MX2012011738A - Metodo para la seleccion de una celula de produccion a largo plazo. - Google Patents

Abstract

En la presente se describe un método para determinar la. metilación de un ácido nucleico promotor operablemente ligado a un ácido nucleico que codifica un polipéptido y de este modo determinar la productividad a largo plazo de una célula. También un aspecto es un método para seleccionar una célula para producir un polipéptido determinando la metilación del ácido nucleico promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica al polipéptido.

Description

METODO PARA LA SELECCION DE UNA CELULA DE PRODUCCION A LARGO PLAZO Campo de la Invención El método descrito en la presente está en el campo de la selección celular y expresión de polipéptidos . A mayor detalle, en la presente se describe un método para la selección de un polipéptido a largo plazo expresando o secretando célula basada en la detección de la metilación del ácido nucleico del promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica al polipéptido.

Antecedentes de la Invención La metilación enzimática de citosina basada en carbono 5 que resulta en 5-metil-citosina es una modificación de ADN encontrada en procariotas así como también en eucariotas. En las células eucarióticas es bien conocido como un mecanismo epigenético fundamental resultando en la silenciación del gen. La metilación ocurre específicamente en dinucleótidos CpG que se encuentran frecuentemente dentro de las regiones promotoras. Fuera de los promotores, los sitios CpG son raros. Los promotores metilados son silenciosos es decir transcripcionalmente inactivos de manera que el gen no se expresa. El ADN metilado recluta proteínas que enlazan el ADN-metilo que forman una plataforma para otros factores como HDACs que modifican y condensan la cromatina.

Ref . : 234497 La silenciación del gen por metilación de promotor se ha reportado no solo para los genes autólogos sino también para los constructos de genes recombinantes (Escher, G., et al, J. Lipid Res. 46 (2005) 356-365; Brooks, A. R. , et al, J. Gen. Med. 6 (2004) 395-404) . El tratamiento de bisulfito de ADN es un método idóneo para discriminar entre sitios CpG metilados y no metilados. Bajo las condiciones usadas, la citosina pero no 5-metil-citosina es desaminada en C4 y de este modo convertida a uracilo. Complementariamente las hebras de ADN de este se convierten en dos hebras, A y B, que ya no son complementarias .

Barnes, L.M. , et al. (Biotechnol. Bioeng. 96 (2006) 337-348) describe que el nivel de mARN LC/HC es para célula NS0 un marcador para estabilidad a largo plazo. Chusainow, J., et al. (Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1182-1196) y Jiang, Z., et al. (Biotechnol. Prog.22 (2006) 313-318) describe que los niveles de mARN LC/HC son más altos para las células tratadas MTX. Lee, C.J., et al. (Biotechnol. Bioeng. 102 (2008) 1107-1118) describe la selección de células basadas en el nivel de mARN HC.

Escher et al. (ver arriba) describe el promotor CMV silenciando en macrófagos transectados transitoriamente. El promotor CMV silenciando in vivo con adenovirus es describedo por Brooks et al. (ver arriba) .

Los elementos VEZF1 que median la protección de metilación de ADN es describedo por Dickson, J. , et al. (PLoS Genetics 6 (2001) el000804) . Mielke, C, et al. (Gene 254 (2000) 1-8) describe la expresión a largo plazo, estabilizada, de proteínas heterodiméricas de mARN tricistrónico . La relación específica de cepa de cierre de actividad de potenciador CMV en hígado murino que es confirmada por el uso de vectores adenovirales persistentes es describeda por Everett, R.S., et al. (J. Virol. 325 (2004) 96-105). Proesch, S., et al. (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377 (1996) 195-201) describe la inactivación del promotor anticipado inmediato muy fuerte HCMV por metilación ADN CPG in vi tro. Los métodos basados en PCR para detectar biomarcadores de metilación de ADN de un solo lugar en diagnósticos, pronósticos, y respuesta de cáncer al tratamiento son describedos por Kristensen, L.S. and Hansen, L.L. (Clin. Chem. 55 (2009) 1471-1483). Recillas-Targa, F., et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 99 (2002) 6883-6888) describe que la protección de posición-efecto y bloqueo del potenciador por el aislador beta-globina de pollo son actividades que pueden separarse.

Breve Descripción de la Invención Se ha encontrado que la determinación del grado de metilación de un sitio CpG específico en el ácido nucleico promotor operablemente ligado a un gen estructural que codifica a un polipéptido en una célula o una línea celular para la producción del polipéptido respectivo puede usarse para predecir una disminución en la productividad durante el cultivo a largo plazo.

Como un aspecto, se describe en la presente un método para seleccionar una célula que comprende las siguientes etapas : a) identificar un sitio CpG en un ácido nucleico promotor con un método que comprende las siguientes etapas: 1) aislar separadamente el ADN de al menos 10 células de un cultivo de una célula que tiene una tasa de producción de un polipéptido que está después de un tiempo de cultivo de 30 generaciones de la célula en la ausencia de un agente de selección de menos que 90 % de la tasa de producción de la célula después de la cebadora generación del cultivo, 2) modificar la citosina del ADN aislada por el tratamiento de bisulfito, 3) identificar un sitio CpG dentro del ácido nucleico promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica al polipéptido con una frecuencia de metilación de al menos 0.2 basado en el ADN obtenido en la etapa 2) y de este modo identificando un sitio CpG, b) proporcionando al menos una célula que comprende un ácido nucleico que comprende un gen estructural que codifica un polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor que es el mismo como el de la etapa a) , c) determinar la frecuencia de metilacipn del sitio CpG identificado en la etapa a) para cada una de al menos un célula de la etapa b) basada en el menos 10 copias del ácido nucleico promotor o 10 células obtenidas de un cultivo de las mismas, d) seleccionar una célula en la que la frecuencia de metilacion como se determinó en la etapa c) está debajo de dos veces el valor promedio obtenido determinando la metilacion de una citosina en un sitio no CpG o, seleccionando una célula en la que la frecuencia de metilacion como se determinó en el paso c) está debajo de 5 %.

Otro aspecto como se describe en la presente es un método para seleccionar una célula que comprende las siguientes etapas: a) determinar para cada una de al menos una célula que comprende un ácido nucleico, que comprende un gen estructural codificando un polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 01, la frecuencia de metilacion de un sitio CpG en una posición seleccionada de las posiciones 80, 96, 425, 437, 563 y 591 de SEQ ID NO: 01 basada en la metilacion determinada por al menos 10 copias del ácido nucleico promotor o en al menos 10 células obtenidas de un cultivo de cada célula, b) seleccionar una célula en la que la frecuencia de metilación como se determinó está debajo de 5 % .

En una modalidad la determinación comprende las siguientes etapas: 1) aislar el ADN de cada una de las células, 2) realizar para cada ADN aislado individualmente una metilación específica de reacción de cadena de polimerasa, 3) determinar con los resultados obtenidos en la etapa 2) la frecuencia de metilación del sitio CpG.

En otra modalidad la etapa 2) es la siguiente etapa: 2) realizar para cada ADN aislado individualmente una reacción de cadena de polimerasa con un cebador específico de metilación y un cebador universal.

También en una modalidad de la etapa 2) es la siguiente etapa: 2) individualmente digerir el ADN aislado con una enzima de restricción y realizar una reacción de cadena de polimerasa para cada uno de los ADN digeridos con un cebador específico de metilación y un cebador universal.

En una modalidad el ácido nucleico promotor tiene la secuencia de SEQ ID NO: 01 o comprende una fragmento de la misma o una variante de la misma y el sitio CpG se selecciona de las posiciones 80, 96, 425, 437, 563 y 591 de SEQ ID NO: 01 o una posición correspondiente al mismo en un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad los cebadores son independientemente el uno del otro seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NO: 06 a 20. En una modalidad adicional un cebador se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 11, 14 y 15, el cebador universal tiene la secuencia de SEQ ID NO: 09 y un cebador específico de metilacion se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, 18 y 19. También en una modalidad el cebador universal tiene la secuencia de SEQ ID NO: 09 y 11 y el cebador específico de metilacion tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y 18.

También un aspecto como se describe en la presente es un método para la producción de un polipéptido que comprende las siguientes etapas: a) seleccionar una célula con un método como se describe en la presente, b) cultivar la célula seleccionada, y c) recuperar el polipéptido del medio de cultivo y/o la célula y de este modo producir un polipéptido.

En una modalidad el método comprende previo a la etapa a) las siguientes etapas: a-3) proporcionar una célula, a-2) transfectar la célula proporcionada con un ácido nucleico que contiene un gen estructural que codifica al polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor, a-1) i) opcionalmente cultivar y propagar la célula transfectada en la presencia de un agente de selección, ii) depósito sencillo de las células, y iii) cultivar el depósito sencillo de las células transfectadas en la presencia de un agente de selección.

Un aspecto adicional como se describe en la presente es un kit que comprende a) un reactivo para la modificación de citosina no metilada en un sitio CpG, y b) un cebador seleccionado de SEQ ID NO: 13, 16, 17, 18, 19 y 20.

En una modalidad de los aspectos como se describe en la presente la célula es un clon de célula.

Breve Descripción del Listado de Secuencias SEQ ID NO: 01 Secuencia de nucleótido del promotor/potenciador (hCMV) anticipado inmediato CMV humano.

SEQ ID NO: 02 Secuencia de nucleótido de hebra A del promotor/potenciador hCMV, todos los sitios CpG preservados SEQ ID NO: 03 Secuencia de nucleótido de hebra A del promotor/potenciador hCMV, completamente desaminado SEQ ID NO: 04 Secuencia de nucleótido de hebra B del promotor/potenciador hCMV, todo el sitio CpG preservado SEQ ID NO: 05 Secuencia de nucleótido de la hebra B completamente desanimada del promotor/potenciador hCMV, completamente desaminado SEQ ID NO: 06 Cebador 227.

SEQ ID NO: 07 Cebador 228.

SEQ ID NO: 08 Cebador 229.

SEQ ID NO: 09 Cebador 237.

SEQ ID NO: 10 Cebador 238.

SEQ ID NO: 11 Cebador 239.

SEQ ID NO: 12 Cebador 240.

SEQ ID NO: 13 Cebador específico de metilación 254 SEQ ID NO: 14 Cebador 263.

SEQ ID NO: 15 Cebador 264.

SEQ ID NO: 16 Cebador específico de metilación 265 SEQ ID NO: 17 Cebador específico de metilación 266 SEQ ID NO: 18 Cebador específico de metilación 267 SEQ ID NO: 19 Cebador específico de metilación 268 SEQ ID NO: 20 Cebador específico de metilación 262 SEQ ID NO: 21 Secuencia de plantilla #11.

SEQ ID NO: 22 Secuencia de plantilla #62.

SEQ ID NO: 23 Secuencia de plantilla #01.

SEQ ID NO: 24 Secuencia de plantilla #04.

SEQ ID NO: 25 Secuencia de plantilla #16.

SEQ ID NO: 26 Cebador 133.

SEQ ID NO: 27 Cebador 132.

SEQ ID NO: 28 Cebador 166.

SEQ ID NO: 29 Cebador 178.

SEQ ID NO: 30 Cebador 180.

SEQ ID NO: 31 Cebador 185.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 Número del sitio CpG metilado del promotor/potenciador hCMV obtenido de diferentes líneas celulares.

Figura 2 Mapa plásmido de p5057.

Figuras 3A-3E 3A:Tasa de producción específica en la ausencia de un agente de selección de la línea celular K18.1 sobre generaciones múltiples en una producción a largo plazo. 3B: Tasa de producción específica en la ausencia de un agente de selección de la línea celular G25-10 sobre generaciones múltiples en una producción a largo plazo. 3C: Tasa de producción específica en la ausencia de un agente de selección de la línea celular G25-17 sobre generaciones múltiples en una producción a largo plazo. 3D: Tasa de producción específica en la ausencia de un agente de selección de la línea celular G42-5 sobre generaciones múltiples en una producción a largo plazo. 3E: Tasa de producción específica en la ausencia de un agente de selección de la línea celular 43-16 AlO sobre generaciones múltiples en una producción a largo plazo.

Figuras 4A-4E Figuras 4A-4E superior: la frecuencia de metilación dentro de ADN hCMV-MIE de líneas celulares CHO recombinantes en sitios de metilación diferentes determinados por el análisis de 19-22 ácidos nucleicos promotores individuales; Figuras 4A-4E inferiores: representación esquemática de sitios CpG metilados dentro de ADN promotor/potenciador hCMV-MIE de líneas celulares CHO recombinantes, los sitios metilados se muestran en negro, la posición 425 es resaltada por una flecha. 4A: línea celular K18.1 - Metilación de todos los sitios CpG: 12 %, Metilación del sitio C425: 64 %, Metilación del sitio C591: 27 %, Metilación del sitio C96: 32%; 4B: línea celular G25-10 - Metilación de todos los sitios CpG: 0.5 %, Metilación del sitio C425: 0 %, Metilación del sitio C591: 5 %, Metilación del sitio C96: 0 %; 4C: línea celular G25-17 - Metilacion de todos los sitios CpG: 0.3 %, Metilacion del sitio C425: 0 %, Metilacion del sitio C591: 0 %, Metilacion del sitio C96: 0 %; 4D: línea celular G42-5 - Metilacion de todos los sitios CpG: 0.6 %, Metilacion del sitio C425: 0 %, Metilacion del sitio C591: 0 , Metilacion del sitio C96: 0 %; 4E: línea celular 43-16 A10 - Metilacion de todos los sitios CpG: 4.4 %, Metilacion del sitio C425: 25 %, Metilacion del sitio C591: 15 %, Metilacion del sitio C96: 10 %.

Figuras 5A-5D La discriminación de hCMV-MIE que es metilada en el sitio 425 de hCMV-MIE que no es metilada en el sitio 425 por pPCR de tiempo real específico · por metilacion; curvas de amplificación PCR para las plantillas #11 (Fig. 5A) , #62 (fig. 5B) , #01 (Fig. 5C) y #04 (Fig. 5D) .

Figura 6 Las curvas de amplificación PCR para cebador específico de metilacion diferente y pares de cebador .

Figura 7 Recuperación del sitio 425 hCMV-MIE metilado en el fondo de hCMV-MIE no metilado por qPCR en tiempo real específico por metilacion.

Figuras 8A-8B Metilación de ácido nucleico de promotor CMV en el sitio de metilación 425 obtenido con cebador #239 y #267 con pre-amplificación (Fig. 8A) y directamente de ADN tratado con bisulfito (Fig. 8B) .

Figura 9 Metilación de ácido nucleico de promotor CMV en el sitio de metilación 425 obtenido con cebador (negro) 239+237 y 239+267, (blanco) 263+237 y 263+267, (líneas horizontales) 264+237 y 264 +267 y (líneas verticales) 239+237 y 239+266.

Figuras 10A-10B El análisis de curva de fundición normalizada de alta resolución de ej emplificación (Fig. 10A) y el primer derivado del mismo, es decir picos de fundición (Fig. 10B) .

Figuras 11A-11B Correlación del grado de metilación en C425 antes del cultivo a largo plazo y la alteración relativa del SPR después de 60 cultivos de generaciones con 250 nM MTX (Fig.

HA) o sin MTX (Fig. 11B) .

Figura 12 Correlación del grado de metilación en C425 antes del cultivo a largo plazo y el grado de metilación después de 60 cultivos de generaciones con 250 nM MTX.

Figura 13 Representación esquemática de sitios CpG metilados con ADN promotor/potenciador hCMV- MIE del clon 44-28. Los sitios metilados se muestran en negro. La posición del nucleótido 425 está resaltada por una flecha. La metilación de todos los sitios CpG: 18 %; metilación en C425: 80 %; metilación en C591: 70%; metilación en C96: 60%.

Figura 14 Los números de copia de cadena ligera antes y después de la prueba de estabilidad sin MTX.

Figuras 15A-15B Las Figuras 15A y 15B son números de copia de cadena ligera y metilación hCMV- IE de anticuerpo que produce líneas celulares CHO.

Descripción Detallada de la Invención Las líneas celulares de mamíferos para la producción de proteína recombinante necesitan mantener la productividad más allá de los tiempos de cultivo ampliado. Los estudios de estabilidad a largo plazo son tiempo y recurso intensivo, pero son ampliamente desempeñados para identificar y eliminar los candidatos inestables durante el desarrollo de la línea celular. La inestabilidad de la producción de la fabricación de líneas celulares puede asociarse con metilación y silenciación del promotor heterólogo. Los dinucleótidos CpG dentro del potenciador/promotor anticipado inmediato mayor citomegalovirus (hCMV-MIE) se han identificado en la presente que son f ecuentemente metilados en anticuerpo inestable produciendo líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) . Un qPCR de tiempo real de metilación específica se ha establecido para permitir la medición sensible y rápida de la metilación hCMV-MIE en múltiples líneas celulares y proporcionar evidencia de que la metilación hCMV-MIE y los números de copia de transgen pueden usarse como marcadores anticipados para predecir la estabilidad de producción de líneas celulares CHO recombinantes . Estos marcadores deben proporcionar la oportunidad para enriquecer los productores estables anticipados en el desarrollo de líneas celulares.

De este modo, en la presente se describe un método para la selección de una célula así como también un método para la producción de un polipéptido. La célula seleccionada y también la célula usada para la producción de un polipéptido es una célula de producción a largo plazo. Tal célula puede seleccionarse como se describe en la presente con base en la metilación del promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica al polipéptido.

El término "casi" denota que el valor seguido de esta expresión es un valor centro con cierta variabilidad. En una modalidad la variabilidad es de ± 20 % del valor, en otra modalidad la variabilidad es de + 10 %, y en una modalidad adicional la variabilidad de ± 5 %. De este modo, el término casi constante denota que un valor está en una modalidad en el intervalo de desde 80 % a 120 %, en otra modalidad en el intervalo de desde 90 % a 110 %, y en una modalidad adicional en el intervalo de desde 95 % a 105 %.

El término "anticuerpo" denota una molécula que comprende al menos dos de los tan llamados polipéptidos de cadena ligera (cadena ligera) y dos de los llamados polipéptidos de cadena pesada (cadena pesada) . Cada uno de los polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada comprende un domino variable (región variable) (generalmente la porción general de amino de la cadena de polipéptido) que comprende las regiones de enlace que son capaces de interactuar con un antígeno. Cada uno de los polipéptidos de cadena ligera y pesada también comprende una región constante (generalmente la porción carboxi-terminal) . La región constante de la cadena pesada media el enlace del anticuerpo i) para las células que llevan un receptor gamma Fe (FcyR) , tal como células fagocíticas, o ii) para células que llevan el receptor neonatal Fe (FcRn) también conocido como receptor Brambell. También media el enlace para algunos factores incluyendo factores del sistema de complemento clásico tal como componente (Clq) .

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en diferentes clases: clase IgA, clase IgD, clase IgE, clase IgG, y clase IgM. Algunas de estas clases además se dividen en subclases (isotipos) , es decir IgG en IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4 , o IgA en IgAl e IgA2. De acuerdo a la clase a la que pertenece un anticuerpo las regiones constantes de cadena pesada son llamadas (IgA), d (IgD), e (IgE), ? (IgG), y µ (IgM) , respectivamente. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo de la clase IgG. En otra modalidad el anticuerpo tiene una región constante humana o una región constante derivada de origen humano. En una modalidad adicional el anticuerpo es de la subclase IgG4 o las subclases IgGl, IgG2 , o IgG3, que se modifica de manera que no pueda detectarse ningún receptor Fey (por ejemplo Fc^RIIIa) enlazando y/o no enlazando a Clq. En una modalidad el anticuerpo es de la subclase IgG4 humana o de la subclase IgGl humana mutada. En una modalidad el anticuerpo es de la subclase IgGl humana con mutaciones L234A y L235A. En otra modalidad el anticuerpo es en lo que respecta al enlace del receptor Fe/ receptor de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2, con una mutación en L234, L235, y/o D265, y/o que contiene la mutación PVA236. En una modalidad adicional el anticuerpo tiene una mutación seleccionada de S228P, L234A, L235A, L235E, SPLE (S228P y L235E) , y/o PVA236 (PVA236 se refiere a que la secuencia de aminoácidos ELLG (dada en una letra de código de aminoácidos) desde la posición de aminoácidos 233 a 236 de IgGl o EFLG de IgG4 es remplazada por PVA) . En una modalidad el anticuerpo es de la subclase IgG4 y tiene la mutación S228P de IgG4, o el anticuerpo es de la subclase IgGl y tiene las mutaciones L234A y L235A.

El dominio variable de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina en turno comprende diferentes segmentos, es decir cuatro regiones de marco de trabajo (FR, por sus siglas en inglés) y tres regiones hipervariables (CDR, por sus siglas en inglpes) .

El término "tratamiento de bisulfito" denota una reacción para la conversión de bases de citosina en ácido nucleico para bases de uracilo en a presencia de iones de bisulfito por las cuales las bases de 5-metil-citosina no se convierten de manera importante. Esta reacción para la detección de citosina metilada es descrita a detalle por Frommer et al. (Frommer, M . , et al, Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89 (1992) 1827-1831) and Grigg and Clark (Grigg, G.W. and Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-436; Grigg, G.W. , ADN Seq. 6 (1996) 189-198) . La reacción de bisulfito contiene una etapa de desaminación y una etapa de desulfonación que puede conducirse por separado o simultáneamente. La declaración de que las bases 5-metil-citosina no se convierten de manera importante sólo tomará en consideración el hecho de que no puede excluirse que un pequeño porcentaje de bases 5-metil-citosina se convierte a uracilo aunque se pretende convertir sólo y exclusivamente las bases citosina (no metiladas) .

El término "célula" denota una célula en la que un ácido nucleico por ejemplo codifica un, opcionalmente heterólogo, polipéptido, puede o es introducido/transfectado . El término "célula" incluye tanto células procariotas, que se usan para la propagación de plásmidos, como células eucarióticas, que se usan para la expresión de un ácido nucleico. En una modalidad la célula es una célula eucariótica y en una modalidad adicional la célula eucariótica es una célula de mamífero. En otra modalidad la célula de mamífero se selecciona del grupo de las células de mamífero que comprende células CHO (por ejemplo CHO Kl, CHO DG44) , células BHK, células NSO, células SP2/0, células HEK 293, células HEK 293 EBNA, células PER.C6®, y células COS. Como se usa en la presente, la expresión "célula" incluye la célula sujeto y su progenie. De este modo, el término "célula" denota la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de ahí sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas . Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica como se seleccionó para la célula transformada originalmente.

El término "sitio CpG" denota el dinucleótido CG dentro de un ácido nucleico que puede ser reconocido por las células metilantes de una célula y en donde la citosina puede convertirse a 5-metil-citosina. En una modalidad el sitio CpG está dentro de un ácido nucleico promotor.

El término "cásete de expresión" denota un constructo que contiene los elementos regulatorios necesarios, tales como el sitio de poliadelinación y el promotor, para la expresión de al menos el ácido nucleico contenido en una célula .

El término "plásmido de expresión" denota un ácido nucleico que proporciona todos los elementos requeridos para la expresión de los genes estructurales comprendidos de una célula. Generalmente, un plásmido de expresión comprende una unidad de propagación de plásmido procariótico, por ejemplo para E. coli, comprende un origen de replicación, y un marcador de selección, un marcador de selección eucariótico, y uno o más casetes de expresión para la expresión de los genes estructurales de interés cada uno comprende un ácido nucleico promotor, un gen estructural, un terminador de transcripción incluyendo una señal de poliadelinación. El gen de expresión usualmente se coloca bajo el control de un ácido nucleico promotor, y dicho gen estructural se dice está "operablemente ligado a" el ácido nucleico promotor. Similarmente , un elemento regulatorio y un ácido nucleico promotor de núcleo están operablemente ligados si el elemento regulatorio regula la actividad del ácido nucleico promotor de núcleo.

El término "tiempo de generación" denota el tiempo requerido por una célula para dividir y para producir una célula hija. De este modo, una célula que ha sido dividida una vez tiene una edad de una generación. El término "generación" denota el número de división celular de una célula.

El término "frecuencia alta" denota que en este sitio de metilación la citosina es metilada más frecuentemente que en otros sitios de metilación basado en el análisis de metilación del número importante estadístico de células individuales o clones de ADN, respectivamente. Este número importante estadístico está en una modalidad de al menos 10 células individuales o clones de ADN, respectivamente, en una modalidad adicional al menos 15 células individuales o clones de ADN, respectivamente, y en otra modalidad al menos 20 células individuales o clones de ADN, respectivamente. En una modalidad se analizan al máximo 400 células o clones de ADN, respectivamente .

El término "célula de producción a largo plazo" denota que una célula que produce un polipéptido, en una modalidad un polipéptido heterologo, por el cual la tasa de producción específica de la célula es casi constante por al menos 30 generaciones. En una modalidad la célula de producción a largo plazo tiene una tasa de producción específica que es casi constante para al menos 30 generaciones, en otra modalidad para al menos 45 generaciones y en una modalidad adicional para al menos 60 generaciones. En una modalidad la célula de producción a largo plazo tiene una tasa de producción específica que es casi constante para hasta 60 generaciones, en una modalidad adicional para hasta 75 generaciones y en otra modalidad para hasta 90 generaciones.

El término "metilación" denota un proceso dentro de una célula que se ha transfectado con un ácido nucleico que comprende un gen estructural codificando un polipéptido operablemente ligado a un promotor en el que una citosina del ácido nucleico promotor se convierte a 5-metil-citosina. Un ácido nucleico promotor en el que al menos una citosina se convierte a 5-metil-citosina se denota como ácido nucleico "metilado" .

El término "operablemente ligado" denota una yuxtaposición de dos o más componentes, en donde los componentes así descritos están en una relación permitiéndoles que funcionen en la manera pretendida. Por ejemplo, un promotor y/o potenciador están operablemente ligado a una secuencia de codificación, si actúa en cis para controlar o modular la transcripción de la secuencia ligada. Generalmente, pero no necesariamente, las secuencias de ADN que están "operablemente ligadas" son contiguas y, donde es necesario unir dos proteínas codificando regiones tales como un líder secretor y un polipéptido, contiguo y en marco (lectura) . Sin embargo, aunque un promotor operablemente ligado generalmente se localiza hacia arriba de la secuencia de codificación, no es necesariamente contiguo a él. Los potenciadores no tienen que ser contiguos . Un potenciador está operablemente ligado a una secuencia de codificación si el potenciador incrementa la transcripción de la secuencia de codificación. Los potenciadores operablemente ligados pueden estar localizados hacia arriba, dentro o hacia abajo de las secuencias de codificación a distancia considerable del promotor. Un sitio de poliadenilación está operablemente ligado a una secuencia de codificación si se localiza en el extremo hacia abajo de la secuencia de codificación de manera que la transcripción proceda a la secuencia de codificación en la secuencia de poliadenilación. Un codón de interrupción de traslación está operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico exónica si se localiza en el extremo dirección 3' (extremo 3') de la secuencia de codificación de manera que la traslación proceda a través de la secuencia de codificación para el codón de interrupción y se determine ahí. La ligación se logra por métodos recombinantes conocidos en la técnica, por ejemplo, usando metodología PCR y/o por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen sitios de restricción convenientes, entonces los adaptadores o ligadores de oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional.

El término "polipéptido" denota un polímero que consiste de aminoácidos unidos por enlaces péptido, ya sea producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos que cerca de 20 residuos de aminoácidos pueden referirse como "péptidos" , mientras que las moléculas que consisten de dos o más polipéptidos o comprenden un polipéptido de más que 100 residuos de aminoácidos pueden referirse como "proteínas" . Un polipéptido también puede comprender componentes no aminoácidos, tales como grupos carbohidrato, iones metálicos, o esteres de ácido carboxílico. Los componentes no aminoácidos pueden agregarse por la célula, en la que se expresa el polipéptido, y puede variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en la presente en términos de su estructura de columna vertebral de aminoácidos o el ácido nucleico codificando a la misma. Las adiciones como los grupos carbohidrato generalmente no se especifican, sin embargo pueden estar presentes .

El término "variante" de un ácido nucleico promotor denota que dentro del ácido nucleico promotor uno o más nucleótidos se cambian sin interferir con la función del ácido nucleico promotor. Tal cambio puede ser para remover o introducir un sitio de restricción.

El término "producir" denota la expresión de un gen estructural insertado en un cásete de expresión en una célula. El término incluye los procesos de transcripción y traslación de ácidos nucleicos. La producción se realiza en células procarióticas o eucarióticas apropiadas y el expresado, es decir el polipépetido producido, puede recubrirse de las células después de la lisis o del sobrenadante de cultivo.

El término "ácido nucleico promotor" denota una secuencia de polinucleótido que controla la transcripción de un gen estructural/gen o secuencia de ácido nucleico a la que está operablemente ligado. Un ácido nucleico promotor incluye señales para enlace polimerasa ARN y la iniciación de transcripción. El ácido nucleico promotor usado será funcional en la célula en la que se contempla la expresión del gen estructural seleccionado. Un número grande de ácidos nucleicos promotores incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles de una variedad de diferentes fuentes son bien conocidos en la técnica (e identificados en las bases de datos tal como GenBank) y están disponibles como o dentro de polinucleótidos clonados (de, por ejemplo, depositarios tal como ATCC así como también de otras fuentes individuales o comerciales) .

Un "ácido nucleico promotor" denota una secuencia de nucleótidos que dirige o promueve la transcripción de un gen estructural operablemente ligado. Generalmente, un ácido nucleico promotor se ubica en la región no traducida o no codificadora 51 de un gen, proximal al sitio de comienzo transcripcional del gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de ácidos nucleicos promotores que funcionan en la iniciación de la transcripción frecuentemente se caracterizan por las secuencias de nucleótidos consensas. Estos elementos incluyen sitios de enlace polimerasa ARN, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos de diferenciación específica (DSE, por sus siglas en inglés) , elementos de respuesta AMP cíclica (CRE, por sus siglas en inglés) , elementos de respuesta de suero (SER, por sus siglas en inglés) , elementos de respuesta glucorticoide (GRE, por sus siglas en inglés) , y sitios de enlace para otros factores de transcripción, tales como CRE/ATF, AP2, SP1, cAMP proteína de enlace de elementos de respuesta (CREB, por sus siglas en inglés) y otros factores octámeros . Si un ácido nucleico promotor es un ácido nucleico promotor inducible, entonces la tasa de transcripción incrementa en respuesta a un agente de inducción, tal como un CMV ácido nucleico promotor seguido por dos sitios operador tet, los ácidos nucleicos promotores de metalotioneina y choque térmico. La tasa de transcripción no es regulada por un agente de inducción si el ácido nucleico promotor si un ácido nucleico promotor es constitutivamente activo. Entre los ácidos nucleicos promotores eucarióticos que han sido identificados como ácidos nucleicos promotores fuertes para expresión están el ácido nucleico promotor anticipado SV40, el ácido nucleico promotor tardío mayor adenovirus, el ácido nucleico promotor metalotioneina-I de ratón, la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous, el factor de elongación de hámster Chino 1 alfa (CHEF-1, por sus siglas en inglés) , alfa EF-1 humano, ubiquitina, y ácido nucleico promotor anticipado inmediato citomegalovirus humano (CMV IE, por sus siglas en inglés) .

El término "marcador de selección" denota un ácido nucleico que permite que las células lo transporten para que sea específicamente seleccionado para o contra, en la presencia de un agente de selección correspondiente. Generalmente, un marcador de selección conferirá resistencia a un fármaco o compensado para un defecto metabólico o catabólico en la célula en la que se introduce. Un marcador de selección puede ser positivo, negativo, o bifuncional. Un marcador útil de selección positiva es un gen de resistencia antibiótica permitiendo la selección de células transformas con eso en la presencia del agente de selección correspondiente, por ejemplo el antibiótico. Una célula no transformada no es capaz de crecer o sobrevivir bajo las condiciones selectivas, es decir en la presencia del agente de selección. Los marcadores de selección negativa permiten a las células transportar el marcador para ser selectivamente eliminado. Los marcadores de selección usados células eucarióticas incluyen, por ejemplo, los genes estructurales que codifican fosfotransferasa aminoglicosoide (APH) , tal como por ejemplo higromicina (hyg) , neomicina (neo) , y marcadores de selección G418, reductasa dihidro folato (DHFR, por sus siglas en inglés) , cinasa timidina (tk, por sus siglas en inglés) , sintetasa glutamina (GS, por sus siglas en inglés) , sintetasa asparagina, sintetasa triptofan (agente de selección indol) , dehidrogenasa histidinol (agente de selección histidinol D) , y ácidos nucleicos que confieren resistencia a puromicina, bleomicina, pleomicina, cloramfenicol , Zeocina, y ácido micofenólico .

El término "tasa de producción a corto plazo" denota la cantidad de polipéptido producido por una célula sencilla dentro de un día como se determina de la cantidad de polipéptido producido dentro de un periodo de tiempo dado y la densidad de célula viable, en donde el periodo de tiempo es corto. En una modalidad el cultivo a corto plazo es para de 2 días a 20 días, en otra modalidad para de desde 4 a 15 días, y aún en otra modalidad adicional para de desde 10 a 14 días.

El término "tasa de producción específica" o "tasa de producción" denota la cantidad de polipéptido producido por una célula sencilla dentro de polipéptido dentro de un periodo de tiempo dado y la densidad de la célula viable. La tasa de producción específica (SPR, por sus siglas en inglés) puede calcularse usando la siguiente fórmula: SPR = Pa-Pi/ ( (D2-Di) /2*At) (Fórmula 2) con SPR [pg/célula/d] : tasa de producción específica, pi [ug/ml] : concentración de polipéptido en el comienzo del periodo de tiempo, P2 [pg/ml] : concentración de polipéptido al final del periodo de tiempo, Ü! [células/ml] : densidad de célula en el comienzo del periodo de tiempo, D2 [células/ml] : densidad de célula al final del periodo de tiempo, At [d] : duración del periodo de tiempo.

El término "gen estructural" denota la región de un gen sin una secuencia de señal, es decir la región de codificación .

Las células que producen polipéptido, es decir células transfectadas con un ácido nucleico que comprende un cásete de expresión que contiene un gen estructural que codifica un polipéptido heterólogo, pueden agruparse en diferentes clases : En una cebadora clase de células la tasa de producción específica es casi constante sobre generaciones múltiples mientras que en la segunda clase de células la tasa de producción específica disminuye, disminuye de manera especial monotónicamente, sobre generaciones múltiples. La productividad de desvanecimiento de polipéptido que produce células y líneas celulares, respectivamente, es causada por el incremento sólido de la metilación y con eso silenciando el ácido nucleico promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica el polipéptido o por pérdida de copias del gen estructural .

Se ha encontrado que la presencia de metilación detectable en el ácido nucleico promotor que está operablemente ligado al gen estructural que codifica a un polipéptido que proporciona describeción respecto a la productividad a largo plazo de la célula o línea celular, respectivamente .

Cada ácido nucleico promotor usado para la expresión de un gen estructural contiene sitios propensos a metilación por las enzimas de las células en las que se ha introducido si el ácido nucleico promotor no es blindado por elementos protectores. Un sitio responsable para la metilación es denominado sitio CpG y comprende/consiste del dinucleótido CG. Sin embargo no todos los sitios CpG son metilados con la misma frecuencia relativa, algunos de los sitios CpG son metilados más frecuentemente que otros. Se ha encontrado que ciertos sitios por ejemplo dentro del promotor CMV humano son metilados con frecuencia diferente y tiene diferente impacto sobre la silenciación de promotor.

El siguiente método puede usarse para identificar un sitio CpG en una secuencia de ácido nucleico. Éste comprende las etapas: 1) proporcionar una célula con una tasa de producción de un polipéptido que es después de un tiempo de cultivo 30 generaciones de la célula en la ausencia de un agente de selección de menos que 90 % de la tasa de producción de la célula después de la cebadora generación del cultivo, 2) aislar separadamente el ADN de la menos 10 células de un cultivo de la célula de 1) , 3) modificar la citosina del ADN aislado por tratamiento de bisulfito, 4) identificar un Sitio CpG dentro del ácido nucleico promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica al polipéptido con una frecuencia de metilación de al menos 0.2 basado en el ADN obtenido en la etapa 3) y de este modo identificando un sitio CpG.

En una modalidad la tasa de producción de la célula después del tiempo de cultivo de 30 generaciones es de 60 % o menos que la tasa de producción de la célula después de la cebadora generación del cultivo. En otra modalidad la frecuencia de metilación es al menos 0.4. En una modalidad adicional el ADN se aisla de al menos 20 células. También en una modalidad el ácido nucleico promotor tiene la secuencia de SEQ ID NO: 01 o comprende un fragmento de la misma o una variante de la misma.

En una modalidad el modificador de la citosina del ADN aislado por tratamiento de bisulfito comprende las siguientes etapas : 3 -a) incubar el ADN aislado en la presencia de iones de sulfito por el cual el ADN es desaminado, y 3-b) incubar el ADN desaminado bajo condiciones alcalinas por las que el ADN desaminado es desulfonizado .

Un método para obtener una célula que produce un polipéptido es un proceso que comprende al menos una etapa de transíectación y al menos una etapa de selección incluyendo el depósito de células sencillas de células exitosamente transfectadas ya sea directamente después de la transfección o después del crecimiento en la presencia de un agente de selección. En la etapa de selección las células se identifican basándose en su tasa de producción específica a corto plazo, es decir basándose en la concentración de polipéptido en el sobrenadante después de un cultivo a corto plazo. Entre las células seleccionadas algunas tiene una tasa de producción específica que es casi constante sobre generaciones múltiples y otras tiene tasa de producción específica que disminuye monótonamente sobre generaciones múltiples. De este modo, con criterios de selección generalmente aplicados no puede hacerse selección específica de una célula o células con una productividad estable a largo plazo.

De este modo, en la presente se describe un método para seleccionar una célula que produce un polipéptido que comprende las siguientes etapas: a) determinar para al menos una célula que comprende un ácido nucleico que comprende un gen estructural que codifica el polipéptido operablemente ligado · a un ácido nucleico promotor la metilación de un sitio CpG con frecuencia alta de metilación dentro del ácido nucleico promotor, y b) seleccionar una célula que produce un polipéptido en donde la metilación determinada en la etapa b) está debajo del valor umbral.

En el método como se describe en la presente puede analizarse cualquier célula obtenida por transfeccion con un plásmido de expresión que comprende un cásete de expresión que comprende un ácido nucleico promotor operablemente ligado a un gen estructural que codifica un polipéptido de interés a ser producido por la célula transfectada. El plásmido de expresión también generalmente comprende un marcador de selección. De este modo, en una modalidad las células se cultivan en la presencia de un agente de selección después de la etapa de transfeccion y previo a la etapa de selección. En otra modalidad el método comprende cultivar las células sin previa deposición de células sencillas o dilución limitada como la acumulación en la presencia de un agente de selección. En una modalidad adicional el método comprende cultivar las células después de la deposición de células sencillas o dilución límite.

En una modalidad la determinación comprende 1) aislamiento individual del ADN de cada una de las células proporcionadas, 2) realizar un PCR específico de metilación, 3) calcular con los resultados obtenidos en la etapa 2) la metilación de un sitio CpG con frecuencia alta de metilación dentro del ácido nucleico promotor.

En otra modalidad la etapa 2) es 2) realizar un PCR con un cebador específico de metilación y un cebador universal, o 2) digerir el ADN con una enzima de restricción y realizar un PCR con el ADN digerido y un cebador específico de metilación y un cebador universal.

Después del cultivo/selección de la agrupación tiene que realizarse una deposición de células sencillas. Si la deposición de células sencillas se realiza después de la etapa de cultivo de acumulación de cultivo además las células también se cultivan después de la deposición de células sencillas .

Con la finalidad de identificar las células o líneas celulares con una tasa de producción específica que es casi constante sobre generaciones múltiples la concentración de polipéptido en el sobrenadante y la densidad de célula viable tienen que determinarse en tiempos de cultivo definidos en un cultivo a largo plazo sobre generaciones múltiples . Un sitio CpG con una frecuencia alta de metilación puede identificarse por tratamiento de bisulfito de ADN hebrado sencillo, por ejemplo en pH 5, con éxito de desulfuración alcalina. En la presente pueden discriminarse sitios CpG metilados y no metilados. Bajo las condiciones de tratamiento específico la citosina pero no 5-metil-citosina se desanima en la posición 4 del N-heterociclo y se convierte a uracilo. Las hebras de ADN complementario se convierten en dos hebras, hebra A y hebra B, que ya no son complementarias. La determinación puede basarse sobre cualquiera de estas hebras .

Este cultivo a largo plazo tiene que realizarse sólo una vez para el ácido nucleico promotor o combinación del ácido nucleico promotor y línea celular. Si se usa una segunda vez el mismo ácido nucleico promotor o la combinación la selección puede basarse sobre los datos ya recolectados .

Puede aplicarse un número de técnicas para revelar diferencias de secuencias entre alelos metilados y no metilados después del tratamiento de bisulfito. En una modalidad la secuencia de interés (ya sea hebra A o hebra B) puede ejemplificarse por PCR bajo condiciones específicas de no metilación, es decir con cebador no sensible a los sitios metilados, y subsecuentemente analizado por métodos tal como el secuenciado de ADN (con o sin clonación) , el análisis de punto de fundición de alta resolución o el análisis de microarreglo . En otra modalidad puede realizarse un PCR cuantitativo (qPCR) con cebador específico de metilación o metilación sensible o probetas. En una modalidad alternativa el ADN metilado se precipita con anticuerpos específicos de 5-metil citosina seguido por una reacción de cadena polimerasa cuantitativa.

El PCR de metilación específica (MSP, popr sus siglas en inglés) también puede usarse para dirigir la secuencia del ADN tratado con bisulfito directamente sin previa amplificación de PCR de la región de interés. Los cebadores usados en MSP comprenderán uno o más sitios CpG. Estos pueden ser ya sea complementarios a 5-metil-citosina no convertida para la detección de ADN metilado o complementarios a uracilo convertido de citosina para la detección de ADN no metilado.

La metilación de los sitios CpG identificados es determinada por un número de células. En una modalidad el número de células es de al menos 10, en otra modalidad al menos 15, y en una modalidad adicional al menos 20. Más tarde se calcula la frecuencia de metilación para cada sitio CpG, es decir se calcula para cada sitio CpG el número de células metiladas en ese sitio CpG dividido por el número total de células analizadas. La determinación de la frecuencia de metilación se hace para una célula o para un número de células que muestra la disminución más alta en la tasa de producción específica durante el cultivo a largo plazo. En una modalidad un Sitio CpG con una frecuencia de metilación alta es un sitio que tiene una frecuencia de metilación de al menos 0.2, en otra modalidad de al menos 0.25, en una modalidad adicional de al menos 0.4, y aún en una modalidad adicional de al menos 0.5.

Después de la determinación de los sitios CpG con una frecuencia alta de metilación se lleva a cabo la metilación de los sitios CpG respectivos en un número de células que han mostrado la más baja o casi sin disminución en la tasa de producción específica durante el cultivo a largo plazo.

Un sitio CpG con una frecuencia alta de metilación idónea para el método como se describe en la presente es un sitio CpG que tiene una frecuencia de metilación alta determinada basada en un número de células que muestra una diminución en la tasa de producción específica durante el cultivo a largo plazo y que tiene una frecuencia de metilación determinada basada en un número de células que muestra la más baja o casi sin disminución en la tasa de producción específica durante el cultivo a largo plazo que está debajo del valor de un umbral predeterminado.

En una modalidad el valor del umbral predeterminado es cinco veces el valor promedio de la metilación aparente de una citosina en un sitio no CpG. El término "aparente" denota que aunque no hay metilación presente puede determinarse una frecuencia de metilación. De este modo, este valor corresponde al ruido de fondo. En otra modalidad el valor del umbral es tres veces el promedio. En una modalidad el valor del umbral es dos veces el valor promedio. Los mismos valores del umbral pueden usarse en la etapa de selección del método como se describe en la presente.

Otro aspecto como se describe en la presente es un método para la producción de un polipéptido que comprende las siguientes etapas: a) seleccionar una célula que produce un polipéptido de acuerdo al aspecto como se describe en la presente, b) cultivar la célula seleccionada, y c) recuperar el polipéptido del medio de cultivo y/o la célula y de este modo producir un polipéptido.

En una modalidad el método comprende una etapa adicional d) purificar el polipéptido recuperado.

En otra modalidad el método comprende previo a la etapa a) las siguientes etapas: a-3) proporcionar una célula, a-2) transfectar la célula proporcionada con un ácido nucleico que contiene un gen estructural que codifica al polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor, a-1) i) opcionalmente cultivar la célula transfectada en la presencia de una agente de selección, ii) depositar sólo las células transfectadas , y iii) cultivar sólo las células transfectadas depositadas en la presencia de un agente de selección.

En una modalidad la etapa a) comprende: i) proporcionar al menos una célula que comprende un ácido nucleico que comprende un gen estructural que codifica al polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor, ii) determinar la metilación de un sitio CpG con una frecuencia de metilación alta dentro del ácido nucleico promotor, y iii) seleccionar una célula que produce un polipéptido en donde la metilación determinada en la etapa b) está debajo del valor del umbral.

Se ha encontrado que incluso los niveles bajos de ácido nucleico promotor metilado, es decir arriba del valor del umbral predeterminado, en una célula o línea celular usada para la producción de un polipéptido puede usarse para predecir una disminución en la productividad durante el cultivo a largo plazo.

De este modo, un aspecto como se describe en la presente es un método para determinar la metilación de un ácido nucleico promotor operablemente ligado a un ácido nucleico que codifica a un, opcionalmente heterólogo, polipéptido y por lo tanto determinar la productividad a largo plazo de la célula. También un aspecto es un método para seleccionar una célula para producir un polipéptido determinando la metilación del ácido nucleico promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica al polipéptido.

A mayor detalle el método comprende en una modalidad las siguientes etapas: a) proporcionar una célula con productividad a largo plazo estable y una célula con productividad a largo plazo no estable, b) la identificación de los sitios CpG metilados clonando ácido nucleico promotor tratado con bisulfito de la línea celular con productividad a largo plazo no estable usando el ácido nucleico promotor de la línea celular con productividad a largo plazo estable como referencia, c) opcionalmente realizar un análisis de punto de fundición de alta resolución, d) proporcionar cebador PCR sensible a la metilación o probetas para el sitio CpG metilado identificado en la etapa b) , e) opcionalmente verificar el valor de predicción del sitio sitio CpG metilado identificado proporcionando líneas celulares adicionales con productividad a largo plazo estable y no estable.

En una modalidad la etapa e) se realiza con al menos 10 células diferentes o líneas celulares derivadas de la misma línea celular pariente y que comprenden el mismo cásete de expresión para expresar un polipéptido de interés operablemente ligado al mismo ácido nucleico promotor.

En una modalidad el ADN se digiere previo al tratamiento de bisulfito.

En una modalidad la célula es una célula eucariótica. En otra modalidad la célula es una célula de mamífero. En una modalidad adicional la célula se selecciona de la célula CHO, célula BHK, célula HEK, y célula Sp2/0. Aún en otra modalidad la célula es una célula CHO. En una modalidad adicional la célula es una célula CHO Kl .

En la Figura 1 se muestra el número del Sitio CpG metilado del mismo ácido nucleico promotor obtenido de células diferentes.

Los métodos como se describe en la presente se encuentran en la siguiente ej emplificación con el promotor anticipado inmediato de citomegalovirus humano (promotor CMV IE) que está disponible en suficientes cantidades en nuestros laboratorios en el tiempo en el que se hizo la invención. Estos datos se presentan para identificar los métodos como se describe en la presente y no como limitación. El enfoque de la invención se establece en las reivindicaciones .

El promotor CMV IE humano como secuencia de ácido nucleico como se ilustra en lo siguiente (se subrayan los sitios CpG) : ATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCA TATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCC GCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA ATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACG CCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGG ACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAGCATGGTGATGCGGTTTTGGCA GTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTC AATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCAT TGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCCGTTTAGTGAACG (SEQ ID NO: 01) .

En la SEQ ID NO: 01 están presentes treinta y tres sitios CpG, que son sitios potenciales para la metilación de ácidos nucleicos. Con el método como se subrayó arriba pueden identificarse los residuos de citosina dentro del promotor CMV humano que son predominantemente metilados .

La hebra A con todos los sitios CpG preservados tiene la secuencia de nucleótidos ATGTTGATATTGATTATTGATTAGTTATTAATAGTAATTAATTACGGGGTTATTAGTTTATAGTTTA TATATGGAGTTTCGCGTTATATAATTTACGGTAAATGGTTCGTTTGGTTGATCGTTTAACGATTTTC GTTTATTGAOGTTAATAATGACGTATGTTTTTATAGTAACGTTAATAGGGATTTTTTATTGACGTTA ATGGGTGGAGTATTTACGGTAAATTGTTTATTTGGTAGTATATTAAGTGTATTATATGTTAAGTACG TTTTTTATTGACGTTAATGACGGTAAATGGTTCGTTTGGTATTATGTTTAGTATATGATTTTATGGG ATTTTTTTATTTGGTAGTATATTTACGTATTAGTTATCGTTATTAGTATGGTGATGCGGTTTTGGTA _ _ _ GTATATTAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGATTTACGGGGATTTTTAAGTTTTTATTTTATTGACGTT AATGGGAGTTTGTTTTGGTATTAAAATTAACGGGATTTTTTAAAATGTCGTAATAATTTCGTTTTAT TGACGTAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAGTAGAGTTTCGTTTAGTGAACG (SEQ ID NO: 02) y la hebra A completamente desanimada tiene la secuencia de nucleótidos ATGTTGATATTGATTATTGATTAGTTATTAATAGTAATTAATTATGGGGTTATTAGTTTATAQTTTA TATATGGAGTTTTGTGTTATATAATTTATGGTAAATGGTTTGTTTGGTTGATTGTTTAATGATTTTT GTTTATTGATCTTAATAATGA GTATGTTTTTATAGTAATGTTAATAGGGATTTTTTATTGATGTTA ATGGGTGGAGTATTTATGGTAAATTGTTTATTTGGTAGTATATTAAGTGTATTATATGTTAAGTATG TTTTTTATTGATGTTAATGATGGTAAATGGTTTGTTTGGTATTATGTTTAGTATATGATTTTATGGG ATTTTTTTATTTGGTAGTATATTTATGTATTAGTTATTGTTATTAGTATGGTGATGTGGTTTTGGTA GTATATTAATGGGTGTGGATAGTGGTTTGATTTATGGGGATTTTTAAGTTTTTATTTTATTGATGTT AATGGGAGTTTGTTTTGGTATTAAAATTAATOGGATTTTTTAAAATGT GTAATAATTTTGTTTTAT TGATGTAAATGGGTGGTAGGTGTGTATGGTGGGAGGTTTATATAAGTAGAGTTTTGTTTAGTGAATG (SEQ ID NO: 03) . La hebra B con todos los sitios CpG preservados tiene la secuencia de nucleótidos CGTTTATTAAACGGAGTTTTGTTTATATAGATTTTTTATCGTATACGTTTATCGTTTATTTGCGTTA ATGGGGCGGAGTTGTTACGATATTTTGGAAAGTTTCGTTGATTTTGGTGTTAAAATAAATTTTTATT GACGTTAATGGGGTGGAGATTTGGAAATTTTCGTGAGTTAAATCGTTATTTACGTTTATTGATGTAT TGTTAAAATCGTATTATTATGTTAATAGCGATGATTAATACGTAGATGTATTGTTAAGTAGGAAAGT TTTATAAGGTTATGTATTGGGTATAATGTTAGGCGGGTTATTTATCGTTATTGACGTTAATAGGGGG CGTATTTGGTATATGATATATTTGATGTATTGTTAAGTGGGTAGTTTATCGTAAATATTTTATTTAT TGACGTTAATGGAAAGTTTTTATTGGCGTTATTATGGGAATATACGTTATTATTGACGTTAATGGGC GGGGGTCGTTGGGCGGTTAGTTAGGCGGGTTATTTATCGTAAGTTATGTAACGCGGAATTTTATATA TGGGTTATGAATTAATGATTTCGTAATTGATTATTATTAATAATTAGTTAATAATTAATGTTAATAT (SEQ ID NO: 04) y la hebra B en la forma completamente desanimada tiene la secuencia de nucleótidos TGTTTATTAAATGGAGTTTTGTTTATATAGATTTTTTATTGTATATGTTTATTGTTTATTTGTGTTA ATGGGGTGGAGTTGTTATGATATTTTGGAAAGTTTTGTTGATTTTGGTGTTAAAATAAATTTTTATT GATGTTAATGGGGTGGAGATTTGGAAATTTTTGTGAGTTAAATTGTTATTTATGTTTATTGATGTAT TGTTAAAATTGTATTATTATGTTAATAGTGATGATTAATATGTAGATGTATTGTTAAGTAGGAAAGT TTTATAAGGTTATGTATTGGGTATAATGTTAGGTGGGTTATTTATTGTTATTGATGTTAATAGGGGG TGTATTTGGTATATGATATATTTGATGTATTGTTAAGTGGGTAGTTTATTGTAAATATTTTATTTAT TGATGTTAATGGAAAGTTTTTATTGGTGTTATTATGGGAATATATGTTATTATTGATGTTAATGGGT GGGGGTTGTTGGGTGGTTAGTTAGGTGGGTTATTTATTGTAAGTTATGTAATGTGGAATTTTATATA TGGGTTATGAATTAATGATTTTGTAATTGATTATTATTAATAATTAGTTAATAATTAATGTTAATAT (SEQ ID NO: 05) .

En las Figuras 4A-4E se muestra la frecuencia de metilación en los sitios CpG individuales en diferentes líneas celulares. Los números se han determinado analizando de 19 a 22 clones diferentes obtenidos de diferentes líneas celulares parientes CHO después de la transfección con un plásmido que comprende un cásete de expresión para expresar un polipéptido. Este muestra los patrones de metilación de ADNs sencillos (inferior) y la frecuencia de metilación en sitios CpG sencillos (superior) para cada línea celular. La línea celular K18.1 es altamente metilada (Figura 4A) . La frecuencia de metilación no es igual en los diferentes sitios CpG pero parece tener centros en 3 grupos, es decir en el extremo 51 , el extremo 3 ' y en una posición alrededor de (o nucleótido, respectivamente,) 400. Catorce de 22 insertos secuenciados tuvieron una citosina en la posición 425. La metilación del ácido nucleico promotor en la línea celular 43-16 A10 se muestra en la Figura 4E. La distribución de metilación es similar a la distribución observada con la línea celular K18.1. Como con K18.1 la posición 425 se metilo más frecuentemente, cinco de 20 insertos secuenciados contuvieron una citosina en esta posición.

En otras tres líneas celulares analizadas la citosina se detecta esporádicamente, es decir como eventos sencillos, en diferentes sitios CpG (Figuras 4B, 4C y 4D) . Con el fin de obtener estadística importante para las líneas celulares con metilación total baja se requeriría de la secuencia de cientos de insertos. Adicionalmente los eventos sencillos también pueden representar eventos positivos falsos debido a la desanimación de citosina incompleta más que la metilación de promotor actual .

Para la determinación confiable de metilación específica de la posición CpG se ha desarrollado un método PCR de metilación específica. Para la metilación pueden usarse cebadores PCR de específicos como se muestra en la siguiente Tabla. Estos cebadores ya sea solos o en combinación también son aspectos como se describe en la presente.

Tabla A: Cebadores que pueden usarse en PCR específico de metilación.

En el curso de la evaluación del cebador se ha encontrado que los pares de metilación de cebador específico, que son altamente selectivos para ADN promotor CMV desaminado con una citosina en la posición 425, difieren en sus propiedades (ver Figura 6) . En una modalidad el cebador para para el PCR de metilación específica tiene la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 18.

De este modo, en una modalidad de los métodos como se describe en la presente el ácido nucleico promotor es el ácido nucleico CMV humano de SEQ ID NO: 01. En una modalidad el sitio CpG con alta frecuencia de metilación se selecciona de los sitios CpG en la posición (bp) 80, 96, 425, 437, 563 y 591 de SEQ ID NO: 01. En otra modalidad el sitio CpG con frecuencia alta de metilación se selecciona del sitio CpG en la posición (bp) 425 y en combinaciones del sitio CpG en la posición (bp) 425 con al menos uno de los sitios CpG en la posición (bp) 80, 96, 438, 563 y 591.

Tabla B: Resultados esperados para los pares de cebador específicos de metilación (MSP, por sus siglas en inglés) cebador y par de cebador universal qPCR.

El par de cebador universal debe amplificar las cuatro plantillas mientras el par de cebador MSP debe amplificar selectivamente la plantilla #62 (SEQ ID NO: 22) y la plantilla #01 (SEQ ID NO: 23) . El valor ACp debe ser tan pequeño como sea posible entre el par del cebador MSP y el par de cebador universal en la plantilla #62 y la plantilla #01. Por contraste, los valores Cp obtenidos con el par de cebador MSP en las plantillas #11 (SEQ ID NO: 21) y #04 (SEQ ID NO: 24) deben ser tan altos como sea posible, es decir ACp comparado a la amplificación con el par de cebador universal debe ser máximo.

El cebador específico de metilación debe ser capaz de detectar 5-metil citosina en la posición 425 selectivamente aunque dos posiciones de metilación adicionales estén en la posición 416 y 437.

La determinación de la metilación es posible con una frecuencia de metilación de desde 1 % a 100 %.

Los resultados comparables con respecto a la extensión de la metilación se observaron con un PCR específico de metilación y clonando y secuenciando, pero el PCR específico de metilación es mucho más sensible. Las líneas celulares con una productividad que disminuye en la producción a largo plazo tienen una metilación en la posición 425 con una frecuencia de metilación arriba de un valor del umbral. El valor del umbral es en una modalidad es dos veces el ruido de fondo del método determinado. Una línea celular con una productividad estable a largo plazo tiene una frecuencia de metilación en el sitio CpG que está debajo del valor del umbral .

Para el análisis de punto de fundición de alta resolución el ácido nucleico promotor se amplifica comenzando en la posición 334 hasta la posición 487, es decir 154 bp. Un análisis de punto de fundición de ejemplificación se muestra en la Figura 10A y su cebador derivado en la Figura 10B. Puede verse que con un análisis de punto de fundición de alta resolución un ácido nucleico promotor metilado (plantilla #16, SEQ ID NO: 25) puede distinguirse de un ácido nucleico promotor no metilado (plantilla #11) . El fragmento de ácido nucleico promotor metilado puede detectarse en una frecuencia relativa de 50 % o más. El fragmento de promotor no metilado puede detectarse en una frecuencia relativa de 10 % o más .

Estos datos muestran que la estabilidad de las líneas celulares CHO recombinantes que contienen genes exteriores conducidos por el potenciador/promotor anticipado inmediato CMV humano puede predecirse midiendo el estatus de metilación de la citosina en la posición 425.

De este modo, se ha encontrado que la determinación de metilación C425 puede usarse como marcador de predicción para determinar la expresión de polipéptido en clones de células generadas y por lo tanto permitir la selección de clones estables con productividad estable durante el desarrollo de la línea celular. Además se ha encontrado que la metilación C425 de 5 % o menos es un criterio idóneo para la selección de clones de célula estable. También se ha encontrado que la fracción de los clones de célula que son falsamente predichos como estables (clones de célula negativos falsos) puede reducirse cultivándolos por un tiempo en la ausencia de MTX antes de la prueba.

Teniendo establecido un método PCR sensible y exacto para cuantificar la metilación del nucleótido hCMV-MIE en el sitio CpG 425, se ha evaluado la metilación en líneas celulares CHO recombinantes K18.1, 43 16 A10 y G45-2. El ADN tratado con bisulfito que había sido analizando por secuencia se usó como plantilla en qPCR tiempo real metilación específica, ya sea directamente o después de la amplificación PCR de la región hCMV-MIE completa (Figuras 8A y 8B) . Las dos configuraciones de ensayo proporcionaron resultados comparables. Más importantemente, correlacionaron bien con los resultados de la secuencia de bisulfito. Esto demuestra que el ensayo qPCR de metilación específica sitio CpG 425 puede usarse para medir la metilación hCMV-MIE en el sitio CpG 425 en líneas celulares CHO recombinantes y puede usarse sin amplificación PCR previa del objetivo de ADN.

En principio, otros sitios CpG dentro del ADN promotor/potenciador de ADN anticipado inmediato CMV pudieron utilizarse para predecir la inestabilidad de producción. Sin embargo, la metilación en C425 se encontró es de aproximadamente 5 veces más alta que la metilación total en todos los sitios CpG. Además algunos sitios no se metilaron incluso en clones de célula altamente metilados, por ejemplo C280 y C289 (Figuras 4a-4E y 13) . El ensayo se vuelve más sensible seleccionando el correcto es decir el sitio CpG frecuentemente modificado para el análisis de metilación promotor. La metilación importante de los clones G25-17, G25-10 y 43-16 A10 que es cerca de 10% es probable que se pierda, si un sitio CpG se seleccionó aleatoriamente para análisis.

Puede usarse también la estabilidad de predicción dirigiendo el estatus de metilación de sitios CpG relevantes dentro de un ácido nucleico con otros ácidos nucleicos promotores heterogénicos .

Con el fin de evaluar una correlación potencial de la metilación de promotor anticipada y la inestabilidad de producción, la metilación 425 del sitio CpG 425 al comienzo del estudio de estabilidad se presentó contra a la alteración relativa de qP en la presencia o ausencia de MTX. Las presentaciones de correlación se muestran en las Figuras 11A (con MTX) y 11B (sin MTX) . Para la evaluación, las áreas de presentación se dividieron en cuatro compartimentos con límites en metilación al 5 % - igualando de dos a tres tantos de fondo de la medida de metilación, es decir el límite de detección- y 40 % de disminución en qP - representando el límite de aceptación de estabilidad de producción. Se determinó el número de clones en los compartimentos diferentes. El análisis de contingencias del estatus de metilación status usando una prueba de cuadro Pearson chi demostró una asociación importante con un valor p de 0.05 para el cultivo con MTX y una tendencia con un valor p de 0.13 para cultivo sin MTX. Resultó que la mayoría de los clones con menos que metilación al 5% en el Sitio CpG 425 se encontraron en la fracción de clones estables (menos que 40 % de disminución en qP con o sin MTX, mostrados en los compartimentos a la izquierda inferior) .

De este modo, resumiendo lo anterior, la pérdida de productividad durante la ampliación es un riesgo mayor en el desarrollo de líneas celulares de fabricación. Por lo tanto, existe una necesidad para marcadores moleculares de inestabilidad de producción que pueden ser fácilmente y rápidamente examinados. Se ha encontrado que puede emplearse la metilación de promotor para predecir una pérdida futura de productividad en líneas celulares CHO recombinantes . Con el fin de evaluar esto, se analizó la metilación de ADN de 33 sitios CpG dentro de una región 603 bp del potenciador/promotor hCMV-MIE ampliamente usado. El nivel total de metilación de la región investigada varió entre aproximadamente 1 % y 18 % de todos los sitios CpG. 1 % de metilación aparente representa los antecedentes técnicos que resultan de la desanimación incompleta de citosinas no metiladas (no se muestran los datos) . Además, dentro de los promotores metilados, el nivel de metilación varía en gran medida entre los sitios CpG individuales y se acumula en tres grupos con un máximo en el sitio CpG 425. La metilación en el sitio CpG 425 parecía ser de aproximadamente 5 veces más alto que el grado promedio de metilación de todos los otros sitios CpG. Por otro lado, algunos sitios CpG parecen ser completamente no metilados, incluso en líneas celulares altamente metiladas. La metilación total de hCMV-MIE, así como también la distribución de metilación entre los sitios CpG individuales, pueden variar considerablemente entre los tipos de célula y tejidos (ver por ejemplo Kong, Q. , et al, PLoS One 4 (2009) e6679, Krishnan, M . , et al, FASEB J. 20 (2006) 106-108, Menta, A.K., et al, Gene 428 (2009) 20-24 9).

Se ha encontrado que la metilación dominante del sitio CpG 425 se adapta como marcador para la metilación de hCMV-MIE. Se ha establecido un sitio CpG 425 qPCR específico de metilación como un método rápido y sensible con rendimiento de medio. Cuando se analiza un número grande de líneas celulares por el sitio CpG 425 qPCR específico de metilación, se ha encontrado que la mayoría de los productores inestables mostraron más que 5 % de metilación en el sitio CpG 425, incluso antes del cultivo a largo plazo, mientras que la mayoría de los productores estables mostraron menos que 5 % de metilación en este sitio.

La metilación anticipada del sitio CpG 425 se encontró exclusivamente con clones transportando más de diez copias de plásmido heterólogo. Los informes previos han proporcionado algo de evidencia de que las repeticiones en tándem de copias de transgenes múltiples son más susceptibles a la metilación y silenciación en células de mamífero (Garrick, D., et al, Nat. Genet. 18 (1998) 56-59, McBurney, M.W., et al, Exp Cell Res 274 (2002) 1-8) .

El número de copias de gen de cadena ligera y los niveles de metilacion, ambos antes de la prueba de estabilidad, se presentan el uno contra el otro en la Figura 15A. La metilacion anticipada, es decir metilacion antes de la prueba de estabilidad, se encontró exclusivamente en células que transportan más de diez copias de transgen (círculos negros en Fig. 15A) . Como una consecuencia, los clones de selección con números de copias de transgen bajo antes de la prueba de estabilidad igualmente enriquecen los clones con productividad estable. Dos clones con diez o menos de diez copias de transgen adquirieron metilacion durante el cultivo a largo plazo (círculos grises en Fig. 15A) de números de copia, de diez copias a tres copias y de dos copias a seis copias.

Los números de copias de transgen antes y después del cultivo a largo plazo sin MTX se comparan en la Figura 15. En la Figura 15A la metilación del sitio CpG 425 de clones sencillos en el comienzo de la prueba de estabilidad (mCpG 25_comienzo) se trazaron contra la copia de gen cadena ligera en el comienzo de la prueba de estabilidad (LC gen copias_comienzo) ; círculos blancos: los clones con metilación del sitio CpG 425 debajo de 5% en el comienzo así como también al final de la prueba de estabilidad a largo plazo; círculos grises: los clones se elevaron arriba de 5% en la metilacion del sitio CpG 425 durante la prueba de estabilidad a largo plazo; círculos negros: los clones con metilacion del sitio CpG 425 arriba de 5% en el comienzo y en el final de la prueba de estabilidad. Los clones se identificaron por números. En la Figura 15B se muestran los números de copia de gen de cadena ligera (copias de gen LC) de clones sencillos en el comienzo (S) de prueba de estabilidad y al final (E) del cultivo a largo plazo sin MTX. Barras blancas: los clones con metilación del sitio CpG 425 debajo de 5% en el comienzo así como también en el final de la prueba de estabilidad a largo plazo; barras grises: los clones se elevan arriba de 5% en la metilación del sitio CpG 425 durante la prueba de estabilidad a largo plazo; barras negras: los clones con metilación del sitio CpG 425 arriba de 5% en el comienzo y en el final de la prueba de estabilidad. Los datos representan los valores medios ± SEM (barras de error) de cuatro experimentos independientes .

Se ha mostrado en al presente que los productores estables pueden enriquecerse seleccionando clones con algunas copias de transgen.

En resumen, la metilación de hCMV-MIE en el sitio CpG 425 y los números de copias de transgen alto, es decir la presencia de más de 10 copias del gen estructural y el ácido nucleico promotor, pueden usarse como indicadores anticipados de inestabilidad de producción de líneas celulares CHO recombinantes . Estos indicadores proporcionan una oportunidad para enriquecer los productores estables anticipados en el desarrollo de línea celular.

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, el verdadero enfoque que se establece en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Ejemplo 1 Técnicas generales Técnicas de ADN recombinante Los métodos estándar se usaron para manipular el ADN como se describe en Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Determinación de la secuencia de ADN La secuencia del ADN se realizó en SequiServe GmbH (Vaterstetten, Alemania) .

Análisis de ADN y secuencia de proteína y administración de los datos de secuencia El paquete de software EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) y el software Vector NTI de Invitrogen versión 9.1 se usaron para la creación de la secuencia, mapeo, análisis, anotación e ilustración.

Determinación de la proteína Se usó un método cromatográfico para cuantificar la cantidad de anticuerpo presente en una muestra. Se usó una columna PorosA que enlaza a la región Fe del anticuerpo. El anticuerpo enlaza a la columna y es subsecuentemente eluido por condiciones de pH bajas. La concentración de proteína se determinó determinando la densidad óptica (OD) en 280 nm, con una longitud de onda de referencia de 320 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácido.

Ejemplo 2 Generación de líneas celulares CHO recombinantes Las líneas celulares recombinantes que expresan un anticuerpo humano de la clase IgG se generaron por transfeccion estable de células de crecimiento de suspensión CH0-K1 o CHO-DG44 con un vector codificando la cadena ligera y pesada de un anticuerpo que comprende una cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana y una cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina humana o gamma 4. El vector además comprendió un ácido nucleico codificando una reductasa folato dihidro murino (DHFR) (Figura 2) . Los casetes de expresión de cadena pesada y ligera ambos estuvieron bajo el control de un promotor y potenciador anticipado inmediato CMV humano (SEQ ID NO: 1) . La transfección de células se realizó ya sea por nucleofección (Lonza Cologne GmbH o Amaxa Biosystems) o por electroporacion usando Gene Pulser XCell (BIO-RAD) .

Por ejemplo, la suspensión CH0-K1 o CHO-DG44 se transfectaron con ADN plásmido linearizado, usando el dispositivo Nucleofector en combinación con el kit V Nucleofector (Lonza Cologne GmbH, Colonia, Alemania) o por electroporacion usando el Gene Pulser XCell (Bio-Rad, Hercules, CA) , de acuerdo a los protocolos del fabricante. Las células transfectadas se sembraron en placas de 96 o 384 pocilio que contienen medio libre de timidina con varias concentraciones de metotrexato (MTX) como agente de selección. Después de tres semanas, líneas celulares que expresan anticuerpo se identificaron midiendo los títulos de anticuerpo en el medio de cultivo por ELISA. Los productores superiores se expandieron a volúmenes más altos, subcloandos por dilución limitante y crioconservado .

Las células establemente transfectadas se seleccionaron en timidina y medio libre de proteína que contiene Metotrexato 20 nM a 1200 nM (MTX) como agente de selección. Las células o líneas celulares que expresan anticuerpo se identificaron midiendo las titulaciones de anticuerpo en el medio de cultivo y subclonados por dilución limitada y/o FACS deposición de células sencillas.

Las células se propagaron en matraces de 50 mi de movimiento de ventilación desechables bajo condiciones humidificadas estándar (95 % rH, 37 °C, y 5 % a 8% C02) en una tasa de agitación constante de 120 rpm/min a 150 rpm/min. Cada 3-4 días las células se dividieron en medio fresco. La densidad y viabilidad de los cultivos se determinaron usando el contador de células CASY TT o Cedex HiRes (Roche Innovates AG, Bielefeld, Alemania) .

Además, las técnicas estándar de cultivo de células se aplicaron como se describe por ejemplo en Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino, J.S. et al. (eds) , John Wiley & Sons, Inc., New York (2000).

Ejemplo 3 Cultivo a largo plazo y producción Cinco líneas celulares CHO obtenidas de acuerdo al Ejemplo 2 se investigaron por productividad a largo plazo: la línea celular K18.1 se deriva de una célula CHO-Kl y produce un anticuerpo de subclase humana IgGl; las líneas celulares G25-10, G25-17 y G42-5 son cada una derivadas de la célula CHO-Kl y producen un anticuerpo de subclase humana IgG4 ; la línea celular 43-16 A10 se deriva de una célula CHO-DG44 y produce un anticuerpo de subclase humana IgG4.

Las células se probaron para fenotípica, es decir producción, estabilidad para 35 a 70 generaciones en la ausencia de un agente de selección. Las células se cultivaron continuamente en matraces de movimiento de 125 mi ventilados que contienen 50 mi de medio sin MTX y diluidos dos veces a la semana con medio fresco. La densidad de siembra fue de 2 a 3 x 105 células/ml. Previo al paso se determinaron la densidad de célula viable y la viabilidad. La edad del cultivo en generaciones al final de cada paso se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación: a2 = ai + ln(D2/Dx) /ln2 (Fórmula 1) con a2 [no. de generaciones] : edad del cultivo al final del pasaj e , ai [no. de generaciones] : edad del cultivo al comienzo del pasaje es decir edad del cultivo al final del pasaje previo, Di [células/ml] : densidad de células viables al comienzo del pasaje, D2 [células/ml] : densidad de células viables al final del pasaje.

La concentración del anticuerpo en el sobrenadante (titulación de anticuerpo) se determinó por proteína A HPLC al final de cada pasaje. De estos datos, la tasa de producción específica (SPR) para cada paso se calculó usando la siguiente fórmula: SPR = P2-Pi/ ( (D2-Di) /2* At) (Fórmula 2) con SPR [pg/célula/d] : tasa de producción específica, Pi [pg/ml] : título de anticuerpo al comienzo del pasaje, P2 [ g/ml] : título de anticuerpo al final del pasaje, Di [células/ml] : densidad de células viables al comienzo del pasaje, D2 [células/ml] : densidad de células viables al final del pasaje, At [d] : duración del pasaje.

Los valores SPR se trazaron contra la edad del cultivo al final del pasaje respectivo en generaciones. Una línea de tendencia lineal se calculó sobre todos los puntos de datos SPR y la alteración relativa del SPR (en porcentaje) sobre el periodo probado se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación : ASPR = m* a/SPR0* 100 (Fórmula 3) con ASPR [%] : alteración porcentual de SPR, m [pg/célula/d/generación] : pendiente de línea de tendencia lineal, [no. de generaciones] : edad del cultivo, SPR0: eje "y" intercepta la línea de tendencia lineal. La línea celular G42-5 no mostró cambio de SPR sobre el periodo completo probado (cerca de 70 generaciones) . Todas las otras líneas celulares mostraron una disminución de la productividad ya después de 30 generaciones. La disminución estuvo en un intervalo de entre 29 I a 73 ¾. Para las línea celulares G25-17, G42-5 y 43-16 A10 el cultivo se detuvo después de 35 a 45 generaciones (Figuras 3A a 3E, Tablas 1 y 2) .

Tabla 1: Cambio en SPR durante el cultivo de cinco líneas celulares en la ausencia de MTX. n.d. = no determinada.

Tabla 2 : SPR restante durante el cultivo de cinco líneas celulares en la ausencia de MTX. 100 % = SPR en la primera generación. n.d. = no determinada Ejemplo 4 Identificación de sitios CpG metilados dentro de ADN promotor/potenciador anticipado inmediato CMV humano por tratamiento de bisulfito y secuencia de ADN El fragmento de promotor/potenciador anticipado inmediato CMV humano (SEQ ID NO: 01) usado para la expresión de genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo contiene 33 sitios CpG.

El ADN genómico se aisló de las líneas celulares CHO K18.1, G25-10, G25-17, G42-5 y 43-16 A10 usando el mini kit Allprep ADN/ARN de Qiagen (Hilden, Alemania) . Cinco microgramos de ADN se trozaron con la enzima Dra I y se cuantificaron midiendo la extinción en 260 nm. Cien nanogramos de ADN se sometieron a tratamiento de bisulfito y se purificaron usando el kit EpiTect Bisulfite (Qiagen, Hilden, Alemania) . El bisulfito que trató al ADN se recuperó en 20 µ? de ARNse libre de agua (Qiagen, Hilden, Alemania) .

Con la finalidad de amplificar una hebra A (delantero) de fragmento de promotor/potenciador anticipado inmediato CMV humano (SEQ ID NO: 02), 1 µ? bisulfito que trató ADN se combinó con 24 µ? mezcla maestra PCR y se sometió a PCR usando GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc., E.U.A. ) . 24 µ?? de mezcla maestra PCR comprende: 1 µ? cebador delantero 227 of SEQ ID NO: 06 (10 pmol/µ?) , 1 µ? cebador inverso 229 de SEQ ID NO: 08 (10 pmol/µ?) , 22 µ? Platinum® PCR SuperMix HighFidelty (Invitrogen Corp., E.U.A. ) .

El cebador delantero 227 es complementario al extremo 5' del fragmento de promotor/potenciadOr anticipado inmediato CMV humano. El cebador inverso 229 enlaza hacia abajo con el 51 -UTR de los genes de inmunoglobulina.

Las condiciones PCR fueron como sigue a continuación: temp. duración Etapa 1 Desanturalización 95 °C 10 min.

Etapa 2: PCR Desanturalización 94 °C 30 seg. # ciclos: 45 Alineados en sus pares base 50 °C 2 min.

Extensión 68 °C 2 min.

Etapa 3 Extensión final 72 °C 10 min.

Etapa 4 Remojo 4 °C indefinida El producto PCR se verificó para su tamaño y pureza por electroforesis de gel agarosa y se clonó en el vector pCR4 (Invitrogen Corp., E.U.A.) usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen Corp., E.U.A.) . Los clones de plásmido se aislaron y se analizaron por restricción de digestión y electroforesis de gel agarosa. Para cada línea celular, se secuenciaron de 19 a 22 plásmidos que contiene el inserto. Con la finalidad de estimar la eficiencia de desanimación del tratamiento de bisulfito en sitios no CpG, se determinó el número de citosina residual en sitios no CpG. La eficiencia de determinación porcentual se calculó como sigue: Em0d = 00- (Creg/Ctotal* 100) (Fórmula 4) con Emod-%] : eficiencia de desanimación, Cres: número de citosina residual en sitios no CpG en todos los insertos analizados, sitios de cebadores PCR excluidos , Ctotai : número de citosina en el fragmento promotor/potenciador CMV tratado sin bisulfito, sitios de cebador PCR excluidos, multiplicados por el número de insertos analizados, es decir 107 * 20.

Se encontró que la eficiencia de desanimación en no-CpG citosina fue más grande que 99 % en todas las muestras (Tabla 3) .

Tabla 3: Eficiencia de desanimación de citosina sin-CpG.

La protección de 5-metil citosina de desanimación se confirmó por tratamiento de bisulfito y clonación subsecuente y secuencia de ADN plásmido aislado de dcm+ E.coli. Los Dcm+ E.coli metilan los residuos de citosina interna dentro de las secuencias CCAGG o CCTGG (sitios dcm) . Se encontró que la eficiencia de determinación fue de 99 % en sitios no dcm y de menos que 5 % en la citosina interna dentro de los sitios dcm.

Con el fin de cuantificar la extensión de la metilación de ADN en sitios CpG dentro del fragmento promotor/potenciador CMV tratado con bisulfito, el numero de citosina encontrada en cada sitio CpG se determinó y se trazó para cada célula analizada.

La línea celular K18.1 está altamente metilada (Figura 3A) . La frecuencia de metilación se acumula en 3 grupos, una en el extremo 51 , uno en el extremo 31 y uno en una posición alrededor de 400. El grado más alto de metilación se encontró en la posición 425. Catorce de los veintidós insertos secuenciados tuvieron una citosina ahí.

La metilación del promotor CMV de la línea celular 43-16 A10 fue notable (Figura 3E) . La distribución de la metilación fue similar a la distribución observada con línea celular K18.1. La posición 425 se metilo más frecuentemente. Cinco de los veinte insertos secuenciados contuvieron una citosina en esta posición.

En las otras tres líneas celulares investigadas citosina se detectaron sólo esporádicamente en los sitios CpG (Figuras 3B, 3C y 3D) .

Ejemplo 5 PCR específico de metilación cuantitativa de ADN promotor/potenciador anticipado- inmediato CMV humano tratado con bisulfito En este ejemplo se describe de un qPCR en tiempo real específico por metilacion como método para detectar metilación en una posición CpG, para ser más precisos en la posición 425 del ácido nucleico promotor hCMV.

Se designaron dos conjuntos de cebadores: - un par de cebador específico de metilación (MSP par de cebador) selectivamente amplificando ADN promotor CMV desaminado con una citosina en la posición 425 representando ADN que se metila en la posición 425, y - un par de cebador universal amplificando ADN promotor CMV desaminado independientemente del estatus de Metilación.

El par de cebador universal se usó para normalización. Para usarse en la misma corrida de PCR ambos pares de cebador deben tener puntos de fundición similares.

La posición de los cebadores detectando metilación en la posición 425 se complicó por la presencia de dos sitios CpG adicionales en proximidad cercana (posición 416 y posición 437) . Los cebadores sensibles de metilación deben detectar 5mC425 independiente del estatus de metilación de la posición 416 y la posición 437.

Cuatro fragmentos de promotor/potenciador anticipado-inmediato CMV humano desaminados aislados en el Ejemplo 4 representa las posibles variaciones de frecuencia en las posiciones 425 y 437: #11, #62, #01 y #04 (Tabla 4, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22) han sido usados como plantillas qPCR plantillas para PCR específico de metilación y pares de cebador universal.

Tabla 4 : Resultados esperados para MSP y pares de cebador universal qPCR.

Con el cebador universal todas las cuatro plantillas pueden ser comparablemente amplificadas mientras el par de cebador específico de metilación puede selectivamente amplificar la plantilla #62 y la plantilla #01. ACp debe ser tan pequeño como sea posible entre el par de cebador específico de metilación y el par de cebador universal sobre la plantillas #62 y la plantilla #01. Los valores Cp obtenidos con el par de cebador específico de metilación sobre la plantilla #11 y la plantilla #04 deben ser tan altos como sea posible, es decir ACp comparado a la amplificación con el par de cebador universal debe ser máximo.

Para qPCR se empleó el sistema LightCycler® 480 II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y las muestras se prepararon usandoLightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . Cinco microlitros de solución de plantilla que contiene 0.05 ng ADN se combinó con 15 µ? mezcla maestra PCR en un pocilio de una placa multipocillos de 96 pocilios. 15 µ? mezcla maestra PCR comprendió: - 4.2 µ? de agua, -0.4 µ? de cebador delantero 239, 263 o 264 (también el cebador posible 227, 228, 240, 238) (10 pmol/µ?) -0.4 µ? cebador inverso 237, 254, 262, 265, 266, 267 o 268 (también el cebador posible 229) (10 pmol/µ?) , - 10 µ? SYBR Green I Master.

La placa multipocillo se selló con un sellado de lámina LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se centrifugó en 1,500 x g por 2 minutos. Después la placa se montó en el sistema LightCycler® 480 y se sometió a qPCR. Cada muestra se probó en duplicado, triplicado o cuadruplicado. Con el fin de permitir la determinación de números de copia absolutos, se generaron las curvas estándar para el transgen LC y el HC, usando el plásmido de expresión linearizada como estándar. Las diluciones estándar contuvieron 2.5 x 107, 2.5 x 106, 2.5 x 105, 2.5 x 104 o x 103 copias de plásmido. El ADN genómico se probó en duplicado; los estándares se corrieron en cuadruplicado.

Las condiciones PCR fueron como sigue a continuación: La recolección y análisis de datos se hizo con el software LightCycler® 480 versión 1.5. El grado aparente de metilación se calculó usando la siguiente fórmula, donde la eficiencia de amplificación ideal e asumió (E = 2) . mCapp = 2Cp(t)-Cp(m)* 100 (Fórmula 5) con Cgpp [%] : grado aparente de metilación, Cp(t) : valor Cp obtenido con valores universales, Cp (m) : valor Cp obtenido con cebadores específicos de metilación.

Durante la evaluación del cebador, se encontró que la designación del cebador específico de metilación, que son altamente selectivos para determinar el ADN promotor CMV con una citosina en la posición 425 ( "metilada" ) , tiene que realizarse con cuidado. El cebador 266 y 267 mostró la diferencia máxima entre Cp(#ll) y Cp(#62), es decir la selectividad más alta para ADN "metilado" . El cebador 265, 268 y 254 mostró selectividad menor. El par de cebador universal 263/237 se probó como control para ACp mínimo (Figura 6 y Tabla 5) .

Tabla 5: Resultados de evaluación de cebador.

En las Figuras 5A-5D se muestran los resultados obtenidos con el par de cebador específico de metilación 239/267 (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18) en combinación con el par de cebador universal 239/237 (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 09) . El par de cebador universal 239/237 amplificó todas las cuatro plantillas casi igualmente, mientras que el par de cebador específico de metilación 239/267 amplificó sus plantillas #62 y #01. Las plantillas #11 y #4 son sólo pobremente amplificadas por el par de cebador 239/267.

La frecuencia de metilación calculada de los valores Cp fue casi de 100 % para la plantilla #62 y la plantilla #01 y casi 0 % para la plantilla #11 y la plantilla #04 (Tabla 6A) . Esto muestra que el par de cebador específico de metilación 239/267 en combinación con el par de cebador universal 239/237 puede usarse para discriminar el ADN promotor CMV que es metilado en la posición 425 del ADN promotor CMV que no es metilado en la posición 425 por qPCR en tiempo real.

Los pares de específico de metilación y universal adicionales se encontraron y se caracterizaron en la Tabla 6A y 6B.

Tabla 6A: cebador inverso específico de metilación 267 y cebador inverso específico de no metilación 237 combinado con tres diferentes cebadores delanteros.

Tabla 6B: Cebador inverso específico de metilacion 266 y cebador específico de metilación no inverso 237 combinado con dos diferentes cebadores delanteros.

Para la cuantificación del grado de metilación sobre una plantilla de intervalo amplio #62 se mezcló en diferentes relaciones con plantilla #11. qPCR se realizó como se describe arriba usando pares de cebador 239/237 y 239/267 y la recuperación de la plantilla #62 en la plantilla #11 de fondo se calculó.

Para el cálculo de la fracción de la plantilla #62 ADN, se determinaron las eficiencias de amplificación de los pares de cebador bajo las condiciones usadas. Las diluciones de serie de las plantillas #62 y #11 de n=0.005 ng a 0.5 ng ADN se sometieron a qPCR y los valores Cp determinados se trazaron contra el registro (n) . Una línea de regresión lineal se calculó usando ajuste XL (Microsoft) . La eficiencia de amplificación se calculó usando la siguiente fórmula: E = l(T1/m (Fórmula 6) con E: eficiencia de amplificación, m: pendiente de la línea de pendiente lineal.

Las eficiencias de amplificación de ambos pares de cebador se calcularon son de aproximadamente de 1.7. La siguiente fórmula se empleó para calcular la fracción de la plantilla #62 ADN: mC = i.7Cp(t)-Cp(ra) * 100 (Fórmula 7) con mC [%] : fracción de ADN metilado en la posición 425, Cp(t) : valor Cp obtenido con el par de cebador universal , Cp (m) : valor Cp obtenido con el par de cebador específico de metilación.

Las fracciones determinadas de la plantilla #62 ADN de los dos experimentos independientes se trazaron contra los valores esperados (Figura 7) . Puede realizarse la cuantificación de la metilación entre 1 % y 100 %.

Ejemplo 6 Correlación de metilación promotor/potenciador anticipado-inmediato CMV humano con productividad a largo plazo a) qPCR específico de metilación con hebra A promotor/potenciador anticipado-inmediato CMV humano pre amplificado Como se describe en el Ejemplo 4 el ADN genómico se aisló de las líneas celulares CHO K18.1, G25-10, G25-17, G42-5 y 43-16 A10, troceado con la enzima Dral y desaminado por el tratamiento de bisulfito. La hebra A del promotor/potenciador anticipado-inmediato CMV humano se amplificó usando cebador 227 y 229.

El producto PCR se diluyó 1:50,000. Cinco microlitros de cada dilución se usaron para qPCR en tiempo real. El cebador 239 y 237 se emplearon para la cuantificación del ADN promotor CMV total; el cebador 239 y 267 se emplearon para la cuantificación de ADN promotor/potenciador CMV metilado en la posición 425. Las muestras se probaron en triplicados. Las plantillas #11, #62 y #01 se usaron como controles.

El qPCR se estableció como se informó en el Ejemplo 5 combinando 5 µ? de plantilla con 15 µ? de mezcla maestra PCR. Las condiciones PCR fueron como se informó en el Ejemplo 5.

La temperatura alineada en sus pares base del cebador fue 58 °C. b) qPCR específico de metilación con ADN genómico tratado con bisulfito El ADN genómico se extrajo de líneas celulares CHO K18.1, G25-10, G25-17, G42-5 y 43-16 A10, troceada con la enzima Dra I y desanimada por tratamiento de bisulfito. Dos microlitros desaminados de ADN diluidos en 3 µ? de agua se usaron como plantilla en qPCR en tiempo real aplicando el par de cebador 239/237 para a la amplificación de hebra promotor/potenciador CMV total y par de cebador 239/267 para la amplificación de hebra A promotor/potenciador CMV metilada en la posición 425. Las muestras se probaron en triplicados. Las plantillas #11 y #62 se usaron como controles.

El PCR se configuró y qPCR se realizó como se describe en el Ejemplo 5. La temperatura de alineación en los pares base del cebador fue de 58 °C.

Para a) y b) la fracción del promotor de ADN metilado en la posición 425 se calculó como sigue a continuación: mC = 1. 7c <t)_cp( ni j # 1 0 0 (Fórmula 7) con mC [%] : fracción de ADN metilado en la posición 425, Cp(t): valor Cp obtenido con el par de cebador universal 239/237, Cp(m): valor Cp obtenido con el par de cebador específico de metilación 239/267.

Ambas configuraciones de ensayo proporcionaron resultados comparables. La desviación estándar dentro de los triplicados fue más alta que la pre amplificación de la hebra A promotor CMV (Figuras 8A y 8B) . La metilación de la posición 425 del ácido nucleico promotor CMV en las líneas celulares K18.1, G25-10, G25-17 y 43-16 A10 fue más alta que el fondo de la desanimación incompleta, que se había encontrado era aproximadamente de 1 %. La metilación en la línea celular G42-5 estuvo debajo o máximo en el nivel de fondo. Para la línea celular K18.1 se determinó la metilación más alta (más que 60 %) .

El ensayo establecido a) se realizó con otros pares de cebador específico de metilación y universal. Para el cálculo de la fracción de ADN metilado en la posición 425, la eficiencia de amplificación para todos los pares de cebador se asumió es de 2 : mC = 2Cp(t)-Cp(m)* 100 (Fórmula 5*) con mC [%] : fracción de ADN metilado en la posición 425, Cp(t) : valor Cp obtenido con el par de cebador universal , Cp (m) : valor Cp obtenido con el par específico de metilación.

La Tabla 7 muestra un resumen de combinaciones de pares de cebador que han sido probadas sobre plantillas de ADN ya sea clonadas o ADN genómico con o sin pre amplificación de ADn promotor CMV Tabla 7: Combinaciones de pares de cebador.

Ejemplo 7 Metilación de promotor/potenciador anticipado-inmediato CMV y predicción de inestabilidad de producción e línea celular CHO recombinante Las células CHO-K1 se transfectaron con un plásmido que codifica para un anticuerpo IgG4 humano y se seleccionaron clones estables usando el sistema DHFR/MTX . Los clones parentales de producción alta se subclonaron por dilución limitada. MTX se mantuvo en el medio de crecimiento durante el proceso de generación de línea celular completa. Se seleccionaron 16 subclones de 10 clones parentales.

Las células seleccionadas se re cultivaron con 250 nM de MTX. Tan pronto como mostraron crecimiento estable, se probaron para su estabilidad de producción a largo plazo sobre 60 a 80 generaciones en la presencia y en la ausencia de MTX. Se calculó la alteración relativa de SPR sobre 60 generaciones. La metilación de C435 se determinó en el comienzo del estudio con células crecidas en MTX y al final del estudio de células que habían sido cultivadas sin MTX.

La metilación C425 al comienzo del estudio se trazó contra la alteración relativa del SPR en la presencia (Figura 11A) y en la ausencia de MTX (Figura 11B) . La mayoría de los clones con menos que 5 % de metilación en C425 pueden encontrarse en la fracción de clones estables (menos que 40 % de disminución de SPR con o sin MTX) , mientras que la mayoría de los clones con más que 5 % de metilación en C425 están agrupados en la fracción de clones inestables. Esto es independiente de si la metilación se correlacionó con la estabilidad en la presencia o en la ausencia de MTX (ver también tabla 8) . La mayoría de los clones estables, que pierden menos que 20 % de productividad con MTX y menos que 30 % de productividad sin MTX, exhiben menos que 5 % de metilación C425.

Tabla 8: Correlación de metilación con estabilidad en presencia o en la ausencia de MTX (A) y número de copia plásmido (B) .

Este descubrimiento muestra que la determinación de metilación C425 puede usarse como marcador de predicción para determinar la estabilidad de expresión de polipéptido en clones de célula generados y por lo tanto permitiendo la selección de clones estables con productividad estable durante el desarrollo de línea celular. Se ha encontrado que la metilación C425 de 5 % o menos es un criterio idóneo para la selección de clones de células estables .

Además se ha encontrado que dos clones de células intermediamente estables así como también dos clones muy inestables que fueron no metilados al comienzo del estudio se eleva arriba de 5 % en metilación durante la prueba de estabilidad sin MTX (ver también la Figura 12) . Esto muestra que las fracciones de clones de células que se predicen falsamente como estables (clones de células negativos falsos) pueden reducirse cultivándolos por algún tiempo en la ausencia de MTX antes de la prueba.

Con la finalidad de confirmar metilación C425 Metilación por medio de un segundo método, se realiza el procesado por secuencia de bisulfito con clon altamente metilado 44-28 (Figura 13) . El grado de metilación en C425 se encontró es de 80 %. Esto fue consistente con el resultado de PCR específico de metilación, considerando la variación de ambos ensayos. Como con los clones K18.1 y 43-16 A10 (Figuras 4A-4E) , C425 fue más frecuentemente entre todos los sitios CpG con el ADN promotor/potenciador anticipado- inmediato CMV. Otros eventos de metilación se agruparon en el 5' extremo y en el extremo 3'. El grado de porcentaje de metilación en todos los sitios fue de 18 %.

Ejemplo 8 Metilación anticipada que coincide con los números de copia de transgen Se determina las copias integradas de genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina en el comienzo y en el final de la prueba de estabilidad usando un ensayo qPCR multiplex basado en el principio TaqMan. Se usaron dos conjuntos de cebador que consisten de un cebador delantero, un cebador inverso y una sonda de hidrólisis: uno siendo específico para el gen de cadena kappa humana, el otro siendo específico para los genes de cadena pesada gamma humana. Se usó como estándar el plásmido de expresión linearizado para permitir la determinación de números de copia absolutos. Se aseguraron la eficiencia de amplificación igual de las muestras y el estándar.

Para qPCR, se empleó el sistema LightCycler® 480 II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y las muestras se prepararon usando the LightCycler® 480 Probes Master (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . 5 µ? de solución de plantilla que contienen 50 ng de ADN genómico se combinó con 15 µ? PCR mezcla en el pocilio de una placa de microtitulación de 96 pocilios. En el caso del estándar, la solución de la plantilla contuvo 2.5 x 107, 2.5 x 106, 2.5 x 105, 2.5 x 104 y 2.5 x 103 copias del ADN plásmido linearizado correspondiente. 15 µ? mezcla maestra PCR comprendió: 10 µ? LightCycler® 480 Probes Master 1 µ? cebador delantero #133 (10 pmol/µ?) 1 µ? cebador inverso # 132 (10 pmol/µ?) 0.5 µ? sonda #166 (10 pmol/µ?) 1 µ? cebador delantero #178 (10 pmol/µ?) 1 µ? cebador inverso # 180 (10 pmol/µ?) 0.5 µ? sonda #185 (10 pmol/µ?) La placa se selló con un sellado de lámina LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se centrifugó en 1,500 g por 2 minutos. Después de eso la placa se montó en el sistema LightCycler® 480 y se sometió a qPCR. Cada muestra se probó en triplicado, los estándares se corrieron en cuadruplicado.

Las condiciones PCR fueron como sigue a continuación: La recolección de análisis de los datos se realizó usando el software LightCycler® 480 versión 1.5. Básicamente, los valores Cp medios de las diluciones estándar de plásmido se trazaron contra los números de copia de gen respectivo para generar una curva estándar de la que el número de transgenes en la muestra se extrapolar!zó .

El número de transgenes por célula se calculó asumiendo que el contenido de ADN promedio por célula es jpg: Nc = Ns/50000*6 Nc: número de copias de transgen por célula Ns: número de copias de transgen en la muestra Tabla 9 Secuencias de cebador.

La Figura 14 representa los números de copia de gen de cadena ligera de células metiladas y no metiladas antes y después de la prueba de estabilidad. No se encontraron sorprendentemente, números de copia idénticos al gen de cadena pesada ya que las células habían sido transfectadas con un vector de gen doble transportando ambos genes (no se muestran los datos) . La metilación anticipada es decir la metilación antes de la prueba de estabilidad se encontró exclusivamente con las células que transportan más que 10 copias de transgen mientras que algunos clones con menos que 10 copias de transgen adquirieron metilación durante la prueba de estabilidad. Como una consecuencia, los clones de selección con números de copia de transgen bajos antes de la prueba de estabilidad igualmente enriquecen los clones con productividad estable (Tabla 10) .

Tabla 10: Correlación de copias de transgen con estabilidad en la presencia o en la ausencia de MTX.

Además observamos, que la inestabilidad de producción no se asoció generalmente con una pérdida de copias de transgen. Los clones 1A5-05, 1A5-21, 1A5-24 y 2B1-02 perdieron las copias de transgen, 2B-13 fue estable y 14-13 así como también 14-23 incrementaron en copias de gen (ver también la Figura 11B) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para seleccionar un clon de célula caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) identificar un sitio CpG en un ácido nucleico promotor con un método que comprende las siguientes etapas: 1) aislar por separado el ADN de al menos 10 células de un cultivo de una célula que tiene una tasa de producción de un polipéptido que está después de un tiempo de cultivo de 30 generaciones de la célula en la ausencia de un agente de selección de menos que 90 % de la tasa de producción de la célula después de la primera generación del cultivo, 2) modificar la citosina del ADN aislado por tratamiento de bisulfito, 3) identificar un sitio CpG dentro del ácido nucleico promotor operablemente ligado al gen estructural que codifica al polipéptido con una frecuencia de metilación de al menos 0.2 basado en el ADN obtenido en la etapa 2) y de este modo identificando un sitio CpG, b) determinar la frecuencia de metilación del sitio CpG identificado en la etapa a) para un clon de célula, que comprende un ácido nucleico que comprende un gen estructural que codifica a un polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor que es el mismo como el de la etapa a) , basado en al menos 10 copias del ácido nucleico o 10 células obtenidas de un cultivo del mismo, c) seleccionar un clon de célula en el que la frecuencia de metilación como se determina en la etapa b) está debajo de dos veces el valor promedio obtenido determinando la metilación de una citosina en un sitio no CpG, o seleccionar un clon de célula en el que la frecuencia de metilación como se determina en la etapa c) está debajo del 5 %.

2. Un método para seleccionar un clon de célula caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) determinar para cada uno de al menos un clon de célula, que comprende un ácido nucleico que comprende un gen estructural que codifica un polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor que tiene la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 01, la frecuencia de metilación de un sitio CpG en una posición seleccionada de las posiciones 80, 96, 425, 437, 563 y 591 de SEQ ID NO: 01 basado en al metilación determinada para al menos 10 copias del ácido nucleico o en al menos 10 células obtenidas de un cultivo de cada clon de célula, b) seleccionar un clon de célula en el que la frecuencia de metilación es como se determina está debajo de 5 %.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porgue la determinación comprende las siguientes etapas: 1) aislar el ADN de cada uno de los clones de célula, 2) realizar para cada ADN aislado individualmente una reacción de cadena de polimerasa específica de metilación, 3) determinar con los resultados obtenidos en al etapa c-2) la frecuencia de metilación del sitio CpG.

4. EL método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la etapa 2) es 2) realizar para cada ADN aislado individualmente una reacción de cadena de polimerasa con un cebador especifico de metilación y un cebador universal.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado porque la etapa 2) es 2) digerir el ADN individualmente aislado con una enzima de restricción y realizando una reacción de cadena de polimerasa para cada uno de los ADN digeridos con un cebador específico de metilación y un cebador universal.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico promotor tiene la secuencia de SEQ ID NO: 01 o comprende un fragmento de la misma o una variante de la misma y el sitio CpG se selecciona de la posición 80, 96, 425, 437, 563 y 591 de SEQ ID NO: 01 o una posición correspondiente a la misma en un fragmento o variante de la misma.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque el cebador es independientemente uno del otro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 06 a SEQ ID NO: 20.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque un cebador se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 11, 14 y 15, el cebador universal tiene la secuencia de SEQ ID NO: 09 y un cebador específico de metilación se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, 18 y 19.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque el cebador universal tiene la secuencia de SEQ ID NO: 09 y 11 y el cebador específico de metilación tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y 18.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el clon de célula es un clon de célula CHO.

11. Un método para la producción de un polipéptido caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) seleccionar un clon de célula con un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, b) cultivar el clon de célula seleccionada, y c) recuperar el polipéptido del medio de cultivo y/o el clon de célula y de este modo producir un polipéptido.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende previo a la etapa a) las siguientes etapas: a-3) proporcionar una célula de mamífero no humana a-2) transfectar la célula proporcionada con un ácido nucleico que contiene un gen estructural que codifica al polipéptido operablemente ligado a un ácido nucleico promotor, a-1) i) opcionalmente cultivar el clon de célula transfectada en la presencia de un agente de selección, ii) depositar sólo de las células transfectadas, y iii) cultivar sólo las células transfectadas depositadas en la presencia de un agente de selección.

13. Un kit, caracterizado porque comprende a) un reactivo para la modificación de citosina no metilada en un sitio CpG, y b) un cebador seleccionado de SEQ ID NO: 13, 16, 17, 18, 19 y 20.