WO2015162930A1 - タンパク質発現を向上させる方法およびタンパク質発現用組成物 - Google Patents

タンパク質発現を向上させる方法およびタンパク質発現用組成物 Download PDF

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mrna
protein
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poly
disorder
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啓史 位▲高▼
片岡　一則
賢 池上
智士 内田
寛邦 内田
和也 長田
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一般社団法人 医療産業イノベーション機構
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving protein expression and a composition for protein expression.
  • Protein is extremely promising as a physiologically active substance. For example, protein replacement therapy is effective in treating diseases caused by a decrease in a particular protein. Therefore, techniques for producing a large amount of protein intracellularly or extracellularly have been developed so far.
  • Protein is produced by transcription from DNA encoding the protein to mRNA and translation of the protein from the mRNA.
  • Transcriptional regulators are involved in transcription of mRNA from DNA, and the amount of mRNA production is controlled by transcriptional regulation.
  • protein translation from mRNA is thought to be controlled by the association of translation initiation factors to mRNA. It is also known that mRNA is unstable in cells and its stability varies depending on poly A added to the 3 'UTR of mRNA.
  • Poly A is usually added to the 3 'UTR of mRNA by a poly A addition signal.
  • a complex containing a cleavage / polyadenylation factor (CPSF) recognizes the poly A addition signal region of the 3′UTR of the mRNA, and 10 to 10 of the signal.
  • MRNA is cleaved 30 bases downstream, and poly-A is initiated from the cleavage site. Then, it is considered that the synthesis of poly A is terminated when poly A reaches about 100 to 300 bases (Non-patent Document 1). However, the synthesis of poly A is not strictly controlled.
  • the length of poly A is considered to be related to the amount of protein translation from mRNA.
  • Non-Patent Document 2 discloses that the translation efficiency of mRNA is increased when the length of poly A added to the 3'UTR of mRNA is 120 bases.
  • poly A is enzymatically added to mRNA based on the poly A addition signal region.
  • the expression level is controlled by selecting a promoter, and various expression vectors in which the promoter sequence is devised to enhance protein expression have been commercially available.
  • the present invention provides a method for improving protein expression and a composition for protein expression.
  • the present inventors have found that mRNA with a polyA length in a certain range significantly enhances the binding with eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E).
  • eIF4E eukaryotic translation initiation factor 4E
  • the present inventors have also found that mRNA with a poly A length in a certain range shows a significantly high translation efficiency.
  • the present invention is based on these findings.
  • a composition for use in expressing a target protein comprises mRNA encoding the protein of interest, 80% or more of the mRNA contained in the composition has a sequence consisting essentially of polyA having a length of 230 to 250 bases on the 3 ′ end side of the protein coding region, Composition.
  • Composition Composition.
  • composition (3) The above (1), wherein 95% or more of the mRNA contained in the composition has a sequence consisting essentially of polyA having a length of 230 to 250 bases on the 3 ′ end side of the protein coding region. Composition. (4) The composition according to any one of the above (1) to (3), wherein 20% or less of the mRNA contained in the composition is mRNA having poly A having a length of 270 bases or more. (5) a protein expression vector, A gene encoding a protein operably linked to a promoter; A protein expression vector comprising a sequence substantially consisting of 230 to 250 bases in length and comprising poly A downstream of a protein coding region of a gene encoding a protein.
  • a pharmaceutical composition for use in treating a disease or disorder in a subject suffering from a disease or a subject having a disorder comprising mRNA encoding a protein capable of treating the disease or disorder And 80% or more of the mRNA contained in the composition has a sequence consisting essentially of a polyA sequence having a length of 230 to 250 bases on the 3 ′ end side of the protein coding region of the mRNA .
  • the disease or disorder is a disease or disorder caused by protein reduction or deficiency, and the protein capable of treating the disease or disorder is a protein that is reduced or deficient in a subject (the above)
  • the composition according to 8 ).
  • composition according to (8) above wherein the disease or disorder is spinal cord injury and the protein capable of treating the disease or disorder is brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • FIG. 1 is an electrophoresis photograph of purified mRNA.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of poly A length on the amount of mRNA bound to the protein described in the figure.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between poly A length and translation efficiency in cultured cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between poly A length and translation efficiency in a cell-free extraction system.
  • FIG. 4A shows the results in a human cell-free extraction system
  • FIG. 4B shows the results in a rabbit reticulocyte lysate.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between poly A length and translation efficiency in vivo.
  • FIG. 6 is a diagram showing the influence of poly A length on the therapeutic effect of the sciatic nerve injury model.
  • mRNA means messenger RNA.
  • the mRNA is preferably derived from a eukaryote.
  • eukaryotes include bacteria such as E. coli, fungi such as yeast, insects such as silkworm, and mammals such as human. More preferably, the eukaryote is E. coli, yeast, silkworm or human.
  • mRNA is produced in vivo by transcription from DNA. When transcription is completed, poly A is added to the 3 'end of the mRNA.
  • a 3 'untranslated region (3'UTR) is usually interposed between a protein coding region (CDS) and polyA.
  • CDS protein coding region
  • protein coding region means a region encoding a protein on DNA and a region encoding a protein on RNA.
  • the “3 ′ end side of the protein coding region” means a region outside the protein coding region and 3 ′ end side in mRNA, and preferably a region further outside the 3 ′ UTR. Yes, may mean the 3 'end of the 3'UTR.
  • upstream means a region existing on the opposite side to the direction in which genetic information is read when viewed from the protein coding region of a gene.
  • downstream means a region that exists in a direction in which genetic information is read when viewed from the protein coding region of a gene.
  • poly A means DNA or RNA formed by polymerizing adenine.
  • sequence consisting essentially of poly A means 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 100% of all bases of the sequence. Means that it consists of That is, the base consisting essentially of poly A may contain a base other than adenine (A).
  • bases other than adenine (A) are concentrated in a region of, for example, 3 or less, preferably 2 or less, more preferably 1 or less.
  • the base other than adenine (A) is, for example, a restriction enzyme cleavage site.
  • the “promoter” means a transcriptional control region of mRNA existing on DNA.
  • an in vitro transcription system promoter and a eukaryotic promoter can be used as the “promoter”.
  • promoters for in vitro transcription systems include SP6 promoter, T3 promoter and T7 promoter, which can be used in the present invention.
  • eukaryotic promoters include bacterial promoters such as E. coli and mammalian promoters, which can be appropriately selected according to the host cell and used in the present invention.
  • Examples of the promoter for E. coli include T7 promoter, tac promoter, and T7lac promoter.
  • the promoter for mammals include ⁇ -actin promoter such as CMV promoter and CAG promoter, EF1 ⁇ promoter and SR ⁇ promoter.
  • terminal means a termination signal for transcription.
  • Poly A chain functions as a binding site for poly A binding protein and promotes transport of mRNA out of nucleus.
  • the poly A chain has a role of protecting mRNA from its degradation in the cytoplasm. Thereby, poly A chain contributes to the improvement of the translation efficiency to protein.
  • EIF4E is also called eukaryotic translation initiation factor 4E and plays an important role in the translational control of mRNA.
  • eIF4E is involved in recognition of the 5 'cap structure of mRNA and plays a role in circularizing mRNA through eIF4G and poly A binding protein (PABP).
  • PABP poly A binding protein
  • mRNA with long poly A binds more strongly to PABP, while the complex formation between mRNA and eIF4E has a specific length of poly A (specifically 240 bases). Sometimes found to be significantly promoted. Further, when the poly A length exceeded a certain value, the binding to PABP was strengthened, while the binding to eIF4E was weakened. Since eIF4E is thought to bind to (or form a complex with) mRNA polyA via PABP, eIF4E binding to eIF4E is reduced in mRNA having a long polyA that increases the binding between mRNA and PABP. The result of weakening was very surprising.
  • the poly A length of mRNA when the poly A length of mRNA is 210 bases or less and when it is 270 bases or more, the translation efficiency is remarkably reduced as compared with 240 bases. Therefore, in the present invention, it is preferable that the poly-A length of mRNA is controlled to a certain length.
  • the “certain length” here is, for example, 220 to 260 bases, preferably 225 to 255 bases, particularly preferably 230 to 250 bases, more preferably 230 to 245 bases, Even more preferred is 235 to 245 bases.
  • the amount of mRNA having poly A of 270 bases or more is reduced or removed from the composition.
  • ⁇ Poly A length can be easily controlled by removing poly A addition signal.
  • the mRNA does not have a poly A addition signal.
  • the DNA that transcribes mRNA does not have a poly A addition signal between its protein coding region and its terminator.
  • the DNA that transcribes mRNA does not have a poly A addition signal between its protein coding region and its terminator, but instead has a sequence consisting of a poly A of a certain length. Have.
  • the present inventors have clarified that the binding ability to eIF4E is improved when the mRNA has a certain length of poly A. Accordingly, in one aspect of the present invention, there is provided a method for improving the binding ability of mRNA to eIF4E, wherein the mRNA comprises a sequence consisting essentially of polyA having a certain length on the 3 ′ end side of the protein coding region. There is provided a method comprising adding a sequence consisting of polyA or substantially polyA downstream of the protein coding region of the DNA to which the mRNA is transcribed. In certain preferred embodiments, the constant length is 230 to 250 bases.
  • MRNA is obtained by transcription of the region between the transcription initiation region on DNA and the terminator by RNA polymerase II.
  • poly A or a sequence consisting essentially of poly A can be inserted between the protein coding region of DNA and the terminator.
  • the method for improving the binding ability of mRNA of the present invention to eIF4E may further include removing the poly A addition signal.
  • the poly A addition signal is typically AATAAA (or AAUAAAA), and those skilled in the art can easily remove the poly A addition signal. Since the poly A addition signal is contained in the region between the CDS and the terminator, or in the 3'UTR, it can also be removed by removing part or all of these regions.
  • the method for improving the binding ability of the mRNA of the present invention to eIF4E may further include, in one embodiment, reducing or removing mRNA having poly A having a length of 270 bases or more. Certain embodiments of the invention may further comprise reducing or removing mRNA having a polyA of 210 bases or less in length. One aspect of the present invention may further include reducing or removing mRNA having a poly A of 210 bases or less and 270 bases or more.
  • the inventors have clarified that the translation efficiency is remarkably improved when the poly A length of mRNA is 240 bases.
  • the translation efficiency greatly exceeded that of mRNA having a poly A length of 210 bases and mRNA having a poly A length of 270 bases.
  • a composition for use in expressing a target protein comprising mRNA encoding the target protein, and 80% of the mRNA contained in the composition. % Or more (molecular ratio, the same applies hereinafter), preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, even more preferably 99% or more, and most preferably 100%.
  • a composition having a sequence consisting essentially of polyA having a certain length (for example, 230 to 250 bases) on the 3 ′ end side of the coding region is provided. As described above, it is preferable that the poly-A length of mRNA is controlled to a certain length.
  • the ratio (%) of the number of mRNA molecules can be determined by methods well known to those skilled in the art.
  • the molecular number ratio can be determined from, for example, an electrophoresis pattern obtained by electrophoresis of mRNA encoding a target protein.
  • an electrophoresis method with excellent quantification using a microchip for RNA analysis has been developed and can be used for calculation of the number ratio of mRNA molecules.
  • the composition of the present invention is 20% or less, preferably 15% or less, more preferably 10% or less, even more preferably 5% or less, even more preferably, of mRNA encoding the target protein contained in the composition.
  • 3% or less, particularly preferably 1% or less is mRNA having poly A having a length of 270 bases or more, and most preferably mRNA encoding a target protein having poly A having a length of 270 bases or more is substantially contained in the composition.
  • the composition of the present invention is 20% or less, preferably 15% or less, more preferably 10% or less, even more preferably 5% or less, even more preferably, of mRNA encoding the target protein contained in the composition.
  • 3% or less is mRNA having poly A having a length of 210 bases or less, and most preferably mRNA encoding a target protein having poly A having a length of 210 bases or less is contained in the composition.
  • 1% or less is mRNA having a poly A of 210 base length or less and 270 base length or more, and most preferably mRNA having a poly A of 210 base length or less or 270 base length or more is contained in the composition. Virtually not included.
  • the composition of the present invention contains 80% or more of mRNA whose poly A length is a certain length (for example, 230 to 250 bases) relative to the mRNA encoding the target protein contained in the composition.
  • the poly A length is a certain length (for example, 230 to 250 bases)
  • the translation efficiency is remarkably increased, which is extremely advantageous from the viewpoint of translation efficiency.
  • % Have a sequence consisting essentially of polyA of a certain length (eg, 230 to 250 bases) on the 3 ′ end side of the protein coding region.
  • the mRNA does not have a poly A addition signal.
  • the composition of the present invention may contain one kind of mRNA or a mixture of plural kinds of mRNA.
  • the composition of the present invention may be a mixture of mRNAs having various lengths of poly A.
  • the composition of the present invention may contain a carrier such as a buffer or an excipient in addition to mRNA.
  • the composition of the present invention may contain a carrier for mRNA delivery.
  • composition of the present invention can be used to express a protein in cells in vitro or in vivo.
  • compositions of the invention can also be used to express proteins in in vitro translation systems such as cell-free extraction systems.
  • a protein expression vector is a gene encoding a protein operably linked to a promoter, and has a certain length (eg, 230-250) downstream of the protein coding region of the gene encoding the protein.
  • a protein expression vector comprising a sequence consisting essentially of polyA.
  • the protein expression vector of the present invention is used for producing mRNA in which a sequence substantially consisting of poly A having a certain length (for example, 230 to 250 bases) is added to the 3 'UTR region.
  • a method for expressing a target protein in a body cell of a subject comprising mRNA encoding the target protein, wherein 80% or more of the mRNA contained in the composition , Preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 99% or more, and most preferably 100% is constant on the 3 ′ end side of the protein coding region of the mRNA.
  • the method may further comprise reducing or removing mRNA having a polyA having a length of 270 bases or more.
  • Certain embodiments of the invention may further comprise reducing or removing mRNA having a polyA of 210 bases or less in length.
  • One aspect of the present invention may further include reducing or removing mRNA having a poly A of 210 bases or less and 270 bases or more.
  • a method of treating a disease or disorder in a subject suffering from or having a disorder comprising mRNA encoding a protein capable of treating the disease or disorder.
  • a method is provided.
  • the disease or disorder is peripheral nerve injury
  • the protein capable of treating the disease or disorder is insulin-like growth factor (IGF-1) is there.
  • the peripheral nerve injury can be a sciatic nerve injury.
  • IGF-1 exhibits muscle hypertrophy effect (or muscle atrophy prevention effect) by intramuscular administration of mRNA encoding IGF-1 and also has a nerve regeneration promoting action, and promotes regeneration of damaged nerves. And the recovery of the motor function of the subject.
  • the disease or disorder is spinal cord injury
  • the protein capable of treating the disease or disorder is brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is there.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor promotes recovery of neural function after spinal cord injury, for example, by intrathecal administration of mRNA encoding BDNF.
  • the disease or disorder is a disease or disorder caused by protein reduction or deficiency
  • the protein capable of treating the disease or disorder is A protein that is reduced or deficient in the disease or disorder. That is, this particular embodiment is protein replacement therapy.
  • the protein capable of treating the disease or disorder is a secretory factor or a facilitator that promotes production of the secreted factor, and the disease or disorder Is a disease or disorder caused by a reduction or deficiency of secreted factors.
  • a pharmaceutical composition for use in a method of treating a disease or disorder of the present invention there is provided a pharmaceutical composition for use in a method of treating a disease or disorder of the present invention. That is, according to the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for use in treating a disease or disorder in a subject afflicted with a disease or a subject having a disorder, and a protein capable of treating the disease or disorder. 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, even more preferably 99% or more of the mRNA contained in the composition.
  • a pharmaceutical composition in which 100% has a sequence consisting essentially of a polyA sequence of a certain length (eg, 230 to 250 bases) on the 3 ′ end side of the protein coding region of the mRNA.
  • the disease or disorder is peripheral nerve injury and the protein capable of treating the disease or disorder is insulin-like growth factor (IGF-1).
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • the peripheral nerve injury can be a sciatic nerve injury.
  • the disease or disorder is spinal cord injury and the protein capable of treating the disease or disorder is brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease or disorder caused by protein reduction or deficiency comprising mRNA encoding the protein.
  • mRNA encoding the protein 80% or more of the mRNA contained in the composition, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 99% or more, most preferably 100%.
  • a pharmaceutical composition having a sequence consisting essentially of a polyA sequence having a certain length (for example, 230 to 250 bases) on the 3 ′ end side of the protein coding region of mRNA.
  • the protein is a secretory factor.
  • a protein capable of treating a disease or disorder in the manufacture of a pharmaceutical composition for use in treating the disease or disorder in a subject suffering from or having a disorder is encoded.
  • the present invention relates to the use of mRNA having a sequence consisting essentially of a polyA sequence having a certain length (eg, 230 to 250 bases) on the 3 ′ end side of the protein coding region.
  • the composition comprises 80% or more of the mRNA contained in the composition, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, even more preferably 99% or more, and most preferably 100% is a substantially poly A sequence having a certain length (eg, 230 to 250 bases) on the 3 ′ end side of the protein coding region of the mRNA.
  • the disease or disorder is peripheral nerve injury and the protein capable of treating the disease or disorder is insulin-like growth factor (IGF-1).
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • the peripheral nerve injury can be a sciatic nerve injury.
  • the disease or disorder is spinal cord injury and the protein capable of treating the disease or disorder is brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • the disease or disorder is a disease or disorder caused by a reduction or deficiency of the protein, and the protein capable of treating the disease or disorder is reduced or deficient in the disease or disorder. It is a protein.
  • the protein is a secretory factor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain one kind of mRNA or a mixture of plural kinds of mRNA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a mixture of mRNAs having various lengths of poly A.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or excipient such as a buffer in addition to mRNA.
  • the composition of the present invention may contain a carrier for mRNA delivery.
  • parenteral administration include, but are not limited to, intramuscular administration, intraventricular administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, intraventricular administration, intraocular administration, subcutaneous administration, intranasal administration, intravaginal administration and intrathecal.
  • Intracavitary administration is included, which allows the pharmaceutical composition to be administered in the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is provided as an injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered systemically or locally by an appropriate administration form depending on the disease or disorder.
  • treatment means to cure, prevent or ameliorate a disease or disorder or to reduce the rate of progression of a disease or disorder. Treatment can be accomplished by administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition.
  • a “subject” is preferably a human subject or a human patient.
  • the composition or pharmaceutical composition of the present invention is such that the mRNA forms a polyion complex with PEG-PAsp (DET).
  • PEG-PAsp refers to a copolymer of a polyethylene glycol block and a polyaspartic acid derivative block.
  • PEG has an average degree of polymerization of 5 to 20000, preferably 10 to 5000, more preferably 40 to 500, but inhibition of polyion complex formation between block copolymer and mRNA. As long as it is not done, the degree of polymerization of the PEG content is not limited.
  • the aspartic acid derivative has a side chain carboxyl group having a diethyltriamine (DET) group (—NH—CH 2 —CH 2 —NH—CH 2 —CH Aspartic acid substituted with 2- NH 2 ).
  • DET diethyltriamine
  • R 1 is a hydroxyl group, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group
  • R 4 is H, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group
  • R 3 is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) 2 —NH 2
  • n is an integer of 0 to 5000, for example, an integer of 0 to 500
  • m is an integer from 0 to 5000, for example, an integer from 0 to 500
  • m + n is an integer from 2 to 5000, for example, an integer from 2 to 500
  • n ⁇ m is an integer of 0 or more
  • Each repeating unit in the formula is shown in a specific order for convenience of description, but each repeating unit can be present in any order, each repeating unit may be present randomly, and each repeating unit is May be the same or different, However, when the polycation block forms a copolymer with polyethylene glycol, R 1 or
  • Example 1 Construction of protein expression plasmid
  • a plasmid having a poly A sequence having a different length downstream of the protein coding region of mRNA was constructed.
  • the GLuc gene (derived from the animal species Gaussia princeps ) and the NLuc gene (derived from the animal species Oplophorus gracilirostris ) were used. It was cut out from Vector (Primega, catalog number N1001) with restriction enzymes HindIII and XbaI. Each luciferase gene was cloned into the HindIII and XbaI cleavage sites in the multiple cloning site under the control of the T7 promoter of the pSP73 vector (Promega, catalog number P2221). The resulting plasmid is called pSP73-Luc plasmid.
  • a poly A sequence 120, 180, 210, 240, 270 or 360 base length
  • Oligo DNA was used for the preparation of the poly A chain sequence. Specifically, it is as follows.
  • a plasmid having poly A having a length of 1-2.180, 210 or 240 bases Two oligo DNAs 5'-AATTC-A 120 -GATATCA-3 'and 5'-GATCTGATATC-T 120 -G-3' Is inserted into the pSP73-Luc plasmid linearized with restriction enzymes EcoRI and BglII, pSP73-GLuc- containing 120-base polyA and containing the restriction enzyme EcoRV recognition sequence A (120) -EcoRV plasmid was prepared, and then the resulting plasmid was linearized with restriction enzymes EcoRV and BglII.
  • 5′-GA X -GAGACGA-3 ′ and 5′-GATCTCGTCTC-T X -C-3 ′ are further added to the restriction enzyme sites of the obtained plasmid.
  • Double-stranded DNAs prepared from these two oligo DNAs were inserted, respectively, to prepare plasmids having poly A with a length of 180, 210 or 240 bases.
  • a plasmid having poly A having a length of 270 or 360 bases 2 prepared from two oligo DNAs 5′-GA 120 -GATATCA-3 ′ and 5′-GATCTGATATC-T 120 -C-3 ′
  • This double-stranded DNA was inserted into a pSP73-Luc-A (120) -EcoRV plasmid linearized with restriction enzymes EcoRV and BglII to prepare a pSP73-GLuc-A (240) -EcoRV plasmid.
  • the prepared plasmid was linearized with restriction enzymes EcoRV and BglII.
  • the restriction enzyme sites of the obtained plasmid were divided into two of 5′-GA X -GAGACGA-3 ′ and 5′-GATCTCGTCTC-T X -C-3 ′ (where x is 31 or 121). Double-stranded DNAs prepared from oligo DNAs were inserted, respectively, to prepare plasmids having poly-A lengths of 270 and 360 base chains.
  • pSP73-Luc-A base length of poly A
  • pSP73-Luc-A base length of poly A
  • a poly A sequence having a length of 120 bases is represented as pSP73-Luc-A (120).
  • This protein expression plasmid was replicated in Escherichia coli by a conventional method, then purified and used in the following examples.
  • Example 2 Protein binding ability of mRNA
  • the ability of mRNA to bind to protein was confirmed.
  • a plasmid having a 120, 180 or 210 base chain length poly A was converted to a linear DNA with typeIIS type restriction enzyme BsmBI and purified by agarose electrophoresis.
  • the 240, 270 or 360 base chain length plasmid was converted into linear DNA using two types of restriction enzymes BsmBI and HpaI, and purified by agarose electrophoresis.
  • the purified linear DNA has a luciferase gene under the control of the T7 promoter.
  • mRNA was prepared by in vitro transcription according to the manufacturer's manual.
  • FIG. 1 shows the results of electrophoresis of mRNA having A (120), A (240) and A (360).
  • MRNA bound to nuclear protein was obtained as follows. That is, Huh7 cells were seeded at 5,000 cells / well in a 96-well plate and cultured for 24 hours. As the medium, DMEM containing 10% FBS was used. 190 ng of GLuc mRNA having various lengths of poly A purified in Example 1 was introduced into Huh7 cells using a gene introduction reagent LipofectamineLTX (Life Technologies). 24 hours after introduction, a cell lysis sample was obtained using Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kit (Life Technologies, Inc.).
  • the binding between mRNA and protein was confirmed by immunoprecipitation. That is, the amount of mRNA that was precipitated by precipitating mRNA that bound to these proteins and formed a complex using an antibody against PABP or eIF4E was used as an indicator of protein binding. Specifically, anti-PABP antibody (Abcam, catalog number ab21060) and anti-eIF4E antibody (Santacruz, catalog number sc-13963) were used as antibodies. In the immunoprecipitation reaction, the antibody and the protein were bound by incubating at 4 ° C. for 30 minutes using Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kit (Life Technologies).
  • RNA was collected using RNeasy® Mini® Kit (QIAGEN), and cDNA was prepared from mRNA contained in the total RNA by RevertraAce® qPCR® RT® Master® Mix® with “gDNA® Remover® (TOYOBO)”.
  • the amount of GLuc® mRNA that bound to the protein and precipitated was quantified by quantitative polymerase chain reaction (quantitative PCR) using ABI® Prism® 7500® Sequence® Detector® (Applied® Biosystems). As primers, forward primer: 5'-TTGAACCCAGGAATCTCAGG-3 'and reverse primer: 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3' were used. And the amount of mRNA in the case of poly A length 120 was set to 1, and the quantitative result was standardized. The result was as shown in FIG.
  • FIG. 2A explains the result of binding of mRNA to PABP.
  • mRNA having A (240) ie, poly A length is 240 bases
  • mRNA having A (120) ie, poly A length is 120 bases
  • mRNA with A (360) bound more PABP than mRNA with A (240). From this, it was confirmed that mRNA having a long poly A length can be advantageously bound to PABP.
  • FIG. 2B mRNA with A (240) was shown to bind significantly more eIF4E than mRNA with A (120) or A (360). It was revealed that a specific length of poly A was suitable for binding to eIF4E, suggesting that too long poly A may inhibit binding to eIF4E.
  • PABP is known to bind to poly A of mRNA, and the result that it binds favorably to mRNA having a long poly A was an expected result. Since eIF4E was also thought to bind to polyA of mRNA via PABP, it was similarly expected to bind favorably to mRNA with long polyA. However, according to the above results, eIF4E binds strongly to mRNA having a specific length of poly A (specifically, mRNA having A (240)), while A (120) or A (360) It was shown to bind significantly more strongly than mRNA with That is, in the mRNA having A (360), the binding to eIF4E was unexpectedly weakened despite the strong binding to PABP.
  • Example 3 Translation efficiency of protein from mRNA in vitro
  • the translation efficiency of protein from the obtained mRNA was examined.
  • Huh7 cells were seeded in a 96-well plate at 5,000 cells / well and cultured for 24 hours.
  • DMEM containing 10% FBS was used as the medium.
  • 190 ng of GLuc mRNA having various lengths of poly A purified in Example 1 was introduced into Huh7 cells using the gene introduction reagent Lipofectamine LTX (Life technologies). Further, as a control, mRNA to which poly A was enzymatically added using a poly A addition signal was prepared.
  • the pSP73-Luc plasmid obtained in Example 1 was digested with the restriction enzyme NdeI.
  • Quantification was performed based on the amount of luminescence from luciferase. Specifically, the amount of luciferase luminescence from each mRNA was measured with GloMax TM 96 microplate luminometer (Promega) using Renilla® Luciferase assay system (Promega). The amount of luminescence was determined as relative luciferase units (RLU). The result was as shown in FIG.
  • mRNA having A (120), A (180) or A (210) showed almost the same level of protein expression.
  • mRNA with A (240) showed significantly higher levels of protein expression compared to these. This increase in expression was statistically significant.
  • mRNA with A (270) or A (360) was statistically significantly lower in protein expression compared to mRNA with A (240). From this result, it was revealed that when the poly A length is 240, the protein expression is significantly enhanced as compared with the case where the poly A length is 210 or 270. And that the translation efficiency was remarkably reduced by mRNA having A (27) suggests that poly A having 270 bases or more has an activity to inhibit translation.
  • MRNA with A (90) showed the same level of protein expression as mRNA with A (120) (data not shown).
  • AATAAA poly A addition signal
  • the control only an RLU equivalent to mRNA having A (360) was shown. That is, the expression level of the target protein from the mRNA having A (240) far exceeded the expression level from the mRNA with poly A added enzymatically similar to natural mRNA.
  • a (180), A (210), A (240), A (270), and A (360) include a restriction enzyme site-derived intervening sequence (GAUG sequence) between poly A and poly A. .
  • GAUG sequence a restriction enzyme site-derived intervening sequence between poly A and poly A.
  • a (120) and A (60) -GAUG-A (60) were prepared in the same manner as described above, and the expression levels were compared.
  • a (60) -GAUG -A (60) showed an expression level of about 80% of A (120), and it was revealed that the influence of the intervening sequence was limited (data not shown).
  • Example 4 Efficiency of protein translation from mRNA in vivo
  • the expression efficiency of luciferase protein in mouse skeletal muscle was examined.
  • the NLuc mRNA having A (120), A (240) or A (360) obtained in Example 1 was used. For administration, it was encapsulated in a nanomicelle type carrier (PLoS One 8 (2): e56220, 2013) encapsulating mRNA. Specifically, as the block copolymer constituting the nano micelle, the number average molecular weight of the PEG block portion is 12,000, and the number average degree of polymerization of the Asp (DET) block portion is 65. PEG-PAsp (DET) was used. PEG-PAsp (DET) is a copolymer of a polyethylene glycol block and a polyaspartic acid derivative block.
  • the aspartic acid derivative has a carboxyl group with a diethyltriamine group (-NH-CH 2 -CH 2 -NH-CH 2 Aspartic acid substituted with —CH 2 —NH 2 ).
  • PEG-PAsp (DET) and mRNA were each dissolved in 10 mM HEPES buffer, and both were mixed to prepare a nanomicelle solution.
  • a nano micelle solution having an N / P ratio of 8 was prepared by setting the molar ratio of the amino group (N) of PEG-PAsp (DET) to the phosphate group (P) of mRNA as the N / P ratio.
  • mice were administered to the lower limb skeletal muscles of mice by the hydrodynamics method. Specifically, after anesthetizing the mouse with 3% isoflurane (Abbott Japan), a tourniquet was placed in the proximal part of the thigh to temporarily block the circulation of the lower limbs. Then, 300 ⁇ L of a nano micelle solution containing 5 ⁇ g of mRNA was administered over 5 seconds from the great saphenous vein behind the ankle condyle, and the tourniquet was removed 5 minutes later.
  • the amount of luciferase protein expressed in skeletal muscle 72 hours after administration was quantified. Specifically, the lower limb skeletal muscle 72 hours after administration was collected, and the tissue was homogenized using a multi-bead shocker (Yasui Kikai). The luciferase protein was quantified based on the amount of light emitted from the lucifer back. The amount of luminescence was quantified using a Nano-GLoiferLuciferase assay system (Promega) and a Lumat LB9507 luminometer (Berthold), and the amount of luminescence was standardized by the protein concentration in the cell lysate.
  • the mRNA having A (240) showed a protein expression at a significantly higher level than the mRNA having A (120) or A (360).
  • Example 5 Treatment of Sciatic Nerve Injury Model Mice
  • IGF-1-expressing mRNAs having different lengths of poly A were administered to sciatic nerve injury model mice to confirm the therapeutic effect.
  • the left sciatic nerve of the mouse (Balb / c albino mouse, female, 10-14 weeks old, purchased from Charles River Laboratories) was exposed near the greater trochanter and the sciatic nerve exposed with tweezers cooled with liquid nitrogen A sciatic nerve injury model mouse was prepared by compression.
  • PEG-poly N ′-[N- (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] -aspartic acid is prepared by adding polyA having a length of 120 or 240 bases to the 3′UTR region of IGF-1 expressing mRNA.
  • a block copolymer PEG-PAsp (DET)
  • PEG-PAsp (DET) was prepared according to a conventional method (see ChemMedChem 1 (2006) 439-444). From the H 1 -NMR measurement, the number average molecular weight of the PEG moiety was estimated to be 12,000, and the degree of polymerization of the PAsp (DET) moiety was estimated to be 69. The resulting PEG-PAsp (DET) block copolymer and mRNA are dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), respectively, and the resulting solution is mixed to form polyion complex micelles for administration. I let you.
  • the obtained micelles were intravenously administered to the foot of the above disease model to allow the micelles to penetrate into the muscle tissue.
  • the motor function of the mice was evaluated from day 7 to day 28 after administration.
  • the motor function of sciatic nerve injury model mice administered with luciferase mRNA instead of IGF-1 was evaluated.
  • SFI Sciatic Functional Index
  • the footprint was acquired using a gait analyzer Catwalk (Noldus). EPL, NPL, EPW, and NPW are as described in the above formula, but are also illustrated in FIG. 6B. Ideally, when the foot is 100% paralyzed, SFI indicates -100, when normal, it indicates 0, and an increase in SFI value indicates recovery of the motor function of the foot.

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Abstract

　本発明は、タンパク質発現を向上させる方法およびタンパク質発現用組成物を提供する。　目的タンパク質を発現させることに用いるための組成物であって、組成物は、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、組成物中に含まれるｍＲＮＡの８０％以上が、そのタンパク質コード領域の３'末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有する、組成物。

Description

タンパク質発現を向上させる方法およびタンパク質発現用組成物 関連出願の参照
　本願は、２０１４年４月２４日に出願された日本国特許出願第２０１４－０９０６３４号の優先権の利益を享受するものであり、この内容の全体は引用することにより本願明細書に取り込まれる。
　本発明は、タンパク質発現を向上させる方法およびタンパク質発現用組成物に関する。
　生理活性物質としてタンパク質は極めて有望である。例えば、特定のタンパク質が減少することにより生じる疾患の治療において、タンパク質の補充療法は効果を示す。従って、これまでに、タンパク質を大量に細胞内で、または細胞外で生産する技術が開発されている。
　タンパク質は、タンパク質をコードするＤＮＡからのｍＲＮＡへの転写と、ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳により生産される。ＤＮＡからのｍＲＮＡの転写には、転写調節因子が関与しており、転写調節によりｍＲＮＡの産生量を制御している。一方、ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳は、ｍＲＮＡへの翻訳開始因子の会合などにより制御されていると考えられている。また、ｍＲＮＡは、細胞内では不安定であり、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに付加されるポリＡによりその安定性が変動することが知られている。
　ポリＡは、通常はポリＡ付加シグナルにより、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに付加される。具体的には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりＤＮＡからｍＲＮＡが転写されると、切断・ポリアデニル化因子（ＣＰＳＦ）を含む複合体がｍＲＮＡの３’ＵＴＲのポリＡ付加シグナル領域を認識してシグナルの１０～３０塩基下流でｍＲＮＡを開裂させ、開裂部位からポリＡ化を開始させる。そして、ポリＡが１００～３００塩基程度になるとポリＡの合成を終了すると考えられている（非特許文献１）。しかしながら、ポリＡの合成は厳密には制御されてない。
　ポリＡの長さは、ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳量に関係すると考えられている。例えば、非特許文献２は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに付加されるポリＡの長さが１２０塩基のときにｍＲＮＡの翻訳効率が高まったことを開示する。しかしながら、制御された長さのポリＡを合成することは困難であり、この研究はこれ以上の進展を見せていない。現在では、ポリＡ付加シグナル領域に基づいて酵素的にポリＡをｍＲＮＡに付加しているのが実情である。そして、発現量の制御はプロモーターの選択により行い、プロモーター配列を工夫してタンパク質の発現を高めた発現ベクターが様々市販されるに至っている。
E. Wahle, Journal of Biological Chemistry, 270: 2800-2808, 1995 Holtkamp et al., Blood, 108: 4009-4017, 2006
　本発明は、タンパク質発現を向上させる方法およびタンパク質発現用組成物を提供する。
　本発明者らは、ポリＡ長が一定の範囲の長さであるｍＲＮＡが真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）との結合を顕著に高めることを見出した。本発明者らはまた、ポリＡ長が一定の範囲の長さであるｍＲＮＡが顕著に高い翻訳効率を示すことを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）目的タンパク質を発現させることに用いるための組成物であって、
　組成物は、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、
組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上が、そのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有する、
組成物。
（２）組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの９０％以上が、そのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有する、上記（１）に記載の組成物。
（３）組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの９５％以上が、そのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有する、上記（１）に記載の組成物。
（４）組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの２０％以下が、２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡである、上記（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）タンパク質発現ベクターであって、
　プロモーターと作動可能に連結したタンパク質をコードする遺伝子と、
タンパク質をコードする遺伝子のタンパク質コード領域の下流に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列と
を含んでなる、タンパク質発現ベクター。
（６）ｍＲＮＡのｅＩＦ４Ｅへの結合能を向上させる方法であって、
　ｍＲＮＡがそのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有するように、ｍＲＮＡが転写されるＤＮＡのタンパク質コード領域の下流にポリＡまたは実質的にポリＡからなる配列を付加すること
を含んでなる、方法。
（７）標的タンパク質を対象の体内細胞で発現させる方法であって、
標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなる組成物であって、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、組成物を提供することと、
組成物を対象に投与することと
を含んでなる、方法。
（８）疾患に罹患した対象または障害を有する対象において該疾患または障害を処置することに用いるための医薬組成物であって、その疾患または障害を治療することができるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、医薬組成物。
（９）疾患または障害が、タンパク質の低減または欠乏を原因とする疾患または障害であり、その疾患または障害を治療することができるタンパク質が、対象において低減または欠乏しているタンパク質である、上記（８）に記載の組成物。
（１０）疾患または障害が、脊髄損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である、上記（８）に記載の組成物。
（１１）疾患または障害が、末梢神経損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質が、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）である、上記（８）に記載の組成物。
図１は、精製したｍＲＮＡの電気泳動写真である。 図２は、図に記載のタンパク質へのｍＲＮＡの結合量に対するポリＡ長の効果を示す図である。 図３は、培養細胞におけるポリＡ長と翻訳効率の関係を示す図である。 図４は、無細胞抽出系におけるポリＡ長と翻訳効率の関係を示す図である。図４Ａは、ヒト無細胞抽出系における結果を示し、図４Ｂは、ウサギ網状赤血球溶解液における結果を示す。 図５は、インビボにおけるポリＡ長と翻訳効率の関係を示す図である。 図６は、坐骨神経損傷モデルの治療効果に対するポリA長の影響を示す図である。
発明の具体的な説明
　本発明では、「ｍＲＮＡ」とは、メッセンジャーＲＮＡを意味する。ｍＲＮＡは好ましくは真核生物に由来する。真核生物としては、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、カイコなどの昆虫、およびヒトなどの哺乳類が挙げられる。真核生物は、より好ましくは、大腸菌、酵母、カイコまたはヒトである。ｍＲＮＡは、生体内では、ＤＮＡからの転写により産生される。転写が終了するとｍＲＮＡの３’末端にはポリＡが付加される。ｍＲＮＡにおいて、通常は、タンパク質コード領域（ＣＤＳ）とポリＡの間には３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が介在する。
　本明細書で用いられる「タンパク質コード領域」とは、ＤＮＡ上でタンパク質をコードする領域、およびＲＮＡ上でタンパク質をコードする領域を意味する。また、「タンパク質コード領域の３’末端側」とは、ｍＲＮＡにおいて、タンパク質コード領域の外の領域であって３’末端側の領域を意味し、好ましくは、３’ＵＴＲのさらに外側の領域であり、３’ＵＴＲの３’末端を意味することがある。
　本明細書で用いられる「上流」とは、遺伝子のタンパク質コード領域からみて遺伝情報が読み取られる方向とは逆側に存在する領域を意味する。本明細書で用いられる「下流」とは、遺伝子のタンパク質コード領域からみて遺伝情報が読み取られる方向に存在する領域を意味する。
　本明細書では、「ポリＡ」とは、アデニンが重合してなるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本明細書では、「実質的にポリＡからなる配列」は、該配列の全塩基の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは１００％がアデニン（Ａ）からなることを意味する。すなわち、実質的にポリＡからなる配列には、アデニン（Ａ）以外の塩基が含まれていてもよい。実質的にポリＡからなる配列では、アデニン（Ａ）以外の塩基は、例えば、３箇所以内、好ましくは２箇所以内、より好ましくは１箇所以内の領域に集中して存在する。実質的にポリＡからなる配列では、アデニン（Ａ）以外の塩基は、例えば、制限酵素切断部位である。
　本明細書では、「プロモーター」とは、ＤＮＡ上に存在するｍＲＮＡの転写制御領域を意味する。本発明では、「プロモーター」としては、インビトロ転写系のプロモーターおよび真核生物のプロモーターを用いることができる。インビトロ転写系のプロモーターとしては、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーターが挙げられ、本発明で用いられ得る。真核生物のプロモーターとしては、大腸菌などの細菌のプロモーターおよび哺乳動物のプロモーターが挙げられ、宿主細胞に合せて適宜選択して本発明で用いることができる。大腸菌用のプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーターおよびＴ７ｌａｃプロモーターが挙げられる。哺乳動物用のプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターなどのβアクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーターおよびＳＲαプロモーターが挙げられる。本明細書では、「ターミネーター」とは、転写の終結シグナルのことを意味する。
　生体内における通常のｍＲＮＡの翻訳時のポリＡ化の工程を説明すると、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりＤＮＡからｍＲＮＡが転写されると、切断・ポリアデニル化因子（ＣＰＳＦ）を含む複合体がｍＲＮＡの３’ＵＴＲのポリＡ付加シグナル領域を認識してシグナルの下流でｍＲＮＡを開裂し、開裂部位からポリＡ化を開始させると考えられている。
　ポリＡ鎖は、ポリＡ結合タンパク質の結合部位として機能し、ｍＲＮＡの核外への輸送を促進する。また、ポリＡ鎖は、細胞質においてｍＲＮＡをその分解から守る役割を有する。また、これにより、ポリＡ鎖は、タンパク質への翻訳効率の向上に寄与する。
　ｅＩＦ４Ｅは、真核生物翻訳開始因子４Ｅとも呼ばれ、ｍＲＮＡの翻訳制御において重要な役割を担う。ｅＩＦ４Ｅは、ｍＲＮＡの５’キャップ構造の認識に関与し、また、ｅＩＦ４ＧおよびポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）を介して、ｍＲＮＡを環状化する役割を果たす。
　本発明者らは、長いポリＡを有するｍＲＮＡはＰＡＢＰとより強く結合する一方で、ｍＲＮＡとｅＩＦ４Ｅとの複合体形成は、ポリＡ長が特定の長さ（具体的には２４０塩基）であるときに顕著に促進されることを見出した。また、ポリＡ長が一定値を超えると、ＰＡＢＰへの結合が強まる一方で、ｅＩＦ４Ｅとの結合は弱まった。ｅＩＦ４Ｅは、ＰＡＢＰを介してｍＲＮＡのポリＡと結合する（または複合体を形成する）と考えられているため、ｍＲＮＡとＰＡＢＰとの結合が強まる長いポリＡを有するｍＲＮＡにおいて、ｅＩＦ４Ｅとの結合が弱まるという結果は、非常に驚くべきものであった。
　また、本発明によれば、ｍＲＮＡのポリＡ長は２１０塩基以下の場合および２７０塩基以上の場合には、２４０塩基の場合と比較して、翻訳効率が顕著に低下した。従って、本発明においては、ｍＲＮＡのポリＡ長は一定の長さに制御されることが好ましい。ここでいう「一定の長さ」とは、例えば、２２０～２６０塩基であり、好ましくは２２５～２５５塩基であり、特に好ましくは２３０～２５０塩基であり、さらに好ましくは２３０～２４５塩基であり、さらにより好ましくは２３５～２４５塩基である。また、ある態様では、２７０塩基以上のポリＡを有するｍＲＮＡは組成物中からその量が低減されているか除去されている。
　ポリＡ付加シグナルを除去するとポリＡ長の制御が容易になる。従って、本発明のある態様では、ｍＲＮＡは、ポリＡ付加シグナルを有さない。また、本発明のある態様では、ｍＲＮＡを転写するＤＮＡは、そのタンパク質コード領域とそのターミネーターとの間にポリＡ付加シグナルを有さない。またある特定の態様では、ｍＲＮＡを転写するＤＮＡは、そのタンパク質コード領域とそのターミネーターとの間にポリＡ付加シグナルを有さず、代わりに一定の長さの実質的にポリＡからなる配列を有する。
　　本発明者らは、ｍＲＮＡが一定の長さのポリＡを有するときに、ｅＩＦ４Ｅへの結合能を向上させることを明らかにした。従って、本発明のある側面では、ｍＲＮＡのｅＩＦ４Ｅへの結合能を向上させる方法であって、ｍＲＮＡがそのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さの実質的にポリＡからなる配列を有するように、ｍＲＮＡが転写されるＤＮＡのタンパク質コード領域の下流にポリＡまたは実質的にポリＡからなる配列を付加することを含んでなる、方法が提供される。ある好ましい態様では一定の長さは、２３０～２５０塩基である。
　ｍＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりＤＮＡ上の転写開始領域からターミネーターの間の領域が転写されて得られる。従って、ポリＡまたは実質的にポリＡからなる配列は、ＤＮＡのタンパク質コード領域とターミネーターの間に挿入することができる。
　本発明のｍＲＮＡのｅＩＦ４Ｅへの結合能を向上させる方法は、ポリＡ付加シグナルを除去することをさらに含んでいてもよい。ポリＡ付加シグナルは、代表的にはＡＡＴＡＡＡ（またはＡＡＵＡＡＡ）であり、当業者であればポリＡ付加シグナルを容易に除去することができる。ポリＡ付加シグナルは、ＣＤＳとターミネーターとの間の領域、または３’ＵＴＲに含まれるので、これらの領域の一部または全部を除去することによっても除去することができる。
　本発明のｍＲＮＡのｅＩＦ４Ｅへの結合能を向上させる方法は、ある態様では、２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡを低減するまたは除去することをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、２１０塩基長以下のポリＡを有するｍＲＮＡを低減するまたは除去することをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、２１０塩基長以下および２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡを低減するまたは除去することをさらに含んでいてもよい。
　発明者らは、ｍＲＮＡのポリＡ長が２４０塩基のときに顕著に翻訳効率を向上させることを明らかにした。そして、その翻訳効率は、ポリＡ長が２１０塩基であるｍＲＮＡやポリＡが２７０塩基であるｍＲＮＡの効率を大きく超えた。従来は、ポリＡは長ければ長いほど安定であり翻訳効率が高まると考えられていたため、ｍＲＮＡの翻訳効率が、ポリＡ長が特定の極めて狭い範囲で、しかも顕著に上昇することは、予想外のことであった。
　従って、本発明のある側面では、目的タンパク質を発現させることに用いるための組成物であって、組成物は、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上（分子数比であり、以下同様）、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％が、そのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡからなる配列を有する、組成物が提供される。上述の通り、ｍＲＮＡのポリＡ長は一定の長さに制御されることが好ましい。ｍＲＮＡの分子数比（％）は、当業者に周知の方法により求めることができる。分子数比は、例えば、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを電気泳動し、電気泳動パターンから求めることができる。また、ＲＮＡ分析用マイクロチップによる定量性に優れた電気泳動法も開発されており、ｍＲＮＡの分子数比の算出に用いることができる。
　本発明の組成物は、ある態様では、組成物中に含まれる目的タンパク質をコードするｍＲＮＡの２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、さらにより好ましくは３％以下、取分け好ましくは１％以下が２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡであり、最も好ましくは２７０塩基長以上のポリＡを有する目的タンパク質をコードするｍＲＮＡは組成物中に実質的に含まれない。本発明の組成物は、ある態様では、組成物中に含まれる目的タンパク質をコードするｍＲＮＡの２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、さらにより好ましくは３％以下、取分け好ましくは１％以下が、２１０塩基長以下のポリＡを有するｍＲＮＡであり、最も好ましくは２１０塩基長以下のポリＡを有する目的タンパク質をコードするｍＲＮＡは組成物中に実質的に含まれない。本発明のある態様では、組成物中に含まれる目的タンパク質をコードするｍＲＮＡの２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、さらにより好ましくは３％以下、取分け好ましくは１％以下が２１０塩基長以下および２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡであり、最も好ましくは２１０塩基長以下または２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡは組成物中に実質的に含まれない。
　天然に生じるｍＲＮＡまたはポリＡ付加シグナルによりポリＡが付加されて生じるｍＲＮＡは、ポリＡの長さが広範な範囲に分布する。一方で、本発明の組成物は、組成物中に含まれる目的タンパク質をコードするｍＲＮＡに対してポリＡ長が一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）であるｍＲＮＡを８０％以上含むものであり、ポリＡ長が一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）であるときには翻訳効率が顕著に高まるため、翻訳効率の観点からは極めて有利である。本発明の好ましい態様では、組成物中に含まれる目的タンパク質をコードするｍＲＮＡの９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、取分け好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％がそのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡからなる配列を有する。本発明のある態様では、ｍＲＮＡはポリＡ付加シグナルを有さない。
　本発明の組成物は、１種類のｍＲＮＡを含むものであっても、複数種類のｍＲＮＡの混合物であってもよい。本発明の組成物は、様々な長さのポリＡを有するｍＲＮＡの混合物であってもよい。本発明の組成物は、ｍＲＮＡ以外に緩衝液等の担体または賦形剤を含んでいてもよい。本発明の組成物は、ｍＲＮＡ送達用のキャリアを含んでいてもよい。
　本発明の組成物は、インビトロまたはインビボの細胞にタンパク質を発現させるために用いることができる。本発明の組成物はまた、無細胞抽出系などのインビトロトランスレーション系でタンパク質を発現させるために用いることができる。
　本発明のある側面では、タンパク質発現ベクターであって、プロモーターと作動可能に連結したタンパク質をコードする遺伝子と、タンパク質をコードする遺伝子のタンパク質コード領域の下流に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡからなる配列とを含んでなる、タンパク質発現ベクターが提供される。本発明のタンパク質発現ベクターは、３’ＵＴＲ領域に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡからなる配列が付加したｍＲＮＡを製造することに用いられる。本発明のある態様では、ＣＤＳとターミネーターとの間の領域にポリＡ付加シグナルを有さない。
　本発明のある側面では、標的タンパク質を対象の体内細胞で発現させる方法であって、　標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなる組成物であって、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、組成物を提供することと、
組成物を対象に投与することと
を含んでなる、方法が提供される。
　本発明の標的タンパク質を対象の体内細胞で発現させる方法では、ある態様では、２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡを低減するまたは除去することをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、２１０塩基長以下のポリＡを有するｍＲＮＡを低減するまたは除去することをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、２１０塩基長以下および２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡを低減するまたは除去することをさらに含んでいてもよい。
　本発明のさらなる側面では、疾患に罹患した対象または障害を有する対象において該疾患または障害を処置する方法であって、その疾患または障害を治療することができるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなる組成物を該対象に投与することを含んでなり、組成物は、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、方法が提供される。
　本発明の疾患または障害を処置する方法のある特定の態様では、疾患または障害は、末梢神経損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）である。本発明のある特定の態様では、末梢神経損傷は、坐骨神経損傷であり得る。ＩＧＦ－１は、例えば、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡの筋内投与により、筋肥大効果（または筋萎縮防止効果）を発揮すると共に、神経再生促進作用を有し、損傷した神経の再生を促進し、対象の運動機能の回復を可能とする。
　本発明の疾患または障害を処置する方法の別のある特定の態様では、疾患または障害は、脊髄損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。ＢＤＮＦは、例えば、ＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡのくも膜下腔内投与により、脊髄損傷後の神経機能回復を促進する。
　本発明の疾患または障害を処置する方法の別のある特定の態様では、疾患または障害は、タンパク質の低減または欠乏を原因とする疾患または障害であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、該疾患または障害において低減または欠乏しているタンパク質である。すなわち、この特定の態様は、タンパク質の補充療法である。本発明の疾患または障害を処置する方法の別のある特定の態様では、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、分泌性因子または分泌因子の産生を促進する促進因子であり、疾患または障害は、分泌因子の低減または欠乏を原因とする疾患または障害である。
　本発明のさらなる側面では、本発明の疾患または障害を処置する方法に用いるための医薬組成物が提供される。すなわち、本発明によれば、疾患に罹患した対象または障害を有する対象において該疾患または障害を処置することに用いるための医薬組成物であって、その疾患または障害を治療することができるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物の特定の態様では、疾患または障害は、末梢神経損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）である。本発明のある特定の態様では、末梢神経損傷は、坐骨神経損傷であり得る。本発明の医薬組成物の別の特定の態様では、疾患または障害は、脊髄損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。
　本発明の医薬組成物の別の態様では、タンパク質の低減または欠乏を原因とする疾患または障害を処置および／または予防するための医薬組成物であって、該タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、ある特定の態様では、タンパク質は分泌因子である。
　本発明のさらなる側面では、疾患に罹患した対象または障害を有する対象において該疾患または障害を処置することに用いるための医薬組成物の製造における、その疾患または障害を治療することができるタンパク質をコードし、かつ、タンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡ配列からなる配列を有するｍＲＮＡの使用に関する。本発明のある特定の態様では、疾患に罹患した対象または障害を有する対象において該疾患または障害を処置することに用いるための医薬組成物の製造における、その疾患または障害を治療することができるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなる組成物の使用であって、該組成物は、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に一定の長さ（例えば、２３０～２５０塩基）の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、使用が提供される。本発明の使用の特定の態様では、疾患または障害は、末梢神経損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）である。本発明のある特定の態様では、末梢神経損傷は、坐骨神経損傷であり得る。本発明の使用の別の特定の態様では、疾患または障害は、脊髄損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。本発明の使用の別の態様では、疾患または障害は、タンパク質の低減または欠乏を原因とする疾患または障害であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、該疾患または障害において低減または欠乏しているタンパク質である。本発明の使用の特定の態様では、タンパク質は分泌性因子である。
　本発明の医薬組成物は、１種類のｍＲＮＡを含むものであっても、複数種類のｍＲＮＡの混合物であってもよい。本発明の医薬組成物は、様々な長さのポリＡを有するｍＲＮＡの混合物であってもよい。本発明の医薬組成物は、ｍＲＮＡ以外に緩衝液等の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含んでいてもよい。本発明の組成物は、ｍＲＮＡ送達用のキャリアを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、例えば、非経口投与により投与されうる。非経口投与としては、特に限定されないが、例えば、筋肉内投与、心室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、脳室内投与、眼内投与、皮下投与、鼻腔内投与、膣内投与およびくも膜下腔内投与が挙げられ、これにより本発明で医薬組成物を投与することができる。本発明の医薬組成物は、ある態様では、注射剤として提供される。本発明の医薬組成物は、その疾患や障害に応じて適切な投与形態により、全身投与または局所投与することができる。
　本明細書で用いられる「治療」とは、疾患または障害を治癒、予防若しくは寛解、または、疾患または障害の進行速度の低下をもたらすことを意味する。治療は、治療上有効な量の医薬組成物を投与することにより達成され得る。
　本明細書で用いられる「対象」とは、好ましくはヒト対象またはヒト患者である。
　本発明の組成物または医薬組成物は、ある態様では、組成物中で、ｍＲＮＡがＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とポリイオンコンブレックスを形成している。ここで、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とは、ポリエチレングリコールブロックとポリアスパラギン酸誘導体ブロックとの共重合体をいう。本発明で用いられるＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）において、ＰＥＧは、平均重合度５～２００００、好ましくは１０～５０００、より好ましくは４０～５００であるが、ブロックコポリマーとｍＲＮＡとのポリイオンコンプレックス形成が阻害されない限り、ＰＥＧ含有量の重合度は限定されない。本発明で用いられるＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）において、ある態様では、アスパラギン酸誘導体は、側鎖のカルボキシル基がジエチルトリアミン（ＤＥＴ）基（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ２）で置換されたアスパラギン酸である。ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）の構造は以下の化学式で示される。
ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　｛式中、
　Ｒ１は、水酸基、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）２－ＮＨ２で表される基であり、
　　ｎは、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　　ｍは、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　　ｍ＋ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、例えば、２～５００のいずれかの整数であり、
　　ｎ－ｍは、０以上の整数であり、
　式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示しているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、
　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している。｝なお、上記一般式（Ｉ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。
実施例１：タンパク質発現プラスミドの構築
　本実施例では、異なる長さのポリＡ配列をｍＲＮＡのタンパク質コード領域の下流に有するプラスミドを構築した。
　ルシフェラーゼ遺伝子としては、GLuc遺伝子(動物種Gaussia princeps由来)と NLuc遺伝子(動物種Oplophorus gracilirostris由来)を用い、それぞれpCMV-GLuc Control Plasmid（New England Biolabs社、カタログ番号 N8081S）およびpNL1.1[NLuc] Vector（Primega社、カタログ番号N1001）から制限酵素HindIIIとXbaIにより切り出した。各ルシフェラーゼ遺伝子は、pSP73ベクター（Promega社、カタログ番号P2221）が持つT7プロモーターの制御下のマルチクローニングサイト中のHindIIIとXbaIの切断サイトにクローニングした。得られたプラスミドをpSP73-Lucプラスミドと呼ぶ。
　その後、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にインフレームでポリＡ配列（１２０、１８０、２１０、２４０、２７０または３６０塩基長）を組み込んだ。ポリＡ鎖配列の作製には、オリゴＤＮＡを使用した。具体的には以下の通りである。
１－１．１２０塩基鎖長のポリＡを有するプラスミドの作製
　5’-AATTC-A121-GAGACGA-3’と5’-GATCTCGTCTC-T121-G-3’ の２つのオリゴＤＮＡをアニールし、２本鎖ＤＮＡを作製した後、制限酵素EcoRIとBglIIを用いて直鎖状化したpSP73-Lucプラスミドに挿入し、１２０塩基鎖長のポリＡ（Ａ（１２０））を有するプラスミドを作製した。上記配列中、Ａｎは、アデニンがｎ塩基長にわたり存在していることを示し、例えば、Ａ１２１は、アデニンが１２１塩基長にわたり連続することを意味する。
１－２．１８０、２１０または２４０塩基鎖長のポリＡを有するプラスミドの作製
　5’-AATTC-A120-GATATCA-3’と5’-GATCTGATATC-T120-G-3’ の２つのオリゴＤＮＡから作製した２本鎖ＤＮＡを、制限酵素EcoRIとBglIIで直鎖状化したpSP73-Lucプラスミドに挿入し、１２０塩基長のポリＡを有し、かつ制限酵素EcoRV認識配列を含むpSP73-GLuc-A(120)-EcoRVプラスミドを作製し、次いで得られたプラスミドを制限酵素EcoRVとBglIIで直鎖状化した。その後、得られたプラスミドの制限酵素部位に、さらに5’-G-AX-GAGACGA-3’と5’-GATCTCGTCTC-TX-C-3’（ここでｘは、６１、９１または１２１である）の２つのオリゴＤＮＡから作製した２本鎖ＤＮＡをそれぞれ挿入し、各１８０，２１０または２４０塩基鎖長のポリＡを有するプラスミドを作製した。
１－３．２７０または３６０塩基鎖長のポリＡを有するプラスミドの作製
　5’-G-A120-GATATCA-3’と5’-GATCTGATATC-T120-C-3’ の2つのオリゴDNAから作製した２本鎖ＤＮＡを、制限酵素EcoRVとBglIIで直鎖状化したpSP73-Luc-A(120)-EcoRVプラスミドに挿入し、pSP73-GLuc-A(240)-EcoRVプラスミドを作製した。作製したプラスミドを制限酵素EcoRVとBglIIで直鎖状化した。その後、得られたプラスミドの制限酵素部位に、5’-G-AX-GAGACGA-3’と5’-GATCTCGTCTC-TX-C-3’ （ここでｘは、３１または１２１である） の２つのオリゴＤＮＡから作製した２本鎖ＤＮＡをそれぞれ挿入し、２７０および３６０塩基鎖長のポリＡを有するプラスミドを作製した。
　以下、得られたプラスミドを「ｐＳＰ７３－Ｌｕｃ－Ａ（ポリＡの塩基長）」と表記する。例えば、ポリＡ配列が１２０塩基長のものは、ｐＳＰ７３－Ｌｕｃ－Ａ（１２０）と表記される。
　このタンパク質発現プラスミドを常法により大腸菌内で複製し、その後精製して以降の実施例で用いた。
実施例２：ｍＲＮＡのタンパク質結合能
　本実施例では、ｍＲＮＡのタンパク質への結合能を確認した。
　１２０、１８０または２１０塩基鎖長のポリＡを有するプラスミドは、typeIIS型制限酵素BsmBIにより直鎖状のＤＮＡにし、アガロース電気泳動により精製を行った。また、２４０、２７０または３６０塩基鎖長のプラスミドは、２種類の制限酵素BsmBIとHpaIにより直鎖状のＤＮＡにし、アガロース電気泳動により精製を行った。精製された直鎖状ＤＮＡは、T7プロモーター制御下にルシフェラーゼ遺伝子を有する。得られた直鎖状ＤＮＡとmMESSAGE mMACHINE T7Ultra Kit（Ambion社）を用いて、製造者マニュアルに従ってインビトロトランスクリプションによりｍＲＮＡを作製した。得られたｍＲＮＡは、RNeasy Mini Kit（Qiagen社）により精製した。精製されたｍＲＮＡのアガロース電気泳動の結果は図１に示される通りであった。図１には、Ａ（１２０）、Ａ（２４０）およびＡ（３６０）を有するｍＲＮＡの電気泳動の結果を示す。
　核内タンパク質と結合したｍＲＮＡは、以下のように得た。すなわち、Ｈｕｈ７細胞は、９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種し２４時間培養した。培地としては１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いた。実施例１で精製した様々な長さのポリＡを有するGLuc mRNA１９０ｎｇを遺伝子導入試薬LipofectamineLTX（Life tecnologies社）を用いてＨｕｈ７細胞に導入した。導入２４時間後に、Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kit( Life tecnologies社)を使用し細胞溶解サンプルを得た。
　ｍＲＮＡとタンパク質との結合は、免疫沈降法により確認した。すなわち、ＰＡＢＰまたはｅＩＦ４Ｅに対する抗体を用いてこれらのタンパク質と結合して複合体を形成したｍＲＮＡを沈降させて沈降したｍＲＮＡの量をタンパク質との結合の指標とした。具体的には、抗体は、抗ＰＡＢＰ抗体（Abcam社, カタログ番号ab21060）および抗ｅＩＦ４Ｅ抗体（Santacruz社, カタログ番号sc-13963）を使用した。免疫沈降反応は、Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kit（Life tecnologies社）を用いて、４℃で３０分間インキュベートすることにより、抗体とタンパク質を結合させた。その後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いて全ＲＮＡを回収し、RevertraAce qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO社) により全ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
　タンパク質に結合して沈降したGLuc mRNA量は、ABI Prism 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems)を用いて、定量ポリメラーゼ連鎖反応（定量ＰＣＲ）により定量を行った。プライマーは、フォワードプライマー：5’-TTGAACCCAGGAATCTCAGG-3’とリバースプライマー：5’-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3’を用いた。そして、ポリＡ長１２０の場合のｍＲＮＡ量を１として定量結果を標準化した。その結果は図２に示される通りであった。
　図２ＡによりｍＲＮＡのＰＡＢＰへの結合結果を説明する。図２Ａに示されるように、Ａ（２４０）（すなわち、ポリＡ長が２４０塩基）を有するｍＲＮＡは、Ａ（１２０）（すなわち、ポリＡ長が１２０塩基）を有するｍＲＮＡよりも顕著にＰＡＢＰに結合した。また、Ａ（３６０）を有するｍＲＮＡは、Ａ（２４０）を有するｍＲＮＡよりも多くのＰＡＢＰと結合した。このことから、長いポリＡ長を有するｍＲＮＡは、ＰＡＢＰと有利に結合できることが確認できた。
　次に、図２ＢによりｍＲＮＡのｅＩＦ４Ｅへの結合結果を説明する。図２Ｂに示されるように、Ａ（２４０）を有するｍＲＮＡは、Ａ（１２０）またはＡ（３６０）を有するｍＲＮＡよりも顕著に多くのｅＩＦ４Ｅに結合することが示された。特定の長さのポリＡがｅＩＦ４Ｅとの結合に適していることが明らかとなり、長すぎるポリＡは、ｅＩＦ４Ｅとの結合を阻害する可能性が示唆された。
　ＰＡＢＰは、ｍＲＮＡのポリＡに結合することが知られ、長いポリＡを有するｍＲＮＡに有利に結合するとの結果は、予想された結果であった。ｅＩＦ４Ｅも、ＰＡＢＰを介してｍＲＮＡのポリＡに結合すると考えられていたため、同様に、長いポリＡを有するｍＲＮＡに有利に結合すると予想された。しかしながら、上記の結果によれば、ｅＩＦ４Ｅは特定の長さのポリＡを有するｍＲＮＡ（具体的にはＡ（２４０）を有するｍＲＮＡ）に強く結合する一方で、Ａ（１２０）またはＡ（３６０）を有するｍＲＮＡよりも顕著に強く結合することが示された。すなわち、Ａ（３６０）を有するｍＲＮＡでは、ＰＡＢＰとの結合が強いにも関わらず、ｅＩＦ４Ｅとの結合は意外にも弱まった。
実施例３：インビトロでのｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳効率
　本実施例では、得られたｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳効率を調べた。
　Ｈｕｈ７細胞は９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種し２４時間培養した。培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いた。実施例１で精製した様々な長さのポリＡを有するGLuc mRNA 190ngを遺伝子導入試薬LipofectamineLTX( Life technologies社)を用いてＨｕｈ７細胞に導入した。また、対照として、ポリＡ付加シグナルを用いて酵素的にポリＡを付加したｍＲＮＡを調製した。実施例１で得られたpSP73-Lucプラスミドを制限酵素NdeIを用いて切断した。直鎖状になったプラスミドとmMESSAGE mMACHINE T7Ultra Kit（Ambion社）を用いて、製造者マニュアルに従ってインビトロトランスレーションを行ない、ｍＲＮＡを得た。続いて、同製造者マニュアルに従い、得られたｍＲＮＡにポリＡを付加した（反応条件：３７℃４５分）。得られたｍＲＮＡをRNeasy Mini Kit（Qiagen社）により精製し、上記の通りＨｕｈ７細胞に導入した。
　定量は、ルシフェラーゼからの発光量に基づいて行なった。具体的には、Renilla Luciferase assay System（Promega社）を用いてGloMaxTM 96 microplate luminometer （Promega社）により各ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発光量を計測した。発光量を相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として求めた。その結果は、図３に示される通りであった。
　図３に示されるように、Ａ（１２０）、Ａ（１８０）またはＡ（２１０）を有するｍＲＮＡはほぼ同程度のタンパク質発現を示した。しかし、Ａ（２４０）を有するｍＲＮＡは、これらと比較して顕著に高いレベルのタンパク質発現を示した。この発現量の増大は統計的に有意であった。一方で、Ａ（２７０）またはＡ（３６０）を有するｍＲＮＡは、タンパク質の発現は、Ａ（２４０）を有するｍＲＮＡと比較して統計的に有意に低かった。この結果から、ポリＡ長が２４０であるときには、ポリＡ長が２１０または２７０である場合と比較して顕著なタンパク質発現の増強を示すことが明らかとなった。そして、Ａ（２７）を有するｍＲＮＡで翻訳効率が顕著に低下したことは、２７０塩基以上のポリＡが翻訳を阻害する活性を備えたことを示唆する。
　Ａ（９０）を有するｍＲＮＡは、Ａ（１２０）を有するｍＲＮＡと同等レベルのタンパク質発現を示した（データ非掲載）。また、ポリＡの代わりにポリＡ付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有するタンパク質発現プラスミドを用いてルシフェラーゼを発現させる（前記対照）と、Ａ（３６０）を有するｍＲＮＡと同程度のＲＬＵしか示さなかった。すなわち、Ａ（２４０）を有するｍＲＮＡからの目的タンパク質の発現量は、天然のｍＲＮＡと類似する酵素的にポリＡを付加したｍＲＮＡからの発現量を遙かに超えた。
　なお、Ａ（１８０）、Ａ（２１０）、Ａ（２４０）、Ａ（２７０）およびＡ（３６０）は、ポリＡとポリＡの間に制限酵素部位由来の介在配列（ＧＡＵＧ配列）を含むものである。ＧＡＵＧのタンパク質発現に対する影響を確認するために、Ａ（１２０）とＡ（６０）－ＧＡＵＧ－Ａ（６０）を上記と同様に作製して、発現量を比較したところ、Ａ（６０）－ＧＡＵＧ－Ａ（６０）は、Ａ（１２０）の８０％ほどの発現量を示し、介在配列の影響は限定的であることが明らかとなった（データ非掲載）。
　無細胞翻訳系（ウサギ網状赤血球溶解液およびヒト無細胞抽出液）でも同様の結果を確認した。具体的には、ウサギ網状赤血球溶解液としてRabbit Reticulocyte Lysate, Untreated（Promega社）を用いて、またはヒト無細胞抽出液としてHuman Cell-Free Protein Expression System（タカラバイオ社）を用いて、各ポリＡ長を有するGLuc mRNAをそれぞれ３０℃で１２０分間、または３２℃で３０分間インキュベートした。発現量は、ルシフェラーゼからの発光量に基づいて定量した。Renilla Luciferase assay System（Promega社）を用いてGloMaxTM 96 microplate luminometer（Promega社）により各ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発光量を計測した。
　結果は図４にされる通りであった。図４ＡおよびＢに示されるように、Ａ（２４０）を有するｍＲＮＡは、Ａ（１２０）またはＡ（３６０）を有するｍＲＮＡよりも顕著に高いタンパク質発現を示した。従って、無細胞抽出系を用いても、２４０塩基長のポリＡを有するｍＲＮＡの発現量が他の長さのポリＡを有する場合に比べて顕著に高いことが確認された。
実施例４：インビボでのｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳効率
　本実施例では、マウス骨格筋でのルシフェラーゼタンパク質の発現効率を調べた。
　実施例１で得られたＡ（１２０）、Ａ（２４０）またはＡ（３６０）を有するNLuc mRNAを用いた。投与には、ｍＲＮＡを内包するナノミセル型キャリア（PLoS One 8(2): e56220, 2013参照）に内包して投与した。具体的には、ナノミセルを構成するブロック共重合体として、PEGブロック部分の数平均分子量が１２，０００で、かつ、Asp(DET)ブロック部分の数平均重合度が６５のPEG-PAsp(DET)を用いた。PEG-PAsp(DET)は、ポリエチレングリコールブロックとポリアスパラギン酸誘導体ブロックとの共重合体であり、アスパラギン酸誘導体は、カルボキシル基がジエチルトリアミン基（-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2）で置換されたアスパラギン酸である。PEG-PAsp(DET)とｍＲＮＡを10 mM のHEPESバッファーにそれぞれ溶かし、両者を混合させることでナノミセル溶液を調製した。PEG-PAsp(DET)のアミノ基（Ｎ）とｍＲＮＡのリン酸基（Ｐ）のモル比をＮ／Ｐ比とし、Ｎ／Ｐ比が８のナノミセル溶液を調製した。
　ミセルは、マウスの下肢骨格筋にハイドロダイナミクス法により投与した。具体的には、マウスを３％のイソフルラン（アボットジャパン社）にて麻酔した後、大腿近位部に駆血帯を留置し、下肢の血行を一時的に遮断した。そして５μｇのｍＲＮＡを含む３００μＬ　のナノミセル溶液を足関節内顆後方の大伏在静脈より５秒間かけて投与し、その５分後に駆血帯を外した。
　次に、投与７２時間後に骨格筋で発現したルシフェラーゼタンパク質の量を定量した。具体的には、投与７２時間後の下肢骨格筋を採取し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて組織をホモジェナイズした。ルシフェラーゼタンパク質の定量は、ルシフェラー背の発光量に基づき行なった。発光量の定量は、Nano-GLo Luciferase assay system（Promega社）とLumat LB9507 luminometer（Berthold社）を用いて行い、細胞溶解液中のタンパク質濃度で発光量を標準化して求めた。
　その結果、図４に示されるように、Ａ（２４０）を有するｍＲＮＡは、Ａ（１２０）またはＡ（３６０）を有するｍＲＮＡと比較して顕著に高いレベルでのタンパク質発現を示した。
　これらのことから、ｍＲＮＡの翻訳効率を高めるためには、ポリＡの長さは２４０塩基長付近とすることがよいことが明らかとなった。
実施例５：坐骨神経損傷モデルマウスの治療
　本実施例では、坐骨神経損傷モデルマウスに、異なる長さのポリＡを有するＩＧＦ－１発現ｍＲＮＡを投与して治療効果を確認した。
　マウス（Balb/c　アルビノマウス、雌、１０～１４週齢、Charles River Laboratoriesから購入）の左足の坐骨神経を大転子付近で露出させて、液体窒素で冷却したピンセットで露出させた坐骨神経を圧迫して坐骨神経損傷モデルマウスを作製した。
　ＩＧＦ－１発現ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域に１２０塩基長または２４０塩基長のポリＡを付加してＰＥＧ－ポリ（Ｎ’－［Ｎ－（２－アミノエチル）－２－アミノエチル］－アスパラギン酸）ブロック共重合体（ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））と混合して、ポリイオンコンプレックス型ミセルを形成させた。
　ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）は、常法に従って調製した（ChemMedChem 1 (2006) 439-444参照）。Ｈ１－ＮＭＲ測定により、ＰＥＧ部分の数平均分子量は１２，０００、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）部分の重合度は６９と見積もられた。得られたＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合とｍＲＮＡとをそれぞれ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解させて、得られた溶液を混合することにより、投与用のポリイオンコンプレックス型ミセルを形成させた。
　ミセルをマウスの大腿付近で駆血した上で、得られたミセルを上記疾患モデルの足の静脈投与し、筋組織にミセルを浸透させた。治療効果を確認するため、投与後７日目から２８日目にかけてマウスの運動機能を評価した。陰性対照として、ＩＧＦ－１の代わりにルシフェラーゼｍＲＮＡを投与した坐骨神経損傷モデルマウスの運動機能を評価した。
　運動機能の評価は、図６Ａのようにマウスを自由歩行させて足跡を取得し、運動機能回復の評価指標として知られるSciatic Functional Index（ＳＦＩ）を指標として行った（ＳＦＩについては、Inserra MM et.al. Microsurgery. 1998;18(2):119-124を参照）。ＳＦＩは、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 ｛式中、ＥＰＬは、疾患モデル側の足における足跡の進行方向の長さ、ＮＰＬは、健常脚における足跡の進行方向の長さ、ＥＰＷは、疾患モデル側の足の足跡の幅、ＮＰＷは、健常足の足跡の幅を示す。｝に基づいて算出した。
　足跡の取得は、歩行解析装置キャットウォーク（Noldus社製）を用いた。ＥＰＬ、ＮＰＬ、ＥＰＷ、ＮＰＷについては、上記式にて説明したとおりであるが、図６Ｂにも図示されている。なお、理想的には、足が１００％麻痺している場合、ＳＦＩは－１００を示し、正常な場合には０を示し、ＳＦＩ値の上昇は足の運動機能の回復を示す。
　坐骨神経損傷モデルマウスの疾患モデル側の足にＩＧＦ－１発現ｍＲＮＡを投与した後、７日目、１０日目、１２日目、１４日目、２１日目および２８日目でマウスの歩行回復をＳＦＩ値を指標として調べた。結果は図６Ｃに示される通りであった。
　図６Ｃに示されるように、陰性対照であっても時間経過と共に運動能は回復したが、ポリＡ長が２４０である場合（ＩＧＦ－１　２４０Ａ）に、顕著な運動能回復が観察された。また、ポリＡ長が２４０である場合（ＩＧＦ－１　２４０Ａ）に、ポリＡ長が１２０である場合（ＩＧＦ－１　１２０Ａ）よりも高い運動能回復が観察された。
　このようにｍＲＮＡにおいてポリＡの長さを一定長（特に、２４０塩基長）にそろえると、ｍＲＮＡからのタンパク質の発現量は顕著に増大し、その効果は生体内においても確認された。

Claims (11)

  1. 　目的タンパク質を発現させることに用いるための組成物であって、
    　組成物は、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、
    　組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上が、そのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有する、
    　組成物。
  2. 　組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの９０％以上が、そのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 　組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの９５％以上が、そのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  4. 　組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの２０％以下が、２７０塩基長以上のポリＡを有するｍＲＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 　タンパク質発現ベクターであって、
    　プロモーターと作動可能に連結したタンパク質をコードする遺伝子と、
    　タンパク質をコードする遺伝子のタンパク質コード領域の下流に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列と
    　を含んでなる、タンパク質発現ベクター。
  6. 　ｍＲＮＡのｅＩＦ４Ｅへの結合能を向上させる方法であって、
    　ｍＲＮＡがそのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡからなる配列を有するように、ｍＲＮＡが転写されるＤＮＡのタンパク質コード領域の下流にポリＡまたは実質的にポリＡからなる配列を付加すること
    　を含んでなる、方法。
  7. 　標的タンパク質を対象の体内細胞で発現させる方法であって、
    　標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなる組成物であって、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、組成物を提供することと、
    　組成物を対象に投与することと
    を含んでなる、方法。
  8. 　疾患に罹患した対象または障害を有する対象において該疾患または障害を処置することに用いるための医薬組成物であって、その疾患または障害を治療することができるタンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなり、組成物中に含まれる該ｍＲＮＡの８０％以上が、該ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’末端側に２３０～２５０塩基長の実質的にポリＡ配列からなる配列を有する、医薬組成物。
  9. 　疾患または障害が、タンパク質の低減または欠乏を原因とする疾患または障害であり、その疾患または障害を治療することができるタンパク質が、対象において低減または欠乏しているタンパク質である、請求項８に記載の組成物。
  10. 　疾患または障害が、脊髄損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である、請求項８に記載の組成物。
  11. 　疾患または障害が、末梢神経損傷であり、疾患または障害を治療することができるタンパク質が、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）である、請求項８に記載の組成物。
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