CN104789533B

CN104789533B - 高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法

Info

Publication number: CN104789533B
Application number: CN201510144423.5A
Authority: CN
Inventors: 蔡晓龙; 陈意雄; 邹杰; 王丽莎; 朱鹏飞; 李明明; 杨龙飞; 许曼蒂; 万颖; 曹青; 卞正雅; 韦唯
Original assignee: Ke Weichuan Bio Tech Ltd Shanghai
Current assignee: HANBIO BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) Co.,Ltd.
Priority date: 2015-03-30
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2018-02-13
Anticipated expiration: 2035-03-30
Also published as: CN104789533A

Abstract

本发明公开了一种高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法，经过发明人深入的研究，意外地发现，通过对293A细胞中的ABCB4基因的表达水平进行调控，能够使得腺病毒的产毒效率得到极大的提升。使用本发明的技术方案进行腺病毒的包装，总病毒颗粒数提高了约60％，感染性滴度提高了约10倍，说明本发明的技术方案特别适用于对腺病毒的高效制备。

Description

高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法。

背景技术

腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳呈规则的20面体结构。腺病毒家族(Adenoviridae)的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、外源基因装载容量大等优点，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者，已广泛地被应用于基础研究和临床试验中。

病毒载体作为新一代的转基因载体，在生物医药产业各环节都有广泛的应用前景，具体表现在：

(1)病毒载体是研究基因功能的必备工具。

(2)病毒载体是基因靶向治疗的利器。

(3)病毒载体是药物研发和筛选方案实施的强有力助力器。

虽然有着广阔的应用前景，但由于其技术难度大，成本高，时空表达难以有效控制等特点，使得病毒载体技术在生命科学领域的应用受到一定阻力。

目前根据需要已经开发三代腺病毒载体：E1区或者E1&E3缺失的载体被称作第一代腺病毒载体；E2区或者E2&E4缺失的载体被称作第二代腺病毒载体；依赖于辅助病毒的腺病毒载体(Helper-Dependent Ad，HD-Ad)通常也称作无偿腺病毒或者高容量载体被划分为第三代腺病毒载体。

目前已有的腺病毒载体系统有三种：

1、经典的双质粒共转染法(同源重组)

原理是同源重组。在腺病毒左臂区域(通常缺失E1基因区)插入目的基因表达盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组(通常缺失E1基因区)的大质粒共同转染携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。主要缺点是重组效率比较低。

2、AdEasyTM包装系统

AdEasyTM包装系统主要的特点是利用原核重组酶在大肠杆菌中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程，获得环状的重组腺病毒基因组，并且具有在细菌中复制的必需元件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染293细胞，避免了双质粒共转染得到重组腺病毒难度大的风险。由于获得重组腺病毒质粒有明显的筛选方法，操作步骤也比较好掌握，因此这个系统一出现就受到极大的欢迎。

3、AdMax包装系统

AdMax包装系统是通过Cre/loxP获得重组病毒，与目前使用最普及的AdEasy系统相比，有一定的优势：AdMax系统只需要2～4周就能完成从质粒构建到重组出毒，因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34％，且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种安全高效制备腺病毒的技术。

本发明的第一方面，提供了一种分离的细胞或细胞系，所述细胞高表达ABCB4基因。

进一步地，所述“高表达”是指与野生型的细胞相比，高表达ABCB4基因的细胞中ABCB4基因表达水平至少高出30％，较佳地高出50％，最佳地高出100％。

进一步地，所述细胞是包含外源的ABCB4基因的细胞。优选地，所述细胞：(a)具有含有ABCB4基因的载体；或者(b)基因组中整合有外源的ABCB4基因。

进一步地，所述细胞中还包含腺病毒载体。

优选地，所述细胞或细胞系为293A细胞或细胞系。

进一步地，所述含有ABCB4基因的载体以pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒为骨架。

进一步地，所述腺病毒载体为pHBAd-U6-GFP质粒。

优选的，所述ABCB4基因的序列如SEQ ID NO.:1所示。

本发明的第二方面，提供了一种高效制备腺病毒的方法，包括步骤：

(1)制备高表达ABCB4基因的细胞；

(2)用高表达ABCB4的细胞扩增腺病毒。

进一步地，步骤(1)中所述细胞为293A细胞。

优选地，步骤(1)中所述制备高表达ABCB4基因的细胞系的方法包括步骤：

a)构建ABCB4慢病毒载体；

b)慢病毒包装；

c)将包装好的慢病毒感染293A细胞。

优选地，步骤a)中使用pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒构建ABCB4慢病毒载体pHBLV-CMVIE-IRES-puro-ABCB4。pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒序列如SEQ ID NO.:4所示。

更优选地，构建ABCB4慢病毒载体过程中扩增ABCB4基因所使用的引物序列为：

CGTactagtATGGATCTTGAGGCGGCAAAGA(SEQ ID NO.:2)；和

CGTgcggccgcTCATAAGTTCTGTGTCCCAGCC(SEQ ID NO.:3)。

优选地，步骤b)中，病毒包装系统包括质粒pspax2、pMD2G和ABCB4慢病毒载体。

优选地，所述ABCB4慢病毒载体为pHBLV-CMVIE-IRES-puro-ABCB4。

优选地，步骤b)中，慢病毒包装细胞为293T细胞。

优选地，步骤b)中，慢病毒包装过程为：

培养293T细胞，胰酶消化后，加入pspax2、pMD2G和ABCB4慢病毒载体组成脂转体系，转染后收集病毒。优选地转染48h和72h。pspax2质粒序列如SEQ ID NO.:5所示。pMD2G质粒序列如SEQ ID NO.:6所示。

优选地，步骤c)中，将包装好的慢病毒感染293A细胞得高表达ABCB4的细胞系。

进一步地，步骤2)中，用高表达ABCB4的细胞扩增腺病毒的方法包括步骤：

a)转染

将重组腺病毒载体质粒转染步骤1)中获得的高表达ABCB4基因的细胞系；

b)收毒

转染后，采用反复冻融的方式收集病毒；

c)扩增

用上一步骤收集的病毒，继续感染高表达ABCB4基因的细胞系，进行扩增。

优选地，步骤a)中，腺病毒载体质粒为pHBAd-U6-GFP。pHBAd-U6-GFP质粒序列如SEQ ID NO.:7所示。

优选地，步骤a)中，转染体系包括：重组腺病毒载体质粒pHBAd-U6-GFP、骨架质粒pHBAd-BHG、和Lipofiter^TM脂质体。pHBAd-BHG质粒序列如SEQ ID NO.:8所示。

优选地，步骤c)中，至少扩增两次。

技术效果

使用本发明的技术方案进行腺病毒的包装，总病毒颗粒数提高了约60％，感染性滴度提高了约10倍，说明本发明的技术方案特别适用于对腺病毒的高效制备。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1显示了pHBLV-CMVIE-IRES-puro载体图谱。

图2显示了ABCB4基因的PCR扩增结果。

图3A显示了ABCB4慢病毒载体构建后的PCR电泳结果；图3B显示了ABCB4慢病毒载体酶切鉴定的结果。

图4显示了包装好的慢病毒感染293A细胞及WB验证的结果。图4A为对照病毒(左图)和过表达ABCB4目的病毒感染293A细胞(右图)，显示病毒成功包装并感染293A细胞。图4B为ABCB4慢病毒感染293A细胞后wb鉴定结果。

图5显示了重组腺病毒载体pHBAd-U6-GFP质粒图谱。

具体实施方式

AdMax包装系统中，腺病毒的重组和包装是将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293A细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。那么293A细胞的状态和功能对于腺病毒的产毒效率，起到了非常关键的作用。经过发明人深入的研究，意外地发现，通过对293A细胞中的ABCB4基因的表达水平进行调控，能够使得腺病毒的产毒效率得到极大的提升。

ABCB4基因

人ABCB4位于7q21.1，属于ABC转运家族。ABCB4基因主要在肝脏毛细胆管膜上高度表达，编码多药耐药蛋白3(multidrug resistance protein 3，MDR3)，由ABCB4基因编码翻译的P糖蛋白(P glycoprotein，PgP)Pgp3，主要在肝脏表达，是ABC(ATP bindingcassette，ABC)转运体家族的成员之一。肝细胞外排各种化合物的过程几乎都由ABC家族成员完成。MDR3、PgP3的作用是充当依赖ATP的磷脂弹跳酶的角色，将磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline，PC)从肝小叶胆管膜内转运到膜外。ABCB4基因的突变可能会导致胆管损伤，从而引起胆汁淤积，继而引起多种疾病的发生。

本发明中优选的ABCB4目的序列如下：

>lcl|BC042531.1_cdsid_AAH42531.1[gene＝ABCB4][protein＝ATP-bindingcassette,sub-family B(MDR/TAP),member 4][protein_id＝AAH42531.1][location＝113..3973]

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所使用的生物材料(如质粒、细胞、酶等)和试剂，如无特别说明，均可从市售渠道获得。

实施例1稳定高表达ABCB4基因的293细胞系构建

通过慢病毒载体构建稳定高表达ABCB4基因的293细胞系。

1实验材料

试剂名称	生产厂家
		大肠杆菌菌株DH5α	Tiangen
限制性内切酶	Fermentas
		T4连接酶	Fermentas
质粒DNA小,大量抽提试剂盒	康为世纪
		凝胶回收试剂盒	Axygen
琼脂糖	Biowest
		DNA ladder	GeneRay

载体及目的基因信息

1)pHBLV-CMVIE-IRES-puro载体图谱如图1所示，其中EcoRI和BamHI为插入位点，pHBLV-CMVIE-IRES-puro载体序列如SEQ ID NO.:4。

pHBLV-CMVIE-IRES-puro载体有CMVIE启动子启动目的基因的表达，并含有Puromycin抗性基因作为标记。

2)目的片段信息如SEQ ID NO.:1所示。

经过大量筛选验证，本发明人获得的扩增引物如下：

2实验流程

ABCB4慢病毒载体的构建

1、PCR引物由上海桑尼生物合成PAGE胶纯化的oligo序列，分别稀释至10uM。50ulPCR体系：5ul，10×buffer；5ul，dNTP；3ul，MgSO4；1ul，上游引物；1ul，下游引物；1ul，KOD Plus Neo酶；0.5ul，模板；34ul，H₂O。

PCR电泳结果如图2所示，图中泳道1为ABCB4PCR产物，泳道2为DNA分子量标记(注：分子量标记从上至下依次为：12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。

PCR产物回收后，用EcoRI，BamHI双酶切，酶切体系如下：4ul，PCR产物；1ul，EcoRI；1ul，BamHI；2ul，10×buffer；12ul，H2O。

酶切完成后再次胶回收。

2、载体pHBLV-CMVIE-IRES-puro双酶切，酶切体系如下。20ul酶切体系37度3小时：4ul，pHBLV-CMVIE-IRES-puro载体(500ng/ul)；1ul，EcoRI；1ul BamHI；2ul，10×buffer；12ul，H₂O。

电泳检测，结果如图3A所示，图中泳道1为：HBLV-CMVIE-IRES-puro酶切回收；泳道2为ABCB4PCR产物酶切回收；泳道3为DNA分子量标记(注：从上至下依次为：12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。

处理好的目的片段与载体连接反应体系：6ul，PCR酶切回收片段(约50ng/ul)；1ul，酶切好的载体(约50ng/ul)；2ul，ligase buffer；1ul，T4ligase；10ul，H2O。以上连接液在16℃过夜。

3、转化(感受态细胞:DH5a)，抗性:Amp；37℃，培养过夜。

4、转化后ABCB4分别平板挑菌,37℃250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海桑尼生物技术有限公司测序，测序结果与预期相符，克隆成功的质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定的结果如图3B所示，图中泳道1为ABCB4-IRES-puroSpeI/NotI双酶切；泳道2为DNA分子量标记(注：分子量标记从上至下依次为：12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。

本实施例中成功的构建了pHBLV-CMVIE-IRES-puro-ABCB4慢病毒载体。

实施例2慢病毒包装

1、实验流程

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，0.45um滤器(Millpore公司)过滤病毒上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。

2、实验材料

2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株

该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pSPAX2(该质粒序列如SEQ ID NO.:5所示),pMD2G(该质粒序列如SEQ ID NO.:6),pHBLV-CMVIE-IRES-puro-ABCB4。其中pHBLV-CMVIE-IRES-puro-ABCB4具有Puromycin药物抗性，可以进行药物筛选。

细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株大肠杆菌菌株DH5-α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

2.2主要试剂

2.3主要仪器

仪器名称	生产厂家
		PCR仪	Applied Biosystems公司
电泳仪	Bio-rad公司
		荧光倒置显微镜	奥林帕斯

冷冻超速离心机	Hitachi
		细胞培养箱	healforce
凝胶成像仪稳压DNA电泳仪	BioRad
		移液器	Gilson
电热恒温水浴锅	上海一恒实验设备有限公司
		数码凝胶处理系统	天能科学仪器
一次性平皿,Flask,移液管	BD Falcon
		耗材(EP管，PCR管，枪头等)	Axygen
流式细胞仪	BD FaCSAria
		0.45um过滤器	Millpore公司
烧瓶	西巴斯公司

3.慢病毒生产实验步骤

3.1传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min即可使用，铺细胞前，将明胶再次将瓶底完全覆盖一次，完全吸净，即可将细胞铺上。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL 10％DMEM培养基。

3.2传293T细胞

将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 4度冰箱取出的0.25％胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37度水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul 10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10倍稀释)，即为实际n万/mL细胞浓度。

3.3.转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。

3.4.做脂转complex：Opti MEM需在37度水浴中预热，Fugene HD试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。

转染每瓶T75的complex成分如下：

pspax2 10μg，

PMD2G 10μg，

pHBLV-CMVIE-IRES-puro-ABCB410μg，

转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％DMEM 10mL，即开始收集病毒。

3.5收集24-48h病毒上清，收集后以0.45μm滤器过滤,于40mL超速离心管中，4℃，72000g/min离心120分钟；

3.6 500ul PBS重悬病毒沉淀，置于4度冰箱保存。

4、实验结果

包装好的慢病毒感染293A细胞(293A细胞可以购自ATCC)

1.将细胞铺盘于6孔板，每孔为5×10⁵细胞，每孔加入不同的慢病毒(pHBLV-CMVIE-IRES-puro和pHBLV-CMVIE-IRES-puro-ABCB4),MOI＝30,24小时后换液。

2.48小时后，将培液完全更换为加有2ug/ml的puromycin的培液，约2天更换次培液，待细胞生长稳定之后，可以进行细胞传代，2代之后无需加puromycin培养,建系完成。一部分细胞用于保种，一部分细胞收集细胞蛋白，Western Blot验证ABCB4的表达。

结果如图4A和4B所示，图4A为对照病毒(左图)和过表达ABCB4目的病毒感染293A细胞(右图)，显示病毒成功包装并感染293A细胞。图4B为ABCB4慢病毒感染293A细胞后wb鉴定结果。结果显示，过表达293A细胞系的ABCB4蛋白的过表达明显，建系成功。

实施例3高表达ABCB4的293A细胞用于腺病毒的包装，比较正常293A细胞和293A-ABCB4细胞的出毒效率

1、实验材料

重组腺病毒载体质粒pHBAd-U6-GFP图谱如图5所示(该质粒序列如SEQ ID NO.:7所示)。

人胚肾细胞系293A细胞、293A-ABCB4(高表达ABCB4的293A细胞)；DMEM购于Hyclone公司；真核转染试剂Lipofiter^TM为汉恒生物(汉恒生物，Hanbio)产品；胎牛血清、胰酶购于Hyclone公司；60mm培养皿、10cm培养皿、96孔板、移液管(5ml,10ml)、15ml及50ml离心管均购自NEST公司；双抗购自invitrogen公司；滤膜滤器购自Millipore公司。

2、实验方法

2.1大量制备重组质粒

1)将对数生长期的大肠杆菌菌液2ml加入100mL含100ug/ml Amp的LB培养基中；

2)37℃300rpm震荡摇菌过夜；

3)用康为世纪中提质粒试剂盒提取质粒

2.2重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增

2.2.1铺细胞：

转染前一天，将293A细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10％Hyclon胎牛血清,置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。

2.2.2转染

待细胞生长至底面积的长满到70～80％时，取重组腺病毒载体质粒pHBAd-U6-GFP及骨架质粒pHBAd-BHG(质粒序列如SEQ ID NO.:8)，用Lipofiter^TM脂质体(汉恒生物，Hanbio)转染试剂进行转染。具体步骤为：

a.转染前2小时更换完全培养基。取2ug重组腺病毒载体质粒，4ug骨架质粒pHBAd-BHG。用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

b.取15ul的Lipofiter^TM，用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

c.将两者混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字摇晃后置于37℃含5％CO₂的培养箱中培养。

注：Lipofiter^TM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考Lipofiter^TM说明书。

2.2.3换液

转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。

2.2.4收毒(P1)：

每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15ml离心管中。

2.2.5冻融：

打开恒温水浴锅至37℃，将15ml离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为Ad-IL1BshRNA第一代毒种(P1)，将作为随后大量病毒扩增的毒种。

2.2.6扩增：

从P1代病毒上清(约3ml左右)中取2ml感染一个10cm的细胞培养皿的细胞(细胞密度保证90％以上)。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中-80℃保留，做为毒种保留。

2..2.7收毒(P2)：

病毒扩增两天后待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15ml离心管中，依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于－80℃保存。以后每代的病毒扩增及收毒都如此反复进行。

2.2.8P3代病毒扩增扩增及收毒：

按每个75cm²方瓶中接种4×10⁶293细胞，接种4个75cm²培养瓶，培养过夜，待细胞生长满至90％时，将P2代病毒(除取少量留毒种外)全部接种培养瓶内，24小时，显微镜下观察发现有60％细胞病变，48小时后细胞完全病变。收获病变细胞混悬液后，2000rpm离心5分钟，离心，弃上清，加入4ml ST buffer(培养液+10％血清+2.5％甘油)，votex混匀，于-80℃和37℃间冻融三次，3000rpm离心5min取上清，作为第三代病毒(P3)。

2.2.9腺病毒滴度检验流程及方法

OD260，OD260/OD280，及VP的检测

取10ul纯化后的Ad-GFP病毒液，加90ul PH8.0的Tris·Cl稀释，以100ul PH8.0的Tris·Cl作为空白对照，用分光光度计测OD260及OD260/OD280的值

OD260/OD280的正常范围：1.20-1.40。检测结果为1.26符合正常范围。

病毒颗粒数(VP)与OD260的换算公式：

(OD260)×稀释倍数×1.1x10¹²＝__VP/ml

所测得OD260为0.137，体积1ml

所以总病毒颗粒数为：0.137×10×1.1x10¹²＝1.507×10¹²VP

项目名称	293A(正常)	293A-ABCB4
			OD260	0.088	0.137
OD260/OD280	1.23	1.33
			总体积	1ml	1ml
总病毒颗粒数VP	0.968×10¹²	1.507×10¹²

(二)感染性滴度检测：

检测方法：使用TCID50法进行感染性滴度检测。

结果：

1、293A

滴度：

T＝10^1+(11.3-0.5)＝10^11.8TCID50/ml

将TCID50/ml换算成PFU/ml

T＝10^11.8-0.7＝10^11.1＝1.2×10¹¹PFU/ml

2、293A-ABCB4

滴度：

T＝10^1+(12.1-0.5)＝10^12.6TCID50/ml

将TCID50/ml换算成PFU/ml

T＝10^12.6-0.7＝10^11.9＝0.8x10¹²PFU/ml

本实施例比较了正常293A细胞和293A-ABCB4细胞(高表达ABCB4基因的细胞)的出毒效率。实验表明使用293A-BCB4细胞进行腺病毒包装，与正常的293A细胞相比，总病毒颗粒数提高了约60％，感染性滴度提高了约10倍，说明本发明的技术方案特别适用于对腺病毒的高效制备。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种分离的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞高表达ABCB4基因，并且，所述细胞中还包含腺病毒载体；所述细胞或细胞系为293A细胞或293A细胞系。

2.如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞是包含外源的ABCB4基因的细胞。

3.如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述ABCB4基因的序列如SEQ IDNO.:1所示。

4.如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞：(a)具有含有ABCB4基因的载体；或者(b)基因组中整合有外源的ABCB4基因。

5.如权利要求4所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述含有ABCB4基因的载体以pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒为骨架；和/或，所述腺病毒载体为pHBAd-U6-GFP质粒。

6.一种高效制备腺病毒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)制备高表达ABCB4基因的细胞；

(2)用高表达ABCB4的细胞扩增腺病毒；

其中，所述步骤(1)中所述细胞为293A细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述制备高表达ABCB4基因的细胞的方法包括步骤：

a)构建ABCB4慢病毒载体；

b)慢病毒包装；

c)将包装好的慢病毒感染293A细胞。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，构建ABCB4慢病毒载体过程中扩增ABCB4基因所使用的引物序列如SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:3所示。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，病毒包装系统包括质粒pspax2、pMD2G和ABCB4慢病毒载体。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤b)中，慢病毒包装细胞为293T细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤b)中，慢病毒包装过程为：

培养293T细胞，胰酶消化后，加入pspax2、pMD2G和ABCB4慢病毒载体组成脂转体系，转染后收集病毒。

12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中，用高表达ABCB4的细胞扩增腺病毒的方法包括步骤：

a)转染

b)收毒

转染后，采用反复冻融的方式收集病毒；

c)扩增