TW202325720A - 經修飾aav蛋白殼及載體 - Google Patents
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Abstract
本發明大體上關於經修飾腺相關病毒(adeno-associated virus;AAV)蛋白殼多肽及編碼核酸分子。本發明亦關於包含該等蛋白殼多肽之AAV載體及包含該等編碼核酸分子的核酸載體(例如質體),以及關於包含該等載體之宿主細胞。本發明亦關於該等多肽、編碼核酸分子、載體及宿主細胞之方法及用途。
Description
本發明大體上關於經修飾腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)蛋白殼多肽及編碼核酸分子。本發明亦關於包含該等蛋白殼多肽之AAV載體及包含該等編碼核酸分子的核酸載體(例如質體),以及關於包含該等載體之宿主細胞。本發明亦關於該等多肽、編碼核酸分子、載體及宿主細胞之方法及用途。
基因療法最常使用病毒載體進行研究及實現,且值得注意的最新進展係基於腺相關病毒載體。腺相關病毒(AAV)為複製缺陷型小病毒,其單股DNA基因體為約4.7 kb長。AAV基因體包括分子兩端處之反向末端重複序列(inverted terminal repeat,ITR),其側接兩個開放閱讀框:
rep及
cap。
cap基因編碼三個結構蛋白殼蛋白:VP1、VP2及VP3。三個蛋白殼蛋白典型地以1:1:8-10之比值組裝而形成AAV蛋白殼,儘管已產生含有僅VP3,或VP1及VP3,或VP2及VP3的AAV蛋白殼。
cap基因亦編碼來自替代性開放閱讀框之組裝活化蛋白(assembly activating protein,AAP)。AAP促進蛋白殼組裝,對使蛋白殼蛋白靶向核起作用且促進蛋白殼形成。
rep基因編碼四個已知調節蛋白:Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。此等Rep蛋白參與AAV基因體複製、包裝、基因體整合及其他過程。最近,
X基因已在AAV2基因體之3'端中識別(Cao等人 PLoS One, 2014, 9:e104596)。經編碼之X蛋白似乎參與AAV生命週期,包括DNA複製。
ITR與若干種功能有關,特定言之將AAV DNA整合至宿主細胞基因體中,以及基因體複製及包裝。當AAV感染宿主細胞時,病毒基因體可整合至宿主之染色體DNA中,導致細胞之潛伏感染。因此,AAV可用於將異源序列引入細胞中。本質上,輔助病毒(例如腺病毒或疱疹病毒)提供允許AAV病毒在受感染細胞中複製及包裝新病毒粒子之蛋白因子。在腺病毒情況下,基因E1A、E1B、E2A、E4及VA提供輔助功能。在受輔助病毒感染後,補救並擴增AAV原病毒,並產生AAV及輔助病毒。
含有缺乏天然AAV基因體之部分、大部分或全部的基因體且代替地含有藉由ITR側接之一或多個異源序列之AAV載體(亦稱為重組AAV、rAAV)已成功用於基因療法環境。出於治療目的此等AAV載體廣泛用於將異源核酸遞送至受試者之細胞,且在許多情形下異源核酸之表現賦予治療作用。儘管目前已有若干種AAV載體用於臨床,但僅有限數量之AAV載體呈現所需要的初級人類細胞/組織之活體內轉導效率以促進異源核酸之充分表現而用於治療性應用。因此需要開發含有促進宿主細胞之活體內有效轉導的蛋白殼蛋白之替代性AAV載體。
本發明在某種程度上以與提高的轉導效率相關之AAV蛋白殼變異體可變區(VR)-I序列之生成及識別為基礎。在特定實施例中,當含於AAV載體中時本發明之包含本文所述變異體VR-I序列的蛋白殼多肽促進人類細胞(諸如人類肝細胞)之有效轉導。典型地,與包含其他AAV蛋白殼多肽(例如SEQ ID NO: 5中所闡述之原型AAV2蛋白殼)之AAV載體相比包含本發明之蛋白殼多肽的AAV載體之活體內轉導提高了。因此本發明之蛋白殼多肽尤其適用於製備AAV載體,且特定言之供基因療法用途之AAV載體。類似地,包含本發明之蛋白殼多肽(即具有蛋白殼,該蛋白殼包含本發明之蛋白殼多肽或由其組成)的AAV載體在基因療法應用中具有特定用途,諸如用於遞送用以治療不同疾病及病況之異源核酸。
在一個態樣中,本發明提供一種包含變異體VR-I之蛋白殼多肽,其中變異體VR-I包含SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列,且其中蛋白殼多肽包含與以下序列具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列:(i) SEQ ID NO: 2中所闡述之序列;(ii) SEQ ID NO: 2之位置138-735處的胺基酸序列;或(iii) SEQ ID NO: 2之位置203-736處的胺基酸序列。
在一特定實施例中,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
本發明之另一態樣提供一種包含變異體VR-I之蛋白殼多肽,其中變異體VR-I包含SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列,且其中蛋白殼多肽包含與以下序列具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列:(i) SEQ ID NO: 4中所闡述之序列;(ii) SEQ ID NO: 4之位置138-735處的胺基酸序列;或(iii) SEQ ID NO: 4之位置204-735處的胺基酸序列。
在一特定實施例中,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
本發明之另一態樣提供一種包含變異體VR-I之蛋白殼多肽,其中變異體VR-I包含SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列,且其中蛋白殼多肽包含與以下序列具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列:(i) SEQ ID NO: 340中所闡述之序列;(ii) SEQ ID NO: 340之位置138-735處的胺基酸序列;或(iii) SEQ ID NO: 340之位置204-735處的胺基酸序列。
在一特定實施例中,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
亦提供一種包含本發明之蛋白殼多肽的AAV載體。在一些實例中,AAV載體包含異源編碼序列,諸如編碼肽、多肽或聚核苷酸(例如治療性肽、多肽或聚核苷酸)之異源編碼序列。
亦提供一種編碼本發明之蛋白殼多肽的核酸分子。在另一態樣中,提供一種包含前述核酸分子之載體。在一些實例中,載體選自質體、黏質體、噬菌體及轉位子。
在另一態樣中,提供一種宿主細胞,其包含本發明之AAV載體、核酸分子或載體。
亦提供一種用於將異源編碼序列引入宿主細胞中之方法,其包含使宿主細胞與本發明之AAV載體接觸。在一些實例中,宿主細胞為肝細胞。在特定實施例中,使宿主細胞與AAV載體接觸包含向受試者投與AAV載體。在其他實施例中,方法為活體外或離體。
在另一態樣中,提供一種用於產生AAV載體之方法,其包含培養宿主細胞,該宿主細胞包含編碼本發明之蛋白殼多肽的核酸分子、AAV rep基因、藉由AAV反向末端重複序列側接之異源編碼序列及用於發生產生性AAV感染的輔助功能,培養係在適合於促進包含有包含本發明之蛋白殼多肽的蛋白殼之AAV載體的組裝之條件下,其中蛋白殼使異源編碼序列蛋白殼化。在一些實例中,宿主細胞為肝細胞。
亦提供一種用於產生展現增強之人類肝細胞轉導效率之經修飾AAV載體的方法,其包含:a)識別用於活體內轉導人類肝細胞之參考蛋白殼多肽;b)在位置262、263、264、265、266、267、268、269、270及271 (相對於SEQ ID NO: 5編號)中之一或多者處修飾參考蛋白殼多肽之序列,包含位置262-271 (相對於SEQ ID NO: 5編號)處之SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列;及c)使經修飾蛋白殼多肽載體化,藉此產生經修飾AAV載體。在一些實例中,其中參考蛋白殼多肽包含與SEQ ID NO: 2、4或340中所闡述之序列至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中,方法進一步包含評定利用人類肝細胞之活體內系統中經修飾AAV載體之轉導效率。在一個實例中,活體內系統包含帶有包含人類肝細胞之嵌合肝的較小動物(例如小鼠),諸如hFRG小鼠。
除非另外定義,否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之熟習此項技術者通常所理解相同之含義。除非另外提及,否則整個揭示內容通篇所提及的所有專利、專利申請案、公開申請案及公開案、資料庫、網站及其他公開材料均以全文引用之方式併入。在關於術語存在複數種定義之情況下,以此章節中之彼等定義為準。在提及URL或其他此類識別符或位址之情況下,應瞭解,雖然此類識別符可改變且網際網路上之特定資訊可變來變去,但可藉由搜索網際網路尋找等效資訊。提及識別符證實此類資訊之可用性及公開傳播。
如本文所用,除非上下文另外明確規定,否則單數形式「一(a/an)」及「該」亦包括複數態樣(即至少一個或多於一個)。因此,舉例而言,提及「多肽」包括單一多肽以及兩種或更多種多肽。
在本說明書之情況下,術語「約」應理解為指熟習此項技術者將考慮與達成相同功能或結果之情況下所列舉值相當之數值範圍。
在本說明書及隨後之申請專利範圍通篇中,除非上下文另外要求,否則「包含(comprise)」一詞及變化形式(諸如「包含(comprises/comprising)」)應理解為暗示包括所述整體或步驟或整體或步驟之群組但不排除任何其他整體或步驟或步驟或整體或步驟之群組。
如本文所用,「載體」包括指代聚核苷酸載體及病毒載體,其各自能夠將載體內所含有之轉殖基因遞送至宿主細胞中。載體可為附加型,亦即並不整合至宿主細胞之基因體中,或可整合至宿主細胞基因體中。載體亦可為複製勝任型或複製缺陷型。例示性聚核苷酸載體包括(但不限於)質體、黏質體及轉位子。例示性病毒載體包括例如AAV、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、疱疹病毒及肝炎病毒載體。
如本文所用,「腺相關病毒載體」或「AAV載體」係指其中蛋白殼衍生自腺相關病毒之載體,腺相關病毒包括(但不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13,來自其他分枝系或自合成、經生物工程改造或經修飾AAV蛋白殼蛋白分離或衍生之AAV,包括嵌合蛋白殼蛋白。在特定實施例中,AAV載體具有包含本發明之蛋白殼多肽的蛋白殼。當提及AAV載體時,基因體之來源及蛋白殼之來源均可識別,其中基因體之來源標為第一數字而蛋白殼之來源標為第二數字。因此,舉例而言,其中蛋白殼及基因體均衍生自AAV2之載體更精確地稱為AAV2/2。具有AAV6衍生之蛋白殼及AAV2衍生之基因體的載體最精確地稱為AAV2/6。具有經生物工程改造之DJ蛋白殼及AAV2衍生之基因體的載體最精確地稱為AAV2/DJ。為簡單起見且因為大部分載體使用AAV2衍生之基因體,應理解提及AAV6載體一般指AAV2/6載體,提及AAV2載體一般指AAV2/2載體等。AAV載體在本文中亦稱為「重組AAV」、「rAAV」、「重組AAV病毒粒子」、「rAAV病毒粒子」、「AAV變異體」、「重組AAV變異體」及「rAAV變異體」術語,該等術語可互換使用且係指複製缺陷型病毒,複製缺陷型病毒包括使AAV基因體殼體化之AAV蛋白殼殼層。AAV載體基因體(亦稱為載體基因體、重組AAV基因體或rAAV基因體)包含藉由功能性AAV ITR側接於兩側上之轉殖基因。典型地,已自基因體整體或部分刪除野生型AAV基因中之一或多者,較佳地rep及/或cap基因。功能性ITR序列為將載體基因體補救、複製及包裝至rAAV病毒粒子中所必需的。
術語「ITR」係指AAV基因體之任一末端處之反向末端重複序列。此序列可形成髮夾結構且參與AAV DNA複製及補救或自原核質體切除。用於本發明中之ITR不必為野生型核苷酸序列,且可改變,例如藉由核苷酸之插入、缺失或取代,只要序列提供rAAV之功能性補救、複製及包裝即可。
如本文所用,關於蛋白殼多肽之「功能性」意謂多肽可自組裝或與不同蛋白殼多肽組裝以產生AAV病毒粒子之蛋白質殼層(蛋白殼)。應理解並非給定宿主細胞中之所有蛋白殼多肽均組裝至AAV蛋白殼中。較佳地,所有AAV蛋白殼多肽分子之至少25%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%組裝至AAV蛋白殼中。用於量測此生物活性之適合的檢驗描述於例如Smith-Arica及Bartlett (2001), Curr Cardiol Rep 3(1): 43-49中。
「AAV輔助功能」或「輔助功能」係指使得AAV藉由宿主細胞複製及包裝之功能。AAV輔助功能可以多種形式中之任一者提供,包括(但不限於)以輔助病毒形式或以有助於AAV複製及包裝之輔助病毒基因形式。輔助病毒基因包括(但不限於)腺病毒輔助基因,諸如E1A、E1B、E2A、E4及VA。輔助病毒包括(但不限於)腺病毒、疱疹病毒、痘病毒(諸如痘瘡)及桿狀病毒。腺病毒涵蓋多個不同子組,但子組C之腺病毒5型(Ad5)最常用。已知人類、非人類哺乳動物及禽類來源之多種腺病毒且可購自貯藏所(諸如ATCC)。疱疹家族之病毒(其亦購自諸如ATCC之貯藏所)包括例如單純疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)及偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)。購自貯藏所之桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾(
Autographa californica)核多角體病毒。
如本文所用,術語「轉導」係指AAV載體進入一或多種特定細胞類型中及AAV載體內所含有之DNA轉移至細胞中。轉導可藉由量測細胞或細胞群體中AAV DNA或由AAV DNA表現之RNA的量,及/或藉由評定含有AAV DNA或由DNA表現之RNA的群體中細胞之數量來評定。當評定RNA之存在或量時,所評定的轉導類型在本文中稱為「功能性轉導」,亦即AAV將DNA轉移至細胞及使彼DNA表現之能力。術語「轉導效率」及其文法變體係指AAV載體轉導宿主細胞之能力且更特定言之AAV載體轉導宿主細胞之效率。在特定實施例中,轉導效率為活體內轉導效率且係指在向受試者投與載體以後AAV載體活體內轉導宿主細胞之能力。轉導效率可以此項技術者已知之多種方式評定,包括評定在曝露於或投與給定數量之載體粒子以後所轉導的宿主細胞之數量(例如藉由使用顯微鏡或流動式細胞量測技術評定來自載體基因體之報導基因(諸如GFP或eGFP)之表現);在曝露於給定數量之載體粒子以後宿主細胞群體中載體DNA之量(例如載體基因體的數量);在曝露於給定數量之載體粒子以後宿主細胞群體中載體RNA之量;及在曝露於或投與給定數量之載體粒子以後自宿主細胞群體中之載體基因體中的報導基因(例如GFP或eGFP)表現之蛋白量。宿主細胞群體可表示特定數量之宿主細胞、一定體積或重量之組織或整個器官(例如肝)。活體內轉導效率可反映AAV載體接近宿主細胞(諸如肝臟中之肝細胞)之能力;AAV載體進入宿主細胞之能力;及/或載體基因體中所含有之異源編碼序列在宿主細胞進入後之表現。
如本文所用,「對應核苷酸」、「對應胺基酸殘基」或「對應位置」係指在所比對基因座處出現之核苷酸、胺基酸或位置。相關或變異體聚核苷酸或多肽序列藉由熟習此項技術者已知的任何方法比對。此類方法典型地最大化匹配(例如位置處一致的核苷酸或胺基酸),且包括諸如使用人工比對及藉由使用可購得的多種比對程式(例如BLASTN、BLASTP、ClustlW、ClustlW2、EMBOSS、LALIGN、Kalign等)及熟習此項技術者已知的其他方法。藉由比對聚核苷酸之序列,熟習此項技術者可識別對應核苷酸。藉由比對兩種AAV蛋白殼多肽(例如如圖2中所展示),熟習此項技術者可識別一種AAV多肽內對應於另一AAV多肽中之不同區或殘基的區或胺基酸殘基。舉例而言,SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼多肽之位置262處的絲胺酸為SEQ ID NO: 4中所闡述之AAVC11.11蛋白殼多肽之位置263處的絲胺酸之對應胺基酸或與其對應(如圖2中之比對中所展示)。在另一實例中,且亦參考圖2,AAVC11.11蛋白殼多肽之位置734與AAV-LK03-REDH蛋白殼多肽之位置735比對或對應,且AAV2蛋白殼多肽之位置734處的天冬醯胺與AAV-LK03-REDH蛋白殼多肽之位置735處的脯胺酸對應或為其對應胺基酸。在另一實例中,AAV2蛋白殼多肽之位置262-271處之殘基(其構成AAV2蛋白殼之VR-I)對應於AAV7蛋白殼多肽之殘基263-273 (即AAV7蛋白殼之VR-I)及AAVC11.11蛋白殼多肽之殘基263-272 (即AAVC11.11蛋白殼多肽之VR-I)。因此,當本文參照特定蛋白殼多肽提及胺基酸殘基或位置時,應理解在適當時亦參考另一蛋白殼多肽中之對應胺基酸殘基或位置。舉例而言,提及包含有「包含序列SQSGASNDNH (SEQ ID NO: 12)之VR-I」之蛋白殼多肽不僅涵蓋分別在SEQ ID NO: 5及4中所闡述之AAV2及AAVC11.11蛋白殼多肽(其具有擁有位置262-271處的序列SQSGASNDNH (SEQ ID NO: 12)之VR-I),且亦涵蓋具有包含序列SQSGASNDNH (其在對應於SEQ ID NO: 5之位置262-271的位置處)之VR-I之其他蛋白殼多肽,諸如SEQ ID NO: 2中所闡述之AAV-LK03-REDH蛋白殼多肽(其中VR-I包含位置263-272處的序列SQSGASNDNH),基於如本文所定義之理解,任何AAV蛋白殼多肽之VR-I包括對應於SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼的位置262-271處之彼等殘基的殘基。在另一實例中提及包含有「包含序列NRTGGGATNDNA (SEQ ID NO: 23)之VR-I」的蛋白殼多肽涵蓋具有在對應於SEQ ID NO: 5之位置262-271之位置處的序列NRTGGGATNDNA (SEQ ID NO: 23)的蛋白殼多肽。如將理解的,因為序列NRTGGGATNDNA (SEQ ID NO: 23)包含12個胺基酸,殘基之實際位置將不同。舉例而言,若蛋白殼主鏈為SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼,則蛋白殼多肽將包含位置262-273處(其對應於SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼的位置262-271)之序列NRTGGGATNDNA (SEQ ID NO: 23)。
如本文所用,「異源編碼序列」係指聚核苷酸、載體或宿主細胞中所存在之核酸序列,該核酸序列非聚核苷酸、載體或宿主細胞中天然發現或非在聚核苷酸、載體或宿主細胞中所處位置處天然發現,亦即為非天然的。「異源編碼序列」可編碼肽或多肽或者聚核苷酸,該肽或多肽或者聚核苷酸自身具有功能或活性,諸如反義或抑制性寡核苷酸,包括反義DNA及RNA (例如miRNA、siRNA及shRNA)。在一些實例中,異源編碼序列為基本上與動物之基因體DNA中之一段核酸同源的一段核酸,從而當將異源編碼序列引入動物之細胞中時,可能發生異源序列與基因體DNA之間的同源重組。在一個實例中,異源編碼序列為基因之功能性複本,用於引入具有缺陷性/經突變複本的細胞中。
如本文所用,關於啟動子及編碼序列之術語「可操作地連接」意謂編碼序列之轉錄在啟動子的控制下或由啟動子驅動。
術語「宿主細胞」係指已引入外源DNA (諸如載體或其他聚核苷酸)之細胞,諸如哺乳動物細胞。術語包括已引入外源DNA之原始細胞的後代。因此,如本文所用,「宿主細胞」一般指已由外源DNA轉染或經轉導之細胞。
如本文所用,關於聚核苷酸或多肽之「經分離」意謂聚核苷酸或多肽實質上不含來自細胞(自其衍生聚核苷酸或多肽)之細胞材料或其他污染蛋白,或在化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物質。
如本文所用,術語「受試者」係指動物,尤其哺乳動物,且更特定言之靈長類,包括低級靈長類及甚至更特定言之可受益於本發明之人類。受試者,無論人類或非人類動物抑或胚胎,均可稱為個體、受試者、動物、患者、宿主或受體。本發明具有人類及獸醫學應用兩者。為方便起見,「動物」具體言之包括家畜動物,諸如牛、馬、綿羊、豬、駱駝、山羊及驢;以及馴養動物,諸如狗及貓。就馬而言,此等動物包括用於賽馬業之馬以及娛樂性或畜牧業中所用之彼等馬。實驗室測試動物之實例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠及倉鼠。兔及嚙齒動物(諸如大鼠及小鼠)提供方便的測試系統或動物模型,靈長類及低級靈長類亦如此。在一些實施例中,受試者為人類。
如本文所用,術語「保守序列修飾」或「保守取代」係指並不顯著影響或更改含有胺基酸序列之載體的特徵之胺基酸修飾。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由此項技術中已知標準技術將修飾引入與各種實施例相容之載體中,諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發。保守胺基酸取代為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族在此項技術中已定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此,蛋白殼內之一或多個胺基酸殘基可經來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基替代且可使用本文所述之功能分析測試經更改的蛋白殼之趨向性及/或遞送負載物之能力。
表 1 .IUPAC 核苷酸編碼
IUPAC 核苷酸編碼 | 鹼基 |
A | 腺嘌呤 |
C | 胞嘧啶 |
G | 鳥嘌呤 |
T | 胸腺嘧啶 |
R | A或G |
Y | C或T |
S | G或C |
W | A或T |
K | G或T |
M | A或C |
B | C或G或T |
D | A或G或T |
H | A或C或T |
V | A或C或G |
N | 任何鹼基 |
應瞭解,上述術語及相關定義僅用於說明目的且並不意欲為限制性。
蛋白殼多肽
本發明在某種程度上以賦予AAV載體提高的轉導特性之變異體蛋白殼VR-I序列之識別為基礎。因此,本文提供包含變異體VR-I序列之蛋白殼多肽,包括經分離之蛋白殼多肽。出於本發明之目的,VR-I定義為包括對應於SEQ ID NO: 5中所闡述之原型AAV2蛋白殼多肽的位置262-271之位置處的殘基。如圖1中所展示,此區包括AAV3b蛋白殼之位置262-271、AAV1蛋白殼之位置262-272、AAV9蛋白殼之位置262-273、AAV7蛋白殼之位置263-273及AAV8及AAV10蛋白殼之位置263-274處的殘基。如圖2中所展示,VR-I包括SEQ ID NO: 4中所闡述之AAVC11.11蛋白殼之位置263-272、SEQ ID NO: 2中所闡述之AAV-LK03-REDH蛋白殼之位置262-271及SEQ ID NO: 340中所闡述之AAVC11.12蛋白殼之位置263-272的殘基。
典型地,當存在於AAV載體之蛋白殼中時,蛋白殼多肽促進人類細胞(諸如人類肝細胞)之有效轉導。與包含參考AAV蛋白殼多肽(例如SEQ ID NO: 5中所闡述之原型AAV2蛋白殼,或分別在SEQ ID NO: 2或4中所闡述之LK03-REDH蛋白殼或AAVC11.11蛋白殼)相比,藉由具有包含變異體VR-I之蛋白殼的AAV載體產生之細胞活體內轉導一般增加或增強。AAV載體之轉導或轉導效率可增加至少或約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多,例如與參考AAV蛋白殼多肽相比,包含本發明之蛋白殼多肽的AAV載體在活體內轉導細胞時可為至少或約1.2x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、11x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x或更高的有效。在特定實例中,在人類肝臟組織或人類肝細胞中觀測到增加的轉導或轉導效率。
因此本發明之蛋白殼多肽尤其適用於製備AAV載體,且特定言之供基因療法用途之AAV載體。在例示性實施例中,本發明之蛋白殼多肽尤其適用於製備轉導肝細胞(且特定言之人類肝細胞)之AAV載體,且由此適用於以肝為目標的基因療法應用。
本發明之蛋白殼多肽包含變異體VR-I,該變異體VR-I包含:由X
1X
2X
3X
4X
5X
6X
7X
8X
9X
10X
11X
12表示之序列,其中X
1為S或N;X
2為Q、S、A、G、E、D、H、K、N、P、T或R;X
3為S或T;X
4為A、S或T或無胺基酸;X
5為G或無胺基酸;X
6為G;X
7為A或S;X
8為S或T;X
9為N;X
10為D;X
11為N;及X
12為T、A或H,或具有1、2或3個由X
1X
2X
3X
4X
5X
6X
7X
8X
9X
10X
11X
12表示之序列的保守胺基酸取代之序列。在特定實例中,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 21-336 (參見表2)中的任一者所闡述之序列或具有其1、2或3個保守胺基酸取代之序列。在特定實例中,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列或具有其1、2或3個保守胺基酸取代之序列。如將理解的,變異體VR-I存在於蛋白殼多肽中之對應於SEQ ID NO: 5中所闡述之原型AAV2蛋白殼多肽的位置262-271之位置處(即在蛋白殼多肽的位置262-271處,相對於SEQ ID NO: 5中所闡述之原型AAV2蛋白殼多肽編號)。
表 2 . 變異體 VR-I 序列
SEQ ID NO | 序列 | SEQ ID NO | 序列 | SEQ ID NO | 序列 |
21 | SRSAGGASNDNA | 126 | SGTGGGASNDNH | 231 | NKTSGASNDNA |
22 | SRSSGGSTNDNA | 127 | SNSSGGSTNDNA | 232 | SKTAGSSNDNA |
23 | NRTGGGATNDNA | 128 | NSTNGGATNDNA | 233 | SGTNGSSNDNA |
24 | NTTAGSSNDNP | 129 | NSSSGGATNDNT | 234 | NRTTGGATNDNP |
25 | NRTAGGSTNDNH | 130 | SQSSGGATNDNH | 235 | SSTGGGSSNDNN |
26 | SRSSGGSSNDNT | 131 | SKSDGGSTNDNH | 236 | SSSDGGATNDNT |
27 | SKSTGASNDNN | 132 | SNTAGGSSNDNT | 237 | NGSNGGSSNDNN |
28 | SRSSGGASNDNH | 133 | NESAGGSSNDNN | 238 | SQSAGSSNDNA |
29 | NKTGGGASNDNT | 134 | NHSGGGATNDNP | 239 | NQTAGGSSNDNH |
30 | NKTNGGATNDNH | 135 | SSSSGGATNDNA | 240 | SETGGGSSNDNP |
31 | NRTTGGATNDNH | 136 | SHTDGSTNDNH | 241 | STTDGSTNDNT |
32 | NKTGGASNDNT | 137 | SATDGGSTNDNA | 242 | NQSSGGSSNDNH |
33 | SKSAGGSSNDNA | 138 | SKSSGATNDNT | 243 | SESNGGSTNDNH |
34 | NRTSGGASNDNH | 139 | NRSTGGSTNDNT | 244 | SATNGSTNDNH |
35 | SRSTGGASNDNA | 140 | SPTDGGSTNDNN | 245 | SESSGSSNDNA |
36 | SKSTGASNDNA | 141 | SESAGGSTNDNN | 246 | SDTTGGSTNDNN |
37 | NKTAGGATNDNT | 142 | NSSGGGSTNDNT | 247 | SESSGASNDNA |
38 | NRSSGGATNDNA | 143 | NDTSGGATNDNT | 248 | SQTDGGASNDNT |
39 | SRSSGGASNDNA | 144 | NNTGSSNDNH | 249 | NQTDGASNDNA |
40 | SKTTGGSSNDNA | 145 | NKSSGGSTNDNN | 250 | NKSAGGATNDNT |
41 | SKSAGGASNDNH | 146 | STTSGGSTNDND | 251 | SKSSGASNDNN |
42 | SRSTGGASNDNN | 147 | SHSAGGSTNDNA | 252 | NSSSGSTNDNH |
43 | SRSTGGSSNDNA | 148 | SDTAGGSTNDNN | 253 | SKTTGASNDNA |
44 | NKTAGGSTNDNH | 149 | SRTDGSTNDNP | 254 | STSTGASNDNT |
45 | NRTNGGATNDNT | 150 | NHSGATNDNP | 255 | NHSNGGASNDNN |
46 | NRTTGGSTNDNN | 151 | NSSGGATNDNA | 256 | SESSGGATNDNA |
47 | NKTTGGATNDNH | 152 | NNSNGSSNDNA | 257 | NNTTGGATNDNA |
48 | NNSGATNDNH | 153 | NPSNGGSSNDND | 258 | SKTTGGASNDNN |
49 | NHSNGATNDNN | 154 | SQTNGGSTNDND | 259 | STTGGGATNDNP |
50 | SKTSGSSNDNH | 155 | SDSGSSNDNT | 260 | STSGATNDNA |
51 | SRSAGGSSNDNT | 156 | NESAGATNDNN | 261 | SKTSGSTNDNN |
52 | NGTAGSSNDNN | 157 | NPSAGGSSNDNN | 262 | SATTGSTNDNP |
53 | NRTSGGASNDNA | 158 | SSTGATNDNT | 263 | SKTSGATNDNP |
54 | SSSSGGASNDNN | 159 | SESNGGSSNDNT | 264 | SNTTGGASNDNP |
55 | SRSSGGSSNDNA | 160 | SDTNGSTNDNA | 265 | NKSAGGSTNDNH |
56 | NKTNGGASNDNN | 161 | NPSGASNDNT | 266 | NHSAGATNDNT |
57 | NKTGGGASNDNH | 162 | STSGGGSTNDNP | 267 | NRSDGSTNDNA |
58 | SRTTGGSSNDNH | 163 | NHSTGGATNDND | 268 | SDTDGGSSNDNP |
59 | SRTAGGATNDNN | 164 | NDSGGATNDNT | 269 | SQSTGATNDNP |
60 | SRSGGGSSNDNT | 165 | SHTDGGSSNDNA | 270 | NGTAGGSSNDNN |
61 | NHTSGSSNDNH | 166 | SKSSGATNDNA | 271 | SGTAGGSSNDNA |
62 | SKSTGSTNDNH | 167 | SKTGSTNDND | 272 | SGSNGGSTNDNT |
63 | NSTGGSSNDNA | 168 | SQTGGGSSNDNP | 273 | NKSSGGATNDNH |
64 | NESGGGASNDNN | 169 | SHTSGSSNDNP | 274 | SRTNGGSSNDNH |
65 | NNSSGATNDNN | 170 | NASSGSSNDND | 275 | SSTTGASNDNP |
66 | NRTNGGATNDNH | 171 | SSTAGGSTNDNH | 276 | SKTAGGASNDNA |
67 | NRTGGGATNDNH | 172 | NGSDGGSTNDND | 277 | SDSTGGSSNDND |
68 | NASTGGATNDNN | 173 | STSSGGSSNDNP | 278 | NRSTGASNDNH |
69 | SDTNGATNDNN | 174 | SNTGGASNDNA | 279 | NASDGGSTNDNT |
70 | SASGSSNDNH | 175 | NDTDGASNDNA | 280 | NETAGGSSNDND |
71 | NDSTGGATNDNN | 176 | SDTTGATNDNN | 281 | NESGGATNDNH |
72 | NATTGGASNDNA | 177 | SPSGSTNDNN | 282 | NNTDGSSNDNN |
73 | SKTNGSSNDNH | 178 | NRSAGATNDNP | 283 | NKSAGGATNDNH |
74 | STTSGASNDNA | 179 | NTSGATNDNT | 284 | NHSTGGSSNDNH |
75 | SHTAGGSSNDNH | 180 | NRTGGSTNDNA | 285 | SSSTGGATNDNP |
76 | STSAGASNDNH | 181 | SETGGATNDNT | 286 | SQSGATNDNP |
77 | NRSGGATNDNH | 182 | SATNGGSSNDNA | 287 | STTNGGSSNDNA |
78 | NTSGGSSNDNN | 183 | SKTDGSSNDNT | 288 | SRTGGGSSNDNA |
79 | NHSAGGASNDNA | 184 | NGTSGSTNDNN | 289 | SRSGSTNDNH |
80 | SETSGGSSNDNH | 185 | NNSSGGSSNDNA | 290 | NQTTGGATNDNP |
81 | SASNGGSSNDNA | 186 | NQSTGGSSNDNT | 291 | NPSGATNDNN |
82 | SDTGGGASNDNT | 187 | NQSNGSTNDNA | 292 | NRTNGGSTNDNP |
83 | SSSGGGATNDNA | 188 | SSTTGSTNDNA | 293 | SQSTGGSSNDNP |
84 | SNSAGGSSNDNA | 189 | NDSGGSTNDNT | 294 | SSTGGSTNDNT |
85 | SSTNGGSTNDNH | 190 | NETSGGSSNDNA | 295 | NASTGGSTNDNH |
86 | SGTGGGASNDNA | 191 | NSTDGATNDNP | 296 | SSTSGASNDNH |
87 | SGTTGGATNDNN | 192 | NRSSGGSTNDNH | 297 | SKTNGATNDNT |
88 | SGTSGGASNDNA | 193 | SKTGGATNDNA | 298 | NSSAGGATNDNP |
89 | NDSSGSSNDNT | 194 | NKSTGGATNDNT | 299 | NQSTGGATNDNP |
90 | NKSTGASNDNN | 195 | NSSTGSSNDNA | 300 | NNSAGSSNDNP |
91 | NQTGGSSNDNA | 196 | NRSAGGSSNDNH | 301 | SPTNGGSTNDNP |
92 | SNSGATNDNH | 197 | NDTSGGSSNDNA | 302 | NASSGSTNDNA |
93 | SHSSGGSSNDNH | 198 | SKSTGSSNDNA | 303 | NQSDGGSTNDNN |
94 | SQTGGGASNDNH | 199 | SHTTGATNDNT | 304 | NQTSGGASNDNP |
95 | SKTSGSSNDNN | 200 | NNSNGATNDNT | 305 | NASDGGSTNDNN |
96 | SRSSGGASNDNT | 201 | NKSAGGATNDNN | 306 | SDTAGATNDNP |
97 | NRSTGASNDNN | 202 | NGTDGGSTNDNN | 307 | SATTGSTNDNA |
98 | NGSNGGASNDNN | 203 | NKSTGSTNDNH | 308 | NNTGGATNDNA |
99 | SRTNGGSTNDNA | 204 | STTTGSTNDNT | 309 | NQTDGSTNDND |
100 | SSSGGSTNDNA | 205 | NRTTGGATNDNA | 310 | NNTGGATNDNP |
101 | SGTNGGSTNDNT | 206 | NGTNGGSTNDNH | 311 | SETGGGSSNDNA |
102 | SRSDGGSTNDNN | 207 | SKTTGGASNDNT | 312 | NPTSGGSTNDNN |
103 | SGSNGGASNDNN | 208 | NNTAGGSSNDNA | 313 | SPSDGGSSNDNT |
104 | NRSNGGSSNDNH | 209 | SSTNGGSSNDNH | 314 | NETGSSNDNA |
105 | SKTNGGASNDNH | 210 | SNTSGGATNDNA | 315 | NTTSGSSNDNN |
106 | SRSSGGATNDNA | 211 | STTSGATNDNT | 316 | STTNGSTNDNA |
107 | SSSTGGATNDNA | 212 | SHTSGGSSNDNN | 317 | NQSNGSTNDNN |
108 | NDTGGGATNDNP | 213 | NETSGSSNDNA | 318 | NETGGSTNDNN |
109 | SGSGGGSTNDNA | 214 | STSAGGASNDNH | 319 | NKSAGGSSNDNH |
110 | SSSGGGSTNDNA | 215 | STTTGSSNDNN | 320 | NSSNGGASNDNP |
111 | SDTSGATNDNA | 216 | SKSAGGSSNDNN | 321 | NSSDGGATNDNT |
112 | NASTGGATNDNP | 217 | NHSTGATNDNA | 322 | NSTAGGATNDND |
113 | NKTSGGSSNDNA | 218 | NNSTGGATNDNA | 323 | NQTAGSTNDNH |
114 | NATGGGATNDNP | 219 | STSAGGSTNDNP | 324 | NQTTGGSTNDND |
115 | SKTNGGSTNDNA | 220 | SKSGGGATNDNA | 325 | NNTAGGASNDNT |
116 | SGTNGGSSNDNT | 221 | SKSDGASNDNA | 326 | SHTGASNDNA |
117 | NTTAGGSTNDNN | 222 | NNTSGGSTNDNN | 327 | NASTGGATNDNT |
118 | SQTGGGASNDNT | 223 | STSNGGSTNDNH | 328 | NSSNGSTNDNH |
119 | NTTTGATNDNT | 224 | SDSSGGSTNDNH | 329 | NATTGGSTNDNN |
120 | SHTAGSSNDNA | 225 | NATAGGSSNDNH | 330 | NKSDGGSTNDNN |
121 | SKSSGSSNDNA | 226 | SNTDGSSNDNT | 331 | NDSTGASNDNT |
122 | SSSDGGSTNDNA | 227 | NSTDGATNDNA | 332 | NGTSGGSTNDND |
123 | SNTTGGSTNDNH | 228 | SESGSTNDNH | 333 | NDTDGGSSNDNA |
124 | NQTGGGATNDNT | 229 | NQTSGATNDNA | 334 | NQTTGSSNDNA |
125 | NRSDGGSTNDNN | 230 | NQTDGASNDNP | 335 | SQTGASNDNA |
336 | STSDGGSTNDNH |
蛋白殼多肽之主鏈(即除VR-I區之外的殘基)可來自任何AAV蛋白殼多肽,包括任何經修飾AAV蛋白殼多肽,諸如NP40、NP59或LK03 (參見例如Paulk等人 2018,
Mol Ther.26(1):289-303;及Lisowski等人, 2014,
Nature506:382-386),或國際專利申請案第專利合作條約/AU2021/050158號中所描述之任何經修飾蛋白殼多肽,諸如AAVC11.12。蛋白殼多肽可包含全長VP1 (即對應於SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼的位置1-735)或其片段,諸如VP2 (即對應於SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼之位置138-735)或VP3 (即對應於SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼的位置203-735)。
在一個實例中,本發明之蛋白殼多肽包含變異體VR-I,變異體VR-I包含C11.11主鏈中SEQ ID NO: 21-336中之任一者所闡述的序列(即蛋白殼多肽包含藉由SEQ ID NO: 4中所闡述之C11.11多肽之殘基1-262及273-735側接的變異體VR-I或其VP2或VP3片段),或具有與由SEQ ID NO: 4中所闡述之C11.11多肽之殘基1-262及273-735所表示的C11.11主鏈具有至少或約85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之主鏈或其VP2或VP3片段。因此,在一些實例中,蛋白殼多肽包含與SEQ ID NO: 4中所闡述之VP1蛋白、SEQ ID NO: 4之位置138-735處所闡述的VP2蛋白或SEQ ID NO: 4之位置204-735處所闡述的VP3蛋白具有至少或約85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列,其中蛋白殼多肽包含有包含SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列的變異體VR-I (即包含位置262-272處之SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列,相對於SEQ ID NO: 4中所闡述之C11.11多肽編號)。
視情況,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
在另一實例中,本發明之蛋白殼多肽包含變異體VR-I或其VP2或VP3片段,該變異體VR-I包含LK03-REDH主鏈(即蛋白殼多肽包含藉由SEQ ID NO: 2中所闡述之LK03-REDH多肽之殘基1-261及272-736側接的變異體VR-I或其VP2或VP3片段)中或與由SEQ ID NO: 2中所闡述之LK03-REDH多肽的殘基1-261及272-736所表示之LK03-REDH主鏈具有至少或約85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的主鏈中之SEQ ID NO: 21-336中任一者所闡述之序列。因此,在一些實例中,蛋白殼多肽包含與SEQ ID NO: 4中所闡述之VP1蛋白、SEQ ID NO: 2之位置138-736處所闡述的VP2蛋白或SEQ ID NO: 2之位置203-736處所闡述的VP3蛋白具有至少或約85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列,其中蛋白殼多肽包含有包含SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列之變異體VR-I (即包含位置262-271處的SEQ ID NO: 21-336中之任一者所闡述之序列,相對於SEQ ID NO: 2中所闡述之LK03-REDH多肽編號)。
視情況,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
在另一實例中,本發明之蛋白殼多肽包含有包含C11.12主鏈中之SEQ ID NO: 21-336中任一者所闡述之序列的變異體VR-I (即蛋白殼多肽包含藉由SEQ ID NO: 340中所闡述之C11.12多肽的殘基1-262及273-735側接之變異體VR-I或其VP2或VP3片段),或具有與由SEQ ID NO: 340中所闡述之C11.12多肽的殘基1-262及273-735表示之C11.12主鏈具有至少或約85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的主鏈或其VP2或VP3片段。因此,在一些實例中,蛋白殼多肽包含與SEQ ID NO: 340中所闡述之VP1蛋白、SEQ ID NO: 340之位置138-735處所闡述的VP2蛋白或SEQ ID NO: 340之位置204-735處所闡述的VP3蛋白具有至少或約85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列,其中蛋白殼多肽包含有包含SEQ ID NO: 21-336中任一者所闡述之序列的變異體VR-I (即包含位置262-272處之SEQ ID NO: 21-336中任一者所闡述之序列,相對於SEQ ID NO: 340中所闡述之C11.12多肽編號)。
視情況,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
亦提供編碼本文所述之蛋白殼多肽的核酸分子,包括經分離之核酸分子。因此,舉例而言,在本文所提供之核酸分子中為編碼本文所述之蛋白殼多肽中任一者之VP1、VP2及/或VP3的核酸分子,該等蛋白殼多肽包含有包含SEQ ID NO: 21-336中任一者所闡述之序列的變異體VR-I。
載體
本發明亦提供包含編碼本文所述之蛋白殼多肽的核酸分子之載體,及包含本文所述之蛋白殼多肽的載體。載體包括包含編碼本文所述之蛋白殼多肽之核酸分子的核酸載體,及具有包含本文所述之蛋白殼多肽之蛋白殼的AAV載體。
核酸載體
本發明之載體包括核酸載體,該等核酸載體包含編碼本文所述之蛋白殼多肽之全部或一部分的聚核苷酸。載體可為附加型載體(亦即不會整合至宿主細胞之基因體中)或可為整合至宿主細胞基因體中之載體。包含編碼蛋白殼多肽之核酸分子的例示性載體包括(但不限於)質體、黏質體、轉位子及人工染色體。在特定實例中,載體為質體。
適合用於細菌、昆蟲及哺乳動物細胞之載體(諸如質體)經廣泛描述且為此項技術中熟知的。熟習此項技術者將瞭解本發明之載體亦可含有另外的序列及元件,該等序列及元件適用於載體在原核及/或真核細胞中之複製、載體之選擇及異源序列在各種宿主細胞中之表現。舉例而言,本發明之載體可包括原核複製子(亦即具有在原核宿主細胞(諸如細菌宿主細胞)中染色體外引導載體之自主複製及維持的能力之序列)。此類複製子為此項技術中所熟知。在一些實施例中,載體可包括使得載體適合於在原核生物及真核生物兩者中複製及整合之穿梭子元件。此外,載體亦可包括一種基因,其表現賦予可偵測標誌物(諸如抗藥性基因),其實現宿主細胞之選擇及維持。載體亦可具有可報導標誌物,諸如編碼螢光或其他可偵測蛋白之基因。核酸載體將可能亦包含其他元件,包括下文所述之彼等元件中之任何一或多者。最典型地,載體將包含可操作地連接至編碼蛋白殼蛋白之核酸的啟動子。
本發明之核酸載體可使用已知技術構築,包括(但不限於)限制性核酸內切酶消化、接合、轉型、質體純化、DNA之活體外或化學合成及DNA定序之標準技術。可使用此項技術中已知之任何方法將本發明之載體引入宿主細胞中。因此,本發明亦關於包含本文所述之載體或核酸的宿主細胞。
AAV 載體
本文提供AAV載體,其包含本文所述之蛋白殼多肽,諸如包含AAV蛋白殼之全部或一部分的多肽,該AAV蛋白殼包含有包含SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列的變異體VR-I。視情況,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
用於使蛋白殼蛋白載體化之方法為此項技術中熟知且任何適合的方法可用於本發明之目的。舉例而言,
cap基因可回收(例如藉由PCR或用切斷
cap之上游及下游的酶分解)及選殖入含有
rep之包裝構築體。可使用任何AAV
rep基因,包括(例如)來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13及其任何變體之
rep基因。典型地,
cap基因在
rep之下游選殖,如此
repp40啟動子可驅動
cap表現。此構築體不含有ITR。隨後將此構築體引入具有含有ITR (典型地側接異源編碼序列)之第二構築體的包裝細胞株中。亦引入輔助功能或輔助病毒,且自包裝細胞株之上清液回收重組AAV,該重組AAV包含由蛋白殼蛋白(由
cap基因表現)生成的蛋白殼且使包含藉由ITR側接之轉殖基因的基因體蛋白殼化。各種類型之細胞可用作包裝細胞株。舉例而言,可使用之包裝細胞株包括(但不限於)HEK293細胞、希拉細胞(HeLa cell)及維羅細胞(Vero cell),例如US20110201088中所揭示的。輔助功能可藉由一或多種包含腺病毒輔助基因之輔助質體或輔助病毒提供。腺病毒輔助基因之非限制性實例包括E1A、E1B、E2A、E4及VA,其可向AAV包裝提供輔助功能。AAV之輔助病毒為此項技術中已知的且包括例如來自腺病毒科及疱疹病毒科之病毒。AAV之輔助病毒之實例包括(但不限於)描述於US20110201088中的SAdV-13輔助病毒及類SAdV-13輔助病毒、輔助載體pHELP (Applied Viromics)。熟習此項技術者應瞭解,本文中可使用可向AAV提供足夠輔助功能之AAV之任何輔助病毒或輔助質體。
在一些情形下,rAAV病毒粒子係使用細胞株來產生,該細胞株穩定表現AAV病毒粒子產生所必需的組分中之一些。舉例而言,可將如本文所述識別之包含含有
cap基因之核酸的質體(或多種質體)及
rep基因以及可選標誌物(諸如新黴素抗藥性基因)整合至細胞(包裝細胞)之基因體中。隨後包裝細胞株可經AAV載體及輔助質體轉染或經AAV載體轉染並經輔助病毒(例如提供輔助功能之腺病毒)共感染。此方法之優勢在於細胞為可選的且適合於大規模生產重組AAV。作為另一非限制性實例,腺病毒或桿狀病毒而非質體可用於將編碼蛋白殼多肽之核酸(且視情況
rep基因)引入包裝細胞中。作為又一非限制性實例,AAV載體亦穩定整合至生產細胞之DNA中,且輔助功能可由野生型腺病毒提供以產生重組AAV。
在又其他情形下,AAV載體係藉由合成AAV蛋白殼蛋白及活體外組裝及包裝蛋白殼來以合成方式產生。
典型地,本發明之AAV載體亦包含異源編碼序列。可使異源編碼序列可操作地連接至啟動子以促進序列之表現。異源編碼序列可編碼肽或多肽,諸如治療性肽或多肽,或可編碼自身具有功能或活性之聚核苷酸或轉錄物,諸如反義或抑制性寡核苷酸,包括反義DNA及RNA(例如miRNA、siRNA及shRNA)。在一些實例中,異源編碼序列為基本上與動物之基因體DNA中之一段核酸同源的一段核酸,從而當將異源編碼序列引入動物之細胞中時,可能發生異源編碼序列與基因體DNA之間的同源重組。如將理解的,異源編碼序列之性質並非本發明必需的。在特定實施例中,包含異源編碼序列之載體將用於基因療法。
在特定實例中,異源編碼序列編碼肽或多肽或聚核苷酸,其表現具有醫療用途,諸如(例如)用於治療疾病或病症。舉例而言,治療性肽或多肽之表現可用以復原或替代有缺陷的肽或多肽之內源性形式之功能(即基因替代療法)。在其他實例中,來自異源序列之治療性肽或多肽或聚核苷酸之表現用以更改宿主細胞中之一或多種其他肽、多肽或聚核苷酸的含量及/或活性。因此,根據特定實施例,藉由本文所述之載體引入宿主細胞中之異源編碼序列的表現可用於提供治療量之肽、多肽或聚核苷酸以減輕疾病或病症之症狀。在其他情形下,異源編碼序列為基本上與動物之基因體DNA中之一段核酸同源的一段核酸,從而當將異源序列引入動物之細胞中時,可能發生異源編碼序列與基因體DNA之間的同源重組。因此,藉由本文所述之AAV載體將異源序列引入宿主細胞中可用於校正基因體DNA中之突變,其轉而可減輕疾病或病症之症狀。
在非限制性實例中,異源編碼序列編碼表現產物,當向受試者且特定言之受試者之肝遞送該表現產物時,治療肝相關疾病或病況。在說明性實施例中,肝相關疾病或病況係選自以下:脲循環病症(urea cycle disorder,UCD;包括N-乙醯麩胺酸合酶缺乏症(N-acetylglutamate synthase deficiency,NAGSD)、胺甲醯磷酸合成酶1缺乏症(carbamylphosphate synthetase 1 deficiency,CPS1D)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症(ornithine transcarbamylase deficiency,OTCD)、精胺基丁二酸合成酶缺乏症(argininosuccinate synthetase deficiency,ASSD)、精胺基丁二酸解離酶(argininosuccinate lyase,ASLD)、精胺酸酶1缺乏症(arginase 1 deficiency,ARG1D)、檸檬素或天冬胺酸/麩胺酸載劑缺乏症及導致高鳥胺酸血症-高胺血症-同型瓜胺酸尿症症候群(HHH症候群)之線粒體鳥胺酸轉運蛋白1缺乏症);有機酸代謝病(或有機酸血症,包括甲基丙二酸血症、丙酸血症、異戊酸血症及楓糖尿病);胺基酸代謝病;糖原病(I型、III型及IV型);威爾森氏病(Wilson's disease);進行性家族性肝內膽汁淤積;原發性高草酸鹽尿症;補體病;凝血病(例如A型血友病、B型血友病、馮威里氏病(von Willebrand disease,VWD))、克果納賈爾症候群(Crigler Najjar syndrome);家族性高膽固醇血症;α-1-抗胰蛋白酶缺乏症;線粒體呼吸鏈肝病及檸檬素缺乏症。熟習此項技術者將能夠容易地選擇適當異源編碼序列用於治療此類疾病。在一些實例中,異源編碼序列包含與疾病相關之基因之全部或一部分,諸如表3中所闡述的基因之全部或一部分。將此類序列引入肝可用於基因替代或基因編輯/校正,例如使用CRISPR-Cas9。在特定實例中,異源編碼序列編碼由與疾病相關之基因編碼之蛋白質,諸如表3中所闡述的基因。
表 3
例示性肝相關疾病 | 例示性相關基因 |
脲循環病症(UCD) | OTC 、 ASS 、 CPS1 、 ASL 、 ARG1 |
有機酸代謝病 | PCCA 、 PCCB 、 MMUT |
胺基酸代謝病 | PAH 、 FAH |
糖原病(I型、III型及IV型) | SLC37A4 |
威爾森氏病 | ATP7B |
進行性家族性肝內膽汁淤積 | ABCB4 、 ABCB11 、 ATP8B1 |
原發性高草酸鹽尿症 | AGXT |
補體病 | CFH 、 CFI |
凝血病 | F8 、 F9 、 VWF |
克果納賈爾症候群 | UGT1A1 |
家族性高膽固醇血症 | LDLR |
α-1-抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINA1 |
線粒體呼吸鏈肝病 | POLG |
檸檬素缺乏症 | SLC25A13 |
AAV載體中之異源編碼序列藉由3'及5'AAV ITR側接。用於本發明之載體的AAV ITR不必具有野生型核苷酸序列,且可例如藉由核苷酸之插入、缺失或取代而更改。另外,AAV ITR可衍生自若干AAV血清型中之任一者,包括(但不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。此類ITR為此項技術中所熟知。
如熟習此項技術者將瞭解,適合於純化AAV之任何方法可用於本文所述之實施例以純化AAV載體,且此類方法為此項技術中所熟知。舉例而言,可自包裝細胞及/或包裝細胞之上清液分離及純化AAV載體。在一些實施例中,藉由使用CsCl或碘克沙醇梯度離心之分離方法來純化AAV。在其他實施例中,如US20020136710中所述使用包括基質之固體載體來純化AAV,介導AAV連接之人工受體或類受體分子固定於該基質上。
載體中之另外的元件
本發明之載體可包含啟動子。在載體為包含編碼蛋白殼多肽之核酸的核酸載體之情形下,啟動子可促進編碼蛋白殼多肽之核酸的表現。在載體為AAV載體之情形下,啟動子可促進如上文所述之異源編碼序列之表現。
在一些實例中,啟動子為AAV啟動子,諸如p5、p19或p40啟動子。在其他實例中,啟動子衍生自其他來源。組成型啟動子之實例包括(但不限於)反轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV) LTR啟動子(視情況具有RSV強化子)、細胞巨大病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子(視情況具有CMV強化子)、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(phosphoglycerol kinase,PGK)啟動子及EF1α啟動子。誘導性啟動子允許基因表現之調節且可藉由以下調節:外源供應之化合物;環境因素,諸如溫度;或特定生理狀態(例如急性期)之存在,細胞之特定分化狀態之存在,或僅存在於複製細胞中。藉由外源供應之啟動子調節的誘導性啟動子之非限制性實例包括鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(metallothionine,MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone,Dex)-誘導性小鼠乳房腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統;蛻皮激素昆蟲啟動子、四環素可抑制性系統、四環素誘導性系統、RU486誘導性系統該雷帕黴素誘導性系統。可適用於此上下文之其他類型之誘導性啟動子為由特定生理狀態(例如溫度、急性期)、細胞之特定分化狀態調節或僅在複製細胞中調節之彼等啟動子。在一些實施例中,使用組織特異性啟動子。此類啟動子之非限制性實例包括肝特異性甲狀腺素結合球蛋白(thyroxin binding globulin,TBG)啟動子、胰島素啟動子、升糖素啟動子、生長抑素啟動子、胰臟多肽(pancreatic polypeptide,PPY)啟動子、突觸蛋白-1 (Syn)啟動子、肌酸激酶(MCK)啟動子、哺乳動物肌間線蛋白(DES)啟動子、α-肌凝蛋白重鏈(α-myosin heavy chain,a-MHC)啟動子、肌鈣蛋白T (cardiac Troponin T,cTnT)啟動子、β-肌蛋白啟動子及B型肝炎病毒核心啟動子。適當啟動子之選擇較佳地在一般熟習此項技術者之能力範圍內。
載體亦可包括轉錄強化子、轉譯信號以及轉錄及轉譯終止信號。轉錄終止信號之實例包括(但不限於)聚腺苷酸化信號序列,諸如牛生長激素(bovine growth hormone,BGH) poly(A)、SV40晚期poly(A)、兔β-血球蛋白(rabbit beta-globin,RBG) poly(A)、胸苷激酶(thymidine kinase,TK) poly(A)序列及其任何變異體。在一些實施例中,轉錄終止區位於轉錄後調節元件下游。在一些實施例中,轉錄終止區為多腺苷酸化信號序列。
載體可包括不同轉錄後調節元件。在一些實施例中,轉錄後調節元件可為病毒轉錄後調節元件。病毒轉錄後調節元件之非限制性實例包括土拔鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element,WPRE)、B型肝炎病毒轉錄後調節元件(hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element,HBVPRE)、RNA轉運元件及其任何變異體。RTE可為rev反應元件(rev response element,RRE),例如慢病毒RRE。非限制性實例為牛免疫缺乏病毒rev反應元件(RRE)。在一些實施例中,RTE為組成型轉運元件(constitutive transport element,CTE)。CTE之實例包括(但不限於)梅森輝瑞(Mason-Pfizer)猴病毒CTE及禽類白血病病毒CTE。
信號肽序列亦可包括於載體中以使得可自哺乳動物細胞分泌多肽。信號肽之實例包括(但不限於) HGH及其變異體之內源性信號肽;干擾素及其變異體之內源性信號肽,包括I型、II型及III型干擾素及其變異體之信號肽;及已知的細胞介素及其變異體之內源性信號肽,諸如紅血球生成素(erythropoietin,EPO)、胰島素、TGF-β1、TNF、IL1-α及IL1-β及其變異體之信號肽。典型地,信號肽之核苷酸序列緊靠著載體中之異源序列(例如在所關注蛋白質之編碼區的5'處融合)的上游。
在進一步實例中,載體可含有允許例如自單個mRNA轉譯多種蛋白之調節序列。此類調節序列之非限制性實例包括內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)及2A自處理序列,諸如來自口蹄疫病毒之2A肽位點(F2A序列)。
宿主細胞
本發明亦提供包含本發明之核酸分子或載體之宿主細胞。在一些情形下,宿主細胞用於擴增、複製、包裝及/或純化聚核苷酸或載體。在其他實例中,宿主細胞用於表現異源序列,諸如包裝在AAV載體內之異源序列。例示性宿主細胞包括原核及真核細胞。在一些情形下,宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。選擇適當宿主細胞用於本發明之聚核苷酸、載體或rAAV病毒粒子的表現、擴增、複製、包裝及/或純化較佳地在熟習此項技術者之技能內。例示性哺乳動物宿主細胞包括(但不限於) HEK293細胞、希拉細胞、維羅細胞、HuH-7細胞及HepG2細胞。在特定實例中,宿主細胞為肝細胞或衍生自肝細胞之細胞株。
組合物
亦提供包含本發明之核酸分子、多肽及/或載體之組合物。在特定實例中,提供包含本文所揭示之AAV載體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。組合物亦可包含另外的成分,諸如稀釋劑、穩定劑、賦形劑及佐劑。
載劑、稀釋劑及佐劑可包括緩衝劑,諸如磷酸、檸檬酸或其他有機酸;抗氧化劑,諸如抗壞血酸;低分子量多肽(例如少於約10個殘基);蛋白,諸如血清aAAVC.umin、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖醇,諸如甘露糖醇或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;及/或非離子界面活性劑,諸如Tween™、Pluronics™或聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中,生理學上可接受之載劑為水性pH緩衝溶液。
方法
本發明之AAV載體及含有該等AAV載體之組合物可在用於將異源編碼序列引入宿主細胞中之方法使用。此類方法涉及使宿主細胞與AAV載體接觸。此方法可活體外、離體或活體內執行。在特定實施例中,宿主細胞為肝細胞(例如人類肝細胞)。
當離體或活體內執行方法時,典型地將異源序列引入宿主細胞中係出於治療目的,從而異源序列之表現促成治療疾病或病況。因此,可向有需要之受試者(例如人類)投與本文所揭示之AAV載體,諸如患有用由本文所述之異源序列編碼的蛋白、肽或聚核苷酸治療可改善之疾病或病況之受試者。
當活體內使用時,待向受試者投與之AAV載體的效價視以下而變化:例如特定重組病毒、待治療之疾病或病症、投與模式、治療目標、待治療之個體及所靶向之細胞類型,且可藉由熟習此項技術者熟知的方法判定。儘管準確劑量將基於個體判定,但在大多數情況下,典型地,本發明之重組病毒可以在1×10
10個重組病毒之基因體複本/kg受試者與1×10
14個基因體複本/kg之間的劑量向受試者投與。在其他實例中,少於1×10
10個基因體複本可能對於治療作用而言足夠。在其他實例中,對於治療作用可能需要超過1×10
14個基因體複本。
投與途徑不受特定限制。舉例而言,治療有效量之AAV載體可經由例如肌肉內、陰道內、靜脈內、腹膜內、皮下、經上表皮、皮內、經直腸、眼內、經肺、顱內、骨內、經口、頰內或經鼻途徑向受試者投與。AAV載體可以單次劑量或多次劑量形式以不同時間間隔投與。
亦提供用於產生上文及本文所述之AAV載體之方法,亦即包含本發明之蛋白殼多肽的AAV載體。此類方法包含培養包含編碼本發明之蛋白殼多肽的核酸分子、AAV rep基因、藉由AAV反向末端重複序列側接之異源編碼序列及用於發生產生性AAV感染之輔助功能的宿主細胞,培養係在適合於促進包含本發明之蛋白殼多肽之AAV載體的組裝條件下,其中蛋白殼使異源編碼序列蛋白殼化。
在進一步態樣中,提供藉由修飾參考蛋白殼多肽之VR-I從而使經修飾VR-I包含SEQ ID NO: 21-336中的任一者闡述之序列來增強AAV載體之活體內人類肝細胞轉導效率之方法。視情況,變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、207、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
因此,提供用於產生展現增強之轉導功效之經修飾AAV載體的方法,其中該等方法包括以下步驟:在位置262、263、264、265、266、267、268、269、270及271 (相對於SEQ ID NO: 5編號)中之一或多者處修飾參考蛋白殼多肽的序列(即替代及/或插入一或多個胺基酸),藉此產生經修飾蛋白殼多肽,其包含位置262-271 (相對於SEQ ID NO: 5編號)處之SEQ ID NO: 21-336中的任一者所闡述之序列。
應理解,任何修飾或修飾之組合,例如胺基酸替代或取代、胺基酸缺失及/或胺基酸插入,將產生與參考蛋白殼多肽相比經修飾蛋白殼多肽中之胺基酸序列的變化。因此,舉例而言,提及修飾以下不包括在其範疇內:其中一種胺基酸殘基經相同胺基酸殘基取代之胺基酸取代,或胺基酸缺失伴隨著所缺失胺基酸之插入的修飾,從而與參考蛋白殼多肽序列相比經修飾蛋白殼多肽之胺基酸序列不存在差異,亦即經修飾蛋白殼多肽之胺基酸序列不能相同於(或必須不同於)參考蛋白殼多肽序列之胺基酸序列。
典型地,方法包括首先識別用於活體內轉導人類肝細胞之參考蛋白殼多肽的起始步驟。參考蛋白殼多肽可為任何AAV多肽,諸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13蛋白殼多肽,或合成或嵌合蛋白殼多肽。在說明性實施例中,參考多肽包含與SEQ ID NO: 2或4中所闡述之序列至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。參考蛋白殼多肽包括包含VP1蛋白、VP2蛋白或VP3蛋白之全部或一部分的彼等蛋白殼多肽。因此,在一些實施例中,參考蛋白殼多肽包含與SEQ ID NO: 2或4中所闡述之序列具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的VP1蛋白之全部或一部分;與闡述為SEQ ID NO: 2之胺基酸138-736或SEQ ID NO: 4之胺基酸138-735的VP2蛋白具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VP2蛋白之全部或一部分;及與闡述為SEQ ID NO: 2之胺基酸203-736或SEQ ID NO: 4之204-735的VP3蛋白具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VP3蛋白之全部或一部分。
修飾參考蛋白殼多肽或聚核苷酸之序列以產生經修飾蛋白殼多肽或聚核苷酸之方法為此項技術中所熟知,且可利用任何此類方法以執行本發明之方法。舉例而言,修飾參考蛋白殼聚核苷酸之序列以產生經修飾蛋白殼聚核苷酸可使用此項技術中已知之任何方法來執行,包括計算機及/或活體外執行(部分或完全)之重組及合成方法。在特定實例中,計算機執行序列之修飾,隨後重新合成具有經修飾序列之經修飾蛋白殼聚核苷酸(例如藉由基因合成方法,諸如涉及化學合成重疊寡核苷酸隨後基因組裝之彼等基因合成方法)。
經修飾蛋白殼聚核苷酸可含於核酸載體(諸如質體)中,用於後續表現、複製、擴增及/或操縱。適合用於細菌、昆蟲及哺乳動物細胞之載體經廣泛描述且為此項技術中熟知的。熟習此項技術者將瞭解載體亦可含有另外的序列及元件,該等序列及元件適用於載體在原核及/或真核細胞中之複製、載體之選擇及異源序列在各種宿主細胞中之表現。舉例而言,載體可包括原核複製子,其為具有在原核宿主細胞(諸如細菌宿主細胞)中染色體外引導載體之自主複製及維持的能力之序列。此類複製子為此項技術中所熟知。在一些實施例中,載體可包括使得載體適合於在原核生物及真核生物兩者中複製及整合之穿梭子元件。此外,載體亦可包括一種基因,其表現賦予可偵測標誌物(諸如抗藥性基因),其實現宿主細胞之選擇及維持。載體亦可具有可報導標誌物,諸如編碼螢光或其他可偵測蛋白之基因。核酸載體將可能亦包含其他元件,包括下文所述之彼等元件中之任何一或多者。最典型地,載體將包含可操作地連接至編碼蛋白殼蛋白之核酸的啟動子。
核酸載體可使用已知技術構築,包括(但不限於)限制性核酸內切酶消化、接合、轉型、質體純化、DNA之活體外或化學合成及DNA定序之標準技術。可使用此項技術中已知之任何方法將包含經修飾蛋白殼聚核苷酸之載體引入宿主細胞中。
在修飾以後,隨後使經修飾蛋白殼載體化。用於使蛋白殼多肽載體化之方法為此項技術中所熟知且非限制性實例描述於上文。
藉由此等方法產生之AAV載體典型地具有與參考AAV載體相比增強的轉導效率,該參考AAV載體具有包含參考蛋白殼多肽之蛋白殼。與未經修飾AAV載體(即包含參考蛋白殼之AAV載體)之活體內轉導效率相比轉導效率水平可增強至少或約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多,例如AAV載體之轉導效率可為至少或約2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x或更多。在一些實例中,此係在利用人類肝細胞之活體內系統中評定,諸如較小動物(例如小鼠),其具有包含人類肝細胞之嵌合肝(例如hFRG小鼠)。
因此,亦提供藉由本發明之方法產生之AAV載體。
為了本發明可容易地理解並付諸實踐,現將藉助於以下非限制性實例來描述特定較佳實施例。
本說明書中對任何先前公開案(或來源於其之資訊)或對已知之任何事項的提及不視為且不應視為認可、承認或以任何形式表明先前公開案(或來源於其之資訊)或已知事項形成本說明書相關研究領域中之公共常識的一部分。
實例 實例 1 . 生成庫 - 一般方法 DNA 及 RNA 分離及 cDNA 合成
如之前(Cabanes-Creus, 2020, Sci Transl Med 12)中詳細描述不經修改執行DNA及RNA之分離以及cDNA合成。簡言之,使用標準苯酚:氯仿方案提取DNA且用Direct-Zol套組(Zymogen目錄號R2062)提取RNA。
AAV 載體 包裝及病毒產生
如先前所描述(Xiao等人 1998, J Virol 72, 2224-2232)使用HEK293細胞及不含輔助病毒之系統將AAV構築體包裝至AAV蛋白殼中。使用攜帶來自AAV2之
rep基因及特定
cap之封裝質體構築體將基因體包裝於蛋白殼變異體中。所有載體均使用碘克沙醇梯度超速離心純化,如先前所描述(Khan等人 2011, Nat Protoc 6, 482-501)。
小鼠研究
所有動物實驗程序及照護均經威斯特米德動物照護及倫理委員會(Westmead Animal Care and Ethics Committee)下之聯合兒童醫學研究所(Children's Medical Research Institute,CMRI)及兒童醫院批准。如最近所描述(Cabanes-Creuset等人, 2020, Mol Ther Methods Clin Dev 17, 1139-1154)培育、圈養、移植及監測Fah
-/-Rag2
-/-Il2rg
-/-(FRG)小鼠(Azuma等人, 2007, Nat Biotechnol 25, 903-910)。藉由量測周邊血液中人類白蛋白之存在使用人類白蛋白ELISA定量套組(Bethyl實驗室,目錄號E80-129)來估計人類細胞移植之水平。為了評估AAV轉導可能性,將小鼠置於10% NTBC上且維持在此情況下直至收集。將小鼠隨機分配至實驗並經由使用指定載體劑量靜脈內注射(側向尾部靜脈)來轉導。在一些情形下,首先經由注射5 mg可溶IVIg使小鼠被動免疫。在轉導之後1週藉由CO
2吸入使小鼠安樂死。為了自異種移植鼠類肝獲得鼠類及人類單細胞懸浮液,遵循與最近描述相同的膠原蛋白酶灌流程序(Cabanes-Creus等人, 2020, Sci Transl Med 12)。對於所有實驗,細胞均用結合藻紅素(PE)之抗人類-HLA-ABC (選殖系W6/32,Invitrogen 12-9983-42;1:20)、結合生物素之抗小鼠-H-2Kb (選殖系AF6-88.5,BD Pharmigen 553568;1:100)及結合別藻藍蛋白(APC)之鏈黴抗生物素蛋白(eBioscience 17-4317-82;1:500)標記。使用BD Influx細胞分選儀將經GFP-陽性標記之樣品分選至最低95%純度。在澳大利亞新南威爾士州威斯特米德之威斯特米德醫學研究所(Westmead Institute for Medical Research,WIMR)的流動式細胞測量術機構中執行流動式細胞測量術。使用FlowJo 7.6.1 (FlowJo LLC)來分析資料。
肝外植體
使用常溫肝灌流及解剖學分割來製備肝外植體。灌流系統係根據商購肝灌流機器(Liver assist, Organ Assist, Groningen, Netherlands)修改。向系統中添加一個滲析膜、兩個長期氧合器及一個氣體摻合器以延長器官存活期。灌流液含有紅血球、兩個單位之新鮮冷凍血漿及白蛋白,且其維持在36℃下。移植體接受牛膽酸(7.7 mg/hr)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone) (50 mg/24 hr)、非經腸營養(20 mL/hr)及可滴定胰島素及升糖素之輸注液。在灌流之後20小時,將整個肝以解剖學方式分割,條件為達成所有存活期要求。此等條件為乳酸<2.5 mmol/L及以下中之兩者或更多者:膽液產生、動脈pH >7.3、葡萄糖代謝之證據、均相灌流及膽液pH >7.4。在左葉之門靜脈中注射AAV庫。注射後兩天,取得核心活組織切片,且提取DNA及RNA以便AAV分離。
定序
用次世代定序分析圍繞同義密碼子條形碼及VR-I庫之區,NGS-F及NGS-R引子提供於下表22中。對質體庫、載體庫及經轉導肝細胞(DNA及cDNA)執行NGS分析。藉由Genewiz (Suzhou, China)使用Illumina MiSeq儀器執行NGS庫製備及使用2×150個成對末端組態之定序。在Snakemake (5.6) (Koster等人, 2018, Bioinformatics 34, 3600)中寫入工作流以處理讀段及計數條形碼。使用BBMerge合併成對讀段且隨後過濾得到第二次傳送通過BBDuk中具有預期長度之讀段,均來自BBTools 38.68 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/)。將經合併、過濾之fastq文件傳送至所識別條形碼對應於AAV變異體之Python (3.7)指令碼。將來自DNA及cDNA群體之NGS讀段標準化至來自注射前混合物之讀段。
分析 hFRG 小鼠中之庫變異體
為了評定對hFRG小鼠注射VR-I庫以後變異體之效能,進行一系列反映變異體進入肝細胞(分析DNA;「物理轉導」)及進入以後表現(分析cDNA;「功能性轉導」)之能力的計算。
對於每個變異體,重複三次計算以下評分:
進入指數 =log2 [%DNA 之 讀段 ]/[% 病毒庫之讀段 ] 表現指數 =log2 [%cDNA 之 讀段 ]/[% 病毒庫之讀段 ]
為了對變異體進行排名,利用旨在使恆定效能最大化(即在重複三次中給定變異體之效能的類似性與同義密碼子無關)之策略。為此創建適合度評分:
進入適合度 = 進入指數 01+ 進入指數 02+ 進入指數 03 表現適合度 = 表現指數 01+ 表現指數 02+ 表現指數 03
類似地,對用不同同義密碼子以不同方式執行之變異體進行處罰。為此,在應用處罰具有高標準偏差之變異體的校正公式之前確定進入及表現指數之標準偏差:
校正適合度 = 適合度 -(0.5× 偏差 2 )
隨後按經校正進入適合度與經校正表現適合度之和計算總分。
實例 2 . 生成 VR-I 庫
VR-I庫係基於LK03-R594E+D598H蛋白殼主鏈(亦稱為LK03-REDH;SEQ ID NO:1 (nt)及SEQ ID NO:2 (aa)中所闡述之蛋白殼序列)及基於C11.11蛋白殼主鏈(SEQ ID NO:3 (nt)及SEQ ID NO:4 (aa)中所闡述之蛋白殼序列)構建。LK03-REDH為基於LK03 (其自身為類AAV3B蛋白殼多肽)之蛋白殼,但進一步包含R594E及D598H突變。鑒於圍繞VR-I之同源,選殖不同庫之製程相同。
比對來自AAV1、AAV2、AAV3b、AAV7、AAV8、AAV9及AAV10蛋白殼之VR-I之序列(圖1)。AAV2中之位置262對應於AAV1、AAV3b及AAV9蛋白殼(及LK03-REDH)中之位置262以及AAV7、AAV8及AAV10蛋白殼(及C11.11)中的位置263。當與AAV2蛋白殼相比時,AAV1及AAV7蛋白殼在VR-I內具有一個胺基酸插入而AAV8、AAV9及AAV10蛋白殼在VR-I內具有兩個胺基酸插入。對於位置262-271 (相對於SEQ ID NO: 5中所闡述之AAV2蛋白殼編號)中之各者,列出AAV中之任一者所存在的胺基酸,如表4中所示。因此將庫變異體構築為在此區中含有10、11或12個胺基酸,殘基之任何組合(或缺失)展示於表4中(相對於頂列中所展示之AAV2蛋白殼編號)。
表 4. 來自不同血清型之位置 262-271 處之胺基酸殘基
AAV2 | AAV2 265 | AAV2 266 | AAV2 267 | AAV2 268 | AAV2 269 | AAV2 270 | AAV2 271 | ||||
262 | 263 | 264 | INS 265 | INS 266 | 267 | 268 | 269 | 270 | 271 | 272 | 273 |
S | Q | S | A | G | G | A | S | N | D | N | T |
N | S | T | S | S | T | A | |||||
A | T | H | |||||||||
G | |||||||||||
E |
對於各位置,使用「AA-Calculator」工具(http://guinevere.otago.ac.nz/cgi-bin/aef/AA-Calculator.pl) (Firth, 2008)來找出最佳密碼子以編碼所選胺基酸。挑選簡併密碼子之準則為以下:1)避開終止密碼子;2)含有AAV中之所有天然存在的胺基酸;3)減少編碼密碼子之數量。若第2項由於基因密碼之限制而變得不可能,則遵循以下選擇簡併密碼子:4)減少編碼胺基酸之數量;及5)減少編碼密碼子之數量。舉例而言,對於位置262,天然存在之胺基酸為Asn (N)及Ser (S)。三核苷酸ART或ARC將在ARY之前選擇,條件為後者編碼4個密碼子且因此將在密碼子水平下增加庫複雜度。在一些情形下,例如對於位置263,不可能找出僅編碼Q、S、A、G、E之簡併密碼子。因此,包括在所選野生型變異體中並不存在之其他胺基酸,如下文所例示。選擇三核苷酸VVW,此係因為其並不編碼終止密碼子且使胺基酸之數量減至最少至12個及密碼子之數量減至18個。表5概述各位置之所選簡併密碼子(用斜體)及彼等簡併密碼子所編碼之胺基酸(AA)。亦展示在所選野生型AAV中之任一者不存在但包括於庫中之胺基酸(在括號內)。
表 5 . 位置 262-271 處所包括之密碼子及胺基酸殘基
AAV2 262 | AAV2 263 | AAV2 264 | AAV2 265 | AAV2 266 | AAV2 267 | AAV2 268 | AAV2 269 | AAV2 270 | AAV2 271 | |||
262 | 263 | 264 | INS 265 | INS 266 | 267 | 268 | 269 | 270 | 271 | 272 | 273 | |
密碼子 | ARC | VVW | WCW | RVC | GGA | GGA | KCT | WCW | AAC | GAC | AAC | VMC |
AA | S | Q | S | A | G | G | A | S | N | D | N | T |
N | S | T | S | S | T | A | ||||||
A | T | H | ||||||||||
G | ||||||||||||
E | ||||||||||||
(D) | (N) | (P) | ||||||||||
(H) | (D) | (D) | ||||||||||
(K) | (G) | (N) | ||||||||||
(N) | ||||||||||||
(P) | ||||||||||||
(T) | ||||||||||||
(R) |
鑒於C11.11與LK03-REDH蛋白殼之間圍繞VR-I之區為共同的,故對於每一者使用相同的選殖策略。將蛋白殼區選殖入具有曲美普林(Trimethoprim)抗藥性之選殖質體中,
Swa-I及
Nsi-I限制位點圍繞蛋白殼插入序列。在Q263 (相對於SEQ ID NO: 2中所闡述之LK03-REDH蛋白殼編號)處選殖終止密碼子從而減少背景質體編碼的包裝。隨後將基於PCR之策略用於選殖,其中與VR-I區下游之蛋白殼區比對三個正向引子具有共同區且簡併密碼子符合上文所述之表格。每個正向引子(Fwd 10aa、Fwd 11aa及Fwd 12aa)均用於不同的與共同反向引子(Rev共同1) (序列參見表22)之PCR反應中。每個正向引子均「固定」Q263_終止密碼子。此外,線性PCR產物具有相容的、互補的末端以便吉布森(Gibson)組裝且因此可自黏合生成功能性質體。獨立執行PCR,且產物經純化並分開維持以使個別變異體之間的莫耳差異減至最小。11 aa/12 aaPCR產物含有10 aa產物之變異體的數量之6倍。顧及此等差異,在繼續進行吉布森組裝之前將PCR產物以1:6:6莫耳比(10/11/12 aa)混合。遵循製造商之說明書進行反應,總共混合1 pmol。
為了降低與庫選擇相關之雜訊,研發出生成動物內複製物的新穎策略。為了該目的且遵循如上文所述之嚴格相同的方案,藉由僅改變反向引子來選殖每個蛋白殼主鏈之兩個另外的獨立VR-I庫。生成Rev共同2及Rev共同3 (參見表22)。胺基酸TYNN存在於LK03-REDH及C11.11之位置250-253處。將在DNA水平下維持TYNN但允許「條形碼」之同義密碼子用於覆蓋此區之Rev共同2及Rev共同3中。
隨後在包裝步驟混合三個庫且藉由單個片段之150-PE Illumina次世代定序分析,其中PCR引子圍繞同義密碼子條形碼及庫自身。
庫含有14976種變異體,由表4中存在之所有可能的胺基酸組合組成。與含有來自AAV2/3b之10 aa VR-I區之C11.11及LK03-REDH蛋白殼相比,庫中之一些變異體係在位置264 (相對於AAV2蛋白殼編號)之後包括1個胺基酸或2個胺基酸插入。從而,庫由具有10、11或12胺基酸VR-I之變異體組成。
如先前所描述(Cabanes-Creus等人, 2020, Methods Clin Dev, 17:1139-1154;亦參見PCT/AU2019/051133,其揭示內容以引用之方式併入本文中)將庫選殖入功能性轉導平台(具有肝特異性啟動子(Liver-Specific Promoter,LSP))中並包裝。
實例 3. 識別具有提高的轉導之變異體
將庫注射至經高度移植之hFRG小鼠(實例1)中。具體言之,在兩隻高度人類化FRG小鼠中獨立篩選AAV-LK03-REDH及AAVC11.11庫,且一隻高度人類化FRG小鼠在AAV注射之前24小時用5 mg IVIg被動免疫。在注射之後一週從經分選人類肝細胞提取DNA及cDNA。
亦在灌流系統(參見實例1)中之人類肝外植體的左葉中聯合篩選庫。在庫注射後兩天回收DNA及cDNA。為了區分開AAV-LK03-REDH及AAVC11.11,進入人類外植體中之庫進一步在I240 (LK03-REDH編號)處如下標記條碼:
胺基酸 | 同義密碼子蛋白殼 | |
REDH | ITT | ATCACAACA |
AAVC11.11 | ITT | ATTACTACG |
來自肝外植體之用於NGS之引子分別為SEQ ID NO: 337及SEQ ID NO: 20之正向引子及反向引子序列;參見表22。
藉由NGS評定從肝分離之人類肝細胞中的載體DNA及RNA (cDNA)含量(分別使用SEQ ID NO: 19及20之正向引子及反向引子序列;參見表22),且如上文所述計算不同進入及表現評分以及總評分。隨後基於變異體之總評分將其自1至14976排名。
表6提供來自基於AAV-LK03-REDH主鏈在無IVIg之hFRG小鼠中篩選之庫的前40種變異體。引起關注地,含有來自AAV-LK03-REDH之野生型VR-I (SQSGASNDNH;SEQ ID NO: 12)的載體排在1932。重要地,對於此載體觀測到相比於表現分數相對較高的進入評分,其與對於AAV-LK03-REDH所觀測到的相符。表7提供來自此在單獨hFRG小鼠(無IVIg)中篩選之庫的前40種變異體;表8提供來自此在hFRG小鼠(有IVIg)中篩選之庫的前40種變異體;及表9提供來自此在肝外植體中篩選之庫的前40種變異體。表10-13提供來自基於AAVC11.11主鏈、分別在兩隻單獨hFRG小鼠(無IVIG)及一隻hFRG小鼠(有IVIg)以及肝外植體中篩選之庫的前40種變異體。
表 6. AAV-LK03-REDH VR-I 變異體 -hFRG ( 無 IVIg) 複製物 1 之 評分
表 7. AAV-LK03-REDH VR-I 變異體 -hFRG ( 無 IVIg) 複製物 2 之 評分
表 8. AAV-LK03-REDH VR-I 變異體 -hFRG+IVIg 之 評分
表 9. AAV-LK03-REDH VR-I 變異體 - 肝外植體之評分
表 10. AAVC11.11 VR-I 變異體 -hFRG ( 無 IVIg) 複製物 1 之 評分
表 11. AAVC11.11 VR-I 變異體 -hFRG ( 無 IVIg) 複製物 2 之 評分
表 12. AAVC11.11 VR-I 變異體 -hFRG+IVIg 之 評分
表 13. AAVC11.11 VR-I 變異體 - 肝外植體之評分
實例 4 . 生成二級 (2y) 庫
排名 | 插入序列 | 進入適合度 | 經校正進入適合度 | 表現適合度 | 經校正表現適合度 | 總評分 |
1 | SRSAGGASNDNA | 10.515 | 10.501 | 11.863 | 11.167 | 21.668 |
2 | SRSSGGSTNDNA | 17.648 | 12.642 | 18.872 | 6.964 | 19.607 |
3 | NRTGGGATNDNA | 12.640 | 12.542 | 6.453 | 6.194 | 18.737 |
4 | NTTAGSSNDNP | 11.727 | 8.515 | 16.384 | 9.784 | 18.299 |
5 | NRTAGGSTNDNH | 11.633 | 11.267 | 6.123 | 5.773 | 17.041 |
6 | SRSSGGSSNDNT | 11.065 | 10.193 | 8.318 | 6.390 | 16.583 |
7 | SKSTGASNDNN | 11.273 | 10.531 | 6.890 | 5.953 | 16.484 |
8 | SRSSGGASNDNH | 7.790 | 7.481 | 10.274 | 8.909 | 16.390 |
9 | NKTGGGASNDNT | 12.136 | 12.118 | 4.524 | 4.246 | 16.364 |
10 | NKTNGGATNDNH | 9.204 | 8.983 | 8.973 | 7.263 | 16.247 |
11 | NRTTGGATNDNH | 9.025 | 9.018 | 9.074 | 6.476 | 15.494 |
12 | NKTGGASNDNT | 11.231 | 10.452 | 10.890 | 4.767 | 15.218 |
13 | SKSAGGSSNDNA | 12.151 | 11.719 | 3.664 | 3.168 | 14.887 |
14 | NRTSGGASNDNH | 10.248 | 10.166 | 6.685 | 4.456 | 14.621 |
15 | SRSTGGASNDNA | 10.731 | 10.279 | 9.287 | 4.240 | 14.519 |
16 | SKSTGASNDNA | 10.974 | 10.300 | 4.494 | 4.204 | 14.503 |
17 | NKTAGGATNDNT | 12.385 | 11.009 | 3.716 | 3.492 | 14.501 |
18 | NRSSGGATNDNA | 11.931 | 11.253 | 4.609 | 2.923 | 14.176 |
19 | SRSSGGASNDNA | 10.334 | 10.243 | 6.217 | 3.887 | 14.129 |
20 | SKTTGGSSNDNA | 11.778 | 11.718 | 2.646 | 2.334 | 14.052 |
21 | SKSAGGASNDNH | 9.720 | 9.480 | 8.265 | 4.523 | 14.003 |
22 | SRSTGGASNDNN | 9.428 | 9.370 | 4.934 | 4.216 | 13.585 |
23 | SRSTGGSSNDNA | 10.489 | 10.278 | 3.494 | 3.159 | 13.437 |
24 | NKTAGGSTNDNH | 10.351 | 10.142 | 3.231 | 3.213 | 13.355 |
25 | NRTNGGATNDNT | 8.685 | 8.667 | 4.999 | 4.610 | 13.277 |
26 | NRTTGGSTNDNN | 9.852 | 9.444 | 3.765 | 3.723 | 13.167 |
27 | NKTTGGATNDNH | 9.293 | 8.541 | 11.013 | 4.583 | 13.124 |
28 | NNSGATNDNH | 5.867 | 5.019 | 11.124 | 7.950 | 12.969 |
29 | NHSNGATNDNN | 4.958 | 4.775 | 8.814 | 8.163 | 12.938 |
30 | SKTSGSSNDNH | 11.562 | 10.395 | 4.247 | 2.495 | 12.890 |
31 | SRSAGGSSNDNT | 10.610 | 9.897 | 3.787 | 2.979 | 12.876 |
32 | NGTAGSSNDNN | 9.704 | 6.575 | 12.182 | 6.295 | 12.870 |
33 | NRTSGGASNDNA | 9.184 | 9.118 | 3.676 | 3.668 | 12.786 |
34 | SSSSGGASNDNN | 5.998 | 5.189 | 10.122 | 7.561 | 12.749 |
35 | SRSSGGSSNDNA | 9.714 | 9.295 | 3.439 | 3.434 | 12.728 |
36 | NKTNGGASNDNN | 7.418 | 7.394 | 8.247 | 5.302 | 12.696 |
37 | NKTGGGASNDNH | 8.646 | 8.458 | 5.344 | 4.180 | 12.638 |
38 | SRTTGGSSNDNH | 10.204 | 9.522 | 5.485 | 3.077 | 12.599 |
39 | SRTAGGATNDNN | 9.083 | 7.427 | 11.728 | 5.163 | 12.590 |
40 | SRSGGGSSNDNT | 9.344 | 9.314 | 5.374 | 3.186 | 12.500 |
1928 | SQSGASNDNH | 2.731 | 2.410 | -4.359 | -4.969 | -2.559 |
排名 | 插入序列 | 進入適合度 | 經校正進入適合度 | 表現適合度 | 經校正表現適合度 | 總評分 |
1 | NHTSGSSNDNH | 8.194 | 7.937 | 11.165 | 10.795 | 18.731 |
2 | SKSTGSTNDNH | 10.431 | 8.487 | 11.960 | 6.788 | 15.275 |
3 | NSTGGSSNDNA | 9.555 | 7.513 | 11.802 | 7.610 | 15.124 |
4 | NESGGGASNDNN | 9.612 | 7.401 | 12.808 | 7.088 | 14.489 |
5 | NNSSGATNDNN | 8.187 | 5.665 | 12.481 | 8.725 | 14.391 |
6 | NRTNGGATNDNH | 5.808 | 5.434 | 8.908 | 7.960 | 13.395 |
7 | NRTGGGATNDNH | 6.476 | 5.778 | 8.419 | 4.702 | 10.480 |
8 | NASTGGATNDNN | 6.864 | 6.134 | 7.334 | 3.966 | 10.100 |
9 | SDTNGATNDNN | 5.337 | 5.047 | 7.671 | 4.958 | 10.004 |
10 | SASGSSNDNH | 6.043 | 5.706 | 7.194 | 3.929 | 9.636 |
11 | NDSTGGATNDNN | 9.948 | 6.507 | 10.925 | 2.949 | 9.456 |
12 | NATTGGASNDNA | 7.800 | 5.477 | 9.985 | 3.739 | 9.216 |
13 | SKTNGSSNDNH | 7.790 | 5.946 | 10.034 | 2.971 | 8.917 |
14 | STTSGASNDNA | 5.268 | 5.103 | 4.355 | 3.773 | 8.876 |
15 | SHTAGGSSNDNH | 8.474 | 6.546 | 8.498 | 2.005 | 8.551 |
16 | STSAGASNDNH | 3.658 | 3.293 | 6.725 | 5.197 | 8.490 |
17 | NRSGGATNDNH | 8.210 | 4.336 | 11.618 | 4.095 | 8.431 |
18 | NTSGGSSNDNN | 7.000 | 5.083 | 8.252 | 3.073 | 8.156 |
19 | NHSAGGASNDNA | 8.067 | 7.028 | 6.567 | 1.037 | 8.065 |
20 | SETSGGSSNDNH | 12.075 | 5.198 | 13.954 | 2.659 | 7.856 |
21 | SASNGGSSNDNA | 8.148 | 5.685 | 8.612 | 2.103 | 7.788 |
22 | SDTGGGASNDNT | 8.077 | 6.049 | 7.881 | 1.661 | 7.710 |
23 | SSSGGGATNDNA | 7.510 | 5.231 | 8.422 | 2.465 | 7.696 |
24 | SNSAGGSSNDNA | 5.148 | 4.990 | 3.671 | 2.700 | 7.690 |
25 | SSTNGGSTNDNH | 7.053 | 6.852 | 1.447 | 0.813 | 7.665 |
26 | SGTGGGASNDNA | 4.287 | 3.856 | 6.019 | 3.795 | 7.651 |
27 | SGTTGGATNDNN | 7.773 | 5.976 | 7.544 | 1.661 | 7.637 |
28 | SGTSGGASNDNA | 3.362 | 3.230 | 4.762 | 4.373 | 7.604 |
29 | NDSSGSSNDNT | 8.342 | 4.224 | 10.542 | 3.336 | 7.560 |
30 | NKSTGASNDNN | 5.804 | 4.068 | 7.784 | 3.467 | 7.535 |
31 | NQTGGSSNDNA | 3.851 | 3.846 | 4.569 | 3.669 | 7.516 |
32 | SNSGATNDNH | 6.751 | 4.652 | 9.287 | 2.465 | 7.117 |
33 | SHSSGGSSNDNH | 8.756 | 5.851 | 9.127 | 1.088 | 6.940 |
34 | SQTGGGASNDNH | 5.617 | 5.018 | 6.989 | 1.821 | 6.838 |
35 | SKTSGSSNDNN | 6.118 | 5.358 | 4.420 | 1.342 | 6.700 |
36 | SRSSGGASNDNT | 5.042 | 4.287 | 6.437 | 2.275 | 6.562 |
37 | NRSTGASNDNN | 8.720 | 5.322 | 11.355 | 1.200 | 6.522 |
38 | NGSNGGASNDNN | 4.879 | 3.996 | 6.835 | 2.491 | 6.486 |
39 | SRTNGGSTNDNA | 6.185 | 5.878 | 0.961 | 0.533 | 6.411 |
40 | SSSGGSTNDNA | 3.914 | 2.494 | 6.492 | 3.711 | 6.204 |
8811 | SQSGASNDNH | -4.641 | -5.501 | -11.815 | -12.363 | -17.864 |
排名 | 插入序列 | 進入適合度 | 經校正進入適合度 | 表現適合度 | 經校正表現適合度 | 總評分 |
1 | SGTNGGSTNDNT | 10.025 | 9.553 | 9.549 | 2.644 | 12.197 |
2 | SRSDGGSTNDNN | 8.326 | 8.070 | 3.536 | 3.371 | 11.441 |
3 | STTSGASNDNA | 7.677 | 6.840 | 7.088 | 3.090 | 9.929 |
4 | SGSNGGASNDNN | 7.196 | 5.831 | 8.703 | 3.385 | 9.216 |
5 | NRSNGGSSNDNH | 12.710 | 7.960 | 12.536 | 0.754 | 8.714 |
6 | SKTNGGASNDNH | 6.957 | 5.694 | 8.077 | 2.898 | 8.592 |
7 | SRSSGGATNDNA | 9.708 | 6.707 | 9.623 | 1.854 | 8.561 |
8 | SSSTGGATNDNA | 6.020 | 5.625 | 2.947 | 2.717 | 8.342 |
9 | NDTGGGATNDNP | 6.171 | 6.171 | 2.051 | 1.855 | 8.026 |
10 | SGSGGGSTNDNA | 5.300 | 4.758 | 6.210 | 3.260 | 8.018 |
11 | SSSGGGSTNDNA | 9.995 | 7.547 | 8.365 | 0.340 | 7.886 |
12 | SDTSGATNDNA | 6.991 | 1.888 | 11.709 | 5.918 | 7.806 |
13 | NASTGGATNDNP | 4.746 | 4.444 | 3.314 | 3.309 | 7.752 |
14 | NKTSGGSSNDNA | 5.485 | 5.414 | 4.498 | 2.196 | 7.610 |
15 | NATGGGATNDNP | 7.586 | 6.932 | 0.977 | 0.649 | 7.581 |
16 | SKTNGGSTNDNA | 8.654 | 7.260 | 1.899 | 0.319 | 7.579 |
17 | SGTNGGSSNDNT | 7.410 | 6.711 | 1.194 | 0.379 | 7.091 |
18 | NTTAGGSTNDNN | 9.395 | 7.181 | 7.717 | -0.118 | 7.063 |
19 | SQTGGGASNDNT | 5.947 | 5.746 | 4.022 | 1.170 | 6.917 |
20 | NTTTGATNDNT | 5.373 | 5.255 | 1.638 | 1.631 | 6.885 |
21 | SHTAGSSNDNA | 6.692 | 6.509 | 1.384 | 0.358 | 6.867 |
22 | SKSSGSSNDNA | 4.999 | 4.843 | 2.314 | 1.907 | 6.751 |
23 | SSSDGGSTNDNA | 4.339 | 3.836 | 2.761 | 2.761 | 6.597 |
24 | SNTTGGSTNDNH | 7.401 | 6.312 | 0.882 | 0.193 | 6.505 |
25 | NQTGGGATNDNT | 7.745 | 7.114 | 5.037 | -0.680 | 6.434 |
26 | NRSDGGSTNDNN | 4.050 | 3.764 | 2.636 | 2.636 | 6.400 |
27 | SGTGGGASNDNH | 4.627 | 3.995 | 6.339 | 2.353 | 6.349 |
28 | SNSSGGSTNDNA | 7.245 | 7.155 | -0.686 | -0.836 | 6.319 |
29 | NSTNGGATNDNA | 6.606 | 5.110 | 1.998 | 1.095 | 6.206 |
30 | NSSSGGATNDNT | 6.479 | 5.062 | 1.466 | 1.014 | 6.076 |
31 | SQSSGGATNDNH | 5.719 | 5.607 | 1.544 | 0.452 | 6.059 |
32 | SKSDGGSTNDNH | 4.830 | 4.630 | 1.510 | 1.410 | 6.039 |
33 | SNTAGGSSNDNT | 7.079 | 6.625 | -0.271 | -0.607 | 6.018 |
34 | NESAGGSSNDNN | 5.339 | 5.198 | 1.861 | 0.812 | 6.011 |
35 | NHSGGGATNDNP | 5.315 | 5.287 | 0.904 | 0.697 | 5.984 |
36 | SSSSGGATNDNA | 6.126 | 6.007 | 0.113 | -0.044 | 5.963 |
37 | SHTDGSTNDNH | 4.548 | 4.547 | 1.371 | 1.320 | 5.867 |
38 | SATDGGSTNDNA | 6.455 | 6.394 | -0.397 | -0.544 | 5.850 |
39 | SKSSGATNDNT | 6.948 | 6.396 | 0.273 | -0.711 | 5.685 |
40 | NRSTGGSTNDNT | 4.744 | 4.550 | 1.337 | 1.088 | 5.638 |
5681 | SQSGASNDNH | -3.868 | -3.906 | -7.494 | -7.661 | -11.568 |
排名 | 插入序列 | 進入適合度 | 經校正進入適合度 | 表現適合度 | 經校正表現適合度 | 總評分 |
1 | SPTDGGSTNDNN | 21.593 | 15.422 | 22.640 | 8.309 | 23.731 |
2 | SESAGGSTNDNN | 11.527 | 9.809 | 5.537 | 2.756 | 12.566 |
3 | NSSGGGSTNDNT | 10.330 | 9.230 | 2.992 | 2.026 | 11.255 |
4 | NDTSGGATNDNT | 9.112 | 9.024 | 1.969 | 1.351 | 10.375 |
5 | NNTGSSNDNH | 7.906 | 7.735 | 2.391 | 2.272 | 10.007 |
6 | NKSSGGSTNDNN | 9.035 | 8.314 | 1.844 | 1.607 | 9.921 |
7 | STTSGGSTNDND | 7.924 | 7.589 | 3.534 | 2.030 | 9.620 |
8 | SHSAGGSTNDNA | 8.481 | 8.341 | 1.259 | 1.221 | 9.562 |
9 | SDTAGGSTNDNN | 7.780 | 6.855 | 3.364 | 2.626 | 9.481 |
10 | SRTDGSTNDNP | 8.092 | 7.428 | 2.166 | 2.041 | 9.470 |
11 | NHSGATNDNP | 7.683 | 7.592 | 2.844 | 1.871 | 9.463 |
12 | NSSGGATNDNA | 9.319 | 7.969 | 1.747 | 1.004 | 8.973 |
13 | NNSNGSSNDNA | 9.098 | 8.675 | 1.384 | -0.262 | 8.412 |
14 | NPSNGGSSNDND | 6.557 | 6.554 | 1.849 | 1.839 | 8.393 |
15 | SQTNGGSTNDND | 7.511 | 7.137 | 1.212 | 0.942 | 8.078 |
16 | SDSGSSNDNT | 5.132 | 4.690 | 3.103 | 2.945 | 7.635 |
17 | NESAGATNDNN | 7.515 | 6.888 | 0.879 | 0.612 | 7.500 |
18 | NPSAGGSSNDNN | 7.321 | 6.064 | 1.754 | 1.313 | 7.377 |
19 | SSTGATNDNT | 8.043 | 5.196 | 2.976 | 2.079 | 7.275 |
20 | SESNGGSSNDNT | 7.936 | 6.645 | 1.949 | 0.623 | 7.269 |
21 | SDTNGSTNDNA | 5.057 | 5.003 | 2.259 | 2.165 | 7.168 |
22 | NPSGASNDNT | 5.458 | 5.386 | 1.391 | 1.324 | 6.710 |
23 | STSGGGSTNDNP | 4.406 | 4.129 | 2.522 | 2.500 | 6.629 |
24 | NHSTGGATNDND | 6.689 | 5.444 | 0.489 | 0.402 | 5.846 |
25 | NDSGGATNDNT | 4.871 | 4.868 | 0.890 | 0.761 | 5.629 |
26 | SHTDGGSSNDNA | 6.178 | 6.014 | -0.200 | -0.559 | 5.455 |
27 | SKSSGATNDNA | 6.371 | 5.978 | 0.674 | -0.533 | 5.445 |
28 | SKTGSTNDND | 7.734 | 7.690 | -2.259 | -2.284 | 5.406 |
29 | SQTGGGSSNDNP | 5.993 | 5.081 | 0.391 | 0.272 | 5.354 |
30 | SHTSGSSNDNP | 7.010 | 6.615 | -0.139 | -1.327 | 5.287 |
31 | NASSGSSNDND | 5.338 | 5.333 | -0.083 | -0.107 | 5.227 |
32 | SSTAGGSTNDNH | 6.174 | 6.068 | 0.522 | -0.858 | 5.209 |
33 | NGSDGGSTNDND | 5.589 | 5.561 | -0.194 | -0.412 | 5.149 |
34 | STSSGGSSNDNP | 5.098 | 4.078 | 1.107 | 0.913 | 4.992 |
35 | SNTGGASNDNA | 5.544 | 4.767 | 2.094 | 0.187 | 4.954 |
36 | NDTDGASNDNA | 4.390 | 4.390 | 0.508 | 0.426 | 4.817 |
37 | SDTTGATNDNN | 5.157 | 5.155 | -0.346 | -0.346 | 4.808 |
38 | SPSGSTNDNN | 4.671 | 4.671 | 0.142 | 0.128 | 4.799 |
39 | NRSAGATNDNP | 7.588 | 7.322 | -2.373 | -2.537 | 4.785 |
40 | NTSGATNDNT | 6.304 | 5.288 | 1.949 | -0.504 | 4.783 |
2792 | SQSGASNDNH | 0.562 | 0.379 | -9.158 | -9.168 | -8.789 |
排名 | 插入序列 | 進入適合度 | 經校正進入適合度 | 表現適合度 | 經校正表現適合度 | 總評分 |
1 | NRTGGSTNDNA | 12.004 | 11.469 | 7.595 | 7.386 | 18.855 |
2 | SETGGATNDNT | 13.569 | 8.966 | 16.685 | 7.118 | 16.084 |
3 | SATNGGSSNDNA | 9.951 | 7.429 | 10.295 | 6.482 | 13.911 |
4 | SKTDGSSNDNT | 11.317 | 10.259 | 3.491 | 3.047 | 13.306 |
5 | NGTSGSTNDNN | 10.525 | 10.306 | 3.249 | 2.965 | 13.270 |
6 | NNSSGGSSNDNA | 11.472 | 6.824 | 5.781 | 5.668 | 12.492 |
7 | NQSTGGSSNDNT | 8.372 | 8.370 | 4.290 | 3.064 | 11.434 |
8 | NQSNGSTNDNA | 9.781 | 7.527 | 3.996 | 3.873 | 11.400 |
9 | SSTTGSTNDNA | 9.701 | 7.482 | 4.485 | 3.506 | 10.987 |
10 | NDSGGSTNDNT | 8.156 | 8.083 | 3.030 | 2.823 | 10.906 |
11 | NETSGGSSNDNA | 8.971 | 8.505 | 2.225 | 2.032 | 10.537 |
12 | NSTDGATNDNP | 8.086 | 7.642 | 3.413 | 2.822 | 10.464 |
13 | NRSSGGSTNDNH | 9.889 | 9.192 | 8.059 | 1.184 | 10.376 |
14 | SKTGGATNDNA | 7.907 | 7.897 | 2.845 | 2.346 | 10.243 |
15 | NKSTGGATNDNT | 9.646 | 7.005 | 4.100 | 3.022 | 10.027 |
16 | NSSTGSSNDNA | 8.938 | 8.925 | 1.170 | 1.002 | 9.927 |
17 | NRSAGGSSNDNH | 8.614 | 7.935 | 2.034 | 1.862 | 9.797 |
18 | NDTSGGSSNDNA | 9.524 | 8.157 | 3.775 | 1.419 | 9.576 |
19 | SKSTGSSNDNA | 8.966 | 7.538 | 2.042 | 2.035 | 9.573 |
20 | SHTTGATNDNT | 7.406 | 7.382 | 2.058 | 1.960 | 9.342 |
21 | NNSNGATNDNT | 9.839 | 8.727 | 1.381 | 0.561 | 9.288 |
22 | NKSAGGATNDNN | 8.419 | 8.268 | 1.047 | 0.762 | 9.030 |
23 | NGTDGGSTNDNN | 7.534 | 7.500 | 2.111 | 1.180 | 8.680 |
24 | NKSTGSTNDNH | 10.332 | 5.431 | 6.115 | 3.053 | 8.484 |
25 | STTTGSTNDNT | 9.380 | 5.314 | 5.131 | 2.956 | 8.270 |
26 | NRTTGGATNDNA | 7.907 | 7.483 | 0.734 | 0.679 | 8.162 |
27 | NGTNGGSTNDNH | 7.370 | 7.367 | 0.705 | 0.689 | 8.057 |
28 | SKTTGGASNDNT | 8.911 | 7.297 | 2.000 | 0.679 | 7.976 |
29 | NNTAGGSSNDNA | 8.878 | 5.636 | 3.338 | 2.336 | 7.971 |
30 | SSTNGGSSNDNH | 6.640 | 5.892 | 2.226 | 2.038 | 7.930 |
31 | SNTSGGATNDNA | 7.902 | 7.863 | 0.938 | 0.015 | 7.878 |
32 | STTSGATNDNT | 7.456 | 7.272 | 1.018 | 0.587 | 7.859 |
33 | SHTSGGSSNDNN | 6.418 | 6.272 | 1.825 | 1.506 | 7.778 |
34 | NETSGSSNDNA | 9.114 | 5.973 | 2.702 | 1.707 | 7.680 |
35 | STSAGGASNDNH | 6.525 | 5.769 | 8.894 | 1.865 | 7.634 |
36 | STTTGSSNDNN | 8.656 | 7.198 | 1.382 | 0.417 | 7.614 |
37 | SKSAGGSSNDNN | 6.200 | 4.994 | 3.161 | 2.533 | 7.527 |
38 | NHSTGATNDNA | 6.983 | 6.446 | 1.850 | 1.053 | 7.499 |
39 | NNSTGGATNDNA | 8.338 | 6.602 | 0.901 | 0.862 | 7.463 |
40 | STSAGGSTNDNP | 5.173 | 5.129 | 2.292 | 2.248 | 7.378 |
956 | SQSGASNDNH | 5.058 | 2.749 | -2.350 | -4.603 | -1.854 |
排名 | 插入序列 | 進入適合度 | 經校正進入適合度 | 表現適合度 | 經校正表現適合度 | 總評分 |
1 | SKSGGGATNDNA | 11.881 | 10.271 | 6.656 | 5.740 | 16.012 |
2 | SKSDGASNDNA | 11.159 | 9.875 | 5.878 | 4.994 | 14.869 |
3 | NNTSGGSTNDNN | 16.020 | 9.664 | 16.854 | 4.830 | 14.494 |
4 | STSNGGSTNDNH | 10.643 | 9.990 | 4.647 | 3.811 | 13.801 |
5 | SDSSGGSTNDNH | 8.582 | 8.300 | 4.862 | 4.725 | 13.024 |
6 | NATAGGSSNDNH | 8.788 | 8.512 | 4.257 | 4.171 | 12.683 |
7 | SNTDGSSNDNT | 9.014 | 8.907 | 3.927 | 3.692 | 12.599 |
8 | NSTDGATNDNA | 8.907 | 8.791 | 4.220 | 3.407 | 12.198 |
9 | SESGSTNDNH | 9.494 | 8.996 | 3.133 | 3.021 | 12.017 |
10 | NQTSGATNDNA | 8.859 | 8.756 | 3.198 | 3.134 | 11.890 |
11 | NQTDGASNDNP | 11.245 | 9.309 | 4.115 | 2.571 | 11.880 |
12 | NKTSGASNDNA | 8.711 | 8.093 | 3.895 | 3.613 | 11.706 |
13 | SKTAGSSNDNA | 7.532 | 7.444 | 3.895 | 3.881 | 11.326 |
14 | SGTNGSSNDNA | 8.954 | 8.614 | 3.295 | 2.673 | 11.287 |
15 | NDSTGGATNDNN | 9.128 | 8.520 | 3.874 | 2.674 | 11.194 |
16 | NRTTGGATNDNP | 8.014 | 7.493 | 4.166 | 3.622 | 11.116 |
17 | SSTGGGSSNDNN | 7.505 | 7.155 | 4.224 | 3.939 | 11.095 |
18 | NTTTGATNDNT | 7.468 | 7.447 | 3.602 | 3.553 | 11.000 |
19 | SSSDGGATNDNT | 10.537 | 8.461 | 4.283 | 2.536 | 10.997 |
20 | NGSNGGSSNDNN | 7.017 | 6.958 | 3.888 | 3.839 | 10.798 |
21 | SQSAGSSNDNA | 8.608 | 8.412 | 2.814 | 2.342 | 10.754 |
22 | NQTAGGSSNDNH | 9.714 | 8.477 | 2.981 | 2.046 | 10.523 |
23 | SETGGGSSNDNP | 8.182 | 6.844 | 5.168 | 3.559 | 10.402 |
24 | STTDGSTNDNT | 7.457 | 6.906 | 3.606 | 3.453 | 10.359 |
25 | NQSSGGSSNDNH | 7.363 | 7.260 | 3.109 | 2.916 | 10.176 |
26 | SESNGGSTNDNH | 8.826 | 7.955 | 2.821 | 1.937 | 9.893 |
27 | SATNGSTNDNH | 8.621 | 8.413 | 1.736 | 1.450 | 9.864 |
28 | SESSGSSNDNA | 7.994 | 7.837 | 1.915 | 1.632 | 9.468 |
29 | SDTTGGSTNDNN | 8.487 | 8.133 | 2.626 | 1.226 | 9.358 |
30 | SESSGASNDNA | 7.710 | 7.673 | 1.715 | 1.597 | 9.270 |
31 | SQTDGGASNDNT | 7.754 | 7.538 | 2.242 | 1.611 | 9.149 |
32 | NQTDGASNDNA | 9.212 | 7.737 | 3.138 | 1.350 | 9.088 |
33 | NKSAGGATNDNT | 10.075 | 2.296 | 6.831 | 6.767 | 9.064 |
34 | SKSSGASNDNN | 8.936 | 7.858 | 2.465 | 1.135 | 8.993 |
35 | NSSSGSTNDNH | 7.350 | 6.546 | 3.059 | 2.248 | 8.793 |
36 | SKTTGASNDNA | 7.596 | 7.478 | 1.290 | 1.253 | 8.731 |
37 | STSTGASNDNT | 7.725 | 7.658 | 1.122 | 1.049 | 8.707 |
38 | NHSNGGASNDNN | 8.995 | 7.355 | 3.253 | 1.328 | 8.683 |
39 | SESSGGATNDNA | 7.639 | 7.623 | 0.976 | 0.886 | 8.509 |
40 | NNTTGGATNDNA | 8.479 | 5.076 | 4.599 | 3.376 | 8.452 |
624 | SQSGASNDNH | 1.709 | 1.067 | -0.271 | -2.487 | -1.420 |
排名 | 插入序列 | 進入適合度 |
1 | SKTTGGASNDNN | 8.915 |
2 | STTGGGATNDNP | 8.543 |
3 | STSGATNDNA | 7.232 |
4 | SKTSGSTNDNN | 7.189 |
5 | SATTGSTNDNP | 7.022 |
6 | SKTSGATNDNP | 6.924 |
7 | SNTTGGASNDNP | 6.452 |
8 | NKSAGGSTNDNH | 6.405 |
9 | NHSAGATNDNT | 6.297 |
10 | NRSDGSTNDNA | 6.280 |
11 | SDTDGGSSNDNP | 5.890 |
12 | SQSTGATNDNP | 5.762 |
13 | NGTAGGSSNDNN | 5.675 |
14 | SGTAGGSSNDNA | 5.647 |
15 | SGSNGGSTNDNT | 5.637 |
16 | NKSSGGATNDNH | 5.601 |
17 | SRTNGGSSNDNH | 5.353 |
18 | SSTTGASNDNP | 5.298 |
19 | SKTAGGASNDNA | 5.233 |
20 | SDSTGGSSNDND | 5.223 |
21 | NRSTGASNDNH | 5.199 |
22 | NASDGGSTNDNT | 5.159 |
23 | NETAGGSSNDND | 5.072 |
24 | NESGGATNDNH | 4.861 |
25 | NNTDGSSNDNN | 4.858 |
26 | NKSAGGATNDNH | 4.759 |
27 | NHSTGGSSNDNH | 4.714 |
28 | SSSTGGATNDNP | 4.706 |
29 | SQSGATNDNP | 4.701 |
30 | STTNGGSSNDNA | 4.609 |
31 | SRTGGGSSNDNA | 4.588 |
32 | SRSGSTNDNH | 4.559 |
33 | NQTTGGATNDNP | 4.540 |
34 | NPSGATNDNN | 4.523 |
35 | NRTNGGSTNDNP | 4.523 |
36 | SQSTGGSSNDNP | 4.486 |
37 | SSTGGSTNDNT | 4.431 |
38 | NASTGGSTNDNH | 4.385 |
39 | SSTSGASNDNH | 4.341 |
40 | SKTNGATNDNT | 4.304 |
64 | SQSGASNDNH | 3.868 |
排名 | 插入序列 | 進入適合度 | 經校正進入適合度 | 表現適合度 | 經校正表現適合度 | 總評分 |
1 | NSSAGGATNDNP | 10.010 | 9.493 | 5.280 | 4.544 | 14.037 |
2 | NQSTGGATNDNP | 8.705 | 8.368 | 5.485 | 5.344 | 13.712 |
3 | NNSAGSSNDNP | 6.611 | 6.479 | 6.931 | 6.793 | 13.273 |
4 | SPTNGGSTNDNP | 8.691 | 8.662 | 4.602 | 4.452 | 13.114 |
5 | NASSGSTNDNA | 9.904 | 8.308 | 6.132 | 4.804 | 13.112 |
6 | NQSDGGSTNDNN | 8.827 | 8.657 | 4.132 | 4.108 | 12.765 |
7 | NQTSGGASNDNP | 8.777 | 8.680 | 2.798 | 2.583 | 11.263 |
8 | NASDGGSTNDNN | 7.623 | 7.623 | 4.877 | 3.278 | 10.902 |
9 | SDTAGATNDNP | 7.513 | 6.156 | 5.063 | 4.189 | 10.345 |
10 | SATTGSTNDNA | 7.661 | 7.230 | 3.980 | 2.822 | 10.051 |
11 | NNTGGATNDNA | 6.968 | 6.766 | 3.263 | 3.259 | 10.026 |
12 | NQTDGSTNDND | 7.377 | 7.318 | 2.485 | 2.470 | 9.787 |
13 | NNTGGATNDNP | 8.744 | 8.131 | 2.280 | 1.622 | 9.753 |
14 | SPTDGGSTNDNN | 9.623 | 8.408 | 4.737 | 1.316 | 9.724 |
15 | SETGGGSSNDNA | 5.952 | 4.674 | 7.087 | 4.485 | 9.158 |
16 | NPTSGGSTNDNN | 7.884 | 6.865 | 3.128 | 2.255 | 9.120 |
17 | SPSDGGSSNDNT | 6.451 | 6.325 | 2.678 | 2.677 | 9.002 |
18 | NETGSSNDNA | 9.289 | 8.956 | 3.280 | -0.173 | 8.782 |
19 | NTTSGSSNDNN | 8.460 | 8.217 | 0.422 | 0.373 | 8.591 |
20 | STTNGSTNDNA | 7.226 | 7.166 | 1.640 | 1.398 | 8.564 |
21 | NQSNGSTNDNN | 6.173 | 6.155 | 2.695 | 2.375 | 8.530 |
22 | NETGGSTNDNN | 9.744 | 7.534 | 4.263 | 0.949 | 8.483 |
23 | NKSAGGSSNDNH | 6.783 | 6.637 | 2.678 | 1.733 | 8.370 |
24 | NSSNGGASNDNP | 6.758 | 6.758 | 1.543 | 1.379 | 8.138 |
25 | NSSDGGATNDNT | 5.479 | 5.459 | 2.128 | 2.126 | 7.585 |
26 | NSTAGGATNDND | 5.932 | 5.824 | 1.555 | 1.544 | 7.368 |
27 | NQTAGSTNDNH | 5.787 | 5.774 | 1.488 | 1.459 | 7.233 |
28 | NQTTGGSTNDND | 6.009 | 4.880 | 2.395 | 2.304 | 7.184 |
29 | NNTAGGASNDNT | 8.165 | 8.134 | -0.846 | -1.022 | 7.112 |
30 | SHTGASNDNA | 7.412 | 7.402 | 1.585 | -0.448 | 6.954 |
31 | NASTGGATNDNT | 5.779 | 5.778 | 1.421 | 1.100 | 6.878 |
32 | NSSNGSTNDNH | 5.829 | 5.723 | 1.210 | 1.134 | 6.857 |
33 | NATTGGSTNDNN | 6.518 | 6.452 | 0.263 | 0.207 | 6.659 |
34 | NKSDGGSTNDNN | 5.731 | 5.704 | 0.847 | 0.838 | 6.542 |
35 | NDSTGASNDNT | 5.173 | 4.770 | 1.695 | 1.691 | 6.461 |
36 | NGTSGGSTNDND | 5.514 | 5.450 | 0.958 | 0.867 | 6.317 |
37 | NDTDGGSSNDNA | 6.367 | 5.221 | 1.637 | 1.038 | 6.259 |
38 | NQTTGSSNDNA | 5.446 | 5.188 | 1.903 | 1.010 | 6.198 |
39 | SQTGASNDNA | 5.887 | 5.393 | 0.836 | 0.761 | 6.154 |
40 | STSDGGSTNDNH | 7.344 | 7.183 | -0.739 | -1.054 | 6.130 |
2626 | SQSGASNDNH | 1.364 | 0.782 | -7.866 | -10.085 | -9.303 |
構築兩個二級(2y)庫,一個基於AAV-LK03-REDH蛋白殼主鏈及另一個基於AAVC11.11蛋白殼主鏈。
將AAV-LK03-REDH 2y庫構築為含有表6-9中所述之AAV-LK03-REDH VR-I庫的前40種變異體,除「STTSGASNDNA」之外,STTSGASNDNA在來自在hFRG小鼠(無IVIg)複製物2中篩選的AAV-LK03-REDH VR-I庫之前40種變異體(表7)中且在來自在hFRG小鼠(有IVIg)中篩選的AAV-LK03-REDH VR-I庫之前40種變異體(表8)之中。
將AAVC11.11 2y庫構築為含有表10-13中所述之AAVC11.11 VR-I庫之前40種變異體。因此,AAV-LK03-REDH 2y庫含有159種所選變異體且AAVC11.11 2y庫含有160種所選變異體。
與跟隨有同義密碼子之策略相似,要求2y庫之每個變異體呈兩個複製物形式(2個寡核苷酸/變異體)。為了能夠將其以複製物形式使用,用人類中最頻繁使用的密碼子構築兩個寡核苷酸之第一者,且用人類中第二頻繁使用的密碼子構築兩個寡核苷酸中之第二者。作為一實例,具有野生型VR-I (SQSGASNDNH;SEQ ID NO: 12)之最頻繁使用之密碼子的第一寡核苷酸之序列為AGCCAGAGCGGCGCCAGCAACGACAACCAC (SEQ ID NO: 341)且具有野生型VR-I (SQSGASNDNH;SEQ ID NO: 12)之第二頻繁使用之密碼子的第二寡核苷酸之序列為TCCCAATCCGGAGCTTCCAATGATAATCAT (SEQ ID NO: 342)。
因為兩個2y庫均以寡核苷酸形式合成,故每個庫均包括一組對照,對應於野生型VR-I序列「SQSGASNDNH」 (SEQ ID NO: 12),四個前述選擇(hFRG (無IVIg)複製物1、hFRG (無IVIg)複製物2、hFRG+IVIg及肝外植體)中之各者的兩個陰性VR-I對照(未經選擇變異體),野生型AAV1、AAV7、AAV8、AAV9及AAV10之VR-I胺基酸區及僅具有終止密碼子之變異體。所合成寡核苷酸亦具有兩個在VR-I區之上游(5'-ACAACCATCTCTACAAGCAAATCTCC;SEQ ID NO: 338)及下游(5'-TACTTTGGCTACAGCACCCCTTGG;SEQ ID NO: 339)的同源區。用吉布森組裝將每個2y庫選殖入對應背景蛋白殼中。
為了區分開聯合注射之AAV-LK03-REDH及AAVC11.11 2y庫,每個庫均進一步如下在I240 (LK03-REDH編號)處標記條碼:
胺基酸 | 同義密碼子蛋白殼 | |
REDH | ITT | ATCACAACA |
AAVC11.11 | ITT | ATTACTACG |
將兩個2y庫獨立包裝,以1:1混合,且隨後注射至四個不同小鼠模型中:1)肝外植體;2) hFRG (無IVIg);3)如實例3中所述之hFRG+IVIg;及4) PxB (無IVIg)。比如FRG、PxB小鼠亦為具有人類化肝之嵌合小鼠。(PhoenixBio)在注射之後一個月自FRG及PXB小鼠及在注射之後第2、4、6及8天時自肝外植體回收DNA及cDNA。
來自肝外植體模型之AAVC11.11 2y庫於DNA(進入)層次前面排名之變異體係基於以下準則而判定:1)兩種同義密碼子複製物均在前100種變異體中;及2)在4天中之至少3天中兩種同義密碼子複製物均存在。表14中提供基於變異體之進入排名靠前的變異體。變異體命名為LB11 2y 1-LB11 2y 8 (野生型命名為wt_LB11)。亦將此等變異體選殖入AAVC11.12蛋白殼主鏈中(且對應地命名為LB12 2y 1-LB 12 2y 8)。
表 14. AAVC11.11 2y 庫 - 肝外植體之按進入排名靠前的變異體
1 選殖入AAVC11.12主鏈中,對應地命名為LB12 2y 1-LB12 2y 8。
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 1 | 複製物1 | 複製物2 |
SQSGASNDNH | 12 | wt_LB11 | 234 | 242 |
SKTTGASNDNA | 253 | LB11 2y 1 | 1 | 5 |
SKSSGASNDNN | 251 | LB11 2y 2 | 2 | 48 |
NRSAGGSSNDNH | 196 | LB11 2y 3 | 3 | 82 |
SRTNGGSSNDNH | 274 | LB11 2y 4 | 8 | 60 |
NKSAGGSSNDNH | 319 | LB11 2y 5 | 12 | 55 |
SRTGGGSSNDNA | 288 | LB11 2y 6 | 13 | 91 |
NKSTGGATNDNT | 194 | LB11 2y 7 | 15 | 18 |
NKTSGASNDNA | 231 | LB11 2y 8 | 17 | 44 |
來自肝外植體模型之表現cDNA讀段僅產生兩個靠前的蛋白殼變異體。在表現量下之同等排名提供於表15中。變異體命名為LB11 2y 9-LB11 2y 10。亦將此等變異體選殖入AAVC11.12蛋白殼主鏈中(且對應地命名為LB12 2y 9-LB 12 2y 10)。
表 15. AAVC11.11 2y 庫 - 肝外植體之按表現排名靠前的變異體
1 選殖入AAVC11.12主鏈中,對應地命名為LB12 2y 9-LB12 2y 10。
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 1 | 複製物1 | 複製物2 |
SKTGGATNDNA | 193 | LB11 2y 9 | 4 | 294 |
NHSAGATNDNT | 266 | LB11 2y 10 | 241 | 未發現 |
亦基於變異體之進入及表現排名來選擇來自hFRG (無IVIg) (表16)、hFRG+IVIg (表17)及PxB (無IVIg) (表18)模型之AAVC11.11 2y庫的靠前變異體。此等變異體亦選殖入AAVC11.12蛋白殼主鏈中。基於變異體之表現排名選擇變異體LB11 2y 11-LB11 2y 14 (表16)。基於變異體之表現排名選擇變異體LB11 2y 3、7-9及LB11 2y 15-17 (表17)及基於變異體之進入排名選擇變異體LB11 2y 1、12及18-20 (表17)。基於變異體之表現排名選擇變異體LB11 2y 21-LB11 2y 24 (表18)及基於變異體之進入排名選擇LB11 2y 25 (表18)。
表 16 . AAVC11.11 2y 庫 -hFRG ( 無 IVIg) 之 排名靠前的變異體
1 選殖入AAVC11.12主鏈中,對應地命名為LB12 2y 11-LB12 2y 14。
表 17. AAVC11.11 2y 庫 -hFRG+IVIg 之 排名靠前的變異體
1 選殖入AAVC11.12主鏈中,對應地命名為LB12 2y 15-LB12 2y 20。
表 18. AAVC11.11 2y 庫 -PxB ( 無 IVIg) 之 排名靠前的變異體
1 選殖入AAVC11.12主鏈中,對應地命名為LB12 2y 21-LB12 2y 25。
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 1 | 進入排名 | 表現排名 |
SKTTGGASNDNT | 207 | LB11 2y 11 | / | 2 |
NKSSGGATNDNH | 273 | LB11 2y 12 | / | 5 |
SESNGGSTNDNH | 243 | LB11 2y 13 | / | 6 |
SQSGATNDNP | 286 | LB11 2y 14 | / | 7 |
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 1 | 進入排名 | 表現排名 |
NRSAGGSSNDNH | 196 | LB11 2y 3 | / | 2 |
NKSTGGATNDNT | 194 | LB11 2y 7 | / | 3 |
SSTNGGSSNDNH | 209 | LB11 2y 15 | / | 4 |
SESSGGATNDNA | 256 | LB11 2y 16 | / | 5 |
NKTSGASNDNA | 231 | LB11 2y 8 | / | 6 |
NNTGGATNDNP | 310 | LB11 2y 17 | / | 9 |
SKTGGATNDNA | 193 | LB11 2y 9 | / | 10 |
SKTTGASNDNA | 253 | LB11 2y 1 | 1 | / |
SKSGGGATNDNA | 220 | LB11 2y 18 | 2 | / |
SKSTGSSNDNA | 198 | LB11 2y 19 | 3 | / |
NKSSGGATNDNH | 273 | LB11 2y 12 | 4 | / |
NKSAGGATNDNH | 283 | LB11 2y 20 | 5 | / |
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 1 | 進入排名 | 表現排名 |
SSTTGASNDNP | 275 | LB11 2y 21 | / | 2 |
STSNGGSTNDNH | 223 | LB11 2y 22 | / | 4 |
SHTSGGSSNDNN | 212 | LB11 2y 23 | / | 5 |
NSSNGSTNDNH | 328 | LB11 2y 24 | / | 9 |
STSTGASNDNT | 254 | LB11 2y 25 | 2 | / |
亦基於變異體之進入及表現排名來選擇來自hFRG (無IVIg) (表19)、hFRG+IVIg (表20)及PxB (無IVIg) (表21)模型之AAV-LK03-REDH 2y庫的一些靠前變異體。此等變異體未選殖入AAVC11.12蛋白殼主鏈中。基於變異體之表現排名選擇變異體REDH 2y 1-REDH 2y 4 (表19)。基於變異體之表現排名選擇變異體REDH 2y 5及6 (表20)。基於變異體之表現排名選擇變異體REDH 2y 7-REDH 2y 9 (表21)及基於變異體之進入排名選擇REDH 2y 10 (表21)。
表 19. AAV-LK03-REDH 2y 庫 -hFRG ( 無 IVIg) 之 排名靠前的變異體
表 20. AAV-LK03-REDH 2y 庫 -hFRG+IVIg 之 排名靠前的變異體
表 21. AAV-LK03-REDH 2y 庫 -PxB ( 無 IVIg) 之 排名靠前的變異體
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 | 進入排名 | 表現排名 |
NRTGGGATNDNH | 67 | REDH 2y 1 | / | 1 |
NPSAGGSSNDNN | 157 | REDH 2y 2 | / | 3 |
NSSSGGATNDNT | 129 | REDH 2y 3 | / | 4 |
NESGGGASNDNN | 64 | REDH 2y 4 | / | 8 |
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 | 進入排名 | 表現排名 |
NTTAGGSTNDNN | 117 | REDH 2y 5 | / | 1 |
SKSSGATNDNA | 166 | REDH 2y 6 | / | 8 |
所選擇之VR-I區 | SEQ ID NO | 命名 | 進入排名 | 表現排名 |
NRTNGGATNDNT | 45 | REDH 2y 7 | / | 3 |
SRSTGGASNDNA | 35 | REDH 2y 8 | / | 6 |
NDSGGATNDNT | 164 | REDH 2y 9 | / | 7 |
NKTGGASNDNT | 32 | REDH 2y 10 | 1 | / |
AAVC11.11 2y庫及AAV-LK03-REDH 2y庫之所有選擇/生成之變異體及選殖至AAVC11.12蛋白殼主鏈上的彼等變異體(總共60種)均用兩個標記條碼的ITR2-LSP1-eGFP-標記條碼的-WPRE-ITR2轉殖基因載體化。將AAVC11.11、AAVC11.12、AAV-LK03及AAV-LK03-REDH用作對照。
將60種選擇/生成之蛋白殼變異體分成兩組以在hFRG小鼠中驗證。第1組(34種變異體)包括來自用於AAVC11.11 2y及AAV-LK03-REDH 2y庫之肝外植體及hFRG+IVIg模型之排名靠前的變異體及對應的AAVC11.12 2y變異體。第2組(26種變異體)包括來自用於AAVC11.11 2y及AAV-LK03-REDH 2y庫之hFRG (無IVIg)及PxB模型之排名靠前的變異體及對應的AAVC11.12 2y變異體。
兩個選擇/生成之蛋白殼變異體組中之每一者均注射至具有或不具有IVIg之hFRG小鼠中(n=3/組,總共6隻hFRG小鼠/蛋白殼變異體組)且與AAVC11.11、AAVC11.12、AAV-LK03及AAV-LK03-REDH對照比較。藉由NGS評定自肝分離之人類肝細胞中的載體DNA及RNA (cDNA)層次,藉由標準化至注射混合前且隨後藉由如下計算標準化至AAV-C11.12的效能來提供資料:(
蛋白殼 i DNA%/ 蛋白殼 i 混合前 %)/( 蛋白殼 C11.C12 DNA%/ 蛋白殼 C11.C12 混合前 %)。結果展示於圖3至圖6中。C11.C12顯示為1,且對於n=3隻FRG/情況在與C11.C12相比時其餘蛋白殼指示平均倍數變化。
表 22. 引子序列
表 23. 蛋白殼序列
SEQ ID NO | 名稱/描述 | 序列(5'-3') |
13 | Fwd 10aa | CATCTCTACAAGCAAATCTCCARCVVWWCWGGAKCTWCWAACGACAACVMCTACTT |
14 | Fwd 11aa | CATCTCTACAAGCAAATCTCCARCVVWWCWRVCGGAKCTWCWAACGACAACVMCTACTT |
15 | Fwd 12aa | CATCTCTACAAGCAAATCTCCARCVVWWCWRVCGGAGGAKCTWCWAACGACAACVMCTACTT |
16 | Rev共同1 | GGAGATTTGCTTGTAGAGATGGTTGTTGTAAGTGGGCAGGGCCCAGGTTCTGG |
17 | Rev共同2 | GGAGATTTGCTTGTAGAGATGATTATTGTACGTGGGCAGGGCCCAGGTTCTGG |
18 | Rev共同3 | GGAGATTTGCTTGTAGAGATGGTTATTATAGGTGGGCAGGGCCCAGGTTCTGG |
19 | 正向NGS | ACCACCAGCACCAGAACCTGG |
20 | 反向NGS | GCAGTGGAATCTGTTAAAGTCAAAATACCCCC |
337 | 正向NGS (肝外植體) | ACTGAATGGCTGGGCGACAGAGTCAT |
338 | 2y庫(上游) | ACAACCATCTCTACAAGCAAATCTCC |
339 | 2y庫(下游) | TACTTTGGCTACAGCACCCCTTGG |
341 | 密碼子優化1 | AGCCAGAGCGGCGCCAGCAACGACAACCAC |
342 | 密碼子優化2 | TCCCAATCCGGAGCTTCCAATGATAATCAT |
SEQ ID NO | 名稱 | 序列 |
1 | AAV-LK03-R594E+ D598H -VP1 (nt) | ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTTCTGAAGGCATTCGAGAGTGGTGGGCGCTGCAACCTGGAGCCCCTAAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAGGACAACGCTCGGGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTCGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAACCCGTCAACGCAGCGGACGCGGCAGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGTGACAACCCCTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGATCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCATCATCTGGTGTTGGCAAATCGGGCAAACAGCCTGCCAGAAAAAGACTAAATTTCGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCACCAGCAGCCCCCACAAGTTTGGGATCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGTGCCGATGGAGTGGGTAATTCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCAGAACCTGGGCCCTGCCCACTTACAACAACCATCTCTACAAGCAAATCTCCAGCCAATCAGGAGCTTCAAACGACAACCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATTAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAAACTCAGCTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTTAAAGAGGTCACGCAGAACGATGGCACGACGACTATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTGTTTACGGACTCGGAGTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCGCACCAAGGCTGTCTCCCGCCGTTTCCAGCGGACGTCTTCATGGTCCCTCAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGAAGTCAAGCGGTGGGACGCTCATCCTTTTACTGCCTGGAGTACTTCCCTTCGCAGATGCTAAGGACTGGAAATAACTTCCAATTCAGCTATACCTTCGAGGATGTACCTTTTCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTTTGGATCGCTTGATGAATCCTCTTATTGATCAGTATCTGTACTACCTGAACAGAACGCAAGGAACAACCTCTGGAACAACCAACCAATCACGGCTGCTTTTTAGCCAGGCTGGGCCTCAGTCTATGTCTTTGCAGGCCAGAAATTGGCTACCTGGGCCCTGCTACCGGCAACAGAGACTTTCAAAGACTGCTAACGACAACAACAACAGTAACTTTCCTTGGACAGCGGCCAGCAAATATCATCTCAATGGCCGCGACTCGCTGGTGAATCCAGGACCAGCTATGGCCAGTCACAAGGACGATGAAGAAAAATTTTTCCCTATGCACGGCAATCTAATATTTGGCAAAGAAGGGACAACGGCAAGTAACGCAGAATTAGATAATGTAATGATTACGGATGAAGAAGAGATTCGTACCACCAATCCTGTGGCAACAGAGCAGTATGGAACTGTGGCAAATAACTTGCAGAGCTCAAATACAGCTCCCACGACTGAAACTGTCAATCATCAGGGGGCCTTACCTGGCATGGTGTGGCAAGATCGTGACGTGTACCTTCAAGGACCTATCTGGGCAAAGATTCCTCACACGGATGGACACTTTCATCCTTCTCCTCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAACATCCGCCTCCTCAAATCATGATCAAAAATACTCCGGTACCGGCAAATCCTCCGACGACTTTCAGCCCGGCCAAGTTTGCTTCATTTATCACTCAGTACTCCACTGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAGTGGGAGCTACAGAAAGAAAACAGCAAACGTTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTAGACACTAATGGTGTTTATAGTGAACCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTTACCCGTCCCCTGTAA |
2 | AAV-LK03-R594E+ D598H -VP1 (aa) | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTETVNHQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL |
3 | AAVC11.11 (nt) | ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGCATTCGCGAGTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCTCCACAACCCAAGGCCAACCAACAGCATCAGGACAACGGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACAAGCAGCTCGAGCAGGGGGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCGTCACCTCAGCGTTCCCCCGACTCCTCCACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCCAGAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTAGTGTGGGATCTGGTACAGTGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATTACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGCCAATCAGGAGCTTCAAACGACAACCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATTAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCCCAGTACGGCTACCTAACACTCAACAACGGTAGTCAGGCCGTGGGACGCTCCTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACGGGCAATAACTTTGAGTTCAGCTACAGCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCACACAGCCAGAGCTTGGACCGACTGATGAATCCTCTCATTGACCAGTACCTGTACTACTTATCCAGAACTCAGTCCACAGGAGGAACTCAAGGTACCCAGCAATTGTTATTTTCTCAAGCTGGGCCTGCAAACATGTCGGCTCAGGCCAAGAACTGGCTGCCTGGACCTTGCTACCGGCAGCAGCGAGTCTCCACGACACTGTCGCAAAACAACAACAGCAACTTTGCTTGGACTGGTGCCACCAAATATCACCTGAACGGCAGAAACTCGTTGGTTAATCCCGGCGTCGCCATGGCAACTCACAAGGACGACGAGGACCGCTTTTTCCCATCCAGCGGAGTCCTGATTTTTGGAAAAACTGGAGCAACTAACAAAACTACATTGGAAAATGTGTTAATGACAAATGAAGAAGAAATTCGTCCTACTAATCCTGTAGCCACGGAAGAATACGGGATAGTCAGCAGCAACTTACAAGCGGCTAATACTGCAGCCCAGACACAAGTTGTCAACAACCAGGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACAGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTTATGGGCGGCTTTGGACTCAAGAACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCGGAGTTTTCAGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAGTATTCCACAGGACAAGTGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTATACATCTAACTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTCACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTTACCCGTCCCCTGTAA |
4 | AAVC11.11 (aa) | MAADGYLPDWLEDTLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDKQLEQGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSSVGSGTVAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYSFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTQGTQQLLFSQAGPANMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRNSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKTGATNKTTLENVLMTNEEEIRPTNPVATEEYGIVSSNLQAANTAAQTQVVNNQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL |
5 | AAV2原型蛋白殼-VP1 | MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
6 | AAV1蛋白殼位置248-281 | ALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWG |
7 | AAV2/3b蛋白殼位置248-280 | ALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWG |
8 | AAV7蛋白殼位置249-282 | ALPTYNNHLYKQISSETAGSTNDNTYFGYSTPWG |
9 | AAV8蛋白殼位置249-283 | ALPTYNNHLYKQISSGTSGGATNDNTYFGYSTPWG |
10 | AAV9蛋白殼位置248-282 | ALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWG |
11 | AAV10蛋白殼位置249-283 | ALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWG |
12 | AAV2蛋白殼位置262-271 | SQSGASNDNH |
340 | AAVC11.12 (aa) | MAADGYLPDWLEDTLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDKQLEQGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRILEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSSVGSGTVAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTQGTQQLLFSQAGPANMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRNSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKTGATNKTTLENVLMTNEEEIRPTNPVATEEYGIVSSNLQAANTAAQTQVVNNQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPEVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVSVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL |
本發明之實施例僅藉助於非限制性實例參考以下圖式描述於本文中。
圖 1為不同AAV血清型之蛋白殼VR-I的比對。比對中之第一丙胺酸對應於AAV2中之A248。VR-I跨越AAV2蛋白殼之位置262-271。AAV2之S262對應於AAV1及AAV3b中之S262、AAV9中之N262、AAV7中之S263以及AAV8及AAV10中之N263。因此,VR-I跨越AAV3b蛋白殼之位置262-271、AAV1蛋白殼之位置262-272、AAV9蛋白殼之位置262-273、AAV7蛋白殼之位置263-273及AAV8及AAV10蛋白殼之位置263-274。
圖 2為來自AAV2、AAVC11.11及AAV-LK03-REDH之蛋白殼序列的比對。加陰影、加粗文本表示VR-I,如出於本發明之目的所定義。
圖 3展示來自如實例4中所述之二級庫之變異體之活體內效能(無IVIg預免疫)。(
A)人類肝細胞中之DNA攝取及(
B)人類肝細胞中之cDNA表現(功能性轉導)。n=3隻具有2 BC/蛋白殼之FRG小鼠。變異體如表14、16及19中所展示。
圖 4展示來自如實例4中所述之二級庫之變異體之活體內效能(IVIg預免疫)。(
A)人類肝細胞中之DNA攝取及(
B)人類肝細胞中之cDNA表現(功能性轉導)。n=3隻具有2 BC/蛋白殼之FRG小鼠。變異體如表14、16及19中所展示。
圖 5展示來自如實例4中所述之二級庫之變異體之活體內效能(無IVIg預免疫)。(
A)人類肝細胞中之DNA攝取及(
B)人類肝細胞中之cDNA表現(功能性轉導)。n=3隻具有2 BC/蛋白殼之FRG小鼠。變異體如表15、17、18及20中所展示。
圖 6展示來自如實例4中所述之二級庫之變異體之活體內效能(IVIg預免疫)。(
A)人類肝細胞中之DNA攝取及(
B)人類肝細胞中之cDNA表現(功能性轉導)。n=3隻具有2 BC/蛋白殼之FRG小鼠。變異體如表15、17、18及20中所展示。
TW202325720A_111132048_SEQL.xml
Claims (24)
- 一種包含變異體VR-I之蛋白殼多肽,其中: 該變異體VR-I包含SEQ ID NO: 21至336中之任一者所闡述之序列;及 該蛋白殼多肽包含與以下序列具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列:(i) SEQ ID NO: 2中所闡述之序列;(ii) SEQ ID NO: 2之位置138至735處的胺基酸序列;或(iii) SEQ ID NO: 2之位置203至736處的胺基酸序列。
- 如請求項1之蛋白殼多肽,其中該變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、2074、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
- 一種包含變異體VR-I之蛋白殼多肽,其中: 該變異體VR-I包含SEQ ID NO: 21至336中之任一者所闡述之序列;及 該蛋白殼多肽包含與以下序列具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列:(i) SEQ ID NO: 4中所闡述之序列;(ii) SEQ ID NO: 4之位置138至735處的胺基酸序列;或(iii) SEQ ID NO: 4之位置204至735處的胺基酸序列。
- 如請求項3之蛋白殼多肽,其中該變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、2074、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
- 一種包含變異體VR-I之蛋白殼多肽,其中: 該變異體VR-I包含SEQ ID NO: 21至336中之任一者所闡述之序列;及 該蛋白殼多肽包含與以下序列具有至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列:(i) SEQ ID NO: 340中所闡述之序列;(ii) SEQ ID NO: 340之位置138至735處的胺基酸序列;或(iii) SEQ ID NO: 4之位置204至735處的胺基酸序列。
- 如請求項5之蛋白殼多肽,其中該變異體VR-I包含SEQ ID NO: 253、251、196、274、319、288、194、231、193、266、2074、273、243、286、209、256、310、220、198、283、275、223、212、328、254、67、157、129、64、117、166、45、35、164或32中的任一者所闡述之序列。
- 一種AAV載體,其包含如請求項1至6中任一項之蛋白殼多肽。
- 如請求項7之AAV載體,其進一步包含異源編碼序列。
- 如請求項8之AAV載體,其中該異源編碼序列編碼肽、多肽或聚核苷酸。
- 如請求項9之AAV載體,其中肽、多肽或聚核苷酸為治療性肽、多肽或聚核苷酸。
- 一種核酸分子,其編碼如請求項1至6中任一項之蛋白殼多肽。
- 一種載體,其包含如請求項11之核酸分子。
- 如請求項12之載體,其中該載體係選自質體、黏質體、噬菌體及轉位子之中。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項7至10中任一項之AAV載體、如請求項11之核酸分子或如請求項12或請求項13之載體。
- 一種用於將異源編碼序列引入至宿主細胞中之離體或活體外方法,其包含使宿主細胞與如請求項7至10中任一項之AAV載體接觸。
- 如請求項15之方法,其中該宿主細胞為肝細胞。
- 一種如請求項7至10中任一項之AAV載體之用途,其用於製造用以將異源編碼序列引入至受試者細胞中之組合物。
- 一種用於產生AAV載體之方法,該方法包含在適合於促進包含有包含如請求項1至6中任一項之蛋白殼多肽的蛋白殼之AAV載體的組裝之條件下,培養包含以下之宿主細胞:編碼如請求項1至6中任一項之蛋白殼多肽的核酸分子、AAV rep基因、藉由AAV反向末端重複序列側接之異源編碼序列及用於發生產生性AAV感染之輔助功能,其中該蛋白殼使該異源編碼序列蛋白殼化。
- 如請求項18之方法,其中該宿主細胞為肝細胞。
- 一種用於使人類肝細胞產生展現經增強轉導效率的經修飾AAV載體之方法,其包含: a)識別用於活體內轉導人類肝細胞之參考蛋白殼多肽; b)在相對於SEQ ID NO: 5編號的位置262、263、264、265、266、267、268、269、270及271中之一或多者處修飾該參考蛋白殼多肽之序列,包含相對於SEQ ID NO: 5編號的位置262至271處之SEQ ID NO: 21至336中的任一者所闡述之序列;及 c)使經修飾蛋白殼多肽載體化,藉此產生經修飾AAV載體。
- 如請求項20之方法,其中該參考蛋白殼多肽包含與SEQ ID NO: 2、4或340中所闡述之序列至少或約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。
- 如請求項20或21之方法,其進一步包含在利用人類肝細胞之活體內系統中評定該經修飾AAV載體之轉導效率。
- 如請求項22之方法,其中該活體內系統包含帶有包含人類肝細胞之嵌合肝的較小動物(例如小鼠)。
- 如請求項23之方法,其中該活體內系統包含hFRG小鼠。
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