物质相比，“分离的”核酸分子富集至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。
同样，“分离的”多肽意为至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如，通常发现的与多肽相关联的细胞或病毒结构组分或或其他多肽或核酸)分离的多肽。在代表性实施方案中，与起始物质相比，“分离的”多肽被富集至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。
如本文所用，通过“分离”或“纯化”(或语法等同物)病毒载体，意指病毒载体至少部分地与起始物质中的至少一些其他组分分离。在代表性实施方案中，与起始物质相比，“分离的”或“纯化的”病毒载体被富集至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。
如本文所用，“神经元细胞”包括感觉神经元、假单极神经元、运动神经元、多极神经元、中间神经元和/或位于脑亚结构(例如皮质、运动皮质、海马、下丘脑、纹状体、基底神经节、杏仁核、小脑、背根神经节和/或脊髓)中的双极神经元。
“治疗性蛋白质”是能够减轻、减少、预防、延迟和/或稳定由细胞或受试者中的蛋白质的缺乏或缺陷引起的症状的蛋白质，和/或是另外赋予受试者益处的蛋白质。
如本文所用的“治疗性RNA分子”或“功能性RNA分子”可以是反义核酸、核酶(例如，如美国专利No.5,877,022中所描述的)、影响剪接体介导的反式剪接的RNA(参见，Puttaraju等人(1999)Nature Biotech.17:246；美国专利No.6,013,487；美国专利No.6,083,702)、包括siRNA、shRNA或miRNA的干扰RNA(RNAi)(其介导基因沉默)(参见，Sharp等人，(2000)Science 287:2431)，和任何其他诸如“指导”RNA的非翻译RNA(Gorman等人(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:4929；Yuan等人的美国专利No.5,869,248)等，如本领域已知的。
术语“治疗”(及其语法变体)意味着受试者病况的严重程度降低，至少被部分改善或稳定，和/或实现至少一种临床症状的一些缓解、减轻、降低或稳定，和/或存在疾病或病症的进展的延迟。
术语“预防”(及其语法变体)是指，相对于在不存在本公开的方法的情况下将发生的，预防和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状的发作和/或降低疾病、病症和/或临床症状的发作的严重性。预防可以是完全的，例如完全没有疾病、病症和/或临床症状。预防也可以是部分的，使得受试者的疾病、病症和/或临床症状的发生和/或发作的严重程度小于在没有本公开时发生的情况。
如本文所用的“治疗有效”量是足以为受试者提供一些改善或益处的量。或者说，“治疗有效”量是在受试者的至少一种临床症状中提供一些缓解、减轻、降低和/或稳定的量。本领域技术人员会理解，治疗效果不需要是完整的或治愈的，只要向受试者提供一些益处即可。
本文所用的“预防有效”量是，相对于在不存在本公开的方法的情况下将发生的，足以预防和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状发作，和/或减少和/或延迟疾病、病症和/或临床症状发作的严重程度的量。本领域技术人员会理解，预防水平不需要是完全的，只要向受试者提供一些益处即可。
术语“异源核苷酸序列”和“异源核酸分子”在本文中可互换使用，并且是指非天然存在于病毒中的核酸分子和/或核苷酸序列。通常，异源核酸分子或核苷酸序列包含开放阅读框，所述开放读码框编码感兴趣蛋白质或非翻译RNA(例如，用于递送至细胞或受试者)。
如本文所用，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”是指作为核酸递送载体起作用的病毒(例如，AAV)颗粒，其包含包装在病毒体内的载体基因组(例如，病毒DNA[vDNA])。备选地，在某些情况下，术语“载体”可用于指单独的载体基因组/vDNA。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或更多个异源核酸序列的重组AAV基因组(即vDNA)。rAAV载体通常仅需要(一个或更多个)顺式末端重复序列(TR)来产生病毒。所有其他病毒序列都是非必要的并且可以以反式提供(Muzyczka(1992)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.158:97)。通常，rAAV载体基因组仅保留一个或更多个TR序列，以便最大化能够由载体有效包装的转基因的大小。结构和非结构蛋白编码序列可以反式提供(例如，从载体，诸如质粒，和/或通过将该序列稳定整合到包装细胞中)。在实施方案中，rAAV载体基因组包含至少一个末端重复(TR)序列(例如，AAV TR序列)，任选地两个TR(例如，两个AAV TR)，其通常会位于该载体基因组5'和3'末端并与该异源核酸序列侧接，但不需要与其邻接。TR可以彼此相同或不同。
术语“末端重复”或“TR”包括形成发夹结构并且起到反向末端重复序列的作用(即，介导所需功能，诸如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等等)的任何病毒末端重复序列或合成序列。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列，诸如其他细小病毒(例如，犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)的序列或任何其他合适的病毒序列(例如，用作SV40复制起点的SV40发夹)，可以用作TR，所述TR可以通过截短、置换、缺失、插入和/或添加而进一步修饰。此外，TR可以是部分或完全合成的，诸如Samulski等人的美国专利No.5,478,745中描述的“双D序列”。
“AAV末端重复序列”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或现在已知或以后发现的任何其他AAV(参见例如表1)。AAV末端重复序列不需要具有天然末端重复序列(例如，天然AAV TR序列可以通过插入、缺失、置换、截短和/或错义突变来改变)，只要末端重复序列介导所需功能，例如，复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。
本发明的病毒载体还可以是“靶向”病毒载体(例如，具有定向趋向性)和/或“杂合”细小病毒(即，其中病毒TR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)，如国际专利公开WO 00/28004和Chao等人(2000)Molecular Therapy 2:619中所述。
本公开的病毒载体还可以是如国际专利公开WO 01/92551(其公开通过引用以其整体并入本文)中所述的双链体细小病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，双链(双链体)基因组可以包装到本公开的病毒衣壳中。
此外，病毒衣壳或基因组元件可包含其他修饰，所述修饰包括插入、缺失和/或置换。
如本文所用，术语“氨基酸”涵盖任何天然存在的氨基酸，其修饰形式和合成氨基酸。
天然存在的左旋(L-)氨基酸显示在表3中。
此外，非天然存在的氨基酸可以是Wang等人Annu Rev Biophys BiomolStruct.35:225-49(2006)中所描述的“非天然”氨基酸。这些非天然氨基酸可有利地用于将感兴趣的分子化学连接至AAV衣壳蛋白。
经修饰的AAV衣壳蛋白以及包含其的病毒衣壳和病毒载体。
本公开提供了在氨基酸序列中包含突变(即，修饰，其可以是置换或插入或缺失)的AAV衣壳蛋白，以及包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒衣壳和病毒载体。突变的AAV衣壳蛋白和编码它们的核酸在自然界中未发现(即，是非天然的)，并且既不具有在自然界中发现的野生型序列的序列，也不具有这些序列的功能。相反，本发明人已发现本文所描述的氨基酸位置的修饰能够赋予包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒载体一种或更多种所需特性，所需特性包括但不限于：(i)全身注射后在穿过血脑屏障后神经元细胞的选择性转导；(ii)全身注射后心脏组织和神经组织的同时转导；(iii)从肝脏、脾脏、肾脏和其他外周器官中去靶向。
在具体的实施方案中，本公开的经修饰的AAV衣壳蛋白包含天然AAV1衣壳蛋白的氨基酸序列中或来自另一AAV血清型的衣壳蛋白的相应氨基酸残基中的一个或更多个突变(即修饰)，包括但不限于AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10。“对应于”天然AAV1衣壳蛋白中的这些位置的其他AAV血清型或经修饰的AAV衣壳中的氨基酸位置对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以使用序列比对技术(参见例如WO 2006/066066的图7)和/或晶体结构分析(Padron等人(2005)J.Virol.79:5047-58)容易地确定。
本领域技术人员会理解，对于一些AAV衣壳蛋白，相应的修饰会是插入和/或置换，这取决于相应的氨基酸位置是否部分或完全存在于病毒中，或者是否完全不存在。同样地，当修饰AAV而非AAV1时，特定氨基酸位置可以与AAV1中的位置不同(使用VP1编号)。如本文其他地方所讨论的，使用公知的技术，相应的氨基酸位置对于本领域技术人员而言是显而易见的。
如本文所用，氨基酸序列中的“突变”或“修饰”包括置换、插入和/或缺失，每种可涉及一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸。在特定实施方案中，所述修饰是置换。在其他实施方案中，所述修饰是(例如，氨基酸序列中两个氨基酸残基之间的单个氨基酸残基的)插入。
因此，在一个实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基S262、A263、S264、T265、A267和S268处的修饰，和在残基266和267(VP1编号)之间的单个氨基酸残基插入，其中每个残基的编号基于AAV1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列或AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ IDNO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白可包含在氨基酸残基H272处的修饰。在特定实施方案中，修饰是S262N、A263G、S264T、T265S、A267S、S268T、H272T及其组合。在特定实施方案中，在残基266和267之间的单个氨基酸残基插入是G(指定为-267G)。
在一些实施方案中，本发明的AVV衣壳蛋白能够进一步包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基Q148、E152、S157、T162、H272、T326、D328、V330、T331、V341和S345处的修饰，以及残基152和153(VP1编号)之间的单个氨基酸残基插入，其中每个残基的编号基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中的等同氨基酸残基。在特定实施方案中，修饰是Q148P、E152R、S157T、T162K、H272T、T326Q、D328E、V330T、T331K、V341I和S345T。在特定实施方案中，在残基152和153之间的单个氨基酸残基插入是S(指定为-153S)。
在一些实施方案中，上文描述的AAV衣壳蛋白能够进一步包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：氨基酸残基L188、S205、N223、A224和H272(VP1编号)的修饰，其中每个残基的编号基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中的等同氨基酸残基。在特定实施方案中，修饰是L188I、S205A、N223S、A224S和H272T。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基S262、A263、S264、T265和A267(VP1编号)处的修饰，和在残基S268和N269之间的单个氨基酸残基插入，其中各个残基的编号基于AAV1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列或AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰是S262N、A263G、S264T、T265S和A267S中的至少一个。在一些实施方案中，AAV衣壳可进一步包含在氨基酸残基H272处的修饰，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白可进一步包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基Q148、E152、S157、T162、H272、T326、D328、V330、T331、V341和S345处的修饰，以及在残基E152和P153之间的单个氨基酸残基插入。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基L188、S205、N223、A224和H272处的修饰。在一些实施方案中，修饰是L188I、S205A、N223S、A224S和H272T中的至少一个。在一些实施方案中，在残基S268和N269之间的氨基酸残基插入是单个T残基的插入。在一些实施方案中，在残基E152和P153之间的氨基酸残基插入是单个S残基的插入。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：产生以下氨基酸序列的修饰：在对应于天然AAV1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置262至265(VP1编号)的氨基酸处的X1-X2-X3-X4(SEQID NO:35)，其中X1是除S以外的任意氨基酸；其中X2是除A以外的任意氨基酸；其中X3是S以外的任意氨基酸；其中X4是T以外的任意氨基酸。45.在一些实施方案中，氨基酸X1是N，氨基酸X2是G，氨基酸X3是T，或氨基酸X4是S。在一些实施方案中，氨基酸X1是N，氨基酸X2是G，氨基酸X3是T，氨基酸X4是S。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白进一步包含氨基酸残基H272的修饰。在一些实施方案中，修饰是H272T。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白进一步包含氨基酸残基S268和N269之间的氨基酸残基插入。在一些实施方案中，氨基酸残基插入是单个T残基的插入。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基S262、A263、S264、T265、A267和H272处的修饰，和在残基S268和N269之间的单个氨基酸残基插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV1(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV3(SEQ IDNO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰包括S262N、A263G、S264T、T265S、A267G和H272T中的至少一个。在一些实施方案中，在残基S268和N269之间的天然单个氨基酸残基插入是单个T残基的插入。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基S262、Q263、S264、A266、S267和H271处的修饰，和在残基S261和S262之间的至少一个氨基酸残基的插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV3(SEQID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ IDNO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰包括S262T、Q263S、S264G、A266S、S267T和H271T中的至少一个。在一些实施方案中，在残基SS61和S262之间的插入是单个氨基酸残基的插入。在一些实施方案中，在残基S251和S252之间的插入是多于一个氨基酸残基的插入。在一些实施方案中，在残基S251和S252之间的插入是N和G残基的插入。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基S262、Q263、S264、A266、A267、H271处的修饰，和在残基S261和S262之间的单个氨基酸残基插入，其中每个残基的编号基于AAV3(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV6(SEQID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰包括S262T、Q263S、S264G、A266S、A267T、H271T中的至少一个。在一些实施方案中，在残基SS61和S262之间的插入是单个氨基酸残基或多于一个氨基酸残基的插入。在一些实施方案中，在残基S251和S252之间的插入是N和G残基的插入。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：在氨基酸残基S263、S269、A237(VP1编号)处的修饰，其中每个残基的编号基于AAV9(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列或在AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰包括S263G、S269T和A273T中的至少一个。
在一些实施方案中，本公开提供腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:34中任一个的序列。
分别在AAV血清型1、2、3、6、7、8和9中产生本公开的衣壳蛋白的修饰的非限制性实例显示于表2中，其中在各AAV血清型中的等同氨基酸残基被鉴定。
在进一步的实施方案中，本公开的衣壳蛋白可包含下述，基本上由下述组成或由下述组成：SEQ ID NO:9的氨基酸序列(AAV1RX)；SEQ ID NO:10的氨基酸序列(AAV2RX)；SEQID NO:11的氨基酸序列(AAV3RX)；SEQ ID NO:12的氨基酸序列(AAV6RX)；SEQ ID NO:13的氨基酸序列(AAV7RX)；SEQ ID NO:14的氨基酸序列(AAV8RX)；SEQ ID NO:15的氨基酸序列(AAV9RX)；SEQ ID NO:16的氨基酸序列(AAV1R6)；SEQ ID NO:17的氨基酸序列(AAV2R6)；SEQ ID NO:18的氨基酸序列(AAV3R6)；SEQ ID NO:19的氨基酸序列(AAV6R6)；SEQ ID NO:20的氨基酸序列(AAV7R6)；SEQ ID NO:21的氨基酸序列(AAV8R6)；SEQ ID NO:22的氨基酸序列(AAV9R6)；SEQ ID NO:23的氨基酸序列(AAV1R7)；SEQ ID NO:24的氨基酸序列(AAV2R7)；SEQ ID NO:25的氨基酸序列(AAV3R7)；SEQ ID NO:26的氨基酸序列(AAV6R7)；SEQ ID NO:27的氨基酸序列(AAV7R7)；SEQ ID NO:28的氨基酸序列(AAV8R7)；和SEQ IDNO:29的氨基酸序列(AAV9R7)。在一个实施方案中，本公开的衣壳蛋白具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列(AAV1RX)。在一个实施方案中，本公开的衣壳蛋白具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列(AAV1R6)。在一个实施方案中，本公开的衣壳蛋白具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列(AAV1R7)。
在一些实施方案中，本公开提供了AAV衣壳蛋白，其与以下具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％，包括其间的所有范围和子范围，的序列同一性：SEQID NO:9的氨基酸序列(AAV1RX)；SEQ ID NO:10的氨基酸序列(AAV2RX)；SEQ ID NO:11的氨基酸序列(AAV3RX)；SEQ ID NO:12的氨基酸序列(AAV6RX)；SEQ ID NO:13的氨基酸序列(AAV7RX)；SEQ ID NO:14的氨基酸序列(AAV8RX)；和SEQ ID NO:15的氨基酸序列(AAV9RX)。
在一些实施方案中，本公开提供了AAV衣壳蛋白，其与以下具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％，包括其间的所有范围和子范围，的序列同一性：SEQID NO:16的氨基酸序列(AAV1R6)；SEQ ID NO:17的氨基酸序列(AAV2R6)；SEQ ID NO:18的氨基酸序列(AAV3R6)；SEQ ID NO:19的氨基酸序列(AAV6R6)；SEQ ID NO:20的氨基酸序列(AAV7R6)；SEQ ID NO:21的氨基酸序列(AAV8R6)；SEQ ID NO:22的氨基酸序列(AAV9R6)。
在一些实施方案中，本公开提供了AAV衣壳蛋白，其与以下的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％，包括其间的所有范围和子范围，的序列同一性：SEQ ID NO:23的氨基酸序列(AAV1R7)；SEQ ID NO:24的氨基酸序列(AAV2R7)；SEQ IDNO:25的氨基酸序列(AAV3R7)；SEQ ID NO:26的氨基酸序列(AAV6R7)；SEQ ID NO:27的氨基酸序列(AAV7R7)；SEQ ID NO:28的氨基酸序列(AAV8R7)；和SEQ ID NO:29的氨基酸序列(AAV9R7)。
本公开还提供了腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中AAV衣壳蛋白在所有位置或少于所有位置的任何组合中包含一个或更多个置换，产生氨基酸序列：X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO:35)。在一些实施方案中，氨基酸序列的修饰：X1-X2-X3-X4位于对应于天然AAV1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置262至265(VP1编号)的氨基酸处。在一些实施方案中，X1可以是除S之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，X2可以是除A以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，X3可以是除S以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，X4可以是除了T之外的任何氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸X1是N。在一个实施方案中，氨基酸X2是G。在一个实施方案中，氨基酸X3是T。在一个实施方案中，氨基酸X4是S。在另一个实施方案中，X1是N，X2是G，X3是T，和X4是S。在一些实施方案中，X1至X4之一未被置换，并且未置换位置处的氨基酸残基是野生型氨基酸残基。
可以用于置换在本文描述的各个位置处的天然氨基酸的氨基酸残基的实例列于表3中。
应理解，本公开的AAV衣壳蛋白中描述的置换和插入可包括用保守氨基酸残基的置换和/或插入。这种保守置换是本领域熟知的，并且包括例如非极性氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp和Pro可互相置换；极性氨基酸Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln可互相置换；带负电荷的氨基酸Asp和Glu可以互相置换；带正电的氨基酸Lys、Arg和His可以相互置换，以任何组合。
本公开还提供了包含本公开的衣壳蛋白的AAV衣壳，以及包含本公开的AAV衣壳的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包含下述、基本上由下述组成或由下述组成：包含本公开的AAV衣壳的病毒载体；和包含至少一个末端重复序列的核酸分子，其中所述核酸被AAV衣壳包壳。在一些实施方案中，末端重复序列是AAV末端重复序列。在一些实施方案中，末端重复序列是非AAV末端重复序列。
本文还提供了在药学上可接受的载体中的包含本公开的衣壳蛋白和/或病毒载体的组合物。
本公开还提供了几种方法，包括将核酸分子引入细胞的方法，包括使细胞与本公开的病毒载体和/或组合物接触，例如，在由此病毒载体被细胞容纳或内化且通过该病毒载体引入的核酸分子在该细胞中表达的条件下。
本文还提供了将核酸分子递送至受试者的方法，其包括向受试者施用本公开的病毒载体和/或组合物。在特定实施方案中，将所述病毒载体和/或组合物施用至受试者的中枢神经系统。在特定的实施方案中，将所述病毒载体和/或组合物穿过血脑屏障递送。
在一些实施方案中，本公开的病毒载体可包含感兴趣的核酸分子。在一些实施方案中，感兴趣的核酸分子能够编码治疗性蛋白质或治疗性RNA分子。
本公开还提供选择性递送感兴趣的核酸分子至神经元细胞的方法，其包括使所述神经元细胞与本公开的病毒载体接触，其中所述病毒载体包含感兴趣的核酸分子。在进一步的实施方案中，该方法可另外包括选择性地将感兴趣的核酸分子递送至心肌细胞，例如，当该方法在受试者(例如，人受试者)中进行时。在一些实施方案中，将组合物选择性递送至神经元细胞。在一些实施方案中，将组合物选择性地递送至心肌细胞。
在另一个实施方案中，本公开提供用于治疗受试者的神经障碍或缺陷的方法，其包括向所述受试者施用本公开的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码在治疗神经障碍或缺陷中有效的治疗性蛋白质或治疗性RNA的核酸分子。
本文另外提供了用于治疗受试者的神经和心血管障碍或缺陷的方法，其包括向所述受试者施用本公开的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码在治疗神经和心脏障碍或缺陷中有效的治疗性蛋白质或治疗性RNA的核酸分子。
在本文所述的方法中，本公开的病毒载体和/或组合物可通过全身途径(例如，静脉内、动脉内、腹膜内等)施用/递送至本公开的受试者。在一些实施方案中，病毒载体和/或组合物可以通过脑室内(intracerebroventrical)，脑池内，实质内，颅内和/或鞘内途径施用至受试者。
在一些实施方案中，病毒载体和/或组合物对受试者的全身施用导致脱靶组织(例如，除中枢神经系统之外)的较低转导。在本公开的一些实施方案中，病毒载体从脾脏、肝脏和/或肾脏中去靶向(detarget)。在一些实施方案中，病毒载体从脾细胞、肝细胞和/或肾细胞中去靶向。在一些实施方案中，与通过AAVrh.10的转导相比，病毒载体以降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的水平转导肝脏、脾脏和/或肾脏，其中病毒转导任选地通过荧光素酶或GFP表达来确定。优选地，与通过AAVrh.10的转导相比，病毒载体以降低至少50％-100％或80％-90％的水平转导肝脏、脾脏和/或肾脏，其中病毒转导任选地通过荧光素酶或GFP表达来确定。
在一些实施方案中，与通过AAV1的转导相比，病毒载体以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的水平转导脑，其中病毒转导任选地通过荧光素酶或GFP表达来确定。优选地，与通过AAV1的转导相比，病毒载体以增加至少2倍、2.5倍、3倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍的水平转导脑，其中病毒转导任选地通过荧光素酶或GFP表达来确定。在一些实施方案中，病毒载体选择性地转导神经元。
本公开预期本公开的经修饰的衣壳蛋白可以通过修饰现在已知或以后发现的任何AAV的衣壳蛋白来产生。此外，待修饰的AAV衣壳蛋白可以是天然存在的AAV衣壳蛋白(例如，AAV2、AAV3a或3b，AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10或表1中所示的任何AAV血清型)，但不是如此有限。本领域技术人员会理解，对AAV衣壳蛋白的各种操作是本领域已知的，并且本公开不限于天然存在的AAV衣壳蛋白的修饰。例如，与天然存在的AAV相比，待修饰的衣壳蛋白可能已经具有修饰(例如，来源于天然存在的AAV衣壳蛋白，例如AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和/或AAV12或现在已知或以后发现的任何其他AAV)。此类AAV衣壳蛋白也在本公开的范围内。
因此，在特定实施方案中，待修饰的AAV衣壳蛋白可以来源于天然存在的AAV，但是可以进一步包含一个或更多个外来序列(例如，天然病毒的外源序列)，所述外来序列被插入和/或置换入该衣壳蛋白中和/或已经通过一个或更多个氨基酸的缺失而改变。
因此，当在本文中提及特定AAV衣壳蛋白(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12衣壳蛋白或来自表1所示的任何AAV血清型的衣壳蛋白等)时，旨在涵盖天然衣壳蛋白以及具有除本公开的修饰之外的改变的衣壳蛋白。这些改变包括置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，与天然AAV衣壳蛋白序列相比，所述衣壳蛋白可包含插入其中的(除了本发明的插入之外的)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，少于20、少于30、少于40、少于50、少于60或少于70个氨基酸。在本公开的实施方案中，与天然AAV衣壳蛋白序列相比，所述衣壳蛋白可包含(除了根据本发明的氨基酸置换之外的)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，少于20、少于30、少于40、少于50、少于60或少于70个氨基酸置换。在实施方案中，与天然AAV衣壳蛋白序列相比，所述衣壳蛋白可包含(除了本发明的氨基酸缺失之外的)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，少于20、少于30、少于40、少于50、少于60或少于70个氨基酸的缺失。
在特定实施方案中，AAV衣壳蛋白具有天然AAV衣壳蛋白序列或具有与天然AAV衣壳蛋白序列至少约90％、95％、97％、98％或99％相似或同一性的氨基酸序列。例如，在特定实施方案中，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12等衣壳蛋白涵盖天然AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12衣壳蛋白序列以及与天然AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12衣壳蛋白序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相似或同一性的序列。
确定两个或更多个氨基酸序列之间的序列相似性或同一性的方法是本领域已知的。序列相似性或同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定，包括但不限于Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2,482(1981)的局部序列同一性算法，通过Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48,443(1970)的序列同一性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包，Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，由Devereux等人Nucl.Acid Res.12,387-395(1984)描述的最佳拟合序列程序，或通过检查。
另一种合适的算法是BLAST算法，其描述于Altschul等人J.Mol.Biol.215,403-410,(1990)和Karlin等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5787(1993)。一种特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获得自Altschul等人Methods in Enzymology,266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html。WU-BLAST-2使用若干个搜索参数，所述参数任选地设置为默认值。
此外，另一种有用的算法是如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402报道的有缺口的BLAST。
修饰的病毒衣壳可以用作“衣壳载体”，如例如美国专利No.5,863,541中所述。可以通过修饰的病毒衣壳包装并转移到细胞中的分子包括异源DNA、RNA、多肽、小有机分子、金属或其组合。
异源分子定义为在AAV感染中非天然存在的那些，例如，不由野生型AAV基因组编码的那些。此外，治疗上有用的分子可以与嵌合病毒衣壳的外部相关联，用于将分子转移到宿主靶细胞中。此类相关联的分子可包括DNA、RNA、小有机分子、金属，碳水化合物、脂质和/或多肽。在本公开的一个实施方案中，将治疗上有用的分子共价连接(即缀合或化学偶联)至衣壳蛋白。共价连接分子的方法是本领域技术人员已知的。
本公开的经修饰的病毒衣壳还发现作为模板用于进一步修饰抗原性以逃避任何哺乳动物血清中的中和抗体的用途，例如PCT申请序列号PCT/2016/054143中所述。
本公开的经修饰的病毒衣壳还发现在产生(raise)针对新型衣壳结构的抗体方面的用途。作为另一种备选方案，可以将外源氨基酸序列插入经修饰的病毒衣壳中用于对细胞的抗原呈递，例如，施用至受试者以产生对外源氨基酸序列的免疫应答。
在其他实施方案中，可在施用递送编码感兴趣的多肽、肽和/或功能性RNA的核酸分子的病毒载体之前和/或同时(例如，在彼此的数分钟或数小时内)，施用病毒衣壳以阻断某些细胞位点。例如，可以递送本发明的衣壳以阻断特定细胞上的细胞受体，并且递送载体可以随后或同时施用，这可以减少阻断细胞的转导，并增强其他靶标的转导。
根据代表性实施方案，经修饰的病毒衣壳可以在根据本公开的经修饰的病毒载体之前和/或同时施用至受试者。此外，本公开提供了包含本发明的经修饰的病毒衣壳的组合物和药物制剂；任选地，该组合物还包含本公开的经修饰的病毒载体。
本公开还提供编码本公开的经修饰的病毒衣壳和衣壳蛋白的核酸分子(任选地，分离的核酸分子)。还提供了包含核酸分子的载体，和包含本公开的核酸分子和/或载体的细胞(体内或培养的)。合适的载体包括但不限于病毒载体(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、甲病毒、牛痘、痘病毒、杆状病毒等)、质粒、噬菌体、YAC、BAC等。此类核酸分子、载体和细胞可用作，例如，用于产生如本文所述的经修饰的病毒衣壳或病毒载体的试剂(例如，包装构建体或包装细胞的辅助子)。
根据本发明的病毒衣壳可以使用本领域已知的任何方法(例如通过从杆状病毒表达(Brown等人(1994)Virology 198:477-488)产生。
根据本发明的对AAV衣壳蛋白的修饰是“选择性”修饰。该方法与使用AAV血清型之间的整个亚基或大结构域交换的先前工作形成对比(参见例如，国际专利公开WO 00/28004；Hauck等人(2003)J.Virology 77:2768-2774；Shen等人(2007)Mol Ther.15(11):1955-62；和Mays等人(2013)J Virol.87(17):9473-85)。据发明人所知，本发明的AAV衣壳蛋白是使穿过血脑屏障成为可能的特定氨基酸变化的第一个实例。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白含有使穿过血脑屏障成为可能的特定氨基酸变化。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸的置换，其中置换的氨基酸源自AAVrh.10，其中所述氨基酸置换使穿过血脑屏障成为可能。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白源自AAV1衣壳蛋白，且包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸的置换，其中置换的氨基酸源自AAVrh.10，其中所述氨基酸置换使穿过血脑屏障成为可能。在一些实施方案中，使穿过血脑屏障成为可能的特定氨基酸是262N、263G、264T、265S、267G、268S、269T和273T(VP1编号)，其中每个残基的编号基于氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:30。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白含有特定的氨基酸变化，所述特定的氨基酸变化使从肝脏、肾脏和/或脾脏去靶向成为可能。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸的置换，其中置换的氨基酸源自AAVrh.10，其中所述氨基酸置换使从肝脏、肾脏和/或脾脏去靶向成为可能。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白源自AAV1衣壳蛋白，且包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸，其中置换的氨基酸源自AAVrh.10，其中所述氨基酸置换使从肝脏、肾脏和/或脾脏去靶向成为可能。
在一些实施方案中，置换的氨基酸位于衣壳的VR-I区。在一些实施方案中，置换的氨基酸位于衣壳的表面上。在一些实施方案中，置换的氨基酸位于在衣壳的3倍对称轴的突起的基部。在一些实施方案中，置换的氨基酸位于衣壳的2倍对称轴的凹陷中。在一些实施方案中，置换的氨基酸位于衣壳蛋白的VR-II区内，DE-环内。在一些实施方案中，置换的氨基酸位于衣壳的β链E内。
在特定实施方案中，“选择性”修饰导致小于约20、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个邻接的氨基酸的插入和/或置换和/或缺失。
本公开的经修饰的衣壳蛋白和衣壳可进一步包含现在已知或以后鉴定的任何其他修饰。
例如，本公开的AAV衣壳蛋白和病毒衣壳可以是嵌合的，因为它们可以包含来自另一种病毒(任选地另一种细小病毒或其他的AAV血清型)的衣壳亚基的全部或部分，例如，如国际专利公开WO 00/28004中所述。
病毒衣壳可包含靶向序列(例如，置换和/或插入病毒衣壳中)，所述靶向序列指导病毒衣壳与存在于所需的靶组织上的细胞表面分子相互作用(参见，例如，国际专利公开WO00/28004和Hauck等人(2003)J.Virology 77:2768-2774)；Shi等人Human Gene Therapy17:353-361(2006)[描述整联蛋白受体结合基序RGD在AAV衣壳亚基的位置520和/或584处的插入]；美国专利No.7,314,912[描述在AAV2衣壳亚基的氨基酸位置447、534、573和587之后的含有RGD基序的P1肽的插入]和国际专利公开No.WO 2015038958[描述显示增加的CNS转导的含肽序列的AAV载体的选择性回收])。耐受插入的AAV衣壳亚基内的其他位置是本领域已知的(例如Grifman等人Molecular Therapy 3:964-975(2001)描述的位置449和588)。
例如，本公开的一些病毒衣壳针对大多数感兴趣的靶组织(例如，肝脏、骨骼肌、心脏、膈肌、肾、脑、胃、肠、皮肤、内皮细胞和/或肺)具有相对低效的趋向性。靶向序列可以有利地掺入这些低转导载体中，从而赋予病毒衣壳所需的趋向性和任选地对特定组织的选择性趋向性。包含靶向序列的AAV衣壳蛋白、衣壳和载体载体描述于例如国际专利公开WO 00/28004中。作为另一种可能性，可以将如Wang等人(Annu Rev Biophys Biomol Struct.35:225-49(2006))描述的一个或更多个非天然存在的氨基酸掺入正交位点的AAV衣壳亚基中，作为将低转导载体重定向至所需靶组织的手段。这些非天然氨基酸可有利地用于将感兴趣的分子化学连接至AAV衣壳蛋白，包括但不限于：聚糖(甘露糖-树突细胞靶向)；RGD，铃蟾肽或神经肽用于靶向递送至特定癌细胞类型；选自靶向特定细胞表面受体(如生长因子受体、整联蛋白等)的噬菌体展示的RNA适体或肽。化学修饰氨基酸的方法是本领域已知的(参见例如Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,第一版,Academic Press,1996)。
在代表性实施方案中，靶向序列可以是将感染引导至特定细胞类型的病毒衣壳序列(例如，自主细小病毒衣壳序列、AAV衣壳序列或任何其他病毒衣壳序列)。
作为另一个非限制性实例，可将肝素结合结构域(例如，呼吸道合胞病毒肝素结合结构域)插入或置换到通常不结合硫酸乙酰肝素(HS)受体的衣壳亚基(例如，AAV 4，AAV5)中，以使得肝素与所得突变体结合。
作为另一个非限制性实例，氨基酸足迹，其能够使结合至聚糖(例如半乳糖，唾液酸，甘露糖，乳糖，磺基-N-乳糖胺，半乳糖胺，葡萄糖，葡糖胺，果糖，岩藻糖，神经节苷脂，壳三糖，硫酸软骨素，硫酸角蛋白、硫酸皮肤素)成为可能，可以接枝到衣壳亚基上，所述衣壳亚基通常不结合上文列出的一种或更多种糖[例如，题为Methods and compositions fordual glycan binding AAV vectors的美国专利公开No.US20160017005]。
B19感染原代红细胞类祖细胞以红细胞糖苷脂为受体(Brown等人(1993)Science262:114)。B19的结构已确定至分辨率(Agbandje-McKenna等人(1994)Virology 203:106)。结合至红细胞糖苷脂的B19衣壳的区域已经在氨基酸399-406之间映射(Chapman等人(1993)Virology 194:419)，β-桶结构E和F之间的环状区域(Chipman等人(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93:7502)。因此，B19衣壳的红细胞糖苷脂受体结合结构域可以被置换到AAV衣壳蛋白中，以将包含其的病毒衣壳或病毒载体靶向至类红细胞。
在代表性实施方案中，外源靶向序列可以是编码肽的任何氨基酸序列，所述肽改变包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒衣壳或病毒载体的趋向性。在特定的实施方案中，靶向肽或蛋白质可以是天然存在的，或备选地可以是完全或部分合成的。示例性靶向序列包括配体和结合至细胞表面受体和糖蛋白的其他肽，例如RGD肽序列、缓激肽、激素、肽生长因子(例如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子I和II等)、细胞因子、，黑色素细胞刺激激素(例如，α，β或γ)、神经肽和内啡肽等，以及保留将细胞靶向至其同源受体的能力的他们的片段。其他说明性肽和蛋白质包括物质P、角质化细胞生长因子、神经肽Y、胃泌素释放肽、白细胞介素2、鸡蛋清溶菌酶、促红细胞生成素、促性腺激素释放素、皮质稳定素、β-内啡肽、亮氨酸脑啡肽、强啡肽B(rimorphin)、α-新脑啡肽、血管紧张素、pneumadin、血管活性肠肽、神经降压素、促胃动素及如上所述的其片段。作为另一种备选方案，来自毒素的结合结构域(例如破伤风毒素或蛇毒素，例如α-银环蛇毒素等)可以作为靶向序列被置换到衣壳蛋白中。在另一个代表性实施方案中，AAV衣壳蛋白可以通过如Cleves(Current Biology 7:R318(1997))所述的将“非经典的”输入/输出信号肽(例如，成纤维细胞生长因子-1和-2、白细胞介素1、HIV-1Tat蛋白、疱疹病毒VP22等)置换入AAV衣壳蛋白来修饰。还涵盖指导特定细胞摄取的肽基序，例如FVFLP肽基序触发由肝细胞的摄取。
噬菌体展示技术以及本领域已知的其他技术可用于鉴定识别任何感兴趣的细胞类型的肽。
靶向序列可以编码靶向至细胞表面结合位点(包括受体(例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白或蛋白多糖))的任何肽。细胞表面结合位点的实例包括但不限于硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和其他糖胺聚糖，唾液酸部分，聚唾液酸部分，糖蛋白和神经节苷脂，MHC I糖蛋白，膜糖蛋白上发现的碳水化合物组分，包括：甘露糖，N-乙酰基-半乳糖胺，N-乙酰基-葡糖胺，岩藻糖，半乳糖等。
作为又一备选方案，靶向序列可以是能够用于化学偶联至另一个靶向进入细胞的分子的肽(例如，可以包含能够通过其R基团化学偶联的精氨酸和/或赖氨酸残基)。
上述修饰可以彼此组合和/或与现在已知或以后发现的任何其他修饰组合掺入到本公开的衣壳蛋白或衣壳中。
本公开还涵盖包含本公开的经修饰的衣壳蛋白和衣壳的病毒载体。在特定的实施方案中，病毒载体是细小病毒载体(例如，包含细小病毒衣壳和/或载体基因组)，例如AAV载体(例如，包含AAV衣壳和/或载体基因组)。在代表性的实施方案中，病毒载体包含经修饰的AAV衣壳，所述经修饰的AAV衣壳包含本公开的修饰的衣壳亚基和载体基因组。
例如，在代表性实施方案中，病毒载体包含：(a)经修饰的病毒衣壳(例如，经修饰的AAV衣壳)，其包含本公开的经修饰的衣壳蛋白；和(b)包含末端重复序列(例如AAV TR)的核酸，其中包含末端重复序列的核酸被经修饰的病毒衣壳包壳。该核酸可任选地包含两个末端重复序列(例如，两个AAV TR)。
在代表性实施方案中，病毒载体是重组病毒载体，其包含编码感兴趣的蛋白质或功能性RNA的异源核酸分子。下面更详细地描述重组病毒载体。
本领域技术人员将理解，本公开的修饰的衣壳蛋白、病毒衣壳和病毒载体排除那些在其天然状态下在指定位置具有指定氨基酸的衣壳蛋白、衣壳和病毒载体(即，不是突变体)。
产生病毒载体的方法
本公开还提供了产生本发明病毒载体的方法。在一个代表性实施方案中，本公开提供了产生病毒载体的方法，该方法包括向细胞提供：(a)包含至少一个TR序列(例如，AAVTR序列)的核酸模板，和(b)AAV序列，其足以复制核酸模板且足以衣壳化至AAV衣壳内(例如，编码本公开的AAV衣壳的AAV rep序列和AAV cap序列)。任选地，核酸模板还包含至少一个异源核酸序列。在特定实施方案中，核酸模板包含两个AAV ITR序列，其位于异源核酸序列(如果存在)的5'和3'，尽管它们不需要与其直接邻接。
在以下条件下提供核酸模板和AAV rep和cap序列：包含在AAV衣壳内包装的核酸模板的病毒载体在细胞中产生。该方法可以进一步包括从细胞收集病毒载体的步骤。病毒载体能够从培养基中和/或通过裂解细胞收集。
细胞可以是允许AAV病毒复制的细胞。可以采用本领域已知的任何合适的细胞。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。作为另一选择，细胞可以是反式互补包装细胞系，所述反式互补包装细胞系提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能，例如293细胞或其他E1a反式互补细胞。
AAV复制和衣壳序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案通常在单个质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能是方便的。AAV rep和/或cap序列可以由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入至缺失的腺病毒载体的E1a或E3区中)。EBV载体也可用于表达AAV cap和rep基因。这种方法的一个优点是EBV载体是附加的，但始终在连续的细胞分裂中将保持高拷贝数(即，作为染色体外元件稳定整合到细胞中，指定为“基于EBV的核附加体”，参见Margolski(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67)。
作为另一种备选方案，rep/cap序列可以稳定地整合到细胞中。
通常，AAV rep/cap序列不会被TR侧接，以防止这些序列的拯救和/或包装。
可以使用本领域已知的任何方法将核酸模板提供给细胞。例如，模板可以由非病毒(例如质粒)或病毒载体供应。在特定实施方案中，核酸模板由疱疹病毒或腺病毒载体供应(例如，被插入至缺失的腺病毒的E1a或E3区中)。作为另一个例证，Palombo等人(1998)J.Virology 72:5025描述了携带侧接AAV TR的报告基因的杆状病毒载体。EBV载体也可应用于递送模板，如上文关于rep/cap基因所述。
在另一个代表性实施方案中，核酸模板由复制的rAAV病毒提供。在又另外的实施方案中，包含核酸模板的AAV原病毒稳定整合到细胞的染色体中。
为了增强病毒滴度，可以向细胞提供促进产生性AAV感染的辅助病毒功能(例如，腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所必需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。备选地，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒或病毒载体提供，例如，作为非感染性腺病毒小质粒，其携带促进有效AAV产生的所有辅助基因(如由Ferrari等人,(1997)Nature Med.3:1295,和美国专利No.6,040,183和6,093,570所述)。
此外，辅助病毒功能可通过用嵌入染色体中的或保持为稳定的染色体外元件的辅助序列包装细胞来提供。通常，辅助病毒序列不能包装到AAV病毒粒子中，例如，不侧接TR。
本领域技术人员会理解，提供AAV复制以及在单一辅助构建体上的衣壳序列和辅助病毒序列(例如，腺病毒序列)可能是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性说明，辅助构建体可以是包含AAV rep/cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。
在一个特定的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体供应。此载体还可以进一步包含核酸模板。可以将AAV rep/cap序列和/或rAAV模板插入到腺病毒的缺失区域(例如，E1a或E3区域)中。
在进一步的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体供应。根据该实施方案，rAAV模板可以作为质粒模板提供。
在另一个说明性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且rAAV模板作为原病毒整合到细胞中。备选地，rAAV模板由EBV载体提供，所述EBV载体作为染色体外元件(例如，作为基于EBV的核附加体)维持在细胞内。
在另一个示例性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助子提供。rAAV模板可以作为分离的复制病毒载体提供。例如，rAAV模板可以由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据前述方法，杂合腺病毒载体通常包含足以用于腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即腺病毒末端重复序列和PAC序列)。将AAV rep/cap序列和rAAV模板(如果存在的话)嵌入腺病毒骨架中并与5'和3'顺式序列侧接，以便这些序列可以包装到腺病毒衣壳中。如上所述，腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列通常不与TR侧接，以便这些序列不被包装到AAV病毒粒子中。
Zhang等人((2001)Gene Ther.18:704-12)描述了包含腺病毒和AAV rep和cap基因的嵌合辅助子。
疱疹病毒也可用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码AAV Rep蛋白的杂合疱疹病毒可有利地促进可扩展的AAV载体生产方案。表达AAV-2rep和cap基因的杂合单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体已经描述于(Conway等人(1999)Gene Therapy 6:986和WO 00/17377。
作为另一种备选方案，如例如Urabe等人(2002)Human Gene Therapy 13:1935-43所描述的，可使用杆状病毒载体以递送rep/cap基因和rAAV模板，在昆虫细胞中产生本公开的病毒载体。
可以通过本领域已知的任何方法获得不含污染性辅助病毒的AAV载体原液。例如，可以基于大小容易地区分AAV和辅助病毒。AAV也可以基于亲和层析与辅助病毒分离[例如，对于肝素底物(Zolotukhin等人(1999)Gene Therapy 6:973)，或使用亲和树脂(Wang等人(2015),Mol Ther Methods Clin Dev 2:15040)或例如其他方法(综述于Qu等人(2015)Curr Pharm Biotechnol.16(8):684-95)]。可以使用删除的复制缺陷型辅助病毒，以便任何污染的辅助病毒都不具有复制能力。作为另一种备选方案，可以采用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助细胞，因为仅需要腺病毒早期基因表达来介导AAV病毒的包装。对于晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100K和ts149腺病毒突变体)。
重组病毒载体
本公开的病毒载体可用于在体外、离体和体内将核酸递送至细胞。特别地，病毒载体可以有利地用于将核酸递送或转移至动物，包括哺乳动物，的细胞。
可以在本公开的病毒载体中递送任何感兴趣的异源核酸序列。感兴趣的核酸包括编码多肽和/或功能性或治疗性RNA分子的核酸，所述多肽包括治疗性(例如，用于医学或兽医用途)或免疫原性(例如用于疫苗)蛋白质。
治疗性多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)，肌养蛋白(包括小肌养蛋白和微肌养蛋白，参见例如Vincent等人(1993)Nature Genetics 5:130；美国专利公开No.2003/017131；国际公开WO/2008/088895,Wang等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13714-13719(2000)；和Gregorevic等人Mol.Ther.16:657-64(2008))，肌肉生长抑制素(myostatin)前肽，卵泡抑素，活化素II型可溶性受体，IGF-1，抗炎多肽如Ikappa B显性突变体，肌长(sarcospan)，肌营养相关蛋白(utrophin)(Tinsley等人(1996)Nature 384:349)，小子宫磷脂(mini-utrophin)，凝血因子(例如，因子VIII，因子IX，因子X等)，促红细胞生成素，血管他丁，内皮他丁，过氧化氢酶，酪氨酸羟化酶，超氧化物歧化酶，来普汀，LDL受体，脂蛋白脂肪酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，β-珠蛋白，α-珠蛋白，血影蛋白，α1-抗胰蛋白酶，腺苷脱氨酶，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶，β-葡萄糖脑苷脂酶，鞘磷脂酶，溶酶体己糖胺酶A，支链酮酸脱氢酶，RP65蛋白，细胞因子(例如，α-干扰素，β-干扰素，干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-4，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，淋巴毒素等)，肽生长因子，神经营养因子和激素(例如生长激素，胰岛素，胰岛素样生长因子1和2，血小板衍生生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子，神经营养因子-3和-4，脑源性神经营养因子，骨形态发生蛋白(bone morphogenic proteins)[包括RANKL和VEGF]，神经胶质衍生生长因子，转化生长因子-α和-β等)，溶酶体酸α-葡萄糖苷酶，α-半乳糖苷酶A，受体(如肿瘤坏死生长因子α可溶性受体)，S100A1，细小白蛋白，腺苷酰环化酶6型，调节钙处理的分子(例如，SERCA2A，PP1的抑制剂1及其片段[例如，WO 2006/029319和WO 2007/100465])，影响G蛋白偶联的受体激酶2型敲低的分子，如截短的组成型活性bARKct，抗炎因子如IRAP，抗肌生长抑制素蛋白(anti-myostatin proteins)，天冬氨酸酰酶，单克隆抗体(包括单链单克隆抗体；示例性Mab是Mab)，神经肽及其片段(例如，神经节肽，神经肽Y(参见U.S.7,071,172)，血管生成抑制剂例如血管抑制素(Vasohibins)和其他VEGF抑制剂(例如，血管抑制素2[参见，WO JP2006/073052])。其他说明性异源核酸序列编码自杀基因产物(例如，胸苷激酶，胞嘧啶脱氨酶，白喉毒素和肿瘤坏死因子)，赋予用于癌症治疗的药物以抗性的蛋白质，肿瘤抑制基因产物(例如，p53，Rb，Wt-1)，TRAIL，FAS-配体和在有此需要的受试者中具有治疗效果的任何其他多肽。AAV载体也可用于递送单克隆抗体和抗体片段，例如针对肌肉生长抑制素的抗体或抗体片段(参见例如Fang等人Nature Biotechnology 23:584-590(2005))。
编码多肽的异源核酸序列包括编码报告多肽(例如酶)的那些。报道多肽是本领域已知的，包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶，荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。
任选地，异源核酸分子可以编码分泌的多肽(例如，在其天然状态下是分泌多肽的多肽，或者已被工程化以分泌的多肽，例如，通过与如本领域已知的分泌信号序列可操作地结合)。
备选地,在本公开特定的实施方案中，异源核酸可以编码反义核酸、核酶(例如，如美国专利No.5,877,022中所描述的)、影响剪接体介导的反式剪接的RNA(参见，Puttaraju等人(1999)Nature Biotech.17:246；美国专利No.6,013,487；美国专利No.6,083,702)、包括siRNA、shRNA或miRNA的干扰RNA(RNAi)(其介导基因沉默)(参见，Sharp等人，(2000)Science 287:2431)，和其他诸如“指导”RNA的非翻译RNA(Gorman等人(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:4929；Yuan等人的美国专利No.5,869,248)等。示例性非翻译RNA包括针对多重耐药性(MDR)基因产物的RNAi(例如，用于治疗和/或预防肿瘤和/或用于施用至心脏以防止化学损伤)，针对肌肉生长抑制素的RNAi(例如，用于杜氏肌营养不良症)，针对VEGF的RNAi(例如，用于治疗和/或预防肿瘤)，针对受磷蛋白的RNAi(例如，用于治疗心血管疾病，参见例如Andino等人J.Gene Med.10:132-142(2008)和Li等人ActaPharmacol Sin.26:51-55(2005))；受磷蛋白抑制性或显性阴性分子如受磷蛋白S16E(例如，用于治疗心血管疾病，参见例如Hoshijima等Nat.Med.8:864-871(2002))，针对腺苷激酶的RNAi(例如，用于癫痫)，以及针对病原生物和病毒(例如，乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，CMV，单纯疱疹病毒，人乳头瘤病毒等)的RNAi。
此外，可以递送指导可变剪接的核酸序列。为了说明，与肌养蛋白外显子51的5'和/或3'剪接位点互补的反义序列(或其他抑制序列)可以与U1或U7小核(sn)RNA启动子一起递送以诱导此外显子的跳过。例如，包含位于反义/抑制序列5'的U1或U7snRNA启动子的DNA序列可以在本发明的修饰衣壳中包装并递送。
病毒载体还可以包含异源核酸分子，所述异源核酸分子与宿主染色体上的基因座具有同源性并与之重组。该方法可用于，例如，校正宿主细胞中的遗传缺陷。
本公开还提供了表达免疫原性多肽(例如用于疫苗接种)的病毒载体。该核酸分子可编码本领域已知的任何感兴趣的免疫原，所述免疫原包括但不限于，来自人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、流感病毒、HIV或SIV gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。
免疫原性多肽可以是适于引发免疫应答和/或保护受试者免受感染和/或疾病(包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和/或病毒的感染和疾病)的任何多肽。例如，免疫原性多肽可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，诸如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白，或马流感病毒免疫原)或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)免疫原，或人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，如HIV或SIV包膜GP160蛋白，HIV或SIV基质/衣壳蛋白，以及HIV或SIV gag，pol和env基因产物)。免疫原性多肽也可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒免疫原，诸如拉沙热病毒核衣壳蛋白和拉沙热包膜糖蛋白)，痘病毒免疫原(例如牛痘病毒免疫原，诸如牛痘L1或L8基因产物)，黄病毒免疫原(例如，黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)，丝状病毒免疫原(例如，埃博拉病毒免疫原，或马尔堡病毒免疫原，诸如NP和GP基因产物)，布尼亚病毒免疫原(例如，RVFV，CCHF和/或SFS病毒免疫原)或冠状病毒免疫原(例如，感染性人类冠状病毒免疫原，诸如人冠状病毒包膜糖蛋白，或猪传染性胃肠炎病毒免疫原，或禽类传染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽还可以是脊髓灰质炎免疫原，疱疹免疫原(例如，CMV，EBV，HSV免疫原)，腮腺炎免疫原，麻疹免疫原，风疹免疫原，白喉毒素或其他白喉免疫原，百日咳抗原，肝炎(例如，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎等)免疫原，和/或本领域现在已知的或以后被鉴定为免疫原的任何其他疫苗免疫原。
或者，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌抗原在癌细胞的表面上表达。示例性癌症和肿瘤细胞抗原描述于S.A.Rosenberg(Immunity 10:281(1991))中。其他说明性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物，BRCA2基因产物，gp100，酪氨酸酶，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，LAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-连环蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE，SART-1，PRAME，p15，黑素瘤肿瘤抗原(Kawakami等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3515；Kawakami等人(1994)J.Exp.Med.,180:347；Kawakami等人(1994)Cancer Res.54:3124)，MART-1、gp100MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪氨酸酶(Brichard等人(1993)J.Exp.Med.178:489)；HER-2/neu基因产物(美国专利No.4,968,603)，CA125，LK26，FB5(内皮唾液酸蛋白)，TAG 72，AFP，CA19-9，NSE，DU-PAN-2，CA50，SPan-1，CA72-4，HCG，STN(唾液酸化Tn抗原)，c-erbB-2蛋白，PSA，L-CanAg，雌激素受体，乳脂肪球蛋白，p53肿瘤抑制蛋白(Levine(1993)Ann.Rev.Biochem.62:623)；粘蛋白抗原(国际专利公开号WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头状瘤病毒抗原；和/或现在已知或以后发现的与下列癌症相关的抗原：黑色素瘤，腺癌，胸腺瘤，淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤)，肉瘤，肺癌，肝癌，结肠癌，白血病，子宫癌症，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，膀胱癌，肾癌，胰腺癌，脑癌和现在已知或以后鉴定的任何其他癌症或恶性病况(参见，例如，Rosenberg(1996)Ann.Rev.Med.47:481-91)。
作为另一种备选方案，异源核酸可以在体外、离体或体内的细胞中编码期望产生的任何多肽。例如，可以将病毒载体引入培养的细胞中并从中分离表达的基因产物。
在另外的实施方案中，异源核酸可以编码(a)基于锌指核酸酶或大范围核酸酶或内切核酸酶或基于TALEN或基于CRISPR/Cas系统的核酸酶的定点修饰多肽，其含有与DNA靶向RNA分子(gRNA)相互作用的RNA结合部分，或编码这种多肽的mRNA；(b)一种或更多种指导RNA分子(gRNA)，其包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列，和与定点修饰多肽相互作用的第二区段；和/或(c)一个或更多个DNA供体模板分子，其包含设计用于同源重组到哺乳动物基因组靶位点中的单链或双链DNA序列。例如，病毒载体可以导入离体的干细胞和/或T淋巴细胞、培养的细胞、体内组织和/或整个生物体，且表达的基因产物能够使宿主中的靶基因的编辑、破坏、转录激活和/或抑制成为可能。
本领域技术人员将理解，感兴趣的异源核酸分子可以与适当的控制序列可操作地连接。例如，异源核酸分子可以与诸如以下表达控制元件可操作地连接：转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等。
此外，可以在转录后水平实现感兴趣的异源核酸分子的受调节的表达，例如通过在特定位点选择性地阻断剪接活性的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物的存在或不存在来调节不同内含子的选择性剪接(例如，如WO 2006/119137中所述)。
本领域技术人员将理解，可以使用多种启动子/增强子元件，这取决于所需的水平和组织特异性表达。启动子/增强子可以是组成型或诱导型的，这取决于所需的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外源的，且可以是天然的或合成的序列。通过外源，意图是在引入转录起始区的野生型宿主中未发现转录起始区。
在特定的实施方案中，启动子/增强子元件对于靶细胞或待治疗的受试者可以是天然的。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件对于异源核酸序列可以是天然的。通常选择启动子/增强子元件，使其在感兴趣的靶细胞中起作用。此外，在特定实施方案中，启动子/增强子元件可以是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。
诱导型表达控制元件通常在那些需要提供对异源核酸序列表达的调节的应用中是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心脏、骨骼和/或平滑肌特异性或优选的)，神经组织特异性或优选的(包括脑-特异性或优选的)，眼特异性或优选的(包括视网膜特异性和角膜特异性)，肝特异性或优选的，骨髓特异性或优选的，胰腺特异性或优选的，脾特异性或优选的，以及肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件，RU486诱导型启动子，蜕皮激素诱导型启动子，雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在其中异源核酸序列在靶细胞中被转录然后翻译的实施方案中，通常包括特异性起始信号用于插入的蛋白质编码序列的有效翻译。这些外源翻译控制序列，其可以包括ATG起始密码子和相邻序列，可以是多种来源，天然的和合成的。
根据本发明的病毒载体提供了将异源核酸递送到广泛的细胞中的手段，包括分裂和非分裂细胞。病毒载体可用于在体外将感兴趣的核酸递送至细胞，例如，以在体外产生多肽或用于离体基因治疗。病毒载体还可用于将核酸递送至需要其的受试者，例如，以表达免疫原性或治疗性多肽或功能性RNA，的方法。以这种方式，多肽或功能RNA可以在受试者体内产生。受试者可能需要多肽，因为受试者具有多肽的缺乏。此外，可以实施该方法，因为在受试者中产生多肽或功能性RNA可以产生一些有益效果。
病毒载体还可用于在培养的细胞或受试者中产生感兴趣的多肽或功能性RNA(例如，使用受试者作为生物反应器，以产生多肽或观察功能性RNA对受试者的作用，例如，结合筛选方法)。
通常，本公开的病毒载体可用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸，以治疗和/或预防任何递送治疗性多肽或功能性RNA对其有益的疾病状态。说明性疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和其他肺病，血友病A(因子VIII)，血友病B(因子IX)，地中海贫血(β-珠蛋白)，贫血(促红细胞生成素)和其他血液疾病，阿尔茨海默病(GDF；脑啡肽酶)，多发性硬化症(β-干扰素)，帕金森病(胶质细胞源性神经营养因子[GDNF])，亨廷顿病(RNAi以去除重复)，肌萎缩侧索硬化症，癫痫(甘丙肽，神经营养因子)和其他神经系统疾病，癌症(内皮他丁，血管他丁，TRAIL，FAS配体，包括干扰素的细胞因子；RNAi，其包括针对VEGF或多重耐药基因产物的RNAi，mir-26a[例如，用于肝细胞癌])，糖尿病(胰岛素)，肌营养不良症，包括杜氏营养不良症(肌营养不良蛋白，迷你肌营养不良蛋白，胰岛素样生长因子I，肌糖(sarcoglycan)[例如，α，β，γ]，针对肌肉生长抑制素，肌肉生长抑制素前肽，卵泡抑素，激活素II型可溶性受体，抗炎多肽如Ikappa B显性突变体，肌长(sarcospan)，肌营养相关蛋白(utrophin)，小肌营养相关蛋白(mini-utrophin)的RNAi，针对肌养蛋白基因中的剪接点以诱导外显子跳跃的反义或RNAi[参见，例如，WO/2003/095647]，针对U7snRNA以诱导外显子跳跃[参见例如WO/2006/021724]的反义，和针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段)和Becker，Gaucher病(葡糖脑苷脂酶)，Hurler病(α-L-艾杜糖醛酸酶)，腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)，糖原贮积病(如法布里病[α-半乳糖苷酶]和蓬佩病[溶酶体酸α-葡萄糖苷酶])和其他代谢紊乱，先天性肺气肿(α1-抗胰蛋白酶)，Lesch-Nyhan综合征(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)，Niemann-Pick病(鞘磷脂酶)，Tay Sachs病(溶酶体己糖胺酶A)，枫糖尿病(支链酮酸脱氢酶)，视网膜退行性疾病(以及眼睛和视网膜的其他疾病；例如用于黄斑变性和/或血管抑制素的PDGF或VEGF或其他血管生成抑制剂的其他抑制剂，以治疗/预防视网膜疾病，例如I型糖尿病)，实体器官如脑的疾病(包括帕金森病[GDNF]，星形细胞瘤[内皮他丁、血管他丁和/或针对VEGF的RNAi]，胶质母细胞瘤[内皮他丁、血管他丁和/或针对VEGF的RNAi]，肝脏，肾脏，心脏，包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(PAD)(例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂)I(I-1)及其片段(例如，I1C)，serca2a，调节受磷蛋白基因的锌指蛋白，Barkct，β2-肾上腺素能受体，β2-肾上腺素能受体激酶(BARK)，磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)，S100A1，细小白蛋白，腺苷酸环化酶6型，一种影响G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子，如截短的组成型活性bARKct；calsarcin，针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制或显性阴性分子，诸如受磷蛋白S16E等)，关节炎(胰岛素样生长因子)，关节疾病(胰岛素样生长因子1和/或2)，内膜增生(例如通过递送enos，inos)，改善心脏移植的存活率(超氧化物歧化酶)，艾滋病(可溶性CD4)，肌肉萎缩(胰岛素样生长因子I)，肾虚症(促红细胞生成素)，贫血(促红细胞生成素)，关节炎(抗炎因子如IRAP和TNFα可溶性受体)，肝炎(α-干扰素)，LDL受体缺乏症(LDL受体)，高氨血(鸟氨酸转氨甲酰酶)，克拉伯病(半乳糖脑苷脂酶)，脊髓性肌萎缩症(SMA)，巴顿病，脊髓性脑共济失调(spinal cerebral ataxias)，包括弗里德赖希氏共济失调，SCA1，SCA2和SCA3，苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)，自身免疫疾病等。本发明还可以在器官移植后使用，以增加移植的成功和/或减少器官移植或辅助治疗的负面副作用(例如，通过施用免疫抑制剂或抑制性核酸来阻断细胞因子的产生)。作为另一个实例，骨形态发生蛋白(包括BMP 2，7等，RANKL和/或VEGF)可以与骨同种异体移植物一起施用，例如，在癌症患者中破坏(break)或手术切除后。
本公开还可用于产生诱导的多能干细胞(iPS)。例如，本公开的病毒载体可用于将干细胞相关核酸递送到非多能细胞中，例如成体成纤维细胞，皮肤细胞，肝细胞，肾细胞，脂肪细胞，心肌细胞，神经细胞，上皮细胞，内皮细胞等。编码与干细胞相关的因子的核酸是本领域已知的。与干细胞和多能性相关的此类因子的非限制性实例包括Oct-3/4，SOX家族(例如，SOX1，SOX2，SOX3和/或SOX15)，Klf家族(例如，Klf1，Klf2，Klf4和/或Klf5)，Myc家族(例如，C-myc，L-myc和/或N-myc)，NANOG和/或LIN28。
本公开还可以实践用于治疗和/或预防癫痫，中风，创伤性脑损伤，认知障碍，行为障碍，精神障碍，亨廷顿氏病，阿尔茨海默病，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，以及任何其他可能受益于或需要轴突/神经元再生或修复的神经退行性病况。
在特定实施方案中，可以实践本公开以促进轴突再生和神经元修复，恢复回路和/或补充丢失的神经元作为矫正疗法，例如通过靶向调节或过表达干细胞分化和重编程因子如FoxJ1，Fox2，NeuroD2，NG2或Olig2和/或诸如miR-137，MiR124的微小RNA，以及涉及神经元发育和分化的任何其他因子或miRNA。
基因转移具有用于理解和提供疾病状态治疗的巨大潜在用途。存在许多遗传疾病，在其中缺陷基因是已知的并且已被克隆。一般而言，上述疾病状态分为两类：缺陷状态，通常是酶的缺陷状态，其通常以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病，基因转移可用于将正常基因带入受影响的组织中以进行替代治疗，以及使用反义突变产生该疾病的动物模型。对于不平衡的疾病状态，基因转移可用于在模型系统中产生疾病状态，然后其可用于抵抗疾病状态。因此，根据本公开的病毒载体允许治疗和/或预防遗传疾病。
根据本发明的病毒载体也可用于在体外或体内向细胞提供功能性RNA。功能性RNA在细胞中的表达，例如，可以减少细胞对特定靶蛋白的表达。因此，功能性RNA能够施用以降低有此需要的受试者中特定蛋白质的表达。功能性RNA也可以在体外施用至细胞以调节基因表达和/或细胞生理学，例如，以优化细胞或组织培养系统或筛选方法。
另外，根据本公开的病毒载体可用于诊断和筛选方法，藉此感兴趣的核酸在细胞培养系统中，或者备选地转基因动物模型中，瞬时或稳定表达。
本发明的病毒载体还可用于各种非治疗目的，包括但不限于用于评估基因靶向、清除、转录、翻译等的方案中，如本领域技术人员显而易见的。病毒载体也可用于评估安全性(扩散、毒性、免疫原性等)。这些数据，例如，在评估临床疗效之前被美国食品和药物管理局视为监管批准过程的一部分。
作为另一方面，本公开的病毒载体可用于在受试者中产生免疫应答。根据该实施方案，可以向受试者施用包含编码免疫原性多肽的异源核酸序列的病毒载体，并且受试者针对免疫原性多肽启动主动免疫应答。免疫原性多肽如上所述。在一些实施方案中，保护性免疫应答被引发。
备选地，病毒载体可以离体施用至细胞，并将改变的细胞施用至受试者。将包含异源核酸的病毒载体引入细胞中，并将该细胞施用至受试者，其中编码免疫原的异源核酸可被表达，并针对免疫原诱导受试者中的免疫应答。在特定的实施方案中，细胞是抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。
“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“与免疫原相遇后宿主组织和细胞的参与。它涉及淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化和增殖，导致抗体合成或细胞介导的反应性的发展，或两者”。Herbert B.Herscowitz,Immunophysiology:Cell Function andCellular Interactions in Antibody Formation,in IMMUNOLOGY:BASIC PROCESSES 117(Joseph A.Bellanti ed.,1985)。或者说，宿主在通过感染或接种疫苗暴露于免疫原后进行主动免疫应答。主动免疫可以与被动免疫相对，被动免疫是通过“将预先形成的物质(抗体，转移因子，胸腺移植物，白细胞介素-2)从主动免疫的宿主转移到非免疫宿主”而获得的。Id.
如本文所用的“保护性”免疫应答或“保护性”免疫指示免疫应答赋予受试者一些益处，因为它预防或降低了疾病的发病率。备选地，保护性免疫应答或保护性免疫可用于治疗和/或预防疾病，特别是癌症或肿瘤(例如，通过预防癌症或肿瘤形成，通过引起癌症或肿瘤消退和/或通过预防转移和/或通过阻止转移性结节的生长)。保护作用可以是完全的或部分的，只要治疗的益处超过其任意缺点即可。
在特定的实施方案中，包含异源核酸的病毒载体或细胞可以以免疫原性有效量施用，如下所述。
通过施用表达一种或更多种癌细胞抗原(或免疫学上类似的分子)或产生针对癌细胞的免疫应答的任何其他免疫原的病毒载体，还可将本公开的病毒载体施用用于癌症免疫疗法。为了说明，免疫应答可以针对受试者中的癌细胞抗原通过施用包含编码癌细胞抗原的异源核酸的病毒载体而产生，例如以治疗患有癌症的患者和/或以预防癌症在受试者中发展。如本文所述，病毒载体可以体内或通过使用离体方法施用至受试者。备选地，癌抗原可以表达为病毒衣壳的一部分或以其他方式与病毒衣壳相关联(例如，如上所述)。
作为另一种备选方案，任何本领域已知的其他治疗性核酸(例如RNAi)或多肽(例如细胞因子)都可以施用以治疗和/或预防癌症。
如本文所用，术语“癌症”涵盖肿瘤形成癌症。同样，术语“癌组织”涵盖肿瘤。“癌细胞抗原”涵盖肿瘤抗原。
术语“癌症”在本领域中具有其理解的含义，例如，具有扩散到身体的远处部位(即，转移)的潜能的组织的不受控制的生长。示例性癌症包括但不限于黑色素瘤，腺癌，胸腺瘤，淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤)，肉瘤，肺癌，肝癌，结肠癌，白血病，子宫癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，膀胱癌，肾癌，胰腺癌，脑癌和现在已知或以后确定的任何其他癌症或恶性病况。在代表性实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防肿瘤形成癌症的方法。
术语“肿瘤”在本领域中也被理解，例如，作为多细胞生物体内的未分化细胞的异常质量。肿瘤可以是恶性的或良性的。在代表性实施方案中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。
通过术语“治疗癌症”，“癌症的治疗”和等同术语，旨在减少或至少部分地消除癌症的严重性，和/或减缓和/或控制疾病的进展，和/或稳定疾病。在特定实施方案中，这些术语表明预防或减少或至少部分消除癌症的转移，和/或防止或减少或至少部分消除转移性结节的生长。
通过术语“预防癌症”或“癌症的预防”和等同术语，旨在该方法至少部分地消除或减少和/或延迟癌症发病的发生率和/或严重性。换句话说，受试者中癌症的发病可能在可能性或概率上降低和/或延迟。
在特定的实施方案中，细胞可以从患有癌症的受试者中取出，并使之与根据本公开的表达癌细胞抗原的病毒载体接触。然后将经修饰的细胞施用至所述受试者，由此引发针对癌细胞抗原的免疫应答。该方法可以有利地用于免疫受损的受试者，其在体内不能启动足够的免疫应答(即，不能产生足够量的增强抗体)。
本领域已知免疫应答可以通过免疫调节细胞因子增强(例如，α-干扰素，β-干扰素，γ-干扰素，ω-干扰素，τ-干扰素，白细胞介素-1α，白细胞介素-1β，白介素-2，白细胞介素-3，白细胞介素-4，白细胞介素5，白细胞介素-6，白细胞介素-7，白细胞介素-8，白细胞介素-9，白细胞介素-10，白细胞介素-11，白细胞介素12，白细胞介素-13，白细胞介素-14，白细胞介素-18，B细胞生长因子，CD40配体，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，单核细胞趋化蛋白-1，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素)。因此，免疫调节细胞因子(优选地，CTL诱导细胞因子)可以与病毒载体一起施用至受试者。
细胞因子可以通过本领域已知的任何方法施用。可以向受试者施用外源细胞因子，或者备选地可以使用合适的载体将编码细胞因子的核酸递送至受试者，并在体内产生细胞因子。
受试者，药物制剂和施用模式
根据本发明的病毒载体和衣壳可用于兽医和医学应用。合适的受试者包括禽类和哺乳动物。本文所用的术语“禽类”包括但不限于鸡，鸭，鹅，鹌鹑，火鸡，野鸡，鹦鹉，长尾鹦鹉等。本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人，非人灵长类动物，牛，绵羊，山羊，马，猫，犬，兔类等。人类受试者包括新生儿，婴儿，青少年，成人和老年受试者。
在代表性实施方案中，受试者“需要”本公开的方法。
在具体的实施方案中，本公开提供药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的本公开的病毒载体和/或衣壳，以及任选的其他医疗剂，药剂，稳定剂，缓冲剂，载体，佐剂，稀释剂等。对于注射，载体通常是液体。对于其他施用方法，载体可以是固体或液体。对于吸入施用，载体将是可吸入的，并且任选地可以是固体或液体颗粒形式。
“药学上可接受的”是指并非有毒或以其他方式不合需要的物质，即该物质可以施用至受试者而不会引起任何不希望的生物学效应。
本公开的一个方面是在体外将核酸转移至细胞的方法。可以根据适合于特定靶细胞的标准转导方法，以适当感染复数将病毒载体引入细胞中。施用的病毒载体的滴度可以根据靶细胞类型和数量以及特定的病毒载体而变化，并且可以由本领域技术人员确定而无需过多的实验。在代表性的实施方案中，将至少约103个感染单位，任选地至少约105个感染单位引入细胞中。
引入病毒载体的细胞可以是任何类型，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是诸如神经元和少突胶质细胞的脑细胞)，肺细胞，眼睛细胞(包括视网膜细胞，视网膜色素上皮细胞和角膜细胞)，上皮细胞(如肠道和呼吸道上皮细胞)，肌肉细胞(如骨骼肌细胞，心肌细胞，平滑肌细胞和/或膈肌细胞)，树突细胞，胰腺细胞(包括胰岛细胞)，肝细胞，心肌细胞，骨细胞(如骨髓干细胞)，造血干细胞，脾细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，内皮细胞，前列腺细胞，生殖细胞等。在代表性的实施方案中，细胞可以是任何祖细胞。作为另一种可能性，细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞，肝干细胞)。作为又一备选方案，细胞可以是癌症或肿瘤细胞。此外，如上文所指出的，细胞可以来自任何种类的来源。
可以将病毒载体体外引入细胞中，用于将修饰的细胞施用至受试者的目的。在特定的实施方案中，已从受试者中取出细胞，将病毒载体导入其中，然后将细胞再次施用回受试者。从受试者中取出细胞用于离体操作，然后引回受试者的方法是本领域已知的(参见例如美国专利No.5,399,346)。备选地，可以将重组病毒载体引入来自供体受试者的细胞，引入培养的细胞，或引入来自任何其它合适来源的细胞，并将细胞施用至需要其的受试者(即“受体”受试者)。
用于离体核酸递送的合适细胞如上所述。施用至受试者的细胞的剂量将根据受试者的年龄、病况和物种、细胞类型、细胞表达的核酸、施用方式等而变化。通常，每剂量在药学上可接受的载体中施用至少约102至约108个细胞或至少约103至约106个细胞。在具体的实施方案中，用病毒载体转导的细胞以治疗有效量或预防有效量与药学载体一起施用至受试者。
在一些实施方案中，将病毒载体引入细胞中，并将细胞施用至受试者以引发针对所递送的多肽(例如，表达为转基因或表达在衣壳中)的免疫原性应答。通常，将一定量的表达免疫原性有效量的多肽的细胞与药学上可接受的载体组合使用。“免疫原性有效量”是表达多肽的量，其足以在施用药物制剂的受试者中引起针对多肽的主动免疫应答。在特定的实施方案中，所述剂量足以产生保护性免疫应答(如上所定义)。赋予的保护程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处超过其任意缺点即可。
本公开的另一方面是施用所述病毒载体和/或病毒衣壳至受试者的方法。可以通过本领域已知的任何方法将根据本发明的病毒载体和/或衣壳施用至有此需要的人类受试者或动物。任选地，病毒载体和/或衣壳在药学上可接受的载体中以治疗有效剂量或预防有效剂量递送。
可以进一步施用本公开的病毒载体和/或衣壳以引发免疫原性应答(例如，作为疫苗)。通常，本公开的免疫原性组合物包含与药学上可接受的载体组合的免疫原性有效量的病毒载体和/或衣壳。任选地，所述剂量足以产生保护性免疫应答(如上所定义)。赋予的保护程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处超过其任意缺点即可。受试者和免疫原如上所述。
待施用至受试者的病毒载体和/或衣壳的剂量取决于施用方式，待治疗和/或预防的疾病或病况，个体受试者的病况，特定的病毒载体或衣壳，以及待递送的核酸等等，并且可以以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量是至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015个转导单位的滴度，任选约108-1013个转导单位的滴度。
在特定的实施方案中，可以采用多于一次的施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)，以在不同的间隔期间(例如，每天、每周、每月、每年等)实现期望的基因表达水平。
示例性施用方式包括口服，直肠，转化粘液质，鼻内，吸入(例如，通过气溶胶)，口腔(例如，舌下)，阴道，鞘内，眼内，透皮，子宫内(或卵内)，肠胃外(例如，静脉内，皮下，皮内，肌肉内，皮内，胸膜内，脑内和关节内)，局部(例如，至皮肤和粘膜表面，包括气道表面和经皮施用)，淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如，至肝脏，骨骼肌，心肌，膈肌或脑)。在一些实施方案中，肌内包括施用至骨骼肌，膈肌和/或心肌。施用也可以是施用至肿瘤(例如，肿瘤或淋巴结内或附近)。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗和/或预防的病况的性质和严重程度以及所使用的特定载体的性质。
还可以通过递送包含病毒载体和/或衣壳的贮库(depot)来实现向靶组织的递送。在代表性实施方案中，将包含病毒载体和/或衣壳的贮库植入骨骼肌，心肌和/或膈肌组织中，或者可使组织与包含病毒载体和/或衣壳的膜或其他基质接触。这种可植入的基层或底物描述于美国专利No.7,201,898中。
在具体的实施方案中，将根据本发明的病毒载体和/或病毒衣壳施用至骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如，以治疗和/或预防肌营养不良、心脏病)。在一些实施方案中，施用根据本发明的病毒载体和/或病毒衣壳以治疗PAD或充血性心力衰竭。
还可以实施本公开的方法以产生反义RNA、RNAi或其他功能性RNA(例如，核酶)用于全身递送。
注射物可以以常规形式制备，可以是液体溶液或悬浮液，适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者是乳液。备选地，可以以局部而非全身的方式施用本公开的病毒载体和/或病毒衣壳，例如，在贮库或缓释制剂中。此外，病毒载体和/或病毒衣壳可以附着在可手术植入的基质上递送(例如，如美国专利公开No.US-2004-0013645-A1中所述)。
病毒载体和病毒衣壳可以施用至CNS的组织(例如，脑，眼)，并且可以有利地导致病毒载体或衣壳比在没有本公开的情况下观察到的更广泛分布。
在具体的实施方案中，可以施用本公开的递送载体以治疗CNS的疾病，包括遗传疾病、神经变性疾病、精神疾病和肿瘤。
CNS的示例性疾病包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，卡纳万病(Canavan disease)，利氏病，雷夫叙姆病，图雷特多综合征，原发性侧索硬化症，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，进行性肌萎缩症，皮克病，肌营养不良症，多发性硬化症，重症肌无力，宾斯旺格病，脊髓损伤和/或头部损伤(如创伤性脑损伤)引起的创伤，泰-萨克斯病，雷歇病(Lesch-Nyan disease)，癫痫，中风，脑梗塞，精神障碍包括情绪障碍(例如，抑郁症，双相情感障碍，持续情感障碍，继发情绪障碍)，精神分裂症，药物依赖(例如，酒精中毒和其他物质依赖)，神经机能病(例如，焦虑，强迫症，躯体形式障碍，分离性障碍，悲伤，产后抑郁症)，精神病(如幻觉和错觉)，痴呆，妄想症，注意力缺陷症，性心理障碍，任何可能受益于或需要轴突/神经元再生和/或修复的神经退行性疾病，认知障碍，行为障碍，睡眠障碍，疼痛障碍，进食或体重障碍(如肥胖，恶病质，神经性厌食症和贪食症(bulemia))和CNS的癌症和肿瘤(例如，垂体肿瘤)。
CNS的病症包括涉及视网膜，后道和视神经的眼科病症(例如色素性视网膜炎，糖尿病性视网膜病和其他视网膜退行性疾病，葡萄膜炎，年龄相关性黄斑变性，青光眼)。
大多数(如果不是全部)眼科疾病和病症与三种适应症中的一种或更多种相关：(1)血管生成，(2)炎症，和(3)变性。本发明的递送载体可用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性，促进细胞保留(cell sparing)或促进细胞生长的因子以及前述的组合。
例如，糖尿病性视网膜病的特征在于血管生成。糖尿病性视网膜病可以通过眼内(例如，在玻璃体内)或眼周(例如，在眼球筋膜下区域)递送一种或更多种抗血管生成因子来治疗。一种或更多种神经营养因子也可以眼内(例如，玻璃体内)或眼周共同递送。
葡萄膜炎涉及炎症。可以通过眼内(例如，玻璃体或前房)施用本公开的递送载体来施用一种或更多种抗炎因子。
相比之下，色素性视网膜炎的特征在于视网膜变性。在代表性的实施方案中，色素性视网膜炎可以通过编码一种或更多种神经营养因子的递送载体的眼内施用(例如，玻璃体施用)来治疗。
年龄相关性黄斑变性涉及血管生成和视网膜变性。可以通过眼内(例如玻璃体)施用本发明的编码一种或更多种神经营养因子的递送载体和/或眼内或眼周(例如，在眼球筋膜下区域)施用本发明的编码一种或更多种抗血管生成因子的递送载体来治疗该病症。
青光眼的特征在于眼压升高和视网膜神经节细胞丧失。青光眼的治疗包括使用本发明的递送载体施用一种或更多种保护细胞免受兴奋毒性损伤的神经保护剂。这些药剂包括眼内递送，任选眼内递送的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂，细胞因子和神经营养因子。
在其他实施方案中，本公开可用于治疗癫痫发作，例如，以减少癫痫发作的发作、发生率或严重程度。癫痫发作的治疗性疗法的功效可以通过行为(例如，眼睛或口腔的摇动，滴答声(ticks))和/或电图手段(大多数癫痫发作具有特征性电图异常)来评估。因此，本发明还可用于治疗癫痫，其随着时间的推移以多次癫痫发作为特征。
在一个代表性实施方案中，使用本公开的递送载体将生长抑素(或其活性片段)施用至脑以治疗垂体肿瘤。根据该实施方案，编码生长抑素(或其活性片段)的递送载体通过微量输注施用到垂体中。同样，这种治疗可用于治疗肢端肥大症(垂体的异常生长激素分泌)。生长抑素的核酸(例如GenBank登录号J00306)和氨基酸(例如GenBank登录号P01166；含有加工的活性肽生长抑素-28和生长抑素-14)序列是本领域已知的。
在特定实施方案中，载体可包含分泌信号，如美国专利No.7,071,172中所述。
在本公开的代表性实施方案中，将病毒载体和/或病毒衣壳施用至CNS(例如，施用至脑或眼睛)。病毒载体和/或衣壳可以被引入脊髓，脑干(延髓，脑桥)，中脑(下丘脑，丘脑，上丘脑，脑垂体，黑质，松果体)，小脑，端脑(纹状体，大脑包括枕叶，颞叶，顶叶和额叶，皮质，基底神经节，海马和门静脉舌(portaamygdala)，边缘系统，新皮质，纹状体，大脑和下丘。病毒载体和/或衣壳也可以施用至眼睛的不同区域，例如视网膜、角膜和/或视神经。
可以将病毒载体和/或衣壳递送到脑脊髓液中(例如，通过腰椎穿刺)用于递送载体的更多地分散施用。病毒载体和/或衣壳可以进一步在血脑屏障被扰动的情况下(例如脑肿瘤或脑梗塞)血管内施用至CNS。
病毒载体和/或衣壳可通过本领域已知的任何途径施用至CNS的所需区域，包括但不限于脑室内，脑池内，实质内，颅内，鞘内，眼内，脑内，心室内，静脉内(例如，在诸如甘露醇的糖的存在的情况下)，鼻内，耳内，眼内(例如，玻璃体内，视网膜下，前房)和眼周(例如，眼球筋膜下)输送以及具有逆行递送的肌内递送至运动神经元。
在具体的实施方案中，病毒载体和/或衣壳通过直接注射(例如，立体定向注射)在液体制剂中施用至CNS中的所需区域或区室。在其他实施方案中，病毒载体和/或衣壳可以通过局部应用提供至所需区域或通过鼻内施用气溶胶制剂来提供。施用至眼睛，可以通过液滴的局部施用。作为另一种备选方案，病毒载体和/或衣壳可以作为固体缓释制剂施用(参见，例如，美国专利No.7,201,898)。
在另外的实施方案中，病毒载体可用于逆行运输以治疗和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如，肌萎缩侧索硬化症(ALS)；脊髓性肌萎缩症(SMA)等)。例如，病毒载体可以被递送到肌肉组织，从中其能够迁移到神经元中。
以下实施例仅用于说明目的，而不是限制性的。
实施例
实施例1发现能够使AAV穿过血脑屏障转运的向神经的足迹
腺相关病毒(AAV)是非致病性细小病毒，由小的25nm二十面体衣壳组成，包装大约4.7kb单链DNA基因组。已从人和灵长类组织中分离出多种AAV衣壳序列，其已基于序列和结构多样性分类为几个不同的进化枝。遍及这些进化枝中，不同的血清型在物种、组织和细胞水平上表现出广泛的趋向性。这些不同的表型由衣壳结构决定。AAV衣壳由60个病毒蛋白(VP)亚基组装而成。核心VP单体(VP3)具有由通过交叉环区连接的7条反平行β链组成的果冻卷β桶结构。这些高度可变环的部分是表面暴露的并且限定AAV衣壳的拓扑结构，其反过来确定了各种AAV血清型的组织趋向性、抗原性和受体使用。AAV衣壳上的表面环残基是高度可塑的并且易于修饰，从而提供对抗原性、转导谱和组织趋向性的控制。
AAV生命周期的第一步是识别和附着到细胞表面聚糖受体。这些包括针对AAV2、AAV3和AAV6的硫酸乙酰肝素(HS)，针对AAV1、AAV5和AAV6的α2,3-和α2,6-N-连接的唾液酸(Sia)，针对AAV4的O-连接的唾液酸，以及针对AAV9的半乳糖(Gal)。在聚糖结合之后，AAV的细胞摄取涉及二级共受体，包括各种生长因子受体以及整联蛋白。最近，跨膜蛋白KIAA0319L(AAVR)已被鉴定为多种AAV血清型的通用受体。这些因子，和组织糖基化模式一起，有助于不同AAV血清型的不同组织趋向性。特别是关于CNS，根据施用途径，不同的AAV血清型显示出一系列转导谱和细胞趋向性。例如，当通过直接实质内或脑脊液(CSF)内注射直接施用至小鼠CNS内时，AAV衣壳在顺行和/或逆行方向上经历轴突运输和跨突触扩散，这取决于血清型。此外，我们最近已经展示了CSF的神经胶质相关淋巴(类淋巴(glymphatic))转运影响AAV在小鼠脑实质内的扩散和从CNS的清除。
为了实现CNS基因转移，静脉内施用的AAV载体必须首先穿过血脑屏障(BBB)以进入大脑。由内皮细胞紧密连接点与相关的星形细胞末端足和外膜细胞一起组成，BBB阻断大分子/颗粒的扩散和细胞旁流动，并调节其他分子的运输。感染脑的大多数病毒通过破坏或削弱BBB来实现的。然而，一些病毒已经设计了通过诸如以下的方法来实现进入CNS的策略：在宿主免疫细胞内搭车(hitchhiking)(例如HIV)，通过感染脑内皮细胞或通过感染外周神经和利用轴突运输(例如狂犬病)。在AAV的情况下，BBB防止大多数血清型进入脑，但有少数值得注意的例外。例如，AAV血清型1-6和8的血管内施用导致差的CNS转导，而在其他血清型中，分离物AAV9、AAVrh.8和AAVrh.10已经在不同的动物模型中显示出有效地穿过BBB。
为了在CNS中达到转基因表达的治疗水平，通常需要高载体剂量(例如，在脊髓性肌萎缩试验NCT02122952中1×1014vg/kg)。除了与规模放大和成本相关的负担之外，还显示高载体剂量会引起不良副作用，诸如肝毒性。为了提高基因转移至CNS的特异性/效率并降低有效载体剂量，需要更好地了解使AAV衣壳能够穿透BBB的结构特征。
为了剖析穿过BBB的结构-功能相关性，我们仅使用两种血清型--AAV1(其不穿过维管结构)和已知有效穿过BBB的AAVrh.10来产生变体衣壳基因的组合文库。我们通过计算分析，系统发育分析和结构分析选择了单个变体以便在小鼠中进行进一步筛选，而不是进化出新的变体。
嵌合AAV衣壳板的生成
AAV1/rh.10结构域交换衣壳文库通过DNA改组产生。简而言之，AAV1和AAVrh.10的Cap基因通过简短的DNase消化随机片段化，并使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(NEB Cat#M0530L)使用无引物PCR重新组装，其中短(<400bp)片段的部分同源性允许片段的自身引发(self-priming)。然后使用侧接Cap基因的特异性保守引物，将二级PCR步骤用于扩增重新组装的全长Cap序列文库，同时插入侧翼限制性位点以便于随后克隆到用于病毒生产的pTR质粒骨架中。
系统发育和序列分析
使用ClustalW比对不同AAV衣壳分离物的氨基酸序列，并使用MEGAv7.0.21软件包产生系统发育树。使用邻接算法生成系统发生，并使用泊松校正计算氨基酸距离。通过1000次复制的自引(bootstrapping)进行统计测试，以测试系统发育分析的置信度并生成自引共识树。对应于在少于50％的自引复制中再现的分区的分支被折叠。在分支旁边显示复制树的百分比，其中关联的分类群在自引测试中聚集在一起。所有序列比对使用Invitrogen的Vector NTI Advance 11.5.2软件进行。
病毒产生和滴度
更新的三重质粒转染方案用于产生重组AAV载体。具体地，转染的质粒包括(i)衣壳特异性pXR辅助质粒(即pXR1，pXRrh.10，或编码本研究中使用的各种嵌合Cap基因的各种质粒)，(ii)腺病毒辅助质粒pXX680，和(iii)pTR-CBh-scGFP或pTR-CBA-Luc质粒，分别编码由鸡β肌动蛋白杂交体(CBh)启动子驱动的自补充绿色荧光蛋白(GFP)报告基因转基因或由鸡β肌动蛋白启动子(CBA)驱动的荧光素酶报告基因转基因(Luc)，侧翼为源自AAV2基因组的反向末端重复序列(TR)。使用碘克沙醇密度梯度超速离心纯化病毒载体。随后使用Sartorius Vivaspin2 100kDa分子量截留(MWCO)离心柱(F-2731-100Bioexpress,Kaysville,UT)，对包装CBh-scGFP转基因的载体进行缓冲液交换和浓缩。使用Zeba SpinDesalting Columns，40K MWCO(Thermo Scientific，Cat#87770)，对包装CBA-Luc转基因的载体进行缓冲液交换和脱盐。纯化后，使用Roche Lightcycler 480(Roche AppliedSciences,Pleasanton,CA)通过定量PCR测定病毒基因组滴度。设计定量PCR引物以特异性识别AAV2反向末端重复序列(正向，5’-AACATGCTACGCAGAGAGGGAGTGG–3’；(SEQ ID NO:36)，反向，5’-CATGAGACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG-3’)(SEQ ID NO:37)(IDT Technologies,AmesIA)。
动物研究
所有动物实验均使用购自Jackson Laboratories(BAR Harbor，ME)的6至8周龄雌性C57/BL6小鼠进行。按照NIH指南并经UNC机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准，对这些小鼠进行供养和治疗。为了研究AAV载体穿过BBB并转导CNS细胞群的能力，以5×1011vg的剂量，通过尾静脉注射，静脉内(i.v.)施用包装CBh-scGFP转基因的AAV载体或1xPBS(作为模拟物处理)。为了测定GFP报告基因转基因表达，在注射后21天用三溴乙醇(Avertin)(0.2ml 1.25％溶液)处死动物，然后用30ml的1xPBS，和后续的30ml的PBS中的4％多聚甲醛进行经贲门(transcardial)灌注。取出包括脑、心脏和肝脏的组织并在固定24小时后，使用Leica VT 1200S振动刀片切片机(Leica Biosystems，IL)获得每个组织的50μm厚的切片。然后按照下文描述的对小鼠脑切片进行免疫染色。对于体内荧光素酶转导和病毒基因组生物分布实验，以1×1011vg的剂量给小鼠注射1x PBS或包装CBA-荧光素酶转基因的病毒载体。如上所述，在注射后14天处死小鼠并取出各种组织。对于这些实验，未用在1x PBS中的4％多聚甲醛进行固定，而是将组织解剖并在在-80℃冷冻，然后再使用。
为了定量荧光素酶表达，在注射后14天处死注射了1×1011包装CBA-Luc转基因的病毒基因组的小鼠，且收获组织并在-80℃冷冻。在使用Tissue Lyser II 352仪器(Qiagen，Valencia，CA)机械裂解之前，随后将组织解冻，称重，并通过添加150μl的2x被动裂解缓冲液(Promega，Madison WI)进行裂解，然后离心以除去任何剩余的组织碎片。为了测量荧光素酶转基因表达，然后将来自每种裂解液的50μl上清液与50μl荧光素一起上样到测定板上，并使用Victor2光度计(PerkinElmer，Waltham，MA)进行发光分析。然后将每个样品获得的相对光单位归一化为每个样品的输入组织重量，以克为单位测量。绘制数据，并使用非配对的双尾T检验，使用Welch校正以及ANOVA进行统计分析，然后在指明处进行Tukey的多重比较检验。这些统计分析在GraphPad Prism 软件中进行。
组织处理和组织学分析
对于使用包装GFP报告基因转基因的病毒的小鼠实验，自由漂浮的50-μm厚的冠状脑切片在24孔板中染色。将切片在1x PBS中的含有10％山羊血清和1％Triton X(Sigma-Aldrich)的封闭缓冲液中于室温下温育1小时。然后将切片在4℃下与在封闭缓冲液中稀释的一级单克隆兔α-GFP抗体(Life-Technologies-G10,362 1:750)一起温育过夜。第二天，用1x PBS进行三次10分钟的洗涤。使用Vectastain ABC试剂盒(Rabbit IgG PK-4001试剂盒，Vector biolabs，Burlingame，CA)进行随后的GFP表达的组织化学分析，并将组织固定在显微镜载玻片上。由UNC转化病理学实验室使用Aperio ScanScope XT仪器(AperioTechnologies，Vista，CA)在明场(20x物镜)中对免疫染色的切片进行数字成像，图像使用Leica eSlide Manager(集中图像存储和数据管理软件)获得，并使用Aperio ImageScope和WebViewer软件分析。通过计数每50μm冠状脑切片基于形态确定的GFP+神经元或神经胶质细胞的数量来计算定量。如上所述绘制数据并进行统计分析。基于与从Allen MouseBrain Atlas获得的冠状小鼠脑参照的比较来鉴定特定脑区域。为了测定心脏和肝脏中的GFP表达，用如上所述的抗GFP一抗对组织进行GFP染色；然而，使用与Alexa-488缀合的抗兔山羊抗体作为二抗，稀释度为1:500(抗兔Abcam-96,883)。然后使用EVOS FL表面荧光细胞成像系统(AMC/Life Technologies)使用GFP光立方体(激发470nm，发射510nm)对这些组织中的免疫染色的GFP成像。如前所述进行统计分析。
载体基因组生物分布
如上所述进行动物研究。在注射后21天，处死小鼠并将组织在-80℃冷冻。随后解冻组织，并使用DNeasy试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从组织裂解物中提取病毒基因组。然后用对荧光素酶转基因特异性的引物(正向，5′-AAAAGCACTCTGATTGACAAATAC-3′(SEQ IDNO:38)；和反向，5′-CCTTCGCTTCAAAAAATGGAAC-3′(SEQ ID NO:39))，使用定量PCR确定每个组织的病毒基因组拷贝数。然后使用引物(正向，5′-GGACCCAAGGACTACCTCAAGGG-3′(SEQ IDNO:40)；和反向，5′-AGGGCACCTCCATCTCGGAAAC-3′(SEQ ID NO:41))将这些病毒基因组拷贝数归一化至小鼠lamin B2管家基因。病毒基因组的生物分布表示为每个组织回收的每个细胞的载体基因组的比率。如前所述绘制数据并进行统计分析。
分子建模
先前公布的坐标(PDB ID，3NG9)用于产生AAV1VP3三聚体/三倍对称轴的三维结构。使用SWISS-Model服务器(swissmodel.expasy.org)获得AAVrh.10和各种AAV1/rh.10嵌合衣壳结构的同源模型，其中AAV8VP3(PDB ID，2QA0)的晶体结构用作模板，并且使用WinCoot软件中的二级结构匹配(SSM)应用生成基于结构的对齐，其中AAV1VP3(PDB ID3NG9)单体用作模板。使用VIPERd寡聚物发生器实用程序(viperdb.scripps.edu/oligomer_multi.php)生成VP3三聚体/3倍对称轴、VP3三聚体二聚体/2倍对称轴、VP3五聚体/5倍对称轴和完整衣壳。使用PyMOL(PyMOL分子图形系统， LLC,www.pymol.org)可视化这些模型的表面描绘。使用RIVEM(病毒电子密度图的径向解释)软件生成突出显示AAVrh.10衍生的向神经足迹内的表面暴露的氨基酸残基处AAV1RX衣壳表面的立体路线图投影。
AAV1/rh.10结构域交换文库的产生和嵌合衣壳变体的分离
我们对不同的衣壳结构域进行了比较分析，以确定穿过BBB的结构-功能相关性。我们通过DNA改组生成了AAV1/rh.10结构域交换文库。我们选择AAV1和AAVrh.10作为用于DNA改组的亲本衣壳序列，因为它们穿过BBB的能力明显不同，并且由于它们的衣壳(Cap)基因共有的序列同源性(85％)。然后将36个嵌合衣壳序列克隆分离并测序。从该文库产生的变体在DNA和氨基酸水平上显示出显著的多样性。序列比对揭示了连续的结构域交换，然后我们按照从AAV1到AAVrh.10的同源性增加的顺序进行组织(图4A，从上到下)。通过构建邻接树，进一步将所述克隆组进行系统发育表征，所述邻接树将这些变体广泛地分类为更像AAV1的(进化枝A)或更像AAVrh.10的(进化枝E)(图4B)。然后使用小规模载体产生来建立相对滴度，以从该研究中排除在组装或包装上缺陷的衣壳。生成了突出显示三倍对称轴上的关键表面域/残基的亲本和代表性嵌合衣壳三聚体的基于同源性的结构模型(图4C)，以进一步缩小嵌合衣壳变体的列表以用于体内初始筛选。基于结构分析选择10种嵌合衣壳变体，其中6种产生重组载体(其包装scGFP或ssLuc转基因盒)，滴度与亲本AAV1和AAVrh.10载体相似。然后进一步筛选这些变体。
体内筛选鉴定了在成年小鼠中静脉内施用后能够穿过BBB的两种AAV1/rh.10嵌合衣壳
然后我们测试所选择的衣壳变体组在I.V.施用后穿过BBB和转导CNS的能力是否不同。值得注意的是，我们的方法不涉及定向进化，因为该策略通常适用于选择最佳衣壳并且不太适合研究结构-功能关系。我们通过尾静脉注射，以每只小鼠AAV1、AAVrh.10或6个不同嵌合AAV载体之一的5×1011个病毒基因组(vg)的剂量，注射6-8周龄小鼠，其中所述嵌合AAV载体包装自身互补的CBh-GFP报告盒。
在每只小鼠的遍及多个冠状脑切片中，对大脑皮质中的GFP阳性神经元进行人工计数，定量并取平均值。对于AAV1，n＝2；对于AAV1R6和AAV1R7，n＝3(图1)。注射后3周的冠状脑切片的免疫染色揭示了大脑皮质中的AAV1转导限于维管结构，而AAVrh.10显示了各种细胞群的强大转导，包括神经元、神经胶质和内皮细胞，如形态学所确定的(图2，图5)。GFP+细胞的进一步形态学评估表明嵌合变体的不同表型。AAV1R19.1和AAV1R20主要转导在皮质中的微血管内皮细胞，而对于AAV1R8和AAV1R19d载体，神经元和神经胶质细胞的低至中等转导是明显的(图5)。相比之下，AAV1R6和AAV1R7显示了皮质神经元的强健转导，神经胶质的中等转导和皮质内维管结构的稀少(如果有的话)转导。显示了高放大倍数的皮质体感区域的代表性图像。在脑的其他区域一致地观察到这些嵌合体的类似趋势(图6)。这些观察表明嵌合衣壳AAV1R6和AAV1R7可能具有穿过BBB的能力，类似于亲本AAVrh.10载体，尽管其机制尚不清楚。然而，与亲本AAV1或AAVrh.10不同，嵌合体都不能有效地转导维管结构。
静脉内递送的AAV1R6和AAV1R7嵌合衣壳穿过BBB并在整个脑中优先转导神经元。
然后，我们进一步表征了这些变体穿过脑的多个功能相关结构的转导谱。对于下面讨论的每个脑区域，从GFP免疫染色的小鼠脑冠状切片获得更高放大倍数的代表性图像，并在20倍放大倍数下在明视场中扫描。另外，通过基于细胞形态分别计数GFP+神经元和神经胶质细胞，来确定每个区域的神经元和神经胶质转导的定量数据。
大脑皮质。AAVrh.10显示在整个皮质中的神经元、神经胶质和血管内皮细胞的强大转导，并且在血管内递送的AAV1的情况下，观察到血管转导，伴随着神经元表达的缺失和神经胶质中的低表达水平(图7和图8)。我们还观察到，静脉施用的AAV1R6和AAV1R7(AAV1R6/7)载体介导皮质神经元中强大的GFP表达，以及在遍及皮质的杏仁核区、梨状区、内嗅区、颞联合区，听觉区，体感区，运动区，后顶叶区和后皮质区的神经胶质中的降低表达，但是在遍及所分析的切片中以一致的趋势水平变化。对于运动皮质(图7A)和皮质的体感区域(图7B)，显示了转导的皮质区域的代表性图像。此外，AAV1R6/7似乎在整个皮质上显示出优先的神经元细胞趋向性，显示出中等的神经胶质转导和显著减少的血管转导。该特征与血管性(vasculotropic)AAV1以及AAVrh.10形成鲜明对比，血管性AAV1以及AAVrh.10以高效率转导神经元，神经胶质和血管内皮细胞(图7A和7B)。虽然AAV1R6/7在遍及整个皮质中介导强大的神经元和中等的胶质细胞表达，但它们的表达水平仍低于AAVrh所达到的水平。通过定量我们对GFP+细胞的形态学分析，证实了这些趋势(图8A和8B)，其显示相对于AAV1，针对AAVrh.10、AAV1R6和AAV1R7的皮质转导的统计学显著差异。值得注意的最后一个差异是穿过皮质的AAVrh.10转导倾向于集中在该组织外围，皮质层1-3周围，特别是在后皮质、运动、体感和视觉皮质的区域内。虽然这可归因于差异免疫染色，但我们在分析中观察到这种现象在遍及染色的AAVrh.10切片中具有高度一致性。这种趋势并不适用于AAV1R6/7，它似乎介导了遍及皮质层的更均匀分布的表达。
海马。静脉内递送后，嵌合AAV1R6/7载体似乎介导双侧穿过脑半球的整个海马的神经元中的强大GFP表达。在CA1、CA2和CA3锥体层内观察到GFP+海马神经元(图27C，CA2和部分CA1所示)。AAV1R6/7似乎也有效转导齿状回内的神经元，显示出大量GFP+神经元，它们看起来是基于形态学的颗粒细胞(图7D)。AAV1R6/7在海马中显示的神经元转导谱与AAVrh.10所见的类似。然而，与AAVrh.10相反，AAV1R6/7似乎不以任何可感知的水平转导任一区域中的神经胶质或内皮细胞，在AAV1和AAV1R6/7之间在GFP+神经胶质细胞中没有观察到显著差异(图8C和8D)。
在海马中观察到的AAV1转导再次限于维管结构。此外，这些定性趋势通过海马(图8C)和齿状回(图8D)中神经元和神经胶质细胞转导的定量数据得到证实。
丘脑。对于AAV1R6/7，GFP+神经元在丘脑中检测，其水平与AAVrh.10相当(图7E)。此外，AAV1R6/7显示出内皮的最小转导，以及丘脑中神经胶质转导水平与AAVrh相比显著降低。定量数据进一步证实了这些趋势(图8E)，在这些定量数据中发现AAVrh.10、AAV1R6和AAV1R7的丘脑神经元的转导相对于AAV1显著不同。相反，相对于AAV1，AAV1R6/7的丘脑神经胶质转导没有发现显著差异。
下丘脑。尽管有些变化，但是当全身施用时，我们在针对亲代和嵌合载体的下丘脑内观察到一致的低水平的GFP表达，与细胞类型无关(图27F)。观察到对于AAVrh.10的下丘脑中神经元转导水平的变化，揭示了小鼠中高数量和低数量的GFP+神经元。通过我们的定量数据中AAVrh.10转导显示的偏差，说明了这种转导谱(图8F)。AAV1显示中等的下丘脑转导，其仅限于维管结构。AAV1R6/7载体在下丘脑中显示低数量的GFP+神经元和神经胶质细胞，以及少数GFP+内皮细胞(图7F和图8F)。
纹状体。AAV1R6/7与AAVrh10一样有效地转导纹状体(特别是尾状壳核)中的神经元(图7G)，如我们的定量数据所进一步证实的，所述定量数据表明每种相对于AAV1的显著差异；然而，这些载体在纹状体中转导约2倍少的神经胶质细胞和较少数量的内皮细胞(图8G)，尽管有一些观察到的变化。
杏仁核。对于AAV1R6/7的杏仁核转导谱显示出强烈的神经元GFP表达，与AAV1相比显著不同。检测到少量GFP+神经胶质细胞，与AAV1相比没有显著差异(图7H和图8H)，与其他脑区域如纹状体和丘脑类似，几乎没有观察到可检测的GFP+内皮细胞。
总之，静脉内递送AAV1R6和AAV1R7后来自小鼠的免疫染色脑区的形态学评估证明了与亲本AAVrh.10相当的强健的和选择性的神经元转导。此外，这些嵌合体显示出减少的神经胶质转导，并且它们转导脑微维管结构内皮细胞的能力似乎减弱。此外，这些结果似乎在各种大脑区域内是一致的，但下丘脑除外，在下丘脑中一般观察到低转导水平。
AAV1R6和AAV1R7从肝脏去靶向，同时保留亲本心脏转导谱
通过免疫染色心脏和肝脏切片，我们分析了这些变体相比于亲本血清型的相对心脏和肝脏转导。用剂量为5×1011vg的包装与绿色荧光蛋白(GFP)编码序列连接的杂合鸡β肌动蛋白启动子(CBh)(CBh-scGFP)的载体(AAV1、AAV1R6或AAV1R7)或作为阴性对照的PBS通过尾静脉注射全身施用至6-8周龄雌性BL6小鼠。注射后21天处死小鼠，并收获组织，将其固定并切片。显微镜检查用于可视化GFP报告基因转导。使用ImageJ软件，通过对每只小鼠的多个图像的相对荧光求平均来量化GFP表达。对于模拟物，n＝1，对于AAV1，n＝2，对于AAV1R6和AAV1R7，n＝3。
如图10所示，相对于亲本血清型AAV1和AAVrh.10，两种嵌合载体在心脏中表现出相当水平的GFP表达，相对于AAV1，对于AAVrh.10、AAV1R6或AAV1R7没有发现显著差异；然而，心脏组织中的AAVrh.10表达水平在小鼠中显示出显著变化(图10A和10B)。在肝脏中，AAV1表现出中等的转导水平，而AAVrh.10表现异常良好，证明了更高对数倍的转导。相反，在与模拟物处理的小鼠相当的背景水平下，AAV1R6和AAV1R7在肝脏中介导可忽略的GFP表达(图10B)，其相对于AAVrh.10而言显著降低。因此，我们得出结论，AAV1R6和AAV1R7相对于其亲本血清型是肝脏去靶向的。
单独地，将包装与荧光素酶编码序列连接的鸡β肌动蛋白(CBA)启动子以产生CBA-荧光素酶转基因的AAV载体以1×1011vg的剂量通过尾静脉注射施用至C57/B16小鼠。在注射后14天处死小鼠，收获组织，将其切碎、裂解并进行荧光素酶测定，以检测脑、心脏、肝脏和脊髓组织的相对转导水平。将数据归一化作为每克组织的相对光单位。在脑中，AAV1R6、AAV1R7和AAV1RX显示出相当大的转导水平，尽管不如AAVrh.10高(图3)。嵌合衣壳另外显示与亲本AAV1和AAVrh.10衣壳在心脏中相当的转导水平。在脊髓中，嵌合体的转导水平似乎介于亲本之间。引人注目的是，该数据进一步证明AAV1R6、AAV1R7和AAV1RX都是肝脏去靶向的。N＝3。
AAV1R6嵌合衣壳的结构分析鉴定了AAVrh.10的三个潜在结构域，这些结构域可能使得穿过BBB
序列分析显示AAV1R6与AAV1具有97-98％的同一性，其中18个独特的氨基酸残基来自AAVrh.10。AAV1R7也与AAV1大致相同，但总共有22个源自AAVrh.10的残基，包括AAV1R6中存在的18个残基。在AAV1R7特有的4个额外残基中，两个位于VP1独特(VP1u)N末端区域(189I，206A)内，且另外两个位于掩埋的VP3N末端区域(224S和225S)。由于这些残基没有暴露在衣壳表面上，并且因为体内数据表明AAV1R6和AAV1R7显示的转导谱是等同的(图7和图8)，所以我们从我们分析的其余部分中排除了AAV1R7，仅关注AAV1R6。
AAV1R6具有3段来自AAVrh.10亲本毒株的非连续残基。第一组残基(组i)包括VP1u区域内的三个氨基酸(148P、152R和153S)(图9A)。具体地，一个残基位于碱性区域1(BR1)附近，其含有VP1的第一核定位信号(NLS)。另外，组i还在位于VP2N-末端区域内的NLS附近含有两个残基(158T和163K)(图9A)。如前所述，这些残基不是表面暴露的，而是在衣壳内保持内在化，直到随后在细胞内运输途径。
AAV1R6上的第二组源自AAVrh.10的残基(组ii)由包含BC环的8个氨基酸组成，位于可变区I(VR-1)内(图9A和9B)。这些残基暴露在衣壳表面上，在3倍对称轴的突起底部(图9D和9F)，并且也定位于2倍对称轴处的凹陷处(图9C和9F)。同样重要的是要注意，AAVrh.10上的这组氨基酸残基被嵌合的AAV1R8/19/20衣壳中的AAV1残基置换，所述AAV1R8/19/20衣壳在全身施用后不能穿透CNS。
存在于AAV1R6中的第三组源自AAVrh.10的残基(组iii)包括总共6个氨基酸。这些残基中的四个(328Q、330E、332T和333K)位于VR-II，DE环内，其有助于在5倍对称轴处形成孔(图9A、9B、9E、9F)。该组中最后两个剩余的残基(343I和347T)位于β-链E内，位于衣壳内部(图9A和9B)。虽然这些残基在AAV1和AAVrh.10之间不同，但应注意它们在不同的AAV血清型中相对保守。
AAV1RX(一种嵌合衣壳，其具有用于穿过BBB的来自AAVrh.10的最小足迹)的合理设计
使用合理的方法，我们缩小了1R6足迹中AAVrh.10衍生的氨基酸残基的最小数量，其能够穿过BBB并赋予CNS趋向性。我们首先排除了未暴露在衣壳表面的任何氨基酸，消除了位于衣壳序列的VP1/2N末端区域内的一段残基(148P，152R，153S，158T和163K)。使用相同的基本原理，我们还排除了保守的β链E(343I和347T)内的残基，以及VR-II内的残基，其是连接β链D和E的成孔环(328Q、330E、332T和333K)。通过这种方法，选择在VR-1(在AAV1R6上桥接β-链B和C的环)内发现的包含8个氨基酸(263N、264G、265T、266S、268G(相对于AAV1序列的插入)、269S、270T和274T)的足迹，，，用于进一步评估(图11A和11B)。这些表面暴露的残基位于2倍对称轴的凹陷附近(图11C和11F)，和在三倍突起的底部(图11D和11F)。在3倍对称轴上的表面暴露残基的立体路径图投影突出了这8个残基关于衣壳表面周围氨基酸的拓扑取向(图11G)。如前所述，我们还考虑到这些氨基酸不存在于AAV1R8/19/20变体中，这些变体在全身施用后不能转导脑实质。
然后我们通过将来自AAVrh.10的8个氨基酸残基移植到AAV1血清型上来设计嵌合衣壳，将该嵌合衣壳命名为AAV1RX。我们通过尾静脉注射以每只小鼠5×1011vg剂量将AAV1RX-CBh-scGFP载体施用至6-8周龄雌性C57/Bl6小鼠。在注射后21天通过免疫染色评估大脑中的GFP报告基因表达。如图11H中所示，AAV1RX转导在运动皮质和皮质神经元内的神经元，遍及整个皮质，同时证明有限的神经胶质转导和减少的血管转导，如先前使用嵌合衣壳AAV1R6和AAV1R7所见的。继续这种趋势，在海马中观察到许多GFP+锥体神经元，以及齿状回中丰富的GFP+颗粒细胞。值得注意的是，这些区域中的GFP+神经胶质和内皮细胞基本上不存在。在丘脑中，AAV1RX表现出与AAV1R6和AAV1R7相当的水平的强大的神经元转导，具有中等的神经胶质和内皮细胞转导，尽管其水平高于其他脑区。在下丘脑中，GFP+神经元是稀疏的，并且观察到很少的GFP+神经胶质和血管内皮细胞。最后，AAV1RX显示的优选神经元转导谱也见于纹状体(特别是尾状壳核)和杏仁核中(图11H)。这些脑区域的定量分析和与对于AAV1、AAVrh.10和嵌合AAV1R6和AAV1R7载体所见到的那些的比较表明，来自AAVrh.10的8个氨基酸残基的这个最小足迹对于穿过BBB是至关重要的(图13)。
AAV1R6、AAV1R7和AAV1RX介导外周组织中的低转导水平和生物分布。
为了对具有亲本血清型的不同嵌合衣壳进行比较分析，用包装由鸡β肌动蛋白启动子驱动的单链荧光素酶报告基因转基因(ssCBA-Luc)的AAV1、AAVrh.10、AAV1R6、AAV1R7或AAV1RX载体，以每只动物1×1011vg的剂量，通过尾静脉注射6-8周龄雌性C57/Bl6小鼠。在注射后2周，处死小鼠并收获组织。对组织裂解物进行荧光素酶活性测定以及进行qPCR分析，以确定载体生物分布(图12)。与AAV1相比，在大脑内观察到所有三种嵌合载体介导更高的荧光素酶转基因表达以及针对每种嵌合体的病毒基因组拷贝的相应增加(图12A和12B)。然而，与AAVrh.10相比，它们的转基因表达水平和病毒基因组拷贝数在脑中低约2-3倍，除了AV1RX生物分布之外，它们都被发现具有统计学意义(图12A和12B)。尽管观察到对于AAV1RX的心脏转导水平有一些变化，但观察到心脏中对于AAV1R6、AAV1R7和AAV1RX的相似的转导水平和病毒基因组拷贝数，与对于AAV1所见的相当(图12C和12D)。与其他载体相比，AAVrh.10在心脏中介导约2-4倍高的心脏荧光素酶表达和相应的约2倍高的病毒基因组拷贝(图12C和12D)。正如其他组所证明的那样，AAVrh.10在肝脏中显示出几倍高的荧光素酶转基因表达水平和一致的高病毒基因组拷贝。相反，在肝脏中检测到对于AAV1、1R6、1R7和1RX的低至背景水平的荧光素酶表达和显著减少的病毒基因组拷贝(图12E和12F)。值得注意的是，在肾脏中检测到针对AAVrh.10的荧光素酶表达和病毒基因组拷贝数的相应趋势(图12G和12H)。尽管三种嵌合载体显示出相似的病毒基因组拷贝数水平，但肾脏中的荧光素酶表达却不存在。总之，这些数据似乎表明嵌合AAV1R6、1R7和1RX载体从肝脏去靶向并且可能通过肾脏从血液循环中清除。
在静脉内施用后，我们鉴定了能够穿过BBB并有效转导CNS的嵌合衣壳的子集。发现穿过BBB的能力与细胞培养物中的感染性和对神经氨酸酶的敏感性成反比关系。结构建模和路线图分析进一步帮助确定了AAVrh.10中几个关键的残基簇，这些残基能够穿过脑维管结构进行转运和广泛的神经元转导。随后，我们能够通过合理的诱变方法进一步缩小这种足迹的大小，然后在体内进行功能验证。总之，我们已经确定了来自AAVrh.10的最小足迹，当移植到其他AAV毒株上时，其允许穿过BBB转运，并且与AAVrh相比能够实现更具靶向的CNS转导谱。此外，所得衣壳从脑维管结构、肝脏和其他外周组织中去靶向。这种新型向神经的足迹的功能映射提供了工程化合成AAV衣壳的路线图，用于具有改进的安全性的有效的CNS基因转移。
在本研究中用于产生嵌合衣壳文库的亲本血清型AAV1和AAVrh.10都是属于两个不同进化枝的非人灵长类动物分离株--AAV1属于进化枝A而AAVrh.10属于进化枝E。尽管它们之间有进化距离，但它们的Cap基因之间共享约85％的序列同源性。已知AAV1识别N-连接的唾液酸(Sia)，并且最近已经报道了构成AAV1衣壳上的Sia识别足迹的关键残基。目前的研究所鉴定的262N、263G、264T、265S、267G、268S、269T和273T作为嵌合AAV1RX衣壳的关键残基，其来源于AAVrh.10，是穿过BBB所必需的。虽然AAV1的Sia接触残基都不位于嵌合1RX足迹内，但残基S268、D271和N272的骨架羰基氧原子已经可能与稳定衣壳-聚糖相互作用和增加Sia结合亲和力有关。此外，该位置的残基(D271和N272)位于AAV9上的半乳糖结合足迹内。因此，目前的研究支持下述概念：VR-I内的残基是关键的。
天然AAV分离株的VP3序列的比对揭示了，赋予AAV1RX CNS表型的8个氨基酸残基在AAVrh.8和AAVrh.39(进化枝E中的其他向神经衣壳)中是保守的(图14)。类似地，同样位于进化枝E中的AAV8和AAVrh.43显示出穿过BBB的能力，尽管效率低得多。在这个足迹中，两者都拥有8个残基中的7个；因此，在这些衣壳上引入完整的足迹可能会增强他们穿过BBB的能力。
表型上，AAV1和AAVrh.10在穿过BBB以及转导脑中的神经元和神经胶质的能力方面显著不同。当静脉内递送时，AAV1表现出在血管内皮细胞中的优先摄取和转导。相反，AAVrh.10不仅会被血管内皮细胞吸收并将其转导，而且还会穿过维管结构并转导下面的组织，如CNS或骨骼肌。目前的研究确定了AAVrh.10衣壳上的残基的最小组，这些残基部分赋予AAV1衣壳这些特征。虽然AAV1RX嵌合体上的这个最小足迹对于穿过BBB和转导神经元似乎是必需的，但是外周组织(例如肝脏)中的转导显著减少，而心脏表达保持与AAV1相似。这些差异表明AAVrh.10衣壳上的其他结构域可能在赋予全身转导谱方面发挥作用。关于脑实质，重要的是要注意，在CNS进入后，AAV1RX的进入后转导谱优先是神经胶质转导比AAVrh.10降低的神经元。这可能归因于大多数衣壳来自AAV1的事实，已知AAV1在脑室内注射后介导优先神经元转导。1RX穿过BBB的未知机制也可能介导优先神经元摄取，或AAVrh.10衣壳上的其他基序/氨基酸残基可介导神经胶质转导中的进入后步骤。
从临床角度来看，可以穿过BBB，优先转导脑内的神经元并且同时从肝脏去靶向的衣壳可以证明来自全身施用途径的CNS靶向基因转移应用的改善的安全性特征。外周器官中特别是肝脏中载体摄取的减少可以减少肝毒性的潜在威胁，如通过全身注射某些AAV血清型后患者血清中转氨酶的瞬时升高所证实的。
AAV1R6/7/X载体可广泛用于全局CNS基因转移，特别是用于开发治疗神经障碍(如弗里德赖希氏共济失调或脊髓性肌萎缩)的基因治疗策略。
表1.
表2.AAV血清型1、2、3、6、7、8、9和rh10中的AAV1R7修饰。
*编号是相对于野生型。
表3氨基酸残基和缩写。
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Claims (127)

1.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、A263、S264、T265、A267、S268和H272处的修饰，和在残基G266和A267之间的单个氨基酸残基插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列或AAV2(SEQ IDNO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的AAV衣壳蛋白，其进一步包含在氨基酸残基Q148、E152、S157、T162、T326、D328、V330、T331、V341和S345处的修饰，以及残基E152和P153(VP1编号)之间的单个氨基酸残基插入，其中每个残基的编号基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中的等同氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的AAV衣壳蛋白，其进一步包含氨基酸残基L188、S205、N223和A224(VP1编号)的修饰，其中每个残基的编号基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中的等同氨基酸残基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰是S262N、A263G、S264T、T265S、A267S、S268T和H272T中的至少一个。
5.如权利要求1-2中任一项所述的AAV衣壳，其中所述修饰是Q148P、E152R、S157T、T162K、T326Q、D328E、V330T、T331K、V341I和S345T中的至少一个。
6.如权利要求3所述的AAV衣壳，其中所述修饰是L188I、S205A、N223S和A224S中的至少一个。
7.如权利要求1所述的AAV衣壳蛋白，其包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:9的氨基酸序列(AAV1RX)；
b)SEQ ID NO:10的氨基酸序列(AAV2RX)；
c)SEQ ID NO:11的氨基酸序列(AAV3RX)；
d)SEQ ID NO:12的氨基酸序列(AAV6RX)；
e)SEQ ID NO:13的氨基酸序列(AAV7RX)；
f)SEQ ID NO:14的氨基酸序列(AAV8RX)；和
g)SEQ ID NO:15的氨基酸序列(AAV9RX)。
8.如权利要求2所述的AAV衣壳，其包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:16的氨基酸序列(AAV1R6)；
b)SEQ ID NO:17的氨基酸序列(AAV2R6)；
c)SEQ ID NO:18的氨基酸序列(AAV3R6)；
d)SEQ ID NO:19的氨基酸序列(AAV6R6)；
e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列(AAV7R6)；
f)SEQ ID NO:21的氨基酸序列(AAV8R6)；和
g)SEQ ID NO:22的氨基酸序列(AAV9R6)。
9.如权利要求3所述的AAV衣壳，其包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:23的氨基酸序列(AAV1R7)；
b)SEQ ID NO:24的氨基酸序列(AAV2R7)；
c)SEQ ID NO:25的氨基酸序列(AAV3R7)；
d)SEQ ID NO:26的氨基酸序列(AAV6R7)；
e)SEQ ID NO:27的氨基酸序列(AAV7R7)；
f)SEQ ID NO:28的氨基酸序列(AAV8R7)；和
g)SEQ ID NO:29的氨基酸序列(AAV9R7)。
10.AAV衣壳，其包含如权利要求1-9中任一项所述的衣壳蛋白。
11.病毒载体，其包含：
(a)权利要求10所述的AAV衣壳；和
(b)包含至少一个末端重复序列的核酸，
其中所述核酸由AAV衣壳包壳。
12.组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求11所述的病毒载体。
13.将核酸分子导入细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求11所述的病毒载体和/或权利要求12所述的组合物接触。
14.将核酸分子递送至受试者的方法，其包括向所述受试者施用权利要求11所述的病毒载体和/或权利要求12所述的组合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中将所述病毒载体和/或组合物施用至所述受试者的中枢神经系统。
16.如权利要求15所述的方法，其中将所述病毒载体和/或组合物穿过血脑屏障递送。
17.如权利要求14、15或16中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含感兴趣的核酸分子。
18.选择性递送感兴趣的核酸分子至神经元细胞的方法，其包括使所述神经元细胞与权利要求11所述的病毒载体接触，其中所述病毒载体包含所述感兴趣的核酸分子。
19.如权利要求18所述的方法，其还包括选择性地将感兴趣的核酸分子递送至心肌细胞。
20.如权利要求17、18或19中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的核酸分子编码治疗性蛋白质或治疗性RNA。
21.如权利要求18、19或20中任一项所述的方法，其中所述神经元细胞和心肌细胞是在受试者中的。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述病毒载体从脾细胞、肝细胞或肾细胞去靶向。
23.如权利要求14-17、21或22中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
24.用于治疗受试者的神经障碍或缺陷的方法，其包括向所述受试者施用权利要求11所述的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码在治疗所述神经障碍或缺陷中有效的治疗性蛋白质或治疗性RNA的核酸分子。
25.用于治疗受试者的神经和心血管障碍或缺陷的方法，其包括向所述受试者施用权利要求11所述的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码在治疗所述神经和心血管障碍或缺陷中有效的治疗性蛋白质或治疗性RNA的核酸分子。
26.如权利要求14-17、21、22、23、24或25中任一项所述的方法，其中将所述病毒载体或组合物静脉内、动脉内或腹膜内施用至所述受试者。
27.如权利要求14-17、21、22、23、24或25中任一项所述的方法，其中将所述病毒载体或组合物经过脑室内、脑池内、实质内、颅内和/或鞘内途径施用至所述受试者。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述病毒载体和/或组合物对所述受试者的全身施用导致脱靶组织中的较低转导。
29.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、A263、S264、T265和A267(VP1编号)处的修饰，和在残基S268和N269之间的单个氨基酸残基插入，其中所述氨基酸残基基于AAV1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列或AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
30.如权利要求29所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基H272处的修饰。
31.如权利要求29或30所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基Q148、E152、S157、T162、H272、T326、D328、V330、T331、V341和S345处的修饰，以及在残基E152和P153之间的单个氨基酸残基插入。
32.如权利要求29-31中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基L188、S205、N223、A224和H272处的修饰。
33.如权利要求29-32中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰是S262N、A263G、S264T、T265S和A267S中的至少一个。
34.如权利要求31-33中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰是Q148P、E152R、S157T、T162K、H272T、T326Q、D328E、V330T、T331K、V341I和S345T中的至少一个。
35.如权利要求32-24中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰是L188I、S205A、N223S、A224S和H272T中的至少一个。
36.如权利要求29-35中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基S268和N269之间的所述氨基酸残基插入是单个T残基的插入。
37.如权利要求31-36中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基E152和P153之间的所述氨基酸残基插入是单个S残基的插入。
38.如权利要求29所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白的氨基酸序列选自由以下各项组成的组：
a)SEQ ID NO:9的氨基酸序列(AAV1RX)；
b)SEQ ID NO:10的氨基酸序列(AAV2RX)；
c)SEQ ID NO:11的氨基酸序列(AAV3RX)；
d)SEQ ID NO:12的氨基酸序列(AAV6RX)；
e)SEQ ID NO:13的氨基酸序列(AAV7RX)；
f)SEQ ID NO:14的氨基酸序列(AAV8RX)；和
g)SEQ ID NO:15的氨基酸序列(AAV9RX)。
39.如权利要求38所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:9(AAV1RX)。
40.如权利要求31所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白的氨基酸序列选自由以下各项组成的组：
a)SEQ ID NO:16的氨基酸序列(AAV1R6)；
b)SEQ ID NO:17的氨基酸序列(AAV2R6)；
c)SEQ ID NO:18的氨基酸序列(AAV3R6)；
d)SEQ ID NO:19的氨基酸序列(AAV6R6)；
e)SEQ ID NO:20的氨基酸序列(AAV7R6)；
f)SEQ ID NO:21的氨基酸序列(AAV8R6)；和
g)SEQ ID NO:22的氨基酸序列(AAV9R6)。
41.如权利要求40所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:16(AAV1R6)。
42.如权利要求32所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白的氨基酸序列选自由以下各项组成的组：
a)SEQ ID NO:23的氨基酸序列(AAV1R7)；
b)SEQ ID NO:24的氨基酸序列(AAV2R7)；
c)SEQ ID NO:25的氨基酸序列(AAV3R7)；
d)SEQ ID NO:26的氨基酸序列(AAV6R7)；
e)SEQ ID NO:27的氨基酸序列(AAV7R7)；
f)SEQ ID NO:28的氨基酸序列(AAV8R7)；和
g)SEQ ID NO:29的氨基酸序列(AAV9R7)。
43.如权利要求42所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:23(AAV1R7)。
44.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含导致在对应于天然AAV1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置262至265(VP1编号)的氨基酸处的以下氨基酸序列的修饰：
X1-X2-X3-X4
其中X1是除S以外的任意氨基酸；
其中X2是除A以外的任意氨基酸；
其中X3是除S以外的任意氨基酸；和
其中X4是除T以外的任意氨基酸。
45.如权利要求44所述的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸X1是N。
46.如权利要求44所述的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸X2是G。
47.如权利要求44所述的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸X3是T。
48.如权利要求44所述的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸X4是S。
49.如权利要求44所述的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸X1是N，X2是G，X3是T，且X4是S。
50.如权利要求44-49中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基H272处的修饰。
51.如权利要求50所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰是H272T。
52.如权利要求44-51中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白进一步包含在氨基酸残基S268和N269之间的氨基酸残基插入。
53.如权利要求52所述的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸残基插入是单个T残基的插入。
54.腺相关病毒(AAV)载体，其包含权利要求29-53中任一项所述的AAV衣壳蛋白。
55.如权利要求54所述的AAV载体，其进一步包含：
包含至少一个末端重复序列的核酸，其中所述核酸由所述AAV衣壳蛋白包壳。
56.如权利要求55所述的AAV病毒载体，其中所述末端重复序列是AAV末端重复序列。
57.如权利要求55所述的AAV病毒载体，其中所述末端重复序列是非AAV末端重复序列。
58.如权利要求55-57中任一项所述的AAV病毒载体，其中所述核酸进一步包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的序列。
59.药物组合物，其包含权利要求54-58中任一项所述的病毒载体。
60.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
61.将核酸分子导入细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求54-59中任一项所述的AAV病毒载体接触。
62.将核酸分子导入细胞的方法，其包括使细胞与权利要求59或60所述的药物组合物接触。
63.如权利要求61或62所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物施用至受试者的中枢神经系统。
64.如权利要求63所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物穿过血脑屏障递送。
65.如权利要求61或62所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肝脏去靶向。
66.如权利要求61或62所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肾脏去靶向。
67.如权利要求61或62所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从脾脏去靶向。
68.选择性地将治疗性蛋白质或治疗性RNA递送至受试者的神经元细胞的方法，其包括使所述神经元细胞与权利要求54-58中任一项所述的病毒载体或权利要求59-60所述的组合物接触，其中所述病毒载体或所述组合物包含所述治疗性蛋白质或治疗性RNA。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肝脏去靶向。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肾脏去靶向。
71.如权利要求68所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从脾脏去靶向。
72.治疗受试者神经障碍或缺陷的方法，其中该方法包括向受试者施用权利要求54-58中任一项所述的病毒载体或权利要求59-60所述的组合物，其中所述病毒载体或所述组合物包含编码在治疗神经障碍中有效的治疗性蛋白质或治疗性RNA的核酸分子。
73.如权利要求72所述的方法，其进一步包括治疗受试者的心血管障碍或缺陷。
74.如权利要求72所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物选择性地递送至神经元细胞。
75.如权利要求72所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物选择性地递送至心肌细胞。
76.如权利要求72所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物从肝脏、肾脏和/或脾脏去靶向。
77.如权利要求61-76中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
78.权利要求61-77中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
79.如权利要求61-78中任一项所述的方法，其中将所述病毒载体或组合物经过选自由以下各项组成的组的施用路径递送至所述受试者：静脉内、动脉内、腹膜内、脑室内、脑池内、实质内、颅内和鞘内。
80.如权利要求79所述的方法，其中将所述病毒载体或组合物通过静脉内施用递送至所述受试者。
81.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、A263、S264、T265、A267和H272处的修饰，和在残基S268和N269之间的单个氨基酸残基插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV1(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
82.如权利要求81所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰包含S262N、A263G、S264T、T265S、A267G和H272T中的至少一个。
83.如权利要求81或82所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基S268和N269之间的单个氨基酸残基插入是单个T残基插入。
84.如权利要求81至83中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含SEQID NO:30或SEQ ID NO.33的序列。
85.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、Q263、S264、A266、S267和H271处的修饰，和在残基S261和S262之间的至少一个氨基酸残基的插入，(VP1编号)，其中每个残基的编号基于AAV2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或AAV1(SEQ IDNO:1)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
86.如权利要求85所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰包含S262T、Q263S、S264G、A266S、S267T和H271T中的至少一个。
87.如权利要求85或86所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基SS61和S262之间的插入是单个氨基酸残基的插入。
88.如权利要求85或86所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基S251和S252之间的插入是多于一个氨基酸残基的插入。
89.如权利要求88所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基S251和S252之间的插入是N和G残基的插入。
90.如权利要求85至89中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含SEQID NO:31的序列。
91.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S262、Q263、S264、A266、A267、H271处的修饰，和在残基S261和S262之间的单个氨基酸残基插入，其中每个残基的编号基于AAV3(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ IDNO:2)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)、AAV9(SEQ ID NO:7)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
92.如权利要求91所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰包括S262T、Q263S、S264G、A266S、A267T、H271T中的至少一个。
93.如权利要求91或92所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基SS61和S262之间的插入是单个氨基酸残基的插入。
94.如权利要求91或92所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基S251和S252之间的插入是多于一个氨基酸残基的插入。
95.如权利要求94所述的AAV衣壳蛋白，其中在残基S251和S252之间的插入是N和G残基的插入。
96.如权利要求91至95中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含SEQID NO:32的序列。
97.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含在氨基酸残基S263、S269、A237(VP1编号)处的修饰，其中每个残基的编号基于AAV9(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列或AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)、AAV7(SEQ ID NO:5)、AAV8(SEQ ID NO:6)或AAVrh10(SEQ ID NO:8)中的等同氨基酸残基。
98.如权利要求97所述的AAV衣壳蛋白，其中所述修饰包含S263G、S269T和A273T中的至少一个。
99.如权利要求97或98所述的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO:34的序列。
100.腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO:9至SEQ IDNO:34中任一个的序列。
101.腺相关病毒(AAV)载体，其包含权利要求81-100中任一项所述的AAV衣壳蛋白。
102.如权利要求101所述的AAV载体，其进一步包含：
包含至少一个末端重复序列的核酸，其中所述核酸被所述AAV衣壳蛋白包壳。
103.如权利要求102所述的AAV病毒载体，其中所述末端重复序列是AAV末端重复序列。
104.如权利要求102所述的AAV病毒载体，其中所述末端重复序列是非AAV末端重复序列。
105.如权利要求101-104中任一项所述的AAV病毒载体，其中所述核酸进一步包含编码治疗性蛋白质或治疗性RNA的序列。
106.药物组合物，其包含权利要求101-105中任一项所述的病毒载体。
107.如权利要求106所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
108.将核酸分子导入细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求101-105中任一项所述的AAV病毒载体接触。
109.将核酸分子导入细胞的方法，包括使细胞与权利要求106或107所述的药物组合物接触。
110.如权利要求108或109所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物施用至受试者的中枢神经系统。
111.如权利要求110所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物穿过血脑屏障递送。
112.如权利要求108或109所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肝脏去靶向。
113.如权利要求108或109所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肾脏去靶向。
114.如权利要求108或109所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从脾脏去靶向。
115.选择性地将治疗性蛋白质或治疗性RNA递送至受试者的神经元细胞的方法，其包括使所述神经元细胞与权利要求101-105中任一项所述的病毒载体或权利要求106-107所述的组合物接触，其中所述病毒载体或所述组合物包含所述治疗性蛋白质或治疗性RNA。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肝脏去靶向。
117.如权利要求115所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从肾脏去靶向。
118.如权利要求115所述的方法，其中所述病毒载体或所述组合物从脾脏去靶向。
119.治疗受试者神经障碍或缺陷的方法，其中该方法包括向所述受试者施用权利要求101-105中任一项所述的病毒载体或权利要求106-107所述的组合物，其中所述病毒载体或所述组合物包含编码在治疗神经障碍中有效的治疗性蛋白质或治疗性RNA的核酸分子。
120.如权利要求119所述的方法，其进一步包括治疗受试者的心血管障碍或缺陷。
121.如权利要求119所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物选择性地递送至神经元细胞。
122.如权利要求119所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物选择性地递送至心肌细胞。
123.如权利要求119所述的方法，其中将所述病毒载体或所述组合物从肝脏、肾脏和/或脾脏去靶向。
124.如权利要求108-123中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
125.如权利要求108-124中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
126.如权利要求108-125中任一项所述的方法，其中将所述病毒载体或组合物经过选自由以下各项组成的组的施用路径递送至所述受试者：静脉内、动脉内、腹膜内、脑室内、脑池内、实质内、颅内和鞘内。
127.如权利要求126所述的方法，其中将所述病毒载体或组合物通过静脉内施用递送至所述受试者。
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