JPS62502662A - 外来性ｄｎａの高レベル増幅および発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 外来性ＤＮＡの高レベル増幅および発現背景 本発明は形質転換用の選択可能なマーカーとしておよび／または内因性アデノシ ンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を含む宿主細胞中の外米性夕７ノｅり質をコードする ＤＮＡのコアンプリファイア（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｅｒ）として異種アデノシン デアミナーゼＤＮＡを使用する方法、ならびに特異な発現ベクターに関する。

形質転換は新しい遺伝物質が意図するタンパク質やポリペプチドをコードする外 米性ＤＮＡ配列の取込みにょシ真核細胞または原俵細胞によって獲得−れるとい う、一般的に使用される遺伝子操作法である。通常、形質転換を受ける細胞集団 の中で実際に外来性ＤＮＡを取込む細胞の数はきわめて少数である。

これらの問題は外来性ＤＮＡ配列のほかに選択マーカーを用いて細胞を形質転換 することにょシ回避できる。選択マーカーが外来性タン・ξり質をコードするＤ ＮＡに結合されるがどうが、又どのくらい接近して結合されるかに応じて、選択 マーカーを保有する細胞もまた外来性ＤＮＡを含むであろう。適当な条件を使用 することによシ、選択マーカーをもつ形質転換細胞を外来性ＤＮＡを取込まなか った細胞から識別することができる。

選択は容易に同定しうるマーカーをコードするＤＮＡ（例えば抗生物質耐性）の 使用を伴う。形質転換の際に、細胞集団はマーカーの存在について試験される。

首尾よくマーカーＤＮＡを取込んだ細胞はマーカーの特性（例えば、抗性物質含 有培地での生存）を示し、またマーカーの取込みに失敗した細胞はマーカーの特 徴を示さず、例えばそれらは抗生物質と接触させた際に死滅するであろう。

形質転換細胞によって発現される外来性タンパク質の量は、選択可能なマーカー と同様に増幅可能な遺伝子をコードするＤＮＡを形質転換過程で挿入する場合に 実質的に増大される。

遺伝子の増幅は、生存のために増幅可能な遺伝子の多数のコピーを生産させるの に十分な環境圧に形質転換細胞をさらすことを伴う。従って、外来性遺伝子を高 レベルで発現させる遺伝子増幅の使用は重要な技術である。

最もムく使用されるマーカー／増幅系は、多くの細胞株に存在するジヒドロ葉酸 還元酵素（ＤＨＦＲ）の遺伝子を使用する。

ＤＨＰＲをコードするＤＮＡで形質転換された細胞を細胞箒濃度のメトトレキセ イト（ＭＴＸ）と接触させると、生き残るために細胞はＤＨＦＲを増幅するよう 促される。このＭＴＸ選別法で生き残る細胞はＤＨＰＲをコードするＤＮＡの多 数のコピーを有する。ＤＨＦＲ遺伝子が別の遺伝子のＤＮＡ配列を含むプラスミ ド上に存在するとき、その遺伝子もまた一般に増幅されるようになる。従って、 ＤＨＦＲ遺伝子と外来性遺伝子を含むベクターで細胞を形質転換する場合、ＤＨ Ｆ’Ｒはそのはフタ−を取込まなかった細胞からそのベクターを取込んだ細胞を 同定する際の選択マーカーとして挙動し、またＤＨＦＲ自体が増幅され、結果的 に外来性ＤＮＡを増幅する。選択可能でしかも増幅可能なマーカーとしてＤＨＦ Ｒ遺伝子は形質転換細胞株を誘導するために太いに使用されるようになった。

しかしながら、実際に、ＤＨＦＲ系はＤＨＦＲを欠損した唯一の細胞株であるチ ャイニーズハムスター卵巣法（ＣＨＯＤＨＦＲ）に対してのみその一般有用性を 示した。〔ユーラウズ（Ｕｒｌａｕｂ）（１９８２）を参照されたい。〕゛内因 性ＤＨＦＲ遺伝子を含む細胞株は、その内因性ＤＨＦＲがＤＨＦＲ／外来性遺伝 子含有ベクターを含む細胞の選択を妨げるので使用できない。

発表されたところによれば、内因性ＤＨＦＲを含む細胞株内に挿入されたときに 発現可能である突然変異ＤＨＦＲ遺伝子が報告された。〔シモンソン（Ｓｉｍｏ ｎｓｏｎ、　Ｃ，Ｃ，私ヱ二丑を参照されたい。〕しかし、これらの細胞株は有 意に増幅されず、形質転換細胞から所望の外来性ポリペプチドヲ高レベルで得よ うとするときにあまシ役に立たない。ＤＨＰＲ遺伝子を保有する細胞体でのＤＨ Ｆ’Ｈの使用を可能にする選択マーカーのこの種の細胞株において外来性タン・ ぐり質を発現させるのに必要となる最適条件を得ることは困難であると判明した 。

こうして、ＤＨＦ’Ｒ系による外来性タンパク質の発現および増幅は１つの細胞 ５株に制限され、その細胞株が常に意図するタンパク質の生産にとって最上の細 胞株であるとは限らない。他の細胞株が一定灸件下でＣＨＯＤＨＦＲ−よシも高 いしはルで特定のタンパク質全生産し、またＣＨＯ’ＤＨＦＲ−よりも良好に生 育するだろう。様々な異なる細胞株で異種ＤＮＡ＝ｉ増幅および発現させるその 他の系も、当分野においてまだ解決されていない問題を依然として残したままで ある。

発明の要約 本発明の一面として、鴬くべきことに、外来性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ ）遺伝子が内因性ＡＤＡ：ｌｔ伝子を含む細胞株の選択可能な且つ増幅可能なマ ーカーとして使用できることが発見された。Ａ　Ｉ）Ａ　ｉコードする遺伝子は ほとんど全ての呻乳動物組織に存在するが、それは細胞の生育にとって不可欠な 酵素ではない。（シップマン（Ｓｈｉｐｍａｎ、　Ｃｕｒ、）ら、５ｃｉｅｎｃ ｅ２００：１１６３〜１１６５（１９７８）；　バージョン（Ｈｌｒｓｃｈｏｒ ｎ。

Ｒ，）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、７ ３　：　２１３〜２１７（１９７６）’を参照されたい。〕従って、本発明は多 数のＡＤＡ　真核細胞（特に呻乳動物細胞、）において目的タンパク質をコード する外来性ＤＮＡの増幅を可能にする。本方法は内因性ＡＤＡ遺伝子を含む細胞 株中に外来性ＡＤＡ遺伝子と目的タンパク質をコードする異種遺伝子を組込むこ とを包含する。

外来性ＡＤＡ遺伝子と異種タンパク質遺伝子を含む細胞はその楼選択されて、そ の遺伝子が増幅される。最後に、異種タン・ξり質遺伝子が発現され、そして目 的とするタンパク質が収穫される。

本発明の別の面として、ＡＤＡ増幅法において使用するための細胞株が提供され る。この細胞株は内因性ＡＤＡを含む細胞６ＡＤＡコード化外因性遺伝子と目的 タンパク質コード化外因性遺伝子とで形質転換し、これらの外来性遺伝子を同時 増幅させることによシ作られる。その後、増幅されたＡＤＡ／タンパク質遺伝子 を含む細胞株は本発明に従って培養される。高しくルの目的タンパク質がそれに よって発現される。このように使用されるＡＤＡ遺伝子はヒトＡＤＡまたはネズ ミＡＤＡのいずれかの既知配列のものであり得る。しかしながら、そのタン・ぐ り質がどれに利用されるかに応じて、他の種のＡＤＡ遺伝子も類似の方法で使用 することができる。

本発明のさらに他の面として、外来性ＡＤＡ遺伝子と目的リングξり質をコート ９する外来性遺伝子とを含む新規なベクターが提供される。これらのベクターは ポリオーマウィルスまたはレトロウィルスの配列を含み、本発明方法で使用烙れ るＡＤＡ″″細胞または細胞株全形質転換して目的タンツク質全生産させるべく 使用される。

ＤＨＥＲ−細胞株の使用を必要とするＤＨＦＲ増幅系と違って、ＡＤＡ増幅法は ＡＤＡ−細胞およびＡＤＡ−細胞株ばかりでなく、一定条件下で最良に生育しか つ／また目的生産物を優先的に発現する多くのＡＤＡ　細胞およびＡＤＡ　細胞 株の使用を可能にする。またそのタンパク質をより効果的にまたは適切に（例え ばガンマカルボキシル化のような翻訳後修飾をすることにより）処理する細胞体 の使用も可能である。

図面の簡単な説明 第１図はプラスミ）’ｐ９ＡＤＡ５−２９の構造を示す。

第２図はプラスミ）；’ｐＦ’ＶＸＭの構造を示す。

発明の詳細な説明 本発明方法によれば、内因性ＡＤＡ遺伝子を含む細胞株が外来ＡＤＡｃＤＮＡで 形質転換さｎる。ＡＤＡｃＤＮＡの作製は他の遺伝子をクローニングする方法と 類似した方法によって行われるだろう。〔一般にはマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　’ｒ、）ら、リング・ハーバ−研究所（１９８２）；ｌ−ウー／ｌ／　（ Ｔｏｏｌｅ＋Ｊ　、Ｊ　−）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：　３４２〜３４７（１ ９８４）’ｋｇμ６されたい。〕ヒト由来のＡＤＡ、ｃＤＮＡ　およびマウス由 来のＡＤＡ　ｃＤＮＡの塩基配列はすでに決定されている。〔ライギントン（Ｗ ｉｇｉｎｔｏｎ。

Ｄ、Ａ、　）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１５　Ｒｅｓ、、１２：　１０１５〜１０２４ （１９８４）；バレリオ（／Ｖａｌｅｒｉｏ、　Ｄ、　）ら、Ｇｅｎｅ　３１　 ：１４７〜１５３（１９８４）；ユン（Ｙｅｕｎｇ＋　Ｃ、）ら、Ｊ、　Ｂｉｏ ’１．　Ｃｈｅｍ、、　２５８：１５１７９〜１５１８５（１９８３）ｋ参照さ れたい。）ＡＤＡ　ｃＤＮＡＩＩ′ｉ当分野で通常の知識を有する者によく知ら れた技術ｆ、使って、呻乳類の発現ベクター中に組込むことができる。

形質転換すべき細胞は酵母プロトプラストおよび種々の細菌細胞を含めたＡＤＡ 　真核細胞のいずれであってもよいが、好好ましくは真菌細胞以外のものであり 、最も好ましくは安定な呻乳類の細胞株である。ＨｅＬａ細胞、Ｂｏｗｅｓ細胞 株のような黒色腫細胞株、マウスＬ細胞、マウス線維芽細胞、マウスＮ工Ｈ３Ｔ ３細飽などが本発明方法において有用である。ＡＤＡおよび他の遺伝子を染色体 ＤＮＡ中に安定して組込むことが知られている細胞株、例えばチャイニーズハム スター卵巣（ＣＨＯ）株、ヒト肝がんＨｅｐ　Ｇ２細胞株およびマウスミエロー マ細胞株も、その細胞株に要求される他の必要条件に応じて望ましいものである 。

外来性遺伝子は通常内因性染色体遺伝子と同様に発現されない。従って、ＡＤＡ 　細胞を外来性ＡＤＡで形質転換して、同じ選択方法の結果としてＡＤＡ遺伝子 の増幅を受けることによシ内因性ＡＤＡ＋細胞と比較して有意に高いしはルのＡ ＤＡ発現によって特徴づけられる形質転換細胞を選択することができるというこ とは、本発明の鴛くべき面である。大抵の細胞では非常に低レイルでＡＤＡが発 現されるので、ＡＤＡは独特である。有効な発現ＡＤＡ遺伝子の導入はこれらの 形質転換細胞を選択可能にする。しかしながら、少数のＡＤＡ　細胞体、例えば 胃腸組織や胸腺組織に由来するものは大抵の細胞株で生産されるレベルよりも高 いＡＤＡレベルを発現するので使用を避はルヘきでちる。〔リ−（Ｌｅｅ、　Ｐ 、Ａ、、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、、　３１　：　２２７〜２３３（１９７３）； 　バー）　：ｙ　（Ｂａｒｔｏｎ、　Ｒ，）ら、Ｃｅ１ｘ　工ｍｍｕｎｏ１．。

４９　：　２０８〜２１４（１９８２）；　シジ（Ｓｔａｔ、　Ｙ、）ら、Ｔｈ ｙｍｕｓ４　：　１４７〜１５４（１９８２）を参照されたい。〕形形質転換性 にさらされた細胞集団はその後形質転換細胞（すなわち、ＡＤＡ選択遺伝子の表 現型を示す小さなサブ集団）を同定するために処理される。培養物中の細胞はそ の細胞に選択圧をかけることにより表現型についてスクリーニングされる。

使用すべき特定の選択方法は当分野で通常の知識を有する者によって決定される 。増大したＡＤＡ発現についての既知の選択方法を以下に要約して述べる。熟練 研究者はこれらのおよび他の既知方法を外米性ＡＤＡ含有細胞の選択方法へ適応 させることができるだろう。

１つのこのようなＡＤＡ選択方法はアデノシン類似体の使用を包含する。細胞は 細胞毒性アデノシン類似体の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（Ａｒａ −Ａ）　ｉたは９−β−Ｄ−キシロフラノシルアデニン（Ｘ７１−Ａ）に対する 耐性について選択される。Ａｒａ−ＡまたはＸ７１−Ａの多段選択はＡＤＡ活性 が埒強された細胞集団をもたらす。〔ユン（Ｙｅｕｎｇ＋りら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５８コ８３３０〜８３３７（１９８３）’を参照されたい。〕Ａ ＤＡはこれらのアデニン類似体のそれらの各イノシン誘導体（最終的にプリンヌ クレオシビホスホリラーゼによりリボースを除去されてヒポキサンチンを生成す ることにより解毒される）への不可逆的転化全触媒する能力を持っている。細胞 はアデノシンキナーゼ活性の欠損によシこれらの類似体に対して耐性になるので 、必ずしも生存細胞のすべてが増大したＡＤＡレベル金もつというわけではない だろう。〔チャン（Ｖ、Ｌ、Ｃｈａｎ　）ら、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１１Ｇｅｎ ｅｔ、、７　：　１４７〜１６０（１９８１）　；　ユンらの上記文献１に参照 されたい。〕しかしながら、アデノシンキナーゼの欠’ＭＨ度はこのアデノシン キナーゼ遺伝子の二倍体を含む細胞では一般に低いであろう。

アデノシンキナーゼの存在を選択する方法〔チャンらのＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ ｘ　ＧｅｎｅｔｉｃＢ、４　：　１〜１２（１９７８）’を参照〕はＡＤＡの増 大した発現レベルを選択できる工うに改変された。

〔ユンらの上記文献１．５’１７９〜１５１８５（１９８３）　を参照されたい 。〕最初の方法と対照的に、生存細胞のすべてが増大したＡＤＡレベルを示す。

アデノシンキナーゼはＡＡＵ（アデノシン、アラノシ／、ウリジン）の存在下で 選択さ扛る。この生育条件下において、細胞はアラノシンによりデ　ノボＡＭＰ （アデノシン−リン酸）生合成を妨げられ、そしてアデノシンをＡＭＰに転化す るためのアデノシンキナーゼを特徴とする特許デノシンはホスホリボシルビロリ ン酸（ＰＲＰＰ）’ｉ減少させて内因性ピリミジン合成の阻害をもたらすので、 培地にはウリジｙｉ補給する。〔グリ−ｙ　（Ｇｒｅｅｎ、　Ｈ，）ら、５ｃｉ ｅｎｃｅ＋　１８２：８３６〜８３７（１９７３）；　イシイ（Ｉｓｈｉｉ、　 Ｋ、）ら、Ｃｅ’１ｌＳｃｉ、＋１３：４２９〜４３９（１９７３）を参照され たい。〕しかしながら、アデノシンの濃度が１１倍に増加するとき（以後１ｌ− ＡＡＵ選択と略す）、高濃度のアデノシ／は細胞にとって毒性となり、この毒性 を緩和するためにＡＤＡが必要となる。〔ホックス（Ｆ’ＯＸ、　ニーＨ９）ら 、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４７　：　６５５〜６８６（１９７ ８）を参照されたい。〕 ”ひとたび倣能的ＡＤＡが細胞生首のために必要とされると、ＡＤＡの緊密結合 性遷移状態類似体阻害剤（Ｋａ−２，５ｘｌＯ）であることが証明された抗生物 質のローテオキシコホルマイシン（ａＣＦ）６用いてＡＤＡ遺伝子の増幅につい て選別することヲ参照されたい。〕これらの系で生き残るためには、大抵の細胞 が生産するレベルよりも高いレベルのＡＤＡが必要となる。

次第に増加する濃度のａＣＦの存在下に１ｌ−ＡＡＵ状態で細胞全生育させると 、ＡＤＡ遺伝子の増幅の結果として高度のＡＤＡ発現を示す細胞が選別される。

〔ユン（Ｙｅｕｎｇ＋　Ｃ−）＋　上記文献８３３３〜８３４５（１９８３）を 参照されたい。〕別の選択方法は炭素源としてデオキシアデノシンを使用する。

して２−デオキシアデノシンを細胞に供給することによシ、細胞はＡＤＡ活性に 依存して生育することができる。〔フエルナデノシンはＡＤＡによってデオキシ イノシンに転化されたときだけ一般プリン源として利用でれる。その結果、細胞 はａＣＦの濃度を次第に増加させながらアザセリン中で生育させることにより、 増大したＡＤＡ活性について選択される。培地にはデ照されたい。〕 唯一の炭素源としてアデノシンを利用する類似方法がノ・ント（Ｈｕｎｔ、Ｓ、 Ｗ、　）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、２５８　：　１３１８５〜１３１９ ２　。

（１９８３）によって開示された。これらの条件下において、機能的ＡＤＡ’に 必要とするノビコツフ級肝がん細胞（Ｎｏｖｉｋｏｆｆｒａｔｅ　ｈｅｐａｔｏ ｍａ　ｃｅｌｌ）のａＣＦ耐性変異体が、アデノ’／７キナーゼ欠損細胞２ａＣ Ｆ濃度を段階的に増加させながら唯一の炭素源としてアデノシンを含む培地中で 生育させることにより単離された。この方法はＡＤＡ遺伝子を３２０倍に増幅さ せた細胞をもたらす。〔さらにホツフイ−（Ｈｏｆｆθｅ、　Ｐ、Ａ、）ら、Ｓ ｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ＩＧｅｎｅｔ、、　８　：　１３１８５〜１３１９２（１ ９８３）′ｔ−参照さｎたい。〕 どの細胞集団でも、内因性ＡＤＡ遺伝子を含む一定数の細胞が他の細胞よυ高レ ベルでＡＤＡ’ｉ発現するであろう。それ故に、選択圧の程度は外来性ＡＤＡで 形質転換された細胞と、内因性ＡＤＡ遺伝子から比較的高いＡＤＡ発現レベルを 示す細胞とを識別する感度に影響するであろう。従って、内因性ＡＤＡ遺伝子を 含む細胞によって一般に発現されるものよりも５倍のレベルで、よシ好ましくは １０倍のレベルでＡＤＡｚ−発現する細胞を選択することが望ましい。

＋ 内因性ＡＤＡ　細力刃よシも高レベルのＡＤＡＩ示す形質転換細胞は、異種遺伝 子の効率のよい発現をもたらすベクターを使用することによジ得ることができる 。細胞はＡＤＡ遺伝子および生産物遺伝子のほかにエンハンサ−、プロモーター 、イントロン、補助ＤＮＡ、ポリＡ部位および３つのプライム非コーディング領 域のような１つまたはそれ以上の他の因子？含むベクターの使用により形質転換 される。〔クラーク（Ｃ１ａｒｋ、　Ｓ、Ｃ，）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１　：２５４１〜２５４７（１９８４）； またカウフ−ｑ　７　（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ　、　）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２　：　６８９〜６９３（１９８５）’ｔ”参照 された°　い。〕これらは天然源から得られるか、あるいは既知方法により合成 される。基本的には、ＤＮＡ中に存在する諸成分が例えばウィルス機能のように 大量に利用可能である場合、またはポリＡ部位のようにそれらが合成可能である 場合、大量のベクターは単に微生物源を培養し、そのＤＮＡ全適当なエンドヌク レアーゼによシ消化し、ＤＮＡ、ｙラグメントｔ−分離し、目的とする因子を含 むＤＮＡ’ｉｉ同定し、それを回収することによシ、適当な制限画素を使用して 得られる。

ポリオーマウィルスやレトロウィルス金倉めたさまざまなベクター系は、もしも それらが内因性ＡＤＡ含有細胞によって発現されるしはル以上のレベルで外来性 ＡＤＡ遺伝子からＡＤＡを発現させるならば使用可能である。好ましくは５倍以 上、より好ましくは１０倍以上の発現が望ましい。

ここでの形質転換には２種類のベクターが使用できる。非結合にフタ−（すなわ ち、外来性ＡＤＡ遺伝子を含む１つの〈フタ−と意図する外来性生産物遺伝子を 含むもう１−′）のにフタ−）による形質転換は同時に行うことができる。ＤＮ Ａの細胞内取込みを促進させる方法は当業者によく知られている。相当に優れた 形質転換効率はＡＤＡｌｌを伝子に対してモル過剰の生産物遺伝子（好ましくは １０：１またはそれ以上）を使用して形質転換することによＶ＝られる。

ＡＤＡおよび生産物遺伝子の同時増＠を最も効率よく行うために、ＡＤＡ遺伝子 と生産物遺伝子とが共有結合された結合ベクターを使用することが好ましい。Ａ ＤＡ遺伝子と生産物遺伝子のコード鎖は好適には、生産物遺伝子の停止コドン’ １ＡＤＡ遺伝子の出発コドンに隣接して直接連結させることにより結合される。

これらの遺伝子同士はオリゴデオキシリボヌクレオチド欄を介して連結されても よい。このオリゴヌクレオチド５橋は終止コドンや出発コドンを含まず、またＲ ＮＡヘアピンルーゾを形成する可能性を減らすために回文構造（パリンドローム 構造）を含まない方がよい。また、多数の別個の生産物遺伝子を含む１つまたは ２つ以上のベクターで形質転換することもできる。

本発明方法に有用な細胞または細胞株を作る際に使用されるベクターは好ましく はらせん状の二本鎖環状構築物であって、標準原核生物クローニング法から得ら れるベクターである。しかしながら、（之ターはゲノム補助ＤＮＡへの連結のよ うに他の工程に付随して１箇所で共有結合が切断された線状ベクターであっても よい。

１つの好適なベクターはメリーラントゝ州ロックビル、パークローント９ライプ １２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ寄託番 号３９７５４　として大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｌ）ＭＣ１０６１中に寄託てれたプラスミド’ｐ９１０２３（Ｂ）である 。この寄託ベクターはＥｃｏＲＩで消化してＣ３Ｆ’遺伝子を欠失させ、それ１ ＡＤＡ遺伝子と置き換えることにより修飾される。ｐ９１０２３（Ｂ）　ばＣＨ ＯＭＢ胞やヘビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）中でＡＤＡ″全発現させるために 使用てれた。

本発明の一実施悪様として、外来性ＡＤＡ遺伝子および目的タンパク質をコード する外来性遺伝子と関連畑せてポリオーマ複製起点々らびに転写エンハンサ−を 含むベクターが提供される。例えば、ｐ９１０２３ベクターは自分野で知られた 技術を使って、５Ｖ４Ｑ　エンハンサ−を欠失させ、それヲホリオーマ、ＡＤＡ およびタンパク質コーディング配列で置き換えることにより修飾される。その後 、このベクターは高レベルのＴ抗原を発現しているｓリオーマ形質転換マウス細 胞株に導入される。

このポリオーマ系はかなりの利点を有するが、ＣＯ８系で使用されるものと類似 している。ＧＯ８ｍ胞はＳＶ４０により形質転換されたサル腎細胞であり、これ は５Ｖ４ＱからＴ抗原を発現する。５ｖ４０の複製起点を含むプラスミド全ＣＯ ８＃Ｉ胞に導入すると、Ｔ抗原がその５ｖ４０複製起点に作用して、非常に高い 特表昭６２−５０２６６２　（５） コピー数のプラスミドヲ複製させるであろう。プラスミドはこのように高いコピ ー数（約５０．０００コピー／細胞）へと複製されるので、細胞は急速に死滅し 、それらは高々２週間培養されるにすぎない。

ポリオーマはＣＯ８系よりも尖ったコピー数で複製し、それによシ細胞が生き残 るためのより良い状態全提供する。ポリオーマが複製できるマウス細胞は、ポリ オーマからＴ抗原全発現させるように選択される。ＡＤＡｉコードし且つポリオ ーマの複製起点をもつプラスミドがポリオーマにより形質転換されたマウス細胞 に導入される。複製は組込みによってよりもむしろプラスミドとしておこジ、細 胞あた５１，０００〜１０，０００のコピー数である。ポリオーマ細胞体を使用 し、それ全高レベルのアデノシンまたはＸｙ　１−　Ａの存在下にａｃＦ　２用 いて増幅させることにより、一般にＣＨＯやＢＨＫで通常得られるよりも１００ 倍高いａＣＦ　耐性が得られるでちろう。

本発明の別の実施態様では、レトロウィルス配列と外来性ＡＤＡ遺伝子と全連結 きせた新規なベクターが提供される。グループ抗原、ポリメラーゼおよび二ンは ロープ遺伝子がレトロウィルスから欠失されて、ＡＤＡ遺伝子およびＡＤＡ遺伝 子をウィルス内に封入させる適当な転写およびパッケージングシグナルで置換さ れる。このようなレトロウィルス構築技術は当業者に仰られている。その後この ウィルスは細胞から細胞へと伝染する。このＡＤＡウィルスの存在は他の細胞で の増大したＡＤＡ発現の存在について選択することによりスクリーニングされる 。このベクターは非常に高い効率でＡＤＡ遺伝子全細胞内に組み入れる能力を有 するので特に望ましい。コピー数はＡＤＡ遺伝子の存在ゆえに初期感染後に増幅 される。この種のレトロウィルスベクターは本方法に有用な細胞株全つくり出す ためばかりでなく、呻乳類の遺伝子療法においてｉｎ　ＶｉＶＯで細胞に感染さ せるために使用される。

ひとたび宿主細胞または細胞株が外来性ＡＤＡ　ＤＮＡおよび目的タンノξり質 をコードする外来性遺伝子を含むベクターで形質転換されて、意図する形質転換 細胞が選択されると、それらは生産物遺伝子のそれらの染色体への連結について 、あるいは生産物それ自体の発現についてスクリーニングされる。使用し得る生 産物遺伝子は本質的に無限である。呻乳動物やを推動物のような高等動物の細胞 に存在する活性のあるタンパク質や酵素の遺伝子が、目下のところ最も興味のあ る遺伝子である。

毒素全合成したジ宿主タンパク質を加水分解することにより全細胞に悪影響を及 ぼすタンパク質の遺伝子さえも、培地に抗毒素を加えたり又は最適発現レベルよ りも低いレベルを選択するなどして方法全変更することによフ使用することがで きる。

生産物遺伝子の連結についてのスクリーニングはサザンプロット分析金使って行 われる。生産物の発現についてのスクリーニングは標準的な免疫検定法、バイオ アッセイまたは酵素検定法金利用することができる。いったん形質転換細胞が同 定されると、生産物遺伝子の発現は上記のように一定量または次第に増加する量 の選択薬剤の存在下で継代培養することにより増幅させることができる。目下の ところでは、増加する濃度のａｃｔ’を用いる１ｌ−ＡＡＵ法の使用が好適であ る。一般にこれは（ａ）細胞集団中の他の細胞と比較したとき優先的に生産物を 発現する１個またはそれ以上の細胞を形質転換細胞集団から選択し、（１））選 択した細胞を表現型の発現の変化について選択するために考案された条件下で後 続の細胞集団へと培養し、そして（Ｃ１後続の集団中の他の細胞と比較したとき 優先的に生産物を発現する１個またはそれ以上の細胞をその後続の細胞集団から さらに選択することを伴う。工程（ｂ）は有利には複数の工程（ａ）のクローン を用いて行われる。

上記の方法はどれも形質転換細胞の選択および増幅の両方に利用さｎるが、よシ 好ましい実施態様では、異なる方法の組合せが利用きれるべきである一Ｘ７１− Ａ法は外来性ＤＮＡの取込みについての選択において１ｌ−ＡＡＵ系よりも感度 がよくしかも首尾一貫しているように思われる。形質転換細胞の増幅は好ましく は１ｌ−ＡＡＵ選択方法を便って行われる。

形質転換細胞はどんな培地でも生育できるが、後述するように使用する特定の方 法に応じていくつかの注意が必要でちる。

例えば、ウシ胎児血清はウマ血清よジも高レベルの内因性ＡＤＡを含有する。Ｘ ｙｌ−Ａ選択方法では３ｎＭのａＣＦが４．０μＭのＸｙｌ−Ａの存在下で使用 でｎるのに対して、１ｌ−ＡＡＵ選択方法では０．０１μＭのａＣＦが１ｍＭの アデノ７ンの存在下で０．０３μＭのａＣＦと共に使用される。従って、きわめ て低レベルの細胞毒剤（例えばＸｙｌ−Ａ　）　２必要とするだけの選択方法を 使用する場合、高レベルの内因性ＡＤＡ（例えばウシ胎児血清）を含む培地はそ の細胞毒剤を解毒しうる。ウシ胎児血清の使用が望まれた場合は、選択方法を例 えばかなり多量の細胞毒剤を使用する１ｌ−ＡＡＵのような異なる系に変えて、 ウシ胎児ＡＤＡによる影響を最小限に抑える。また、別の選択マーカーを利用す ることもできる。

Ｘ７１−Ａ選択方法の使用が望まれる場合は、多くの策略を講じることによりこ の問題を克服することができる。ウマ血清は高レイルの内因性ＡＤＡ’ｉ含まな いのでウシ胎児血清の代わりに使用されるだろう。しかしながら、ウシ胎児血清 の使用が望まれる場合は、高濃度のＸｙｌ−Ａ　ｆ使用してウシ胎児血清ＡＤＡ の作用を最小限に抑えることができる。さらに、選択の直前にＸ７１−Ａ　２加 えるか、またはＸｙｌ−Ａ　２定期的に加え続けてウシ胎児ＡＤＡによって解毒 されたＸ７１−Ａ　＞補充することができる。

次の実施例は本発明方法の使用を示すものである。

発現用のＡＤＡ　ｃＩ）ＮＡはすでに発表されたヒトおよびネズミの配列から選 択される。例えば、マウスＡＤＡｃＤＮＡ、ｐＡＤＡ５−２９（ユンらの上記文 献１５１７９〜１５１８５を参照〕は呻乳動物発現ベクターｐ９０１２３　（Ｃ ８Ｆ遺伝子６ＥｃｏＲ工消化で欠失させることによりｐ９１０２３（Ｂ）から誘 導される）の中に配置された。ｐＡＤＡ５−２９中の１０５６ヌクレオチドオー プン・リーディング・フレーム１Ｎｃｏ工およびＥｃｏＲＩ消化によジ切除した 。両末端’１ＤＮＡポリメラーゼｌのフレノウ断片によりイ１復して平滑末端と し、そしてベクターｐ９１０２３のＥｃｏＲ工部位に連結した。得られたベクタ ーｐ９ＡＤＡ５−２９（第１図参照）は（左から右へ向かって）アデノウィルス ＶＡ遺伝子（ＶＡ）、７２ｂｐ　エフｉ−７’！ｊ−ｆ含む５ｖ４０複製起点、 アデノウィルス３分節リーダーおよび５′スプライス部位を含むアデノウィルス メジャー後期プロモーター（ＡａＭＬＰ）、３′スプライス受容部位（３’ｓｓ ）、ＡＤＡ挿入物（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸還元酵素挿入物（ＤＨＰＲ）、５Ｖ ４Ｑ初期ポ１７　Ａ部位（ｓｖ４０）および大腸菌内での増殖に必要とされるｐ ＢＲ３２２配列を含む。

ベクターｐ９ＡＤＡ５−２９　を使用して、ＤＥＡＥ−デキストラン法によ、ｐ ｃＯ８−１細飽ヲトランスフエクトした。〔カラツマ゛ｙ　（Ｋａｕｆｍａｎ、 　Ｒ，Ｊ、　）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａａ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 同上を参照。〕トトランスフエフトされた細胞は９その細胞が高レベルでオーセ ンティックマウスＡＤＡ２生産するということを示すチモグラム分ｖＴヲ受けた 。

ＤＨＦＲ欠ＭｃＨＯｍｌｌ、ＣＨＯＤＨＦＲ（ＤＵＫＸＢＩＩ）Ｕ１０μ９／ｒ ｒｔｌのチミジン、デオキシアデノシンおよびアデノシンを含むアルファ培地で 増殖させた。これらの細胞ｔカウフマンらのＪ、Ｍｏ１．　Ｂｉ、ｏｘ、、ユ互 ０：６０１〜６２１（１９８２）に記載の方法によりｐＡＤＡ５−２９（２５μ ｇ／１０　細胞）でトランス；ｙｚり）ｔ、７’ｃ。トランスフェクションの４ ８時間後、（１）１０μ９７ｍ１チミジン、１５μ９／工Ｅヒポキサンチン、４ μＭＸｙ１−Ａおよびいろいろな濃度のａＣＦｙ２含むアルファ培地、または（ ２）１０μｇ７ｄチミジン、１０μ９　／ｒｔｔｌ　デオキシアデノシン、１ｍ Ｍウリジン、１．０ｍＭアデノシンおよびいろいろな濃度のｄＣＦ　ｔ−含むア ルファ培地で上記細胞を培養した（８Ｘ１０　細胞／　１０ｃｍ平板）。両方の 培地に対して、それぞれのａＣＦ’濃度の４つの平板を用意した。使用した２つ の培地はそれぞれＸｙｌ−Ａ選択法および修飾１ｌ−ＡＡＵ選択選択相当する。

１ｌ−ＡＡＵ　法はＣＨＯＤＨＦＲ−細胞力げリン類（翌　ｙ４生産することが できずアラノシンを使用する必要がないので変更した。ウシ胎児血清に内因性の 低レイルＡＤＡによる細胞学的薬剤や解毒を避けるために、１０チウシ胎児血清 は培地の使用直前に加えた。

このトランスフェクション法はまた比較のために擬似トランスフェクトされたＣ ＨＯＤＨＦＲ−細胞を作るべ（ＣＨＯ細胞株に外米性ＡＤＡＤＮＡｉ挿入しない で上記のように正確に繰り返された。選択方法の結果は、Ｘ７’ｌ−Ａ選択培地 が１ｌ−ＡＵ法よりも外来性ＤＮＡの取込みを示すのにより感度がよいことを示 した。ＤＮＡ取込みＫついての選択は好ましくは約４μＭＸｙ１−Ａおよび約０ ．００３〜０．０１４Ｍ　ａＣＦ’　１に：用いて測定すレｕｂ。

形質転換細胞はユン（Ｙｅｕｎｇ＋　Ｃ−）らの上記文献８３３８〜８３４５　 に記載されるような、またアラノシンを除いて先に改変されたような、次嬉に増 加する量のａＣＦ２使用する１ｌ−ＡＡＵ法で増幅させた。形質転換細胞は１０ ％ウシ胎児血清（グランド・アイランド・バイオロジカル・カンパニー）を含む ＤＭＥＭ　中３７℃でインキユイートシた。形質転換ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞は上 記の１ｌ−Ａｕ培地で増殖することができた。

０．０３μＭおよび０．１μＭのａＣＦ濃度で１ｌ−ＡＵ選択により選択された ６個の形質転換コロニーヲ上記の培地にまいた。次いで、これらの細胞ｉ０．１ μＭまたは０．５μＭのａＣＦ　にそれぞれさらした。大量のＡＤＡ２生産しな い細胞は死滅した。生き残った細胞が再び増殖を始めると、これらの細胞は同じ レベルのａＣＦ　に数回通過させた。その後ａＣＦ　の濃度を高めた。

細胞は０．０３μＭ、０．１μＭ　、　０．５μＭ、１μＭ、５μＭおよび２０ μＭのしはルで段階的にａＣＦにさらした。

分テすべき細胞は薬剤選択から１週間の間取り出し、収獲の２４時間前に１０チ 血清を含む新たなりＭＥＭ　を加えた。細胞をトリプシン処理により収獲し、・ ・ンクスの平衡塩ゆ液（Ｍｇ”およびＣａ　は不含）で３回洗い、そしてそれら の充填容量の２倍容量のホモナイゼーション用媒体（１０ｍＭ）リス−Ｈ（Ｊ。

ＰＨ７−５＋　１　ｍ　Ｍβ−メルカプトエタノールおよび１　ｍＭ　ＥＤＴＡ ）中に懸濁した。懸濁硬レットは一２０℃で凍結させ、解凍し、モーター付テフ ロンホモジナイザーを使ってホモジナイズした。

試料１’！１５０００Ｘ９で３０分ずつ２回遠心して細胞破片を除いた。上清（ 約１■／　ｍｌのタンパク質を含む）はデンプンゲルに直接加えた。電気泳動は ４℃において２００ｖで１６時間または４００ｖで５時間行った。電気炎動後、 デンプンゲルは約１調の厚でのレプリカシートに切り取り、そしてシシラノ（Ｓ ｉｃｉｌａｎｏ、　Ｍ、Ｊ、）うＯ／ロマトグラフ法および電気泳動法（スミス 、１．ｍ集）第４版、２巻、１８５〜２０９頁、Ｗｍ。

泳動ハンビズソク、ノース／ハウラントゝ、オツクスフオービ（１９７６）に記 載されるごとくアゾンシンデアミナーゼ活性のために組織化学的に染色した。

この処理ｉｄ　０．１μＭａＣＦ　で選択された形質転換細胞については約１０ 倍の増幅を、セして０，０３μＭ　ａＣＦ’で選択された形質転烟面ｐｅ１１に ついてｉｒｉ約５０倍の増幅をもたらした。これ以上の増幅は上記のようにｄｃ Ｆ２段階的に増加させて生存細胞に選択圧を加え続けることにより得られる。

実施例１に記載のプラスミドル９ＡＤＡ５−２９七、Ｃ３Ｆ’遺伝子の代わりに 目的生産物ｒ’　ＩＪ　ｓプチド全コードするＤＮＡ配列全含むｐ９１０２３（ Ｂ）誘導体のｐ９１０２３−ｐ　と混合した。

５０μ９　ｐ９１０２３−ｐ全０，５μｇ　ｐｇＡＤＡ５−２９と混合し、Ｎａ ０Ａｃ　（ｐ）１４．ｓ　）加えて０．３Ｍとなし且ツ２．５倍容量のエタノー ル？加えることにより沈澱させ九。沈澱したＤ　Ｎ　Ａ全自然乾燥させ、次に２ 　Ｘ　ＨＥＢＳＳ　（０，５ｍ／’　）　（チュー　（、Ｃｈｕ　）ら、３凹１ ．ユ３：Ｉ９７〜２０２（１９８１）　を参服〕中に再懸濁し、そしてカウフマ ンらのＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ　同上に記載されるように０、２５　Ｍ　ＣａＣ０ ，２（０，５ｍＢ）と共に弧しく混合した。リン敏カルシウムーＤＮＡ沈澱物は 室温で３０分間放置させ、ＣＨＯＤＵＫＸ−ＢＩ細胞に加えた〔チェイン７　（ Ｃｈａｓｉｎ　）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡニア：４２１６〜４２２０（１９８ １）ａ：参照〕。これらの細胞の増殖および維持にカウフマンらのＪ、ＭＯｌ、 　Ｂｌｏｌ、同上およびチェイン／らの上記文献に記載されている。

ＤＵＫＸ−Ｂ工細胞はトランスフェクションに先立って５×１０／１０ｃｆｎ皿 で２４時時間式培養した。培地を除き、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈澱物を単層 の細胞に加えた。室温−１１”３０分インキュイージョン後、１０チウシ胎児血 清金含むアルファ培地（フロー）５ａＩを加えて、細胞を３７℃で４．５時間イ ンキュベートした。次いで単層の細胞から培地を＄９出し、１０チグリセロール を含むアルファ培地（フロー）２ａＩを室温（２４℃）で３分間加え、その後除 去し、細胞を洗浄し、そしてｌＯチウシ胎児血清、１０μ９１ｔｎｉずつのチミ ジン、アデノシン、デオキシアデノシン、４ニジリンおよびストレプトマイシン を含むアルファ培地を加えた。２日後、細胞ハ上記のような選択培地中１：１５ で継代培養した。

コロニーハ選択培地での継代培養後１０〜１２日目に出現するであろう。選択お よび増幅の２つの計画が次に行われる。第１の計画では、単一の独立したクロー ン化形質転換細胞を外来性Ａ　Ｄ　Ａ　Ｄ　Ｎ　Ａの取込みに基づいて単離し、 続いて各クローンを生産物遺伝子の発現全高める条件下、すなわち次第に増加す る濃度のｄＣＦの存在下で増殖させる。第２の計画では、多数の独立した形質転 換細胞のプールを外来性ＡＤＡ　ＤＮＡの取込みに基づいて単離し、そして生産 物遺伝子の発現金高める条件下、すなわち次第に増加する濃度のａＣＦの存在下 で増殖させる。その後、個々のクローンを大量選択集団から単離して、生産物遺 伝子の発現について分析する。最高レベルの生産物遺伝子発現を示すクローンに 、生産物発現をさらに高める条件下、すなわち培地中の（ＩｃＦ濃度を次第に高 めて増殖させる。

トランスフエフ）ＡＤＡおよび生産物遺伝子ｋｌｉＪ時増幅させる別の方法は、 本実施例の方法で使用した非結合ベクターｐ９１０２３−ｐおよびｐ９ＡＤＡ５ −９の代われに、ＡＤＡ遺伝子と生産物遺伝子の両方を含むｐ９１０２３ベクタ ーを使用するこマウス線維芽−胞中の異種ＡＤＡ遺伝子の選択ｐＡＤＡ５−２９ １１Ｐの５ｖ４Ｑ起点および転写エンハンサ−の代ゎジに、ポリオーマウィルス 複製起点および転写エンハンッ゛−を含むプラスミ）’ｐＸｃ−ＡＤＡ　ｉ次の 方法ｌこより誘導された。

ＢＣＩ　Ｉ　部逗でＸｈｏｌ　ＩＪンカーと連后したポリオーマ調節領域を含む 出発プラスミドｐ、８４．Ａ２．Ｘ　（ベルトマン（Ｖｅｌｄｍａｎ）ら、Ｍｏ １．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　５　：６４９〜６５８（１９８５）ｋｇ照〕ヲ匍 」限エンドヌクレアーゼＢｇｌｌで消化した。末端は１００μＭ−ｆつのｄＡＴ Ｐ、ｄ、ＴＴＰ、ｄ、ＣＴＰ　およＵａＧＴＰ　（Ｄ存在下ＫＴ４ＤＮＡポリメ ラーゼ１を用いる修復反応にょジ平滑末端とした。

（マニアチュらの上記又ｉｔ参照〕。ＥｃｏＲニリンカー（コラポラティブリサ ーチ）を付加し、このＤ　Ｎ　Ａ　ｆ、ｒ過剰のＥｃｏＲＩとＸｈ、ｏ工で消化 した。得られたＤ　Ｎ　Ａはバッファー系としてトリス−ホウ酸を使用して６係 ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけ、そして３７０塩基で泳動する断片 を電気溶離（工ｄ）により単離した。

３７０　ｂｐ断片はＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで予めＹ白化しておいＢｌｏｌ、 同上を参照）に連結させた。得られたプラスミドヲＸｈｏ工および（Ｊａ工で消 化することにより約４００　ｂｐ断片全遊離サす＋！：り。ＥｃｏＲ工部位とＣ ｘａＩ部位の間にｐＢＲ３２２由来の２４ｂｐ’ｉ含むこの断片を単離し、Ｘｈ ｏＩおよびＣ１ａＩで予め消化して２いたｐＡＤＡ５−２９　に連結はせた。こ のＤＮＡを使って大腸菌ＨＢＩＯＩをテトラサイクリン耐性へと形質転換し、コ ロニーはｐ、８４．Ａ２．Ｘ由来のもとのＸｈｏＩ−Ｂｇｌ工断片のニックトラ ンスレーションにより作製したプローブへのフィルターハイブリグイゼーション 〔クルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、、　７２：３９６１（１９７５）’ｉ参照〕によりスクリーニン グした。ポジティブにハイブリダイズするクローンを分析し、そしてプラスミ） ”ｐＸＣ−ＡＤＡはｕ化−１＝シウム中で２回ＤＮＡ１バンド化することにより 調製した。プラスミド”ｐＸＣ−ＡＤＡの構造は多数の制限酵素で消化した後分 析することによジ確かめた。

ｐＸＣ−ＡＤＡはカウフマンらの；ｆ、Ｍｏｌ　Ｂｌｏｘ、、同上に記載される ように起点欠損ポリオーマウィルス初期領域で形質転換され次マウス線維芽細胞 （ＭＯＰ、ニューヨーク医科大学のクララジオ・バシリコ（Ｃ１ａｕｄｉｏ　Ｂ ａ日１１１ｃｏ　）により提案された〕をトランスフェクトするために使用した 。但し細胞は１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で増殖させた。

ポリオーマウィルスの初期領嘉に形質転換された表現型を誘発する３種の形質転 換抗原（犬、中、小のＴ抗原）七発現する。

犬Ｔ抗原にマウス線維芽細胞に導入されたｒｙ、＋）オーマ複製起点を含むプラ スミドの複製を誘発する。〔チングル（Ｔｙｎｄａ’ｌｌ　）ら、Ｎｕｃ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９　：　６２３１〜６２５０（１９８１）を参照。〕ト トランスフェクトンの４８時間後、細胞は次第に増加する濃度のａｃＦと共に４ μＭ　Ｘｙｘ−Ａ　ｆ：含む培地中２×１０　細胞／皿で継代培養しｆｃａ濃度 ごとに５つの平板を用慧した。

２週間後、ｐＸＣ−ＡＤＡ　でトランスフェクトした細胞と擬似トランスフェク トした細胞（外来性ＤＮＡ＝ｉ含まない）は両方とも０．０１μＭａＣＦ　で選 択した際にコロニーを有していた。

０．０３μＭａＣＦ　では、トランスフェクトした細胞に４３個のコロニーが現 れたのに対して、擬似トランスフェクトした細胞でに３個だった。トランスフェ クトし７′ＣＩ＃Ｕ胞におけるこの数はｏ、ｉμＭｄＣＦ　で３４個、０．３μ ＭａＣＦで１５個に減少した。

擬似トランスフェクトした細胞にはこれらの高レベルでコロニーが全く見られな かった。これらの高ａＣＦ濃度での細胞の増殖に、トランスフェクトされた細胞 がさらに高いａＣＦ濃度での逐次選択による増幅を伴わなくともプラスミド’ｐ Ｘｃ−ＡＤＡの多数のコピーを含むことを示している。ｐＸＣ−ＡＤＡ　’ｉ使 用するポリオーマ形質転換線維芽細胞での高レベルＡＤＡ発現の選択は、恐らく ポリオーマ複製シグナルによってもたう畑れた高プラスミド複製から生じたもの であろう。

レトロウィルスイクタ−ｐＥＶＸ（クリ−グラ−（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）ら１．９ 土リエ、ユ８：４８３〜４９１（１９８４）全参照〕はモロネイ（Ｍｏｌｏｎｅ ｙ）　白血病ウィルスとハーベイ（Ｈａｒｖθｙ）肉腫ウィルスの両方の配列か ら誘導でれた。ｐＥＶＸは完全に機能するモロネイ白血病ウィルスの・ξツケー リングシグナル配列を保持させつつ、ハーベイ肉腫ウィルスのパッケージング部 位を欠失させることにより修飾された（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、、　７２　：３９６１（１９７５）を参照〕。

得られたプラスミ）”ｐＦＶＸＭ（第２図参照）はウィルスのロング・ターミナ ル・リピー）（ＬＴＲ）および異種遺伝子挿入用の内部ポリリンカーを含む。そ れはレトロウィルスのグループ抗原（ｇａｇ）、ポリメラーゼ（ｐｏｘ）および エンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子を含まない。このプラスミドのＢｇ１Ｄ部位は唯 一のものでろり、挿入配列によってコードされるタンパク質を生産しうるピリオ ンの挿入およびその後の発現にとって理想的である。

外米性ＡＤＡ　はｐＦＶＸＭへの挿入Ｏ７ｔめＫ、ｐＡＤＡ５−２９＝ｉＥｃｏ Ｒ工およびＳａｃ工で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して両末端全平滑 化し、セしてＢｇｌｌｌリンカ−（コラボラテイブ・リサーチ）を付刀口するこ とにより得られた。Ｂｇ１１消化およびアガロースゲルによる電気泳動の後、約 １．８Ｋｂのバンドを単離した。この断片は予めＢｇｌｌで消化しておいたｐＦ ’ＶＸＭに連結した。ニックトランスレートチれたＤＮＡ断片（ｐＡＤＡ５−２ ９　から単離シタもとのＥｃｏＲ工／Ｓａｃ　Ｉ断片）へのコロニーハイブリダ イゼーション（グルンスタインらの上記文献参照）によジコロニーヲ選別した。

ＤＮＡはポジティブにハイブリダイズするクローンから制限エンドヌクレアーゼ 分析により調製した。１つのクローンのｐＲｅｔｒｏ　ＡＤＡ　１−１は転写開 始のために使用さｎるレトロウィルスのロング・ターミナル・リピ−）　（ＬＴ Ｒ）に対して適切な方向で挿入てれたＡＤＡを含むことが判明した。

ｐＲｅｔｒｏ　ＡＤＡ　１−Ｉ　ＤＮＡは大腸菌ＨＢＩＯＩ中で増殖させること により調製し、塩化セシウムで２回バント９化した。このＤＮＡを用いてマウス 線維芽細胞Ｗ２細胞〔成熟ピリオンへとパッケージされない欠損モロネイウイル スゲノム金含む；マン（Ｍａｎｎ）ら、Ｃｅ１ｌ　３３　：　１５３〜１５９（ １９８３）を参照〕をトランスフェクトした。しかしながら、ｇａｇ、　１）０ １およびｅｎｖポリイプチド（ウィルス生産にとって必要であり、ｐＲｅｔｒ。

ＡＤＡ　１−１　から欠失されている）はその欠損ゲノムから発現される。これ らのタンパク質はｐＲｅｔｒｏ　ＡＤＡ　１−１に欠失されている全ての機能全 補足するのに充分である。２Ｘ１０　’／’２細胞のｐＲｅｔｒｏ　ＡＤＡ　１ −１　２５９によるＣ　ａＰＯ４媒介ＤＮＡトランスフエクシヨンの４８時間後 、細胞は０．０１　Ｍ　ａＣＦ　ｋ含む４μＭＸｙ１−Ａ　中で継代培養した。

ＤＮＡ１−受は取った細胞からは３つのコロニーが現れたが、ＤＮＡを欠いたと きにはが選択され、ＡＤＡのレトロウィルス生産について分析された。

１０　細胞（１ｉＪ）からの調整培地は２４時間後に回収し、濾過（０，２μＭ フィルター）後８μ９７ｍ１のポリブレンの存在下で３Ｔ３細胞（２Ｘ１０　） に２時間加えた。その後ウィルスを除き、細胞に新たな培地ｔ−供給した。４８ 時間後、全面３Ｔ３細胞ｔ　４　μＭ　Ｘｙｌ−Ａ　オ！ヒＯ，ｏ　１　’！　 タＩＣＯ，０３ｐＭ　ｄＣＦｆ含む培地中１＝１０で継代培養した。１４日後に コロニー全計数した。非感染細胞は２×１０　個の初めに感染嘔せた細胞めた９ ０．０１まｆｃは０．０３　Ｍ　ａＣＦ　中で増殖するコロニーを全くもたなか った。感染細胞は０．０１μＭ　ａＣＦ　で約４０００コロニーを、そして０． ０３μＭ　ａＣＦ’　で約３０００コロニーを有していた。これらの結果は）１ ０　の感染性単位がトランスフェクトされたＦ２細胞からの培養液１ゴるたりに 存在していたことを示している。

この方法は異種ＡＤＡ全発現する細胞を得る友めに、強力な選択系により細胞へ の増幅可能なイクターの導入を可能にする。

それは当分野でよく知られた技術を使用してレトロウィルスに他の遺伝子全導入 し、そしてまたそれら全細胞内に導入することにより可能であるだろう。外来性 ＡＤＡ遺伝子の存在は挿入されたウィルスＤＮＡの増幅を可能にする。さらに、 ｖ２細胞内のレトロウィルス配列の増幅は、動物やヒトに遺伝子全導入するため に必要なより高い力価のウィルス＃をもたらす。

ｐＦＶＸＭ Ｈθ２ 国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＤＡをコードする内因性遺伝子の少なくとも１つのコピー、ＡＤＡをコー ドする外来性遺伝子の増幅されたコピー、および選択されたタンパク質をコード する外来性遺伝子の増幅されたコピーを含む細胞を培養することから成る、選択 された外来性タンパク質を高レベルで発現させる方法。
2. ２．ＡＤＡをコードする内因性遺伝子を含む細胞を、ＡＤＡをコードする外来性 遺伝子および選択されたタンパク質をコードする外来性遺伝子で形質転換し、次 いで該外来性ＡＤＡ遺伝子を該外来性タンパク質遺伝子と共に同時増幅させるこ とから成る、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．外来性タンパク質遺伝子と外来性ＡＤＡ遺伝子を含む単一の発現ベクターで 該細胞を形質転換することから成る、請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．外来性タンパク質遺伝子と外来性ＡＤＡ遺伝子とが共有結合されている単一 発現ベクターで該細胞を形質転換することから成る、請求の範囲第３項記載の方 法。
5. ５．外来性ＡＤＡ遺伝子を含む第１の発現ベクターおよび外来性タンパク質遺伝 子を含む第２の発現ベクターで該細胞を形質転換することから成る、請求の範囲 第２項記載の方法。
6. ６．該細胞は酵母細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞株から成る群より選ばれる 、請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．哺乳動物細胞株はボウエス（Ｂｏｗｅｓ）細胞株、マウスＬ細胞、マウス線 維芽細胞、マウスＭＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト肝がんＨｅｐＧ２細胞株およびＣＨＯ 細胞様から成る群より選ばれる、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．ＡＤＡをコードする内因性遺伝子を含む細胞株を、ＡＤＡコードする外来性 遺伝子および選択されたタンパク質をコードする外来性遺伝子で形質転換し、次 いで該外来性ＡＤＡ遺伝子と該外来性タンパク質遺伝子とを同時増幅させること により作られた、選択された外来性タンパク質を高レベルで発現させるための細 胞株。
9. ９．ＡＤＡをコードする外来性遺伝子はネズミＡＤＡ、ヒトＡＤＡ、細菌ＡＤＡ および酵母ＡＤＡから成る群より選ばれる請求の範囲第８項記載の細胞株。
10. １０．ＡＤＡをコードする外来性遺伝子と該遺伝子のウイルス内封入を支配しう るレトロウイルス転写およびパツケージノグ配列を含有するベクター。
11. １１．目的の外来性タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む請求の範囲第１ ０項記載ノベクター。
12. １２．ＡＤＡをコードする外来性遺伝子および目的タンパク質をコードする遺伝 子をアデノウイルスＶＡ遺伝子、ＳＶ４０複製起点、アデノウイルスメジヤー後 期プロモーターおよびＳＶ４０初期ポリＡ部位と関連させて含有するベクター。
13. １３．ＡＤＡをコードする外来性遺伝子および目的タンパク質をコードする遺伝 子をポリオーマウイルス複製起点およびポリオーマウイルス転写エンハンサーと 関連させて含有するべクター。