PT669977E - Celulas endoteliais transformadas - Google Patents
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- 1 - iO{
DESCRIÇÃO "CÉLULAS ENDOTELIAIS TRANSFORMADAS" #
Este invento refere-se a xenotransplantação e em particular com células endoteliais que foram alteradas para tomarem tecidos que as contenham menos prováveis de serem rejeitados por um recipiente em xenotransplantação. Mais especificamente o invento refere-se a um factor que suprime a actividade do factor de transcrição NFkB e à sua utilização para inibir a activação de células endoteliais e suprimir o processo inflamatório.
Um dos principais problemas na transplantação bem sucedida de órgãos entre espécies discordantes é a rejeição hiperaguda do órgão. Existem dois componentes principais envolvidos na ocorrência da rejeição hiperaguda: a presença de anticorpos específicos para as células xenogénicas e a subsequente fixação e activação do sistema do complemento no recipiente. Uma solução para este problema é proposta em WO 91/05855 que descreve animais transgénicos que exprimem os factores de restrição do complemento do recipiente. Deste modo, quando um órgão de um animal transgénico é enxertado no recipiente, a activação da via do complemento no recipiente é bloqueada pelo factor de restrição.
No entanto as células do órgão do dador também dão origem a rejeição através da estimulação de coagulação no recipiente e através de alterações no endotélio do órgão do dador. Durante a inflamação, a expressão de vários genes diferentes nas células endoteliais é sobre-regulada, incluindo os que codificam interleucinas, factores de transcrição, moléculas de adesão e -2- componentes do sistema de coagulação. A transcrição de muitos deste genes envolve o factor de transcrição NFkB. O factor de transcrição NFkB é expresso constitutivamente no citoplasma das células. Foi proposto que a indução da transcrição dos genes por proteínas semelhantes a NFkB é o resultado de modificações pós tradução envolvendo a passagem do factor de transcrição pré formado do citoplasma para o núcleo. Esta passagem é controlada pela modificação de uma proteína inibidora chamada IkB, que se liga a e que forma um complexo com NFkB e que assim o retém no citoplasma. A estimulação da célula por sinais apropriados conduz à modificação de IkB que por sua vez resulta na sua dissociação de NFkB.
Crê-se que a ligação da proteína IkB a NFkB mascara o sinal de localização nuclear (SLN) (NLS) de NFkB. Após a estimulação da célula com agentes específicos, que dependem do tipo de célula e estádio de desenvolvimento da célula, a IkB é modificada de um modo que incapacita a ligação a NFkB, conduzindo à dissociação de NFkB de IkB. Crê-se que os sinais que conduzem a esta modificação envolvem a criação de radicais de oxigénio e conduzem à fosforilação de IkB em locais específicos. Como resultado o NLS é desmascarado e NFkB passa para o núcleo, onde se liga aos locais de NFkB. Isto por fim conduz à transcrição de genes envolvidos no processo inflamatório. O factor de transcrição NFkB foi originalmente isolado de células B maduras onde se liga a um motivo decamérico da sequência no estimulador da cadeia leve de k. Embora inicialmente se acreditasse que NFkB era específico para este tipo de células e deste estádio de desenvolvimento, foram desde então identificadas proteínas semelhantes a NFkB num grande número de tipos de células e, tal como discutido acima, mostrou-se que estavam envolvidas mais geralmente na indução da transcrição de genes. Isto foi ainda apoiado pela identificação de locais de ligação de NFkB em vários genes induzíveis. (Baeuerle, P.; 1991; BBA. 1072, págs. 63 a 80). NFkB é uma proteína heterodimérica que consiste numa subunidade de 50 kD (p50) e numa subunidade de 65 kD (p65). Os ADNcs para p50 e p65 foram clonados e mostrou-se que eram homólogos ao longo de uma região de 300 aminoácidos. A subunidade p50 mostra homologia significativa aos produtos do proto-oncogene c-rel isolado de mamíferos e de aves e ao produto do gene de Drosophila dorsal. Recentemente um membro adicional da família de NFkB, relB, foi clonado como gene de resposta imediata inicial de fibroblastos estimulados com soro.
Tanto p50 como p65 são capazes de formarem homodímeros, embora com propriedades diferentes: enquanto que os homodímeros de p50 possuem forte afinidade de ligação a DNA mas não podem transactivar a transcrição, os homodímeros de p65 apenas se podem ligar fracamente a DNA mas são capazes de trasactivação. p50 é sintetizada como parte amino-terminal de um percursor de 110 kD (pllO), que não possui actividade de ligação a DNA nem de dimerização. A parte carboxi-terminal contém oito repetições de anqui-rina, um motivo verificado em várias proteínas envolvidas no controlo do ciclo e da diferenciação celulares. A clonagem de uma espécie de RNA mais curto (2,6 kb) que é induzido em paralelo com o RNA do percursor de 4 kb de p50 revelou que, tanto através de união alternativa como através da utilização diferencial do promotor, a parte C-terminal da proteína de 110 kb também pode ser expressa independentemente.
Foram clonadas três proteínas semelhantes a ΙκΒα: pp40, identificada como uma fosfoproteína associada a rei em células linfóides transformadas de galinha (Davies et al., Science 253 (1991), 1268-1271); RL/IF-1 que é factor 1 inibidor da regeneração do fígado (Tewarl et al., Mol. Cell Biol. 12 (6) (1992), 2898-2908) e MAD-3 que é o produto de um gene induzido em macrófagos humanos após aderência a superfícies de plástico (Haskill et al., Cell 65 (1991), 1281-1289).
Todas as três proteínas semelhantes a ΙκΒα contêm cinco repetições de anquirina. RL/IF-1 foi clonada e mostrou-se ser expressa na regeneração do fígado em 30 minutos após hepatectomia. Estudos de mutagénese por deleção revelaram que quatro das cinco repetições de anquirina de pp40 são essenciais para inibir a actividade de ligação a DNA e para se associar com c-rel e que também é necessária a região C-terminal. Estudos com anticorpos mono-específicos, conduzidos com o percursor p50 de 110 kd, demonstraram que a parte C-terminal (a parte com actividade de IkB ) mascara o sinal de localização nuclear (NLS) situado na região amino-terminal de p50.
Surpreendentemente verificámos agora que a expressão de IkB é induzida em células endoteliais (CE) pelos mesmos estímulos que activam as CE, embora com uma cinética atrasada em comparação com a rápida activação pós-tradução de NFkB . A expressão de IkB parece portanto representar um mecanismo de retroacção de ocorrência natural para inibir a activação de CE. Utilizámos esta descoberta para desenvolver outra estratégia para prevenir a rejeição de transplantes.
Conformemente num primeiro aspecto este invento proporciona uma célula endotelial compreendendo i) uma sequência de DNA heteróloga que é constitutivamente expressa pela célula e que codifica para a expressão de uma proteína que possui actividade de IkB, ou -5- ii) uma sequência de DNA promotora induzível heteróloga operativamente ligada a uma sequência de DNA que codifica para a expressão de uma proteína que possui actividade de IkB, em que a proteína que possui actividade de IkB compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% homóloga à sequência de aminoácidos desde a posição número 1 à posição número 280 de SEQ ID No. 1, ou uma parte desta que possui actividade de IkB, de forma que a indução mediada por NFkB da transcrição de genes nas células é evitada e o tecido que contém as células é tomado menos provável de ser rejeitado por um recipiente de um transplante que um tecido contendo células endoteliais que não compreendem a sequência de DNA heteróloga ou a sequência de DNA promotora induzível heteróloga.
Para os objectivos do presente invento “uma proteína que possui actividade de IkB” é uma proteína que é capaz de se ligar a NFkB e evitar que NFkB migre para o núcleo e/ou se ligue aos locais de ligação de NFkB no material genético de uma célula evitando assim a indução mediada por NFkB da transcrição de genes. Tal proteína pode ser uma proteína semelhante a IkB de ocorrência natural, parte desta ou um análogo ou variante de ambas que possua esta actividade de ligação a NFkB e de inibição da indução da transcrição de genes. Numa concretização preferida a proteína pode ser uma variante compreendendo uma ou mais sequências sinal adaptadas para dirigirem a proteína para um compartimento celular específico, tal como o núcleo da célula.
De preferência as células endoteliais do invento expressam a proteína que possui actividade de IkB constitutivamente (i.e. continuamente e sem uma cinética atrasada em comparação com a expressão de NFkB), imediatamente após os estímulos de activação das células endoteliais ou quando necessário em resposta a um estímulo externo predeterminado. -6-
Tipicamente as células endoteliais do invento são obtidas como resultado da modificação do material genético das células. Esta modificação inclui a introdução de DNA heterólogo que codifica para a expressão de uma proteína que possui actividade de IkB bem como a alteração ou substituição de sinais de controlo da expressão de sequências que codificam a IkB nativa.
Assim numa concretização preferida a célula endotelial do invento compreende uma sequência de DNA heteróloga que é expressa constitutivamente pela célula e que codifica para a expressão de uma proteína com actividade de IkB . A sequência que codifica a proteína com actividade de IkB está operativamente ligada a uma sequência promotora, que é tipicamente também heteróloga para as células, de forma a que a proteína seja expressa constitutivamente.
Numa concretização alternativa a célula endotelial do invento compreende uma sequência de DNA promotora induzível heteróloga operativamente ligada a uma sequência de DNA que codifica para a expressão de uma proteína com actividade de IkB, de forma que a proteína é expressa imediatamente após os estímulos activadores da célula endotelial ou quando necessário em resposta a um estímulo externo predeterminado. A sequência que codifica a proteína que está operativamente ligada à sequência promotora induzível heteróloga, pode ser uma sequência que codifica a IkB nativa ou uma sequência que codifica IkB heteróloga e pode incluir uma sequência que codifica para uma sequência sinal apropriada, p. ex., uma sequência sinal específica do núcleo. Os estímulos activadores da célula endotelial pode ser quaisquer uns dos estímulos que dão origem a mudanças no endotélio do tecido ou órgãos do doador e que estimulam a coagulação no recipiente, conduzindo à rejeição. O estímulo predeterminado pode ser a presença de um fármaco, citocina ou outro agente indutor que estimula a expressão a partir do promotor induzível. Por exemplo um paciente de transplante pode ser tratado com um agente indutor, tal como um fármaco, após o transplante para induzir expressão de IkB e deste modo bloquear a activação das células endoteliais do órgão do dador e a consequente rejeição do órgão.
Pode ser utilizado qualquer promotor induzível adequado. Por exemplo pode ser utilizado um promotor induzível tal como o descrito por Gosen e Bujard [PNAS (1992), 89, 5547-5551].
Noutro aspecto o invento proporciona um processo para preparação de células endoteliais de acordo com o invento que compreende a transfecção de células endoteliais com uma sequência de DNA heteróloga que é constitutivamente expressa pelas células e que codifica para a expressão de uma proteína que possui actividade de IkB.
Além disso em ainda outro aspecto o invento proporciona um processo para a preparação de células endoteliais de acordo com o invento que compreende a ligação operativa de uma sequência de DNA promotora induzível heteróloga com uma sequência de DNA nativa que codifica para a expressão de uma proteína que possui actividade de IkB de forma a que a proteína seja expressa imediatamente após os estímulos activadores da célula endotelial ou quando necessário em resposta a um estímulo externo predeterminado.
De preferência as sequências de DNA heterólogas são incorporadas no genoma da célula. Altemativamente as sequências heterólogas podem ser mantidas na célula extracromossomicamente, tanto estavelmente como durante um período limitado.
De acordo com o presente invento foi identificada uma proteína semelhante a ItcB anteriormente desconhecida, a seguir referida por ECI-6, em células endoteliais da aorta de suíno (CEAS) (PAEC) estimuladas com agentes anti-inflamatórios tais como TNFa e IL-la. Esta proteína e partes desta que possuem actividade de IkB e análogos seus estão incluídos dentro do âmbito do invento. A sequência de aminoácidos de, e a sequência natural de DNA que codifica para, ECI-6 são dadas em SEQ ID No. 1. A proteína que possui actividade de IkB pode compreender ECI-6 ou partes activas desta ou análogos ou variantes activos destas.
Assim numa concretização preferida a sequência heteróloga que codifica para a proteína que possui actividade de IkB codifica para uma proteína que compreende uma sequência que é pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80% sendo preferível pelo menos 90% homóloga à sequência da proteína desde a posição n° 1 à posição n° 280 de SEQ ID No. 1 ou 2, ou parte desta que possua actividade de IkB.
Numa concretização particularmente preferida a sequência heteróloga codifica para uma sequência proteica que é alterada para incapacitar um ou mais locais de fosforilação (aminoácidos de 30 a 36 aminoácidos de 39 a 47 e aminoácidos de 260 a 264 de SEQ ID No. 1). Estas alterações podem incluir mudanças da Ser central na primeira e na terceira sequência para Gly e da Tyr na segunda sequência para Phe.
A proteína com actividade semelhante a IkB evita a migração de NFkB para o núcleo e/ou inibe a ligação do NFkB aos locais de ligação do NFkB -9- no material genético da célula. A inibição da ligação de NFkB pode ser determinada utilizando métodos de bioensaio padrão. Por exemplo pode ser utilizado um ensaio de mudança na mobilidade electroforética para detectar a inibição da ligação de NFkB em células endoteliais. Um exemplo particular de um tal ensaio é como se segue: São cultivadas células endoteliais da aorta de suíno num meio de cultura que compreende Meio de Eagle Modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal de vitelo. São utilizados 100 ng de lipopolissacárido bacteriano para estimular as células durante duas horas e as proteínas nucleares são então extraídas tal como descrito em Dignam et al., 1983; Nucl. Acids Res.; 11, 1475-1489. O RNA é então transcrito in vitro de um plasmídeo (Bluescript II obtido de Stratagene) contendo um fragmento BamHI-Xhol (bases de 126 a 1605) do cDNA mostrado na Figura 1. A reacção de transcrição é efectuada de acordo com o protocolo do fabricante excepto que é adicionadoo m G(5’)ppp(5’) 0,25 nM (Boehringer). O RNA obtido é então utilizado para tradução in vitro em extracto de gérmen de trigo ou em lisado de reticulócitos de coelho; ambos obtidos de Promega Corporation, Madison, WI, USA de acordo com o protocolo do fabricante. O EMSA é então efectuado através da preparação de um oligonucleótido BS-2 16-mer marcado (dado a seguir como SEQ ID No. 3), que é um local de ligação de NFkB. A reacção de ligação é conduzida a 20° C e a um pH de 7,9 durante 15 minutos num volume total de 15 μΐ contendo glicerol 12%, Hepes 12 mM, Tris 4 mM, KC1 60 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, poly (dl-dC) 200 μg/ml, albumina de soro bovino 300 μg/ml, 0,2 ng do BS-2 etiquetado (100000 cpm), 5 μg de proteínas nucleares e várias quantidades da proteína traduzida. A inibição da ligação de NFkB ao oligonucleótido BS-2 pode ser determinada através da comparação com os extractos de gérmen de trigo ou com os lisados de reticulócitos de coelho de controlo.
Noutros aspectos o invento proporciona tecido do dador ou um órgão do dador contendo as células endoteliais. O material do dador pode ser xenogénico para o recipiente ou pode ser da mesma espécie. De preferência o material do dador é obtido de um porco. O material do dador pode ser obtido de um animal transgénico. Altemativamente o DNA heterólogo pode ser transfectado para as células endoteliais do órgão do dador através de técnicas de terapia génica convencionais. As técnicas adequadas estão descritas em Miller, A. D.; 1992; Nature, 357, 455-460.
Adicionalmente a proporcionar órgãos e tecidos do dador o invento pode também ser geralmente utilizado para proporcionar células endoteliais geneticamente alteradas que expressam IkB tal como descrito acima e noutros locais nesta descrição, por exemplo em relação a distúrbios das células endoteliais que possam beneficiar do bloqueio da indução da expressão mediada por NFkB.
Em ainda outro aspecto o invento proporciona uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína que possui actividade de IkB e que inclui a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID No. 1, que se inicia no aminoácido da posição n° 1 e que termina no aminoácido da posição n° 280; ou as sequências de aminoácidos que são substancialmente i.e. pelo menos 95%, homólogas a ela; para utilização em células endoteliais transfectadas. As células endoteliais transfectadas podem ser utilizadas em transplantação ou para controlo da expressão em células do músculo liso.
As sequências nucleotídicas podem compreender ainda codões que codifiquem para os aminoácidos de 281 a 314 da sequência ilustrada na Figura 1. De preferência as sequências nucleotídicas codificam uma proteína na qual a sequência é alterada para incapacitar um ou mais locais de fosforilação (aminoácidos de 30 a 36, aminoácidos de 39 a 47 e aminoácidos de 260 a 264).
As alterações resultam de preferência na mudança da Ser central na primeira e na terceira sequência para Gly e a mudança da Tyr na segunda sequência para Phe.
Num outro aspecto o invento proporciona uma sequência de DNA que codifica para uma proteína que possui actividade de IkB que compreende uma sequência sinal heteróloga. A sequência sinal é tipicamente uma sequência sinal adaptada para dirigir a proteína para um compartimento celular específico, de preferência uma sequência sinal específica do núcleo.
Em outros aspectos o invento proporciona também uma construção de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA que codifica para uma proteína que possui actividade de IkB que possui operativamente ligados a ela 1) um promotor induzível ou 2) um promotor específico de células endoteliais, em que o promotor é distinto do promotor que é nativo na referida sequência de DNA que codifica para a proteína com actividade de IkB.
De preferência o promotor é induzível e específico para células endoteliais .
Normalmente a sequência que codifica a proteína com actividade de IkB é uma sequência heteróloga e pode ser uma sequência tal como descrito acima compreendendo uma sequência sinal ou em relação a SEQID No. 1. O invento proporciona ainda um vector de expressão que contém uma sequência nucleotídica ou uma construção de DNA recombinante tal como acima definida.
De preferência o vector é seleccionado de um vector retroviral, um vector adenoviral, um complexo de uma sequência nucleotídica e um conjugado tranferrina-policatião e uma plasmídeo formulado num lipossoma.
Vectores retrovirais adequados estão descritos em WO 92/07573. Vectores adenovirais adequados estão descritos em Rosenfeld, Μ. A. et al., 1991; Science; 252, 432. Complexos tranferrina-policatião adequados estão descritos em Wagner, E. et al., 1991; Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 88, 4255-4259. Complexos de lipossomas estão descritos em Stewart, M. et al., 1992; Human Gene Therapy, 3, 267-275.
Noutro aspecto o invento proporciona uma proteína que possui actividade semelhante a IkB e que compreende a sequência de aminoácidos ilustrada na Figura 1, que se inicia no aminoácido da posição n° 1 e que termina no aminoácido da posição n° 280. A proteína pode ainda compreender os aminoácidos de 281 a 314 da SEQ ID No. 1. Estes aminoácidos contêm sequências PEST que noutras proteínas foi relatado serem responsáveis por instabilidade proteica. (Rogers et al., 1986; Science, 234; 364-368). De preferência estes aminoácidos não estão presentes na proteína e isto pode ser feito através da introdução de um codão de terminação após o codão para o aminoácido 280. Isto pode ser alcançado através -13- da mutação do codão para prolina no aminoácido da posição 281 através de reacção em cadeia de polimerase.
De preferência a sequência de aminoácidos da proteína é alterada para incapacitar um ou mais dos locais de fosforilação (aminoácidos de 30 a 36 aminoácidos de 39 a 47 e aminoácidos de 260 a 264).
Estas alterações podem compreender a mudança da Ser central na primeira e na terceira sequência para Gly e a mudança de Tyr na segunda sequência paraPhe.
Noutro aspecto o invento proporciona uma proteína que possui actividade de IkB que compreende uma sequência sinal heteróloga, p. ex., uma sequência sinal específica do núcleo.
Será apreciado que as células endoteliais e os órgãos do dador acima definidos possuam uma função suplementar na prevenção da rejeição dos transplantes em xenotransplantação uma vez que a rejeição primária é rejeição hiperaguda. Por isso o material genético das células do órgão do dador é também tipicamente alterado de forma a que a activação da via do complemento no recipiente seja evitada. Tal como descrito em WO 91/05855 isto pode ser feito proporcionando animais transgénicos que expressem os factores de restrição do complemento da espécie recipiente. As células endoteliais do órgão do dador obtido de um tal animal podem ser modificadas através de técnicas de terapia génica para proporcionarem as células endoteliais acima definidas. Altemativamente pode ser introduzido um vector tal como acima definido no animal transgénico no estádio de célula única ou no estádio inicial de mórula. Deste modo o animal transgénico resultante expressará os factores de restrição do complemento e terá células endoteliais tal como acima definidas. - 14-
Assim num outro aspecto o invento proporciona também células endoteliais, tecidos ou órgãos de dadores não humanos tal como acima definido que expressam um ou mais factores de restrição do complemento humano.
Foi isolado RNA que codifica para a proteína ECI-6 de células endoteliais da aorta de suíno (PAEC) que foram estimuladas com os agentes inflamatórios TNFa e IL-la. Verificou-se que o RNA de ECI-6 foi induzido em 2 horas de estimulação com os agentes inflamatórios, diminuindo após 4 horas. Uma pequena quantidade foi também detectada em células “não estimuladas”. A adição de ciclo-hexamida juntamente com LPS durante seis horas resultou num aumento do sinal, sugerindo que não é necessária síntese proteica anterior para a indução. O RNA foi identificado utilizando uma abordagem de pesquisa diferencial que utiliza células endoteliais activadas versus não-activadas. A actividade de IkB de ECI-6 foi testada num ensaio de ligação de DNA in vitro e verificou-se que inibe especificamente e de um modo dependente da dose a actividade de ligação de NFkB presente nas fracções nucleares de PAEC estimuladas com lipopolissacárido (LPS). De modo semelhante, o NFkB endógeno presente em lisados de reticulócitos de coelho foi inibido através da preparação dos lisados com RNA de ECI-6, mas os lisados de controlo não. A ligação de NFkB era específica uma vez que podia competir com oligonucleótidos não marcados que representam locais de ligação de NFkB mas não com locais de ligação de NFkB mutados ou com um oligonucleótido não relacionado. A proteína ECI-6 mostra forte homologia (mais de 90%) à proteína IkB MAD-3 e elevada homologia para as proteínas pp40 e RL/IF-1.
Concretizações do invento são agora descritas, apenas por exemplo, com referência aos desenhos nos quais: A Figura 1 mostra um gel de poliacrilamida que ilustra a inibição da ligação de proteínas nucleares aos locais de NFkB na presença de ECI-6 traduzida in vitro num extracto de gérmen de trigo e, A Figura 2 mostra um gel de poliacrilamida que ilustra a inibição da ligação de NFkB endógeno ao local de ligação de IkB-2 em lisados de reticulócitos de coelho.
Exemplo 1: Clonagem de genes induzidos a) Preparação de uma biblioteca de cDNA de células endoteliais da aorta de suíno estimuladas (PAEC)
As PAEC pós-confluentes são tratadas com uma combinação de TNFa recombinante humano e IL-Ια (obtidos de Genzyme), cada um a uma concentração de 100 U/ml, durante 4 e durante 9 horas. As células são colhidas em ambos os tempos e o RNA celular total de cada tempo é extraído e isolado utilizando o procedimento descrito em Maniatis et al., 1989; Molecular Cloning. Cold Spring Harbour, páginas 7 a 10. Os ARNs de ambos os tempos são então reunidos. São preparados 5 pg de RNA poly A+ com celulose de oligo dT (Boehringer Mannheim) de acordo com o protocolo do fabricante. É preparada uma biblioteca de cDNA no bacteriófago λ Zap II utilizando um conjunto de síntese de cDNA (Stratagene, La Jolla, califomia) de acordo com o protocolo do fabricante. O empacotamento dos vectores é então realizado utilizando o sistema Gigapack Glod (Stratagene, La Jolla, califomia). São obtidos cerca de 2,2 milhões de clones primários. São pesquisadas aproximadamente 5000 placas. b) Preparação de sondas e pesquisa São preparadas duas sondas: uma a partir de RNA obtido a partir de PAEC que não foram induzidas e uma a partir de PAEC induzidas tal como descrito em a). A sonda não induzida é preparada através da transcrição reversa de 1 pg de RNA com transcriptase reversa (Gibco-BRL) de acordo com o protocolo do fabricante. Na reacção são utilizados 50 pCi de P-CTP. A sonda induzida é preparada do mesmo modo, mas é então subtraída duas vezes com 10 pg de RNA não induzido biotinilado. A biotinilação e a subtracção são realizadas utilizando Subtractor I (InVitrogen, San Diego, Califórnia) de acordo com o protocolo do fabricante. São pesquisadas duas réplicas da biblioteca de PEAC, uma com a sonda não induzida e a outra com a sonda induzida sob condições de hibridação padrão a 65° C (Maniatis et al.). Os fagos que dão sinais mais fortes com a sonda induzida em comparação com a sonda não induzida são subclonados através de excisão in vitro utilizando o protocolo de Stratagene.
Em todos os casos, é efectuada uma análise Northern de acordo com os métodos padrão (Maniatis et al.). Um fragmento EcoRI-Xhol de 1,5 kb do clone induzido que é marcado com um conjunto de oligoiniciadores aleatórios (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante, é utilizado como sonda.
A sequênciação dos nucleótidos dos clones de cDNA é então determinada através do método de terminação dideoxi da cadeia utilizando um conjunto Sequenase (US Biochemicals, Cleveland, Ohio) de acordo com o protocolo do fabricante. A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos prevista são dadas em SEQ ID No. 1. As cinco repetições de anquirina estão nos resíduos de aminoácidos de 73 a 99, de 110 a 136, de 143 a 169, de 182 a 208 e de 216 a 242 e os três potenciais locais de fosforilação CK-II
Tyr e PKC estão nos resíduos de aminoácidos de 30 a 36, de 39 a 47 e de 260 a 264 respectivamente. A parte 5’ da sequência (pos. 1-270) é obtida a partir de um clone genómico e é ligada ao cDNA no local Xhol (pos. 285) para se obter um clone funcional para traduções in vitro. A sequência proteica é então comparada com as sequências de MAD-3, RL/IF-1 e pp40 utilizando o programa PILEUP de UWGCG software e verifica-se que possui elevada homologia com estas proteínas. A proteína é designada ECI-6.
Exemplo 2: Traduções in vitro
Um vector linearizado (10 pg; Bluescript) com uma inserção contendo uma sequência nucleotídica correspondendo às posições de 126 a 1605 de SEQ ID No. 1 é transcrito para RNA utilizando polimerase T7 (Stratagene), num volume total de 100 μΐ tal como recomendado pelo fabricante, mas incluindo também m7G(5’)ppp(5’)G 0,25 mM. O mRNA coroado é então extraído em fenol e clorofórmio e precipitado em etanol. 1/50 do produto é utilizado para tradução in vitro em extracto de gérmen de trigo ou em lisado de reticulócitos de coelho, tal como recomendado pelo fabricante (Promega). Foram utilizadas concentrações diferentes correspondendo a 5, 1, 0,2 e 0,04 μΐ da tradução in vitro em análise de mudança da mobilidade electroforética (ΑΜΜΕ) (EMSA).
Exemplo3: EMSA O protocolo de EMSA que é utilizado é o descrito em Ausubel, I e Frederick, M. (Eds.); 1987; “Current Protocols in Molecular Biology”, J. Wiley & Sons, secção 12-2. São cultivadas células endoteliais (CE’s) (EC’s) em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco contendo 10% de soro fetal de bovino. As células endoteliais são estimuladas com 100 ng/ml de lipopolissacárido bacteriano (LPS) durante duas horas e as proteínas nucleares são então extraídas tal como descrito em Dignam, J.D., Lebovits, R.M., e Roeder, R.G., 1983; Nucl. Acids Res.; 11, 1475-1489). 0,2 ng de um oligonucleótido BS-2 26-mer de cadeia dupla (cuja sequência é dada a seguir como SEQ ID No. 4; 100000 cpm) é marcado através de preenchimento nas extremidades com o fragmento de Klenow de DNA-polimerase I na presença de nucleósidos trisfosfatos radioactivos. O oligonucleótido é então incubado em 15 μΐ de tampão de ligação compreendendo glicerol 12%, HEPES 12 mM, Tris 4 mM, KCL 60 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, poli(dl-dC) 200 μg/ml e albumina de soro bovino 300 pg/ml. São então adicionados 15 pg de proteínas nucleares e 5, 1, 0,2 ou 0,04 μΐ da proteína ECI-6 traduzida. A reacção de ligação é conduzida a 30° C e a um pH de 7,9 durante 15 minutos. A inibição da ligação de NFkB ao oligonucleótido BS-2 pode ser determinada através de comparação com os extractos de gérmen de trigo ou com os lisados de reticulócitos de coelho de controlo. O procedimento é repetido com lisados de reticulócitos de coelho com ou sem RNA de ECI-6, mas sem o extracto nuclear. Há competição pela ligação entre BS-2 frio e BS-1 (cuja sequência é dada a seguir como SEQ ID No. 5), ELkB (um local de ligação do promotor de suíno ELAM-1 que possui a sequência dada a seguir como SEQ ID No. 6) ou IgKB (um local de ligação de NFkB do estimulador da cadeia leve kapa da imunoglobulina humana que possui a sequência dada a seguir como SEQ ID No. 7), mas não com um local de NFkB mutado possuindo a sequência dada a seguir como SEQ ID No. 8. É utilizado um excesso molar de 500 vezes de oligonucleótidos não marcados para ensaios de competição. Os complexos resultantes são separados num gel de poliacrilamida a 5% tal como descrito em Dignam et al. Os resultados estão ilustrados nas figuras 3a e 3b. É observado que a proteína ECI-6 inibe a ligação de NFkB ao local de ligação de ΙκΒ-2.
Exemplo 4: Experiências de Expressão Transiente É construído um promotor mínimo responsivo a NFkB no vector UBT.Luc do gene repórter de luciferase (de Martin et al., 1993: Gene 124, 137-138) utilizando técnicas padrão da biologia molecular. Resumidamente, um oligonucleótido de cadeia dupla representando 37 pb do promotor da timidina cinase com partes salientes de EcoRI e HindIII nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente, é clonado em pKSM13 (Stratagene), resultando no vector pKSM13-TK. Duas cópias de um oligonucleótido de cadeia dupla com partes salientes de EcoRI, representando um local de ligação de NFkB, são clonadas em pKSM13-TK, resultado no vector pKSM13-2xIgKB-TK. A correcção da construção é confirmada através de sequênciação do DNA. O fragmento 2xIgicB-TK é excisado através de digestão com Notl e HindIII (um local Notl situa-se a montante (5’) do local EcoRI). O fragmento resultante é ligado em UBT.Luc que foi cortado com as enzimas de restrição correspondentes, resultando no vector 2xIgKBTK.Luc. A sequência do fragmento 2xIgicB-TK é dada abaixo e em SEQ ID No. 9:
EcoRI NFkB EcoRI NFkB GAATTCAGAGGGGGATTTCCCGAGGAATTCAGAGGGGGATTTCCCGAG-
EcoRI -GAATTCCACTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAA-
HindlII
-CACCGAGCGAAGCTT
Este vector é transfectado em células ΝΙΗ3Τ3 utilizando Lipofectin (BRL, ver protocolo adjunto). Os ensaio de luciferase são efectuados tal como descrito (de Wet et al., 1987: Mol. Cell Biol. 7, 725-737). Não é detectada expressão de luciferase acima dos valores de fundo. Quando 2xIgKBTK.Luc é co-transfectado juntamente com um vector de expressão para a subunidade p65 de NFkB (CMV.p65), são detectados níveis elevados de luciferase. Quando, adicionalmente a 2xIgKBTK.Luc e CMV.p65, é co-transfectado um vector de expressão para ECI-6/IicBa, os níveis de luciferase são reduzidos para os valores de fundo. Todas as transfecções contêm um vector de expressão de RSV-β-galactosidase como controlo interno. O mutante de deleção da região PEST é gerado através de PCR através da introdução de um codão de terminação após o aminoácido Leucina 280.
Exemplo 5: Construção de retrovírus recombinantes para trans-ducão estável de PAEC primárias com cDNA de ECI-6/ΙκΒ
Um painel de 5 vectores retrovirais é avaliado para a produção de retrovírus recombinantes capazes de transdução de elevada eficiência de PAECs (células endoteliais da aorta de suíno) com a molécula trombomodulina humana. Verifica-se que o vector pNTK-2 gera o título mais elevado de vírus recombinantes e de expressão em PAECs infectadas reunidas tão elevado como com vectores nos quais o gene é conduzido pelo LTR 5’ virai. Com base neste estudo, pNTK-2 é seleccionado para a construção de um retrovírus recombinante para a expressão de cDNA de ECI-6/ΙκΒ em PAEC. O proviras recombinante é construído através da inserção de um fragmento parcial Xhol-Sall de ca 1 kb compreendendo o cDNA de ECI-6 no único local Xhol a jusante do promotor de tk no proviras pNTK-2. Os recombinantes puros contendo o cDNA nas orientações com sentido e anti-sentido em relação ao promotor de TK, destinguidos através de digestão com BamHI, são recuperados em E. coli XL-1 blue. A construção anti-sentido é tomada para controlo. Para maximizar a eficiência da transfecção da linha celular de empacotamento PA317 o plasmídeo altamente puro é isolado das culturas bacterianas com Qiagen. Para minimizar a ocorrência de integrações incompatíveis com a produção de vírus, as construções com sentido e anti-sentido (10 pg) são linearizadas com a endonuclease de restrição HindIII, que cliva fora do provírus. O DNA digerido é purificado através de extracções sucessivas de fenol-clorofórmio e de clorofórmio e precipitação em etanol e dissolvido em 100 μΐ de tampão de electroporação (PBSA + tampão HEPES 20 mM, pH 7,0) de um dia para o outro a 4o C. A resolubilização é confirmada através de electroforese em gel de agarose antes da transfecção. As células de empacotamento PA317 são transfectadas ou falsamente transfectadas (-DNA) utilizando um conjunto electroporador Biorad a 0,25 kV e 500 microfarads que gera um tempo constante de 13,7 milissegundos. As células sobreviventes são ressuspensas em 20 ml de meio de cultura fresco e incubadas de um dia para o outro antes da aplicação da selecção (G418 0,8 mg/ml). Após 7 dias de selecção são obtidas colónias resistentes à droga a partir de células transfectadas com DNA com sentido e anti-sentido enquanto que as células de controlo (-DNA) estão todas mortas.
As colónias são reunidas e semeadas em frascos T-75 em meio contendo G418. As células subconfluentes em fase log de sobre o frasco são congeladas em alíquotas em LN2 (células da reserva principal). As células para colheita de vírus são deixadas a crescer até à confluência e o vírus é colhido em 20 ml de meio completo durante um período de 24 horas. O meio contendo víms é então congelado rapidamente em LN2 para matar as células produtoras em suspensão e para armazenamento a -80° C. São então feitas duas colheitas adicionais de vírus. As células são testadas quanto à expressão de IkB e também ensaiadas quanto à inibição da indução de expressão associada a NFkB.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: Sandoz Ltd (B) RUA: P. Box (C) CIDADE: Basel (D) ESTADO: B S (E) PAÍS: Suíça (F) CÓDIGO POSTAL: CH 4002 (G) TELEFONE: 061 324 1111 (H) TELEFAX: 061 324 7572 (I) TELEX: 965 050 55 (A) NOME: Sandoz - Patent - GmbH (B) RUA: Humboldstrasse 3 (C) CIDADE: Lorrach (D) ESTADO: Alemanha (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 2340 (G) TELEFONE: 0 7621/4 8014 (A) NOME: Sandoz Erfmdungen Verwaltungsgesellschaft m.b.H. (B) RUA: Brunner Strasse 59 (C) CIDADE: Viena (D) ESTADO: Áustria (E) PAÍS: Áustria (F) CÓDIGO POSTAL: A-123 5 Viena (ii) TÍTULO DO INVENTO: Células Endoteliais Transformadas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 9 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete
(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (v) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: WO PCT/EP93/ (vi) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: GB 9222931.9 (B) DATA DE REGISTO: 02- NOV-1992 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: -23- (A) COMPRIMENTO: 1604 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Sus scrofa (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: ECI-6 (ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 126..1070 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GCGCTGCCGA GCCCACAACA GTCCGAGGCC ATCGTCCCGC CCGCCCGAGC CACCGCGAGC 60 AGCCACGCGC CGCGCAGCCT GTGGCCCGCG CACCTAGGGA GCAGCGCCCA AGCCCTCATC 120 GCGCC ATG TTC CAG CCC GCA GAG CCC GGC CAG GAG TGG GCC ATG GAG 167
Met Phe Gin Pro Ala Glu Pro Gly Gin Glu Trp Ala Met Glu 15 10 GGG CCC CGG GAC GCG CTC AAG AAG GAG CGG CTA CTG GAT GAC CGC CAC 215 Gly 15 Pro Arg Asp Ala Leu 20 Lys Lys Glu Arg Leu 25 Leu Asp Asp Arg His 30 GAC AGC GGC CTG GAC TCC ATG AAG GAC GAG GAG TAC GAG CAG ATG GTG 263 Asp Ser Gly Leu Asp 35 Ser Met Lys Asp Glu 40 Glu Tyr Glu Gin Met 45 Vai AAG GAG CTG CGC GAG ATC CGC CTC GAG CCG CAG GAG GCG CCC CGC GGC 311 Lys Glu Leu Arg SO Glu Ile Arg Leu Glu 55 Pro Gin Glu Ala Pro 60 Arg Gly GCC GAG CCC TGG AAG CAG CAG CTC ACC GAG GAC GGA GAC TCG TTC CTG 359 Ala Glu Pro 65 Trp Lys Gin Gin Leu 70 Thr Glu Asp Gly Asp 75 Ser Phe Leu CAC TTG ATC ATC CAT GAA GAG AAG GCA CTG ACC ATG GAA GTG GTC 407 His Leu 80 Ala Ile Ile His Glu 85 Glu Lys Ala Leu Thr 90 Met Glu Vai Vai CGC CAA GTG AAG GGA GAT CTG GCT TTT CTT AAC TTC CAG AAC AAC CTG 455 Arg 95 Gin Vai Lys Gly Asp 100 Leu Ala Phe Leu Asn 105 Phe Gin Asn Asn Leu 110 CAG CAG ACT CCA CTC CAC TTG GCG GTG ATC ACC AAC CAG CCA GAA ATC 503 Gin Gin Tfcr Pro Leu 115 His Leu Ala Vai Ile 120 Thr Asn Gin Pro Glu 125 Ile -24-
GCT GAG GCA CTT GAA GCT GGC TGT GAT cct GAG CTC CGA GAC 551 Ala Glu Ala Leu 130 Leu Glu Ala Gly Cys 135 Asp 136 Pro Glu Leu Arg 140 Asp Phe CGA GGA AAT ACC CCT CTA CAC CTT GCC TGT GAG CAG GGC TGC CTG GCC 599 Arg 143 Gly Asn Thr L45 Pro Leu His Leu Ala 150 Cys Glu Gin Gly Cys 155 Leu Ala AGT GTG GGA GTC CTG ACT CAG ccc CGC GGG ACC CAG CAC CTC CAC TCC 647 Ser Vai 160 Gly val Leu Thr Gin 165 Pro Arg Gly Thr Gin 170 His Leu His Ser ATT CTG CAG GCC ACC AAC TAC AAT GGC CAC ACA TGT CTG CAC TTA GCC 695 Ile 175 Leu Gin Ala Thr Asn ISO Tyr Asn Gly His Thr 185 Cys Leu His Leu Ala 190 TCG ATC CAT GGC TAC CTG GGC ATT GTG GAG CTG TTG GTG TCT TTG bui 743 Ser Ile His Gly Tyr 195 Leu Gly ile Val Glu 200 Leu Leu Val Ser Leu 205 Gly GCT GAT GTC AAC GCT CAG GAG ccc TGC AAT GGC CGA ACC GCC CTG CAT. 791 Ala Asp Vai Asn 210 Ala Gin Glu Pro Cvs 215 Asn Gly Arg Thr Ala 220 Leu His CTT GCG GTG GAC CTG CAG AAT CCC GAC CTG GTG TCG CTC TTG TTG AAG 839 Leu Ala Vai 225 Asp Leu Gin Asn Pro 230 Asp Leu Val Ser Leu 235 Leu Leu Lys TGT GGG GCT GAT GTC AAC AGA GTC ACC TAC CAG GGC TAC TCC CCG TAC 887 Cys Gly 240 Ala Asp Val Asn Arg 245 Val Thr Tyr Gin Gly 250 Tyr Ser Pro Tyr CAG CTC ACC TGG GGC CGC CCA AGC ACT CGG ATA CAG CAG CAG CTG GGC 935 Gin 255 Leu Thr Trp Gly Arg 260 Pro Ser Thr Arg Ile 265 Gin Gin Gin Leu Gly 270 CAG CTG ACC CTA GAA AAC CTC CAG ATG CTT CCA GAG AGC GAG GAT GAG 983 Gin Leu Thr Leu Glu 275 Asn Leu Gin Met Leu 280 Pro Glu Ser Glu A5p 285 Glu GAG AGC TAT GAC ACG GAG TCA GAG TTC ACA GAG GAT GAG CTG CCC TAT 1031 Glu Ser Tyr Asp 290 Thr Glu Ser Glu Phe 295 Thr Glu Asp Glu Leu 300 Pro Tyr GAC Asp GAC ASp TGC Cys 305 GTG Val CTT Leu GGA Gly GGC Gly CAG Gin 310 CGC Arg CTG Leu ACG Thr TTA Leu TGA 315 GCTTTGG 1077 AAAGTGTCTA AAAGACCATG TACTTGTACA TTTGTACAAA ATCAAGAGTT TTATTTTTCT 1137 AAAAAAAAAG AAAAAAAGAA AAAAAAAGAA AAAAGGGTAT ACTTATAACC ACACCGCACA 1197 CTGCCTGGCC TGAAACATTT TGCTCTGGTG GATTAGCCCC GATTTTGTTA TTCTTGTGAA 1257 ctttggaaag GCGCCAAGGA GGATCATCGG AATGCAGAGA GAACCTCTTT TAAACGGCAC 1317 CTTGGTGGGG CCTGGGGGAA AGGTTATCCC TAATTTGATG GGAC7CTTTT ATTTATTGCG 1377 CTTCTTGGTT GAACCACCAT GGAGTCAGTG GTGGAGCCCA GGTGTATCTG GGAAATGTTA 1437 GAATCAGGTG TGTTGTTAAA CCTGTCAGTG GGGTGGGGTT AAAAGTCACG ACCTGTCAAG 1497 GTTTGTGTTA CCCTGCTGTA AATACTGTAC ATAATGTATT TTGTTGGTAA TTATTTTGGT 1557 ACTTCTAAGA TGTATATTTA TTAAATGGAT TTTTACAAAC AGAAAAA 1604 -25- (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 314 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:
Met 1 Phe Gin Pro Ala 5 Glu Pro Gly Gin Glu 10 Trp Ala Met Glu Gly 15 Pro Arg Asp Ala Leu 20 Lys Lys Glu Arg Leu 25 Leu Asp Asp Arg His 30 Asp Ser Gly Leu Asp 35 Ser Met Lys Asp Glu 40 Glu Tyr Glu Gin Met 45 Val Lys Glu Leu Arg 50 Glu Ile Arg Leu Glu 55 Pro Gin Glu Ala Pro 60 Arg Gly Ala Glu Pro 65 Trp Lys Gin Gin Leu 70 Thr Glu Asp Gly Asp 75 Ser Phe Leu His Leu 80 Ala Ile Ile His Glu 85 Glu Lys Ala Leu Thr 90 Met Glu Val Val Arg Gin 95 vai Lys Gly Asp 100 Leu Ala Phe Leu Asn 105 Phe Gin Asn Asn Leu 110 Gin Gin Thr Pro Leu 115 His Leu Ala Val Ile 120 Thr Asn Gin Pro Glu 125 Ile Ala Glu Ala Leu 130 Leu Glu Ala Gly Cys 135 Asp Pro Glu Leu Arg Asp 140 Phe Arg Gly Asn 145 Thr Pro Leu His Leu 150 Ala Cys Glu Gin Gly 155 Cys Leu Ala Ser Val 160 Gly Vai Leu Thr Gin 165 Pro Arg Gly Thr Gin 170 His Leu His Ser Ile 175 Leu Gin Ala Thr Asn 180 Tyr Asn Gly His Thr 185 Cys Leu Kis Leu Ala 190 Ser Ile Kis Gly Tyr 195 Leu Gly Ile Val Glu 200 Leu Leu Val Ser Leu Gly 205 Ala Asp vai Asn 210 Ala Gin Glu Pro Cys 215 Asn Gly Arg Thr Ala 220 Leu His Leu Ala Vai 225 Asp Leu Gin Asn Pro 230 Asp Leu Val Ser Leu 235 Leu Leu Lys Cys Gly 240 Ala Asp Vai Asn Arg 245 Vai Thr Tyr Gin Gly 250 Tyr Ser Pro Tyr Gin 255 Leu Thr Trp Gly Arg 260 Pro Ser Thr Arg Ile 265 Gin Gin Gin Leu Gly 270 Gin Leu Thr Leu Glu 275 Asn Leu Gin Met Leu 280 Pro Glu Ser Glu Asp 285 Glu Glu Ser -26-
Tvr Asp Thr Glu Ser Giu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro Tyr Asp Asp 290 295 300
Cvs Vai Leu Gly Gly Gin Arg Leu Thr Leu 3Õ5 310 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AATTCGGCTT GGAAAT 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: AATTCGGCTT GGAAATTCCC CGAGCG 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 5:
AATTCGTCGG GAGGACTTTC CAGCCAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:
AATTCATGCT GCTGGGAATT CCTCTGTATG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:
ATTCAGAGGG GGATTTCCCA GAGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases -28- (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 8: AGCTTAGATT TTACTTTCCG AGAGGA 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 105 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GAATTCAGAG GGGGATTTCC CGAGGAATTC AGAGGGGGAT TTCCCGAGGA ATTCCACTTC 60 GCATATTAAG GTGACGCGTG TGGCCTCGAA CACCGAGCGA AGCTT 105
Lisboa, 25 de aio de 2000
JORGE CRUZ
Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES 1. Célula endotelial compreendendo i) uma sequência de DNA heteróloga que é expressa constitutivamente pela célula e que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB, ou ii) uma sequência de DNA promotora induzível heteróloga operativamente ligada a uma sequência de DNA que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB, em que a proteína possuindo actividade de IkB compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% homóloga à sequência de aminoácidos desde a posição número 1 à posição número 280 de SEQ ID No. 1, ou uma parte desta que possua actividade de IkB, de forma a que a indução mediada por NFkB da transcrição de genes nas células seja evitada e que a rejeição dos tecidos contendo as células por um recipiente de transplantes se tome menos provável que a rejeição dos tecidos contendo células endoteliais que não compreendem a sequência de DNA heteróloga ou a sequência de DNA promotora induzível heteróloga.
- 2. Célula endotelial de acordo com a reivindicação 1, na qual a sequência de DNA que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB foi alterada para incapacitar um ou mais locais de fosforilação nos aminoácidos de 30 a 36, de 39 a 47 ou de 260 a 264 de SEQ ID No. 1, através da mudança de Ser no aminoácido 32 ou no aminoácido 262 para Gly, ou de Tyr no aminoácido 42 para Phe. -2-
- 3. Tecido ou órgão do dador compreendendo células endo-teliais de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
- 4. Tecido ou órgão do dador de acordo com a reivindicação 3 que é xenogénico para o recipiente.
- 5. Sequência de DNA que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB e incluindo a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID No. 1 iniciando-se no aminoácido da posição número 1 e terminando no aminoácido da posição número 280.
- 6. Sequência de DNA que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB compreendendo uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à sequência dada em SEQ ID No. 1 iniciando-se no aminoácido da posição número 1 e terminando no aminoácido da posição número 280.
- 7. Vector de expressão que é um vector retroviral, um vector adenoviral, um vector virai específico para células endoteliais, um complexo da construção de DNA recombinante a ser expressa e um conjugado de transferrina-policatião ou um plasmídeo formulado num lipossoma e que compreende um promotor específico para células endoteliais operativamente ligado a uma sequência de DNA que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB, em que o promotor é diferente do promotor que é nativo para referida sequência de DNA e a proteína possuindo actividade de IkB compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% homóloga à sequência de aminoácidos desde a posição n° 1 à posição n° 280 de SEQ ID No. 1, ou uma parte desta que possua actividade de IkB. -3-
- 8. Processo para a preparação de células endoteliais de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a transfecção de células endoteliais com uma sequência de DNA heteróloga que é constitutivamente expressa pelas células e que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% homóloga à sequência de aminoácidos desde a posição n° 1 à posição n° 280 de SEQ ID No. 1, ou uma parte desta que possua actividade de IkB.
- 9. Processo para a preparação de células endoteliais de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a ligação operativa de uma sequência de DNA promotora induzível heteróloga a uma sequência de DNA nativa que codifica para expressão de uma proteína possuindo actividade de IkB que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% homóloga à sequência de aminoácidos desde a posição n° 1 à posição n° 280 de SEQ ID No. 1, ou uma parte desta que possua actividade de IkB.
- 10. Proteína possuindo actividade de IkB que compreende a sequência de aminoácidos dada em SEQ ID No. 1 iniciando-se no aminoácido da posição número 1 e terminando no aminoácido da posição número 280.
- 11. Proteína de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência de aminoácidos foi alterada para incapacitar um ou mais locais de fosforilação nos aminoácidos de 30 a 36, de 39 a 47 ou de 260 a 264 de SEQ ID No. 1 através da mudança de Ser no aminoácido 32 ou no aminoácido 262 para Gly, ou de Tyr no aminoácido 42 para Phe.
- 12. Proteína possuindo actividade de IkB que compreende a -4- sequência de aminoácidos desde a posição n° 1 à posição n° 280 de SEQ ID No. 1, ou uma parte desta que possua actividade de IkB, e que compreende um sequência sinal heteróloga específica para o núcleo.
- 13. Células endoteliais não humanas de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou tecidos ou órgãos de dador de acordo com a reivindicação 3 ou 4 que expressem um ou mais factores de restrição do complemento humano, seleccionados de Factor I, Factor H, proteína de ligação C4, DAF, proteína Cofactor Membranar, CRI, CR2, C8bp, P-18 ou SP4040. Lisboa, 25 de Maio de 2000JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
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