CN106255757B - 生产多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明报道了具有SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的核酸序列的启动子，其是人CMV主要立即早期(hCMV‑MIE)启动子/增强子，相对于转录起始位点在‑41和/或‑179位置具有C到G点突变。这种新型启动子尤其在大规模生产多肽时特别有用，因为它显示出减少的启动子沉默和改善的多肽生产。

Description

生产多肽的方法
本发明属于蛋白质表达领域。本文报道的是具有至少一个点突变的启动子，以及使用此启动子生产多肽的方法。
发明背景
蛋白质的表达是活细胞中的基本过程。用于蛋白质表达所需的所有信息都由单一核酸提供。该核酸不仅包含蛋白质的氨基酸序列信息，还提供所需的调控信息(例如，核糖体结合位点、转录的开始和结束信号、剪接信号、增强子元件等)，包括启动子/启动子序列。
启动子是一种核酸，其调控与其有效连接的核酸(例如编码多肽)转录成前mRNA的量。它是转录控制元件，其定位于有效连接的编码序列的5'末端的RNA聚合酶起始位点附近。从SV40早期启动子的分析可知，用于转录激活子的识别/结合位点包含在启动子中的由7-20个碱基对组成的区段中。一个区段是用于RNA合成的起始位点，例如已知的TATA盒。其他区段，位于用于RNA合成的起始位点的5'(即，上游)约30-110个碱基对，限定转录起始的频率。启动子至少需要一个区段，其在特定位点和在限定的方向(即，在5'到3'的方向上)启动RNA合成。
在长期培养中的生产力的逐渐损失是开发生产细胞系的普遍问题(Barnes,L.M.等人，Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639)。重组蛋白表达的减少可能是由于转基因拷贝的丢失和/或转基因启动子的沉默(参见例如Escher,G.等人，J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.等人，FASEB J.20(2006)106-108；Yang,Y.等人，J.Biotechnol.147(2010)180-185)。启动子的沉默是通过染色质的外遗传修饰如组蛋白的翻译后修饰，以及启动子DNA在CpG位点的的直接甲基化引起的(参见例如Cedar,H.和Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304；De Carvalho,D.D.等人，Trends Cell Biol 20(2010):609-617；Klose；R.J.和Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97)。甲基化的启动子一般是失活的。
人巨细胞病毒(hCMV-MIE)的主要立即早期基因的极强启动子和增强子被用于多肽在哺乳动物细胞中的重组表达。已经表明该启动子容易在瞬时以及稳定转染的哺乳动物细胞通过甲基化沉默(参见例如Escher,G.等人，J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.等人，FASEB J.20(2006)106-108；Proesch,S.等人，Biol Chem Heppe Seyler377(1996):195-201；Yang,Y.等人，J.Biotechnol.147(2010)180-185)。
已经在WO2011/128377中证明hCMV-MIE启动子的直接甲基化可以作为预测重组CHO细胞系的生产不稳定性的早期标记。
Osterlehner,A.等人报道了启动子甲基化和转基因拷贝数预测在重组中国仓鼠卵巢细胞系中的不稳定蛋白生产并描述了不同的CpG位点是以不同的频率甲基化(Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681)。
发明概述
已经发现，在hCMV-MIE启动子的特定位点的C到G点突变，即，单个C到G的突变，造成降低的启动子沉默以及同样造成提高的生产稳定性。此外，已经发现，可以实现所产生多肽的更高效价。相对于转录起始位点，在位置-41和/或位置-179的C到G的突变已证明是特别有效的。
如本文所报道的一个方面是人CMV启动子(基于SEQ ID NO:01的启动子)，其相对于转录起始位点，具有在核苷酸位置-41(和/)或-179的核苷酸G。
在此方面的一个实施方式中，(在与相对于转录起始位点在位置-41和/或-179无C到G点突变的人CMV启动子进行比较时)人CMV启动子具有提高的生产稳定性和/或改善的产品效价。
在此方面的一个实施方式中，人CMV启动子具有SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的核酸序列。
如本文所报道的一个方面是具有SEQ ID NO:02的核酸序列的启动子。
如本文所报道的一个方面是一种核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:02的核酸组成，并且当有效连接至编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸时具有SEQID NO:01的人CMV主要立即早期启动子的至少80％的启动子强度。
如本文所报道的一个方面是用于生产多肽的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a)用包括表达盒的核酸转染真核细胞，该表达盒包含SEQ ID NO:02的第一核酸，该第一核酸有效连接到编码所述多肽的第二核酸，
b)选择在步骤a)中转染的细胞，
c)(在适合于多肽表达的条件下)培养步骤b)的经选择的细胞，
d)从细胞或培养基中回收多肽，
和由此生产多肽。
在此方面的一个实施方式中，生产是大规模生产。在一个实施方式中，生产是以500l或更大的最终培养体积，在一个实施方式中为500l至10,000l。
在此方面的一个实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。
在此方面的一个实施方式中，多肽是免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链或其变体或其片段或其融合物。
在此方面的一个实施方式中，核酸包含编码选择标记的另一表达盒。在此方面的一个实施方式中，核酸包含编码免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链的另一表达盒。
在此方面的一个实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或
Figure BDA0001138507270000031
细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述选择标记是二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。
如本文所报道的一个方面是使用SEQ ID NO:02的启动子用于生产多肽。
如本文所报道的一个方面是包含如本文所报道的启动子或如本文所报道的核酸的细胞。
如本文所报道的一个方面是具有SEQ ID NO:03的核酸序列的启动子。
如本文所报道的一个方面是一种核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:03的核酸组成，并且当有效连接至编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸时具有SEQID NO:01的人CMV主要立即早期启动子的至少80％的启动子强度。
如本文所报道的一个方面是一种生产多肽的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a)用包括表达盒的核酸转染真核细胞，该表达盒包含SEQ ID NO:03的第一核酸，该第一核酸有效连接到编码该多肽的第二核酸，
b)选择在步骤a)中转染的细胞，
c)(在适合于多肽表达的条件下)培养步骤b)的经选择的细胞，
d)从细胞或培养基中回收多肽，
和由此生产多肽。
在此方面的一个实施方式中，生产是大规模生产。在一个实施方式中，生产是以500l或更大的最终培养体积，在一个实施方式中为500l至10,000l。
在此方面的一个实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。
在此方面的一个实施方式中，多肽是免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链或其变体或其片段或其融合物。
在此方面的一个实施方式中，核酸包含编码选择标记的另一表达盒。在此方面的一个实施方式中，核酸包含编码免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链的另一表达盒。
在此方面的一个实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或
Figure BDA0001138507270000051
细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述选择标记是二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。
如本文所报道的一个方面是使用SEQ ID NO:03的启动子用于生产多肽。
如本文所报道的一个方面是包含如本文所报道的启动子或如本文所报道的核酸的细胞。
如本文所报道的一个方面是一种人CMV启动子，其相对于转录起始位点在核苷酸位置-41处具有核苷酸G。
在此方面的一个实施方式中，人CMV启动子是人CMV主要立即早期启动子。
如本文所报道的一个方面是一种人CMV启动子，其相对于转录起始位点在核苷酸位置-179处具有核苷酸G。
在此方面的一个实施方式中，人CMV启动子是人CMV主要立即早期启动子。
发明详述
当使用稳定转染的真核细胞系用于重组多肽(如分泌的蛋白质、细胞内报告蛋白或细胞表面标记)的生产/表达时，在长期培养中生产力的逐渐损失是开发生产细胞系的普遍问题(Barnes,L.M.等人，Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639)。对于细胞系/细胞克隆的生产，即用于多肽(如例如抗体)的大规模重组生产的细胞克隆/细胞系，该细胞克隆/细胞系的生产稳定性，即，一代代的生产力损失，是非常重要的。因此，用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞系需要在延长的培养时间期间保持生产率。通常细胞克隆/细胞系的生产稳定性是通过培育该细胞克隆/细胞系很长一段时间来确定的。以规则的时间间隔，将培养基用新鲜的培养基稀释，并基于产物效价和活细胞密度来测定每个细胞的比生产力。比生产力的变化(通常是减小)指示细胞克隆/细胞系的长期生产稳定性。
重组蛋白表达的减少可能是由于转基因拷贝的丢失和/或转基因启动子的沉默(参见例如Escher,G.等人，J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.等人，FASEB J.20(2006)106-108；Yang,Y.等人，J.Biotechnol.147(2010)180-185)。启动子的沉默是由染色质的外遗传修饰如组蛋白的翻译后修饰，以及启动子DNA在CpG位点的直接甲基化造成的(参见例如Cedar,H.和Bergman,Y.，Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304；De Carvalho,D.D.等人，Trends Cell Biol 20(2010):609-617；Klose；R.J.and Bird,A.P.,Trends BiochemSci 31(2006):89-97)。甲基化的启动子通常是处于失活状态。
Osterlehner，A等人早先已经表明，启动子甲基化和转基因拷贝数预测在重组中国仓鼠卵巢细胞系中的不稳定蛋白生产并描述了不同的CpG位点是以不同的频率甲基化(Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681)。
本文调查了不同的CpG位点单独或组合。产生了在人CMV主要立即早期启动子/增强内含有CpG点突变的各种细胞系并测试了长期生产力。
很重要的是启动子突变不显著影响其基因表达的效力，即，不应影响启动子强度。
本发明发现在具有如本文所报道的点突变的hCMV-MIE启动子中，启动子强度未受到影响。在人CMV主要立即早期启动子/增强子片段中具有点突变的质粒和未突变对照质粒之间，没有检测到显著差异。
本发明至少部分是基于以下发现：可以通过在人CMV主要立即早期启动子/增强的特定CpG位点处从C到G的点突变来降低启动子的沉默。由此可以提高细胞系的长期生产稳定性，并且可以在很长一段时间以高/更高的产率来生产重组多肽。
示例性的CHO细胞用质粒16107(含点突变C-179到G)或质粒16109(含点突变C-41到G)稳定转染并培养。测定在延长的培养时间中每个质粒中8-10个独立稳定转染的细胞池的eGFP强度。
在已被质粒16109或对照质粒16111转染的细胞中，检测了转染细胞的长期生产力的统计学显著差异(p值<0.05；见下表)。
已经发现，当相对于转录起始位点在位置-41引入C到G的点突变(即，消除甲基化位点)时，可以实现对报告基因表达的稳定性的积极影响。
表：用质粒16107、16109或16111转染的CHO细胞池的荧光几何平均数的最小显著差异(LSD)的p值
Figure BDA0001138507270000071
因此，如本文中报道的一个方面是具有SEQ ID NO:02的核酸序列的启动子，即具有C-41到G点突变的hCMV-MIE启动子。在一个实施方式中，启动子具有至少一个C到G的点突变。在一个实施方式中，启动子具有两个C到G的点突变。在一个实施方式中，启动子具有三个C到G的点突变。在一个优选的实施方式中，启动子具有C到G的单点突变。在一个优选的实施方式中，启动子相对于转录起始位点在位置-41具有C到G的单点突变。在一个优选的实施方式中，启动子相对于转录起始位点在-179位置具有C到G的单个点突变。
如本文所报道的另一个方面是一种核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:02的核酸组成，并且当有效连接至编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸时具有SEQ ID NO:01的人CMV主要立即早期启动子的至少80％的启动子强度。
如本文所报道的一个方面是一种用于生产多肽的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a)用包括表达盒的核酸转染真核细胞，该表达盒包含SEQ ID NO:02的第一核酸(即具有C-41至G点突变的hCMV-MIE启动子)，该第一核酸有效连接到编码该多肽的第二核酸，
b)选择在步骤a)中转染的细胞，
c)(在适合于多肽表达的条件下)培养步骤b)的经选择的细胞，
d)从细胞或培养基中回收所述多肽，
和由此生产多肽。
在此方面的一个实施方式中，生产是大规模生产。在一个实施方式中，生产是以500l或更大的最终培养体积，在一个实施方式中为500l至10,000l。
在此方面的一个实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。
在此方面的一个实施方式中，多肽是免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链或其变体或其片段或其融合物。应理解的是，如果要生产完整的免疫球蛋白分子，有必要包含具有编码各种的其它免疫球蛋白链的核酸的另一表达盒。例如，如果多肽是免疫球蛋白轻链，导入具有编码免疫球蛋白重链的核酸的另一表达盒。在此方面的一个实施方式中，核酸包含编码免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链的另一表达盒。
在此方面的一个实施方式中，核酸包含编码选择标记的另一表达盒。在此方面的一个实施方式中，所述选择标记是二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。如本文所报道的另一个方面是使用SEQ ID NO:02的启动子生产多肽的用途。
在此方面的一个实施方式，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在此方面的一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或
Figure BDA0001138507270000091
细胞。在此方面的一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
将另外的细胞系16107和16111进行直接比较。细胞系16107与对照细胞系16111相比更高的eGFP表达趋势显示出相对于转录起始位点在位置C-179的C到G点突变对于eGFP表达基因的稳定性的积极影响。
相对于转录起始位点的位置-41对应于SEQ ID NO:01的位置561。相对于转录起始位点的位置-179对应于SEQ ID NO:01的423。
因此，如本文中报道的一个方面是具有SEQ ID NO:03的核酸序列的启动子，即具有C-179到G点突变的hCMV-MIE启动子。
如本文所报道的另一个方面是一种核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:03的核酸组成，并且当有效连接至编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸时具有SEQ ID NO:01的人CMV主要立即早期启动子的至少80％的启动子强度。
如本文所报道的另一个方面是一种用于生产多肽的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a)用包括表达盒的核酸转染真核细胞，所述表达盒包含SEQ ID NO:03的第一核酸，该第一核酸有效连接到编码所述多肽的第二核酸，
b)选择在步骤a)中转染的细胞，
c)(在适合于多肽表达的条件下)培养步骤b)的经选择的细胞，
d)从细胞或培养基中回收多肽，
和由此生产多肽。
在此方面的一个实施方式中，生产是大规模生产。在一个实施方式中，生产是以500l或更大的最终培养体积，在一个实施方式中为500l至10,000l。
在此方面的一个实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。
在此方面的一个实施方式中，多肽是免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链或其变体或其片段或其融合物。
在此方面的一个实施方式中，核酸包含编码选择标记的另一表达盒。
在此方面的一个实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述的哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或
Figure BDA0001138507270000101
细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述的哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
在此方面的一个实施方式中，所述选择标记是二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。
如本文所报道的另一个方面是SEQ ID NO:03的启动子用于生产多肽的用途。
定义
“启动子”是指一种核酸，即多核苷酸序列，它控制与其有效连接的核酸的转录。启动子可以包括用于RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所使用的启动子将在(其中考虑了有效连接的核酸的表达的)宿主细胞的细胞类型中是有功能的。在本领域中公知大量的启动子，包括来自各种不同来源的组成型、诱导型和阻抑型启动子(并且在诸如GenBank的数据库中被鉴定)。它们可作为克隆的多核苷酸获得或在克隆的多核苷酸内(来自，例如，保藏机构例如ATCC以及其它商业或个体来源)。“启动子”包括指导例如有效连接的结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区或5'-非翻译区(5'UTR)，接近结构基因的转录起始位点。在转录起始中起作用的启动子内的序列元件通常以共有核苷酸序列来表征。这些序列元件包括RNA聚合酶结合位点，TATA序列，CAAT序列，分化特异性元件(DSEs；McGehee，R.E.等人，Mol.Endocrinol.7(1993)551)，环AMP应答元件(CRE)，血清应答元件(SREs；Treisman,R.,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47)，糖皮质激素应答元件(GRE)和其他转录因子，如CRE/ATF的结合位点(O'Reilly,M.A.等人，J.Biol.Chem.267(1992)19938)，AP2(Ye,J.等人，J.Biol.Chem.269(1994)25728)，SP1，cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253-264)和八聚体因子(通常参见，Watson等人编，Molecular Biology of the Gene，第4版，The Benjamin/Cummings PublishingCompany,Inc.1987，和Lemaigre,F.P.and Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14)。如果启动子是诱导型启动子，那么响应于诱导剂，转录速率增加。与此相反，如果启动子是组成型启动子，转录速率不受诱导剂调控。阻抑型启动子也是已知的。例如，c-fos启动子在生长激素结合到其在细胞表面上的受体被特异活化。四环素(tet)调节的表达可以通过人工杂交启动子来实现，所述杂交启动子由例如CMV启动子后面是两个Tet操纵基因位点组成。Tet-阻遏物结合至两个Tet操纵基因位点并阻断转录。在加入诱导物四环素时，tet-阻遏物从Tet操纵基因位点释放并且转录继续(Gossen,M.and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)5547-5551)。对于其他诱导型启动子，包括金属硫蛋白和热休克启动子，参见，例如，Sambrook等人(同上)，和Gossen,M.等人，Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。已经被鉴定为用于高水平表达的强启动子的真核启动子包括SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子，劳斯肉瘤病毒长末端重复，中国仓鼠延伸因子1α(CHEF-1，参见如US 5,888,809)，人EF-1α，泛素和人类巨细胞病毒主要立即早期启动子(CMV-MIE)。“增强子”(即，作用于启动子以增加转录的顺式作用DNA元件)可能必需与启动子结合来发挥功能以增加单独通过启动子得到的表达水平，并可以被包括作为转录调控元件。通常，含有启动子的多核苷酸片段也将包括增强子序列(例如，CMV或SV40)。
术语“CpG位点”表示核酸内可以被细胞的甲基化酶所识别的二核苷酸CG，并且其中胞嘧啶可以被转化为5-甲基胞嘧啶。在一个实施方式中，CpG位点是在启动子核酸内。
如本文所用的术语“核酸”是由单个核苷酸组成的聚合物，即多核苷酸。它指的是天然存在的，或者部分或完全非天然存在的核酸，这是例如编码可以重组产生的多肽。该核酸可以由DNA片段构成，该DNA是分离的或者是通过化学方法合成的。核酸可以被整合到另一个核酸，例如在表达质粒或宿主细胞的基因组/染色体中。质粒包括穿梭和表达载体。典型地，该质粒还包含原核繁殖单元，其包括分别用于在细菌中复制和选择载体的复制起点(例如，ColE1复制起点)和筛选标记(例如，氨苄青霉素或四环素抗性基因)。
在本发明中所用的术语“启动子强度”及其语法等同物是指启动子在有效连接的核酸的转录中的效力。如果与SEQ ID NO:01的野生型hCMV-MIE启动子的启动子强度相比，启动子的启动子强度可以是高的，也就是说，它可以从75％至超过100％，中度的，也就是说，它可以从40％至小于75％，或是低的，也就是说，它可以高达小于40％。该值可以通过比较有效连接到目的启动子的异源多肽的表达量与有效连接到相同细胞类型的野生型SV40启动子的异源多肽的表达量来确定。这可以例如通过ELISA测定法测定转染了表达盒的CHO-或HEK细胞中的异源多肽的表达量来完成，该表达盒由有效连接到编码异源多肽的核酸的目的启动子组成。通过将该量与在相同细胞系中的相同异源多肽的表达量(由相同的ELISA测定法测定)进行比较，即，将相同细胞中的异源多肽的量与其中仅启动子改变的相同的表达质粒相比，可以测定相对启动子强度，所述细胞系转染了由有效连接到编码异源多肽的核酸的野生型SV40启动子的表达盒组成。
“有效连接的”是指两个或更多个组分的并列，其中如此描述的组分处于一种允许它们以其预期方式发挥功能的关系。例如，启动子和/或增强子有效连接到编码序列，如果它顺式控制或调节所连接的编码序列的转录的话。通常，但不一定，被“有效连接”的DNA序列是邻接的，并在需要连接两个蛋白编码区域(例如分泌前导/信号序列和多肽)时，是邻接的且在读码框内。然而，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，它不一定是与之邻接。增强子不必是邻接的。如果增强子增加了编码序列的转录，那么增强子有效连接到编码序列。有效连接的增强子可以位于编码序列的上游，之内或下游，并距启动子相当的距离。如果多聚腺苷酸化位点以转录进行通过编码序列到聚腺苷酸化序列这样一种方式位于编码序列的下游，那么多聚腺苷酸化位点有效连接到编码序列。连接是通过本领域中已知的重组方法，例如，使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点连接而完成的。如果不存在方便的限制性位点，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
在本发明的范围内，转染的细胞可以用本领域已知的基本上任何类型的转染方法来获得。例如，核酸可以通过电穿孔或显微注射的方法被引入细胞中。备选地，可使用脂转染试剂如FuGENE 6(Roche Diagnostics GmbH，德国)，X-tremeGENE(Roche DiagnosticsGmbH，德国)和LipofectAmine(Invitrogen Corp.，美国)。还备选地，核酸可以通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺伴随病毒的适当病毒载体系统(Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314)被引入到细胞中。
术语“细胞”或“宿主细胞”指可以或是在其中引入/转染例如编码异源多肽或组成性shRNA的核酸的细胞。宿主细胞包括原核细胞，其被用于载体/质粒的繁殖，和真核细胞，其被用于核酸的表达。在一个实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方式中，哺乳动物宿主细胞是选自包含CHO细胞(如CHO K1或CHO DG44)、BHK细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞、PER.C6细胞和COS细胞的哺乳动物细胞。在进一步的实施方式中，哺乳动物细胞选自杂交瘤、骨髓瘤和啮齿动物细胞。骨髓瘤细胞包括大鼠骨髓瘤细胞(例如YB2)和小鼠骨髓瘤细胞(例如NS0、Sp2/0)。在一个实施方式中，用于药物应用的多肽在哺乳动物细胞如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、
Figure BDA0001138507270000131
细胞等中产生。对于宿主细胞的发酵以及因此对于目的多肽的表达，使用了培养基。今天CHO细胞被广泛地用于药物多肽的表达，无论是实验室小规模或在生产过程中的大规模。由于它们的广泛分布和使用，CHO细胞的特性和遗传背景是众所周知的。因此，CHO细胞被监管部门批准用于生产应用于人类的治疗性蛋白。在一个实施方式中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
“表达盒”是指一种核酸，其包含在宿主细胞中表达和分泌至少所含有的结构基因所必需的元件。核酸同样通过由其单个核苷酸的序列或由核酸分子编码的氨基酸序列表征。
“基因”表示核酸，其是例如染色体上或质粒上可实现肽、多肽或蛋白质表达的区段。在编码区旁边，即结构基因，基因包括其它功能元件例如信号序列、启动子、内含子和/或终止子。
“结构基因”表示基因没有信号序列的区域，即编码区。
如本文所用的术语“表达”指的是发生在细胞内的转录和/或翻译。在宿主细胞中的所需产物的转录水平可以基于存在于细胞内的相应mRNA的量来确定。例如，从所选核酸转录的mRNA可以通过PCR或通过Northern杂交来定量(参见Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。由所选核酸编码的蛋白质可以通过各种方法来定量，例如，通过ELISA，通过用于蛋白质的生物活性测定法，或通过采用测定独立于这种活动的测定法，例如Western印迹或放射性免疫测定法，通过使用识别并结合所述蛋白质的抗体(参见Sambrook等人，1989，上文)。
无论是天然或合成产生的，“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。少于约20个氨基酸残基的多肽可被称为“肽”。包含两个或多个氨基酸链或包含100个氨基酸或以上长度的氨基酸链的多肽可被称为“蛋白质”。多肽或蛋白质也可包含非肽组分，例如碳水化合物基团或金属离子。碳水化合物和其他非肽类取代基可以通过产生所述蛋白质的细胞被添加到蛋白质中，并且可以随着细胞的类型而变化。蛋白质和多肽在本文中是针对它们的氨基酸主链结构定义的；添加如碳水化合物基团通常并无规定，但仍然可以存在。在一个实施方式中，多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。在一个实施方式中，多肽是免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链或其片段、融合物或其缀合物。
术语“选择标记”表示一种核酸，它允许携带该核酸的细胞在相应的“筛选剂”的存在下被特异性选择出来或选择除去。有用的阳性选择标记是例如抗生素抗性基因。选择标记允许以其所转化的细胞在相应的选择剂的存在下进行选择；未转化的细胞不能够在选择性培养条件下(即在选择剂存在下)生长或存活。选择标记可以是阳性、阴性或双功能的。阳性选择标记允许对携带该标记的细胞的筛选，而阴性选择标记允许选择性地消除携带该标记的细胞。典型地，选择标记将赋予药物抗性或补偿细胞中的代谢或分解缺陷。真核细胞中有用的选择标记包括，例如，氨基糖苷磷酸转移酶(APH)，如潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418APH、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(选择剂吲哚)、组氨醇脱氢酶(选择剂组氨醇D)的基因和提供对嘌呤霉素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸抗性的基因。进一步的选择标记在WO 92/08796和WO 94/28143中报道。
术语“在适合于所述多肽表达的条件下”表示被用于表达异源多肽的哺乳动物细胞培养和本领域的技术人员已知的或可以容易地确定的条件。本领域技术人员还已知，这些条件可根据培养的哺乳动物细胞的类型和表达的蛋白质的类型而变化。通常，哺乳动物细胞是在例如20℃和40℃之间的温度培养，并在从0.1升至107升的体积中培养足以允许有效生产蛋白质的一段时间，例如4至28天。
在本申请中使用的术语“多肽的回收”是指沉淀、盐析、超滤、渗滤、冻干、溶剂体积减少得到浓缩液，或层析法。通常，层析方法被用于多肽的分离和纯化。不同的方法已经确立并广泛用于蛋白质的回收和纯化，如用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香族吸附层析(例如，使用苯基-琼脂糖，氮杂－arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合物亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和性材料)，尺寸排阻层析，和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
术语“免疫球蛋白”是指包括至少两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)的分子。每个重链和轻链多肽包含可变结构域(可变区)(一般为多肽链的氨基末端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。每个重链和轻链多肽还包含恒定区(通常是羧基端部分)。重链的恒定区介导免疫球蛋白ⅰ)与带有Fcγ受体(FcγR)的细胞，如吞噬细胞或ii)或与带有新生Fc受体(FcRn，也被称为Brambell受体)的细胞的结合。它也介导与一些因子的结合，包括诸如组分(C1q)的经典补体系统的因子。
术语“免疫球蛋白”在本文中以最广义使用，并且包括各种免疫球蛋白结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和免疫球蛋白片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
根据重链的恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分为不同类：IgA类、IgD类、IgE类、IgG类和IgM类。这些类中的一些被进一步分成亚类(同种型)，即在IgG中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或在IgA中的IgA1和IgA2。根据免疫球蛋白所属的类，重链恒定区分别被称为
Figure BDA0001138507270000161
δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。在一个实施方式中，免疫球蛋白是IgG类的免疫球蛋白。在另一个实施方式中，免疫球蛋白具有人恒定区或源自于人源的恒定区。在进一步的实施方式中，免疫球蛋白是IgG4亚类或IgG1或IgG2或IgG3亚类，它们以下述的方式被修饰，即没有Fcγ受体(例如FcγRIIIa)结合和/或没有Clq结合可以被检测到。在一个实施方式中，免疫球蛋白是人IgG4亚类或突变的人IgG1亚类。在一个实施方式中，免疫球蛋白是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在另一个实施方式中，免疫球蛋白是关于IgG4亚类的或IgG1的或IgG2亚类的Fcγ受体结合(在L234、L235和/或D265中有突变)，和/或包含PVA236突变。在进一步的实施方式中，免疫球蛋白具有选自S228P，L234A，L235A，L235E，SPLE(S228P和L235E)，和/或PVA236(PVA236意指来自IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸代码给出)或IgG4的EFLG被PVA取代)的突变。在一个实施方式中，免疫球蛋白是IgG4亚类的，并具有IgG4的突变S228P，或者免疫球蛋白是IgG1亚类的，并具有突变L234A和L235A。
免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域相应地包含不同的区段，即，四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。
“免疫球蛋白片段”表示在包含下组结构域中的至少一个结构域的多肽，所述组包括免疫球蛋白的重链的可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或免疫球蛋白轻链的可变结构域或CL结构域。也包括衍生物及其变体。可以存在另外的可变结构域，其中一个或多个氨基酸或氨基酸的区域被缺失。
“免疫球蛋白缀合物”表示包含通过肽键缀合到另一多肽的免疫球蛋白重链或轻链的至少一个结构域的多肽。另一多肽是非免疫球蛋白肽，例如激素、生长受体、抗融合肽等。
提供以下实施例、附图和序列表，以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附的权利要求中给出。可以理解的是可以在所提出的步骤中进行修改而不脱离本发明的精神。
序列表的说明
SEQ ID NO:01人CMV主要立即早期(hCMV-MIE)启动子/增强子的核苷酸序列
SEQ ID NO:02相对于转录起始位点，在位置-41具有C到G点突变的hCMV-MIE启动子/增强子的核苷酸序列
SEQ ID NO:03相对于转录起始位点，在位置-179具有C到G点突变的hCMV-MIE启动子/增强子的核苷酸序列
SEQ ID NO:04包括去稳定化PEST序列的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的核苷酸序列
SEQ ID NO:05包括信号肽的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:06相对于转录起始位点，在位置-41和-179具有C到G点突变的hCMV-MIE启动子/增强子的核苷酸序列
附图说明
图1：分泌型碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒p5532的质粒图谱
图2：增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达质粒p16111的质粒图谱
图3：细胞培养物上清液的稀释过程
图4：无(斜线柱)或用DAC处理(垂直阴影柱)的瞬时转染的CHO细胞悬浮液的归一化的SEAP表达水平。表示出被用于转染的质粒。误差线代表八(无DAC)或4(有DAC)个生物学重复的标准差。也示出了模拟物转染的CHO-K1细胞(两个生物学重复)的背景信号。
图5：在正向散射(FSC)/侧向散射(SSC)点图中未转染的CHO-K1细胞的存活栅。相同的栅被施用于相同的FACS测定法的所有样本。
图6：稳定转染的CHO细胞的培养物的eGFP荧光的存活栅直方图。荧光用AlexaFluor 488通道在激发波长488nm下测量。两个峰能够被辨别为代表非eGFP表达者(左峰)和高eGFP表达者(右峰)的两个主要亚群。
图7：使用质粒16107、16109或16111稳定转染后六周CHO细胞的独立池的eGFP表达水平。点代表单个CHO池的荧光强度的几何平均数。
图8：使用质粒16107或16111稳定转染后六周CHO细胞的独立池的eGFP表达水平。点代表单个CHO池的荧光强度的几何平均数。
图9：IgG类抗体表达质粒p21504的质粒图谱
图10：用质粒16134(CGG)、16135(CGC)或16136(CCG)或21504(CCC)转染后68天(A)或134天(B)的稳定转染的CHO细胞池的抗体效价(μg/ml)。点代表单个CHO池的抗体效价的几何平均数。
图11：用质粒16134(CGG)、16135(CGC)或16136(CCG)或21504(CCC)转染后68天(A)或131天(B)的稳定转染的CHO细胞池的比生产力(qP)。点代表单个CHO池的比生产力的几何平均数。
图12：突变体与对照用Tukey HSD检验(ΔqP平均值)的平均值比较。
实施例1
通用技术
重组DNA技术
按照在Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)所述，使用标准方法操作DNA。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
DNA序列测定
DNA测序是在SequiServe GmbH(瓦特斯蒂恩，德国)进行。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套装)软件包和Invitrogen的Vector NTI 9.1版本用于序列创建、绘图、分析、注释和说明。
用于抗体分析的样品制备：
计算细胞浓度并且每样品取2ml进行离心(500g，在20-30℃下5分钟)。将上清液转移至新的96深孔板并在使用前储存在-20℃。将冷冻的上清液在4℃解冻过夜，6×倒置离心(4000rpm，在20-30℃下30分钟)。将310μl通过离心(1200rpm，在20-30℃下3分钟)过滤，将多孔Millipore板放在带条码的96圆孔板顶上。
实施例2
重组CHO细胞系的产生
用携带报告基因的载体，或瞬时转染或稳定转染CHO-K1细胞悬浮液，所述报告基因在人CMV主要立即早期启动子/增强子片段(野生型(SEQ ID NO:01)，或含有C到G点突变)的控制下，所述报告基因是分泌型碱性磷酸酶(SEAP：图1；SEQ ID NO:05)或者是增强的绿色荧光蛋白(eGFP：图2)或IgG类的人抗体构建体(在WO 2014023752报道的IgG细胞因子(IL2)融合蛋白；图9)。在hCMV-MIE片段内的CpG二核苷酸的C到G突变C-508、C-179和C-41被单独或以各种组合插入来提高长期稳定性(表1)。C到G的突变是通过它们距转录起始位点(TSS)的距离来鉴定的。突变是使用QuikChange Multi－Site－Directed Mutagnesis试剂盒(Agilent Technologies，Waldbronn，德国)插入的。载体进一步包括编码鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)的核酸序列(图1、2和9)。细胞转染用Amaxa核转染系统进行(Lonza CologneGmbH，科隆，德国)。
表1：在人CMV主要立即早期启动子/增强子片段内的CpG二核苷酸的C到G点突变的组合
Figure BDA0001138507270000201
Figure BDA0001138507270000211
例如，根据制造商的方案，使用Nucleofector设备组合Nucleofector试剂盒V(Lonza Cologne GmbH，科隆，德国)，将用于SEAP瞬时表达的环形质粒DNA或将用于eGFP稳定表达的线性化质粒DNA或用于IgG类抗体融合蛋白的稳定表达的适当质粒转染CHO-K1细胞。将瞬时转染的细胞悬浮液接种在96孔板中并培养5天。通过化学反应的颜色变化，在Tecan-Reader SECTRAFluor Plus(Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany)中检查SEAP浓度。
将稳定转染的细胞悬浮液接种到含有游离胸苷培养基的384或6孔板中(以250至1600nM甲氨蝶呤(MTX)作为选择剂)。三至四周后，检查表达eGFP的细胞库或表达抗体的细胞库在1-3个月的长期稳定性。通过流式细胞术检查eGFP的表达强度。在384和96孔板中接种表达抗体的单细胞克隆。三周后，通过ELISA测量培养基中的抗体效价来鉴定表达抗体的细胞系。随机挑选生长细胞，并且为了长期稳定性测定，以更高体积(在6孔板中每孔3ml)扩增细胞克隆并在每次传代结束时，用蛋白AHPLC和ELISA测定抗体浓度。
在标准加湿条件下(95％rH，37℃和5％至8％CO2)，将细胞以120rpm/min至150rpm/min的恒定搅拌速率在一次性125ml通气摇瓶中繁殖。每3-4天将细胞分传到新鲜培养基中。采用Cedex HiRes细胞计数器(Roche Innovates AG,Bielefeld,德国)测定培养物的密度和活力。此外，按照例如Current Protocols in Cell Biology,Binifacino,J.S.etal.(编),John Wiley&Sons,Inc.,New York(2000)所描述的应用标准细胞培养技术。
实施例3
长期培养和生产
调查根据实施例2得到的、在人CMV主要立即早期启动子/增强子片段内含有CpG点突变的各种CHO细胞池(表1)的长期生产力。
将细胞在选择剂的MTX的存在下转染后，测试生产稳定性2至3个月。细胞在125ml含带有选择剂的20-40ml培养基的摇瓶中通风连续培养，用新鲜培养基一周稀释两次。接种密度为2至3×105细胞/ml。传代之前测定活细胞的密度和生存力。
在每次传代结束，用蛋白A HPLC和ELISA测定上清液的抗体浓度(抗体效价)。从这些数据中，用下列公式计算每次传代的细胞比生产力(qP)：
Figure BDA0001138507270000231
qP[pg/细胞/d]：细胞比生产力，
P1[μg/ml]：在传代开始时的抗体效价，
P2[μg/ml]：在传代结束时的抗体效价，
D1[细胞/ml]：在传代开始时的活细胞密度，
D2[细胞/ml]：在传代结束时的活细胞密度，
Δt[d]：传代的持续时间。
该qP值是针对在世代中各传代结束时的培养物年龄绘制的。在全部qP数据点上计算线性趋势线，并且根据下面的等式内部计算在此期间的qP的相对改变(百分比)：
Figure BDA0001138507270000232
ΔqP[％]：QP的改变百分比，
M[pg/细胞/d/世代]：线性趋势线的斜率，
a[世代数]：培养物的年龄，
qP0：线性趋势线的y轴截距。
考虑到在hCMV-MIE启动子变体的稳定性试验中得到的数据点数目较少，对每个样品，将最后三个qP值的平均值除以前两个Qp值的平均值并且以百分数显示以得到ΔqP。
Figure BDA0001138507270000241
平均qP EOS：最后三个qP值的平均值
平均qP PSB：前两个qP值的平均值
实施例4
在不同的人CMV主要立即早期启动子/增强子片段的控制下，报告基因表达的定量。
a)在不同的人CMV主要立即早期启动子/增强子片段控制下的SEAP表达的定量
按照制造商的方案，使用Nucleofector设备结合Nucleofector Kit V(LonzaCologne GmbH，科隆，德国)在Amaxa Shuttle 96孔板中，用环形质粒DNA转染CHO-K1细胞用于SEAP的瞬时表达。将每质粒12瞬时转染的细胞悬浮液在96孔板中接种并培养5天。在第2天，每质粒一式四份加入5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(DAC)到最终浓度1μM以使DNA脱甲基化。在Tecan Reader SECTRAFluor Plus(Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim，德国)上检查SEAP浓度。
按以下方案通过pNPP(对硝基苯基磷酸)向pNP(对硝基苯酚)的代谢率来检查SEAP的相对浓度：
表2：用于SEAP测定法的溶液：
Figure BDA0001138507270000251
在多个步骤中将150μl的经离心的细胞培养物上清液以1：3稀释(图3)。
在新的96孔板中添加50μl稀释液并与50μl底物溶液混合。5分钟后，使用SECTRAFluor Plus光度计(Tecan Deutschland GmbH，Crailsheim，德国)，以405nm波长测量光密度。
将未经DAC处理的每质粒8个重复的平均数与经DAC处理的每质粒4个重复的平均数(表1)进行归一化来控制没有点突变的质粒(p5532)(图4)。
没有检测到在人CMV主要立即早期启动子/增强子片段中具有点突变的质粒和未突变的对照质粒5532之间的显著差异。此外，在具有和没有DAC处理的样品之间没有观察到显著差异，表明转染后5天之内没有发生显著的启动子沉默。因此可以得出结论，被引入到人CMV主要立即早期启动子/增强子片段的点突变不影响启动子强度(点突变对人CMV立即早期启动子/增强子片段的直接效力没有影响)。
b)通过FACS对在不同的人CMV主要立即早期启动子/增强子片段的控制下的eGFP表达的量化
将表达eGFP的稳定转染的细胞悬浮液培养1-3个月的时间。使用BD FACS CantoII或BD FACS Calibur(BD,Heidelberg，德国)测量eGFP的表达强度。使用BD FACS Diva软件v6.12或Cell Quest Pro Software(BD,Heidelberg，德国)进行数据收集。用FlowJo7.6.5EN软件(TreeStar，Olten，瑞士)进行主要的数据分析。
对于实施例，用BD FACS Calibur在多个时间点检查CHO细胞悬液16105、16106、16107、16108、16109、16110和16111以检测eGFP的表达。所有样品以3-4个生物学重复进行检查。测量每个样品10000个事件。活细胞的栅极用未转染的CHO-K1细胞定义并且施用到相同的FACS实验中的所有样品(图8)。
活细胞的eGFP荧光以488nm(Alexa Fluor 488通道)的激发波长和大约516nm的发射波长进行测量。图6示出了活栅极事件的荧光强度的直方图。
荧光数据用FlowJo 7.6.5EN软件进行分析。用FlowJo计算在活栅极中eGFP表达的几何平均数、平均值和中值。进一步的统计分析用JMP软件版本10(SAS，
Figure BDA0001138507270000261
德国)完成。
实施例5
eGFP表达和人CMV主要立即早期启动子/增强子片段的C到G的点突变的相关性。
如实施例2所述产生8个(质粒16107)或10个(质粒16109或16111)个稳定转染的CHO细胞的池并且培养。如实施例4所述测量eGFP强度。
将eGFP强度的几何平均数用于相关性研究并以图表显示(图7&8)。为确定质粒16107和16109相比于对照质粒16111之间的显著差异，使用Dunnett's检验。
计算在长期培养期间的不同时间点的eGFP的强度的几何平均数的P值(表3)。将显著差异的限制设置为p<0.005。
表3：转染了质粒16107、16109或16111的CHO池的几何平均数的p值
Figure BDA0001138507270000271
例如，检测在转染6-周和8周(取样日期03-14至03-25)之间的质粒16109和对照质粒16111之间的显著差异(参见表3)。长期稳定性测定法的结果与SEAP测定法的结果相结合显示出C到G点突变C-41对报告基因表达的稳定性有积极影响，而不会影响启动子强度。
质粒16107和16111在第二次计算中成对比较。对荧光强度的几何平均值作图并使用Dunnett's检验计算p值(见表4)。
表4：CHO细胞系16107和16111的几何平均数的p值
Figure BDA0001138507270000272
Figure BDA0001138507270000281
质粒16107显示出相对于对照质粒提高的生产稳定性，即C到G点突变C-179增加了报告基因表达的稳定性，而不会影响启动子强度。
实施例6
在不同的人CMV主要立即早期启动子/增强子片段的控制下抗体生产的量化
a)用HPLC量化抗体产生：
使用层析方法来量化样品中存在的抗体量。使用结合抗体的Fc区的PorosA柱。抗体结合到柱上，随后通过低pH条件洗脱。通过测定280nm处的光密度(OD)，用320nm为参照波长，使用基于氨基酸序列计算出的摩尔消光系数来建立蛋白质浓度。
b)用ELISA量化抗体产生：
ELISA(酶联免疫吸附测定)技术是基于抗体夹层原理。对目标分析物特异的捕获抗体例如IgG的Fc部分结合至微量滴定板(Maxisorp，Inhouse，Roche)以创建固相。在封闭和洗涤步骤后，将样品、标准品(参照Ab的稀释系列)和对照随后用固相抗体孵育，其捕获分析物。洗去未结合的分析物后，加入缀合的检测抗体(例如，POD缀合的)。该检测抗体结合到被测量的分子的不同的表位，完成夹层。BM Chemiluminescence ELISA Substrate POD(Roche,Penzberg,德国)提供了基于过氧化物酶(POD，HRP)的二级检测系统的底物溶液。在免疫测定中的信号产生的速率与结合于固相的标记酶的量成正比。
实施例7
抗体生产/效价和人CMV主要立即早期启动子/增强子片段的C到G点突变的相关性。
通过使用ELISA技术来检查抗体(IgG-IL2融合蛋白)浓度并计算出抗体效价(ug/ml)，以及每个细胞和天(qP)的比生产力。显示出培养阶段开始和结束时的测量以可视化突变体与对照的差异和培养过程中表达的变化。由此，培养阶段开始和结束效价表明在所有突变体中抗体生产相比于对照的改进(图10A和B)。
通过Tukey HSD检验来比较克隆细胞系的效价(表5)。计算突变与未突变启动子变体的效价差异的P值。比较在培养阶段的效价。显著性水平设定为0.05(5％)。
表5
Figure BDA0001138507270000291
例如，在除了转染后第127天的整个培养阶段，CGC突变体与对照显著不同。
效价的比较表明，所有突变细胞悬液具有每体积高于对照的抗体生产力。
需要澄清的是表达强度或细胞浓度是否是效价差异的主要效应子。
为此目的，比较了整个培养阶段突变体与对照的每个细胞和天数(qP)的抗体表达。从培养阶段开始(图11A)到结束(图11B)的qP值表现与效价值相当，与对照的明显差异较少。
获得培养开始时的CGC和CGG突变体的较高效价。在培养结束时，CCG和CGG突变体获得了比对照稍高的qPs。CGC突变细胞在培养阶段结束时具有较高的qP值。
将突变和未突变的细胞系的比生产力与Tukey HSD检验进行比较(表6)。从而，CGC突变体与未突变的对照的差异随时间增加。对于CCG突变，也得到qP值的增加。
表6Tukey HSD检验计算hCMV MIE启动子突变体qPs相比未突变对照的P值
Figure BDA0001138507270000301
显著性水平设定为0.05(5％)。
考虑到单突变的细胞系与未突变的细胞系的qP值的时间依赖性增加差异，提出了更高的稳定性。为了检验这一假设，计算比生产力的相对改变。
通过对前两个(PSB＝68&83天)和最后三个(EOS＝124、127及131天)qP值取平均数，比生产力在第一天和分裂依赖性变化稳定化。在第二步骤中，将qP的改变被定义为稳定的结束到稳定的开始点的百分比比率。
Figure BDA0001138507270000302
平均的qP EOS：最后三个qP的平均数
平均的qP PSB：前两个qP的平均数
相比于未突变的对照，包括CGC和CCG启动子突变体的单克隆细胞系的长期稳定性较高(图12)。G-41启动子突变体在整个培养阶段是稳定的，而G-179点突变造成IgG表达随时间增加(平均％ΔqP)。双突变CGG在开始时具有高表达值，但随着时间的推移而降低。
表7
Figure BDA0001138507270000311
以0.05(5％)的显著性水平比较克隆细胞系的％ΔqPs。
包括hCMV-MIE启动子变体CGC(16135)及CCG(16136)的单克隆细胞系比未突变的对照(21504)显著更稳定。
Figure IDA0001138507320000011
Figure IDA0001138507320000021
Figure IDA0001138507320000031
Figure IDA0001138507320000041

Claims (14)

1.启动子，其由SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的核酸序列组成。
2.一种核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的核酸组成，并且当有效连接至SEQ ID NO:04的核酸时，具有SEQ ID NO:01的人CMV-主要立即-早期启动子的至少80％的启动子强度。
3.一种生产多肽的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a)用包含表达盒的核酸转染真核细胞，所述表达盒包含SEQ IDNO:02或SEQ ID NO:03的第一核酸，所述第一核酸有效连接到编码所述多肽的第二核酸，
b)选择在步骤a)中转染的细胞，
c)培养步骤b)的被选择的细胞，
d)从所述细胞或培养基中回收所述多肽，
由此生产所述多肽。
4.根据权利要求3的方法，其中所述生产是大规模生产。
5.根据权利要求3至4中任一项的方法，其中所述多肽是免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链或其变体或其片段或其融合物。
6.根据权利要求3至4中任一项的方法，其特征在于所述核酸包含编码选择标记的另一表达盒。
7.根据权利要求3至4中任一项的方法，其特征在于所述真核细胞是哺乳动物细胞。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或
Figure FDA0002265567340000011
细胞。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
10.根据权利要求3至4中任一项的方法，其特征在于所述多肽是免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。
11.根据权利要求6的方法，其特征在于所述选择标记是二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。
12.SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的启动子在生产多肽中的用途。
13.一种细胞，其包含根据权利要求1的启动子或根据权利要求2的核酸。
14.一种表达盒，其包含SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的核酸。
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