HU230247B1 - A kívánt fehérjék túlexpressziója eukarióta sejtekben, a D1 ciklin túlexpressziójával vezérelve - Google Patents
A kívánt fehérjék túlexpressziója eukarióta sejtekben, a D1 ciklin túlexpressziójával vezérelve Download PDFInfo
- Publication number
- HU230247B1 HU230247B1 HU0103485A HUP0103485A HU230247B1 HU 230247 B1 HU230247 B1 HU 230247B1 HU 0103485 A HU0103485 A HU 0103485A HU P0103485 A HUP0103485 A HU P0103485A HU 230247 B1 HU230247 B1 HU 230247B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cell
- protein
- cyclin
- interest
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 42
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 title claims description 34
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 title claims description 31
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 131
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 25
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims description 8
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims description 8
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 claims 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 19
- 101000798130 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Proteins 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 16
- 102100032236 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Human genes 0.000 description 16
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 16
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108010019673 Darbepoetin alfa Proteins 0.000 description 8
- 102100032610 Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Human genes 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 7
- 210000004128 D cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 5
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 4
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000052781 human TNFRSF11B Human genes 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 2
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010058544 Cyclin D2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003909 Cyclin E Human genes 0.000 description 1
- 108090000257 Cyclin E Proteins 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000013698 Cyclin-Dependent Kinase 6 Human genes 0.000 description 1
- 108010025468 Cyclin-Dependent Kinase 6 Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 102100024185 G1/S-specific cyclin-D2 Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001063991 Homo sapiens Leptin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 1
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000002299 affinity electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150040681 cho1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 101150062626 dpo gene Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 102000049953 human LEP Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 101150098327 neoN gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N pyrimethanil Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NC=2C=CC=CC=2)=N1 ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A kívánt fehérjék túlexpresszíója eukaríóta sejtekben, a Dl eiklin túlexpressziójával vezérelve
Az emlős sejtciklus előrehaladását a ciklin-dependens kínázok rendezett aktiválása vezérli. Egy aktív ciklin-dependens kináz tartalmaz egy katalitikus alegységei, valamint egy eiklin nevö szabályozd alegységet, A ciklin-dependens kináz aktivitását a ciklinekkel és a ciklin-dependens kináz inhibitorokkal (CKI~k) való kölcsönhatások és a poszt-transzlációs módosítások (azaz például a íoszíorilezés) szabályozzák.
A sejtciklus különböző fázisai közötti átmenetet meghatározott ellenőrzési pontokban .különböző eiklin alegységek szabályozzák; a. GI cikknek a Gí/S átmenetet, az S cikknek az S fázisban való előrehaladást, valamint a G2 vagy mítotikus cikknek a mítőzisha való belépést, A sejtnek az az „állásfoglalása”, hogy belép az S fázisba, a. késői öl fázis egy restrikciós pontjában (B) történik meg, ami után a sejteknek már nincs szükségük a autogén növekedési faktorokra ahhoz, hogy befejezzék az osztódást.
A D és E eiklínek szekvenciálisán szintetizálod nak a G1 fázisban, és ezek a sebesség-meghatározók az S fázisba való belépés során, ezért tehát GI eiklineknek. tekinthetők. Legalább három emlős gén kódolja a D-tipusú cikiineket (Dl, D2 és D3). A D típusú ciklinek progresszíven indukálódnak a mitogén serkenV * * ϊ ♦·:
* ♦ * * * tésre adott késleltetett korai válasz részeként, és sejtvonaí-specihkus módon expresszálódnak. A D-típusú cikíinek CDK4 és CDKö-tal való ősszeáilását mítogének szabályozzák poszt-transziáeiős&n. Ha egyszer már összeálltak, akkor a D eikiinhez kötött ciklín-dependens kinázokat egy ciklín-dependens kinázt aktiváló kínáznak (CAK) kell foszforileznie ahhoz, hogy katalitikus aktivitást kapjunk.
A D cikknek az evolúció eltérő ágán találhatók, mint az A-, B~ vagy E-típusú cikknek, és a D-tipusű cíklíneknek van néhány, a többiektől eltérő tulajdonsága. Ezek rövid felezési idejű fehérjék (h /2 < 25 perc). A növekedési faktorok visszavonása a. G1 során megakadályozza a D eiklin állandó felhalmozódását, ann összhangban vau azzal, hogy a növekedési faktoroktól megfosztott sejtek nem képesek túljutni az R pontom Tehát a D eiklin expressziőját extraceiíuláris jelek szabályozzák, az A, B és B eíklínektői eltérően.
A humán Dl és B cikíinek rágcsáló vagy hunián fíbrobíasztokban való expressziója rovíditi a G1 -et, csökkentik a sejt méretét, és csökkentik a Gl-S átmenet szeműn-igényét pResnítzky és mtsaí: Molecuiar & Celiular Biology 14, 1.669· 1679 (1994); Quelle és mtsai: Genes & Development 7, 1559-1571 (1993); Ohtsubo & Rofaerts: Science 259, 1908 1912 (1992)]. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a D cikíinek elnyomnak egy E eiklin által fiziológiásán szabályozott, funkciót, vagy fordítva. Azonban a D vagy E eiklin tűlexpressziója nem eredményezi a íibroblaszl transzformációját ~ a sejtek szérum dependensek.
kontakt-gátoltak maradnak, és nem képesek telepeket képezni félszílárd közegben, Á Dl ciklín túlexpressziőjáról is kiderült., hogy fokozza az endogén gének ampHíikációját, axní azt sugallja, hogy a tumor kifejlődése során a .genomi&lis instabilitásban, .játszik szerepet |Zhou és mtsai: Cancer Rés. 56, 36-39 (199ő}j.
A jelen találmány tárgyát egy CHO sejt képezi, ami a következő komponenseket tartalmazza:
géntern egy inzertált génkonstmkcíö egt számára, amiben a Dl működőképesen expresszálödik egy inzertált génkonstrukdó egy számunkra érdekes géntermék ahol a CHO sejt szérum-mentes közeghez adaptált.
. jelen találmány tárgyát képezi továbbá, egy számunkra érdekes íkéxje előállítási eljárása, ami az alábbi lépéseket tartalmazza:
A, létrehozunk egy szérummentes közeghez adaptált CHO sejtet, v az alábbiakat tartalmazza:
egy inzertált: génkonstrukdó egy Dl eíklin géntermék számára, amiben a Dl ciklín géntermék esen egy inzertált gén konstrukció egy számunkra érdekes fehérje számára,
B. a sejtet olyan, körülmények között tenyésztjük, amik lehetővé teszik a számunkra érdekes fehérje expresszíóját és a Dl ciklin géntermék működőképes expresszióját; és
Α , 4 · ♦ X* izoláljuk a számunkra, érdekes fehérjét,
A jelen találmány szerinti fehérjék előnyösen emlős fehérjék, amik közül a CHO sejteket részesítjük leginkább előnyben. A D ciklin génterméke előnyösen emlős eredetű, és a humán eredetűt részesítjük leginkább előnyben. A D ciklin gén, vágj7 a számunkra érdekes fehérjét kódold gén {vagy mindkettő) a sejtben egy expressziős vektorban vagy vektorokban lehet, vagy a sejt genomjába lehet, integrálódva.
Bármilyen számú, számunkra érdekes fehérjét használhatunk a jelen találmányban. Specifikus esetben az EPO. az OPG, a leptin és a NESP, valamint ezek bármilyen származéka használható,
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékeit ábrákat.
Az 1. ábrán a pcDNA3.1/Dl ciklin-nel transzfektá.lt, és humán Dl ciklin-specifikus ellenanyaggal kezelt AM-1 sejtek Iizátumainak Western biottja látható (lásd az „Anyagok és Módszerek” részt). Ez a. blott a humán. Dl ciklin expresszióját demonstrálja az AM-1 /D sejtekben.
A 2A., 2B,, 2C. és 2E>, ábrák hisztogrammok, amik az AM~ 1/D és AM-1 sejtvonalak nem-szinkronizált sejtjei relatív DNS tartalmát jx-tengély) és sejtszámát (y tengely) mutálják, propidium -jodiddal való festés és FACSean -nel (Becton Dickinson; lásd az „Anyagok és Módszerek* részt) elemzés után. Ezek az ábrák azt mutatják., bőgj' az ÁM 1/D sejtekben szígnífisejt van az S f
A 3. ábra egy grafikon, ami az OPG-Fc-t különböző szinten expresszáló kiónok számát mutatja. Az AM-l/D sejteket a pDSRallá2/OPG-Fc plazmáddal transzíektáljuk, az alábbiakban az 1, példában ismerteted: módon. Ez a. grafikon azt mutatja, hogy a legmagasabban expresszáló klönok az AM-l/D sejtvonalböl származnak,
A 4, ábra egy grafikon, ami az EPO expresszíóját mutatja, az amplifikáláshoz használt MTX koncentrációjával szemben ábrázolva, Az AM-l/D sejteket a pDSRalfa2/hEPO plazmáddal transzfektáljuk, az alábbiakban a 2, példában leírt módon, A klönok közül kettőben megnőtt az EPO termelés, ha nőd az MTX koneentráeiója, ami sikeres gén-amplífikácíóra utal.
Az 5, ábrán az OPG(22~194pcys~Fc expresszlós szintjének összehasonlítását láthatjuk az AM-1 CHO sejtekből vagy AM1/ei.klin D CHO sejtekből származó 46 egyedi klánban, Az AM 1/cikiin D CHO sejtvonal szignifikánsan magasabb OPG{22~194)~ cys-Fc expressziét mutat, mint az AM-1 CHO sejtekből származó klönok.
A 6, ábrán az OPG{22-201 -Fc expresszió összehasonlítását láthatjuk a 24 , korábban Western blottal meghatározva legmagasabban expresszálónák talált kiónban. Minden egyes esetben az AM-1/ciklín D CHO sejtvonalból származó kiónok az OPG(22~ 2öl)~Fc sokkal magasabb expresszióját mutatják, mint a CHOl'SF) sejtekből származó klönok,
A 7, ábrán az átlagos KESP expressxiö látható, az egyes kiindulási CHO sejtvonalból származó, EIA-val meghatározva lég-
-e *.* *
jobbnak bizonyult 14 kiónban. A kondicionált tápközeg mintákat 24-lukas lemezekről gyűjtjük össze, két nap elteltével, a mintákat Western hlottai előszűrjük.
A 8, ábrán hajszálcsőves és bíoreak.toros eredetű minták Western biottja látható, aholis a hajszálcsóves és bioreaktoros eredetű kiválasztott NESP fehérjék, izoformáinak összehasonlítása látható. A hajszálcsöves eredetű minták amplinkálatian kiónokból származnak. A standard NESP fehérje, amit forgó palackból származó kondicionált közegből izoláltunk, mutatja a. kívánt nagy’ molekulasúlyú izotermákat. A kondicionált közeg tartalmazza az összes izoformát. A biottok a magas izoformák jelenlétét matatják az összes mintában.
Az alábbi definíciók a jelen leírásban használt szakkifejezésekre vonatkoznak, hacsak külön nem korlátozzuk a specifikus esetekben.
Az „inszertált nukleinsavak, vagy? a nukleinsavak Űnszerelöjá* szakkifejezés azt jelenti, hogy a nukleinsavat külső eszközökkel (azaz például transzfekcióval) juttatjuk be egy? sejtbe vagy szervezetbe. Az ínszertált nukleinsav szekvenciája a sejt genomjához viszonyítva lehet idegen, vagy a genomban már megtalálható. Az utóbbi esetben a bevitt nukleinsav lehetővé teszi a bevitt nukleinsav által kódolt fehérje nagyobb vágj? differenciáltan szabályozott expresszióját.
Az „EPO-val rokon fehérje” szakkifejezés jelentése a rekombináns DNS, vagy? más módszerekkel előállított, erítropoíetin valamint származékai és analógjai. Ilyen származék pél«: · ♦ * ♦
dául a terminálisán csonkított fehérje, a belső aminosavak eltávolításával (azaz példán! restrikciós emésztéssel hasított és újra ligáit) módosított fehérje, az aminosavak helyettesítései és hasonlók, Ilyen származékok például a fúziós fehérjék (azaz például egy Fc régióval képezett fúziós fehérjék). Az eritropoíetin jellemző példáit a. WO 91/05367, 94/09257, 38/03808 és 86/07594 számú nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk,
A „leptinnel rokon fehérje” szakkifejezés jelentése leptín, előnyösen humán leptín, valamint ennek származékai, amik rekombináns DNS és egyéb módszerekkel állíthatók elő. Ilyen származékok például azok a fehérjék, amiknek a vége csonkítva van. vagy belső aminosavak el vannak távolitva belőlük, aminosavak helyettesítve vannak bennük, és hasonlók. Ennek a definíciónak megfelelnek még a leptint tartalmazó fúziós fehérjék, azaz például a leptint és egy Fc fragmenst tartalmazó fúziós fehérje. A megfelelő leptín származékokat szabadalmi bejelentésekben ismertetik (WO 96/40912 (benyújtva 1995. december 19-én), WÖ 96/05309 (benyújtva 1996. február 22-én). WO 97/06816 (benyújtva. 1997. december 27-én), WÖ 97/18833 (benyújtva 1997. május 29-én), amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk].
Az „OFG-vel rokon fehérje” szakkifejezés jelentése az OPG-re és származékaira vonatkozik, amiket rekombináns DNS és .más módszerekkel lehet előállítani. Ilyen származék például a terminálisán csonkított fehérje, a belső aminosavak eltávolításával ♦ < * (azaz például restrikciós emésztéssel hasított és újra. ligáit) mó dosított fehérje, az atninosavak helyettesítései és hasonlók. Ilyen származékok, például a fúziós fehérjék (azaz például egy Fc régióval képezett fúziós fehérjék). Az OPG származékait például a WO 97/23614 számú szabadalmi, bejelentésben ismertetik, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.
Génkonstrukelők
A jelen találmányban használt nukleinsavakat rekombináns DNS módszerekkel állíthatjuk elő, lásd például Nelles és munkatársai rekombináns DNS módszereit [Nelles és mtsai: Journal of Bíological Chemistry 262, 1ÖS55 (1987)],
A nuklcmsavak számos különböző forráshői származhatnak, beleértve a genomiális DNS-t, a szubgenomiális DNS-t, a cDNS-t, a szintetikus DNS-t és ezek kombinációit. A. genomiális és cDNS-t számos különböző módszerrel előállíthatjuk. A kívánt szekvenciát kódoló sejtek izolálhatok, és a genomiális DNS-ük fragmentáiható (azaz például egy vagy tőhh restrikciós endonukleázzal kezelve), és a kapott fragmensek klónozhatok, azonosíthatók egy próbával, ami komplementer a kívánt szekvenciával, és megvizsgálható, hogy van- e benne a kívánt aktivitást kódoló szekvencia, A cDNS esetében a cDNS klónozható, és a kapott kiónt átvizsgálhatjuk, hogy van-e benne a vitást kódoló szekvencia. A kívánt klón izolálása után a cDNS-t lényegében ugyanolyan módszerekkel manipulálhatjuk, mint a genomiális DNS-t.
Χ««
Φ
A számunkra
Tjét kódoló szekvencia mellett a számos különböző szabályozó régiót ís kell
Zi z egy felismert transzkripciós és transzlációs szignálokra van szükség. A kódoló szekvenciát emellett a gazdasejftei kompatíbilis promoterhez is kapcsolni keli. A promoter lehet indukálható, ami az expressziö további szabályozását teszi lehetővé, vagy lehet konstitutív. Számos különböző, alkalmazható promoter ismert a
Egy másik változat szerint a genomiális DNS promoter régióját megkaphatjuk a kódoló szekvenciával összekapcsolva. Ameddig a gazdasejtek felismerik a kódoló régióhoz kapcsolódó transzkripciós szabályozó és transzlációs íniciácíós szignálokat, a kódoló szekvenciával szomszédos 5' régió megtartható, és használható transzkripciós és transzlációs szabályozásra. Ez a régió tipi kus esetben tartalmazza azokat a szekvenciákat, amik a transz krpció és transzláció iniciálásában játszanak szerepet, azaz péla TATA boxot, a lezáró szekvenciát, a CAAT szekvenciát és a.
hasonlókat. Tipikus esetben ez a régió legalább 150 bázispár hosszú, még tipikusabb, ha körülbelül 200 bázispár, és mérete ritkán haladja meg az 1-2 kílobázíst.
A nem-kődolő 3' régiót is megtarthatjuk, főleg a transzkripciós terminációs szabályozó-szekvenciái, azaz például a stop szignál és a pohadenilezési régió miatt. Emellett a 3' nem-kódoló régió tartalmazhat egy fokozol is. Amikor a transzkripciós terminációs szignálok nem működnek kielégítően a gazdasejtben, ·ΐθ akkor egy másik génből származó funkcionális 3' régióval lehet helyettesíteni. A helyettesített 3 régió megválasztása függ az expresssióhoz kiválasztott sejtrendszertől.
Számos különböző transzkripciós és transzlációs szabáiyozószekvencia használható, a gazdaszervezet természetétől függően. A transzkripciós és transzlációs szabályozó-szekvenciák származhatnak viráils forrásokból (azaz például adenovírnsból, szarvasmarha papíllóma vírusból, Simian vírusból és hasonlókból), amikor a szabályozó-szekvenciák egy olyan génből származnak, ami nagyon jól expresszálödik a gazdaszervezetben. Egy másik változat szerint az emlős expressziós termékekből (azaz például míozínból és hasonlókból) származó promoterek is használhatók. Olyan transzkripciós iniciácíós szabályoző-szekveneiákat választhatunk ki, amik lehetővé teszik a repressziót vagy aktívádét, és ezáltal a gének expressziója befolyásolhatóvá válik. Egy ilyen szabályozható modulációs technika a hőmérséklet-érzékeny szabályozó szignálok használata, ezáltal az expresszíő a hőmérséklet megváltoztatásával elnyomható vagy inícíálható. Egy másik szabályozható modulációs technika a bizonyos kémiai anyagokra érzékeny szabályozó szignálok haszná A génkonstrukciók előállításához a DNS fragmenseket a szakterületen ismertet hagyományos technikákkal ligái hatjuk. Ilyen technika pékiául a restrikciós enzimek használata a tapadás végű fragmensek tompavégúvé (vagy fordítva.) való alakítására, a polimerázok és nukleotídok használata a. tapadös végek.
tompavégűvé való feh.öiiéséhez, az alkalikus foszfatáz használata a. nem-kívánt ligálás elkerüléséhez, és a ligázok használata a osszA könatrutóók transzformációval juttathatók be a sejtbe, egy olyan génnel együtt, amit lehetővé teszi a szelekciót, ha a konstrukció beépül a gazdaszervezet genomjába (azaz például homológ rekombinációval). A konstrukció általában egy vektor része, aminek a gazdasejt által felismert replikáciős rendszere van.
Expressziös vektorok
A jelen találmány szerinti molekulák előállításához használt expresszié» hordozók lehetnek plazmidok vagy más vektorok. Az ilyen vektorok általában olyan kontroll szekvenciákat tartalmaznak, amik lehetővé teszik az expressziót a különböző sejttípusokban. A kívánt kódoló és kontroll szekvenciákat tartalmazó megfelelő expressziös vektorokat a szakterületen ismertetett
DNS technikákkal állíthatjuk elő [Sambrook és mtsai: Molecuiar Cloning: A Laboratory Manuak 2, kiadás, Cold Spring Harbor Press, Coki Spring Harbor, N.Y. (1989)).
Egy jelen találmány szerinti expressziás vektor legalább arra képes, hogy vezérelje a számunkra érdekes fehérjét vagy ciklin génterméket kódoló fehérjéi kódoló nukleinsav replikációját és expresszióját. A vektorok egyik csoportja olyan DNS elemeket tartalmaz, amik állati vírusokból (azaz például adenovírasból, szarvasmarha papillóma vírusból, políóma vírusból, Simian ví* * * *
X 4 »ől és hasonlókból) származó, autonóm replikációra képes extrakromoszömális plazmídokat biztosítanak, A vektorok egy másik csoportja a kívánt génnek a gazdasejt kromoszómájába való integrálódásán alapul.
Á leien találmányban jól általában tartalmaznak egy replíkációs origót, az expresszálandő DNS szekvenciától 5' (azaz upstream) Irányban található promotert, valamint egy transzkripciós terminá.oiös szekvenciát. Megfelelő replíkációs ongo lehet például a ColEl, pSC.101, Ml 3, SV40 és EBV replikáoiós origó. A megfelelő terminációs szekvenciák közé tartozhat például a. cítomegalovírus promoter,. a lacZ promoter, a gal lö promoter és az AcMNPV políhedrális promoter, A. promoter «szekvenciája is lehet indukálható, hogy lehetővé tegye az expresszié modulálását, (azaz tápanyagoknak vagy más indukálószereknek a táptalajban való jelenlétével). Az egyik ilyen példa, a lambda plaő bakteriofágból származó lac operon, ami IPTG -vel indukálható.
Az expresszlős vektorok tartalmazhatnak más szabályozószekvenciákat is a kívánt termék optimális expressziójához. Ilyen szekvencia lehet: például a stabilitási vezérszekvencía, ami stabilitást biztosít az expresszlős terméknek; a szekréciós vezérszekvencia, ami az expresszlős termék szekrécióját biztosítja; a fokozok, amik erősítik a DNS szekvencia expressziőját; és a restrikciós enzim felismerési szekvenciák, amik a restrikciós endonnkleázok számára biztosítanak hasítási helyeket. Az összes ilyen anyag ismert a szakirodalomban, és kereskedelmi forgalom bán beszerezhető lOkayama; Molecular & Cellular Bíology 3. 28( « «χ. ** ♦·* „ ♦ ♦ > * * *
X *»;♦ .*** XX
X ·Χ ♦ * »Α« «Ο *« «* *·Κ *
*♦» * . >
** ϊ?<>3η ehetővé teszik a transzformált gazdase expressziós vektor tartalmazhat marki venclákat is, amil íenotípusos szelekcióját. Egy ilyen marker biztosíthat prototrőfiát egy auxotröf gazdaszervezetben, biocid rezisztenciát (azaz például antibiotikum rezisztenciát), és hasonlókat. A szelekciós marker gén vagy közvetlenül kapcsolódik az expresszáiandó kódoló szekvenciákhoz, vagy ko-expressziőval lehet ugyanabba a sejtbe bejuttatni. A szelekciós markerek közé tartozhat például a neomieln . ampicillín-, hígromíein-rezisztencía és hasonlók.
A használt aktuális expressziős vektorok jellemzőinek kompatibilisnek kell lenniük a használt gazd.asejtt.el. Egy emlős gazdaszervezetbez például az expressziós vektor tartalmazhat az emlős sejtből izolált promotereket (azaz például az egér metalloiíoneín promotert.), vagy az ezekben a sejtekben szaporodó vírusokból származó promotereket (azaz például a vakcínia vírus 7,5 & promoterét).
A megfelelő, kereskedelmi forgalomban levő expressziós vektorok, amikbe a jelen találmány szerinti kódoló szekvenciák beépíthetők, lehetnek a pcDNA vagy pcDNA I/N'eo emlős expressziós vektorok (amit előnyben részesítünk), a pSiueBae hakulovirus expressziós vektor, a pcDNA Π prokaríőfa expressziós vektor és az élesztő pYes2 expressziós vektor, amik mind beszerezhetők az Invitrogen Corp.nial.
lOgO ne ♦ * XX »· ♦ ♦ Λ *· » ♦ XX « ♦ ♦ -*·*
X ♦ ♦ <
χ* ♦* ««
Gazdasejtek
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan expressziós vektorokat, tartalmazó gazdasejtek:, amik a számunkra érdekes fehérjét és a D ciklm génterméket kódoló DNS szekvenciákat tartalmaznak. A leginkább megfelelő gazdasejtek az eukaríota sejtek, azaz például a ^odoptera/mplperda rovarsejtek. a COS-7 sejtek, a humán fi'brobíasztok, és a Sacehnrompees eerevánue sejtek. A gazdasejtként jól használható emlős sejtek közé tartoznak a fíbroblaszt eredetű sejtek (azaz például a VERŐ vagy CHO-Kl), vagy a límfoíd eredetű sejtek (azaz például az SP2/1-AG14 vagy a P3*63Sg8), vagy ezek származékai. Az előnyben részesített emlős gazdasejtek a CHO sejA halhatatlanná tett sejtek:, azaz például a mielőma vagy Hmfőma sejtek, szintén megfelelő gazdasejtek. Ezek a sejtek a .megfelelő táptalajon szaporithatők tenyésztő lombikokban, vagy egy szinergikus gazdaszervezetbe (azaz például egérbe vagy pat?st vagy immundeficiens gazdaszervezetbe vagy gazdahelyre (azaz például pucér egérbe vagy hörcsög pofazacskójába) injekciózhatok. Részletesebben, a sejteket bejuttathatjuk a hasüregbe, aszcitesz folyadék előállítása céljából, amiből a kiméra molekula kinyerhető. Egy másik változat szerint a szubkután injekciózhatok, majd az ellenanyagokat a gazdaszervezet véréből nyerhetjük ki. A sejteket Ugyanúgy használhatjuk, mint a híbrídóma sejteket [Diamond és mtsai: Tbc New England Journal of Medicíne 304, 1344 (1981); „Monoelonal Antíbodies:
**
- ϊ 5 -
« * *
* *·* *
* * *
Hybridomas --- A New Dimension in Biologic Analysis”, szerk.: Kennatt és munkatársai, Ptermm (1980)1.
Áz expressziós vektorokat a szakterületen ismertet különböző módszereidre! juttathatjuk be a gazdasejtekbe, Például a gazdasejtek expressziős vektorokkal való transzfekcióját a kalcium-foszfát csapadékos módszerrel hajthatjuk végre. Azonban más módszerek: is használhatók az expressziós vektoroknak a gazdasejtekbe való bejuttatására (például elektroporáció.
liposzómás fúzió, sejtmag injekció és virális- vagy fágfertozés).
Az expressziós vektor?: tartalmazó gazdasejteket az általános megköxeiítesi mód közül eggyel vagy többel azonosíthatjuk: (a) DNS-DNS hibridizáció; (b) a marker gén funkciók megléte vagy hiánya; (e) a transzkripció szintjének megbecsülése, a gazdasejtben, a génkonstrukciót kódoló mRNS transzkriptnmok termelődésének mérésével; (d) a géntermék immunológiai kimutatásával; (e) enzimesszével; és (f) poíimeráz láncreakcióval· Ezek a módszerek a szakterületen. jól ismertek (lásd például az 5,744,314 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírást, amely publikációt a. továbbiakban referenciaként kezeA jelen. találmány szerinti expressziós vektorok és DNS molekulák szekvenálhatők is. A szakterületen különböző szökvén á.l á.si módszerek ismertek. Ilyen például Sa.nger és munkatársai dídezoxi láneterminácíós módszere (Sanger és mtsai: Proceedíngs of the National Aeademy of Sciences, USA 74, 5463-5467 (1977)1,
Uö ’V valamint a Maxam-Giibert módszer [Maxam, Gilbert; Proceedlngs of the National Acádemy of Sciences, USA 74, 560-564 (1977)1.
Miután egy expresszlős vektort bejuttattunk egy megfelelő gazdasejtbe, a gazdasejtet olyan körülmények között tenyészthetjük, amik lehetővé teszik nagymennyiségű, számunkra érdekes fehérje expressziőját. A. számunkra érdekes fehérjét hagyományos körülmények között izolálhatjuk és tisztíthatjuk, azaz például extrakcíóval, kiesapással, kromatografiával, affinitáskromatográfíával, elektroforézissei és hasonlókkal. Az előnyben részesített módszer az aífimitáskromatográfia.
Az természetesen nyilvánvaló, hogy nem az összes expresszlős vektor és DNS szabályozó-szekvencia működik egyformán jól a jelen találmány szerinti nuldeinsavak expresszáíásábam Nem mindegyik gazdasejt működik egyformán ugyanazzal az expressziős rendszerrel. Azonban a szakterületen sztam az expresszms vés szabályozó-szekvenciák és gazdasejtek közül, a leírásban megadott kítanítás alapján, fölösleges kísérletezések nélkül, és anélkül hogy eltérne a jelen találmány oltalmi körétől és szellemétől.
Az alábbiakban részletesen megadjuk a jelen találmány specifikus megvalósítási módjait. Ezek a megvalósítási módok csak példaként szolgálnak, és az a céljuk, hogy illusztrálják a jelen találmány széles alkalmazhatósági körét. Hacsak a specifikációban külön nem jelezzük, akkor ezek a megvalósítási módok a részesített elemeit tartalmazzák.
t:
* .♦« :♦> «:·. . « V χ χ- ♦ ♦ » »
Φ ΧΦΦ *'* ♦ ♦ X *Χ »
χ......Φ « * 9 ♦
,.χ/φ '♦'* «♦ ♦*;
Anyagok én Módszerek
Plazmidok.
A humán Dl cíklin gént. (Genbank letéti szám M64349) a. pcDNA 3.1 plazmidba (Invítrogen) klónozzuk, majd konstiíuüve expressznltatjuk a citomegalovírus promoter/fokozó vezérletével, hogy előállítsuk a pvDNA 3.1/eÍkkn Dl piazmidot. A vektor emellett tartalmazza. a neomicin-rezisztencia gém, hogy stabil emlős sejtekben G418 jelenlétében szelektálni lehessen.
Sejttenyészet
CHÖd (SF) sejteket ÍÖÖ mm-es lemezeken tenyésztőnk komplett táptalajban (DMEM (Gibeo/BRL), 5% borjümagzat szérum (JRH Biosciences). .1% nem-esszeneiális atninosavak (Gíhco/BRLj, 1% hípoxantín/timidin (HT)(G.ibeo/BRL) és 1% glutamin / penicillin/ sztreptomicín (Gibco/ BRLjj. A sejteket tnpszinlzáiuk, megszámláltuk, majd 60 mm-es lemezekre szélesztjük (Falcon), 1><1Ö6 sejt/mi sűrűségben. Az AM-I CHOd sejteket szuszpenzíós forgatott tenyészetben szaporítjuk, Amgcn VM-szója táptalajban. A sejteket megszámláljuk, centrifugáljuk, újra szuszpendáljuk komplett táptalajban·, majd 60 mm-es lemezekre oltjuk le (Falcon), te li)6 sejt/ml sűrűségben. A sejteket éj szakán át tenyésztjük, A transzíekciö előtt három órával a sejtekről eltávolítjuk a táptalajt, és 4 ml friss táptalajjal helyettesítjük.
#
Dl ciklin transzfekció
Ebben a transzfekcióba.n a pc.DNA3,1 neoN vektort (Invitrogen) használjuk, ami a Dl ciklin cDNS inszertet tartalmazza. Mindegyik 60 mm-es lemezen levő sejttenyészethez 5 u.g pcDNA 3.1/ ciklin Dl. vektort (2 mg/ml) és 5 pg egér genomiális hordozd} DNS-t (Clonfech) (100 pg) adunk 1.72,5 μΐ steril vízben. 25 pl 2,5 mol/l CaCh-ot adunk a DNS oldathoz, így' 250 μΐ végtérfogatot kapunk. Kontroll vektorként 5 cg pneo vektor DNS-t (1,126 mg/ml). 5 pg hordozó DNS-sel, adunk 170,5 pl steril vízhez, majd 25 pl 2,5 mol/l CaCb~t adunk hozzá. Hamis kontrollként 25 pl 2,5 mol/l CaCb-ot adunk 225 pl vízhez. A DNS oldatokat cseppenként adjuk azonos térfogatú (250 ml) 2xHSS-hez (280 mrnol/1 nátríum-klorid, 10 mmol/l kálium-klorid, 1,5 mmol/l NaHPO4x2 H>O, 0,2 mmol/l dextröz, 50 mmol/l HEPES, pH~7,05), amin állandóan levegőt buhorékoltatunk át. A DNSHBS oldatokat 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A közeget eltávolítjuk a CHO sejtek lemezeiről, majd cseppenként DNA/HBS oldatot (500 pl őssztérfogat per lemez) adunk hozzá. Sejtvonalantot összesen 3 lemezt kezelünk pcDNA 3.1/ciklín Dl DNS-sel. valamim egy-egy lemezt a vektor- és a hamis kontrollal. A sejteket szobahőmérsékleten inkubáljuk 30 percig, majd 5 ml komplett közeget adunk minden egyes lemezhez. A sejteket azután éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A kővetkező napon a közeget friss táptalajjal helyettesítjük.
A CHOlSF) sejtek a transzfekció titán 48 órával egybe nőttek, A sejteket Iripszinízáljuk, majd teljes táptalajon újra szélesztjük, ;9 t feö mm lemeztől 8*100 mm lemezig terjedő ará j».y
Φ «« * * V* ♦ ♦ * * * * *· *· * κ Xí« ΦΦ* ** *** * ♦- . * * *. ♦ ♦ A * * ♦ ** ** ♦*
Á kővetkező napon a táptalajt komplett táptalajjal helyettesítjük., arai 1 mg/ml geneticínt (G418) (Gibco/BRL) tartalmaz. Az AM-l CHO sejtek a iranszfekció után 72 órával, nőttek egybe, ezután hasonló módon újra széleszíjük őket. A sejteken levő táptalajt hetente kétszer G4l8-at tartalmazó friss komplett táptalajjal cseréljük ki. A G418 szelektív táptalaj első hozzáadása után 10 nappal telepeket izolálunk a CHO(SF) és AM-l CHO Dl ciklinnel transzfektált lemezektől,, üveg klónozó hengerek (Belied) alkalmami énm es juk. A CHO(SF) sejtek transzfekdős gyakorisága sokkal magasabb (>1ÖO telep/lemez), mint az AM-l CHO sejteké (20-30 telep/lemez). Egyik hamis kontroll lemezcsoporton sem volt telep G418-at tartalmazó táptalajon. Miután a telepeket izoláltuk, az egyes lemezesoportokon levő sejteket tripszinizáljuk és egyesített tenyészetekbe kombináljuk 100 mm-es lemezeken ( 3 pool a CHO(SF)/cíklin Dl. és 2 pool az AM-l CHO/ciklin D2 esetében).
A transzfektált sejteket egyhenövésig szaporítjuk, majd újra széleszíjük hatlukas lemezeken, 2 luk. per klón per pool arányban. Az egybenővés elésérekor az egyes klón/pool sejtjeinek egyik lukából származó sejteket lizáltatjuk, 250 ml 1%-os Triton lízis pufFerrel (1% Triton XI00, 1 mmol/1 NaVOs, 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH”8, 100 mmol/1 nátrium-klorid, proteáz inhibitorok). A lizátumokat 14000 per pere fordulatszámmal 15 percig centrifugáljuk. A felülúszökat összegyűjtjük és -20 vC~on tároljuk. A lizátumokat Western hloítal elemezzük, hogv a sván
-2ö expresszálódík. Az egyes mintákból, valamint a kiindulási CHO(SF) és AM-I CHO sejtvonalakhól vett kontroliokból 25 μΐ-t-t összekeverünk 5 μ.1 5* PA.GE gélminta pufferrel, 3 percig forraljuk, majd 12%-os Novex TRISZ-glicin. gélekre visszük. A géleket 0,2 am-s nitroeellulóz szórólapokra (Schleicher és Schuell) elektrobiottoljuk. A szűröket antl-Dl ciklin Ab-3 monoklonáiis ellenanyaggal (Calbíochem) vizsgáljuk át, majd Amersham ECL reagensekkel hívjuk éld. Az eredmények azt mutatják, hogy a Dl ciklin különböző mértékben expresszálódík túl a poolozott tenyé szetekben és a legtöbb klánban.
A két AM-1 Cllü/clklm Dl poolozott tenyészetet és a két legerősebben expresszáíó CHÖ(SF)/ciklin D l tenyészetet minden egyes sejtvonal esetében „master ροοΓ-okba kombináljuk, amiket azután a későbbi transziekciőkban lehet használni:. A master pool tenyészeteket megvizsgáljuk, hogy megkapták-e a DHFR negatív tenotlpust, oly módon, hogy a sejteket hipoxantín/tinüdirimentes szelektív táptalajon (DMEM, 5% dialízált borjűmagzat szérum (Hyclone), nem-esszenciális aminosavak, glutamin/penicillin/sztreptomi cin) szaporítjuk. Ezen a táptalajon nem tudtuk sej tszaporodást kimutatni,
EPQ transzfekció
A CHO(SF)/cí.klín Dl és AM-1. CHÖ/ciklín Dl master pool tenyészeteket 1 mg/ml G4.18-cal kiegészített, komplett CHOd- táptalajon tartjuk. Ezeket a sejteket 60 mm-es lemezekre oltjuk, 8*ÍÖS scjt/iemez sűrűségben, majd éjszakán át inkubáljuk. A * y*
Μ X * < '*· * ♦ « ; * 5 « χ χ * .sejteket az előzőkben ismertet protokoll szerint pSW19 (ez egy közeli származéka a pDSRalfa2-nek)/EPO célDNS-sel, pDSRalía.2 vektor kontroll DNS-sel és heringsperma hordozó DNS-sel (Gíbco/BRL). 5 pg/lemez pSW19/EPO DNS végkoncentrációt használunk, A transzfekcíó után huszonnégy' órával a sejtekhez friss közeget adunk. A transzfekciő után hetvenkét órával a. sejteket tripszínizáljuk és 1:8, 1:10., 1:20 arányban újra széiesztjük 1 mg/ml G418-al tartalmazó szelektív táptalajon (60-100 mm-es lemezeken). A sejteken a táptalajt hetente kétszer cseréljük ki G418-at tartalmazó friss táptalajra. Az újra-szélesztés után tizenkét nappal 48 telepet izolálunk a CHÖ(SF)/eiklin DI/EPO-val tra.nszíektá.ií lemezekről. A megmaradt sejteket tripszínizáljuk és két pool tenyészetbe kombináljuk. Tizenöt napoz újra-szélesztés után negyvennyolc telepet izolálunk az AM1 CHÖ/cikiin DI/EPO-val transzferált lemezekről, majd a megmaradt sejteket két pool-ba egyesítjük. Az EPO expressziöt Western Unttal vizsgáljuk izolált klánok egyhenött huszonnégy-lukas tenyészeteiből, vagy a pool-ok 100 mm-es lemezes tenyészeteiből összegyűjtött, szérummentes kondicionált táptalajon. A géleket redukáló körülmények között futtatjuk, majd a biottokat 2D8 antí-EPO mo.noklonális ellenanyaggal vizsgáljuk át.
ORG fransxfckcíók
A pSW19/OPG DNS konstrukció CHOd (SP)/eiklin Ϊ master pool-okba és a CHÖd (SFj kiindulási sejtvonalba való transzfekciöját ugyanúgy hajtjuk végre, mint az EPO transzfekciót, Az OPG-Pc(22-2öl) két külön transziekcióját mindhárom gazdasejt··vonalba elvégezzük. Összesen 124 CHO(SF), 110 CHÖ{SF)/cycD és 147 AM I CHO/cycD telepet izolálunk az OPG-Fc(22-20I) transzfekcíókból, Az OPG expressziét Western blottal vizsgáljuk a kapott kiónokban és poohokban, anti-huIgGFe-HPP ellenanyagot (Pierce) vagy affinitás-tisztított nyúl antihuOPG políklonális ellenanyagot használva,
A DNS propídiumjodldos festése
A sejteket 1ÖÖ mm-es lemezekre oltjuk, majd körülbelül 5ö% os egvhenővésig hagyjuk szaporodni, A vizsgálathoz a sejteknek lóg fázisban kell lenniük. A sejteket tripszinizálássai gyűjtjük össze, majd azonos térfogatú DMEM/FBS-t tartalmazó oentriingaesöbe pipettázzuk, A sejtszuszpenzíö egy aiíkvot részét hemocitométerrel megszámláljuk. A sejtsm usegnek körülbelül lö6·KP sejt/5 ml között kell lennie. A sejteket eentríiúgálással (lOööxgj ülepítjük, majd kétszer mossuk jéghideg PBS-sel. A sejteknek egysejtes szuszpenziöban kell lenniük, 0,5 ml PBS-t adunk hozzá, majd a sejtszuszpenziót vortexeljük, A sejteket azután fixáljuk 2 mi 70%-os etanolnak a eső oldalán való eseppénlcéhtí hozzáadásával, miközben a sejtszuszpenziót óvatosan rázatjuk. A minimális fixálási idő 30 perc. (Ennél a pontnál a sejtszuszpenziót körülbelül 2 hétig tárolhatjuk 4 °C~on, mielőtt megfestjük és elemezzük,) A sejteket centrifugáljuk, hogy az- etanolos iélülúszót eltávolítsuk., egyszer mossuk PBS-sel, majd 5 percig 4 *C-on hagyjuk rehidratálódni. Á sejteket centrifugáljuk.
<φ ' fc ·* fc χ fcfc* * * . . >
'· .·* 'ί ·' ' .^•fc* *
-** ♦
***· * fc
;.'f '
a. PBS-t eltávolítjuk, majd az üledéket 0,5 ml propídium-jodid oldatban (Molecular Probes) reszuszpendáljnk (50 ag/ml, PBS-ben készítve). 10 μΐ DN&z mentes RNázt (10 mg/ml) (Boehringer M&nnheim) adunk hozzá, majd a sejtszuszpenziót 20 percig 37 öCo.n inkubáljuk. A mintákat 1 ml PBS-sel hígítjuk, majd 1 órán belül FACS-szal elemezzük.
A gének sejtékben való amplínkálását metotrexátnak (MTX) a növesztő táptalajhoz cseppenként való hozzáadásával hajtjuk végre. A sejteket továbboltjuk 1.:10 arányban 100 mm-es lemezeken, három alacsony metotrexát koncentrációban (1 nM;. 2,5 nM és 5 nM). A sejtek növekedését ellenőrizzük, majd azt a lemezt használjuk fel a következő amplifíkálási lépésben, amelyik elsőként érte el az -egyfeenőtt állapotot. Ka a sejtek egyformán jól nőnek egy vagy több metotrexát koncentráció mellett, akkor a következő menethez a legmagasabb metotrexát koncentrációt használjuk. Negyvennyolc órás szérummentes DMEM-en növesztett tenyészetet (4 ml/lemez) használunk arra, hogy Western blottal vagy EIA-val elemezzük a fehérje expressziójának szintjét. Huszonnégy óra hosszat hagyjuk, hogy a sejtek magukhoz térjenek a. metotrexátot tartalmazó komplett táptalajban, majd 1:10 arányban tovább oltjuk 3 magasabb metotrexát koncentrációra. A metotrexát. koncentrációját lépésekben lö nM-röl 1ÖÖ nM-ra emeljük. Általánosságban, ha a fehérje expressziqjának szintje nem éri el a 100 nM-os csúcsot, akkor az amplífikálást tovább * φ kos emelésekkel, ameddig elérjük a maximális expressziös szintet. A sejteket metotrexát. jelenlétében tartjuk, miután az optimális koncentrációt meghatároztuk.
Az AM-l/D sejtvonal létrehozása
Az AM-l/D sejtvonal az 1987. október 27-én megadott 4,703,008 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, valamint Urlaub és munkatársai publikációjában (Urlaub és mtsai: Proceedings of the National Aeaderny o:f Sciences, USA 77, 4461 (19801 (amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk}! ismertetett. CHOd(-) sejtvonalböl származik. A CHOd(-) sejtvonalat VM-Soy táptalajon való passzálással adaptáljuk, borjúmagzat szérum egyre csökkenő mennyisége, és végül teljes távolléte mellett. A kapott AM-1 szé~ rummentes sejtvonal megtartja a dhfr(-·} fenotípust. Az AM-1 sejtvonalat génsebészeti módszerekkel változtatjuk meg, hogy túlexpresszálja a humán Dl cikiint.
A. pcDNA. 3.1/ciklin Dl plazmidot az AM I sejtvonalba a standard kalcium-foszíátos kícsapásos transzfekciőval juttatjuk be. A G418-as szelekció után a telepeket tripszinizáljuk és két pool-ha egyesítjük. A humán Dl ciklin fehérje expresszióját a pöol-okből izolált sejtlizátumok Western blottjával demonstráljuk (1. ábra}, humán Dl ciklmre specifikus ellenanyag fant! Dl ciklin
A.b-8, Calbiochem} felhasználásával. Számos telepet izolálunk véletlenszerűen, klónozó gyűrűkkel, majd a sejtlizátumokat elkészítjük és elemezzük. A humán Dl ciklin expressziója a várható *·Μ·
-2$ módon változik a kiónok között. A klánokkal összehasonlítva. á két. pool magasabb általános humán. Dl ciklin fehérje -szintet, mutatott (L ábra). A két pool t egy master pool tenyészetbe kombináljuk, ami az összes későbbi kísérletben a kiindulási sejtvonal.
Az AM-l/D sejtvonalban expresszálf humán Dl ciklin funkcionális
Meghatároztuk, hogy' a humán Dl ciklin funkcionálisan expresszálődik a sejtciklus dinamikájának megváltoztatásával {lásd például a 2. példát és az alábbi leírást).
Az AM-l/D és AM~1 sejtvonalakböl származó nem-szinkronizált sejteket propídium-jodiddaJ festjük, majd FACScannal (Becton Díckínson) elemezzük. A 2A-2D, ábrán ri relatív DNS tártaimat (x tengely) és a sejtek számát (y tengely) láthatjuk. Szignifikánsan több sejt van S-fázísban az AM-l/D sejtek között (40,08%, 40,14%), mint az AM-1 sejtek között (33,73%), 32.25%). Ez azt demonstrálja, hogy a humán Dl ciklin túlexpresszíója. az AM-l/D-ben, egy CHO sejtvonalban funkcionális, mert szignifikánsan megváltoztatja a sejtciklus dinamikáját.
1., Példa
Elkészítjük a pDSRalfa2/OPG Fc piazmídot, hogy7 a humán OPG (GenBank. let éli szám U94332)-Fc fúziós fehérjét, a. p.DSRalfa2 expresszios vektorral expresszáltassuk. A standard koloinm-foszfáí kicsapás alkalmazásával a linearizált
*.♦ pDSRaifa2/OPG-Fc DNS-t párhuzamosan transzíektáljuk A 1/D sejtekbe, valamint módosítatlan, eredeti AM-1 sejtekbe. Az egyes transzfekciókböl 44 telepet választunk ki véieríenszerűen. majd két hétre HT kiegészítőket nem tartalmazó szelektív táptalajra tesszük.
A telepeket egyenként átvisszük huszormégylnkas lemezekre, és egybe növés lg szaporítjuk. Negyvennyolc óra elteltével a szérummentes kondicionált táptalajt összegyűjtjük.
-va elemezzük, a humán OPG-re specifikus antiszéruraot használva. A 3. ábrán az ebbői a sejtvonalból származó, az OPG-Fc-t külön>zo szmtexen expresszálö klónak szama :o, •fc»’-’’?
hogy az AM-l/D sejtvonalakból szignifikánsan több klón expresszálja magasabb szinten a rekombináns fehérjét, és az összes, legmagasabb szinten expresszálö klón, amik az GPG-Fe-t több mint 20 mg/ml koncentrációban expresszáiják, az AM-l/D sejtvonalból származik.
2. Példa
A humán Dpo gén expresszálására. a pDS.Ralía2/hEpo plazmídot állítjuk elő, majd AM-l/D sejtekbe transzíektáljuk az előzőkben ismertetett kalcium-főszfát klesapásos módszerrel. A további elemzéshez véletlenszerűen kiválasztunk negyvennyolc telepet. A négy legmagasabb szinten expresszálö kiönt a kondicionált táptalaj EÍA elemzésével azonosítjuk, majd metotrexát amplifikálásnak vetjük alá, 1 nM-nái kezdve. A 4. ábrán az E.PÖ expressziója látható az amplítlkálás során, A kiónok közűi kettő.
d *’χ» ·** » í **í rt*. ·*· x*’ '· ..· Űrt az AM-l/D 2-es klón és az AM-l/D 33-as klón
EPO termelést mutat a metotrexát növekvő koncentrációja mellett,, ezzel demonstrálva a sikeres gémamplífikáeiőt. Ezeket a kiónokat fagyasztás-olvasztás ciklussal vizsgáljuk, valamint extenzív passzálással igazoljuk, hogy az EPO expresszió nem vész el, ami az Epo gén stabil, expresszioját mutatja, ezekben a Időnokban.
Az QPG expressziéin AM I /cikiin D CHO sejtekben
Két OPG konstrukció expresszíóját hasonlítjuk össze cixhn sejtekben és más sejtvonalakban. Az ÖPG(22Fc-t AM-l/eil· sem es a Rnnutuast vonalba transzfektáljuk, amit korábban adaptáltunk a szérummentes táptalajon való szaporodáshoz jCHO(SF}k Az OPG (22194}xcysFc-t AM-1 cikiin D CHO sejtekbe, valamint a kiindulási AM I CHO sejtvonalba, transzfektáljuk. A transzfekcíókat a standard kalcium-foszfát módszerrel és DHFR szelekcióval hajtjuk végre. A transzfektált telepeket üveg klónozó hengerekkel izoláljuk. Az egyedi telepeket egybenövésig szaporítjuk huszonnégy-lukas lemezeken. A szérummentes .kondicionált begyűjtéseket Western blottal elemezzük, hogy szekretálják-e az OPG-t, ehhez eg/ OPG elleni poliklonálls ellenanyagot használva. A Western blottal a legmagasabb expressziós szintet mutató klönokböl származó kondicionált közeg-mintákat ELISA-val tovább elemezzük. Az AM-1 CHO sejtekből vagy az AM-1/cikiin D CMOS sejtekből származó 46 egyedi klón OPG(22- l94)-cys-Fc expressziós
' Ji •28 szintjeit összehasonlítottuk Í5, ábra). Ezenkívül összehasonlítottuk az OPG(22-201)-Fc expressziós szintjét a Western blottal meghatározva a 24 legmagasabb expressziét mutató klonban (6. ábra). Mindegyik esetben az AM-1 /eiklín D CHO sejtekből származó klánok szignifikánsan magasabb expressziós szintet, mutatnak, mint a CHO(SF) vagy AM-1 CHO sejtekből származó klánok.
A p.DSRx2 expressziós vektorba beépített NESP DNS-t a standard kalcium-foszfát módszerrel három különböző szérumadaptált CHOd sejtvonaiba transzfektáljuk: CHOd (SF), AM-1 és AM- 1 /eiklín D. A transzfekciöt, szelekciói: és a kiónok izolálását szérumtart.a.im.ú táptalajban hajtjuk végre, letapadt tenyészettek A NESP-et. magas szinten expresszálö klórokat kiindulásként
Western blottal azonosítjuk, egy1 EPO elleni monoklonális ellenanyaggal. Az expresszié mennyiségi meghatározását EIA-val végezzük. Az egyes sejtvonalakból a legmagasabb expressziét adó kiónok növekedését vizsgáljuk szémmmentes táptalajban, szuszpenziős tenyészetben. A kiónokat DNS a.mplíbkálásna.k vetjük alá, fokozatosan növelve a metotrexát koncentrációját szérummentes táptalajban, letapadt tenyészetben. Az amplifikáció során a NESP expresszióját Western blottal és EIA elemzéssel követjük. Az amplifiká.eiös eljárás során különböző pontokban szérummentes szuszpenziós tenyészetben elemezzük a kiónok növeke* * »** , /' ’
-?.9 ·· dését és expresszióját. Az AM-1/ciklin D CHO sejtvonalból származó kiónokban a NESP expresszió összességében magasabb szintű, mint a két másik, A klónokat izoelektromos határozzuk az izoformák kiindulási CHO sejtvonalban (7. ábra), fókuszálással Is elemezzük, hogy megeloszlását. Az izoformák eloszlásában nincs szignifikáns különbség a különböző kiónokban vagy a. kiindulási CHO sejtvonaíhói származó kontroll sejtvonalban (61L) (8.
A leírásban használt, rövidítések jelentése az alábbi; CHO aranyhörcsög petefészek DHFR dihidrofoiát-reduktáz
| E.3V | Eps lein Barr vírus |
| EIA | enzim immunesszé |
| EPO | eritroooiebn |
| HŐS | HEPES-sel puffereit sóold |
| 1EF | izoelektromos lekaszálás |
| MTX | metotrexát |
| NESP | uj eritropoiézist serkentő |
| OPG: | oszteoprotegerin |
Claims (20)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1, Eokanóta sejt, ami a következő komponenseket tartalmazza:a) egy Inzertéit nukleinsavat, ami egy D cikiln génterméket kódol, ahol a D cikiln géntennék funkcionálisan bármely természetes expreszsziós szintnél magasabb szinten expresszáiádik a sejtben; ésb) egy inzertált nukleinsavat, amely egy számunkra érdekes fehérjét kódok ami a sajtban bármely természetes expressziós szintnél magasabb szinten expresszáiódik.
- 2. Az 1. igénypont szerinti sejt, ahol a sejt egy emlős sejt,
- 3. Az t, igénypont szerinti sejt, ahol a sajt egy CKO sejt.
- 4. A 3. igénypont szerinti sejt, ahol a sejt szérummentes közeghez van adaptálva.
- 5. Az 1. igénypont szer Ind sejt, ahol a sajt egy AMA sejt.
- 6; Az 1. igénypont szerinti sejt, ahol a D eskün géntermék sgy emlős Dl cikiint tartalmaz.
- 7. Az 1. Igénypont szerinti sejt, ahol a D cikiln géntermék egy humán D cikiint tartalmaz.
- 8. Az 1. igénypont szerinti sejt, ahol a D cikiln géntermék egy humán Dl ciklim tartalmaz.
- 9. Az 1, igénypont szerinti sejt, ahol a számunkra érdekes fehérje egy EPÖ-vai rokon fehérje, egy OPG-vai rokon fehérje, vagy egy leptlonel rokon fehérje.lö. Az 1, igénypont szerinti fehérje, ahol a számunkra érdekes fehérje az EPO, az OPG, az ÖPG-Pc, a ieptin vagy az Fc-leptln.
- 11. Bj áráé egy számunkra -érdekéé fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a követkézé lépéseket alkalmazzuk:A) létrehozunk egy Izolált eukariőta sejtet, ami a kővetkezőket expresszáfia:1, egy D ciklin géntermékek bármely természetes expresszién szintnél magosabb szinten, és2. egy számunkra érdekes fehérjét, bármely a természetes expresszlős szintnél magasabb szinten oly módon, hogy egy olyan expresszlős vektort viszünk he, amely a szamunkra érdekes fehárte számára agy DNS szekvenciák tartalmaz, és egy olyan expresszlős vektort viszünk be, amely a D olklln géntermék számára egy DNS: szekvenciát tartalmazBj a sejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amik lehetővé teszik a számunkra érdekes: fehérje expressziéjét és a D eáiin géntennék funkcionális expreszszloját; ásC) Izoláljuk a számunkra érdekes tehénét
- 12, Alt. Igénypont szerinti eljárás, ahol a sejt egy emlős sejt.
- 13, A11. Igénypont szerinti ekárés, ahol a sejt agy CHO sejt,
- 14, A 13. igényperé szerinti eljárás, ahol a sejt szérummentes táptalajhoz van adaptálva.16. All, igénypont szerinti eljárás, ahol a sejt egy Atd-1 sejt.16, A 11, Igénypont szerinti eljárás, ahol a D ciklin géntermék egy emlős Dl oikiint tartalmaz,17, A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a D ciklin géntermék egy humán D clklint tartalmaz.
- 15, A 11, igénypont szerinti eljárás, ahol a D ciklin géntermék egy humán 01 cíkllnt tartalmaz,
- 19. All. igénypont szerinti eljárás, ahol a számunkra érdekes fehérje egy EFö-vai rokon fehérje, egy OPG-vel rokon fehérje, vagy egy leptlnnel rokon fehérje.
- 20. A 10,. Igénypont -szerinti eljárás, atol a számunkra érdekes fehérie- bPO. OPG; OPG-Pc, lapén-vagy FeAeptin.
- 21. Az 1, Igénypont szerinti sóit, ahol a számunkra érdekes fehérje egy a sejt genotnje számára Ideges szekvenciával rendelkezik.
- 22. A 11. Igénypont szerinti eljárás, ahol a számunkra érdekes fehérje egy a sejt genomja szemére Idegen szekvenciával rendelkezik.
- 23, Alt igénypont szerint· eljárás, ehet s számunkra érdekes lehégét transziekóléval Inzertaljuk a sejtbe.
- 24. A 11. vagy 23, igénypont szerint· eljárás, ehol e D clklin gántermékef transz.tokoséval inzertáljuk a sejtbe,
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9608698P | 1998-08-11 | 1998-08-11 | |
| US60/096,086 | 1998-08-11 | ||
| US09/371,309 | 1999-08-10 | ||
| US09/371,309 US6210924B1 (en) | 1998-08-11 | 1999-08-10 | Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line |
| PCT/US1999/018213 WO2000009714A1 (en) | 1998-08-11 | 1999-08-11 | Overexpression of desired proteins in eukaryotic cells mediated by cyclin d1 overexpression |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0103485A2 HUP0103485A2 (hu) | 2002-01-28 |
| HUP0103485A3 HUP0103485A3 (en) | 2010-01-28 |
| HU230247B1 true HU230247B1 (hu) | 2015-11-30 |
Family
ID=22255220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0103485A HU230247B1 (hu) | 1998-08-11 | 1999-08-11 | A kívánt fehérjék túlexpressziója eukarióta sejtekben, a D1 ciklin túlexpressziójával vezérelve |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6210924B1 (hu) |
| EP (1) | EP1105507B1 (hu) |
| JP (1) | JP4562915B2 (hu) |
| KR (1) | KR100502701B1 (hu) |
| CN (1) | CN1151263C (hu) |
| AT (1) | ATE374827T1 (hu) |
| AU (1) | AU747640B2 (hu) |
| CA (1) | CA2338820C (hu) |
| CY (1) | CY1106987T1 (hu) |
| DE (1) | DE69937243T2 (hu) |
| DK (1) | DK1105507T3 (hu) |
| ES (1) | ES2291038T3 (hu) |
| HU (1) | HU230247B1 (hu) |
| PT (1) | PT1105507E (hu) |
| WO (1) | WO2000009714A1 (hu) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020090646A1 (en) * | 2000-05-03 | 2002-07-11 | Amgen Inc. | Calcitonin-related molecules |
| MXPA04000134A (es) | 2001-06-26 | 2005-06-06 | Abgenix Inc | Anticuerpos para ligandos de osteoprotegerina. |
| AU2002316384A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-03-03 | Photomed Technologies, Inc. | Multiple wavelength illuminator |
| KR100427299B1 (ko) * | 2001-08-10 | 2004-04-14 | 한국생명공학연구원 | 인체 골 재흡수 억제인자（ｈＯＰＧ）를 생산하는 재조합플라스미드 ｐＧＨＯＰＧ（ＫＣＴＣ １０１９ＢＰ） |
| AU2003243139B2 (en) | 2002-04-05 | 2007-06-21 | Amgen Inc. | Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors |
| BRPI0314038B8 (pt) | 2002-09-06 | 2021-05-25 | Amgen Inc | anticorpo humano isolado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, uso de um anticorpo, e, composição farmacêutica |
| MY146381A (en) | 2004-12-22 | 2012-08-15 | Amgen Inc | Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies |
| EP1739179A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| AR056806A1 (es) | 2005-11-14 | 2007-10-24 | Amgen Inc | Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp |
| EP2500415A1 (en) | 2006-09-13 | 2012-09-19 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
| SG10201510384UA (en) | 2006-09-13 | 2016-01-28 | Abbvie Inc | Cell culture improvements |
| EP2111412A2 (en) * | 2007-02-02 | 2009-10-28 | Amgen, Inc | Hepcidin and hepcidin antibodies |
| US7982016B2 (en) | 2007-09-10 | 2011-07-19 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin |
| JO3382B1 (ar) | 2008-12-23 | 2019-03-13 | Amgen Inc | أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري |
| AU2010321720B2 (en) | 2009-11-23 | 2017-03-02 | Amgen Inc. | Monomeric antibody Fc |
| CN103097542B (zh) * | 2010-07-05 | 2016-04-13 | 维也纳农业大学 | 生产细胞系 |
| CA2825894C (en) | 2011-02-02 | 2021-11-30 | Amgen Inc. | Prognosis of cancer using a circulating biomarker |
| WO2013169734A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-14 | Amgen Inc. | Anti-erythropoietin antibodies |
| WO2014004549A2 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | Amgen Inc. | Anti-mesothelin binding proteins |
| MX2016002870A (es) | 2013-09-05 | 2017-02-23 | Amgen Inc | Moleculas que contienen fc que presentan perfiles de glicoforma predecibles, consistentes y reproducibles. |
| US10435464B1 (en) | 2014-09-05 | 2019-10-08 | Coherus Biosciences, Inc. | Methods for making recombinant proteins |
| MX2017003247A (es) | 2014-09-15 | 2017-11-30 | Amgen Inc | Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas. |
| MX2017004769A (es) | 2014-10-15 | 2017-10-16 | Amgen Inc | Elementos promotores y reguladores para mejorar la expresion de genes heterologos en celulas hospederas. |
| CN105669863B (zh) | 2014-12-05 | 2019-09-13 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用 |
| EP4435105A2 (en) | 2015-09-29 | 2024-09-25 | Amgen Inc. | Asgr inhibitors for reduzing cholesterol levels |
| EP3408397B1 (en) | 2016-01-27 | 2020-07-15 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Hybrid promoter and uses thereof |
| US11261462B2 (en) | 2016-01-27 | 2022-03-01 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Inducible expression from transposon-based vectors and uses |
| US11098310B2 (en) | 2016-01-27 | 2021-08-24 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Expression from transposon-based vectors and uses |
| TWI826351B (zh) | 2016-05-31 | 2023-12-21 | 大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司 | Ｒ抗體,其藥物組合物及其應用 |
| WO2018144784A1 (en) | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Smet Pharmaceutical Inc. | MONOMERIC HUMAN IgG1 Fc AND BISPECIFIC ANTIBODIES |
| CN117003874A (zh) | 2018-03-20 | 2023-11-07 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CN110357959B (zh) | 2018-04-10 | 2023-02-28 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CA3099163A1 (en) | 2018-05-01 | 2019-11-07 | Amgen Inc. | Antibodies with modulated glycan profiles |
| CN110655577A (zh) | 2018-06-13 | 2020-01-07 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| MX2021014931A (es) | 2019-06-07 | 2022-01-24 | Amgen Inc | Construcciones de union biespecificas con enlazadores selectivamente escindibles. |
| CN112239507A (zh) | 2019-07-17 | 2021-01-19 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | ETA抗体与TGF-β Trap的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CN112521501A (zh) | 2019-09-18 | 2021-03-19 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CA3184351A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
| EP4255931A1 (en) | 2020-12-03 | 2023-10-11 | Amgen Inc. | Immunoglobuline constructs with multiple binding domains |
| CN115141276A (zh) | 2021-03-31 | 2022-10-04 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其在糖尿病肾病和慢性肾病治疗中的应用 |
| MX2023014415A (es) | 2021-06-04 | 2024-02-08 | Amgen Inc | Moléculas de acoplamiento de linfocitos t y usos de las mismas. |
| CN113698466B (zh) * | 2021-07-30 | 2023-07-14 | 山东农业大学 | Ccnd1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用 |
| WO2024092033A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Amgen Inc. | Multispecific molecules for clearance of immunoglobulins in the treatment of autoantibody-induced diseases |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| IL79176A (en) | 1985-06-20 | 1992-06-21 | Kirin Amgen Inc | Process for the recovery of erythropoietin from a fluid |
| US5013718A (en) | 1986-11-21 | 1991-05-07 | Amgen, Inc. | Method for treating iron overload using EPO |
| KR100263845B1 (ko) | 1989-10-13 | 2000-08-16 | 스튜어트 엘.왓트 | 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물 |
| JPH06117187A (ja) | 1992-10-08 | 1994-04-26 | Iseki Tory Tech Inc | シールド掘削機 |
| US5514571A (en) | 1993-08-05 | 1996-05-07 | University Technologies International Inc. | Cyclin D1 negative regulatory activity |
| US5521066A (en) | 1993-09-13 | 1996-05-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Periplasmic membrane-bound system for detecting protein-protein interactions |
| EP0734438A4 (en) | 1993-12-17 | 1998-12-23 | Spinal Cord Society | METHOD FOR INDUCING DNA SYNTHESIS IN NEURONES |
| US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| EP0832220A1 (en) | 1995-06-07 | 1998-04-01 | Amgen Inc. | Ob protein compositions and method |
| MX9801159A (es) | 1995-08-17 | 1998-05-31 | Amgen Inc | Metodos de reduccion o para mantener los niveles reducidos de lipidos en la sangre usando composiciones de proteina ob. |
| EP0956862A1 (en) | 1995-11-22 | 1999-11-17 | Amgen Inc. | Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions |
| US6369027B1 (en) | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| GB9608143D0 (en) * | 1996-04-19 | 1996-06-26 | Ver Nl Kanker Inst | Assay |
-
1999
- 1999-08-10 US US09/371,309 patent/US6210924B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 ES ES99942098T patent/ES2291038T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 HU HU0103485A patent/HU230247B1/hu unknown
- 1999-08-11 KR KR10-2001-7001843A patent/KR100502701B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 CN CNB998118990A patent/CN1151263C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 AU AU55546/99A patent/AU747640B2/en not_active Expired
- 1999-08-11 PT PT99942098T patent/PT1105507E/pt unknown
- 1999-08-11 AT AT99942098T patent/ATE374827T1/de active
- 1999-08-11 DE DE69937243T patent/DE69937243T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 WO PCT/US1999/018213 patent/WO2000009714A1/en active IP Right Grant
- 1999-08-11 EP EP99942098A patent/EP1105507B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 JP JP2000565148A patent/JP4562915B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 DK DK99942098T patent/DK1105507T3/da active
- 1999-08-11 CA CA002338820A patent/CA2338820C/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-11-08 CY CY20071101438T patent/CY1106987T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1105507T3 (da) | 2007-11-05 |
| JP4562915B2 (ja) | 2010-10-13 |
| CN1322253A (zh) | 2001-11-14 |
| KR20020013462A (ko) | 2002-02-20 |
| DE69937243D1 (de) | 2007-11-15 |
| WO2000009714A9 (en) | 2000-05-18 |
| CA2338820C (en) | 2005-10-18 |
| PT1105507E (pt) | 2007-12-07 |
| WO2000009714A1 (en) | 2000-02-24 |
| CY1106987T1 (el) | 2012-09-26 |
| DE69937243T2 (de) | 2008-07-03 |
| EP1105507B1 (en) | 2007-10-03 |
| CN1151263C (zh) | 2004-05-26 |
| EP1105507A1 (en) | 2001-06-13 |
| US6210924B1 (en) | 2001-04-03 |
| JP2003524378A (ja) | 2003-08-19 |
| HUP0103485A3 (en) | 2010-01-28 |
| KR100502701B1 (ko) | 2005-07-22 |
| AU747640B2 (en) | 2002-05-16 |
| ATE374827T1 (de) | 2007-10-15 |
| AU5554699A (en) | 2000-03-06 |
| CA2338820A1 (en) | 2000-02-24 |
| ES2291038T3 (es) | 2008-02-16 |
| HUP0103485A2 (hu) | 2002-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU230247B1 (hu) | A kívánt fehérjék túlexpressziója eukarióta sejtekben, a D1 ciklin túlexpressziójával vezérelve | |
| CN115651927B (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
| CN113939591A (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
| KR20150123803A (ko) | 향상된 이식유전자 발현 및 가공 | |
| KR20190093171A (ko) | CRISPR/Cas9 시스템을 통한 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류의 제조방법 | |
| ES2213925T5 (es) | Seleccion entre positivos y negativos en el caso de la recombinacion homologa. | |
| US20200370056A1 (en) | Cell lines and methods for increased protein production | |
| US20080070996A1 (en) | Chondroitin synthase and nucleic acid encoding the enzyme | |
| US7273729B2 (en) | Chondroitin synthase and DNA encoding the enzyme | |
| TW200930815A (en) | Novel recombination sequences | |
| JP2024531607A (ja) | Ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼを含む組成物及びその使用 | |
| JP5990171B2 (ja) | Ｈｓｐｃ１１７分子のｒｎａリガーゼとしての使用 | |
| KR20230145117A (ko) | 변이체 cas12i4 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 이의 용도 | |
| EP3896155A1 (en) | Production method for genome-edited cells | |
| KR102361479B1 (ko) | ｓｉＲＮＡ의 생성 및 기능 증진 활성을 갖는 ＣＭＴＲ１의 신규용도 | |
| WO2024185889A1 (ja) | ガイドｒｎａ、及びその使用方法 | |
| EP1241253A1 (en) | HUMAN PROTEINS BINDING TO HUMAN TYROSINE KINASE Hck AND GENES ENCODING THE SAME | |
| MXPA01001238A (en) | Overexpression of desired proteins in eukaryotic cells mediated by cyclin d1 overexpression | |
| JPWO2005019456A1 (ja) | シノビオリン遺伝子のプロモーター | |
| Polymerases et al. | Animal Nuclear DNA-Dependent |