CN1151263C - 由细胞周期蛋白d1超量表达介导的真核细胞中所需蛋白的超量表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于蛋白表达的真核细胞，所述真核细胞包含：(a)编码细胞周期蛋白D基因产物的插入的核酸片段和(b)编码目的蛋白的插入的核酸片段，其中所述细胞周期蛋白D基因产物和所述目的蛋白在所述细胞中被表达。本发明还涉及生产目的蛋白的方法，所述方法包括(a)将编码细胞周期蛋白D基因产物的核酸和编码目的蛋白的核酸插入到真核细胞中；和(b)在允许表达所述目的蛋白的条件下培养所述细胞；和(c)分离所述目的蛋白。所述细胞最好是哺乳动物细胞，而CHO细为最优选的。所述细胞周期蛋白D基因产物最好是人源的。合适的目的蛋白包括促红细胞生成素(EPO)、骨原细胞生成素(OPG)、OPG-Fc、leptin、Fc-leptin和新红细胞发生刺激蛋白(NESP)。
Description
发明背景
哺乳动物细胞周期的递进(progression)通过依赖细胞周期蛋白的激酶(CDK)有序地活化而被驱动。活性CDK由催化亚基和称为细胞周期蛋白的调节亚基组成。通过用细胞周期蛋白与CDK抑制因子(CKI)相互作用以及翻译后修饰(例如磷酸化作用)调节CDK活性。
由不同细胞周期蛋白亚基在定义的关卡上调节细胞周期状态之间的转换：G1细胞周期蛋白调节G1/S转换，S细胞周期蛋白调节通过S期的递进，而G2或有丝分裂细胞周期蛋白调节进入有丝分裂。细胞定向进入S期发生在G1后期中的限制点(R)上，此后细胞完成分裂不再需要促有丝分裂生长因子。
细胞周期蛋白D和E在G1期间顺序地合成，并对进入S期限速，因此它们可以被认为是G1细胞周期蛋白。至少三种哺乳动物基因编码D-型细胞周期蛋白(D1、D2和D3)。D-型细胞周期蛋白作为对促有丝分裂刺激的延迟早期反应的部分被逐步诱导，并且它们以细胞谱系特异性的方式被表达。用CDK4和CDK6装配D-型细胞周期蛋白由促细胞分裂原翻译后调节。一旦装配成功，结合细胞周期蛋白D的CDK就必须由CDK活化激酶(CAK)磷酸化以获得催化活生。
来自A-、B-或E-型细胞周期蛋白的细胞周期蛋白D基因位于进化树的不同分支上，而D-型细胞周期蛋白具有有些不同于其它细胞周期蛋白的特性。它们为短寿命蛋白(t1/2＜25min)。在G1期间生长因子的撤出防止细胞周期蛋白D的稳定积累，与生长因子丧失的细胞不能通过R点的递进相关。因此，细胞周期蛋白D的表达由胞外信号调节，而不象细胞周期蛋白A、B和E的定期表达。
人细胞周期蛋白D1和E在啮类动物或人成纤维细胞中的超量表达缩短G1期、减小细胞大小和减少从G1期到S期转换的血清需求量(Resnitzky等，
MCB
14，1669-79(1994)；Quelle等，
Genes & Development
7，1559-71(1993)；Ohtsubo & Roberts，
Science
259，1908-12(1992))。这些结果表明，D细胞周期蛋白可能超越了由细胞周期蛋白E生理学地调节的功能，或反之亦然。然而，细胞周期蛋白D或E的超量表达不导致成纤维细胞的转化—细胞保持依赖血清、接触抑制且不能在半固体培养基中形成集落。还发现细胞周期蛋白D1的超量表达增强内源基因扩增，表明它在肿瘤发育期间基因组不稳定性中起着重要的作用。Zhou等，
Cancer Res.
56：36-9(1996)。
发明概述
本发明涉及包括真核细胞，所述真核细胞包含：
(a)细胞周期蛋白D基因产物，其中所述细胞周期蛋白D基因产物在所述细胞中为功能性表达，其表达水平高于比任何天然表达水平；和
(b)目的蛋白，其中所述目的蛋白在所述细胞中被表达，其表达水平高于任何天然表达水。
本发明还涉及产生目的蛋白的方法，所述方法包括：
A.提供表达以下物质的真核细胞
1.细胞周期蛋白D基因产物，其表达水平高于任何天然表达水和
2.目的蛋白，其表达水平高于任何天然表达水平；
B.在允许表达所述目的蛋白和功能性表达所述细胞周期蛋白D基因产物的条件下培养所述细胞；和
C.分离所述目的蛋白。
本发明的所述细胞最好是哺乳动物细胞，而CHO细胞为最优选的。所述细胞周期蛋白D基因产物最好是哺乳动物的，人源产物为最优选的。所述细胞周期蛋白D基因或编码所述目的蛋白的基因(或两者)可以包括于所述细胞内的一种或多种表达载体中，或可以将其整合到所述细胞基因组中。
任何数量的目的蛋白可以用于本发明中。具体地讲，可以使用EPO、OPG、leptin和NESP及它们的任何衍生物。
附图简述
图1显示用pcDNA3.1/细胞周期蛋白D1转染并用人细胞周期蛋白D1特异性抗体处理的AM-1细胞的裂解物的蛋白质印迹(参见材料和方法)。该印迹证实在AM-1/D细胞中人细胞周期蛋白的表达。
图2A、2B、2C和2D为曲线图，显示得自用碘化丙锭染色和根据FACScan分析的AM-1/D和AM-1细胞系的非同步细胞的相对DNA含量(x轴)和细胞数目(y轴)的(Becton Dickinson；参见材料和方法)。这些图显示AM-1/D细胞中有显著性更多的S期细胞。
图3为显示在各种水平上表达OPG-Fc的克隆数目的图。如此后本文实施例1中所描述，用质粒pDSRα2/OPG-Fc转染AM-1/D细胞。该图显示最高表达的克隆得自AM-1/D细胞系。
图4为显示EPO表达对用于扩增的MTX浓度作图的曲线图。如下文实施例2中所描述的，用质粒pDSRα2/hEPO转染AM-1/D细胞。其中二个克隆显示随着MTX浓度的增加EPO产量提高，证实成功的基因扩增。
图5显示得自AM-1 CHO细胞或AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞的46个单独的克隆中OPG(22-194)-cys-Fc表达水平的比较。得自AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞系的克隆显示出比得自AM-1CHO细胞的克隆显著高的OPG(22-194)-cys-Fc表达水平。
图6显示先前根据蛋白质印迹所测定的24个最高表达克隆中OPG(22-201)-Fc表达的比较。在所有情况下，得自AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞系的克隆均比得自CHO(SF)细胞的克隆显示出显著高的OPG(22-201)-Fc表达水平。
图7显示得自每个亲代CHO细胞系的14个最佳克隆中根据EIA测定的平均NESP表达。从24孔板中收集条件培养液样品，收获2天。根据蛋白质印迹预筛选样品。
图8显示旋转瓶(spinner)和生物反应器收获物的IEF蛋白质印迹，比较得自旋转瓶和生物反应器培养物的分泌的NESP蛋白的同种型分布。旋转瓶收获物来自未扩增的克隆。从滚瓶条件培养液纯化的标准NESP蛋白显示所需的高分子量同种型。所述条件培养液收获物包括所有同种型。所述印迹显示所有样品中都存在高同种型(highisoform)。
发明详述
除非在具体的实例中被限定，否则以下定义适用于本说明书所用的术语。
术语核酸的“被插入”和“插入”是指通过外源的方法将(例如，转染)将核酸导入细胞或生物中。所述插入的核酸可以具有对于细胞基因组为外源的序列或已经存在于细胞基因组中的外源序列。在后一种情况下，所述插入的核酸使由所述插入的核酸编码的蛋白的表达更高或所受的调节不同。
术语“EPO-相关蛋白”是指可以通过重组DNA和其它方法产生的促红细胞生成素及其衍生物和类似物。这种衍生物包括末端截短、去除内部氨基酸(例如通过相关DNA的限制和再连接)和氨基酸置换等的蛋白。这种衍生物还包括融合蛋白(例如，具有Fc区)。促红细胞生成素典型的衍生物描述于国际专利申请WO 91/05867、94/09257、88/03808和86/07594中，每个专利申请都通过引用结合到本文中。
术语“leptin-相关蛋白”是指可以通过重组DNA和其它方法产生的leptin(最好是人leptin)及其衍生物。这种衍生物包括末端截短、去除内部氨基酸和氨基酸置换等的蛋白。该定义内还包括包含leptin的融合蛋白，诸如包含1eptin和Fc片段的融合蛋白。合适的1eptin衍生物描述于专利申请WO 96/40912(1996年12月19日申请)、WO96/05309(1996年2月22日申请)、WO 97/06816(1997年2月27日申请)和WO 97/18833(1997年5月29日申请)中，所述专利申请都通过引用结合到本文中。
术语“OPG-相关蛋白”是指可以通过重组DNA和其它方法产生的OPG及其衍生物。这种衍生物包括末端截短、去除内部氨基酸(例如，通过相关DNA的限制和再连接)和氨基酸置换等。这种衍生物还包括融合蛋白(例如，具有Fc区)。OPG典型的衍生物描述于国际专利申请WO 97/23614中，所述专利申请通过引用结合到本文中。
制备方法
基因构建物
本发明所用的核酸可以通过重组核酸方法制备。参见，例如，Nelles等，
J.Biol.Chem.262，10855(1987)的重组DNA方法。
所述核酸可以得自各种来源，包括基因组DNA、亚基因组DNA、cDNA、合成DNA及其组合。基因组DNA和cDNA可以以许多方法获得。可以分离编码所需序列的细胞，分离基因组DNA (例如，通过用一种或多种限制性内切核酸酶处理)和克隆产生的片段，用与所需序列互补的探针鉴定，并筛选编码所需活性的序列的存在。对于cDNA，所述cDNA可以克隆，并用编码所需区域的cDNA的探针筛选产生的克隆。在分离所需克隆时，所述cDNA可以以与所述基因组DNA基本上相同的方式操作。
除所述目的蛋白的编码序列外，所述基因构建物应包括许多调节区。对于表达，由合适的宿主识别的转录和翻译信号是必需的。所述编码序列也应连接到与所述宿主细胞相匹配的启动子上。所述启动子可以为诱导型的，使得可以进一步控制表达，或可以是组成型的。许多合适的启动子为本领域已知的。
在另一方面，得自基因组DNA的启动子区可以与所述编码序列结合获得。对于宿主细胞识别与编码区相连的转录调节信号和翻译起始信号而言，可以保留并编码序列邻近的5’区并用于转录和翻译调节。该区通常包括涉及转录和翻译的起始的那些序列，诸如TATA盒、加帽序列和CAAT序列等。该区通常为至少大约150碱基对长，更通常为大约200bp，而极少超过大约1-2kb。
所述非编码3’区可以保留，以及尤其是其转录终止调节序列，诸如终止信号和聚腺苷酰化区域。另外，所述非编码3’区还包括增强子。在所述转录终止信号不是宿主细胞中令人满意的功能信号的情况下，则得自不同基因的功能性3’区可以被置换，置换的3’区的选择将依赖于选择用于表达的细胞系统。
可以根据宿主的性质，使用各种各样的转录和翻译调节序列。所述转录和翻译调节序列可以得自病毒源(例如，腺病毒、牛乳头瘤病毒和猿猴病毒等)，其中所述调节信号得自宿主中具有高表达水平的基因。或者，可以使用来自哺乳动物表达产物(例如，肌动蛋白、胶原蛋白和肌球蛋白等)的启动子。可选择便于阻抑或活化的转录起始调节信号，以使所述基因的表达可以被调节。一种这样的可控调节技术为利用温度敏感的调节信号，以便可以通过改变温度来阻抑或起动表达。另一种可控调节技术为利用对某些化学物敏感的调节信号。
所述构建物可以包括与对细胞可以是或不是内源的启动子、增强子和其它调节区相连的对宿主细胞而言为内源的核酸序列。这种构建物使得能够增加(例如，通过有效偶联于组成型启动子)或控制(例如，通过有效偶联于调节信号)所述内源序列的表达。
为构建所述基因构建物，可以按照本领域已知的常规技术连接DNA片段：这些技术包括使用限制性内切酶将粘端片段转化为平端片段(或反之亦然)、使用聚合酶和核苷酸去补平粘端以形成平端、使用碱性磷酸酶去避免不需要连接和使用连接酶去连接片段。
可以通过与便于选择的基因相联的转化，将所述构建物导入细胞，其中所述构建物将整合到所述宿主基因组中(例如，通过同源重组)。所述构建物通常为具有宿主细胞识别的复制系统的载体的部分。
表达载体
用于产生本发明的所述分子的表达载体包括质粒或其它载体。一般而言，这样的载体包括在各种类型的细胞中提供表达的控制序列。可以使用本领域已知的重组DNA技术，构建含有所需编码序列和控制序列的合适的表达载体，其中许多技术描述于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，纽约，(1989)。
根据本发明所构思的表达载体为至少可以指导编码所述目的蛋白或细胞周期蛋白D基因产物蛋白的核酸的复制和表达。第一类载体利用提供得自动物病毒(例如，牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或猿猴病毒40)的自主复制染色体外质粒的DNA元件。第二类载体依靠将所需基因序列整合到宿主细胞染色体中。
可用于本发明的表达载体通常包括复制起始点、位于被表达DNA序列的5’(即上游)的启动子以及转录终止序列。合适的复制起始点包括例如ColE1、pSC101、M13、SV40和EBV复制起始点。合适的终止序列包括例如牛生长素、SV40、lacZ和AcMNPV多角体聚腺苷酸化信号。合适的启动子包括例如巨细胞病毒启动子、lacZ启动子、gal10启动子和AcMNPV多角体启动子。所述启动子序列也可以为诱导型的，以提供对表达的条件(例如，在菌种生长培养基中有或无营养物或其它诱导物)。一个实例为得自λ噬菌体plac5的lac操纵子，所述操纵子可以由IPTG诱导。
所述表达载体还可以包括对所需产物最佳表达的其它调节序列。这样的序列包括保证所述表达产物稳定性的稳定性前导序列；保证所述表达产物分泌的分泌性前导序列；正调节所述DNA序列表达的增强子；和提供限制性内切核酸酶切割的位点的限制性内切酶识别序列。所有这些材料均为本领域已知的和为市场上可得到的。参见，例如，Okayama，
Mol.Cell Biol.，3，280(1983)。
合适的表达载体还可以包括标记序列，所述标记序列允许表型选择转化的宿主细胞。这种标记可以提供原养型到营养缺陷型的宿主和杀生物剂抗性(例如，抗生素抗性)等。所述选择性标记基因可以或者直接连接至被表达的所述编码序列上，或者通过共转染导入同一细胞中。选择性标记的实例包括新霉素抗性、氨苄青霉素抗性和潮霉素抗性等的基因。
所用的实际表达载体的特征必须与所使用的宿主细胞相匹配。对于哺乳动物宿主，例如，所述表达载体可以包括从哺乳动物细胞基因组分离的启动子(例如，小鼠金属硫蛋白启动子)或从生长于这些细胞中的病毒分离的启动子(例如，痘苗病毒7.5K启动子)。
合适的市场上可得到的可以插入本发明编码序列的表达载体包括哺乳动物表达载体pcDNA I或pcDNA I/Neo(所述载体是最好的)、杆状病毒表达载体pBlueBac、原核生物表达载体pcDNA II和酵母表达载体pYes2，所有这些载体可以得自Invitrogen Corp.，San Diego，Calif。
宿主细胞
本发明还涉及含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含所述目的蛋白和所述细胞周期蛋白D基因产物的DNA序列。合适的宿主细胞为真核细胞；例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞、COS-7细胞、人成纤维细胞和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。可以用作宿主的哺乳动物细胞包括成纤维细胞源的细胞(例如，VERO或CHO-K1)或淋巴细胞源的细胞(例如，SP2/0-AG14或P3x63Sg8)或其衍生细胞。优选的哺乳动物宿主细胞为CHO细胞。
诸如骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞的无限增殖化细胞也为合适的宿主细胞。这些细胞可以生长在培养瓶中合适的营养培养液内或注射到胞质传递宿主(synergenic host)(例如，小鼠或大鼠)或免疫缺陷宿主或宿主部位(例如，无胸腺小鼠或仓鼠囊袋(pouch))。特别是可以将所述细胞导入腹腔生产腹水并收获所述嵌合分子。或者，可以将所述细胞皮下注射并从所述宿主的血液中收获抗体。所述细胞可以以与杂交瘤细胞相同的方式使用。参见，Diamond等，
N.Eng.I.Med.，304，1344(1981)；
Monoclonal Antibodies：Hybridomas-A New Dimension in Biologic Analysis(Kennatt等著)Plenum(1980)。
通过本领域已知的各种方法，可以将表达载体导入宿主细胞。例如，用表达载体转染宿主细胞可以通过磷酸钙沉淀法进行。然而，对将表达载体导入宿主细胞，也可以使用其它方法(例如，电穿孔、脂质体融合、核注射和病毒或噬菌体感染)。
含有表达载体的宿主细胞可以通过以下六个一般方案中的一个或多个鉴别：(a)DNA-DNA杂交；(b)有或无标记基因功能；(c)评价根据所述宿主细胞中编码基因构建物的mRNA转录物的产生所测定的转录水平；(d)免疫学方法检测所述基因产物；(e)酶测定和(f)PCR。这些方法为本领域众所周知的；参见，例如，美国专利第5,744,314号，所述专利通过引用结合到本文中。
也可以对本发明的所述表达载体和DNA分子进行序列分析。各种序列分析方法为本领域已知的。参见，例如，描述于Sanger等，
Proc. Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-7(1977)的双脱氧链终止方法和描述于Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，560-4(1977)的Maxam-Gilbert方法。
一旦将表达载体导入合适的宿主细胞，就可以在允许表达大量所述目的蛋白的条件下培养所述宿主细胞。按照常规方法(诸如抽提、沉淀、层析、亲和层析和电泳等)，可以分离和纯化所述目的蛋白。优选方法为亲和层析。
当然，不用说并不是所有表达载体和DNA调节序列均同样好地起作用，以表达本发明的所述核酸。也不是所有的宿主细胞采用相同的表达系统都将起到同样好的作用。然而，本领域一般技术人员在不采用过度实验和不背离本发明的范围和精神的情况下，都可以使用本文所提供的指导在表达载体、DNA调节序列和宿主细胞之间作出选择。
最佳实施方案的详述
以下为本发明的具体实施方案的详细描述。这些实施方案为示例性的，用来说明本发明广泛应用性。除非本说明书中另有说明，否则这些实施方案包括本发明的优选元件。
材料和方法
质粒
将人细胞周期蛋白D1基因(Genbank登录号M64349)克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)中，并在巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子下组成型表达产生pcDNA3.1/细胞周期蛋白D1。所述载体也携带新霉素抗性基因以在G418存在下选择稳定的哺乳动物细胞系。
细胞培养
将CHOd-(SF)细胞生长在100mm培养皿中的完全培养液{DMEM(Gibco/BRL)、5％胎牛血清(JRH Biosciences)、1％非必需氨基酸(Gibco/BRL)、1％次黄嘌呤/胸苷(HT)(Gibco/BRL)和1％谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Gibco/BRL)}中。将所述细胞胰蛋白酶消化、计数并以1×10 e6细胞/皿接种于60mm培养板(Falcon)中。在悬浮旋转瓶培养中，AM-1 CHOd细胞生长在Amgen VM-大豆培养液中。将细胞计数、离心、重新悬浮于完全培养液中，并以1×10e6细胞/皿接种于60mm培养板中。将细胞培养过夜。在转染前3小时，用4ml新鲜培养液更换所述细胞中的培养液。
细胞周期蛋白D1转染。该转染使用含有细胞周期蛋白D1 cDNA插入片段的载体pcDNA3.1 neo(Invitrogen)。对细胞的每个60mm培养板，将5μg pcDNA3.1/细胞周期蛋白D1(2mg/ml)和5μg小鼠基因组载体DNA(Clontech)(100μg/ml)加入到172.5μl无菌蒸馏水中。将25μl 2.5M CaCl2加入到所述DNA溶液中，得到终体积250μl。将5μg pneo载体DNA(1.126mg/ml)与5μg载体DNA一起加入到170.5μl无菌水中，接着加入25μl 2.5M CaCl2，作为载体对照。将25μl 2.5M CaCl2加入到225μl水中，作为模拟对照。将所述DNA溶液滴加到等体积(250μl)2x HBS(280mM NaCl，10M KCl，1.5mMNaHPO4·2H2O，0.2mM葡聚糖，50mM HEPES，pH 7.05)中，向其中不断通入空气。所述DNA/HBS溶液于室温下温育30分钟。从CHO细胞培养板中除去培养液，然后滴加DNA/HBS溶液(每皿500μl总体积)。对于每个细胞系，用pcDNA3.1/细胞周期蛋白D1、对所述载体对照和模拟对照的各一个培养板处理总共3个培养板。将所述细胞室温下温育30分钟，此后在每个皿加入5ml完全培养液。然后将细胞于37℃培养过夜。次日用新鲜培养液更换所述培养液。
在转染后48小时，所述CHO(SF)达到融合。胰蛋白酶消化所述细胞，然后以1×60mm皿对8×100mm皿的比率在完全培养液中再次贴壁培养。次日用含有1mg/ml遗传霉素(G418)(Gibco/BRL)的完全培养液更换所述培养液。在转染后72小时，AM-1 CHO细胞达到融合，然后进行相同的再次贴壁培养。每星期两次用新鲜完全培养液+G418更换所述细胞的培养液。在首次加入G418选择性培养液后10天，使用玻璃克隆圆柱体(Bellco)从CHO(SF)转染的和AM-1 CHO细胞周期蛋白D1转染的贴壁培养板中分离集落。胰蛋白酶消化细胞，然后再次接种于24孔板中。CHO(SF)细胞的转染效率比AM-1CHO细胞(20-30集落/板)高很多(＞100集落/板)。从CHO(SF)/细胞周期蛋白D1板分离出总共72个集落，而从AM-1 CHO/细胞周期蛋白D1板分离出68个集落。在含有G418选择性培养液的模拟对照皿上无集落存在。在挑取集落后，胰蛋白酶消化每个板中剩余的细胞，然后混合到100mm板合并培养物中(CHO(SF)/细胞周期蛋白D1为3个合并物(pool)，而AM-1 CHO/细胞周期蛋白D1为2个合并物)。
使所述转染的细胞生长到融合，然后再次贴壁培养于6孔板中，每克隆2孔/合并。在达到融合时，每个克隆细胞的其中1孔/合并用250ml1％Triton裂解缓冲液(1％Triton X100、1mM NaVO3、50mMTris/HCl pH 8、100mM NaCl、蛋白酶抑制剂)裂解。裂解物于14K离心15分钟。收集上清液，然后贮存于-20℃。根据对细胞周期蛋白D1表达的蛋白质印迹分析裂解物。25μl每个样品加亲代CHO(SF)和AM-1 CHO系的对照样品，与5μl 5X PAGE凝胶样品缓冲液混合，煮沸3分钟，然后上样于12％Novex Tris-甘氨酸凝胶上。在0.2μ硝酸纤维素滤膜(Schleicher and Schuell)上电印迹所述凝胶。用抗-细胞周期蛋白D1 Ab-3单克隆抗体(Calbiochem)探测所述滤膜，然后使用Amersham ECL试剂显色。结果表明在合并培养物和大多数克隆中有不同程度细胞周期蛋白D1的超量表达。
将两个AM-1 CHO/细胞周期蛋白D1合并培养物和两个最高表达CHO(SF)/细胞周期蛋白D1合并培养物混合为“总合并物(masterpool)”，以用于随后转染每个细胞系。通过在次黄嘌呤/无胸苷选择性培养液(DMEM、5％透析的胎牛血清(Hyclone)、非必需氨基酸、谷氨酰胺/青霉素/链霉素)中培养所述细胞，测试所述总合并培养物，以确定它们能否还保留DHFR阴性表型。在该培养液中没有检测到细胞生长。
EPO转染
将CHO(SF)/细胞周期蛋白D1和AM-1 CHO/细胞周期蛋白D1的总合并培养物保持在补充有1mg/ml G418的完全CHOd培养液中。将这些细胞以8×10e5细胞/皿接种于60mm板中，并培养过夜。使用上述方法用pSW19(pDSRα2几乎相同的衍生物)/EPO靶DNA、pDSRα2载体对照DNA和鲱鱼精子载体DNA(Gibco/BRL)转染所述细胞。所用的pSW19/EPO DNA的终浓度为5μg/皿。转染后24小时，给予所述细胞新鲜培养液。转染后72小时，胰蛋白酶消化所述细胞，并以1∶8、1∶10和1∶20的比率(60mm板对100mm板)在选择性培养液+1mg/ml G418中再次贴壁培养。每星期两次用含有G418的新鲜培养液更换所述细胞中的培养液。在再次贴壁培养后12天，从CHO(SF)/细胞周期蛋白D1/EPO转染的板中分离出48个集落。胰蛋白酶消化所述剩余的细胞，然后混合为两个合并培养物。在再次贴壁培养后15天，从AM-1 CHO/细胞周期蛋白D1/EPO转染的板中分离出48个集落，并将所述剩余的细胞混合为两个合并物。通过得自分离克隆的融合24孔培养物或得自100mm板合并培养物的无血清条件培养液收获物的蛋白质印迹，分析EPO表达。在还原条件下进行凝胶电泳，然后用抗-EPO单克隆抗体2D8探测印迹。
OPG转染
将pSW19/OPG DNA的构建物转染到CHOd(SF)/细胞周期蛋白D1和Am-1 CHOd/细胞周期蛋白D1总合并物中，然后所述CHOd(SF)亲代系以如所述EPO转染相同的方法进行转染。将OPG-Fc(22-201)的其中两个分离转染物转染到所有三个宿主细胞系。从OPG-Fc(22-201)转染物中挑取总共124个CHO(SF)集落、110个CHO(SF)/cycD集落和147个AM-1 CHO/cycD集落。在产生的克隆和合并物中，使用抗-huIgG-Fc-HRP抗体(Pierce)或亲和纯化的兔多克隆抗-huOPG，通过蛋白质印迹分析OPG表达。
碘化丙锭染色DNA
将细胞接种于100mm板中，并使其生长到大约50％融合。用于测定的细胞必须处于对数期。通过胰蛋白酶消化，收获所述细胞，然后将其吸移到含有等体积DMEM/FBS的离心管中。用血细胞计数器计数一等份细胞悬浮液。细胞密度应为大约106-107细胞/5ml。通过于1000xg离心沉淀所述细胞，然后用冰冷PBS漂洗二次。所述细胞必须是在单细胞悬浮液中。加入0.5ml PBS并涡旋混合所述细胞悬浮液。然后一边轻轻地混合所述细胞悬浮液，一边沿管壁滴加2ml70％乙醇固定所述细胞。最短的固定时间为30分钟。(此时可以将细胞悬浮液于4℃贮存约2个星期，然后进行染色和分析。)将所述细胞离心除去乙醇上清液，用PBS漂洗一次，使其于4℃再次水合5分钟。离心所述细胞，除去PBS，然后将所述沉淀物重新悬浮于0.5ml碘化丙锭溶液(Molecular Probes)(于PBS中制备的50μg/ml)中。加入10μl无DNA酶的RNA酶(10mg/ml)(Boehringer Mannheim)，然后所述细胞悬浮液于37℃温育20分钟。所述样品用1ml PBS稀释，并在1小时内通过FACS分析该样品。
基因扩增
根据逐渐分步加入氨甲蝶呤(MTX)到生长培养液中，进行所述细胞中的基因扩增。在氨甲蝶呤三种低浓度(1nM、2.5nM和5nM)的100mm板中，以比率1∶10传代培养所述细胞。监测所述细胞的生长，并将最先达到融合的培养板用于下一轮的扩增。假如所述细胞在一种以上浓度的氨甲蝶呤中生长得同样好，则取最高浓度用于下一轮的试验。取48小时无血清DMEM收获物(4ml/板)，根据蛋白质印迹或EIA进行所述蛋白表达水平的分析。使所述细胞在含有氨甲蝶呤的完全培养液中恢复24小时，然后以1∶10的比率传代培养到3种较高的氨甲蝶呤浓度中。以增长量10nM至100nM增加MT×的浓度。一般来讲，假如所述蛋白表达水平在100nM没有达到峰值，则扩增以100nM增加量继续进行，直到达到最高表达水平。一旦确定最佳浓度，就将所述细胞保持在有MTX的培养液中。
AM-1/D细胞系的产生
AM-1/D细胞系得自描述于1987年10月27日授予的美国专利第4,703,008号，和Urlaub等，(1980)，
Proc.Natl.Acad.Sci.77：4461中的CHOd(-)田胞系，两者均通过引用结合到本文中。通过在逐渐减少直到最终无胎牛血清的VM-SOY培养液中传代，使CHOd(-)细胞系适应。产生的适应无血清的细胞系AM-1仍然保留dhfr(-)表型。将AM-1细胞系工程改造以超量表达人细胞周期蛋白D1。
通过用于转染的标准磷酸钙沉淀法，将pcDNA3.1/细胞周期蛋白D1转染到AM-1细胞系中。在用G418选择时，胰蛋白酶消化所述集落，并混合为两个合并物。使用人细胞周期蛋白D1特异性抗体(抗细胞周期蛋白D1 Ab-3，Calbiochem)，通过由所述合并物制备的细胞裂解物的蛋白质印迹(图1)，证实人细胞周期蛋白D1蛋白的表达。用克隆环随机地挑取许多集落，制备细胞裂解物以及进行分析。正如所期望的，在克隆之间，人细胞周期蛋白的表达是可变的。在所述克隆比较中，两个合并物显示总体高水平的人细胞周期蛋白D1蛋白(图1)。将该两个合并物混合为总合并培养物(AM-1/D)，所述培养物为用于全部随后实验中的亲代细胞系。
在AM-1/D细胞系中表达的人细胞周期蛋白是有功能的
通过改变细胞周期动态(dynamics)，我们确定人细胞周期蛋白D1为功能性地表达；参见，例如，图2及下文。
将得自AM-1/D和AM-1细胞系的非同步细胞用碘化丙锭染色，然后根据FACScan(Becton Dickinson)分析。图2A-2D显示相对DNA含量(x轴)和细胞数目(y轴)。AM-1/D细胞(40.08％，40.14％)与AM-1细胞(33.73％，32.25％)相比有显著性更多的S期细胞。这证实在一种CHO细胞系即AM-1/D中，人细胞周期蛋白D1的超量表达为功能性的，以便显著性改变细胞周期动态。
实施例1：用表达载体pDSRα2构建质粒pDSRα2/OPG-Fc，以表达人OPG(GenBank登录号U94332)-Fc融合蛋白。使用标准磷酸钙沉淀法，将pDSRα2/OPG-Fc的线性化DNA平行转染到AM-1/D细胞和未修饰、最初的AM-1细胞中。在将细胞置于缺乏HT补充物的选择性培养液中两个星期后，随机挑取每个转染物的44个集落。
将所述集落单独地转染到24孔板中，并生长到融合。48小时后，收集无血清条件培养液，使用对人OPG特异性的抗血清通过EIA进行分析。图3显示得自这两种细胞系在各种水平上表达OPG-Fc的克隆数目。清楚表明得自的AM-1/D细胞系有显著性更多的克隆表达较高水平的重组蛋白，并且表达超过20mg/ml OPG-Fc的所有最高表达克隆均得自AM-1/D细胞系。
实施例2：构建质粒pDSRα2/hEpo以表达人Epo基因，接着用上面描述的磷酸钙沉淀法转染到AM-1/D细胞中。随机挑取48个集落用于进一步地分析。根据所述条件培养液的EIA分析鉴定出其中4个高表达克隆，然后进行开始于1nM的氨甲蝶呤扩增。图4显示在扩增过程期间EPO的表达。其中2个克隆，AM-1/D克隆2和AM-1/D克隆33显示随着MTX浓度的增加，EPO产量升高，证实成功地进行了基因扩增。用冰冻-融化和再次传代测试这些克隆，没有丧失EPO表达，证实这些克隆中EPO基因表达的稳定性。
AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞中OPG的表达
在AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞和其它CHO细胞系中，比较两种OPG构成物的表达。将OPG(22-201)-Fc转染到AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞和亲代CHO细胞系中，这些细胞先前适应于生长在无血清培养液[CHO(SF)]中。将OPG(22-194)·cys-Fc转染到AM-1细胞周期蛋白D CHO细胞中和转染到其亲代AM-1 CHO细胞系中。使用标准磷酸钙法和DHFR选择法进行所述转染。使用玻璃克隆圆柱体分离转染的集落。在24孔板中，让各个集落生长到融合。使用对OPG的多克隆抗血清，根据蛋白质印迹，分析无血清条件培养液收获物的分泌OPG。得自根据蛋白质印迹显示最高表达水平的那些克隆的条件培养液样品，根据ELISA进一步分析。在得自AM-1 CHO细胞或AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞的46个单独的克隆中，我们比较了OPG(22-194)-cys-Fc表达水平(图5)。在根据蛋白质印迹先前所确定的24个最高表达克隆中，我们也比较了OPG(22-201)-Fc的表达(图6)。在每种情况下，得自AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞系的克隆比得自CHO(SF)或AM-1 CHO细胞的克隆显示显著高的表达水平。
适应无血清培养液的CHO细胞中NESP的表达
根据标准磷酸钙法，将插入了NESP DNA的pDSR·2表达载体转染到三种不同的适应无血清的CHOd细胞系：CHOd(SF)、AM-1和AM-1/细胞周期蛋白D中。在贴壁培养的有血清培养液中进行克隆的转染、选择和分离。使用抗EPO的单克隆抗体，根据蛋白质印迹，首先鉴定出表达高水平NESP的克隆。根据EIA进行表达的定量。根据于无血清培养液的悬浮培养中的生长，测试得自每个细胞系的最高表达克隆。通过在贴壁培养的有血清培养液中，在逐渐增加氨甲蝶呤的浓度下生长，对所述克隆也进行DNA扩增。根据蛋白质印迹和EIA分析，监测在扩增过程期间的NESP表达。在扩增过程期间的各个阶段，分析所述克隆在无血清悬浮培养中的生长和表达。得自AM-1/细胞周期蛋白D CHO细胞系的克隆比得自另外两个亲代CHO细胞系的那些克隆有总体上的高NESP表达水平(图7)。也根据等电聚焦确定同种型分布分析所述克隆。在得自亲代CHO细胞系的各种克隆中或对照细胞系(61L)中，观察到同种型分布方面没有显著性差异(图8)。
本说明书中所用的缩写定义如下：
CHO 中国仓鼠卵巢细胞
DHFR ————
EBV 埃-巴二氏病毒
EIA 酶免疫测定
EPO 促红细胞生成素
HBS HEPES缓冲盐溶液
IEF ————
MTX 氨甲蝶呤
NESP 新红细胞发生刺激蛋白
OPG 骨原细胞生成素(osteoprotegerin)
Claims (18)
1.哺乳动物细胞，包含：
a)细胞周期蛋白D基因产物的插入基因构建物，其中所述细胞周期蛋白D基因产物在细胞中被功能性地表达，其表达水平高于所述细胞周期蛋白D基因产物在插入前细胞中的表达水平；和
b)目的蛋白的插入基因构建物，其中所述目的蛋白在所述细胞中被表达，其表达水平高于所述目的蛋白在插入前细胞中的表达水平。
2.权利要求1所述的细胞，其中所述细胞为CHO细胞。
3.权利要求1所述的细胞，其中所述细胞为AM-1细胞。
4.权利要求1所述的细胞，其中所述细胞周期蛋白D基因产物包括哺乳动物细胞周期蛋白D1。
5.权利要求1所述的细胞，其中所述细胞周期蛋白D基因产物包括人细胞周期蛋白D。
6.权利要求1所述的细胞，其中所述细胞周期蛋白D基因产物包括人细胞周期蛋白D1。
7.权利要求1所述的细胞，其中所述目的蛋白为促红细胞生成素-相关蛋白、骨原细胞生成素-相关蛋白或leptin-相关蛋白。
8.权利要求1所述的细胞，其中所述目的蛋白为促红细胞生成素、新红细胞生成刺激蛋白、骨原细胞生成素、骨原细胞生成素-Fc、leptin或Fc-leptin。
9.权利要求2所述的细胞，其中所述细胞适应无血清培养液。
10.生产目的蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括以下物质的哺乳动物细胞
1.细胞周期蛋白D基因产物的插入基因构建物，其中所述细胞周期蛋白D基因产物在细胞中被功能性地表达，其表达水平高于所述细胞周期蛋白D基因产物在插入前细胞中的表达水平和
2.目的蛋白的插入基因构建物，其中目的蛋白在细胞中被功能性地表达，其表达水平高于所述目的蛋白在插入前细胞中的表达水平；
b)在允许表达所述目的蛋白和功能性地表达所述细胞周期蛋白D基因产物的条件下培养所述细胞；和
c)分离所述目的蛋白。
11.权利要求10所述的方法，其中所述细胞为CHO细胞。
12.权利要求10所述的方法，其中所述细胞为AM-1细胞。
13.权利要求10所述的方法，其中所述细胞周期蛋白D基因产物包括哺乳动物细胞周期蛋白D1。
14.权利要求10所述的方法，其中所述细胞周期蛋白D基因产物包括人细胞周期蛋白D。
15.权利要求10所述的方法，其中所述细胞周期蛋白D基因产物包括人细胞周期蛋白D1。
16.权利要求10所述的方法，其中所述目的蛋白为促红细胞生成素-相关蛋白、骨原细胞生成素-相关蛋白或leptin-相关蛋白。
17权利要求10所述的方法，其中所述目的蛋白为促红细胞生成素、新红细胞生成刺激蛋白、骨原细胞生成素、骨原细胞生成素-Fc、leptin或Fc-leptin。
18.权利要求11所述的方法，其中所述细胞适应无血清培养液。
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