CN1774500B - 用于瞬时或稳定表达外源分子的表达盒和载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于表达多核苷酸的表达盒和含有所述表达盒的载体。所述表达盒包括启动子/增强子，插入区，以及聚腺苷酸化信号结构域。本发明还提供了表达系统以及所述表达盒及载体的使用方法。

Description

用于瞬时或稳定表达外源分子的表达盒和载体
技术领域
本发明涉及表达载体和表达盒，更具体地说涉及用于在生物体中表达外源分子的方法、组合物和系统。
背景技术
将核酸分子，多肽，肽，和小分子导入靶细胞及组织不仅被用作治疗递送系统，还被用于在体外制备治疗分子。该方法的适用性随着对宿主细胞以及细胞分裂、分化及表达机理的分子生物学的进一步理解而增加。
发明概述
现已发现：由CMV启动子驱动、并由变体人生长激素基因(hGHv)的polyA结构域终止的转录比不含有这两种元件或其中之一的其它表达载体更有效。因此，本发明提供了用于表达目的多核苷酸的表达盒及表达载体。本发明所述表达盒包括调控元件的组合，所述调控元件的组合能够提供有效的转录，有效的转录终止，以及转录产物的增加的mRNA稳定性。实施方案中，所述表达盒包括人巨细胞病毒启动子/增强子，克隆位点或目的多核苷酸，以及hGHv聚腺苷酸化信号结构域。任选地可存在长度可变的间插序列(variable length intervening sequence)。
本发明提供表达盒，其中包括人CMV立即早期1(hCMV IE1)启动子/增强子区域，目的多核苷酸，以及变体人生长激素(hGHv)polyA信号结构域或其变体。所述polyA信号结构域或其变体的长度为至少100个核苷酸，并含有序列AATAAA，并且与hGH polyA信号结构域具有至少92％的同一性。
本发明还提供了含有本发明所述表达盒的表达载体，以及含有本发明所述表达盒或表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了表达盒，其中包含人CMV立即早期1(hCMV IE1)启动子/增强子区域，含有剪接供体和剪接受体位点的长度可变的间插序列(VLIVS)，目的多核苷酸，及变体人生长激素(hGHv)polyA信号结构域或其变体。所述polyA信号结构域或其变体的长度为至少100个核苷酸，其中含有序列AATAAA，并与hGHv polyA信号结构域具有至少92％的同一性。
本发明还提供了表达载体，其中包含人CMV立即早期1(hCMV IE1)启动子/增强子区域，其中含有剪接供体位点和剪接受体位点的长度可变的间插序列(VLIVS)，克隆位点，hGH聚腺苷酸化区域，以及选择标记。在本发明的一个方面，所述hCMV IE1启动子/增强子区域位于所述克隆位点的上游(5’)，所述hGH聚腺苷酸化区域位于该克隆位点的下游(3’)。
本发明还包括在体内递送目的药剂的方法。该方法包括：将含有表达盒的组合物递送至受试者，所述表达盒包含：hCMV IE1启动子/增强子区域；含有剪接供体和剪接受体位点的长度可变的间插序列；编码所述目的药剂的多核苷酸；以及人生长激素(hGHv)polyA信号结构域或其变体。
本发明还包括表达系统。所述表达系统包括经由本发明表达盒转染或转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞在使目的多核苷酸表达的条件下培养；以及回收所述目的药剂。
本发明的一个或多个实施方案的详述见下文的附图和说明书。本发明的其它特点、目的和优势可以从下面的说明和附图以及权利要求部分明显地看出。本申请中引用的所有文献在此引入作为参考。
附图说明
图1是pV10载体的质粒图谱。通过PCR制备巨细胞病毒立即早期1(CMV IE1)启动子/内含子(IVS)，并将其克隆入HindIII和BamH1位点。另外还标明了氨苄西林抗性基因β内酰胺酶(bla)。
图2是pV40的质粒图谱。标明了巨细胞病毒立即早期1(CMV IE1)启动子，内含子(IVS)，长约600个碱基对的hGHv聚腺苷酸化信号结构域(polyA)，以及氨苄西林抗性基因β内酰胺酶(bla)。
图3是质粒pV70的示意图。图中标出了CMV IE1启动子，含有缺失连接(deletion junction)以及剪接供(SD)和剪接受体(SA)位点的IVS，hGHvpolyA信号结构域，和bla基因。所述缺失连接表示的是BspE1′/′HpaI的平端连接结果。
图4是制备pXLC.1载体的示意图。所述pXLC.1载体是使用表达载体pV70和含有轻链编码序列的PCR产物构建而成的。用BamHI将PV70线性化，用BamHI消化所述PCR产物，然后连接这两者生成所述pXLC.1载体。
图5是制备pXLC.2载体的示意图。
图6图示了pV60载体以及pXHC载体的制备。所述pXHC载体是使用表达载体pV60和含有大部分重链编码序列(不包括N-末端的52个氨基酸)构建而成的。用BamHI将PV60线性化，用BamHI消化所述PCR产物，然后将二者连接在一起。
图7是pXHC.1载体的示意图。
图8是pXHC.3载体的示意图。
图9是图示了将dhfr盒添加到pXHC.3得到的pXHC.5载体。所述表达盒的调控元件源自于pSI(Promega，Genbank登录号#U47121)，其中含有SV40启动子/增强子，人工内含子和SV40晚期聚腺苷酸化序列。
图10是载体pV80的示意图。标出的是：含有剪接供体(SD)和剪接受体(SA)位点的巨细胞病毒立即早期1(CMV IE1)启动子/内含子(IVS)片段，hGHv聚腺苷酸化信号结构域(polyA)，氨苄西林抗性基因，β内酰胺酶(bla)，SV40启动子/增强子，人工内含子和SV40晚期聚腺苷酸化序列。
图11A和11B是载体pV90的示意图及相应的标注(annotated)序列。图11A是载体图谱。标出的是：含有剪接供体(SD)和剪接受体(SA)位点的巨细胞病毒立即早期1(CMV IE1)启动子/内含子(IVS)片段，hGHv聚腺苷酸化信号结构域(polyA)，氨苄西林抗性基因，β内酰胺酶(bla)，SV40启动子/增强子，人工内含子和SV40晚期聚腺苷酸化序列。所述载体不含dhfr表达盒中的NotI位点。图11B是pV90载体的标注序列。图11B中，SEQ IDNO：19中的第1275-1866位核苷酸代表长度约600个核苷酸的hGHv polyA。
图12是pSI-DHFR.2的载体图谱。SV40启动子驱动dhfr基因。
图13图示了经转染的合并物的相对比产率。3个合并物用来分析pCMV-hGHvPA-SEAP和pSEAP2，一个合并物用于分析pUC18。
图14是显示所述分离株的相对比产率的一对图表。每一种构建体的前20种分离株按排列顺序给出。
图15给出的是Genbank登录号No.K00470中的序列(SEQ ID NO：18)。
发明详述
本发明涉及表达盒以及含有该表达盒的载体。所述表达盒含有能够驱动真核宿主中的转录的转录调控区域以及转录终止区域。本发明所述表达盒和载体提供了强的转录起始和终止以及转录产物的增强的mRNA稳定性。
本发明提供了来自任一株巨细胞病毒的启动子和任选的增强子元件，例如本申请所述的或者例如美国专利No.5,658,759等文献中所述的巨细胞病毒毒株，这些文献的内容在本申请引入作为参考。例如，可用于本发明所述表达盒的合适的CMV立即早期启动子区域可以从CMV-启动的β-半乳糖苷酶表达载体CMVβ获得(MacGregor et al.，Nucl.Acids Res.17：2365(1989))。
如本申请中进一步所述，所述hGHv聚腺苷酸化信号结构域提供了强的转录终止信号，以及提高的mRNA转录物稳定性。所述调控/表达元件可以通过例如，目的多核苷酸或克隆位点(例如，多克隆位点)。自hGHv聚腺苷酸化信号结构域分离。
本发明的一个方面，提供了其中含有表达盒的多核苷酸，该表达盒包括巨细胞病毒(CMV)转录调控区域，长度可变的间插序列(例如，来自CMV的内含子A)，目的多核苷酸，和聚腺苷酸化信号结构域。本发明进一步涉及用于从宿主细胞制备和回收异源多肽的方法和表达载体。
另一方面，本发明的表达盒包括，可操作地连接的如下序列(i)CMV主要立即早期1(IE1)启动子/增强子区域和长度可变的间插序列(例如，内含子A的衍生物)，(ii)目的多核苷酸，和(iii)hGHv聚腺苷酸化信号结构域。所述术语“可操作地连接的”是指并置(juxta position)，其中的各成分间的相互关系使得它们可以其预定方式发挥作用(例如，功能性地连接)。因此，例如，可操作地连接于目的多核苷酸的启动子/增强子以这样一种方式与后者连接，即使得能够在与活化所述启动子/增强子表达相容的条件下完成所述目的多核苷酸的表达。
在本发明的具体实施方案中，所述表达盒包括SEQ ID NO：1中的约第1-约第1867位核苷酸所示的序列(例如，约第1-第1865，1866，1867，1868，或1869位核苷酸)。SEQ ID NO：1中第1-1867位核苷酸所示表达盒包含大量不同的结构域，例如CMV IE1启动子/增强子区域，所述结构域具有SEQID NO：1中约x1-约x2所示的序列，其中x1是第1-20位核苷酸中的核苷酸，x2是约第715-720位核苷酸(例如，SEQ ID NO：1中约第1-719位核苷酸)中的核苷酸。所述表达盒的另一结构域包括长度可变的间插序列(VLIVS)，其中含有剪接供体和剪接受体位点。所述VLIVS可以为长度至少50bp(例如，长度至少100，150，200，或250bp)，而且可以包括来自本领域任一已知来源的剪接供体和受体。参见，例如，Varani et al.，Annu Rev BiophysBiomol Struct 27：407-45(1998)和Koning，Eur J Bi°Chem 219：25-42(1994)。合适的插入结构域可以包括任意CMV毒株基因组的内含子A的全部，或可以包括较小的片段，这种较小片段含有连接在一起的含剪接供体位点的5’序列和含剪接受体位点的3′序列。例如，所述VLIVS包括SEQ ID NO：1中约x3-约x4的核苷酸，其中x3是第715-720位核苷酸中的核苷酸，x4是第1236-1254位核苷酸(例如，SEQ ID NO：1中第719-1236位核苷酸)中的核苷酸。位于CMV IE1启动子/增强子之后的间插序列的大小可以变化，可多达为SEQ ID NO：1中的317个核苷酸。例如，从pV40和pV70(分别见例如图2和3)所示的IVS序列缺失317个核苷酸，来制备SEQ ID NO：1的VLIVS。因此，在本发明的另一方面，所述表达盒包括SEQ ID NO：1的约第1-约第1254位核苷酸的序列(例如，CMV IE1启动子/增强子和间插序列)。多克隆位点可以存在于IVS区域(例如，包括BamH1位点和Not1位点的SEQID NO：1的第1255-1272位核苷酸)之后(即，下游)。可以使用本领域技术人员已知技术，在所述表达盒中构建不同的或另外的限制酶切位点。所述表达盒还可以进一步包括polyA结构域。
所述polyA信号结构域源自于hGHv基因，该基因的3′UTR序列可变，例如，从等位基因到等位基因。hGHv基因的一种等位基因的描述见Genbank登录号No.K00470(SEQ ID NO：18)，另一序列为图11B中描述的SEQ IDNO：19，该序列对应于SEQ ID NO：18中第2032-2625位核苷酸(参见图15)。polyA信号结构域的非天然存在的变体可以通过诱变技术制备，包括适于多核苷酸、细胞或生物体的技术。hGHv基因的polyA变体包括polyA信号结构域，该结构域不同于野生型hGHv polyA信号结构域但是仍保留了发出转录终止信号和/或稳定mRNA的能力。例如，所述聚腺苷酸化信号结构域可以包括SEQ ID NO：18或19所示的hGHv聚腺苷酸化信号结构域序列。分子生物学领域的技术人员还应理解，所述序列的长度无需约为600个核苷酸。相反，包含任何这样的polyA序列结构域，其包含hGHv基因的至少100nt(例如，至少200，300，400，500，或600nt)的连续核苷酸序列(包含标准(canonical)AATAAA位点)。此外，本发明还包括与上述序列之间的差异达8％(例如，与SEQ ID NO：18或19或其特征结构域具有92％同一性)的序列。例如，长度为100nt的多核苷酸，其与SEQ ID NO：1的第1-1867位核苷酸具有95％同一性，并含有可保持终止转录的能力的AATAAA序列。
本发明的另一方面中，提供了含有表达盒的载体。在本申请中，“载体”是指一经导入受体细胞(例如，细菌如大肠杆菌(E.coli))，即能够自主复制的核酸分子(DNA或RNA)。质粒、病毒和噬菌体是载体的实例。从表达载体“表达”的过程是已知的，包括细胞酶的使用和从目的多核苷酸制备表达产物的过程(processes)。表达载体是指能够介导克隆的多核苷酸在宿主细胞中表达的载体，所述宿主细胞与用于载体复制或增殖的细胞可以相同或不同类型。许多哺乳动物表达载体能够在常见细菌(受体细胞)中增殖，但在哺乳动物细胞(宿主细胞)中表达目的多核苷酸而不能在细菌中表达。
本发明涉及那些能够允许多核苷酸在真核(例如，哺乳动物，更具体地为，人，鼠，猿，牛，猪，啮齿动物，或绵羊细胞)细胞中有效转录和翻译的载体的设计和使用。本发明所述载体包括上述表达盒，其中含有能提供有效转录终止和mRNA稳定性的聚腺苷酸化信号结构域。
本发明所述载体包括：用于接纳目的多核苷酸的克隆位点；足以允许被插入宿主细胞中克隆位点的多核苷酸的转录的转录调控元件(例如，CMVIE1启动子/增强子区域)；足以允许所述多核苷酸的RNA转录物在宿主细胞中翻译的翻译元件，以及(如果需要)足以允许所述载体在宿主细胞或用于所述载体的增殖的另一受体细胞中进行复制的复制元件。本发明所述载体能介导在宿主细胞中的所述瞬时或稳定表达。
在具体的实施方案中，本发明载体包括(1)SEQ ID NO：1所示序列；(2)与SEQ ID NO：1所示序列互补的序列；(3)与SEQ ID NO：1至少80％(优选至少90％；95％；98％或99％)相同的序列或其互补序列；或(4)载体，其含有SEQ ID NO：1中的约第1-约第1867位核苷酸并且含有目的多核苷酸和/或选择标记。
含有SEQ ID NO：1的载体具有大量不同的结构域和编码区域。例如，具有SEQ ID NO：1中约x1-约x2所示序列的CMV IE1启动子/增强子区域存在于所述载体中，其中x1是第1-20位核苷酸中的核苷酸，x2是约第715-720位核苷酸(例如，SEQ ID NO：1中约1-719位核苷酸)中的核苷酸。本发明表达载体的另一结构域包括含有剪接供体和剪接受体位点的长度可变的间插序列(VLIVS)。例如，所述IVS包括SEQ ID NO：1的约x3-约x4，其中x3包括第715-720位核苷酸中的核苷酸，x4包括第1236-1254位核苷酸(例如，SEQ ID NO：1中大约第719-1236位核苷酸)中的核苷酸。所述表达载体的多克隆位点包括SEQ ID NO：1的第1255-1272位核苷酸(例如，BamH1位点和Not1位点)。可以使用本领域技术人员已知技术在所述表达载体中构建不同的或其它的限制酶切位点。所述表达载体还可以进一步包括polyA信号结构域。所述polyA信号结构域是hGHv polyA信号结构域或hGH polyA信号结构域的其它变体。例如，polyA信号结构域包括SEQ ID NO：19所示的hGHv polyA信号结构域序列。另外，本发明载体中还含有一种或多种选择标记。例如，SEQ ID NO：1包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(例如，SEQ IDNO：1中约第2568-约第3132位核苷酸)。除上述的那些元件之外，本发明载体可以包括另外的启动子/增强子元件和调控区域(例如，聚腺苷酸化结构域)。所述另外的调控元件和聚腺苷酸化结构域可以位于选择标记或目的多核苷酸的侧翼(例如，紧密邻接于其5’和3’端)。例如，所述含有SEQ ID NO：1的载体包括SEQ ID NO：1中约第2568-约第3132位核苷酸所示的二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。所述dhfr基因侧接SV40启动子/增强子元件和SV40聚腺苷酸化区域(例如，分别为SEQ ID NO：1的约第1868-约第2210位核苷酸和约第3144-约第3440位核苷酸)。
选择标记的具体实例是编码下述蛋白质的选择标记，所述蛋白质可赋予针对细胞抑制药物或杀细胞药物的抗性，所述蛋白质例如，能赋予抗氨甲蝶呤抗性的DHFR蛋白质(Wigler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567(1980)；O’Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；能赋予抗霉酚酸(mycophenolic acid)抗性的GPF蛋白(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))，能赋予抗氨基糖苷G-418抗性的新霉素抗性标记物(Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150：1(1981))；能赋予抗潮霉素抗性的Hygro蛋白(Santerre et al.，Gene 30：147(1984))；和ZeocTM抗性标记(可购自Invitrogen)。此外，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guaninephophoribosyltransferase)(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：2026(1962))，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，Cell 22：817(1980))可以分别应用于tk-，hgprt-或aprt-细胞中。其它选择标记编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶或腺苷脱氨酶。
对两个或多个核酸分子来说，当使用比较算法或者通过人工比对及目测进行检测，在比较窗比较并比对以得到最大对应度口时，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或多个序列或亚序列是相同的或者具有特定比例的相同核苷酸。这些定义也指序列的互补序列(例如，SEQ ID NO：1所示序列的互补序列或其含有表达盒的片段)。例如，所述表达盒及其片段包括与SEQ ID NO：1部分序列(例如，SEQ ID NO：1的1-719，1-1254位核苷酸等)具有至少约80％，约90％，约95％，约97％，约98％或约99％核苷酸序列同一性的那些序列。因此，如果序列与SEQ ID NO：1的全长序列或其结构域之间具有所需的序列同一性，那么该序列就可以分别作为本发明的表达盒或结构域而起作用。
就序列比较而言，通常将一段序列用作参照序列，将受试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将受试及参照序列输入电脑，设定亚序列坐标(如有必要)，并设定序列算法的程序参数。可以使用默认的程序参数，或者也可以设定替换参数。然后，根据设定的参数或默认的程序参数，用所述序列比较算法计算受试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。在本申请中，“比较窗”，包括参照选自具有下列数目之一个连续核苷酸的任一片段：25-600个，通常约50-约200个，更通常为约100-约150个，其中可以在将将序列与具有同等数目个连续核苷酸的参照序列进行最佳比对之后，对这两个序列进行比较。用于比较的序列比对法已为本领域所熟知。用于比较的序列最佳比对可以用以下方法进行：例如，Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索算法，这些算法的电脑化运行(GAP，PILEUP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA in the Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或通过人工比对以及目测检查。
适于测定序列同一性百分比(即，基本上的相似性或同一性)的算法的一个实例是BLAST算法，其描述见Altschul，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。用于执行BLAST分析的软件公众可以从the National Center forBiotechnology Information(on the World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov/)获得。这种算法包括：首先通过鉴定询问序列中的短字长W(short words of lengthW)，鉴定出高得分序列对(HSP)，它们或者相互匹配，或者当与数据库序列中等长的字符比对时满足一些正值的阈值得分(positive-valued thresholdscore)T。“T″是指邻近字符得分阈值(neighborhood word score threshold)。这些起始邻近击中字符串(initial neighborhood word hits)作为种子(seed)启动检索以发现含有它们的更长的HSP。然后，沿每一序列的双向延伸得到的击中字符串，只要能增加累积的比对得分即可。使用参数M(成对匹配残基的奖励得分；永远＞0)和N(错配残基的处罚得分；永远＜0)计算核苷酸序列的累积得分。当达到下述情况时击中字符串的双向延伸停止：累积比对得分比其最大获得值低数量X；由于一或多个阴性-得分残基比对的累积，所述累积得分降至零或零以下；或者到达任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。一个实施方案中，为了测定一种核酸序列是否落于本发明范围之内，使用BLASTN程序(对于核苷酸序列)，引入字长(W)11的缺省值(default)，期望值(E)10，M＝5，N＝4，以及对两条链进行比较。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用下列缺省参数：字长(W)3，期望值(E)10，以及BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)。
另外还使用BLAST算法对两个序列之间的相似度进行了统计分析(参见，例如，Karlin，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787，1993)。BLAST算法提供的一种相似度测算方法是最小求和概率(smallest sum probability)(P(N))，该方法提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的概率的指标。例如，如果受试核酸和参照核酸之间比较中的最小求和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，以及最优选小于约0.001，那么就认为该核酸与参照序列相似。
本发明此外还包括能够与SEQ ID NO：1中约第1-1867位核苷酸所示多核苷酸序列特异性杂交的多核苷酸。术语“选择性(或特异性)杂交”是指在严谨杂交条件下，分子与具体参照多核苷酸的结合、双螺旋或杂交。术语“严谨杂交条件”是指这样的条件，在该条件下探针主要与其亚序列杂交，所述目标亚序列通常在核酸的复杂混合物中，但是所述探针不与其它序列杂交。严谨条件是序列-依赖性的，因环境的不同而不同，例如，取决于探针的长度。较长的序列可以在较高温度特异性杂交。核酸杂交的全面指导见Tijssen，Techniques in Bi°hemistry and Molecular Biology--Hybridizationwith Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid assays”(1993)。通常，在一定离子强度和pH时，严谨条件被选择为比具体序列的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是指这样的温度(在一定的离子强度、pH和核酸浓度)，在该温度达平衡时，互补于靶序列的探针的50％与所述靶序列杂交(由于靶序列过量存在，在Tm达平衡时，50％的探针被结合)。严谨条件中的盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH为7.0-8.3，温度对于短探针(例如，10-约50个核苷酸)为至少约30℃而对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严谨条件还可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交而言，阳性信号(例如，本发明核酸的鉴定)是背景杂交的约2倍。对于长探针而言，用于鉴定本发明范围内基本相同的核酸的“严谨”杂交条件包括：在含50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS的缓冲液中、42℃-65℃进行杂交，65℃用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。但是，本领域普通技术人员显然明白，杂交条件可以根据序列组成进行调整。代表性的“中度严谨杂交条件”包括：37℃、在包含40％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS的缓冲液中杂交，然后在45℃、用1X SSC洗涤。阳性杂交应该至少是背景信号的两倍。本领域普通技术人员很容易认识到可以使用其它杂交和洗涤条件以提供类似严谨度的条件。因此，本发明的表达盒可以包括在高度严谨条件下与含SEQ ID NO：18或19所示核苷酸序列的ssDNA杂交的hGHv polyA信号结构域。
所述表达盒可以以裸核酸构建体的形式使用。可选地，所述表达盒可作为核酸载体(例如，表达载体如上述表达载体)的一部分导入。所述载体包括质粒和病毒载体。载体可以包括位于所述表达盒侧翼的序列，包括与诸如哺乳动物基因组序列的真核基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这样就可以通过同源重组酶将所述表达盒导入真核细胞或病毒的基因组。例如，包含与病毒序列侧接的表达盒的质粒载体可用于制备适于将所述表达盒递送至脊椎动物的病毒载体，所述脊椎动物包括鱼、鸟类或哺乳动物细胞。所采用技术已为本领域技术人员所熟知。
所述术语“目的多核苷酸”意欲包括至少能够被转录的核酸分子。所述分子相对于启动子可为有或反义方向。可以采用本领域熟知的技术，使用反义构建体抑制细胞中基因的表达。所述目的多核苷酸可以包括异源多核苷酸。术语异源多核苷酸包括任一基因。异源多核苷酸通常源自与表达盒或载体中与该异源多核苷酸可操作连接的调控元件所不同的物种，或者如果来自相同的来源，那么就是其原始形态的经修饰的基因。因此，可操作地连接于启动子的异源多核苷酸的来源与所述启动子的来源不同，或者，如果它们的来源相同，那么就是其原始形态的经修饰的启动子。对异源多核苷酸的修饰可以通过以下方法进行，例如，通过用限制性内切酶处理DNA制得能够可操作连接于所述启动子的DNA片段。另外还可使用定点诱变对异源多核苷酸进行修饰。异源多核苷酸还可以包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白的基因)或者其产物能够调节其它基因表达的基因。因此，用作mRNA、tRNA和rRNA的多核苷酸也在该定义的范畴之内。所述异源基因可以是野生型基因的等位变体，或者其可以是突变基因。mRNA可任选包括位于5’和/或3’端转录但不翻译的侧翼区域的一部分或全部，该区域与翻译的编码序列天然或非天然相连。
目的多核苷酸可以任选更进一步包括通常与所转录出的分子相连的相关转录控制元件，例如转录终止信号，聚腺苷酸化结构域和下游增强子元件。所述目的多核苷酸可以编码治疗产物或者作为治疗产物的模板，所述治疗产物可以是例如肽，多肽，蛋白质或者核糖核酸。所述目的多核苷酸通常是编码多肽产物的DNA序列(例如cDNA或基因组DNA)，所述多肽产物诸如酶(例如β-半乳糖苷酶)；血液衍生物；激素；细胞因子；白介素；干扰素；TNF；生长因子(例如IGF-1)；可溶性受体分子(例如，可溶性TNF受体分子)；神经递质或其前体；营养因子诸如BDNF，CNTF，NGF，IGF，GMF，aFGF，bFGF，NT3和NT5；载脂蛋白诸如ApoAI和ApoAIV；肌营养不良蛋白(dystrophin)或小肌营养不良蛋白(minidystrophin)；肿瘤-抑制型蛋白诸如p53，Rb，Rap1A，DCC和k-rev；凝血相关因子(factors involvedin coagulation)例如因子VII，VIII和IX；或者完整或部分天然或人工免疫球蛋白(例如Fab和ScFv，或者克隆的IgG的轻链或重链)。
目的多核苷酸还可以包括用作制备反义分子的模板，其在靶细胞中的转录使得细胞mRNA的基因表达或转录能够得以控制。可以用本领域已知技术，所述分子可例如在靶细胞中被转录为细胞mRNA的互补RNA，从而能够阻遏细胞mRNA翻译为蛋白质。具体而言，反义分子可以用于在炎性细胞因子或代谢细胞因子引发的关节炎和组织丢失治疗过程中阻遏这些细胞因子的翻译。
所述目的多核苷酸序列通常编码诊断或治疗用的多肽。可以使用含有本发明所述表达盒的各种宿主细胞(例如，COS细胞或CHO细胞或其衍生物)，在生物反应器中在体外制备所述多肽。可选地，本发明所述表达盒和/或载体可用于基因递送，蛋白质递送，和/或基因治疗。
本发明还可以用于表达毒性因子和多肽。后者具体而言可以为细胞毒素(诸如白喉毒素，假单胞菌毒素和篦麻毒素A)，能诱导针对外界因子(例如胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶)的敏感性的产物，或者可选能够诱导细胞死亡的因子(例如Grb3-3和抗-ras ScFv)。
治疗用途意指能够实现消除疾病或病症，治愈疾病或病症，以及/或者减轻疾病或病症严重程度的用途。诊断用途包括使用下述分子，所述分子能够测定分子与疾病过程之间的因果关系或相关程度或提供相关信息，或者测定疾病或病症是否存在。诊断试剂并不能直接促进疾病或病症的改善。
另外，目的多核苷酸还可以编码可用作疫苗的抗原多肽。抗原多肽或核酸分子源自于病原生物体例如，细菌或病毒。例如，抗原多肽包括存在于病原生物体的基因组或基因产物中的抗原决定簇，所述病原生物体例如，病毒性出血性败血症(viral haemorrhagic septicemia)，细菌性肾病，弧菌病(vibriosis)和疖病(furunculosis)的病原生物体。抗原性的多肽可以选自例如丙型肝炎病毒基因组的区域和基因产物。
在本申请中，“分离的”这一词汇用来描述分子或组合物诸如本发明的载体或表达盒或目的多核苷酸时，意指所述分子或组合物与至少一种其它化合物例如蛋白质、DNA、RNA或其它污染物分离开来，所述分子或组合物在体内或其天然存在状态下与所述其它化合物相结合。因此，当目的多核苷酸同与其天然结合的任何其它成分已经分离开来的时候，那么就可以称这种目的多核苷酸为分离的。但是，分离的组合物也可以是基本上纯的。分离的组合物可以处于均质状态(homogeneous state)。它可以是干燥的/冻干的状态或水溶液。纯度和均质性可以用分析化学技术测定，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，琼脂糖凝胶电泳或高压液相色谱(HPLC)。
在本申请中，术语“核酸分子”和“多核苷酸”可以交换使用，包括寡核苷酸(即，短多核苷酸)。另外它们还可以指合成的和/或非天然存在的核酸分子(例如，包括核苷酸类似物或经过修饰的主链残基或键)。另外，该术语还可指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语包括其中含天然核苷酸类似物的核酸。该术语还包括带有合成主链的核酸-样结构。本发明提供的DNA主链类似物包括磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基-膦酸酯，氨基磷酸酯，烷基磷酸三酯，氨基磺酸酯，3’-硫缩醛，甲叉(甲亚氨基(methylimino))，3’-N-氨基甲酸酯，吗啉代氨基甲酸酯，和肽核酸(PNA)；参见Oligonucleotides and Analogues，F.Eckstein编著，a Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1991)；AntisenseStrategies，Annals of the New York Academy of Sciences，Volume 600，Baserga和Denhardt编著(NYAS 1992)；Milligan(1993)J.Med.Chem.36：1923-1937；Antisense Research and Applications(1993，CRC Press)。PNA含有非离子主链，例如N-(2-氨乙基(aminoethyl))甘氨酸单元。硫代磷酯键的描述见WO97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197。该术语包括的其它合成主链包括甲基-膦酸酯键或交替的甲基膦酸酯和磷酸二酯键(Strauss-Soukup(1997)Biochemistry36：8692-8698)，和苯甲基-膦酸酯键(Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-156)。
在本申请中，“重组”是指合成的或者体外操作的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)，使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中制备产物的方法，或者由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。重组多核苷酸包括不同来源的核酸分子，其被连接入表达盒或表达载体，所述载体用于表达例如融合蛋白或者通过多肽的可诱导型或组成型表达制备的那些蛋白质(例如，本发明表达盒或载体可操作地连接于异源的多核苷酸，例如多肽编码序列)。
在常见的表达系统中，从异源多核苷酸制备多肽的过程要么不受调控，要么通过下述方式实现调控：对自可操作地连接于编码异源多肽的多核苷酸上游的转录启动子的转录进行调节。但是，为了提供正确的转录终止和mRNA稳定性，还必须在下游进行适当调控。本发明的一个方面，在本发明表达盒或载体中目的多核苷酸的下游提供了人生长激素变体(hGHv)聚腺苷酸化(polyA)信号结构域。所述hGHv polyA信号结构域含有源自人生长激素基因序列的序列。所述hGHv聚腺苷酸化信号结构域序列在真核细胞中提供强的转录终止，并且提供增强了的mRNA稳定性。该hGHv聚腺苷酸化信号结构域具有独特的优势，胜过包括使用CMV启动子/增强子的表达盒和/或载体在内的现有的表达盒和/或载体。
另外，还可能存在翻译元件，并意图包括允许RNA转录物翻译为蛋白质所必需的专门序列(诸如核糖体结合位点和起始密码子)包括在内。翻译元件还可以包括共有序列、前导序列、剪接信号等，用于促进或提高翻译程度，或者提高表达产物的稳定性。例如，所述hGHv聚腺苷酸化信号结构域提供提高了的mRNA稳定性。本发明所述载体可以拥有辅助转录区域，例如内含子，聚腺苷酸化信号，Shine/Dalgamo翻译信号和Kozak共有序列(Shine et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)71：1342-1346(1974)；Kozak，Cell44：283-292(1986))。
术语“复制元件”意图包括允许载体在载体受体细胞中复制所必需的专门序列(例如复制起点)。通常，所述载体含有足以允许载体在受体细胞中自主稳定复制的至少一个复制起点。
为了有助于本发明载体的筛选和保持，可以在所述载体中引入一或多种选择标记(例如能够赋予抗生素抗性或者使细胞能在极限培养基上或在毒性代谢产物存在的条件下生长的多核苷酸)。
另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建体(例如，本发明所述的表达盒或载体)的宿主细胞。本发明所述表达盒可以通过下述方式对宿主细胞进行重组修饰：转染或者转化宿主细胞以表达所需的目的多核苷酸。在本申请中，术语“重组修饰”是指将本发明的表达盒或载体导入活细胞或表达系统。通常，其中含有目的多核苷酸的表达盒存在于载体(例如，质粒)中。表达系统包括已导入了目的多核苷酸(其产物将被表达)的活宿主细胞，如本申请所述。
宿主细胞是指表达盒(包括其中含有表达盒的载体)能够在其中增殖并且多核苷酸编码的产物能够被表达的细胞。宿主细胞还包括目的宿主细胞或其衍生物的任一后代。应理解所有后代并不会完全等同于亲代细胞，因为在复制过程中有突变发生。但是，当使用“宿主细胞”这一术语时是将这样的后代包括在内的。可用于本发明的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞(例如，酵母)、植物细胞和动物细胞。例如，宿主细胞可以是较高等的真核细胞例如哺乳动物细胞等，或者较低等的真核细胞例如酵母等，或者所述宿主细胞可以是原核细胞例如细菌细胞等。将构建体导入宿主细胞可以通过下列方式实施：磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。作为合适宿主的代表性实例，可以列出的有：真菌细胞，诸如酵母；昆虫细胞诸如果蝇S2和斜纹夜蛾(Spodoptera)Sf9；动物细胞例如CHO，COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。通过本申请中的教导，可以认为合适宿主的选择在本领域技术人员掌握的范围之内。
可用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)。在本发明的一方面，所述宿主细胞是适合于在细胞培养中生长的哺乳动物产物细胞。工业化生产中常用的所述细胞的实例有CHO，VERO，BHK，HeLa，CV1(包括Cos；Cos-7)，MDCK，293，3T3，C127，骨髓瘤细胞系(具体是鼠的)，PC12和W138细胞。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被广泛用于制备数种复合体重组蛋白，例如细胞因子，凝血因子和抗体(Brasel et al.，Blood88：2004-2012(1996)；Kaufman et al.J.Biol Chem 263：6352-6362(1988)；McKinnon et al.，J Mol Endorinol 6：231-239(1991)；Wood et al.，J.Immunol145：3011-3016(1990)).二氢叶酸还原酶(DHFR)-缺陷的突变体细胞系(Urlaub et al.，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220(1980))是所选的(ofchoice)CHO宿主细胞系，因为有效的DHFR可选择且可扩增的基因表达系统使得能够在这些细胞中实现高水平的重组蛋白质表达(Kaufman，MethEnzymol 185：527-566(1990))。此外，这些细胞易于以可贴壁或悬浮培养方式操作，并且表现出相对较好的遗传稳定性。CHO细胞和表达于其中的重组蛋白质已经被广泛地研究，已经被管理机构批准用于临床生产。此外，还可以使用源自上述任一细胞系并具有所需表型的宿主细胞。例如，衍生的宿主细胞包括已经被选择性用于培养所需表型(例如，通过阳性和/或阴性筛选方法)的CHO细胞(例如，DG44细胞系)。
本发明的一方面，提供了用于体外生产目的多核苷酸所编码药剂的表达系统。如本申请所述，所述目的多核苷酸可以编码具有药用、医用、营养和/或工业价值的多肽。例如，所述的多核苷酸可以编码基于多肽(polypeptide-based)的药物。通常所述多肽可以作为细胞外产物表达。例如，可以用本发明所述表达盒和/或载体制备的多肽包括，但是不局限于，Flt3配体，CD40配体，促红细胞生成素，血小板生成素，降钙素，Fas配体，NF-κB受体活化剂的配体(RANKL)，TNF-相关的凋亡-诱导型配体(TRAIL)，ORK/Tek，胸腺基质(thymic stroma)-衍生的淋巴细胞生成素(lymphopoietin)，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，肥大细胞生长因子，干细胞生长因子，表皮生长因子，RANTES，生长激素，胰岛素，促胰岛素生成素(insulinotropin)，胰岛素-样生长因子，甲状旁腺激素，干扰素(例如，干扰素β)，神经生长因子，胰高血糖素，白介素1-18，集落刺激因子，淋巴毒素-β，肿瘤坏死因子，白血病抑制因子，制瘤素(oncostatin)-M，细胞表面分子Elk和Hek的各种配体(例如eph-相关激酶的配体，或LERKS)，以及抗体的轻链或重链。
任一上述蛋白质的受体也可以用发明的方法和组合物表达，包括两种形式的肿瘤坏死因子受体(称为p55和p75)，白介素-1受体(1型和2型)，白介素-4受体，白介素-15受体，白介素-17受体，白介素-18受体，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体，粒细胞集落刺激因子受体，制瘤素-M和白血病抑制因子的受体，NF-κB的受体活化剂(RANK)，TRAIL受体，BAFF受体，淋巴毒素β受体，TGF β受体I型和2型，以及含有死亡结构域的受体，诸如Fas或凋亡-诱导型受体(Apoptosis-Inducing Receptor)(AIR)。
可以用本发明表达盒和/或载体表达的其它蛋白质包括簇分化抗原(称为CD蛋白质)，例如，Leukocyte Tvping VI(Proceedings of the VIthInternational Workshop and Conference；Kishimoto，Kikutani et al.，eds.；Kobe，Japan，1996)中公开的那些，或者后来的研讨会(workshop)公开的CD分子。所述分子的实例包括CD27，CD30，CD39，CD40，及其配体(CD27配体，CD30配体和CD40配体)。这其中的一些是TNF受体家族的成员，其中包括41BB和OX40；所述配体通常是TNF家族的成员(41BB配体和OX40配体也是)；因此，所述TNF和TNFR家族的成员也可以使用本发明表达。
另外，具有酶促活性的多肽也可以按照本发明来表达。实例包括金属蛋白酶-去整联蛋白(disintegrin)家族成员，各种激酶，葡糖脑苷脂酶(glucocere brosidase)，过氧化物歧化酶(superoxide dismutase)，组织纤溶酶原激活物，因子VIII，因子IX，载脂蛋白E，载脂蛋白A-I，球蛋白，IL-2拮抗剂，α-1抗胰蛋白酶，TNF-α转化酶(TACE)，以及众多的其它酶。具酶促活性蛋白的配体也可以使用本发明表达盒和载体表达。
本发明的组合物和方法还可用于表达其它类型的重组蛋白质和多肽，包括免疫球蛋白分子或其部分以及嵌合抗体(例如，具有与鼠抗原结合区域偶联的人恒定区的抗体)或其片段。已知多种技术可对编码免疫球蛋白分子的DNA进行操作以产生编码重组蛋白质的DNA，所述重组蛋白质诸如单链抗体，高亲合力抗体，或其它以基于抗体的多肽(参见，例如，Larrick et al.，Biotechnology 7：934-938(1989)；Reichmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Roberts et al.，Nature 328：731-734(1987)；Verhoeyen et al.，Science239：1534-1536(1988)；Chaudhary et al.，Nature 339：394-397(1989))。克隆的人源化抗体包括能特异性结合淋巴毒素β受体和整联蛋白诸如VLA-1、VLA-4、和αvβ6的抗体，所述抗体可以是激动剂或拮抗剂。
各种融合蛋白质也可以使用本发明的方法和组合物表达。所述融合蛋白质的实例包括：表达为与部分免疫球蛋白分子的融合物的蛋白质，表达为带有拉链部分(zipper moiety)的融合蛋白的蛋白质，以及新的多功能蛋白质诸如细胞因子与生长因子的融合蛋白质(例如，GM-CSF和IL-3，MGF和IL-3)。WO 93/08207和WO 96/40918描述了一种被称为CD40L的分子的各种可溶性寡聚形式的制备方法，包括分别免疫球蛋白融合蛋白质和拉链(zipper)融合蛋白质；其中描述的技术适用于其它蛋白质。
目的多核苷酸一旦被表达，那么所述表达产物(例如，蛋白质或多肽)可以使用本领域常规技术纯化。例如，当所述目的多核苷酸编码含有纯化标记的融合多肽时，可以使用可特异性结合所述标记的抗体来纯化。在一方面，将编码标记分子的寡核苷酸连接在编码所需多肽的目的多核苷酸的5’或3’末端；所述寡核苷酸可以编码聚His(例如Hexa His)，或其它“标记”诸如FLAG，HA(流感病毒血凝素(hemaglutinin Influenza virus))，或可得到其商品化抗体的myc。在表达所述多肽时，通常将所述标记与多肽融合在一起，从用作将目的多肽自宿主细胞中的亲合纯化的方法。例如，可以通过使用抗标记抗体作为亲和基质的柱层析，来完成亲合纯化。任选地，随后可以用各种方法例如蛋白水解切割，将标记从纯化后的多肽除去。
本发明所述的表达盒和载体可用于将目的多核苷酸稳定地转移入宿主细胞。稳定转移意指目的多核苷酸在宿主中连续地保持。本发明所述的表达盒或载体还可以用于将目的多核苷酸在宿主细胞中的瞬时表达。瞬时转染的宿主细胞会在细胞复制和生长期间丢失外源性DNA。
本发明的表达盒可用于将治疗剂递送至需要治疗的人或动物。可选地，本发明所述表达盒可用于将编码体内发挥疫苗作用的潜在免疫原性多肽的药剂递送至受试者(例如，人)，具体是用于家养动物的免疫接种，包括食用(foodstock)动物，例如鱼，猪，马，牛，犬及猫科。
本发明所述表达盒可以作用裸露的核酸构建体直接施用，该构建体通常含有与宿主细胞基因组同源的侧翼序列。可以用包括生物弹射击(biolistic)转化法和脂质转染法(lipofection)在内的几种已知技术，来提高脊椎动物对裸露核酸构建体的摄取。
可选地，所述表达盒可作为载体的一部分导入，所述载体包括质粒载体或病毒载体。
通常，将所述表达盒或载体与可药用的载体或稀释剂混合来制备药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液包括，例如，磷酸盐缓冲的盐水。可以将其中含有所述表达盒或载体的组合物配制用于各种施用形式，包括，例如经肌内施用。
当其中含有所述表达盒或载体的组合物以可注射形式使用时，通常将其与可药用的载体混合制成可直接注射入待治疗位点的可注射剂型。所述可药用的载体或稀释剂可以是，例如，无菌的等渗(isotonic)溶液。其中含有所述表达盒或载体的所述组合物还可以配制成为口服活性形式。
所用的实际剂型可由本领域技术人员轻易确定，并且随待施用物质的性质和施用途径变动。
所用物质的剂量可以根据各种参数来调整，尤其是根据所用物质，受试者的年龄、体重、状态，所用施用方式和所需的临床治疗方案来调整。医师应能根据任一具体受试者和疾病确定所需的施用途径和剂量。
实施例
pV10载体的构建
pV10构建的其它细节概括于图1。从用人巨细胞病毒株AD169转染的人二倍体成纤维细胞中分离出基因组DNA(ATCC No.VR-538)，然后用其作为PCR扩增CMV立即早期基因1启动子/增强子区域(CMV IE1P/E)的模板(CMV IE1基因的5’UTR的细节参见图11(B)(SEQ ID NO：1))。扩增启动子，所用的引物在5’末端含有HindIII位点(tttAAGCTTGACATTGATTATTGACTAG；SEQ ID NO：2；下划线部分为限制酶切位点)并在3′末端含有BamHI位点(ttttGGATCCCTGTCAAGGACGGTGACTGC；SEQ ID NO：3；下划线部分为限制酶切位点)。位于限制酶切位点之前的末端″t″核苷酸包含在寡核苷酸设计中，以促进限制性内切酶消化，并在随后的克隆步骤中被除去。
所有PCR反应全部在DNA engine PTC-200Pelier Thermal Cycler(MJResearch，Watertown，MA)中完成。反应总体积为100μl：1X NEB Vent聚合酶缓冲液(10mM KCl，20mM Tris pH 8.8，25℃，10mM(NH4)SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100)，2.5mM dNTP’s，2单位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，每种引物各1μg，1μg分离自CMV感染的细胞的基因组DNA作为模板。反应的条件如下：99℃、1分钟，55℃、30秒，75℃、1.5分钟，共15个循环。得到的片段用限制性内切酶BamHI和HindIII(New England Biolabs)消化后，亚克隆入经BamHI和HindIII消化的克隆载体pUC19。对插入片段的序列进行分析，发现与克隆的CMV IE1启动子/增强子区域的公开序列一致。
pV40载体的构建
pV40的构建概括于图2。从分离自人成纤维细胞的基因组DNA通过PCR扩增出含有polyA信号的hGHv基因的3’UTR。5’引物的(+)链(TTTTGGATCCCTGCCCGGGTGGCATCC；SEQ ID NO：20)含有末端的BamHI限制酶切位点，3’引物的(-)链含有末端的EcoRI位点(TTTTGAATTCATGAGAGGACAGTGCCAAGC；SEQ ID NO：21)。PCR反应条件与pV10构建中所述的相同。得到的PCR片段用BamHI和EcoRI消化后，用凝胶纯化，然后连接入经BamHI和EcoRI消化的载体pv10。得到的质粒命名为pV40，用限制性内切酶分析加以确证。随后测序表明：该hGHv基因的3UTR(SEQ ID NO：19)和公开的Genbank登录号No.K00470中的hGHv基因序列(SEQ ID NO：18)有少数几个核苷酸不同。这些差异中的至少一些是由于等位基因突变引起的。
pV70载体的构建
用BspE1和HpaI消化所述pV40载体以便从内含子A区域中去除317个核苷酸的片段(参见，例如，图2和3)。pV60通过平端连接入(blunt endligation into)pV40的dhfr编码区域的BspEI-HpaI制得。所述pV70表达载体含有调控转录的人巨细胞病毒主要立即早期1(hCMV IE1)启动子/增强子区域。其中还含有hCMV IE15’UTR和内含子A，而所述内含子包括317个碱基对缺失。为了终止转录，所述载体含有人生长激素变体聚腺苷酸化(hGHv poly A)区域，SEQ ID NO：19。pV40、pV60和pV70的构建下文有详细描述，进一步描述见附图。
A.pXLC.1的产生
将含有抗体轻链编码序列的PCR产物用BamHI消化后，克隆入表达载体pV70的单一BamHI位点(图3)。将所述轻链编码区域插入单一的BamHI位点，该位点位于hCMV IE1内含子3’末端的5’UTR和hGHv poly A区域的5’末端之间。所述质粒命名为pXLC.1。图4图示的是产生pXLC.1载体的示意图。
B.neo表达盒-pXLC.2的添加
将新霉素转移酶(neo)表达盒导入pXLC.1用作选择标记(图5)。所述neo表达盒被制备为名为pGT-N28的商品化质粒(New England Biolabs，catalog#307-28)的BamHI/EcoRI片段。该质粒中，所述neo基因是由磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子驱动，终止于PGK聚-腺苷酸化位点。使用下列衔接子寡聚物(adaptor aligo)将neo表达盒5’BamHI尾转化为NarI尾端：
EcoRI
BamHI相容(compatible)GATCGATGAATTCGG(SEQ ID NO：4)
                         CTACTTAAGCCGC(SEQ ID NO：5)NarI相容
利用这些接头，添加了新的EcoRI位点。首先将所述衔接子连接至BamHI/EcoRI切出的neo片段，然后将经转化的NarI/EcoRI片段克隆入经NarI和EcoRI消化后的pXLC.1。这样，就将所述neo表达盒插入了所述质粒的轻链序列德3’末端。该质粒命名为pXLC.2(图5)。
重链表达载体-pXHC.5的构建
A.重链的RT-PCR扩增
通过RT-PCR反应扩增得到重链，使用5’PCR引物TTTTGGATCCATGTACTGGGTGAAGCAG(SEQ ID NO：6)，其中斜体序列是加入的带有BamHI位点的接头区域，加下划线的碱基对应于重链编码序列中的第二个甲硫氨酸。使用3’PCR  引物，GCCCGGATCCTCATTTACCCGGAGACAG(SEQ ID NO：7)，其还含有添加的具有BamHI位点的接头区域(斜体字母)以及对应于重链编码序列并含终止密码子的序列(下划线部分)。获得了1268个碱基对的预期PCR产物。
B.pXHC的构建
因为使用的5’PCR引物是与编码区域中的第二个ATG密码子而不是与PCR产物所含编码区域中的起始ATG杂交，所以该重链编码区域是不完整的。将含有所述不完整重链的BamHI片段克隆入质粒pV60(图6)。除了在内含子的缺失位置处含有dhfr编码区外，该载体与pV70(上述)完全相同。将所述重链编码区域插入单一的BamHI位点，该位点位于hCMV IE1内含子3’末端的5’非翻译序列与hGHv变体polyA区域的5’末端之间。将这种含有所述不完整重链的质粒命名为pXHC。
C.重链编码序列的填充(completion)-pXHC.1
将上述重链序列中缺失的编码区插入pXHC制备得到质粒pXHC.1(图7)。为了实现这一点，使用含有抗体编码序列的质粒作为模板，通过PCR制备得到一种片段。使用的5’PCR引物为：
    PstI    BamHI
TTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGGGATCCATGGACTGGACCTTGGAGGG(SEQ ID NO：8)。斜体序列对应于BamHI位点5′侧的pXHC序列，粗体序列对应于从重链序列中起始密码子前的两个碱基处开始的序列。所用的3’引物为CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTCCCTTGGCCCC (SEQID NO：9)。该引物与第一外显子(重链可变区)的末端杂交。正如所料得到了445个碱基对的PCR产物，用PstI和StuI切割该产物。将该PstI/StuI片段克隆入经PstI和StuI切割的pXHC以制备pXHC.1。
D.内含子dhfr的去除-pXHC 3
pXHC.1含有hCMV IE1内含子中的dhfr基因。由于这种结构在扩增时可能引发问题，从该内含子除去dhfr基因，并将表达盒插入到重链表达盒的3’(图8)。第一步是去除内含子中的dhfr基因。这一步通过下述方法完成：从pXHC.1中切割出重链编码序列作为PstI/EcoRI片段，然后将其克隆入经同样酶切割的pXLC.1质粒。通过这一克隆步骤容易地将所述质粒中的轻链置换为重链(switched the light chain for the heavy chain)。得到的质粒与pXHC.1相同，除了含dhfr基因的内含子被具有上述pXLC.1缺失的内含子取代外。该重链质粒命名为pXHC.3(图8)。
E.dhfr表达盒的插入-pXHC.5
dhfr构型(configuration)改变的第二步是将dhfr表达盒插入重链表达盒的3’(图9)。所述dhfr表达盒源自于质粒pSI-DHFR的BglII/BamHI片段上，并含有SV40早期启动子、dhfr基因和SV40poly A区域。使用下列衔接子寡聚物，将该片段克隆入位于pXHC.3中hGHv polyA区域3’末端的EcoRI位点：
              SalI
EcoRI相容AATTCGTCGACA(SEQ ID NO：10)
            GCAGCTGTCTAG(SEQ ID NO：11)BamHI/BglII相容
首先将该衔接子连接到经EcoRI切割的质粒，然后将所述BglII/BamHIdhfr表达盒连接到连接了衔接子的(adapted)质粒。该质粒命名为pXHC.5(图9)。
pXLC.2和pXHC.5的定性
使用限制性内切酶对这两种质粒进行分析，验证插入片段的存在和方向。另外，对质粒的编码区进行测序，证实PCR或克隆步骤过程中没有任何突变的累积。
通过下述方法验证功能性neo选择标记的存在：将pXLC.2转染入CHO细胞，证明抗G418的抗性。当将pXLC.2和pXHC.5质粒共-转染入适应无血清条件的(serum free adapted)DG44CHO宿主细胞时，证明能够进行双重选择的能力。在双重选择培养基(含400mg/ml G418的α-MEM 10％dFBS)中，菌落从共-转染物(co-transfection)长出。同样条件下，任一单独的选择培养基(either selection alone)(α-MEM或400mg/ml G418)能杀死未转染的细胞。
载体的构建：pV80和pV90载体
从重链表达载体pXHC.5制备pV80(图10)。使用BamHI去除pXHC.5中的重链编码序列。连接该主链使其在BamHI位点处再环化。
在pV80载体上做两处改变制备pV90(图11)。pV80构建体中第3166位的NotI位点(位于dhfr编码区的末端，参见所附序列)被破坏。为了实现这一点，用NotI消化该质粒，用Klenow聚合酶将突出端“补平(fill-in)”。因此，再连接后的质粒就失去了第3166位的NotI位点。然后，用BamHI消化所述载体，导入NotI接头，在克隆位点创建新的NotI位点，该NotI接头是下列14-mer自身退火制得的：GATCCGCGGCCGCG(SEQ IDNO：12)。当一起退火时，所述接头序列为：
                   Notl
BamHI相容的GATCCGCGGCCGC(SEO ID NO：13)
               CGCCGGCGCCTAGG(SEQ ID NO：14)BamHI相容的
该克隆步骤在NotI位点的两侧各自再建BamHI位点。这些BamHI位点可用于用该载体产生的稳定细胞系的基因分析。通过序列分析验证pV90的克隆位点序列。
在pv80载体中，可以将多核苷酸(例如，编码序列)克隆入BamHI位点GGATCCCTGCCCGGGT(SEQ ID NO：15)。所述粗体序列代表BamH1位点。在pV90载体中，可以将多核苷酸(例如，编码序列)克隆入BamHI或NotI位点GGATCCGCGGCCGCGGATCCCTGCCCGGGT(SEQ ID NO：16)。其中，粗体序列表示BamHI位点，下划线序列表示NotI位点。为了取得使用NotI位点时的最佳结果，应该在PCR引物中起始密码子之前添加“C”以实现与Kozak序列的最佳匹配(例如，GGATCC GCGGCCGC C ATG(SEQID NO：17))。
pV80和pV90中的限制酶切位点
除了NotI限制酶切位点外pV80和pV90完全相同：pV80在第3166位具有单一NotI位点(dhfr编码区的末端)，pV90在第1260位具有单一NotI位点(克隆位点)。
其中的2个或少于2个被发现的共同限制酶切位点(common restrictionsites ofwhich 2 or fewer were found)包括表1中列出的位点。
表1：
AatI(1)        2274              ApaI(1)  1733          AspEI(2) 1382，4807       BamH1(1)  1254
BsgI(1)        1494              BsiXI(1) 3404          ClaI(1)  3404             EgeI(1)   3585
HindIII(2)     2293，6059        HpaI(1)  3308          KasI(1)  3585             Kpn2I(1)  1121
KpnI(2)        1927，3144        NarI(1)  3585          NdeI(2)  254，3637        NheI(1)   2557
NotI(1)        see above         PstI(2)  1231，2331    PvuI(2)  3544，444        0SacI(2)  585，2819
SacII(2)       673，1258         SmaI(2)  1271，3161    SpeI(1)  20StuI(1)2274
XbaI(1)        3150XhoI(1)3127   XmaI(2)  1271，3161
未发现下列常见酶切位点：
表2
AatII   AfaI   AfeI    AgeI     AluI    ApaLI  AspHI   AspI    AvaI     AvaII   BsiWI    DpnI
DpnII   DraI   DraII   DraIII   EaeI    EagI   EarI    EcoRI   EcoRV    FspI    HaeII    HaeIII
HincI   HpaI   NaeI    NcoI     NdeII   NspI   PacI    SalI    SphI     XhoII   XmaIII
报道物基因的克隆
将其中含有CMV IE1、内含子A片段和hGHv polyA构建体的表达盒/载体与以基于商品化SV40的高表达载体进行比较。
使用分泌的碱性磷酸酶(SEAP)作为报道物来比较所述质粒。基于SV40的表达载体pSEAP2-对照(Cat#6052-1，Clontech)能够在SV40早期启动子和SV40增强子的控制下表达SEAP。所述SEAP编码序列后接SV40晚期聚腺苷酸化信号以确保真核细胞中的SEAP转录物能得到正确有效的加工。合成的转录阻遏物(transcription blocker)(TB)由邻接的聚腺苷酸化和转录暂停位点组成，其位于MCS上游，能够减少背景转录。所述载体整合大量以下特性：通过提高SEAP表达的效率提高SEAP敏感性，或改善所述载体的使用(utility)。这些包括：增加Kozak共有序列翻译起始位点；去除SV40小-t内含子，该内含子能够导致隐蔽剪接以及一些基因和/或细胞类型中表达的减少；将SV40的早期聚腺苷酸化信号转换为晚期聚腺苷酸化信号，这通常会引起mRNA水平增加5倍；扩大的多克隆位点(MCS)；压缩(compact)质粒大小；除去SEAP mRNA 3’非翻译区的外源序列。Genbank登录号U89938。
为了制备pCMV-hGHvPA-SEAP质粒，用PCR方法从pSEAP2-对照质粒中提取SEAP编码序列，并将其克隆入pV110载体。pV110质粒是pV90的衍生物(无dhfr表达盒，不同的多聚接头，除此以外都完全相同)。通过测序对所述pCMV-hGHvPA-SEAP质粒构建体进行验证。
用于转染的宿主是二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷的中华仓鼠卵巢细胞系DG44(Urlaub et al.，Cell 33，405-412(1983))。用编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的质粒共-转染CMVSEAP和pSEAP2-对照报道质粒，以便能够筛选出稳定的转染体(pSI-DHFR.2，图12)。每一转染含有50μg报道质粒和5μg pSI-dhfr.2。所有DNA都使用Megaprep试剂盒(Qiagen)制备。在转染之前，用ETOH沉淀DNA，然后用70％EtOH洗涤，干燥，重悬于HEBS(20mMHepes，pH 7.05，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖)，然后在转染前进行定量。用包括pUC18在内的阴性对照(ATCC No.37253)作为报道物对照，用无DNA转染(no DNA transfection)的作为转染对照(表3)。
0.28kV和950mF条件下使用0.4cm样品池(BioRad)，通过在0.8mlHEBS中进行电穿孔，转染细胞和DNA。每次转染都使用5E6细胞。电穿孔脉冲后，让细胞在样品池中于室温保温5-10分钟。然后，将其转移到离心管(含有10ml含核苷及10％dFBS的αMEM)中，然后1K RPM沉淀5分钟。将重悬的沉淀物接种于含有αMEM(含10％dFBS但无核苷)的6-孔平板中，在湿润温箱中，于5％CO2、36℃保温直至菌落形成。
表3  转染试验
  报道质粒(各50μg)  DHFR质粒(各50μg)   转染编号
  pSEAP2-对照   pSIDHFR.2   3
  pCMVSEAP   p SIDHFR.2   3
  pUC18   pSIDHFR.2   1
  无DNA   无DNA   1
转染约2周后，在只含有pSIDHFR.2质粒的转染物中有菌落形成。稳定转染体以合并物(pool)或者分离株方式进行分析。试验测定比繁殖力，其中把培养基换为新鲜的培养基，24小时后从培养基取样，进行细胞计数。将产品滴度标准化为24小时的试验结束时的细胞数目，然后将产率表示为每个细胞的SEAP活性。
SEAP试验.使用the Great EscAPeTM SEAP Reporter System3(clontech)对经调节的培养基(conditioned medium)进行分析。该试验使用荧光底物检测经调节的培养基中的SEAP活性。按照96孔格式(format)使用试剂盒，除了下列内容不同外，按照厂商说明书进行。把试剂盒中的试验缓冲液换为1.5M二乙醇胺，0.75mM MgCl2，15mM L-同型精氨酸(homoarginine)，和10％Emerald II(Cat#9761，Applied BiosystemsBiosystems)。所有标准物和样本都用新鲜的培养基而不用提供的稀释缓冲液来稀释。将只在60分钟后读数1次改为以10-20分钟的间隔时间多次读数，然后使用这些读数结果将SEAP活性表示为每分钟相对荧光单位(RFU/min)。平板读数器(Cytofluor II，PerSeptive Biosystems)使用的发射滤波器(emission filter)为460nm而非推荐的449nm。
根据试剂盒提供的标准物，将RFU/min值相对于标准曲线标准化。由于提供的标准物未定量，所以所有值全都是相对值。将这些相对值相对于细胞数目和孵育期进行标准化，以产生相对比繁殖力(每个细胞每日的SEAP活性)。
合并物.菌落出现后，收集并且合并来自每次转染的细胞。将合并物以每孔～2×105个细胞种植入6-孔平板。第二天，将培养基换为2ml新鲜培养基。24小时后，进行细胞计数，使用培养基的样本测定SEAP活性。合并物试验的结果图示于图13。
分离株.从转染物“挑取(picking)”菌落获得分离株。通过用设定在50ml的P200PipetmanTM从菌落直接吸取完成“挑取”。首先将吸出的菌落转移到48孔平板，然后在有足够数目的细胞时再转移到6孔平板。在将近铺满至铺满细胞密度时，使用上述24-小时试验测定比产率(图14)。
如图13和14概括的那样，基于CMV IE启动子和hGHv polyA信号结构域的组合的表达载体比自称具有高表达能力的商品化载体要好得多。
虽然已经描述了本发明的许多实施方案。但是，显然还可以做各种改变而不脱离本发明的实质和范围。因此，其它实施方案也在下列权利要求的范围之内。
序列表
<110>比奥根艾迪克公司(Biogen Idec Inc.)
 
<120>用于瞬时表达或稳定表达外源分子的表达盒和载体
 
<130>13751-013WO1
 
<150>US 60/448,179
<151>2003-02-14
 
<160>21
 
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
 
<210>1
<211>6069
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>1
agcttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca      60
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc     120
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat     180
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt     240
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc     300
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta     360
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg     420
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt     480
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac     540
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa     600
ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga     660
ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag     720
tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt atgcatgcta     780
tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg tgatggtata     840
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata     900
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt ggctatatgc     960
caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtctcat    1020
ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca gtttttatta    1080
aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggaacgg tggagggcag    1140
tgtagtctga gcagtactcg ttgctgccgc gcgcgccacc agacataata gctgacagac    1200
taacagactg ttcctttcca tgggtctttt ctgcagtcac cgtccttgac acgggatccg    1260
cggccgcgga tccctgcccg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggt    1320
cgtggaaggt gctactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat    1380
tttgtttgac taggtgtcct tgtataatat tatggggtgg aggcgggtgg tatggagcaa    1440
ggggcaggtt gggaagacaa cctgtagggc cttcagggtc tattgggaac caggctggag    1500
tgcagtggca cgatcttggc tcgctgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct    1560
gcctcagtct cccgaatagt tgggattcca ggcatgcacg accaggctca gctaattttt    1620
gtatttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagt ctggtctcca tctcctgacc    1680
tcaggtaatc cgcccgcctc ggcctcccaa attgctggga ttacaggtat gagccactgg    1740
gcccttccct gtcctgtgat tttaaaataa ttataccagc agaaggacgt ccagacacag    1800
catgggctac ctggccatgc ccagccagtt ggacatttga gttgtttgct tggcactgtc    1860
ctctcatgaa ttcgtcgaca gatctgcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga    1920
ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta    1980
gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat    2040
tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc    2100
atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta    2160
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca    2220
gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga    2280
ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa cagtctcgaa cttaagctgc    2340
agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga    2400
gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct    2460
attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat    2520
tacagctctt aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcat ggttcgacca    2580
ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg gcaagaacgg agacctaccc    2640
tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa tgaccacaac ctcttcagtg    2700
gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct ggttctccat tcctgagaag    2760
aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta gagaactcaa agaaccacca    2820
cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct taagacttat tgaacaaccg    2880
gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag gcagttctgt ttaccaggaa    2940
gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa ggatcatgca ggaatttgaa    3000
agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata aacttctccc agaataccca    3060
ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt ataagtttga agtctacgag    3120
aagaaagact aactcgagaa ttcacgcgtg gtacctctag agtcgacccg ggcggccggc    3180
cgcttcgagc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc    3240
agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta    3300
taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg    3360
gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt aaaatcgata    3420
aggatctgtc gacgaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg    3480
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg    3540
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc    3600
tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc    3660
tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg    3720
ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg    3780
tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa    3840
agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga    3900
cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa    3960
tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt    4020
gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg    4080
cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag    4140
atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg    4200
agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg    4260
gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt    4320
ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga    4380
cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac    4440
ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc    4500
atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc    4560
gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac    4620
tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag    4680
gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg    4740
gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta    4800
tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg    4860
ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata    4920
tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt    4980
ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc    5040
ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct    5100
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa    5160
ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag    5220
tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc    5280
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg    5340
actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca    5400
cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat    5460
gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg    5520
tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc    5580
ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc    5640
ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc    5700
cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg    5760
cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga    5820
gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc    5880
attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa    5940
ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc    6000
gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg    6060
attacgcca                                                            6069
 
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>2
tttaagcttg acattgatta ttgactag                                         28
 
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>3
ttttggatcc ctgtcaagga cggtgactgc                                       30
 
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>衔接子寡核苷酸
 
<400>4
gatcgatgaa ttcgg                                                       15
 
<210>5
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>衔接子寡核苷酸
 
<400>5
ctacttaagc cgc                                                         13
 
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>6
ttttggatcc atgtactggg tgaagcag                                         28
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>7
gcccggatcc tcatttaccc ggagacag                                         28
 
<210>8
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>8
ttttctgcag tcaccgtcct tgacacggga tccatggact ggaccttgga ggg             53
 
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>9
ctgaggagac ggtgaccagg gtcccttggc ccc                                   33
 
<210>10
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>衔接子寡核苷酸
 
<400>10
aattcgtcga ca                                                          12
 
<210>11
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>衔接子寡核苷酸
 
<400>11
gcagctgtct ag                                                          12
 
<210>12
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成制备的寡核苷酸
 
<400>12
gatccgcggc cgcg                           14
 
<210>13
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成制备的寡核苷酸
 
<400>13
gatccgcggc cgc                            13
 
<210>14
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成制备的寡核苷酸
 
<400>14
cgccggcgcc tagg                           14
 
<210>15
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成制备的寡核苷酸
 
<400>15
ggatccctgc ccgggt                         16
 
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成制备的寡核苷酸
 
<400>16
ggatccgcgg ccgcggatcc ctgcccgggt          30
 
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成制备的寡核苷酸
<400>17
ggatccgcgg ccgccatg                                                    18
 
<210>18
<211>2660
<212>DNA
<213>人(Homosapiens)
 
<400>18
gaattcagca ctgaatcatg cccagaaccc ccgcaatcta ttggctgtgc tttggcccct      60
tttcccaaca cacacattct gtctggtggg tggaggggaa acatgcgggg aggaggaaag     120
gaataggata gagagtggga tggggtcggt aggggtctca aggactggcc tatcctgaca     180
tccttctccg cgttcaggtt ggccaccatg gcctgctgcc agagggcacc cacgtgaccc     240
ttaaagagag gacaagttgg gtggtatctc tggctgacat tctgtgcaca accctcacaa     300
cgctggtgat ggtgggaagg gaaagatgac aagtcagggg gcatgatccc agcatgtgtg     360
ggaggagctt ctaaattatc cattagcaca agcccgtcag tggccccagg cctaaacatg     420
cagagaaaca ggtgaggaga agcagcgaga gagaaggggc caggtataaa aagggcccac     480
aagagaccag ctcaaggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac     540
agctcactag cggcaatggc tgcaggtaag cgcccctaaa atccctttgg cacaatgtgt     600
cctgagggga gaggcggcgt cctgtagatg ggacgggggc actaaccctc aggtttgggg     660
cttatgaatg ttagctatcg ccatctaagc ccagtatttg gccaatctct gaatgttcct     720
ggtccctgga ggaggcagag agagagagag agaaaaaaaa aacccagctc ctggaacagg     780
gagagcgctg gcctcttgct ctccagctcc ctctgttgcc tccggtttct ccccaggctc     840
ccggacgtcc ctgctcctgg cttttggcct gctctgcctg tcctggcttc aagagggcag     900
tgccttccca accattccct tatccaggct ttttgacaac gctatgctcc gcgcccgtcg     960
cctgtaccag ctggcatatg acacctatca ggagtttgta agctcttggg taatgggtgc    1020
gcttcagagg tggcaggaag gggtgaattt cccccgctgg gaagtaatgg gaggagacta    1080
aggagctcag ggttgttttc tgaagtgaaa atgcaggcag atgagcatac gctgagtgag    1140
gttcccagaa aagtaacaat gggagcaggt ctccagcata gaccttggtg ggcggtcctt    1200
ctcctaggaa gaagcctata tcctgaagga gcagaagtat tcattcctgc agaaccccca    1260
gacctccctc tgcttctcag agtctattcc aacaccttcc aacagggtga aaacgcagca    1320
gaaatctgtg agtggatgcc ttctccccag gtgggatggg gtagacctgt ggtcagagcc    1380
cccgggcagc acagccactg ccggtccttc ccctgcagaa cctagagctg ctccgcatct    1440
ccctgctgct catccagtca tggctggagc ccgtgcagct cctcaggagc gtcttcgcca    1500
acagcctggt gtatggcgcc tcggacagca acgtctatcg ccacctgaag gacctagagg    1560
aaggcatcca aacgctgatg tgggtgaggg tggcaccagg atccaatcct ggggccccac    1620
tggcttccag ggactgggga gagaaacact gctgccctct ttttagcagt caggcgctga    1680
cccaagagaa ctcaccgtat tcttcatttc ccctcgtgaa tcctccaggc ctttctctac    1740
aacctggagg ggagggagga aaatggatga atgagagagg gagggaacag tgcccaagcg    1800
cttggcctct ccttctcttc cttcactttg cagaggctgg aagatggcag cccccggact    1860
gggcagatct tcaatcagtc ctacagcaag tttgacacaa aatcgcacaa cgatgacgca    1920
ctgctcaaga actacgggct gctctactgc ttcaggaagg acatggacaa ggtcgagaca    1980
ttcctgcgca tcgtgcagtg ccgctctgtg gagggcagct gtggcttcta gctgcccggg    2040
tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggtcg tggaaggtgc tactccagtg    2100
cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtttgacta ggtgtccttg    2160
tataatatta tggggtggag gcgggtggta tggagcaagg ggccaggttg ggaagacaac    2220
ctgtagggcc ttcagggtct attcgggaac caggctggag tgcagtggca gtcttggctc    2280
gctgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagtctcc cgaatagttg    2340
cgattccagg catgcaagac caggctcagc taatttttgt atttttggta gagacggggt    2400
ttcaccatat tggccagtct ggtctccatc tcctgacctc aggtaatccg cccgcctcgg    2460
cctcccaaat tgctgggatt acaggtatga gccactgggc ccttccctgt cctgtgattt    2520
taaaataatt ataccagcag aaggacgtcc agacacagca tgggctacct ggccatgccc    2580
agccagttgg acatttgagt tgtttgcttg gcactgtcct ctcatgcatt gggtccactc    2640
agtagatgct tgttgaattc                                                2660
 
<210>19
<211>594
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggtcgt ggaaggtgct     60
actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtttgactag    120
gtgtccttgt ataatattat ggggtggagg cgggtggtat ggagcaaggg gccaggttgg    180
gaagacaacc tgtagggcct tcagggtcta ttcgggaacc aggctggagt gcagtggcag    240
tcttggctcg ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagtctccc    300
gaatagttgc gattccaggc atgcaagacc aggctcagct aatttttgta tttttggtag    360
agacggggtt tcaccatatt ggccagtctg gtctccatct cctgacctca ggtaatccgc    420
ccgcctcggc ctcccaaatt gctgggatta caggtatgag ccactgggcc cttccctgtc    480
ctgtgatttt aaaataatta taccagcaga aggacgtcca gacacagcat gggctacctg    540
gccatgccca gccagttgga catttgagtt gtttgcttgg cactgtcctc tcat          594
 
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>20
ttttggatcc ctgcccgggt ggcatcc                                         27
 
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>21
ttttgaattc atgagaggac agtgccaagc                                      30

Claims (40)

1.表达盒，其中含有：
人CMV立即早期1(hCMV IE1)启动子/增强子区域；
目的多核苷酸；和
变体人生长激素(hGHv)polyA信号结构域，和
长度可变的间插序列(VLIVS)，所述VLIVS含有剪接供体和剪接受体位点，并含有hCMV IE1基因的内含子A
其中所述信号结构域保留了发出转录终止信号和/或稳定mRNA的能力，其中所述hGHv polyA信号结构域在高度严谨条件下与含有SEQ IDNO：18或19所示核苷酸序列的ssDNA杂交。
2.权利要求1所述的表达盒，其中所述的hCMV IE1启动子/增强子区域含有SEQ ID NO：1中x1到x2所示的序列，其中x1表示在SEQ ID NO：1中第1-第20位之间的核苷酸，x2表示在SEQ ID NO：1中第715-第720位之间的核苷酸。
3.权利要求1所述的表达盒，其含有SEQ ID NO：1所示的序列。
4.权利要求1所述的表达盒，其含有与SEQ ID NO：1所示的序列互补的序列。
5.权利要求1所述的表达盒，其中所述的hCMV IE1启动子/增强子区域含有与SEQ ID NO：1的核苷酸1-719或其互补序列具有至少100％同一性的序列。
6.权利要求1所述的表达盒，其含有SEQ ID NO：1的第1-第1867位核苷酸。
7.权利要求1所述的表达盒，其中所述VLIVS含有hCMV IE1基因的内含子A，该基因具有在所述内含子A的剪接受体和剪接供体之间的缺失。
8.权利要求1所述的表达盒，其中所述的VLIVS含有SEQ ID NO：1中x3到x4所示的序列，其中x3表示在SEQ ID NO：1中第715-第720位之间的核苷酸，x4表示在SEQ ID NO：1中第1236-第1254位之间的核苷酸。
9.权利要求1所述的表达盒，还包含其它启动子/增强子元件或调节区。
10.权利要求9所述的表达盒，其中所述启动子/增强子元件是SV40启动子/增强子元件。
11.权利要求9的表达盒，其中所述调节区是SV40聚腺苷酸化区。
12.权利要求1的表达盒，还包含选择标记。
13.权利要求12的表达盒，其中所述选择标记选自以下物质组成的组：二氢叶酸还原酶，GPF，新霉素，Hygro，ZeocinTM，单纯疱疹病毒胸苷激酶，腺嘌呤磷酸核糖转移酶，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，嘌呤霉素N-乙酰转移酶或腺苷脱氨酶。
14.权利要求12的表达盒，其中所述选择标记是二氢叶酸还原酶。
15.权利要求1所述的表达盒，其中所述目的多核苷酸编码治疗剂。
16.权利要求1所述的表达盒，其中所述目的多核苷酸相对于启动子位于反义方向。
17.权利要求1所述的表达盒，其中所述目的多核苷酸是异源多核苷酸。
18.权利要求1所述的表达盒，其中所述目的多核苷酸还包括转录控制元件。
19.权利要求18所述的表达盒，其中所述转录控制元件选自转录终止信号，聚腺苷酸化结构域和下游增强子元件组成的组。
20.权利要求1所述的表达盒，其中所述目的多核苷酸编码用于诊断或治疗的多肽。
21.权利要求1所述的表达盒，其中所述目的多核苷酸编码用作疫苗的抗原多肽。
22.权利要求1所述的表达盒，其中所述hGHv polyA信号结构域含有SEQ ID NO：19的至少100个连续核苷酸。
23.权利要求22所述的表达盒，其中所述hGHv polyA信号结构域包含SEQ ID NO：19。
24.权利要求1所述的表达盒，其为裸露的核酸构建体形式。
25.表达载体，其中含有权利要求1-24中任一项所述的表达盒。
26.宿主细胞，其中含有权利要求25所述的表达载体。
27.宿主细胞，其中含有权利要求1-24中任一项所述的表达盒。
28.制备多肽的方法，包括使权利要求26或27的宿主细胞增殖并使目的多核苷酸表达。
29.权利要求26或27的宿主细胞在制备用于向需要治疗的动物递送治疗剂的递送物质中的用途。
30.权利要求26或27的宿主细胞在制备用于基因治疗的药物组合物中的用途。
31.遗传载体pV40，如图2所示。
32.遗传载体pV60，如图6所示。
33.遗传载体pV70，如图3所示。
34.遗传载体pV80，如图10所示。
35.遗传载体pV90，如图11所示。
36.遗传载体pXLC.1，如图4所示。
37.遗传载体pXLC.2，如图5所示。
38.遗传载体pXHC.1，如图7所示。
39.遗传载体pXHC.3，如图8所示。
40.遗传载体pXHC.5，如图9所示。
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