JP2022508724A - 進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３（ｐｆｉｃ３）の治療のためのコドン最適化導入遺伝子 - Google Patents

Abstract

本開示は、進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３の治療に使用する遺伝子治療ベクターに関する。より具体的には、本発明は、ＰＦＩＣ３の治療のためのＭＤＲ３アイソフォームＡをコードするコドン最適化配列を含むアデノ随伴ウイルスベクターに関する。

Description

本開示は、進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３の治療に使用する遺伝子治療ベクターに関する。より具体的には、本発明は、ＰＦＩＣ３の治療のためのＭＤＲ３アイソフォームＡをコードするコドン最適化配列を含むアデノ随伴ウイルスベクターに関する。

進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３（ＰＦＩＣ３）は、多剤耐性タンパク質３（ＭＤＲ３）をコードするアデノシン三リン酸結合カセット、サブファミリーＢ、４（ＡＢＣＢ４）遺伝子の変異と関連する遺伝病である（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ ＥＣｌｉｎ Ｒｅｓ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１２；３６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ２６－３５）。肝細胞の小管膜に主に発現するこのタンパク質は、肝細胞膜から胆汁へのホスファチジルコリンの移行に関与するフロッパーゼ（ｆｌｏｐｐａｓｅ）である。ホスファチジルコリンは、混合ミセルの生成を通して胆汁酸塩の毒性を中和するために必要である。ＡＢＣＢ４遺伝子の変異により、適切なミセル形成が妨げられ、その結果、毛細胆管および胆管上皮が損傷され、胆汁鬱滞が引き起こされる（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ Ｅ．ら．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００１；１２０：１４４８－１４５８）。

現在、ＰＦＩＣ３の治療法は存在せず、したがって、満たされていない医療ニーズは非常に高い。ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）療法は一部の患者の症状を改善する可能性があるが、肝移植以外では現在のところＰＦＩＣ３に対する治癒的治療法はない。胆道変更術という形での外科的介入は、患者の転帰を改善する。しかし、感染症などの術後合併症やストーマ袋の問題は患者のＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）に影響を及ぼす一方で、肝硬変や肝癌のリスクは依然として残っている。肝臓移植は有効な治療であるが、そのような複雑な処理に伴う危険性、ならびに状態の再発の可能性を伴う（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｅｒｄら Ｗｏｒｌｄ Ｊ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１７；２３（５）：７６３－７７５）。

疾患発生の原因となる欠陥遺伝子を修正する遺伝子治療は、多くの疾患に対する有望な治療法である。しかしながら、この技術は依然として研究中である。ＰＦＩＣ３を治療または予防するための肝細胞におけるＡＢＣＢ４の安定な組み込みおよび発現は、ＷＯ２０１５／１３９０９３に開示されている。しかしながら、これらの組み込みベクター系は、挿入突然変異誘発を引き起こす潜在的な危険性である主な欠点を示す。進行性家族性肝内胆汁鬱滞３（ＰＦＩＣ３）のような肝臓状態を、ＡＢＣＢ４を含む種々の潜在的治療遺伝子を用いて治療するＲＮＡ療法は、ＷＯ２０１７／１００５５１においてのみ示唆された。したがって、挿入突然変異誘発を回避し、一方で安定かつ長期の導入遺伝子発現を可能にする遺伝子治療法を開発する必要性が依然として存在する。ここでは、罹患患者の胆汁中の毒性の原因を復帰させるために、胆汁鬱滞性肝臓での高発現の成功を可能にするＭＤＲ３アイソフォームＡをコードするコドン最適化配列によるＰＦＩＣ３遺伝子療法について述べる。

驚くべきことに、本発明者らは、野生型ＭＤＲ３アイソフォームＡとは対照的に、ＭＤＲ３アイソフォームＡのコドン最適化配列が、インビボで投与された場合、肝細胞の小管膜において特異的に効率的な発現を示したことを見出した。ＰＦＩＣ３症状の大部分を再現するＡｂｃｂ４^－／－ノックアウトマウスにおいて、ＭＤＲ３アイソフォームＡのコドン最適化バージョンをコードするＡＡＶの投与は、ＰＦＩＣ３血清バイオマーカーレベルの有意な回復、肝臓および脾臓の大きさの低下、胆汁ホスファチジルコリンの増加および肝臓形態異常の補正のような長期治療効果を達成する。

したがって、本開示の第１の態様はＭＤＲ３アイソフォームＡをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物に関し、該導入遺伝子は、配列番号１によって表されるか、または配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列である。

特定の実施形態では、前記核酸構築物はさらに、宿主細胞への導入時に導入遺伝子発現を開始するプロモーター、好ましくは肝臓特異的プロモーター、より好ましくはα－１－アンチトリプシンプロモーターまたは胆汁酸塩誘導性プロモーターを含む。特定の実施形態では、前記ベクターはさらに、ポリアデニリル化シグナル配列、例えば配列番号３の配列を有する合成ポリアデニリル化シグナル配列を含む。

特定の実施形態では、前記核酸構築物はさらに、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、特にＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を含む。

より特定の実施形態では、前記核酸構築物は、配列番号４の核酸配列または配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

別の態様では、前記核酸構築物が、発現ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはＡＡＶベクターに含まれる。

本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含み、好ましくは、ＡＡＶタイプ３３Ａ、ＡＡＶタイプ３３Ｂ、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、ＬＫ０３、ＡＡＶ３－ＳＴ、Ａｎｃ８０およびＡＡＶ８血清タイプからなる群より選択されるカプシドタンパク質などのアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子に関する。

本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞、または、本発明のウイルス粒子で形質導入された宿主細胞に関する。

本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、またはウイルス粒子を、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて含み、また、任意に他の活性成分を含む、薬学的組成物に関する。

本発明はまた、それを必要とする対象者における進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３の予防および／または治療などの薬剤として使用するための、本発明の生成物に関する。特定の実施形態では、対象者が、新生児、乳児、小児または成人、好ましくは新生児、乳児または小児、より好ましくは新生児または小児である。

また、本明細書には、
ａ）上記のような宿主細胞を培養培地中で培養する工程、および、
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程
を含む、上記のようなウイルス粒子を製造するためのプロセスが開示される。

本開示はまた、上述したような、核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、ウイルス粒子、または薬学的組成物を、１つ以上の容器中に含み、随意的に、さらに、取扱説明書またはパッケージング材料を含むキットに関する。

示されたヒトＭＤＲ３アイソフォームを発現するプラスミドでトランスフェクションされたＨｕｈ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像である。Ｗｔ：野生型配列、ｃｏ：コドン最適化配列。核をＤＡＰＩで染色した。 示されたヒトＭＤＲ３アイソフォームを発現するプラスミドでトランスフェクションされたＨｕｈ７細胞の共焦点顕微鏡像である。アイソフォームＢｗｔ、Ｂｃｏ、Ｃｗｔ、およびＣｃｏに対し、ＭＤＲ３の細胞質局在化を実証する直交投影が示される。Ｗｔ：野生型配列、ｃｏ：コドン最適化配列。核をＤＡＰＩで染色した。 ＨＤＩ（裸のＤＮＡ転写）を介してｐＡＡＶ－ＭＤＲ３プラスミドを注射されたマウス由来の肝臓切片におけるＭＤＲ３発現である。ＭＤＲ３アイソフォームＡｃｏを注射した１匹のマウスからの３つの画像を示し（左パネル）、ＭＤＲ３アイソフォームＡｗｔを注射した両方のマウスを示す（右パネル）。 ＡＡＶＡｎｃ８０－ＭＤＲ３－Ａｃｏベクターで処理した３週齢のＡｂｃｂ４^－／－マウスにおける胆汁ＰＣ濃度である。ＡＡＶ用量をｘ軸の下に示す。雄（Ｍ）は塗りつぶされたシンボルであり、雌（Ｆ）は白抜きのシンボルである。 ＡＡＶＡｎｃ８０－ＭＤＲ３－Ａｃｏ処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスにおける血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）および胆汁酸塩（ＢＳ）レベルである。雄は塗りつぶされたシンボルで示され、雌は白抜きのシンボルで示されている。サンプルを、処理後５日、１週、２週および３週で収集した。ｄ、日；ＷＴ、Ａｂｃｂ４^＋／＋マウス；ＫＯ、Ａｂｃｂ４^－／－マウス。 ２週齢でＡＡＶＡｎｃ８０－ＭＤＲ３－Ａｃｏで処理し、３週間後に屠殺したＡｂｃｂ４^－／－マウス（ＫＯ）の脾臓および肝臓の重量（体重の割合として）を、未処理のＡＢＣＢ４^－／－（方形）または野生型（ｗｔ）マウス（三角）と比較したものである。雄（Ｍ）は塗りつぶされたシンボルで示され、雌（Ｆ）は白抜きのシンボルで示される。＊，ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意ではない。 生理食塩水（Ａ＆Ｄ）またはＡＡＶＡｎｃ８０－ＭＤＲ３－Ａｃｏを１．５×１０^１３（Ｂ＆Ｅ）または５×１０^１３（Ｃ＆Ｆ）で２週齢で処理し、３週間後に屠殺した雄Ａｂｃｂ４^－／－マウス（ＫＯ）における肝臓のシリウスレッド（Ａ－Ｃ）およびマッソントリクローム（Ｄ－Ｆ）染色である。（Ｇ）シリウスレッド染色について陽性の面積パーセントの定量を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを介して行った。＊：ｐ＜０．０５；ｎｓ：有意ではない。 未処理のＡｂｃｂ４^－／－（方形）またはｗｔマウス（三角）と比較して、２週齢でＡＡＶＡｎｃ８０－ＭＤＲ３－Ａｃｏで処理し、３週間後に屠殺したＡｂｃｂ４^－／－マウス（ＫＯ）の胆汁ＰＣ濃度である。雄（Ｍ）は塗りつぶされたシンボルで示され、雌（Ｆ）は白抜きのシンボルで示される。＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 ＡＡＶ８－ＭＤＲ３－Ａｃｏで処理したＡｂｃｂ４^－／－マウスにおける血清バイオマーカーである。雄（Ｍ）は塗りつぶされたシンボルで示され、雌（Ｆ）は白抜きのシンボルで示される。処理からの週をｘ軸のすぐ下に示し、そして各群についてのＡＡＶ用量を下に示す。 ＡＡＶ８－ＭＤＲ３－Ａｃｏで処理し、１２週間後に屠殺したＡｂｃｂ４^－／－マウス（ＫＯ）の脾臓および肝臓重量（体重の割合として）を、未処理のＡＢＣＢ４^－／－（ＫＯ）または野生型（ｗｔ）マウスと比較したものである。雄（Ｍ）は塗りつぶされたシンボルで示され、雌（Ｆ）は白抜きのシンボルで示される。＊＊＊，ｐ＜０．００１ ＊＊、ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意ではない。 生理食塩水（上）またはＡＡＶ８－ＭＤＲ３－Ａｃｏで５×１０^１３ ＶＧ／ｋｇ（中央）で処理し、１週間後に採取したＡｂｃｂ４^－／－マウスからの肝臓切片の抗ＭＤＲ３抗体でのＩＨＣ染色である。野生型マウス（ＷＴ）肝臓切片の染色は、対照および陽性対照として含める（下）。 Ａｂｃｂ４^－／－マウスにおけるＡＡＶ８－ＭＤＲ３－Ａｃｏの用量範囲設定研究のための血清バイオマーカーレベルである。指示された血清マーカーをベクター投与１～１０週後に分析した。雄（Ｍ）は塗りつぶされたシンボルで示され、雌（Ｆ）は白抜きのシンボルで示される。ＡＡＶ用量をｘ軸の下に示す。 ５週齢で処理したＡｂｃｂ４^－／－マウスからの血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルである。野生型（ＷＴ）動物を灰色の白丸で示し、生理食塩水処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを黒四角で示し、ＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｃｏ処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを黒丸で示す。雄は左側のグラフに示され、雌は右側のグラフに示される。 ５週齢で処理したＡｂｃｂ４^－／－マウスからのアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）および胆汁酸塩（ＢＳ）レベルである。野生型（ＷＴ）動物を灰色の白丸で示し、生理食塩水処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを黒四角で示し、ＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｃｏ処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを黒丸で示す。雄は左側のグラフに示され、雌は右側のグラフに示される。 ５週齢で処理したＡｂｃｂ４^－／－マウスにおける肝臓（ａ）および脾臓（ｂ）の重量（体重の割合として）である。野生型（ＷＴ）動物を灰色の菱形で示し、生理食塩水処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを白丸で示し、ＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｃｏ処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを黒い三角で示す。 ５週齢で処理したＡｂｃｂ４^－／－マウスにおける胆汁ＰＣ（ｃ）、線維症（ｄ）、およびＭＤＲ３タンパク質発現（ｅ）である。野生型（ＷＴ）動物を灰色の菱形で示し、生理食塩水処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを白丸で示し、ＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｃｏ処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスを黒い三角で示す。

本発明はＭＤＲ３アイソフォームＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００４３４．１）をコードするコドン最適化配列を含む導入遺伝子に関するものである。ＭＤＲ３遺伝子と名付けられたＡＢＣＢ４遺伝子によってコードされる膜関連タンパク質は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターのスーパーファミリーのメンバーである。この遺伝子はホスファチジルコリンを基質とする膜タンパク質の完全なトランスポーターとｐ‐糖タンパク質ファミリーのメンバーをコードし、肝細胞から胆汁へのリン脂質の輸送に関与している可能性がある。この遺伝子の選択的スプライシングにより、Ａ、ＢおよびＣと名づけられた３つの潜在的なアイソフォームが生じる。

本明細書中で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする外因性ＤＮＡまたはｃＤＮＡをいう。遺伝子産物は、ＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質であり得る。遺伝子産物のコード領域に加えて、導入遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、レポーターエレメント、インシュレーターエレメント、ポリアデニル化シグナルおよび／または他の機能的エレメントのような、発現を促進または増強するための１つ以上のエレメントを含み得るか、またはそれと関連し得る。本発明の実施形態は、任意の公知の適切なプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、レポーターエレメント、インシュレーターエレメント、ポリアデニル化シグナルおよび／または他の機能エレメントを利用し得る。適切なエレメントおよび配列は、当業者に周知である。

〔核酸構築物〕
より詳細には、本発明は、ＭＤＲ３アイソフォームＡをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物に関し、該導入遺伝子は配列番号１もしくは２によって表されるか、または配列番号１もしくは２と少なくとも９０％の同一性を有する。

用語「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、モノマーヌクレオチドから構成されるか、またはモノマーヌクレオチドを含む任意の分子を指すために、互換的に使用され得る。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾されていても、人工的であってもよい。ヌクレオチド配列には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらの配列の各々は、分子の骨格への変更によって、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオエート型ヌクレオチドが使用されてもよい。他のデオキシヌクレオチドアナログには、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’－ホスホラミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートならびにそれらの２’－０－アリルアナログおよび２’－０－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが含まれ、これらは本発明のヌクレオチドに使用することができる。

「核酸構築物」という用語は、本明細書中で使用される場合、組み換えＤＮＡ技術の使用から生じる人工核酸分子をいう。核酸構築物は核酸配列のセグメントを含むように修飾された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子であり、これらはさもなければ天然には存在しない様式で組み合わされ、そして並置される。核酸構築物は通常、「ベクター」、すなわち、外因的に作製されたＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される核酸分子である。

本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列のアラインメントからの位置における一致（同一の核酸残基）の数をいう。配列同一性は配列ギャップを最小限にしながら、重複および同一性を最大限にするようにアラインメントされた場合の配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに依存して、多数の数学的グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。同様の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントさせるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；４８（３）：４４３－５３）を使用してアラインメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ．；９１（２）：３７９－８０）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；２５（１７）：３３８９－４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．；２１（８）：１４５１－６））を使用してアラインメントされる。核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の範囲内である様々な方法で、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／のようなインターネットウェブサイト上で利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを行うために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書中の目的のために、％核酸配列同一性値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作製するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成される値をいい、ここで、全ての検索パラメーターはデフォルト値、すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０およびエンドギャップ伸長＝０．５に設定される。

本明細書中で使用される場合、前記核酸構築物は、本発明によるＭＤＲ３アイソフォームＡをコードする導入遺伝子、および前記コード配列の発現に必要な１つ以上の制御配列を含む。一般に、核酸構築物は、コード配列および選択された遺伝子産物の発現に必要なコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含む。したがって、核酸構築物は、典型的にはプロモーター配列、コード配列、および通常ポリアデニル化部位および／または転写ターミネーターを含む３’非翻訳領域を含む。核酸構築物はまた、さらなる調節エレメント（例えば、エンハンサー配列、ベクター内のＤＮＡフラグメントの挿入を容易にするポリリンカー配列および／またはスプライシングシグナル配列）を含み得る。

一実施形態では、核酸構築物はプロモーターを含む。前記プロモーターは、宿主細胞への導入時に導入遺伝子発現を開始する。本明細書で使用する「プロモーター」という用語はそれが作動可能に連結されている核酸の転写を指示する調節エレメントを指す。プロモーターは、作動可能に連結された核酸の転写の速度および効率の両方を調節することができる。プロモーターはまた、核酸のプロモーター依存性転写を増強する（「エンハンサー」）または抑制する（「リプレッサー」）他の調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。これらの調節エレメントは、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するために直接的または間接的に作用することが当業者に公知のヌクレオチドの任意の他の配列（例えば、アテニュエーター、エンハンサー、およびサイレンサーを含む）を含むが、これらに限定されない。プロモーターは、作動可能に連結されている遺伝子またはコード配列の転写開始部位の近く、ＤＮＡ配列の同じ鎖および上流（センス鎖の５’領域に向かって）に位置する。プロモーターは、約１００～１０００塩基対の長さであり得る。プロモーター中の位置は、特定の遺伝子についての転写開始部位に対して指定される（すなわち、上流の位置は－１から数えて負の数であり、例えば、－１００は１００塩基対上流の位置である）。

本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、機能的関係にあるポリヌクレオチド（またはポリペプチド）素子の連結をいう。核酸がそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたは転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結された手段は連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続していることである；２つのタンパク質コード領域を連結しなければならない場合、それらは連続しており、リーディングフレームにある。

特定の実施形態において、本発明の核酸構築物はさらに、本発明の導入遺伝子に作動可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む。本発明との関連において、「肝臓特異的プロモーター」は、身体の任意の他の組織よりも肝臓においてより活性であるプロモーターである。典型的には、肝臓特異的プロモーターの活性は、他の組織よりも肝臓においてかなり大きい。例えば、このようなプロモーターは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも１０倍活性であり得る（例えば、他の細胞または組織における発現を駆動する能力と比較して、所定の組織における発現を駆動する能力によって決定される）。したがって、肝臓特異的プロモーターはそれに連結された遺伝子の肝臓における活性発現を可能にし、他の細胞または組織におけるその発現を妨げる。

１つの実施形態において、肝臓特異的プロモーターは、α１－アンチトリプシン遺伝子プロモーター（ＡＡＴまたはＡ１ＡＴ）（配列番号６）、胆汁酸塩誘導性プロモーター（配列番号７または８）、またはアルブミン遺伝子エンハンサー要素（Ｅａｌｂ）と結合したα１－アンチトリプシン遺伝子プロモーター配列（ＡＡＴまたはＰａ１ＡＴ）を含むキメラプロモーター配列ＥａｌｂＰａ１ＡＴである。これらのプロモーター配列はすべて肝臓特異的プロモーターの性質をもっている。

これらの核酸構築物の実施形態の各々はまた、ポリアデニリル化シグナル配列を、他の任意のヌクレオチド素子と共に、または他の任意のヌクレオチド素子と共に含まなくてもよい。本明細書中で使用される、用語「ポリアデニル化シグナル」または「ポリ（Ａ）シグナル」は遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の特異的認識配列を意味し、これは前駆体ｍＲＮＡ分子に転写され、遺伝子転写の終結を誘導する。ポリ（Ａ）シグナルは、新たに形成された前駆体ｍＲＮＡの３’末端でのエンドヌクレアーゼによる切断、およびアデニン塩基のみからなるＲＮＡ伸長部分のこの３’末端への付加のシグナルとして作用する（ポリアデニル化プロセス；ポリ（Ａ）尾部）。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの核輸送、翻訳、および安定性に重要である。本発明との関連において、ポリアデニル化シグナルは、哺乳動物細胞における哺乳動物遺伝子および／またはウイルス遺伝子のポリアデニル化を指示し得る認識配列である。

ポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、ａ）プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）の３’末端切断およびポリアデニル化の両方に必要であること、ならびに下流転写終結を促進することが示されているコンセンサス配列ＡＡＵＡＡＡ、および、ｂ）ポリ（Ａ）シグナルとしてのＡＡＵＡＡＡの利用効率を制御するＡＡＵＡＡの上流および下流のさらなる素子からなる。哺乳類の遺伝子では、これらのモチーフにかなりのばらつきがある。

１つの実施形態において、必要に応じて、上記または下記の様々な実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせて、本発明の核酸構築物のポリアデニリル化シグナル配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子のポリアデニリル化シグナル配列である。適当なポリアデニル化シグナルには、とりわけ、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ ＥＩｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、インシリコ設計ポリアデニル化シグナル（合成）などが含まれる。

特定の実施形態において、核酸構築物のポリアデニリル化シグナル配列は、ウサギβグロビン遺伝子に基づく合成ポリ（Ａ）シグナル配列、より詳細には配列番号３の配列を有する合成ポリ（Ａ）である。

〔発現ベクター〕
本発明の核酸構築物は、発現ベクターに含まれ得る。本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」は遺伝物質を転写するための、そして特に、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞中に核酸を送達するためのビヒクルとして使用される核酸分子をいう。発現ベクターはまた、このような配列に適合する宿主細胞または宿主生物において遺伝子（導入遺伝子）の発現を達成することができる核酸分子をいう。発現ベクターは、典型的には少なくとも適切な転写調節配列および場合により３’転写終結シグナルを含む。正確な誘導シグナル（内因性またはキメラ転写因子）に応答することができる発現エンハンサーエレメント、または特定の細胞、器官または組織に特異的な発現エンハンサーエレメントのような、発現を達成するのに必要または役立つさらなる因子も存在し得る。ベクターにはプラスミド、ファスミド、コスミド、転移因子、ウイルス、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のベクターは、遺伝子または細胞治療における使用に適したベクターであり、特に肝細胞を標的とするのに適している。

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＶ、ＭＰＳＶまたはＳＮＶ、レンチウイルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）またはウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシ乳頭腫ウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハルビーマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳房腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。

当技術分野で知られているように、使用すると考えられる特定のウイルスベクターに応じて、機能的ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター用のＡＡＶ ＩＴＲ、またはレンチウイルスベクター用のＬＴＲを得るために、本発明のベクターに適切な配列を導入すべきである。特定の実施形態では、前記ベクターはＡＡＶベクターである。

ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療のための潜在的ベクターとしてかなりの関心が生じている。このウイルスの好ましい特性の中には、あらゆるヒト疾患との関連性がないこと、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力があること、感染可能な異なる組織に由来する広範囲の細胞株があることが挙げられる。ＡＡＶゲノムは、４６８１個の塩基を含む線状の一本鎖ＤＮＡ分子から構成される（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ、１９８７、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）３２：２４３－３０７）。ゲノムは両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはＤＮＡ複製の起点としてシスで機能し、ウイルスのパッケージングシグナルとして機能する。ＩＴＲの長さは約１４５ｂｐである。ゲノムの内部非反復部分には２つの大きなオープンリーディングフレームがあり、それぞれＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子として知られている。これらの遺伝子は、ビリオンの複製とパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードしている。特に、少なくとも４つのウイルスタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２およびＲｅｐ ４０から合成され、それらの見かけの分子量に従って命名される。ＡＡＶｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の少なくとも３つのタンパク質をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．１９９２ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ＭｉｃｒｏｂｉｏｌおよびＩｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９を参照のこと。

したがって、一実施形態では、本発明の導入遺伝子を含む核酸構築物はさらに、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「逆方向末端反復（ＩＴＲ）」は、ウイルスの５’末端（５’ＩＴＲ）に位置するヌクレオチド配列、およびウイルスの３’末端（３’ＩＴＲ）に位置するヌクレオチド配列をいい、これは、パリンドローム配列を含み、そしてＤＮＡ複製の開始の間にプライマーとして機能するＴ型ヘアピン構造を形成するように折り畳まれ得る。これらは、ウイルスゲノムの宿主ゲノムへの組み込み、宿主ゲノムからのレスキュー、ウイルス核酸の成熟ビリオンへのカプシド封入にも必要である。ＩＴＲはベクターゲノムの複製とウイルス粒子へのパッケージングにシスで必要である。

本発明のベクターにおける使用のためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有し得るか、または挿入、欠失もしくは置換によって改変され得る。ＡＡＶベクターの逆方向末端反復（ＩＴＲ）の血清型は、任意の公知のヒトまたは非ヒトＡＡＶ血清型から選択され得る。特定の実施形態では、発現ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在知られているまたは後に発見された任意の他のＡＡＶ血清型を含む任意のＡＡＶ血清型のＩＴＲを用いることによって実施され得る。

一実施形態では、核酸構築物はさらに、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。

特定の実施形態において、本発明の核酸構築物は、配列番号４もしくは５を含むか、またはそれらからなるか、または配列番号４もしくは５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。

一実施形態では、本発明による核酸構築物またはＡＡＶベクターゲノムは、組み換えバキュロウイルスゲノムに含まれる。本明細書中で使用される「組み換えバキュロウイルスゲノム」という用語は、バキュロウイルス感染および複製を許容する宿主細胞（典型的には昆虫細胞）中での組み換えバキュロウイルスゲノムの自律的複製のためのバキュロウイルス遺伝要素を含む核酸を意味する。明らかに、「組み換えバキュロウイルスゲノム」という用語は、バキュロウイルスに異種性である核酸を含むゲノムを含む。同様に、「組み換えバキュロウイルスゲノム」という用語は、ゲノムが感染サイクルの完了のために必要ではないウイルス配列を欠いていてもよいので、必ずしも完全なバキュロウイルスゲノムを意味しない。特に、組み換えバキュロウイルスゲノムは、ｒＡＡＶ生成に有用な異種ＡＡＶ遺伝子および／または遺伝子治療に使用するためにｒＡＡＶにカプシド封入されるコドン最適化したＭＤＲ３アイソフォームＡなどの導入遺伝子を含み得る。本開示において使用するバキュロウイルス遺伝子エレメントは、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）から得られることが好ましい。

特定の実施形態では、前記第１および第２のバキュロウイルスゲノム中のバキュロウイルスカテプシンおよびキチナーゼをコードする遺伝子が破壊または欠失される。特に、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスの遺伝子ｖ－ｃａｔｈ（Ａｃ１２７）およびｃｈｉＡ（Ａｃ１２６）は、対応するカテプシンまたはキチナーゼが発現されないか、または不活性型として発現される（すなわち、酵素カテプシンまたはキチナーゼ活性を有さない）ように破壊または欠失され得る。特定の実施形態において、前記組み換えバキュロウイルスゲノムは、少なくともｐ２４遺伝子（Ａｃ１２９）、好ましくは３つのバキュロウイルス遺伝子ｐ１０（Ａｃ１３７）、ｐ２４およびｐ２６（Ａｃ１３６）についてさらに破壊または欠失される。特定の実施形態では、前記組み換えバキュロウイルスゲノムは、機能的ｐ７４バキュロウイルス遺伝子（Ａｃ１３８）を含む（すなわち、前記遺伝子は欠失または破壊されていない）。

一方、本発明の核酸構築物または発現ベクターは、合成的５’ＩＴＲおよび／または３’ＩＴＲを使用することによって；ならびに異なる血清型のウイルスに由来する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを使用することによっても実施され得る。ウイルスベクター複製に必要な他の全てのウイルス遺伝子は、以下に記載されるように、ウイルス生成細胞（パッケージング細胞）内にトランスで提供され得る。したがって、ウイルスベクターへのそれらの包含は任意である。

一実施形態では、本発明の核酸構築物またはウイルスベクターは、ウイルスの５’ＩＴＲ、ψパッケージングシグナル、および３’ＩＴＲを含む。「ψパッケージングシグナル」はウイルスゲノムのシス作用性ヌクレオチド配列であり、いくつかのウイルス（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス…）では、複製中にウイルスゲノムをウイルスカプシドにパッケージングするプロセスに不可欠である。

組み換えＡＡＶウイルス粒子の構築は当該分野で一般に公知であり、そして例えば、ＵＳ ５，１７３，４１４およびＵＳ ５，１３９，９４１；ＷＯ ９２／０１０７０、ＷＯ ９３／０３７６９、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ、ＢＪ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ（１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７－１２９；およびＫｏｔｉｎ、ＲＭ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１に記載されている。

〔ウイルス粒子〕
本発明の核酸構築物または発現ベクターは、「ウイルスベクター粒子」とも呼ばれる「ウイルス粒子」を生成するためにウイルスカプシドにパッケージングされてもよい。特定の実施形態では、核酸構築物または発現ベクターは、「アデノ随伴ウイルス粒子」または「ＡＡＶ粒子」を生成するためにＡＡＶ由来カプシドにパッケージングされる。本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含み、好ましくはアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含むウイルス粒子に関する。

ＡＡＶベクター粒子という用語は、遺伝子操作された任意の組み換えＡＡＶベクター粒子または突然変異体ＡＡＶベクター粒子を包含する。組み換えＡＡＶ粒子は、同じまたは異なる血清型のＡＡＶに対応する天然または突然変異体Ｃａｐタンパク質によって形成されるウイルス粒子上に、特定のＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲを含む核酸構築物またはウイルス発現ベクターをカプシド封入することによって調製され得る。

アデノ随伴ウイルスのウイルスカプシドのタンパク質には、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３がある。様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質配列の相違は、細胞侵入のための異なる細胞表面受容体の使用をもたらす。これは、別の細胞内プロセシング経路と組み合わせて、各ＡＡＶ血清型に対して異なる組織親和性を生じる。天然に存在するＡＡＶウイルス粒子の構造的および機能的特性を改変および改善するために、いくつかの技術が開発されている（Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈら Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２００８；１０：７１７－７３３；Ｐａｕｌｋら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１８．２６（１）：２８９－３０３；Ｗａｎｇ Ｌら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１５．２３（１２）１８７７－８７；Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１６．２４（６）：１０４２－１０４９；Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１５；１２（６）：１０５６－６８）。

したがって、本開示によるＡＡＶウイルス粒子において、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲを含む核酸構築物またはウイルス発現ベクターは、例えば、以下のようにパッケージングされ得る：
ａ）同一または異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ５カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡｎｃ８０カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質）に由来するカプシドタンパク質で構成されるウイルス粒子；
ｂ）異なるＡＡＶ血清型または突然変異体由来のカプシドタンパク質の混合物で構成されるモザイクウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）；
ｃ）異なるＡＡＶ血清型または変異体（例えば、ＡＡＶ３ドメインを有するＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）間のドメインスワッピングにより切断されたカプシドタンパク質で構成されるキメラウイルス粒子。

当業者は、本開示によるＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４（Ｐａｕｌｋら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８．２６（１）：２８９－３０３）、ＬＫ０３（Ｗａｎｇ Ｌら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５（１２）：１８７７－８７）、ＡＡＶ３－ＳＴ（Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６．２４（６）：１０４２－１０４９）、Ａｎｃ８０（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１５；１２（６）：１０５６－６８）および現在知られているまたは後に発見された他のＡＡＶ血清型を含む任意のＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含み得ることを認識するであろう。

特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、肝細胞への送達に、より適したＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群より選択される血清型由来のカプシドタンパク質を含む（Ｎａｔｈｗａｎｉら、Ｂｌｏｏｄ ２００７；１０９：１４１４－１４２１；Ｋｉｔａｊｉｍａら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００６；１８６：６５－７３）。

特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、肝臓、筋肉および網膜を標的とするための非常に強力な遺伝子治療ベクターとして挙動する、ウイルスＡＡＶ血清型１、２、８および９の予測される祖先であるＡｎｃ８０由来のカプシドタンパク質を含む（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ．２０１５；１２（６）：１０５６－６８）。より特定の実施形態では、ウイルス粒子は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３カプシドタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＫＴ２３５８０４）を含む。

したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含み、そして好ましくはＡｎｃ８０およびＡＡＶ８血清型、より好ましくはＡＡＶ８血清型由来のカプシドタンパク質のようなアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子に関する。

特定の実施形態では、ウイルス粒子は、組み換えバキュロウイルスに含まれるＡＡＶベクターゲノムを含む。したがって、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐを含む第２の組み換えバキュロウイルスゲノムが、ＡＡＶウイルス粒子を生成するために使用される。特定の実施形態において、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、異なるバキュロウイルス後期プロモーターから、好ましくは逆方向で発現される。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、第２のバキュロウイルスゲノムは、ｒｅｐタンパク質、例えば、バキュロウイルス多面体（Ｐ_Ｐｈ）プロモーターの転写制御下にあるＡＡＶ２由来のｒｅｐタンパク質をコードする異種核酸を含む。他の実施形態では、第２のバキュロウイルスゲノムは、ｐ１０バキュロウイルスプロモーターの転写制御下でｃａｐタンパク質をコードする異種核酸を含む。昆虫細胞における適切な発現のための、および／またはＶＰおよびビリオンの収率を増加させるための、またはビリオンの親和性を変化させるかまたは抗原性を減少させるための、野生型ＡＡＶ配列の他の改変もまた、当該分野で公知である。ＡＡＶ血清型のｒｅｐ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）および異なる血清型ＡＡＶのｃａｐ ＯＲＦをコードするヘルパーバキュロウイルス構築物を用いることにより、所定のＡＡＶ血清型のＩＴＲに隣接するベクターを、異なる血清型の構造カプシドタンパク質から集合したビリオンにパッケージングすることが可能である。モザイクベクター、キメラベクターまたは標的ベクターをパッケージングすることも、この同じ手順によって可能である。

ウイルス－グリカン相互作用は宿主細胞侵入の重要な決定因子である。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は１つ以上のアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質を含み、ここで、この置換は、ＡＡＶカプシドタンパク質に新しいグリカン結合部位を導入する。より特定の実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＡＶ２中のアミノ酸２６６、アミノ酸４６３～４７５およびアミノ酸４９９～５０２、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡｎｃ８０およびＡｎｃ８０Ｌ６５を含む任意の他のＡＡＶ血清型中の対応するアミノ酸位置にある。

導入された新しいグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位［例えば、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）またはフコース（ｆｕｃ）結合部位］；シアル酸（Ｓｉａ）結合部位［例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＳＡｃ）またはＮ－グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＳＧｃ）などのＳｉａ残基］；または二糖類結合部位であってよく、二糖類は例えば、Ｓｉａ（α２，３）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌの形態でガラクトースに結合したシアル酸である。ＡＡＶ血清型からの新しい結合部位を別の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質に導入するための詳細なガイダンスは、国際特許公開ＷＯ２０１４１４４２２９およびＳｈｅｎら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０１３；２８８（４０）：２８８１４－２８８２３）に記載されている。特定の実施形態において、ＡＡＶ９由来のＧａｌ結合部位は、ＡＡＶ２ ＶＰ３骨格に導入され、細胞侵入のためにＨＳおよびＧａｌ受容体の両方を使用することができる二重グリカン結合ＡＡＶ歪を生じる。好ましくは、前記二重グリカン結合ＡＡＶ歪はＡＡＶ２Ｇ９である。Ｓｈｅｎらは、ＡＡＶ９ ＶＰ３カプシドタンパク質サブユニット上のＧａｌ認識部位に直接関連するまたは直接隣接するアミノ酸残基を、ＡＡＶ９ ＶＰ３サブユニットコード領域上の対応する残基に置き換えることによって、ＡＡＶ２Ｇ９を生成した（ＡＡＶ２ ＶＰ３番号Ｑ４６４Ｖ、Ａ４６７Ｐ、Ｄ４６９Ｎ、Ｉ４７０Ｍ、Ｒ４７１Ａ、Ｄ４７２Ｖ、Ｓ４７４Ｇ、Ｙ５００ＦおよびＳ５０１Ａ）。

別の実施形態では、本開示による使用のためのウイルス粒子は、Ａｄ５ウイルス粒子などのアデノウイルス粒子であってもよい。ＡＡＶウイルス粒子の場合のように、Ａｄウイルス粒子のカプシドタンパク質はまた、それらの親和性および細胞標的化特性を改変するように操作され得、代替のアデノウイルス血清型もまた使用され得る。

〔ウイルス粒子の製造プロセス〕
上記に開示される発現ウイルスベクターを保有するウイルス粒子の生成は、従来の方法およびプロトコールによって実施され得、これらは生成されるべきベクターの発現ベクターおよびウイルス粒子の実際の実施形態のために選択される構造的特徴を考慮して選択される。

簡潔には、ウイルス粒子は、宿主細胞、より詳細には、ヘルパーベクターまたはウイルスまたは他のＤＮＡ構築物の存在下で、パッケージングされる核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクションされる特異的ウイルス生成細胞（パッケージング細胞）において生成され得る。

本明細書中で使用される用語「パッケージング細胞」は、本発明の核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクションされ得る細胞または細胞株をいい、そしてウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングに必要とされる全ての欠失した機能をトランスで提供する。典型的には、パッケージング細胞は、構成的または誘導可能な様式で、１つ以上の前記欠失ウイルス機能を発現する。前記パッケージング細胞は、接着細胞または懸濁細胞であり得る。

典型的には、ウイルス粒子の製造プロセスは、以下の工程を含む：
ａ）上記の核酸構築物または発現ベクターを含むパッケージング細胞を培養培地中で培養する工程；および、
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程。

従来の方法を使用して、本発明の導入遺伝子を保有する核酸構築物または発現ベクター（例えば、プラスミド）；ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を保有しない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；ならびにＡＡＶ複製に必要なアデノウイルス機能を提供する第３の核酸構築物（例えば、プラスミド）との一過性細胞同時トランスフェクションにて存在するＡＡＶウイルス粒子を生成し得る。ＡＡＶ複製に必要なウイルス遺伝子はここではウイルスヘルパー遺伝子と称する。典型的には、ＡＡＶ複製に必要な前記遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、またはＶＡ ＲＮＡなどのアデノウイルスヘルパー遺伝子である。好ましくは、アデノウイルスヘルパー遺伝子は、Ａｄ５またはＡｄ２血清型のものである。

本開示によるＡＡＶ粒子の大規模製造はまた、例えば、組み換えバキュロウイルスの組み合わせを用いた昆虫細胞の感染によって実施され得る（Ｕｒａｂｅら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００２；１３：１９３５－１９４３）。ＳＦ９細胞を、ＡＡＶｒｅｐ、ＡＡＶｃａｐおよびパッケージングされるべきＡＡＶベクターをそれぞれ発現する２つまたは３つのバキュロウイルスベクターに同時感染させる。組み換えバキュロウイルスベクターは、ウイルス複製および／またはパッケージングに必要なウイルスヘルパー遺伝子機能を提供する。Ｓｍｉｔｈら ２００９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｖｏｌ．１７、ｎｏ．１１、ｐｐ １８８８－１８９６）はさらに、昆虫細胞におけるＡＡＶ粒子の大規模製造のための二重バキュロウイルス発現系を記載している。

適切な培養培地は、当業者に公知である。このような培地を構成する成分は、培養される細胞のタイプに依存して異なり得る。栄養組成物に加えて、浸透圧およびｐＨは、培養培地の重要なパラメーターと考えられる。細胞増殖培地は、アミノ酸、ビタミン、有機塩および無機塩、炭水化物の供給源、脂質、微量元素（ＣｕＳ０４、ＦｅＳ０４、Ｆｅ（Ｎ０３）３、ＺｎＳ０４…）を含む、当業者に周知の多くの成分を含み、各成分は、インビトロでの細胞の培養（すなわち、細胞の生存および増殖）を支持する量で存在する。成分はまた、緩衝物質（重炭酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓなど）、酸化安定剤、機械的ストレスを打ち消すための安定剤、プロテアーゼインヒビター、動物成長因子、植物加水分解物、凝集防止剤、消泡剤などの種々の補助物質を含んでもよい。細胞増殖培地の特性および組成は、特定の細胞要件に応じて異なる。市販の細胞増殖培地の例は、ＭＥＭ（最小必須培地）、ＢＭＥ（基礎培地Ｅａｇｌｅ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏにより改変したＥａｇｌｅ培地）、Ｉｓｃｏｖｅｓ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの培地のＩｓｃｏｖｅによる改変）、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５、ＭｃＣｏｙ’ｓ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｈａｍ（Ｈａｍの培地）Ｆ１０および誘導体、Ｈａｍ Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などである。

本開示による使用のためのウイルスベクターの構築および製造についてのさらなるガイダンスは、遺伝子治療のためのウイルスベクター、方法およびプロトコールに見出すことができる。シリーズ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７３７．ＭｅｒｔｅｎおよびＡｌ－Ｒｕｂｅａｉ（編）；２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍ． Ｇｉａｃｃａ．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ ＲおよびＷｅｇｅｒ Ｓ．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９７；Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（編）．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；ｐｐ．１４３－１７０；Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｒ．Ｏ．ＳｎｙｄｅｒおよびＰ．Ｍｏｕｌｌｌｉｅｒ（編）。２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈら Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００８；１０：７１７－７３３；；アデノウイルス：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍ． ＣｈｉｌｌｏｎおよびＡＢｏｓｃｈ（編）；Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ２０１４ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。

〔宿主細胞〕
別の態様において、本発明は、本発明の核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。より詳細には、本発明による宿主細胞は、ヘルパーベクターまたはウイルスまたは他のＤＮＡ構築物の存在下で、本発明による核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクションされ、ウイルス粒子の完全な複製およびパッケージングに必要とされる全ての欠失した機能をトランスで提供する、パッケージング細胞とも呼ばれる特異的ウイルス生成細胞である。前記パッケージング細胞は、接着細胞または懸濁細胞であり得る。

例えば、前記パッケージング細胞は真核細胞、例えば、哺乳動物細胞（サル、ヒト、イヌおよびげっ歯類細胞を含む）であり得る。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ０１／３８３６２）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ ＬＣ２）および胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ１６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）またはＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）である。齧歯類細胞の例は、ハムスター細胞、例えばＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはＣＨＯ細胞である。

哺乳動物供給源の代替として、ウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジなどのトリ供給源に由来し得る。鳥類細胞株の例には、鳥類胚幹細胞（ＷＯ０１／８５９３８およびＷＯ０３／０７６６０１）、不死化アヒル網膜細胞（ＷＯ２００５／０４２７２８）、およびニワトリ細胞（ＷＯ２００６／１０８８４６）を含む鳥類胚幹細胞由来細胞、またはＥＢ６６細胞株（ＷＯ２００８／１２９０５８およびＷＯ２００８／１４２１２４）などのアヒル細胞が含まれる。

別の実施形態において、細胞は、バキュロウイルス感染および複製パッケージング細胞を許容する任意の細胞であり得る。特定の実施態様において、前記細胞は昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）または高い Ｆｉｖｅ（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）である。

したがって、特定の実施形態では、任意選択で、上記または下記の様々な実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせて、宿主細胞は以下のものを含む：
・本発明によるＭＤＲ３アイソフォームＡをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物または発現ベクター（例えば、本発明によるＡＡＶベクター）、
・核酸構築物、例えば、ＩＴＲ配列を保有しないＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、および／または、
・ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物、例えばプラスミドまたはウイルス。

別の態様において、本発明は本発明のウイルス粒子で形質導入された宿主細胞に関し、そして本明細書中で使用される用語「宿主細胞」は、目的のウイルスによる感染に感受性であり、そしてインビトロでの培養に従順である任意の細胞株をいう。

本発明の宿主細胞は、生体外遺伝子治療目的のために使用され得る。このような実施形態において、細胞は、本発明のウイルス粒子で形質導入され、その後、患者または対象者に移植される。移植された細胞は、自家性、同種性または異種性の起源を有し得る。臨床使用のために、細胞単離は一般的にＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）条件下で実施される。移植の前に、細胞の質および微生物または他の汚染物質の不在を典型的にチェックし、放射線および／または免疫抑制処理などによる肝臓のプレコンディショニングを行うことができる。さらに、宿主細胞は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの、細胞増殖および／または分化を刺激するための成長因子とともに移植されてもよい。

特定の実施形態において、宿主細胞は、肝臓への生体外遺伝子治療のために使用される。好ましくは、前記細胞は、ヒト、類人猿、チンパンジー、サル、およびオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌおよびネコを含む飼育動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜、または限定されないがマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種などの真核細胞であるが、これらに限定されない。当業者は、移植される患者または対象者に従って、より適切な細胞を選択する。

前記宿主細胞は、幹細胞または誘導多能性幹細胞などの自己再生および多能性特性を有する細胞であってもよい。幹細胞は、好ましくは間葉幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または筋細胞の少なくとも１つに分化することができ、任意のタイプの組織から単離することができる。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、または末梢血から単離される。それらを得るための方法は、当業者に周知である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても知られる）は、成体細胞から直接生成できる多能性幹細胞の一種である。Ｙａｍａｎａｋａらは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子をマウスおよびヒト線維芽細胞に移入し、そして細胞に遺伝子を強制的に発現させることによって、ｉＰＳ細胞を誘導した（ＷＯ ２００７／０６９６６６）。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、続いて、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの代わりにＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を使用してヒトｉＰＳ細胞を生成した（ＷＯ ２００８／１１８８２０）。

前記宿主細胞はまた、肝細胞であってもよい。細胞単離およびその後のヒトまたはマウスレシピエントへの移植を含む肝細胞移植手順は例えば、ＦｉｌｉｐｐｉおよびＤｈａｗａｎ、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２０１４，１３１５ １３１５ ５０－５５；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９６，１１１：１６５４－１６６０；Ｉｒａｎｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１、３：３、３０２－３０９；およびＶｏｇｅｌら Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１４、３７：１６５－１７６に記載されている。ウイルスベクターの肝細胞への生体外形質導入のための方法は例えば、Ｍｅｒｌｅら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００６、４１：８、９７４－９８２に記載されている。

〔薬学的組成物〕
本開示の別の態様は、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、または宿主細胞を、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて含む薬学的組成物に関する。

本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能である」は、動物および／またはヒトにおける使用のために、規制当局によって承認されたか、または欧州薬局方のような認知されたことを意味する。用語「賦形剤」は、それと治療剤とが一緒に投与されるような、希釈剤、補助剤、担体、またはビヒクルをいう。

任意の適切な薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤が、薬学的組成物の調製において使用され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ ＲＧｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｐｒｉｌ １９９７を参照のこと）。薬学的組成物は典型的には無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定である。薬学的組成物は、溶液（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液、または他の薬学的に受容可能な滅菌流体）、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い生成物濃度を収容するのに適した他の秩序だった構造（例えば、微粒子またはナノ粒子）として処方され得る。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持される。多くの場合に、等張剤、例えば糖質、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。

注射可能な組成物の延長された吸収は組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。本発明の生成物は、制御放出製剤で、例えば、注入およびマイクロカプセル化送達システムを含む、生成物を急速放出から保護する徐放性ポリマーまたは他の担体を含む組成物で投与され得る。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸／ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ）などの生分解性および生体適合性ポリマーを使用することができる。好ましくは、前記薬学的組成物は、溶液として、より好ましくは、任意に緩衝化された生理食塩水溶液として製剤化される。補足的な活性化合物もまた、本発明の薬学的組成物に組み込むことができる。追加の治療薬の同時投与に関するガイダンスは例えば、カナダ薬学者協会の医薬品専門部会（ＣＰＳ）に見出すことができる。

一実施形態では、薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内投与に適した組成物を含む非経口薬学的組成物である。これらの薬学的組成物は、例示的なものにすぎず、他の非経口および非経口投与経路に適した薬学的組成物を限定するものではない。本明細書中に記載される薬学的組成物は、単一の単位用量形態または複数の用量形態でパッケージングされ得る。

〔治療的用途〕
さらなる態様において、本発明は、それを必要な対象者における薬剤として使用するための、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物に関する。

本明細書で使用される「対象者」または「患者」という用語は哺乳動物を指す。開示された治療方法から恩恵を受けることができる哺乳動物種には、ヒト、類人猿、チンパンジー、サル、およびオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌおよびネコを含む飼育動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜、または限定されないがマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記対象者は、新生児、乳児、または小児、より具体的には新生児または乳児である。本明細書で使用される「新生児」は２８日未満の乳児を指し、本明細書で使用される「乳児」は、２９日から２年の間の子供を指す。

さらなる態様において、本発明は、肝疾患、特にそれを必要とする対象者における家族性胆汁鬱滞タイプ３（ＰＦＩＣ３）の処理における使用のための、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物に関する。

本明細書中で使用される場合、用語「処理」は、疾患の治療、予防、予防法および遅延のような、患者の健康状態を改善することが意図される任意の行為をいう。特定の実施形態では、このような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、このような疾患を有する対象者への１つ以上の治療薬の投与から生じる疾患の広がりまたは悪化を最小限にすることを指す。

特定の実施形態では、肝疾患は、妊娠タイプ３（ＩＣＰ３）の肝内胆汁鬱滞、コレステロール胆石疾患、薬物誘発性胆汁鬱滞、一過性新生児胆汁鬱滞、成人特発性肝硬変、胆管癌、および家族性胆汁鬱滞タイプ３（ＰＦＩＣ３）からなる群より選択される。より特定の実施形態では、前記肝疾患は、家族性胆汁鬱滞タイプ３（ＰＦＩＣ３）である。

関連する態様において、本発明は、肝疾患の処理において使用するための、好ましくは家族性タイプ３胆汁鬱滞（ＰＦＩＣ３）の処理において使用するための薬剤の調製における、本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物の使用に関する。

さらなる態様において、本発明は、治療有効量の本発明の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または薬学的組成物を対象者に投与することを含む、それを必要とする対象者における肝疾患、好ましくは家族性胆汁鬱滞タイプ３（ＰＦＩＣ３）を治療および／または予防する方法に関する。

本発明との関連において、「有効量」は、治療有効量を意味する。本明細書において使用される場合、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間において有効な量をいい、例えば、血清中のバイオマーカーレベル、例えば、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、胆汁酸塩（ＢＳ）およびビリルビンの減少、胆汁ホスファチジルコリンまたは他のリン脂質濃度の回復をいう。本発明の生成物、またはそれを含む薬学的組成物の治療有効量は、個々の疾患状態、年齢、性別、および重量、ならびに個々において所望の応答を誘発する生成物または薬学的組成物の能力などの因子に従って異なり得る。用量・用法は、最適の治療応答を提供するために調節してよい。治療有効量はまた、典型的には、生成物または薬学的組成物の任意の毒性または有害な効果を治療上有益な作用が上回る量である。

本発明の生成物による治療は、家族性タイプ３胆汁鬱滞（ＰＦＩＣ３）の１つまたは複数の症状の重篤度を緩和、改善、または軽減低減することができる。例えば、治療により、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、胆汁酸塩（ＢＳ）およびビリルビンなどの血清中のバイオマーカーレベルが低下するか；または胆汁ホスファチジルコリンまたは他のリン脂質濃度が回復する可能性があり；その結果、胆管炎、細胆管増殖、胆管線維症、門脈圧亢進症、肝硬変、消化管出血、黄疸、胆汁鬱滞、そう痒症、および肝不全の重篤度を緩和、改善、または軽減低減しうる。

本発明の生成物は、典型的には、薬学的組成物または薬剤中に含まれ、場合により薬学的担体、希釈剤および／またはアジュバントと組み合わせて含まれる。このような組成物または薬剤は、所望の治療効果を提供するのに十分な有効量の本発明の生成物、および薬学的に受容可能な担体または賦形剤を含む。

１つの実施形態において、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、またはその治療用途のための薬学的組成物は、非経口経路によって、特に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内経路によって、対象者または患者に投与される。

１つの実施形態において、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、またはその治療用途のための薬学的組成物は間質経路によって、すなわち、組織の間隙への、またはその中への注入によって投与される。組織標的は、特異的であってもよく、例えば肝臓組織であってもよく、またはいくつかの組織、例えば筋肉組織および肝臓組織の組み合わせであってもよい。例示的な組織標的は、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着物、腎臓、肺、血管内皮、上皮および／または造血細胞を含み得る。好ましい実施形態において、それは、肝内注入、すなわち、肝組織の間質空間への注入によって投与される。

対象者または患者に投与される本発明の生成物の量は、個体の年齢、性別、および体重；疾患の性質および段階、疾患の攻撃性；投与経路；および／または対象者または患者に処方された併用薬を含む、個々の対象者または患者の特定の状況に依存して異なり得る。用量・用法は、最適の治療応答を提供するために調節してよい。

任意の特定の対象者について、特定の用量・用法は、個々の必要性、および組成物を投与するまたは投与を監督する人の専門的判断に従って、経時的に調節され得る。本明細書に記載される用量範囲は単に例示的なものであり、医師によって選択され得る用量範囲を限定するものではない。

一実施形態において、本発明によるＡＡＶウイルス粒子は、ＰＦＩＣ３病の治療のために、５×１０^１１～１×１０^１６ ｖｇ／ｋｇ（ｖｇ：ウイルスゲノム；ｋｇ：対象者または患者の体重）の範囲内に含まれる量または用量で対象者または患者に投与することができる。より特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、１×１０^１３～１×１０^１５ ｖｇ／ｋｇの範囲内に含まれる量で投与される。より特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、少なくとも２×１０^１３ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは４．５×１０^１３ ｖｇ／ｋｇ、より好ましくは５×１０^１３ ｖｇ／ｋｇ、より好ましくは８×１０^１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

〔キット〕
別の態様において、本発明はさらに、１つ以上の容器中に本発明の核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、ウイルス粒子または薬学的組成物を含むキットに関する。キットは、キット内に含まれる核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または薬学的組成物を患者に投与する方法を記載する取扱説明書またはパッケージング材料を含み得る。キットの容器は任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属など、および任意の適切なサイズ、形状、または構成であり得る。特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液形態の本発明の生成物を含有する１つ以上のアンプルまたはシリンジを含み得る。

以下の実施例は例示のために提供され、そしてそれらは本発明を限定することを意図しない。さらに、本発明は、本明細書に記載される特定の好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。

〔実施例〕
〔トランスフェクションによりインビトロで分析した６つのＭＤＲ３導入遺伝子変異体〕
ＡＢＣＢ４遺伝子は、肝細胞の小管膜に局在し、胆汁中のホスファチジルコリン（ＰＣ）濃度の調節を担うホスファチジルコリン（ＰＣ）トランスポータータンパク質である多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ３）をコードする。ＰＣは、胆汁酸と混合ミセルを形成し、ＰＣは、遊離胆汁酸によって引き起こされる組織損傷および毒性を減少させるのに役立つ。ＡＢＣＢ４の突然変異は毒性を引き起こす胆汁中のＰＣの欠乏につながり、それが胆汁鬱滞につながる可能性がある。その結果生じる障害は、進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３である（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ、Ｅ．２０１２、Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；３６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ２６－３５）。ＭＤＲ３に対して３種類のアイソフォームが存在する可能性があり、Ａ、Ｂ、Ｃと名付けた。肝臓特異的α１‐抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターの転写制御下で、ヒトＭＤＲ３‐Ａ、‐Ｂまたは‐Ｃ ｃＤＮＡの野生型（ｗｔ）またはコドン最適化（ｃｏ）バージョンのいずれかを含むプラスミドを作成した。これらのプラスミドをヒト肝細胞株Ｈｕｈ７に一過性にトランスフェクションし、６つの変異体の発現を分析し、比較した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、固定し、抗ウサギＭＤＲ３一次抗体および抗ウサギ－Ａｌｅｘａ４８８二次抗体で染色し、免疫蛍光および共焦点顕微鏡によって可視化した。ＭＤＲ３発現陽性に染色された細胞の画像から、アイソフォームＡのみが細胞膜に局在すると思われることが示された。このことは、ＭＤＲ３陽性細胞の連続面が明らかな膜局在性発現を示したことから、共焦点顕微鏡法の方が明らかであった（図１および図２）。注目すべきことに、潜在的アイソフォームＢおよびＣ（発現配列タグ（ＥＳＴ）データに基づく交互スプライシング変異体の遺伝子予測を介してＣの場合に同定される）の配列は、ヌクレオチド結合ドメイン２付近の７アミノ酸付加の存在および膜貫通ドメインをそれぞれ１１含む４７アミノ酸の欠失により、Ａアイソフォームとは異なる。アイソフォームＣ（ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ２１４３９）の自然な存在の実験的確認はない。

〔コドン最適化ＭＤＲ３－Ａアイソフォームのみが、効率的なＡＡＶベクター生成と適合性である。〕
一過性にトランスフェクションされたプラスミドから発現された場合、Ｈｕｈ７細胞の膜に局在化されたアイソフォームＡのみを示すデータを用いて、ＭＤＲ３アイソフォームＡの野生型（ＭＤＲ３－Ａｗｔ）またはコドン最適化（ＭＤＲ３－Ａｃｏ）導入遺伝子変異体のいずれかをコードする人工Ａｎｃ８０変異体（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．；２０１５，１２（６）：１０５６－６８）に基づくＡＡＶベクターを作製した。最も慣用的なＡＡＶベクター製造プロセスは、ベクターゲノム増幅、カプシド製造およびウイルス粒子集合体に必要な全ての機能を提供する２または３のプラスミドのセットを用いたＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションに基づく。これらのプラスミドの１つは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含み、ベクターの生成を可能にするのに十分な量で生成されなければならない。Ａ１ＡＴプロモーター下流のＭＤＲ３‐ＡｗｔおよびＭＤＲ３‐Ａｃｏ配列を含むＡＡＶプラスミドを作製した。予想外にも、本発明者らは、ＭＤＲ３－Ａｗｔ ＡＡＶプラスミドを有する細菌を増殖させる際に、単離されたプラスミドＤＮＡの異常な制限酵素消化分析によって見られるように、細菌増殖速度の低下および組み換えのより高い例などの問題に遭遇した。これらの問題は増殖温度を３０℃に低下させることによってプラスミド製造において部分的に改善されたが、組み換え／不純プラスミドＤＮＡ汚染物質は未解決のままである。対照的に、ＭＤＲ３－Ａｃｏ配列を含むＡＡＶプラスミドははるかに安定であり、上記の技術的問題のいずれもなしに生成され得た。

ＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによりＭＤＲ３プラスミドで製造した。簡潔には、ＡＡＶＡｎｃ８０ウイルス粒子を生成するために、融合性の（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞単層を含む３０個の１５０ｃｍ^２フラスコを、ヘルパープラスミドｐδＦ６、ｐＡＡＰ２、ｐＫＡｎｃ８０Ｌ６５（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ；２０１５，１２（６）：１０５６－６８）およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してパッケージングされるべきベクター配列を含む選択されたＡＡＶプラスミド（ＡＡＶ－ＭＤＲ３－ＡｃｏまたはＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｗｔ）で同時トランスフェクションした。７２時間のインキュベーション後、Ｖａｎｒｅｌｌ Ｌ．ら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１；１９（７）：１２４５－５３に記載されているように、イオジキサノール勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用する超遠心分離によって、上清および細胞からＡＡＶ粒子を精製した。最後に、精製ウイルスを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ－Ｕｌｔｒａｃｅｌ １００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、Ａ１ＡＴプロモーターに特異的なオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧ－３’（配列番号９）；リバースプライマー：５’－ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＧＴＡＴＴＴ－３’（配列番号１０））を使用する定量ＰＣＲによって滴定した。ＡＡＶ８ウイルス粒子を、ｐＤＰ８（ＰｌａｓｍｉｄＦａｃｔｏｒｙ、ドイツ）を単一のヘルパープラスミドとして使用することを除いて、同じ方法で生成した。ＡＡＶＡｎｃ８０－ＭＤＲ３－Ａｃｏウイルス粒子は、４．６×１０^１２ウイルスゲノム（ＶＧ）／ｍＬの平均力価で、インビボ試験（表１）に適合する量と濃度でルーチン通りに製造された。驚くべきことに、ＭＤＲ３－Ａｗｔアイソフォームを用いてＡＡＶＡｎｃ８０ベクターを生成する５つの試行のうち４つは、いかなる有意な収率も達成することができなかった（５つのうち４つは５×１０^１１ ＶＧ／ｍＬ未満の力価を有し、これはインビボ適用には低すぎた）。これは、以前に観察されたように、プラスミドとして運ばれる場合だけでなく、ＡＡＶ粒子との関連においても、ＭＤＲ３－Ａｗｔアイソフォームコード配列の予想外の固有の特徴を示した。ＭＤＲ３－Ａｗｔバージョンを有するＡＡＶベクターの生成は、コドン最適化ＭＤＲ３－Ａｃｏの生成よりも、実質的なトラブルシューティングおよび／またはより多量の時間、資源、および材料を必要とすると推定された。したがって、アイソフォームＭＤＲ３－Ａｃｏを、さらなる開発のために選択した。

〔流体力学的注入（プラスミドＤＮＡトランスフェクション）を介したＭＤＲ３ ＷＴおよび共変異体の肝臓発現のインビボ試験〕
トランスジェニックマウスモデルＦＶＢ．１２９Ｐ２－ＡＢＣＢ４ｔｍ１Ｂｏｒ／Ｊ（ＡＢＣＢ４ ^－／－）はＡｂｃｂ４遺伝子のホモ接合性ノックアウトである（Ｓｍｉｔ Ｊ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ．１９９３；７５（３）：４５１－６２）。流体力学的注射（ＨＤＩ）を介したＭＤＲ３導入遺伝子変異体を含有するプラスミドの送達後、これらのマウスにおいてインビボでＭＤＲ３発現を分析した。７週齢の雄Ａｂｃｂ４^－／－マウスに、総容量２．４ｍｌ中２５μｇのプラスミドｐＡＡＶ－ＭＤＲ３を５秒以内に尾静脈に注射した。ＭＤＲ３アイソフォームＡｃｏ、Ａｗｔ、Ｃｃｏ、およびＣｗｔを有するプラスミドを試験した。２４時間後に動物を屠殺し、肝臓を採取し、免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＭＤＲ３発現について染色した。ｐＡＡＶ‐ＭＤＲ３‐Ａｃｏを接種した両マウスはＭＤＲ３発現を示した。特に、１匹のマウスは、肝臓組織全体にわたって個別のポケットでＭＤＲ３発現を示し（図３）、ＭＤＲ３は明らかに肝細胞の小管膜上に位置していた。対照的に、ｐＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｗｔを有するＨＤＩは、全サンプル中の１つの細胞のみの周りで検出され得るＭＤＲ３発現を示す１つの動物のみをもたらした（図３）。これらの結果は、ＭＤＲ３－Ａｃｏ配列が、ＭＤＲ３－Ａｗｔと比較して、インビボではるかに効率的に発現され得ることを示唆する。最後に、ｐＡＡＶ－ＭＤＲ３－ＣｃｏもｐＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ｃｗｔも、ＭＤＲ３に対していかなる陽性染色も示さなかった（データは示さず）。

〔ＰＦＩＣ３のマウスモデルにおけるＭＤＲ３導入遺伝子を有するＡＡＶベクターの試験〕
Ａｂｃｂ４^－／－ノックアウトマウスモデルは、血清肝トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、胆汁酸塩およびビリルビンレベルの上昇；肝臓および脾臓の大きさの増加；胆汁中のホスファチジルコリン濃度の低下；ならびに線維症、コラーゲン沈着および細胞浸潤のような肝臓における重篤な形態学的異常のようないくつかのＰＦＩＣ３関連マーカーを確実に複製することが示されている。これらのマウスにおける症状の発症は４週齢以前に現れる。本発明者らは最初に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターの導入遺伝子を有するＡｎｃ８０変異体に基づくＡＡＶベクターを用いて、これらのマウスがＡＡＶ感染に感受性であるかどうかを試験した。

５×１０^１２ ＶＧ／ｋｇ体重を接種したマウス（３または４週齢）を１週間後に屠殺し、肝臓サンプルを、それぞれｑＰＣＲおよびＲＴ－ｑＰＣＲによってＡＡＶベクターゲノムコピーおよびＧＦＰ ｍＲＮＡコピーの定量のためにプロセシングした。３週齢および４週齢のＡｂｃｂ４^－／－マウスのいずれも、同じ年齢で接種したＷＴマウスと比較した場合、有意なレベルでＡｎｃ８０ベクターで形質導入されないことが見出された（データは示さず）。

次に、２週齢または３週齢のＡｂｃｂ４^－／－マウスに、ＭＤＲ３‐Ａｃｏ導入遺伝子を有するＡＡＶＡｎｃ８０ベクターを３種類の用量（５×１０^１２、１．５×１０^１３および５×１０^１３ ＶＧ／ｋｇ）で注射した。３週齢で処理され、２週間後に屠殺されたマウスは、５×１０^１３用量の雄のみにおいてＰＦＩＣ３症状（血清バイオマーカーレベルおよび脾臓および肝臓の大きさ）の非常に最小限の向上しか示さなかったが（データは示さず）、一方、最も高いＡＡＶ用量を与えられた雄および雌の両方において、胆汁ＰＣ濃度のわずかな増加が観察された（ｐ＝０．０５７対生理食塩水処理Ａｂｃｂ４^－／－マウス）（図４）。

しかしながら、５×１０^１３ ＶＧ／ｋｇのＡＡＶＡｎｃ８０－ＭＤＲ３－Ａｃｏにて２週齢で処理したマウスは、処理後３週間まで血清バイオマーカーの顕著な改善を示した（図５）。これらのマウスを処理後３週間で屠殺すると、肝臓および脾臓の重量および肝臓の組織学的所見において、野生型の特性に戻って復帰が見られた（図６および図７）。しかしながら、３倍低用量（１．５×１０^１３ ＶＧ／ｋｇ）で処理したマウスは、陰性対照の生理食塩水処理ＡＢＣＢ４^－／－マウスよりもほとんどまたは全く改良を示さなかった。胆汁ＰＣ濃度もまた、最高用量で処理したマウスにおいて有意に増加した（図８）。

〔ＡＡＶ血清型８ベクターは、ＰＦＩＣ３マウスにおいて持続的な治療反応を達成する。〕
ＭＤＲ３－Ａｃｏ導入遺伝子を有する血清型８のＡＡＶベクターを作製し、Ａｂｃｂ４^－／－マウスで試験した。ＡＡＶ８‐ＭＤＲ３‐Ａｃｏベクターを１．５×１０^１３または５×１０^１３ＶＧ／ｋｇ用量のいずれかで２週齢でマウスに投与した。処理後１～２週という早い時期に、最高用量で処理されたマウスの血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、胆汁酸塩（ＢＳ）およびビリルビンのバイオマーカーレベルは、病気の動物で示されたレベルから野生型動物レベルに明らかに復帰した（図９）。肝臓と脾臓の重量および肝臓の組織学的所見において、野生型の特性に戻って復帰が認められた（図１０）。この肝疾患の復帰は、試験の全期間（処理後１２週間まで）にわたって維持された。一方、低用量処理マウスのバイオマーカーレベルは、生理食塩水処理Ａｂｃｂ４^－／－マウスのバイオマーカーレベルと異ならなかった。

〔ＡＡＶ８‐ＭＤＲ３‐Ａｃｏで処理したＰＦＩＣ３マウスではＭＤＲ３発現が高レベルで達成された。〕
５×１０^１３ ＶＧ／ｋｇのＡＡＶ８‐ＭＤＲ３‐Ａｃｏで処理したＡｂｃｂ４^－／－マウスの肝臓におけるＭＤＲ３発現を、抗ヒトＭＤＲ３抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）により分析した。実質的なＭＤＲ３発現は肝細胞の小管膜上に明らかなタンパク質局在を有する肝臓において検出され（図１１）、これは野生型マウスにおいて観察された発現のパターンおよび強度に匹敵した（抗ｈＭＤＲ３を生成するための合成ペプチドがＭＤＲ３のマウスバージョンの配列と１００％の配列同一性を有したので、同じ条件下で染色されたこれらのマウスは比較体を提供した）。生理食塩水で処理した対照動物は、予想通りＭＤＲ３の発現を示さなかった。

〔ＰＦＩＣ３マウスにおけるＡＡＶ８－ＭＤＲ３処理は用量反応を示す。〕
Ａｂｃｂ４^－／－マウスを５種類のＡＡＶ８－ＭＤＲ３用量（５ｘ１０^１２、１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３および８ｘ１０^１３ ＶＧ／ｋｇ）で処理した。処理３週間後には、血清バイオマーカーレベルについて、明らかな用量依存性の反応が認められる（図１２）。

〔ＡＡＶ血清型８ベクターは、５週齢のＰＦＩＣ３マウスにおいて持続的な治療反応を達成する。〕
ＡＡＶ８－ＭＤＲ３－Ａｃｏベクターを、１×１０^１４ ＶＧ／ｋｇで５週齢のＡｂｃｂ４^－／－マウスに投与した。１２週間の追跡期間を通して、バイオマーカーレベルは、２週齢で処理した場合に見られたように、疾患状態から野生型動物で見られるレベルまで復帰した（図１３）。その効果は、雌よりも雄の方が一貫性が高かった。１７週齢で、マウスを屠殺し、ＡＡＶ８－ＭＤＲ３－Ａｃｏ処理マウスは、肝臓および脾臓サイズの減少（図１４ａ－ｂ）、胆汁ＰＣの増加（図１４ｃ）および肝線維症の減少（図１４ｄ）を含む、ＰＦＩＣ３病の明らかに減少した証拠を示した。ＭＤＲ３タンパク質の発現を、ＭＤＲ３に特異的な抗体を使用する免疫組織化学による染色によって測定した。発現量は、雄で野生型レベルの６６％、雌で３１％であった（図１４ｅ）。胆汁ＰＣは、雄と雌でそれぞれ５４％と２５％の野生型レベルに回復した。

結論として、本発明者らは、ＭＤＲ３のアイソフォームＡのコドン最適化バージョンがＰＦＩＣ３患者を潜在的に治療する遺伝子治療ベクターを開発するための最良の候補であることを見出した。インビトロのヒト肝細胞株でＤＮＡトランスフェクションにより発現を試験したところ、アイソフォームＡのみが細胞膜に局在することがわかった。驚くべきことに、裸のＤＮＡとして投与した場合、コドン最適化ＭＤＲ３－Ａのみが効率的なインビボ発現を示した。

ＭＤＲ３－Ａ導入遺伝子を有するＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０およびＡＡＶ８）の製造を開始する場合、コドン最適化したバージョンのみが、期待される標準収率でベクター製造のために実行可能であった。

Ａｂｃｂ４^－／－ＫＯマウスモデルにおいてＭＤＲ３－Ａｃｏ導入遺伝子を有するこれらのＡＡＶベクターの試験から、２週齢で処理したマウスは、肝細胞の小管膜への局在およびバイオマーカーレベルの有意な回復を伴うＭＤＲ３の高発現レベルを示し、治療効果を達成した。祖先血清型Ａｎｃ８０を利用する研究において、５×１０^１３ ＶＧ／ｋｇでのベクター処理は、ＰＦＩＣ３血清バイオマーカーレベルの復帰（処理後３週間まで）、肝臓および脾臓サイズの減少、胆汁ＰＣの増加、ならびに胆汁鬱滞性マウスにおいて観察される肝臓形態異常の矯正を達成した。５×１０^１３ ＶＧ／ｋｇのＡＡＶ８－ＭＤＲ３－Ａｃｏでは、ＰＦＩＣ３病を示す血清バイオマーカーレベルは、処理後３ヶ月まで、野生型動物で観察された正常レベルに復帰した。さらに、肝臓と脾臓のサイズ、胆汁ＰＣ、および肝臓の形態において、これらのＡＡＶ８‐ＭＤＲ３‐Ａｃｏ処理マウスは、処理３か月後にＰＦＩＣ３特性の顕著な改善も示した。

〔本発明を実施する際に使用するための配列〕
本発明を実施する際に使用するための配列を以下に記載する：
〔ＭＤＲ３アイソフォームＡ（ｃｏ－ＭＤＲ３（Ａ））をコードするコドン最適化配列：（配列番号１）〕
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〔ＭＤＲ３アイソフォームＡ（ｃｏ－ＭＤＲ３（Ａ）－２）をコードするコドン最適化配列（配列番号２）〕
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〔合成ポリＡ配列（配列番号３）〕
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〔ｒＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｃｏ １（配列番号４）〕
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〔ｒＡＡＶ－ＭＤＲ３－Ａｃｏ ２（配列番号５）〕
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＧＧＧＣＴＴＴＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＧＧＧＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＡＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＡＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＴＧＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴＣＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＧＣＣＣＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＡＴＣＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＣＣＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＣＴＡＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＣＴＡＣＣＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＴＣＴＡＴＧＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＴＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ
〔α１アンチトリプシンプロモーター（配列番号６）〕
ＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡ
〔ヒト最小胆汁酸塩排出ポンプ（ＡＢＣＢ１１）遺伝子プロモーター（配列番号：７）〕
ＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴ
〔マウス最小胆汁酸塩排出ポンプ（ＡＢＣＢ１１）遺伝子プロモーター（配列番号８）〕
ＧＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＡＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣ

Claims (16)

1. ＭＤＲ３アイソフォームＡをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物であって、前記導入遺伝子が配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列である、核酸構築物。
2. さらに、肝臓特異的プロモーター、好ましくはα－１－アンチトリプシンプロモーターまたは胆汁酸塩誘導性プロモーターを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
3. さらに、ポリアデニリル化シグナル配列、特に配列番号３の配列を有する合成ポリアデニリル化シグナル配列を含む、請求項１または２に記載の核酸構築物。
4. さらに、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
5. 配列番号４の核酸配列または配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
7. 前記発現ベクターがウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６に記載の発現ベクター。
8. ウイルス粒子であって、
   請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項６もしくは７に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
9. ＡＡＶ粒子であって、
   請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項６または７に記載の発現ベクターを含み、好ましくは、ＡＡＶタイプ３３Ａ、ＡＡＶタイプ３３Ｂ、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、ＬＫ０３、ＡＡＶ３－ＳＴ、Ａｎｃ８０およびＡＡＶ８血清タイプからなる群より選択されるカプシドタンパク質などのアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ粒子。
10. 宿主細胞であって、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項６もしくは７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞、または、
    請求項８もしくは９に記載のウイルス粒子で形質導入された、宿主細胞。
11. 薬学的組成物であって、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項６または７に記載の発現ベクター、請求項８または９に記載のウイルス粒子、または請求項１０に記載の宿主細胞、および、
    薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
12. それを必要とする対象者における薬剤としてのその使用のための、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項６または７に記載の発現ベクター、請求項８または９に記載のウイルス粒子、請求項１０に記載の宿主細胞、または請求項１１に記載の薬学的組成物。
13. それを必要とする対象者における進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３（ＰＦＩＣ３）の予防および／または治療のためのその使用のための、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項６または７に記載の発現ベクター、請求項８または９に記載のウイルス粒子、請求項１０に記載の宿主細胞、または請求項１１に記載の薬学的組成物。
14. 対象者が、新生児、乳児、小児または成人、好ましくは新生児、乳児または小児、より好ましくは新生児または乳児であって、それを必要とする対象者における進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３（ＰＦＩＣ３）の予防および／または治療のためのその使用のための、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項６または７に記載の発現ベクター、請求項８または９に記載のウイルス粒子、請求項１０に記載の宿主細胞、または請求項１１に記載の薬学的組成物。
15. 請求項８または９に記載のウイルス粒子の製造方法であって、
    ａ）請求項１０に記載の核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞を培養培地中で培養する工程と、
    ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程と、
    を含む、方法。
16. キットであって、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項６もしくは７に記載の発現ベクター、請求項８もしくは９に記載のウイルス粒子、請求項１０に記載の宿主細胞、または請求項１１に記載の薬学的組成物を、１つ以上の容器中に含むキットであって、随意的に、さらに、取扱説明書またはパッケージング材料を含む、キット。
    
    

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