JPH09504959A - 哺乳動物細胞周期蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規哺乳動物細胞周期蛋白質であるｐ５５ＣＤＣ、ｐ５５ＣＤＣをコードするＤＮＡ配列、及びこの蛋白質を製造する方法が記述される。また、ｐ５５ＣＤＣを検出する方法、及びｐ５５ＣＤＣもしくはｐ５５ＣＤＣ関連蛋白質複合体のレベル又は活性を制御する化合物による細胞分裂を調節する方法も記述される。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物細胞周期蛋白質 本発明は、哺乳動物細胞周期蛋白質、ｐ５５ＣＤＣ、これをコードするＤＮＡ 配列、この蛋白質に特異的な抗体、この蛋白質を製造する方法及びｐ５５ＣＤＣ 又はｐ５５ＣＤＣ関連蛋白質複合体のレベルもしくは活性を制御することによる 細胞分裂を調節する方法に関する。 発明の背景 真核細胞周期には成長期と分裂期（reproductive phase）があり、分裂期は細 胞分裂装置の確立と重なる中心体周期と染色体周期とからなる（詳細については 、４７を参照のこと）。細胞分裂に導く深部形態変化には、リン酸化及び脱リン 酸化事象のカスケードが伴う。哺乳動物細胞においては、キナーゼ及びそれらの 関連調節蛋白質の種々の複合体が、中断期間を介して細胞周期の進行を制御する （詳細については、６０、６７を参照のこと）。全ての真核細胞が、細胞周期の 各段階を介して細胞周期の進行を制御する類似の機構を利用するが、その制御に 関与するサイクリン、キナーゼ及びホスファターゼの独特の組合せが細胞分裂の 細胞や生物に特異的なパターンの原因である ことは明らかである（１８、５１、５２参照）。 細胞周期における各期間の決定的な移行を調節する様々なキナーゼが同定され ている。検討された全ての真核細胞において同定されたｐ３４^cdc2が最もよく特 徴付けられている（３、１６、２０、２８、４０、４１、４２、５９、７６参照 ）。加えて、ｐ３４^cdc2との相同性を有し、細胞周期内でのｐ３４^cdc2様の活性 の変動を示す多くの他のキナーゼが記述されている（４８、６０参照）。また、 別の型のキナーゼが細胞周期の異なる期間で活性が変動することも示されており 、それらがｐ３４^cdc2とはほとんど、あるいは全く相同性がないにもかかわらず 、細胞分裂の調節において特定の役割を果たすことが提唱されている。これらに は、ＭＡＰキナーゼ、及びＭＡＰキナーゼ活性を調節するＭＥＫキナーゼが含ま れる（詳細については、１１を参照のこと）。さらに、真菌アスペルギルス・ニ デュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）中に、有糸分裂の開 始に必要な新規キナーゼ、ＮＩＭＡキナーゼが同定された（５３−５５参照）。 このＮＩＭＡキナーゼと相同性を有する哺乳動物キナーゼ、Ｎｅｋ１が、それが 生殖腺組織内に高レベルで発現し、かつ減数分裂に必要とされ得る 場合に、マウスに見出されている（４３参照）。 上述のように、これらのキナーゼの多くの活性は、それらの１以上のサイクリ ンとの関連によって調節されている。サイクリンは、サイクリンボックスと呼ば れる保存領域内において互いに相同である（４４参照）。細胞周期内でのサイク リン依存性キナーゼの活性の変動は、新たに合成されたサイクリンとの他から区 別される関係の結果であり、この新たに合成されたサイクリンは、その後、細胞 周期の特定の移行点で分解される。しかしながら、全てのサイクリンが細胞周期 内で同程度の変動を示すわけではない；例えば、Ｄ型サイクリンのレベルは、細 胞周期内で、Ａ及びＢ型サイクリンほど顕著には変動しない。加えて、近年記述 されるサイクリン、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）のｍｃｓ２サイクリンは、細 胞周期内でのレベルの変動を示さず、ｍｃｓ２サイクリンに関連する新規キナー ゼ活性の変動も示さない（４９参照）。 酵母における実験では、細胞周期の秩序だった進行にも極めて重要な多数の他 の細胞分裂周期（Ｃｄｃ）蛋白質を、これらの蛋白質の多くの機能は正確には定 義されてはいないものの、明確にしている（３４参照）。これらの蛋白質のうち の２つ、ＣＤＣ２０ 及びＣＤＣ４遺伝子の産生物は、紡錘体または分離装置の要素である ことが提唱されている（３２参照）。ｃｄｃ２０温度感受性変異体は、非許容温 度での有糸分裂において、完全な短紡錘体が形成されて母細胞と巨大芽体との間 のネック部分に核が移動した後、停止する（６参照）。Ｃｄｃ２０蛋白質が染色 体移動に直接必要であることが提唱されている（５６参照）。加えて、Ｃｄｃ２ ０蛋白質は、微小管の解離を促進すること（１、６５参照）、又は微小管の表面 を変化させることのいずれかにより微小管構造の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ） に必要であり、有糸分裂以外の微小管依存性過程にも必要である（６５参照）。 Ｓ．セレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＤＣ４遺伝子は、ＤＮ Ａ合成の開始に不可欠である。ｃｄｃ４における条件的致死性、温度感受性変異 を有する細胞は非許容温度で分裂を停止し、この細胞は終止表現型の多数の芽体 、単一の核、橋かけ構造によって接続された２つの紡錘体極体を有する（６参照 ）。また、ＣＤＣ４は、核融合（ｋａｒｙｏｇａｍｙ）及び胞子形成にも必要で あると思われる（２１、６８、７１参照）。Ｃｄｃ４蛋白質の作用機序は未だに 不明であるが、酵母 での細胞下位置付け（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）研 究は、それが核骨格に関連することを示している（７参照）。２つの紡錘体極体 の出現は、ＣＤＣ４遺伝子産物が極体の分離及び完全な紡錘体の形成に必要であ ることを示すものであることが提唱されている（６、７５参照）。近年、哺乳動 物細胞から中心体（高等真核細胞における紡錘体極体の等価物）を除去すると、 成長周期が分裂周期から分離することが示されており、これは、細胞分裂が、二 極紡錘体の確立に中心体の存在を必要とすることを示している（４５参照）。 本発明の目的は、細胞周期の制御に関連する１以上の蛋白質を同定することに あり、ここで、この蛋白質は、細胞周期を調節する化合物の標的であってもよい 。ｐ５５ＣＤＣと呼ばれる新規タンパク質が同定された。ｐ５５ＣＤＣをコード するｍＲＮＡは、胚性組織、胎盤及び成人造血組織の他に、試験した全ての細胞 系に遍在したが、分化が誘発された細胞及び細胞分裂を停止した細胞には検出さ れなかった。ヒトｐ５５ＣＤＣの推定アミノ酸配列は、Ｓ．セレビシアエＣｄｃ ２０及びＣｄｃ４蛋白質と相同の領域を、これら３つの蛋白質のカルボキシ末端 側半分に見出されるＧβ−繰り返し内に示す。ｐ５５ＣＤＣの 発現は、哺乳動物細胞の細胞分裂に極めて重要であると思われる。細胞周期にあ る細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ ｃｅｌｌ）においては、ｐ５５ＣＤＣはリン酸化され ている。ｐ５５ＣＤＣに対するポリクローナル抗血清によって沈降する免疫複合 体は、ｐ５５ＣＤＣ自体はキナーゼ活性の内在性基質であるとは思われないにも かかわらず、細胞周期内で変動するキナーゼ活性を有している。 発明の要約 本発明は、細胞分裂に不可欠の新規哺乳動物蛋白質、ｐ５５ＣＤＣに関する。 ｐ５５ＣＤＣは、ゆっくりと分裂する細胞又は静止細胞においては検出されず、 活発に増殖している細胞において発現することが見出された。ＣＨＯ細胞にアン チセンスｐ５５ＣＤＣ ｃＤＮＡをトランスフェクションすることにより、結果 として、センス方向のｐ５５ＣＤＣ ｍＲＮＡが補償的に増加した細胞のみが単 離される。 本発明により、生物学的に活性なｐ５５ＣＤＣをコードするＤＮＡ配列も提供 される。ＤＮＡ配列には、ラット（配列番号１）及びヒト（配列番号３）ｐ５５ ＣＤＣ並びにラットもしくはヒトｐ５５ＣＤＣ、又はそれらの断片にハイブリダ イズする ＤＮＡが含まれ、ここで、ハイブリダイズするＤＮＡは生物学的に活性なｐ５５ ＣＤＣをコードする。また、ｐ５５ＣＤＣＤＮＡ配列を有するベクター及びこの ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトされた宿主細胞も提供される。ま た、ｐ５５ＣＤＣが発現するように形質転換もしくはトランスフェクトされた宿 主細胞を培養することを包含するｐ５５ＣＤＣポリペプチドの製造方法も含まれ る。 本発明のｐ５５ＣＤＣポリペプチドは、複合体が細胞周期依存性キナーゼ活性 を有するように、１以上の宿主蛋白質と好ましく複合体を形成する。ｐ５５ＣＤ Ｃ複合体のキナーゼ活性は、細胞周期内で変動する。 また、細胞分裂を調節する方法も本発明に包含される。ここで、この方法は、 細胞（例えば、腫瘍細胞）に、ｐ５５ＣＤＣ複合体のキナーゼ活性を調節する化 合物を導入することを包含する。ｐ５５ＣＤＣ関連キナーゼ活性の調節は、細胞 周期内の特定の期間での活性の増加又は減少に関与し、これは、次に、ｐ５５Ｃ ＤＣ関連キナーゼ活性のタイミング又は特異性の変更に繋がる。好ましい実施態 様において、ｐ５５ＣＤＣ複合体形成を阻止する化合物に晒すことにより、細胞 分裂が阻害される。 図面の説明 図１．ｐ５５ＣＤＣのノーザン分析。 （Ａ）異なる発達段階の様々なラット組織由来の全ＲＮＡ（３０μｇ）を、ラ ットゲノム０．２６ｋｂ ＰｓｔＩ断片で精査（プロービング）した。 （Ｂ）ヒト組織由来のポリＡ⁺ ＲＮＡ（２．５μｇ）を、ラット由来の［³² Ｐ］標識ｐ５５ＣＤＣ ｃＤＮＡで精査した。 （Ｃ）ヒト造血細胞系由来のポリＡ⁺ ＲＮＡ（２．５μｇ）を、図１Ｂと同 じプローブで分析した。比較のため、ラットアクチンｃＤＮＡプローブで得られ た信号を示す。 （Ｄ）実験手順に記述される通りに分化を誘発した細胞系及び対照細胞から調 製した全ＲＮＡ（３０μｇ）を、図１Ｂと同じプローブで精査した。比較のため 、２８ＳＲＮＡのエチジウム・ブロマイド染色を示す。ＲＮＡ単離及びノーザン ・ブロット・ハイブリダイゼーションの詳細の全ては、実験手順に記述されてい る。 図２．ラット及びヒトｐ５５ＣＤＣ ＤＮＡ配列。 ２つのラットｃＤＮＡクローンから編集した配列を示す。ヒトｃＤＮＡのオー プン・リーディング・フレームは、ラットの 配列と異なる場合にのみ示す。ヌクレオチド塩基対番号を左に示し、右にこのヌ クレオチド配列から推定されたアミノ酸の番号をふった。開始メチオニンの上流 の２つのフレーム内停止コドンに下線を付し、この停止コドンの下流のポリアデ ニル化シグナルをボックスで示す。 図３．ｐ５５ＣＤＣは７つのＧβ−繰返しを有し、Ｓ．セレビシアエＣｄｃ２ ０及びＣｄｃ４蛋白質との相同性を示す。 （Ａ）７つのラットｐ５５ＣＤＣ繰返しを、ＧＣＧ ＢＥＳＴＦＩＴプログラ ムを用いる対にしての比較（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）の後 に、人力により構築した。最適の整列を得るためにギャップを導入した。ギャッ プは空白で表す。同一の残基、又は４回以上の頻度で発生する高度に保存された 残基、を黒地に白抜きで示す。高度の保存性を有する置換は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕも しくはＶａｌ、ＳｅｒもしくはＴｈｒ、及びＡｌａもしくはＧｌｙであることが 明らかにされる。 （Ｂ）ヒトｐ５５ＣＤＣのＧβ−繰返しの配列を、ＧＣＧ ＢＥＳＴＦＩＴプ ログラム、次いで視認最適化を用いて、Ｃｄｃ２０及びＣｄｃ４の繰返しの配列 と一緒に整列させた。最適の整列を得るためにギャップを導入した。ギャップは 空白で表 す。同一の残基を黒地に白抜きで示し、高度に保存された残基をボックスで示す 。高度の保存性を有する置換は、Ｉｌｅ、ＬｅｕもしくはＶａｌ、Ｓｅｒもしく はＴｈｒ、ＡｌａもしくはＧｌｙ、ＴｙｒもしくはＰｈｅ、ＡｓｐもしくはＧｌ ｕ、及びＡｒｇ、ＬｙｓもしくはＨｉｓであることが明らかにされる。 図４．様々な種に由来するゲノムＤＮＡのサザーン分析。 幾つかの種に由来するゲノムＤＮＡ（１０μｇ）をＨｉｎｄIIIで消化し、１ ％アガロースゲルで分離した。材料及び方法に記述される通りに、中程度に厳格 （ｍｅｄｉｕｍ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）な条件下において、ラットｐ５５ＣＤ Ｃ ｃＤＮＡでフィルターを精査した。 図５．ＣＨＯ細胞中でのセンスまたはアンチセンス方向のｐ５５ＣＤＣ ｃＤ ＮＡの過発現が、成長プロフィールの変更を生じる結果となる。 （Ａ）ＣＨＯｄ^-細胞に、（△）ＰＭＴ、（○）ＰＭＴｐ５５ｓ又は（□）Ｐ ＭＴｐ５５ａｓ ＤＮＡをトランスフェクションし、材料及び方法に記述される 通りに増幅した。細胞を０．５×１０⁶細胞／６０ｍｍ皿の開始密度で塗布し、 示される時間に計数した。矢印は、培地を変えた日を示す。各点は、並行する培 養の２回の計数の平均を示し、これらは通常プロッ トされた平均から２−１４％変動する。 （Ｂ）固定化され、ヨウ化プロピジウム染色されたＰＭＴｐ５５ｓ（−）及び ＰＭＴｐ５５ａｓ（−−）細胞のフローサイトメトリー分析を、材料及び方法に 記述される通りに行った。 図６．ｐ５５ＣＤＣに対する抗体によって検出される免疫複合体。 （Ａ）対数期にある³⁵Ｓ−標識細胞からの細胞溶解物（レーン１、２、３、６ 、７、８、１１、１２、１３について２５０μｇ、またはレーン４、５、９、１ ０及び１４について５００μｇ）を、様々な抗体で免疫沈降させた。１０μｌの ｐ３４^cdc2ＭＡｂ（レーン１、６および１１）、ｐ５５ＣＤＣ競合抗血清（８． ４μｇ／レーン２、４、７、９、１２）及びアフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗血 清（１μｇ／レーン３、５、８、１０、１３、１４）で得られた免疫複合体を、 １０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。乾燥したゲルをオートラジオグラフィ ーに２１時間露出した。 （Ｂ）静止期にある³⁵Ｓ−標識細胞からの細胞溶解物（レーン１、２、３、６ 、７、８、１１、１２、１３について２５０μｇ、またはレーン４、５、９、１ ０、１４、１５について ５００μｇ）を、様々な抗体で免疫沈降させた。１０μｌのｐ３４^cdc2ＭＡｂ（ レーン１、６、１１）、ｐ５５ＣＤＣ競合抗血清（８．４μｇ／レーン２、４、 ７、９、１２、１４）又はアフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体（１μｇ／レーン ３、５、８、１０、１３、１５）で得られた免疫複合体を、１０％ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥゲルで分析した。オートラジオグラフィーを１週間行った。 図７．ｐ５５ＣＤＣ免疫複合体のヒストンＨ１キナーゼ活性及びｐ５５ＣＤＣ のリン酸化。 （Ａ）ベクター（ＰＭＴ）、センス転写体を含むベクター（ＰＭＴｐ５５ｓ） 及びアンチセンス転写体を含むベクター（ＰＭＴ５５ａｓ）をトランスフェクト したＣＨＯ細胞系の溶解物を、アフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体で免疫沈降さ せた。材料及び方法に記述される通りに、免疫複合体をヒストンＨ１キナーゼ活 性について検定した。 （Ｂ）ＣＨＯ細胞を、材料及び方法に記述される通りに、［³²Ｐ］−オルトリ ン酸で標識した。９００μｇの溶解物から得られ、１μｇのアフィニティ精製ｐ ５５ＣＤＣ抗体（レーン１）又は２８μｇのｐ５５ＣＤＣ競合抗血清（レーン２ ）で沈 降した免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 図８．ラット１及びＨｅＬａ細胞においてｐ５５ＣＤＣ抗体により検出された 免疫複合体及び細胞周期の異なる期間での様々な基質に対するそれらのキナーゼ 活性。 （Ａ）指数的に増殖するラット１及びＨｅＬａ細胞からの溶解物を、ｐ５５Ｃ ＤＣ競合抗血清（レーン１及び３）、アフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体（レー ン２及び４）、及び網膜芽細胞腫タンパク質に対する２種の異なるモノクローナ ル抗体（レーン５及び６）で免疫沈降させた。 （Ｂ）材料及び方法に記述される通りに調製したＨｅＬａ細胞からの溶解物（ ２００μｇ）を、各基質の最初のレーンに示される対照ｐ５５ＣＤＣ競合抗血清 か、またはアフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体のいずれかで免疫沈降させた。材 料及び方法に記述される通りにキナーゼアッセイを行った。図では、外在性基質 の濃度は左から右に向かって減少する。これらのアッセイにおけるヒストンＨ１ の濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌであった 。ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）及びα−カゼインの濃度は、０．４ｍｇ／ｍ ｌから０．１ｍｇ／ｍｌに減少した。対照アッセイは、常 に最高基質濃度を用いて行った。 （Ｃ）材料及び方法に記述される通りにＨｅＬａ細胞から調製した溶解物（２ ００μｇ）を、増量するアフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体（０．０７μｇ、０ ．２８μｇ及び１．１２μｇ）で免疫沈降させた。４．２μｇのｐ５５ＣＤＣ競 合抗血清を用いて陰性対照を行った。０．４ｍｇ／ｍｌのＭＢＰを基質として用 いて、材料及び方法に記述される通りにキナーゼアッセイを行った。 （Ｄ）細胞周期の様々な段階でのＨｅＬａ細胞から材料及び方法に記述される 通りに溶解物（２００μｇ）を調製し、８．４μｇのｐ５５ＣＤＣ競合抗血清（ レーン１、８及び９）又は１．０μｇのアフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体（レ ーン２−７）のいずれかで免疫沈降させた。０．４ｍｇ／ｍｌのＨ１、０．４ｍ ｇ／ｍｌのＭＢＰ又は０．４ｍｇ／ｍｌのα−カゼインを外在性基質として用い て、キナーゼアッセイを行った。 （Ｅ）図７Ｄにおいて得られた乾燥ゲルからの切除バンドを計数した。実験値 （図８Ｄ）レーン２−７）から対照値（図８Ｄ、レーン１、８及び９）を引き算 し、結果をグラフにした。 図９．細胞周期にある細胞は、静止細胞と比較して、ｐ５５ＣＤＣを活発に翻 訳し、高レベルの関連α−カゼインキナーゼ活性を示す。 （Ａ）成長及び静止ラット１細胞を、材料及び方法に記述される通りに、³⁵Ｓ −トランスラベル（Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ）で１時間標識した。溶解物（１００ μｇ）を様々な抗体で免疫沈降させた。１０μｌのｐ３４^cdc2ＭＡｂ（レーン１ 及び７）、ｐ５５ＣＤＣ競合抗血清（８．４μｇ／レーン２及び８）及びアフィ ニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体（０．０３５μｇ／レーン３、０．１４μｇ／レー ン４及び９、０．５６μｇ／レーン５及び１０、１．１２μｇ／レーン６及び１ １）で得られた免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 （Ｂ）材料及び方法に記述される通りに、成長及び静止ラット１細胞から溶解 物（１００μｇ）を調製した。１０μｌのｐ３４^cdc2ＭＡｂ、８．４μｇのｐ５ ５ＣＤＣ競合抗血清及び１．１２μｇのアフィニティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体を用 いて免疫複合体を得た。０．４ｍｇ／ｍｌのα−カゼインを基質として用いて、 材料及び方法に記述される通りにキナーゼアッセイを行った。 発明の詳細な説明 本発明は、哺乳動物細胞分裂に関与する、ｐ５５ＣＤＣと命名されるポリペプ チドに関する。ｐ５５ＣＤＣをコードするｍＲＮＡ転写体は、増殖細胞の集団を 含む胚性組織及び成人造血組織では発現したが、活発に分裂する細胞を欠く成人 組織においては検出されなかった。さらに、化学物質で分化が誘導されたヒト造 血細胞系も、分裂を停止した細胞と同様に、ｐ５５ＣＤＣ転写体の欠失を示した 。ラットｐ５５ＣＤＣ ＤＮＡ配列（図２及び配列番号１）及びヒトｐ５５ＣＤ Ｃ ＤＮＡ配列（図２及び配列番号３）によってコードされるポリペプチドが、 サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ ）に由来するｃｄｃ４及びｃｄｃ２０蛋白質の一部に相同の広範なアミノ酸 配列を有することが観察された（図３）。ｃｄｃ４及びｃｄｃ２０は共に有糸分 裂及び細胞分裂に関与することが知られているので、この相同性は、これらの分 裂過程へのｐ５５ＣＤＣの関与をも示唆している。細胞分裂へのｐ５５ＣＤＣの 関与のさらなる証拠が、実施例２にある。宿主細胞にラットｐ５５ＣＤＣアンチ センス・クローンをトランスフェクトすることによるｐ５５ＣＤＣ発現のダウン レギュレーション（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が、センス転写体を過剰 産生する細胞を生き残らせる結果となり、明らかにｐ５５ＣＤＣ ｍＲＮＡの欠 失を相殺することが示された。加えて、ラットｐ５５ＣＤＣは、活発に成長する 細胞において高レベルで合成されるが、静止細胞では合成されないように思われ る（実施例５）。 ｐ５５ＣＤＣは、少なくとも１つの他の宿主細胞蛋白質との複合体の形成によ り、有糸分裂及び細胞分裂を調節するように思われる。ｐ５５ＣＤＣを含有する 複合体が、ｐ５５ＣＤＣ抗血清により、ラット１細胞、ＨｅＬａ細胞、及びラッ トｐ５５ＣＤＣクローンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から沈降した。推定 される宿主細胞蛋白質は、これらの細胞系の各々においてｐ５５ＣＤＣに関連す ることが観察された（実施例３及び４）。これらの細胞系に由来するｐ５５ＣＤ Ｃ複合体は、細胞周期内で変動するキナーゼ活性を示した。ｐ５５ＣＤＣ複合体 のキナーゼ活性は、以下の方法において、サイクリンＡ／ＣＤＫ２、サイクリン Ｅ／ＣＤＫ２及びサイクリンＢ／ｐ３４^cdc2を含む他の公知の細胞周期関連キナ ーゼと区別することが可能である：（１）ｐ５５ＣＤＣ複合体は、単一の基質に 対するよ りも、むしろヒストンＨ１、ミエリン塩基性蛋白質及びα−カゼインを含む多数 の基質に対するキナーゼ活性を有していた；並びに（２）Ｇ₁／Ｓ移行期及びＧ₂ ／Ｍ移行期では、ｐ５５ＣＤＣ関連キナーゼ活性の減少が観察された。この細胞 周期キナーゼ活性のプロフィールは、以前には観察されていない。 本発明は、生物学的に活性なｐ５５ＣＤＣポリペプチドをコードする単離ＤＮ Ａを提供し、ここで、このＤＮＡは、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ ； ｂ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ ；及び ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のＤＮＡ、又はそれらの断片とハイブリダイズする ヌクレオチド配列を有するＤＮＡであって、このハイブリダイズするＤＮＡがｐ ５５ＣＤＣの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、 からなる群より選択されるＤＮＡである。 本発明のＤＮＡは、適切な温度及び塩の条件下において、ｐ５５ＣＤＣをコー ドするＤＮＡ配列と選択的にハイブリダイズする。適切なハイブリダイゼーショ ン条件の確立は、公表さ れているプロトコル（例えば、６３を参照）を用いて、当業者の能力の範囲内に ある。例として、ハイブリダイゼーションは、４２℃で、４０％ホルムアミド及 び５×ＳＳＰＥ中において、少なくとも１２時間行い、次いで、２×ＳＳＣ、０ ．１％ＳＤＳにおいて５０℃で３回洗浄し、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに おいて３０分間洗浄すればよい。ｐ５５ＣＤＣ ＤＮＡとハイブリダイズする配 列は、欠失、挿入、点突然変異、フレームシフト、代わりのオープン・リーディ ング・フレーム、又はｍＲＮＡスプライス変種によって関連付けられる。また、 ハイブリダイズする配列は、ｐ５５ＣＤＣの発現を調節するようにｐ５５ＣＤＣ ＤＮＡもしくはＲＮＡに結合するアンチセンス核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ） であってもよい。アンチセンス核酸は、ｐ５５ＣＤＣコーディング領域又はｐ５ ５ＣＤＣの転写及び／又は翻訳に関与する調節配列を標的としてもよい。 ｐ５５ＣＤＣにハイブリダイズするＤＮＡ配列は、好ましくは、ｐ５５ＣＤＣ の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。実施例３及び４に示される ように、ｐ５５ＣＤＣは１以上の宿主蛋白質と会合して細胞周期依存性キナーゼ 活性を有 する複合体を形成する。ここに記述されるように、ｐ５５ＣＤＣの生物学的活性 は、ヒストンＨ１、α−カゼイン及びミエリン塩基性蛋白質のような様々な基質 に対して活性の複合体関連キナーゼ活性を指し、１以上の基質に対するキナーゼ 活性は細胞周期内で調節される。例えば、α−カゼインに対するｐ５５ＣＤＣ複 合体のキナーゼ活性は、哺乳動物細胞周期のＧ₁／Ｓ及びＧ₂／Ｍ移行期の間に消 失する。 また、本発明は、外来性ＤＮＡ配列の原核細胞又は真核細胞発現の産生物とし てのｐ５５ＣＤＣポリペプチドに関し、すなわち、ｐ５５ＣＤＣは好ましくは組 換えｐ５５ＣＤＣである。ｐ５５ＣＤＣをコードする外来性ＤＮＡはゲノムＤＮ Ａであっても、ｃＤＮＡであってもよく、あるいは部分的もしくは完全合成ＤＮ Ａであってもよい。実施態様の１つにおいて、ｐ５５ＣＤＣ ＤＮＡは、原核宿 主細胞、特に大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主細胞中での発現に好ましい１以上の コドンを含む。ｐ５５ＣＤＣ発現のための配列に組み立て上げるＤＮＡ配列の合 成は、Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． ２８ ， ７１６−７３４ （１９８９））に記述される方法のような、当業者が容易 に利用可能な合成方 法を用いてなされる。 また、ｐ５５ＣＤＣ蛋白質の発現のためのプラスミド及び宿主細胞も本発明に よって提供される。ｐ５５ＣＤＣの発現は、原核又は真核宿主（例えば、哺乳動 物、植物もしくは昆虫細胞、酵母もしくは細菌細胞）中で成し遂げることができ る。好ましい宿主細胞には、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のよ うな哺乳動物細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような細菌 宿主が含まれる。ｐ５５ＣＤＣは、用いられる宿主細胞に適する様々なプラスミ ドまたはウイルスベクターから発現させることが可能である。ＣＨＯ細胞におけ るラットｐ５５ＣＤＣの発現へのベクターｐＭＴの使用が実施例２に記述されて いる。しかしながら、他の宿主細胞におけるｐ５５ＣＤＣの発現に適した他のベ クターも用いることができる。当業者が利用可能な発現ベクター及びＤＮＡトラ ンスフェクション手順を用いて、トランスジェニック動物でのｐ５５ＣＤＣの発 現を達成することができる。 また、ｐ５５ＣＤＣポリペプチドの製造方法も含まれる。この方法は、ｐ５５ ＣＤＣポリペプチドを発現するように、ｐ５５ＣＤＣ ＤＮＡ配列を含む発現べ クターで形質転換 又はトランスフェクトされている原核又は真核宿主細胞を培養することを包含す る。 単離されたｐ５５ＣＤＣポリペプチドは、本発明に包含される。このようなポ リペプチドは、ｐ５５ＣＤＣをコードするＤＮＡ分子の発現によって製造するこ とが可能であり、あるいは、当業者が利用可能な手順を用いるペプチドの化学合 成によって製造することが可能である。前述の生物学的もしくは化学的方法によ って生成されたｐ５５ＣＤＣポリペプチドは、当業者に周知の精製技術を用いて 単離される。ｐ５５ＣＤＣポリペプチドは、それぞれ配列番号２または配列番号 ４に示されるラットまたはヒトポリペプチドの類似体であってもよく、ここで、 この類似体は、１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。加えて、ｐ５ ５ＣＤＣポリペプチドの化学合成は、選択された位置での非天然アミノ酸（例え ば、Ｄ−アミノ酸）の組込みを可能とする。ｐ５５ＣＤＣポリペプチド内の活性 に必要なアミノ酸残基は、類似体を生成させ、この類似体を活性、例えば、細胞 周期関連キナーゼ活性を有する複合体を形成する能力、もしくは細胞周期を通し て宿主細胞を向上（ａｄｖａｎｃｅ）させる能力、について試験することにより 決定される。材料及 び方法に記述されるプロテインキナーゼアッセイを、ｐ５５ＣＤＣ類似体の生物 学的活性の試験に用いることが可能である。細胞分裂蛋白質ｃｄｃ４及びｃｄｃ ２０と相同性を示す領域（図３参照）のようなｐ５５ＣＤＣポリペプチドの選択 された領域を、生物学的に活性なｐ５５ＣＤＣ類似体またはペプチド断片の設計 に用いることができる。これらの領域はＧβ繰返しと呼ばれ、ｐ５５ＣＤＣの構 造及び／又は機能に重要であるようである。 また、本発明のｐ５５ＣＤＣポリペプチドに特異的に結合する抗体も提供され る。抗体はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよく、無傷蛋 白質の他に、ｐ５５ＣＤＣの断片、類似体及び融合ポリペプチドを認識すること が可能である。マウス抗ｐ５５ＣＤＣ抗体は、当業者に利用可能な技術によって 生成させることが可能であり、キメラもしくはヒト化抗体を形成するように変性 させることが可能である。抗ｐ５５ＣＤＣ抗体は、生物学的サンプル中に存在す るｐ５５ＣＤＣ及びｐ５５ＣＤＣ複合体を定量する下記検定において有用である 。 また、ｐ５５ＣＤＣ及び少なくとも１つの他の宿主細胞蛋白 質を含む複合体も提供される。実施例３には、ｐ５５ＣＤＣ及び会合した２１０ ｋＤａ蛋白質を有する、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの免疫複合体が 記述されており、この複合体は細胞周期関連キナーゼ活性を有している。実施例 ４には、第２のポリペプチドと会合したｐ５５ＣＤＣを有し、かつキナーゼ活性 を示す、ラット１及びＨｅＬａ細胞からの免疫複合体が記述されている。１１０ ｋＤａ蛋白質がラット免疫複合体中に同定され、１００ｋＤａ蛋白質がＨｅＬａ 免疫複合体中に同定された。得られた複合体が様々な宿主細胞分子をリン酸化す るように少なくとも１以上の他のポリペプチドと会合するｐ５５ＣＤＣの能力は 、細胞周期を調節するｐ５５ＣＤＣの能力に相関するように思われる。ｐ５５Ｃ ＤＣ類似体及び少なくとも１つの他の宿主細胞蛋白質を含む複合体も本発明に包 含される。好ましい実施態様において、ｐ５５ＣＤＣ複合体は、実施例４に記述 されるような細胞周期依存性キナーゼ活性を有する。 また、本発明は、生物学的サンプル中のｐ５５ＣＤＣのレベルを検出する方法 に関する。この方法は、ｐ５５ＣＤＣ、又はそれらの断片、類似体、もしくは融 合ポリペプチドを特異的に 結合する抗体を、サンプルと共に、抗体とｐ５５ＣＤＣとの複合体の形成に適し た条件下でインキュベートし、及びｐ５５ＣＤＣ−抗体複合体の存在を検出する ことを包含する。また、この抗体は、ｐ５５ＣＤＣが他の宿主細胞蛋白質と複合 体を形成している場合でも、ｐ５５ＣＤＣに結合することができる。したがって 、この方法は、ｐ５５ＣＤＣ複合体の検出をも包含する。ｐ５５ＣＤＣは活発に 分裂する細胞中には存在するが、静止細胞中には存在しないことから、ｐ５５Ｃ ＤＣの診断検定が、細胞分裂のレベルが高められたサンプルの同定に最も有用で あることが期待される。 細胞分裂を調節する方法も提供される。ｐ５５ＣＤＣの活性を調節する化合物 が細胞周期活性をも調節するであろうことは、当業者によって認識されるであろ う。ｐ５５ＣＤＣの合成を調節し、及び／又は細胞周期関連キナーゼ活性を有す る複合体を形成するｐ５５ＣＤＣの能力を調節する化合物は、ｐ５５ＣＤＣ活性 の決定について記述した手順を用いて同定することができる。ｐ５５ＣＤＣキナ ーゼ活性の調節は、細胞周期内の特定の期間での活性の増大または減少に関与す る可能性があり、ｐ５５ＣＤＣ複合体活性のタイミングまたは特異性の変更に繋 がるだろう。続いて細胞分裂の制御に用いられ得る化合物には以下のものが含ま れるが、これらに限定されるものではない：（１）ｐ５５ＣＤＣ合成のレベルを 増大もしくは減少させる化合物；（２）ｐ５５ＣＤＣに結合してキナーゼ活性を 有するｐ５５ＣＤＣ複合体の形成を阻害する化合物；（３）複合体の形成につい てｐ５５ＣＤＣと競合し、それ自身が不活性の複合体を形成する化合物；及び（ ４）ｐ５５ＣＤＣ複合体の形成を促進し、あるいは半減期を増大させることによ り解離からこの複合体を安定化する化合物。例には、ｐ５５ＣＤＣ ＤＮＡもし くはｐ５５ＣＤＣポリペプチドに結合する核酸分子、抗体、ペプチド、有機分子 及び炭水化物が含まれる。このような化合物は、化学合成又は天然源（例えば、 細菌、真菌、植物）から誘導される核酸、ペプチド又は小有機分子を含む大レー パトリー又はライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。分子又 はポリマーの天然もしくは合成の大ライブラリーの合成、特徴付け及びスクリー ニングについて、相当数の文献が存在する。当業者は、そのようなライブラリー をｐ５５ＣＤＣ活性を調節する化合物についてスクリーニングすることが可能で あることを認めるであろう。 ｐ５５ＣＤＣの生合成または活性を阻害する化合物は、正常の非ガン性細胞と 比較してｐ５５ＣＤＣのレベルが増大し、又はｐ５５ＣＤＣに関連する細胞周期 依存性キナーゼ活性のレベルが増大した腫瘍細胞の成長の抑制に有用である。化 学療法剤として有用な化合物には以下のものが含まれるが、これらに限定される ものではない：（１）ｐ５５ＣＤＣ合成のレベルを減少させる化合物；（２）ｐ ５５ＣＤＣに結合してキナーゼ活性を有するｐ５５ＣＤＣ−宿主細胞蛋白質複合 体の形成を阻止する化合物；及び（３）複合体形成に関与する１以上の宿主細胞 蛋白質との会合についてｐ５５ＣＤＣと競合し、それ自身不活性の複合体を形成 する化合物。恐らく増大したｐ５５ＣＤＣ活性のおかげで正常非ガン性細胞より も急速に成長する腫瘍細胞は、ｐ５５ＣＤＣ阻害剤に対しより感受性が高い可能 性がある。このような薬剤は、正常細胞のｐ５５ＣＤＣ活性にはほとんど作用が ないことが期待される。 また、医薬上有効なアジュバント中のｐ５５ＣＤＣ活性の減少もしくは抑制に 有効な量の化合物で哺乳動物を処置することを包含する化学療法も提供される。 ｐ５５ＣＤＣ活性を減少もしくは抑制させる化合物は、ここに記述されるｐ５５ ＣＤＣ活 性の検定を用いて、適当な供給源をｐ５５ＣＤＣに対する活性についてスクリー ニングすることにより同定される。ｐ５５ＣＤＣ活性の減少もしくは抑制に有効 な投与量は、治療する症状及び投与レジメのような因子を考慮して、当業者が決 定することができる。重要な考慮すべき問題には、治療する腫瘍の型及び位置、 並びに投与経路が注入（静脈内、筋肉内、もしくは皮下）によるものであるか、 あるいは経口もしくは鼻摂取によるものであるかが含まれる。本発明の化合物は 、適切な緩衝剤、可溶化剤、保存剤、担体又は酸化防止剤を含み得る、医薬上許 容し得るアジュバントと混合する。好ましくは、このアジュバントは、化合物の ｐ５５ＣＤＣ阻害活性を減少させないものである。医薬上許容し得るアジュバン トの広範な調査が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ． Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ ． Ｍａｃｋ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （１９９０）に見出される。 実施例１ ｐ５５ＣＤＣの同定および特徴付けｐ５５ＣＤＣ遺伝子 ｐ５５ＣＤＣをコードする遺伝子は、ラットα２，６シアリルトランスフェラ ーゼ（５７，７３参照）をコードするｃＤＮＡを有するラットゲノムライブラリ ーの低緊縮（ｌｏｗ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）スクリーニングにより新規グリコ シルトランスフェラーゼ酵素を同定する試みの中で偶発的に同定された。１回の スクリーニング中に、ゲノムクローンが単離された。制限地図分析により最初に ハイブリダイジング領域を２ ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩフラグメントに狭めた。この フラグメントの交差ハイブリダイジング領域をさらに０．２６ ｋｂ Ｐｓｔ Iフラグメントに狭め、それを、種々の胚、新生児および大人のラットの組織の ノーザン分析のために用いた。これにより、ｃＤＮＡライブラリーの構築のため のＲＮＡ源として用いることのできる組織を同定した。 ノーザン分析により、独特の転写体の組織特異性的かつ発生的に制御された発 現が示された（図１Ａ）。２ ｋｂ ｍＲＮＡは全ラット胚からのＲＮＡ中に豊 富であり、この転写体は胚 性ラットの肝臓に多い。しかしながら、２日齢の新生児ラットにおいて、肝臓に おけるメッセージレベルは急降下した。転写体は依然として２日齢ラットからの 脾臓において豊富であり、少量が腎臓に存在していた。１６日齢のラットにおい て、転写体は依然として脾臓および胸腺において豊富であったが、肝臓および腎 臓においてはほとんど検出されなかった。転写体はいかなる大人の組織において も検出できなかったが、より多くのＲＮＡを含むブロットをより長時間露出する と脾臓サンプルにおいて弱いバンドが現れた。新生児の肝臓、胸腺および脾臓の ような造血組織における転写体の存在は、細胞増殖が生じる組織においてこの新 規遺伝子の発現が最高であることを示している。 ｃＤＮＡライブラリーは、２日齢ラット脾臓からのポリＡ⁺ＲＮＡを用いて構 築された。Ｐｓｔ Ｉゲノムフラグメントをプローブとして用いて、およそ１： １５０００の頻度で数個の陽性プラークを同定した。二つの最も大きい挿入ｃＤ ＮＡをサクブローニングおよび配列決定した。ヌクレオチド配列（図２および配 列番号１）は、予想される分子量が５５ｋＤａの、４９９アミノ酸のタンパク質 をコードした。しかしながら、グリコシルトランスフェラーゼがゴルジ体におい て適正に配向さ れるために必須である、シグナル−アンカードメインに及ぶアミノ末端疎水性膜 の形跡がなかったので、この配列は古典的グリコシルトランスフェラーゼ酵素を コードしなかったようである（５７参照）。 ヒトｐ５５ＣＤＣ遺伝子を、以下の手順により、ＨＴ１０８０細胞系統ｃＤＮ Ａライブラリーから単離した。ヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列 を図２および配列番号３に示す。ラットとヒトの配列のオープンリーディングフ レームの比較はヌクレオチドレベルで８７％の同一性を示し、それはアミノ酸レ ベルで９５％に増加した。ヒトのヌクレオチド配列の相違がラット配列の上に示 され、ヒトのアミノ酸配列の相違が下に示されている。ヒトの配列は、ラットの ＡＴＧ開始部位の上流からかなりそれており、３’非翻訳領域においてもそうで あった。ｐ５５ＣＤＣの細胞周期タンパク質との相同性 ｇｅｎＥＭＢＬデータベースを調べると、ＧタンパクのβユサブユニットのＷ Ｄ−４０反復（２７参照）、およびこの不完全な繰返しモチーフを含む多くのタ ンパク（詳細については、１２，７２参照）に相同の７つの領域を、ラットおよ びヒトのｐ５５ＣＤＣタンパクが有していることが示された（図３Ａ）。 これらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＣＤＣ２０（６５参照）およびＣＤ Ｃ４ （７７参照）、ＴＵＰ１／ＡＥＲ２（７８参照）、ＰＲＰ４（５８参照）な らびにＭＳＩ１（６２参照）の産生物、また、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ遺 伝子Ｅｓｐ１、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｕｍ遺伝子ＡＡＣ３（６６参照）、Ａｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子ＣＯＰ１（１３参照）ならびにＤｒｏ ｓｏｐｈｉｌａ ＴＦ１１Ｄ（２２参照）のｄＴＡＦ₁₁８０サブユニットの産生 物を含む。図３Ｂに示す最も高度の相同性が、ｐ５５ＣＤＣと、二つのＳ．ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ 細胞分裂周期タンパクであるＣｄｃ２０（５１９アミノ酸）お よびＣｄｃ４（７７９アミノ酸）との間に見られた。ＢＥＳＴＦＩＴ分析により 、ｐ５５ＣＤＣのアミノ酸１７２〜４０７とＣｄｃ２０タンパクのアミノ酸２４ ９〜４７９との間の同一性が４５％であり、それが高度保存置換が含まれる場合 は５９％に増加することが示された。これは、ｐ５５ＣＤＣにおける縮重内部Ｇ β−反復との高度の類似性が判明した唯一のタンパクであった。Ｃｄｃ４タンパ クは、Ｃｄｃ４タンパクにおいて見られる９つの反復の最初の７つを用いると、 ｐ５５ＣＤＣにおいて見られる７つの反復全てに相同性が 高い唯一のタンパクであった（図３Ｂ）。これら二つのタンパクにおける高度縮 重ＷＤ−４０反復の整列は、３００アミノ酸残基に１６個のギャップを導入する ことを要求する。この比較は、この領域の２８％の残基が同一であり、４１％が 同一または高度に保存されていることを示した。注目すべきは、Ｓ．ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ Ｃｄｃ２０およびＣｄｃ４タンパクはそれぞれ、相互の相同性より も、哺乳類ｐ５５ＣＤＣタンパクに対して大きな程度の相同性を示した。 最近、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｄｃ１５突然変異体の温度感受性欠陥を 抑制する能力に基づいてＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離 されたクローンが、カルボキシ末端側の半分に７つのＧβ−反復を有する５１８ アミノ酸のタンパク（６９参照）をコードすることが示された。βＴｒＣＰ（β −トランスデューシン反復を含むタンパク）と呼ばれるこのタンパクは、ＣＤＣ ２０ の機能的相同体ではないが、これら両遺伝子の過発現はＣＤＣ１５突然変異 を抑制することができる（１，６９参照）。βＴｒＣＰおよびｐ５５ＣＤＣの両 方が７つのＧβ−反復を有し、この領域に２４％の同一性を示す。 Ｇβ−反復を越えて延びるｐ５５ＣＤＣに大きな相同性を示 した唯一のタンパクは、ｃＡＭＰレベルのＲＡＳ関連誘導の負の制御物質であるＳ ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＳＩ１タンパクであった（６２参照）。ＭＳＩ１ タンパク（４２２アミノ酸）は、ｐ５５ＣＤＣに２４％同一であり、これはｐ５ ５ＣＤＣのアミノ末端１７８残基のみをＭＳＩ１のアミノ末端１４８残基と比べ た場合、２８％に増加した。ｐ５５ＣＤＣの交雑種相同性 種々の哺乳類種、鶏、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ からのゲノムＤＮＡを、ラットｃＤＮＡプローブを用いてサザンブロッ ト分析により試験すると、ｐ５５ＣＤＣオープンリーディングフレーム内におけ る高度の進化保存が見られた（図４）。全ての哺乳類および鳥類種において交雑 種を検出することができたが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＤ．ｍｅｌａｎ ｏｇａｓｔｅｒ ＤＮＡを含むレーンにおいてバンドは見られなかった。これらの 結果は、ｐ５５ＣＤＣをコードする遺伝子が単一コピー遺伝子であり、試験した 種の中に密接に関係する遺伝子はないことも示している。組織および細胞系統におけるｐ５５ＣＤＣの発現 胚性および新生児ラット組織におけるｐ５５ＣＤＣ ｍＲＮＡの発現パターン 、および細胞分裂におけるｐ５５ＣＤＣの可 能な役割を示唆するｐ５５ＣＤＣとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣｄｃ２０および Ｃｄｃ４タンパクとの間の明確な関係に促されて、我々はｐ５５ＣＤＣ発現のた めの他の発生哺乳類組織を試験した。ヒト組織のノーザン分析は、ラットにおい て見られるものに類似する発現パターンを示し、胎児の肝臓および幼期の胸腺に おいては発現のレベルが高く、しかし、胎児の肺、成体の肺または肝臓、あるい は主に非分裂白血球からなる成体のバフィー・コートにおいては発現が見られな かった（図１Ｂ）。ヒト成人の心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および 膵臓からのポリＡ⁺ＲＮＡを試験する第２のノーザン分析は、一つの組織のみに おいて、すなわち活発に分裂している細胞を含む胎盤のみにおいてｐ５５ＣＤＣ の発現を示し、類似の発現パターンがｐ３４^cdc2（４８参照）について示された 。 多くのヒト細胞系統はｐ５５ＣＤＣ転写体も発現した。その転写体は、Ｔ細胞 系統ＭＯＬＴ ４ｆおよびＣＥＭ、Ｂ細胞系統ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓ、単核 細胞系統Ｕ９３７および骨髄赤血球細胞系統Ｋ５６２を含む試験した全ての白血 病細胞系統において豊富であった（図１Ｃ）。実際、我々は、系統に拘わらず、 対数増殖期において試験した全ての細胞系統において ｐ５５ＣＤＣの発現を観察した。 ｐ５５ＣＤＣ転写体の発現が細胞の分裂能に関係しているかどうか試験するた めに、我々は、二つの白血病細胞系統であるＫ−５６２およびＨＬ−６０の独自 の特性を利用した。Ｋ−５６２細胞は、成長速度に重大な影響を与えることなく 赤血球の分化を行わせるために酪酸ナトリウムで処理することにより誘導するこ とができる（２参照）。これに対して、Ｋ−５６２細胞をホルボールエステルＴ ＰＡで処理することにより成長停止を伴う単核細胞分化が引き起こされる。ＨＬ −６０細胞をＴＰＡで処理しても単核細胞分化が引き起こされ、ＤＮＡ合成およ び細胞分裂が停止される（６１参照）。我々は、これら二つの細胞系統における ｐ５５ＣＤＣ ｍＲＮＡの発現レベルへの、これら試薬の効果を試験した（図１ Ｄ）。ｐ５５転写体は、両方の偽処理細胞系統において容易に見つけることがで きた。Ｋ−５６２およびＨＬ−６０の両方について、細胞をＴＰＡで処理すると ｐ５５ＣＤＣ ｍＲＮＡの発現が損失した。その分化に成長停止が伴わない、酪 酸ナトリウムで処理したＫ−５６２細胞において、ｐ５５ＣＤＣ転写体のレベル は偽処理細胞において見られるものにほぼ等しかった。これらの結果は、ｐ５５ ＣＤＣ ｍＲＮＡが分裂細胞においてのみ合成されることを示している。 実施例２ 細胞増殖へのｐ５５ＣＤＣの影響 ｐ５５ＣＤＣタンパクの可能な機能を調べるために、ＣＨＯｄ^-細胞を、セン ス（ＰＭＴｐ５５ｓ）またはアンチセンス（ＰＭＴｐ５５ａｓ）配向においてラ ットのｐ５５ＣＤＣをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクシ ョンした。ラットｃＤＮＡの１．８ｋｂフラグメントを、ｐＭＴ０１０／Ａ⁺哺 乳類発現ベクターにおけるメタロチオネインプロモーターの下流に挿入した（９ 参照）。このベクターは、二つの主要な選択可能マーカー、すなわちＳＶ４０プ ロモーターにより作動される細菌ｎｅｏ遺伝子およびマウスＤＨＦＲ遺伝子も含 む。対照細胞はベクターのみでトランスフェクションした（ＰＭＴ）。メトトレ キセートでの増幅後に、３つの細胞プールを、亜鉛０．０５ｍＭの存在下に６０ ｍｍのプレート当たり０．５×１０⁶細胞の密度でプレーティングし、成長のプ ロフィールを１４日間プロットした（図５Ａ）。ＣＨＯｄ^-細胞におけるクロー ン変化の作用を最少限にするために、個々のクローンではなく、トランスフェク ションした細胞のプールを研 究した。最初は、トランスフェクションした細胞の３つのプール間で成長速度に ほとんど差異が見られなかったが、フローサイトメトリーおよび顕微鏡による目 視観察により決定される順方向散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ）分析に より示されるようにＰＭＴｐ５５ａｓ細胞はＰＭＴｐ５５ｓまたは対照細胞より かなり大きい。さらに、ヨウ化プロピジウム取り込みにより測定されるＤＮＡ含 量分析は、ＰＭＴｐ５５ａｓ細胞が増加量のＤＮＡ／細胞を有していることを示 したが、これはこれらの細胞が過２倍体（ｈｙｐｅｒｄｉｐｌｏｉｄ）であるこ とを示している（図５Ｂ）。プレートが集密状態に達しはじめると、成長プロフ ィールに劇的な相違が観察された。層寸法に合致する、より低い細胞数において 、ＰＭＴｐ５５ａｓ細胞が最初に集密に達した。集密に達した後、ＰＭＴｐ５５ ａｓ細胞はゆっくりと分裂を続けた。より小さいＰＭＴｐ５５ｓ細胞は、集密に 達した後により早い速度で分裂を続けた。ＰＭＴｐ５５ｓ細胞は１４日までに２ ４×１０⁶細胞／プレートの密度に達したが、これに対して、ＰＭＴｐ５５ａｓ 細胞は６×１０⁶細胞／プレートであった。ＰＭＴ細胞の成長プロフィールは、 ＰＭＴｐ５５ｓ細胞とＰＭＴｐ５５ａｓ細胞との中ほどであった。 アンチセンス転写体をコードするベクターによりトランスフ ェクションされた細胞は、変化した表現型を有していても生存を続けるので、ト ランスフェクションされた細胞プールのセンスおよびアンチセンスｐ５５ＣＤＣ ｍＲＮＡ転写体の存在をＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて試験した（７０参照 ）。表１に示すように、ＰＭＴ細胞は細胞当たり平均１６６コピーのセンスｍＲ ＮＡを有していたが、一方、予想されたように、ＰＭＴｐ５５ｓ細胞は細胞当た り平均７３４コピーの増加したセンスｍＲＮＡを有していた。驚くべきことに、 ＰＭＴｐ５５ａｓ細胞も、細胞当たり平均７１４コピーの増加したコピー数のセ ンスｍＲＮＡを有していた。さらに、ＰＭＴｐ５５ａｓ細胞は、アンチセンス転 写体をコードするｃＤＮＡによりトランスフェクションされていたにもかかわら ず、細胞当たり平均２０５コピーの中位のアンチセンスｍＲＮＡしか有していな かった。細胞プールから単離されたクローン細胞系統を分析したときに同じパタ ーンが観察された。４つのＰＭＴｐ５５ａｓクローン系統の各々が、全ての系統 においてセンス転写体の量を増加させ、この量はアンチセンス転写体の量の少な くとも５倍であった。予想されたように、対照ＰＭＴ細胞において、細胞当たり のセンス転写体の平均コピー数は集密細胞においてかなり低下した。 ６つのクローン細胞系統全てのゲノムＤＮＡ分析は、センス転写体の高度発現 は内因性遺伝子の増幅によるものではないことを示した。センス配向転写体を発 現する二つの単離したクローンは互いに異なっていた。対照的に、プラスミドま たはｐ５５ＣＤＣ配列を検出するために二つの異なる制限酵素および二つの異な るプローブを用いた４つのクローンＰＭＴｐ５５ａｓ細胞系統の制限地図分析は 同一のバンドパターンを示したので、単離した４つのＰＭＴｐ５５ａｓクローン 全てが、最初の細胞プール中の一つだけのトランスフェクションされた細胞の増 殖から誘導されたようである。この結果は、アンチセンス転写体によるｐ５５Ｃ ＤＣ発現の抑制が、センス転写体の過発現により補償されたことを示していた。 このデータは、ｐ５５ＣＤＣが培地における細胞増殖の維持にために必須である ことを示した。 実施例３ ｐ５５ＣＤＣを含む免疫複合体 ポリクローン性のウサギ抗血清を、ｐ５５ＣＤＣとグルタチオンＳ−トランス フェラーゼとからなる融合タンパクに対して生成させた。最初の抗血清およびア フィニティ精製抗体調製物 の両方が、ｐ５５ＣＤＣ ｃＤＮＡを含むin vitro転写／翻訳反応からＭｒ ５ ５ ｋＤａのタンパクを沈降させ、それはポリペプチドの予想した分子量に一致 していた。 トランスフェクションした細胞系統におけるｐ５５ＣＤＣ産生のレベルを試験 するために、アフィニティ精製抗体を用いて、対数期の³⁵Ｓ−標識化細胞の抽出 物について免疫沈降を行った。図６Ａに示すように、ＰＭＴｐ５５ｓおよびＰＭ Ｔｐ５５ａｓ細胞は、ＰＭＴ細胞と比べて増加したレベルのｐ５５ＣＤＣを有し ており、これは、これらの細胞内におけるｐ５５ＣＤＣをコードする増加した数 の転写体の立証と一致する。ＰＭＴｐ５５ｓ細胞において、おそらくｐ５５ＣＤ Ｃの分解生成物を表す３１ｋＤａの強いバンドがあったが、このバンドは、ポリ クローン抗体調製を用いる細胞抽出物の免疫ブロット分析においても検出された 。この３１ｋＤａバンドは、プロテアーゼ阻害剤の不在下に細胞溶解物を調製し た場合にも観察され、プロテアーゼ阻害剤の不存在下には無傷のｐ５５ＣＤＣは 検出されなかった。免疫複合体のいずれにおいてもｐ３４^cdc2タンパクは検出さ れなかったので、このペプチドはｐ３４^cdc2ではなかった。 ｐ５５ＣＤＣの免疫沈降物は、Ｍｒ ２１０ ｋＤａのタンパクも含んでいた 。免疫沈降物中で見つかったｐ２１０の量は、ｐ５５ＣＤＣの量におおむね比例 していた。この実験を静止期の細胞について繰返し行った場合、プレーティング 後７日で、ｐ５５ＣＤＣおよびｐ２１０の両方の量が大きく減少し（図６Ｂ）、 図６Ｂにおいて、ｐ５５ＣＤＣの検出に１週間のオートラジオグラムの露出が必 要であったが、これに対して図６Ａにおいては２１時間の露出であった。これら の結果は、ｐ５５ＣＤＣの産生が増殖細胞において最も高いことを示している。 実施例４ ｐ５５ＣＤＣ免疫複合体のキナーゼ活性 細胞周期内の多くの事象が種々のキナーゼにより制御されるので、ｐ５５ＣＤ Ｃ免疫複合体がキナーゼ活性を有しているかどうか決めることは興味深い。プロ ティンキナーゼ活性を試験した全ての免疫複合体は、図６と同様の条件下に沈降 した。免疫沈降緩衝液は、非特異的タンパク結合を最少限にするように調製され た（ＮＰ−４０が１％、デオキシコール酸塩１％およびＳＤＳ０．１％）。多く の細胞分裂キナーゼがヒストンＨ１をリン酸化しうるので、この基質が最初にア ッセイされた。図 ７Ａに示すように、ｐ５５ＣＤＣ抗体で免疫沈降した免疫複合体がヒストンＨ１ をリン酸化した。ＰＭＴ、ＰＭＴｐ５５ｓおよびＰＭＴｐ５５ａｓ細胞の溶解物 から調製される免疫複合体は全て、ヒストンＨ１に対してキナーゼ活性を示した 。ｐ５５ＣＤＣの発現の向上したＰＭＴｐ５５ｓおよびＰＭＴｐ５５ａｓ細胞に おいて最も高いレベルのリン酸化が見られた。競合する抗血清を用いる陰性対照 において、少量の残存活性が見られる。外因性の基質を添加せずに行った反応に おいて、リン酸化タンパクは検出されず、このことは免疫複合体中のタンパクが キナーゼ活性の内因性基質でないことを示していた。しかしながら、トランスフ ェクションした細胞の３つのプールの全てが［³²ｐ］−オルトリン酸で標識され 、ｐ５５ＣＤＣが免疫沈降されたとき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ｐ５５Ｃ ＤＣがリン酸化されたことが示された（図７Ｂ）。すなわち、ｐ５５ＣＤＣは、 ＣＨＯ細胞内の別の内因性キナーゼの基質である。ＰＭＴｐ５５ｓ細胞において 、³²ｐ−標識３１ ｋＤａバンドは検出されず（図６ＡおよびＢ、レーン８およ び１０参照）、これは、ｐ５５ＣＤＣの３１ ｋＤａ分解フラグメントがリン酸 化されないか、分解前に脱リン酸化されることを示している。 異なる細胞系統中におけるｐ５５ＣＤＣが免疫複合体中の他のタンパクと会合 するかどうか、およびこれらの複合体がキナーゼ活性も有するかどうかを試験す ることを我々は望んだ。この分析のためにラット１線維芽細胞およびＨｅＬａ細 胞系を選択した。増殖しているラット１およびＨｅＬａ細胞を溶解し、アフィニ ティ精製ｐ５５ＣＤＣ抗体を用いて免疫複合体を沈降した（図８Ａ、レーン２お よび４）。免疫複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はＣＨＯ細胞において見られる２ １０ｋＤａバンドを示さなかったが、細胞特異的であると思われる他の別々のバ ンドを示した。ラット１細胞において、１１０ｋＤａのタンパクがｐ５５ＣＤＣ 免疫複合体中に存在し、一方、１００ｋＤａのタンパクがＨｅＬａ細胞内のｐ５ ５ＣＤＣ免疫複合体内に見られた。 ＨｅＬａ細胞からのｐ５５ＣＤＣ免疫複合体を、多くの異なる基質に対するキ ナーゼ活性について試験した（図８Ｂ）。キナーゼ活性は、ヒストンＨ１、ミエ リン塩基性タンパクおよびα−カゼインについて検出され、ミエリン塩基性タン パクについて最高の活性が検出された。β−カゼインも試験したが、基質として のβカゼインについて最小の活性が検出された（デー タは示さない）。免疫沈降に用いられる抗体の量の増加によりミエリン塩基性タ ンパクのリン酸化が増大するので、キナーゼ活性のレベルは、ｐ５５ＣＤＣ濃度 に相関していた（図８Ｃ）。 ｐ５５ＣＤＣ関連キナーゼ活性が、サイクリン依存性キナーゼについて記載し たように、細胞周期中に変動するかどうかを決めるために、細胞を細胞周期内の 種々の時点において休止し、細胞溶解産物から沈降された免疫複合体をキナーゼ 活性について試験した。キナーゼ活性中の細胞周期関連変動の異なるパターンが 、３つの試験した基質のうちの一つであるあるα−カゼインのみについて検出さ れた（図８ＤおよびＥ）。α−カゼインに対するキナーゼ活性はＨｅＬａ細胞、 および血清枯渇によりＧ₁がブロックされた細胞において存在していた。α−カ ゼインに対する活性レベルは、Ｇ₁／Ｓで休止された細胞において約４倍であり 、Ｓ期中に採集した細胞において最高レベルに戻った。キナーゼ活性は、細胞周 期のＧ₂期における細胞において一定に維持され、Ｇ₂／Ｍ移行における細胞にお いて６分の１に減少した。ｐ５５ＣＤＣ免疫複合体によるヒストンＨ１に対する キナーゼ活性は、細胞周期を通して安定であった（図８Ｅ）。Ｇ₂／Ｍ細胞にお けるヒストンＨ１キナーゼ活性のバ ックグラウンドレベル（図８Ｄ、レーン８）は、これらのサンプル中の残存ｐ３ ４^cdc2キナーゼ活性に最も起因するようである。ミエリン塩基性タンパクに対す るキナーゼ活性も、活性が２分の１に減少することが観察されたＧ₂／Ｍ移行を 除いて、細胞周期中において比較的一定であった。いずれの種々の期間において も、細胞から調製された細胞溶解物の免疫ブロッティングによりｐ５５ＣＤＣを 検出することは困難であるが、細胞内に存在するｐ５５ＣＤＣの量は、ｐ５５Ｃ ＤＣ免疫複合体について観察されるキナーゼ活性における変動と異なり、細胞周 期中に変動しないようであった。 実施例５ 成長および休止細胞における ｐ５５ＣＤＣ発現およびキナーゼ活性 成長および休止細胞集団におけるｐ５５ＣＤＣの発現および関連するキナーゼ 活性を、制限血清条件下にラット１細胞が成長を停止させる能力を調べることに より比較した。図９Ａに示すように、指数的に増殖しているラット１細胞は標識 化ｐ５５ＣＤＣを盛んに合成した（レーン３〜６）が、休止細胞集団は、１時間 の標識化期間中に最少のｐ５５ＣＤＣ産生を示した（レ ーン９〜１１）。観察されるキナーゼ活性が非特異的に細胞溶解物から沈降しな いようにするために、免疫沈降において増加量のｐ５５ＣＤＣ抗体を用いた。レ ーン３〜６に示すように、ｐ５５ＣＤＣ抗体の量の増加は、増加レベルのｐ５５ ＣＤＣの沈降を生じた。この結果は、図８Ｃにおいて観察された結果と一致する が、沈降に用いられる抗体の量を増加させると、検出されるｐ５５ＣＤＣキナー ゼ活性のレベルが増大した。また、免疫沈降物のクーマシーブルー染色ゲル上で 検出されるように、二つのサンプルにおいてｐ３４^cdc2合計量は実質的に等しい が、標識化されたｐ３４^cdc2の産生は休止細胞集団において実質的に減少する（ レーン１と７とを比較）。我々はまた、これら二つの条件下におけるｐ５５ＣＤ Ｃ関連キナーゼ活性を試験し、それを対照としてのｐ３４^cdc2免疫複合体につい て観察されるものと比較した。α−カゼインはｐ３４^cdc2キナーゼの基質として はよい基質でないので、α−カゼインを基質として用いることにより、ｐ５５Ｃ ＤＣ複合体についてより高いレベルの活性が観察された（図９Ｂ）。ｐ３４^cdc2 キナーゼとｐ５５ＣＤＣ関連キナーゼの両方が、休止細胞において活性の低下を 示した。ＨｅＬａ細胞において見られるように、基質としてミエリ ン塩基性タンパクを用いた場合、ｐ５５ＣＤＣ関連キナーゼ活性の大きな変化は 見られなかった。 材料および方法ＲＮＡ分析 コムチンスキ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）およびサッチ（Ｓａｃｃｉ）の方法 により、新鮮な解剖ラット組織、ヒト胸腺およびバフィコートから全ＲＮＡを調 製した（８参照）。ヒト細胞系統からのｍＲＮＡは、ファストラック・キット（ Ｆａｓｔｒａｃｋ ｋｉｔ）（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製） により調製した。ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルにおいて全ＲＮＡ （３０μｇ／レーン）のゲル電気泳動を行ない、先に報告されたようにノーザン ハイブリダイゼーションを行った（７３参照）。アマーシャム・マルチプライム （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ）ＤＮＡ標識化システムＲＰＮ． １６０１を用いて放射性標識プローブをつくった。ｍＲＮＡのサイズは市販のＲ ＮＡ標準と比較することにより決めた（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社 （Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ガイザ ースブルク（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）， メリーランド州）。他のヒト組織からのｍＲＮＡは、多重ヒト組織ノーザンブロ ットとしてクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。 ＲＮＡｓｅ保護アッセイのためのリボプローブをつくるために、Ｔ７プロモー ターに対してセンスおよびアンチセンス配向の両方の配向で、ゲル精製ｐ５５Ｃ ＤＣ ｃＤＮＡフラグメントをブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（ス トラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ラジョラ（ＬａＪｏｌｌａ），カリ フォルニア州）にサブクローニングした。その後の全ての工程は前述したように 行った（７０参照）。簡単に言えば、細胞（１×１０⁶／ｍｌ）をリン酸塩緩衝 食塩水（ＰＢＳ）中で洗い、室温で２０分間インキュベートすることにより、ト リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１０ｍＭ（ｐＨ８．０）、ＥＤＴＡ １ ｍＭ、ジチオトレイトール２０ｍＭ、プロテイナーゼＫ １００μｇ／ｍｌおよ び０．２％ＳＤＳ中に溶解した。溶解サンプルを、標識化リボプローブとともに ハイブリダイゼーション混合物に添加し、８４℃で２時間インキュベートした。 ＲＮＡｓｅ ＡおよびＲＮＡｓｅＴ１を用いた３７℃で２０分間のＲＮＡｓｅ消 化に続いて、サンプルをセファクリル （Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ２００スーパーファイン（Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）ゲル 濾過カラム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ），セントルイス、メリーランド州）にロー ドし、保護されたプローブを含むボイド容積画分をカウントした。遺伝子特異的 ＲＮＡの量を標準曲線から算出した。全てのアッセイは２回行った。ＲＮＡ分析 ゲノムサザーンおよび制限地図分析は、標準的分子生物学的技術を用いて行っ た（６３参照）。種々の種からのゲノムＤＮＡはクローンテック社（Ｃｌｏｎｔ ｅｃｈ）（パロ アルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ），カリフォルニア州）から購入 した。中位のストリンジェントのハイブリダイゼーションを４０％ホルムアミド 中４２℃で行った。全てのハイブリダイゼーションは５×ＳＳＰＥの塩濃度で行 った。一晩のハイブリダイゼーション後に、フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中５０℃で３回洗った。最後の洗浄は０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中 で３０分間行った。ＤＮＡ配列は、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ユ ー・エス・バイオケミカル社（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）製）を用いて 、製造元のプロトコールに従って決定した。また、配列決定を、タグ・ダイ・デ オキ シ・ターミネーター・キット（Ｔａｇ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔ ｏｒ ｋｉｔ）を用いて指示されたプロトコールに従い、アプライド・バイオシ ステムズ・３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーで行った。ＧＣＧ ＢＥＳＴＦＩＴ プログラムを用い、ギャップ重量を２．０および長さ重量（length weight）を ０．０５にして、Ｇβモチーフを有する遺伝子間の比較のための同一性値％を得 た。ラットｐ５５ＣＤＣのｃＤＮＡクローニング シャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａ（クローンテック社製）内に連結されたＥｃｏ ＲＩ部分消化物からつくられたラットゲノムライブラリーを、ａ２，６シアリル トランスフェラーゼ遺伝子のアミノ酸残基１４１〜２８６を含む４３５塩基対ｃ ＤＮＡプローブを用いて、低ストリンジェント条件（４３％ホルムアミド中３７ ℃でのハイブリダイゼーション）でスクリーニングした（７３参照）。単離され たゲノムクローンの制限地図分析は、プローブにハイブリダイズした２ ｋｂ Ｂｇｌ IIフラグメントを示した。このフラグメントをｐＵＣベクター内にサブ クローニングし、さらなる分析によりハイブリダイジング領域を０．２６ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉフラグメントに狭め、それを 全てのその後の分析において用いた。新生児ラットの脾臓からのポリＡ⁺ＲＮＡ を、２サイクルのオリゴ（ｄＴ）−セルロース・タイプ２（コラボラティブ・リ サーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）製）への結合により 選択した。ｃＤＮＡライブラリーを、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ｃＤ ＮＡ合成キットを用い、続いてｌｇｔ１０ベクター内に連結することにより構築 した。これを、ギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）ＩＩゴールド（Ｇｏｌｄ）クロ ーニング・キット（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）を用いてパ ッケージングした。最初のパッケージング反応により３．３×１０⁶ｐｆｕを得 、プローブとして０．２６ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ フラグメントを用いて１×１０⁶ ｐｆｕをスクリーニングした。ヒトｐ５５ＣＤＣのｃＤＮＡクローニング ヒトＨＴ１０８０細胞系ｃＤＮＡライブラリーを、ｐＳＰＯＲＴ−１プラスミ ドベクター（ＢＲＬ・ライフ・テクノロジー社（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）製）内に構築した。約５０００コロニーの４４プー ルからのＤＮＡの各々をＮｏｔ Ｉで線状化し、プローブとしてラット のｐ５５ＣＤＣｃＤＮＡを用いてサザンブロットによりスクリーニングした。最 も長い挿入体を有するクローンのプラークおよびコロニー精製を標準的技術を用 いて行った（６３参照）。細胞培養、同調および標識化 ＨＬ６０およびＫ５６２細胞を、ＰＲＭＩ１６４０（アービン・サイエンティ フィック社（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），アービン，カリフオルニ ア州）中、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭおよび１５％牛胎児血清を加えて、成長させた。 細胞は０．２×１０⁶細胞／ｍｌ培地の濃度で接種した。酪酸ナトリウム１ｍＭ で処理した細胞を７５ｃｍ²フラスコ内で３日間成長させた。ホルボールエステ ルで誘導した細胞を、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール １３−アセテ ート（ＴＰＡ）３０ｎｇ／ｍｌの存在下に３日間成長させた。細胞をグアニジン チオシアネートで溶解し、全ＲＮＡを記載したように調製した（８参照）。ＣＨ Ｏｄ^-細胞を、５％の牛胎児血清、グルタミン、非必須アミノ酸およびヒポキサ ンチンを加えたダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。ラット １細胞を、１０％血清およびグルタミンを含むＤＭＥＭ中に維持し、ＨｅＬａ細 胞を、１０％血清、グルタミンおよび非必須アミノ 酸を加えた最少必須培地中に維持した。 ＨｅＬａ細胞を、ハインツ（Ｈｅｉｎｔｚ）らにより記載された二重チミジン ／アフィジコリンブロックによりＳ期（Ｇ₁／Ｓ）の開始時に同調させた（３５ 参照）。４時間後に採取した細胞はＳ期中にあった（５９参照）。Ｇ₂／Ｍ移行 における同調（synchronization）は、ノコダゾール０．５μｇ／ｍｌの存在下 における１２〜２４時間の成長により達成した。培地を注意深く吸引して取り去 り、非付着性有糸分裂細胞を、緩衝液をゆっくりとピペットで単層上に移すこと により採取した。付着性の細胞をＰＢＳで洗い、溶解した。この個体群は有糸分 裂性ではなく、主にＧ₂期にある（３６参照）。 同調していない指数的に増殖する細胞を、２％透析血清を含みメチオニンおよ びシステインを含まない培地で１時間成長させ、続いて³⁵Ｓ トランスラベル（ Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ）（ＩＣＮ バイオメディカルズ社（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅ ｄｉｃａｌｓ），アービン，カリフォルニア州）の培地１００μＣｉ／ｍｌを含 む同じ培地で２時間成長させた。リン酸塩を含まない培地での１時間の予インキ ュベーションに続いて、［³²Ｐ］−オルトリン酸塩（ＩＣＮ バイオメディカル ズ社製）による 標識化を３時間行った。 プレートをＰＢＳで濯ぎ、続いて０．１％牛胎児血清を含む培地中で濯ぐこと によりラット１細胞を成長停止させた。細胞を低血清培地中で４８時間成長させ て休止細胞集団を得た。³⁵Ｓ−トランスラベルによる標識化を、透析血清濃度を ０．１％に維持し、ラベルを１時間かかって組み込んだ以外は、前述のように行 った。指数的に成長するラット１細胞の集団について、標識化中に透析血清濃度 を２％に維持した。 フローサイトメトリー分析のために、１×１０⁶細胞をＰＢＳ中で洗い、７０ ％エタノール、２．０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００中で１時間固定し た。固定した細胞をＰＢＳ中で洗い、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）５０μｇ／ｍ ｌおよびＲＮＡｓｅ Ａ２０μｇ／ｍｌの溶液中で染色した。ＦＡＣＳｃａｎ（ ベクトン・ディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），マウンテン ビュー，カリフォルニア）を用いて、細胞のＤＮＡ含量（蛍光強度）および細 胞サイズ（順方向散乱）を分析した。ＣＨＯｄ^-細胞のトランスフェクション 新生ラット脾臓ライブラリーから得られた１．８ ｋｂ ｃＤＮＡを、ｐＭＴ０１０／Ａ⁺哺乳類発現ベクターのＢａｍ Ｈ１部位内にク ローニングした（９参照）。ｃＤＮＡを、センス（ＰＭＴｐ５５ｓ）およびアン チセンス（ＰＭＴｐ５５ａｓ）の両方の配向でメタロチオネインプロモーターの 下流に挿入した。対照としてのベクター単独のみならず、これらのプラスミドを 、指示されたプロトコールに従ってリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ ＢＲＬ・ライフ・テクノロジー社（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ，Ｉｎｃ．）製）を用いて細胞内にトランスフェクションした。ヒポキサンチ ンを含まないで培地中４００μｇ／ｍｌでのジェネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ）による最初の選択に続いて、メトトレキセートによる段階的増幅により２μＭ の最終濃度に達した。亜鉛０．０５ｍＭを含む培地中で成長曲線を実行しメタロ チオネインプロモーターを誘導した。抗体調製 最初の１０コドンを欠いているｐ５５ＣＤＣ ｃＤＮＡクローンを、ｐＧＥＸ −３Ｘベクター（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＧＳＴ遺伝子融合システ ム）のＥｃｏＲ１部位に挿入した。コンピテントＸＬ−１細胞（ストラタジーン 社製）を 形質転換し、組換えプラスミドを保有するコロニーを単離した。融合タンパクの 増量生成のために、培地をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（最終 濃度０．１ｍＭ）で誘導した。音波処理および１％トリトンＣＦ−５４による可 溶化の後に、ペレット中に留る７６ｋＤａの不溶性融合タンパクを得た。溶解お よび音波処理した細胞から得られるペレットを、１％トリトンＣＦ−５４を含む ＰＢＳで２回洗い、得られるペレットを１０Ｍ尿素で抽出した。１０Ｍ尿素を欠 いたもので融合タンパクを抽出しようとする全ての試みは失敗した。尿素抽出物 をＰＢＳで一晩透析し、得られる懸濁液をアリコートとして８０℃以下で貯蔵し 、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりさらに精製した。ペレットをＳＤＳ サンプル緩衝液中に再度懸濁し、１０％ＳＤＳゲル中で分離した。５５ｋＤａお よび８０ｋＤａの目視できる標準マーカーの間の領域を切り取り、タンパクを電 気溶離（バイオラード・モデル・４２２・エレクトロエルーター（Ｂｉｏｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ４２２ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｅｌｕｔｅｒ））により回収した。こ の調製物をフロイント不完全アジュバントと混合し、ウサギの免疫に用いた。フ ロイント不完全アジュバントを用いて４週間後にブースター注入を行っ た。ブースター注入後１０〜１４日目に動物を出血させた。抗血清の精製のため のアフィニティカラムを得るために、粗製の不溶性融合タンパクペレットをカッ プリング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ８．３；０．５Ｍ ＮａＣｌ； ０．５％ ＳＤＳ）中に再懸濁させ、製造者（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ），ピスキャットアウェイ，ニュージャージー州）の指示に従ってシアノー ゲンブロミド活性化セファロースにカップリングした。約０．４ｍｇタンパク／ ｍｌゲルのカップリング効率を達成した。抗血清を最初に、関係のない不溶性融 合タンパクに吸収させて、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼまたは夾雑す るＥ．ｃｏｌｉタンパクに対して反応性を有する抗体を除去した。この部分精製 した抗血清をアフィニティカラムに添加した。カラムを５倍カラム容積のＰＢＳ で洗い、アフィニティ精製抗体を３Ｍチオシアン酸ナトリウムで溶離した。抗体 画分プールを直ちにＰＢＳで透析し、−８０℃で貯蔵した。このカラムからの素 通り画分を競合する抗血清として用いた。免疫沈降およびプロティンキナーゼアッセイ ヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）， マジソン，ウィスコンシン州）および ［³Ｈ］−ロイシン（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＴＲＫ６８３）を用い てin vitro 翻訳を行った。ストラタジーンin vitro 転写キットを用いてｍＲ ＮＡテンプレートを製造し、ｐ５５ＣＤＣ ｃＤＮＡを支持体としてのブルース クリプトベクター内にサブクローニングした。プレートをＰＢＳで２回濯いだ後 に細胞溶解物を記載された（５９参照）ように調製した。追加のプロテアーゼを 含有する改良した放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（ＮａＣｌ １５０ ｍＭ，１．０％ＮＰ−４０，１．０％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％Ｓ ＤＳ，ＥＤＴＡ２ｍＭ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄６ｍＭ，ＮａＨ₂ＰＯ₄４ｍＭ，ＮａＦ５０ ｍＭ，Ｎａ₃ＶＯ₄２００μＭ，アプロチニン２０μｇ／ｍｌ，ロイペプチン１μ ｇ／ｍｌ，大豆トリプシンインヒビター１０μｇ／ｍｌおよびフェニルメチルス ルホニルフルオライド５０μｇ／ｍｌ）中で細胞を溶解した。全てのプロテアー ゼインヒビターはシグマ社（Ｓｉｇｍａ）から購入した。タンパク濃度はビシン コニン酸（Bicinchoninic acid）試薬（ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）製）を用い て評価した。最終容量７００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中の２５０μｇの溶解物に対 し、両調製物に等量のイムノグロブリンを与えるアフィニティ精製 ｐ５５ＣＤＣ抗体（１４０μｇタンパク／ｍｌ）７μｌまたはｐ５５ＣＤＣ競合 抗血清（７００μｇタンパク／ｍｌ）１２μｌを用いた。ｐ３４^cdc2マウスモノ クローナル抗体１７（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），サンタクルーズ，カリフォルニア州 ）１０μｌを用いてｐ３４^cdc2複合体の免疫沈降を行った。この研究で用いた他 の抗体は、Ｒｂ（１Ｆ８）、すなわちＲｂ−βガラクトシド融合タンパクに対す るマウスモノクローナルＩｇＧ（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社（Ｓ ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製）、およびＲｂ（Ａｂ− １）、すなわちレチノブラストーマタンパクに対する他のモノクローナル抗体（ オンコジーン・サイエンス社（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ），ユニオン デール，ニューヨーク州）である。免疫複合体を氷上で日常的方法で一晩インキ ュベートし、翌朝、プロティンＧ−セファロース（ファーマシア社製）の５０％ スラリー３０μｌを用いて集めた。洗ったペレットを、（５９）に記載している ようにヒストンＨ１キナーゼ活性についてアッセイした。全ての反応は３０℃で ３０分間行った。アッセイは、また、同じアッセイ条件を用い て、示された濃度において種々のキナーゼ基質を用いて行った。ヒストンＨ１は 、ベーリンガーマンハイムから購入し、ミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）、β −カゼインおよびα−カゼインの全てはシグマ社から購入した。反応生成物は、 染色したバンドを乾燥ゲルから切り出し、計数することにより定量した。 本発明を好ましい実施態様により説明してきたが、当業者はこれらを変更およ び変形するものと解される。したがって、添付の請求の範囲は、請求している発 明の範囲内においてそのような均等の変形を含むものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/18 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9359−4Ｂ 9/12 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/12 9358−4Ｂ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 0276−2Ｊ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 33/577 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ウエインステイン，ジヤスミンダー アメリカ合衆国、カリフオルニア・91361、 ウエストレイク・ビレツジ、リツジフオー ド・ドライブ・3470

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するＤ ＮＡ； ｂ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ ；及び ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のＤＮＡ又はそれらの断片とハイブリダイズするヌ クレオチド配列を有するＤＮＡであって、このハイブリダイズするＤＮＡがｐ５ ５ＣＤＣの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、 からなる群より選択される、生物学的に活性なｐ５５ＣＤＣポリペプチドをコー ドする単離ＤＮＡ。 ２． ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡである請求項１記載の単離ＤＮＡ 。 ３． 大腸菌宿主細胞における発現に好ましい１以上のコドンを含む請求項１記 載の単離ＤＮＡ。 ４． 請求項１記載のＤＮＡを含む、生物学的に機能的なプラスミド又はウイル スＤＮＡベクター。 ５． 請求項４記載のＤＮＡベクターで安定に形質転換もしく はトランスフェクトされている原核又は真核宿主細胞。 ６． 単離ｐ５５ＣＤＣポリペプチド。 ７． 配列番号４のアミノ酸配列を有する請求項６記載のポリペプチド。 ８． 外来性ＤＮＡ配列の原核細胞又は真核細胞発現の産生物であることによっ て特徴づけられる請求項６記載のポリペプチド。 ９． 請求項１記載のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペ プチド。 １０． 細胞周期依存性キナーゼ活性を有する複合体を形成する能力を有する請 求項９記載のポリペプチド。 １１． 請求項５記載の宿主細胞を培養して該宿主細胞がｐ５５ＣＤＣポリペプ チドを発現することを可能にすることを包含するｐ５５ＣＤＣポリペプチドの製 造方法。 １２． 請求項１記載のＤＮＡによってコードされるポリペプチドを特異的に結 合する抗体。 １３． モノクローナル抗体である請求項１２記載の抗体。 １４． ２以上の蛋白質の複合体であって、該蛋白質の１つがｐ５５ＣＤＣで あり、かつ該複合体が細胞周期依存性キナーゼ 活性を有する複合体。 １５． 細胞分裂を調節する方法であって、請求項１４記載の複合体の細胞周期 依存性キナーゼ活性を調節する化合物を細胞に導入することを包含する方法。 １６． 前記化合物が、 ａ）ｐ５５ＣＤＣ合成のレベルを増大もしくは減少させる化合物； ｂ）細胞周期依存性キナーゼ活性を有するｐ５５ＣＤＣ複合体の形成を阻害す る化合物；及び ｃ）ｐ５５ＣＤＣ複合体の形成を促進し、又は該複合体を安定化する化合物、 からなる群より選択される、請求項１５記載の方法。 １７． 前記化合物が核酸分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、炭水化物及び 有機分子である請求項１６記載の方法。 １８． 細胞周期依存性キナーゼ活性を阻害するに十分な量の化合物を細胞に導 入することにより細胞分裂が抑制される請求項１５記載の方法。 １９． 前記化合物が、 ａ）ｐ５５ＣＤＣ合成のレベルを減少させる化合物；及び ｂ）細胞周期依存性キナーゼ活性を有するｐ５５ＣＤＣ複合体の形成を阻害す る化合物、 からなる群より選択される、請求項１８記載の方法。 ２０． 前記細胞が腫瘍細胞である請求項１８記載の方法。 ２１． 薬学的に有効なアジュバント中の、請求項１４記載の複合体のキナーゼ 活性を抑制するに十分な量の化合物で哺乳動物を処置することを包含する化学療 法。 ２２． 生物学的流体中のｐ５５ＣＤＣのレベルを検出する方法であって、ｐ５ ５ＣＤＣに特異的な抗体を、該流体と共に、該抗体とｐ５５ＣＤＣとの複合体の 形成に適する条件下でインキュベートする工程、及び抗体−ｐ５５ＣＤＣ複合体 の存在を検出する工程を包含する方法。 ２３． 生物学的流体中の請求項１４記載の複合体のレベルを検出する方法であ って、ｐ５５ＣＤＣに特異的な抗体を、該流体と共に、ｐ５５ＣＤＣへの抗体結 合に適する条件下でインキュベートする工程、及び複合体に結合した抗体の存在 を検出する工程を包含する方法。