JP2023543356A - 組成物およびその使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、一般には、ネコ対象を処置するための組成物および方法に関する。ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列を含む核酸分子を含むアデノ随伴ウイルスベクターが提供される。本明細書に開示される別の局面において、本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む単位剤形であって、約１．０×１０９～約５．０×１０９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む単位剤形が提供される。本開示はまた、本明細書に記載される組成物または剤形を含むキットにも及ぶ。

Description

分野
本開示は、一般に、ネコ対象、特に貧血であるか、または貧血になるリスクがあるネコ対象を処置するための組成物および方法に関する。

配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＳＣＴＢ－００８－０１ＷＯ＿ＳＴ２５である。テキストファイルは、１４ＫＢであり、２０２１年９月２４日に作成され、本明細書とともに電子形式で提出されている。

背景
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、ヘマトポエチンまたはヘモポエチンとしても知られており、細胞の低酸素に応答して、主に腎臓の尿細管周囲細胞内で産生されるホルモンである。ＥＰＯは、主に胎児期および周産期には肝臓でも産生されるが、成人期においては腎合成が支配的である。ＥＰＯは骨髄に作用し、赤血球生成を刺激して、正常な赤血球代謝回転（赤血球恒常性）を補償する。エリスロポエチンはまた、成熟赤血球のアポトーシス（プログラム細胞死）を制御する。

腎疾患は典型的にはＥＰＯ産生を低下させる。ヒトでは、慢性腎臓疾患における貧血の管理は、組換えヒトＥＰＯ（エポエチン）の開発によって革新的に変化した。疲労、嗜眠、傾眠および息切れなどの慢性腎臓疾患に起因するとされている症状の多くは、いずれも生活の質に好ましくない影響を及ぼし、貧血が補正されると解消または著しく改善される。ＥＰＯはまた、骨髄形成異常などの他の疾患および化学療法に起因する貧血状態の処置にも使用されている。しかしながら、心筋梗塞、脳卒中および静脈血栓塞栓症を含む、ＥＰＯ療法に伴うリスクが存在する。ＥＰＯ処置が、乱れた赤血球恒常性または赤血球増加症、すなわち、過剰なヘモグロビンレベル（ヒトでは、典型的には、１１～１２ｇ／ｄＬ超）をもたらす場合、これらのリスクは増加し得る。

慢性腎臓疾患に起因する貧血を含む貧血は、ネコを含む動物にも影響を及ぼす。慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）に罹患しているネコは２００万匹を超えて存在しており、ＣＫＤ関連腎不全を有するネコおよびイヌなどの愛玩動物は、通例、不十分なレベルのＥＰＯを少なくとも原因の１つとする貧血を含む、ヒトＣＫＤで見られるものと同様の病態生理学的特徴を呈することが注目される。貧血を有する愛玩動物に対する既存の処置には、ヒト組換えＥＰＯの投与が含まれる。しかしながら、動物は、通例、組換えＥＰＯに対する免疫応答を生じるので、長期処置は一般に無効である。したがって、ＥＰＯの長期送達を必要とする対象における、特にネコに対するＥＰＯの長期送達のための改善された治療レジメンが依然として緊急に必要とされている。

概要
本明細書に開示される局面において、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための方法であって、赤血球恒常性を促進することを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で前記対象に投与され、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、方法が提供される。一実施形態において、用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である。

本開示は、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための医薬の製造における、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で投与するために製剤化されており、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、使用にも及ぶ。一実施形態において、用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である。

本明細書に開示される別の局面においては、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進する上で使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で投与するために製剤化されており、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、医薬組成物が提供される。一実施形態において、用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である。

本明細書に記載される組換えベクターは、慢性腎臓疾患および循環赤血球の不十分な数によって特徴付けられる他の状態（すなわち、貧血）を処置するためのレジメンにおいて使用することができる。

本明細書に開示される別の局面において、本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む単位剤形であって、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む単位剤形が提供される。

本開示はまた、本明細書に記載される組成物または剤形を含むキットにも及ぶ。

本発明の他の局面および利点は、本発明の以下の詳細な説明から容易に明らかである。

図１は、正常な実験用ネコにおけるヘマトクリット（ＨＣＴ）に対するネコＥＰＯ発現ＡＡＶ１（ＡＡＶ１－ＥＰＯ）の効果を示す。１．９×１０^８、６．０×１０^８、１．９×１０^９および６．０×１０^９遺伝子コピー／ｋｇ体重（ｇｃ／ｋｇ；ｎ＝６／投与群）で、ＡＡＶ１－ＥＰＯを投与した。対照動物には、プラセボとしてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を与えた。任意の個々のネコにおけるＨＣＴの最大増加は１５ポイント（％）であった。正常な健康なネコでは、１．９×１０^９および６．０×１０^９ｇｃ／ｋｇの用量は、群平均ＨＣＴの有意で一貫した増加を示した。１．９×１０^８ｇｃ／ｋｇおよび６．０×１０^８は、プラセボと比較した場合、平均ＨＣＴに対して有意な効果を示さなかった。Ｙ軸－ヘマトクリット（ＨＣＴ％）；Ｘ軸－ＡＡＶ１－ＥＰＯの投与後の日数。

図２は、ＣＫＤ関連貧血を有する３匹のネコにおけるヘマトクリット（ＨＣＴ）に対する３．０×１０^９ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ１－ＥＰＯの効果を示す。Ｙ軸－ヘマトクリット（ＨＣＴ％）；Ｘ軸－０日目でのＡＡＶ１－ＥＰＯの投与後の日数。

図３は、約２．０×１０^８～約６．０×１０^８ｇｃ／ｋｇの用量範囲でのＡＡＶ１－ＥＰＯの投与後でのＣＫＤ関連貧血のネコにおける赤血球恒常性を示す。ＡＡＶ１－ＥＰＯによる処置を受けたネコは、赤血球増加症の処置を必要としなかった。Ｙ軸－ヘマトクリットまたは血中血球容積（ＰＣＶ％）；Ｘ軸－０日目（ベースライン）でのＡＡＶ１－ＥＰＯの投与後の日数。^＊ベースラインと比較してｐ＜０．０５（対応のあるＴ検定）；エラーバーは標準偏差を示す；それぞれ、表記の時点でｎ＝１５、１５、１４、１３、１０、９。

図４は、ネコＥＰＯの例示的なアミノ酸配列（配列番号１）を示す。リーダー配列には下線が引かれている。配列番号１のネコＥＰＯプロタンパク質をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列が配列番号２に示されている。ウイルスベクターを作製するための発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに挟まれているネコＥＰＯ構築物配列および他の発現制御配列を含有し、配列番号３に示されている。 図４は、ネコＥＰＯの例示的なアミノ酸配列（配列番号１）を示す。リーダー配列には下線が引かれている。配列番号１のネコＥＰＯプロタンパク質をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列が配列番号２に示されている。ウイルスベクターを作製するための発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに挟まれているネコＥＰＯ構築物配列および他の発現制御配列を含有し、配列番号３に示されている。 図４は、ネコＥＰＯの例示的なアミノ酸配列（配列番号１）を示す。リーダー配列には下線が引かれている。配列番号１のネコＥＰＯプロタンパク質をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列が配列番号２に示されている。ウイルスベクターを作製するための発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに挟まれているネコＥＰＯ構築物配列および他の発現制御配列を含有し、配列番号３に示されている。

図５は、ネコＥＰＯプロタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＮ８５６７０．１）、ニワトリβ－アクチンプロモーターおよび部分的ＣＭＶ前初期エンハンサーをコードするＡＡＶ１－ネコＥＰＯ発現ベクターを示す。発現構築物は、５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれている。次いで、三重形質移入およびイオジキサノール勾配精製によってＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシド中にネコＥＰＯ発現構築物をパッケージングし、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲによって力価を決定した。

図６は、ＳＢ－００１で処置されたネコの生存期間を示す－ステージ４の慢性腎臓疾患の診断から死亡まで（ｎ＝９）。生存期間の中央値は６４日であった。

詳細な説明
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記述することを目的とするものに過ぎず、限定することは意図されていない。別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載される材料および方法と類似または同等の任意の材料および方法を使用することができる。定義および当技術分野の用語、ならびに当業者に公知の他の方法については、実施者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５）Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：７９－８７を参照し得る。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、基準の分量、レベル、値、寸法、サイズまたは量に対して最大１０％（例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）変化する分量、レベル、値、寸法、サイズまたは量を指す。

本明細書全体を通じて、文脈上別段の必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、挙げられた要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を包含することを意味するが、任意の他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を除外することを意味しないことが理解される。

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、「からなる」という語句に続くものは全て含み、それに限定されることが意味される。従って、「からなる」という語句は、列記された要素が必要とされるまたは必須であること、他の要素は存在し得ないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、その語句の後に列記された全ての要素を含み、列記された要素に対して本開示中で指定された活性または作用を妨害せずまたはその活性または作用に寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、「から本質的になる」という語句は、列記された要素が必要とされるまたは必須であること、但し、他の要素は任意であり、他の要素が列記された要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて、存在し得、または存在し得ないことを示す。

本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の指示をしなければ、複数の局面を含む。例えば、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」への言及は、単一のベクター、ならびに２またはそれを超えるベクターを含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、１つの細胞ならびに２またはそれを超える細胞を含む、などである。

ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列識別子番号（配列番号）によって参照される。配列番号は、配列識別子＜４００＞１、＜４００＞２などに数値的に対応する。配列識別子の概要は本明細書中に提供されている。

本発明は、少なくとも一部には、組換えネコＥＰＯの発現を駆動するように適合されており、さもなければ、健康なネコ対象においてヘマトクリットまたは血中血球容積を増加させるのに十分であるアデノウイルスベクターの用量が、予想外なことに、貧血を有するネコ対象にとって有害または致命的であるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。本発明者らは、健康なネコ対象においてヘマトクリットまたは血中血球容積を増加させることが予想されないより低い用量で、ネコＥＰＯ発現アデノウイルスベクターが貧血ネコ対象に投与される場合、それにもかかわらず、赤血球恒常性が貧血ネコ対象において回復され得ることを予想外にも見出した。有利なことに、本発明者らはまた、本明細書に記載される低用量処置レジメンが貧血動物における赤血球増加症のリスクを最小限に抑えることも見出した。

したがって、本明細書に開示される局面において、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための方法であって、赤血球恒常性を促進することを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で前記対象に投与され、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、方法が提供される。

赤血球恒常性
「赤血球恒常性」という語句は、本明細書で使用される場合、その種の健康な対象についての許容され得るまたは正常な限界の範囲内であると理解される、対象における循環赤血球のレベルの生理学的維持を指す。例えば、ネコ対象では、循環赤血球の正常レベルは、典型的には約２８．２％～約５０％（ヘマトクリットまたは血中血球容積）の範囲内である。

ヘマトクリットは、平均赤血球容積（ＭＣＶ）と赤血球（ＲＢＣ）数の積として計算され、いずれも適切な分析装置によって直接測定することができ、ＨＣＴ＝（ＭＣＶ×ＲＢＣ数）÷１０である。ＭＣＶ（例えば、ＲＢＣの貯蔵は、ＲＢＣの膨潤をもたらし、増加したＭＣＶを伴い得る。）またはＲＢＣ数（例えば溶血）を誤って増加または減少させ得る要因は、ＨＣＴに影響を及ぼし得るが、必ずしもＰＣＶには影響を及ぼさない。血中血球容積（ＰＣＶ）は、典型的には、マイクロヘマトクリット遠心機において、マイクロヘマトクリット管内の血液試料を遠心分離することにより測定され、遠心分離後のマイクロヘマトクリット管内の赤血球柱の高さを、試料の全高のパーセンテージとして求める。ＨＣＴとは異なり、ＰＣＶ測定は、血漿捕捉および赤血球が柱内でどのように塊になっているかによって影響を受けることがあり得る。ＨＣＴおよびＰＣＶはいずれも、血液の％として表される（ＳＩ単位は、典型的にはＬ／Ｌである）、すなわち、％÷１００＝Ｌ／Ｌ。正常な（健康な）ネコ対象におけるＨＣＴ／ＰＣＶ値の様々な報告が存在するが、それらの値は典型的には約２８．２％～約５０％の範囲である。対照的に、貧血ネコ対象は、典型的には、２８．２％未満のＨＣＴ／ＰＣＶを有する。

貧血は、典型的には、赤血球またはヘモグロビンの数または質の欠乏として定義される。貧血は、いくつかの異なる因子によって引き起こされ、その例には、失血（例えば、外傷および胃腸出血）、赤血球産生の減少（例えば、鉄欠乏、ビタミンＢ１２欠乏、栄養不良、サラセミアおよび骨髄の新生物）、および赤血球破壊の増加（例えば、凝固疾患、寄生虫感染症（例えば、ノミ、ダニ、鉤虫、マイコプラズマ・ヘモフェリス（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ））および自己免疫疾患などの遺伝的状態）が含まれる。本明細書に開示される一実施形態において、ネコ対象が、約２９％未満、好ましくは約２８．２％未満のＰＣＶのヘマトクリットまたは血中血球容積を有する場合に、ネコ対象は貧血性として（すなわち、貧血を有するものとして）特徴付けられる。一実施形態において、貧血を有するネコ対象は、約２８％またはそれ未満のＰＣＶを有する。さらに別の実施形態において、貧血を有するネコ対象は、約１０％～約２８％の範囲のＰＣＶを有する。一実施形態において、貧血を有するネコ対象は、約２２％～約２８％の範囲のＰＣＶを有する。一実施形態において、貧血を有するネコ対象は、約２２．５％のＰＣＶを有する。

一実施形態において、貧血は、少なくとも一部には、薬物治療の使用に起因し、その実例には、化学療法を含む、ＦＩＶ／ネコＡＩＤＳ処置およびがん治療が含まれる。一実施形態において、貧血は、少なくとも一部には、医学的状態に起因し、その実例には、がん、ＦＩＶ／ＡＩＤＳ、関節リウマチ、クローン病ならびに他の慢性炎症性疾患および機能不全骨髄（例えば、再生不良性貧血、白血病、骨髄形成異常または骨髄線維症）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害およびリンパ腫、溶血性貧血、鎌状赤血球貧血およびサラセミアが含まれる。一実施形態において、貧血は慢性腎臓疾患に起因する。一実施形態において、貧血は慢性腎臓疾患と関連する。

いくつかの実施形態において、例えば、ネコ対象が貧血状態を促進する可能性がある疾患または状態と診断されているが、それ以外には正常範囲内のＨＣＴ／ＰＣＶを有する場合、貧血を発症するリスクがあるネコ対象を処置することが望ましいことがあり得る。それらの状況では、貧血を予防するために、またはネコ対象が貧血になった際に赤血球恒常性を回復するために、本明細書に記載される方法が使用され得る。したがって、貧血を発症するリスクがあるネコ対象における赤血球恒常性を促進するための方法であって、赤血球恒常性を促進することを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で前記対象に投与され、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、方法も本明細書において想定される。

ＡＡＶベクターの投与後に、その種の健康な対象にとって許容され得るまたは正常な範囲内の値への、対象におけるＨＣＴ／ＰＶＣの増加が存在する場合に、本明細書に記載される方法は、ネコ対象における赤血球恒常性を促進した（すなわち、回復した）ことが当業者によって理解される。

一実施形態において、用量は、組成物の投与後７０日目までに、ネコ対象におけるＰＣＶを約５～約３０ ＰＣＶポイント増加させるのに有効である。別の実施形態において、用量は、組成物の投与後７０日目までに、ネコ対象におけるＰＣＶを約１０～約２０ ＰＣＶポイント増加させるのに有効である。さらに別の実施形態において、用量は、組成物の投与後７０日目までに、ネコ対象におけるＰＣＶを約１５ＰＣＶポイント増加させるのに有効である。

一実施形態において、用量は、組成物の投与後７０日目までに、ネコ対象におけるＰＣＶを約３０％～約５５％の値に増加させるのに有効である。別の実施形態において、用量は、組成物の投与後７０日目までに、ネコ対象におけるＰＣＶを約３０％～約３５％の値に増加させるのに有効である。さらに別の実施形態において、用量は、組成物の投与後７０日目までに、ネコ対象におけるＰＣＶを約３３％～約３５％の値に増加させるのに有効である。

本明細書の他の箇所で述べたように、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載される投与レジメンが赤血球増加症（過剰なまたは異常に高い赤血球レベル）を回避しながら赤血球恒常性を促進するか、またはそうでなければ回復させることを見出した。したがって、一実施形態において、ネコ対象は、組成物の投与後７０日目までに赤血球増加症を発症しない。別の実施形態において、ネコ対象は、赤血球増加症に対する処置を必要としない、好ましくは、組成物の投与後７０日目までに赤血球増加症に対する処置を必要としない。

一実施形態において、組成物は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の単位用量としてネコ対象に筋肉内投与される。一実施形態において、組成物は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の単位用量としてネコ対象に筋肉内投与される。一実施形態において、組成物は、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量としてネコ対象に筋肉内投与される。一実施形態において、組成物は、約１．２×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量としてネコ対象に筋肉内投与される。

本開示は、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための医薬の製造における、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で投与するために製剤化されており、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、使用にも及ぶ。一実施形態において、用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である。一実施形態において、組成物は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。一実施形態において、組成物は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。一実施形態において、組成物は、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。
一実施形態において、組成物は、約１．２×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。

本明細書に開示される別の局面においては、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進する上で使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で投与するために製剤化されており、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、医薬組成物が提供される。一実施形態において、用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である。一実施形態において、組成物は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。一実施形態において、組成物は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。一実施形態において、組成物は、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。一実施形態において、組成物は、約１．２×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量としてネコ対象への筋肉内投与のために製剤化される。

本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する方法であって、ＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象に約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象に約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量で筋肉内に投与される、方法が提供される。

本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置するための医薬の製造におけるＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象への約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象への約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での筋肉内投与のために製剤化されている、使用が提供される。

本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する上で使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、ＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象への約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象への約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での筋肉内投与のために製剤化されている、医薬組成物が提供される。

本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する方法であって、ＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象に約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象にそれぞれが約３．６５×１０^９ゲノムコピーを含む２つの用量の形態で投与される約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量で筋肉内に投与される、方法が提供される。

本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置するための医薬の製造におけるＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象への約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象への、それぞれが約３．６５×１０^９ゲノムコピーを含む２つの用量の形態で投与される約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での筋肉内投与のために製剤化されている、使用が提供される。

本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する上で使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、ＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象への約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象への、それぞれが約３．６５×１０^９ゲノムコピーを含む２つの用量の形態で投与される約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での筋肉内投与のために製剤化されている、医薬組成物が提供される。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）
ＥＰＯは、主に腎臓で産生される糖タンパク質ホルモンである。ヒトＥＰＯは極度にグリコシル化されており、約３０ ｋＤａの分子量を有し、分子量の４０％はその炭水化物成分に由来する。ＥＰＯは、未だヘモグロビンを合成し始めていないＥＰＯ依存性赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ－Ｅ）細胞および赤芽球の生存を促進する。リガンドが結合すると、固有の触媒機能を欠き、低酸素誘導性であるＥＰＯ受容体（ＥｐｏＲ）は、チロシンキナーゼヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）と会合し、次にＥｐｏＲをリン酸化し、ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインを含有するシグナル伝達タンパク質のための複数のドッキング部位を提供する。ＥｐｏＲでのシグナル伝達は、シグナル伝達および転写活性化因子（ＳＴＡＴ）５経路、ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ／プロテインキナーゼＢ（ＰＩ－３Ｋ／ＡＫＴ）およびマイトジェン関連プロテインキナーゼ／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路、ならびにプロテインキナーゼＣを含む複数の経路を介して起こる。組織酸素化がＥＰＯ産生を制御し、ＥＰＯが赤血球（ＲＢＣ）産生を制御する負のフィードバックシステムは、体組織への酸素送達の恒常性を提供する（Ｋｏｕｒｙ ａｎｄ Ｂｏｎｄｕｒａｎｔ，１９９１；Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．；１８（４ Ｓｕｐｐｌ １）：２０－３）。ＥＰＯは初期赤血球前駆細胞における有糸分裂に対していくらかの効果を有し得るが、赤血球産生のその制御は、赤血球細胞発達の後期段階において起こるようであり、この段階で、ＥＰＯはプログラム細胞死を防ぐ。

２０１３年の論文”Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．；３（３）：ａ０１１６１９）においてＨ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｂｕｎｎによって指摘されているように、赤血球生成は、通常、ヒトおよび他の哺乳動物において低い基底速度で進行し、老化した赤血球を若い網状赤血球で置き換える。ヒトでは、赤血球産生は、出血、溶血、および動脈血の酸素化または組織への酸素の送達を損なう他の種類のストレスを含む様々な臨床状況において、ベースライン速度の８倍も高められ得る。胎児の発育中、ＥＰＯは主に肝臓で産生されるが、出生後、腎臓はＥＰＯ産生の約８０％を占める。

ヒトＥｐｏメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、１９３残基のポリペプチドをコードする。小胞体内でのカノニカルリーダー配列の切断および翻訳後グリコシル化に続いて、１６６残基のポリペプチドが放出される。ｒｈＥｐｏの一次構造は、Ｃ末端のアルギニン残基のインビボ翻訳後切断を除いて、内因性ホルモンの一次構造と同一であることが示された。ＥＰＯは、血漿中で約７～８時間の血漿半減期で循環し、骨髄中の赤血球前駆細胞（ＣＦＵｅ）の表面上に比較的少数（約１０００個／細胞）で存在する高親和性（約１００ｐＭ）受容体に結合する。

ＥＰＯは、異なる種にわたって相同性を共有するリーダー配列を有するプロペプチドまたは前駆体タンパク質としてインビボで発現される（例えば、Ｗｅｎら（１９９３），Ｂｌｏｏｄ，８２（５）：１５０７－１５１６を参照）。ネコＥＰＯのアミノ酸およびヌクレオチド配列は当業者によく知られており、その実例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００９２６９、Ｕ００６８５、ＡＦＮ８５６７０、ＡＡＡ１８２８２、Ｗｅｎら（１９９３，Ｂｌｏｏｄ，８２（５）：１５０７－１５１６）、Ｗａｌｋｅｒら（２００５，ＡＪＶＲ，６６（３）：４５０－４５６）、Ｂｅａｌｌら（２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：５３４－５３９）および国際公開第２０１７／０４０５２４号に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

一実施形態において、ネコＥＰＯをコードする核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になるネコＥＰＯプロタンパク質をコードする。配列番号１の配列のネコＥＰＯプロタンパク質が図４に示されており、成熟ネコＥＰＯタンパク質は配列番号１のアミノ酸位置２７で開始することが注目される。

一実施形態において、ネコＥＰＯは、配列番号２の核酸配列またはこれと少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列（nucleotide acid sequence）を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる核酸配列によってコードされる。

一実施形態において、ウイルスベクターを作製するための発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに挟まれているネコＥＰＯ構築物配列と、配列番号３の核酸配列を含む、配列番号３の核酸配列からなる、または配列番号３の核酸配列から本質的になる他の発現制御配列とを含有する。

一実施形態において、配列番号３の核酸配列またはこれと少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる核酸配列によってコードされる発現カセット。

一実施形態において、ネコＥＰＯは完全長ネコＥＰＯタンパク質である。「完全長」とは、本明細書に記載される核酸配列によってコードされるネコＥＰＯが、天然のネコＥＰＯタンパク質と、すなわち、天然に存在するネコＥＰＯタンパク質と１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むことを意味する。

ネコＥＰＯの機能的バリアントも本明細書で企図される。本明細書で使用される場合、「機能的バリアント」という用語は、天然のネコＥＰＯと少なくともいくらかの配列同一性を共有しながら、インビボで赤血球産生を増加させる能力などの、通例、天然のネコＥＰＯタンパク質に属する生物学的活性、の少なくともいくつかも保持するアミノ酸配列を指す。したがって、機能的バリアントは、天然のネコＥＰＯタンパク質の機能的断片にまで適切に及び得る。本明細書に記載されるネコＥＰＯの機能的バリアントを同定する方法は当業者によく知られており、その実例は本明細書の他の箇所に記載されている。

一実施形態において、ＥＰＯの機能的バリアントには、野生型配列の機能を保持する、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知のＥＰＯ核酸またはアミノ酸配列からの最大約１０％の変動を含み得るバリアントが含まれる。本明細書で使用される場合、「機能を保持する」とは、核酸またはアミノ酸が、必ずしも同じレベルの発現または活性ではないが、野生型配列と同じように機能することを意味する。例えば、一実施形態において、機能的バリアントは、野生型配列と比較して発現または活性の増加を有する。別の実施形態において、機能的バリアントは、野生型配列と比較して発現または活性の減少を有する。一実施形態において、機能的バリアントは、野生型配列と比較して、発現または活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超える増加または減少を有する。

別の実施形態において、ＥＰＯの機能的バリアントには、野生型配列の機能を保持する、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知のＥＰＯ核酸またはアミノ酸配列からの最大約２０％の変動を含み得るバリアントが含まれる。一実施形態において、ＥＰＯの機能的バリアントには、野生型配列の機能を保持する、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知のＥＰＯ核酸またはアミノ酸配列からの最大約３０％の変動を含み得るバリアントが含まれる。

一実施形態において、ネコＥＰＯは、配列番号１のアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％もしくは好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらのアミノ酸配列からなるか、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

一実施形態において、ネコＥＰＯ配列は、配列番号２の核酸配列、またはこれと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％もしくは好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。

一実施形態において、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに挟まれているネコＥＰＯ構築物配列および他の発現制御配列を含有するウイルスベクターを作製するための発現カセットは、配列番号３の核酸配列、またはこれと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％もしくは好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。

本明細書で使用される場合、「コードする」、「コードしている」などの用語は、核酸が別の核酸またはポリペプチドを提供する能力を指す。例えば、典型的には宿主細胞において、ポリペプチドを産生するために、核酸配列が転写および／もしくは翻訳されることができる場合、またはポリペプチドを産生するために転写および／もしくは翻訳されることができる形態に核酸配列がプロセシングされることができる場合、核酸配列は、ポリペプチドを「コードする」と称される。このような核酸配列は、コード配列またはコード配列と非コード配列の両方を含み得る。したがって、「コードする」、「コードしている」などの用語は、ＤＮＡ分子の転写から生じるＲＮＡ産物、ＲＮＡ分子の翻訳から生じるタンパク質、ＲＮＡ産物を形成するためのＤＮＡ分子の転写およびＲＮＡ産物のその後の翻訳から生じるタンパク質、またはＲＮＡ産物を提供するためのＤＮＡ分子の転写、プロセシングされたＲＮＡ産物（例えば、ｍＲＮＡ）を提供するためのＲＮＡ産物のプロセシングおよびプロセシングされたＲＮＡ産物のその後の翻訳から生じるタンパク質を含む。

「少なくとも７０％」への言及は、最適な整列または最適合分析後における、配列番号１、２および３を含む列挙された配列の任意の１つに対する、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズムのコンピュータ化された実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査および当業者に公知の任意の適切な方法によって生成された最良の整列（すなわち、比較ウィンドウにわたって最大相同性パーセントをもたらす）によって実施され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照され得る。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９４－１９９８）：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．のユニット１９．３にも見出すことができる。

本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、配列が比較のウィンドウにわたってヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同一であるまたは構造的に類似している程度を指す。例えば、２またはそれを超えるペプチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一性は、２つの整列された配列間の完全一致の数を短い方の配列の長さで割って１００を掛けたものとして記載され得る。核酸配列のおよその整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３（１９８６）によって標準化されたスコアリングマトリックスを使用してペプチド配列とともに使用するように拡張することができる。２またはそれを超えるアミノ酸配列の整列を実施し、それらの配列同一性または相同性を決定するための適切な方法およびコンピュータプログラムは、当業者に周知である。例えば、２つのアミノ酸配列の同一性または類似性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡまたはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して容易に計算することができる。従って、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較すること、一致した位置の数を得るために、両配列中で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が生じる位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって除すること、および配列同一性のパーセンテージを得るために結果に１００を乗じることによって計算され得る。例えば、「配列同一性」は、ソフトウェアに付随する参照マニュアルにおいて使用される標準的なデフォルトを使用してＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）によって計算された「一致率」である。

本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで比較される配列間での正確な同一性を含む。本明細書に記載される配列同一性は、典型的には、最大相同性パーセントを達成するために配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後における、配列同一性の一部として一切の保存的置換を考慮しない、対応するペプチド配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージに関する。Ｎ末端またはＣ末端伸長および挿入はいずれも、配列同一性または相同性を低下させると解釈されてはならない。

本開示はまた、配列間の任意の差異（複数可）が、それにもかかわらず構造的、機能的、生化学的および／または立体構造レベルで互いに関連するアミノ酸（またはヌクレオチドの文脈では、前記ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸）に関連するヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの配列の非正確な同一性（すなわち、類似性）にも及ぶ。例えば、アミノ酸レベルで非同一性（類似性）が存在する場合、「類似性」は、それにもかかわらず構造、機能、生化学および／または立体構造レベルで互いに関連するアミノ酸を含む。一実施形態において、ヌクレオチドおよび配列の比較は、類似性ではなくむしろ同一性のレベルで行われる。例えば、イソロイシンまたはバリン残基はロイシンに置き換えられ得る。これは保存的置換と称され得る。一実施形態において、非修飾ポリペプチドと比較したときに、修飾が、修飾されたポリペプチドの機能的活性に対して影響を有しないか、または影響が無視できるように、アミノ酸配列は、その中に含まれるアミノ酸残基のいずれかの保存的置換によって修飾され得る。

本明細書に開示される一実施形態において、核酸配列はコドン最適化されている。

一実施形態において、ネコＥＰＯは、ネコＥＰＯタンパク質と少なくとも７０％の配列同一性を有し、野生型ネコＥＰＯタンパク質の機能と同じまたは実質的に同じ機能をなお保持する機能的バリアントを含むか、このような機能的バリアントからなるか、またはこのような機能的バリアントから本質的になる。ネコＥＰＯバリアントが基礎とする配列は、いくつかの実施形態においては、（例えば、配列番号１；図４に示されているように）プロペプチドリーダー配列を含み得る。別の実施形態において、本明細書に記載されるネコＥＰＯバリアントは、成熟ペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸残基２７～１９２）のみを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。本明細書で使用される場合、「機能を保持する」という用語は、機能的バリアントが野生型ネコＥＰＯタンパク質と同じようにまたは実質的に同じように機能することを意味するが、必ずしも同じレベルの発現または活性であるとは限らない。例えば、機能的バリアントは、野生型ネコＥＰＯタンパク質と比較して発現または活性の増加を有し得る。あるいは、機能的バリアントは、野生型ネコＥＰＯ配列と比較して発現または活性の減少を有し得る。一実施形態において、機能的バリアントは、野生型ネコＥＰＯタンパク質の発現または活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％を有する。

本明細書に開示される一実施形態において、ネコＥＰＯをコードする核酸配列は、異種のリーダー配列を含む。「異種」という用語は、アミノ酸または核酸配列に関して使用される場合、典型的には、アミノ酸または核酸配列が、自然界では互いに対して同じ関係で見出されない２またはそれを超える配列または部分配列を含むことを示す。例えば、発現カセットは、典型的には組換え産生され、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係な遺伝子由来の２またはそれを超える配列を有する。一実施形態において、リーダー配列は、異なる遺伝子、すなわち、ＥＰＯをコードする遺伝子以外に由来し得る。別の実施形態において、リーダー配列は、ネコ以外の種に由来する。適切なリーダー配列は当業者によく知られており、その実例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ１８）、免疫グロブリン、インスリン、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドのシグナル配列、または組織特異的分泌タンパク質由来の配列が挙げられる。一実施形態において、リーダー配列は、ＩＬ－２シグナルペプチド（例えば、配列番号４：Ｍ Ｙ Ｒ Ｍ Ｑ Ｌ Ｌ Ｓ Ｃ Ｉ Ａ Ｌ Ｓ Ｌ Ａ Ｌ Ｖ Ｔ Ｎ Ｓ）をコードする。一実施形態において、リーダー配列は、ＥＰＯプロペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸残基１～２６）由来の内因性リーダー配列である。

「由来する」または「に由来する」という用語は、本明細書では互換的に使用され、配列（アミノ酸またはヌクレオチド配列）がネコ対象から供給されるか、またはネコ対象から供給されたタンパク質またはヌクレオチド配列と同じ配列を共有することを意味する。例えば、ネコ「に由来する」プロペプチド配列は、ネコで発現されるのと同じプロペプチド配列と同じ配列（または本明細書で定義されるその機能的バリアント）を共有し得る。しかしながら、特定の核酸またはアミノ酸は、実際にネコから供給される必要はない。類似のタンパク質（例えば、相同体）の変異誘発または核酸もしくはアミノ酸配列の人工的（組換え）産生を含む、所望の配列を産生するために使用することができる様々な技術が当業者に公知である。生成された核酸またはアミノ酸は、典型的には、生成された配列の実際の供給源にかかわらず、生成された核酸またはアミノ酸が由来する種において同じ核酸またはアミノ酸の同じまたは実質的に同じ機能を保持する。

本開示はまた、野生型ネコＥＰＯ配列（例えば、配列番号１）に対して１またはそれを超えるアミノ酸置換が行われたネコＥＰＯの機能的バリアントにも及ぶ。一実施形態において、１またはそれを超えるアミノ酸置換は、１またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含み、その実例は本明細書の他の箇所に記載されている。

「アミノ酸置換」などの用語は、アミノ酸を別の置換するアミノ酸残基で置き換えることによるアミノ酸配列の改変を包含することが意図される。置換は、本明細書の他の箇所に記載されているように、保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、置換は、非保存的置換であり得る。２つのアミノ酸に言及する場合、「保存的」という用語は、それらのアミノ酸が当業者によって認識される共通の特性を共有することを意味することが意図される。例えば、疎水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性酸性側鎖を有するアミノ酸および親水性塩基性側鎖を有するアミノ酸。共通の特性はまた、疎水性側鎖を有するアミノ酸、脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性中性側鎖を有するアミノ酸、帯電した側鎖を有するアミノ酸、帯電した酸性側鎖を有するアミノ酸および帯電した塩基性側鎖を有するアミノ酸であり得る。天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方が当技術分野で公知であり、複数の実施形態において置換アミノ酸として使用され得る。アミノ酸を置き換えるための方法は当業者に周知であり、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異が含まれるが、これに限定されない。

本明細書における「１またはそれを超える」への言及は、例えば、１、２、３、４、５、６またはそれを超える個々の実施形態を包含することが意図される。

本明細書の他の箇所で述べたように、ネコＥＰＯをコードする核酸配列はコドン最適化され得る。例えば、ネコＥＰＯペプチドの機能的バリアントが所望される場合、これらの機能的バリアントのコード配列は、野生型核酸配列の部位特異的変異誘発を使用して生成され得る。アミノ酸配列を、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡの両方を含む核酸コード配列に逆翻訳するために、ウェブベースまたは市販のコンピュータプログラム、およびサービスベースの会社が使用され得る。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／；Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ－／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照のこと。一実施形態において、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡコード配列は、本明細書で考察されているように、最終的に投与が意図される対象種における最適な発現のために設計される。したがって、一実施形態において、コード配列は、ネコにおける最適な発現のために設計される。

コード配列は、コドン最適化を使用して、最適な発現のために設計され得る。コドン最適化されたコーディング領域は、様々な異なる方法によって設計され得る。この最適化は、オンラインで利用可能な方法、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社を使用して実施され得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際特許公開第２０１５／０１２９２４号に記載されている。簡潔には、産物をコードする核酸配列は、同義コドン配列で修飾される。適切には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変される。しかしながら、いくつかの実施形態においては、ＯＲＦの断片のみが変更され得る。これらの方法の１つを使用することにより、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、そのポリペプチドをコードするコドン最適化されたコード領域の核酸断片を産生することができる。

一実施形態において、ＥＰＯをコードする核酸配列は、記載される配列と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む、本明細書に記載されるＥＰＯペプチドのいずれかをコードするコドン最適化された配列である。一実施形態において、核酸配列は、投与が所望される対象における発現のためにコドン最適化されている。

アデノ随伴ウイルスベクター
ネコＥＰＯ発現構築物を運搬するアデノ随伴ウイルスベクターは、ネコ対象における使用のために開発された。治療剤としての組換えネコＥＰＯタンパク質の開発および製造は、罹患した動物中での組換えＥＰＯの発現のためのウイルスベクター媒介系と比較すると、法外な費用がかかるであろう。組換えＥＰＯタンパク質の反復投与が必要とされるのとは対照的に、ウイルスベクター治療薬は、対象を処置するために単回投与のみまたはより少ない数の投与が必要とされ得る限りにおいて、利便性という利点も有し、それによって生活の質をさらに改善する。本明細書に記載されるＥＰＯ構築物は、処置されるべきネコ対象に天然に存在するＥＰＯ配列を適切に提供するが、これは、典型的には、対象が非天然ＥＰＯタンパク質に対する免疫応答を生じるリスクを低減するか、または回避するためである。

互換的に使用される「ベクター」および「構築物」とは、ネコＥＰＯをコードする核酸配列がその中に挿入またはクローニングされ得る核酸分子、好ましくは例えばプラスミド、バクテリオファージまたはウイルスに由来するＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、好ましくは、１またはそれを超える固有の制限部位を含有し、標的細胞もしくは組織もしくはこれらの前駆細胞もしくは組織を含む所定の宿主細胞中で自律複製することが可能であり得る、またはクローニングされた配列が複製可能であるように所定の宿主のゲノムに組み入れ可能であり得る。したがって、ベクターまたは構築物は、自律的に複製するベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）であり得、その複製は染色体の複製とは独立している（例えば、直鎖もしくは閉環状プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体または人工染色体）。ベクターは、自己複製を確保するための任意の手段を含有し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、ゲノム中に組み込まれ、ベクターがその中に組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、宿主細胞のゲノム中に導入されるべき全ＤＮＡを一緒に含有する２もしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターがその中に導入されるべき宿主細胞との、ベクターの適合性に依存する。ベクターはまた、適切な形質転換体の選択のために使用することができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含み得る。そのような耐性遺伝子の例は、当業者によく知られている。

一実施形態において、ベクターは、対象における組換えネコＥＰＯの持続的発現を可能にする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス科のメンバーであり、約５，０００ヌクレオチド未満の直鎖一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との共感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与のために使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、ＤＮＡ複製およびパッケージングのための認識シグナルを含有する末端反復配列（ＩＴＲ）のみが残るように、親ゲノムの約９６％が欠失している。これにより、ウイルス遺伝子の発現による免疫学的または毒性の副作用が排除される。さらに、特定のＡＡＶタンパク質を産生細胞に送達することにより、所望であれば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むＡＡＶベクターを細胞ゲノムの特定の領域中に組み込むことが可能になる（例えば、米国特許第６，３４２，３９０号および同第６，８２１，５１１号を参照されたい。）。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞成長や形態の変化を示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号を参照されたい。）。

ＡＡＶ ＩＴＲは、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造キャプシド（Ｃａｐ）タンパク質（ビリオンタンパク質（ＶＰ）としても知られる）のためのユニークなコードヌクレオチド配列に隣接している。末端の１４５ヌクレオチドは自己相補的であり、Ｔ字形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように編成されている。これらのヘアピン構造は、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体に対するプライマーとして働くことによって、ウイルスＤＮＡ複製のための起点として機能する。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８はｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ ５２およびＲｅｐ４０はｐ１９プロモーターから転写される。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質は、ＡＡＶ末端の分離を可能にするために、生産的複製中にヘリカーゼおよびニッカーゼ機能を果たす多機能ＤＮＡ結合タンパク質である（例えば、Ｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６１：４４７－５７（１９９０）を参照されたい。）。これらのタンパク質はまた、内因性ＡＡＶプロモーターおよびヘルパーウイルス内のプロモーターからの転写を調節する（例えば、Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１０７９－１０８８（１９９７）を参照されたい。）。他のＲｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の機能を改変する。ｃａｐ遺伝子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。

１またはそれを超える調節配列に作動可能に連結された、本明細書に記載されるＥＰＯ分子をコードする核酸配列を含む発現構築物も本明細書に開示される。

本明細書で使用される場合、用語「ＥＰＯ構築物」、「ＥＰＯ発現構築物」および同義語は、本明細書中に記載されるようなＥＰＯ配列を含む。用語「ＥＰＯ構築物」、「ＥＰＯ発現構築物」およびその同義語は、ＥＰＯ（内因性または異種のリーダーを有するＥＰＯ成熟タンパク質またはプロペプチドを含む）をコードする核酸配列またはその発現産物を指すために使用され得る。

「構築物」という用語はまた、異なる供給源からの１またはそれを超える単離された核酸配列を含む組換え遺伝的分子を意味すると理解される。したがって、構築物は、異なる起源の２またはそれを超える核酸配列が単一の核酸分子に組み立てられたキメラ分子であり、（１）天然には一緒に見られない調節配列およびコード配列（すなわち、ヌクレオチド配列の少なくとも１つは、その他のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して異種である）を含む核酸配列、または（２）天然には隣接していない機能的ＲＮＡ分子もしくはタンパク質の一部をコードする配列、または（３）天然には隣接していないプロモーターの一部を含有する任意の構築物を含む。代表的な構築物には、任意の源に由来し、ゲノム組み込みまたは自律的複製が可能であり、１またはそれを超える核酸分子が作動可能に連結された核酸分子を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製するポリヌクレオチド分子、ファージ、または直鎖もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸分子などの任意の組換え核酸分子が含まれる。適切な構築物は、一般に、例えば標的核酸配列または修飾因子核酸配列など、同じく構築物中に含有される関心対象の核酸配列の発現を指示するために必要なエレメントを含む。このようなエレメントは、関心対象の核酸配列に（その転写を指示するように）作動可能に連結されたプロモーターなどの制御エレメントまたは調節配列を含み得、しばしばポリアデニル化配列も含む。本発明の特定の実施形態では、構築物はベクター内に含有され得る。構築物の成分に加えて、ベクターは、例えば、１もしくはそれを超える選択可能なマーカー、１もしくはそれを超える複製起点、例えば原核生物および真核生物の起点、少なくとも１つの多重クローニング部位、ならびに／または宿主細胞のゲノム中への構築物の安定な組み込みを促進するための要素を含み得る。２もしくはそれを超える構築物は、単一のベクターなどの単一の核酸分子内に含有されることができ、または２もしくはそれを超える別個のベクターなどの２もしくはそれを超える別個の核酸分子内に含有されることができる。「発現構築物」は、一般に、関心対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つの制御配列を含む。このようにして、例えば、発現されるべきヌクレオチド配列と動作可能に接続するプロモーターが、生物または宿主細胞を含むその一部における発現のために発現構築物中に提供される。本発明の実施のために、構築物および宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法は、当業者に周知である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅｓ １，２，ａｎｄ ３．Ｊ．Ｆ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ Ｎ．Ｉｒｗｉｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照されたい。

本明細書で使用される「制御エレメント」、「制御配列」、「調節配列」などは、特定の宿主細胞中での作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を意味する。原核細胞に適した制御配列には、例えば、プロモーター、ならびに必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位などのシス作用配列が含まれる。真核細胞に適した制御配列には、転写制御配列、例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳制御配列、例えば翻訳エンハンサーおよび配列内リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、ｍＲＮＡ安定性を調節する核酸配列、ならびに転写されたポリヌクレオチドによってコードされる産物を細胞内の細胞内区画または細胞外環境に標的とする標的化配列が含まれる。

一実施形態において、本明細書に記載されるネコＥＰＯ構築物をコードする核酸配列は、任意の適切な遺伝子エレメントへと操作され、その実例には、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡを運搬するナノ粒子、パッケージング宿主細胞中のウイルスベクターを生成するために、および／または対象中の宿主細胞への送達のために、その上で運搬されるＥＰＯ配列を宿主細胞に導入する、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、エピソームなどが含まれる。一実施形態において、遺伝子エレメントはプラスミドである。選択された遺伝子エレメントは、当業者に公知の任意の適切な方法によって送達され得、その実例としては、形質移入、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合が挙げられる。このような構築物を作製するために使用される方法はまた、核酸操作の当業者によく知られており、その実例には、遺伝子操作、組換え操作および合成技術が含まれる。例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられるＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「発現構築物」は、ネコＥＰＯのコード配列、プロモーターを含み、これらに対する他の調節配列を含み得る核酸分子を指し、そのカセットは遺伝子エレメントへと操作され得る、および／またはウイルスベクターのキャプシド（例えば、ウイルス粒子）へとパッケージングされ得る。典型的には、ウイルスベクターを作製するためのこのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに挟まれている本明細書に記載されるネコＥＰＯ構築物配列および本明細書に記載されるものなどの他の発現制御配列を含有する。本明細書の他の箇所に記載されているように、例えばコドン最適化を含む当技術分野で公知の技術を使用して、任意の発現制御配列を特定の種に対して最適化することができる。

発現カセットは、典型的には、発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含有する。プロモーターは、特定の遺伝子または下流の核酸の転写を開始する核酸の領域である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近くに位置し得る。プロモーターは、発現カセットおよび発現ベクターの重要なエレメントであり、所与の遺伝子の転写のレベルを指示するために、エンハンサー、サイレンサーおよびインシュレーターなどの他の調節エレメントと協働し得る。したがって、異なるプロモーターは、異なるレベルの転写を指示し得る。

本明細書の他の箇所で述べられているように、本開示は、赤血球恒常性を促進する（または回復させる）ことを必要とするネコ対象において赤血球恒常性を促進する（または回復させる）ための組換えネコＥＰＯの制御された発現のための発現構築物の使用に関する。組換えネコＥＰＯの発現のレベルは、ネコ対象における組換えネコＥＰＯの発現を駆動するために使用されるプロモーターの種類によって適切に制御され得ることが理解されよう。

プロモーターの文脈において、「強い」および「弱い」という用語は、典型的には、転写速度およびその後の遺伝子発現に対するプロモーターの効果に従ってプロモーターを記載するために使用され、「強い」プロモーターは、典型的には、「弱い」プロモーターと比較してより速い転写速度を提供することが理解されよう。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ（および／またはシグマ因子）に対するその親和性に従って、強いまたは弱いとして分類され得、これは、典型的には、プロモーター配列がポリメラーゼに対する理想的なコンセンサス配列にどれほど近く類似しているかに関連する。プロモーターの強度は、転写の開始がそのプロモーターにおいて高い頻度または低い頻度で起こるかどうかにも依存し得る。異なるレベルの遺伝子／タンパク質発現を有する遺伝子回路を構築するために、異なる強度を有する異なるプロモーターが使用され得る（例えば、弱いプロモーターから開始される発現のレベルは、強いプロモーターから開始される発現のレベルより低い。）。

本明細書で使用される場合、「強いプロモーター」という用語は、その制御下にある遺伝子が弱いプロモーターと比較した場合により高いレベルで発現されることを可能にするプロモーターを指す。強いプロモーターは、天然に存在するものであり得、または改変されたプロモーターもしくは合成プロモーター、例えば天然に存在するプロモーターの誘導体であり得る。したがって、強いプロモーターは天然または非天然であり得る。「強いプロモーター」という用語は当業者によく知られており、その実例は文献に広く記載されている（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｃｈｌａｂｅａｃｈら、２０１０，ＰＮＡＳ，１０７（６）：２５３８－２５４３およびＢｉｅｎｉｃｋら、２０１４，ＰＬｏＳ ｏｎｌｉｎｅ，９（１０）：ｅ１０９１０５を参照されたい。）。強いプロモーターは、関心対象の遺伝子から大量の転写産物および最終タンパク質産物を産生することができる。例えば、強いプロモーターは、全細胞タンパク質の少なくとも１％のレベルでタンパク質を発現することができる。好ましくは、強いプロモーターは、全細胞タンパク質の２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％のレベルでタンパク質を発現することができる。したがって、プロモーターは、特定の宿主細胞および発現系に関連して、選択された条件で上記の発現レベルを達成すれば、強いプロモーターであり得る、すなわち、プロモーターは、使用される特定の方法および試薬に対して強いプロモーターであり得る。好ましくは、強いプロモーターは、関心対象の遺伝子によってコードされるタンパク質が少なくとも１ミリグラム／リットルの分量で細胞から精製されることができるように、関心対象の遺伝子の発現を可能にする。より好ましくは、５ミリグラム／リットルである。さらにより好ましくは、１０ミリグラム／リットルである。強いプロモーターは、典型的には、コード配列の発現を高レベルで、または約｛割合（１／１０）｝の転写物～約｛割合（１／１００）｝の転写物～約｛割合（１／１，０００）｝の転写物で駆動する。

一般に、「弱いプロモーター」とは、強いプロモーターと比較して低いレベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターである。「低いレベル」とは、約｛割合（１／１０，０００）｝の転写物～約｛割合（１／１００，０００）｝の転写物のレベルを意図する。本開示のある局面では、ネコＥＰＯの発現を駆動するプロモーターは弱いプロモーターである。すなわち、それは、強いプロモーターよりも低いレベルのネコＥＰＯの転写を指示する。プロモーターの相対的な弱さは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられるＱｉｎら（２０１０，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，５（５）：ｅ１０６１１；１－４）に開示されている方法によって決定され得る。適切な弱いプロモーターは当業者によく知られており、その実例は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｃｈｌａｂｅａｃｈら（２０１０，ＰＮＡＳ，１０７（６）：２５３８－２５４３）およびＢｉｅｎｉｃｋら（２０１４，ＰＬｏＳ ｏｎｌｉｎｅ，９（１０）：ｅ１０９１０５）に広く記載されている。

プロモーターの強度、「強い」または「弱い」かどうかは、同一のベクター状況（すなわち、ベクターの他のすべてのエレメントが同一である。）で使用される場合ならびに同じ細胞型中および同じ条件下で発現される場合に評価することができる。これに関連して、プロモーター強度に関する任意の適切な尺度、例えば転写物の数または産生されるタンパク質の量が使用され得る。

適切な強いプロモーターの実例としては、Ｐｍプロモーター、Ｐｔａｃ、Ｐｔｒｃｉｌ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｐ_７φｌ ０）、ＸＰＬおよびＰＢＡＤ、ならびに前述のもののいずれかの誘導体が挙げられる。好ましくは、強いプロモーターは、組換えネコＥＰＯが少なくとも１ミリグラム／リットル、より好ましくは５ミリグラム／リットルまたはさらにより好ましくは１０ミリグラム／リットルの分量で細胞から精製されることができるように、宿主細胞中での組換えネコＥＰＯの発現を可能にする。強いプロモーターは、典型的には、コード配列の発現を高レベルで、または約｛割合（１／１０）｝の転写物～約｛割合（１／１００）｝の転写物～約｛割合（１／１，０００）｝の転写物で駆動する。

強いプロモーターの他の実例としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＭＰＳＶ、ラムダファージのＰＲプロモーターおよびＰＬプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ－１ ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲを含むウイルスＬＴＲなどが挙げられる。ＨＩＶ ｔａｔおよびＴＡＲ系などの他のエレメントも、発現を増強するために使用され得る。他の強いプロモーターには、誘導性プロモーターが含まれる。

弱いプロモーターの実例としては、ＰＣ_ＯＮ（例えば、Ｄｏｂｒｙｎｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７，３６５－３７６，１９８０）、ＵＢＣプロモーターおよびＰＧＫプロモーターが挙げられる。

別の実施形態において、プロモーターはＴＢＧプロモーターである。

一実施形態において、プロモーターはＣＢ７プロモーターである。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスのエンハンサーエレメントを有するニワトリβ－アクチンプロモーターである。あるいは、他の肝臓特異的プロモーターが使用され得る（例えば、Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ，α１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミン Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ；およびＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２９（１９９６）を参照）。ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、α－抗トリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ ｎｔ）２５（イントロンレスｓｃＡＡＶを必要とする）。一実施形態において、肝臓特異的プロモーターであるチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が使用される。他のプロモーター、例えばウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター（例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号および国際公開第２０１３／０４９４３号を参照）、または生理学的手がかりに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターにおいて使用され得る利用され得る。

プロモーターに加えて、発現カセットおよび／またはベクターは、他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；ＴＡＴＡ配列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；イントロン；タンパク質安定性を高める配列；ならびに、所望される場合、コードされた産物の分泌を増強する配列を含有し得る。発現カセットまたはベクターは、本明細書に記載されるエレメントのいずれも含有しなくてもよく、本明細書に記載されるエレメントのいずれかの１つまたはそれより多くを含有してもよい。適切なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）およびＴＫポリＡが挙げられる。適切なエンハンサーの例としては、例えば、とりわけ、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。

したがって、ネコＥＰＯの発現レベル、および赤血球恒常性を促進することを必要とするネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量は、使用されるプロモーターの種類に依存し得、プロモーターの種類により、ネコ対象における赤血球恒常性を促進または回復するのに有効である用量を決定し得る。したがって、本明細書に開示される別の局面において、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための方法であって、赤血球恒常性を促進することを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で前記対象に投与され、ここで、前記用量は、ネコ対象のＰＣＶを約５～約３０ＰＣＶ％ポイント、好ましくは少なくとも約１５ＰＣＶ％ポイントの値だけ増加させるのに有効である方法が提供される。
本明細書に開示される別の局面において、貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための方法であって、赤血球恒常性を促進することを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で前記対象に投与され、前記用量は、ネコＥＰＯの発現が強いプロモーターによって駆動されるＡＡＶキャプシドの体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の用量によって達成されるであろうＰＣＶの増加と同等であるネコ対象におけるＰＣＶの増加を提供するのに有効である方法が提供される。一実施形態において、用量は、ネコＥＰＯの発現が強いプロモーターによって駆動されるＡＡＶキャプシドの体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満の用量によって達成されるであろうＰＣＶの増加と同等であるネコ対象におけるＰＣＶの増加を提供するのに有効である。
一実施形態において、発現制御配列は組織特異的プロモーターを含む。適切な組織特異的プロモーターは、当業者によく知られている。一実施形態において、組織特異的プロモーターは、腎臓特異的プロモーターまたは筋肉特異的プロモーターである。一実施形態において、組織特異的プロモーターは、Ｎｋｃｃ２プロモーター、ウロモジュリンプロモーター、Ｋｓｐ－カドヘリンプロモーターおよびＴＨＰ遺伝子プロモーターから選択される。
一実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、イントロン、コザック配列、ポリＡおよび転写後調節エレメントの１つまたはそれより多くをさらに含む。
適切なＡＡＶキャプシドは当業者によく知られており、その実例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３ｂ．ＡＲ２．１２およびＡＡＶｒｈ１０が挙げられる。一実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３ｂ．ＡＲ２．１２およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択される。
一実施形態において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ８キャプシドである。一実施形態において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ１キャプシドである。
プロモーターに加えて、発現カセットおよび／またはベクターは、他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；ＴＡＴＡ配列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；イントロン；タンパク質安定性を高める配列；ならびに、所望される場合、コードされた産物の分泌を増強する配列を含有し得る。発現カセットまたはベクターは、本明細書に記載されるエレメントのいずれも含有しなくてもよく、本明細書に記載されるエレメントのいずれかの１つまたはそれより多くを含有してもよい。適切なポリＡ配列の実例としては、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）およびＴＫポリＡが挙げられる。適切なエンハンサーの例としては、例えば、とりわけ、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。
一実施形態において、ウイルスベクターは、５’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、必要に応じてエンハンサーを伴うプロモーター、ＥＰＯ配列、ポリＡ配列、および３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸発現カセットを含み、前記発現カセットは、宿主細胞内で機能的ネコＥＰＯを発現する。
これらの制御配列は、ＥＰＯ構築物配列に「作動可能に連結」されている。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、関心対象の遺伝子と近接する発現制御配列と、関心対象の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方を指す。
発現カセットは、ウイルスベクターの産生のために使用されるプラスミド上に設計され得る。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするために必要とされる最小配列はＡＡＶ５’および３’ＩＴＲであり、これらはキャプシドと同じＡＡＶ起源のものであり得、または（ＡＡＶ偽型を産生するために）異なるＡＡＶ起源のものであり得る。一実施形態において、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列またはその欠失されたバージョン（ΔＩＴＲ）は、便宜のためにおよび規制上の承認を加速するために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源からのＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られたベクターは偽型化されていると呼ばれ得る。典型的には、ＡＡＶベクター用の発現カセットは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、プロペプチド－ＥＰＯ活性ペプチドコード配列および任意の調節配列、およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も適切であり得る。Ｄ配列および末端解離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮されたバージョンが記載されている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。
略語「ｓｃ」は自己相補的を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって運搬されるコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染すると、第２鎖の細胞を介した合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的半分が会合して、即時の複製および転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、「Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；および同第７，４５６，６８３号に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、標的細胞に送達するための核酸配列がその中にパッケージングされたＡＡＶタンパク質キャプシドを有するＡＡＶ Ｄｎａｓｅ耐性粒子である。ＡＡＶキャプシドは、選択されたＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で正二十面体対称に配置された６０個のキャプシド（キャップ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成される。例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ．１０、公知のもしくは言及されたＡＡＶまたは未だ発見されていないＡＡＶのいずれかのバリアントを含むＡＡＶウイルスベクター（Ｄｎａｓｅ耐性ウイルス粒子）のキャプシドのための供給源として、ＡＡＶ血清型が選択され得る。一実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶ８キャプシドまたはそのバリアントである。別の実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶ１キャプシドまたはそのバリアントである。例えば、米国特許出願公開第２００７－００３６７６０Ａ１号；米国特許出願公開第２００９－０１９７３３８Ａ１号；欧州特許第１３１０５７１号を参照されたい。国際公開第２００３／０４２３９７号（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号および米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、国際公開第２００５／０３３３２１号および米国特許第７，９０６，１１１号（ＡＡＶ９）、ならびに国際公開第２００６／１１０６８９号および国際公開第２００３／０４２３９７号（ｒｈ．１０）も参照されたい。
あるいは、列挙されたＡＡＶのいずれかに基づく組換えＡＡＶがＡＡＶキャプシドの供給源として使用され得る。これらの文献はまた、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶも記載しており、参照により組み入れられる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターにおいて使用するためのＡＡＶキャップは、前述のＡＡＶキャップまたはそのコード核酸の１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）作製することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、上述のＡＡＶキャプシドタンパク質の２つまたは３つまたは４つまたはそれより多くからのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶからのＶｐ１、Ｖｐ２およびＶｐ３モノマーのモザイクである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、前述のキャップの１つより多くを含む。別の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、任意の記載されたまたは公知のＡＡＶキャプシド配列からの最大約１０％の変動を含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶキャプシドは、本明細書に提供されるおよび／または当技術分野で公知のＡＡＶキャプシドと約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１キャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドのパーセント同一性を決定する場合、比較は、可変タンパク質のいずれか（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）に対して行われ得る。一実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８ ｖｐ３と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１ ｖｐ３と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態において、自己相補的ＡＡＶが使用される。
発現カセットをビリオン中にパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子と同じ構築物中でシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。一実施形態において、複製（ｒｅｐ）および／またはキャプシド（ｃａｐ）のためのコード配列は、ＡＡＶベクターを生成するために、ＡＡＶゲノムから除去され、トランスでまたはパッケージング細胞株によって供給される。例えば、上記のように、偽型化されたＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドの供給源とは異なる供給源からのＩＴＲを含有し得る。これに加えてまたはこれに代えて、キメラＡＡＶキャプシドが利用され得る。さらに他のＡＡＶ成分が選択され得る。このようなＡＡＶ配列の供給源は本明細書に記載されており、学術的、商業的、または公的な供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からも単離または取得され得る。あるいは、ＡＡＶ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などの文献またはデータベースで入手可能であるような公開された配列を参照することによって、合成手段または他の適切な手段を通じて取得され得る。
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成および単離するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第７７９０４４９号；米国特許第７２８２１９９号；国際公開第２００３／０４２３９７号；国際公開第２００５／０３３３２１号、国際公開第２００６／１１０６８９号；米国特許第７５８８７７２Ｂ２号および国際公開第２０１７／０４０５２４号を参照されたい。）。一実施形態において、産生細胞株は、末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれている導入遺伝子をコードする構築物ならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物を一過性に形質移入される。別の実施形態において、ｒｅｐおよびｃａｐを安定に供給するパッケージング細胞株は、ＩＴＲに挟まれている導入遺伝子をコードする構築物を一過性に形質移入される。これらの系の各々において、ＡＡＶビリオンは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスによる感染に応答して産生され、混入ウイルスからのｒＡＡＶの分離を必要とする。より最近では、ＡＡＶを回復するためにヘルパーウイルスによる感染を必要としない系が開発されており、必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も系によってトランスで供給される。これらのより新しい系では、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物による細胞の一過性形質移入によって供給されることができ、または細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するように操作されることができ、その発現は転写または転写後レベルで制御され得る。さらに別の系では、ＩＴＲに挟まれている導入遺伝子およびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスに基づくベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生系の総説については、一般に、例えば、Ｚｈａｎｇら（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる２００９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９）を参照されたい。これらおよび他のＡＡＶ産生系を作製および使用する方法は、以下の米国特許にも記載されており、それらの内容全体が参照により本明細書に組み入れられる：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；および７，４３９，０６５。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇら、２００８，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３）を参照されたい。本明細書に記載される実施形態のいずれかを構築するための適切な方法は、核酸操作の当業者によく知られており、その実例には、遺伝子操作、組換え操作および合成技術（例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。）が含まれる。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は当業者に周知である（例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２および米国特許第５，４７８，７４５号）。
本明細書に記載されるウイルスベクター構築物を含む組成物も本明細書で提供される。本明細書に記載される医薬組成物は、任意の適切な経路または異なる経路の組み合わせによって、送達を必要とする対象に送達するように設計される。（必要に応じて静脈内を介した、肝動脈を介した、または移植による）肝臓への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与経路。本明細書に記載されるウイルスベクターは、単一の組成物または複数の組成物において送達され得る。必要に応じて、２またはそれを超える異なるＡＡＶ、または複数のウイルスが送達され得る（例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号および国際公開第２０１３／０４９４９３号を参照されたい。）。別の実施形態において、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有し得る。
複製欠損ウイルスは、遺伝子導入および遺伝子治療用途において使用するための生理学的に許容され得る担体と共に製剤化することができる。ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量が、製剤または懸濁液中に含有される用量の尺度として使用され得る。本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するために、当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。ＡＡＶ ＧＣ数の滴定を行うための１つの方法は以下の通りである：まず、精製されたＡＡＶベクター試料をＤｎａｓｅで処理して、キャプシドに封入されていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは混入プラスミドＤＮＡを産生プロセスから除去する。次いで、Ｄｎａｓｅ耐性粒子を熱処理に供して、キャプシドからゲノムを放出させる。次いで、ウイルスゲノムの特異的領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲによって、放出されたゲノムを定量する。
用量および剤形
本明細書の他の箇所で述べられているように、本発明は、少なくとも部分的には、（ｉ）組換えネコＥＰＯの発現を駆動するように適合されており、それ以外に健康なネコ対象においてヘマトクリットまたは血中血球容積を増加させるのに十分であるアデノウイルスベクターの用量が、貧血を有するネコ対象にとって予想外に有害または致命的である；（ｉｉ）それにもかかわらず、健康なネコ対象においてヘマトクリットまたは血中血球容積を増加させることが予想されないより低い用量で、ネコＥＰＯ発現アデノウイルスベクターが貧血ネコ対象に投与されると、貧血ネコ対象において赤血球恒常性を回復させることができること、および（ｉｉｉ）本明細書に記載される低用量処置レジメンは、貧血動物における赤血球増加症のリスクを最小化するという本発明者らの驚くべき発見に基づいている。
ネコ対象、特に貧血ネコ対象における赤血球恒常性を促進し、またはさもなければ回復させるのに有効な用量は、好ましくは約２×１０^９ｇｃ／ｋｇまたはそれ未満である。一実施形態において、ネコ対象、特に貧血ネコ対象における赤血球恒常性を促進し、またはさもなければ回復させるのに有効な用量は、好ましくは約１×１０^９ｇｃ／ｋｇまたはそれ未満である。用量範囲の下限は、ネコ対象における赤血球恒常性を促進し、またはさもなければ回復させるのに、好ましくは、処置の開始後約７０日までにネコ対象における赤血球恒常性を促進し、またはさもなければ回復させるのに有効である、０以外の約２×１０^９ｇｃ／ｋｇ未満の任意の数であり得ることを理解すべきである。一実施形態において、用量は約１×１０^８～２×１０^９ｇｃ／ｋｇである。一実施形態において、用量は約１×１０^８～１×１０^９ｇｃ／ｋｇである。一実施形態において、用量は約２×１０^８～１×１０^９ｇｃ／ｋｇである。一実施形態において、用量は約２×１０^８～６×１０^８ｇｃ／ｋｇである。一実施形態において、用量は約５．５×１０^８～約１．４×１０^９ｇｃ／ｋｇである。一実施形態において、用量は約２×１０^８～１．８×１０^９ｇｃ／ｋｇである。
一実施形態において、用量は、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象については約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象については約７．３０×１０^９ゲノムコピーである。一実施形態において、用量は、体重が６ｋｇを超えるネコ対象については約７．３０×１０^９ゲノムコピーである。
本明細書の他の箇所に記載されているように、ネコＥＰＯの発現が弱いプロモーターによって駆動される場合には、強いプロモーターと比較して同じまたは実質的に同じレベルの発現を達成するために、適宜用量を調整し得る。一実施形態において、弱いプロモーターが使用される場合には、ネコ対象における赤血球恒常性を促進するか、またはさもなければ回復させるのに有効な用量は、強いプロモーターが使用される場合に約３×１０^９ｇｃ／ｋｇまたはそれ未満の用量によって達成される発現のレベルと同等である、ネコ対象におけるネコＥＰＯの発現のレベルを達成するのに十分な用量である。強いプロモーターが使用される場合に、約２×１０^９ｇｃ／ｋｇもしくはそれ未満の用量によって、または約１×１０^９ｇｃ／ｋｇもしくはそれ未満の用量によって達成される発現のレベルと同等である、ネコ対象におけるネコＥＰＯの発現のレベルを達成するのに十分な用量は、当業者によって決定することができる。このような用量は、約１×１０^９ｇｃ／ｋｇを超える量を投与することによって適切に達成され得る。これに代えてまたはこれに加えて、このような用量は、連続用量、すなわち、１回より多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９など）の連続用量によって適切に達成され得る。
いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムの量は分割用量で送達され得る。一実施形態において、構築物は、１μＬ～約１００ｍＬの体積で獣医学的対象に対して送達され得る（様々な獣医学的動物に物質を投与するための適正規範の考察については、例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＤｉｅｈｌら、２００１，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５－２３を参照）。したがって、本明細書で使用される場合、「投与量」または「用量」という用語は、処置の過程で対象に送達される総投与量、または（複数のうちの）単一の投与で送達される量を指すことができる。一実施形態において、ネコ対象に投与される用量は、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーである。一実施形態において、ネコ対象に投与される用量は、約１．２×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーである。一実施形態において、ネコ対象に投与される用量は、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象では約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象では約７．３０×１０^９ゲノムコピーである。一実施形態において、６ｋｇを超える体重のネコ対象に２回の用量が投与され、各用量は約３．６５×１０^９のゲノムコピーを含む。
組換えベクターを宿主細胞に送達するための適切な方法は、当業者に公知である。ｒＡＡＶは、好ましくは生理学的に適合し得る、担体、希釈剤、賦形剤および／または佐剤に懸濁され、ネコ対象に投与され得る。適切な担体は、導入ウイルスが対象とする適応症を考慮して当業者によって容易に選択され得る。例えば、適切な担体には食塩水が含まれ、それは様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化され得る。適切な担体の他の実例としては、無菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油および水が挙げられる。

必要に応じて、本明細書に記載される組成物は、ｒＡＡＶおよび／またはバリアントならびに担体（複数可）に加えて、防腐剤などの他の従来の医薬成分、または化学的安定剤を含有し得る。適切な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが含まれる。適切な化学的安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。
本明細書に記載されるウイルスベクターおよび他の構築物は、ＥＰＯ構築物を送達すること必要とするネコ対象にＥＰＯ構築物を送達するための、および／またはネコ対象における慢性腎臓疾患を処置するための医薬を調製する際に使用され得る。したがって、別の局面では、ネコ対象における慢性腎臓疾患を処置する方法が提供される。したがって、一実施形態において、ネコ対象は、慢性腎臓疾患を有する。別の実施形態において、組成物は、ネコ対象に静脈内投与される。
一実施形態において、本方法は、本明細書に記載される組成物を、本明細書に記載される組成物を投与することを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるように、ＥＰＯ発現カセットを含有するウイルスベクターを含む。一実施形態において、対象は哺乳動物である。別の実施形態において、対象はネコ（ｆｅｌｉｎｅ）である。さらに別の局面では、貧血を処置する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載される組成物を、本明細書に記載される組成物を投与することを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるように、ＥＰＯ発現カセットを含有するウイルスベクターを含む。一実施形態において、対象は哺乳動物である。別の実施形態において、対象はネコ（ｆｅｌｉｎｅ）である。
一実施形態において、ネコにおける慢性腎臓疾患を処置するための方法が提供される。この方法は、ネコＥＰＯをコードする配列を含む核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクターを投与することを含む。
本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する方法であって、本明細書に記載されているように、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記組成物は体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピーまたはそれ未満の用量で前記対象に投与される方法が提供される。本明細書に開示される別の局面において、前記組成物が、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピーまたはそれ未満の用量で投与するために製剤化されている、本明細書に記載されている組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用が提供される。本明細書に開示される別の局面において、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する上で使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、本明細書に記載されるように、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記組成物は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピーまたはそれ未満の用量で投与するために製剤化されている、医薬組成物が提供される。

一連の処置は、必要に応じて、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ１ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ１０；ＡＡＶ１およびＡＡＶ８；ＡＡＶ１およびＡＡＶｒｈ１０など）の反復投与を含み得る。本明細書に記載されるものを含む、適切なウイルスベクターを使用して、他の組み合わせも選択され得る。本明細書に記載される組成物はまた、例えば、例えば組換えネコＥＰＯタンパク質を含む、他の薬物もしくはタンパク質をベースとする治療ならびに／または食事療法および運動療法などの生活様式の変化を含むレジメンにおいて適切に組み合わせられ得る。

本明細書で使用される「調節」という用語またはその変形は、生物学的経路の１またはそれを超える成分を阻害する組成物の能力を指す。

本明細書に開示される別の局面において、本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む単位剤形であって、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む単位剤形が提供される。一実施形態において、単位剤形は、約１．２×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む。一実施形態において、単位剤形は、約１．２×１０^９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む。一実施形態において、単位剤形は、約２．４×１０^９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む。一実施形態において、単位剤形は、約３．６５×１０^９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む。一実施形態において、単位剤形は、約４．８６×１０^９ゲノムコピーの量でｒＡＡＶを含む。一実施形態において、剤形は筋肉内剤形である。

本開示はまた、本明細書に記載される組成物または剤形を含むキットにも及ぶ。キットは、本明細書に記載される方法および使用に従って組成物または剤形を使用するためのなどの、指示をさらに含み得る。キットは、凍結乾燥された形態の本明細書に記載される組成物または剤形をさらに含み得る。凍結乾燥された形態を調製するための適切な方法は、当業者によく知られている。キットが凍結乾燥された形態の組成物または剤形を含む場合、キットは、本明細書に記載される方法および使用による筋肉内投与のためなどの、投与の前に凍結乾燥された形態を再構成するための薬学的に許容され得る希釈剤を含む別個の容器をさらに含み得る。

本明細書において別段の定義がなければ、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって、および本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する公開されたテキストを参照することによって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

以下の実施例は例示にすぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

［実施例１］
ＡＡＶ－ネコＥＰＯ発現ベクターの構築
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＮ８５６７０．１；配列番号１）のネコＥＰＯをコードする核酸配列をコドン最適化することによって、ネコＥＰＯプロタンパク質をコードする核酸配列を作製した。部分的ＣＭＶ前初期エンハンサーとともにニワトリβ－アクチンプロモーターを含有する発現ベクター中に、コドン最適化された核酸配列（配列番号２）をクローニングした。発現構築物は、２つ（５’および３’）のＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれていた。ヘルパーおよびトランスプラスミドでの三重形質移入後、ネコ構築物をＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシド中にパッケージングした。次いで、これをイオジキサノール勾配精製によって精製し、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲによって滴定した。ＡＡＶ１－ネコＥＰＯ発現ベクターが図５に示されており、本明細書ではＳＢ－００１とも呼ばれる。

［実施例２］
正常なネコにおけるネコエリスロポエチンのＡＡＶを介した発現
ＡＡＶ１－ネコＥＰＯ発現ベクター、ＳＢ－００１の投与に対する安全性および血液学的応答を評価するために、単回筋肉内（ＩＭ）用量を様々な用量で健康な成体ネコに投与した。

この調査は、無作為化され、対照化された並行デザインでの単一施設非臨床検査研究として行われた。３４匹のネコを７日間研究条件に順応させた後、３０匹のネコを選択して投与期に入れた。ＳＢ－００１またはリン酸緩衝食塩水プラセボの単回ＩＭ用量を受ける前に、性別バランスのとれた５つの群にネコを無作為に割り当てた。投与群は、図１に示すように０日目に１回処置した。投与前および後の様々な時点で、注射部位評価、身体検査および体重を評価した。投与前および後の時点で、臨床化学および潜在的な免疫原性評価のために血液を採取した。全体的な健康を評価するための臨床観察を毎日行った。自動分析装置を用いた包括的な血液学的評価を投与前に３回行い、次いで研究期間を通して毎週行った。さらに、必要に応じて、過度に高いＨＣＴレベルを有するネコを監視するために、手作業でのＰＣＶ／ＴＰ測定を毎週１回行った。投与後５６および６０日目に、全てのネコについて手作業でのＰＣＶ／ＴＰデータを生成した。研究の最後に、ＳＢ－００１を投与した全てのネコを安楽死させ、剖検した。

単回ＩＭ注射後、ＳＢ－００１は、評価された２つの最高用量レベル（Ｔ３；１．９×１０^９遺伝子コピー／キログラム体重（ｇｃ／ｋｇ）およびＴ４；６．０×１０^９ｇｃ／ｋｇ）でＨＣＴの持続的かつ統計学的に有意な変化をもたらした。最低用量（Ｔ１；１．９×１０^８ｇｃ／ｋｇおよびＴ２；６．０×１０^８ｇｃ／ｋｇ）は、研究の過程にわたってＨＣＴの一貫した変化をもたらさなかった。群Ｔ２、Ｔ３およびＴ４で観察されたエリスログラムの変化は概ね予想され、これらの知見のいずれも追加の臨床的に有意な安全シグナルとは考えられなかった。

筋肉内注射によって与えられるＳＢ－００１の単一用量は、健康なネコにおいて１．９×１０^９（Ｔ３）および６．０×１０^９ｇｃ／ｋｇ（Ｔ４）の用量でＨＣＴの持続的かつ統計学的に有意な変化をもたらした。この赤血球血液学的応答は６２／６３日の期間にわたって持続し、臨床的に有意な安全性の懸念はいずれの用量レベルでも特定されなかった（図１）。これらのデータは、Ｗａｌｋｅｒら（２００５，ＡＪＶＲ，６６（３）：４５０－４５６）およびＢｅａｌｌら（２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：５３４－５３９）によって報告された以前の研究と概ね一致している。例えば、Ｂｅａｌｌらは、１．２５×１０^１２ｇｃ／ｋｇの用量のアデノウイルス－ネコＥＰＯ発現ベクターのみが健康なネコ対象のＨＣＴを増加させるのに有効であることを示した。１．２５×１０^１０ｇｃ／ｋｇの最低用量は無効であることが示された。同様に、Ｗａｌｋｅｒらは、試験した用量（約１．５×１０^７、１．５×１０^８および１．５×１０^９ｇｃ／ｋｇ）のうち、最高用量（１．５×１０^９ｇｃ／ｋｇ）のみが健康なネコにおいてＨＣＴの増加を示したのに対して、試験したより低用量のいずれにおいても効果が存在しないことを示した。

健康なネコからの前述のデータに照らして、本発明者らは、慢性腎臓疾患を有する貧血ネコにおけるＳＢ－００１構築物の効果を調査するために３．０×１０^９ｇｃ／ｋｇの平均用量を採用した。これを以下の実施例３に示す。

［実施例３］
慢性腎臓疾患を有するネコにおけるネコエリスロポエチンのＡＡＶを介した発現の投与量研究
本試験では、それぞれ慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）に関連する貧血と診断された３匹のネコ（Ｃｌａｒａ、ＣｏｓｍｏおよびＯｌｉｖｅｒ）にＳＢ－００１（ＩＭ；３．０×１０^９ｇｃ／ｋｇ）を与えた。驚くべきことに、別段健康なネコにおいてＨＣＴを増加させるのに有効であることが見出されたＳＢ－００１の３．０×１０^９ｇｃ／ｋｇの用量は、十分に耐容されなかったか、または貧血のネコにおいて致死的であった。これらの結果は図２に示されており、以下でさらに説明する。
・ Ｏｌｉｖｅｒ：１８．５歳、ＭＣ メインクーン
・ ７０日目にＳＢ－００１ ＥＰＯによる赤血球増加症（ＰＣＶ２９．１％から５５．７％まで＝２６．６ポイントの増加）
・ ８９日目－急性壊死性膵炎を伴って死亡
・ Ｃｌａｒａ：１９．３歳、ＦＳ、ＤＳＨ
・ ２８日目にＳＢ－００１ ＥＰＯによる赤血球増加症（ＰＣＶ１５．３％から５４．５％まで＝３９．２ポイントの増加）
・ Ｄ２７で発作、静脈切開２回
・ ＣＫＤ進行のため、Ｄ５５で安楽死
・ Ｃｏｓｍｏ：１７歳、ＭＣ、ＤＳＨ
・ ＩＲＩＳ ＩＶ：登録時のクレアチニン／ＢＵＮ：
・ ＰＣＶは非常に急速に増加しており、研究を継続することが可能であったならば、赤血球増加症を発症した可能性があったであろう（ＰＣＶ１２％から４０．９％まで＝２９ポイントの増加）
・ Ｄ４６で安楽死－ＣＫＤの進行

［実施例４］
慢性腎臓疾患を有するネコにおけるネコエリスロポエチンのＡＡＶを介した発現の最適化
本研究は、健康なネコでは赤血球恒常性を促進するのに低用量は有効でないという以前の知見にかかわらず（上記の実施例２に記載されているように、ＢｅａｌｌらおよびＷａｌｋｅｒらによる知見と一致する。）、低用量のＳＢ－００１が貧血ネコにおいて有効であり得るかどうかを調査しようと努めた。本研究デザインは、盲検化せず、プラセボを使用しなかったことを除いて、上記の実施例３の研究と同様であった。動物に、約２．０×１０^８～６．０×１０^８ｇｃ／ｋｇの用量のＳＢ－００１を投与した。

最初の７匹のネコの登録後、治療に対して反応しないネコが４２日目に３倍の追加用量（boosted dose）を受けることを可能にするために修正を行った。８匹の追加用量ネコのうち７匹が成功基準（ＰＣＶの正常範囲内への増加または少なくとも５ＰＣＶパーセンテージポイントの増加）を満たした。処置がなければ、ネコのＰＣＶは経時的に減少すると予想される。

有効性は、処置後のＰＣＶ（マイクロヘマトクリットを使用して遠心沈殿させた全血から測定）を安定化するかまたは増加させるかのいずれかによって示された。

驚くべきことに、２２．５％から３３．６％へのＰＣＶの平均増加が研究コホートにおいて観察され（図３）、赤血球増加症のための処置を必要としたネコは存在しなかった。これらの結果は驚くべきことであり、かつ予想外であり、健康なネコにおいては、同様の用量のＳＢ－００１はＨＣＴまたはＰＣＶを増加させるのに無効であったことが注目される。
［実施例５］
慢性腎臓疾患を有するネコにおけるネコエリスロポエチンのＡＡＶを介した発現の用量最適化

本研究は、より低い有効用量のＳＢ－００１が貧血ネコにおいて有効であることを確認しようと努めた。

本研究デザインは、上記の実施例４の研究と同様であった。簡潔には、研究の開始時に単回用量の約３．６５×１０^９遺伝子コピー（ｇｃ）のＳＢ－００１を動物に投与した。この用量は、以下の表１に示されるように、約５．５×１０^８～１．４×１０^９ｇｃ／ｋｇ体重（ＢＷ）に相当した。

処置された８匹のネコのうち７匹が、正常範囲内へのＰＣＶの増加または少なくとも５ＰＣＶパーセンテージポイントの増加とみなされる成功基準を満たした。処置がなければ、ＰＣＶ値は経時的に減少すると予想される。

有効性は、処置後のＰＣＶ（マイクロヘマトクリットを使用して遠心沈殿させた全血から測定）を安定化させるかまたは増加させるかのいずれかにによって示された。

驚くべきことに、以下の表２に示されるように、研究コホートでは、２１．２５％から３９．７５％へのＰＣＶの平均増加が観察され、赤血球増加症のためのその後の処置を必要とするネコは存在しなかった。これらの結果は驚くべきことであり、かつ予想外であり、健康なネコにおいては、同様の用量のＳＢ－００１はＨＣＴまたはＰＣＶを増加させるのに無効であったことが注目される。

［実施例６］
ＳＢ－００１による処置後の末期慢性腎臓疾患を有する貧血ネコの生存期間
本研究は、末期（ステージ４）慢性腎臓疾患を有する貧血ネコでの、生存に対するより低い有効用量のＳＢ－００１の効果を決定しようと努めた。本研究は、上記の実施例４および５に記載した研究と同様であった。簡潔には、上記の実施例４に記載されているように、必要であれば投与される第２の用量を含む、約２×１０^８～１．８×１０^９ｇｃ／ｋｇ体重の総用量で、末期（ステージ４）慢性腎臓疾患を有する貧血ネコにＳＢ－００１を投与した。

驚くべきことに、低用量ＳＢ－００１で処置された９匹のネコのうち４匹が９９日間より長く生存した。これは、ステージ４の慢性腎臓疾患の診断から死亡までのネコの生存期間中央値が３５日であったことを示した（Ｂｏｙｄら２００８の表２を参照）Ｂｏｙｄら（２００８；Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００８；２２：１１１１－１１１７）の知見とは対照的である。ＳＢ－００１で処置されたステージ４のネコは、６４日という生存時間中央値（日数）の増加を有した（図６および表３を参照）。

実施例３～６のネコ対象からの生存データを照合すると、驚くべきことに、低用量ＳＢ－００１で処置されたネコは、Ｂｏｙｄら（２００８）に記載されているように、代替の介入を受けたネコ対象と比較した場合、処置の時点から３倍超長く生存したことが見出された。これらの発見を以下の表４に示す。

［実施例７］
ネコエリスロポエチンのＡＡＶ８を介した発現による慢性腎臓疾患を有する貧血ネコの処置
ネコＥＰＯプロタンパク質をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（例えば、アクセッション番号ＡＦＮ８５６７０）から入手する。部分的ＣＭＶ前初期エンハンサーとともにニワトリβ－アクチンプロモーターを含有する発現ベクター中に、配列をクローニングする。発現構築物は、２つ（５’および３’）のＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれている。三重形質移入およびイオジキサノール勾配精製によってＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）キャプシド中にネコＥＰＯ発現構築物をパッケージングし、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲによって力価を決定してＡＡＶ８－ネコＥＰＯ発現ベクターを作製する。

約２．０×１０^９ｇｃ／ｋｇまたはそれ未満のＡＡＶ８－ネコＥＰＯ発現ベクターの筋肉内（ＩＭ）用量を貧血ネコに投与し、本明細書の他の箇所に記載されるようにＨＣＴおよび／またはＰＣＶの変化を決定する。有効性は、正常範囲内へのＰＣＶの安定化もしくは増加、または少なくとも５ ＰＣＶパーセンテージポイントの増加（例えば、マイクロヘマトクリットを使用して遠心沈殿させた全血から測定）のいずれかによって示される。

Claims (52)

1. 貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための方法であって、赤血球恒常性を促進することを必要とする対象に、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で前記対象に投与され、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、方法。
2. 前記用量が約１×１０^９ｇｃ／ｋｇまたはそれ未満である、請求項１に記載の方法。
3. 前記用量が約１×１０^８～２×１０^９ｇｃ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
4. 前記用量が約１×１０^８～１×１０^９ｇｃ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
5. 前記用量が約２×１０^８～１×１０^９ｇｃ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
6. 前記用量が約２×１０^８～６×１０^８ｇｃ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
7. 貧血を有する前記ネコ対象が、約２８％またはそれ未満の血中血球容積（ＰＣＶ）を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 貧血を有する前記ネコ対象が、約１０％～約２８％の範囲のＰＣＶを有する、請求項７に記載の方法。
9. 貧血を有する前記ネコ対象が、約２２％～約２８％の範囲のＰＣＶを有する、請求項７に記載の方法。
10. 貧血を有するネコ前記対象が約２２．５％のＰＣＶを有する、請求項７に記載の方法。
11. 前記用量が、前記組成物の投与後７０日目までに、前記ネコ対象における前記ＰＣＶを約３０％～約５５％の値に増加させるのに有効である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記用量が、前記組成物の投与後７０日目までに、前記ネコ対象における前記ＰＣＶを約３０％～約３５％の値に増加させるのに有効である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記用量が、前記組成物の投与後７０日目までに、前記ネコ対象における前記ＰＣＶを約３３％～約３５％の値に増加させるのに有効である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記用量が、前記組成物の投与後７０日目までに、前記ネコ対象における前記ＰＣＶを約５～約３０ＰＣＶ％ポイントの量、増加させるのに有効である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記用量が、前記組成物の投与後７０日目までに、前記ネコ対象における前記ＰＣＶを約１０～約２０ＰＣＶ％ポイントの量、増加させるのに有効である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記用量が、前記組成物の投与後７０日目までに、前記ネコ対象における前記ＰＣＶを約１５ＰＣＶ％ポイント増加させるのに有効である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記ネコ対象が赤血球増加症のための処置を必要としない、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記組成物が、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量として筋肉内に投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記方法が、前記ネコ対象に前記組成物の後続の用量を投与することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記後続の用量が、前記組成物の最初の投与後約２８日目から約５６日目までに前記ネコ対象に投与される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記後続の用量が、前記組成物の最初の投与後約４０日目から約４５日目までに前記ネコ対象に投与される、請求項１９に記載の方法。
22. 前記ネコＥＰＯが完全長ネコＥＰＯタンパク質である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記核酸配列が、異種のリーダー配列と組み合わせた成熟ネコＥＰＯタンパク質をコードする、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ネコＥＰＯ配列が、配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記ネコＥＰＯをコードする前記核酸配列が、配列番号２の核酸配列またはこれと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記核酸配列がコドン最適化されている、請求項２５に記載の方法。
27. 前記発現制御配列がプロモーターを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記プロモーターがＣＢ７プロモーターである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記プロモーターがＴＢＧプロモーターである、請求項２７に記載の方法。
30. 前記発現制御配列が組織特異的プロモーターを含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記組織特異的プロモーターが腎臓特異的プロモーターまたは筋肉特異的プロモーターである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記組織特異的プロモーターが、Ｎｋｃｃ２プロモーター、ウロモジュリンプロモーター、Ｋｓｐ－カドヘリンプロモーターおよびＴＨＰ遺伝子プロモーターから選択される、請求項３０に記載の方法。
33. 前記ＡＡＶキャプシドが、イントロン、コザック配列、ポリＡおよび転写後調節エレメントの１つまたはそれより多くをさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３ｂ．ＡＲ２．１２およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ８キャプシドである、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ１キャプシドである、請求項３４に記載の方法。
37. 前記ネコ対象が慢性腎臓疾患を有する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記組成物が前記ネコ対象に静脈内投与される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進するための医薬の製造における、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で投与するために製剤化されており、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、使用。
40. 前記組成物が、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量として筋肉内投与のために製剤化されている、請求項３９に記載の使用。
41. 貧血を有するネコ対象における赤血球恒常性を促進する上で使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、前記ネコ対象における赤血球恒常性を促進するのに有効な用量で投与するために製剤化されており、前記用量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０^９ゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）またはそれ未満である、医薬組成物。
42. 前記組成物が、約１．０×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの単位用量として筋肉内投与のために製剤化されている、請求項４１に記載の使用のための組成物。
43. 慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する方法であって、ＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記組成物は、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象に約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象に約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量で筋肉内に投与される、方法。
44. 前記ｒＡＡＶが約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量で投与され、各々が約３．６５×１０^９ゲノムコピーを含む２つの用量の形態で６ｋｇを超える体重のネコ対象に投与される、請求項４３に記載の方法。
45. 慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置するための医薬の製造におけるＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象への約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象への約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での筋肉内投与のために製剤化されている、使用。
46. 前記ｒＡＡＶが、各々が約３．６５×１０^９ゲノムコピーを含む２つの用量の形態で投与される、約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での、６ｋｇを超える体重のネコ対象への筋肉内投与のために製剤化されている、請求項４５に記載の使用。
47. 慢性腎臓疾患を有する貧血ネコ対象を処置する上で使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、ＡＡＶ１キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ＡＡＶ１キャプシドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、前記対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記ｒＡＡＶは、（ｉ）２～６ｋｇの体重のネコ対象への約３．６５×１０^９ゲノムコピー、または（ｉｉ）６ｋｇを超える体重のネコ対象への約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での筋肉内投与のために製剤化されている、医薬組成物。
48. 前記ｒＡＡＶが、各々が約３．６５×１０^９ゲノムコピーを含む２つの用量の形態で投与される、約７．３０×１０^９ゲノムコピーの用量での、６ｋｇを超える体重のネコ対象への筋肉内投与のために製剤化されている、請求項４７に記載の使用のための組成物。
49. ＡＡＶキャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む単位剤形であって、前記ＡＡＶキャプシドは、ネコエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする核酸配列と、ネコ対象における前記ＥＰＯの発現を指示する発現制御配列とを含み、前記単位剤形が、約１．２×１０^９～約５．０×１０^９ゲノムコピーの量で前記ｒＡＡＶを含む、単位剤形。
50. 前記単位剤形が、前記ｒＡＡＶを約３．６５×１０^９ゲノムコピーの量で含む、請求項４９に記載の単位剤形。
51. 前記剤形が筋肉内剤形である、請求項４９または請求項５０に記載の単位剤形。
52. 請求項４９～５１のいずれか一項に記載の単位剤形を含むキット。

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