CN102597000A - 糖基化重复基序分子缀合物 - Google Patents

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Abstract

本文报道了具有下列通式的糖基化重复基序分子缀合物：（重复基序分子-接头n）m-缀合部分-（接头o-重复基序分子）p，其中n和o是彼此独立的0或1的整数值，并且独立于m和p的各个值，且m和p是彼此独立的0或1或2或3或4或5或6或7的整数值，且其中重复基序分子缀合物包括至少一个与糖基化位点连接的寡糖。还报道了编码核酸和用于在哺乳动物细胞中生产这类重复基序缀合物的方法。

Description

糖基化重复基序分子缀合物
本文报道了GEMOC（糖基化重复基序分子缀合物），其是重组生产的并包括体内糖基化，即来自表达EMOC（重复基序分子缀合物）的细胞类型的糖基化，以及生产这类聚合物的方法和这类聚合物的用途。
发明背景
已开发了不同的重复基序分子作为经典抗原结合分子（例如免疫球蛋白）的备选物提供。
示例性的重复基序分子是设计的锚蛋白重复蛋白（DARPins）。DARPins可以以功能性形式在大肠杆菌菌株的细胞质中表达。DARPins的重复基序包括33个残基的氨基酸序列。重复包括β转角基序和其后的一对反向平行α-螺旋和导致下一个重复折返的环。锚蛋白重复基序分子中一般存在1至30个以上的重复基序，最常见是4至6个。
Kohl等人（Kohl,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)1700-1705）基于对约2000个天然存在的锚蛋白重复序列的比对开发了人工的锚蛋白重复模块。该人工的共同锚蛋白重复序列包括27个固定的氨基酸残基和6个可变的氨基酸残基，形成（一部分的）结合位点（Forrer,P.等人，ChemBioChem 5(2004)183-189）。
为了获得DARPins与预定靶分子的结合，将人工的共同锚蛋白重复序列的可变氨基酸残基随机化，通过核糖体展示鉴别特定的结合子（参见例如，WO 02/020565；Hanes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)4937-4942）。
在US 2009/0148905中报道了抗原结合构建体。WO 2008/135237中报道了补体因子H衍生的短共同重复抗体构建体。WO 2007/122511中报道了抗体-RNA酶-缀合物。US 2008/0206201中报道了包含重组核酸的新城病病毒，当通过感染病毒的肿瘤细胞表达时，核酸编码的结合蛋白具有治疗活性。在US 2008/0248026中，报道了PTEN/AKT方法和涉及BMP的组合物。WO2005/076902和US 2008/0103098中报道了以二硫键桥接的双链形式重组表达的蛋白质。WO 2009/068649中报道了抗原结合构建体。
发明概述
本文报道了糖基化形式的重复基序分子缀合物，即，在哺乳动物细胞中表达的。
因此，本文报道的第一个方面是下列通式的糖基化重复基序分子缀合物：
(重复基序分子-接头n)m-(缀合部分)q-(接头o-重复基序分子)p
其中n和o是彼此独立的0或1的整数值，并且独立于m和p和q的各个值，且m和p是彼此独立的整数值0或1或2或3或4或5或6或7，且q是0或1的整数值，独立于n、m、o和p，
其中重复基序分子缀合物包括至少一个与糖基化位点连接的寡糖，
且其中至少m=q=1或p=q=1。
在一个实施方案中，重复基序分子是锚蛋白-重复基序分子或富含亮氨酸的重复基序分子。在其他实施方案中，锚蛋白-重复基序分子具有SEQ ID NO:4或其变体的氨基酸序列。在另一个实施方案中，接头是选自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:33的肽接头。在一个实施方案中，缀合部分（partner）是多聚的缀合部分。在仍然其他的实施方案中，多聚的缀合部分选自天然的或改造的成对重链CH2和CH3结构域、选自天然的或改造的成对重链CH1结构域和轻链恒定结构域、选自天然的或改造的重链铰链区，选自重链铰链区和CH2和CH3结构域的天然的或改造的序列、选自亮氨酸拉链结构域、选自异亮氨酸拉链结构域、选自4-螺旋束和选自p53四聚结构域，或选自其组合。
在一个实施方案中，根据本发明的缀合物的特征是具有通式：
((重复基序分子-接头n)m-(缀合部分)q-(接头o-重复基序分子)p)r
其中
i)n=1、m=1、q=1、p=0、r=1，或
ii)n=1、m=1、q=1、p=0、r=2，或
iii)n=0、m=1、q=1、p=0、r=1，或
iv)n=0、m=1、q=1、p=0、r=2，或
v)m=0、o=1、q=1、p=1、r=1，或
vi)m=0、o=1、q=1、p=1、r=2，或
vii)m=0、o=0、q=1、p=1、r=1，或
viii)m=0、o=0、q=1、p=1、r=2，或
ix)m=1、n=0、o=1、q=1、p=1、r=1，或
x)m=1、n=0、o=1、q=1、p=1、r=2，或
xi)m=1、n=1、o=1、q=1、p=1、r=1，或
xii)m=1、n=1、o=1、q=1、p=1、r=1，
其中，缀合部分选自天然的或改造的成对重链CH2和CH3结构域、天然的或改造的成对重链CH1结构域和轻链恒定结构域，天然的或改造的重链铰链区，重链铰链区和CH2和CH3结构域的天然的或改造的序列，
且其中重复基序分子是锚蛋白-重复基序分子。
在其他实施方案中，缀合物的特征是至少一个寡糖是通过在CHO细胞或HEK293细胞中表达缀合物而获得的寡糖的混合物。
在一个实施方案中，缀合物的特征是
m=0、q=1、p=1和o=0或o=1，和r=1或2，
其中缀合部分选自SEQ ID NO:50或51或52的N端和SEQ ID NO:43或44的C端的缀合物，或者SEQ ID NO:53或54或55的N端和SEQ ID NO:45或46的C端的缀合物，且
其中重复基序分子是锚蛋白-重复基序分子。
本文报道的另一个方面是糖基化重复基序分子缀合物，其特征是包括两个本文报道的糖基化重复基序分子缀合物。
在另一个实施方案中，糖基化重复基序分子缀合物包括两个根据任一项前述实施方案的糖基化重复基序分子缀合物。
在其他实施方案中，糖基化重复基序分子缀合物还包含
a)如果重复基序分子的缀合部分选自SEQ ID NO:50、51和52，则包括SEQ ID NO:53或54或55的N端和SEQ ID NO:45或46的C端的两个缀合物，或者
b)如果重复基序分子的缀合部分选自SEQ ID NO:53、54和55，则包括SEQ ID NO:50或51或52的N端和SEQ ID NO:43或44的C端的两个缀合物。
本文报道的其他方面是包括下列元件的核酸：
-来自人细胞巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-抗体种系基因的5’非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-重复基序分子缀合物的编码序列，
-多聚腺苷酸（polyA）信号序列。
本文报道的另一个方面是用于生产本文报道的糖基化重复基序分子缀合物的方法，包括
-在适合表达重复基序分子的条件下，培养包含本文报道的核酸的哺乳动物细胞，
-从细胞或培养基中回收糖基化重复基序分子，从而生产糖基化重复基序分子，
-任选的纯化所回收的糖基化重复基序分子。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞选自CHO细胞和HEK293细胞。
在一个实施方案中，多聚的缀合部分是含三个半胱氨酸残基的改造的重链铰链区。在另一个实施方案中，缀合部分包括改造的抗体重链铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在其他实施方案中，重复基序分子是anticalin。在仍然另一个实施方案中，重复基序分子与缀合部分的N端缀合。
发明详述
本文报道了下列通式的糖基化重复基序分子缀合物（GEMOC）：
(重复基序分子-接头n)m-(缀合部分)q-(接头o-重复基序分子)p
其中n和o是彼此独立的0或1的整数值，并且独立于m和p的各个值，而m和p是彼此独立的0或1或2或3或4或5或6或7的整数值，q是独立的0或1，
其中缀合部分包括至少一个糖基化位点，而GEMOC是在哺乳动物细胞在表达的。
术语“糖基化”或其语法等价体表示相应的重复基序分子包括与重复基序分子的氨基酸骨架中的氨基酸共价连接的糖残基。在一个实施方案中，重复基序分子包括至少一个N-糖基化或O-糖基化位点基序，是天然存在的或改造的基序（参见SEQ ID NO:56和58）。在一个实施方案中，N-糖基化位点基序选自asp-X-thr、asp-X-ser或asp-X-cys，其中X可以是脯氨酸（pro、P）以外的任何氨基酸残基。在另一个实施方案中，向重复基序分子添加糖基化标签（参见例如，SEQ ID NO:60、61、62和63；还参见Meder、D.等人，J.Cell Biol.168(2005)303-313；Bulbarelli,A.等人，J.Cell Sci.,115(2002)1689-1702）。因而，在一个实施方案中，缀合物包括SEQ ID NO:62或63的分子作为重复基序分子。使用这些糖基化标签，可以获得包括良好糖基化的重复基序分子。
术语“哺乳动物细胞”表示选自CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、COS细胞、
Figure BDA00001602913200051
细胞和杂交瘤细胞的细胞。
术语“氨基酸”在本申请中用于表示羧基α-氨基酸，可以被核酸直接编码或以前体的形式被编码。单个氨基酸由三个核苷酸组成的核酸编码，即所谓的密码子或碱基三联体。每个氨基酸由至少一个密码子编码。这被称为“遗传密码的简并性”。术语“氨基酸”在本申请中用于表示天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸（三字母密码：ala，一字母密码：A）、精氨酸（arg，R）、天冬酰胺（asn，N）、天冬氨酸（asp，D）、半胱氨酸（cys，C）、谷氨酰胺（gln，Q）、谷氨酸（glu，E）、甘氨酸（gly，G）、组氨酸（his，H）、异亮氨酸（ile，I）、亮氨酸（leu，L）、赖氨酸（lys，K）、甲硫氨酸（met，M）、苯丙氨酸（phe，F）、脯氨酸（pro，P）、丝氨酸（ser，S）、苏氨酸（thr，T）、色氨酸（trp，W）、酪氨酸（tyr，Y）、缬氨酸（val，V）。
术语“抗体”指由一个或多个基本由抗体基因编码的多肽组成的分子。抗体一般包括两条所谓的轻链多肽（轻链）和两条所谓的重链多肽（重链）。每条重链和轻链多肽都含有可变结构域（可变区）（一般是多肽链的氨基端部分），可变结构域包括能够与抗原相互作用的结合区。每条重链和轻链多肽都包括恒定区（一般是羧基端部分）。重链的恒定区介导抗体与下述结合：i）具有Fcγ受体（FcγR）的细胞，例如巨噬细胞，或ii）具有新生儿Fc受体（FcRn）的细胞，也称为Brambell受体。还介导与一些因子的结合，包括经典补体系统的因子，例如补体（C1q）。抗体的轻链或重链的可变结构域依次包括不同的片段，即，四个框架区（FR）和三个超变区（CDR）。
术语“铰链区”在一个实施方案中表示人的全长抗体重链的从残基216（通常是谷氨酸残基）至残基226（通常是半胱氨酸残基），或至残基230（通常是脯氨酸残基）的片段。铰链区包括可以与第二个铰链区相应半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基，例如与第二抗体重链。在一个实施方案中，铰链区包括两个半胱氨酸残基。
术语“第二重链恒定结构域”和“CH2结构域”和“CH2”可互换的使用，在一个实施方案中表示人的全长抗体重链的从残基213至残基340的片段。CH2结构域包括残基297，其通常是氨基酸天冬酰胺，在此糖与氨基酸骨架共价连接。
术语“第三重链恒定结构域”和“CH3结构域”和“CH3”可互换的使用，在一个实施方案中表示人的全长抗体重链的从残基341至残基447的片段，即在CH2结构域的C端。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”可互换的使用，在本申请中表示通过细胞表面具有FC受体（FcR）的非特异性的细胞毒性细胞作用的细胞裂解机制，例如天然杀伤细胞（NK细胞）、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。这些细胞识别和裂解含表面结合具有Fc受体结合部分（例如Fc部分）的抗体的细胞。
术语“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”可互换的使用，在本申请中表示通过补体作用的细胞裂解机制，由C1q与例如结合抗原的抗体相结合而引发。
术语“结合靶分子”表示结合分子（即，提供互补性的）及其结合配偶体（即，特异性的靶分子）之间的特异性相互作用。该特异性相互作用的强度表示为结合亲和力，以KD值给出。术语“不特异性的结合靶分子”表示在结合分子及其靶分子之间的非特异性相互作用，具有10-5mol/l或更高的KD值（例如，10-3mol/l），在一个实施方案中，具有10-6mol/l或更高的KD值。结合亲和力是用标准的结合测定来确定的，例如表面等离子体共振技术
Figure BDA00001602913200071
该结合亲和力的值不应作为精确值处理，仅仅是参照点。术语“特异性的结合靶分子”表示在结合分子及其靶分子之间的特异性相互作用，具有10-7mol/l或更低的KD值（例如，10-10mol/l），在一个实施方案中，具有10-8mol/l或更低的KD值。
在一个实施方案中，重复基序分子的重复是长度从20至40个氨基酸残基。重复排列在单个结构单元中，共同形成重复基序分子。在一个实施方案中，重复基序分子选自锚蛋白-重复基序分子和富含亮氨酸的重复基序分子（LRRP）。
在一个实施方案中，缀合部分包括免疫球蛋白膜锚定结构域或GPI锚定结构域。
术语“重复基序分子”表示可作为单个分子（即，未与第二个分子或与自身的第二份拷贝缀合的）表达的天然存在的或人工的多肽，以可溶形式存在于大肠杆菌的细胞质或周质中。在一个实施方案中，重复基序分子包括至少两个结构相同的单元（重复）。这些单元的氨基酸序列不需要相同。这些单元可以是但不必须是独立折叠的结构域。除重复单元外，重复基序分子可以但不必包括其他序列片段。在一个实施方案中，重复基序分子是锚蛋白重复基序分子。在另一个实施方案中，重复基序分子是富含亮氨酸的重复基序分子。
术语“锚蛋白重复基序分子”表示包括1至30个共同的33个残基的氨基酸序列的人工多肽。每个重复包括β转角基序，后接成对的反向平行的α螺旋，以及导致折回下一个重复的环。在一个实施方案中，锚蛋白重复基序分子包括1至30个重复，在另一个实施方案中是2至10个重复，在另一实施方案中，是3至6个重复。
在一个实施方案中，锚蛋白重复基序分子通过随机诱变和针对靶分子结合进行选择（例如，通过核糖体展示、酵母展示或噬菌体展示）而源自下列共同序列之一：
DGNT(P，A)LHLA(A，V)ENG(H，N)LE(I，V)VKL L(L，I)EAGA(D，N)INA
                                     (SEQ ID NO：01)，
DSDGNTPLHL AAENGQLEVV KLLLEAGADV NAR (SEQ ID NO：02)，
(D，T)KNGLTPLH(L，I)AAQEGHLEVV KLLLENGA(D，N)(V，I)NAK
                                     (SEQ ID NO：03)，
DxxGxTPLHL AAxxGHLEIV EVLLK(H，N，Y)GADV NAx
                                     (SEQ ID NO：04)，
ADVNAKDKDG YTPLHLAARE GHLEIVEVLL KAG (SEQ ID NO：05)，
DxxGxTPLHLAaxxGpxpaVpxLLpxGADVNAx    (SEQ ID NO：06)，
DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx    (SEQ ID NO：07)，
DxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNAx    (SEQ ID NO：08)，
D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1    (SEQ ID NO：09)，
“x”表示完全可变的位置，
括号内给出的氨基酸表示可能在该位置的具体变体，
“a”表示具有非极性侧链的氨基酸，
“p”表示具有极性侧链的氨基酸残基，
“1”表示选自（按一字母代码）氨基酸残基A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸残基，以及
“2”表示选自氨基酸残基H、N和Y的氨基酸残基。
可以通过筛选包含随机化GEMOC或随机化锚蛋白重复基序分子的文库（例如，通过核糖体展示）获得包含与任何预定的靶分子结合的锚蛋白重复基序分子的GEMOC（参见例如，WO 02/120565；Hanes,J.and Plückthun,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)4937-4942）。
在一个实施方案中，GEMOC包括氨基酸序列DLGKKLLE AARAGQDDEVRILMANGADV（SEQ ID NO:47）的N端加帽重复。
在一个实施方案中，GEMOC包括氨基酸序列VNAQDKFGKT AFDISIDNGNEDLAEILQ（SEQ ID NO:48）的C端加帽重复。
在另一个实施方案中，重复基序分子是富含亮氨酸的重复基序分子（LRR）。用于制备富含亮氨酸的重复基序分子的方法报道在WO2006/083275中。
一般而言，抗体具有选自中和活性、针对毒性部分的靶向活性或效应子功能的活性。
在图1中，显示了抗体的结构域构造。全长抗体包括两条所谓的轻链和两条所谓的重链。每条轻链依次包括轻链可变结构域和轻链恒定结构域。轻链恒定结构域选自κ型结构域或λ型结构域。每条重链依次包括重链可变结构域、第一重链恒定结构域（CH1）、铰链区、第二重链恒定结构域（CH2）、第三重链恒定结构域（CH3），和任选的第四重链恒定结构域（CH4）。此外，全长抗体还包括在轻链恒定结构域和第一重链恒定结构域之间的二硫键，以及在两条重链的第二重链恒定结构域之间的两个二硫键。
在一个实施方案中，GEMOC的缀合部分是全长抗体重链或全长抗体轻链，但都不含可变结构域。在一个实施方案中，GEMOC的缀合部分是每个含可变结构域的抗体重链或抗体轻链。在另一个实施方案中，重复基序分子与各个抗体链的C端直接缀合或通过肽接头缀合。在一个实施方案中，GEMOC包括之前的实施方案中的两个GEMOC。
在一个实施方案中，缀合部分是抗Aβ抗体的抗体轻链或重链。此类抗Aβ抗体和相应的核酸序列报道在例如WO 2003/070760或US 2005/0169925中，或在SEQ ID NO:50至55或其变体中。
本文报道的缀合物包括含有一个或多个重复基序分子的各种变体，每种都结合相同的靶分子或结合不同的靶分子。在本文报道的缀合物中，非重复基序分子（即，缀合部分）的不论C末端或是N末端的仅一端共价连接单个重复基序分子。
第一个变体是包括两个或多个重复基序分子的缀合物，每个结合相同或不同的靶分子，其中每对重复基序分子通过肽接头连接。在一个实施方案中，重复基序分子的数量选自2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在图2中，显示了包括通过肽接头连接两个或多个重复基序分子的示例性缀合物。
第二个变体是包括一个或多个重复基序分子和一个或多个非重复基序分子的缀合物。每个重复基序分子结合相同或不同的靶分子。非重复基序分子提供了一个或多个重复基序分子共价结合的支架，任选的和独立的分别通过肽接头。在一个实施方案中，非重复基序分子选自抗体CL结构域、抗体CH1结构域、抗体铰链区、抗体CH2结构域、抗体CH3结构域、抗体CH4结构域、膜锚定基序、跨膜结构域、糖基化标签序列、纯化或检测标签序列，或其一种或多种的组合，不论是天然存在的或是其改造的变体。在一个实施方案中，非重复基序分子包括通过一个或多个二硫键共价连接在一起的两个或多个多肽。在一个实施方案中，非重复基序分子是抗体Fc部分。在一个实施方案中，非重复基序分子是由两个单体组成的二体，其中每个单体按N端至C端的方向，都包括重链铰链区、CH2结构域和CH3结构域，或者是由两个单体组成的二体，其中每个单体按N端至C端的方向，都包括CH1结构域、重链铰链区、CH2结构域和CH3结构域，或者是包括两个按N端至C端的方向各自包括CH1结构域、重链铰链区、CH2结构域和CH3结构域的单体和两个包括轻链恒定结构域的单体的四体。在另一个实施方案中，每个单体彼此独立的进一步包括可变结构域。
术语“肽接头”表示包含通过肽键彼此连接的氨基酸残基的天然和/或合成来源的接头。由线性氨基酸链组成，其中20个天然存在的氨基酸是单体构建模块。链具有从1至50个氨基酸残基的长度，在一个实施方案中，在3至28个氨基酸残基之间，在另一实施方案中，在4至20个氨基酸残基之间。接头可含有重复性氨基酸序列或天然存在的多肽的序列。接头具有确保两个通过接头连接的组件可以正确折叠并由于空间和自由旋转而正确呈递的功能。在一个实施方案中，接头是设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成的肽接头”。这些残基按例如至多5个氨基酸的小重复单元排列，例如(G)GGGS、(Q)QQQG或(S)SSSG（SEQ ID NO:14、15和16）。这些小重复单元可以重复2至5次，形成多体单元。其他合成的肽接头包括重复10至20次的单个氨基酸，例如接头中的丝氨酸GSSSSSSSSSSSSSSSG（SEQ ID NO:17）。在一个实施方案中，接头选自[GQ4]3GNN(SEQ ID NO：18)，LSLSPGK(SEQ ID NO：19)，LSPNRGEC(SEQ ID NO：20)，LSLSGG(SEQ ID NO：21)，LSLSPGG(SEQ IDNO：22)，G3[SG4]2SG(SEQ ID NO：23)或G3[SG4]2SG2(SEQ ID NO：24)。
在一个实施方案中，接头具有4至20个氨基酸残基。在一个实施方案中，接头在重复基序分子之间是相同的，在另一个实施方案中，缀合物含有具有两个或多个不同的氨基酸序列的接头。在另一实施方案中，接头选自（G3S  ）、（G3S  ）2、(G3S)3，(G3S)4，(G3S)5，(G4S)，(G4S)2，(G4S)3，(G4S)4，(G4S)5(SEQ ID NO：14和25至33），优选选自（G4S）3和（G4S）4（SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32）。
在一个实施方案中，本文报道的缀合物包括一个重复基序分子和一个非重复基序分子，和任选的在这些分子之间的肽接头。重复基序分子与非重复基序分子的C端或N端共价连接，或与形成非重复基序分子的多肽的一个C端或一个N端共价连接。
在图3至5中，显示了第二个变体的实施方案的示例性缀合物。在图3中，显示了一个重复基序分子与不同的单个抗体结构域的N端和C端的缀合物。在图4中，显示了一个重复基序分子与2、3或4个抗体结构域的组合的N端和C端的缀合物。在图5中，显示了一个重复基序分子与二硫键连接的抗体结构域（CL-CH1或铰链-铰链）的N端和C端的缀合物，任选的，这些缀合物还可包括除可变结构域以外的其他抗体结构域。
在另一个实施方案中，本文报道的缀合物包括两个重复基序分子和一个非重复基序分子，和任选的至多两个肽接头。一个重复基序分子与非重复基序分子的C端共价连接，一个与非重复基序分子的N端共价连接，或者两个都与形成非重复基序分子的多肽的C端或N端共价连接，或者重复基序分子之一与形成非重复基序分子的多肽的C端共价连接，一个与形成非重复基序分子的多肽的N端共价连接。其中，C端和N端是相同多肽或不同多肽的末端。在图6至8中，显示了这些实施方案的示例性缀合物。在图6中，显示了两个重复基序分子与仅包括一个C端和一个N端的非重复基序分子缀合，其中，非重复基序分子可包括一个或多个抗体结构域。在图7和8中，显示了两个重复基序分子与包括二硫键连接的抗体结构域的非重复基序分子缀合，任选的，这些缀合物还可包括除可变结构域以外的其他抗体结构域。
在另一实施方案中，缀合物包括四个重复基序分子和一个非重复基序分子，和任选的至多四个肽接头。在该实施方案中，非重复基序分子包括至少两个共价连接在一起的多肽，在一个实施方案中，是通过一个或多个二硫键。在一个实施方案中，重复基序分子与非重复基序分子的相应数量的C端和N端共价连接。在另一个实施方案中，两个重复基序分子彼此缀合形成二聚的重复基序分子，而二聚的重复基序分子反过来与非重复基序分子缀合。在图9至11中，显示了该实施方案的示例性缀合物。在图9中，四个重复基序分子与包含两个C端和两个N端的非重复基序分子缀合，其中非重复基序分子可以包括一个或多个抗体结构域。在图10和11中，四个重复基序分子与包括二硫键连接的抗体结构域的非重复基序分子缀合，任选的这些缀合物还包括除可变结构域以外的其他抗体结构域。
在仍然另一个实施方案中，缀合物包括六个重复基序分子和一个非重复基序分子，和任选的至多六个肽接头。在该实施方案中，非重复基序分子包括至少两个共价关联在一起的多肽，在一个实施方案中，通过一个或多个二硫键。在一个实施方案中，重复基序分子与非重复基序分子的相应数量（respective number）的C端和N端共价连接。在另一个实施方案中，四个重复基序分子彼此缀合，形成二聚的重复基序分子，而二聚的重复基序分子反过来与非重复基序分子缀合，而两个重复基序分子不彼此缀合，而各自与非重复基序分子的单个末端缀合。在图12中，显示了这些实施方案的示例性缀合物。
在另一实施方案中，缀合物包括八个重复基序分子和一个非重复基序分子，和任选的至多八个肽接头。在该实施方案中，非重复基序分子包括至少两个共价关联在一起的多肽，在一个实施方案中，通过一个或多个二硫键。在一个实施方案中，重复基序分子与非重复基序分子的相应数量的C端和N端共价连接。在另一个实施方案中，两至八个重复基序分子彼此缀合，形成二聚的重复基序分子，而二聚的重复基序分子反过来与非重复基序分子缀合，而剩余数量的重复基序分子不彼此缀合，而各自与非重复基序分子的单个末端缀合。
重复基序分子可以是支架的衍生物，所述支架选自CTLA-4（Evibody）、脂笼蛋白（lipocalin）、蛋白质A衍生分子例如蛋白质A的Z-结构域（Affibody，SpA）、A-结构域（Avimer，Maxibody）、热激蛋白例如GroEl和GroES、转铁蛋白（transbody）、肽适体、C-型凝聚素结构域（四连接素（Tetranectin））、人y-晶状体球蛋白（y-crystallin）和人泛素（affilins）、PDZ结构域、蝎毒素、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域和纤连蛋白（adnectin）、源自Src同源结构域的重复基序分子（例如，SH2或SH3结构域）、源自PDZ结构域的重复基序分子、源自β-内酰胺酶的重复基序分子、源自高亲和力蛋白酶抑制剂的重复基序分子、源自小二硫键结合蛋白支架的重复基序分子例如蝎毒素、包括重复结合结构域的重复基序分子例如EGF-样结构域、Kringle-结构域、PAN结构域、Gla结构域、SRCR结构域、Kunitz结构域、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂结构域、Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、Trefoil（P-型）结构域、von Willebrand因子C型结构域、anhaphylatoxin-样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白I型重复、LDL-受体A类结构域、Sushi结构域、Link结构域、血小板反应蛋白I型结构域、免疫球蛋白-样结构域、C-型凝聚素结构域、MAM结构域、von Willebrand因子A型结构域、生长调节素B结构域、WAP-型四个二硫键核心结构域、F518C型结构域、血液结合素结构域、层粘连蛋白-型EGF-样结构域、C2结构域、源自Avimers的重复基序分子、源自Telobodies的重复基序分子、源自Evibodies的重复基序分子、源自Microbodies的重复基序分子（参见例如，Jeong,K.J.和Silverman,J.,Nat.Biotechnol.23(2005)1493-1494；Panni,S.等人，J.Biol.Chem.277(2002)21666-21674；Schneider,S.等人，Nat.Biotechnol.17(1999)170-175；Legendre,D.等人，Protein Sci.11(2002)1506-1518；Stoop,A.A.等人，Nat.Biotechnol.21(2003)1063-1068；Vita,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)6404-6408；WO 2006/055689；US2006/0234299）。
在一个实施方案中，GEMOC包括缀合部分，所述缀合部分选自抗体亚结构、小体（minibody）、adnectin、anticalin、affibody、affilin、knottin、glybody、C-型凝聚素-样结构域蛋白、设计的锚蛋白-重复蛋白（DARPin）、四连接素、kunitz结构域蛋白、硫氧还蛋白、细胞色素b562、锌指支架、葡萄球菌核酶支架、纤连蛋白或纤连蛋白二体、粘蛋白（tenascin）、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ICAM、titin、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素的有色蛋白、髓鞘膜粘附分子PO、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD 1、VCAM-1的C2和I-类结构域、肌球蛋白结合蛋白C的1-类免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的1-类免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-类免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白（twitchin）、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、泌乳刺激素受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL和奇异果糖蛋白。
在一个实施方案中，缀合部分是anticalin。在另一实施方案中，anticalin是anticalin A-44。在一个实施方案中，缀合物包括SEQ ID NO:64，和/或SEQ ID NO:65，和/或SEQ ID NO:66的氨基酸序列。已发现相比包含DARPin的GEMOCS，包含anticalin的GEMOCS可以以更高的产量表达。在一个实施方案中，anticalin与抗体Fc部分融合。在另一个实施方案中，Fc部分是有或无突变的人IgG1或人IgG4的Fc部分。示例性的突变是IgG1的氨基酸改变L234A和L235A，和IgG4的S228P和L235E。
已发现，铰链区包括三个链内二硫键对于生产这样的GEMOCS是有利的，所述GEMOCS包含与抗体Fc部分的N端融合的重复基序分子，例如有或无上述鉴别的氨基酸改变的人IgG1的Fc部分或人IgG4的Fc部分。相比在铰链区含有两个链内二硫键桥的缀合物，在铰链区含有三个链内二硫键桥的缀合物可以以降低的副产物含量（尤其是关于碎片化）而生产。
在本文中，之前报道的包含两个或多个重复基序分子的GEMOC为双特异性、三特异性或四特异性的靶分子结合构建体提供了可能性。术语“双特异性”表示GEMOC包括至少两个与两种不同的靶分子结合的重复基序分子。术语“三特异性”表示GEMOC包括至少三个与三种不同的靶分子结合的重复基序分子。术语“四特异性”表示GEMOC包括至少四个与四种不同的靶分子结合的重复基序分子。
在GEMOC包括抗体结构域的情况下，为了实现可接受的产量以及避免需要进行复杂的纯化程序，应该规避或者至少最小化错配的副产物以及片段的生产。规避错配副产物问题的方法（称为“knobs-into-holes”）的目标是通过向CH3结构域中导入突变来修饰接触的界面，迫使各包括抗体重链CH3结构域的两个不同的缀合物配对。一条链上大量的氨基酸被含短侧链的氨基酸取代，产生“孔”。同时，将含大侧链的氨基酸导入另一CH3结构域中，产生“突起（knob）”。通过共表达这两种修饰后的缀合物，观察到与同二聚体（“孔-孔”或“突起-突起”）形成相对应的高产量的异二聚体形成（“突起-孔”）（参见例如，Ridgway,J.B.,Protein Eng.9(1996)617-621；WO 96/027011）。明显降低错配副产物形成的另一方法是使用被称为“结构域交换”或“交叉”的技术。其中开发了在抗体CL和CH1结构域之间的特异性相互作用。在一个实施方案中，本文报道的GEMOC中的缀合部分包括两个多肽，其中一个包括抗体轻链恒定结构域（CL），另一个包括抗体重链第一恒定结构域（CH1）。图13中显示了示例性的双特异性GEMOC。
术语“靶分子”表示与重复基序分子互补并提供与重复基序分子相互作用的相互作用位点的分子。在一个实施方案中，靶分子选自细胞表面分子、可溶性细胞表面分子、细胞因子、激素、酶、免疫球蛋白、毒素、病毒颗粒蛋白、斑块蛋白（plaque protein）和斑块前体蛋白或纳米颗粒。
本文报道的GEMOC包括为展示重复基序分子提供支架的缀合部分。该缀合部分可以额外提供其他功能，例如受体结合功能。在一个实施方案中，缀合部分选自抗体结构域，在一个实施方案中，它包括抗体CH2结构域。抗体CH2结构域提供了ADCC或CDC需要的Fc受体结合功能。在另一个实施方案中，缀合部分是可以与包括相同缀合部分或相应互补关联部分的其他GEMOC多聚化或关联的分子。在一个实施方案中，此类多聚化的缀合部分或缀合部分和互补关联部分的对选自亮氨酸拉链，包括cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）的调控亚基和激酶锚蛋白（AKA）的锚定结构域的对。
GEMOC中使用的缀合部分应该是人来源的，对于折叠和降解高度稳定、“惰性的”，即没有细胞因子或信号功能、生产方便和经济、允许进一步加工（例如，蛋白水解切割、肽的化学修饰、翻译后修饰）、具有恰当的大小（无肾过滤或其他系统性排出），且不是免疫原性的。
术语“多聚化缀合部分”指能够共价或非共价的关联两个或多个单独的GEMOC的分子。在一个实施方案中，多聚化缀合部分选自亮氨酸拉链结构域（Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553；de Kruif，J.等人，J.Biol.Chem.271(1996)7630-7634）、酵母GCN4亮氨酸拉链、异亮氨酸拉链结构域、螺旋-转角-螺旋基序（Pack,P.等人，Biotechnol.11(1993)1271-1277）、最大相互作用蛋白和相关分子（US 5,512,473）、多聚谷氨酸-多聚赖氨酸结构域（US 5,582,996）、天然或改造的成对重链CH2-CH3结构域、天然或改造的成对重链CH1-轻链恒定结构域（Mueller,K.M.等人，FEBS Lett.422(1998)259-264）、TATA结合蛋白的180个氨基酸的羧基端结构域（Colemen,R.A.等人，J.Biol.Chem.270(1995)13842-13849）、VCAM和VLA-4、整联蛋白和胞外基质蛋白、整联蛋白和细胞表面分子（例如，CD54或CD102）、ALCAM、谷胱甘肽转移酶、SRCR结构域、受体二聚体对（例如，白介素-8受体（IL-8R））、整联蛋白异二聚体（例如LFA-1和GPIIIb/IIIa）、或仅其二聚化区域、二聚化配体多肽（例如，神经生长因子（NGF）、神经营养蛋白-3（NT-3）、白介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）（参见例如，Arakawa,T.等人，J.Biol.Chem.269(1994)27833-27839；Radziejewski,C.等人，Biochem.32(1993)13350-6））、或仅其二聚化区域、一般是能够形成二硫键的成对半胱氨酸残基，成对的肽或多肽，每个包括至少一个半胱氨酸残基（例如，从约1个、2个或3个至约10个半胱氨酸残基）使得在肽或多肽之间可以形成二硫键，一般是卷曲-卷曲结构域（coiled-coil domain）（参见例如，Lupas,A.等人，Science 252(1991)1162-1164）、p53的四聚化结构域、软骨寡聚基质蛋白（COMP）的N端残基（氨基酸20-80）、α-螺旋序列（参见例如，Eisenberg,D.等人，Protein 1(1986)16-22；Ho,S.P.和DeGrado,W.F.,J.Am.Chem.Soc.109(1987)6751-6758；Regan,L.和DeGrado,W.F.,Science 241(1988)976-978；Hill,C.P.等人，Science 249(1990)543-546；Plückthun,A.和Pack,P.,Immunotechnol.3(1997)83-105）。在一个实施方案中，多聚化的缀合部分选自天然的或改造的成对重链CH2和CH3结构域、天然或改造的成对重链CH1结构域和轻链恒定结构域、天然或改造的重链铰链区。在另一实施方案中，多聚化的缀合部分选自天然的或改造的成对重链CH2和CH3结构域、天然或改造的成对重链CH1结构域和轻链恒定结构域、重链铰链区和CH2和CH3结构域的天然或改造的序列。在另一个实施方案中，多聚化的缀合部分选自天然的或改造的成对重链CH2和CH3结构域、天然或改造的成对重链CH1结构域和轻链恒定结构域。
可以通过木瓜蛋白酶在靠近每个铰链区的N端侧蛋白水解切割抗体，获得两个抗原结合片段（Fab）和一个恒定区片段（Fc）。Fab片段由完整的轻链和重链的N端片段组成，所述重链的N端片段包括VH和CH1结构域。Fc部分依次包括通过铰链区内的二硫键连接的两条重链的其余结构域。
抗体的Fc部分与免疫系统的组分相互作用，例如补体级联（补体依赖性细胞毒性（CDC））或通过结合Fc-γ受体（抗体依赖性细胞的细胞毒性（ADCC））或细胞毒性效应子细胞。为了改变Fc部分的效应子功能，可以进行氨基酸残基的取代（US 5,648,260；US 5,624,821）。Fc部分负责调节效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。Fc部分一般在226位（Cys）或230位（Pro）开始，并延伸至抗体重链的C端。
本文报道的GEMOC是包括一个或多个碳水化合物残基的糖基化蛋白质。体内的蛋白质生产包括翻译后修饰步骤，尤其是糖基化。糖残基（糖基）酶促添加到蛋白质氨基酸序列的N或O-糖基化基序上。例如，抗体是在Fc部分以及可变结构域中含一个或多个碳水化合物部分的糖基化蛋白质。Fc部分的碳水化合物部分是至少部分对效应子功能负责的，而对抗体的抗原结合或半衰期较较不重要（Jefferis,R.,Biotechnol.Prog.21(2005)11-16）。
根据重链恒定区的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）分为以下类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。一些这些类别进一步分为亚类（同种型），即，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分为IgA1和IgA2。根据抗体所属的免疫球蛋白类别，免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α（IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。根据恒定区的氨基酸序列，抗体轻链被标注为kappa(κ)或lambda(λ)轻链。
术语“糖基化”表示寡糖与至少一个氨基酸残基连接。由于细胞内（即，体内）的翻译后糖基化涉及多个酶，因而所获得的重组生产的多肽根据表达多肽的细胞而具有糖基化模式，即，糖基化异质性。因此，重组生产的多肽不仅包括在特定氨基酸残基处的一种确定的N-或O-连接寡糖，而且是具有相同氨基酸序列但在该特定氨基酸位置处包括不同的寡糖（即，具有糖基化模式）的各种多肽的混合物。因此，糖基化EMOC包括各自具有相同氨基酸序列但在特定氨基酸位置连接不同的寡糖的一组缀合物。术语“寡糖”在本申请中用于表示包括两个或多个共价连接的单糖单元的多聚糖。在一个实施方案中，与糖基化位点连接的寡糖是通过在CHO细胞或HEK293细胞中表达缀合物而获得的寡糖的混合物，即，寡糖是通过表达缀合物的细胞的翻译后修饰而获得的寡糖的混合物，即，对于表达缀合物的细胞而言是特征性的。通过表达多肽的细胞（即，体内）获得的糖基化和糖基化模式完全不同于在体外获得的糖基化或糖基化模式。
本发明的另一个方面是通过在哺乳动物细胞中表达相应的编码核酸，生产本文报道的GEMOC的方法。
详细而言，本文报道了在哺乳动物细胞中生产糖基化重复基序分子缀合物的方法，包括：
-提供包含编码重复基序分子缀合物的核酸的哺乳动物细胞，
-在适合表达重复基序分子的条件下培养细胞，
-从细胞或培养基中回收糖基化重复基序分子，从而生产糖基化重复基序分子，
-任选的纯化所回收的糖基化重复基序分子。
可以在哺乳动物细胞中生产本文报道的GEMOC，即，作为体内的糖基化重复基序分子缀合物。在本文中报道了用于生产糖基化形式的重复基序分子缀合物的方法，在一个实施方案中，以体内的糖基化形式生产。此类体内的糖基化（即，在也表达重复基序分子缀合物的相同细胞中的糖基化）是细胞特异性的翻译后修饰。可以在体外糖基化重组生产的多肽，即，在从生产细胞中分离之后（关于抗体参见例如，Leung,S.等人，J.Immunol.154(1995)5919-5926；US 5,443,953）。
用于纯化多肽和免疫球蛋白的方法是普遍建立和广泛使用的，是单独或者组合使用的。此类方法是例如在某些实施方案中，使用微生物来源蛋白质的亲和层析（例如，蛋白质A或蛋白质G亲和层析）、离子交换层析（例如，阳离子交换（羧甲基树脂）、阴离子交换（氨基乙基树脂）和混合型交换层析）、嗜硫吸附（例如，用β巯基乙醇和其他SH配体）、疏水性相互作用或芳香族吸附层析（例如，含苯基-琼脂糖、aza-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸）、金属螯合剂亲和层析（例如，含Ni(II)-和Cu(II)-的亲和材料）、尺寸排阻层析和预制的电泳方法（例如，凝胶电泳、毛细管电泳）（Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102）。在一个实施方案中，层析柱装填物是选自亲和层析材料、或离子交换层析材料、或嗜硫吸附层析材料、或疏水相互作用层析材料、或芳香族吸附层析材料、或金属螯合剂亲和层析材料、或尺寸排阻层析材料的层析材料。
为了生产分泌性多肽，目标结构基因还可包括编码信号序列/前导肽的DNA片段。信号序列指导新合成的多肽到达和通过内质网（ER）的膜，多肽可以在内质网被导向分泌。在蛋白质跨过ER膜的过程中，通过信号肽酶切去信号序列。宿主细胞的分泌机制的识别对于信号序列的功能是关键性的。因此，所使用的信号序列必须被宿主细胞的分泌机制的蛋白质和酶识别。
翻译调控元件包括翻译起始（AUG）和终止密码子（TAA、TAG或TGA）。一些构建体中可以包括内在的核糖体进入位点（IRES）。
因而，本文报道的另一个方面是用于在哺乳动物细胞中表达重复基序分子缀合物的核酸，包括下列元件：
-人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-抗体种系基因的5’-非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-重复基序分子缀合物的编码序列，
-多聚腺苷酸（“poly A“）信号序列。
在一个实施方案中，抗体种系基因的5’-非翻译区是人抗体种系基因。在另一个实施方案中，免疫球蛋白重链信号序列是小鼠或人的免疫球蛋白重链信号序列。在另一实施方案中，免疫球蛋白重链信号序列包括信号序列内含子（信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2]）。
在下文中，将通过两个结合HER2的模型重复基序分子（DARPinH10-2-G3，支架N2C（2个重复），Zahnd,C.等人，J.Mol.Biol.369(2007)1015-1028；DARPin 9-26，支架N3C（3个重复），Steiner,D.等人，J.Mol.Biol.382(2008)1211-1227），来示例本文展示的对象。测试了用于在HEK293细胞中表达这些GEMOC的四种表达构建体（按N至C端的方向）：
1)前导肽–重复基序分子-六组氨酸标签，
2)前导肽–重复基序分子-免疫球蛋白Fc片段，
3)前导肽-免疫球蛋白Fc片段-重复基序分子，
4)前导肽-免疫球蛋白Fc片段-重复基序分子。
因而，本文报道的其他方面是SEQ ID NO:10、11、12、13、34、35、36、37、38、39、40、41、42的GEMOC，包括SEQ ID NO:11和11、SEQ ID NO:13和13、SEQ ID NO:11和13、SEQ ID NO:34和34、SEQ ID NO:35和35、SEQ ID NO:34和35、SEQ ID NO:36和37、SEQ ID NO:39和39的GEMOC，以及编码这些的相应核酸，以及含有这些编码核酸序列和序列组合的相应核酸，以及生产这些GEMOC的方法。
下列实施例、序列表和附图供帮助理解本发明，其真实的范围提及在所附权利要求中。应理解，在不脱离本发明的精神的范围内，可以对所提及的规程进行修饰。
序列表的说明
SEQ ID NO:01锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列1。
SEQ ID NO:02锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列2。
SEQ ID NO:03锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列3。
SEQ ID NO:04锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列4。
SEQ ID NO:05锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列5。
SEQ ID NO:06锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列6。
SEQ ID NO:07锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列7。
SEQ ID NO:08锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列8。
SEQ ID NO:09锚蛋白-重复基序分子氨基酸共同序列9。
SEQ ID NO:10C端缀合了六组氨酸标签氨基酸序列的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:11C端缀合了IgG1Fc-部分的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:12C端缀合了六组氨酸标签氨基酸序列的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:13C端缀合了IgG1Fc-部分的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:14至33肽接头序列。
SEQ ID NO:34C端缀合了在铰链区含两个二硫键的IgG1Fc-部分的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:35C端缀合了在铰链区含两个二硫键的IgG1Fc-部分的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:36C端缀合了含CH3-突起-结构域的IgG1Fc-部分的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:37C端缀合了含CH3-孔-结构域的IgG1Fc-部分的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:38C端缀合了模型重复基序分子9-26的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:39含C端缀合了在铰链区含二个二硫键的IgG1Fc-部分（C端缀合了模型重复基序分子9-26）的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:40C端缀合了模型重复基序分子9-26（C端缀合了六组氨酸标签）的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:41C端缀合了模型重复基序分子H10-2-G3（C端缀合了六组氨酸标签）的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:42C端缀合了六组氨酸标签的二聚模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:43人IgG1恒定区。
SEQ ID NO:44人IgG4恒定区。
SEQ ID NO:45人κ恒定区。
SEQ ID NO:46人λ恒定区。
SEQ ID NO:47N-端加帽重复。
SEQ ID NO:48C-端加帽重复。
SEQ ID NO:49CMV启动子序列。
SEQ ID NO:50抗-Aβ抗体可变重链结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:51抗-Aβ抗体可变重链结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:52抗-Aβ抗体可变重链结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:53抗-Aβ抗体可变轻链结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:54抗-Aβ抗体可变轻链结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:55抗-Aβ抗体可变轻链结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:56C端缀合了六组氨酸标签氨基酸序列和在C-加帽重复起始处导入改造的糖基化位点的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:57C端缀合了IgG1Fc-部分及其C端缀合了膜锚定结构域的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:58C端缀合了六组氨酸标签氨基酸序列和在C-加帽重复起始处导入改造的糖基化位点的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:59C端缀合了IgG1Fc-部分及其C端缀合了膜锚定结构域的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:60具有在C端缀合的六组氨酸标签氨基酸序列和含有C端区域的糖基化标签的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:61具有在C端缀合的六组氨酸标签氨基酸序列和C端区域的糖基化标签的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:62具有C端缀合的六组氨酸标签氨基酸序列和糖基化标签的模型重复基序分子H10-2-G3。
SEQ ID NO:63C端缀合了六组氨酸标签氨基酸序列和糖基化标签的模型重复基序分子9-26。
SEQ ID NO:64包括含六组氨酸标签的anticalin A-44的模型缀合物。
SEQ ID NO:65含Fc标签和在铰链区含三个二硫键桥的模型anticalin A-44。
SEQ ID NO:66含Fc标签和在铰链区含两个二硫键桥的模型anticalin A-44。
附图描述
图1抗体的结构域构架的示意性展示图和用于其他附图的符号标记。
图2包括两个或多个重复基序分子的示例性缀合物。
图3与不同的单个抗体结构域的N端和C端结合的一个重复基序分子的示例性缀合物。
图4与两、三或四个抗体结构域的组合的N端和C端结合的一个重复基序分子的示例性缀合物。
图5与二硫键连接的抗体结构域的N端和C端结合的一个重复基序分子的示例性缀合物。
图6两个重复基序分子与只包括一个C端和一个N端的非重复基序分子缀合的示例性缀合物。
图7两个重复基序分子与包括二硫键连接的抗体结构域（部分1）的非重复基序分子缀合的示例性缀合物。
图8两个重复基序分子与包括二硫键连接的抗体结构域（部分2）的非重复基序分子缀合的示例性缀合物。
图9四个重复基序分子与包括两个C端和两个N端的非重复基序分子缀合的示例性缀合物。
图10四个重复基序分子与包括二硫键连接的抗体结构域（部分1）的非重复基序分子缀合的示例性缀合物。
图11四个重复基序分子与包括二硫键连接的抗体结构域（部分2）的非重复基序分子缀合的示例性缀合物。
图12六个重复基序分子与一个非重复基序分子的示例性缀合物。
图13示例性的结构域交换的GEMOC。
图14表达质粒9800的质粒图。
图15表达质粒9801的质粒图。
图16重链-多肽-缀合物表达质粒9807的质粒图。
图17抗体轻链表达载体5170的质粒图。
图18第7天，瞬时转染的HEK23细胞的上清液中表达的锚蛋白-重复基序分子缀合物的SDS-PAGE凝胶；构建体1=SEQ ID NO:10的蛋白质，构建体2=SEQ ID NO:12的蛋白质，构建体3=SEQ ID NO:11的蛋白质，构建体4=SEQ ID NO:13的蛋白质。
图19根据本发明的GEMOC与可溶性HER2结合的BIAcore分析。
实施例1
质粒构建
用于操作DNA的标准方法描述在Sambrook,J.等人，Molecularcloning:A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中。根据生产商的说明使用分子生物学试剂。通过基因合成制备所需的基因片段。将合成的基因片段克隆到特定的表达载体中。通过DNA测序验证亚克隆基因片段的DNA序列。
表达质粒9800和9803
通过唯一的限制性酶切位点BsmI和Bpu10I，将编码SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的缀合物的基因片段克隆到特定的表达质粒中。将表达质粒设计为组合了缀合物的编码序列与C端的六组氨酸标签，用于例如在HEK293细胞中表达和之后的纯化。除缀合物的表达盒外，质粒还包括：
-载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在E.coli中复制，和
-在E.coli中产生氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
缀合物编码序列的转录单元包括下列元件：
-人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-人抗体种系基因的5’-非翻译区，
-包括信号序列内含子和在L2的3’末端唯一的限制性酶切位点BsmI的小鼠免疫球蛋白重链信号序列（信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2]），
-缀合物的编码序列，
-与缀合物的编码序列读码框连续的，在缀合物的编码序列的3’末端编码唯一的Bpu10I的GSG接头，
-在GSG接头的3’末端的六组氨酸标签，与缀合物的编码序列和GSG接头读码框连续，
-多聚腺苷酸（“poly A“）信号序列，和
-在表达序列的3’末端的唯一的限制性酶切位点NheI和EagI。
表达质粒9800和9803的质粒图相应的显示在图14中。成熟缀合物的氨基酸序列（不含信号序列）标注在SEQ ID NO:10和12中。
表达质粒9801和9804
通过唯一的限制性酶切位点HindIII和PmlI，将编码SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的缀合物的基因片段克隆到特定的表达质粒中。将表达质粒设计为在IgG1类免疫球蛋白的铰链区的N端缀合了缀合物，从而替换天然存在的VH和CH1结构域。所获得的表达质粒可分别用于表达SEQ ID NO:11和13的缀合物，例如在HEK293细胞中。除与IgG1铰链、-CH2和-CH3序列缀合的重复基序分子的表达盒外，质粒还包括：
-载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在E.coli中复制，和
-在E.coli中产生氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
重复基序分子-铰链-CH2-CH3缀合物的转录单元包括下列元件：
-人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-人巨细胞病毒的内含子A序列，
-人抗体种系基因的5’-非翻译区，
-包括信号序列内含子和在L2的3’末端唯一的限制性酶切位点BsmI的小鼠免疫球蛋白重链信号序列（信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2]），
-缀合物的编码序列，
-编码人IgG1的铰链区、CH2-和CH3-结构域的序列，在铰链区具有唯一的PmlI限制性酶切位点，允许克隆缀合物的编码序列，和
-多聚腺苷酸（“poly A“）信号序列。
表达质粒9801和9804的质粒图相应的显示在图15中。成熟缀合物的氨基酸序列（不含信号序列）标注在SEQ ID NO:11和13中。
表达质粒9807和9808
不含六组氨酸标签的SEQ ID NO:10和12的重复基序分子可以缀合的抗体实例是抗淀粉体β-A4肽（抗-Aβ抗体）的抗体。此类抗体和相应的核酸序列报道在例如WO 2003/070760或US 2005/0169925中。通过唯一的限制性酶切位点MroI和NheI，将编码缀合物的基因片段克隆到特定的表达质粒中。将表达质粒设计为在IgG1亚类人免疫球蛋白重链C端缀合多肽（基因组有序的表达盒；外显子-内含子排列）。所获得的表达质粒可用于表达缀合物，例如在HEK293细胞中。除单克隆抗体重链-重复基序分子缀合物的表达盒外，质粒还包括：
-载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在E.coli中复制，和
-在E.coli中产生氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
重链-重复基序分子缀合物的转录单元包括下列元件：
-人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-人抗体种系基因的5’-非翻译区，
-包括信号序列内含子的小鼠免疫球蛋白重链信号序列（信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2]），
-抗-Ab抗体可变重链结构域编码片段，在3’末端安排了剪切供体位点和唯一的BamHI限制性酶切位点，
-编码由内含子分开的人γ1恒定结构域CH1、铰链、CH2和CH3的核酸，
-与CH3结构域的3’末端读码框连续的融合的(G4S)3接头，
-在接头的3’末端的唯一的限制性酶切位点MroI和NheI，允许与接头的C端读码框连续的克隆多肽，和
-多聚腺苷酸（“poly A“）信号序列。
重链-重复基序分子缀合物的表达质粒9807和9808的质粒图相应的显示在图15中。
表达质粒5170
为了表达抗体轻链，使用质粒5170。质粒5170是表达质粒，用于例如在HEK293细胞中瞬时表达抗体轻链（基因组有序的表达盒；外显子-内含子排列）。
除抗体κ轻链表达盒外，该质粒还包括：
-作为可选择标志物的新霉素抗性基因
-载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在E.coli中复制，和
-在E.coli中产生氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体κ轻链基因的转录单元包括下列元件：
-人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-人抗体种系基因的5’-非翻译区，
-包括信号序列内含子的小鼠免疫球蛋白重链信号序列（信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2]），
-抗-Aβ抗体可变轻链结构域编码片段，在3’末端安排了剪切供体位点和唯一的BamHI限制性酶切位点，截短的人κ轻链内含子2，
-人κ轻链基因恒定结构域，
-多聚腺苷酸（“poly A“）信号序列，和
-在3’末端的唯一的限制性酶切位点AscI和SgrAI。
抗体κ轻链表达载体5170的质粒图显示在图17中。
实施例2
瞬时转染和表达
通过瞬时转染悬浮培养的HEK293-Freestyle细胞（人胚肾细胞系293，Invitrogen）获得如实施例1中示例的根据本发明的重组缀合物。转染的细胞按30ml至250ml培养基的规模，在37℃，8%CO2中摇瓶培养在F17培养基（Gibco）或Freestyle 293培养基（Invitrogen）中，所述培养基补充了6mM谷氨酰胺（Ultra-谷氨酰胺（Biowhittake/Lonza）或L-谷氨酰胺（Sigma））。为了转染，Fectin（Invitrogen）按试剂（μl）与DNA（μg）的比例为4:3使用。在与抗体重链C端缀合的情况下，从两种不同的质粒表达轻链和重链，分别使用轻链比重链编码质粒为1:2至2:1的摩尔比。在转染后6至8天收获含缀合物的细胞培养上清液。Meissner,P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出了关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息。
实施例3
使用SDS-PAGE的表达分析
LDS样品缓冲液，四倍浓度（4xLDS）：4g甘油，0.682g TRIS（tris-（羟甲基）-氨基甲烷），0.666g TRIS-HCl（tris-（羟甲基）-氨基甲烷-盐酸），0.8g LDS（十二烷基磺酸锂），0.006g EDTA（乙二胺四乙酸），0.75ml的Serva Blue G250的按重量计1%（w/w）水溶液，0.75ml的酚红的按重量计1%（w/w）溶液，加水至总体积10ml。
离心含有分泌的缀合物的培养肉汤，去除细胞和细胞残片。将等份的澄清上清液与1/4体积（v/v）的4xLDS样品缓冲液和1/10体积（v/v）的0.5M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）混合。然后，样品在75℃孵育10min，通过SDS-PAGE分离蛋白质。根据生产商的说明使用Pre-Cast凝胶系统（Invitrogen）。特别的是，使用10%
Figure BDA00001602913200312
Figure BDA00001602913200313
Bis-TRIS Pre-Cast凝胶（pH 6.4）和MES走样缓冲液。可以清楚地检测到多肽和多肽-缀合物（参见图18）。
实施例4
通过亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白质
Fc-和抗体-缀合物
使用蛋白质A亲和材料MabSelectSure（GE Healthcare），通过亲和层析纯化表达和分泌的Fc-和抗体-缀合物。简而言之，在离心（10,000g，10分钟）和通过0.45μm滤器过滤后，将含有缀合物的澄清培养上清液应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mMNaCl和2.7mM KCl，pH 7.4）平衡过的MabSelectSure柱子。通过用平衡缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白质。用0.1M柠檬酸缓冲液，pH 3.3洗脱缀合物，用1M TRIS pH 9.0中和含有产物的级分。之后，在4°C用PBS缓冲液透析溶液，用Amicon Centricon浓缩装置浓缩，并储存在0℃的冰水浴中。通过分析性尺寸排阻层析分析Fc-和抗体-缀合物的聚集。将表现出高分子量聚集物的级分用于预制的尺寸排阻层析。简而言之，通过在Centricon装置（Amicon）中重复浓缩和稀释，将缀合物的缓冲液交换为组氨酸缓冲液（20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0）。在浓缩至1-4ml后，将含有缀合物的溶液应用于用相同的组氨酸缓冲液平衡过的Superdex200High Load柱子（GE HealthCare）上。收集1ml的级分。通过分析性SEC（Superdex200，GE HealthCare）分析所有的级分，混合含纯的单体聚合物的级分。如前文所述，在存在和缺少还原剂的条件下，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，分析缀合物的完整性。
SEQ ID NO:10和12的缀合物
根据已知的方法，使用镍螯合的亲和材料Ni-Sepharose HPHighTrap（GE HealthCare）通过亲和层析纯化包括六组氨酸标签的表达和分泌缀合物（SEQ ID NO:10和12）。简而言之，在离心（10,000g，10分钟）和通过0.45μm滤器过滤后，将含有缀合物的澄清培养上清液应用于用磷酸盐缓冲液（50mM Na3PO4，300mM NaCl，pH 8.0）平衡过的Ni-Sepharose柱子。通过用含20mM咪唑的磷酸盐平衡缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白质。用电导梯度洗脱缀合物。之后，在4°C用组氨酸缓冲液（20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0）充分透析含缀合物的溶液，用Amicon Centricon浓缩装置浓缩，并储存在0℃的冰水浴中。通过分析性尺寸排阻层析分析Fc-和抗体-缀合物的聚集。根据已知的方法，将表现出高分子量聚集物的级分用于预制的尺寸排阻层析。简而言之，如前所报道的，将浓缩的含缀合物的溶液应用于用相同的组氨酸缓冲液平衡过的Superdex200High Load柱子（GE HealthCare）上。收集1ml的级分。通过分析性SEC（Superdex200，GE HealthCare）分析所有的的级分，混合含纯的单体聚合物的级分。如前文所述，在存在和缺少还原剂的条件下，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，分析缀合物的完整性。
实施例5
BIAcore结合测定
在25°C下，在BIAcore 3000仪器（GE Healthcare Biosciences AB,Sweden）上实施所有的表面等离子体共振测量。走样和稀释缓冲液是PBS（1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，105mM NaCl，2.7mM KCl），pH 6.0，0.005%（v/v）Tween 20。将可溶性蛋白A稀释在10mM醋酸钠缓冲液pH 5.0中，并使用标准的氨偶联试剂盒（GE HealthcareBiosciences AB，Sweden）固定在CM5生物传感芯片上，获得约1000RU的蛋白质A表面密度。使用HBS-P（10mM HEPES，pH 7.4，118mMNaCl，0.005%表面活性剂P20；GE Healthcare Biosciences AB，Sweden）作为固定过程中的走样缓冲液。用PBS，0.005%（v/v）Tween 20，pH6.0稀释所讨论的Fc-和抗体-缀合物至450nM浓度，并以30μl/分钟的流速注射3分钟。然后，将可溶性配体稀释在相同缓冲液中以获得70至680nM之间的不同浓度，并以30μl/分钟的流速注射3分钟。之后，用PBS，pH 8.0，0.005%（v/v）Tween 20再生传感芯片1分钟。用BIAevaluation软件（BIAcore，Sweden）实施数据分析（参见图19）。
实施例6
使用ELISA的结合测定
通过ELISA测试（酶联免疫吸附测定）的手段，确定Fc-和抗体-缀合物的结合。本文中使用基于链霉抗生物素/生物素技术的夹心测定。将链霉抗生物素包被的微滴度板用于测定。
实施例7
使用FACS的结合测定
在补充了10%胎牛血清（FCS）和2mM L-谷氨酰胺的McCoy’s 5a培养基（PAN）中培养稳定过表达HER2的细胞系SK-BR-3（ATCC#HTB-30）。为了通过根据本发明的缀合物检测细胞表面的HER2，用补充了1%FCS作为封闭试剂的PBS洗涤细胞。缀合物与细胞在4℃下，在PBS/1%FCS中孵育15min，洗涤并用恰当的检测缀合物的荧光标记的二抗孵育。根据细胞上结合的缀合物，通过荧光辅助的细胞分选（FACS）来分选标记的细胞。
Figure IDA00001602913800021
Figure IDA00001602913800031
Figure IDA00001602913800041
Figure IDA00001602913800051
Figure IDA00001602913800061
Figure IDA00001602913800071
Figure IDA00001602913800081
Figure IDA00001602913800091
Figure IDA00001602913800101
Figure IDA00001602913800111
Figure IDA00001602913800121
Figure IDA00001602913800131
Figure IDA00001602913800141
Figure IDA00001602913800151
Figure IDA00001602913800161
Figure IDA00001602913800171
Figure IDA00001602913800191
Figure IDA00001602913800201
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Figure IDA00001602913800241
Figure IDA00001602913800251
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Figure IDA00001602913800491
Figure IDA00001602913800501
Figure IDA00001602913800521
Figure IDA00001602913800531
Figure IDA00001602913800541
Figure IDA00001602913800551
Figure IDA00001602913800561
Figure IDA00001602913800571
Figure IDA00001602913800591
Figure IDA00001602913800621
Figure IDA00001602913800631
Figure IDA00001602913800641
Figure IDA00001602913800661
Figure IDA00001602913800671
Figure IDA00001602913800681
Figure IDA00001602913800691
Figure IDA00001602913800701
Figure IDA00001602913800711
Figure IDA00001602913800741
Figure IDA00001602913800751
Figure IDA00001602913800761
Figure IDA00001602913800791
Figure IDA00001602913800801
Figure IDA00001602913800821
Figure IDA00001602913800831
Figure IDA00001602913800851
Figure IDA00001602913800861

Claims (15)

1.下列通式的糖基化重复基序分子缀合物：
(重复基序分子-接头n)m-(缀合部分)q-(接头o-重复基序分子)p
其中n和o是彼此独立的0或1的整数值，并且独立于m和p和q的各个值，且
m和p是彼此独立的0或1或2或3或4或5或6或7的整数值，且
q是0或1的整数值，独立于n、m、o和p，
其中重复基序分子缀合物包括至少一个与糖基化位点连接的寡糖，且
其中缀合部分包括含三个半胱氨酸残基的改造的抗体重链铰链区。
2.根据权利要求1的缀合物，其特征是所述重复基序分子是锚蛋白-重复基序分子或富含亮氨酸的重复基序分子或anticalin。
3.根据权利要求2的缀合物，其特征是所述锚蛋白-重复基序分子具有SEQ ID NO:4或其变体的氨基酸序列。
4.根据任一项前述权利要求的缀合物，其特征是所述接头是选自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:33的肽接头。
5.根据任一项前述权利要求的缀合物，其特征是所述缀合部分是多聚的缀合部分。
6.根据权利要求5的缀合物，其特征是所述多聚的缀合部分选自天然的或改造的成对重链CH2和CH3结构域、天然的或改造的成对重链CH1结构域和轻链恒定结构域、天然的或改造的重链铰链区，选自重链铰链区和CH2和CH3结构域、亮氨酸拉链结构域、异亮氨酸拉链结构域、4-螺旋束和p53四聚结构域的天然的或改造的序列。
7.糖基化重复基序分子缀合物，其特征是包括两个根据权利要求1至6的任一项的糖基化重复基序分子缀合物。
8.根据权利要求7的缀合物，其特征是多聚的缀合部分包括含三个半胱氨酸残基的改造的重链铰链区。
9.根据任一项前述权利要求的缀合物，其特征是
i)n=1、m=1、q=1、p=0或
ii)n=0、m=1、q=1、p=0或
iii)m=0、o=1、q=1、p=1或
iv)m=0、o=0、q=1、p=1或
v)m=1、n=0、o=1、q=1、p=1或
vi)m=1、n=1、o=1、q=1、p=1,
其中，缀合部分选自天然的或改造的成对重链CH2和CH3结构域、天然的或改造的成对重链CH1结构域和轻链恒定结构域，和天然的或改造的重链铰链区，选自重链铰链区和CH2和CH3结构域的天然的或改造的序列，
其中重复基序分子是锚蛋白-重复基序分子。
10.根据任一项前述权利要求的缀合物，其特征是
m=0、q=1、p=1、o=0或o=1，
其中缀合部分选自SEQ ID NO:50或51或52的N端和SEQ ID NO:43或44的C端的缀合物，或者SEQ ID NO:53或54或55的N端和SEQ ID NO:45或46的C端的缀合物，且
其中重复基序分子是锚蛋白-重复基序分子。
11.糖基化重复基序分子缀合物，其特征是包括两个根据权利要求10的糖基化重复基序分子缀合物。
12.根据权利要求11的糖基化重复基序分子缀合物，其特征是还包含：
a）在重复基序分子的缀合部分包括SEQ ID NO:50、51和52的情况下，则进一步包括SEQ ID NO:53或54或55的N端和SEQ ID NO:45或46的C端的两个缀合物，或者
b）在重复基序分子的缀合部分包括SEQ ID NO:53、54和55的情况下，则进一步包括SEQ ID NO:50或51或52的N端和SEQ ID NO:43或44的C端的两个缀合物。
13.包括下列元件的核酸：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-抗体种系基因的5’非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-重复基序分子缀合物的编码序列，
-多聚腺苷酸（polyA）信号序列。
14.用于生产根据权利要求1至11的任一项的糖基化重复基序分子缀合物的方法，包括
-提供包含根据权利要求13的核酸的哺乳动物细胞，
-在适合表达重复基序分子缀合物的条件下培养细胞，
-从细胞或培养基中回收糖基化重复基序分子缀合物，从而生产糖基化重复基序分子缀合物，
-任选的纯化所回收的糖基化重复基序分子缀合物。
15.根据权利要求14的方法，其特征是所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、Per.C6细胞和HEK293细胞。
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