CN102859001B - 用于选择长期生产性细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于确定与编码多肽的核酸有效连接的启动子核酸的甲基化和由此确定细胞的长期生产力的方法。再一方面是通过确定与编码多肽的结构基因有效连接的启动子核酸的甲基化而用于选择生产多肽的细胞的方法。

Description

用于选择长期生产性细胞的方法
技术领域
本申请报道的方法属于细胞选择和多肽表达领域。更具体地，本文报道了用于选择长期表达或分泌多肽的细胞的方法，所述方法基于检测与编码该多肽的结构基因有效连接的启动子的核酸的甲基化。
发明背景
胞嘧啶碱基在碳5处的酶促甲基化导致5-甲基胞嘧啶，其是在原核生物和真核生物中发现的DNA甲基化。在真核细胞中，DNA甲基化被熟知为导致基因沉默的基本外遗传机制。甲基化特定地在常出现于启动子区域内的CpG二核苷酸上发生。在启动子以外，CpG位点稀少。甲基化的启动子是沉默的，即转录不活跃的，由此基因是不表达的。甲基化的DNA募集甲基DNA结合蛋白，形成可以修饰和浓缩染色质的HDACs等其它因子的平台。
通过启动子甲基化的基因沉默已不仅针对自体基因而且针对重组基因构建体被报道(Escher,G.,等,J.Lipid Res.46(2005)356-365;Brooks,A.R.,等,J.Gen.Med.6(2004)395-404)。以亚硫酸氢盐处理DNA是适于区分甲基化和非甲基化CpG位点的方法。在所使用的条件下，胞嘧啶而非5-甲基胞嘧啶在C4处脱氨基并由此转变为尿嘧啶。由此，互补的DNA链转变为两条链，即A和B，它们不再是互补的。
Barnes,L.M.,等(Biotechnol.Bioeng.96(2006)337-348)报道，LC/HCmRNA水平是NS0细胞的长期稳定性的标记。Chusainow,J.,等(Biotechnol.Bioeng.102(2009)1182-1196)；Jiang,Z.,等(Biotechnol.Prog.22(2006)313-318)报道，MTX处理的细胞具有较高的LC/HC mRNA水平。Lee,C.J.,等(Biotechnol.Bioeng.102(2008)1107-1118)报道了基于HCmRNA水平来筛选细胞。
Escher等(见上)报道了在瞬时感染的巨噬细胞中CMV启动子的沉默。使用腺病毒的CMV启动子的体内沉默被Brooks等(见上)报道。
Dickson,J.,等(PLoS Genetics 6(2001)e1000804)报道了VEZF1元件可以介导对DNA甲基化的阻止。Mielke,C.,等(Gene 254(2000)1-8)报道了从三顺反子mRNA稳定地、长期表达异二聚体蛋白。Everett,R.S.,等(J.Virol.325(2004)96-105)报道了，通过使用持久性腺病毒载体，证实了鼠肝脏中CMV增强子活性的株系特异性关闭率。Proesch,S.,等(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 377(1996)195-201)报道了在体外由DNA CPG甲基化导致的非常强HCMV立即早期启动子的失活。Kristensen,L.S.和Hansen,L.L.(Clin.Chem.55(2009)1471-1483)报道了在癌症诊断、预后和治疗反应中用于检测单基因座DNA甲基化生物标记的基于PCR的方法。Recillas-Targa,F.,等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)6883-6888)报道了由鸡β珠蛋白绝缘子介导的位置效应保护和增强子阻断是可分开的活性。
发明概要
现已发现，在用于生产多肽的细胞或细胞系中，确定与编码该多肽的结构基因有效连接的启动子核酸中特定CpG位点的甲基化程度，可以用来预测在长期培养期间生产力的降低。
本文一方面报道了用于选择细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)以包括以下步骤的方法鉴定启动子核酸中的CpG位点：
1)从细胞的培养物的至少10个细胞中分别分离DNA，其中所述细胞在缺乏选择试剂时培养30代时间后，其多肽生产速率小于该细胞在第1代培养后的生产速率的90%，
2)通过亚硫酸氢盐处理，修饰所分离DNA的胞嘧啶，
3)基于在步骤2)中获得的DNA，鉴定与编码多肽的结构基因有效连接的启动子核酸内甲基化频率为至少0.2的CpG位点，从而鉴定出CpG位点，
b)提供至少一个细胞，所述细胞包含核酸，其中所述核酸含有与步骤a)相同的启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因，
c)针对步骤b)的至少一个细胞的每一个，基于获自其培养物的至少10个拷贝的该启动子核酸或10个细胞，确定步骤a)中鉴定的CpG位点的甲基化频率，
d)选择在步骤c)中确定的甲基化频率低于通过测定非CpG位点的胞嘧啶甲基化而得到的平均值的2倍的细胞，或
选择在步骤c)中确定的甲基化频率低于5%的细胞。
本文所报道的另一个方面是用于选择细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)针对包含核酸的至少一个细胞的每一个，其中所述核酸含有与具有SEQ ID NO:01的核酸序列的启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因，基于从每个细胞的培养物获得的至少10个拷贝的该启动子核酸或者至少10个细胞所确定的甲基化，确定在选自SEQ ID NO:01的第80、96、425、437、563和591位的位置的CpG位点的甲基化频率，
b)选择所确定的甲基化频率低于5%的细胞。
在一个实施方案中，所述确定包括以下步骤：
1)从每个细胞中分离DNA，
2)对每个分离的DNA分别进行甲基化特异性聚合酶链式反应，
3)根据在步骤2)中得到的结果，确定CpG位点的甲基化频率。
在另一个实施方案中，步骤2)是以下步骤：
2)以甲基化特异性引物和通用引物，对每个分离的DNA分别进行聚合酶链式反应。
在另一个实施方案中，步骤2)是以下步骤：
2)分离的DNA分别以限制性酶消化，并以甲基化特异性引物和通用引物，对每个消化的DNA进行聚合酶链式反应。
在一个实施方案中，启动子核酸具有SEQ ID NO:01的序列或包含其片段或其变体，CpG位点选自SEQ ID NO:01的第80、96、425、437、563和591位、或SEQ ID NO:01的片段或变体中对应的位置。在另一个实施方案中，引物相互独立地选自SEQ ID NO:06至20。在另一个实施方案中，引物选自SEQ ID NO:11、14和15；通用引物具有SEQ ID NO:09的序列，甲基化特异性引物选自SEQ ID NO:17、18和19。在另一个实施方案中，通用引物具有SEQ ID NO:09和11的序列，甲基化特异性引物具有SEQ ID NO:11和18的序列。
本文报道的再一个方面是用于生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)以本文所报道的方法选择细胞，
b)培养所选择的细胞，和
c)从培养基和/或细胞中回收多肽，从而生产多肽。
在一个实施方案中，方法在步骤a)之前包括以下步骤：
a-3)提供细胞，
a-2)以包含与启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因的核酸转染所提供的细胞，
a-1)i)任选地，在存在选择试剂时培养和繁殖所转染的细胞，ii)对这些细胞进行单存放(single depositing)，和iii)在存在选择试剂时培养该单存放的转染细胞。
本文报道的另一个方面是试剂盒，其包含：
a)用于修饰CpG位点中的非甲基化胞嘧啶的试剂，和
b)选自SEQ ID NO:13、16、17、18、19和20的引物。
在本文所报道的这些方面的一个实施方案中，细胞是细胞克隆。
发明详述
用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞系需要在长期的培养时间中维持生产力。长期稳定性研究虽然耗费时间和资源，但仍被广泛地开展以鉴定和消除在细胞系开发期间的不稳定候选因素。制造的细胞系的生产不稳定性可能与异源启动子的甲基化和沉默有关。本文鉴定了人巨细胞病毒主要立即早期启动子/增强子(hCMV-MIE)中的如下CpG二核苷酸，所述CpG二核苷酸在不稳定的生产抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中频繁地被甲基化。建立了甲基化特异性实时qPCR，从而允许在多个细胞系中快速灵敏地测定hCMV-MIE甲基化，并提供可以将hCMV-MIE甲基化和转基因拷贝数用作预测重组CHO细胞系的生产稳定性的早期标记的证据。这些标记将提供在细胞系开发早期富集稳定生产细胞的机会。
因此，本文报道了用于选择细胞的方法以及用于生产多肽的方法。所选择的细胞和用于生产多肽的细胞是长期生产性细胞。可以如本文中所报道的，基于与编码多肽的结构基因有效连接的启动子的甲基化来选择这样的细胞。
术语“近乎”表示该表述后的数值是具有一定变化性的中心值。在一个实施方案中，变化性是数值的±20%，在另一个实施方案中，变化性是±10%，在另一个实施方案中，变化性是±5%。因此，表述“近乎”常数是指，在一个实施方案中，数值在80%至120%范围内，在另一个实施方案中，在90%至110%范围内，在另一个实施方案中，在95%至105%范围内。
术语“抗体”表示包含至少两个所谓轻链多肽(轻链)和两个所谓重链多肽(重链)的分子。每个重链和轻链多肽包含可变结构域(可变区)(其通常在多肽链的氨基端部分)，所述可变区包含能够与抗原相互作用的结合区。每个重链和轻链多肽也包含恒定区(其通常在多肽链的羧基端部分)。重链的恒定区介导抗体结合到i)携带Fcγ受体(FcγR)的细胞，例如吞噬细胞，或ii)携带新生儿Fc受体(FcRn)(也被称为Brambell受体)的细胞。它也介导与一些因子的结合，所述因子包括经典补体系统的因子，例如组分C1q。
根据重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分为不同类别：IgA类、IgD类、IgE类、IgG类和IgM类。这些类别中的一些被进一步分为亚类(同种型)，即IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分为IgA1和IgA2。根据抗体所属类别，重链恒定区分别被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。在一个实施方案中，抗体是IgG类的抗体。在另一个实施方案中，抗体具有人恒定区或来自人源的恒定区。在另一个实施方案中，抗体是IgG4亚类或IgG1、IgG2或IgG3亚类的抗体，所述抗体经过改造而检测不到与Fcγ受体(例如FcγRIIIa)的结合和/或与C1q的结合。在一个实施方案中，抗体是人IgG4亚类或突变的人IgG1亚类的抗体。在一个实施方案中，抗体是具有L234A和L235A突变的人IgG1亚类的抗体。在另一个实施方案中，抗体是就IgG4亚类或IgG1或IgG2亚类的Fcγ受体结合，具有在L234、L235和/或D265上的突变，和/或包含PVA236突变。在另一个实施方案中，抗体具有选自S228P、L234A、L235A、L235E、SPLE(S228P和L235E)和/或PVA236(PVA236表示来自IgG1的第233至236位氨基酸的氨基酸序列ELLG(按单字母氨基酸代码给出)或IgG4的EFLG被PVA取代)的突变。在一个实施方案中，抗体是IgG4亚类的抗体，其具有IgG4的S228P突变，或抗体是IgG1亚类的抗体，其具有L234A和L235A突变。
免疫球蛋白的轻链或重链的可变区依次包含不同的片段，即4个构架区(FR)和3个超变区(CDR)。
术语“亚硫酸氢盐处理”是指，在存在亚硫酸氢根离子时，将核酸中的胞嘧啶碱基转换为尿嘧啶碱基而5-甲基胞嘧啶碱基不显著被转换的反应。Frommer等(Frommer,M.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)1827-1831)和Grigg与Clark(Grigg,G.W.和Clark,S.,Bioessays 16(1994)431-436;Grigg,G.W.,DNA Seq.6(1996)189-198)详细描述了用于检测甲基化胞嘧啶的该反应。亚硫酸氢盐反应包括脱氨基步骤和脱磺酸基步骤，所述步骤可以分开或同时进行。关于5-甲基胞嘧啶碱基不显著被转换的表述，应该仅考虑这样的情况：尽管旨在唯一且排他地转化(非甲基化的)胞嘧啶碱基，但不能排除小比例的5-甲基胞嘧啶碱基被转换为尿嘧啶。
术语“细胞”表示核酸(例如编码多肽，可选地异源多肽)可以被或已经被引入/转化到其中的细胞。术语“细胞”包括原核细胞（其可以用于繁殖质粒），也包括真核细胞（其用于表达核酸）。在一个实施方案中，细胞是真核细胞，在另一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞选自包括CHO细胞(例如CHO K1、CHODG44)、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞、细胞、和COS细胞的哺乳动物细胞组。如本文中使用的，表达“细胞”包括受试细胞及其后代。因此，术语“细胞”表示最初的受试细胞和从其来源的培养物而不管传代的次数。还应理解的是，由于有意或无意的突变，所有的后代在所包含的DNA上可以是不完全相同的。本发明包括这样的变体后代，其具有在最初转化的细胞上所筛选的相同的功能或生物学活性。
术语“CpG位点”表示核酸中能够被细胞的甲基化酶识别的二核苷酸CG，其中胞嘧啶能够被转化为5-甲基胞嘧啶。在一个实施方案中，CpG位点在启动子核酸中。
术语“表达盒”表示，包含对于在细胞中表达至少该所含核酸所必需的调控元件，例如启动子和多聚腺苷酸化位点，的构建体。
术语“表达质粒”指核酸，该核酸提供为了在细胞中表达所包含的结构基因(一个或多个)所必需的所有元件。典型地，表达质粒包含原核质粒繁殖单元(例如对大肠杆菌而言，包含复制原点)和选择标记、真核选择标记以及一个或多个用于表达目的结构基因（一个或多个）的表达盒，每个表达盒包含启动子核酸、结构基因、和包含多聚腺苷酸化信号的转录终止子。基因表达通常处于启动子核酸的控制下，这样的结构基因被称作“有效连接”启动子核酸。类似地，如果调控元件可以调节核心启动子核酸的活性，则该调控元件和核心启动子核酸是有效连接的。
术语“世代时间”表示细胞所需要以分裂和产生子代细胞的时间。因此，已分裂一次的细胞具有一世代的年龄。术语“代”表示细胞的细胞分裂次数。
术语“高频率”表示，基于对统计学意义的数量的单细胞或DNA克隆进行的甲基化分析，胞嘧啶在所述甲基化位点比在其它甲基化位点更经常地被甲基化。所述统计学意义的数量，在一个实施方案中是至少10个单细胞或DNA克隆，在另一个实施方案中是至少15个单细胞或DNA克隆，在另一个实施方案中是至少20个单细胞或DNA克隆。在一个实施方案中，分析最多400个细胞或DNA克隆。
术语“长期生产性细胞”表示生产多肽(在一个实施方案中是异源多肽)的细胞，其中该细胞的比生产速率在至少30代是几乎恒定的。在一个实施方案中，长期生产性细胞具有的比生产速率在至少30代是几乎恒定的，在另一个实施方案中在至少45代是几乎恒定的，在另一个实施方案中，在至少60代是几乎恒定的。在一个实施方案中，长期生产性细胞具有的比生产速率在多达60代是几乎恒定的，在另一个实施方案中，在多达75代是几乎恒定的恒定，在另一个实施方案中，在多达90代是几乎恒定的。
术语“甲基化”表示细胞中的过程，所述细胞已转染了包含与启动子有效连接的编码多肽的结构基因的核酸，在该过程中该启动子核酸的胞嘧啶被转化为5-甲基胞嘧啶。其中至少一个胞嘧啶被转化为5-甲基胞嘧啶的启动子核酸被称为“甲基化的”核酸。
术语“有效连接”表示两个或更多个组件并置，其中所述组件处于允许它们以其预期的方式起作用的关系中。例如，如果启动子和/或增强子以顺式方式起作用以控制或调节所连接的编码序列的转录，则该启动子和/或增强子被有效连接到编码序列。通常但非必需地，“有效连接的”DNA序列是相邻的，并在需要连接两个蛋白质编码区域例如分泌引导序列和多肽时，是相邻的和在阅读框内的。然而，尽管有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它不必与其相邻。增强子不必是相邻的。如果增强子增加编码序列的转录，则增强子被有效连接到编码序列。有效连接的增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游，和位于距启动子相当长的距离。如果多聚腺苷酸化位点位于编码序列末端的下游以致转录前进通过编码序列而进入多聚腺苷酸化序列，则多聚腺苷酸化位点被有效连接到编码序列。如果翻译终止密码子位于编码序列末端(3’末端)的下游以致翻译前进通过编码序列到达终止密码子并在那里终止，则翻译终止密码子被有效连接到外显子核酸序列。连接可以通过本领域已知的重组方法来进行，例如使用PCR方法和/或通过在合适的限制性位点进行的连接。如果不存在合适的限制性位点，则可以根据常规实践，使用合成的寡核苷酸接头或衔接子。
术语“多肽”表示由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论其是天然产生的或是合成的。少于约20个氨基酸残基的多肽可以被称为“肽”，而由两个或更多个多肽组成的或包含多于100个氨基酸残基的一个多肽的分子可以被称为“蛋白质”。多肽也可以包含非氨基酸组分，所述组分例如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以通过表达多肽的细胞添加，并可以随细胞的类型而变化。在本文中，多肽按其氨基酸骨架结构或编码其的核酸进行定义。添加例如碳水化合物基团通常不是规定的，但是可以存在。
术语启动子核酸的“变体”表示在启动子核酸内，一个或多个核苷酸被改变而不干扰启动子核酸的功能。这样的改变可以用于消除或引入限制性位点。
术语“生产”表示在细胞中表达插入到表达盒中的结构基因。该术语包括核酸转录和翻译过程。生产在合适的原核或真核细胞中进行，可以从裂解后的细胞中或从培养物上清中回收所表达的(即生产的)多肽。
术语“启动子核酸”表示控制与其有效连接的基因/结构基因或核酸序列转录的多核苷酸序列。启动子核酸包括用于RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所使用的启动子核酸将在考虑于其中表达所选择的结构基因的细胞中发挥功能。大量的启动子核酸，包括来自多种不同来源的组成型、诱导型和阻遏型启动子在本领域公知(并在例如GenBank等数据库中标识)，其可以作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸中获得（从例如ATCC等保藏机构以及其它商业或个人来源获得）。
“启动子核酸”表示指导或促进有效连接的结构基因转录的核苷酸序列。典型地，启动子核酸位于基因的5'非编码或非翻译区，接近结构基因的转录起始位点。启动子核酸中起转录起始作用的序列元件通常具有共有核苷酸序列的特点。这些元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSEs)、环AMP响应元件(CREs)、血清应答元件(SREs)、糖皮质激素应答元件(GREs)以及其它转录因子例如CRE/ATF、AP2、SP1、cAMP响应元件结合蛋白(CREB)和八聚体因子的结合位点。如果启动子核酸是诱导型启动子核酸，则转录速率将响应于诱导试剂而增加，例如其后接着两个tet操纵子位点的CMV启动子核酸、金属硫蛋白和热激启动子核酸。如果启动子核酸是组成型活性的启动子核酸，则转录的速率不受诱导试剂的调节。已经被鉴定为用于表达的强启动子核酸的真核启动子核酸有：SV40早期启动子核酸、腺病毒主要晚期启动子核酸、小鼠金属硫蛋白-I启动子核酸、劳氏肉瘤病毒长末端重复、中国仓鼠延长因子1α(CHEF-1)、人EF-1α、泛素以及人巨细胞病毒立即早期启动子核酸(CMV IE)。
术语“选择标记”表示，在存在相应的选择试剂时允许特异地选择或淘汰携带其的细胞的核酸。典型地，选择标记赋予对药物的抗性或补偿引入它的细胞中的新陈代谢或分解代谢的缺陷。选择标记可以是正向、负向或双功能的。有用的正向选择标记是抗生素抗性基因，其允许在存在相应的选择试剂例如抗生素时，选择转化了该抗性基因的细胞。在选择条件下，即存在选择试剂时，非转化的细胞不能生长或存活。负向选择标记允许选择性消除携带该标记的细胞。用于真核细胞的选择标记包括例如编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH)的结构基因，例如潮霉素(hyg)、新霉素(neo)和G418选择标记，二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(选择试剂为吲哚)、组氨醇脱氢酶(选择试剂为组氨醇D)，以及赋予对嘌呤霉素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸抗性的核酸。
术语“短期生产速率”表示一天内由单个细胞生产的多肽的量，根据在给定时期内所生产的多肽的量和活细胞密度来确定，其中该时期是短的。在一个实施方案中，短期培养是从2至20天，在另一个实施方案中是从4至15天，在另一个实施方案中是从10至14天。
术语“比生产速率”或“生产速率”表示一天内由单个细胞生产的多肽的量，根据在给定时期内所生产的多肽的量和活细胞密度来确定。可以使用以下公式来计算比生产速率(SPR)：
SPR=P2-P1/((D2-D1)/2*△t)    (公式2)
其中：
SPR[pg/细胞/d]:比生产速率，
P1[μg/ml]:在该时期开始时的多肽浓度，
P2[μg/ml]:在该时期结束时的多肽浓度，
D1[细胞/ml]:在该时期开始时的细胞密度，
D2[细胞/ml]:在该时期结束时的细胞密度，
△t [d]:该时期的持续时间。
术语“结构基因”表示无信号序列的基因区域，即编码区域。
可以将生产多肽的细胞(即转化了包含表达盒的核酸的细胞，所述表达盒包含编码异源多肽的结构基因)分为不同类别：在第一类细胞中，比生产速率在多代内是几乎恒定的，然而在第二类细胞中，比生产速率在多代内是递减的，特别是单调递减的。生产多肽的细胞或细胞系的递减的生产力由与编码多肽的结构基因有效连接的启动子核酸的稳定增加的甲基化和随之而来的沉默、或由结构基因拷贝的丢失引起。
现已发现，与编码多肽的结构基因有效连接的启动子核酸中可检测的甲基化的存在，可以提供关于细胞或细胞系的长期生产力的信息。
如果启动子核酸没有被保护性元件防护，每个用于表达结构基因的启动子核酸都包含易于被其所引入的细胞的酶甲基化的位点。易于甲基化的位点称为CpG位点，包含二核苷酸CG或由其组成。但不是所有的CpG位点都以相同的相对频率被甲基化——一些CpG位点比其它位点更经常被甲基化。现已发现，某些位点，例如在人CMV启动子中，以不同的频率被甲基化，从而对启动子沉默具有不同的影响。
以下方法可被用于鉴定核酸序列中的CpG位点。其包括以下步骤：
1)提供细胞，其中在缺乏选择试剂时，所述细胞在30代培养时间后的多肽生产速率小于在第1代培养后该细胞的生产速率的90%，
2)从1)的细胞的培养物的至少10个细胞中分别分离DNA，
3)通过亚硫酸氢盐处理，修饰所分离DNA的胞嘧啶，
4)基于在步骤3)中获得的DNA，鉴定与编码多肽的结构基因有效连接的启动子核酸内甲基化频率至少为0.2的CpG位点，从而鉴定出CpG位点。
在一个实施方案中，细胞在30代的培养时间后的生产速率是在第一代培养后该细胞的生产速率的60%或更低。在另一个实施方案中，甲基化频率是至少0.4。在另一个实施方案中，从至少20个细胞中分离DNA。在一个实施方案中，启动子核酸具有SEQ ID NO:01的序列或包含其片段或其变体。
在一个实施方案中，通过亚硫酸氢盐处理对分离的DNA的胞嘧啶进行的修饰包含以下步骤：
3-a)在存在亚硫酸根离子下孵育分离的DNA，借此使DNA脱氨基，和
3-b)在碱性条件下孵育脱氨基的DNA，借此使脱氨基的DNA脱磺酸基。
用于获得生产多肽的细胞的方法是包含至少一个转染步骤和至少一个选择步骤的方法，所述选择步骤包括在转染后直接进行或在存在选择试剂下生长后进行成功转染的细胞的单细胞存放(single cell depositing)。在选择步骤中，基于细胞的短期的比生产速率，即基于在短期培养后上清液中多肽浓度来鉴定细胞。在所选择的细胞中，一些具有在多代内几乎恒定的比生产速率，其它则具有在多代内单调递减的比生产速率。因此，采用通常应用的选择标准，不能实现对具有稳定的长期生产力的细胞(一个或多个)进行特异性选择。
因此，本文报道了用于选择生产多肽的细胞的方法，其包括以下步骤：
a)针对至少一个含有如下核酸的细胞，其中所述核酸包含与启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因，确定在该启动子核酸中具有高甲基化频率的CpG位点的甲基化，和
b)选择生产多肽的细胞，其中在步骤a)中确定的甲基化低于阈值。
在如本文报道的该方法中，可以分析通过以表达质粒转染得到的任何细胞，其中所述表达质粒包含表达盒，所述表达盒包含与编码待通过转染的细胞生产的目的多肽的结构基因有效连接的启动子核酸。表达质粒通常还包含选择标记。因此，在一个实施方案中，于转染步骤后和选择步骤前，在存在选择试剂下培养细胞。在另一个实施方案中，方法包含:不进行之前的单细胞存放或有限稀释，以混合库(pool)的形式，在存在选择试剂下培养细胞。在另一个实施方案中，方法包括在单细胞存放或有限稀释之后培养细胞。
在一个实施方案中，确定包括：
1)从每个所提供的细胞中分别分离DNA，
2)进行甲基化特异性PCR，
3)根据在步骤2)中得到的结果，计算在启动子核酸中具有高甲基化频率的CpG位点的甲基化。
在另一个实施方案中，步骤2)是：
1)以甲基化特异性引物和通用引物进行PCR，或
2)以限制性酶消化DNA，并以经消化的DNA和甲基化特异性引物与通用引物进行PCR。
在混合库培养/选择后，必须进行单细胞存放。如果在混合库培养步骤后进行单细胞存放，则在单细胞存放后再培养细胞。
为了鉴定在多代内具有几乎稳定的比生产速率的细胞或细胞系，需要在经过多代的长期培养中在规定的培养时间确定上清液中多肽浓度和活细胞密度。可以通过，例如在pH 5，以亚硫酸氢盐处理单链DNA和随后的碱脱磺化，鉴定具有高甲基化频率的CpG位点。在本文中，可以区分甲基化和非甲基化的CpG位点。在该特定处理条件下，胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶在N-杂环的第4位上被脱氨基和转化为尿嘧啶。互补的DNA链被转化为2条链，即A链和B链，它们不再互补。确定可以基于这两链中的任何链。
对于启动子核酸或启动子核酸和细胞系的组合，需进行仅一次该长期培养。如果第二次使用相同的启动子核酸或组合，则可以基于已经收集的数据进行选择。
许多技术可用于揭示在经亚硫酸氢盐处理后甲基化和非甲基化等位基因之间的序列差异。在一个实施方案中，可以通过在非甲基化特异性条件下，即以对甲基化位点不敏感的引物进行PCR，扩增目的序列(A链或B链)，随后通过例如DNA测序(进行或不进行克隆)、高分辨率熔点分析或微阵列分析等方法来进行分析。在另一个实施方案中，可以以甲基化敏感或甲基化特异性引物或探针进行定量PCR(qPCR)。在可选实施方案中，以5-甲基胞嘧啶特异性抗体沉淀甲基化DNA，随后进行定量聚合酶链式反应。
也可以使用甲基化特异性PCR(MSP)来直接确定经亚硫酸氢盐处理的DNA的序列，而不进行此前对目的区域的PCR扩增。用于MSP的引物将包含一个或多个CpG位点。它们与未转化的5-甲基胞嘧啶互补以检测甲基化的DNA，或与从胞嘧啶转化来的尿嘧啶互补以检测非甲基化的DNA。
确定多个细胞的所鉴定的CpG位点的甲基化。在一个实施方案中，细胞的数量是至少10个，在另一个实施方案中是至少15个，在另一个实施方案中是至少20个。然后，计算每个CpG位点的甲基化频率，即对于每个CpG位点，计算该CpG位点被甲基化的细胞的数量除以所分析的细胞的总数。针对在长期培养期间在比生产速率上表现出最大程度降低的细胞或多个细胞，确定甲基化频率。在一个实施方案中，具有高甲基化频率的CpG位点是具有至少0.2的甲基化频率的CpG位点，在另一个实施方案中为至少0.25，在另一个实施方案中为至少0.4，在另一个实施方案中为至少0.5。
在确定具有高甲基化频率的CpG位点后，在已经显示出在长期培养期间比生产速率发生最低或几乎没有降低的多个细胞中，确定相应CpG位点的甲基化。
适用于本文中所报道方法的具有高甲基化频率的CpG位点是这样的CpG位点，其具有基于在长期培养期间比生产速率显示出降低的多个细胞而确定的高甲基化频率，和具有基于在长期培养期间比生产速率显示最低降低或几乎没有降低的多个细胞而确定的、低于预定阈值的甲基化频率。
在一个实施方案中，预定阈值是非CpG位点胞嘧啶的表观甲基化的平均值的5倍。术语“表观”表示尽管不存在甲基化，但是可以确定甲基化的频率。因此，该值相应于背景噪音。在另一个实施方案中，阈值是平均值的3倍。在另一个实施方案中，阈值是平均值的2倍。在如本文所报道的方法的选择步骤中可以使用相同的阈值。
本文所报道的另一个方面是用于生产多肽的方法，其包括以下步骤：
a)根据本文所报道的方面，选择生产多肽的细胞，
b)培养所选择的细胞，和
c)从培养基和/或细胞中回收多肽，由此生产多肽。
在一个实施方案中还包括进一步步骤：
d)纯化所回收的多肽。
在另一个实施方案中，方法在步骤a)之前包括以下步骤：
a-3)提供细胞，
a-2)以包含与启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因的核酸转染所提供的细胞，
a-1)i)任选地，在存在选择试剂下培养转染的细胞，ii)对所转染的细胞进行单细胞存放，和iii)在存在选择试剂下培养该单存放的转染细胞。
在一个实施方案中，步骤a)包括：
i)提供至少一个包含核酸的细胞，所述核酸包含与启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因，
ii)确定启动子核酸中具有高甲基化频率的CpG位点的甲基化，和
iii)选择生产多肽的细胞，其中在步骤b)中确定的甲基化低于阈值。
现已发现，在用于生产多肽的细胞或细胞系中，即使低水平甲基化的启动子核酸(即高于预定的阈值)也可以用来预测长期培养期间生产力的降低。
因此，本文所报道的一个方面是用于确定与编码多肽（“可选异源”）的核酸有效连接的启动子核酸的甲基化和由此确定细胞的长期生产力的方法。另一个方面是用于通过确定与编码多肽的结构基因有效连接的启动子核酸的甲基化来选择生产多肽的细胞的方法。
更详细地，在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)提供具有稳定的长期生产力的细胞和具有不稳定的长期生产力的细胞，
b)通过克隆来自具有不稳定的长期生产力的细胞系的经亚硫酸氢盐处理的启动子核酸，使用来自具有稳定长期生产力的细胞系的启动子核酸作为参考，鉴定甲基化CpG位点，
c)可选地进行高分辨率熔点分析，
d)提供针对在步骤b)中鉴定的甲基化CpG位点的甲基化敏感性PCR引物或探针，
e)可选地，通过提供另外的具有稳定和不稳定的长期生产力的细胞系，验证所鉴定的甲基化CpG位点的预计值。
在一个实施方案中，使用至少10个不同的细胞或细胞系进行步骤e)，所述细胞或细胞系来自相同的亲本细胞系并包含相同的表达盒，所述表达盒用于表达与相同的启动子核酸有效连接的目的多肽。
在一个实施方案中，DNA在亚硫酸氢盐处理之前被消化。
在一个实施方案中，细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，细胞选自CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞和Sp2/0细胞。在另一个实施方案中，细胞是CHO细胞。在另一个实施方案中，细胞是CHO K1细胞。
图1显示了获自不同细胞的相同启动子核酸的甲基化CpG位点的数目。
以下以人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV IE启动子)对本文所报道的方法进行举例说明，所述启动子在本发明进行时，在我们的实验室可以获得充足的量。呈现该数据以对本文所报道的方法进行举例说明而非作为限定。本发明的范围在权利要求中陈述。
人CMV IE启动子具有如下所述核酸序列(CpG位点以加下划线表示)：
ATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCC GCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAGCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCCGTTTAGTGAACG(SEQ ID NO：01).
在SEQ ID NO:01中存在33个CpG位点，这些CpG位点是核酸甲基化的潜在位点。以上述方法，可以鉴定人CMV启动子中被主要地甲基化的胞嘧啶残基。
保存了所有CpG位点的A链具有核苷酸序列
ATGTTGATATTGATTATTGATTAGTTATTAATAGTAATTAATTACGGGGTTATTAGTTTATAGTTTATATATGGAGTTTCGCGTTATATAATTTACGGTAAATGGTTCGTTTGGTTGATCGTTTAACGATTTTC GTTTATTGACGTTAATAATGACGTATGTTTTTATAGTAACGTTAATAGGGATTTTTTATTGACGTTAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAATTGTTTATTTGGTAGTATATTAAGTGTATTATATGTTAAGTACGTTTTTTATTGACGTTAATGACGGTAAATGGTTCGTTTGGTATTATGTTTAGTATATGATTTTATGGGATTTTTTTATTTGGTAGTATATTTACGTATTAGTTATCGTTATTAGTATGGTGATGCGGTTTTGGTAGTATATTAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGATTTACGGGGATTTTTAAGTTTTTATTTTATTGACGTTAATGGGAGTTTGTTTTGGTATTAAAATTAACGGGATTTTTTAAAATGTCGTAATAATTTCGTTTTATTGACGTAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAGTAGAGTTTCGTTTAGTGAACG(SEQ ID NO:02)，完全脱氨基的A链具有核苷酸序列
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(SEQ ID NO:03)。所有CpG位点均保存的B链具有核苷酸序列
CGTTTATTAAACGGAGTTTTGTTTATATAGATTTTTTATCGTATACGTTTATCGTTTATTTGCGTTAATGGGGCGGAGTTGTTACGATATTTTGGAAAGTTTCGTTGATTTTGGTGTTAAAATAAATTTTTATTGACGTTAATGGGGTGGAGATTTGGAAATTTTCGTGAGTTAAATCGTTATTTACGTTTATTGATGTATTGTTAAAATCGTATTATTATGTTAATAGCGATGATTAATACGTAGATGTATTGTTAAGTAGGAAAGTTTTATAAGGTTATGTATTGGGTATAATGTTAGGCGGGTTATTTATCGTTATTGACGTTAATAGGGGGCGTATTTGGTATATGATATATTTGATGTATTGTTAAGTGGGTAGTTTATCGTAAATATTTTATTTATTGACGTTAATGGAAAGTTTTTATTGGCGTTATTATGGGAATATACGTTATTATTGACGTTAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTTAGTTAGGCGGGTTATTTATCGTAAGTTATGTAACGCGGAATTTTATATATGGGTTATGAATTAATGATTTCGTAATTGATTATTATTAATAATTAGTTAATAATTAATGTTAATAT(SEQ ID NO:04)，完全脱氨基的B链具有核苷酸序列
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(SEQ IDNO:05)。
图4显示了各CpG位点在不同细胞系中的甲基化频率。数目通过分析从转染了包含用于表达多肽的表达盒的质粒的不同CHO亲本细胞系获得的19至22个不同克隆来确定。针对每个细胞系，显示各单条DNA的甲基化模式(底部)和各单个CpG位点的甲基化频率(顶部)。细胞系K18.1是高度甲基化的(图4A)。不同CpG位点的甲基化频率不相等，但看起来集中在3个簇中，即在5'末端、3'末端和第400位(或核苷酸)周围。22个测序的插入序列中的14个在第425位具有胞嘧啶。细胞系43-16A10中启动子核酸的甲基化示于图4E中。甲基化的分布类似于在细胞系K18.1中所观察到的分布。与K18.1一样，第425位最经常地被甲基化：测序的20个插入序列中5个在该位点包含胞嘧啶。
在其它3个所分析的细胞系中，零星检测到胞嘧啶，即在不同的CpG位点作为单个事件存在(图4B、4C和4D)。对于具有低的总体甲基化的细胞系，为了获得统计显著性，需要对数百个插入序列进行测序。此外，单个事件也可能是由于胞嘧啶脱氨基不完全而非实际的启动子甲基化造成的假阳性事件。
为了可靠确定CpG位置特异性甲基化，发展了甲基化特异性PCR方法。为了进行甲基化特异性PCR，可以使用以下表中所示的引物。这些引物单独或组合也是本文所报道的方面。
表:可用于甲基化特异性PCR的引物
在引物评估过程中发现，对第425位具有胞嘧啶的脱氨基CMV启动子DNA高度选择性的甲基化特异性引物对在其特性上不同(见图6)。在一个实施方案中，用于甲基化特异性PCR的引物具有SEQ ID NO:14和SEQID NO:18的核苷酸序列。
因此，在本文所报道的方法的一个实施方案中，启动子核酸是SEQ IDNO:01的人CMV启动子核酸。在一个实施方案中，具有高甲基化频率的CpG位点选自SEQ ID NO:01的第80、96、425、437、563和591位(bp)上的CpG位点。在另一个实施方案中，具有高甲基化频率的CpG位点选自第425位(bp)上的CpG位点、和第425位(bp)上的CpG位点与第80、96、438、563和591位(bp)上CpG位点中的至少一个的组合。
表：甲基化特异性(MSP)引物对和通用引物对在qPCR中的预期结果
通用引物对应扩增所有4个模板，而MSP引物对应选择性扩增模板#62(SEQ ID NO:22)和模板#01(SEQ ID NO:23)。在模板#62和模板#01上MSP引物对和通用引物对之间的△Cp值应该尽可能小。相反，在模板#11(SEQ ID NO:21)和#04(SEQ ID NO:24)上以MSP引物对得到的Cp值应该尽可能高，即与以通用引物对进行的扩增相比，△Cp应该最大。
甲基化特异性引物应该能够选择性检测第425位的5-甲基胞嘧啶，尽管在第416和437位上存在两个另外的甲基化位置。
可以确定具有从1%到100%的甲基化频率的甲基化。
关于甲基化程度，观察到了使用甲基化特异性PCR和通过克隆与测序之间可比较的结果，但甲基化特异性PCR更加灵敏。在长期生产中具有递减的生产力的细胞系在第425位上具有甲基化频率高于阈值的甲基化。在一个实施方案中，阈值是确定方法的背景噪音的两倍。具有长期稳定的生产力的细胞系在该CpG位点上具有低于阈值的甲基化频率。
关于高分辨率熔点分析，从第334位至487位(即154bp)扩增启动子核酸。示例性熔点分析显示于图10A中，其一阶导数显示于图10B中。可以看到，通过高分辨率熔点分析，可以将甲基化的启动子核酸(模板#16,SEQ ID NO:25)与非甲基化的启动子核酸(模板#11)区分开。可以以50%或更高的相对频率检测甲基化的启动子核酸片段。可以以10%或更高的相对频率检测非甲基化的启动子片段。
这些数据显示，可以通过测定第425位胞嘧啶的甲基化状态，预测包含由人CMV立即早期启动子/增强子驱动的外源基因的重组CHO细胞系的稳定性。
因此，已发现，C425甲基化的确定可用作确定所产生的细胞克隆中多肽表达稳定性的预测性标记，并由此允许在细胞系开发期间选择具有稳定生产力的稳定克隆。还发现，5%或更低的C425甲基化是用于选择稳定细胞克隆的合适的标准。还发现，可以通过在测试前在缺乏MTX下培养一段时间，降低被错误预测为稳定的细胞克隆(假阴性细胞克隆)比例。
建立了可以定量hCMV-MIE核苷酸在CpG位点425上的甲基化的灵敏和准确的PCR方法后，对重组CHO细胞系K18.1、4316A10和G45-2中的甲基化进行了评估。将已经通过测序分析的经亚硫酸氢盐处理的DNA，直接或在PCR扩增整个hCMV-MIE区域后，用作甲基化特异性实时qPCR的模板(图8A和8B)。这两个试验设置提供了可比较的结果。更重要的是，它们与亚硫酸氢盐测序的结果很好地相关。这表明，CpG位点425甲基化特异性qPCR试验可用来测定重组CHO细胞系中hCMV-MIE在CpG位点425上的甲基化，并可以在不需要之前对目标DNA进行PCR扩增下使用。
原则上，可以调查CMV立即早期启动子/增强子DNA中其它CpG位点来预测生产不稳定性。然而，发现C425上的甲基化比所有CpG位点上的平均甲基化高约5倍。此外，一些位点即使在高度甲基化细胞克隆例如C280和C289中也根本不甲基化(图4F、4J和13)。通过选择正确的，即频繁修饰的CpG位点来进行启动子甲基化分析，该测定试验将变得更灵敏。如随机选择CpG位点用于分析，克隆G25-17、G25-10和43-16A10中约10%的显著甲基化可能被漏掉。
通过调查启动子核酸中相关CpG位点的甲基化状态来预测稳定性也可以用于其它异源启动子核酸。
为了评价早期启动子甲基化和生产不稳定性之间的潜在相关性，将于稳定性研究开始时CpG位点425甲基化相对于在存在或缺乏MTX下qP的相对改变进行绘图。相关图显示于图11A(有MTX)和11B(无MTX)中。为了进行评价，以5%的甲基化(等于甲基化测量背景的2至3倍，即检测限)和qP降低40%(代表生产稳定性的可接受限度)为限，将图分为4个区。确定不同区中克隆的数量。使用皮尔逊卡方检验进行甲基化状态对稳定性状态的可能性分析，表明在有MTX下培养时存在p值为0.05的显著相关，在无MTX下培养时存在p值为0.13的趋势。结果证明，大多数具有CpG位点425低于5%的甲基化的克隆出现于稳定克隆的部分中(有或无MTX下qP降低低于40%，显示于左上区中)。
因此，总结上文，在按比例扩大过程中生产力的丢失是开发生产性细胞系中的主要风险。因此，需要可快速和容易检测的生产不稳定性分子标记。现已发现，启动子甲基化可用于预测重组CHO细胞系中将来的生产力丢失。为了对此进行评估，分析了广泛使用的hCMV-MIE启动子/增强子的603bp区域中33个CpG位点的DNA甲基化。所调查区域的总体甲基化水平在所有CpG位点的约1%和18%之间变动。1%的表观甲基化代表由非甲基化胞嘧啶的不完全脱氨基产生的技术背景(数据未显示)。此外，在甲基化的启动子中，甲基化水平在各单个CpG位点之间变化非常大，在3个簇中累积并在CpG位点425上最大。位点CpG 425上的甲基化表现出比所有其它CpG位点的平均甲基化程度高约5倍。在另一方面，一些CpG位点即使在高度甲基化的细胞系中也表现出完全的非甲基化。hCMV-MIE的总体甲基化以及各单个CpG位点之间甲基化的分布可以在细胞类型和组织间有相当大的变化(见例如Kong,Q.等,PLoS One 4(2009)e6679,Krishnan,M.等,FASEB J.20(2006)106-108,Mehta,A.K.等,Gene428(2009)20-249)。
已发现，CpG位点425的显著甲基化适合作为hCMV-MIE的甲基化的标记。已建立了CpG位点425甲基化特异性qPCR作为一种中等通量的快速和灵敏的方法。当通过CpG位点425甲基化特异性qPCR分析大量的细胞系时，发现即使在长期培养之前，大部分不稳定的生产者在CpG位点425上表现出高于5%的甲基化，然而大部分稳定生产者在该位点显示出低于5%的甲基化。
CpG位点425的早期甲基化专一在携带多于10个拷贝的异源质粒的克隆中发现。以前的报道已经提供了一些证据证实多个转基因拷贝的串连重复更易于甲基化和在哺乳动物细胞中沉默(Garrick,D.等,Nat.Genet.18(1998)56-59,McBurney,M.W.等,Exp Cell Res 274(2002)1-8)。
在稳定性测试之前，以轻链基因拷贝数和甲基化水平彼此相对作图，于图15A中。早期甲基化，即在稳定性测试之前的甲基化，专一在携带多于10个转基因拷贝的细胞中发现(图15A中黑色圆圈)。因此，在稳定性测试之前选择具有低转基因拷贝数的克隆，也可以富集具有稳定生产力的克隆。具有10个或少于10个转基因拷贝的两个克隆在长期培养期间获得了甲基化(图15A中灰色圆圈)，拷贝数量从10个拷贝至3个拷贝和从2个拷贝至6个拷贝。
图15比较了在无MTX下长期培养前后转基因拷贝数。在图15A中，以在稳定性测试开始时各单克隆的CpG位点425甲基化(mCpG 425开始)对在稳定性测试开始时轻链基因拷贝数(LC基因拷贝开始)作图；白色圆圈：在长期稳定性测试开始时和结束时，CpG位点425甲基化低于5%的克隆；灰色圆圈：在长期稳定性测试期间CpG位点425甲基化上升超过5%的克隆；黑色圆圈：在稳定性测试开始时和结束时，CpG位点425甲基化高于5%的克隆。克隆通过数字标识。图15B中显示了在无MTX下，稳定性测试开始时(S)和长期培养结束时(E)，各单克隆的轻链基因拷贝数(LC基因拷贝)(LC gene copies)。白色条：在长期稳定性测试开始时和结束时，CpG位点425甲基化低于5%的克隆；灰色条：在长期稳定性测试期间CpG位点425甲基化上升超过5%的克隆；黑色条：在稳定性测试开始时和结束时，CpG位点425甲基化高于5%的克隆。数据表示4个独立试验的平均值±SEM(误差条线)。
本文已显示，可以通过选择具有很少的转基因拷贝的克隆来富集稳定的生产者。
总的来说，hCMV-MIE在CpG位点425的甲基化和高转基因拷贝数即存在多于10个拷贝的结构基因和启动子核酸，可用作重组CHO细胞系生产不稳定性的早期指示物。这些指示物提供了在细胞系开发早期富集稳定生产者的机会。
提供了以下实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，本发明的实际范围在后附权利要求中提出。应理解的是，可以对所提出的方法进行修改而不违背本发明的精神。
序列表说明
SEQ ID NO:01人CMV立即早期(hCMV)启动子/增强子的核苷酸序列
SEQ ID NO:02hCMV启动子/增强子A链的核苷酸序列，所有CpG位点保存的
SEQ ID NO:03hCMV启动子/增强子A链的核苷酸序列，完全脱氨基的
SEQ ID NO:04hCMV启动子/增强子B链的核苷酸序列，所有CpG位点保存的
SEQ ID NO:05hCMV启动子/增强子的完全脱氨基的B链的核苷酸序列，完全脱氨基的
SEQ ID NO:06引物227
SEQ ID NO:07引物228
SEQ ID NO:08引物229
SEQ ID NO:09引物237
SEQ ID NO:10引物238
SEQ ID NO:11引物239
SEQ ID NO:12引物240
SEQ ID NO:13甲基化特异性引物254
SEQ ID NO:14引物263
SEQ ID NO:15引物264
SEQ ID NO:16甲基化特异性引物265
SEQ ID NO:17甲基化特异性引物266
SEQ ID NO:18甲基化特异性引物267
SEQ ID NO:19甲基化特异性引物268
SEQ ID NO:20甲基化特异性引物262
SEQ ID NO:21模板#11的序列
SEQ ID NO:22模板#62的序列
SEQ ID NO:23模板#01的序列
SEQ ID NO:24模板#04的序列
SEQ ID NO:25模板#16的序列
SEQ ID NO:26引物133
SEQ ID NO:27引物132
SEQ ID NO:28引物166
SEQ ID NO:29引物178
SEQ ID NO:30引物180
SEQ ID NO:31引物185
附图说明
图1从不同细胞系获得的hCMV启动子/增强子的甲基化CpG位点的数目。
图2p5057的质粒图谱。
图3A：细胞系K18.1于缺乏选择试剂下在长期生产中在多代中的比生产速率
B：细胞系G25-10于缺乏选择试剂下在长期生产中在多代中的比生产速率
C：细胞系G25-17于缺乏选择试剂下在长期生产中在多代中的比生产速率
D：细胞系G42-5于缺乏选择试剂下在长期生产中在多代中的比生产速率
E：细胞系43-16A10于缺乏选择试剂下在长期生产中在多代中的比生产速率
图4上图：通过分析19至22个启动子核酸确定的来自重组CHO细胞系的hCMV-MIE DNA中不同的甲基化位点的甲基化频率；下图：图示来自重组CHO细胞系的hCMV-MIE启动子/增强子DNA中甲基化CpG位点，甲基化位点显示为黑色，以箭头突出显示第425位。
A：细胞系K18.1–所有CpG位点的甲基化：12%，位点C425的甲基化：64%，位点C591的甲基化：27%，位点C96的甲基化：32%；
B：细胞系G25-10–所有CpG位点的甲基化：0.5%，位点C425的甲基化：0%，位点C591的甲基化：5%，位点C96的甲基化：0%；
C：细胞系G25-17–所有CpG位点的甲基化：0.3%，位点C425的甲基化：0%，位点C591的甲基化：0%，位点C96的甲基化：0%；
D：细胞系G42-5–所有CpG位点的甲基化：0.6%，位点C425的甲基化：0%，位点C591的甲基化：0%，位点C96的甲基化：0%；
E：细胞系43-16A10–所有CpG位点的甲基化：4.4%，位点C425的甲基化：25%，位点C591的甲基化：15%，位点C96的甲基化：10%。
图5通过甲基化特异性实时qPCR区分在位点425甲基化的hCMV-MIE和在位点425未甲基化的hCMV-MIE；模板#11(A)、#62(B)、#01(C)和#04(D)的PCR扩增曲线。
图6不同的甲基化特异性引物和引物对的PCR扩增曲线。
图7通过甲基化特异性实时qPCR从非甲基化hCMV-MIE的背景中回收位点425甲基化的hCMV-MIE。
图8通过预扩增(A)和直接地从经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA(B)，以引物#239和#267得到的CMV启动子核酸在甲基化位点425的甲基化。
图9以引物239+237和239+267(黑色)、263+237和263+267(白色)、264+237和264+267(水平线)、和239+237和239+266(垂直线)得到的CMV启动子核酸在甲基化位点425的甲基化。
图10示例性标准化的高分辨率熔解曲线分析(A)和其一阶导数(即溶解峰)(B)。
图11长期培养之前C425的甲基化程度和在有250nM MTX(A)或无MTX(B)下培养60代后SPR的相对改变之间的相关性。
图12长期培养之前C425的甲基化程度和在有250nM MTX下培养60代后甲基化程度之间的相关性。
图13图示来自克隆44-28的hCMV-MIE启动子/增强子DNA中的甲基化CpG位点。甲基化位点显示为黑色。以箭头突出显示第425位。所有CpG位点的甲基化：18%；C425的甲基化：80%；C591的甲基化：70%；C96的甲基化：60%。
图14在无MTX下稳定性测试之前和之后的轻链基因拷贝数。
图15生产抗体的CHO细胞系的轻链基因拷贝数和hCMV-MIE甲基化。
实施例1
一般技术
重组DNA技术
使用标准方法操纵DNA，所述方法描述于Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中。按照生产商的操作指南使用分子生物学试剂。
确定DNA序列
在SequiServe GmbH(Vaterstetten,德国)进行DNA测序。
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
使用EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite)软件包和Invitrogen的Vector NTI 9.1版进行序列创建、作图、分析、注释和说明。
蛋白质测定
使用色谱法定量样品中抗体的量。使用与抗体的Fc区结合的PorosA柱。抗体与柱结合，随后通过低pH条件洗脱。通过测定280nm处的光密度(OD)，以320nm波长为参考，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来确定蛋白质的浓度。
实施例2
制备重组CHO细胞系
通过以编码包含人免疫球蛋白κ轻链和人免疫球蛋白γ1或γ4重链的抗体的轻链和重链的载体稳定转染CHO-K1或CHO-DG44悬浮生长细胞，制备表达人IgG类抗体的重组细胞系。载体另外包含编码鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)的核酸(图2)。轻链和重链表达盒均在人CMV立即早期启动子和增强子(SEQ ID NO:1)的控制下。细胞的转染通过核转染(LonzaCologne GmbH或Amaxa Biosystems)或通过使用Gene Pulser XCell(BIO-RAD)进行的电穿孔来进行。
例如，以线形化的质粒DNA，使用核转染装置结合Nucleofector Kit V(Lonza Cologne GmbH,Cologne,德国)，或通过使用Gene Pulser XCell(Bio-Rad,Hercules,CA)进行电穿孔，按照生产商的操作程序转染CHO-K1或CHO-DG44悬浮液。将转染后的细胞种植到包含具有各种浓度的氨甲蝶呤(MTX)作为选择试剂的无胸腺嘧啶培养基的96或384孔平板中。三周后，通过以ELISA测量培养物中抗体滴度，鉴定表达抗体的细胞系。将最优生产者扩大到更大体积，通过限制稀释进行亚克隆并低温保存。
在包含20nM至1200nM氨甲蝶呤(MTX)作为选择试剂的无胸腺嘧啶和蛋白质的培养基中选择稳定转染的细胞。通过测量培养基中抗体的滴度，鉴定表达抗体的细胞或细胞系，并通过限制性稀释和/或FACS单细胞存放进行亚克隆。
在一次性50ml带通气孔的摇瓶中，于标准的湿润条件下(95%rH,37℃和5%至8%CO2)，以每分钟120至150rpm的恒定摇动速率繁殖细胞。每3-4天将细胞分传到新鲜培养基中。使用CASY TT或Cedex HiRes细胞计数器(Roche Innovates AG,Bielefeld,德国)测定培养物的密度和存活力。
此外，使用了于例如Current Protocols in Cell Biology,Bonifacino,J.S.等(编辑),John Wiley&Sons,Inc.,New York(2000)中描述的标准细胞培养技术。
实施例3
长期培养和生产
调查了根据实施例2获得的5个CHO细胞系的长期生产力：细胞系K18.1来源于CHO-K1细胞和生产人IgG1亚类抗体；细胞系G25-10、G25-17和G42-5每个来源于CHO-K1细胞和生产人IgG4亚类抗体；细胞系43-16A10来源于CHO-DG44细胞和生产人IgG4亚类抗体。
测试细胞在缺乏选择试剂下35至70代的表型，即生产稳定性。在包含50ml无MTX的培养基的通气125ml摇瓶中持续培养细胞，每两周以新鲜培养基稀释一次。种植密度为2至3x 105个细胞/ml。在传代前，测定活细胞密度和存活力。根据以下等式计算每次传代结束后以代计的培养物年龄：
a2=a1+ln(D2/D1)/ln2    (公式1)
其中
a2[代数]：传代结束时培养物的年龄，
a1[代数]：传代开始时培养物的年龄，即前一次传代结束时培养物的年龄，
D1[细胞/ml]：传代开始时活细胞密度，
D2[细胞/ml]：传代结束时活细胞密度。
在每次传代结束时，通过蛋白A HPLC测定上清中抗体浓度(抗体滴度)。根据这些数据，使用以下公式计算每次传代的比生产速率(SPR)：
SPR=P2-P1/((D2-D1)/2*△t)    (公式2)
其中
SPR[pg/细胞/d]：比生产速率，
P1[μg/ml]：传代开始时抗体滴度，
P2[μg/ml]：传代结束时抗体滴度，
D1[细胞/ml]：传代开始时活细胞密度，
D2[细胞/ml]：传代结束时活细胞密度，
△t[d]：代的持续时间。
以SPR值对各次传代结束时以代表示的培养物年龄进行作图。在所有SPR数据点上计算线性趋势线，按照以下等式计算测试时期内SPR的相对改变(以百分比表示)：
△SPR=m*a/SPR0*100    (公式3)
其中
△SPR[%]：SPR的百分比改变，
m[pg/细胞/d/代]：线性趋势线的斜率，
a[代数]：培养物的年龄，
SPR0：线性趋势线的y-轴截距。
细胞系G42-5在整个测试期间(将近70代)没表现出SPR的改变。所有其它细胞系在30代后已经表现出生产力降低。降低范围从29%至73%。对于细胞系G25-17、G42-5和43-16A10，培养在35至45代后停止(图3A至3E，表1和2)。
表1:5个细胞系在缺乏MTX下培养期间SPR的改变
n.d.=未测定。
表2:5个细胞系在缺乏MTX下培养期间剩余的SPR。100%=第一代的SPR。
n.d.=未测定。
实施例4
通过亚硫酸氢盐处理和DNA测序鉴定人CMV立即早期启动子/增强子DNA中甲基化CpG位点
用于表达抗体轻链和重链基因的人CMV立即早期启动子/增强子片段(SEQ ID NO:01)包含33个CpG位点。
使用来自Qiagen的Allprep DNA/RNA Mini试剂盒(Hilden,德国)，从CHO细胞系K18.1、G25-10、G25-17、G42-5和43-16A10中提取基因组DNA。以酶Dra I切割5微克DNA并通过测量260nm处的消光进行定量。使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(EpiTect Bisulfite Kit)(Qiagen,Hilden，德国)对100纳克DNA进行亚硫酸氢盐处理和纯化。将经亚硫酸氢盐处理的DNA回收在20μl的无RNAse水(Qiagen,Hilden,德国)中。
为了扩增人CMV立即早期启动子/增强子片段(SEQ ID NO:02)的A链(正向)，将1μl经亚硫酸氢盐处理的DNA与24μl PCR master混合液混合，使用PCR系统9700(Applied Biosystems Inc.,美国)进行PCR。
24μl PCR master混合液包含：
1μl序列为SEQ ID NO:06的正向引物227(10pmol/μl)，
1μl序列为SEQ ID NO:08的反向引物229(10pmol/μl)，
22μlPCR SuperMix HighFidelty(Invitrogen Corp.,美国)。
正向引物227与人CMV立即早期启动子/增强子片段的5’末端互补。反向引物229下游结合在免疫球蛋白基因的5’-UTR中。
PCR条件如下：
  温度   时间
  步骤1   变性   95℃   10min.
  步骤2:PCR   变性   94℃   30sec.
  循环数:45   退火   50℃   2min.
  延伸   68℃   2min.
  步骤3   最后的延伸   72℃   10min.
  步骤4   浸泡   4℃   无期限
通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物的大小和纯度，并使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corp.,美国)将其克隆到载体pCR4(Invitrogen公司,美国)中。通过限制消化和琼脂糖凝胶电泳分离和分析质粒克隆。对每个细胞系，对19至22个包含插入序列的质粒进行测序。为了估计亚硫酸氢盐对非CpG位点的脱氨基效率，测定了非CpG位点残余胞嘧啶的数量。按如下计算百分比脱氨基效率：
Emod=100-(Cres/Ctotal*100)    (公式4)
其中：
Emod[%]：脱氨基效率
Cres：所有所分析的插入序列中非CpG位点残余胞嘧啶的数量，排除了PCR引物位点，
Ctotal：非亚硫酸氢盐处理的CMV启动子/增强子片段中胞嘧啶的数量（排除了PCR引物位点）乘以所分析的插入序列的数量，即107*20。
已发现，所有样品中非CpG胞嘧啶的脱氨基效率高于99%(表3)。
表3：非CpG胞嘧啶的脱氨基效率
通过对从dcm+大肠杆菌提取的质粒DNA进行亚硫酸氢盐处理和其后克隆与测序，证实了5-甲基胞嘧啶受到了保护而没有脱氨基。Dcm+大肠杆菌使序列CCAGG或CCTGG(dcm位点)中的内部胞嘧啶残基甲基化。已发现，非dcm位点的脱氨基效率为99%，dcm位点中内部胞嘧啶的脱氨基效率小于5%。
为了定量经亚硫酸氢盐处理的CMV启动子/增强子片段中CpG位点的DNA甲基化程度，对每个分析的细胞，测定每个CpG位点的胞嘧啶数量并作图。
细胞系K18.1被高度甲基化(图3A)。甲基化频率在3个簇中累积，一个在5’末端、一个在3’末端、一个在第400位周围。在第425位发现了最高程度的甲基化。22个所测序的插入序列中的14个在此具有胞嘧啶。
来自细胞系43-16A10的CMV启动子的甲基化显著(图3E)。甲基化的分布与在细胞系K18.1中观察到的分布类似。第425位甲基化最频繁。20个所测序的插入序列中的5个在该位置上包含胞嘧啶。
在所调查的其它3个细胞系中，仅零星地在CpG位点上检测到胞嘧啶(图3B、3C和3D)。
实施例5
经亚硫酸氢盐处理的人CMV立即早期启动子/增强子DNA的定量甲基化特异性PCR
在该实施例中，报道了以甲基化特异性实时qPCR方法检测CpG位置上的，更准确地是hCMV启动子核酸的第425位上的甲基化。
设计了两套引物：
-选择性扩增在第425位具有胞嘧啶的脱氨基的CMV启动子DNA的甲基化特异性引物对(MSP引物对)，其中该DNA代表在第425位甲基化的DNA，和
-扩增脱氨基的CMV启动子DNA(无论其甲基化状态如何)的通用引物对。
通用引物用于标准化。在相同的PCR运行条件下使用时，两个引物对应该具有类似的熔点。
识别第425位上甲基化的引物的设计因紧邻的另外两个CpG位点(第416位和第437位)的存在而变得复杂。甲基化敏感引物应该检测到5mC425，而不管第416位和第437位的甲基化状态。
将在实施例4中分离的4个脱氨基的人CMV立即早期启动子/增强子片段（代表在第425和437位上可能的序列变异）：#11、#62、#01和#04(表4,SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22)用作qPCR模板进行甲基化特异性PCR和通用引物对PCR。
表4：MSP和通用引物对在qPCR中的预期结果
以通用引物，能够扩增所有4个模板，而甲基化特异性引物对能够选择性扩增模板#62和模板#01。甲基化特异性引物对和通用引物对之间在模板#62和模板#01上的△Cp值应该尽可能小。以甲基化特异性引物对在模板#11和模板#04上得到的Cp值应该尽可能高，即与用通用引物对进行的扩增相比，△Cp应该最大。
使用480II系统(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)进行qPCR，使用480SYBR Green I Master (RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,德国)制备样品。将5微升包含0.05ngDNA的模板溶液与15μl PCR master混合液在96孔多孔平板中的孔室中混合。
15μl PCR master混合液包含：
-4.2μl水，
-0.4μl正向引物239、263或264(也可以为引物227、228、240、238)(10pmol/μl)，
-0.4μl反向引物237、254、262、265、266、267或268(也可以为引物229)(10pmol/μl)，
-10μl SYBR Green I Master。
以480密封铝箔(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)密封多孔平板，在1,500x g离心2分钟。其后，将平板装到480系统中进行qPCR。每个样品一式重复测试2次、3次和4次。为了允许测定绝对拷贝数，使用线性化的表达质粒作为标准，对LC和HC转基因制作标准曲线。标准稀释液包含2.5x 107、2.5x 106、2.5x 105、2.5x 104或2.5x 103个质粒拷贝。基因组DNA一式重复测试3次，标准样重复进行4次。
PCR条件如下：
以480软件1.5版进行数据收集和分析。使用以下公式计算表观甲基化程度，其中假定理想的扩增效率(E=2)。
mCapp=2Cp(t)-Cp(m)*100    (公式5)
其中
mCapp[%]：表观甲基化程度，
Cp(t)：以通用引物得到的Cp值，
Cp(m)：以甲基化特异性引物得到的Cp值。
在引物评估期间发现，对在第425位具有胞嘧啶(“甲基化的”)的脱氨基的CMV启动子DNA高度选择的甲基化特异性引物的设计必须小心进行。引物266和267在Cp(#11)和Cp(#62)之间表现出最大的不同，即对“甲基化”DNA具有最高选择性。引物265、268和254表现出微小的选择性。通用引物对263/237作为对照来测试最小△Cp(图6和表5)。
表5：引物评估结果
图5显示了以甲基化特异性引物对239/267(SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:18)和通用引物对239/237(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:09)组合得到的结果。通用引物对239/237大约同等好地扩增所有4个模板，而甲基化特异性引物对239/267扩增模板#62和#01。模板#11和#4仅很差地被引物对239/267扩增。
从Cp值计算的甲基化频率对于模板#62和模板#01几乎为100%，对于模板#11和模板#04几乎为0%(表6A)。这表明，甲基化特异性引物对239/267结合通用引物对239/237可用来通过实时qPCR区分在第425位甲基化的CMV启动子DNA和在第425位非甲基化的CMV启动子DNA。
找到了另外的通用和甲基化特异性引物对，将它们表征于表6A和6B中。
表6A：与3条不同的正向引物结合的甲基化特异性反向引物267和非甲基化特异性反向引物237
表6B：与2条不同的正向引物结合的甲基化特异性反向引物266和非甲基化特异性反向引物237
为了在广泛范围内定量甲基化程度，以不同的比率将模板#62与模板#11混合。使用引物对239/237和239/267如上文所述进行qPCR，计算在模板#11背景中模板#62的收获率。
为了计算模板#62DNA的分数，测定了在所使用条件下引物对的扩增效率。以模板#62和#11从n=0.005ng至0.5ng DNA的系列稀释液进行qPCR，将所测定的Cp值对log(n)作图。使用XLfit(Microsoft)计算线性回归线。使用以下公式计算扩增效率：
E=10-1/m    (公式6)
其中
E：扩增效率，
M：线性趋势线的斜率。
计算两个引物对的扩增效率均为约1.7。使用以下公式计算模板#62DNA的分数：
mC=1.7Cp(t)-Cp(m)*100    (公式7)
其中
mC[%]：在第425位甲基化的DNA的分数，
Cp(t)：以通用引物对得到的Cp值，
Cp(m)：以甲基化特异性引物对得到的Cp值。
将来自两个独立实验所测定的模板#62的分数对预期值作图(图7)。可以进行1%和100%之间的甲基化定量。
实施例6
人CMV立即早期启动子/增强子甲基化与长期生产力相关
a)以预扩增的人CMV立即早期启动子/增强子A链进行甲基化特异性qPCR
如实施例4中报道，从CHO细胞系K18.1、G25-10、G25-17、G42-5和43-16A10中提取基因组DNA，以酶DraI切割和通过亚硫酸氢盐处理进行脱氨基。使用引物227和229扩增人CMV立即早期启动子/增强子A链。
将PCR产物按1:50,000稀释。使用5微升的每份稀释液进行实时qPCR。使用引物239和237进行总CMV启动子DNA的定量；使用引物239和267进行在第425位甲基化的CMV启动子/增强子DNA的定量。样品一式重复测试3次。以模板#11、#62和#01作为对照。
组合5μl模板和15μl PCR master混合液，如实施例5中报道，设置qPCR。PCR条件如实施例5中报道。引物退火温度为58°C。
b)以经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA进行甲基化特异性qPCR
从CHO细胞系K18.1、G25-10、G25-17、G42-5和43-16A10中提取基因组DNA，以酶DraI切割和通过亚硫酸氢盐处理进行脱氨基。以稀释于3μl水中的2微升脱氨基的DNA作为实时qPCR的模板，使用引物对239/237进行总CMV启动子/增强子A链的扩增；使用引物对239/267进行在第425位甲基化的CMV启动子/增强子A链的扩增。样品一式重复测试3次。以模板#11和#62作为对照。
如实施例5中报道，设置PCR和进行qPCR。引物退火温度为58℃。
对于a)和b)，按以下计算在第425位甲基化的启动子DNA的分数：
mC=1.7Cp(t)-Cp(m)*100    (公式7)
其中
mC[%]：在第425位甲基化的DNA的分数，
Cp(t)：以通用引物对239/237获得的Cp值，
Cp(m)：以甲基化特异性引物对239/267获得的Cp值。
两个测定试验设置都提供了类似的结果。三次重复内的标准偏差在没有预扩增CMV启动子A链时较高(图8A和8B)。细胞系K18.1、G25-10、G25-17、G42-5和43-16A10中CMV启动子核酸第425位的甲基化比未完全脱氨基的背景高，所述背景被发现为约1%。细胞系G42-5中的甲基化低于或最大达背景水平。在细胞系K18.1中测定到了最高甲基化(高于60%)。
以其它通用和甲基化特异性引物对进行测定试验设置a)。为了计算在第425位甲基化的DNA的分数，假定所有引物对的扩增系数为2：
mC=2Cp(t)-Cp(m)*100    (公式5')
其中
mC[%]：在第425位甲基化的DNA的分数，
Cp(t)：以通用引物对239/237获得的Cp值，
Cp(m)：以甲基化特异性引物对获得的Cp值。
表7显示了在进行或不进行CMV启动子DNA预扩增时，在克隆的DNA模板或基因组DNA上已经测试的引物对组合的总结。
表7：引物对组合
  组合   通用  第425位特异性
  1   239+237  239+266
  2   263+237  263+266
  3   264+237  264+266
  4   239+237  239+267
  5   263+237  263+267
  6   264+237  266+267
实施例7
人CMV立即早期启动子/增强子的甲基化和预测重组CHO细胞系的生产不稳定性
以编码人IgG4抗体的质粒转染CHO-K1细胞，使用DHFR/MTX系统选择稳定的克隆。通过限制性稀释对高产的亲本克隆进行亚克隆。在整个细胞系传代过程中，生长培养基中一直含有MTX。从10个亲本克隆中选择16个亚克隆。
以250nM MTX再次培养所选择的细胞。一旦它们显示出稳定的生长，测试它们在存在和缺乏MTX下60至80代的长期生产稳定性。计算60代内SPR的相对改变。在研究开始时用在存在MTX下生长的细胞和在研究结束时从在无MTX下培养的细胞，测定C435甲基化。
将研究开始时C425甲基化对存在(图11A)和缺乏(图11B)MTX时SPR的相对改变作图。大多数在C425具有小于5%的甲基化的克隆可以在稳定克隆的区域中发现(在有或无MTX时SPR的降低小于40%)，而大多数在C425具有高于5%的甲基化的克隆集中在不稳定克隆的区域中。这不依赖于甲基化是否与存在或缺乏MTX时的稳定性相关(也见表8)。大多数在有MTX时丢失小于20%的生产力和在无MTX时丢失小于30%的生产力的稳定克隆表现出小于5%的C425甲基化。
表8：甲基化与存在或缺乏MTX时的稳定性(A)和质粒拷贝数(B)的相关性
该发现表明，C425甲基化的测定可以用作确定所产生的细胞克隆中多肽表达稳定性的预测性标记，从而允许在细胞系开发期间选择具有稳定生产力的克隆。已发现，5%或更低的C425甲基化是用于选择稳定细胞克隆的合适标准。
还发现，在研究开始时没有甲基化的两个中等稳定细胞克隆和两个非常不稳定的克隆在无MTX下在稳定性测试期间甲基化上升超过5%(也见图12)。这表明，可以通过在测试开始前在缺乏MTX下培养细胞克隆一段时间来降低被错误预测为稳定的细胞克隆(假阴性细胞克隆)的分数。
为了通过第二种方法确认C425甲基化，我们对高度甲基化的克隆44-28进行了亚硫酸氢盐测序(图13)。发现，C425的甲基化程度为80%。在考虑到两种测定试验的差异情况下，这与甲基化特异性PCR的结果一致。与克隆K18.1和43-16A10一样(图4)，在人CMV立即早期启动子/增强子DNA的所有CpG位点中，C425最频繁被甲基化。其它甲基化事件集中在5’末端和3’末端。所有位点的平均甲基化程度为18%。
实施例8
早期甲基化与高转基因拷贝数同时发生
我们使用基于TaqMan原理的多重qPCR测定试验，测定了稳定性测试开始时和结束时免疫球蛋白轻链和重链基因的整合拷贝数。使用了由正向引物、反向引物和水解探针组成的两套引物：一套对人κ链基因特异，另一套对人γ重链基因特异。为了允许测定绝对拷贝数，使用已经用于转染的线性化表达质粒作为标准。保证样品和标准同等的扩增效率。
使用480II系统(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)进行qPCR，使用480Probes Master (RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,德国)准备样品。
在96孔微量滴定板的孔室中，将包含50ng基因组DNA的5μl模板溶液与15μl PCR master混合液混合。对于标准，模板溶液包含相应的线性化质粒DNA的2.5x 107、2.5x 106、2.5x 105、2.5x 104和2.5x 103个拷贝。
15μl PCR master混合液包含：
10μl
480Probes Master
1μl正向引物#133(10pmol/μl)
1μl反向引物#132(10pmol/μl)
0.5μl探针#166(10pmol/μl)
1μl正向引物#178(10pmol/μl)
1μl反向引物#180(10pmol/μl)
0.5μl探针#185(10pmol/μl)
以480密封铝箔(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)密封多孔平板，在1,500g下离心2分钟。其后，将平板装到480系统中进行qPCR。每个样品一式重复测试3次，标准品一式重复进行4次。
PCR条件如下：
使用480软件1.5版进行数据收集和分析。基本上，以质粒标准稀释液的平均Cp值对相应基因拷贝数作图来制作标准曲线，从该曲线外推样品中转基因的数量。
假定每个细胞平均DNA含量是jpg，计算每个细胞的转基因数量：
Nc=Ns/50000*6
Nc：每个细胞中转基因拷贝数
Ns：样品中转基因拷贝数
表9引物序列
图14描述了稳定性测试之前和之后甲基化和未甲基化细胞的轻链基因拷贝数。不出所料的是，因为以携带两个基因的双基因载体转染了细胞，对于重链基因也发现了相同的拷贝数(数据未显示)。早期甲基化，即在稳定性测试之前的甲基化全部在携带多于10个转基因拷贝数的细胞中发现，而一些具有少于10个转基因拷贝数的克隆在稳定性测试期间获得了甲基化。结果，选择在稳定性测试之前具有低转基因拷贝数的克隆，同样也可以富集具有稳定生产力的克隆(表10)。
表10：转基因拷贝数与存在或缺乏MTX时稳定性的相关性
  16个克隆  质粒拷贝数<10 质粒拷贝数≥10
  qPrel_结束+MTX≥60%  7 4
  qPrel_结束+MTX<60%  0 5
  qPrel_结束-MTX≥60%  6 2
  qPrel_结束-MTX<60%  1 7
我们还观察到，生产不稳定性通常不与转基因拷贝数的丢失相关。克隆1A5-05、1A5-21、1A5-24和2B1-02丢失了转基因拷贝，2B-13是稳定的，14-13及14-23的基因拷贝数增加(也见图11B)。

Claims (8)

1.用于选择CHO细胞克隆的方法，其包括以下步骤：
a)针对包含核酸的细胞克隆的每一个，其中所述核酸含有与具有SEQ ID NO:01的核酸序列的启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因，基于从每个细胞克隆的培养物获得的至少10个拷贝的该启动子核酸或者至少10个细胞所确定的甲基化，确定在SEQ ID NO:01的第425位的位置的CpG位点的甲基化频率，
b)选择所确定的甲基化频率低于5％的细胞克隆。
2.根据前述权利要求1的方法，其特征在于所述确定包括以下步骤：
0)提供至少两个细胞克隆；
1)从每个细胞克隆中分离DNA，
2)对每个分离的DNA分别进行甲基化特异性聚合酶链式反应，
3)根据步骤2)中得到的结果，确定CpG位点的甲基化频率。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于步骤2)是
2)对每个分离的DNA分别以甲基化特异性引物和通用引物进行聚合酶链式反应。
4.根据权利要求2或3之任一的方法，其特征在于步骤2)是
2)以限制性内切酶分别消化所分离的DNA，对每个经消化的DNA以甲基化特异性引物和通用引物进行聚合酶链式反应。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，引物选自SEQ ID NO:11、14和15，通用引物为SEQ ID NO:09的序列，甲基化特异性引物选自SEQ ID NO:17和18，其中PCR使用由引物和通用引物组成的通用引物对、和由引物和甲基化特异性引物组成的甲基化特异性引物对进行。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于通用引物对为SEQ ID NO:09和11的序列，甲基化特异性引物对为SEQ ID NO:11和18的序列。
7.用于生产多肽的方法，其包括以下步骤：
a)以根据权利要求1至6之任一的方法选择细胞克隆，
b)培养所选择的细胞克隆，和
c)从培养基和/或细胞克隆中回收多肽，和由此生产多肽。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于在步骤a)之前包括以下步骤：
a-3)提供非人的哺乳动物细胞，
a-2)以包含与启动子核酸有效连接的编码多肽的结构基因的核酸转染所提供的细胞，
a-1)i)可选地在存在选择试剂下培养所转染的细胞克隆，ii)将所转染的细胞进行单存放，和iii)在存在选择试剂下培养该单存放的转染细胞。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201609639VA (en) * 2014-05-19 2016-12-29 Hoffmann La Roche Method for production of polypeptides
EP3146052B1 (en) * 2014-05-19 2018-11-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Method for the selection of a long-term producing cell using histone acylation as markers
TW202426660A (zh) * 2022-09-01 2024-07-01 德商贏創運營有限公司 評估ｃｈｏ細胞中蛋白質生產之方法
WO2024180050A1 (en) * 2023-03-02 2024-09-06 Evonik Operations Gmbh Detection of viral presence in cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006089152A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Maxcyte, Inc. Use of methyltransferase inhibitors to enhance transgene expression

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6030638A (en) * 1991-08-19 2000-02-29 Vanderbilt University Plasmid for in vivo expression of prostaglandin synthase
GB9212926D0 (en) * 1992-06-18 1992-07-29 Morton Int Inc Method of bleaching paper pulp
GB0022995D0 (en) * 2000-09-20 2000-11-01 Cobra Therapeutics Ltd Polynucleotide
US20070037184A1 (en) * 2005-06-16 2007-02-15 Applera Corporation Methods and kits for evaluating dna methylation
US8058027B2 (en) * 2007-01-08 2011-11-15 Millipore Corporation Cell culture methods for producing recombinant proteins in the presence of reduced levels of one or more contaminants
JP2010515435A (ja) * 2007-01-08 2010-05-13 ミリポア・コーポレイション 遺伝子増幅を不要とする高発現細胞株
EP2129790A4 (en) * 2007-02-01 2010-06-09 Centocor Inc SELECTION OF CELL LINES WITH HIGH PRODUCTION

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006089152A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Maxcyte, Inc. Use of methyltransferase inhibitors to enhance transgene expression

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jacqueline Dickson et al..VEZF1 Elements Mediate Protection from DNA Methylation.《PLoS Genetics》.2010,第6卷(第1期),第1页第2段，第2页右栏第3-4段，第4页左栏第1-2段，图2. *
R.S. Everett et al..Strain-specific rate of shutdown of CMV enhancer activity in murine liver confirmed by use of persistent [E1, E2b ] adenoviral vectors.《Virology》.2004,第325卷(第1期),图6A. *
R.S.Everettetal..Strain-specificrateofshutdownofCMVenhanceractivityinmurineliverconfirmedbyuseofpersistent[E1 E2b ] adenoviral vectors.《Virology》.2004 *
VEZF1 Elements Mediate Protection from DNA Methylation;Jacqueline Dickson et al.;《PLoS Genetics》;20100108;第6卷(第1期);第1页第2段，第2页右栏第3-4段，第4页左栏第1-2段，图2 *

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