RU2164415C2 - КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК, РЕКОМБИНАНТНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ - Google Patents
КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК, РЕКОМБИНАНТНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2164415C2 RU2164415C2 RU95110697/14A RU95110697A RU2164415C2 RU 2164415 C2 RU2164415 C2 RU 2164415C2 RU 95110697/14 A RU95110697/14 A RU 95110697/14A RU 95110697 A RU95110697 A RU 95110697A RU 2164415 C2 RU2164415 C2 RU 2164415C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- activity
- sequence
- iχb
- endothelial cells
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 82
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 11
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 abstract 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 25
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 101000998160 Sus scrofa NF-kappa-B inhibitor alpha Proteins 0.000 description 17
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 210000002403 aortic endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 4
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000961071 Homo sapiens NF-kappa-B inhibitor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010001859 Proto-Oncogene Proteins c-rel Proteins 0.000 description 2
- 102000000850 Proto-Oncogene Proteins c-rel Human genes 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101710099573 Casein kinase II subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710159482 Casein kinase II subunit alpha' Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001002634 Homo sapiens Interleukin-1 alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000763314 Homo sapiens Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 101150091206 Nfkbia gene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101000622125 Sus scrofa E-selectin Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000051206 human THBD Human genes 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 101150023313 relB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине. Описаны эндотелиальные клетки, которые экспрессируют белок, обладающий активностью IχB в результате чего NFχB - зависимая активация этих клеток оказывается полностью подавленной. Клетки могут быть получены за счет изменения генетического материала указанных клеток, например, с помощью введения в них гетерологичных последовательностей, кодирующих активность IχB или промотора, при котором активность IχB экспрессируется конструктивно, непосредственно после действия стимулов, активирующих эндотелиальные клетки, либо при необходимости, в ответ на предопределенный внешний стимул. Технический результат - создание пересадочного материала, удобного для использования при трансплантации, например ксенотрансплантации, поскольку они характеризуются благоприятной, меньшей вероятностью отторжения. 7 с. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил.
Description
Изобретение касается ксенотрансплантации, в частности, - эндотелиальных клеток, которые изменяют таким образом, что содержащая их ткань становится менее вероятно отторгаемой реципиентом при ксенотрансплантации. Более конкретно, настоящее изобретение касается фактора, подавляющего активность транспкрипционного фактора NFχB, и его использования для подавления активации эндотелиальных клеток, а также подавления воспалительного процесса.
Главной проблемой успешной трансплантации органов между дискордантными видами является сверхострое отторжение соответствующего органа. Двумя основными компонентами, вовлеченными в явление сверхострого отторжения, являются наличие антител, специфичных к ксеногенным клеткам, а также последовательное фиксирование и активация системы комплемента в реципиенте. Известно [1] решение указанной проблемы, при котором трансгенные животные экспрессируют факторы, подавляющие комплемент у реципиента. Таким образом, в том случае, если реципиенту пересаживают орган от трансгенного животного, активация пути комплемента оказывается заблокированной указанным ингибирующим фактором.
Однако клетки донорного органа тоже вызывают отторжение, стимулируя свертывания крови в реципиенте, а также вызывая изменения в эндотелии указанного донорного органа. В течение воспалительного процесса в эндотелиальных клетках повышается экспрессия определенного числа различных генов, включая гены, кодирующие интерлейкины, транскрипционные факторы, молекулы адгезии, а также компоненты системы свертывания крови. В транскрипции многих из указанных генов принимает участие транскрипционный фактор NFχB.
Транскрипционный фактор NFχB конститутивно экспрессируется в клеточной цитоплазме. Было высказано предположение, что индукция транскрипции гена с помощью белков, сходных с NFχB, является результатом пост-транскрипционных модификаций, включающих в себя перемещение предсуществующего транскрипционного фактора из цитоплазмы в ядро. Указанное перемещение контролируется с помощью модификации ингибирующего белка, названного IχB, который связывается и образует комплекс с NFχB, тем самым удерживая его в цитоплазме. Стимуляция указанных клеток определенными сигналами приводит к модификации IχB, что в свою очередь вызывает диссоциацию его комплекса с NFχB.
Считают, что связывание белка IχB с NFχB маскирует сигналы ядерной локализации (СЯЛ) NFχB. В ходе стимулирования клеток специфическими агентами, которые зависят от типа клеток и стадии клеточного развития, IχB оказывается модифицированным таким образом, что указанная модификация нарушает его связывание с NFχB, в результате чего NFχB отсоединяется от IχB. Считают, что сигналы, приводящие к указанной модификации, участвуют в генерировании радикалов кислорода и приводят к фосфорилированию NFχB по специфическим сайтам. В результате этого СЯЛ оказываются открытыми, а NFχB перемещается в ядро, где связывается с сайтами присоединения NFχB. Это немедленно приводит к транскрипции генов, задействованных в воспалительном процессе.
Транскрипционный фактор NFχB был исходно выделен из зрелых B-клеток, в которых он связывается с мотивом, представляющим собой декамерную последовательность в энхансере легких цепей χ. Хотя NFχB изначально считали специфичным для указанного типа клеток и указанной стадии клеточного развития, сходные с NFχB белки были впоследствии обнаружены в большом количестве типов клеток, и, как отмечено выше, было продемонстрировано, что NFχB более широко вовлечен в индукцию транскрипции генов. В дальнейшем этот факт был подтвержден обнаружением функционально активных сайтов связывания NFχB в различных индуцибельных генах [2].
NFχB представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из субъединицы с молекулярной массой 50 кД (p50) и субъединицы с молекулярной массой 65 кД (p65). Были клонированы кДНК, соответствующие p50 и p65, показано, что они имеют гомологию на протяжении участка в 300 аминокислот. Субъединица p50 обладает существенной гомологией с продуктами протоонкогена c-rel, выделенными у млекопитающих и птиц, а также с продуктом гена dorsal у дрозофилы. Недавно еще один член семейства NFχB, ген relB, был клонирован из фибробластов, стимулированных сывороткой, как ген сверхраннего ответа.
Как p50, так и p65 способны к образованию гомодимеров, которые, тем не менее, отличаются своими свойствами: в то время как гомодимеры p50 обладают высоким сродством к связыванию с ДНК, но не способны к трансактивации транскрипции, гомодимеры p65 могут лишь слабо связываться с ДНК, однако способны к трансактивации. p50 синтезируется в виде амино-терминальной части предшественника с молекулярным весом 110 кД (p110), который не обладает ДНК-связывающей или способствующей димеризации активностью. Карбокси-терминальная часть указанного предшественника содержит восемь анкириновых повторов, представляющих собой мотив, обнаруженный в некоторых белках, участвующих в контроле клеточного цикла и дифференцировки. Клонирование короткой (2,6 т. п.н.) РНК, появляющейся одновременно с РНК предшественника p50, которая имеет длину 4 т.п.н., показало, что C-терминальная часть белка с молекулярным весом 110 кД также может самостоятельно экспрессироваться либо за счет альтернативного сплайсинга, либо в результате использования дифференциальных промоторов.
Клонировано три белка, сходных с IχBα: pp40, идентифицированный в трансформированных лимфоидных клетках цыпленка в качестве связанного с rel фосфопротеина [3]; RL/IF-1, представляющий собой фактор 1 подавления регенерации печени [4]; а также MAD-3, являющийся продуктом гена, индуцируемого в макрофагах человека в ходе прикрепления к пластиковым поверхностям [5].
Все три указанных белка, сходных с IχBα, содержат пять анкириновых повторов. RL/IF был клонирован, показана его экспрессия в регенерирующей печи в течение 30 мин после гепатэктомии. Исследования с помощью делеционного мутагенеза продемонстрировали обязательность наличия четырех из пяти анкириновых повторов в pp40 для подавления ДНК-связывающей активности и для ассоциации с c-rel, а также необходимость его C-терминального района для осуществления указанных эффектов. Исследования с использованием моноспецифических антител, присоединенных к предшественнику p50 с молекулярным весом 110 кД, показали, что указанная C-терминальная часть (часть, обладающая активностью IχB) маскирует сигнал ядерной локализации (СЯЛ), расположенный в амино-терминальном районе p50.
Неожиданно мы обнаружили, что экспрессия IχB индуцируется в эндотелиальных клетках (ЭК) с помощью тех же самых стимулов, которые активируют ЭК, хотя и с отстающей кинетикой по сравнению с быстрой пост-транскрипционной активацией NFχB. Таким образом, оказывается, что экспрессия IχB представляет собой естественный механизм обратной связи, подавляющий активацию ЭК. Мы использовали указанный факт для разработки дальнейшей стратегии, призванной препятствовать отторжению трансплантата.
В соответствии с этим, первый аспект настоящего изобретения предусматривает эндотелиальную клетку, которая экспрессирует белок, обладающий активностью IχB, в результате чего активация указанной клетки с помощью NFχB оказывается совершенно подавленной.
В настоящем описании понятие "белок, обладающий активностью IχB ", означает белок, который способен связываться с NFχB и препятствовать его миграции в ядро и/или связыванию NFχB с сайтами его узнавания в генетическом материале клетки, тем самым предотвращая NFχB-зависимую индукцию транскрипции гена. Указанный белок может представлять собой естественный белок, сходный с IχB, его часть, либо аналог или вариант указанных белков, имеющих вышеупомянутую NFχB-связывающую активность, а также активность, подавляющую индукцию транскрипции генов. В случае предпочтительного воплощения настоящего изобретения указанный белок может представлять собой вариант, включающий в себя одну или более сигнальную последовательность, предназначенную для направления указанного белка в специфический клеточный компартмент, такой как клеточное ядро.
В предпочтительном случае эндотелиальные клетки, предусмотренные настоящим изобретением, экспрессируют белок, обладающий активностью IχB, причем указанная экспрессия осуществляется конститутивно (т.е. постоянно, а также в отсутствие запаздывающей кинетики по сравнению с экспрессией NFχB), непосредственно после действия стимулов, активирующих эндотелиальные клетки, или же при необходимости, в ответ на предопределенный внешний стимул.
Обычно предусмотренные настоящим изобретением эндотелиальные клетки получают в результате модификации генетического материала указанных клеток. Эта модификация включает в себя введение гетерологичной ДНК, которая кодирует экспрессию белка, обладающего активностью IχB, а также изменение или замену сигналов, контролирующих указанных экспрессию и расположенных в составе нативных последовательностей, кодирующих IχB.
Таким образом, одно из воплощений эндотелиальных клеток, соответствующих настоящему изобретению, предусматривает гетерологичную последовательность ДНК, которая конститутивно экспрессируется указанной клеткой и кодирует экспрессию белка, обладающего активностью IχB.
Указанную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью IχB, оперативным образом присоединяют к промоторной последовательности, которая обычно также является гетерологичной по отношению к вышеописанным клеткам, в результате чего указанный белок экспрессируется конститутивно.
В альтернативном воплощении эндотелиальные клетки, соответствующие настоящему изобретению, содержат гетерологичную индуцибельную промоторную последовательность ДНК, присоединенную к последовательности ДНК, кодирующей экспрессию белка, обладающего активностью IχB, в результате чего указанный белок экспрессируется непосредственно после действия стимулов, активирующих эндотелиальные клетки, или же при необходимости, в ответ на предопределенный внешний стимул.
Указанная кодирующая белок последовательность, оперативным образом присоединенная к гетерологичной последовательности индуцибельного промотора, может представлять собой нативную или гетерологичную последовательность, кодирующего IχB, а также может включать в себя последовательность, кодирующую соответствующую сигнальную последовательность, например специфичную сигнальную последовательность ядерной локализации. Вышеупомянутые стимулы, активирующие эндотелиальные клетки, могут представлять собой любые стимулы, приводящие к изменениям в эндотелии донорных тканей или органов, а также стимулирующие свертывание крови в реципиенте, что ведет к отторжению. Указанным предопределенным стимулом может служить наличие лекарства, цитокина или другого индуцирующего агента, стимулирующего экспрессию с указанного индуцибельного промотора. В частности, перенесший трансплантацию пациент может быть после трансплантации подвергнут обработке индуцирующим агентом, таким как лекарство, для того, чтобы индуцировать экспрессию IχB и, таким образом, предотвратить активацию эндотелиальных клеток в донорном органе, а также последующее отторжение указанного органа.
Может быть использован любой приемлемый индуцибельный промотор, например, такой, который описан в [6].
Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения эндотелиальных клеток, соответствующих настоящему изобретению, предусматривающий трансфекцию эндотелиальных клеток гетерологичной последовательностью ДНК, которая конститутивно экспрессируется указанными клетками и кодирует экспрессию белка, обладающего активностью IχB.
Кроме того, еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения эндотелиальных клеток, соответствующих настоящему изобретению, предусматривающий оперативное присоединение гетерологичной последовательности ДНК, которая представляет собой индуцибельный промотор, к нативной последовательности ДНК, кодирующей экспрессию белка, обладающего активностью , в результате чего указанный белок экспрессируется непосредственно после действия стимулов, активирующих эндотелиальные клетки, или же при необходимости, в ответ на предопределенный внешний стимул.
В предпочтительном случае указанные гетерологичные последовательности ДНК включают в геном эндотелиальной клетки. В альтернативном случае указанные гетерологичные последовательности можно поддерживать в эндотелиальной клетке экстрахромосомно либо стабильно, либо в течение ограниченного периода.
В соответствии с настоящим изобретением в эндотелиальных клетках аорты свиньи (ЭКАС), стимулированных воспалительными агентами, такими как TNFα и IL-1α, был идентифицирован ранее неизвестный белок, сходный с IχB и обозначаемый в дальнейшем ECI-6. Указанный белок и его части, обладающие активностью IχB, а также их аналоги подпадают под область рассмотрения настоящего изобретения. Аминокислотная последовательность ECI-6 и кодирующая ее природная последовательность ДНК представлена в виде Последовательности N 1 (перечень последовательностей приведен в конце описания). Указанный белок, обладающий активностью IχB, может включать в себя ECI-6 или его активные части, либо их активные аналоги или варианты.
Таким образом, в случае своего предпочтительного воплощения, гетерологичная последовательность, кодирующая белок, обладающий активностью IχB, кодирует белок, который включает в себя последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%-ной, в предпочтительном случае - по меньшей мере 80%-ной, в более предпочтительном случае - по меньшей мере 90%-ной гомологией с белковой последовательностью, представленной в виде Последовательностей N 1 или N 2, начиная от положения 1 до положения 280, либо включает в себя часть указанного белка, проявляющую активность IχB.
В особо предпочтительном варианте своего воплощения указанная гетерологичная последовательность кодирует последовательность белка, измененную с целью повреждения одного или более сайтов фосфорилирования (аминокислоты 30-36, аминокислоты 39-47, а также аминокислоты 260-264 в Последовательности N 1). Эти изменения могут включать в себя замены центрального остатка Ser, находящегося в первой или третьей вышеупомянутых последовательностях, на Gly, а также замены Tyr, расположенного во второй вышеупомянутой последовательности, на Phe.
Указанный белок, обладающий сходной с IχB активностью, препятствует миграции NFχB в ядро и/или подавляет присоединение NFχB к сайтам связывания NFχB, находящимся в генетическом материале клетки. Подавление связывания NFχB можно выявлять с помощью стандартных биотестерных методов. Так, для того, чтобы зарегистрировать подавление связывания NFχB в эндотелиальных клетках, можно использовать тест на изменение электрофоретической мобильности. Конкретным примером такого теста является следующее.
Эндотелиальные клетки аорты свиньи выращивают в культуральной среде, представляющей собой модифицированную по Дульбекко среду Игла, содержащую 10%-ную фетальную сыворотку теленка. Для стимуляции указанных клеток в течение 2 ч используют 100 нг бактериального липополисахарида, после чего экстрагируют ядерные белки в соответствии с [7]. Затем in vitro транскрибируют РНК с плазмиды (Bluescript II, получена от Strategene), содержащей фрагмент BamHI-XhoI (основания 126-1605) кДНК, представленной на фиг. 1. Реакцию транскрипции осуществляют в соответствии с протоколом производителя, за исключением того, что добавляют 0,25 нМ m7G(5')ppp(5')G (Boehriger).
Полученную РНК в дальнейшем используют для трансляции in vitro в экстракте зародышей пшеницы или в лизате ретикулоцитов кролика (оба из них получают от Promega Corporation, Madison, WI, USA) в соответствии с протоколом производителя. Затем осуществляют EMSA, приготовляя меченный 16-мерный BS-2 олигонуклеотид (представленный в виде Последовательности N 3), который является сайтом связывания NFχB. Реакцию связывания проводят при температуре 20oC и pH 7,9 в течение 15 мин в суммарном объеме 15 мкл, содержащем 12%-ный глицерин, 12 мМ HEPES, 4 мМ Трис, 60 мМ KCl, 1 мМ Эдта, 1 мМ ДТТ, 200 мкг/мл поли(dl-dC), 300 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,2 нг меченого BS-2 (100.000 вспышек/мин), 5 мкг ядерных белков и различные количества указанного транслированного белка. Подавление связывания NFχB с олигонуклеотидом BS-2 можно выявлять, используя для сравнения контрольные экстракты зародышей пшеницы или лизаты ретикулоцитов кролика.
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает донорную ткань или донорный орган, содержащие указанные эндотелиальные клетки. Этот донорный материал может быть ксеногенным по отношению к реципиенту или же может быть взят от особей тех же видов. В предпочтительном случае указанный донорный материал получают от свиней.
Указанный донорный материал может быть получен от трансгенного животного. В альтернативном случае в эндотелиальные клетки донорного органа может быть введена гетерологичная ДНК с использованием традиционных методов генной терапии. Приемлемые для этого методы описаны в [8].
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает трансгенных млекопитающих, отличных от человека и имеющих вышеописанные эндотелиальные клетки.
Гетерологичную ДНК можно вводить в указанное животное или в предка указанного животного, находящегося на одноклеточной стадии или на стадии ранней морулы. Предпочтительной стадией является одноклеточная стадия, хотя процесс введения ДНК можно осуществлять между двухклеточной и восьмиклеточной стадиями. Последовательность ДНК можно микроинъецировать в клетки в соответствии с традиционными методами, либо можно использовать ретровирусную или сходную с ней систему [9].
В предпочтительном случае указанным млекопитающим является свинья.
Настоящее изобретение предусматривает также донорный орган, полученный от указанного трансгенного млекопитающего.
Наряду с созданием донорного органа и ткани, настоящее изобретение также может быть использовано для создания генетически измененных эндотелиальных клеток, экспрессирующих IχB в соответствии с вышеприведенным и нижеследующим описанием, в частности, в связи с такими заболеваниями эндотелиальных клеток, которые могут быть облегчены за счет блокирования опосредованной NFχB индукции экспрессии.
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, и включает в себя аминокислотную последовательность, представленную в виде Последовательности N 1, начиная с аминокислотного положения 1 и заканчивая аминокислотным положением 280; либо содержит аминокислотные последовательности, которые существенно, т.е. по меньшей мере на 95%, гомологичны указанной выше; и предназначена для использования в трансформированных эндотелиальных клетках. Соответствующие трансформированные эндотелиальные клетки могут быть использованы при трансплантации или для контроля экспрессии в клетках гладких мышц.
Указанные нуклеотидные последовательности также могут включать в себя кодоны, кодирующие аминокислоты с 281 по 314 из последовательности, приведенной в Последовательности N 1. В предварительном случае, указанные нуклеотидные последовательности кодируют белок, в котором эта последовательность изменена с целью нарушения одного или более сайтов фосфорилирования (аминокислоты 30-36, аминокислоты 39-47, а также аминокислоты 260-264).
Указанные изменения предпочтительно приводят к замене центрального Ser, находящегося в первой или третьей вышеупомянутой последовательности, на Gly, а также к замене Tyr, расположенного во второй вышеупомянутой последовательности, на Phe.
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, и включает в себя гетерологичную сигнальную последовательность.
Обычно указанная сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность, предназначенную для направления белка в специфический клеточный компартмент, в предпочтительном случае - сигнальную последовательность, специфичную для ядерной локализации.
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает также рекомбинантную конструкцию ДНК, включающую в себя последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, и присоединена оперативным образом к
1) индуцибельному промотору или
2) специфическому промотору эндотелиальных клеток,
причем указанный промотор отличается от естественного промотора вышеупомянутой последовательности ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB.
1) индуцибельному промотору или
2) специфическому промотору эндотелиальных клеток,
причем указанный промотор отличается от естественного промотора вышеупомянутой последовательности ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB.
В предпочтительном случае указанный промотор является как индуцибельным, так и специфичным для эндотелиальных клеток.
Обычно вышеупомянутая последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, является гетерологичной последовательностью, а также может представлять собой вышеописанную последовательность, включающую в себя сигнальную последовательность или соответствующую Последовательности N 1.
Настоящее изобретение предусматривает также вектор экспрессии, содержащий описанную выше нуклеотидную последовательность или рекомбинантную конструкцию ДНК.
В предпочтительном случае указанный вектор представляет собой ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, комплекс нуклеотидной последовательности и трансферрин-поликатионного конъюгата, а также плазмиду, заключенную в липосому.
Приемлемые ретровирусные вектора описаны в [10]. Приемлемые аденовирусные вектора описаны в [11]. Приемлемые трансферрин-поликатионные комплексы описаны в [12]. Липосомные комплексы описаны в [13].
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает белок, обладающий IχB-подобной активностью и включающий в себя аминокислотную последовательность, представленную в Последовательности N 1, начиная с аминокислотного положения 1 и заканчивая аминокислотным положением 280.
Указанный белок также может включать в себя аминокислоты 281-314 из Последовательности N 1. Эти аминокислоты содержат последовательности PEST, для которых показано, что в других белках они отвечают за нестабильность белка [14]. В предпочтительном случае эти аминокислоты не присутствуют в указанном белке, что можно осуществить, вводя стоп-кодон после кодона, соответствующего аминокислоте 280. Указанный результат может быть достигнут путем мутирования кодона, соответствующего пролину, находящемуся в аминокислотном положении 281, с помощью полимеразной цепной реакции.
В предпочтительном случае аминокислотного последовательность указанного белка изменяют с целью нарушения одного или нескольких сайтов фосфорилирования (аминокислоты 30-36, аминокислоты 39-47, а также аминокислоты 260-264).
Эти изменения могут включать в себя замену центрального Ser, находящегося в первой или третьей вышеупомянутой последовательности, на Gly, а также к замене Tyr, расположенного по второй вышеупомянутой последовательности, на Phe.
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает белок, обладающий активностью IχB и включающий в себя гетерологичную сигнальную последовательность, например сигнальную последовательность, специфичную для ядерной локализации.
Следует отметить, что вышеописанные эндотелиальные клетки и донорные органы выполняют вспомогательную функцию в предотвращении отторжения трансплантата при ксенотрансплантации, поскольку указанное первичное отторжение представляет собой сверхострое отторжение. В связи с этим, обычно генетический материал клеток донорного органа также изменяют, в результате чего активация пути комплемента в реципиенте оказывается подавленной. В соответствии с [1] этого можно достичь с помощью трансгенных животных, экспрессирующих специфичные для вида реципиента факторы, подавляющие комплемент. Эндотелиальные клетки донорных органов, полученные у такого животного, могут быть модифицированы с использованием методов генной терапии для создания вышеописанных эндотелиальных клеток. В альтернативном случае, в указанное трансгенное животное, находящееся на одноклеточной стадии или стадии ранней морулы, может быть введен вышеописанный вектор. Полученное таким образом трансгенное животное должно экспрессировать указанные факторы, подавляющие комплемент, а также должно иметь вышеописанные эндотелиальные клетки.
Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения предусматривает соответствующие приведенному выше описанию отличные от человеческих эндотелиальные клетки, ткани, донорные органы и трансгенных животных, экспрессирующие один или более факторов, подавляющих комплемент человека.
РНК, кодирующую белок ECI-6, была выделена из эндотелиальных клеток аорты свиньи (ЭКАС), стимулированных воспалительными агентами TNFα и IL-1α. Была выявлена индукция РНК ECI-6, осуществляющаяся в течение 2 ч после стимуляции указанными воспалительными агентами и ослабляющаяся через 4 ч. Кроме того, небольшое количество ее было обнаружено в "нестимулированных" клетках. Добавление циклогексимида вместе с ЛПС в течение 6 ч приводило к усилению указанного сигнала, свидетельствуя о том, что для индукции не требуется предварительного синтеза белка. Указанную РНК выявляли с помощью метода дифференциального скрининга, использующего активированные эндотелиальные клетки против неактивированных.
IχB-активность белка ECI-6 тестировали с помощью метода связывания ДНК in vitro; было показано, что она специфично, а также в зависимости от дозы подавляет активность, связывающую NFχB и присутствующую в ядерных фракциях ЭКАС, стимулированных липополисахаридом (ЛАС). Сходным образом, эндогенный NFχB, присутствующий в лизатах ретикулоцитов кролика, подавлялся при добавлении к указанным лизатам РНК ECI-6, но не контрольных лизатов. Связывание NFχB было специфичным, поскольку оно могло вступать в конкурентные взаимоотношения с немеченными олигонуклеотидами, представляющими собой сайты связывания NFχB, но не с мутированными сайтами связывания NFχB или неродственными олигонуклеотидами.
Белок ECI-6 проявляет очень высокую гомологию (более 90%) с белком IχB-белком MAD3, а также высокую гомологию с белками pp40 и RL/IF-1.
Далее воплощения настоящего изобретения описаны лишь с помощью примеров со ссылкой на представленные чертежи, на которых:
фиг. 1 демонстрирует полиакриламидный гель, иллюстрирующий подавление связывания ядерных белков с сайтами связывания NFχB в присутствии ECI-6, транслированного in vitro в экстракте зародышей пшеницы,
фиг. 2 демонстрирует полиакраламидный гель, иллюстрирующий подавление связывания эндогенного NFχB с сайтом связывания IχB в лизатах ретикулоцитов кролика.
фиг. 1 демонстрирует полиакриламидный гель, иллюстрирующий подавление связывания ядерных белков с сайтами связывания NFχB в присутствии ECI-6, транслированного in vitro в экстракте зародышей пшеницы,
фиг. 2 демонстрирует полиакраламидный гель, иллюстрирующий подавление связывания эндогенного NFχB с сайтом связывания IχB в лизатах ретикулоцитов кролика.
Примеры
Пример 1: Клонирование индуцированных генов
А. Получение библиотеки кДНК стимулированных эндотелиальных клеток аорты свиньи (ЭКАС)
Пост-конфлюэнтные ЭКАС обрабатывают комбинацией рекомбинантных TNFα и IL-1α человека (получены от Genzyme), при концентрации каждого 100 ед/мл в течение 4 и 9 ч. Клетки собирают в оба момента времени с помощью метода, описанного в [15] , экстрагируют и выделяют тотальную клеточную РНК для каждого момента времени. После этого объединяют полученные РНК для каждого времени. В соответствии с протоколом производителя готовят 5 мкг поли A+ РНК с олиго-dT-целлюлозой (Boehringer Mannheim).
Пример 1: Клонирование индуцированных генов
А. Получение библиотеки кДНК стимулированных эндотелиальных клеток аорты свиньи (ЭКАС)
Пост-конфлюэнтные ЭКАС обрабатывают комбинацией рекомбинантных TNFα и IL-1α человека (получены от Genzyme), при концентрации каждого 100 ед/мл в течение 4 и 9 ч. Клетки собирают в оба момента времени с помощью метода, описанного в [15] , экстрагируют и выделяют тотальную клеточную РНК для каждого момента времени. После этого объединяют полученные РНК для каждого времени. В соответствии с протоколом производителя готовят 5 мкг поли A+ РНК с олиго-dT-целлюлозой (Boehringer Mannheim).
С помощью набора для синтеза кДНК (Stratagene, La Jolla, California), в соответствии с протоколом производителя получают библиотеку кДНК в бактериофаге λ Zap II. Затем осуществляют упаковку полученных векторов с использованием системы Gigipack Gold (Stratagene, La Jolla, California). Получают приблизительно 2,2 миллиона первичных клонов. Скринируют приблизительно 5000 бляшек.
Б. Получение зондов и скринирование
Готовят два зонда: один - из РНК, которая получена из неиндуцированных ЭКАС, и еще один - из ЭКАС, индуцированных как описано в пункте А. Указанный неиндуцированный зонд получают посредством обратной транскрипции 1 мкг РНК с помощью обратной транскриптазы (Gibco-BRL) в соответствии с протоколом производителя. В этой реакции используют 50 мкКи 32P-CTP. Индуцированный зонд получают таким же образом, однако в дальнейшем его дважды подвергают очистке с помощью 10 мкг биотинилированной неиндуцированной РНК. Указанное биотинилирование и очистку осуществляют с использованием Subtractor I (InVitrogen, San Diego, California) в соответствии с протоколом производителя.
Готовят два зонда: один - из РНК, которая получена из неиндуцированных ЭКАС, и еще один - из ЭКАС, индуцированных как описано в пункте А. Указанный неиндуцированный зонд получают посредством обратной транскрипции 1 мкг РНК с помощью обратной транскриптазы (Gibco-BRL) в соответствии с протоколом производителя. В этой реакции используют 50 мкКи 32P-CTP. Индуцированный зонд получают таким же образом, однако в дальнейшем его дважды подвергают очистке с помощью 10 мкг биотинилированной неиндуцированной РНК. Указанное биотинилирование и очистку осуществляют с использованием Subtractor I (InVitrogen, San Diego, California) в соответствии с протоколом производителя.
Скринируют две реплики из библиотеки ЭКАС, одну - неиндуцированным зондом, а другую - индуцированным зондом в стандартных условиях гибридизации при 65oC [15]. Фаги, давшие более сильный сигнал при использовании индуцированного зонда по сравнению с неиндуцированным, были субклонированы путем вырезания in vivo с использованием протокола Stratagene.
В каждом случае осуществляют анализ по Ноузерну стандартным способом [15] . В качестве зонда используют фрагмент EcoRI-Xho1 длиной 1,5 тпн из индуцированного клона, меченный с помощью набора для получения случайных олигонуклеотидных праймеров (Stratagene) в соответствии с протоколом производителя.
Затем определяют нуклеотидную последовательность полученных клонов кДНК, применяя метод терминации цепи с помощью дидеоксила с использованием набора Sequenase (US Biochemicals, Cleceland, Ohio) в соответствии с протоколом производителя. Полученная нуклеотидная последовательность и предсказанная на ее основании аминокислотная последовательности представлены в виде Последовательности N 1. Вышеупомянутые пять анкириновых повторов находятся в аминокислотных положениях 73-99, 110-136, 143-169, 182-208 и 216-242, а три потенциальных сайта фосфорилирования CK-II TYR и PKC находятся в аминокислотных положениях 30-36, 39-47 и 260-264, соответственно. 5'-конец указанной последовательности (положения 1-270) получен из геномного клона и присоединен к вышеупомянутой кДНК по сайту Xhol (положение 285) с получением функционального клона для трансляции in vitro.
В дальнейшем, сравнивая указанную белковую последовательность с последовательностями MAD-3, RL/IF-1 и pp40 с использованием программы PILEUP из программного обеспечения UWGCG, обнаруживают ее высокую гомологию с перечисленными белками. Этот белок обозначают как ECI-6.
Пример 2: Трансляция in vitro
Линеаризованный вектор (10 мкг; Bluescript), несущий вставку, которая содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую положениям 126-1605 Последовательности N 1, транскрибируют в РНК с помощью полимеразы T7 (Stratagene) в суммарном объеме 100 мкл, следуя рекомендациям производителя, но с включением также 0,25 мМ m7G(5')ppp(5')G. В дальнейшем полученную кэпированную мРНК экстрагируют фенолом и хлороформом, а также осаждают в этаноле. 1/50 полученного продукта используют для трансляции in vitro в экстракте зародышей пшеницы или в лизате ретикулоцитов кролика, следуя рекомендациям производителя (Promega). Для анализа изменения электрофоретической подвижности (АИЭН) использовали различные концентрации, соответствующие 5, 1, 0,2 и 0,04 мкл системы трансляции in vitro.
Линеаризованный вектор (10 мкг; Bluescript), несущий вставку, которая содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую положениям 126-1605 Последовательности N 1, транскрибируют в РНК с помощью полимеразы T7 (Stratagene) в суммарном объеме 100 мкл, следуя рекомендациям производителя, но с включением также 0,25 мМ m7G(5')ppp(5')G. В дальнейшем полученную кэпированную мРНК экстрагируют фенолом и хлороформом, а также осаждают в этаноле. 1/50 полученного продукта используют для трансляции in vitro в экстракте зародышей пшеницы или в лизате ретикулоцитов кролика, следуя рекомендациям производителя (Promega). Для анализа изменения электрофоретической подвижности (АИЭН) использовали различные концентрации, соответствующие 5, 1, 0,2 и 0,04 мкл системы трансляции in vitro.
Пример 3: АИЭН
Использованный протокол АИЭН описан в [16]. Эндотелиальные клетки (ЭК) культивируют в среде Игла, модифицированной по Дульбекко и содержащей 10% фетальной сыворотки теленка. Указанные эндотелиальные клетки стимулируют 100 нг/мл бактериального липополисахарида (ДПС) в течение 2 ч, после чего экстрагируют ядерные белки в соответствии с [7]. 0,2 нг двухцепочечного 26-мерного олигонуклеотида BS-2 (последовательность которого представлена ниже в виде Последовательности N 4; 100,000 всп/мин) метят путем заполнения свободных концов с помощью кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I в присутствии радиоактивных нуклеозид трифосфатов. В дальнейшем полученный олигонуклеотид инкубируют в 15 мкл буфера для связывания, содержащего 12% глицерина, 12 мМ HEPES, , 4 мМ Трис, 60 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 200 мкг/мл поли(dl-DC) и 300 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Затем добавляют 15 мкг ядерных белков, а также 5, 1, 0,2 или 0,04 мкл транслированного белка ECI-6. Реакцию связывания осуществляют при температуре 30oC и pH 7,9 в течение 15 мин. Подавление связывания NFχB с олигонуклеотидом BS-2 может быть выявлено с помощью сравнения полученных результатов с контрольными экстрактами зародышей пшеницы или лизатами ретикулоцитов кролика.
Использованный протокол АИЭН описан в [16]. Эндотелиальные клетки (ЭК) культивируют в среде Игла, модифицированной по Дульбекко и содержащей 10% фетальной сыворотки теленка. Указанные эндотелиальные клетки стимулируют 100 нг/мл бактериального липополисахарида (ДПС) в течение 2 ч, после чего экстрагируют ядерные белки в соответствии с [7]. 0,2 нг двухцепочечного 26-мерного олигонуклеотида BS-2 (последовательность которого представлена ниже в виде Последовательности N 4; 100,000 всп/мин) метят путем заполнения свободных концов с помощью кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I в присутствии радиоактивных нуклеозид трифосфатов. В дальнейшем полученный олигонуклеотид инкубируют в 15 мкл буфера для связывания, содержащего 12% глицерина, 12 мМ HEPES, , 4 мМ Трис, 60 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 200 мкг/мл поли(dl-DC) и 300 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Затем добавляют 15 мкг ядерных белков, а также 5, 1, 0,2 или 0,04 мкл транслированного белка ECI-6. Реакцию связывания осуществляют при температуре 30oC и pH 7,9 в течение 15 мин. Подавление связывания NFχB с олигонуклеотидом BS-2 может быть выявлено с помощью сравнения полученных результатов с контрольными экстрактами зародышей пшеницы или лизатами ретикулоцитов кролика.
Указанную процедуру повторяют с лизатами ретикулоцитов кролика, содержащими или несодержащими РНК ECI-6, но без использования упомянутого ядерного экстракта.
Создают конкурентные условия связывания либо с холодным BS-2, либо с BS-1 (последовательность которого представлена ниже в виде Последовательности N 5), либо с ELχB (сайтом связывания из промотора ELAM-1 свиньи, последовательность которого представлена ниже в виде Последовательности N 6), либо с IgχB (сайтом связывания NFχB из энхансера легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека, последовательность которого представлена ниже в виде Последовательности N 7), но не с мутированным сайтом NFχB, последовательность которого представлена ниже в виде Последовательности N 8. В тестах на конкурентное связывание используют 500-кратный молярный избыток немеченных олигонуклеотидов. Образующиеся в результате этого комплексы разделяют на 5%-ном полиакриламидном геле, описанном в [7]. Белок ECI-6 подавляет связывание NFχB с сайтом связывания IχB-2.
Пример 4: Эксперименты по транзиентной экспрессии
Минимальный NFχB-зависимый промотор конструируют в векторе UBT.Luc [17], содержащем репортерный ген люциферазы, с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Коротко, двухцепочечный олигонуклеотид, представляющий собой фрагмент промотора тимидин киназы длиной 37 п.о. и несущий на своих 5' и 3' концах дополнительные участки, характерные для рестриктаз EcoRI и HindIII, соответственно, клонируют в плазмиду pKSM13 (Stragene) с получением вектора pKSM13-TK. Две копии двухцепочечного олигонуклеотида, который несет дополнительные участки, характерные для рестриктазы EcoRI, и представляет собой сайт связывания NFχB, клонируют в плазмиду pKSM13-TK с получением вектора pKSM13-2xIgkB-TK. Правильность указанной конструкции подтверждают с помощью секвенирования ДНК. Полученный фрагмент 2xIgkB-TK вырезают посредством расщепления ДНК рестриктазами NotI и HindIII (сайт узнавания NotI локализован выше по течению (5') по отношению к EcoRI-сайту). Образующийся при этом фрагмент лигируют в вектор UBT.Luc, предварительно расщепленный соответствующими ферментами рестрикции, с получением вектора 2xIgkBTK. Luc. Последовательность фрагмента 2xIgkB-TK представлена ниже, а также в виде Последовательности N 9:
Указанный вектор с помощью трансфекции вводят в клетки NIH3T3 с использованием Lipofectin (BRL, см. прилагаемый протокол). Тест на активность люциферазы осуществляют в соответствии с [18] . Не выявляют превышения экспрессии люциферазы по сравнению с фоном. В том случае, если осуществляют ко-трансфекцию вектора 2xIgkBTK. Luc вместе с вектором, определяющим экспрессию субъединицы p65 белка NFχB (CMV.p65), выявляют высокий уровень активности люциферазы. В том случае, если вместе с векторами 2xIgkBTK.Luc и CMV. p65 осуществляют трансфекцию вектора, определяющего экспрессию ECI-6/IkBa, уровни активности люциферазы уменьшаются до уровня фона. В качестве внутреннего контроля в ходе всех трансфекций используют вектор экспрессии ESV. β-галактозидазы.
Пример 4: Эксперименты по транзиентной экспрессии
Минимальный NFχB-зависимый промотор конструируют в векторе UBT.Luc [17], содержащем репортерный ген люциферазы, с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Коротко, двухцепочечный олигонуклеотид, представляющий собой фрагмент промотора тимидин киназы длиной 37 п.о. и несущий на своих 5' и 3' концах дополнительные участки, характерные для рестриктаз EcoRI и HindIII, соответственно, клонируют в плазмиду pKSM13 (Stragene) с получением вектора pKSM13-TK. Две копии двухцепочечного олигонуклеотида, который несет дополнительные участки, характерные для рестриктазы EcoRI, и представляет собой сайт связывания NFχB, клонируют в плазмиду pKSM13-TK с получением вектора pKSM13-2xIgkB-TK. Правильность указанной конструкции подтверждают с помощью секвенирования ДНК. Полученный фрагмент 2xIgkB-TK вырезают посредством расщепления ДНК рестриктазами NotI и HindIII (сайт узнавания NotI локализован выше по течению (5') по отношению к EcoRI-сайту). Образующийся при этом фрагмент лигируют в вектор UBT.Luc, предварительно расщепленный соответствующими ферментами рестрикции, с получением вектора 2xIgkBTK. Luc. Последовательность фрагмента 2xIgkB-TK представлена ниже, а также в виде Последовательности N 9:
Указанный вектор с помощью трансфекции вводят в клетки NIH3T3 с использованием Lipofectin (BRL, см. прилагаемый протокол). Тест на активность люциферазы осуществляют в соответствии с [18] . Не выявляют превышения экспрессии люциферазы по сравнению с фоном. В том случае, если осуществляют ко-трансфекцию вектора 2xIgkBTK. Luc вместе с вектором, определяющим экспрессию субъединицы p65 белка NFχB (CMV.p65), выявляют высокий уровень активности люциферазы. В том случае, если вместе с векторами 2xIgkBTK.Luc и CMV. p65 осуществляют трансфекцию вектора, определяющего экспрессию ECI-6/IkBa, уровни активности люциферазы уменьшаются до уровня фона. В качестве внутреннего контроля в ходе всех трансфекций используют вектор экспрессии ESV. β-галактозидазы.
Вышеупомянутый мутант, несущий делецию района PEST, получают с использованием ПЦР, вводя стоп-кодон после аминокислоты Лейцин-280.
Пример 5: Конструирование рекомбинантных ретровирусов для стабильной трансдукции первичных ЭКАС кДНК ECI-6/IχB
5 ретровирусных векторов оценивают в плане получения рекомбинантных ретровирусов, способных к высокоэффективной трансдукции ЭКАС (эндотелиальных клеток аорты свиньи) с помощью молекул тромбомодулина человека. Обнаружено, что вектор pNTK-2 приводит к наивысшему титру рекомбинантных вирусов, а также к столь же высокой экспрессии в пуле инфецированных ЭКАС, как и в случае использования векторов, в которых указанный ген переносится за счет 5'-вирусного LTR. На основании этого исследования, для конструирования рекомбинантного ретровируса, предназначенного для экспрессии кДНК ECI-6/IχB в ЭКАС, выбирают вектор pNTK-2. Соответствующий рекомбинантный провирус конструируют, вставляя часть фрагмента Xho1-Sal1 длиной приблизительно 1 т.п.о., включающую в себя кДНК ECI-6, в уникальный сайт Xho1, расположенный в провирусе pNTK-2 ниже по течению по отношению к tk-промотору. Очищенные рекомбинантные продукты, которые содержат указанную кДНК как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации по отношению к tk-промотору и могут быть различены при помощи расщепления рестриктазой BamHI, выявляют в штамме E. coli XL-1 blue. Полученную антисмысловую конструкцию используют в качестве контроля. Для достижения максимальной эффективности трансфекции упаковочной клеточной линии PA317 высокоочищенную плазмиду выделяют из бактериальных культур с использованием Qiagen. Для сведения к минимуму вероятности интеграции, несовместимой с продукцией вируса, смысловую и антисмысловую конструкции (10 мкг) линеаризуют с помощью рестрикционной эндонуклеазы HindIII, производящей расщепление вне провируса. Расщепленную ДНК очищают, проводя последовательную экстракцию фенол-хлороформом и хлороформом, а также осаждение этанолом и растворение в 100 мкл буфера для электропорации (PBSA + 20 мМ буфера HEPES, pH 7,0) в течение ночи при температуре 4oC. Повторное растворение подтверждают с помощью предшествующего трансфекции электрофореза в агарозном геле. Упаковочные клетки PA317 трансфецируют или псевдо-трансфецируют (в отсутствие ДНК) с использованием набора для электропорации Biorad при 0,25 кВ и 500 микрофарадах, что определяет продолжительность воздействия, равную 13,7 мс. Выжившие клетки ресуспендируют в 20 мл свежей культуральной среды и инкубируют в течение ночи перед добавлением селективного агента (0,8 мг/мл G418). После 7 дней селекции получают устойчивые к антибиотику колонии клеток, образовавшиеся в результате трансфекции как смысловой, так и антисмысловой конструкцией, в то время как контрольные клетки (трансфецированные в отсутствие ДНК) полностью погибают.
5 ретровирусных векторов оценивают в плане получения рекомбинантных ретровирусов, способных к высокоэффективной трансдукции ЭКАС (эндотелиальных клеток аорты свиньи) с помощью молекул тромбомодулина человека. Обнаружено, что вектор pNTK-2 приводит к наивысшему титру рекомбинантных вирусов, а также к столь же высокой экспрессии в пуле инфецированных ЭКАС, как и в случае использования векторов, в которых указанный ген переносится за счет 5'-вирусного LTR. На основании этого исследования, для конструирования рекомбинантного ретровируса, предназначенного для экспрессии кДНК ECI-6/IχB в ЭКАС, выбирают вектор pNTK-2. Соответствующий рекомбинантный провирус конструируют, вставляя часть фрагмента Xho1-Sal1 длиной приблизительно 1 т.п.о., включающую в себя кДНК ECI-6, в уникальный сайт Xho1, расположенный в провирусе pNTK-2 ниже по течению по отношению к tk-промотору. Очищенные рекомбинантные продукты, которые содержат указанную кДНК как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации по отношению к tk-промотору и могут быть различены при помощи расщепления рестриктазой BamHI, выявляют в штамме E. coli XL-1 blue. Полученную антисмысловую конструкцию используют в качестве контроля. Для достижения максимальной эффективности трансфекции упаковочной клеточной линии PA317 высокоочищенную плазмиду выделяют из бактериальных культур с использованием Qiagen. Для сведения к минимуму вероятности интеграции, несовместимой с продукцией вируса, смысловую и антисмысловую конструкции (10 мкг) линеаризуют с помощью рестрикционной эндонуклеазы HindIII, производящей расщепление вне провируса. Расщепленную ДНК очищают, проводя последовательную экстракцию фенол-хлороформом и хлороформом, а также осаждение этанолом и растворение в 100 мкл буфера для электропорации (PBSA + 20 мМ буфера HEPES, pH 7,0) в течение ночи при температуре 4oC. Повторное растворение подтверждают с помощью предшествующего трансфекции электрофореза в агарозном геле. Упаковочные клетки PA317 трансфецируют или псевдо-трансфецируют (в отсутствие ДНК) с использованием набора для электропорации Biorad при 0,25 кВ и 500 микрофарадах, что определяет продолжительность воздействия, равную 13,7 мс. Выжившие клетки ресуспендируют в 20 мл свежей культуральной среды и инкубируют в течение ночи перед добавлением селективного агента (0,8 мг/мл G418). После 7 дней селекции получают устойчивые к антибиотику колонии клеток, образовавшиеся в результате трансфекции как смысловой, так и антисмысловой конструкцией, в то время как контрольные клетки (трансфецированные в отсутствие ДНК) полностью погибают.
Полученные колонии объединяют и высевают в колбы T-75 в среду, содержащую G41B. Находящиеся в log-фазе и начинающие слипаться клетки из каждой колбы замораживают в виде аликвот в LN2 (хозяйские сток-клетки). Клетки, предназначенные для наработки вируса, выращивают до состояния слипания и через 24 ч собирают вирус в 20 мл полной среды. Затем содержащую вирус среду быстро замораживают в LN2 для убивания находящихся в суспензии продуцентных клеток, а также для хранения при температуре -80oC. Затем проводят два дополнительных сбора вируса. Исследуют клетки на экспрессию IχB, а также тестируют их на подавление связанной с NFχB индукции экспрессии.
Литература
1. WO 91/05855.
1. WO 91/05855.
2. Baeuerle P. (1991), BBA 1072, 63-80.
3. Davies et al. (1991), Science 253, 1268-1271.
4. Tewarl et al. (1992), Mol. Cell. Biol. 12(6), 2898-2908.
5. Haskill et al. (1991), Cell 65, 1281-1289.
6. Gosen and Bujard (1992), PNAS 89, 5547-5551.
7. Dignam et al. (1983), Nucl. Acids Res. 11, 1475-1489.
8. Miller A.D. (1992), Nature 357, 455-460.
8. Miller A.D. and Rosman G.T. (1989), Biotechniques 7(9), 980-990.
10. WO 92/07573.
11. Rosenfeld M.A. (1991), Science 252, 432.
12. Wagner et al. (1991), PNAS 88, 4255-4259.
13. Stewart et al. (1992), Human Gene Therapy 3, 267-275.
14. Rogers et al. (1986), Science 234, 364-368.
15. Maniatis et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 7-10.
16. Ausubel I. and Frederick M. / Eds. (1987), "Current Protocols in Molecular Biology", J. Willey & Sons, section 12-2.
17. de Martin et al. (1993), Gene 124, 137-138.
18. de Wet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.
Claims (16)
1. Культивируемые эндотелиальные клетки, экспрессирующие белок, обладающий активностью IχB, в результате чего совершенно полностью подавляется NFχB - зависимая активация указанной клетки.
2. Культивируемые эндотелиальные клетки, экспрессирующие белок, обладающий активностью IχB, либо конститутивно, либо непосредственно после воздействия стимулов, активирующих эндотелиальные клетки, либо при необходимости, в ответ на предопределенный внешний стимул.
3. Культивируемые эндотелиальные клетки по п.2, отличающиеся тем, что они содержат последовательность гетерологичной ДНК, которая конститутивно экспрессируется указанными клетками и кодирует экспрессию белка, обладающего активностью IχB.
4. Культивируемые эндотелиальные клетки по п.2, отличающиеся тем, что содержат последовательность ДНК, представляющую собой гетерологичный индуцибельный промотор, который функциональным образом присоединен к последовательности ДНК, кодирующей белок, обладающий активностью IχB, в результате чего указанный белок экспрессируется непосредственно после воздействия стимулов, активирующих эндотелиальные клетки, либо при необходимости, в ответ на предопределенный внешний стимул.
5. Культивируемые эндотелиальные клетки по п.4, отличающиеся тем, что последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, также представляет собой гетерологичную последовательность.
6. Культивируемые эндотелиальные клетки по пп.2 - 5, отличающиеся тем, что указанная последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, кодирует белок, который включает в себя последовательность, по меньшей мере на 70% гомологичную последовательности, представленной в виде последовательности 1, начиная с положения 1 и заканчивая положением 280, либо отличную от нее последовательность, обладающую активностью IχB.
7. Культивируемые эндотелиальные клетки по п.6, отличающиеся тем, что последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, изменена с целью нарушить один или более сайтов фосфорилирования.
8. Последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, и имеющий аминокислотную последовательность, представленную в виде последовательности 1, начиная с аминокислотного положения 1 и заканчивая аминокислотным положением 280.
9. Последовательность ДНК по п.8, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, изменена для того, чтобы нарулить один или более сайтов фосфорилирования.
10. Последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, отличающаяся тем, что она содержит гетерологичную сигнальную последовательность.
11. Последовательность ДНК по п.10, отличающаяся тем, что указанная сигнальная последовательность представляет собой специфическую сигнальную последовательность ядерной локализации.
12. Рекомбинантная конструкция ДНК, отличающаяся тем, что она содержит индуцибельный промотор, который функциональным образом присоединен к последовательности ДНК, кодирующей белок, обладающий активностью IχB по пп.8 - 11, причем указанный промотор отличается от нативного промотора такой последовательности ДНК.
13. Рекомбинантная конструкция ДНК по п.12, отличающаяся тем, что последовательность ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, представляет собой последовательность ДНК по п.10.
14. Способ получения эндотелиальных клеток по п.4, заключающийся в том, что гетерологичную последовательность ДНК, представляющую собой индуцибельный промотор, функциональным образом присоединяют к нативной последовательности ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью IχB, полученную в результате рекомбинантную конструкцию ДНК вводят в эндотелиальные клетки и отбирают клетки, которые экспрессируют указанный белок непосредственно после действия стимулов, активирующих эндотелиальные клетки, либо при необходимости, в ответ на предопределенный внешний стимул.
15. Белок, обладающий активностью IχB, отличающийся тем, что он включает в себя аминокислотную последовательность, представленную в виде последовательности 1, начиная с аминокислотного положения 1 и заканчивая аминокислотным положением 280.
16. Белок по п.15, отличающийся тем, что его аминокислотную последовательность изменяют для того, чтобы нарушить один или более сайтов фосфорилирования: аминокислоты 30 - 36, аминокислоты 39 - 47, а также аминокислоты 260 - 264.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB929222931A GB9222931D0 (en) | 1992-11-02 | 1992-11-02 | Organic compounds |
GB9222931.9 | 1992-11-02 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU95110697A RU95110697A (ru) | 1997-08-27 |
RU2164415C2 true RU2164415C2 (ru) | 2001-03-27 |
Family
ID=10724398
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU95110697/14A RU2164415C2 (ru) | 1992-11-02 | 1993-10-29 | КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК, РЕКОМБИНАНТНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0669977B1 (ru) |
JP (1) | JPH08502653A (ru) |
KR (1) | KR950704477A (ru) |
AT (1) | ATE192492T1 (ru) |
AU (1) | AU680636B2 (ru) |
CA (1) | CA2143489A1 (ru) |
DK (1) | DK0669977T3 (ru) |
ES (1) | ES2146235T3 (ru) |
FI (1) | FI952088A (ru) |
GB (1) | GB9222931D0 (ru) |
GR (1) | GR3033600T3 (ru) |
NO (1) | NO951628L (ru) |
NZ (1) | NZ257539A (ru) |
PT (1) | PT669977E (ru) |
RU (1) | RU2164415C2 (ru) |
WO (1) | WO1994010305A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2574201C2 (ru) * | 2009-11-05 | 2016-02-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом |
US10280214B2 (en) | 2009-11-05 | 2019-05-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2726005B1 (fr) * | 1994-10-10 | 1997-01-03 | Adim | Lignees immortalisees de cellules endotheliales cerebrales et leurs applications au traitement de differents troubles ou maladies primaires et secondaires neurologiques ou psychiatriques |
AU5147996A (en) * | 1995-03-24 | 1996-10-16 | New England Deaconess Hospital Corporation | Gene therapy for transplantation and inflammatory or thrombo tic conditions |
US5981486A (en) * | 1995-04-13 | 1999-11-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peptide suppressing IκBα phosphorylation |
JPH0959151A (ja) * | 1995-08-24 | 1997-03-04 | Kao Corp | NF−κB活性化抑制剤 |
EP0779361A3 (en) | 1995-12-15 | 1999-11-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Truncated form of inhibitory kappa B protein (1kB), recombinant production and uses thereof |
EP0886650A1 (en) * | 1996-02-14 | 1998-12-30 | Novartis AG | Gene therapy of entothelial cells with anti-apoptotic proteins for transplantation and inflammatory conditions |
AU2001231009A1 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-31 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Use of pro-apoptotic factors in treatment of atherosclerosis |
WO2006040615A2 (en) * | 2003-06-11 | 2006-04-20 | Jan Remmereit | Differenciation of stem cells for therapeutic use |
CN103459608B (zh) | 2011-04-01 | 2018-05-01 | 中外制药株式会社 | 重组多肽的制造方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1341606C (en) * | 1988-03-01 | 2010-06-08 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Activation of nf-kb precursor |
DE69123981T3 (de) * | 1990-10-31 | 2006-06-14 | Cell Genesys Inc | Nützliche retrovirale vektoren für die gentherapie |
-
1992
- 1992-11-02 GB GB929222931A patent/GB9222931D0/en active Pending
-
1993
- 1993-10-29 CA CA002143489A patent/CA2143489A1/en not_active Abandoned
- 1993-10-29 NZ NZ257539A patent/NZ257539A/en unknown
- 1993-10-29 PT PT93924544T patent/PT669977E/pt unknown
- 1993-10-29 DK DK93924544T patent/DK0669977T3/da active
- 1993-10-29 ES ES93924544T patent/ES2146235T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 AU AU54404/94A patent/AU680636B2/en not_active Ceased
- 1993-10-29 WO PCT/EP1993/003015 patent/WO1994010305A1/en active IP Right Grant
- 1993-10-29 JP JP6510706A patent/JPH08502653A/ja active Pending
- 1993-10-29 KR KR1019950701716A patent/KR950704477A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-10-29 EP EP93924544A patent/EP0669977B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 RU RU95110697/14A patent/RU2164415C2/ru active
- 1993-10-29 AT AT93924544T patent/ATE192492T1/de not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-04-28 NO NO951628A patent/NO951628L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-05-02 FI FI952088A patent/FI952088A/fi unknown
-
2000
- 2000-06-30 GR GR20000401135T patent/GR3033600T3/el not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
C.Creminon et al. "Differ meas. Of constitutive... endotnelial cells"..., BBA, V.1254, №3, 333/341, 1990. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2574201C2 (ru) * | 2009-11-05 | 2016-02-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом |
US10280214B2 (en) | 2009-11-05 | 2019-05-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR950704477A (ko) | 1995-11-20 |
FI952088A0 (fi) | 1995-05-02 |
ATE192492T1 (de) | 2000-05-15 |
NO951628D0 (no) | 1995-04-28 |
AU5440494A (en) | 1994-05-24 |
PT669977E (pt) | 2000-08-31 |
GB9222931D0 (en) | 1992-12-16 |
AU680636B2 (en) | 1997-08-07 |
EP0669977A1 (en) | 1995-09-06 |
EP0669977B1 (en) | 2000-05-03 |
CA2143489A1 (en) | 1994-05-11 |
NO951628L (no) | 1995-07-03 |
DK0669977T3 (da) | 2000-08-07 |
ES2146235T3 (es) | 2000-08-01 |
WO1994010305A1 (en) | 1994-05-11 |
NZ257539A (en) | 1996-08-27 |
FI952088A (fi) | 1995-05-02 |
GR3033600T3 (en) | 2000-09-29 |
JPH08502653A (ja) | 1996-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2017006119A (ja) | 聴覚障害、変形性関節症および細胞の異常増殖に関するatonal関連配列の治療用途のための組成物および方法 | |
JP4375759B2 (ja) | 標的とされた発現特性に従う異種遺伝子の発現 | |
JP3913274B2 (ja) | コレステロール輸送の調整方法 | |
US5858973A (en) | Transcription factor and uses therefor | |
JPH09510601A (ja) | ヒト遺伝子治療用のエピソーム発現ベクター | |
US5786341A (en) | Use of a COL1A1 mini-gene construct to inhibit collagen synthesis | |
RU2164415C2 (ru) | КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК, РЕКОМБИНАНТНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ IχB-АКТИВНОСТЬЮ | |
JPH10513359A (ja) | サイクリン依存性キナーゼCDK4およびCDK6のインヒビター、InK4c−p18およびInK4d−p19、ならびにそれらの使用 | |
US5962322A (en) | Methods for modulation of cholesterol transport | |
US5266488A (en) | Troponin T gene promoter and derivatives thereof | |
JPH10505223A (ja) | 形態形成タンパク質発現を調節するための方法および組成物 | |
Trevor et al. | Suppression of endo B cytokeratin by its antisense RNA inhibits the normal coexpression of endo A cytokeratin. | |
JP2007510625A (ja) | Lmo2のlim2阻害剤 | |
JP2000503538A (ja) | 細胞周期を仲介する組成物および方法 | |
US5786171A (en) | Aortic preferentially expressed gene and uses thereof | |
WO1999011288A1 (en) | Sr-bi antagonists and use thereof as contraceptives and in the treatment of steroidal overproduction | |
US5559021A (en) | DNA encoding a novel mammalian transporter homologous to neurotransmitter transporters and uses thereof | |
US6514935B1 (en) | Methods of treating hypertension | |
EP0854921A1 (en) | GENE THERAPY WITH MODIFIED p65 PROTEINS | |
JP2000224939A (ja) | 血管組織特異的にアンジオテンシンii2型受容体を発現するトランスジェニック動物 | |
JP2001503615A (ja) | Gaxタンパク質の、転写の抑制に関与し、及び/又は他のタンパク質と相互作用する領域からなるポリペプチド、対応する核酸およびそれらの使用 | |
EP1105473A2 (en) | A single gene encoding aortic-specific and striated-specific muscle cell isoforms, its regulatory sequences and uses thereof | |
Qian | Smooth muscle gamma-actin expression in smooth muscle development and differentiation | |
Goraya | Transcriptional regulation of angiotensin-converting enzyme | |
JP2000507099A (ja) | 平滑筋細胞lim蛋白質 |