CN101208435A

CN101208435A - 改进的表达元件

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Publication number: CN101208435A
Application number: CNA2006800173095A
Authority: CN
Inventors: 大卫·约翰·辛普森; 史蒂文·杰兰特·威廉姆斯; 阿利斯泰尔·辛普森·欧文
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2026-05-09
Also published as: EP1891223A2; GB0509965D0; ES2358680T3; ATE494381T1; CN101208435B; DE602006019422D1; US7632661B2; EP1891223B1; JP2008539781A; WO2006123097A3; EP2295589A1; WO2006123097A2; JP5080452B2; US20080097088A1; US20100015107A1

Abstract

本发明涉及能提高可操作相连的转录单元的表达水平的基因元件。尤其是，这些基因元件来自核糖体蛋白基因的5′非翻译区，并可能包括C_pG岛。还提供包含这些基因元件的载体和宿主细胞，以及获得高水平重组基因表达的方法。

Description

改进的表达元件

技术领域

本发明涉及多核苷酸，其包括可改进可操作相连的转录单元表达的元件。这些元件本质上与核糖体蛋白基因启动区相关，并在重组DNA构建体中，基因表达水平高，重复性好。本发明还涉及包括该多核苷酸序列的载体，包括该载体的宿主细胞，以及该多核苷酸、载体或宿主细胞在治疗中的用途，在细胞培养和其它生物技术应用中，用于生产重组蛋白。

背景技术

高等真核生物染色质结构的现行模式假定基因以“域”的形式组织(Dillon，N.&Grosveld，F.Chromatin Domains As Potential Units OfEukaryotic Gene Function.Curr.Opin.Genet.Dev.4，260-264(1994)；Higgs，D.R.Do Lcrs Open Chromatin Domains？Cell 95，299-302(1998))。染色质域被设想为以一个缩合的、“封闭”的转录静止状态存在，或以一个非缩合的、“开放”的可转录构型存在。开放的染色质结构的特征在于增加DNase I的敏感性，使DNA次甲基化，并使组蛋白高度乙酰化，其建立被认为是基因表达开始的一项先决条件。

染色质域的开放和封闭性体现在转基因的行为中，该转基因随机整合到宿主细胞基因组中。同一构建体在整合到小鼠基因组中的不同的位点时，可出现不同类型的组织特异性和发展阶段特异性表达(Palmiter，R.D.&Brinster，R.L.Ann.Ref.Genet.20，465-499(1986)；Allen，N.D.et al.Nature 333，852-855(1988)；Bonnerot，C，Grimber，G.，Briand，P.&Nicolas，J.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6331-6335(1990))。

基因组织的染色质域模型，表明基因控制元件应与基因组活性区域相关，所述控制元件能够建立和保持一个可转录的、开放的染色质结构。

基因座控制区域(LCRS)是一类转录调控元件，其具有重塑长程染色质的能力。LCR在其功能上，可使转基因小鼠中的顺式连接基因，尤其是单拷贝基因完成与整合位点无关而与转基因拷贝数有关的生理层面的表达(Fraser，P.&Grosveld，F.Curr.Opin.Cell Biol.10，361-365(1998)；Li，Q.，Harju，S.&Peterson，K.R.Trends Genet.15：403-408(1999))。最重要的是，这样的表达是组织特异性的。LCR能够阻挡异染色质的扩散，并防止PEV(Kioussis，D.&Festenstein，R.Curr.Opin.Genet.Dev.7，614-619(1997))，其由一系列DNase I高敏感性(HS)位点组成，这些位点可位于所调控基因的5’端或3’端(LI，Q.，HARJU，S.&PETERSON，K.R.TRENDS GENET.15：403-408(1999))。

通过培养生产可产生大量治疗性蛋白产物的哺乳动物细胞系，是一项重要的新兴产业。染色质的位置效应，使该过程变得困难、费时和昂贵。生产这种哺乳动物的“细胞工厂”的最常用的方法为基因扩增，其通过结合耐药基因(例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)，谷氨酰胺合成酶(Kaufman Rj.Methods Enzymol 185，537-566(1990))，以及维持严格的选择压力来诱导。使用包含高表达基因域LCR的载体和取自适当组织的细胞，可极大地简化程序，得到高比例的具有稳定的高表达水平的克隆细胞系(Needham M，Gooding C，Hudson K，Antoniou M，Grosveld F and Hoims M.Nucleic Acids Res 20，997-1003(1992)；Needham M，Egerton M，Millest A，Evans S，Popplewell M，Cerillo G，Mcpheat J，Monk A，Jack A，Johnstone D and Hollis M.Protein ExpRpurif 6，124-131(1995))。

然而，虽然LCR的组织特异性在某些情况下有用，但也是许多应用的主要限制，例如需要在LCR未知的组织中表达的情况，或需要LCR在许多或所有组织中表达的情况。

在美国专利6,689,606及其共同在审专利申请WO 00/0539(纳入本文参考文献中)，描述了一些元件，这些元件在其自然染色体背景下，负责建立跨越基因座的开放的染色质结构，该基因座只由在各处都可表达的持家基因组成。这些元件并非来自LCR，其包括延长的无甲基化的C_pG岛。

在哺乳类动物DNA中，二核苷酸CPG可由DNA甲基转移酶识别，该酶可将胞嘧啶甲基化转化为5-甲基胞嘧啶。然而，5-甲基胞嘧啶不稳定，可转化为胸腺嘧啶。因此，相比较于人们所预期的偶然发生，CPG二核苷酸的发生频率要小得多。然而，在基因组DNA的一些片段中，CPG的发生频率接近于预期，这些序列被称为“C_pG岛”。本文所用的“C_pG岛”，是指具有至少200bp的基因序列，其GC含量至少50％，观察/预期的CPG含量的比值最少为0.6(即CPG二核苷酸含量为预期含量的至少60％)(Gardiner-Green M and Frommer M.J Moi Biol 196，261-282(1987)；Rice P，Longden I and Bleasby A Trends Genet 16，276-277(2000))。

在现有技术中，无甲基化CPG是公知的(Bird et al(1985)Cell 40：91-99，Tazi and Bird(1990)Cell 60：909-920)，其可定义为C_pG岛，在C_pG岛中，相当比例的胞嘧啶残基未被甲基化，且C_pG岛通常延长超过两个间隔很近(0.1-3kb)的背驰转录的基因的5’端。据报道，DNA的这些区域在所有组织的发育过程中，仍然保持低甲基化(Wise andPravtcheva(1999)Genomics 60：258-271)。他们往往与普遍表达的基因的5’端相关，且大约40％的基因呈现出组织限制性表达图谱(Antequera，F.&Bird，A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，1195-11999(1993)；Cross，S.H.&Bird，A.P.Cum Opin，Genet.Dev.5，309-314(1995))，并且已知其是活性染色质的定位区域。

“延伸”的无甲基化C_pG岛，其延伸跨越包含一个以上的转录起始位点的区域和/或延伸多于300bp，优选多个500bp。延伸的无甲基化C_pG岛，其边界是通过在功能上对该区域结合限制性内切酶进行PCR来确定的，这些限制性内切酶在其识别序列上消化(切割)DNA的能力，易受任何一个存在的CPG残基的甲基化状态影响。其中一个这样的酶是HpaII，其可识别并消化C_pG岛中常见的CCGG位点，但此过程只有在中间的CG残基未被甲基化的时候发生。因此，如果DNA未被甲基化，在使用HpaII消化DNA，对包含HpaII位点的区域进行PCR时，由于HpaII消化不会得到扩增产物。如果DNA被甲基化，PCR只会给出扩增产物。因此，除无甲基化区域，HpaII不消化DNA，会发现PCR扩增产物，由此确定“延伸的无甲基化C_pG岛”的边界。

WO00/05393已显示，跨越无甲基化C_pG岛的区域包含两个背驰转录启动子，分别来自人类TATA结合蛋白(TBP)/蛋白组分-B1(PSMBI)和异质性细胞核核蛋白A2/B1(hnRNPA2)/异染色质蛋白1Hsγ(HP1Hsγ)基因位点，这些区域可进行重复性好，在生理水平上的基因表达，它们能够防止杂色表达模式和基因沉默，这通常在着丝粒异染色质内，与转基因整合一起出现。

众所周知，与活性转录启动子相关的无甲基化C_pG岛，具有重塑染色质的能力，并因此被认为是在持家基因位点建立并维持开放域的主要决定因素(WO00/05393)，并由此认为这些元件可增加生产性基因传递事件的比例，并改进转基因表达水平和稳定性。

核糖体是大RNA和蛋白质的复合体，其负责将mRNA翻译成多肽。每个核糖体含有4个核糖体RNA(rRNA)分子和大量核糖体蛋白(目前在哺乳动物细胞中，被认为79个)。核糖体蛋白质的功能包括帮助rRNA折叠，防止细胞核糖核酸酶，并协调蛋白质合成。一些核糖体蛋白质具有额外的核糖体外功能(WOOL，1996，TIBS 21：164-165)。由于不同物种的核糖体在结构和功能上相似，核糖体蛋白的氨基酸序列的保守程度很高，这并不奇怪，在哺乳动物中，大部分核糖体蛋白的序列几乎相同(WOOL etal，1995，BIOCHEM CELL BIOL 73：933-947)。

两个核糖体蛋白反常出现，因为它们是以前肽(PROPEPTIDES，羧基延伸蛋白)与泛素融合的形式表达的。泛素是一种高度保守的具有76个残基的多肽，其参与了各种细胞功能，包括调节细胞内蛋白分解，调控细胞周期及应激反应(HERSHKO&CIECHANOVER，1992，ANNU REV BIOCHEM 61：761-807；COUX ET A/，1996，ANNU REVBIOCHEM 65：801-847)。

泛素由两个不同类别的基因编码。一个是聚泛素基因，其编码泛素重复单元的线性聚合物。另外一个包括编码自然融合蛋白的基因，在此融合蛋白中，单一的泛素分子连接到核糖体蛋白rps27A或rpL40上(Finley et al，1989，Nature 338：394-401；Chan et al，1995，BiochemBiophys Res Commun 215：682-690；Redman&Burris，1996，Biochem J315：315-321)。

PERRY(2005，BMC Evolutionary Biology 5：15)讨论了核糖体蛋白启动子的共同的结构特点。这些启动子可按照TATA盒基序的本质、转录因子结合位点和AUG启动密码子的数量和类型进行分类。然而，这样的分类似乎并不能预测启动子的强度，证据表明，通过测量连接的报告基因的表达，被测的这样的启动子具有等效的转录活性(Hariharan et al，1989，Genes Dev 3：1789-800)。

美国专利6,063,598公开了仓鼠-泛素/S27A启动子，及其促使重组蛋白质高水平生产的用途。但是，并没有暗示它可用于加强主要从其它启动子转录的基因的表达(即一个除仓鼠-泛素/S27A启动子以外的启动子)。

美国专利申请US 2004/0148647公开了一种使用包含仓鼠-泛素/S27A启动子的表达载体的报告基因分析，该启动子功能性连接至目的产物的基因和荧光蛋白报告基因。再次，该申请只公开了构建体，其中目的基因的转录是从仓鼠-泛素/S27A启动子本身开始的。

获得更高、更可靠的表达水平依然是重组基因表达领域的一个目标，尤其是对于体内与离体的治疗应用和体外生产重组蛋白。

发明内容

在本发明的整个说明书和权利要求书中，“包括”与“含有”以及变化的形式，例如“包括”，是指“包括但不限于”，而不是为了(也没有)排除其他部分、添加剂、部件、整数或步骤。

在本发明的整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，单数包含复数。尤其是，使用不定冠词时，除非上下文另有规定，在本说明书可以理解为复数也可以理解为单数。

除非与本文不符，本发明某一方面、实施方案或举例所描述的特点、整数、特征、化合物、化学部分或基团，可理解为适用于本文的任何其他方面、实施方案或举例。

定义

本文所用的启动区，定义为基因组的核苷酸序列，其组成为启动子和转录起始位点，连同上游转录起始位点5kb的5’端序列和下游第一外显子远端的500bp的3’端序列。

5’端非翻译区是指基因组或cDNA序列中编码的翻译起始位点的5’端区域。它包括所有上游调控元件。5’上游序列是指基因组序列中编码转录起始位点的5’端序列。

本文所用的“可转录核酸”，是指一种核酸，当其可操作地连接到功能性启动子和其他调节序列时，能被转录为功能性RNA分子，如mRNA。这些序列可以包括编码可翻译多肽序列的开放阅读框。另外，功能性RNA可能有另一种功能，如核糖RNA，核酶或反义RNA。

“基因”通常指可转录核酸的编码区域，转录开始的启动子，以及其他调控序列，如增强子和3’多腺苷酸信号的结合体。基因组DNA基因中也含有内含子。“转录单元”有时被用来描述功能性的结合，包括至少一个启动子和带有可转录核算的最小调控序列，其往往来源于内含子被剪接掉的cDNA。“顺反子”指的是一种编码单一多肽带有功能性起始和终止信号的核酸。“转基因”意味着基因已被从一个基因组中转移到另一个基因组中，虽然这个术语可以更宽松地适用于包含于重组DNA构建体，如载体中的任何基因或甚至可转录核酸。

启动子和增强子是本领域众所周知的术语，其包括以下特点，仅供举例说明，但不局限于此。启动子为5’顺式作用的调控序列，其与转录起始直接相连。启动子元件包括所谓的TATA盒和RNA聚合酶起始选择(RIS)序列，该序列的功能为选择转录起始站点。这些序列还结合多肽，这些多肽尤其方便RNA聚合酶进行转录起始选择。

简单来说，启动子为定向元件，其作用是起始转录位于下游的少于100个(通常小于50个)核苷酸碱基对(bp)的序列。他们包含许多短共有核苷酸序列，这些核苷酸序列可以作为参与转录起始及多亚基复合物(称为预启动复合物)装配的各种蛋白质的结合位点(Mcknightand Tjian，1987，Cell 46：795-805)。在大多数基因中，这种情况发生在一个非常宽的保守序列(称为TATA盒，TATAAA)中，其与TATA盒结合蛋白(TBP，通用转录因子TFIID的亚基)结合。然后连接由十个以上其他转录因子组成的有序组件，最终形成POL II全酶复合体。RNA转录实际上起始于下游一个约25-30碱基的起始位点(Breathnach andChambon，1981，Annu Rev Biochem 50：349-393)，该位点也与TBP结合。

大部分功能性启动子包含其他上游启动子元件(UPES)，其中最高度保守的是位于上游约70-200bp的CAAT盒(CCAAT，转录因子CBF、C/EBP和NF-1的结合位点)和位于上游类似位置的GC盒(GGGCGG，通用转录因子Sp-1的结合位点)。虽然基准水平的转录仅从TATA盒开始，但对大多数启动子，至少CAAT和GC盒，需要最优水平的转录。

增强子是一种序列，其可非定向地增加位于局部的，但不一定紧靠的(达几kb远)启动子转录(KADONAGA(2004)CELL 116：247-257)。增强子包含有短(8-12BP)共有序列，该序列代表广泛的转录激活蛋白的结合位点(ONDEK ET AL，1988，SCIENCE 236：1237-1244)，其中包括，如NF-1和SP-1，这些转录激活蛋白也与启动子元件相关。这些序列往往串联重复或反向重复。

在一些天然转录单元中，包括许多DNA病毒，如巨细胞病毒非常活跃的立即/早期基因转录单元，增强子和启动子元件在功能上，可结合到一个可有效延伸的上游元件中。

启动子可被调节，响应细胞类型、温度、金属离子或其他因素；或组成型，使转录与这些因素无反应。在许多用途中，一个强大的组成型启动子，可在许多类型的细胞中达到一致的高水平的转录，就算不是全部类型的细胞，也是非常有利的。多年来，用于驱动人巨细胞病毒中的立即/早期基因表达的增强子/启动子元件，已非常广泛用于驱动外源基因在真核表达载体中的表达(FOECKING&HOFFSTETTER，1986，GENE 45：101-105)。

假设核糖体蛋白基因启动区在增强和稳定相连转基因的表达方面可能具有有用的活性，并假设，高表达基因的调控区域可能更容易含有一些元件，这些元件对维持染色质的可转录活性构型是非常有效的。这些元件与异源启动子连接后可产生更开放的围绕该启动子的染色质环境，导致表达增加。本领域技术人员都了解，核糖体蛋白基因启动子可与核糖体启动子区分开来，这种核糖体启动子为RNA聚合酶I型依赖性启动子，从中rRNA被转录。

为验证该假设，从指数性生长的CHO-K1和NS0细胞系中获得RNA，并对13443小鼠基因进行微阵列分析。我们把分析限于具有高C_pG岛含量和双向启动子可能性的元件。以从hnRNPA2调控区域获得的最小有效序列为标准，将选自这些基因的大约3kb的DNA，以NS0基因组DNA为模板，通过PCR扩增。这些序列接下来被克隆到EGFP表达载体内，并与同一载体的hnRNPA2对照一起转染CHO-K1细胞。

结果发现来自两个核糖体蛋白启动区的序列使实验中所用的异源报告基因序列获得一致地高水平表达。在每一种情况下，启动区包含富含GC的序列，该序列从实际启动子元件上游的5’区域一直延伸到第一外显子，而事实上，延伸到了第一内含子。该富含GC序列符合成为延伸的C_pG岛的标准，因为本文定义延伸的C_pG岛为延伸超过300BP。

因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含

A)包含来自核糖体蛋白基因启动区的至少500个连续的核苷酸的元件，

B)异源启动子，以及

C)与所述异种启动子相邻的可转录核酸序列

其中可转录核酸序列由所述异源启动子转录，所述元件可增强其转录水平。优选地，所述元件包括来自于多核糖体蛋白基因的大于1kb，更优选地，大于3kb的5’端非编码序列。

连续核苷酸选自启动子区，其从转录起始位点的上游5kb位点(有义链5’端)延伸至第一外显子远端(3’端)下游500bp位点(有义链3’端)。

优选地，所述核糖体蛋白基因选自：RPSA，RPS2，RPS3，RPS3A，RPS4，RPS5，RPS6，RPS7，RPS8，RPS9，RPS10，RPS11，RPS12，RPS13，RPS14，RPS15，RPS15A，RPS16，RPS17，RPS18，RPS19，RPS20，RPS21，RPS23，RPS24，RPS25，RPS26，RPS27，RPS27A，RPS28，RPS29，RPS30，RPL3，RPL4，RPL5，RPL6，RPL7，RPL7A，RPL8，RPL9，RPL10，RPL10A，RPL11，RPL12，RPL13，RPL13A，RPL14，RPL15，RPL17，RPL18，RPL18A，RPL19，RPL21，RPL22，RPL23，RPL23A，RPL24，RPL26，RPL27，RPL28，RPL29，RPL30，RPL31，RPL32，RPL34，RPL35，RPL35A，RPL36，RPL36A，RPL37，RPL37A，RPL38，RPL39，RPL41，RPLP0，RPLP1，RPLP2及其直系同源基因(orthologue)。更优选地，所述核糖体蛋白基因为RPS3或RPS11。

在一个优选实施例中，该元件包含C_pG岛，优选为延伸的C_pG岛，其具有至少300bp，更优选地，其具有500bp。优选地，C_pG岛未被甲基化。优选地，所述元件包含启动子，该启动子来自核糖体蛋白基因，核糖体蛋白基因的转录是从该启动子自然启动的。这种启动子往往被称为内源性启动子。在一个优选实施例中，该元件进一步包含所述核糖体蛋白基因一个或多个外显子。

优选地，核糖体蛋白基因为一种哺乳动物的基因，尽管这些基因及其启动子和5’端上游序列在不同的物种中高度保守，并可能替代为昆虫基因、线虫基因或酵母基因。不过，优选地，该核糖体蛋白基因为人或啮齿动物基因，更优选地，为小鼠基因。

在一个更优选的实施例中，本发明中的分离的多核苷酸包括序列表中SEQ ID NO：1所示的小鼠rps3核苷酸序列的第38-3154位的核苷酸。可替选地，该多核苷酸包括序列表中SEQ ID NO：2所示的小鼠rps11核苷酸序列的第12-3032位的核苷酸。

在一个方面，除所描述的元件外，该多核苷酸还包括启动子，该启动子本质上不与来自核糖体蛋白基因的所述元件相关。在本实施方案中，异源启动子(有别于可能会或可能不会存在于第一元件中的内源启动子)，位于该元件下游相邻的可操作连接的位置，该元件包含源自核糖体蛋白基因的5’端序列。在此安排下，该核糖体蛋白基因元件可增强由异源启动子指导的表达。

在一个实施方案中，所述启动子为组成型启动子，更优选地，其选自：巨细胞病毒早期/立即启动子、SV40、EF-1α、鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR或HIV2LTR或由此衍生的序列的组合。更优选地，该启动子为巨细胞病毒(CMV)立即/早期启动子。最优选地，该启动子为小鼠或豚鼠CMV立即/早期启动子。

可替选地，所述启动子可以是一个组织特异性启动子，其指导在组织有限范围内的表达。这些启动子是本领域众所周知的，其包括那些来自β-球蛋白、κ和λ免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、肌间线蛋白、酪氨酸酶、CD2、白细胞介素3(IL-3)、肌球蛋白轻链、人黑素瘤抑制活性基因启动子及角蛋白的启动子。在一个特别优选的实施方案中，该启动子为肿瘤选择性启动子，其优先指导一个或多个肿瘤类型的表达。这些启动子的例子包括基于癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、环氧合酶-2(COX-2)、α-甲胎蛋白(AFP)、酪氨酸酶和T细胞因子1-4(TCF)的启动子。

该可转录核酸可编码任何用于体外表达的有用的多肽，优选地，其可选自抗体、抗体的功能性表位结合片段、生长因子、细胞因子、蛋白激酶、可溶性受体、膜结合受体或凝血因子。可替选地，该可转录核酸可编码用于体内或离体基因治疗的治疗性基因。这种治疗性核酸可以通过取代或补充致病缺陷基因的功能而起作用，所引起的疾病如囊性纤维化、地中海贫血症、镰刀性贫血症、范可尼贫血、血友病、重症联合免疫缺陷病(SCID)、苯丙酮尿症(PKU)、α-1型抗胰蛋白酶缺乏症，裘馨氏肌肉萎缩症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症或成骨不全症。可替选地，该可转录核酸可编码选择性地在靶细胞，如恶性癌细胞中表达以杀死该细胞的细胞毒性剂或前药转换酶。这些应用以及很多其他应用，是本领域技术人员众所周知的，本发明在提高治疗性核酸表达的相关内容对熟练的技术人员来讲是显而易见的。

在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包括本发明上述的多核苷酸。优选地，所述载体为一种适应真核基因表达的表达载体。

典型地，所述适应包括(仅作举例，但不局限于此)，提供转录控制序列(启动子序列)，调控细胞/组织特异性表达。适应还包括提供可选择的标记和自主复制序列，皆有助于所述载体在真核细胞或原核宿主中维持。可自主维持的载体称为附加型载体。附加型载体是理想的，因为他们可自我复制，所以不需要整合即可坚持。WO98/07876中描述了这种附加型载体。

这种适应有助于编码基因载体的表达，其包括提供转录终止/多腺苷酸化序列。其还包括提供内部核糖体进入位点(IRES)，该位点可最大化编码基因载体的表达，这些基因排列在双或多顺反子表达盒中。

这些适应是本领域众所周知的。关于表达载体的构建和通用重组DNA技术，有大量出版文献。请参阅，Sambrook et al(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，ColdSpring Harbour，NY and References Therein；Marston，F(1987)DNACloning Techniques：A Practical Approach Vol III IRL Press，Oxford Uk；DNA Cloning：F M Ausubel et al，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1994).

该载体可以是附加型载体或整合型载体。优选地，该载体为质粒。可替选地，该载体可以是病毒，如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、慢病毒或其他反转录病毒。

可替选地，该载体可包含

A)包含来自核糖体蛋白基因启动区的至少500个连续核苷酸的元件；

B)异源启动子；以及

C)多克隆位点，

其中插入到所述多克隆站点的可转录核酸序列能够由所述异源启动子转录，所述元件可增强其转录水平。

本发明的另一个方面，提供了宿主细胞，其包含本文所描述的分离的多核苷酸或载体。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选地，其选自CHO，NS0，BHK，Hela，HepG2。

本发明还提供了一种多肽表达方法，其包括将含有本发明多核苷酸的表达载体插入到本文所描述的适当的宿主细胞中，在合适的条件下，培养所述宿主细胞，使之表达。优选地，所述多肽是一种对治疗有用的多肽。

本发明的另一个方面，提供了一药学制剂，其含有本文所描述的多核苷酸、载体或宿主细胞，和药学上所接受的载体、赋形剂、缓冲剂或介质。

附图简述

图1所示为载体rps3-1005-EGFP的质粒图谱(见实施例1)。

图2所示为载体rps11-1005-EGFP的质粒图谱(见实施例2)。

图3所示为转染后八天，EGFP报告基因被各种rps3构建体在CHO-K1细胞中表达经流式细胞仪分析的结果。图A所示为平均荧光，图B表示表达报告基因到可探测水平的细胞百分比(％阳性细胞)。见实施例1。

图4所示为转染后七天，报告基因被rps11构建体在CHO-K1细胞中表达(流式细胞仪分析)。A和C为总计数，B到E为基于种群中正在表达的细胞的结果。图A所示为在稳定选定的池中细胞的平均荧光，图B所示为阳性细胞百分比(％)。见实施例2。

图5所示为报告基因在稳定转染的NS0细胞中的表达水平，其是受hCMV启动子所驱动，不存在额外的元件，或将8kb的hnRNPA2或3kb的RPS3元件放置到紧邻hCMV启动子的5’端。图A所示为在28天时，稳定池的平均荧光强度，图B所示为阳性细胞百分比(％)。

图6所示为rps11构建体，与图5类似的数据。图A所示为稳定池的平均荧光强度值，由HCMV驱动的构建体，或紧邻启动子的5’端带有8kb的hnRNPA2或3kb的RPS3元件的相同的构建体5’。图B所示为在表达报告基因的池中，细胞的百分比(阳性细胞百分比(％))。

具体实施方式

材料和方法

微阵列分析

按照生产商的操作规程，从约80％汇合的CHO-K1细胞中，用RNeasy RNA提取试剂盒(Qiagen，Crawley，英国)，提取总RNA。使用代表13443已知转录本的小鼠70聚体寡核苷酸文库(Operon V.1)，对总RNA(2μg/μl)进行微阵列表达分析。辛辛那提大学，基因组学及微阵列实验室，根据参照的操作规程(http://microarray.uc.edu)，承担了微阵列分析。

根据增加的荧光，对基因转录本序列进行排列。在先前的研究中，我们详细介绍了HNRPA2B1/CBX3位点作为染色质-重塑元件，使hCMV受益，HNRPA2转录本被确定为基线表达水平。不过，用现有的微阵列分析，HNRPA2转录本几乎检测不到。由于HNRPA2转录本的表达水平为最小的，使用HNRPA2作为我们的参考，已确定3829个序列用于潜在分析。因此，从排序的表达的转录本的最高2％(76个序列)中，根据包含C_pG岛和一个或多个假定/已知转录起始位点的标准，确定了7个序列(见表1)。C_pG岛的位置、大小和GC∶CG比，使用GrailEXP进行了验证(http://compbio.ornl.gov)。假定/已知转录起始位点从NIX blast分析(http://www.hqmp.mrc.ac.uk)和Ensembl数据库(http://www.ensembl.org)确定。

含有C_pG岛的片段的PCR扩增

设计PCR寡核苷酸，根据已知或预计的编码序列结构(见表2)，扩增约3kb片段，该片段包含嵌入启动区的完整的C_pG岛，同时包括约500bp的编码序列。

PCR反应含有特异于每个基因组片段的寡核苷酸组(每种引物2pmol；表2)。使用Failsafe^TM PCR premixes A-F(Cambio，UK)，1单位的Taq DNA聚合酶(Promega，UK)和200ng模板DNA进行PCR扩增。最初变性为96℃，2分钟，进行35个PCR扩增循环(94℃，1分钟，55-60℃，1分钟，72℃，5分钟)。最后延伸步骤(72℃，10分钟)。

按照制造商提供的操作规程，使用GFX DNA纯化柱(Amersham公司，UK)对PCR产物进行凝胶纯化，并按照制造商提供的操作规程(TOPO；Invitrogen，UK)进行TOPOTA克隆

。为克隆到TOPO载体(Invitrogen，UK)中，包含C_pG岛的每个片段获得正义和反义方向。

表达载体构建

将从pEGFP-N1中获得的hCMVI EGFPI sv40pA(Nhe//Age/缺失的多克隆位点)插入到CET 900，然后将该载体的Asc盒插入到CET1005的Asc位点，可构建为对照表达载体(命名为CET1005EGFP，SEQID NO：20)。

除非另有说明，从TOPO2.1(Invitrogen，UK)中的所有C_pG岛片段去除。将Terf2ip Acc651/EcoRV片段插入到1005的Acc65I/SwaI中。将GAPDH的SpeI/SnaBI位点插入到1005的PmeI/XbaI中。将RPS3XbaI//SpeI片段插入到1005的XbaI。将TOPO4.0和TOPO2.1(Invitrogen，UK)中的RPS11和TUBA1EcoRI的平头片段分别去除，并插入到10005的PmeI。最后，将A430106P18Rik(EcoRV)和2510006D16Rik(BstXI)片段也插入1005的PmeI。所有含有C_pG岛的片段均以正义和反义方向紧邻hCMV启动子上游插入。

细胞系和转染

将CHO-K1细胞在HAMS F12(Invitrogen，Paisley，UK)加上4500mg/l L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，10μg/ml青霉素、10μg/ml链霉素和10％(v/v)热灭活胎牛血清(FCS；Invitrogen，Paisley，UK)的培养基中培养。通过电穿孔进行转染，用来自80％汇合培养物的大约10⁷个细胞和BioRad Gene Pulser II^TM装置递送单一脉冲975μF，250V。转染使用2μg线性CET1005EGFP质粒和等效摩尔数量的不同大小的表达载体。选择稳定的转染细胞，并在含有12.5μg/ml硫酸嘌呤霉素(Sigma，UK)的生长培养基中维持。

转基因表达定量

用Becton-Dickinson FACScan分析转染有EGFP报告基因构建体的细胞，采用亲本CHO-K1细胞系作为背景自身荧光对照。

表1序列分析

a.基因库登陆号

b.Enseml描述(http://www.enseml.org/)

c.Gailexp(http://compbio.orni.org/gailexp)

d.Gapd-来自人序列

表2PCR寡核苷酸和扩增子大小

位点	正义链	反义链	扩增子
位点	正义链	反义链	扩增子	Terf2ip	gtagtttctgacttggaaatgt(SEQ ID NO：3)	aactgacctgccatgccattc(SEQ ID NO：4)	2995bp
Gapd	gagcagtccggtgtcacta(SED ID NO：5)	gcagagaagcagacagttatg(SEQ ID NO：6)	3096bp	Terf2ip	gtagtttctgacttggaaatgt(SEQ ID NO：3)	aactgacctgccatgccattc(SEQ ID NO：4)	2995bp
Gapd	gagcagtccggtgtcacta(SED ID NO：5)	gcagagaagcagacagttatg(SEQ ID NO：6)	3096bp	RPS3	cagagcatcaagtacctgtga(SEQ ID NO：7)	taaccactaagccatctctcc(SEQ ID NO：8)	3056bp
TUBA1	caagaacaaggaagctggcc(SEQ ID NO：9)	taaaacccacagcactgtaggg(SEQ ID NO：10)	3049bp	RPS3	cagagcatcaagtacctgtga(SEQ ID NO：7)	taaccactaagccatctctcc(SEQ ID NO：8)	3056bp
TUBA1	caagaacaaggaagctggcc(SEQ ID NO：9)	taaaacccacagcactgtaggg(SEQ ID NO：10)	3049bp	RPS11	aagactgtttgcctcatgcc(SEQ ID NO：11)	ggatgacaatggtcctctgc(SEQ ID NO：12)	3020bp
A430106P18Rik	atggttgtaggttcacgtcc(SEQ ID NO：13)	atccctcacattgccaagcc(SEQ ID NO：14)	3128bp	RPS11	aagactgtttgcctcatgcc(SEQ ID NO：11)	ggatgacaatggtcctctgc(SEQ ID NO：12)	3020bp
A430106P18Rik	atggttgtaggttcacgtcc(SEQ ID NO：13)	atccctcacattgccaagcc(SEQ ID NO：14)	3128bp	2510006D16Rik	acttaagacctgatgcctcc(SEQ ID NO：15)	gctagcttacataggcagcc(SEQ ID NO：16)	2997bp

实施例1rps3元件驱动的表达

SEQ ID NO：1示出了RPS2克隆序列(第38-3154位核苷酸)；SEQID NO：17示出了完整的pRPS3-1005-EGFP质粒的序列；SEQ ID NO：18示出了完整的pCET1015-EGFP质粒序列。

研究EGFP在CHO-K1池中，转染八天后的表达水平，该CHO-K1池只含有hCMV(对照构建体；pCET1005-EGFP质粒；在转染前用Pmel线形化)，以及含有构建体，所述构建体含有8kb的RNPA2片段(pCET1015-EGFP质粒，在转染前用Pmel线形化)和Rps3(pRPS3-1005-EGFP质粒，在转染前用Pmel线形化)。

以含有Rps3的构建体生成的池中，相比较于对照构建体，EGFP表达水平显着增加。添加hCMV启动子上游的Rps3序列，相对于对照或含有hnRNPA2元件的构建体，平均荧光强度分别增加了5.5倍或1.5倍(图3A)。

研究构建体在NS0细胞中的活性。相比较于仅是hCMV启动子，当包含RPS3元件或hnRNPA2元件时，在稳定池中平均荧光强度分别增加了28倍或18倍(图5A)。

在CHO-K1细胞和NS0细胞中，含有hnRNPA2元件时，阳性细胞的比例显著增加，但含有RPS3元件时，这种增幅更大(图3B和5B)。

实施例2rps11元件驱动的表达

SEQ ID NO：2示出了RPS11克隆序列(第12-3032位核苷酸)；SEQ ID NO：19示出了pRPS11-1005-EGFP的完整序列。

将含有Rps11的载体和对照载体(PmeI线性化)转染到CHO-K1和NS0细胞系中，经嘌呤霉素选择后获得稳定的池。通过FACscan分析评估EGFP平均表达水平。

hCMV上游Rps11元件的加入，使得EGFP在CHO-K1细胞池中的平均表达水平，相比较于含有上述RNPA2片段的构建体，增加了1.2倍(图4A)。

以含有Rps11的构建体稳定转染的NS0细胞系，其平均EGFP表达水平，相比较于hCMV和RNPA2构建体，(分别)增加了1.8倍和1.5倍。

相比较于RNPA2构建体，以Rps11构建体转染的CHO-K1细胞系，其阳性细胞比例增加(图4B)。此外，相比较于hCMV和RNPA2构建体，以Rps11构建体转染的NS0细胞池，其阳性细胞比例增加(图6B)。

序列表

<110>密理博公司(Millipore Corporation)

<120>改进的表达元件(Improved expression elements)

<130>SCT075082-47

<160>20

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>3145

<212>DNA

<213>Mus musculus rps3

<400>1

ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc gcccttataa ccactgagcc atctctccag 60

ccctgagtca tgattttagt gtgagaggca tcattgaatt ttctgagcac ggccatcagg 120

gtagctggca caggtcttca gatacaagga gatagttata agaaggcagc catggctgtg 180

gtgcactaga aatggagaaa cagcttcatc aggtgacaga ccagtctgac tctgtcccat 240

gattagaagc catcttgtta caaggtcaaa ataagttcat tcctgttttc tgtaacactt 300

gggtttgatc ctgtcgtcaa cccattttct ggaatttgac atgttccata ctccattata 360

ccctgacttc caccctgata agatgttctg ccaagttcct gtgtagccaa cattcccctg 420

gaaatctctc ttcccttgga aaccacctag tcttagaaat tttgagttat ataaattcca 480

cttctatgtt tgatgctatt ctttaaaact ccactttagg gagatagccc tgtctgatag 540

aaaataaaac ttgcttaatt tgtctaaaag agtttaagta atagttttta cttttgttcc 600

gtgggattaa tacagggtga aacagactcc cgtgtttcca gtgtgaagtg agccacacac 660

tgcagtacaa gttatatcag caggttctgc ctctgggcaa tgaacttttg cttgtgtgga 720

catcagggtc tgtgtgaagg gaaggtccta tggcctagat ttatactatt caacagtctg 780

tccccgaagc cctggtgctt tattattttg acaagcccct gctgctggta ttccaccctg 840

ctgcgagtca aaaaagttcc tgtctcggaa aaacaaaaca aaacaaaaca accaaaaaat 900

aaaatttttt tttcccacag gttctagtgg aggtgctcac taccagaaat cctacaaata 960

agcccatctc atggatcagg gtttaccttt gtaataatat taaatctgtg tgcatgtgcg 1020

cacgcatgtg ttttatgctt gcatatatgt atacgcagcc atggttttct actgtcccac 1080

tcactctgta acttactgag ccatccagct ggtcctctaa atacatttca atgaaagttt 1140

tcattagcgt gaacgtgaag gtggtaaaat ctgttagtgt gtgcttatgc ctgtggtttg 1200

cacctctagt ctgaaggttg ctcttttcaa attttttatt tatttacgtt tttacttttg 1260

agtcagaaac tcataaaggc caagctggcc tcgaattcgc tatgtagtca atgatgacct 1320

taaacttgtg accctctact tcgttagtgc tggaacccca agcttgctga gtacagagca 1380

ctttcagacc ggaactagat gtctacttcc tgttccgcct acattacagg ttgctaggtt 1440

acaccccccc tacgccgttt tagacgcaaa acttcatttc ccatgcaaaa cttcatttcc 1500

catgaacact tgcaagggtc gccgcgctgc gcggcgtcat tgctcccgcc ctatatacct 1560

acttccgccc gcgagccact tcctttcctt tcagcggcgc gcggctgcaa gatggcggtg 1620

cagatttcca agaagaggaa ggtaagcgtc tgggcccggt tcgggagtcc gccgcgggtt 1680

ctacaagtgc cagggaggcc tgtggctccg tgatcagtcc tgtggagcgt ctggggccgc 1740

ctgccgtctc ttcgagcctc ggatggccgt agattgtgta ttgggccgga gccgggcgag 1800

tgctgtgtgc ctgggcaagg gagggacaaa ctcctcgagt tctggaccga ctcgaacacc 1860

gggcgcctcc agttccggac tagacacctt tgagcgtttc ttggtctcca taatagtaat 1920

cctgtggcac agttagaggg cgtgtgccat cagatctagt ccagtttctt tagtaagtga 1980

agtttagcag tcccttctct tagtcgcgtg atcctgcaag tggccatagt tgaaagccta 2040

cttactgact gctgccgtgt tcactcggga cccggagctg cagcgtccct gtggttatca 2100

tttcatgggg gaaaagtgtg caggttgcca ggtttagaaa tagatggtct gtcgtttgtg 2160

cttatgcaca cagatgataa acctgttttg agtcaggatt cctctcctat ccgaggtaca 2220

acttacagtc ccagctgtac atgtgctact tggagacaga tttttctttg tctcttgggt 2280

gtagattatg ccgtagagcc cttcgatgaa gaggtgatga cgagtctgag taggaagtgt 2340

tgtctttgtc caagatgcct cactatgctg cgttctgtgg cacagctgaa agcactgtgg 2400

tcaaaagaaa cttcctaaag atgaccaaga ggcatttgtc tgagaagggt tgctgctttt 2460

ctgtagggcc attgggcttg ctctgactaa ccctgtcttc acctcagagg taacttgttt 2520

cctttggttc agtttgtagc tgatggcatc ttcaaagctg agctgaatga atttctcact 2580

cgggagctgg ctgaagatgg ctactctgga gttgaagtcc gagttacacc aaccaggaca 2640

gaaatcatta ttttagccac caggtagaaa taccattgat tgtcacctgt aaatactgtg 2700

tgtactgaga tgctgtgtaa acttgggcca accaagcagt aaatctggcc tcagtgggtg 2760

taactgcttt gttagaactg catttgggaa gaacttacct tccatttaac gtgtgtgctg 2820

gcgttgtggt gggcggcagg tgggatcttg agtaaatggt tgcgcttccc ctctacagga 2880

cacagaatgt tcttggggag aagggtcgtc ggatcagaga gttgaccgca gttgtccaga 2940

agcgctttgg cttccctgaa ggcagcgtag aggtgagttc ctctgcttta tctcccgggg 3000

gttttagact gagttgggat gtggcttctg ctatagaatt gtacttctga aaacctgaca 3060

tggccagtga cagtcacagg tacttgatgc tctgagggcg aattctgcag atatccatca 3120

cactggcggc cgctcgagca tgcat 3145

<210>2

<211>3039

<212>DNA

<213>Mus musculus rps11

<400>2

aattcgccct taagactgtt tgcctcatgc ctgcctggcc tgcccttcct ccgccgccaa 60

ctagggaagt ggggaccaaa ggttccttag gcactgctcc tgtgggtaga ggggacatta 120

gagagctgac agcgcaccac ctgcatgagt ttttattaaa gtgcaaacca tgggatgaat 180

cagttgagct tcagtgttga aaatgagtag cagggctgcc ccacccacct gaccaagtac 240

cctattctgc agctatgaaa atgagatctg cacatgagct ggggttcaca agtgcacact 300

tggagcactg ccttgctcct tcccagcaga ccacaaagca gtatttttct ggaggatttt 360

atgtgctaat aaattatttg acttaagtgt gtacgatgtg tgctgtgcag agaggggcag 420

agggcaccag caggtcatct gcatgggggg cccctttggg tgaatccttg ctcacgggat 480

aggctttgtt gctcaaaagt tgcagatata catcttgggt cctgtcctag atggtgttac 540

tgtaagtcag caccaagata caagagctgg tacctggact gtaggaggtc aggccatgac 600

acaaaggctg ggactaaagg catttaccac gcctgagtct tctggttctt taaacatcaa 660

atccttccgg gggctggcga gatggctcag tggttaagag cacagactgc tcttacgaag 720

gatccgagtt caaatcccag caaccaaatg gtgcctaaca actatccata atgaaatctg 780

atgccctctt ctggagtatc tgagaacagc tacagtgtac ttacatataa tcttaaaaat 840

gcttcccatg ttaaccacca ctagagtttt tattacagct agctgacctg gaagccaagt 900

ccttatgcct ccgtgagtgc tggggttaaa aagatccagc accactcaaa atgtcaatct 960

attttgaaaa tatgctttat actgttctag cccatctgtg cagggctaga acggtgaata 1020

cgagaaactg acacaagctt ttgccacctg gctaaatggt tcctctatta cctggggtgg 1080

tcacctaagg ttagacactc atccacgagt agtcaggaca taaacccatc aaagtgtggg 1140

tagacgcgca gcctgagata ctgtcaacaa aggacatgcg accttggtga cgtcggcctt 1200

taataaaagg aagaaaggtt gactattcgg tcgacgctgg ctgctcctga catcgtatgg 1260

cagatactct gctgtaaagc ggttcacccc tttcttgaga cccgctctgc acggccgctt 1320

ctctctggaa actgaatccc agcacgtgtt tcccaacccg tacggcacgc cttctccgcc 1380

ctaagcctcg ccgtaccaca tgatgcacgt ttcctccaca tcgtgctcct gaaatctcgc 1440

gagatgatag gatcttcccg ccccttagtc ctcccccgtc atggcggcgt acggacagtc 1500

ccaggaacgc gggctctcgc cggaagtacc tcccacctcc gtgaggataa ccccgcgtca 1560

cttccgcccc gacctcgcgt ggtgaataag gaagccggga gcggccctgc ctctcccttt 1620

ctccggcggc cgggaagatg gcggacattc aggttcgagc gtttagttgc tttcccccga 1680

cgcttcggtg tggagcgtat cccttggcgt cctcgttgtc ttacgcatta gctgaagcga 1740

ggatgcctgc gaatgccttc gtctcaggcg gctcggaaat ccgggctcta cgcagtaatg 1800

gggtccctgg cgcttcggga gttggttctt aaagctcaga gcttaacggg tgagggattg 1860

tggcgggagg agggcatcct gcggcgcggg agtcctgcgg cggcagagcc ggggacactg 1920

ggtaaagcag gttttttccc cttgatggag actgaggccc ggacctcgtg cgctctacgg 1980

cagggctgcg gtcccgacct cgctgtagtt ttcagtgtga gcgcagctct ggcctcgatg 2040

agcttaggct tgtcttaaac ttgccatcct gcctcaacct caaccgggat gacagatccg 2100

gcccaccagg ctcggctacg tggacataag cttgaatccc gaatgagtgg atttgtatgt 2160

tttggaggtc cagtctggct gaaaagctct ttttgatctc agccgtgagt tctgcaggct 2220

gtggaggtgt tagatgggac gcagtgtgtg agctaaacta gacttggggt ggttggagag 2280

ccctgaccag ccggttttgg cgattggggc aaataaggtt gaaggtagga aggaagaaat 2340

attgtctctg atttccttga actttacctg caacctcacc aaattctcat ccctacagac 2400

ggagcgtgct taccaaaagc agcctacgat ctttcaaaac aagaagcggg ttctgctggg 2460

agaaaccggc aaggaaaaac tccctcggta ctacaagaat atcggtctag gcttcaagac 2520

gcctaaagag gtacaggacc ctccagcaga tgagatccct gctgccctgc acgtgtggga 2580

gcacagccac cccgccccct tcacagtggc ttcccatggg cccctgggaa ttgtagtatg 2640

ggccctgagg cgtcatcctt ggttctgttt aggaagtggt aatctaaacc ccactttctt 2700

aactttgcag gctattgagg gtacctacat agacaagaaa tgccccttca ctggtaacgt 2760

ctccatccga ggtcggatcc tgtctggtga gtgggatgtt ggaagggtgg ttctaggttc 2820

ctgcgtccag gggcgctggc aagtgatgtc tgttctcacg atggtcttca gatgtcctct 2880

agggcactgc tgagacagcc agttgacaaa gctgatgcca taaatggagc ttcttgggag 2940

ccccgttcaa ctgactccta cctgctaaca cctttctgtt actctcccag gtgtcgtgac 3000

gaagatgaag atgcagagga ccattgtcat ccaagggcg 3039

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>3

gtagtttctg acttggaaat gt 22

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>4

aactgacctg ccatgccatt c 21

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>5

gagcagtccg gtgtcacta 19

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>6

gcagagaagc agacagttat g 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>7

cagagcatca agtacctgtg a 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>8

taaccactaa gccatctctc c 21

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>9

caagaacaag gaagctggcc 20

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>10

taaaacccac agcactgtag gg 22

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>11

aagactgttt gcctcatgcc 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>12

ggatgacaat ggtcctctgc 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>13

gtggttgtag gttcacgtcc 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>14

atccctcaca ttgccaagcc 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>15

acttaagacc tgatgcctcc 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic PCR oligonucleotide

<400>16

gctagcttac ataggcagcc 20

<210>17

<211>8691

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Vector pRPS3 1005 EGFP

<400>17

cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attgggtacc 60

gggccccccc tcgaagttta aacatttaaa tctagtaacg gccgccagtg tgctggaatt 120

cgcccttata accactgagc catctctcca gccctgagtc atgattttag tgtgagaggc 180

atcattgaat tttctgagca cggccatcag ggtagctggc acaggtcttc agatacaagg 240

agatagttat aagaaggcag ccatggctgt ggtgcactag aaatggagaa acagcttcat 300

caggtgacag accagtctga ctctgtccca tgattagaag ccatcttgtt acaaggtcaa 360

aataagttca ttcctgtttt ctgtaacact tgggtttgat cctgtcgtca acccattttc 420

tggaatttga catgttccat actccattat accctgactt ccaccctgat aagatgttct 480

gccaagttcc tgtgtagcca acattcccct ggaaatctct cttcccttgg aaaccaccta 540

gtcttagaaa ttttgagtta tataaattcc acttctatgt ttgatgctat tctttaaaac 600

tccactttag ggagatagcc ctgtctgata gaaaataaaa cttgcttaat ttgtctaaaa 660

gagtttaagt aatagttttt acttttgttc cgtgggatta atacagggtg aaacagactc 720

ccgtgtttcc agtgtgaagt gagccacaca ctgcagtaca agttatatca gcaggttctg 780

cctctgggca atgaactttt gcttgtgtgg acatcagggt ctgtgtgaag ggaaggtcct 840

atggcctaga tttatactat tcaacagtct gtccccgaag ccctggtgct ttattatttt 900

gacaagcccc tgctgctggt attccaccct gctgcgagtc aaaaaagttc ctgtctcgga 960

aaaacaaaac aaaacaaaac aaccaaaaaa taaaattttt ttttcccaca ggttctagtg 1020

gaggtgctca ctaccagaaa tcctacaaat aagcccatct catggatcag ggtttacctt 1080

tgtaataata ttaaatctgt gtgcatgtgc gcacgcatgt gttttatgct tgcatatatg 1140

tatacgcagc catggttttc tactgtccca ctcactctgt aacttactga gccatccagc 1200

tggtcctcta aatacatttc aatgaaagtt ttcattagcg tgaacgtgaa ggtggtaaaa 1260

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ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 13260

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<212>DNA

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cacccacctg accaagtacc ctattctgca gctatgaaaa tgagatctgc acatgagctg 360

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ggcggggcgg gcgcccgaag gtcctccgga ggcccggcat tctgcacgct tcaaaagcgc 5340

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ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct cgcagccaac gtcggggcgg caggccccca 6480

gcttttgttc cctttagtga gggttaattt cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 6540

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 6600

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 6660

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagcatcg cgagcacttt tcggggaaat 6720

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 6780

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 6840

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 6900

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 6960

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 7020

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 7080

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 7140

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 7200

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 7260

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 7320

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 7380

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 7440

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 7500

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 7560

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 7620

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 7680

cattggtaac tgtcagactc gcgacactgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 7740

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 7800

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 7860

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 7920

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 7980

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 8040

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 8100

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 8160

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 8220

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 8280

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 8340

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 8400

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 8460

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 8520

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 8580

actca 8585

<210>20

<211>5546

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Vector pCET 1005 EGFP

<400>20

cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attgggtacc 60

gggccccccc tcgaagttta aacatttaaa tctagaagct tatcgatacc ggtggcgcgc 120

caattgaatt aagatctggc ccaatgggcc gtacgaattc gagctcggta cccggggatc 180

ctgatctaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 240

gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 300

acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 360

tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 420

agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 480

atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 540

atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 600

tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 660

gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 720

cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg tcgccaccat 780

ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg 840

cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg 900

caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct 960

cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca 1020

gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt 1080

caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt 1140

gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa 1200

gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg 1260

catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga 1320

ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta 1380

cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct 1440

gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaaag 1500

cggccgcgac tctagatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 1560

aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt 1620

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 1680

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 1740

taactagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttaccggtgg cgcgcgcgcc aattgttaat 1800

taagatctgg cccaatgggc cgtacgaatt ccttaggcta ccgggtaggg gaggcgcttt 1860

tcccaaggca gtctggagca tgcgctttag cagccccgct gggcacttgg cgctacacaa 1920

gtggcctctg gcctcgcaca cattccacat ccaccggccg gtaggcgcca accggctccg 1980

ttctttggtg gccccttcgc gccaccttct actcctcccc tagtcaggaa gttccccccc 2040

gccccgcagc tcgcgtcgtg caggacgtga caaatggaag tagcacgtct cactagtctc 2100

gtgcagatgg acagcaccgc tgagcaatgg aagcgggtag gcctttgggg cagcggccaa 2160

tagcagcttt gctccttcgc tttctgggct cagaggctgg gaaggggtgg gtccgggggc 2220

gggctcaggg gcgggctcag gggcggggcg ggcgcccgaa ggtcctccgg aggcccggca 2280

ttctgcacgc ttcaaaagcg cacgtctgcc gcgctgttct cctcttcctc atctccgggc 2340

ctttcgacca gcttaccatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc acccgcgacg 2400

acgtccccag ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc gccacgcgcc 2460

acaccgtcga tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa ctcttcctca 2520

cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc gcggtggcgg 2580

tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca 2640

tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc ctcctggcgc 2700

cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg cccgaccacc 2760

agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg 2820

gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg 2880

gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg tgcatgaccc 2940

gcaagcccgg tgcctgacgc ccgccccacg acccgcagcg cccgaccgaa aggagcgcac 3000

gaccccatgc atcgtagacg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 3060

tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 3120

cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctagggg 3180

gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta tgacggcaat 3240

aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc 3300

ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat acgcccgcgt 3360

ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa 3420

cgtcggggcg gcaggccccc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt tcgagcttgg 3480

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 3540

acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 3600

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagcatc 3660

gcgagcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 3720

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 3780

aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 3840

tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 3900

ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 3960

tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 4020

gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 4080

aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 4140

agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 4200

acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 4260

actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 4320

accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 4380

actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 4440

cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 4500

cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 4560

gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 4620

ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagact cgcgacactg cattaatgaa 4680

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 4740

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 4800

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 4860

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 4920

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 4980

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 5040

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 5100

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 5160

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 5220

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 5280

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 5340

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 5400

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 5460

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 5520

ctgacgctca gtggaacgaa aactca 5546

Claims

1.一种分离的多核苷酸，其包括

b)异源启动子，以及

c)与所述异源启动子相邻的可转录核酸序列，其中可转录核酸序列由所述异源启动子转录，以及所述元件增强其转录水平。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述的核糖体蛋白基因选自RPSA，RPS2，RPS3，RPS3A，RPS4，RPS5，RPS6，RPS7，RPS8，RPS9，RPS10，RPS11，RPS12，RPS13，RPS14，RPS15，RPS15A，RPS16，RPS17，RPS18，RPS19，RPS20，RPS21，RPS23，RPS24，RPS25，RPS26，RPS27，RPS28，RPS29，RPS30，RPL3，RPL4，RPL5，RPL6，RPL7，RPL7A，RPL8，RPL9，RPL10，RPL10A，RPL11，RPL12，RPL13，RPL13A，RPL14，RPL15，RPL17，RPL18，RPL18A，RPL19，RPL21，RPL22，RPL23，RPL23A，RPL24，RPL26，RPL27，RPL27A，RPL28，RPL29，RPL30，RPL31，RPL32，RPL34，RPL35，RPL35A，RPL36，RPL36A，RPL37，RPL37A，RPL38，RPL39，RPL41，RPLP0，RPLP1，RPLP2。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述的核糖体蛋白基因是RPS3或RPS11。

4.根据权利要求1至3所述的多核苷酸，其中所述元件包含来自核糖体蛋白基因启动区的至少1000个连续的核苷酸。

5.根据以上任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述元件包括所述核糖体蛋白基因的一个或多个外显子。

6.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述元件包括C_pG岛。

7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述元件包括延伸的C_pG岛。

8.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述元件包括延伸的无甲基化的C_pG岛。

9.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中核糖体蛋白基因是哺乳动物的基因。

10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中核糖体蛋白基因是鼠类基因。

11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

12.根据权利要求10所述的多核苷酸，其包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

13.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中核糖体蛋白基因是人类基因。

14.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述异源启动子为组成型启动子。

15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述组成型启动子选自：巨细胞病毒早期/立即启动子、SV40、EF-1α、鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR和HIV2LTR。

16.根据权利要求1-13任一项所述的多核苷酸，其中所述异源启动子为组织特异性启动子。

17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中异源启动子为肿瘤选择性启动子。

18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述启动子选自：基于癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、环氧合酶-2(COX-2)、α-甲胎蛋白(AFP)、酪氨酸酶和T细胞因子1-4(TCF)的启动子。

19.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述可转录核酸编码一种多肽，所述多肽选自：抗体、抗体的功能性表位结合片段、生长因子、细胞因子、蛋白激酶、可溶性受体、膜结合受体、凝血因子等。

20.一种载体，其包含前述权利要求中任一项所述的多核苷酸。

21.根据权利要求20的真核表达载体。

22.一种真核表达载体，其包括：

b)异源启动子；以及

c)多克隆位点，

其中插入到所述多克隆位点的可转录核酸序列能够由所述异源启动子转录，以及所述元件增强其转录水平。

23.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1-19任一项所述的分离的多核苷酸，或权利要求20-22任一项所述的载体。

24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中该细胞选自：CHO、NS0、BHK、HeLa、HepG2。

25.一种多肽的表达方法，其包括将根据权利要求21或22所述的表达载体插入到合适的宿主细胞中，并将该宿主细胞在合适条件下培养，使其表达。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽是一种治疗用的多肽。

27.一种药物制剂，其包含根据权利要求1-19任一项所述的多核苷酸，根据权利要求20-22任一项所述的载体，或根据权利要求23或24所述的宿主细胞，和药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂或介质。