CN101627123A - 消除基因扩增的高表达细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备高效价重组蛋白而无需基因扩增的方法、细胞系和试剂盒。

Description

消除基因扩增的高表达细胞系

相关申请

[0001]本申请要求2007年1月8日提交的美国临时专利申请60/872,162的优先权，其全文包含在此作为参考。

[0002]本申请涉及2007年1月8日提交的美国临时专利申请60/897,221，以及2008年1月8日提交的题为“在存在降低水平的一或多种污染物的条件下制备重组蛋白的细胞培养方法”的美国申请(attorneydocket no.MCA-844 US)，全文包含在此作为参考

[0003]每篇专利申请的全文内容都包含在此作为参考，包括但不限于，说明书，权利要求书，摘要以及任何图示，表，图例等。

技术领域

[0004]本发明涉及重组蛋白表达技术的领域。更具体地，本发明提供了在细胞培养物中产生高效价重组蛋白而无需基因扩增的方法、细胞系以及试剂盒。

背景技术

[0005]适合作为治疗剂、诊断剂和/或研究试剂的重组蛋白的制备是生物技术领域已知的。通常，所述方法的范围包括鉴定产生合适产物的克隆，大规模生产，和产物纯化，并且通常费时费力，需要大量时间、劳动和资源。

[0006]稳定基因表达通过将重组基因插入宿主基因组获得。然而，重组细胞系的鉴定和定性成本高，耗时长。该过程中一个明显的限制性步骤是鉴定并选择以高产率表达靶蛋白的稳定转染的克隆，所述的产率为接近40-50pg/细胞/天。通常所述过程涉及多轮利用选择性标记的基因扩增步骤，以鉴定表达适当的量的靶蛋白的克隆，由此使得整个过程耗时费力。

[007]因此，需要简便并更有效的在细胞培养物中制备靶产物的方法。

发明内容

[0008]一些实施方案中，本发明涉及用于在细胞培养物中制备高效价重组蛋白而无需基因扩增的改进的方法、细胞系和试剂盒。

[0009]一些实施方案中，提供了在细胞培养物中制备高效价重组蛋白而无需基因扩增的方法。所述方法包括将下述核酸分子导入一或多个细胞，所述核酸分子包含可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多个DNA元件，其中所述核酸分子利用高效转染导入一或多个细胞

[0010]高效转染包括将核酸分子导入至少50％或以上，或至少60％或以上，或至少70％或以上，或至少75％或以上，或至少80％或以上，或至少85％或以上，或至少90％或以上，或至少95％或以上，或至少96％或以上，或至少97％或以上，或至少98％或以上，或至少99％或以上或100％的利用本发明的方法转染的细胞。

[0011]一方面，高效转染包括受控电穿孔，其包含以下步骤：1)将一或多个细胞置于电穿孔装置中，所述电穿孔装置包含具有适合接受一或多个细胞的一或多个开口的隔板；2)将所述一或多个细胞固定在所述一或多个开口内；3)将所述一或多个细胞与所述核酸分子接触；4)使所述一或多个细胞与电流接触使得电流通过所述细胞；5)监测电穿孔装置中电流和电压的比值；和6)调节局部场强的量级使其适合实现对一或多个细胞的电穿孔。

[0012]一些实施方案中，所述一或多个细胞与核酸分子接触，然后与电流接触。其他实施方案中，所述一或多个细胞与电流接触然后与核酸分子接触。其他实施方案中，所述一或多个细胞同时与核酸分子和电流接触。

[0013]一些实施方案中，所述隔板包含绝缘材料。一些实施方案中，所述一或多个开口的直径小于所述一或多个细胞的直径。其他实施方案中，所述一或多个开口的直径基本等于所述一或多个细胞的直径。一些实施方案中，一或多个开口的至少80％，或至少90，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或100％被电穿孔的一或多个细胞堵塞。

[0014]一些实施方案中，所述一或多个细胞通过施加压力固定在一或多个开口处。其他实施方案中，所述一或多个细胞通过施加真空固定于开口。

[0015]一些实施方案中，所述电穿孔包含两个小室，每个都适合接受缓冲液。每个小室可包含相同或不同的缓冲液。

[0016]另一方面，高效转染包括受控电穿孔，所述的受控电穿孔包括以下步骤：1)将一或多个细胞置于包含至少一个伸长毛细管的电穿孔装置中，所述伸长毛细管的管腔具有第一和第二末端，其中第一末端和第二末端的开口都进入储池中并且一或多个细胞可流经至少一个毛细管管腔进入储池；2)将一或多个细胞与包含与编码重组蛋白的核苷酸序列可操作连接的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件的核酸接触；3)使所述一或多个细胞与电流接触使得电流通过该一或多个细胞；4)监测电穿孔装置中电流和电压的比值；和5)调节局部场强的量级使其适合实现对一或多个细胞的电穿孔。

[0017]一些实施方案中，所述一或多个细胞与核酸分子接触，然后与电流接触。其他实施方案中，所述一或多个细胞与电流接触然后与核酸分子接触。其他实施方案中，所述一或多个细胞同时与核酸分子和电流接触。

[0018]一些实施方案中，一或多个细胞的直径为所述一或多个毛细管的管腔的直径的至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％。其他实施方案中，所述一或多个细胞的直径超过所述一或多个毛细管的管腔的直径。其他实施方案中，多个细胞占据所述一或多个毛细管的管腔内部总面积的至少80％或以上。

[0019]反之，一些实施方案中，至少一或多个毛细管的直径比所述一或多个细胞的直径多大约20％。其他实施方案中，一或多个毛细管的管腔的直径比所述一或多个毛细管的管腔内的多个细胞周界的直径多至少20％。

[0020]一些实施方案中，根据本发明的各个方面，电场强度为大约150-500V/cm。其他实施方案中，电场强度为大约200-400V/cm。其他实施方案中，电场强度为大约250-350V/cm。具体实施方案中，电场强度为大约400V/cm。

[0021]一些实施方案中，纳米颗粒或磁性颗粒用于高效转染。

[0022]一些实施方案中，所述核酸分子是载体，例如质粒或病毒载体。

[0023]一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，诸如例如BHK21细胞，CHO细胞，CHO-K1细胞，CHO-DUXX细胞，NSO细胞或Sp2/0细胞。一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。

[0024]一些实施方案中，重组蛋白是治疗蛋白。其他实施方案中，所述重组蛋白是抗体(例如单克隆抗体)或其抗原结合片段。

[0025]一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件选自：(a)一或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b)一或多种基质附着区；(c)一或多种稳定化区和抗阻遏区；以及(d)(a)-(c)的任意组合。

[0026]一些实施方案中，一或多种延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在表达的基因的启动子区。遍在表达基因的例子包括但不限于，人hnRNPA2基因，大鼠hnRNPA2基因，小鼠hnRNPA2基因，人TBP基因，小鼠TBP基因，人rpS3基因和小鼠rpS3基因。

[0027]一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在的DNA元件。其他实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是人工合成的DNA元件。其他实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在和人工合成的DNA元件的组合。

[0028]一些实施方案中，所述核酸分子还包括一或多个选自下组的核苷酸序列：(a)能增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。

[0029]其他实施方案中，本发明制备高效价重组蛋白的方法不包括选择步骤。

[0030]本发明还包括用于制备高效价重组蛋白的试剂盒。一些实施方案中，本发明的试剂盒包含：a)核酸分子，其包含可操作连接于适合用于克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多克隆位点的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件；和b)用于进行高效转染(例如高效受控电穿孔)的试剂或装置，以及使用说明。

[0031]一些实施方案中，所述的试剂盒适合在局部场强为大约250-400V/cm的条件下进行受控电穿孔。

[0032]一些实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于监测电流和电压比的工具。

[0033]其他实施方案中，本发明的试剂盒还包含含有适合导入核酸分子的多个细胞的细胞系。一些实施方案中，所述多个细胞是哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)。

发明详述

[0034]各种实施方案中，本发明提供了制备高效价重组蛋白而无需基因扩增的改进的方法，由此减少了与重组蛋白的生产相关的时间以及资源。

[0035]一些实施方案中，本发明提供了利用高效转染将核酸分子导入适宜细胞的方法，其中所述核酸分子波阿含可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是人工合成的DNA元件.

[0036]一些实施方案中，本发明的方法去除了选择步骤。

定义

[0037]为了使得本发明容易理解，首先定义了一些术语。其他定义在说明书中详细说明。

[0038]术语“细胞”，“宿主细胞”包括动物细胞，并包括无脊椎动物，非哺乳动物脊椎动物和哺乳动物细胞。示例性非-哺乳动物脊椎动物细胞包括例如禽细胞，爬行动物细胞和两栖动物细胞。示例性无脊椎动物细胞包括但不限于昆虫细胞，诸如毛虫(Spodoptera frugiperda)细胞，蚊子(Aedes aegypti)细胞，果蝇(Drosophila melanogaster)细胞，Schneider细胞，和Bombyx mori细胞。见，例如，Luckow et al.，Bio/Technology 6：47-55(1988)。所述细胞可分化，部分分化或未分化，例如干细胞，包括胚胎干细胞和造血肝细胞。另外的源自器官或器官系统的组织样品可根据本发明使用。

[0039]示例性哺乳动物细胞包括例如，源自人、非人灵长类、猫、犬、绵羊、山羊、牛、马、猪、兔、啮齿类包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠的细胞，包括但不限于，BHK21细胞，CHO细胞，NSO细胞，Sp2/o细胞，以及其任何衍生物或子代。

[0040]此外，杂交瘤细胞也可用于本发明的方法中。术语″杂交瘤″指将免疫学来源的永生细胞系与抗体产生细胞融合产生的杂合细胞。该术语包括异源杂合骨髓瘤融合物的子代，其是人细胞和小鼠骨髓瘤细胞系融合并随后与浆细胞融合的结果，通常称为trioma细胞系。此外，该术语包括任何永生杂交细胞系，其产生抗体，诸如quadromas。见，例如，Milstein etal.，Nature，537：3053(1983)。杂合细胞系可为任何物种，包括人和小鼠。

[0041]一些实施方案中，本发明方法中所用的细胞系是抗体产生细胞系。抗体产生细胞系可利用本领域已知技术选择并培养。见例如，CurrentProtocols in Immunology，Coligan et al.，Eds.，Green Publishing Associates andWiley-lnterscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，包括附件在内包含在此作为参考。

[0042]通常，任何适合在细胞培养物种表达重组蛋白的细胞可用于本发明的方法中。

[0043]一些实施方案中，本发明的方法中使用的细胞可包括异源核酸分子，其编码所需的重组蛋白，例如利用本发明的方法产生的所需的治疗性蛋白或抗体。具体实施方案中，本发明的方法用于产生高效价所需重组蛋白，例如治疗蛋白或抗体，而无需基因扩增。

[0044]术语“细胞培养物”指悬浮、转瓶、烧瓶等中生长的细胞。大规模方法，诸如生物反应器，包括粘附在搅拌发酵器中的微型载体上生长的粘附细胞，也包含在术语“细胞培养物”中。此外，不仅可培养接触依赖性细胞，也可用于本发明的悬浮培养技术中。示例性微型载体包括例如，葡聚糖，胶原蛋白，塑料，明胶和纤维素以及Butler，Spier & Griffiths，Animal Cell Biotechnology 3：283-303(1988)中所述其他微型载体。多孔载体，诸如或

以及基于葡聚糖的载体，诸如DEAE-葡聚糖(

)，季胺包被的葡聚糖(

)或基于明胶的载体，诸如明胶包被的葡聚糖(

)也可使用。大规模和小规模蛋白生产的细胞培养方法包含在本发明中。所述方法包括但不限于流化床生物反应器，中空纤维生物反应器，转瓶培养，或搅拌式生物反应器系统(stirredtank bioreactor system)也可使用，其中包含或不包含微型载体，并可选以分批、补料分批或灌流方式操作。

[0045]术语“细胞培养基”和“培养基”指用于生长动物细胞的营养溶液，例如，哺乳动物细胞。所述营养溶液通常包括细胞附着、生长和细胞环境维持必需的各种因子。例如，常见的营养溶液可包括基本培养基配方，根据细胞类型的各种补充物，以及有时包括抗生素。一些实施方案中，营养溶液也包括至少一种来自以下一或多个种类的至少一种组分：1)能量源，通常是碳水化合物诸如葡萄糖的形式；2)所有必需氨基酸，通常是20个碱性氨基酸加上半胱氨酸；3)需要的低浓度维生素和/或其他有机化合物；4)游离脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素是无机化合物或天然存在元素，通常需要极低浓度，通常是微摩尔范围。所述营养溶液可选补充一或多种选自下组的任何组分：1)激素和其他生长因子例如胰岛素，转铁蛋白和表皮生长因子；2)盐和缓冲液，例如钙，镁和磷酸盐；3)核苷酸和碱基诸如腺苷和胸苷，次黄嘌呤；和4)蛋白和组织水解物。通常，可使用任何适宜的细胞培养基。培养基可包含血清，例如胎牛血清，小牛血清等。可选，所述培养基可不含血清，不含动物(animal free)，或不含蛋白质。

[0046]术语“可操作连接”和“可操作连接于”可互换使用，指两个或多个核苷酸序列或序列元件的位置使得它们可以意图的方式起作用。一些实施方案中，本发明的核酸分子包括能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件，其可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。其他实施方案中，核酸分子包括可操作连接于编码凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件。其他实施方案中，核酸分子还可包括一或多个选自下组的核苷酸序列：(a)能增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加重组蛋白分泌到细胞外的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。通常但不是必需的，可操作连接的核苷酸序列是相邻的，必要时在读框内。然而，尽管可操作连接的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件通常位于编码重组蛋白的核苷酸序列或编码凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的上游，其不必与之相邻。各种核苷酸序列的可操作连接可通过本领域已知的重组法获得，例如利用PCR法，在适宜的限制位点连接或利用退火。如果适宜的限制位点不存在，合成寡核苷酸连接子或接头可根据常规实践使用。

[0047]术语“表达”指核苷酸序列在宿主细胞中的转录和/或翻译。所需产物在宿主细胞中的表达水平可基于存在细胞内的相应mRNA的量或所选序列编码的所需多肽的量来测定。例如，从所选序列转录的mRNA可通过Northern印迹杂交，核糖核酸酶RNA保护，原位细胞RNA杂交或PCR定量。所选序列编码的蛋白可通过多种方法定量，包括但不限于例如，ELISA，Western印迹，放射免疫测定，免疫沉淀，测定蛋白生物活性或蛋白免疫染色然后进行FACS分析。

[0048]一些实施方案中，本发明的方法能获得高效价重组蛋白，例如治疗蛋白或抗体。

[0049]本发明术语“效价”指利用本发明的方法产生的重组蛋白的量。产生的重组蛋白的量可在mRNA水平或多肽水平利用本领域已知以及本文所述的一或多种技术进行测定。术语“高效价”指利用本发明的方法产生的增加量的重组蛋白，其中所述的量超过不利用：(a)能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件；和/或(b)高效转染时所得的量。一些实施方案中，利用本发明的方法获得的重组蛋白的效价(即高效价)为至少约50mg/ml-约100mg/ml，约100mg/ml-约200mg/ml，约200mg/ml-约300mg/ml，约300mg/ml-约400mg/ml，约400mg/ml-约500mg/ml，约500mg/ml-约600mg/ml，约600mg/ml-约700mg/ml，约700mg/ml-约800mg/ml，以及约800mg/ml-约900mg/ml。具体实施方案中，所述重组蛋白以超过约900mg/ml的效价表达。

[0050]术语“高效转染”指任何将核酸分子转染入细胞(例如哺乳动物细胞)的方法，其导致核酸分子导入至少50％或以上，至少60％或以上，至少70％或以上，至少80％或以上，至少90％或以上，至少95％或以上，或至少99％或以上的细胞。具体实施方案中，核酸分子转移入至少70％被转染的细胞。其他实施方案中，核酸分子转移入至少80％被转染的细胞。示例性转染方法包括受控电穿孔以及利用纳米颗粒包括磁性纳米颗粒。

[0051]术语“电穿孔”指用于将化学种类(例如核酸分子)导入生物细胞的技术，其通过将细胞暴露于跨细胞膜的电压来进行。据信电穿孔可涉及破坏细胞膜脂质双层导致细胞膜中瞬时或永久性孔形成，允许化学种类通过扩散进入细胞。受控电穿孔基于这样的发现，即电穿孔在生物细胞中的发生和程度与生物细胞或包含生物细胞的导电介质的电阻(本文指电流与电压之比)改变相关。生物细胞的电流-电压比增加见于细胞膜由于孔形成而变为通透时。同样，通过流动导电流体的电流-电压比降低见于流体将生物细胞带入流通电池(flow-through electric cell)中的电极之间的区域中时。因此，通过监测生物细胞或悬浮有所述细胞的电解液的电阻，可检测到细胞膜形成孔的时间点，同时检测由于孔形成细胞膜通透性的相对程度。该信息随后可用于确定给定细胞的确发生了电穿孔，或通过控制电压量级的选择控制电穿孔过程。受控电穿孔也可用于同时对多个细胞进行电穿孔，这是由于其直接指示电穿孔的实际发生并且指示细胞整体平均电穿孔程度。该方法也可基于相同理由用于对生物组织(细胞膜相邻的大量生物细胞)进行电穿孔。“高效受控电穿孔”指利用受控电穿孔导入的化学种类(例如核酸分子)进入被电穿孔的细胞的至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或更高。高效受控电穿孔可利用本领域已知以及本发明所述的方法进行。一方面，高效受控电穿孔利用包含隔板的电穿孔装置进行。另一方面，高效受控电穿孔利用包含一或多个毛细管的电穿孔装置进行。电穿孔的开始以及发生电穿孔的细胞的百分比可利用本领域已知的测定法测定，例如通过测定膜非通透分子诸如SYTOX绿的内化。

[0052]实现高效电穿孔的其他示例方法包括，例如纳米颗粒转染(SeeSang et al，Biochimica et biophysica acta(2007)，vol.1770，no.5：747-752以及SIGMA-ALDRICH出售的试剂)以及利用磁性纳米颗粒(例如，CombiMagsold by OZ Biosciences)。所述方法可单独使用或与本领域已知和本发明描述的另外的转染剂或装置组合。

[0053]本发明的方法制备的“重组蛋白”或“重组多肽”指这样的肽或蛋白，通常比利用本发明的方法在细胞培养中产生的对应物多大约10个氨基酸。本发明的方法产生的多肽通常对于产生所述多肽的细胞而言是外源的，即异源或外来的。利用本发明方法，培养的细胞产生的示例性多肽包括治疗多肽以及抗体及其抗原结合片段。本发明还包括融合蛋白。

[0054]术语“免疫球蛋白”或“抗体”(在文中可互换)指具有基本四-多肽链结构的蛋白，所述结构由两个重链和两个轻链组成，所述链被稳定，例如通过链间二硫键稳定，其能特异性结合抗原。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(可互换使用)指具有重链和轻链组成的二-多肽链结构的蛋白，其中所述链通过能特异性结合抗原的链间二硫键稳定。术语“结构域”指重链或轻链多肽的球状区，包含通过例如β-折叠和/或链间二硫键稳定的肽环(例如包含3-4个肽环)。结构域还分为“恒定”或“可变”结构域，在“恒定”结构域的情况中，各个成员的结构域中的序列变化相对缺乏，在“可变”结构域的情况中，各个成员的结构域中的变化明显。抗体或多肽“结构域”与抗体或多肽“区”通常可互换使用。抗体轻链“恒定”结构域也称为“轻链恒定区”，“轻链恒定结构域”，“CL”区或“CL”结构域。抗体重链“恒定”结构域可与“重链恒定区”，“重链恒定结构域”，“CH”区或“CH”结构域互换使用。抗体轻链“可变“结构域可与“轻链可变区”，“轻链可变结构域”，“VL”区或“VL”结构域互换使用。抗体重链“可变“结构域可与“重链可变区”，“重链可变结构域”，“VL”区或“VL”结构域互换使用。免疫球蛋白或抗体可为单克隆或多克隆的，并可以单体或多聚体的形式存在，例如IgM抗体，其以五聚体的形式存在，和/或IgA抗体，其以单体、二聚体或多聚体的形式存在。术语“片段”指抗体或抗体链的一部分，其中包含的氨基酸残基少于完整抗体或抗体链。片段可通过化学或酶处理完整抗体或抗体链来获得。片段也可通过重组方法获得。示例性片段包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fabc和/或Fv片段。

[0055]术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的多肽部分，其结合抗原或与完整抗体竞争(即与其来源的完整抗体竞争)抗原结合(即特异性结合)。结合片段可通过重组DNA技术制备，或通过酶切或化学裂解完整免疫球蛋白。结合片段包括Fab，Fab’，F(ab′)2，Fabc，Fv，单链和单链抗体。

[0056]术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用，指任何长度的核苷酸形成的多聚体形式，而无论是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。这些术语包括单-，双-或三-链DNA，基因组DNA，cDNA，RNA，DNA-RNA杂合子，或包含嘌呤和嘧啶碱基的多聚体，或其他天然、化学、生物化学修饰的非天然或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常在RNA或DNA中见到的)，或修饰的或取代的糖或磷酸基团。此外，双链多核苷酸可得自化学合成的单链多核苷酸产物，可通过合成互补链并在适宜条件下退火所述的链，或通过利用DNA聚合物和适宜的引物从头合成互补链。核酸分子可为多种不同形式，例如基因或基因片段，一或多种外显子，一或多种内含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支的多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶，其他糖和连接基团诸如荧光核糖和硫代物(thioate)，以及核苷酸分支。本发明″DNA″或″核苷酸序列″不仅包括碱基A，T，C，和G，也包括其任何类似物或修饰的形式，诸如甲基化核苷酸，核苷酸间修饰诸如不带电的连接和硫代物，糖类似物的利用，以及修饰的和/或可选主链结构，诸如聚酰胺。具体实施方案中，所述核酸分子包含可操作连接于的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件编码重组蛋白诸如例如治疗蛋白或抗体的核苷酸序列。

[0057]术语″能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件″指任何能使得染色质更接近转录因子并易化可操作连接基因的重复表达的DNA序列或元件，其中所述DNA序列或元件不来自基因座控制区。开放染色质或开放状态的染色质指去浓缩(de-condensed)状态的染色质并且也指常染色质。浓缩的染色质称为异染色质。闭合(浓缩)状态的染色质是转录沉默的。然而，开放(去浓缩)转录染色质是可转录的。开放染色质结构的建立的特征是DNase I敏感性，DNA低甲基化和组蛋白高乙酰化。鉴定开放染色质的标准方法是本领域已知的，并且描述于Wu，1989，Meth.EnzymoL，170，269-289；Crane-Robinson et al，1997，Methods，12，48-56；Rein et al，1998，N.A.R，26,2255-2264。

[0058]″基因座控制区″(LCR)指从真核宿主细胞的组织特异性基因座获得的遗传元件，当与目的基因连接并整合入宿主细胞染色体时，赋予目的基因组织特异性、独立于整合位点、依赖于拷贝数目的表达。

[0059]重复表达指这样的DNA元件，当与目的基因可操作连接时，在一段延长的时间内产生该可操作连接基因的基本相同水平的表达，而与染色质环境和细胞类型无关。一些实施方案中，基本相同水平的表达是指基于每个基因拷贝，与平均值的标准差少于48％，或少于40％，或少于25％的表达水平。可选，基本相同水平的表达指基于每个基因拷贝，表达水平相差少于10倍，少于5倍，或少于3倍。一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件使得可操作连接基因的表达相对于没有所述可操作连接DNA元件的表达而言增加至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少20倍，或至少30倍，或至少40倍，或至少50倍，或至少60倍，或至少70倍，或至少80倍，或至少90倍，或至少95倍，或至少100倍，或至少150倍，或至少200倍，或更高。一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件在延长的时间中获得可操作连接基因的重复表达。例如，一些实施方案中，相对于不与开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件可操作连接的基因而言，所述可操作连接的基因在至少5天，10天，或至少15天，或至少20天，或至少30天，或至少40天，或至少45天，或至少60天，或至少70天，或至少80天，至少90天或更长时间中以基本相同的水平表达。其他实施方案中，可操作连接的基因相对于该基因并非可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件时的表达水平而言在延长的时间内高水平表达。示例性能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件包括但不限于，源自遍在表达基因(UCOEs)的启动子区的延伸的无甲基化GpG岛、基质和/或支架附着区(MARs)以及稳定化区和抗阻遏区(STARs)。本领域技术人员可容易地利用本领域已知的技术以及本发明所述的技术来鉴定所述DNA元件。

[0060]一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是天然存在的DNA元件。天然存在的DNA元件是指所述DNA元件天然存在，例如，其分离自遍在表达基因的启动子区，并且其序列与天然存在序列相比没有改变。

[0061]其他实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是人工合成的DNA元件。人工合成是指所述DNA元件并非天然存在，例如，分离自遍在表达基因的启动子区的DNA元件，其与分离自另一种遍在表达基因的启动子区的第二DNA元件组合，由此产生人工构建体，其中这两种元件通常不天然地一起出现。可选，DNA元件的序列可利用本领域已知的多种技术从其天然存在序列修饰，产生通常不天然存在的DNA元件。

[0062]另一实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是天然存在的和人工合成的DNA元件的组合。

[0063]术语”无甲基化CpG岛″指与大量DNA中的40％的平均值相比，平均GC含量大约60％的CpG岛。本领域技术人员可利用标准技术诸如C和G序列特异性限制酶容易地鉴定CpG-岛，这是本领域已知的。示例性鉴定CpG岛的方法见于，例如，Gardiner-Garden et al.，J.MoI.Biol.1987，196：261-82，包含在此作为参考，本领域技术人员已知用于分析并鉴定CpG岛的计算机程序诸如CpGplot(例如，http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)和Grailexp(http://compbio.ornl.gov/grailexp)。

[0064]术语″延伸的无甲基化GpG岛，″指这样的无甲基化CpG岛，其长度为至少300bp，或至少500bp，或至少1000bp，或至少1500bp，或至少2000bp，或至少2500bp，或至少3000bp并源自遍在表达基因的启动子区。所述的岛是本领域已知的并且描述于美国专利6,964,951；6,689,606；6,881,556；和6,949,361和PCT申请公开WO 2004/067701，包含在此作为参考。

[0065]一些实施方案中，延伸的无甲基化GpG岛包括一或多个转录因子结合位点。其他实施方案中，延伸的无甲基化GpG岛包括启动子和/或增强子序列。其他实施方案中，延伸的无甲基化GpG岛包括双启动子或双向启动子。尽管延伸的无甲基化GpG岛可包括启动子，如本发明所用的那些，所述的岛通常与一或多种通常不与所述岛结合的异源启动子例如人或豚鼠CMV启动子一起使用。一些实施方案中，异源启动子取代CpG岛中发现的内源启动子。

[0066]延伸的无甲基化GpG岛可被限定，例如，通过鉴定所述到的边界。例如，延伸的无甲基化GpG岛的边界可通过利用PCR以及限制内切核酸酶的组合限定，所述酶在DNA识别序列进行消化(切割)的能力对于存在的任何CpG残基的甲基化状态敏感。一种所述的酶是Hpall，其识别并消化位点CCGG，该位点通常见于CpG岛中，但仅仅在中央CG残基没有被甲基化的情况下。因此，利用Hpall-消化的DNA在携带Hpall位点的区域进行的PCR不产生扩增产物，这是由于如果DNA没有被甲基化会发生Hpall消化。PCR仅仅在DNA是甲基化的情况下才产生扩增产物。因此，除了无甲基化区，Hpall不会消化DNA，从而观察到PCR扩增产物，确定″延伸的无甲基化GpG岛″的边界。

[0067]示例性延伸的无甲基化GpG岛包括但不限于源自以下基因启动组区域的那些：人RNPA2基因(SEQ ID NOs：2，3和4)，RPS3基因(登记号NM012052；SEQ ID NO：1)，RPL4基因(登记号NT_039474)，RPL5基因(NT_039308)，RPLIOa基因(登记号NT_039649)，RPL13a基因(登记号NT_039420)，RPL19基因(登记号NT_039521)，RPL24基因(登记号NT_096987)，RPL27a基因(登记号NT_039433)，Terf2ip基因(登记号AB041557)，人3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(登记号M32599)，微管蛋白alpha-1链基因(登记号M13445)，和RPS11基因(登记号AK011207)。遍在表达基因或看家基因的其他实例可见于例如，Trends in Genetics 19，362-365(2003)，包含在此作为参考。

[0068]术语″基质附着蛋白，″或″支架附着蛋白，″或″支架/基质附着蛋白，″或″MAR″或″S/MAR，″可互换使用，指能体外高亲和力结合分离的细胞核支架或细胞核基质的DNA元件。(见例如，Hart and Laemmli(1988)Curr.Opin.Genet.Dev.，8：519-525)。据报道MAR DNA元件可增加细胞培养物中异源基因的表达。(见，例如，Kalos and Fournier(1995)MoI.Cell Biol.15：198-207；Phi-Van et al.(1990)MoI.Cell Biol.10：2302-2307；Klehr et al.(1991)Biochemistry 30：1264-1270；和Poljak et al(1994)Nuc.Acid Res.22：4386-4394)。示例性MAR DNA元件可见于，例如，美国专利7,129,062，包含在此作为参考。具体实施方案中，本发明中所用MAR元件是鸡溶菌酶MAR元件，如美国专利7,129,062所述，以及其功能片段。本领域技术人员可基于已知测定法以及本发明所述的方法轻易鉴定MAR元件，例如，Mesner et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.，3281-3286和Weber et al.，MoI CellBiol.(2003)December；23(24)：8953-8959。另一实施方案中，本发明方法中所用的MAR DNA元件是人[beta]-球蛋白MAR元件。用于本发明方法中的示例性MAR DNA元件如SEQ ID NOs：11-14所述。

[0069]术语″稳定化区和抗阻遏区″或″STAR″指这样的DNA元件，其能阻断异染色质介导的转基因表达。STAR DNA元件可利用已知的测定DNA元件的基因转录调节性质的技术轻易鉴定，例如，WO03/004704，WO2004/056986和EP01202581.3中所述，包含在此作为参考。可用于本发明方法的STAR序列的非限制性实例包括美国专利公开20060141577中SEQ.ID.NOs.1-66所示的序列。

[0070]术语″能增加翻译的核苷酸序列″指能增加多肽从mRNA合成的核苷酸序列。多肽合成的增加可以是产生多肽总量的增加或多肽合成率的增加。一个实施方案中，能增强翻译的核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。能增强翻译的核苷酸序列的能力可通过测定所述能增强翻译的核苷酸序列存在下产生的重组蛋白量的增加或重组蛋白合成率随时间的增加来测定。

[0071]术语″能增加分泌的核苷酸序列″指这样的核苷酸序列，当可操作连接于编码蛋白的核苷酸序列时，能促进蛋白分泌到细胞外。通常，所述的核苷酸序列包含适宜的天然或异源信号肽(前导序列)。The choiceof signal peptide or leader depends on the type of host cells in which therecombinant protein is to be produced，and a heterologous signal peptide canreplace the native signal sequence.可用于本发明方法的示例性序列包括例如源自Gaussia princeps的萤光素酶基因的信号肽(Genbank登记号AY015993)。增加分泌的核苷酸序列也称为信号肽序列，可利用本领域已知的软件程序鉴定，诸如，例如，SignalP Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。

[0072]术语″能增加mRNA稳定性的核苷酸序列″指这样的核苷酸序列，其与编码重组蛋白的核苷酸序列可操作连接时增加翻译为重组蛋白的mRNA的半寿期。通常，所述核苷酸序列源自基因的3′或5′非翻译区(或UTRs)。

II.细胞举例

[0073]不受任何理论限制，认为能产生重组蛋白的任何细胞系可用于本发明的方法中。具体实施方案中，本发明方法中所用的细胞用包含编码重组多肽例如治疗蛋白或抗体的核苷酸序列的核酸分子转染。具体实施方案中，本发明方法中的细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的实例包括但不限于，例如，SV40转染的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.ScL，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；NSO小鼠myeloma细胞(ECACC；SIGMA)，和人肝细胞瘤系(Hep G2)。其他示例性有用细胞系包括但不限于，HT1080细胞(ATCC CCL 121)，MCF-7乳腺癌细胞(ATCCBTH 22)，K-562白血病细胞(ATCC CCL 243)，KB癌细胞(ATCC CCL 17)，2780AD卵巢癌细胞(见Van der Blick，A.M.et al.，Cancer Res.48：5927-5932(1988)，Raji细胞(ATCC CCL 86)，Jurkat细胞(ATCC TIB 152)，Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)，HL-60细胞(ATCC CCL 240)，Daudi细胞(ATCCCCL 213)，RPMI 8226细胞(ATCC CCL 155)，U-937细胞(ATCC CRL 1593)，Bowes黑素瘤细胞(ATCC CRL 9607)，WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCCCLL 75.1)，和MOLT-4细胞(ATCC CRL 1582)，以及通过将人细胞与其他物种的细胞融合产生的异源杂交瘤细胞。这些以及其他细胞和细胞系可商购，例如得自美国典型培养物保藏中心(Virginia，USA)。许多其他细胞系是本领域已知的，并且是本领域技术人员熟悉的；所述细胞系因此同样可用于本发明的方法。具体实施方案中，本发明方法所用细胞是CHO细胞或NSO细胞。

[0074]杂交瘤和抗体产生细胞也可用于本发明的方法中。

III.示例性核苷酸序列和载体

[0075]一些实施方案中，包含编码目的重组蛋白的核苷酸序列的核酸分子利用本发明所述高效转染导入宿主细胞，其中所述核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件。例如，包含编码所需目的重组蛋白的核苷酸序列的第一核酸分子被克隆入适宜的表达载体，其中包含可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件的编码重组蛋白的核苷酸序列。

[0076]任何适宜载体可根据本发明使用。核苷酸序列可利用例如以下载体稳定整合入宿主细胞基因组：逆转录病毒载体(Miller，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.158：1；Miller et al，1993，Meth.Enzymol.217：581)或腺伴随病毒(AAV)载体(Muzyczka，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：97；Flotte and Carter，1995，Gene Ther.2：357)。可选，编码蛋白的核苷酸序列可掺入包含病毒复制起点的自我复制游离体载体，所述复制起点可来自例如EBV(Yates et al.，1985，Nature 313：812)，人乳多空病毒BK(DeBenedetti and Rhoads，1991，Nucl.Acids Res.，19：1925；Cooper and Miron，1993，Hum.Gene Ther.4：557；和BPV-1(Piirsoo et al，1996，EMBO J.15：1)。

[0077]用于遗传改造细胞和/或细胞系以表达目的蛋白的载体和方法是本领域已知的；例如以下文献中所列的各种技术Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel et al.，eds.(Wiley & Sons，New York，1988，andquarterly updates)；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press，1989)和Kaufman，R.J.，Large ScaleMammalian Cell Culture(1990，pp.15-69)。

[0078]其他调节序列也可包含在本发明的表达载体中。其可来自哺乳动物，微生物，病毒和/或昆虫基因。调节序列的实例包括转录启动子，操作子，和增强子，核糖体结合位点(见例如Kozak(1991)，J.Biol.Chem.266：19867-70)，可控制转录和翻译终止的序列以及多腺苷酸信号。(见例如McLauchlan et al.(1988)，Nucleic Acids Res.16：5323-33)。

[0079]一些常用启动子和增强子序列源自病毒基因组，例如多瘤病毒，腺病毒2，猴病毒40(SV40)，和人巨细胞病毒。例如，立即早期基因1的人CMV启动子/增强子可使用(见，例如，Patterson et al.(1994)，AppliedMicrobiol.Biotechnol.40：691-98)。来自SV40病毒基因组的DNA序列，例如，SV40起点，早期和晚期启动子，增强子，拼接，和多腺苷酸化位点可用于提供其他基因元件用于在真核宿主细胞中表达多肽。病毒早期和晚期启动子尤其有用，因为它们都容易作为片段得自病毒基因组，其中也可选包含病毒复制起点(Fiers et al.(1978)，Nature 273：113；Kaufman(1990)，Meth.inEnzymol.185：487-511)。较小或较大的SV40片段也可使用。一些实施方案中，本发明中所用的表达载体包括人或豚鼠CMV启动子。

[0080]一些实施方案中，编码重组蛋白的核苷酸序列可操作连接于选自下组的一或多个核苷酸序列：(a)能增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA稳定性的核苷酸序列。

[0081]其他显示增加异源基因从哺乳动物表达载体的表达的控制序列包括这样的元件，例如来自CHO细胞的表达增强序列元件(EASE)(Morriset al.，Animal Cell Technology，pp.529-534(1997)；U.S.Pat.No.6,312,951 B I；U.S.Pat.No.6,027,915；U.S.Pat.No.6,309,841 B 1)和来自腺病毒2的三分前导(tripartite leader)(TPL)以及VA基因RNA(Gingeras et al.(1982)，J.Biol.Chem.257：13475-13491)以及允许mRNA的翻译的内部核糖体进入位点(IRES)序列。

[0082]编码可选标记的基因通常用于易化重组细胞的鉴定。转化体的选择可利用例如二氢叶酸还原酶(DHTR)选择方案或对细胞毒药物的抗性来进行(见，例如，Kaufman et al.(1990)，Meth.in Enzymology 185：487-511)。DHFR选择的适宜细胞系可为，例如，CHO系DX-B 11，其缺乏DHFR(见，例如，Urlaub and Chasin(1980)，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4216-4220)。其他可选标记的例子包括赋予抗生素抗性的那些，诸如G418和潮霉素B。

[0083]本发明的一些实施方案中，编码可选标记的基因由于利用能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件而不是必需的，这是因为可使用细胞集合而不必选择表达重组蛋白的特定克隆。

[0084]一些实施方案中，用于通过本发明的方法制备蛋白的外源核酸分离自cDNA文库或基因组文库。例如，为了分离编码目的蛋白的核酸，可利用设计为鉴定编码所述蛋白的基因或cDNA克隆的探针来筛选cDNA文库。对于cDNA表达文库，适宜探针包括单克隆或多克隆抗体，其识别并特异性结合目的蛋白；长度大约20-80的寡核苷酸，其编码相同或不同物种来源蛋白的已知或可疑部分；和/或相同或相似基因的互补或同源cDNA或其片段。筛选基因组DNA文库的适宜探针包括但不限于，寡核苷酸，cDNA，或其片段，其编码相同或相似的基因，和/或同源基因组DNA或其片段。利用所选探针筛选cDNA或基因组文库可利用Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)的10-12章所述的标准方法进行。

[0085]本发明的各种实施方案中，本发明所述具体序列以及其同系物和片段均可用于本发明的方法中，只要它们具有所需的活性。例如，一些实施方案中，与本发明包含的具体序列至少70％相同，或至少80％相同，或至少90％相同，或至少95％相同或更高的序列可用于本发明的方法中。

IV.示例性重组蛋白

[0086]本发明的方法可用于制备任何所需重组蛋白或其片段。一些实施方案中，利用本发明的方法制备的重组的那白是治疗蛋白。其他实施方案中，所述重组蛋白是抗体或其功能片段。可利用本发明的方法制备的抗体包括例如多克隆，单克隆，单特异性，多特异性，完全人的，人源化的，单链的，嵌合的，杂合的，突变体以及CDR移植的抗体，及其其抗体结合片段，诸如例如，Fab，F(ab′)2，Fv，和scFv。所述抗体可特异于任何包含适宜表位的所需抗原。所需抗原可包括例如，见于哺乳细胞中或与哺乳细胞相关的标记物，与肿瘤相关的标记物，或与疾病或病症相关的标记物。肿瘤标记的实例包括肿瘤抗原CA 125，肿瘤抗原gp72 LCG(其为与肺癌相关表达的基因产物)，肿瘤相关糖蛋白HER-2，以及肿瘤抗原MUC 1。其他癌标记包括hTERT(Ferber et al.2003，Oncogene 22：3813)，Ki-67(Kruseet al.2002，Am.J.Surg.Pathol.，26：1501)，细胞周期蛋白E(Yasmeen et al.2003，Expert Rev.MoI.Diagn.3(5)：617)和组蛋白H3(Rakowicz-Szulczynska，et al.1996，Cancer Biother.Radiopharm.11：77)。

[0087]一些实施方案中，本发明的方法用于制备高效价抗体或其抗原结合片段。抗体可特异于细胞表面蛋白诸如生长因子或激素受体。

[0088]本发明的抗体包括但不限于：抗-HER2抗体包括Trastuzumab(

(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1 89：4285-4289(1992)，U.S.Pat.No.5,725,856)；抗-CD20抗体诸如U.S.Pat.No.5,736,137中的嵌合抗-CD20″C2B8″

嵌合或2H7抗体的人源化变体，见于U.S.Pat.No.5,721,108，B1，或Tositumomab抗-IL-8(St Johnet al.，Chest，103：932(1993)，以及国际公开WO 95/23865)；抗-VEGF抗体包括人源化和/或亲和成熟的抗-VEGF抗体诸如人源化抗-VEGF抗体huA4.6.1

(Kim et al.，Growth Factors，7：53-64(1992)，国际公开WO 96/30046，和WO 98/45331，公开于1998-10-15)；抗-PSCA抗体(W001/40309)；抗-CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(W000/75348)；抗-CD11a(U.S.Pat.No.5,622,700，WO 98/23761，Steppe et al.，TransplantIntl.4：3-7(1991)，和Hourmant et al.，Transplantation 58：377-380(1994))；抗-lgE(Presta et al.，J Immunol.151：2623-2632(1993)，和国际公开WO95/19181)；抗-CD18(U.S.Pat.No.5,622,700，1997-4-22公开，或WO97/26912，1997-7-31公开)；抗-lgE(包括E25，E26和E27；U.S.Pat.No.5,714,338，公开于1998-2-3或U.S.Pat.No.5,091,313，公开于1992-2-25，WO 93/04173，公开于1993-3-4，或国际公开PCT/US98/13410，1998-6-30提交，U.S.Pat.No.5,714,338)；抗-Apo-2受体抗体(WO 98/51793，公开于1998-11-19)；抗-TNF-α抗体包括cA2

CDP571和MAK-195(见，U.S.Pat.No.5,672,347，公开于Sep.30，1997，Lorenz et al J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)，和Dhainaut et al.Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗-组织因子(TF)(European Patent No.0 420 937 B1 granted Nov.9，1994)；抗-人α4αβ7整联蛋白(WO 98/06248，公开于Feb.19，1998)；抗-EGFR(嵌合或人源化225抗体，WO 96/40210，公开于Dec.19，1996)；抗-CD3抗体诸如OKT3(U.S.Pat.No.4,515,893公开于May 7，1985)；抗-CD25或抗-tac抗体诸如CHI-621

和(见U.S.Pat.No.5,693,762公开于Dec.2，1997)；抗-CD4抗体诸如cM-7412抗体(Choy et al.Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；抗-CD52抗体诸如CAMPATH-1 H(Riechmann et al.Nature 332：323-337(1988))；抗-Fc受体抗体诸如抗FcγRI的M22抗体，见Graziano et al.J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)；抗-癌胚抗原(CEA)抗体诸如hMN-14(Sharkey et al.Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995)；抗乳腺上皮细胞的抗体，包括huBrE-3，hu-Mc 3和CHL6(Ceriani et al.Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman et al.Cancer Res.55(23 Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体诸如C242(Litton et al.Eur J.Immuno1.26(1)：1-9(1996))；抗-CD38抗体，例如AT13/5(Ellis et al.J Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗-CD33抗体诸如HuM195(Jurcic et al.Cancer Res 55(23 Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗-CD22抗体诸如LL2或LymphoCide(Juweid et al.CancerRes 55(23 Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗-EpCAM抗体诸如17-1A

抗-GpIIb/IIIa抗体诸如abciximab或c7E3 Fab

抗-RSV抗体诸如MEDI-493抗-CMV抗体诸如

抗-HIV抗体诸如PRO542；抗-肝炎抗体诸如抗-Hep B抗体

抗-CA 125抗体OvaRex；抗-独特型GD3表位抗体BEC2；抗-αvβ3抗体

抗-人肾细胞癌抗体诸如ch-G250；ING-1；抗-人17-1A抗体(3622W94)；抗-人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；抗-人黑素瘤抗体R24，针对GD3神经节苷脂；抗-人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗-人白细胞抗原(HLA)抗体诸如Smart ID10和抗-HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。抗体的优选靶抗原是：HER2受体，VEGF，IgE，CD20，CD11a，和CD40。

[0089]重组蛋白可为细胞蛋白诸如受体(例如，膜结合或胞液型)或结构蛋白(例如细胞骨架蛋白)。所述重组蛋白可为细胞分泌的细胞因子或一或多个信号转导途径中内部使用的细胞因子。非限制性实例包括但不限于，CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-1.，IL-2，IL-3，IL-7，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受体，IL-4受体，IL-6受体，IL-13受体，IL-18受体亚基，PDGF，EGF受体，VEGF受体，干细胞生长因子，护骨素(osteoprotegerin)配体，干扰素γ，B淋巴细胞刺激物C5补体TAG-72，整联蛋白α4β7，整联蛋白VLA-4，B2整联蛋白，TRAIL受体1，2，3，和4，RANK，RANK配体，TNF，粘附分子VAP-1，表皮细胞粘附分子(EpCAM)，细胞间粘附分子-3(ICAM-3)，白细胞整联蛋白粘附素(leukointegrin adhesin)，血小板糖蛋白gp IIb/IIIa，心脏肌球蛋白重链(cardiac myosin heavy chain)，甲状旁腺激素，rNAPc2，和CTLA4(细胞毒T淋巴细胞相关抗原)。

[0090]重组蛋白也可源自感染因子，诸如病毒、细菌或真菌。例如所述蛋白可来自病毒包衣或可为病毒酶或转录因子。所述蛋白可源自细菌膜或细胞壁，或可源自细菌的胞质。所述蛋白可为酵母菌酶，转录因子或结构蛋白。酵母菌蛋白可为膜结合蛋白，胞质蛋白或分泌蛋白。感染因子的例子包括但不限于，呼吸道合胞病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，葡萄球菌变体和金黄色葡萄球菌，以及白色念珠菌。

[0091]本发明的方法也可用于制备重组融合蛋白，其中包含全部或部分任何上述的蛋白。例如，包含上述蛋白之一和多聚体化结构域诸如亮氨酸拉链、螺旋结构、抗体Fc部分或基本相似的蛋白的重组融合蛋白可利用本领域已知方法制备。见例如国际公开WO 94/10308；Lovejoy et al.(1993)，Science 259：1288-1293；Harbury et al.(1993)，Science 262：1401-05；Harbury et al(1994)，Nature 371：80-83；Hang.kansson et a/.(1999)，Structure7：255-64。

[0092]本发明还包括包含通过本发明的方法制备的一或多种重组蛋白的药物组合物。一些实施方案中，药物组合物还包括可药用载体。术语″可药用载体″指一或多种相容的固体或液体填充物，稀释剂或包囊化物质，其适合给予对象。

V.高效转染方法

[0093]本发明的方法采用高效转染法并可用于产生高效价的重组蛋白，例如治疗蛋白和抗体，而无需基因扩增。

[0094]具体实施方案中，高效受控电穿孔(high efficiency controlledelectroporation)用于导入各种核酸分子到宿主细胞，其中利用包含指导电流流动的隔板，由此离子流经生物细胞同时使得基本上没有电流从该生物细胞旁边通过。用于进行受控电穿孔的示例性装置和方法可见于，例如，U.S.Patent Nos.6,300,108；6,562,604；6,387,671；6,403,348；6,482,619；7,053,063，每篇都包含在此作为参考。

[0095]本发明的一个方面中，受控电穿孔涉及含有被隔板分离的两个储液小室，该隔板基本上不允许电流通过。所述的隔板包含小于生物细胞的开口使得生物细胞一旦到达该开口就会堵住或关闭该开口。为了实现电穿孔，通过机械或化学手段将该生物细胞固定在开口处，例如以可逆方式进行使得生物细胞随后可被移开而不受到破坏。一旦生物细胞固定在开口处，将电压加在两个小室之间并通过固定在开口处的生物细胞。经过小室的电流由此被限制通过该开口以及生物细胞。通过监测电池的电流-电压关系，检测电穿孔的开始以及控制孔形成的程度，以保证电穿孔的发生以及防止过度孔形成和细胞死亡。使用者由此确切了解并控制生物细胞膜的状况以及电通量。所述装置由此包含两个电极。每个电极的极性可交替改变由此允许靶核酸从至少两个不同的点通过细胞膜。例如，所述的点在细胞的平面中呈大约180°分开。

[0096]电穿孔装置可包含内部支持物以固定单个生物细胞或多个生物细胞，以及包含内部隔板，其限制装置中的电流使其路径经过生物细胞。电穿孔装置可包含一或多个适合盛装缓冲液的小室。存在多个小室时，每个小室可盛装相同缓冲液或不同缓冲液。如果没有施加电压，所述结构可用于仅仅进行扩散转运，其无需电压诱导的孔形成进行辅助。该隔板的结构，以及在含有两个小室的实施方案中的两个小室，对于电穿孔细胞(electroporation cell)而言不是关键的，可进行多种变化但仍起作用。生物细胞的体积是显微镜下可见的，而该装置可为电子芯片的大小，通过微细加工技术诸如电子芯片生产中的技术来制造。所述小室可构建为流通小室以允许流体连续流过，间歇流过，或在使用者的指导下流过，或构建为允许浓度、压力以及其他实现对通过生物细胞膜的种类的密切控制的条件发生改变。该装置可包含层状结构或板状结构，其上具有适当的开口，当所述层状结构或板状结构结合在一起时形成流动通道。

[0097]流通小室具有允许单个细胞连续进入和去除的优势，从而大量细胞可被连续处理。流通小室还允许补充溶液中消耗的溶质，使得浓度梯度可在需要时连续维持。流通小室的其他功能是增加或降低压力，对于下述多种目的而言该功能是有用的。

[0098]生物细胞在该结构中的支持可为任何将生物细胞固定在确定位置并允许电流通过的结构。最方便的支持物是隔板中的开口。将生物细胞固定于开口处使得开口被封闭、闭合或堵塞，由此指导电流通过和/或扩散转运经过细胞并消除或最小化细胞周围的泄露。实现这一点的机械装置是将压差施加在开口两侧，其方向将把细胞压迫在开口处。开口的直径应小于细胞直径，细胞进入该装置时会进入两个小室之一。通过增加细胞存留的小室中的压力，或降低另一小室中的压力，所述细胞可被压在开口处，使得开口闭合。一旦该方法完成，通过使得两个小室中的压力相等或逆转压差使得高压施加在另外的小室而非导入细胞的小室即可容易地释放细胞。导入了细胞的小室中液体的流动随后将细胞从开口去移开，将开口暴露于另一个细胞。

[0099]利用细胞封闭开口的另一方法是通过在隔板表面或在开口边缘处利用结合细胞膜的物质进行包被。由于生物细胞膜带负电，所述包被物可带正电，诸如聚赖氨酸，聚精氨酸或聚组氨酸。所述生物细胞可通过跨开口压差导向开口，并被包被物固定。一旦完成该过程，所述细胞可通过即刻增加开口细胞侧小室中液体的流速而从包被物释放，或通过施加反向的跨开口压差来使得细胞离开开口。

[00100]另一方面，利用电穿孔装置来进行受控电穿孔，所述装置诸如Wang et al.，Anal.Chem，(2006)78：5158-5164中所述。

[00101]一方面，高效受控电穿孔利用包含一或多个毛细管的装置进行。受控电穿孔的方法包括以下步骤：1)将一或多个细胞置于包含至少一个伸长毛细管的电穿孔装置中，所述伸长毛细管的管腔具有第一和第二末端，其中第一末端和第二末端的开口都进入储池中并且一或多个细胞可流经至少一个毛细管管腔进入储池；2)将一或多个细胞与包含与编码重组蛋白的核苷酸序列可操作连接的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件的核酸接触；3)使所述一或多个细胞与电流接触使得电流通过该一或多个细胞；4)监测电穿孔装置中电流和电压的比值；和5)调节局部场强的量级使其适合实现对一或多个细胞的电穿孔。

[00102]一些实施方案中，毛细管管腔直径比该管腔中细胞直径大不超过大约20％。一些实施方案中，毛细管的直径比多个细胞的直径(例如管腔中细胞组的周界)大不超过大约20％。

[00103]本发明的各种受控电穿孔方法中，适合实现特定细胞类型电穿孔的最佳局部场强可通过本领域已知方法轻易确定，例如通过测定细胞暴露于各种场强时细胞直径随时间的改变(例如增加)。一些实施方案中，本发明方法中所用局部场强是大约150-500V/cm。其他实施方案中，用于本发明方法中的局部场强是大约250-400V/cm。具体实施方案中，本发明方法中的局部场强是大约400V/cm(例如，在CHO细胞的情况下)。

[00104]本发明其他实施方案中，转染可利用化学药剂诸如磷酸钙作为沉淀剂，或阳离子脂质等例如Lipofectamine^TM(INVITROGEN，Carlsbad，CA)进行。

[00105]不受任何理论限制，本发明的方法中可利用任何适宜的转染方法，只要其可使得至少50％以上，或至少60％以上，或至少70％以上，或至少80％以上，或至少90％以上，或至少95％以上，或至少99％以上的细胞被转染。其他用于本发明方法中的示例性方法包括，利用例如磁性纳米颗粒颗粒(例如，见OZ Biosciences的试剂盒)和纳米颗粒转染(例如，见SIGMA-ALDRICH的试剂盒)。具体实施方案中，任何可使得至少70％的细胞被转染的方法可用于本发明的方法中。其他实施方案中，任何使得至少80％的细胞被转染的方法用于本发明的方法中。

VI.细胞培养基

[00106]电穿孔之后，细胞在促进蛋白表达以及分泌进入培养基的适宜培养基中生长.任何适合的培养基或适合细胞生长和蛋白产生的补料培养基(feed medium)可用于本发明的方法中。适合的培养基或补料培养基可根据其与宿主细胞以及目的多肽的相容性选择。适合的培养基或补料培养基是本领域已知的，包括但不限于，商购的培养基诸如Ham′s F10(SIGMA)，极限必需培养基(SIGMA)，RPMI-1640(SIGMA)，和Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(SIGMA)适合培养动物细胞。

[00107]此外，任何描述于下述文献的培养基可用作宿主细胞的培养基或补料培养基：Ham and Wallace，Meth.Enz.，58：44(1979)，Barnes andSato，Anal.Biochem.，102：255(1980)，U.S.Pat.Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；U.S.Pat.No.Re.30,985；或U.S.Pat.No.5,122,469，包含在此作为参考。任何这些培养基可添加另外的成分以满足被培养细胞的特定需要。

VII.细胞培养方法

[00108]目的重组多肽可利用任何适合特定细胞类型的方案或途径以及合意的制备方案来制备。因此，在本发明的方法中，可利用单步或多步培养方法。例如，在单步培养中，将细胞接种在培养环境中，随后在细胞培养的单个生产阶段添加任何营养或补充物。可选，多阶段培养也可使用。多阶段培养中，细胞可在多个步骤或阶段中培养。例如，细胞可在第一步或生长阶段培养中生长，其中细胞，可能从储存物取出，接种在适合促进生长和高存活力的培养基中。细胞可通过添加新鲜培养基到宿主细胞培养物中来保持在生长阶段适当的时间。具体的实施方案中，细胞生长在多阶段培养中，其中包括一或多个生长阶段以及生产阶段。本发明方法的一些实施方案中，生长阶段包括大约5L培养体积到大约200L培养体积，而生产阶段包含大约15000L培养体积。

[00109]多种细胞培养条件，诸如渗透度，温度和pH可被控制以在细胞培养过程中获得最佳蛋白产生(例如高效价)并减少批次差异。所述条件也可在细胞培养的生长阶段和/或生产阶段受到控制。

[00110]此外，任何适合培养细胞的模式(例如补料分批或连续)可用于本发明的方法中。本发明方法的一些实施方案中，补料分批或连续细胞培养用于促进细胞培养物中生长期的哺乳动物细胞的生长。本发明方法的其他实施方案中，涉及大量细胞培养方法使得细胞生长。在补料分批或连续细胞培养条件下，生长期细胞在适合最大生长的条件和时间下生长。特定细胞类型的最佳培养条件，诸如温度，pH，渗透性，溶解氧(DO2)，等，对于本领域技术人员是显而易见的或可由本领域技术人员轻易确定。

VIII.试剂盒

[00111]本发明还包括用于制备高效价重组蛋白的试剂盒。一些实施方案中，本发明的试剂盒包含：a)核酸分子，其含有可操作连接于适合克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多克隆位点的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件；和b)进行高效转染的装置或试剂，以及使用说明。

[00112]一些实施方案中，本发明的试剂盒包括进行受控电穿孔的装置。一些实施方案中，本发明的试剂盒还包含监测电流和电压比的工具。一些实施方案中，受控电穿孔在大约400V/cm的局部场强下进行。

[00113]一些实施方案中，本发明的试剂盒还包含细胞系(例如包含多个细胞)，其适合导入核酸分子。一些实施方案中，所述细胞系包含多个哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。

[00114]其他实施方案中，本发明的试剂盒包含一或多个适合转染核酸分子的纳米颗粒。

[00115]一些实施方案中，本发明的试剂盒包含说明书和/或宣传材料，其中包括转染装置或转染剂的详细描述。

[00116]说明书通篇可根据引用的参考文献来理解。说明书中的实施方案提供了本发明的举例说明，而并非限制本发明的范围。本领域技术人员容易理解本发明还包含许多其他实施方案。所有公开物和发明都包含在此作为参考。如果包含的文献与本发明的说明书抵触或不相符，以本发明为准。引用的参考文献并非承认其为本发明的现有技术。

[00117]除非另有说明，说明书和权利要求书中所有表达成分、细胞培养物、治疗条件等的量的数均理解为用“大约”修饰。因此，除非有相反的说明，数量参数都是大约值并且可根据本发明所需而变化。除非另有说明，系列元素之前的术语“至少”理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员将理解，或能利用常规实验确定，本发明的具体实施方案的等同方案。所述等同方案包含在本发明中。

[00118]本发明可进行多种修饰和改变而不偏离其精神和范围，这对于本领域技术人员而言显而易见。本发明的具体实施方案仅仅用于举例说明而不以任何方式限制。应理解说明书和实施例均用于示例，权利要求显示本发明的范围。

序列表

SEQ ID NO：1

Element：3.2kb rpS3 UCOE

Origin：Mouse Genonic DNA

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cattttaagtaatgttgttactgagaagtttaacccttacgggacagatccatggacctttatagatgattacga

ggaaagtgaaataacgattttgtccttagttatacttcgattaaaacatggcttcagaggctccttcctgtaatgc

gtatggattgatgtgcaaaactgttttgggcctgggccgctctgtatttgaactttgttacttttctcattttgtttgcaa

tcttggttgaacattacattgataagcataaggtctcaagcgaagggggtctacctggttatttttctttgacccta

agcacgtttataaaataacattgtttaaaatcgatagtggacatcgggtaagtttggataaattgtgaggtaag

taatgagtttttgctttttgttagtgatttgtaaaacttgttataaatgtacattatccgtaatttcagtttagagataac

ctatgtgctgacgacaattaagaataaaaactagctgaaaaaatgaaaataactatcgtgacaagtaacc

atttcaaaagactgctttgtgtctcataggagctagtttgatcatttcagttaattttttctttaatttttacgagtcatg

aaaactacaggaaaaaaaatctgaactgggttttaccactactttttaggagttgggagcatgcgaatggag

ggagagctccgtagaactgggatgagagcagcaattaatgctgcttgctaggaacaaaaaataattgattg

aaaattacgtgtgactttttagtttgcattatgcgtttgtagcagttggtcctggatatcactttctctcgtttgaggttt

tttaacctagttaacttttaagacaggtttccttaacattcataagtgcccagaatacagctgtgtagtacagcat

ataaagatttcagctctgaggtttttcctattgacttggaaaattgttttgtgcctgtcgcttgccacatggccaatc

aagtagct

SEQ ID NO：4

Human hnRNPA2 8kb UCOE sequence

agcttcaatgtttttagcaccctctgtgtggaggaaaataatgcagattattctaattagtgtaatatctaaccac

attaaaatatattacatagtaaactacactccataattttataaatttgactccccagggtaataaactagtctct

agtctgctcaccttcaactgtacaataaagtcttggttcttttgaaatagacctcaaatgagacacctaaaattc

aaagtgtctttacatttaaagacacctacaggaaagcaggtaaaagagccaggttaaaaacaaattctaa

aaccacttagctgcagttaaacatatagtaaagatgcactaaagtttcttactctgtaaatcccttccacttcag

gaaatattccactttcccattcactacacgtcgatctagtactttttccacgacaaattcttcaggctctgcctcttc

aacttttttactctttccattctgtttttttcccattttttgctaaaataaaacaaaagagaaattaagaaatattcctct

tgaattttgagcacattttcaaggctcaattgcttatattattatcacattcgacataaatttttacttctatatcccag

ggcagacaccttctggaaagattaaaagtcaacagacaataaaataaaagaatgctttatcttgttcatttag

ttcaaacttacaacccaccaccaaaataatacaataaaaaaacactatctggaaacagttatttttttccagtc

tttttttttgagacagggtctcacactcttgtcgcccaggctggagtgcagtggcgtgatctcagctcactgcaa

cctccgcctccccaggttcaagcagttctcatgcctcagcctccagagtagctgggattataggcggatgcc

accatgccgggctaattttttttgtgtttttattagaaacagggtttcaccatgttgaccaggctggtctcaaactc

ctgacctgaagtgattcaccagcctgggcctcccaaagtgctggcattacaggcgtgagccactgcgcccg

gccctgtagtcttaaaagaccaagtttactaattttcactcattttaacaacactgcaacaaacaactatgcag

gaagtacctaaagggtgatccagagaagcaagtagtagtgacaggtcttaggtgaacctatgacagacct

tgtatccacccccagatggtaaaagccccagcccccttctcaattcaaatattaatgtcaaaagcatcaatg

atacagagaaaagataaatgcagaatgaaaacatggttcaaaatcctgataccaactgcagggtcaact

atagagaccactaggaggttcaattaaaggacaagattatttttccataatctctgtagataatatttcctacca

cttagaacaaaactataaagctatcacttcaagagaccaacattacaaatttattttaattccctaaggtgaaa

aaaatccttccttcctggtttctcaagagaaagtctatactggtaaccaaattcactttaaacaggcattttctttg

gtatgacactatttaagagaagcaggaaaccaacgtgaaccagctctttccaatggctcaagatttcctatg

agaggactaaaaatggggaaaatttttatgagaggattaaaaatgggggaaaaaaaaccctgaaatggtt

aatcagaagatcctatgggctgagaaggaatccatcttaacatttcatcttaaagcaaatgctattgccgggg

gcagtggctcatgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggtgggcagatcatctgaggtcaggagttt

gagaccagcctgaccaacatggagaaaccccgtttctactaaaaatacaaaattagccaggcatagtggt

gcatgcctgtaatcccagctacttgggaggctgaggcaggagaactgcttgaacccaggaggcttaagttg

cggtgagccaagatcacgccattgcactctagcctggacaacaagagaaaaactctgtctcaaaaaaac

acaaaaacaaaaaacccaaatactatttaaaaaagataaaccttaattgctcaatcattaaagccatccca

caagtaaagcagcaagcagaaaaaagttaagaacacctcaaggctacagaaggacatttcaagctatg

caggcatatgaagtgtgcagacagatatgtaagaaaggcctcaagactgcaaaagggcatttcaagctat

gcaagcatataggtaacacatacacacacacaaaataaaatcccctgaaatacaaaaacatgcagcaa

acacctgacgtttttggataccatttctaagtcaggtgttatgattctcattagtcaagatacttgagtactgggcc

caaacagctttctgccactgtacagtacaagaaggtaggaataatggtgggaggagcaaagacaaactg

taatagacagaagtgtatcagatacctatactacatgaaaaacaaaacagctactgccacaaagggaga

aggctaacaaaataaagtcaacaataaatacagaaaatgaaaaggatacacactaaggtttacaaaaa

aaaaaaggcagacaaaatgccatacagtattcattcactactatggcattcataagctagtttcaaatgctca

ctattttcttttatagtatatatttgccttaacccagcacttttttccaaaagtggatgagtcaaaataaatttcccatt

atttaagtgaaattaacagcacacatatctcacaacactaatgaatttttaaaatggaaagttaagaactttta

aagtggccaacctgtgatccttcacaaaataaactaaatacaataacagaccccaaaggctatcaattgcg

tgcaaaaacaacttctgttttccagggtaaacagaatctaatgcagaatctaatgcagggtaaacagactta

atgcagaatctaatgatggcacaaattaaaaatcactaacgtgccctttttagtgtgaaacccagagagagc

acatacaagccaaaaacaaatgctttattttacctaggagacattaacattcacctttacgtgtttaagattaat

gcaatgttaaatattgtgaaaactgtaactttgaatttcatgatttttatgtgaatattccagggtttaaaaaaactt

gtaacatgacatggctgaataagataaaaaaaaaatctagccttttctcccttctggctcatatttgcgatttcg

atcattttgtttaaaaaacaaaacactgcaatgaattaaacttaatattcttctatgttttagagtaagttaaaaca

agataaagtgaccaaagtaatttgaaagattcaatgacttttgctccaacctaggtgcacaaggtaccttgttc

tttaaattgggctttaatgaaaatacttctccagaattctggggatttaagaaaaattatgccaaccaacaagg

gctttaccattttatgtaacatttttcaacgctgcaaaaatgtgtgtatttctatttgaagataaaaatcctcagcaa

aatccacattgcactgtccttcaaagattagccttctttgaactagttaagacactattaagccaagccagtatc

tccctgtaatgaattcgtttttctcttaattttcccctgtaatttacactgggagagctgggaaatatgtggatgtaa

atttctcagccacagagatgcaaagttatactgtggggaaaaaaaacttgagttaaatccttacatattttagg

ttttcattaacttaccaatgtagttttgttggaggccattttttttattgcagacttgaagagctattactagaaaaat

gcatgacagttaaggtaagtttgcatgacacaaaaaaggtaactaaatacaaattctgtttggattccaaccc

ccaagtagagagcgcacactttcaaacgtgaatacaaatccagagtagatctgcgctcctacctacattgct

tatgatgtacttaagtacgtgtcctaaccatgtgagtctagaaagactttactggggatcctggtacctaaaac

agcttcacatggcttaaaataggggaccaatgtcttttccaatctaagtcccatttataataaagtccatgttcc

atttttaaaggacaatcctttcggtttaaaaccaggcacgattacccaaacaactcacaacggtaaagcact

gtgaatcttctctgttctgcaatcccaacttggtttctgctcagaaaccctccctctttccaatcggtaattaaata

acaaaaggaaaaaacttaagatgcttcaaccccgtttcgtgacactttgaaaaaagaatcacctcttgcaa

acacccgctcccgacccccgccgctgaagcccggcgtccagaggcctaagcgcgggtgcccgccccca

cccgggagcgcgggcctcgtggtcagcgcatccgcggggagaaacaaaggccgcggcacgggggct

caagggcactgcgccacaccgcacgcgcctacccccgcgcggccacgttaactggcggtcgccgcagc

ctcgggacagccggccgcgcgccgccaggctcgcggacgcgggaccacgcgccgccctccgggagg

cccaagtctcgacccagccccgcgtggcgctgggggagggggcgcctccgccggaacgcgggtgggg

gaggggagggggaaatgcgctttgtctcgaaatggggcaaccgtcgccacagctccctaccccctcgag

ggcagagcagtccccccactaactaccgggctggccgcgcgccaggccagccgcgaggccaccgccc

gaccctccactccttcccgcagctcccggcgcggggtccggcgagaaggggaggggaggggagcgga

gaaccgggcccccgggacgcgtgtggcatctgaagcaccaccagcgagcgagagctagagagaagg

aaagccaccgacttcaccgcctccgagctgctccgggtcgcgggtctgcagcgtctccggccctccgcgc

ctacagctcaagccacatccgaagggggagggagccgggagctgcgcgcggggccgccggggggag

gggtggcaccgcccacgccgggcggccacgaagggcggggcagcgggcgcgcgcgcggcggggg

gaggggccggcgccgcgcccgctgggaattggggccctagggggagggcggaggcgccgacgaccg

cggcacttaccgttcgcggcgtggcgcccggtggtccccaaggggagggaagggggaggcggggcga

ggacagtgaccggagtctcctcagcggtggcttttctgcttggcagcctcagcggctggcgccaaaaccgg

actccgcccacttcctcgcccgccggtgcgagggtgtggaatcctccagacgctgggggagggggagttg

ggagcttaaaaactagtacccctttgggaccactttcagcagcgaactctcctgtacaccaggggtcagttc

cacagacgcgggccaggggtgggtcattgcggcgtgaacaataatttgactagaagttgattcgggtgtttc

cggaaggggccgagtcaatccgccgagttggggcacggaaaacaaaaagggaaggctactaagattttt

ctggcgggggttatcattggcgtaactgcagggaccacctcccgggttgagggggctggatctccaggctg

cggattaagcccctcccgtcggcgttaatttcaaactgcgcgacgtttctcacctgccttcgccaaggcaggg

gccgggaccctattccaagaggtagtaactagcaggactctagccttccgcaattcattgagcgcatttacg

gaagtaacgtcgggtactgtctctggccgcaagggtgggaggagtacgcatttggcgtaaggtggggcgt

agagccttcccgccattggcggcggatagggcgtttacgcgacggcctgacgtagcggaagacgcgttag

tgggggggaaggttctagaaaagcggcggcagcggctctagcggcagtagcagcagcgccgggtccc

gtgcggaggtgctcctcgcagagttgtttctcgagcagcggcagttctcactacagcgccaggacgagtcc

ggttcgtgttcgtccgcggagatctctctcatctcgctcggctgcgggaaatcgggctgaagcgactgagtcc

gcgatggaggtaacgggtttgaaatcaatgagttattgaaaagggcatggcgaggccgttggcgcctcagt

ggaagtcggccagccgcctccgtgggagagaggcaggaaatcggaccaattcagtagcagtggggctt

aaggtttatgaacggggtcttgagcggaggcctgagcgtacaaacagcttccccaccctcagcctcccggc

gccatttcccttcactgggggtgggggatggggagctttcacatggcggacgctgccccgctggggtgaaa

gtggggcgcggaggcgggaattcttattccctttctaaagcacgctgcttcgggggccacggcgtctcctcg

gcgagcgtttcggcgggcagcaggtcctcgtgagcgaggctgcggagcttcccctccccctctctcccggg

aaccgatttggcggccgccattttcatggctcgccttcctctcagcgttttccttataactcttttattttcttagtgtgc

tttctctatcaagaagtagaagtggttaactattttttttttcttctcgggctgttttcatatcgtttcgaggtggatttgg

agtgttttgtgagcttggatctttagagtcctgcgcacctcattaaaggcgctcagccttcccctcgatgaaatg

gcgccattgcgttcggaagccacaccgaagagcggggagggggggtgctccgggtttgcgggcccggttt

cagagaagatatcaccacccagggcgtcgggccgggttcaatgcgagccgtaggacaaagaaaccattt

tatgtttttcctgtcttttttttcctttgagtaacggttttatctgggtctgcagtcagtaaaacgacagatgaaccgc

ggcaaaataaacataaattggaagccatcggccacgaggggcagggacgaaggtggttttctgggcgg

gggagggatattcgcgtcagaatcctttactgttcttaaggattccgtttaagttgtagagctgactcattttaagt

aatgttgttactgagaagtttaacccttacgggacagatccatggacctttatagatgattacgaggaaagtg

aaataacgattttgtccttagttatacttcgattaaaacatggcttcagaggctccttcctgtaatgcgtatggatt

gatgtgcaaaactgttttgggcctgggccgctctgtatttgaactttgttacttttctcattttgtttgcaatcttggtcg

aacattacattgataagcataaggtctcaagcgaagggggtctacctggttatttttctttgaccctaagcacgt

ttataaaataacattgtttaaaatcgatagtggacatcgggtaagtttggataaattgtgaggtaagtaatgagt

ttttgctttttgttagtgatttgtaaaacttgttataaatgtacattatccgtaatttcagtttagagataacctatgtgct

gacgacaattaagaataaaaactagctgaaaaaatgaaaataactatcgtgacaagtaaccatttcaaaa

gactgctttgtgtctcataggagctagtttgatcatttcagttaattttttctttaatttttacgagtcatgaaaactac

aggaaaaaaaatctgaactgggttttaccactactttttaggagttgggagcatgcgaatggagggagagct

ccgtagaactgggatgagagcagcaattaatgctgcttgctaggaacaaaaaataattgattgaaaattac

gtgtgactttttagtttgcattatgcgtttgtagcagttggtcctggatatcactttctctcgtttgaggttttttaaccta

gttaacttttaagacaggtttccttaacattcataagtgcccagaatacagctgtgtagtacagcatataaagat

ttcagctctgaggtttttcctattgacttggaaaattgttttgtgcctgtcgcttgccacatggccaatcaagta

SEQ ID NO：5

＞NM_020371|Homo sapiens apoptosis，caspase activation inhibitor

(AVEN)，mRNA.|Homo sapiens

GGGCGTCTCCGCCGCAGCTCGGCTCCCGCGCGCTCAGCACCGCCAGCGGCGGCCAGATGCAGGCGGAGC

G

AGGAGCTCGGGGAGGCCGTGGGCGGCGGCCAGGCCGCGGCCGGCCTGGCGGAGATCGCCACAGCGAGCG

G

CCCGGAGCCGCAGCGGCGGTAGCCAGAGGCGGCGGCGGAGGCGGCGGCGGGGACGGAGGCGGACGCCGG

G

GCCGTGGCCGTGGCCGGGGCTTCCGCGGCGCTCGCGGAGGCCGAGGAGGAGGAGGCGCCCCGCGAGGCA

G

CCGCCGGGAGCCGGGAGGCTGGGGCGCAGGGGCCAGCGCGCCGGTTGAAGATGACAGCGATGCAGAGAC

C

TATGGAGAAGAGAATGATGAACAGGGAAATTATTCTAAAAGAAAGATTGTCTCTAACTGGGATCGATAT

C

AAGATATTGAAAAAGAGGTCAATAATGAAAGTGGAGAGTCACAGAGGGGAACAGATTTCAGTGTCCTCC

T

TAGCTCTGCAGGGGACTCATTCTCACAGTTCCGGTTTGCTGAGGAGAAAGAATGGGATAGTGAAGCTTC

T

TGTCCAAAACAGAATTCAGCATTTTATGTGGATAGTGAGTTATTGGTTCGAGCCCTTCAAGAGCTGCCT

C

TCTGCCTCCGACTCAACGTTGCTGCCGAACTGGTCCAGGGTACAGTTCCTTTAGAGGTTCCTCAGGTGA

A

ACCAAAGAGAACTGATGATGGCAAGGGATTAGGGATGCAGTTAAAGGGGCCCTTGGGGCCTGGAGGAAG

G

GGGCCCATCTTTGAGCTGAAATCTGTGGCTGCTGGCTGCCCTGTGTTGCTGGGCAAAGACAACCCAAGC

C

CGGGTCCTTCAAGGGATTCTCAGAAACCCACTTCCCCACTGCAGTCAGCAGGAGACCATTTGGAAGAAG

A

ACTAGATCTGTTGCTTAATTTAGATGCACCTATAAAAGAGGGAGATAACATCTTACCAGATCAGACGTC

T

CAGGACCTGAAATCCAAGGAAGATGGGGAGGTGGTCCAAGAGGAAGAAGTTTGTGCAAAACCATCTGTG

A

CTGAAGAAAAAAACATGGAACCTGAGCAACCAAGTACCTCCAAAAATGTTACCGAGGAAGAGCTGGAAG

A

CTGGTTGGACAGCATGATTTCCTAAAAAGGGGAAAAAAAGTGCCTGAAGCAAATCTTGGTTGCCTTCTA

A

CGGCAGGTGGGCATAAGGCTGTCCTTCAGGACCAGCCAGTTTACAAGCATGTCTCAAGCTAGTGTGTTC

C

ATTATGCTCACAGCAGTAAATGCCTACCTCTGTGTTTGACATCTGAAAGAATACATTGAAGCAGCTTGT

T

GCATTTGTTTTTCTGGCTTAGTAATCTAATAGATTTCCTTAAGGGCAGGAGATAGACTCTGGCCCTTGT

T

TCTAGCCTCCTTCCTTGCAGTGTTTACAACATAGCCAGTGTTTACAGCATAGCAGATGCTGCTGCTGAT

T

AAGAGAATAGATGCAAACAAGGCATGCATTTGGCCAAAATAAACAAATGCTGGTCTGTCCAAAAAAAAA

A

AAAAAAAAAAA

SEQ ID NO：6

＞Q9NQS1|Cell death regulator Aven.|Homo sapiens

MQAERGARGGRGRRPGRGRPGGDRHSERPGAAAAVARGGGGGGGGDGGGRRGRGRGRGFRGARGGRGGG

G

APRGSRREPGGWGAGASAPVEDDSDAETYGEENDEQGNYSKRKIVSNWDRYQDIEKEVNNESGESQRGT

D

FSVLLSSAGDSFSQFRFAEEKEWDSEASCPKQNSAFYVDSELLVRALQELPLCLRLNVAAELVQGTVPL

E

VPQVKPKRTDDGKGLGMQLKGPLGPGGRGPIFELKSVAAGCPVLLGKDNPSPGPSRDSQKPTSPLQSAG

D

HLEEELDLLLNLDAPIKEGDNILPDQTSQDLKSKEDGEVVQEEEVCAKPSVTEEKNMEPEQPSTSKNVT

E

EELEDWLDSMIS

SEQ ID NO：7

＞NM_028844|Mus musculus apoptosis，caspase activation inhibitor

(Aven)，mRNA.|Mus musculus

GTCGCGCGTTCTGCTCGCCGGCGGCCTCATGCAGGCTGAGCGCGGGGCTAGGGGCGGCCGCGGGCGGCG

G

GGAGGCCGGGAGCGGCCCGGAGGGGACCGAGAGCCGGTCGGGGCAGCGACGGCGCTGGCGAGAGGAGGC

T

GCGGGGACGGAGGCGGCCGGCGGGGCCGAGGCCGGGGCTTCCGCCGAGGCCGAGGAGGTGGCGGCCTGC

G

AGGCGGCCGCTGGGAGCCTGGAGGCCGGGGCGGCGGAGCCAGCACTCGGGTGGAAGAAGACAGCGATTC

A

GAGACCTATGGAGAAGAGAATGATGAGCAAGGAAATTTTTCTAGAAGAAAGATTGTCTCCAACTGGGAT

C

GCTATCAAGATACTGAAAAGGAGGTCAATGGTGAAAGTGGAGAATCTCAGCGGGGCACAGACTTCAGTG

T

CCTCCTGAGCTCTGCAGGGGACTCCTTTTCACAGTTCCGATTTGCTGAGGAGAAAGAATGGGATGGTGA

A

ACTTCATGTCCAAAACAGAATTCAGCACTCTACGTGGACAGTGAGTCACTGGTTCGAGCCCTTGAGCAG

C

TGCCTCTTGCAGTCAGGCTTAATGTTGCTTCAGAATTGATCCAGACCACAATTCCTTTAGAACTTCCAC

A

GGTGAAACCAAGGAGAAACGATGATGGCAAGGAGCTGGGCATGCATTTAAGGGGACCCATCTCTGAGCT

C

AGATCTGCTGCTGGTGCTTGCCCCAGGTCTCTGGGCAGAGGCAGTCTAAGGCAAAGCCCTTTAGAAGGT

T

TGCAGAAAGCACCTACCCCAACACAGTCAGTGGCAGACCACCTGGAAGAAGAACTAGATATGTTGCTGC

A

TTTAGATGCACCTGTGCAAGAGGAAGGCATTATCTCTCCAGACCAGACATCTCGGGACCAGGAACCAGA

A

AAAGATGGGCAGGTAGCCCAGGAGGAAACAGGTCCTGAAAAACCTTCTGTGACCAGAGAGAAGAATGTG

G

AACCTGAGCAGCCAAGCACATCGAAGAATGTCACCGAGGAAGAGCTGGAGGACTGGCTGGACAGCATGA

T

TTCCTGAAGCGGGGTCAAGGGGGAAGAGTGCCTGAAGCAAATGCTGGTTGCCTTCTGTGTAATGAGCCC

G

TCTTGTGAGGACGGGCTCGTTTACCAGCTACCCCATGCTAACACGTCCTGTTATGCTTACAGCAGCCAA

C

ACCTACCTCTGTGTTTGATGGCATCTGAATATATGTATGAGGCC

SEQ ID NO：8

＞Q9D9K3|Cell death regulator Aven.|Mus musculus

MQAERGARGGRGRRGGRERPGGDREPVGAATALARGGCGDGGGRRGRGRGFRRGRGGGGLRGGRWEPGG

R

GGGASTRVEEDSDSETYGEENDEQGNFSRRKIVSNWDRYQDTEKEVNGESGESQRGTDFSVLLSSAGDS

F

SQFRFAEEKEWDGETSCPKQNSALYVDSESLVRALEQLPLAVRLNVASELIQTTIPLELPQVKPRRNDD

G

KELGMHLRGPISELRSAAGACPRSLGRGSLRQSPLEGLQKAPTPTQSVADHLEEELDMLLHLDAPVQEE

G

IISPDQTSRDQEPEKDGQVAQEETGPEKPSVTREKNVEPEQPSTSKNVTEEELEDWLDSMIS

SEQ ID NO：9

Anti-apoptotic E1B-19K human sequences

      CDS                1..504

                         /codon_start＝1

                         /product＝″E1B 19K″

                         /protein_id＝″AAC13957.1″

                         /db_xref＝″GI:303979″

1   atggagttgt ggagtgagtt acaaagttat cagaacctcc gacgcttgct ggagttggct

61  tctgccagaa cttccagctg ttggagaatc ctttttggct caactttaac taatgtaatc

121 tatagagcta aggaggagta ctcttcgcgg tttgctgacc ttttgtcgca taaccctgga

181 atttttgctt ctttgaattt ggggcatcac tcattttttc aagaaattgt gatcagaaat

241 ttagattttt cttctcctgg ccgtacggtt tctgggcttg cttttatttg ttttatattg

301 gatcaatgga gcgcccaaac tcatctgtcg cagggttata ctctggatta catggcaatg

361 gctctgtgga gaaccttgct acggaggaag agggtcttag gttgcttgcc ggcgcagcgt

421 ccgcacggtt tggatccagt gcaggaagag gaggaggagg aggagaacct gagggccggc

481 ctggaccctt caacggaatt gtaa

SEQ ID NO：10

MELWSELQSYQNLRRLLELASARTSSCWRILFGSTLTNVIYRAK

EEYSSRFADLLSHMPGIFASLNLGHHSFFQEIVIRNLDFSSPGRTVSGLAFICFILDQ

WSAQTHLSQGYTLDYMAMALWRTLLRRKRVLGCLPAQRPHGLDPVQEEEEEEENLRAG

LDPSTEL

SEQ ID NO：11

G.gallus lysozyme gene promoter X84223

1   aagcttcttt ggaaatacac cgacttgatt gaagtctctt gaagatagta aacagtactt

61  acctttgatc ccaatgaaat cgagcatttc agttgtaaaa gaattccgcc tattcatacc

121 atgtaatgta attttacacc cccagtgctg acactttgga atatattcaa gtaatagact

181 ttggcctcac cctcttgtgt actgtatttt gtaatagaaa atattttaaa ctgtgcatat

241 gattattaca ttatgaaaga gacattctgc tgatcttcaa atgtaagaaa atgaggagtg

301 cgtgtgcttt tataaataca agtgattgca aattagtgca ggtgtcctta aaaaaaaaaa

361 aaagtaatat aaaaaggacc aggtgtttta caagtgaaat acattcctat ttggaaaaca

421 gttacatttt tatgaagatt accagcgct

SEQ ID NO：12

Chicken lysozyme gene intrinsically curved segment of DNA X52989

1   gcgctgctga ctttctaaac ataaggctgt attgtcttcc tgtaccattg catttcctca

61  ttcccaattt gcacaaggat gtctgggtaa actattcaag aaatggcttt gaaatacagc

121 atgggagctt gtctgagttg gaatgcagag ttgcactgca aaatgtcagg aaatggatgt

181 ctctcagaat gcccaactcc aaaggattta tatgtgtata tagtaagcag tttcctgatt

241 ccagcaggcc aaagagtctg ctgaatgttg cgttgccgga gacctgtatt tctcaacaag

301 gtaagatggt atcctagcaa ctgcggattt taatacattt tcagcagaag tacttagtta

361 atctctacct ttagggatcg tttcatcatt tttagatgtt atacttgaaa tactgcataa

421 cttttagctt tcatgggttc ctttttttca gcctttagga gactgttaag caatttgctg

481 tccaactttt gtgttggtct taaactgcaa tagtagttta ccttgtattg aagaaataaa

541 gaccattttt atattaaaaa atacttttgt ctgtcttcat tttgacttgt ctgatatcct

601 tgcagtgctc attatgtcag ttctgtcaga tattcacaca tcaaaactta acgtgagctc

SEQ ID NO：13

G.gallus lysozyme gene 5′matrix attachment region(MAR)X98408

       1 ggatccataa tataactgta ccaggttttg gtttattaca tgtgactgac

ggcttcctat

       61 gcgtgctcag aaaacggcag ttgggcactg cactgcccgg tgatggtgcc

acggtggctc

      121 ctgccgcctt ctttgatatt cactctgttg tatttcatct cttgttgccg

atgaaaggat

      181 ataacagtct ctgaggaaat acttggtatt tcttctgatc agcgttttta

taagtaatgt

      241 tgaatattgg ataaggctgt gtgtcctttg tcttgggaga caaagcccac

agcaggtggt

      301 ggttgggtgg tggcagctca gtgacaggag aggttttttt gcctgttttt

tttgttgttt

      361 ttttttttta agtaaggtgt tcttttttct tagtaaaatt tctactggac

tgtatgtttt

      421 gacaggtcag aaacatttct tcaaaagaag aaccttttgg aaactgtaca

gcccttttct

      481 ttcattccct ttttgctttc tgtgccaatg cctttggttc tgattgcatt

atggaaaacg

      541 ttgatcggaa cttgaggttt ttatttatag tgtggcttga aagcttggat

agctgttgtt

      601 acatgagata ccttattaag tttaggccag cttgatgctt tatttttttt

cctttgaagt

      661 agtgagcgtt ctctggtttt tttcctttga aactggcgag gcttagattt

ttctaatggg

      721 attttttacc tgatgatcta gttgcatacc caaatgcttg taaatgtttt

cctagttaac

      781 atgttgataa cttcggattt acatgttgta tatacttgtc atctgtgttt

ctagtaaaaa

      841 tatatggcat ttatagaaat acgtaattcc tgatttcctt ttttttttat

ctctatgctc

      901 tgtgtgtaca ggtcaaacag acttcactcc tatttttatt tatagaattt

tatatgcagt

      961 ctgtcgttgg ttcttgtgtt gtaaggatac agccttaaat ttcctagagc

gatgctcagt

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gccttcccag

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cccaggaagt

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gttggcatag

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gtgcataggt

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gatgcctgtt

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gtgctttgtg

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gctgggtact

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tcctcagttg

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gcatctctat

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attgcagcag

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SEQ ID NO：14

Cloning vector pMAR，luciferase reporter vector containing MAR

            insulator sequence AJ277960

1 aggtcactgt gacctagatc cgcaggtcac tgtgacctac atctgatatc atcgtcgacg

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aatgtccgtt

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cgtcgtatgc

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cggagttgca

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gaacatttcg

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cgtgcaaaaa

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ccagggattt

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atacgatttt

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ctctggatct

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attctcgcat

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aagtgttgtt

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tggatttcga

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ggattacaaa

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cactctgatt

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tctttcgaaa

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aggatatggg

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accgggcgcg

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cgggaaaacg

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gtccggttat

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acattctgga

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gaagtcttta

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gttacaacac

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tgaacttccc

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cgtggattac

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tgtggacgaa

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cctcataaag

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tgacgaaatt

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taaggcagtt

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taattggaca

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gctgcactgc

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aacagttata

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attaataact

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aaggaatatt

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agaggtttta

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gaatgcaatt

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tagcatcaca

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ccacagcagg

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ttttcctttg

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taaagcatct

     4561 ctatttgtaa attatgcact tgttagttcc tgaatccttt ctatagcacc

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     4621 gcaggtgtag gctctggtgt ggcctgtgtc tgtgcttcaa tcttttaagc tt

Claims (48)

1.在细胞培养物中制备高效价重组蛋白而无需基因扩增的方法，所述方法包括：将包含可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多个核苷酸序列的核酸分子导入一或多个细胞，其中所述核酸分子利用高效转染导入一或多个细胞。

2.权利要求1的方法，其中高效转染包括受控电穿孔，所述的受控电穿孔包括如下步骤：1)将一或多个细胞置于电穿孔装置中，所述电穿孔装置包含具有适合接受一或多个细胞的一或多个开口的隔板；2)将所述一或多个细胞固定在所述一或多个开口内；3)将所述一或多个细胞与所述核酸分子接触；4)使所述一或多个细胞与电流接触使得电流通过所述细胞；5)监测电穿孔装置中电流和电压的比值；和6)调节局部场强的量级至适合实现对一或多个细胞的电穿孔的值。

3.权利要求2的方法，其中所述一或多个细胞与所述核酸分子接触，然后与电流接触。

4.权利要求2的方法，其中所述一或多个细胞与电流接触，然后与所述核酸分子接触。

5.权利要求2的方法，其中所述一或多个细胞同时与所述核酸分子和电流接触。

6.权利要求1的方法，其中所述高效转染包括受控电穿孔，所述的受控电穿孔包括以下步骤：1)将一或多个细胞置于包含至少一个伸长毛细管的电穿孔装置中，所述伸长毛细管的管腔具有第一末端和第二末端，其中第一末端和第二末端的开口都进入储池中并且所述一或多个细胞可流经所述至少一个毛细管管腔进入储池；2)将所述一或多个细胞与包含与编码重组蛋白的核苷酸序列可操作连接的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件的核酸分子接触；3)使所述一或多个细胞与电流接触使得电流通过该一或多个细胞；4)监测电穿孔装置中电流和电压的比值；和5)调节局部场强的量级至适合实现对一或多个细胞的电穿孔的场强。

7.权利要求6的方法，其中所述一或多个细胞与所述核酸分子接触，然后与电流接触。

8.权利要求6的方法，其中所述一或多个细胞与电流接触，然后与所述核酸分子接触。

9.权利要求6的方法，其中所述一或多个细胞同时与所述核酸分子和电流接触。

10.权利要求1的方法，其中高效转染包括将所述核酸分子导入至少80％的所述细胞。

11.权利要求1的方法，其中高效转染包括将所述核酸分子导入至少85％的所述细胞。

12.权利要求1的方法，其中高效转染包括将所述核酸分子导入至少90％的所述细胞。

13.权利要求1的方法，其中高效转染包括将所述核酸分子导入至少95％的所述细胞。

14.权利要求1的方法，其中所述一或多个细胞是哺乳动物细胞。

15.权利要求1的方法，其中所述一或多个细胞选自下组：一或多个BHK21细胞，一或多个CHO细胞，一或多个CHO-K1细胞，一或多个CHO-DUXX细胞，一或多个NSO细胞或一或多个Sp2/0细胞。

16.权利要求1的方法，其中所述一或多个细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。

17.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是治疗蛋白。

18.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是抗体或其抗原结合片段。

19.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是单克隆抗体。

20.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件选自：(a)一或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b)一或多个基质附着区；(c)一或多个稳定化区和抗阻遏区；以及(d)(a)-(c)的任意组合。

21.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是天然存在的DNA元件。

22.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是人工合成的DNA元件。

23.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是天然存在的DNA元件与人工合成的DNA元件的组合。

24.权利要求20的方法，其中一或多个延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在表达的基因的启动子区。

25.权利要求24的方法，其中所述一或多个遍在表达的基因选自人hnRNPA2，小鼠hnRNPA2，人TBP，小鼠TBP，人rpS3和小鼠rpS3。

26.权利要求1的方法，其中所述核酸分子还包含一或多个选自下组的核苷酸序列：(a)能增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA的稳定性的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。

27.权利要求2的方法，其中所述隔板包含绝缘材料。

28.权利要求2的方法，其中开口的至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％被一或多个细胞堵塞。

29.权利要求2的方法，其中所述一或多个开口的直径小于所述一或多个细胞的直径。

30.权利要求2的方法，其中所述一或多个开口的直径基本等于所述一或多个细胞的直径。

31.权利要求6的方法，其中所述一或多个细胞的直径是所述至少一个毛细管的管腔的直径的至少80％。

32.权利要求1的方法，其中所述核酸分子是载体。

33.权利要求31的方法，其中所述载体是质粒。

34.权利要求31的方法，其中所述载体是病毒载体。

35.权利要求2的方法，其中所述细胞通过施加压力固定在开口处。

36.权利要求2的方法，其中所述细胞通过施加压力固定在开口处。

37.权利要求2的方法，其中所述电穿孔装置包含两个小室，每个小室适合接受缓冲液。

38.权利要求2的方法，其中两个小室中的每个包含相同的缓冲液。

39.权利要求37的方法，其中两个小室中的每个包含不同的缓冲液。

40.权利要求1的方法，其中所述方法不包括选择步骤。

41.用于产生高效价重组蛋白的试剂盒，包括a)核酸分子，其含有可操作连接于适合克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多克隆位点的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多个DNA元件；和b)进行高效转染的装置或试剂，以及使用说明。

42.权利要求41的试剂盒，其中所述装置是受控电穿孔装置。

43.权利要求41的试剂盒，还包括用于监测电流和电压比值的工具。

44.权利要求41的试剂盒，还包括适合导入所述核酸分子的细胞系。

45.权利要求44的试剂盒，其中所述细胞系包含多个细胞。

46.权利要求2或6的方法，其中局部场强为大约250-400V/cm。

47.权利要求1的方法，其中所述高效转染包括利用纳米颗粒。

48.权利要求47的方法，其中所述高效转染包括利用磁性纳米颗粒。