RU2574201C2 - Гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом - Google Patents
Гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2574201C2 RU2574201C2 RU2012122869/10A RU2012122869A RU2574201C2 RU 2574201 C2 RU2574201 C2 RU 2574201C2 RU 2012122869/10 A RU2012122869/10 A RU 2012122869/10A RU 2012122869 A RU2012122869 A RU 2012122869A RU 2574201 C2 RU2574201 C2 RU 2574201C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- molecule
- repeating
- conjugate
- motif
- antibody
- Prior art date
Links
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims abstract description 118
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 37
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 62
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 claims description 27
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 27
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 claims description 19
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 14
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims description 14
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 10
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 10
- 229920001320 Leader sequence (mRNA) Polymers 0.000 claims description 10
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 claims description 10
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 9
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 claims description 9
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 8
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 8
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 claims description 8
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 125000003372 histidine group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 18
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 14
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 14
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 14
- 229920000453 Consensus sequence Polymers 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 0 CC*C(C)C1*=C*(C)(*)C1 Chemical compound CC*C(C)C1*=C*(C)(*)C1 0.000 description 7
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 7
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 5
- 101800001171 Leader peptide Proteins 0.000 description 5
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 5
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 5
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 5
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 4
- -1 Kunitz domain Proteins 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 3
- 101700025368 ERBB2 Proteins 0.000 description 3
- 102100016662 ERBB2 Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 229940114721 Enzymes FOR DISORDERS OF THE MUSCULO-SKELETAL SYSTEM Drugs 0.000 description 3
- 229940093738 Enzymes for ALIMENTARY TRACT AND METABOLISM Drugs 0.000 description 3
- 102100008658 FN1 Human genes 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 3
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 3
- 101710037934 QRSL1 Proteins 0.000 description 3
- 210000003705 Ribosomes Anatomy 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 102500000045 VDR Bsm1 Human genes 0.000 description 3
- 229940019336 antithrombotic Enzymes Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 3
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940083249 peripheral vasodilators Enzymes Drugs 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 3
- PQEJXGNZBLONLG-XJDOXCRVSA-N (2R)-2-amino-3-[1-[3-[2-[4-[1,3-bis(2-methoxyethylcarbamoyloxy)propan-2-yloxy]butanoylamino]ethylamino]-3-oxopropyl]-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl]sulfanylpropanoic acid Chemical compound COCCNC(=O)OCC(COC(=O)NCCOC)OCCCC(=O)NCCNC(=O)CCN1C(=O)CC(SC[C@H](N)C(O)=O)C1=O PQEJXGNZBLONLG-XJDOXCRVSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100005866 ALCAM Human genes 0.000 description 2
- 108010075348 Activated-Leukocyte Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 2
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-Derived Neurotrophic Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-Derived Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000003930 C-Type Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090000342 C-Type Lectins Proteins 0.000 description 2
- 210000004899 C-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N CC1CCCC1 Chemical compound CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100008895 CLEC3B Human genes 0.000 description 2
- 102100012426 COMP Human genes 0.000 description 2
- 108010053017 Cartilage Oligomeric Matrix Protein Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M Coomassie Brilliant Blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002472 Endoplasmic Reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 102100014838 FCGRT Human genes 0.000 description 2
- 230000035693 Fab Effects 0.000 description 2
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N Interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 229940096397 Interleukin-8 Drugs 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 102100009139 NGF Human genes 0.000 description 2
- 229940053128 Nerve Growth Factor Drugs 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 229940032018 Neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 2
- 102000004230 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102000000470 PDZ domain Human genes 0.000 description 2
- 108050008994 PDZ domain Proteins 0.000 description 2
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 2
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 2
- 102000000185 SRCR domain Human genes 0.000 description 2
- 108050008568 SRCR domain Proteins 0.000 description 2
- 101710004918 Smlt3054 Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 2
- 102100015249 VEGFA Human genes 0.000 description 2
- 102100019017 VWF Human genes 0.000 description 2
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 102000035362 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005600 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 102000010681 interleukin-8 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038415 interleukin-8 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 239000003638 reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 108010013645 tetranectin Proteins 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 229960001134 von Willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N β-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700061329 ARTN Proteins 0.000 description 1
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N Bis-tris methane Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- 229940077737 Brain-Derived Neurotrophic Factor Drugs 0.000 description 1
- DMFWEQYDBHFVNQ-UHFFFAOYSA-N C(C1CC2)C3C1C2CC3 Chemical compound C(C1CC2)C3C1C2CC3 DMFWEQYDBHFVNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050009406 C-type lectin-like Proteins 0.000 description 1
- 102000002086 C-type lectin-like Human genes 0.000 description 1
- AAFFTDXPYADISO-UHFFFAOYSA-N C1CC#CCC1 Chemical compound C1CC#CCC1 AAFFTDXPYADISO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXOZQHPXKPDQGT-UHFFFAOYSA-N CC1C=CCC1 Chemical compound CC1C=CCC1 CXOZQHPXKPDQGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100004728 CDH1 Human genes 0.000 description 1
- 101700016900 CDH1 Proteins 0.000 description 1
- 101700003315 CSF3 Proteins 0.000 description 1
- 102100006435 CSF3 Human genes 0.000 description 1
- 102100005310 CTLA4 Human genes 0.000 description 1
- 101700054183 CTLA4 Proteins 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 230000035700 Clearance Rate Effects 0.000 description 1
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 1
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 1
- 235000004035 Cryptotaenia japonica Nutrition 0.000 description 1
- 108010025905 Cystine-Knot Miniproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000012545 EGF-like domain Human genes 0.000 description 1
- 108050002150 EGF-like domain Proteins 0.000 description 1
- 102100010782 EGFR Human genes 0.000 description 1
- 102100016635 EPOR Human genes 0.000 description 1
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100012318 F3 Human genes 0.000 description 1
- 101710003435 FCGRT Proteins 0.000 description 1
- 108060001039 GCN4 Proteins 0.000 description 1
- 102100010042 GHR Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione Transferase family Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione Transferase family Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100003681 HSPD1 Human genes 0.000 description 1
- 101710013836 HSPD1 Proteins 0.000 description 1
- 102100011903 HSPE1 Human genes 0.000 description 1
- 101710013938 HSPE1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013271 Hemopexin Human genes 0.000 description 1
- 108010026027 Hemopexin Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 1
- 102100004115 ICAM1 Human genes 0.000 description 1
- 101700051176 ICAM1 Proteins 0.000 description 1
- 102100019442 ITGAL Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 229940065638 Intron A Drugs 0.000 description 1
- 108020004391 Introns Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100012475 LDLR Human genes 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102000010954 Link domain Human genes 0.000 description 1
- 108050001157 Link domain Proteins 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalins Proteins 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalins Human genes 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N M-Aminophenylboronic Acid Chemical compound NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700073680 MNT Proteins 0.000 description 1
- 102100017978 MNT Human genes 0.000 description 1
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 1
- 210000002500 Microbodies Anatomy 0.000 description 1
- 102000008789 N-cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004898 N-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 102100007544 NCAM1 Human genes 0.000 description 1
- 101700009327 NTF3 Proteins 0.000 description 1
- 102100015697 NTF3 Human genes 0.000 description 1
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 1
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 1
- 229940099990 Ogen Drugs 0.000 description 1
- 102100018130 PRLR Human genes 0.000 description 1
- 102100008799 PTEN Human genes 0.000 description 1
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 210000001322 Periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003531 Phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 1
- 108050008861 SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 102000000395 SH3 domain Human genes 0.000 description 1
- 101700015701 SPI Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 102000000890 Somatomedin B domain Human genes 0.000 description 1
- 108050007913 Somatomedin B domain Proteins 0.000 description 1
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide Dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108091008153 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102000006467 TATA-Box Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010044281 TATA-Box Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100008701 TTN Human genes 0.000 description 1
- 101710023457 TTN Proteins 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 229940094937 Thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 229960002175 Thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 240000002913 Trifolium pratense Species 0.000 description 1
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 102100019577 VCAM1 Human genes 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000024070 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091007650 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 101700018328 ccdB Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 101700079223 cybC Proteins 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 239000003316 glycosidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 101500002601 human Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 108010085650 interferon gamma receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 102000030151 myosin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091013869 myosin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010059725 myosin-binding protein C Proteins 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational Effects 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000001235 proline group Chemical group [H]N1[C@@](C(=O)[*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 239000002795 scorpion venom Substances 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 101710040918 shg Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 235000010436 thaumatin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000892 thaumatin Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 102000002933 thioredoxin family Human genes 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin family Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 thrombospondin family Human genes 0.000 description 1
- 108060008245 thrombospondin family Proteins 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 101700054908 unc-22 Proteins 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом для связывания с антителом, включающим стадии: 1) получение клеток; 2) культивирование клеток; 3) выделение гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом из клеток; 4) необязательную очистку выделенного гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом. Изобретение позволяет снижать содержание побочных продуктов при получении гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 19 ил., 7 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к гликозилированным конъюгатам молекул с повторяющимся мотивом (glycosylated repeat-motif-molecule conjugates - GEMOC), которые получают рекомбинантно, и к гликозилированию in vivo, т.е. в типах клеток, экспрессирующих конъюгат молекул с повторяющимся мотивом (repeat-motif-molecule conjugate - ЕМОС), а также к способу получения таких конъюгатов и к их применению.
Предшествующий уровень техники
Разработаны разнообразные молекулы с повторяющимся мотивом, которые отличные от классических молекул связывания антигена, например, от иммуноглобулинов.
Примером молекул с повторяющимся мотивом являются сконструированные белки с повтором анкирина (designed ankyrin repeat protein - DARPin). Белки DARPin могут экспрессироваться в функциональной форме в цитоплазме штаммов Е.coli. Повторяющийся мотив в DARPin включает последовательность из 33 остатков аминокислот. Повторы включают мотив β-витка, за которым следует пара антипараллельных α-спиралей и петля, приводящая к витку следующего повтора. Обычно от 1 до более чем 30 повторяющихся мотивов содержится в молекулах с повторяющимся мотивом анкирина, наиболее части от 4 до 6.
Kohl и др. (Kohl А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, cc.1700-1705) разработали модуль из повторов анкирина, основанный на выравнивании примерно 2000 природных повторяющихся последовательностей анкирина. Такая искусственная консенсусная последовательность повторов анкирина включает 27 фиксированных аминокислотных остатков и 6 вариабельных аминокислотных остатков, формирующих сайт связывания (часть сайта) (Forrer Р. и др., ChemBioChem 5, 2004, cc.183-189).
Для получения связывания молекул DARPin с определенной молекулой-мишенью, вариабельные аминокислотные остатки искусственной консенсусной последовательности повторов анкирина рандомизируют и выявляют специфическое связующее путем рибосомального дисплея (см., например, WO 02/020565; Hanes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, cc.4937-4942).
В US 2009/0148905 описывают антигенсвязывающие конструкции. Конструкции антитела с коротким консенсусным повтором, производным от фактора комплемента Н, описывают в WO 2008/135237. Конъюгаты антитела с РНКазой описывают в WO 2007/122511. Вирус ньюкаслской болезни (атипичной чумы птиц), включающий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота кодирует связывающий белок, обладающий терапевтическим действием при экспрессии инфицированных вирусом опухолевых клеток, описывают в US 2008/0206201. В US 2008/0248026 описывают способы PTEN/AKT и композиции, относящиеся к BMP. Рекомбинантную экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидной связью описывают в WO 2005/076902 и US 2008/0103098. В WO 2009/068649 описывают антигенсвязывающие конструкции.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении описывают конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом в гликозилированной форме, т.е. экспрессированные в клетках млекопитающих.
Соответственно, первым объектом, заявляемым в настоящем изобретении, является гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом следующей формулы:
(молекула с повторяющимся мотивом - линкерn)m - (конъюгируемый партнер)q - (линкерo - молекула с повторяющимся мотивом)p,
в которой n и o независимо друг от друга и независимо от каждой из величин m, и p, и q, означают целые числа 0 или 1, a m и p независимо друг от друга означают целые числа 0, или 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, а q независимо от величин n, m, o и p означает целое число 0 или 1,
и в которой конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования,
и в которой по меньшей мере m=q=1 или p=q=1.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулой с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом анкирина или молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или ее варианты. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер является пептидным линкером, выбранным из последовательностей SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 25-33. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер является мультимеризируемым конъюгируемый партнером. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризируемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природной или сконструированной шарнирной области тяжелой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из домена лейцинового зиппера, из домена изолейцинового зиппера, из 4-спиральных пучков и из домена тетрамеризации p53 или из их комбинации.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат по настоящему изобретению отличается тем, что имеет формулу:
((молекула с повторяющимся мотивом - линкерn)m - (конъюгируемый партнер)q - (линкерo - молекула с повторяющимся мотивом)p)r,
в которой
i) n=1, m=1, q=1, p=0, r=1, или
ii) n=1, m=1, q=1, p=0, r=2, или
iii) n=0, m=1, q=1, p=0, r=1, или
iv) n=0, m=1, q=1, p=0, r=2, или
v) m=0, o=1, q=1, p=1, r=1, или
vi)m=0, o=1, q=1, p=1, r=2, или
vii) m=0, o=0, q=1, p=1, r=1, или
viii) m=0, o=0, q=1, p=1, r=2, или
ix) m=1, n=0, o=1, q=1, p=1, r=1, или
x) m=1, n=0, o=1, q=1, p=1, r=2, или
xi) m=1, n=1, o=1, q=1, p=1, r=1, или
xii) m=1, n=1, o=1, q=1, p=1, r=1,
в которой конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природных или сконструированных шарнирных областей тяжелой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи,
и в которой молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся повтором анкирина.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат отличается тем, что по меньшей мере один олигосахарид является смесью олигосахаридов, полученных в результате экспрессии конъюгата в клетках СНО или в клетках НЕК293.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат отличается тем, что m=0, q=1, p=1, и o=0 или o=1, и r=1 или 2, причем конъюгируемый партнер выбран из конъюгата N-конца последовательности SEQ ID NO: 50, или 51, или 52 и С-конца последовательности SEQ ID NO: 43, или 44, или N-конца последовательности SEQ ID NO: 53, или 54, или 55, и С-конца последовательности SEQ ID NO: 45, или 46, и
и в котором молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся повтором анкирина.
Другим объектом, представленным в настоящем изобретении, является гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом, отличающийся включением двух гликозилированных конъюгатов молекула с повторяющимся мотивом согласно описанному в настоящем изобретении.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом представляет два гликозилированных конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом по одному из ранее описанных вариантов осуществления настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом дополнительно включает
а) если конъюгируемый партнер молекулы с повторяющимся мотивом выбран из последовательностей SEQ ID NO: 50, 51 и 52, два конъюгата N-концевой последовательности SEQ ID NO: 53 или 54 или 55 и C-концевой последовательности SEQ ID NO: 45 или 46, или
б) если конъюгируемый партнер молекулы с повторяющимся мотивом выбран из последовательностей SEQ ID NO: 53, 54 и 55, два конъюгата N-концевой последовательности SEQ ID NO: 50 или 51 или 52 и C-концевой последовательности SEQ ID NO: 43 или 44.
Другой объект, описанный в настоящем изобретении, представляет нуклеиновую кислоту, включающую следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»). Другой объект, пописанный в настоящем изобретении, представляет способ получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом согласно описанному в настоящем изобретении, включающий:
- культивирование клеток млекопитающих, включающих нуклеиновую кислоту согласно описанному в настоящем изобретении, в условиях, допускающих экспрессию молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и получения в результате гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенного гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО и клеток НЕК293.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризируемый конъюгируемый партнер является сконструированной шарнирной областью тяжелой цепи с тремя остатками цистеина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер включает сконструированную шарнирную областью тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является антикалином. В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом конъюгирована с N-концом конъюгируемого партнера.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении описаны гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом (glycosylated repeat-motif-molecule conjugates - GEMOC) общей формулы:
(молекула с повторяющимся мотивом - линкерn)m - (конъюгируемый партнер)q - (линкерo - молекула с повторяющимся мотивом)p,
в которой n и o независимо друг от друга и независимо от каждой из величин тир означают целые числа 0 или 1, m и p независимо друг от друга означают другие целые числа, а именно 0, или 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, и q независимо означает 0 или 1,
в которой конъюгируемый партнер включает по меньшей мере один сайт гликозилирования и GEMOC экспрессируется в клетках млекопитающих.
Понятие «гликозилированный» или его грамматические эквиваленты означают, что соответствующая молекула с повторяющимся мотивом включает остаток сахарида, ковалентно связанный с аминокислотой каркаса молекулы аминокислоты молекулы с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один мотив сайта N- или O-гликозилирования, или природный, или сконструированный мотив (см., SEQ ID NO: 56 и 58). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мотив сайта N-гликозилирования выбран из asp-X-thr, asp-X-ser или asp-X-cys, где Х может быть каким-либо остатком аминокислоты, но не пролином (pro, P). В другом варианте осуществления настоящего изобретения добавляют метку гликозилирования к молекуле с повторяющимся мотивом (см., например, SEQ ID NO: 60, 61, 62 и 63; см., также Meder D. и др., J. Cell Biol. 168, 2005, cc.303-313; Bulbarelli А. и др., J. Cell Sci., 115, 2002, cc.1689-1702). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат включает в качестве молекулы с повторяющимся мотивом молекулу последовательности SEQ ID NO: 62 или 63. С применением такой метки гликозилирования, включающей молекулы с повторяющимся мотивом, может быть достигнуто хорошее гликозилирование.
Понятие «клетка млекопитающего» означает клетку, выбранную из клеток СНО, клеток ВНК, клеток НЕК, клеток COS, клеток Per.C6® или клеток гибридом.
Понятие «аминокислота», применяемое в настоящем изобретении, означает группу карбокси-α-аминокислот, которые прямо или в форме предшественников могут кодироваться нуклеиновой кислотой. Отдельные аминокислоты кодируются нуклеиновыми кислотами, состоящими из трех нуклеотидов, так называемых кодонов или триплетов оснований. Каждая аминокислота кодируется по меньшей мере одним кодоном. Это явление называется «вырожденностью генетического кода». Понятие «аминокислоты», применяемое в настоящем изобретении, означает природные карбокси-α-аминокислоты, включающие аланин (трехбуквенный код: ala, обозначение одной буквой: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, H), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, P), серии (ser, S), треонин (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Понятие «антитело» означает молекулу, состоящую из одного или нескольких полипептидов, по существу кодируемых генами антитела. Антитело обычно включает два так называемых полипептида легкой цепи (легкую цепь) и два так называемых полипептида тяжелой цепи (тяжелую цепь). Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи содержит вариабельный домен (вариабельную область) (обычно амино-концевую часть полипептидной цепи), включающий области связывания, способные взаимодействовать с антигеном. Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи включает константную область (обычно с карбокси-конца). Константная область тяжелой цепи опосредует связывание антитела i) с клетками, несущими рецептор Fc-гамма (Fc gamma receptor - FcγR), например, клетками фагоцитов, или ii) с клетками, несущими неонатальный рецептор Fc (Fc receptor - FcRn), также называемый рецептором Brambell. Она также опосредует связывание некоторых факторов, включая факторы классической системы комплемента, например, компонент (C1q). Вариабельный домен легкой или тяжелой цепи антитела в свою очередь включает разные сегменты, т.е. четыре каркасных участка (framework region - FR) и три гипервариабельные области (CDR).
Понятие «шарнирная область» означает фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины от остатка в положении 216, который в норме является остатком глутаминовой кислоты, до остатка в положении 226, который в норме является остатком цистеина, или до остатка в положении 230, который в норме является остатком пролина. Шарнирная область включает остатки цистеина, которые могут формировать дисульфидные связи с соответствующими остатками цистеина второй шарнирной области, например, второй тяжелой цепи антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения шарнирная область включает два остатка цистеина.
Понятия «второй константный домен тяжелой цепи», «домен CH2» и «CH2», которые могут применяться взаимозаменяемо, означают фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины с остатка 231 по остаток 340. Домен CH2 включает остаток 297, который в норме является аминокислотой аспарагином, к которой сахарид ковалентно присоединен к аминокислотному каркасу.
Понятия «третий константный домен тяжелой цепи», «домен CH3» и «CH3», которые могут применяться взаимозаменяемо, означают фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины с остатка 341 по остаток 447, т.е. С-конец домена CH2.
Понятие «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC)» означает механизм лизиса клеток, на которые воздействуют неспецифические цитотоксические клетки, имеющие на своей поверхности Fc-рецептор (FcR), например, природных клеток-киллеров (natural killer cells - NK), нейтрофилов и макрофагов. Эти клетки распознают и лизируют клетки со связанным с поверхностью антителом, обладающим частью связывания Fc-рецептора, например, Fc-частью.
Понятие «комплемент-зависимая цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity - CDC)» означает механизм лизиса клеток, вызываемый комплементом, который инициируется путем связывания C1q, например, с антителом, связанным с его антигеном.
Понятие «связывание с молекулой-мишенью» означает специфическое взаимодействие между связывающей, т.е. обеспечивающей комплементарность, молекулой и ее связываемым партнером, т.е. специфической молекулой-мишенью. Силу такого специфического взаимодействия выражают в качестве связывающего сродства, представленного в виде величины KD. Понятие «неспецифическое связывание с молекулой-мишенью» означает неспецифическое взаимодействие между связывающей молекулой и ее молекулами-мишенями с величиной KD 10-5 моль/л или больше (например, 10-3 моль/л), в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной KD 10-6 моль/л или больше. Связывающее сродство определяют с помощью стандартного анализа связывания, например, метода поверхностного плазменного резонанса (BIAcore®). Эта величина связывающего сродства не расценивается в качестве точного значения, это всего лишь контрольная точка. Понятие «специфическое связывание с молекулой-мишенью» означает специфическое взаимодействие между связывающей молекулой и ее молекулой-мишенью с величиной KD 10-7 моль/л или меньше (например, 10-10 моль/л), в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной KD 10-8 моль/л или меньше.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения повторы молекулы с повторяющимся мотивом составляют от 20 до 40 остатков аминокислот в длину. Повторы собраны в отдельные структурные единицы, которые вместе формируют молекулу с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом выбрана из молекулы с повторяющимся мотивом анкирина и молекулы с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином (leucine-rich-repeat-motif-molecule - LRRP).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер включает иммуноглобулиновый мембранный якорный домен или GPI-якорный домен.
Понятие «молекула с повторяющимся мотивом» означает природный или искусственный полипептид, который может экспрессироваться в виде одной молекулы, т.е. не конъюгировать со второй молекулой или со второй собственной копией, в растворимой форме в цитоплазме или периплазме Е.coli. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере две структурно идентичные единицы (два повтора). Не требуется, чтобы эти единицы были идентичными gj аминокислотной последовательности. Эти единицы могут быть независимо сворачивающимися доменами, но это не является обязательным условием. Молекула с повторяющимся мотивом может, но не обязана, включать другие отрезки последовательности помимо повторяющихся единиц. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся мотивом анкирина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином.
Понятие «молекула с повторяющимся мотивом анкирина» означает искусственный полипептид, включающий от 1 до 30 консенсусных последовательностей, состоящих из 33 аминокислотных остатков. Каждый из повторов включает мотив β-витка, за которым следует пара антипараллельных α-спиралей и петля, приводящая к витку следующего повтора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина включает от 1 до 30 повторов, в другом варианте осуществления настоящего изобретения включает от 2 до 10 повторов, и в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения включает от 3 до 6 повторов.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина, производив от одной из следующих консенсусных последовательностей путем случайного мутагенеза и отбора по связыванию молекулы-мишени, например, путем рибосомального дисплея, дрожжевого дисплея и фагового дисплея:
DGNT(P,A)LHLA(A,V) ENG(H,N)LE(I,V)VKL L(L,I)EAGA(D,N)INA (SEQ ID NO: 01),
DSDGNTPLHL AAENGQLEVV KLLLEAGADV NAR (SEQ ID NO: 02),
(D,T)KNGLTPLH(L,I) AAQEGHLEVV KLLLENGA(D,N)(V,I) NAK (SEQ ID NO: 03),
DxxGxTPLHL AAxxGHLEIV EVLLK(H,N,Y)GADV NAx (SEQ ID NO: 04),
ADVNAKDKDG YTPLHLAARE GHLEIVEVLL KAG (SEQ ID NO: 05),
DxxGxTPLHLAaxxGpxpaVpxLLpxGADVNAx (SEQ ID NO: 06),
DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 07),
DxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 08),
D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1 (SEQ ID NO: 09),
в указанных последовательностях «x» обозначает в полной мере вариабельное положение,
аминокислоты, приведенные в скобках, обозначают специфические варианты, возможные в этом положении,
«а» обозначает аминокислоту с неполярной боковой цепью,
«p» обозначает остаток аминокислоты с полярной боковой цепью,
«1» обозначает остаток аминокислоты, выбранный из группы, включающей (выраженные в однобуквенном коде) остатки аминокислот A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y, и
«2» обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, включающей остатки аминокислот Н, N и Y.
Молекулы GEMOC, включающие молекулы с повторяющимся мотивом анкирина, связывающиеся с какой-либо заранее определенной молекулой-мишенью, могут быть получены путем скрининга библиотек, включающих рандомизированные молекулы GEMOC или рандомизированные молекулы с повторяющимся мотивом анкирина, например, с помощью рибосомального дисплея (см., например, WO 02/120565; Hanes J., Plückthun A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, cc.4937-4942).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает N-концевой кэпированный повтор аминокислотной последовательности DLGKKLLE AARAGQDDEVRILMANGADV (SEQ ID NO: 47).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает C-концевой кэпированный повтор аминокислотной последовательности VNAQDKFGKT AFDISIDNGNEDLAEILQ (SEQ ID NO: 48).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекулой с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином (leucine-rich-repeat-motif-molecule - LRR). Способы получения молекул с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином, описаны в WO 2006/083275.
В целом действие антител выбрано из нейтрализующего действия, нацеливающего действия в отношении токсической части молекулы, или эффекторной функции.
На фиг.1 показана конструкция домена антитела. Антитело полной длины включает две так называемые легкие цепи и две так называемые тяжелые цепи. Каждая из легких цепей в свою очередь включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи выбран из домена типа каппа и домена типа лямбда. Каждая из тяжелых цепей в свою очередь включает вариабельный домен тяжелой цепи, первый константный домен тяжелой цепи (CH1), шарнирную область, второй константный домен тяжелой цепи (CH2), третий константный домен тяжелой цепи (CH3) и необязательно четвертый константный домен тяжелой цепи (CH4). Кроме того, включает дисульфидные связи антитела полной длины между константным доменом легкой цепи и первым константным доменом тяжелой цепи, а также две дисульфидные связи между вторыми константными доменами тяжелой цепи двух тяжелых цепей.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером в молекуле GEMOC является тяжелая цепь антитела полной длины или легкая цепь антитела полной длины, но каждая без вариабельного домена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером в GEMOC является тяжелая цепь антитела или легкая цепь антитела, каждая из которых с вариабельным доменом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом конъюгирована с С-концом соответствующей цепи антитела непосредственно или через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает две молекулы GEMOC предшествующего варианта осуществления настоящего изобретения.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером является легкая или тяжелая цепь анти-Aβ антитела. Такое анти-Aβ антитело и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, например, описаны в WO 2003/070760, или US 2005/0169925, или представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 50-55 или их варианта.
Конъюгаты согласно описанному в настоящем изобретении включают различные варианты, содержащие одну или несколько молекул с повторяющимся мотивом, каждая из которых связывается с той же молекулой-мишенью или с другими молекулами-мишенями. В конъюгатах, согласно описанному в настоящем изобретении, с одним концом молекулы без неповторяющегося мотива, т.е. конъюгируемого партнера, независимо от наличия связи с С-концом или с N-концом, ковалентно связана только одна, т.е. единственная молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана.
Первый вариант является конъюгатом, включающим две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, каждая из которых связывается с одной и той же или с разными молекулами-мишенями, причем каждая пара молекул с повторяющимся мотивом соединена пептидным линкером. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения число молекул с повторяющимся мотивом выбрано из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти. На фиг.2 показаны примеры конъюгатов, включающих две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, соединенных пептидными линкерами.
Вторым конъюгатом является конъюгат, включающий одну или несколько молекул с повторяющимся мотивом и одну или несколько молекул без повторяющихся мотивов. Каждая из молекул с повторяющимся мотивом связывается с одной и той же или с разными молекулами-мишенями. Молекула без повторяющегося мотива обеспечивает каркас молекулы, с которым одна или несколько молекул с повторяющимся мотивом ковалентно связаны, необязательно и независимо друг от друга через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов выбрана из домена антитела CL, домена антитела CH1, шарнирной области антитела, домена антитела CH2, домена антитела CH3, домена антитела CH4, мотивов мембранного якоря, трансмембранных доменов, последовательностей метки гликозилирования, последовательностей метки для очистки или обнаружения, или комбинации одного или нескольких из указанных структур, или их природных или сконструированных вариантов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает два или несколько полипептидов, ковалентно связанных вместе одной или несколькими дисульфидными связями. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов является Fc-часть антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулой без повторяющихся мотивов является димер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, или димер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу домен CH1, шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, или тетрамер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу домен CH1, шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, и два мономера, включающих константный домен легкой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения каждый из мономеров независимо друг от друга дополнительно включают вариабельный домен.
Понятие «пептидный линкер» означает линкеры природного и/или синтетического происхождения, включающие аминокислотные остатки, соединенные друг с другом пептидными связями. Они состоят из линейной аминокислотной цепи, в которой 20 природных аминокислот представлены мономерными строительными блоками. Длина цепи составляет от 1 до 50 аминокислотных остатков, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от 3 до 28 аминокислотных остатков, в другом варианте осуществления настоящего изобретения от 4 до 20 аминокислотных остатков. Линкер может включать повторяющиеся аминокислотные последовательности или последовательности природных полипептидов. Функция линкера заключается в гарантировании того, что складчатость двух компонентов, соединенных через линкер, будет корректной и может быть представлена должным образом из-за стерической и ротационной свободы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкером является «синтетический пептидный линкер», который обозначен в качестве обогащенного остатками глицина, глутамина и/или серина. Эти остатки собраны, например, в малые повторяющиеся единицы, содержащие до пяти аминокислот, например, (G)GGGS, (Q)QQQG, или (S)SSSG (SEQ ID NO: 14, 15 и 16). Такие малые повторяющиеся единицы могут быть повторены от двух до пяти раз для формирования мультимерной единицы. Другие синтетические пептидные линкеры составлены из одной аминокислоты, повторенной 10-20 раз, например, серин в линкере GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 17). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер выбран из [GQ4]3GNN (SEQ ID NO: 18), LSLSPGK (SEQ ID NO: 19), LSPNRGEC (SEQ ID NO: 20), LSLSGG (SEQ ID NO: 21), LSLSPGG (SEQ ID NO: 22), G3[SG4]2SG (SEQ ID NO: 23) или G3[SG4]2SG2 (SEQ ID NO: 24).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер содержит от 4 до 20 аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения между молекулами с повторяющимся мотивом имеется один и тот же линкер, в другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат содержит линкер с двумя или несколькими разными аминокислотными последовательностями. В другом варианте осуществления настоящего изобретения линкер выбран из (G3S), (G3S)2, (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G4S), (G4S)2, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5 (SEQ ID NO: 14 и 25-33), предпочтительно из (G4S)3 и (G4S)4 (SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат согласно описанному в настоящем изобретении включает одну молекулу с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов, и необязательно пептидный линкер между этими молекулами. Молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана или с С-концом, или с N-концом одной молекулы без повторяющихся мотивов или с одним из С-концов, или с одним из N-концов полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов.
На фиг.3-5 показаны примеры конъюгатов вариантов осуществления настоящего изобретения второго варианта. На фиг.3 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом разных отдельных доменов антител. На фиг.4 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом комбинаций двух, трех или четырех доменов антитела. На фиг.5 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом связанных дисульфидной связью доменов антител (CL-CH1 или шарнир-шарнир), необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат согласно описанному в настоящем изобретении включает две молекулы с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов, и необязательно до двух пептидных линкеров. Одна молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана с С-концом и одна с N-концом молекулы без повторяющихся мотивов, или обе ковалентно связаны с С-концом или с N-концом полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов, или одна из молекул с повторяющимся мотивом ковалентно связана с С-концом и одна ковалентно связана с N-концом полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов. Указанные С-конец и N-конец являются концами одного полипептида или разных полипептидов. На фиг.6-8 показаны примеры конъюгатов по настоящему изобретению. На фиг.6 две молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей только один С-конец и один N-конец, причем молекула без повторяющихся мотивов может включать один или несколько доменов антител. На фиг.7 и 8 две молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей дисульфидную связь между доменами антитела, необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает четыре молекулы с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно от одного до четырех пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, ковалентно связанные в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекул без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения две из молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом, и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов. На фиг.9-11 показаны примеры конъюгатов настоящего варианта осуществления изобретения. На фиг.9 четыре молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, включая два С-конца и два N-конца, причем молекула без повторяющихся мотивов может включать один или несколько доменов антител. На фиг.10 и 11 четыре молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей связанные дисульфидной связью домены антител, необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает шесть молекул с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно до шести пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, ковалентно связанные, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекулы без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения четыре молекулы из числа молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом, и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов, и две молекулы без повторяющихся мотивов не конъюгированы друг с другом, но каждая конъюгирована с одним концом молекулы без повторяющихся мотивов. На фиг.12 показан пример конъюгата по настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает восемь молекул с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно до восьми пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, связанных ковалентно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекулы без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения от двух до восьми молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов и оставшееся число молекул с повторяющимся мотивом не конъюгированы друг с другом, но каждая конъюгирована с одним концом молекулы без повторяющихся мотивов.
Молекула с повторяющимся мотивом может быть производной каркаса молекулы, выбранного из группы, включающей CTLA-4 (фирма Evibody), липокалин, молекулы - производные от белка А, например, Z-домен белка А (фирма Affibody, SpA), А-домен (фирма Avimer, Maxibody), белки теплового шока, например, GroE1 и GroES, трансферрин (трансантитело), пептидный аптамер, домен лектина С-типа (тетранектин), y-кристаллин человека и убиквитин (аффилины), домены PDZ, токсин скорпиона, домены типа kunitz ингибиторов протеазы человека, и фибронектин (аднектин), молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Src-гомологичных доменов (например, домены SH2 или SH3), молекулы с повторяющимся мотивом, производные от доменов PDZ, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от бета-лактамазы, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от ингибиторов протеазы высокого сродства, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от малых каркасов молекул дисульфид-связанных белков, например, токсины скорпиона, молекулы с повторяющимся мотивом, включающие повторяющие домены связывания, например, EGF-подобный домен, Kringle-домен, PAN домен, Gla домен, SRCR домен, Kunitz домен, домен ингибитора панкреатического трипсина быка, домен ингибитора сериновой протеазы типа Kazal, домен Trefoil (P-типа), домен фактора фон Виллебранда типа С, анафилатоксиноподобный домен, домен CUB, повтор тироглобулина типа I, домен LDL-рецептора класса А, домен Sushi, домен Link, домен тромбоспондина типа I, иммуноглобулино-подобные домены, домен лектина С-типа, домен МАМ, домен фактора фон Виллебранда типа А, домен соматомедина В, коровый домен с четырьмя дисульфидными связями WAP-типа, домен F518 типа С, домен Hemopexin, EGF-подобный домен типа ламинина, домен C2, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Avimers, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Telobody, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Evibody, молекул с повторяющимся мотивом, производные от Microbody (см., например, Jeong K.J., Silverman J., Nat. Biotechnol. 23, 2005, cc.1493-1494; Panni S. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, cc.21666-21674; Schneider S. и др., Nat. Biotechnol. 17, 1999, cc.170-175; Legendre D. и др., Protein Sci. 11, 2002, cc.1506-1518; Stoop A.A. и др., Nat. Biotechnol. 21, 2003, cc.1063-1068; Vita С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1995, cc.6404-6408; WO 2006/055689; US 2006/0234299).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает конъюгируемого партнера, выбранного из подструктуры антитела, минибоди, аднектина, антикалина, аффибоди, аффилина, кноттина, глибоди, лектино-подобного доменного белка С-типа, сконструированных белков с повтором анкирина (designed ankyrin repeat protein - DARPin), тетранектина, доменного белка kunitz, тиоредоксина, цитохрома b562, каркаса молекулы цинкового пальца, каркаса молекулы нуклеазы стафилококка, фибронектина или димера фибронектина, тенасцина, N-кадгерина, E-кадгерина, ICAM, титина, GCSF-рецептора, рецептора цитокина, ингибитора гликозидазы, антибиотического хромопротеина, молекулы адгезии к миелиновой мембране РО, CD8, CD4, CD2, класса I ГКГ, антигенного рецептора Т-клеток, CD1, C2 и I-set доменов VCAM-1, 1-set домена иммуноглобулина миозинсвязывающего белка С, 1-set домена иммуноглобулина миозинсвязывающего белка Н, 1-set домена иммуноглобулина телокина, NCAM, твитчина, нейроглианы, рецептора гормона роста, рецептора эритропоэтина, рецептора пролактина, рецептора интерферона-гамма, β-галактозидазы/глюкуронидазы, β-глюкуронидазы, трансглутаминазы, антигенного рецептора Т-клеток, супероксиддисмутазы, домена тканевого фактора, цитохрома F, зеленого флуоресцирующего белка, GroEL и тауматина.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером является антикалин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антикалин является антикалином А-44. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и/или SEQ ID NO: 65, и/или SEQ ID NO: 66. Установлено, что молекулы GEMOC, включающие антикалин, могут экспрессироваться на высоких уровнях по сравнению с молекулами GEMOC, включающими DARPin. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антикалин гибридизирован с Fc-частью антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения Fc-частью является Fc-часть IgG1 человека или IgG4 человека с мутациями или без мутаций. Примерами мутаций являются замены аминокислот L234A и L235A в IgG1 и S228P и L235E в IgG4.
Установлено, что благоприятно для выработки молекул GEMOC, включающих молекулы с повторяющимся мотивом, гибридизируют с N-концом Fc-части антитела, например, Fc-части IgG1 человека или Fc-части IgG4 человека с установленными выше аминокислотными заменами или без них, чтобы шарнирная область включала три межцепочечных дисульфидные связи. По сравнению с конъюгатами, содержащими два межцепочечных дисульфидных мостика в шарнирной области, конъюгаты с тремя межцепочечными дисульфидными связями в шарнирной области могут быть получены с пониженным содержанием побочных продуктов, особенно касающихся фрагментации.
Ранее описанные в настоящем изобретении молекулы GEMOC, включающие две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, обеспечивают возможность биспецифического, трехспецифического или тетраспецифического связывания конструкциями молекул-мишеней. Понятие «биспецифичные» означает, что GEMOC включает по меньшей мере две молекулы с повторяющимся мотивом, связывающиеся с двумя разными молекулами-мишенями. Понятие «трехспецифичные» означает, что GEMOC включает по меньшей мере три молекулы с повторяющимся мотивом, связывающиеся с тремя разными молекулами-мишенями. Понятие «тетраспецифичные» означает, что GEMOC включает по меньшей мере четыре молекулы с повторяющимся мотивом, связывающиеся с четырьмя разными молекулами-мишенями.
В том случае, когда молекула GEMOC включает домены антитела, получение ошибочно спаренных побочных продуктов, а также фрагментов, обходят или по меньшей мере минимизируют для достижения приемлемого уровня продуктивности и для того, чтобы избежать необходимости в проведении сложных процедур очистки. Подход, заключающийся в том, чтобы обойти проблему ошибочно спаренных подобных продуктов, который называют «выступ-во-впадину», направлен на усиление спаривания двух разных конъюгатов, каждый из которых включает домен CH3 тяжелых цепей антитела путем внедрения мутаций в домены CH3 для модификации поверхности контакта. В одной цепи объемные аминокислоты замещены аминокислотами с короткими боковыми цепями для создания «впадины». Наряду с этим аминокислоты с большой боковой цепью интродуцируют в другой домен CH3 для создания «выступа». Путем совместной экспрессии этих двух модифицированных конъюгатов наблюдают высокие уровни образования гетеродимера («выступ-впадина») относительно формирования гомодимера («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (см., например, Ridgway J.B., Protein Eng. 9, 1996, ее. 617-621; WO 96/027011). Другим подходом к четкому снижению формирования ошибочно спаренных побочных продуктов является применение метода, называемого «обмен домена» или «пересечение». Используют имеющееся специфическое взаимодействие между доменами антитела CL и CH1. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер в молекулах GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении включает два полипептида, из которых один включает константный домен легкой цепи антитела (CL) и другой включает первый константный домен тяжелой цепи антитела (CH1). Примеры биспецифичных молекул GEMOC показаны на фиг.13.
Понятие «целевая молекула (молекула-мишень)» означает молекулу, которая комплементарна и предоставляет сайты взаимодействия для взаимодействия с молекулой с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения целевая молекула выбрана из молекул на поверхности клеток, растворимых молекул на поверхности клеток, цитокинов, гормонов, ферментов, иммуноглобулинов, токсинов, белков вирусных частиц, белков бляшек и предшественников белков бляшек или наночастиц.
Молекулы GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении включают конъюгируемый партнер, обеспечивая каркас молекулы для присутствия молекулы (молекул) с повторяющимся мотивом. Такой конъюгируемый партнер может обеспечить дополнительную функциональность, например, функциональность связывания рецептора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер выбран из доменов антител, в другом варианте осуществления настоящего изобретения включает домен CH2 антитела. Домен CH2 антитела обеспечивает функциональность связывания Fc-рецептора, которая требуется для ADCC или CDC. В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером является молекула, которая может мультимеризироваться или ассоциироваться с другими GEMOC, включающими тот же конъюгируемый партнер или соответствующий комплементарно присоединенный партнер. Такой мультимеризируемый конъюгируемый партнер или пара конъюгируемого партнера и комплементарно ассоциированного партнера в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выбраны из лейциновых зипперов, пары, включающей регуляторную субъединицу сАМВ-зависимой протеинкиназы А (PKA) и заякоривающего домена якорных белков киназы (kinase anchoring proteins - AKA).
Применяемый конъюгируемый партнер в молекулах GEMOC должен происходить от человека, обладать высокой стабильностью в отношении складывания и разрушения, быть «инертным», т.е. не иметь функции цитокина или передачи сигнала, легким и экономичным в получении, допускающим дополнительную переработку (например, протеолитическое расщепление, химическую модификацию пептида, пост-трансляционную модификацию), соответствующего размера (без почечной фильтрации) или другую системную элиминацию и не иметь свойств иммуногенности.
Понятие «мультимеризирующий конъюгируемый партнер» означает молекулы, способные ковалентно или нековалентно ассоциировать два или несколько отдельных GEMOC. Мультимеризирующие конъюгируемые партнеры в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выбраны из домена лейцинового зиппера (Kostelny S.A. и др., J. Immunol. 148, 1992, ее. 1547-1553; de Kruif J. и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, cc.7630-7634), дрожжевого GCN4 лейцинового зиппера, домена изолейцинового зиппера, мотива спираль-виток-спираль (Pack Р. и др., Biotechnol. 11, 1993, cc.1271-1277), max-взаимодействующих белков и родственных молекул (US 5512473), доменов полиглутаминовой кислоты-полилизина (US 5582996), природной или сконструированной пары доменов CH2-CH3 тяжелой цепи, природной или сконструированной пары доменов CH1 тяжелой цепи - константного домена легкой цепи (Mueller К.М. и др., FEBS Lett. 422, 1998, cc.259-264), домена из 180 аминокислот с карбокси-конца связывающего белка ТАТА (Colemen R.A. и др., J. Biol. Chem. 270, 1995, cc.13842-13849), VCAM и VLA-4, интегринов и внеклеточных матриксных белков, интегринов и молекул на поверхности клетки (например, CD54 или CD 102), молекул клеточной адгезии активированных лейкоцитов (activated leukocyte cell adhesion molecule - ALCAM), глутатионтрансферазы, доменов SRCR, рецептора димерной пары (например, рецептора интерлейкина-8 (IL-8R), гетеродимеров интегрина (например, LFA-1 и GPIIIb/IIIa), или только области (областей) их димеризации, димерных лигандных полипептидов (например, фактора роста нервов (nerve growth factor - NGF), нейротрофина-3 (NT-3), интерлейкина-8 (IL-8), фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor - VEGF) и нейротрофического фактора мозга (brain-derived neurotrophic factor - BDNF) (см., например, Arakawa Т. и др., J. Biol. Chem. 269, 1994, ее. 27833-27839; Radziejewski С. и др., Biochem. 32, 1993, cc.13350-6), или только области (областей) их димеризации, обычно пары остатков цистеина, способных формировать дисульфидную связь, пары пептидов или полипептидов, каждый из которых включает по меньшей мере один остаток цистеина (например, из примерно одного, двух или от трех до примерно десяти остатков цистеина) таким образом, что дисульфидная связь (связи) могут формироваться между пептидами или полипептидами, в основном доменами двойной спирали (см., например, Lupas А. и др.. Science 252, 1991, cc.1162-1164), домена тетрамеризации p53, N-концевых остатков (20-80 аминокислот) олигомерного матриксного белка хряща (cartilage oligomeric matrix protein - COMP), альфа-спиральных последовательностей (см., например, Eisenberg D. и др., Protein 1, 1986, cc.16-22; Но S.P., DeGrado W.F., J. Am. Chem. Soc. 109, 1987, cc.6751-6758; Regan L., DeGrado W.F., Science 241, 1988, cc.976-978; Hill С.P. и др., Science 249, 1990, cc.543-546; Pluckthun A., Pack P., Immunotechnol. 3, 1997, cc.83-105). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризуемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, природной или сконструированной шарнирной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения мультимеризуемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения мультимеризуемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи.
Антитела могут протеолитически расщепляться ферментом папаином близко к N-концевой стороне такой шарнирной области, приводя к двум антигенсвязывающим фрагментам (Fab) и одному фрагменту константной области (Fc). Фрагмент Fab состоит из целой легкой цепи и N-концевого фрагмента тяжелой цепи, включающей домен VH и CH1. Fc-часть в свою очередь включает оставшиеся домены двух тяжелых цепей, связанных дисульфидными связями в шарнирной области.
Fc-часть антитела взаимодействует с компонентами иммунной системы, например, каскадом комплемента (комплемент-зависимая цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity- CDC)) или путем связывания с рецепторами Fc-гамма (антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC)) или цитотоксичными эффекторными клетками. Для изменения эффекторной функции Fc-части могут быть произведены замещения аминокислотных остатков (US 5648260; US 5624821). Fc-часть ответственна за опосредование эффекторных функций, например, индукции цитокина, ADCC, фагоцитоза, комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) и периода полураспада/скорости клиренса антитела и комплексов антиген-антитело. Fc-часть обычно начинается с положения 226 (Cys) или 230 (Pro) и продолжается до С-конца тяжелых цепей антитела.
Молекулы GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении являются гликозилированными белками, включающими один или несколько углеводных остатков. Получение белков in vivo включает стадии посттрансляционной модификации, особенно гликозилирования. Остатки сахаров (глюкозиды) ферментативно присоединяют к аминокислотной последовательности белка по мотивам N- или O-гликозилирования. Антителами, например, являются гликозилированные белки с одной или несколькими углеводными частями молекулы в Fc-части и в вариабельных доменах. Углеводные части молекулы в Fc-части по меньшей мере частично ответственны за эффекторную функцию и только менее важны для связывания антигена или период полураспада антитела (Jefferis R., Biotechnol. Prog. 21, 2005, cc.11-16).
В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи антитела (иммуноглобулины) делятся на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов дополнительно делятся на подклассы (изотипы), т.е. иммуноглобулины класса IgG делятся на подклассы IgGI, IgG2, IgG3 и IgG4, или иммуноглобулины класса IgA делятся на подклассы IgA1 и IgA2. В соответствии с классом иммуноглобулина, к которому принадлежит антитело, константные области тяжелой цепи иммуноглобулинов называются α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) и µ (IgM), соответственно. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена легкие цепи антител обозначают легкими цепями каппа (κ) или лямбда (λ).
Понятие «гликозилированные» означает, что олигосахариды присоединены по меньшей мере к одному аминокислотному остатку. Из-за участия множества ферментов в пост-трансляционном гликозилировании в клетках, т.е. in vivo, рекомбинантный полипептид получают, имея неоднородное гликозилирование, т.е. гетерогенное гликозилирование, из-за клеточной экспрессии полипептида. В связи с этим рекомбинантно получаемый полипептид включает не только один, определенный N- или O-связанный олигосахарид по определенному специфическому аминокислотному остатку, но имеется смесь полипептидов, каждый из которых содержит ту же аминокислотную последовательность, но включает разные олигосахариды по определенным аминокислотным положениям, т.е. вариант гликозилирования. Следовательно, гликозилированная молекула ЕМОС представляет группу конъюгатов, каждый из которых имеет одну и ту же аминокислотную последовательность, но с разными олигосахаридами, присоединенными к аминокислоте в определенном положении. Понятие «олигосахарид», применяемое в настоящем описании, означает полимерный сахарид, включающий две или несколько ковалентно связанных моносахаридных единиц. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования, представляет смесь олигосахаридов, полученных экспрессией конъюгата в клетках СНО или в клетках НЕК293, т.е. олигосахарид представляет смесь олигосахаридов, полученных путем посттрансляционной модификации клеток, экспрессирующих конъюгат, т.е. это признак, свойственный клеткам, экспрессирующим конъюгат. Гликозилирование и конфигурация гликозилирования, наблюдаемая в клетке, экспрессирующей полипептид, т.е. in vivo, полностью отличны от гликозилирования или конфигурации гликозилирования, наблюдаемых in vitro.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения молекул GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении путем экспрессии соответствующих кодирующих нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих.
В подробном изложении в настоящем изобретении описывают способ получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом в клетках млекопитающих, включающий:
- обеспечение клеток млекопитающих, включающих нуклеиновую кислоту, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- культивирование клеток в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и посредством этого получение гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенной гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом.
Молекулы GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении могут быть получены в клетках млекопитающих, т.е. в виде гликозилированных in vivo конъюгатов молекулы с повторяющимся мотивом. В настоящем изобретении описан способ получения конъюгатов молекулы с повторяющимся мотивом в гликозилированной форме, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в виде гликозилированных in vivo форм. Такое гликозилирование in vivo, т.е. гликозилирование в той же клетке, которая также экспрессирует конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом, является специфической клеточной пост-трансляционной модификацией. Рекомбинантно вырабатываемые полипептиды могут быть гликозилированными in vitro, т.е. после выделения из образующих их клеток (см., например, Leung S. и др., J. Immunol. 154, 1995, cc.5919-5926; US 5443953 по антителам).
Способы очистки полипептидов и иммуноглобулинов хорошо разработаны и широко применяются, или по отдельности, или в комбинации. Такими способами, например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, являются аффинная хроматография, использующая белки микробного происхождения (например, аффинная хроматография с белком А или белком G), ионообменная хроматография (например, катион-обменная (карбоксиметильные смолы), анион-обменная (аминоэтильные смолы) и смешанного типа обменная хроматография), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматической адсорбции (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами или m-аминофенилборной кислотой), метал-хелатирующая аффинная хроматография (например, с Ni(II)- и Cu(II)-аффинным материалом), эксклюзионная хроматография и методы препаративного электрофореза (например, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, cc.93-102). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения содержимое хроматографической колонки является хроматографическим материалом, выбранным из аффинного хроматографического материала, или ионообменного хроматографического материала, или тиофильного адсорбционного хроматографического материала, или хроматографического материала гидрофобного взаимодействия, или ароматического адсорбционного хроматографического материала, или хелатирующего металлы материала аффинной хроматографии, или материала для эксклюзионной хроматографии.
Для получения секретируемого полипептида целевой структурный ген также может включать сегмент ДНК, который кодирует сигнальную последовательность/лидерный пептид. Сигнальная последовательность направляет вновь синтезированный полипептид к мембране и через мембрану эндоплазматической сети (ЭС), куда полипептид может поступать для секреции. Сигнальная последовательность расщепляется сигнальными пептидазами при прохождении белка через мембрану ЭР. В том, что касается функции сигнальной последовательности, важным является распознавание механизмом секреции клетки-хозяина. Соответственно применяемая сигнальная последовательность распознается белками клетки-хозяина и ферментами механизма секреции.
Элементы регуляции трансляции включают инициацию трансляции (AUG) и стоп-кодон (ТАА, TAG или TGA). Внутренняя сторона входа рибосомы (internal ribosome entry site - IRES) может быть включена в некоторые конструкции.
Таким образом, другим объектом согласно описанному в настоящем изобретении, является нуклеиновая кислота для экспрессии конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом в клетках млекопитающих, которая включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор из цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 5'-нетранслируемая область гена зародышевой линии антитела является геном зародышевой линии антитела человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина является сигнальной последовательностью тяжелой цепи иммуноглобулина мыши или человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина включает интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]).
Сущность настоящего изобретения ниже может быть пояснена на примерах с двумя модельными молекулами с повторяющимся мотивом, связывающимися с HER2 (DARPin H10-2-G3, каркас молекулы N2C (2 повтора), Zahnd С.и др., J. Mol. Biol. 369, 2007, cc.1015-1028; DARPin 9-26, каркас мол N3C (3 повтора), Steiner D. и др., J. Mol. Biol. 382, 2008, cc.1211-1227). Четыре экспрессируемые конструкции для экспрессии таких молекул GEMOC в клетках НЕК.293 были проанализированы (в направлении от N-конца к С-концу):
1) лидерный пептид - молекула с повторяющимся мотивом - метка из шести остатков гистидина,
2) лидерный пептид- молекула с повторяющимся мотивом - фрагмент Fc иммуноглобулина,
3) лидерный пептид - фрагмент Fc иммуноглобулина - молекула с повторяющимся мотивом,
4) лидерный пептид - фрагмент Fc иммуноглобулина - молекула с повторяющимся мотивом.
Таким образом, другими объектами согласно описанному в настоящем изобретении являются молекулы GEMOC последовательностей SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, молекулы GEMOC, включающие SEQ ID NO: 11 и 11, SEQ ID NO: 13 и 13, SEQ ID NO: 11 и 13, SEQ ID NO: 34 и 34, SEQ ID NO: 35 и 35, SEQ ID NO: 34 и 35, SEQ ID NO: 36 и 37, SEQ ID NO: 39 и 39, а также соответствующие нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и соответствующие нуклеиновые кислоты с этими кодирующими нуклеиновыми кислотами и комбинации последовательностей, и способы получения таких молекул GEMOC.
Приводимые ниже примеры, перечень последовательностей и фигуры предусмотрены для разъяснения настоящего изобретения, истинная область охвата которого приводится ниже в прилагаемой формуле настоящего изобретения. Очевидно, что могут быть произведены модификации в приводимых ниже процедурах, не отклоняясь от духа настоящего изобретения.
Описание перечня последовательностей
SEQ ID NO: 01. Аминокислотная консенсусная последовательность 1 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 02. Аминокислотная консенсусная последовательность 2 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 03. Аминокислотная консенсусная последовательность 3 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 04. Аминокислотная консенсусная последовательность 4 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 05. Аминокислотная консенсусная последовательность 5 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 06. Аминокислотная консенсусная последовательность 6 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 07. Аминокислотная консенсусная последовательность 7 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 08. Аминокислотная консенсусная последовательность 8 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 09. Аминокислотная консенсусная последовательность 9 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 10. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 11. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1.
SEQ ID NO: 12. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 13. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1.
SEQ ID NO: 14-33. Последовательности пептидных линкеров.
SEQ ID NO: 34. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с двумя дисульфидными связями в шарнирной области.
SEQ ID NO: 35. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с двумя дисульфидными связями в шарнирной области.
SEQ ID NO: 36. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с CH3-выступ-доменом.
SEQ ID NO: 37. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с CH3-впадина-доменом.
SEQ ID NO: 38. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом 9-26.
SEQ ID NO: 39. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgGI с двумя дисульфидными связями в шарнирной области с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом 9-26.
SEQ ID NO: 40. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 41. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 42. Димерная модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 43. Константная область IgG1 человека.
SEQ ID NO: 44. Константная область IgG4 человека.
SEQ ID NO: 45. Константная область домена каппа человека.
SEQ ID NO: 46. Константная область домена лямбда человека.
SEQ ID NO: 47. N-концевой кэпированный повтор.
SEQ ID NO: 48. C-концевой кэпированный повтор.
SEQ ID NO: 49. Последовательность промотора цитомегаловируса (CMV).
SEQ ID NO: 50. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 51. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 52. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 53. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 54. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 55. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 56. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и интродуцированным сайтом гликозилирования в начале C-кэпированного повтора.
SEQ ID NO: 57. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 и конъюгированный с ней с С-конца домен мембранного якоря.
SEQ ID NO: 58. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и интродуцированным сайтом гликозилирования в начале C-кэпированного повтора.
SEQ ID NO: 59. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 и конъюгированный с ней с С-конца домен мембранного якоря.
SEQ ID NO: 60. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования в области С-конца.
SEQ ID NO: 61. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования в области С-конца.
SEQ ID NO: 62. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования.
SEQ ID NO: 63. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования.
SEQ ID NO: 64. Модельный конъюгат, включающий антикалин А-44 с меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 65. Модельный антикалин А-44 с меткой Fc и тремя дисульфидными мостиками в шарнирной области.
SEQ ID NO: 66. Модельный антикалин А-44 с меткой Fc и двумя дисульфидными мостиками в шарнирной области.
Описание фигур
Фиг.1. Схематическое представление конструкции домена антитела и легенда с обозначениями для последующих фигур.
Фиг.2. Примеры конъюгатов, включающих две или несколько молекул с повторяющимся мотивом.
Фиг.3. Примеры конъюгатов одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом разных отдельных доменов антител.
Фиг.4. Примеры конъюгатов одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом комбинаций двух, трех или четырех доменов антител.
Фиг.5. Примеры конъюгатов одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом связанных дисульфидной связью доменов антитела.
Фиг.6. Примеры конъюгатов двух молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих только один С-конец и один N-конец.
Фиг.7. Примеры конъюгатов двух молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих домены антител, связанные дисульфидной связью (часть 1).
Фиг.8. Примеры конъюгатов двух молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих домены антител, связанные дисульфидной связью (часть 2).
Фиг.9. Примеры конъюгатов четырех молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих два С-конца и два N-конца.
Фиг.10. Примеры конъюгатов четырех молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих связанные дисульфидной связью домены антител (часть 1).
Фиг.11. Примеры конъюгатов четырех молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих связанные дисульфидной связью домены антител (часть 2).
Фиг.12. Пример конъюгата шести молекул с повторяющимся мотивом и одной молекулы без повторяющихся мотивов.
Фиг.13. Примеры молекул GEMOC с замененными доменами.
Фиг.14. Плазмидная карта плазмиды экспрессии 9800.
Фиг.15. Плазмидная карта плазмиды экспрессии 9801.
Фиг.16. Плазмидная карта конъюгата плазмиды экспрессии 9807 с полипептидом тяжелой цепи.
Фиг.17. Плазмидная карта вектора экспрессии легкой цепи антитела 5170.
Фиг.18. SDS-PAGE гели экспрессированных конъюгатов молекул с повторяющимся мотивом анкирина в супернатанте временно трансфецированных клеток HEK293 на 7 сутки; конструкция 1 = белок SEQ ID NO: 10, конструкция 2 = белок SEQ ID NO: 12, конструкция 3 = белок SEQ ID NO: 11, конструкция 4 = белок SEQ ID NO: 13.
Фиг.19. Анализ BIAcore связывания молекул GEMOC по настоящему изобретению с растворимым рецептором эпидермального фактора роста человека HER2.
Пример 1. Конструирование плазмид
Применяют стандартные методы работы с ДНК согласно описанию в кн.: Sambrook J. и др. «Molecular cloning: A laboratory manual», 1989, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Применяют реагенты для молекулярной биологии, следуя рекомендациям производителя. Необходимые генные сегменты получают генным синтезом. Синтезированные генные фрагменты клонируют в специфическом векторе экспрессии. Последовательность ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждают секвенированием ДНК.
Плазмиды экспрессии 9800 и 9803
Генный сегмент, кодирующий конъюгаты последовательностей SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12, клонируют в определенной плазмиде экспрессии по уникальным сайтам рестрикции BsmI и Bpu 10I. Плазмиду экспрессии конструируют для комбинирования последовательности, кодирующей конъюгат, с С-концевой меткой из шести остатков гистидина, например, для экспрессии в клетках HEK293 и последующей очистки. Рядом с кассетой экспрессии конъюгата плазмида включает:
- начало репликации из вектора pUC18, которое допускает репликацию этой плазмиды в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции последовательности, кодирующей конъюгат, включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор из цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела человека,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающую интрон сигнальной последовательности (сигнальную последовательность 1, интрон, сигнальную последовательность 2 [L1-интрон-L2]) и уникальный сайт рестрикции BsmI с 3'-конца L2,
- последовательность, кодирующую конъюгат,
- линкер GSG, кодирующий уникальный сайт Bpu 10I с 3'-конца последовательности, кодирующей конъюгат, и в рамке с последовательностью, кодирующей конъюгат,
- метка из шести остатков гистидина с 3'-конца линкера GSG, в рамке с последовательностью, кодирующей конъюгат, и линкер GSG,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»), и
- уникальные сайты рестрикции NheI и EagI с 3'-конца экспрессированной последовательности.
Плазмидная карта плазмид экспрессии 9800 и 9803, соответственно, показана на фиг.14. Аминокислотные последовательности зрелых (без сигнальной последовательности) конъюгатов представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 10 и 12.
Плазмиды экспрессии 9801 и 9804
Генный сегмент, кодирующий конъюгат последовательности SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, клонируют в специфической плазмиде экспрессии через уникальные сайты рестрикции HindIII и PmlI. Плазмиду экспрессии конструируют для конъюгации конъюгата к N-концу шарнирной области иммуноглобулина класса IgG1, таким образом замещая имеющиеся природные домены VH и CH1. Полученная плазмида экспрессии применима для экспрессии конъюгатов последовательностей SEQ ID NO: 11 и 13, соответственно, например, в клетках HEK293. Рядом с кассетой экспрессии для молекулы с повторяющимся повтором, конъюгированной с последовательностями IgG1-шарнира, -CH2 и -CH3 плазмида включает:
- начало репликации с вектора pUC18, позволяющее осуществлять репликацию этой плазмиды в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом-шарнира-CH2-CH3 состоит из следующих элементов:
- предраннего энхансера и промотора от цитомегаловируса человека,
- последовательности интрона А от цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемой области гена зародышевой линии антитела,
- сигнальной последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающей интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]) и уникальный сайт рестрикции BsmI с 3'-конца L2,
- последовательности, кодирующей конъюгат,
- последовательности, кодирующей шарнирную область, домены CH2- и CH3 в IgG1 человека, с уникальным сайтом рестрикции PmlI в шарнирной области, позволяющим клонировать последовательность, кодирующую конъюгат, и
- сигнальной последовательности полиаденилирования («поли А»).
Плазмидные карты плазмид экспрессии 9801 и 9804, соответственно, показаны на фиг.15. Аминокислотные последовательности зрелых (без сигнальной последовательности) конъюгатов показаны в виде последовательностей SEQ ID NO: 11 и 13.
Плазмиды экспрессии 9807 и 9808
Примером антитела, с которым молекулы с повторяющимся мотивом последовательностей SEQ ID NO: 10 и 12 без метки из шести остатков гистидина могут быть конъюгированы, является антитело против амилоидного β-A4 пептида (анти-Aβ антитело). Такое антитело и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты описаны, например, в WO 2003/070760 или US 2005/0169925. Генный сегмент, кодирующий конъюгат, клонируют в специальной плазмиде экспрессии через уникальные сайты рестрикции MroI и NheI. Плазмиду экспрессии разрабатывают для конъюгирования полипептида с С-концом тяжелой цепи иммуноглобулина человека подкласса IgG1 (геномно организованная кассета экспрессии; организация экзон-интрон). Получаемую плазмиду экспрессии можно применять для экспрессии конъюгатов, например, в клетках HEK293. Рядом с кассетой экспрессии тяжелой цепи конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом моноклонального антитела плазмида включает:
- начало репликации с вектора pUC18, позволяющее осуществлять репликацию этой плазмиды в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом тяжелой цепи включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор от цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающую интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]),
- вариабельный домен тяжелой цепи анти-Ab антитела, кодирующий сегмент, собранный с сайтом сплайсирования донора и уникальным сайтом рестрикции BamHI с 3'-конца,
- нуклеиновую кислоту, кодирующую константные домены γ1 человека CH1, шарнир, CH2 и CH3 разделенные интронами,
- линкер (G4S)3, гибридизированный в рамке с 3'-концом домена CH3,
- уникальные сайты рестрикции MroI и NheI с 3'-конца линкера для осуществления клонирования полипептида в рамке к С-концу линкера, и
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»).
Плазмидные карты плазмид экспрессии 9807 и 9808 конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом тяжелой, соответственно, показаны на фиг.15.
Плазмида экспрессии 5170
Для экспрессии легкой цепи антитела применяют плазмиду 5170. Плазмида 5170 является плазмидой экспрессии, например, временной экспрессии легкой цепи антитела (геномно организованная кассета экспрессии; организация экзон-интрон) в клетках НЕК293.
Рядом с кассетой экспрессии κ-легкой цепи антитела эта плазмида включает:
- ген устойчивости к неомицину в качестве селективного маркера,
- начало репликации от вектора pUC18, которое позволяет реплицировать эту плазмиду в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции гена κ-легкой цепи антитела включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор от цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающую интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]),
- вариабельный домен легкой цепи анти-Aβ антитела, кодирующий сегмент, собранный с сайтом сплайсирования донора и уникальным сайтом рестрикции BamHI с 3'-конца, усеченный интрон 2 κ-легкой цепи человека,
- константный домен гена κ-легкой цепи человека,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A), и
- уникальные сайты рестрикции AscI и SgrAI с 3'-конца. Плазмидная карта вектора экспрессии 5170 κ-легкой цепи антитела показана на фиг.17.
Пример 2. Временная трансфекция и экспрессия
Рекомбинантные конъюгаты по настоящему изобретению, проиллюстрированные в примере 1, получают путем временной трансфекции клеток НЕК293 - Freestyle (линии 293 эмбриональных клеток почки человека (human embryonic kidney cell line 293, фирма Invitrogen), растущих в суспензии. Трансфецированные клетки культивируют в среде F17 (фирма Gibco) или в среде Freestyle 293 (фирма Invitrogen), обогащенной 6 мМ глутамином, или ультра-глутамином (фирма Biowhittake/Lonza), или L-глутамином (фирма Sigma), с 8% CO2 при 37°С в качалочных колбах в количестве от 30 мл до 250 мл среды. Для трансфекции применяют фектин (фирма Invitrogen) в соотношении реагента (мкл) к ДНК (мкг) 4:3. В случае присоединения конъюгатов к С-концу тяжелой цепи антитела, легкие и тяжелые цепи экспрессируют с двух разных плазмид, используя мольное соотношение плазмиды, кодирующей легкую цепь, к плазмиде, кодирующей тяжелую цепь, в диапазоне от 1:2 до 2:1, соответственно. Супернатанты культур клеток, содержащие конъюгаты, собирают на 6-8 сутки после трансфекции. Общую информацию, касающуюся рекомбинантной экспрессии иммуноглобулинов человека, например, в клетках HEK293, приводят в публикации Meissner Р. и др., Biotechnol. Bioeng. 75, 2001, cc.197-203.
Пример 3. Анализ экспрессии с применением метода SDS-PAGE
Буфер с литием додецилсульфатом для образцов в четырехкратной концентрации: 4 г глицерина, 0,682 г TRIS (tris-(hydroxymethyl)-aminomethane-трис-гидроксиметиламнометан), 0,666 г TRIS-HC1 (tris-(hydroxymethyl)-aminomethane-hydrochloride - трис-гидроксиметиламнометан гидрохлорид), 0,8 г лития додецилсульфата, 0,006 г EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 0,75 мл 1 мас.% раствора красителя Serva Blue G250 в воде, 0,75 мл 1 мас.% раствора красителя фенольного красного, добавляют воду до общего объема 10 мл.
Культуральную среду, содержащую секретированный конъюгат, центрифугируют для удаления клеток и клеточных фрагментов. Аликвоту осветленного супернатанта смешивают с 1/4 объема буфера с литием додецилсульфатом для образцов в четырехкратной концентрации и 1/10 объема 0,5 М 1,4-дитиотреитол (ДТТ). Затем образцы инкубируют в течение 10 мин при 75°С и белок выделяют методом SDS-PAGE. Гель-систему NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen) применяют по инструкции производителя. В частности применяют гели 10% NuPAGE® No vex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) и подвижный буфер NuPAGE® MES. Полипептиды и конъюгаты полипептидов могут быть четко выявлены (см. фиг.18).
Пример 4. Очистка белка аффинной хроматографией и гель-фильтрующей хроматографией
Конъюгаты Fc и антитела
Экспрессированные и секретированные конъюгаты Fc и антитела очищают аффинной хроматографией, использую белок А в качестве материала со сродством MabSelectSure (фирма GE Healthcare). Вкратце, после центрифугирования (в режиме 10000 g в течение 10 мин) и фильтрации через фильтр с размером пор 0,45 мкм, осветленные культуральные супернатанты, содержащие конъюгат, вносят в колонку MabSelectSure, уравновешенную буфером ФСБ (10 мМ Na2HPO4, 1 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl, рН 7,4). Несвязанные белки удаляют промыванием уравновешенным буфером. Конъюгат элюируют 0,1 М нитратным буфером, рН 3,3, и содержащий фракции продукт нейтрализуют 1 М TRIS рН 9,0. Затем раствор диализируют против буфера ФСБ при 4°С, концентрируют с помощью концентрирующего устройства Amicon Centricon и хранят в ледяной бане при 0°С. Агрегирование конъюгатов Fc и антитела исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Фракции, в которых выявляют высокомолекулярные агрегаты, подвергают препаративной эксклюзионной хроматографии. Вкратце, буфер конъюгата заменяют на гистидиновый буфер (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, рН 6,0) путем повторяемого концентрирования и разведения в устройстве Centricon (фирма Amicon). После концентрирования до 1-4 мл раствор, содержащий конъюгат, вносят в колонку Superdex200 High Load (фирма GE HealthCare), уравновешенную тем же гистидиновым буфером. Собирают фракции объемом 1 мл. Все фракции исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) (Superdex200, фирма GE HealthCare), и фракции с чистым мономерным конъюгатом объединяют. Целостность конъюгата исследуют методом SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента и окрашивают красителем кумасси бриллиантовым синим согласно описанному в предыдущем разделе.
Конъюгаты последовательностей SEQ ID NO: 10 и 12
Экспрессированные и секретированные конъюгаты, включающие метку из шести остатков гистидина (SEQ ID NO: 10 и 12), очищают аффинной хроматографией, используя хелатирующий никель аффинный материал Ni-Sepharose HP HighTrap (фирма GE Healthcare) по известным методикам. Вкратце, после центрифугирования (в режиме 10000 g в течение 10 мин) и фильтрации через фильтр с размером пор 0,45 мкм, осветленный культуральный супернатант, содержащий конъюгат, вносят в колонку Ni-Sepharose, уравновешенную фосфатным буфером (50 мМ Na3PO4, 300 мМ NaCl, рН 8,0). Несвязанные белки удаляют промывкой фосфатным уравновешивающим буфером, содержащим 20 мМ имидазол. Конъюгат элюируют с помощью проводящего градиента. Затем раствор, содержащий конъюгат, интенсивно диализируют против гистидинового буфера (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, рН 6,0) при 4°С, концентрируют с помощью концентрирующего устройства Amicon Centricon и хранят в ледяной бане при 0°С. Агрегирование конъюгатов Fc и антитела исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Фракции, в которых выявляют высокомолекулярные агрегаты, подвергают препаративной эксклюзионной хроматографии, проводимой известными методами. Вкратце, раствор с концентрированным конъюгатом вносят в колонку Superdex200 High Load (фирма GE HealthCare), уравновешенную тем же гистидиновым буфером согласно описанному выше. Отбирают фракции объемом 1 мл. Все фракции исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) (Superdex200, фирма GE HealthCare), и фракции с чистым мономерным конъюгатом объединяют. Целостность конъюгата исследуют методом SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента и окрашивают красителем кумасси бриллиантовым синим согласно описанному в предыдущем разделе.
Пример 5. Исследование связывания с помощью прибора BIAcore
Все измерения поверхностного плазменного резонанса проводят на приборе BIAcore 3000 (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) при 25°С. В качестве подвижного буфера и буфера для разведения используют ФСБ (1 мМ KH2PO4, 10 мМ Na2HPO4, 105 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl), рН 6,0, 0,005 об.% Tween 20. Растворимый белок А разводят в буфере 10 мМ натрия ацетата, рН 5,0, и иммобилизуют на чипе биосенсора СМ5, используя набор для стандартного присоединения амина (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) для получения на поверхности плотности белка А примерно 1000 RU. HBS-P (10 мМ HEPES, рН 7,4, 118 мМ NaCl, 0,005% поверхностно-активного вещества P20; фирма GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) применяют в качестве подвижного буфера при проведении иммобилизации. Исследуемые конъюгаты Fc и антитела разводят ФСБ, 0,005 об.% Tween 20, рН 6,0, до концентрации 450 нМ и вносят инъекцией на протяжении 3 мин при скорости тока 30 мкл/мин. Затем растворимый лиганд разводят в том же буфере до разных концентраций от 70 до 680 нМ и вносят инъекцией на протяжении 3 мин при скорости тока 30 мкл/мин. Затем сенсорный чип регенерируют в течение 1 мин с помощью ФСБ, рН 8,0, 0,005 об.% Tween 20. Анализ данных осуществляют с помощью программного обеспечения BIAevaluation (фирма BIAcore, Швеция) (см., фиг.19).
Пример 6. Исследование связывания методом ELISA
Связывание конъюгатов Fc и антитела определяют с помощью фермент-связанного иммуносорбентного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). В настоящем изобретении применяют метод сэндвича, основанный на стрептавидине/биотине. Для этого исследования используют планшеты для микротитрования с покрытием из стрептавидина.
Пример 7. Исследование связывания методом FACS
Клетки линии SK-BR-3 (АТСС# НТВ-30), стабильно экспрессирующие HER2, культивируют в среде McCoy 5a (PAN), обогащенной 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ) и 2 мМ L-глутамина. Для обнаружения HER2 на поверхности клеток конъюгатом по настоящему изобретению клетки промывают ФСБ, обогащенным 1% ФСТ в качестве блокирующего реагента. Конъюгат инкубируют в ФСБ/1% ФСТ с клетками при 4°С в течение 15 мин, промывают и инкубируют с соответствующим флуоресцентно меченым вторичным антителом, выявляющим конъюгат. Меченые клетки сортируют методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (fluorescence-activated cell sorting - FACS) для связывания конъюгата на клетках.
Claims (5)
1. Способ получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом для связывания с антителом, формулы:
(молекула с повторяющимся мотивом - линкерn)m - (конъюгируемый партнер)q - (линкерo - молекула с повторяющимся мотивом)p,
в которой n=1, m=1, q=1, р=0,
в которой линкером является пептидный линкер длиной по меньшей мере три аминокислотных остатка,
в которой конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования, и
в которой конъюгируемый партнер включает сконструированную шарнирную область тяжелой цепи антитела с тремя остатками цистеина,
и в которой молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся мотивом анкирина,
включающий:
- получение клеток млекопитающих, выбранных из клеток СНО и НЕК и включающих нуклеиновую кислоту, которая содержит следующие элементы:
предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
5′-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-А»),
- культивирование клеток в условиях, пригодных для экспрессии конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и тем самым получением гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенного гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом.
(молекула с повторяющимся мотивом - линкерn)m - (конъюгируемый партнер)q - (линкерo - молекула с повторяющимся мотивом)p,
в которой n=1, m=1, q=1, р=0,
в которой линкером является пептидный линкер длиной по меньшей мере три аминокислотных остатка,
в которой конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования, и
в которой конъюгируемый партнер включает сконструированную шарнирную область тяжелой цепи антитела с тремя остатками цистеина,
и в которой молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся мотивом анкирина,
включающий:
- получение клеток млекопитающих, выбранных из клеток СНО и НЕК и включающих нуклеиновую кислоту, которая содержит следующие элементы:
предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
5′-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-А»),
- культивирование клеток в условиях, пригодных для экспрессии конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и тем самым получением гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенного гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом.
2. Способ получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом, для связывания с антителом формулы:
(молекула с повторяющимся мотивом - линкерn)m - (конъюгируемый партнер)q - (линкерo - молекула с повторяющимся мотивом)р,
в которой n=0, m=1, q=1, р=0,
в которой линкером является пептидный линкер длиной по меньшей мере три аминокислотных остатка,
в которой конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования, и
в которой конъюгируемый партнер включает сконструированную шарнирную область тяжелой цепи антитела с тремя остатками цистеина,
и в которой молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся мотивом анкирина,
включающий:
- получение клеток млекопитающих, выбранных из клеток СНО и НЕК и включающих нуклеиновую кислоту,
которая содержит следующие элементы:
предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
5′-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-А»),
- культивирование клеток в условиях, пригодных для экспрессии конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и тем самым получением гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенного гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом.
(молекула с повторяющимся мотивом - линкерn)m - (конъюгируемый партнер)q - (линкерo - молекула с повторяющимся мотивом)р,
в которой n=0, m=1, q=1, р=0,
в которой линкером является пептидный линкер длиной по меньшей мере три аминокислотных остатка,
в которой конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования, и
в которой конъюгируемый партнер включает сконструированную шарнирную область тяжелой цепи антитела с тремя остатками цистеина,
и в которой молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся мотивом анкирина,
включающий:
- получение клеток млекопитающих, выбранных из клеток СНО и НЕК и включающих нуклеиновую кислоту,
которая содержит следующие элементы:
предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
5′-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-А»),
- культивирование клеток в условиях, пригодных для экспрессии конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и тем самым получением гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенного гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанная молекула с повторяющимся мотивом анкирина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, указанный линкер является пептидным линкером, выбранным из последовательностей SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 25-33, а конъюгат включает два гликозилированных конъюгата молекул с повторяющимся мотивом.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что конъюгат включает два гликозилированных конъюгата молекул с повторяющимся мотивом.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду, которая включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
- 5′-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-А»).
- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
- 5′-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-А»).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09013887 | 2009-11-05 | ||
| EP09013887.6 | 2009-11-05 | ||
| PCT/EP2010/006728 WO2011054519A1 (en) | 2009-11-05 | 2010-11-04 | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012122869A RU2012122869A (ru) | 2013-12-10 |
| RU2574201C2 true RU2574201C2 (ru) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2164415C2 (ru) * | 1992-11-02 | 2001-03-27 | Бет Израиль Диконесс Медикал Сентэ | КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК, РЕКОМБИНАНТНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ |
| US20030143612A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-07-31 | Pointilliste, Inc. | Collections of binding proteins and tags and uses thereof for nested sorting and high throughput screening |
| US20040203002A1 (en) * | 2000-08-25 | 2004-10-14 | Yen Choo | Determination of protein-DNA specificity |
| WO2009068649A2 (en) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2164415C2 (ru) * | 1992-11-02 | 2001-03-27 | Бет Израиль Диконесс Медикал Сентэ | КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК, РЕКОМБИНАНТНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ |
| US20040203002A1 (en) * | 2000-08-25 | 2004-10-14 | Yen Choo | Determination of protein-DNA specificity |
| US20030143612A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-07-31 | Pointilliste, Inc. | Collections of binding proteins and tags and uses thereof for nested sorting and high throughput screening |
| WO2009068649A2 (en) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Glaxo Group Limited | Antigen-binding constructs |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5735972B2 (ja) | グリコシル化リピートモチーフ分子結合体 | |
| TWI359027B (en) | Bivalent, bispecific antibodies | |
| TWI359028B (en) | Bivalent, bispecific antibodies | |
| KR20180012860A (ko) | 이종 이량체 다중 특이적 항체 포맷 | |
| KR20160143739A (ko) | 삼관능성 항원-결합 분자 | |
| KR20160077036A (ko) | 불변 쇄 변형된 이특이적, 5가 및 6가 ig-m 항체 | |
| WO2018090950A1 (zh) | 抗pd‐1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
| KR20200067197A (ko) | 단일특이적 항체로부터 다중특이적 항체의 생성 방법 | |
| US20070031422A1 (en) | Selection of cells expressing heteromeric polypeptides | |
| KR20220161375A (ko) | 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법 | |
| CN114249818A (zh) | 截短的多价多元体 | |
| RU2574201C2 (ru) | Гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом | |
| CA3189520A1 (en) | Method for the expression of an antibody-multimer-fusion | |
| AU2010314450B2 (en) | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates | |
| CN116635072A (zh) | 异二聚性iga fc构建体及其使用方法 | |
| EA041608B1 (ru) | Гетеродимерный полиспецифичный формат антител | |
| AU2007200686A1 (en) | Selection of cells expressing heteromeric polypeptides | |
| AU2002331883A1 (en) | Selection of cells expressing heteromeric polypeptides |