EA008439B1 - Экспрессионная кассета и вектор для временной или постоянной экспрессии экзогенных молекул - Google Patents

Abstract

Представлены зкспрессионная кассета и вектор экспрессии, содержащий кассету для экспрессии полинуклеотида. Указанная зкспрессионная кассета содержит промотор/энхансер, вставочную последовательность и сигнальную область полиаденилирования. Приведено описание экспрессирующих систем и способов использования экспрессионной кассеты и вектора.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к векторам и экспрессионным кассетам и, конкретно, к способам, композициям и системам для экспрессии экзогенной молекулы в организме.

Уровень техники

Введение молекул нуклеиновых кислот, полипептида, пептидов и небольших молекул в клеткимишени и ткани применяется как в качестве терапевтической системы доставки, так и с целью ίη νίνο продукции терапевтических средств. Применимость данного подхода возросла благодаря прогрессу в понимании роли клеток-хозяев и молекулярной биологии клеточного деления, дифференцировки и механизмов экспрессии.

Сущность изобретения

Было обнаружено, что транскрипция, контролируемая промотором СМУ и терминируемая доменом ро1уА, полученным из варианта гена гормона роста человека (ΗΟΗν), более эффективна, чем другие векторы экспрессии, у которых отсутствует тот или другой, или оба этих элемента. Поэтому настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете и вектору экспрессии, которые могут использоваться для экспрессии интересующих полинуклеотидов. Экспрессионная кассета по настоящему изобретению включает в себя комбинацию регуляторных элементов, которые обеспечивают эффективную транскрипцию, эффективную терминацию транскрипции и повышенную стабильность мРНК транскрибированных продуктов. В одном из вариантов осуществления экспрессионная кассета включает в себя промотор/энхансер цитомегаловируса человека, сайт клонирования или интересующий полинуклеотид и сигнальный домен полиаденилирования ΙιΟΗν. Необязательно может присутствовать вставочная последовательность различной длины.

Настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, которая включает в себя область раннего промотора 1 цитомегаловируса (СМУ) человека (ЙСМУ 1Е1)/энхансера, интересующий полинуклеотид и сигнальный домен ро1уА варианта гормона роста человека (ΗΟΗν) или его вариант. Длина Сигнальный домен ро1уА имеет длину по крайней мере 100 нуклеотидов и содержит последовательность ААТААА и по крайней мере на 92% идентичен сигнальному домену ро1уА 11ΟΗ.

Настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, который включает экспрессионную кассету по настоящему изобретению, а также к клетке-хозяину, содержащей экспрессионную кассету, или вектору экспрессии по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение, более того, относится к экспрессионной кассете, которая включает в себя область раннего промотора 1 цитомегаловируса (СМУ) человека (ЙСМУ 1Е1)/энхансера, вставочная последовательность переменной длины (УЪ1У8), содержащая донорный сайт сплайсинга и акцепторную область сплайсированного фрагмента, интересующий полинуклеотид и сигнальный домен ро1уА варианта гормона роста человека (ΙιΟΗν) или его вариант. Сигнальный домен ро1уА или его вариант имеет длину по крайней мере 100 нуклеотидов и содержит последовательность ААТААА и по крайней мере на 92% идентичен сигнальному домену ΙιΟΗν ро1уА.

Настоящее изобретение относится также к вектору экспрессии, который включает в себя область раннего промотора 1 цитомегаловируса (СМУ) человека (ЙСМУ 1Е1)/энхансера, вставочную последовательность переменной длины (УЫУ8), содержащую донорный сайт сплайсинга и акцепторный сайт сплайсинга, сайт клонирования, область полнаденилирования ΙιΟΗν и селектируемый маркер. В одном из аспектов настоящего изобретения промоторная/энхансерная область ЙСМУ 1Е1 располагается против хода транскрипции (5') относительно сайта клонирования, а область полиаденилирования 11ΟΗ располагается по ходу транскрипции (3') относительно сайта клонирования.

Настоящее изобретение также относится к способу доставки ίη νί\Ό интересующего агента. Способ включает доставку субъекту композиции, содержащей экспрессионную кассету, при этом экспрессионная кассета включает в себя область промотора/энхансера ЙСМУ 1Е1; вставочную последовательность переменной длины, содержащую донорный сайт сплайсинга и акцепторный сайт сплайсинга; полинуклеотид, кодирующий интересующий агент; и сигнальный домен ро1уА гормона роста человека (ΗΟΗν) или его вариант.

Настоящее изобретение более того относится к экспрессирующей системе. Экспрессирующая система включает в себя клетку-хозяин, трансфекцированную или трансформированную экспрессионной кассетой по настоящему изобретению, где клетку-хозяин культивируют в условиях экспрессии интересующего полинуклеотида; и выделение интересующего агента.

Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения представлены в прилагаемых далее рисунках и описании. Другие особенности, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и рисунков, а также из формулы изобретения. Все приведенные ссылки включены здесь в качестве ссылки.

Описание чертежей

На фиг. 1 представлена карта плазмиды вектора рУ10. Ранний промотор 1 цитомегаловируса (СМУ 1Е1) (1У8)/вставочная последовательность получали с помощью полимеразной цепной реакции (РСК.) и клонировали в сайты ΗίηάΙΙΙ и ВатН1. Также указаны ген устойчивости к ампицилину, беталактамаза (Ыа).

- 1 008439

На фиг. 2 представлена карта плазмиды вектора рУ40. Указаны ранний промотор 1 цитомегаловируса (СМУ ΙΕ1), вставочная последовательность (1У8), сигнальный домен полиаденилирования йСНу (ро1уА), имеющий длину около 600 пар оснований, и ген устойчивости к ампицилину, бета-лактамаза (Ыа).

На фиг. 3 схематически представлена плазмида р¥70. Указаны промотор СМУ ΙΕ1, 1У8, включающий сайт делеции и донорный сайт сплайсинга (8Ό) и акцепторный сайт сплайсинга (8А), сигнальную область ро1уА йСНу и ген Ыа. Сайт делеции является результатом лигирования по тупым концам фрагментов В5рЕ1'/'Нра1.

На фиг. 4 схематически представлено получение вектора рХЬС.1. Вектор рХЬС.1 конструируют, используя вектор экспрессии рУ70 и продукт ПЦР, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь. рУ70 линеаризуют с помощью ВатН1, продукт ПЦР расщепляют с помощью ВатН1, и оба продукта сшивают друг с другом с получением вектора рХЬС.1.

На фиг. 5 схематически представлено получение вектора рХЬС.2.

На фиг. 6 схематически представлен вектор рУ60 и показано получение вектора рХНС. Вектор рХНС конструируют, используя вектор экспрессии рУ60 и продукт ПЦР, содержащий большую часть кодирующей последовательности тяжелой цепи (не включены 52 Ν-концевые аминокислоты). рУ60 линеаризуют с помощью ВатН1, продукт ПЦР расщепляют действием ВатН1, и оба продукта сшивают друг с другом.

На фиг. 7 схематически представлен вектор рХНС.1.

На фиг. 8 схематически представлен вектор рХНС.3.

На фиг. 9 схематически представлен вектор рХНС.5, полученный в результате добавления кассеты ФЫг к рХНС.3. Контрольные элементы экспрессионной кассеты получали из р81 (Рготеда, номер доступа И47121 в банке генов СеиВаик), и они включают в себя промотор/энхансер 8У40, искусственную вставочную последовательность и позднюю последовательность полиаденилирования 8У40.

На фиг. 10 схематично представлен вектор рУ80. Указаны фрагмент раннего промотора 1 цитомегаловируса (СМУ ΙΕ1) (ГУ8)/вставочная последовательность, включающий донорный сайт сплайсинга (8Ό) и акцепторный сайт сплайсинга (8А), сигнальный домен (ро1уА) полиаденилирования йСНу, ген устойчивости к ампицилину, бета-лактамазу (Ыа), промотор/энхансер 8У40, искусственную вставочную последовательность и позднюю последовательность полиаденилирования 8У40.

На фиг. 11А и 11В схематически представлен вектор рУ90 и соответствующие аннотированные последовательности. На фиг. 11А показана карта вектора. Указаны фрагмент раннего промотора 1 цитомегаловируса (СМУ ΙΕ1) (1У8)/вставочной последовательности, включающий донорный сайт сплайсинга (8Ό) и акцепторный сайт сплайсинга (8А), сигнальный домен (ро1уА) полиаденилирования йСНу, ген устойчивости к ампицилину, бета-лактамазу (Ыа), промотор/энхансер 8У40, искусственную вставочную последовательность и позднюю последовательность полиаденилирования 8У40. У указанного вектора отсутствует сайт №11 в экспрессионной кассете ФЫг. На фиг. 11В представлена аннотированная последовательность вектора рУ90. На фиг. 11В показана последовательность от нуклеотидов 1275 до нуклеотидов 1866 последовательности с номером идентификации 19 (8ЕО ΙΌ N0:19) обозначает йСНу ро1уА длиной около 600 нуклеотидов.

На фиг. 12 представлена карта вектора р81-ОНЕК2. Промотор 8У40 управляет геном ФЫт.

На фиг. 13 приведена диаграмма, показывающая относительные удельные продуктивности трансфекцированных пулов. Три пула анализируют на рСМУ-йСНуРА-8ЕАР и р8ЕАР2, а один пул - на рИС18.

На фиг. 14 приведены две диаграммы, показывающие относительные удельные продуктивности изолятов. В порядке возрастания приведены 20 наиболее больших изолятов каждой генной конструкции.

На фиг. 15 приведена последовательность в СеиВаик с номером доступа К00470 (8ЕО ΙΌ N0:18).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к экспрессионным кассетам и векторам, содержащим экспрессионную кассету. Экспрессионная кассета включает в себя регуляторную область транскрипции, способную контролировать транскрипцию в эукариотической клетке-хозяине, и область терминации транскрипции. Экспрессионные кассеты и векторы по настоящему изобретению обеспечивают стабильный старт и остановку транскрипции, а также повышенную стабильность мРНК транскрибированных продуктов.

Настоящее изобретение относится к промотору и, необязательно, к энхансерным элементам любого штамма цитомегаловируса, таким как описаны в настоящем описании или в ссылках, например в патенте США 5658759, содержание которого приведено здесь в качестве ссылки. Например, подходящие области промотора СМУ, которые могут использоваться в экспрессионных кассетах по настоящему изобретению, могут быть получены от СУМ-усиленного вектора экспрессии β-галактозидазы, СУМв (МасСгедог е1 а1., №с1. АсЫ§ Ве5.17: 2365 (1989)).

Как описано далее в настоящем описании, сигнальный домен полиаденилирования йСНу обеспечивает стабильный сигнал остановки транскрипции, а также повышенную стабильность транскрипта мРНК. Элемент регулирования/экспрессии может быть отделен от сигнального домена полиаденилирования

- 2 008439

ΙιΟΗν. например, интересующим полинуклеотидом или сайтом клонирования (например множественным сайтом клонирования).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду. включающему экспрессионную кассету. которая содержит область регулирования транскрипции цитомегаловируса (СМУ). вставочную последовательность переменной длины (например. полученную из вставочной последовательности А цитомегаловируса). интересующий полинуклеотид и сигнальный домен полиаденилирования. Изобретение также относится к способам и векторам экспрессии для продуцирования и извлечения гетерологичных полипептидов из клеток-хозяев.

В соответствии с другим аспектом экспрессионная кассета по настоящему изобретению включает операбельно присоединенные (1) основную область раннего промотора 1 (ΙΕ1) СМУ и вставочную последовательность переменной длины/энхансер (например. полученную из вставочной последовательности А). (ίί) интересующий полинуклеотид и (ш) сигнальный домен полиаденилирования йСНу. Термин операбельно присоединенный относится к соединению. при котором компоненты взаимосвязаны. что позволяет им функционировать необходимым образом (например. они функционально связаны). Так. например. промотор/энхансер. операбельно присоединенный к интересующему полинуклеотиду. лигирован с последним таким образом. что экспрессия интересующего полинуклеотида достигалась в условиях. которые совместимы с активацией экспрессии промотором/энхансером.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионная кассета включает последовательность. представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. от приблизительно нуклеотида 1 до приблизительно нуклеотида 1867 (например. приблизительно от 1 до 1865. 1866. 1867. 1868 или 1869). Экспрессионная кассета. представленная фрагментом от нуклеотида 1 до нуклеотида 1867 в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. включает ряд различных доменов. таких как область промотора/энхансера СМУ ΙΕ1. имеющая последовательность. представленную приблизительно от х₁ до приблизительно х₂ в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. где х₁ представляет собой нуклеотид от 1-20. а х₂ представляет собой нуклеотид от приблизительно 715-720 (например приблизительно от 1 до 719 в 8Е0 ΙΌ N0:1). Другой домен экспрессионной кассеты включает вставочную последовательность переменной длины (УЫУЗ). содержащий донорный сайт сплайсинга и акцепторный сайт сплайсинга). Длина УЫУ8 может составлять по крайней мере 50 пар оснований (например. по крайней мере 100. 150. 200 или 250 пар оснований в длину). и УЫУЗ может содержать донорный сайт сплайсинга и акцепторный сайт сплайсинга из любого известного из области техники источника. См.. в частности. Уагаш е1 а1.. Аппи. Ксу. Вюрйук. Вюто1. 81гис1. 27: 407-45 (1998) и Кошд. Еиг. 1. Вюсйет. 219: 25-42 (1994). Подходящий промежуточный домен может включать всю вставочную последовательность А генома СМУ любого штамма или же может включать меньший фрагмент. содержащий 5'-последовательность. содержащую донорный сайт сплайсинга. лигированную с З'-последовательность. содержащей акцепторный сайт сплайсинга. Например. УЫУ8 включает нуклеотиды приблизительно от х₃ до приблизительно х₄ в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. где х₃ представляет собой нуклеотид от 715-720. а х₄ представляет собой нуклеотид от 1236-1254 (например от 719 до 1236 в 8ЕЦ ΙΌ N0:1). Размер вставочной последовательности. следующей за промотором/энхансером СМУ ГЕ1. может изменяться вплоть до 317 нуклеотидов. как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. Например. 317 нуклеотидов вырезают из последовательности ГУ8. как указано в рУ40 и рУ70 (см.. в частности. фиг. 2 и 3 соответственно). с получением УЫУЗ в 8Е0 ΙΌ N0:1. Таким образом. в соответствии с еще одним аспектом изобретения экспрессионная кассета включает последовательность от приблизительно нуклеотида 1 до приблизительно нуклеотида 1254 в 8Е0 ΙΌ N0:1 (например. промотор/энхансер СМУ !Е1 и вставочная последовательность). После области ГУ8 (т.е. по ходу транскрипции) может быть расположен множественный сайт клонирования (например. нуклеотиды 1255-1272 в 8ЕЦ ΙΌ N0:1 включают сайты ВатН и сайт N011). Другие или дополнительные сайты рестрикции могут быть сконструированы в экспрессионной кассете с помощью методов. известных специалистам в данной области. Экспрессионная кассета. более того. включает домен ро1уА.

Сигнальный домен ро1уА получают из гена йОНу. который может изменяться в его последовательности 3'ИТК, в частности. от аллеля к аллелю. Один аллель гена йСНу описан в ОепВапк под номером доступа К00470 (8ЕЦ ΙΌ N0:18). в то время как другая последовательность приведена на фиг. 11В как 8Е0 ΙΌ N0:19. которая соответствует нуклеотидам от 2032 до 2625 в 8ЕЦ ΙΌ N0:18 (см. фиг. 15). Неприродные варианты сигнального домена ро1уА могут быть получены с методами мутагенеза. включая методы. которые используют для полинуклеотидов. клеток или организмов. Вариант ро1уА из гена йСНу включает сигнальный домен ро1уА. который отличается от сигнального домена ро1уА в йСНу дикого типа. однако остается сигналом терминации транскрипции и/или способен стабилизировать мРНК. Например. сигнальный домен полиаденилирования может включать последовательность сигнального домена полиаденилирования в йСНу. как указано в 8ЕЦ ΙΌ N0:18 или 19. Для специалиста в области молекулярной биологии должно быть понятно. что последовательности должны быть не более приблизительно 600 нуклеотидов. Скорее они включают любой домен последовательности ро1уА. который содержит последовательность смежных нуклеотидов. содержащую по крайней мере 100 нуклеотидов (например. по крайней мере 200. 300. 400. 500 или 600 нуклеотидов). включая канонический сайт ААТААА. из гена йСНу. Кроме того. настоящее изобретение охватывает последовательности. которые отличаются от вышеуказанных последовательностей до 8% (например. на 92% идентичны 8ЕЦ ΙΌ N0:18 или 19 или их

- 3 008439 определенному домену). Например, полинуклеотид длиной 100 нуклеотидов, на 95% идентичный нуклеотидам 1-1867 в 8ЕО ΙΌ N0:1 и включающий последовательность ААТААА, будет сохранять способность к терминации транскрипции.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему экспрессионную кассету. В данном описании под вектором понимают молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК либо РНК), способную к автономной репликации при введении в клетку-реципиент (например, бактерию, такую как Е. сой). Примерами векторов являются плазмиды, вирусы и бактериофаги. Процесс экспрессии из вектора экспрессии хорошо известен и включает использование клеточных ферментов и способы получения продукта экспрессии из интересующего полинуклеотида. Векторами экспрессии являются векторы, способные опосредовать экспрессию полинуклеотида, клонированного в клетке-хозяине, которая может быть клеткой того же или другого типа, что и клетка, используемая для репликации или размножения вектора. Многие векторы экспрессии млекопитающих могут быть размножены в обычных бактериях (клетке-реципиенте), однако экспрессия интересующего полинуклеотида происходит в клетках млекопитающих (клетках-хозяевах), а не в бактерии.

Настоящее изобретение относится к конструированию и применению векторов, которые обеспечивают эффективную транскрипцию и трансляцию полинуклеотидов в эукариотических клетках (например, в клетках млекопитающих и, особенно предпочтительно, в клетках человека, мышей, обезьян, коров, свиней, овец или грызунов). Векторы по настоящему изобретению, как указано ранее, включают экспрессионную кассету, содержащую сигнальный домен полиаденилирования, который обеспечивает эффективную терминацию транскрипции и стабильность мРНК.

Векторы по настоящему изобретению включают сайт клонирования для получения интересующего полинуклеотида;

регуляторные элементы транскрипции (например, области промотора/энхансера СΜV ΙΕ1), достаточные для того, чтобы обеспечить транскрипцию полинуклеотида, вставленного в сайт клонирования в клетке-хозяине;

элементы трансляции, достаточные для того, чтобы обеспечить трансляцию транскрипта РНК указанного полинуклеотида в клетке-хозяине, и (если необходимо) элементы репликации, достаточные для того, чтобы обеспечить репликацию указанного вектора в клетке-хозяине или другой клетке-реципиенте, которую используют для размножения вектора.

Векторы по настоящему изобретению способны опосредовать такую экспрессию временно или постоянно в клетках-хозяевах.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает:

(1) последовательность, представленную как 8Е0 ΙΌ N0:1;

(2) последовательность, которая комплементарна последовательности, представленной как 8ЕО ΙΌ N0:1;

(3) последовательность, которая по меньшей мере на 80% (предпочтительно по меньшей мере на 90; 95; 98 или 99%) идентична последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее комплементу; или (4) вектор, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:1 от приблизительно нуклеотида 1 до приблизительно нуклеотида 1867 и включающий интересующий полинуклеотид и/или селектируемый маркер.

Вектор, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:1, имеет ряд различных доменов и кодирующих областей. Например, в векторе присутствует область промотора/энхансера СΜV ΙΕ1, которая имеет последовательность, представленную приблизительно от х₁ до приблизительно х₂ в 8Е0 ΙΌ N0:1, где х₁ представляет собой нуклеотид от 1-20, а х₂ представляет собой нуклеотид приблизительно от 715-720 (например, от приблизительно 1 до 719 в 8Е0 ΙΌ N0:1). Другой домен вектора экспрессии по настоящему изобретению включает вставочную последовательность переменной длины (УМУБ). содержащую донорный сайт сплайсинга и акцепторный сайт сплайсинга. Например, ГУ8 включает нуклеотиды приблизительно от х₃ до приблизительно х₄ в 8Е0 ΙΌ N0:1, где х₃ включает нуклеотид от 715-720, а х₄ включает нуклеотид от 1236-1254 (например, приблизительно нуклеотиды от 719 до 1236 в 8Е0 ΙΌ N0:1). Множественный сайт клонирования вектора экспрессии включает нуклеотиды 1255-1272 в 8Е0 ΙΌ N0:1 (например, сайты ВатЩ и сайт N011). Различные или дополнительные сайты рестрикции могут быть сконструированы в векторе экспрессии с помощью методов, известных специалистам в данной области. Вектор экспрессии далее включает сигнальный домен ро1уА. Сигнальный домен ро1уА представляет собой сигнальный домен ро1уА 11СНу или другой вариант сигнального домена ро1уА ΙιΟΗν. Например, сигнальный домен ро1уА включает последовательность сигнального домена ро1уА ΗΟΗν, указанную в 8Е0 ΙΌ N0:19. Кроме того, в векторе по настоящему изобретению содержится один или несколько селектируемых маркеров. Например, 8Е0 ΙΌ N0:1 включает ген дигдрофолятредуктазы (бМг) (например, от приблизительно нуклеотида 2568 до приблизительно нуклеотида 3132 в 8Е0 ΙΌ N0:1). Вектор по настоящему изобретению, в дополнение к указанным выше, может включать дополнительные элементы промотора/энхансера и регуляторные области (например, домены полиаденилирования). Подобные дополнительные регуляторные элементы и домены полиаденилирования могут фланкировать селектируемый маркер или интересующий полинуклеотид (например, непосредственно примыкать к его 5'-концу и 3'-концу). Например,

- 4 008439 вектор, включающий 8Е0 ГО N0:1, содержит ген дигидрофолятредуктазы (б11Гг) от приблизительно нуклеотида 2568 до приблизительно нуклеотида 3132 в 8Е0 ГО N0:1. Ген бЫт фланкирует элемент промотора/энхансера 8У40 и область полиаденилирования 8У40 (например, от приблизительно нуклеотида 1868 до приблизительно нуклеотида 2210 и от приблизительно нуклеотида 3144 до приблизительно нуклеотида 3440 в 8Е0 ГО N0:1 соответственно).

Конкретными примерами селектируемых маркеров являются такие селектируемые маркеры, которые кодируют белки, придающие устойчивость к цитостатическим и разрушающим клеткам лекарствам, такие как белок ΌΗΓΚ, который придает устойчивость к метотрексату (\У1д1ег е! а1., Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8с1 И8А 77: 3567 (1980); О'Наге е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1 И8А 78: 1527 (1981)); белок ОРГ, который придает устойчивость к микофенольной кислоте (МиШдаи & Вегд. Ргос. №11. Асаб. 8с! И8А 78: 2072 (1981)), маркер устойчивости к меомицину, который придает устойчивость к аминогликозиду 0-418 (Со1ЬеггеОатарт е! а1., 1. Мо1. Вю1. 150: 1 (1981)); белок Нудго, который придает устойчивость к гигромицину (8ап1егге е! а1., Оеие 30: 147 (1984)); и маркер устойчивости 2еосш™ (коммерчески доступен от компании 1иуйтодеи). Кроме того, тимидинкиназа вируса простого герпеса (^1д1ет е! а1., Се11 11: 223 (1977)), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза (8хуЬа15ка & 8хуЬа15к1 Ргос. №111. Асаб. 8с1 И8А 48: 2026 (1962)) и аденин фосфорибозилтрансфераза (Ьо^у е! а1., Се11 22: 817 (1980)) могут быть использованы в клетках !к^-, йдртГ или арг! соответственно. Другие селектируемые маркеры кодируют пуромицин Νацетилтрансферазу или аденозиндеаминазу.

Термины идентичный или процент идентичности в случае двух или нескольких молекул нуклеиновых кислот относятся к двум или нескольким последовательностям или субпоследовательностям, которые совпадают или содержат заданный процент совпадающих нуклеотидов, когда их сравнивают или проводят сравнительный анализ первичной структуры на предмет максимального соответствия матрице сравнения, который осуществляют с использованием алгоритма сравнения или с помощью ручного сравнительного анализа первичной структуры и визуальной оценки. Эта идентификация относится также к комплементу последовательности (например, комплементу последовательности, приведенному в 8Е0 ГО N0:1, или его фрагменту, содержащему экспрессионную кассету). Например, экспрессионная кассета или ее фрагмент включает такие экспрессионные кассеты, нуклеотидная последовательность которых по крайней мере приблизительно на 80, 90, 95, 97, 98 или на 99% идентична части 8Е0 ГО N0:1 (например, нуклеотидам 1-719, 1-1254 и т.п. в 8Е0 ГО N0:1). Так, если последовательность имеет требуемую идентичность последовательности по отношению к полной последовательности в 8Е0 ГО N0:1 или к ее домену, то тогда она может также функционировать, соответственно, в качестве экспрессионной кассеты или ее домена по настоящему изобретению.

При сравнении последовательности, как правило, одна последовательность выполняет роль последовательности сравнения, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма последовательности сравнения тестируемую последовательность и последовательность сравнения вводят в компьютер, если необходимо, обозначают координаты субпоследовательности и задают параметры программы алгоритма последовательности. Могут быть использованы значения программы по умолчанию или же установлены альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательности рассчитывает процент идентичности последовательности для тестируемой(ых) последовательности(ей) по отношению к последовательности сравнения в соответствии с установленными или используемыми по умолчанию параметрами программы. Матрица сравнения в данном описании включает ссылку на сегмент одного из ряда смежных позиций, выбранных из группы, включающей от 25 до 600, обычно приблизительно от 50 до приблизительно 200, чаще приблизительно от 100 до приблизительно 150, в которой последовательность может быть сравнена с последовательностью сравнения с тем же количеством смежных позиций после того, как проведен оптимальный сравнительный анализ первичной структуры. Способы проведения сравнительного анализа первичной структуры последовательностей хорошо известны из области техники. Оптимальный сравнительный анализ первичной структуры может быть проведен, в частности, с помощью алгоритма локальной гомологичности, приведенного в 8ιηί11ι & ^а!егшаи, Абу. Арр1. Ма111. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного сравнительного анализа первичной структуры, приведенного в №еб1ешаи & ХУшъсй 1. Мо1. Вю1. 48: 443 (1970), по способу поиска схожести, приведенному в Реагкои & Ыршаи, Ргос. №111. Асаб. 8с1 И8А 85: 2444 (1988), путем компьютерного выполнения указанных алгоритмов (ОАР, РГОЕИР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, ГА8ТА и ТРА8ТА в ХУЕсопклп Оеиебск 8оП\таге Раскаде, Оеиебск Сотрите! Отоир, 575 8с1еисе Ότ., Мэдисон, Висконсин) или путем проведения ручного сравнительного анализа первичной структуры и визуальной инспекции.

Одним из примеров алгоритма, который подходит для определения процента идентичности последовательностей (например, в случае значительной схожести или идентичности), является алгоритм ВЬА8Т, который приведен в А115с1ш1 1. Мо1. Вю1. 215: 403-410, 1990. Программное обеспечение для проведения анализа ВЬА8Т общедоступно от ^бои! Сеи!ег Гог Вю!есйио1оду 1иГотта!юи (в Интернете на сайте исЬ1.и1т.шй.доу/). Этот алгоритм включает вначале идентифицирование пар последовательностей с высокой степенью совпадения (Н8Р) посредством идентификации коротких фраз длиной в очередной последовательности, который либо совпадает, либо соответствует некоторому положительному пороговому значению Т при сравнительном анализе с фразой той же длины из приведенной в базе дан

- 5 008439 ных последовательности. Указанные первичные совпадения с соседними фразами играют роль затравок для инициирования поиска содержащих их более длинных Н8Р. Совпадения фраз затем распространяют в оба направления вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может быть увеличен кумулятивный количественный показатель сравнительного анализа первичной структуры. Кумулятивные показатели рассчитывают с использованием, в случае нуклеотидной последовательности, параметров М (призовой показатель для пары совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной показатель для несовпадающих остатков; всегда <0). Распространение совпадений фраз в каждом направлении прекращают в том случае когда кумулятивный показатель сравнительного анализа первичной структуры уменьшается на величину X от своего максимально достижимого значения;

кумулятивный показатель изменяется от нуля и меньше вследствие накопления при анализе первичной структуры одного или большего количества остатков с отрицательным показателем; или достигнут конец последовательности.

Параметры А, Т и X алгоритма ВБА8Т определяют чувствительность и скорость проведения сравнительного анализа первичной структуры. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для определения того, попадает ли последовательность нуклеиновой кислоты в объем притязаний по настоящему изобретению, используют программу ВБА8Т (для нуклеотидных последовательностей), которая включает в качестве параметров по умолчанию длину фразы (А), равную 11, и ожидание (Е), равное 10, М=5, N=4, и проводят сравнение обеих цепочек. Для аминокислотных последовательностей программа ВБА8Т использует в качестве параметров по умолчанию длину фразы (А), равную 3, ожидание (Е), равное 10 и матрицу подсчета ВЕО8ИМ62 (см., в частности, Нешкойй, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 89: 10915, 1989).

Алгоритм ВЬА8Т проводит также статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Кат1ш, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 90: 5873-5787, 1993). Один проводимый алгоритмом ВЬА8Т замер сходства представляет собой вероятность суммы (Р(№)), которая обозначает вероятность возможного случайного соответствия между двумя нуклеотидами или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновую кислоту считают схожей с последовательностью сравнения в том случае, если наименьшая вероятность суммы при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой сравнения составляет менее чем приблизительно 0,1, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,001.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, которые специфично гибридизуются в полинуклеотидную последовательность, представленную как 8ЕО Ш №О: 1 от приблизительно нуклеотида 1 до нуклеотида 1867, или ее фрагмент. Фраза селективно (или специфично) гибридизуется в относится к связыванию, удвоению или гибридизации молекулы в конкретный полинуклеотид сравнения в жестких условиях гибридизации. Фраза жесткие условия гибридизации относится к условиям, при которых зонд в основном гибридизуется в свою целевую последовательность, как правило, в сложной смеси нуклеиновых кислот, а не в другие последовательности. Жесткие условия зависят от последовательности и будут меняться в различных обстоятельствах, в частности, в зависимости от длины зонда. Более длинные последовательности специфично гибридизуются при более высоких температурах. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Туззеп, Тесйшциез ίη В1осйет1з1ту апб Мо1еси1аг Вю1оду - НуЬпб1ха1юп χνίΐΐι №ис1е1с РгоЬез, Оуегу1е\т ой рппс1р1ез ой 11уЬпб1ха1юп апб 111е з!та1еду ой пис1е1с ас1б аззауз (1993). В общем случае жесткие условия гибридизации выбирают таким образом, чтобы они приблизительно на 5-10°С были ниже температуры плавления (Т_т) конкретной последовательности при определенной ионной силе и величине рН. Тт представляет собой температуру (при заданной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных целевой последовательности, гибридизуются в равновесных условиях в целевую последовательность (поскольку при Т_т целевые последовательности имеются в избытке, то 50% зондов находятся в равновесных условиях). Жесткие условия будут такими условиями, в которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,0М ионов натрия, как правило, концентрация ионов натрия (или других солей) составляет приблизительно от 0,01 до 1,0М при величине рН от 7,0 до 8,3 и температуре по крайней мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, содержащих от 10 до приблизительно 50 нуклеотидов) и по крайней мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, содержащих более 50 нуклеотидов). Жесткие условия могут быть также достигнуты при добавлении дестабилизующих агентов, таких как формамид. При селективной или специфической гибридизации положительный сигнал (например, идентификация нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению) приблизительно в 2 раза превышает фоновое значение гибридизации. Жесткие условия гибридизации, которые используют для идентификации в значительной степени идентичных нуклеиновых кислот, в соответствии с настоящим изобретением включают гибридизацию в буфере, содержащем 50% формамида, 5х88С и 1% 8Ό8 при температуре между 42 и 65°С, с промывкой смесью 0,2х88С и 0,1% 8Ό8 при 65°С для длинных зондов. Тем не менее, специалисту в данной области должно быть очевидно, что условия гибридизации могут быть модифицированы в зависимости от состава последовательности. Пример сравнительно же

- 6 008439 сткие условия гибридизации включают гибридизацию в буфере, содержащем 40% формамида, 1М ЫаС1 и 1% 8Ό8 при 37°С и промывку в 1х88С при 45°С. Положительное значение гибридизации по меньшей мере вдвое превышает фоновое значение. Специалистам в данной области понятно, что для аналогичных жестких условий могут быть применены альтернативные условия гибридизации и промывки. Так, экспрессионная кассета по настоящему изобретению может включать сигнальную область ро1уА НСНу. которая гибридизуется в очень жестких условиях в одноцепочечную ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО N0:18 или 19.

Экспрессионная кассета может использоваться в форме конструкции чистой нуклеиновой кислоты. Альтернативно, экспрессионная кассета может быть введена как часть вектора нуклеиновой кислоты (например вектора экспрессии, описанного выше). Подобные векторы включают плазмиды и вирусные векторы. Вектор может содержать последовательности, которые фланкируют экспрессионную кассету, которая включает последовательности, гомологичные эукариотическим геномным последовательностям, таким как геномные последовательности млекопитающих, или вирусным геномным последовательностям. Это позволяет ввести экспрессионную кассету в геном эукаритических клеток или вирусов путем гомологической рекомбинации. Например, плазмидный вектор, содержащий экспрессионную кассету, которая фланкирована вирусными последовательностями, может использоваться для получения вирусного вектора, который подходит для доставки экспрессионной кассеты в клетки позвоночных, включая клетки рыб, птиц или млекопитающих. Использованные методы хорошо известны специалисту в данной области.

Под термином интересующий полинуклеотид понимают молекулы нуклеиновых кислот, которые, по крайней мере, могут быть транскрибированы. Молекулы могут быть в смысловом или антисмысловом направлении по отношению к промотору. Антисмысловые генные конструкции могут применяться для ингибирования экспрессии гена в клетке в соответствии с хорошо известными методами. Интересующий полинуклеотид может включать гетерологичный полинуклеотид. Термин гетерологичный полинуклеотид охватывает любой ген. Гетерологичный полинуклеотид, как правило, получают из отличного вида, по сравнению с регуляторным элементом, с которым он операбельно соединен в экспрессионную кассету или векторе экспрессии, а если его получают из того же источника, то он представляет собой модифицированный ген по сравнению с его исходной формой. Таким образом, гетерологичный полинуклеотид, операбельно присоединенный к промотору, получают из источника, отличного от источника, из которого получен промотор, или же, если он происходит из того же источника, то он представляет собой модифицированный промотор по сравнению с его исходной формой. Модификация гетерологичного полинуклеотида может возникнуть, в частности, при воздействии на ДНК ферментом рестрикции с образованием фрагмента ДНК, который позволяет операбельно присоединить его к промотору. Для модификации гетерологичного полинуклеотида также можно использовать сайт-направленный мутагенез. Гетерологичный полинуклеотид может также включать ген маркера (например кодирующий β-галактозидазу или зеленый флуоресцентный белок) или гены, продукты которых регулируют экспрессию других генов. Таким образом, в настоящее описание включены полинуклеотиды, которые служат в качестве матрицы для мРНК, тРНК и рРНК. Гетерологичный ген может быть любым аллельным вариантом гена дикого типа или же он может быть мутантным геном. мРНК необязательно включает некоторые или все 5'- или 3'транскрибированные, но не транслированные фланкирующие области, естественным или иным образом связанные с транслированной кодирующей последовательностью.

Интересующий полинуклеотид также необязательно может включать ассоциированные контрольные элементы, обычно связанные с транскрибированными молекулами, например сигналы остановки транскрипции, домены полиаденилирования или элементы энхансера по ходу транскрипции. Интересующий полинуклеотид может кодировать или служить матрицей для терапевтического продукта, который может быть, например, пептидом, полипептидом, белком или рибонуклеиновой кислотой. Интересующий полинуклеотид, как правило, представляет собой последовательность ДНК (такую как кДНК или геномная ДНК), кодирующую полипептидный продукт, такой как ферменты (например, β-галактозидаза); производные крови; гормоны; цитокины; интерлейкины; интерфероны; ΤΝΕ; факторы роста (например ЮТ-1); растворимые рецепторные молекулы (например растворимые молекулы рецептора к ΤΝΕ); нейромедиаторы или их предшественники; трофические факторы, такие как ΒΌΝΕ, СКГЕ, ΝΟΤ, ЮТ, ОМЕ, аЕСЕ, ВЕСЕ, ΝΤ3 и ΝΤ5; аполипопротеины, такие как АроА1 и ΑροΑίν; дистрофии или минидистрофин; опухоль-угнетающие белки, такие как р53, ВЬ, Вар1А, ОСС и к-теу; факторы, принимающие участие в коагуляции крови, такие как факторы VII, VIII и IX; или, в качестве альтернативы, весь или часть природного или искусственного иммуноглобулина (например ЕаЬ и 8сЕу либо легкая или тяжелая цепочка клонированного ЦС).

Интересующий полинуклеотид может также включать матрицу для генерирования антисмысловой молекулы, транскрипция которой способствует экспрессии гена в клетке-мишени или транскрипции молекул клеточных мРНК, которую необходимо контролировать. Подобные молекулы могут, например, транскрибироваться в клетке-мишени в молекулы РНК, комплементарные молекулам клеточных РНК, и в соответствии с известными методами могут, таким образом, блокировать их трансляцию в белок. В

- 7 008439 частности, антисмысловые молекулы могут применяться для блокирования трансляции в воспалительных или катаболических цитокинах при лечении артрита и потери ткани, вызванной указанными цитокинами.

Интересующая полинуклеотидная последовательность обычно кодирует полипептид, используемый в диагностических или терапевтических целях. Полипептиды могут продуцироваться в биореакторах ίη νίΙΐΌ с помощью различных клеток-хозяев (например клеток СО8 или клеток СНО или их производных), содержащих экспрессионную кассету. В качестве альтернативы экспрессионная кассета и/или вектор экспрессии по настоящему изобретению может применяться для доставки гена, доставки белка и/или генной терапии.

Настоящее изобретение может также использоваться для экспрессии токсических факторов или полипептидов. Последние могут быть, в частности, клеточными ядами (такими как токсин дифтерии, токсин псевдомоны и рицин А), продуктом, который индуцирует чувствительность к внешнему агенту (например тимидинкиназой или цитозиндезаминазой) или, в качестве альтернативы, факторами, способными индуцировать отмирание клеток (например СгВ3-3 и антигеном против гак-8сРу).

Под применением в терапевтических целях понимают применение, которое может обеспечить ослабление болезни или расстройства, излечение болезни или расстройства и/или уменьшение тяжести симптомов заболевания или расстройства. Применение в диагностических целях включает применение молекул, способных определять или давать информацию относительно причины болезни или связи молекулы с заболеванием, или молекул, способных определять присутствие или отсутствие болезни либо расстройства. Диагностический агент не вносит непосредственный вклад в ослабление интенсивности симптомов болезни или расстройства.

Интересующий полинуклеотид может также кодировать антигенный полипептид для использования в качестве вакцины. Антигенные полипептиды или молекулы нуклеиновых кислот получают из патогенных организмов, таких как, например, бактерии или вирусы. Например, антигенные полипептиды включают антигенные детерминанты, которые присутствуют в геномах или генных продуктах патогенного организма, например, при вирусной геморрагической септицемии, бактериальном заболевании почек, вибриозе и фурункулезе. Антигенные полипептиды могут быть выбраны, например, из областей генома вируса гепатита С и генных продуктов.

В тексте настоящего описания выделенный при описании молекулы или композиции, такой как, например, вектор экспрессии или экспрессионная кассета по настоящему изобретению или интересующий полипептид, означает, что молекулу или композицию отделяют по меньшей мере от одного другого соединения, такого как белок, ДНК, РНК или другие примеси, с которыми она связана ίη νΐνο или в природе. Таким образом, интересующий полипептид считается выделенным в том случае, если он отделен от любого другого компонента, с которым он связан естественным образом. Тем не менее, выделенная композиция может также быть в значительной мере чистой. Чистоту и гомогенность можно определить, в частности, с использованием методов аналитической химии, таких как, в частности, электрофорез в полиакриламидном геле (РАСЕ), электрофорез в агарозном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения (НРЬС).

Использующиеся здесь термины молекула нуклеиновой кислоты и полинуклеотид используются взаимозаменяемо и включают олигонуклеотиды (т. е. короткие полинуклеотиды). Они также относятся к синтетическим и/или неприродным молекулам нуклеиновых кислот (например, включают нуклеотидные аналоги или модифицированные остатки каркаса или соединительные вставки). Термины относятся также к дезоксирибонуклеотидым или рибонуклеотидным олигонуклеотидам, либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме. Термины охватывают нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги природных нуклеотидов. Термины также охватывают структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическим каркасом. Аналоги с каркасом ДНК, рассматривающиеся в настоящем изобретении, включают фосфодиэфир, фосфоротиоат, фосфородитиоат, метилфосфонат, фосфорамидат, алкилфосфотриэфир, сульфамат, 3'-тиоацеталь, метилен (метилимино), 3'-Ы-карбамат, морфолинокарбамат и пептиднонуклеиновые кислоты (ΡΝΑ); см. О11допис1еоИбек апб Апа1одиек, а Ргасйса1 Арргоасй, ебйеб Ьу Е.Ескк1еш, 1ЯЬ Ргекк а! ОхГогб ИптуегкИу Ргекк (1991); Апйкепке 81га1ед1ек, Аппа1к оГ 1йе №\ν Уогк Асабету о£ 8с1епсе, νο1. 600, Ебк. Вакегда апб Иепкагб! (ИУА8 1992); Мййдап (1993) 1. Меб. Сйеш. 36: 1923-1937; Апйкепке Яекеагсй апб Аррйсайопк (1993, СЯС Ргекк). ΡNΑ содержат неионные каркасы, такие как №(2-аминоэтил)глициновые фрагменты. Фосфотиолятные соединительные вставки описаны в XV О 97/03211; XVО 96/39154; Ма!а (1997) Тох1со1. Арр1. Рйагшасо1. 144: 189-197. Другие синтетические каркасы, которые охватываются указанным термином, включают метилфосфонатные соединительные вставки или перемежающиеся метилфосфонатные и фосфодиэфирные соединительные вставки (81гаикк8оикир (1997) ВюсйешШгу 36: 8692-8698) и бензилфосфонатные соединительные вставки (8ашк1ад (1996) АпИкепке №.1с1ею Ас1б Эгид Эеу. 6: 153-156).

Как используется здесь, рекомбинатный относится к полинуклеотиду, синтезированному или подвергающемуся другому воздействию в условиях ш ν 11го (например к рекомбинантному полинуклеотиду), к способам применения рекомбинантных полинуклеотидов для получения продуктов в клетках или других биологических системах или к полипептидам (рекомбинантным белкам), кодируемым реком

- 8 008439 бинантным нуклеотидом. Рекомбинантные полинуклеотиды охватывают молекулы нуклеиновых кислот, полученные из различных источников и лигированные в экспрессионную кассету или вектор экспрессии, например, гибридного белка или такие молекулы, которые получают индуцированной или конститутивной экспрессией полипептида (например, экспрессионной кассеты или вектора по настоящему изобретению, операбельно связанного с гетерологичным полинуклеотидом, таким как последовательность, кодирующая полипептид).

В типичной экспрессирующей системе продукция полипептида из гетерологичного полинуклеотида либо не регулируется, либо регулируется модулирующей транскрипцией из промотора транскрипции, операбельно связанного в обратном направлении от полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид. Однако регуляция должна происходить четко в прямом направлении для того, чтобы обеспечить правильную терминацию транскрипции и стабильность мРНК. В одном из аспектов настоящего изобретения сигнальная область полиаденилирования (ро1уА) варианта гормона роста человека (ΙιΟΗν) образуется в прямом направлении (3') интересующего полипептида, который содержится в экспрессионной кассете или векторе экспрессии по настоящему изобретению. Сигнальная область ΙιΟΗν ро1уА включает последовательность, полученную из генетической последовательности гормона роста человека. Сигнальная область полиаденилирования ΙιΟΗν обеспечивает четкую терминацию транскрипции и обеспечивает повышенную стабильность мРНК в эукариотических клетках. Указанная сигнальная область полиаденилирования ΙιΟΗν обеспечивает явные преимущества по сравнению с известными экспрессионными кассетами и/или векторами экспрессии, включая те, которые могут использовать промотор/энхансер СМУ.

Могут также присутствовать трансляционные элементы, и подразумевается, что они охватывают специализированные последовательности (такие как сайты связывания рибосомы или инициирующие кодоны), которые необходимы для осуществления трансляции транскрипта РНК в белок. Трансляционные элементы могут также включать консенсусные последовательности, лидирующие последовательности, сигналы сплайсинга и т. п., которые служат для облегчения или повышения степени трансляции или для повышения стабильности экспрессированного продукта. Например, сигнальная область полиаденилирования ΙιΟΗν обеспечивает повышенную стабильность мРНК. Векторы по настоящему изобретению могут содержать вспомогательные области транскрипции, такие как вставочная последовательность, сигналы полиаденилирования, сайты инициации трансляции Шайна-Дальгарно и консенсусные последовательности Козака (8Ыпе е! а1. Ргос. №111. Асаб. 8сг (И8А) 71: 1342-1346 (1974); Кохак. Се11 44: 283-292 (1986)).

Предполагается, что термин репликационные элементы охватывает специализированные последовательности (такие как точки инициации репликации), которые необходимы для осуществления репликации вектора в клетке-реципиенте. В общем случае подобные векторы содержат по крайней мере одну точку инициации репликации, достаточно эффективную для того, чтобы осуществить автономную стабильную репликацию вектора в клетке-реципиенте.

Для облегчения выбора и сохранения вектора по настоящему изобретению в вектор могут быть включены один или несколько маркеров селекции (таких как полинуклеотиды, которые придают устойчивость к антибиотикам или дают клеткам возможность расти в минимальной среде или в присутствии токсических метаболитов).

В соответствии с еще одним вариантом его осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим вышеописанные генные конструкции (например экспрессионная кассета или вектор по настоящему изобретению). Экспрессионная кассета по настоящему изобретению может использоваться для рекомбинантной модификации клетки-хозяина путем трансфекции клетки-хозяина или трансформирования клетки-хозяина с целью экспрессии требуемого интересующего полинуклеотида. По тексту настоящего описания термин рекомбинантно модифицированный означает введение экспрессионной кассеты или вектора экспрессии по настоящему изобретению в живую клетку или экспрессирующую систему. Как правило, в векторе (например в плазмиде) содержится экспрессионная кассета, включающая интересующий полинуклеотид. Как приведено в настоящем описании, экспрессирующая система включает живую клетку-хозяин, в которую введен интересующий полинуклеотид, продукт которого необходимо экпрессировать.

Клетки-хозяева представляют собой клетки, в которых может размножаться экспрессионная кассета (включая вектор, содержащий экспрессионную кассету), и могут экспрессироваться полипептиды, кодирующие продукты. Клетка-хозяин включает также любое потомство рассматриваемой клетки-хозяина или ее производные. Понятно, что все потомство может не быть идентично родительской клетке, поскольку в процессе репликации могут возникнуть мутации. Тем не менее, когда используется термин клетка-хозяин, к нему также относится и потомство. Клетки-хозяева, которые могут использоваться по настоящему изобретению, включают клетки бактерий, клетки грибов (например клетки дрожжей), клетки растений или клетки животных. Например, клетки-хозяева могут быть клетками высших эукариот, такие как клетки млекопитающих, или клетками низших эукариот, такие как клетки дрожжей, или прокариотическими клетками, такими как клетки бактерий. Введение генной конструкции в клетку-хозяин может осуществляться путем трансфекции фосфата кальция, опосредованной ПЕАЕ-Эех1гап трансфек

- 9 008439 ции или с помощью электропорации (Όανίδ, Ь., ΌίόηοΓ. М., ВаПсу. I., ВаДс Ме1йоб§ ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν (1986)). В качестве характерного примера подходящих хозяев могут быть упомянуты: клетки грибов, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как ΌϊΌδορΙιίΙα 82 и 8робор1ета 8Т9; клетки животных, такие как СНО, СО8 или меланома Боуэса; клетки растений и т.п. Предполагается, что из представленных в данном описании примеров специалисты в данной области техники способны осуществить выбор подходящего хозяина.

Клетки-хозяева для использования по настоящему изобретению представляют собой эукариотические клетки (например клетки млекопитающих). В одном из аспектов настоящего изобретения клеткихозяева представляют собой продуктивные клетки, адаптированные для роста в культуральной среде. Примерами таких обычно промышленно используемых клеток являются клетки СНО, УЕКО, ВНК, НеЬа, СУ1 (включая Сок, Со8-7), МОСК, 293, 3Т3, С127, линии клеток миеломы (особенно мышиные), РС12 и ^У138, клетки яичника китайского хомячка (СНО), которые широко применяются для продуцирования нескольких комплексных рекомбинантных белков, в частности цитокинов, факторов коагуляции крови и антител (Втаке1 е1 а1. В1ооб 88: 2004-2012 (1996); КаиТтап е1 а1. 1. Вю1. Сйеш. 263: 6352-6362 (1988); МсК1ппоп е! а1., 1. Мо1. Епбостшо1. 6: 231-239 (1991); А'ооб е! а1. 1. 1ттипо1. 145: 3011-3016 (1990)). Линии дефицитных по дигидрофолятредуктазе (ΌΗΕΡ.) мутантных клеток (ит1аиЬ е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 77: 4216-4220 (1980)) представляют собой линии клеток СНО, которые могут быть выбраны, поскольку эффективная ΌΗΕΚ. экспрессирующая система селектируемого и способного к амплификации гена позволяет получить в указанных клетках высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка (КаиТтап, Ме111. Епхуто1. 185: 527-566 (1990)). Кроме того, с указанными клетками легко обращаться как в виде прилипающих культур или суспензий культур, и они обладают относительно хорошей генетической стабильностью. Клетки СНО и экспрессируемые в них рекомбинантные белки интенсивно изучались и были одобрены для клинического применения. Кроме того, предполагается, что также могут применяться клетки-хозяева, полученные из любой из вышеуказанных клеточных линий и обладающие требуемым фенотипом. Например, полученная клетка-хозяин включает клетки СНО (например клеточную линию ΌΟ44), которые были селективно культивированы, с целью получения требуемого фенотипа (например, с помощью положительного и/или отрицательного процесса селекции).

В качестве одного из аспектов настоящего изобретения предлагается экспрессирующая система для ίη νίΙΐΌ продукции агента, кодируемого интересующим полинуклеотидом. Как обсуждается в настоящем описании, интересующий полинуклеотид может кодировать полипептид, который имеет фармацевтическую, медицинскую, питательную или промышленную ценность. Например, интересующий полинуклеотид может кодировать лекарство на основе полипептида. Как правило, подобный полипептид экспрессируется в виде внеклеточного продукта. Например, полипептиды, которые могут продуцироваться с использованием экспрессионной кассеты или вектора экспрессии по настоящему изобретению, включают, этим не ограничиваясь, лиганд Е113, лиганд СЭ40, эритропоэтин, тромбопоэтин, кальцитон, лиганд Еак, лиганд для рецептора активатора ΝΕ-каппа В (КАПКЕ), ΤΝΕ-ассоциированный апоптоз-индуцирующий лиганд (ТК.А1Ь), ОКК/Тек, полученный из стромы вилочковой железы лимфопоэтин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор роста тучных клеток, фактор роста стволовых клеток, эпидермальный фактор роста, КАПТЕ8, гормон роста, инсулин, инсулинотропин, инсулиноподобные факторы роста, паратиреоидный гормон, интерфероны (например интерферон бета), факторы роста нервов, интерлейкины от 1 до 18, колониестимулирующие факторы, лимфотоксин-β, фактор некроза опухолей, фактор ингибирования лейкемии, онкостатин-М, различные лиганды для молекул Е1к и Нек на поверхности клеток (такие как лиганды для ерйсвязанных киназ, или ЬЕКК8) и легкие или тяжелые цепочки антител.

Рецепторы любого из вышеуказанных белков могут быть также экспрессированы с использованием способов и композиций по настоящему изобретению, включая обе формы рецептора фактора некроза опухолей (обозначенных как р55 и р75), рецепторы интерлейкина-1 (типа 1 и 2), рецептор интерлейкина-4, рецептор интерлейкина-15, рецептор интерлейкина-17, рецептор интерлейкина-18, рецептор гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, рецептор колониестимулирующего фактора гранулоцитов, рецепторы к онкостатину-М и фактору ингибирования лейкемии, рецептор активатора ΝΕ-каппа В (КАПК), рецепторы к ТКА1Ь, рецептор ВАЕЕ, рецептор лимфотоксина бета, рецепторы ΤΟΕβ типов I и II и рецепторы, которые включают домены смерти, такие как Еак или апоптоз-индуцирующий рецептор (АГК).

Другие белки, которые могут быть экспрессированы с использованием экспрессионной кассеты и/или векторов экспрессии по настоящему изобретению, включают кластер антигенов дифференцировки (называемых СО белками), например, те из них, которые описаны в Ьеикосу1е Τνρίη§ VI (Ртосеебшдк оТ 1йе VIII! !п1егпа(1опа1 ^отккйор апб СопТегепсе; КЫшпоЮ, К1ки1аш е! а1., ебк.; КоЬе, 1арап, 1996) или СО молекулы, раскрытые в последующих симпозиумах. Примеры подобных молекул включают СО27, СО30, СО39, СО40 и их лиганды (лиганд СО27, лиганд СО30 и лиганд СО40). Некоторые из них являются членами семейства рецепторов к ΤΝΕ, которые также включают 41ВВ и 0X40; лиганды часто являются членами семейства ΤΝΕ (также как лиганд 41ВВ и лиганд 0X40); таким образом, члены семейств ΤΝΕ

- 10 008439 и ΤΝΡΚ также могут быть экспрессированы при использовании настоящего изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением могут быть также экспрессированы полипептиды, которые обладают ферментативной активностью. Примеры включают членов семейства металлопротеиназыдезинтегрина, различные киназы, глюкоцереброзидазу, супероксиддисмутазу, тканевый плазминогенный активатор, фактор VIII, фактор IX, аполипопротеин Е, аполипопротеин А-Ι, антагонист 1Ь-2, альфа-1 антитрипсин, ΤΝΡ-альфа превращающий фермент (ТАСЕ) и многочисленные другие ферменты. С использованием экспрессионной кассеты или вектора экспрессии по настоящему изобретению можно также экспрессировать лиганды ферментативно активных белков.

Композиции и способы по настоящему изобретению применимы также для экспрессии других типов рекомбинантных белков и полипептидов, включая молекулы иммуноглобулина или их части и химерные антитела (например, антитела, содержащего константную область человека, соединенную с областью связывания мышиного антигена) или их фрагменты. Известны многочисленные методики, с помощью которых можно проводить манипуляции с ДНК, кодирующими молекулы иммуноглобулина, с получением ДНК, кодирующих рекомбинантные белки, такие как одноцепочечные антитела, антитела с повышенной аффинностью или другие полипептиды на основе антител (см., например, Батек е! а1., Βίο!ескпо1оду 7: 934-938 (1989); Кеюкшаии е! а1., №1Шгс 332: 323-327 (1988); КоЬейз е! а1., №1Шгс 328: 731734 (1987); Vе^йοуеη е! а1., 8с1еисе 239: 1534-1536 (1988); СБаисПинх е! а1., Уинге 339: 394-397 (1989)). Клонированные гуманизированные антитела включают такие, которые специфично связываются с рецептором лимфотоксина бета и интегринами, такими как νΕΑ-1, νΕΑ-4 и αγβ6. Подобные антитела могут быть агонистами или антагонистами.

С использованием способов и композиций по настоящему изобретению могут также зкспрессироваться различные гибридные белки. Примеры подобных гибридных белков включают белки, экспрессированные как белки, слитые с частью молекулы иммуноглобулина, белки, экспрессированные как белки, слитые с зипперным фрагментом, и новые полифункциональные белки, такие как гибридные белки цитокина и фактора роста (например СМ-С8Р и [И-3, МСР и !Б-3). В \УО 93/08207 и \УО 96/40918 описано получение различных растворимых олигомерных форм молекулы, обозначенной как СО40Б, включая гибридный белок иммуноглобулина и гибридный зипперный белок соответственно; обсуждаемые в настоящем описании методики применимы и к другим белкам.

Как только экспрессирован интересующий полинуклеотид, продукт экспрессии (например белок или полипептид) может быть очищен с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Например, в том случае, когда интересующий полипептид кодирует гибридный полипептид, содержащий метку очистки, то полипептид может быть очищен с помощью антител, которые специфично связываются с меткой. В одном из аспектов олигонуклеотид, кодирующий молекулярную метку, лигируют с 5'-или 3'-концом интересующего полипептида, который кодирует требуемый полипептид; указанный олигонуклеотид может кодировать ро1уН15 (такой как йехаШз) или другую метку, такую как РБАС, НА (гемаглютинин вируса гриппа) или тус, для которых имеются коммерчески доступные антитела. Указанную метку обычно конденсируют с полипептидом в процессе экспрессии полипептида, и она может служить как средство аффинной очистки требуемого полипептида от клетки-хозяина. Аффинную очистку можно осуществить, например, с помощью колоночной хроматографии с использованием в качестве аффинной матрицы антител против метки. Далее метку не обязательно можно удалить из очищенного полипептида с помощью различных методов, таких как протеолитическое расщепление.

Экспрессионная кассета и векторы экспрессии по настоящему изобретению могут использоваться для достижения устойчивого переноса интересующего полипептида в клетку-хозяина. Устойчивый перенос означает, что интересующий полипептид постоянно сохраняется в хозяине. Экспрессионная кассета или вектор экспрессии по настоящему изобретению может также обеспечить временную экспрессию интересующего полипептида в клетке-хозяине. Временно трансфекцированные клетки-хозяева теряют ДНК в процессе репликации и роста клеток.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению может применяться для доставки терапевтического агента нуждающемуся в лечении человеку или животному. Кроме того, экспрессионная кассета по настоящему изобретению может применяться в качестве вакцины для доставки субъекту (например человеку) агента, ίη νίνο кодирующего потенциально иммуногенные полипептиды, в частности, для вакцинации домашних животных, включая используемых в пищу животных, таких как рыбы, свиньи, лошади, коровы, виды собачьих и виды кошачьих.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению может вводиться непосредственно как генная конструкция голой нуклеиновой кислоты, как правило, включающий фланкирующие последовательности, гомологичные геному, клетки-хозяина. Усвоение генных конструкций голой нуклеиновой кислоты позвоночными достигается с помощью нескольких известных методов, включая биолистическую трансформацию и липофекцию.

В качестве альтернативы экспрессионная кассета может вводиться как часть вектора, включая плазмидный вектор или вирусный вектор.

Как правило, экспрессионная кассета или вектор экспрессии объединяют с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем с целью получения фармацевтической композиции. Подходящие

- 11 008439 носители и разбавители включают изотонический физиологический раствор, в том числе, например, забуференный фосфатом физиологический раствор. Композиция, содержащая экспрессионную кассету или вектор экспрессии, может быть составлена для различных типов введения, включая, например, внутримышечное введение.

В том случае, когда композиция, содержащая экспрессионную кассету или вектор экспрессии, применяется в форме инъекции, ее обычно смешивают с носителем, который фармацевтически приемлем для получения состава для инъекции, пригодного для прямой инъекции в место, которое необходимо подвергнуть обработке. Фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем может, например, быть стерильный изотонический раствор. Композиции, содержащие экспрессионную кассету или вектор экспрессии, могут быть также составлены в виде перорально активной формы.

Конкретный применяемый состав может быть легко определен специалистом, и он будет меняться в зависимости от типа вводимого вещества и пути введения.

Используемая доза вещества может быть подобрана в зависимости от различных параметров, особенно в зависимости от используемого вещества, возраста, веса и состояния субъекта, лечение которого необходимо провести, применяемого пути введения и требуемой схемы лечения. Врач сможет определить требуемый путь введения и дозу для любого конкретного субъекта и состояния.

Примеры

Конструирование вектора рУ10

Дополнительные детали конструкции рУ10 представлены на фиг. 1. Геномную ДНК выделяют из диплоидных фибропластов человека, инфицированных штаммом АО 169 цитомегаловируса человека (АТСС по. УК-538) и используют для того, чтобы методом ПЦР амплифицировать область раннего гена промотора 1 СМУ (СМУ ΙΕ1 Р/Е)/энхансера (детали 5'ИТК гена СМУ ΙΕ1 см. фиг. 11(В) (8ЕЦ ГО N0:1)). Промотор аплифицируют с использованием праймеров, содержащих сайт ΗίηάΙΙΙ у 5'-конца (ШААССТТСАСАТТСАТТАТТСАСТАС; 8Е0 ГО N0:2; подчеркнут сайт рестрикции) и сайт ВатШ у З'-конца (ЦЦССАТСССТСТСААССАСССТСАСТСС; 8Е0 ГО N0:3; подчеркнут сайт рестрикции). Концевые нуклеотиды ΐ, предшествующие сайту рестрикции, включены в конструкцию олигонуклеотида, с целью облегчить расщепление ферментом рестрикции, и удаляются по окончании стадии клонирования.

Все реакции ПЦР проводят в ДНК-процессоре РТС-200 Рейет Тйегта1 Сус1ег (М1 Кезеагсй, Ватертаун, Массачусетс). Общий объем реакционной смеси составляет 100 мкл: буфер ΙΧ ΝΕΒ УеШ полимеразы (10 мМ КС1, 20 мМ Тпз с рН 8,8 при температуре 25°С, 10 мМ (ΝΗ₄)80₄, 2 мМ Мд80₄, 0,1% Ттйоп Х100), 2,5 мМ άΝΓΡ'δ, 2 единицы УеШ ДНК-полимеразы (№\ν Епд1ап6 Вю1аЬз, Беверли, Массачусетс), 1 мкг каждого праймера, 1 мкг геномной ДНК, выделенной из СМУ-инфицированных клеток в качестве матрицы. Условия проведения реакции следующие: 99°С в течение 1 мин, 55°С в течение 30 с, 75°С в течение 1,5 мин для 15 циклов. Полученный фрагмент расщепляют ферментами рестрикции ВатШ и НтбШ (№\ν Епд1ап6 Вю1аЬз) и субклонируют в вектор клонирования рИС19, который расщепляют с помощью ВатШ и НшбШ. Проводят анализ последовательности инсерции и определяют, что она совпадает с опубликованной последовательностью клонированной области промотора/энхансера СМУ ΙΕ1.

Конструирование вектора рУ40

Конструкция рУ40 приведена на фиг. 2. З'ИТК из гена йОНу, включающий сигнал ро1уА, амплифицируют с помощью ПЦР из геномной ДНК, которую выделяют из фибробластов человека. (+)-Цепь 5'-праймера (ТТТТООАТСССТОСССОООТООСАТСС; 8ЕО ГО N0:20) содержит концевой сайт рестрикции ВатШ, а (-)-цепь 3'-праймера содержит концевой сайт ЕсоШ (ТТТТОААТТСАТОАОАООАСАОТОССААОС; 8ЕО ГО N0:21). Условия проведения ПЦР такие же, что и при конструировании вектора рУ10. Полученный с использованием ПЦР фрагмент расщепляют с помощью ВатШ и ЕсоШ, очищают методом гель-хроматографии и лигируют в вектор рУ10, расщепленный с помощью ВатШ и ЕсоШ. Структуру полученной плазмиды, которую обозначают как рУ40, подтверждают с помощью рестрикционного ферментативного анализа. Последующее секвенирование показывает небольшое отличие в нуклеотидах между 3'ИТК этого гена йСНу (8Е0 ГО N0:19) и опубликованной последовательностью гена йОНу, которая приведена в банке генов ОепВапк под номером доступа К00470 (8Е0 ГО N0:18). По крайней мере, некоторые изменения вызваны аллельными вариациями.

Конструирование вектора рУ70

Вектор рУ40 расщепляют с помощью ВзрЕ1 и ΗраI с целью удаления секции размером в 317 нуклеотидов из области вставочной последовательности А (ГУ8) (см. в частности, фиг. 2 и 3). РУ60 получают лигированием по тупым концам в ВзрЕΙ-НраИ кодирующего дйГг участка рУ40. Вектор экспрессии рУ70, с целью регулирования транскрипции, содержит основную область раннего промотора 1 цитомегаловируса (СМУ) человека (йСМУ Ш1)/энхансера. Он также содержит йСМУ ГЕ1 5'ИТК. и вставочную последовательность А, где вставочная последовательность имеет делецию в 317 пар оснований. С целью терминации транскрипции, вектор содержит область полиаденилирования варианта гормона роста человека (йОНу ро1уА), 8Е0 ГО N0:19. Детали конструкций рУ40, рУ60 и рУ70 приводятся ниже, а также описываются на фигурах.

- 12 008439

A. Генерирование рХЬС.1.

Продукт ПЦР, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь антитела, расщепляют с помощью ВатН1 и клонируют в уникальный сайт ВатН1 в векторе экспрессии рУ70 (фиг. 3). Область, кодирующую легкий участок, вводят в уникальный сайт ВатН1 между 5'ИТК последовательностью у З'-конца вставочной последовательности ИСМУ ΙΕ1 и 5'-концом области ИОНу ро1уА. Указанную плазмиду обозначают как рХЬС.1. Схема генерирования вектора рХЬС.1 представлена на фиг. 4.

B. Введение кластера пео-рХЬС.2.

Экспрессионную кассету неомицинтрансферазы (пео) вводят в рХЬС.1 в качестве селектируемого маркера (фиг. 5). Кластер пео получают в виде ВатН1/ЕсоК1 фрагмента из коммерчески доступной плазмиды, называемой рОТ-№28 (Хе\\· Еп§1апб Вю1аЬз, номер 307-28 по каталогу). В указанной плазмиде ген пео управляется промотором фосфоглицераткиназы (РОК) и терминируется на сайте РОК полиаденилирования. ВатН1 конец у 5'конца кластера пео превращают в Уаг1 конец с помощью следующих адаптерных олигонуклеотидов:

ЕсоК1

ВашН1-совместимый САТССАТСААТТС6С (5Е<2 Ю N0:4)

СТАСТТААССССС (ЗЕ<2 Ю N0:5) ЫагI-совместимый

Вместе с указанными линкерами добавляют также новый сайт ЕсоКТ Адаптер вначале лигируют к ВатН1/ЕсоК1 отрезку фрагмента пео, а затем конвертированный фрагмент клонируют в рХЬС.1, расщепленный с помощью Уаг1 и ЕсоК1. Указанным образом экспрессионную кассету пео вводят в З'-конец последовательности легкой цепи плазмиды. Указанную плазмиду обозначают как рХЬС.2 (фиг. 5).

Конструирование тяжелой цепи вектора экспрессии - рХНС.5

A. КТ-РСК тяжелой цепи.

Тяжелую цепь амплифицируют по реакции КТ-РСК с помощью праймера ТТТТООАТССАТОТАСТОООТОААОСАО (8ЕР ΙΌ N0:6), где выделенная курсивом последовательность представляет собой добавленный участок линкера с сайтом ВатН1, а подчеркнутые основания соответствуют второму метионину в последовательности, кодирующей тяжелую цепь. Использованный 3' ПЦР-праймер, ОСССООАТССТСАТТТАСССООАОАСАО (8ЕР ΙΌ N0:7), также содержит добавленный участок линкера с сайтом ВатН1 (выделен курсивом) и последовательность, соответствующую последовательности, кодирующей тяжелую цепь, которая включает кодон терминации (подчеркнут). Получают ожидаемый продукт реакции ЦПР, содержащий 1268 пар оснований.

B. Конструирование рХНС.

Поскольку использованный 5' ПЦР-праймер гибридизуется со вторым АТО кодоном в кодирующей области, а не инициирующим АТО в кодирующей области, содержащейся в продукте ПЦР, то кодирующая область тяжелой цепи является неполной. Фрагмент ВатН1, содержащий неполную тяжелую цепь, клонируют в плазмиду рУ60 (фиг. 6). Этот вектор идентичен вектору рУ70 (описан выше) за исключением того, что он содержит кодирующую область бй£г в месте делеции во вставочной последовательности. Область, кодирующую тяжелую цепь, вставляют в уникальный сайт ВатН между 5' нетранслированной последовательностью у З'-конца вставочной последовательности кСМУ 1Е1 и 5'-концом области ро1уА варианта кОНу. Указанную плазмиду с неполной тяжелой цепью обозначают как рХНС.

C. Завершение последовательности, кодирующей тяжелую цепь - рХНС.1.

Кодирующую область, которая отсутствует в последовательности тяжелой цепи, вставляют в рХНС, чтобы генерировать плазмиду, обозначенную как рХНС.1 (фиг. 7). Для этого посредством ПЦР генерируют фрагмент, содержащий в качестве матрицы кодирующую последовательность для антитела. Используемый 5' ПЦР-праймер представляет собой:

Рз1:1 ВатН1

ТТТТСТССАСТСАСССТССТТаАСАССССАТССАТООАСТООАССТТООАООе (8Е0 ΙΌ N0:8).

Последовательность, выделенная курсивом, соответствует рХНС.5' последовательности на сайте ВатН1, а последовательность, выделенная жирным шрифтом, соответствует последовательности, которая начинается за два основания перед кодоном инициации в последовательности тяжелой цепи. Используемый 3'-праймер представляет собой СТОАООАОАСООТОАССАОООТСССТТООСССС (8ЕР ΙΌ N0:9). Указанный праймер гибридизуется к концу первого экзона, переменной области тяжелой цепи. Получают ожидаемый ПЦР-продукт из 445 пар оснований и разрезают его с помощью РзИ и 8ΐπΙ. Фрагмент РзП^Ы клонируют в рХНС, разрезанный с помощью РзК и 81ιιΙ, и получают рХНС.1

Ό. Удаление άΗτ вставочная последовательность - рХНС.З рХНС.1 содержит ген άΗτ во вставочной последовательности кСМУ ХЕ1. Вследствие потенциальных проблем с амплификацией, которые обнаружены для данной конфигурации, ген бй£г удаляют из вставочной последовательности, и экспрессионную кассету вставляют в направлении 3' от кластера тяжелой цепи (фиг. 8). Первой стадией является удаление гена άΗτ из вставочной последовательности. Указанный процесс осуществляют, вырезая из рХНС.1 последовательность, кодирующую тяжелую цепь, в виде фрагмента РзИ/ЕсоК! и клонируя ее в плазмиду рХЬС.1, разрезанную тем же самым ферментом.

- 13 008439

Указанная стадия клонирования просто переключает в плазмиде легкую цепь на тяжелую цепь. Полученная плазмида идентична рХНС.1 за исключением того, что вставочную последовательность, содержащую ген <ИП'г, заменяют на вставочную последовательность с делецией, как описано выше для рХБС.1. Указанную плазмиду с тяжелой цепью обозначают как рХНС.3 (фиг. 8).

Е. Инсерция кластера дЫг - рХНС.5.

Второй стадией в изменении конфигурации άΜτ является инсерция дЫг экспрессионной кассеты в направлении 3' от экспрессионной кассеты тяжелой цепи (фиг. 9). Экспрессионную кассету <1Шг получают из плазмиды р81-БНЕК на фрагменте Вд111/ВатН1, и он включает ранний промотор 8У40, ген дЫг и область 8У40 ро1уА. Указанный фрагмент клонируют в сайт ЕсоК1, расположенный у 3' конца области 11О1 Ιν ро1уА в рХНС.3 с использованием следующих адаптерных олигонуклеотидов:

За11

ЕсоК1 совместимый ААТТССТССАСА (3Εζ) ΙΏ N0:10)

ССАССТСТСТАС (ЗЕО Ю N0:11) ВашН1/Вд1И совместимый

Указанный адаптер вначале лигируют в плазмиду, разрезанную с помощью ЕсоК1, а затем кластер Вд111/ВатН1 бЬТг лигируют в адаптированную плазмиду. Указанную плазмиду обозначают как рХНС.5 (фиг. 9).

Определение свойств рХБС.2 и рХНС.5

Обе плазмиды анализируют с помощью фермента рестрикции с целью подтверждения наличия и ориентации вставленных фрагментов. Кроме того, кодирующую область плазмид секвенируют для подтверждения того, что на стадиях ПЦР или клонирования не возникло мутаций.

Присутствие функционального маркера селекции пео подтверждают путем трансфекции рХБС.2 в клетки СНО и демонстрации устойчивости к ( 418. Способность осуществлять двойную селекцию демонстрируют в том случае, когда плазмиды рХБС.2 и рХНС.5 совместно трансфектируют в не содержащий сыворотку адаптированный хозяин [)О44 СНО. Колонии выращивают из совместной трансфекции в двойных селектирующих средах (а - МЕМ 10% 6ЕВ8 с 400 мг/мл 0418). В тех же условиях каждая селекция по отдельности (а - МЕМ или 400 мг/мл 0418) способна убивать нетрансфекцированные клетки.

Конструирование векторов: векторы рУ80 или рУ90 рУ80 генерируют из вектора экспрессии рХНС.5 тяжелой цепи (фиг. 10). Последовательность, кодирующую тяжелую цепь, удаляют из рХНС.5 с помощью ВатН1. Каркас лигируют, чтобы восстановить циклизацию по сайту ВатН1.

С целью генерирования вектора рУ90 проводят два изменения в векторе рУ80 (фиг. 11). Разрушают сайт \о11, обнаруживаемый в генной конструкции рУ80 в позиции 3166 (на конце кодирующей области дЫт). Для этого плазмиду разрезают с помощью \о11 и вставляют нависающие части с помощью полимеразы Кленова. В результате вновь лигированная плазмида теряет сайт \о11 в позиции 3166. Затем создают новый сайт \о11 на сайте клонирования, разрезая вектор с помощью ВатН1 и вводя линкер \о11, полученный ренатурацией следующего 14-мера с самим собой: ОАТССОСООССОСО (8ЕР ГО N0:12). При совместной ренатурации получают последовательность линкера:

ΝοΙΙ

ВатН1 совместимый САТСС6С66СС6С (5Εζ) Ю N0:13)

С6СС66С6ССТАС0 (ЗЕО Ю N0:14) ВатН1 совместимый

Указанная стадия клонирования восстанавливает сайты ВатН1 по обеим сторонам сайта Νΰί1. Указанные сайты ВатН1 могут быть полезны при проведении генетического анализа стабильных клеточных линий с помощью указанного вектора. Последовательность сайта клонирования в рУ90 подтверждают секвенированием.

В векторе рУ80 какой-либо полинуклеотид (например кодирующую последовательность) можно клонировать в сайт ВатН1 ССАТСССТОСССОООТ (8ЕР ГО N0:15). Выделенная жирным шрифтом последовательность соответствует сайту ВатН1. В векторе рУ90 какой-либо полинуклеотид (например, кодирующую последовательность) можно клонировать в сайт ВатН1 или \о11 ССАТССОСООССОСССАТСССТОСССОООТ (8Ер ГО N0:16). Здесь выделенная жирным шрифтом последовательность соответствует сайту ВатН1, а подчеркнутая последовательность - сайту Νΰί1. С целью получения оптимальных результатов при использовании сайта \о11 С должен быть добавлен перед стартовым кодоном в ПЦР-праймерах с тем, чтобы наилучшим образом соответствовать последовательности Козака (например ООАТСС ОСООССОС С АТО (8ЕР ГО N0:17)).

Сайты рестрикции в рУ80 и рУ90 рУ80 и рУ90 идентичны за исключением сайтов рестрикции ^Я: рУ80 содержит единственный сайт \о11 в положении 3166 (конец области, кодирующей бЫг), а рУ90 содержит единственный сайт \о11 в положении 1260 (сайт клонирования).

Общие сайты рестрикции, из которых обнаруживают 2 или менее, включают сайты рестрикции, приведенные в табл. 1.

- 14 008439

Таблица 1

АаИ (1) 2274	Ара1(1) 1733
Взд1 (1) 1494	ΒβίΧΙ (1) 3404
ΗίηάΙΠ (2) 2293, 6059	Нра1 (1)3308
ΤΖ-—Т /04 1ΛΟΊ О1ЛЛ гхрш (½) 174 1, эт	/1\ осос ΙΝϋΙΙ ) эυου
Νοίΐ (1) см. выше	РзЯ(2) 1231,2331
8асП (2) 673, 1258	8та1(2) 1271,3161
ХЬа! (1)3150	ХЬо1 (1)3127

Не обнаружены следующие общие сайты ферментов рестрикции.

Таблица 2

АзрЕ1 (2) 1382,4807	ВатШ (1) 1254
С1а1 (1) 3404	Еде! (1) 3585
Каз1 (1) 3585	Крп21(1) 1121
ътл~т /о\ осл огап	ХТКхчТ /14 ОССО
гчист /	1Ч11СЛ ν. ±7 1
ΡνιιΙ (2) 3544,4440	8ас1 (2)585,2819
8ре! (1) 20	81и1 (1)2274

Хша!(2) 1271,3161

АаШ	АЙ1	АГе1	Аде1	А1и1	АраБ1	АзрЕП	Азр1	Ауа1	АуаП	Β514ΜΙ	ϋρηΐ
ϋρηΠ	Е>га1	ОгаП	Е>га1П	Еае1	Еа§1	Еаг1	ЕсоК1	ЕсоКУ	Гзр1	НаеП	НаеШ
ΗίηοΙ	Нра!	Иае!	ΝοοΙ	ΝάεΠ	ΝβρΙ	Рас!	8аП	8рЫ	ХЬоП	ХтаШ

Клонирование репортерных генов.

Экспрессионную кассету/вектор экспрессии, включающую СМУ 1Е1, фрагмент вставочной последовательности А и генную конструкцию ΗΟΗν ро1уА, сравнивают с коммерчески доступным сильным вектором экспрессии на основе 8У-40.

Секретируемую алкалинфосфатазу (8ЕАР) используют в качестве репортера для сравнения плазмид. Вектор экспрессии на основе 8У-40, р8ЕАР2-еоп1го1 (номер по каталогу 6052-1, С1оп1ееИ) экспрессирует 8ЕАР под контролем раннего промотора 8У40 и энхансера 8У40. За кодирующей 8ЕАР последовательностью следует поздний сигнал полиаденилирования 8У40, с целью обеспечения правильного, эффективного процессинга транскрипта 8ЕАР в эукариотических клетках. Синтетический блокатор транскрипции (ТВ), составленный из примыкающих друг к другу сайтов полиаденилирования и временной приостановки транскрипции, которые расположены в обратном направлении от МС8, снижает фоновую транскрипцию. Вектор имеет ряд особенностей, которые улучшают чувствительность 8ЕАР за счет повышения эффективности экспрессии 8ЕАР или повышают полезность векторов. Они включают улучшенный консенсусный сайт инициации трансляции Козака;

удаление вставочной последовательности 8У-40 зта11-1, которая может вызывать латентный сплайсинг и приводить к снижению экспрессии в некоторых генах и/или типах клеток;

переключение с раннего на поздний сигнал полиаденилирования 8У40, который обычно вызывает пятикратное повышение уровней мРНК;

расширенный множественный сайт клонирования (МС8);

компактный размер плазмиды; и удаление посторонних последовательностей из 3' нетранслированной области 8ЕАР мРНК. Номер доступа в И89938 в банке генов.

С целью генерации плазмиды рСМУ-ЬОНуРА-8ЕАР последовательность, кодирующую 8ЕАР, извлекают из плазмиды р8ЕАР2-еоп1го1 с помощью ПНР и клонируют в вектор рУ110. Плазмида рУ110 является производной от рУ90 (отсутствует экспрессионная кассета йЫт, содержится отличный полилинкер, а в остальном то же самое). Конструкцию плазмиды рСМУ-ЬОПуРА-8ЕАР подтверждают секвенированием.

Хозяином, который используют для проведения трансфекций, является дефицитная по дигидрофолятредуктазе (ΌΗΡΚ) клеточная линия ΌΟ44 яичников китайского хомячка (Цг1аиЬ е1 а1., Се11 33, 405-412 (1983)). Репортерные плазмиды СМУ8ЕАР и р8ЕАР2-еоп1го1 подвергают совместной трансфекции плазмидой, кодирующей дигидрофолятредуктазу (йй£г) таким образом, чтобы для них могли быть выбраны стабильные трансфектанты (р81-ОНЕК.2, фиг. 12). Каждая трансфекция содержит 50 мкг репортерной плазмиды и 5 мкг р81-ОНЕК.2. Все ДНК получают с использованием набора реагентов Медаргер (Р1адеп). Перед проведением трансфекций ДНК осаждают с помощью ЕЮН, промывают 70% ЕЮН, сушат, повторно суспендируют в НЕВ8 (20 мМ Нерез, рН 7,05, 137 мМ ИаС1, 5 мМ КС1, 0,7 мМ На₂НРО₄, 6 мМ декстрозы) и перед трансфекцией проводят количественный анализ. Отрицательные контроли включают рИС18 (АТСС Но. 37253) в качестве репортерного контроля и ДНК без трансфекций в качестве контроля трансфекции (табл. 3).

Клетки и ДНК трансфектируют электропорацией в 0,8 мл НЕВ8, используя кювету 0,4 см (ВюКай) и 0,28 кВ и 950 мФ. Количество клеток, используемых для проведения каждой трансфекции, составляет 5Е6. После импульса электропорации каждой клетке дают инкубировать в кювете в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Затем их переносят в пробирку центрифуги, содержащую 10 мл альфа МЕМ с нуклеозидами и 10% ЙЕВ8, и в течение 5 мин формируют таблетку при скорости вращения 1000 об./мин. Таблетки после повторного суспендирования высевают в 6-луночные планшеты в альфа МЕМ без нуклеозидов с 10% ЙЕВ8 и инкубируют при 36°С с 5% СО₂ в модифицированном инкубаторе до тех пор,

- 15 008439 пока не образуются колонии.

Таблица 3

Репортерная плазмида (50 мкг каждой)	Плазмида ϋΗΕΚ (5 мкг каждой)	Номер трансфекции
рЗЕАР2-соп11го1	рЗЮНГК.2	3
рСМУЗЕАР	рЗЮНЕН.2	3
риС18	рЗЮНЕК.2	1
Нет ДНК	Нет ДНК	1

Приблизительно через 2 недели после трансфекции колонии образуются в трансфекциях, содержащих лишь плазмиду р8I^ΗΡΚ.2. Стабильные трансфектанты анализируют либо в виде пула, либо в виде изолятов. Удельную продуктивность определяют с помощью анализов, в которых среду заменяют на свежую, а через 24 ч берут пробы среды и проводят подсчет клеток. Титр продукта нормализуют относительно количества клеток по окончании 24-часового анализа, и продуктивность выражают в виде активности 8ЕАР на клетку.

Анализ 8ЕАР. Кондиционированную среду анализируют с помощью Огеа! ЕзсАРе™ 8ЕАР Керог1ег 8уз!ет 3 (С1оп!есН). В указанном анализе для определения активности 8ЕАР в кондиционированной среде используют флуоресцентный субстрат. Набор реагентов применяют в 96-луночном формате в соответствии с рекомендациями изготовителя, за исключением следующего. Буферный раствор из набора для проведения анализа заменяют на раствор, содержащий 1,5М диэтаноламина, 0,75 мМ МдС1₂, 15 мМ Ь-гомоаргинина и 10% ЕшегаМ II (номер по каталогу 9761, АррНей Вю8у81ешз). Все стандартные растворы и образцы разбавляют свежей средой, а не предлагаемым буферным раствором для разбавления. Вместо того чтобы проводить одно считывание через 60 мин, проводят множество считываний через интервалы 10-20 мин, и их используют для выражения активности 8ЕАР в виде относительных единиц флуоресценции в минуту (ΚΡϋ/мин). Для планшет-ридера (Су1ойиог II, Рег8ер1гуе Вю8у81еш8) вместо рекомендуемого фильтра 449 нм применяют фильтр испускания 460 нм.

Значения ΚΡϋ/мин нормализуют относительно стандартной кривой на основе стандарта, прилагаемого к набору реагентов. Поскольку прилагаемый стандарт не является количественным, то все значения являются относительными. Для получения величин относительной удельной продуктивности (активность 8ЕАР на клетку в день) указанные относительные значения нормализуют по отношению к количеству клеток и инкубационному периоду.

Пулы. После появления колоний клетки собирают и готовят пулы каждой трансфекции. Пулы высевают в 6-луночные планшеты в количестве ~2х10⁵ клеток на лунку. На следующий день среду заменяют на 2 мл свежей среды. Через 24 ч клетки подсчитывают, и образец среды используют для анализа активности 8ЕАР. Результаты анализа пулов приведены на фиг. 13.

Изоляты. Изоляты получают отбором колоний из трансфекции. Отбор осуществляют отсасыванием прямо над колонией с помощью устройства Р200 Р1ре1шап™, установленного на объем 50 мл. Колонии после отсасывания вначале переносят на 48-луночный планшет, а затем, когда будет получено достаточное количество клеток, переносят на 6-луночный планшет. Удельную продуктивность анализируют на 6-луночных планшетах при плотностях клеток, близких к конфлюэнтным, используя 24-часовой анализ, который описан выше (фиг. 14).

Как суммировано на фиг. 13 и 14, вектор экспрессии на основе комбинации промотора СМУ Ш и сигнальной области ΗΘ11 ν ро1уА, значительно превосходит коммерчески доступный вектор, который отличается высокой экспрессирующей способностью.

Описано несколько вариантов осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, следует понимать, что могут быть внесены различные модификации, которые соответствуют сущности и объему притязаний по настоящему изобретению. Таким образом, другие варианты осуществления настоящего изобретения подпадают под следующую формулу изобретения.

Claims (29)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Экспрессионная кассета, включающая область раннего промотора 1 (НСМУ 4Е1)/энхансера СМУ человека; интересующий полинуклеотид и сигнальный домен ро1уА варианта гормона роста человека (ΗΘΗν) или его вариант, где сигнальный домен ΗΘΗν ро1уА имеет длину по крайней мере 100 нуклеотидов и содержит последовательность ААТААА, и вариант ро1уА по крайней мере на 92% идентичен сигнальному домену ΗΘΗ ро1уА.
2. 2. Экспрессионная кассета по п.1, где область промотора 4Е1/энхансера НСМУ включает последовательность, представленную от приблизительно х₁ до приблизительно х₂ последовательности 8Е0 ГО N0:1, где х₁ обозначает нуклеотид приблизительно от 1 до 20 последовательности 8Е0 ГО N0:1, а х₂ обозначает нуклеотид приблизительно от 715 до 720 последовательности 8Е0 ГО N0:1.

   - 16 008439
3. 3. Экспрессионная кассета по п.1, где область промотора ШНэнхансера 11СМУ включает последовательность 8ЕО ΙΌ N0:1.
4. 4. Экспрессионная кассета по п.1, где область промотора Ш1/энхансера 11СМУ комплементарна последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1.
5. 5. Экспрессионная кассета по п.1, где область промотора Ш1/энхансера 11СМУ содержит последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8Е0 ΙΌ N0:1 или комплементарной ей последовательности.
6. 6. Экспрессионная кассета по п.1, где область промотора Ш1/энхансера 11СМУ содержит последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична 8Е0 ΙΌ N0:1 или комплементарной ей последовательности.
7. 7. Экспрессионная кассета по п.1, где область промотора ШНэнхансера 11СМУ содержит нуклеотид от 1 до 1867 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1.
8. 8. Экспрессионная кассета по п.1, которая дополнительно включает вставочную последовательность переменной длины (УЪЕУ8), содержащую донорный сайт сплайсинга и акцепторный сайт сплайсинга.
9. 9. Экспрессионная кассета по п.8, где УЫУ8 включает интрон А гена ΙΕ1 11СМУ.
10. 10. Экспрессионная кассета по п.8, где УЫУ8 включает интрон А гена ΙΕ1 11СМУ с делецией между акцепторным сайтом сплайсинга и донорным сайтом сплайсинга интрона А.
11. 11. Экспрессионная кассета по п.8, где УЫУ8 включает последовательность от приблизительно х₃ до х₄ последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, где х₃ обозначает нуклеотид между приблизительно 715-720 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, а х₄ обозначает нуклеотид между приблизительно 1236-1254 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1.
12. 12. Экспрессионная кассета по п.1, дополнительно содержащая добавочный промоторный/энхансерный элемент или регуляторную область.
13. 13. Экспрессионная кассета по п.12, где промоторный/энхансерный элемент представляет собой промоторный/энхансерный элемент 8ν40.
14. 14. Экспрессионная кассета по п.12, где регуляторная область является областью полиаденилирования 8ν40.
15. 15. Экспрессионная кассета по п.1, где маркер селекции выбран из группы, состоящей из дигидрофолатредуктазы, СРЕ, неомицина, Нидго, 2еосш™, тимидинкиназы вируса простого герпеса, гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы, аденинфосфорибозилтрансферазы, пуромицин N ацетилтрансферазы или аденозиндеаминазы.
16. 16. Экспрессионная кассета по п.15, где маркером селекции является дигидрофолатредуктаза.
17. 17. Экспрессионная кассета по п.1, где интересующий полинуклеотид кодирует терапевтический агент.
18. 18. Экспрессионная кассета по п.1, где интересующий полинуклеотид кодирует полипептид для диагностического или терапевтического применения.
19. 19. Экспрессионная кассета по п.1, где интересующий полинуклеотид кодирует антигенный полипептид для применения в качестве вакцины.
20. 20. Экспрессионная кассета по п.1, где сигнальный домен ро1уА включает по крайней мере 100 последовательных нуклеотидов последовательности 8Е0 ΙΌ N0:19.
21. 21. Экспрессионная кассета по п.20, где сигнальный домен ро1уА включает последовательность 8ЕО ΙΌ N0:19.
22. 22. Экспрессионная кассета по п.1 в виде конструкции голой нуклеиновой кислоты.
23. 23. Полинуклеотид, который специфически гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 приблизительно от 1 до приблизительно 1867 или ее фрагментом.
24. 24. Экспрессионный вектор, содержащий экспрессионную кассету по любому из пп.1-22.
25. 25. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.24.
26. 26. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионную кассету по любому из пп.1-22.
27. 27. Способ получения полипептида, включающий деление клетки-хозяина по п.25 или 26 и экспрессию интересующего полинуклеотида.
28. 28. Способ доставки терапевтического агента животным, включающий деление клетки-хозяина по п.25 или 26 и экспрессию интересующего полинуклеотида.
29. 29. Генетический вектор 11ХНС.5.