JPH09510601A

JPH09510601A - ヒト遺伝子治療用のエピソーム発現ベクター

Info

Publication number: JPH09510601A
Application number: JP7513785A
Authority: JP
Inventors: クーパー，マーク・ジェイ
Original assignee: ケース・ウエスタン・リザーブ・ユニバーシティ
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-04-13
Publication date: 1997-10-28
Also published as: WO1995013377A1; US5770374A; US6339065B1; EP0728202A4; EP0728202A1; AU7353494A; US5624820A

Abstract

(57)【要約】パポバウイルスの複製開始点およびパポバウイルスラージＴ抗原変異型を含むエピソームプラスミドは、ヒト細胞においてエピソームとして複製し、エピソームのコピー数に比例した遺伝子の発現レベルが得られる。リポソームまたは受容体仲介伝達システムと組み合わせて、パポバウイルス由来のエピソームプラスミドは、特に高レベルの遺伝子発現が必要とされる手法を使用するときに遺伝子治療において有用なベクターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト遺伝子治療用のエピソーム発現ベクター本発明に至る研究は、国立衛生研究所より、認可第Ｐ３０ＣＡ４３７０３号に一部支援されている。米国政府は、本発明に対して権利を保持する。発明の背景発明の分野本発明は、哺乳動物中で効率的に複製するエピソームを高コピー数持ちおよびコードする遺伝子を高レベルで発現する安定な形質導入体を作りだすパポバウイルス由来のエピソームを目的とする。パポバウイルス由来のエピソームは、膀胱癌細胞の増殖を調節するための遺伝子治療手段において有用である。関連した技術についての概説ヒト癌細胞に対する遺伝子治療の１つのアプローチは、優性な癌遺伝子および増殖因子受容体の発現を阻害するアンチセンス配列を発現するベクターを導入することである。しかし、癌遺伝子が高レベルで発現している場合、アンチセンスの発現も同程度必要であり、これは特に安定な形質導入体中で多コピーになることがある程度制限されている発現ベクターを使用する場合には、かなり技術的な障害となる。レトロウイルスベクターで形質導入したヒト細胞は、安定な形質導入体においては挿入されたレトロウイルスを１つまたは数コピーしか持たない。反対に、エピソームプラスミドは、染色体とは別に複製するために安定な形質導入体中で数百コピー蓄積できる。アンチセンス転写物を高レベルで発現するための１つの方法は、ヒト細胞中で染色体とは別に複製できるエピソームプラスミドベクターを使用することである。ある種のヒト細胞中で複製できるエピソームベクターを作製する試みは、文献で報告されている。エピソームプラスミドは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）（サーバー、ら．，１９８１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１：４８６− ４９６；ジマリオ、ら．，１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４０３０−４０３４）、ＳＶ４０（ツイ、ら．，１９８２，Ｃｅｌｌ．，３０：４９９−５０８）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）（イエイツ、ら．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１２−８１５；マルゴルスキー，ら．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２８３７−２８４７；ベルト、ら．，１９８９，Ｇｅｎｅ，８４：４０７−４１７；チテンダン、ら．，１９８９，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６３：３０１６−３０２５）、およびＢＫウイルス（ＢＫＶ）（ミラネシ、ら．，１９８４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ１．，４：１５５１−１５６０）を含む、いくつかのＤＮＡウイルスから作製されている。これらのエピソームプラスミドは各々、ＤＮＡ複製のウイルス用の開始点およびウイルス用の開始点にトランスに働き、形質導入した宿主細胞中でエピソームが複製できるようなウイルスの初期遺伝子を含む。ＥＢＶ由来のエピソームは、ｃＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニングするのに使用されたが、ＥＢＶのシステムはリンパ細胞でない細胞型に対して適用が制限されており（バイダル、ら．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０４８：１７１−１７７）、およびＥＢＶのレプリコンは、多くの細胞型において活性でない。さらに、ＥＢＮＡ−１は、ヒトリンパ細胞を死なせないいくつかのＥＢＶ遺伝子の１つであり、ＥＢＶ陰性ＢＪＡＢリンパ細胞腫系列をＥＢＶＡ−１で形質導入すると、細胞の形質転換を示す軟寒天上上での増殖を誘導する。（木下、１９９０、北海道医学雑誌、６５：３６２−３７５）さらに、ＥＢＮＡ−１（トランスアクチベーター）およびＯＲＩ−Ｐ（ＥＢＶＤＮＡ開始点）をコードするＥＢＶエピソームプラスミドで形質導入したＥＢＮＡ−１陰性細胞系列の安定な形質導入の効率は低く、エピソームでないプラスミドに対して有意に高くはない（イエイツ、ら．，１９８５；バイタル、ら．，１９９０）。しかし、ＥＢＮＡ−１が形質導入に先だって細胞中において発現している場合に、続いてＯＲＩ−Ｐおよび選択マーカーを含むプラスミドで形質導入すると、安定な形質導入効率が１０％まで上昇する（マルゴルスキー、ら．，１９８８；ベルトら．，１９８９；イエイツ、ら．，１９８４，Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３８０６−３８１０；ルトファリア、ら．，１９８９，Ｇｅｎｅ７６：２７−３９）。比較できる結果は、ＳＶ−Ｔを高レベルで発現するＣＯＳ細胞クローンの関連したシステムにおいて知られており、この場合には一過性の形質導入においてＳＶ４０の開始点を含むプラスミドの効率的な複製が可能になる（ツイ、ら．，１９８２；リオ、ら．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：２３−２８；チッテンダン、ら．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｏｌ．６５：５９４４−５９５１）。しかし、ＣＯＳ細胞のシステムにおいて、エピソームの複製は容易に進行し、形質導入後４８時間で１０⁴個のエピソームのコピーが生じる。一過性の形質導入においてエピソームの複製が効率的にもかかわらず、安定な形質導入の効率は低いことが、これらの実験において示されている（チッテンダン、ら．，１９９１；ロバート、ら．，１９８６，Ｃｅｌｌ，４６：７４１−７５２）。おそらく、ほとんどの一過性の形質導入体は、エピソームによって仲介される細胞死により二次的に死ぬのであろう（チッテンダン、ら．，１９９１；ロバート、ら．，１９８６）。しかし、ＳＶ４０ＤＮＡ開始点を含むプラスミドでＣＯＳ細胞を形質導入すると、エピソームプラスミドを持つ安定な形質導入体が得られ（ツイ、ら．，１９８２）、他のウイルスの複製制御領域の使用を含む、様々な方法によってエピソームの複製制御が容易になる。例えば、ＣＯＳ細胞クローン中での容易なエピソームの複製は、ＳＶ４０ＤＮＡ開始点およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）レプリコンを含むプラスミドを使用することによって制御可能である（ロバート、ら．，１９８６；ロバート、ら．，１９８８、Ｃｅｌｌ５２：３９７−４０４）。これらの研究は、一過性の形質導入におけるＳＶ４０エピソームの複製を調節にする２つのＢＰＶ配列（ＮＣＯＲＩおよびＮＣＯＲＩＩ）、および読み枠Ｅ１における５’配列にコードされる第３のトランスにサプレスする因子を同定している。ＳＶ４０ＤＮＡ開始点およびＢＰＶの２１１３塩基対のＥｃｏＲＩ断片をコードするハイブリッドプラスミドは、ｐＳＶ−ＮＥＯより、安定な形質導入効率は実質的に高い（ロバート、ら．，１９８６）。ＤＮＡホモロジー検索を行なったが、ＢＫＶまたはＳＶ４０レプリコンの中には同様なＮＣＯＲ相同配列は同定できなかった。従って、遺伝子治療に応用するための、哺乳動物細胞においてエピソームが制御されて複製されるベクターが必要とされる。特に、細胞を形質転換せずにヒト細胞においてエピソームを複製するベクターが必要とされる。発明の概要細胞を形質転換せずに哺乳動物細胞においてエピソームを生産するベクターを提供することが本発明の目的である。本発明のさらなる目的は、形質導入した細胞を形質転換することなく高コピー数のエピソームを複製するベクター上にコードされた外来遺伝子を、エピソームベクターによって形質導入した哺乳動物細胞において発現させることによる、遺伝子治療の方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、複製可能であるが形質転換能は陰性のパポバウイルスラージＴ抗原の変異型を提供することである。これらおよび他の目的を達成するために、本発明は、好適にはＳＶ４０またはＢＫウイルスの開始点である少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点、および、複製開始点としての複製能に関与する結合部位を含むが野生型ｐ５３または網膜芽細胞腫抑制因子（ＲＢ）遺伝子産物の少なくとも一方に、好適には両方に対して結合しないようなパポバウイルスのラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列で、ホモまたはヘテロなプロモーターにつながっているＤＮＡ配列を含む複製可能でおよび形質転換能は陰性のベクターである哺乳動物ベクターを提供する。ベクターの別の態様において、パポバウイルスラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列は、パポバウイルスの初期プロモーター、誘導可能なプロモーター、またはホルモン制御下にあるプロモーターのいずれかにつながっている。別の態様において、本発明は、少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点、複製開始点としての複製能に関与する結合部位を含むが野生型ｐ５３または網膜芽細胞腫抑制因子の遺伝子産物の少なくとも一方に対して結合しないような、パポバウイルスのラージＴ抗原の変異型をコードする第一ＤＮＡ配列、第一ＤＮＡ配列につなげた第一プロモーター、および第二プロモーターにつなげた外来遺伝子をコードする第二ＤＮＡ配列を含む、複製能をもつが形質転換能の陰性なベクターで哺乳動物細胞を形質導入し；および形質導入した細胞において外来遺伝子を発現することを含む哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現方法を提供する。この方法の好適な態様において、パポバウイルスの複製開始点はＢＫウイルスの複製開始点またはＳＶ４０の複製開始点のいずれかであり、パポバウイルスラージＴ抗原の変異型は、ＳＶ４０およびＢＫウイルスの複製開始点の両方に結合するが、野生型ｐ５３および網膜芽細胞腫抑制因子の遺伝子産物は結合しない変異型ＳＶ４０ラージＴ抗原である。別の態様において、哺乳動物細胞をｉｎｖｉｔｒｏでベクターで形質導入し、それから細胞を哺乳動物中に導入して外来遺伝子をｉｎｖｉｖｏで発現させる、またはベクターを哺乳動物中に投与してその哺乳動物の細胞をｉｎｖｉｖｏで形質導入し、これらの細胞から外来遺伝子が発現するようにする。別の態様において、本発明は、ＳＶ４０の複製開始点として、野生型ｐ５３および網膜芽細胞腫抑制因子の遺伝子産物には結合しない、複製能に関する結合部位を含むＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列を提供する。好適な態様において、そのＤＮＡ配列にコードされるＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型の１０７番目の残基はリジンで、４０２番目の残基はグルタミン酸である。ヒト細胞において染色体外で複製する高度に効率的なエピソーム発現ベクターが開発された。本発明者らは、複製可能で、形質転換能の陰性なＳＶ４０ラージＴ抗原変異は、ＳＶ４０のＤＮＡ開始点またはＢＫウイルスのＤＮＡ複製開始点を含むプラスミドの複製を効率よく引き起こすことを示した。好適なベクターは、ＳＶ４０と有意な相同性を示す小さなＤＮＡウイルスであるＢＫウイルス（ＢＫＶ）に由来する。安定な膀胱癌細胞系列の形質導入体において同定されたＢＫＶエピソームの特性は、これらのベクターは少なくとも５カ月のあいだ染色体外で複製し；エピソームによって仲介される細胞死を誘導することなく安定な高コピー数（１５０コピー）になり；挿入（インテグレーション）の確率は非常に低く；コピー数に比例して遺伝子を転写し；細胞分裂の際には娘細胞に効率的に転移し；ヒルト(Hirt)上清ＤＮＡから細菌にシャトル可能で；および選択をかけなくとも数カ月の間膀胱癌細胞形質導入体中で存在することがわかった。これらの特性は、このベクターのシステムをヒト細胞に遺伝子を転移するのに使用可能であることを示している。本発明は、ＳＶ４０またはＢＫＶのＤＮＡ開始点のような、パポバウイルスのＤＮＡ複製開始点を含むプラスミドの複製を引き起こすパポバウイルスラージＴ抗原の複製可能で形質転換能の陰性な変異を作製することによってエピソームベクター技術に有意な利点をもたらす。他のＤＮＡ開始点トランス活性化因子（例えばＥＢＮＡ−１）の複製可能で形質転換能の陰性な変異は、現在のところ得られていないので、このエピソーム発現システムは宿主細胞に形質転換を誘導せずに効率的にエピソームの複製を可能にする唯一の形態である。この利点により、ヒト遺伝子治療への応用に対して安全で効率的なエピソームベクターの開発が可能になる。このエピソームベクターシステムはまた、癌腫瘍進行測定の開発のようなｉｎｖｉｔｒｏにおける応用にも拡張でき、ｃＤＮＡライブラリークローニング用の効率的なエピソームベクターシステムおよびヒト細胞におけるｉｎｖｉｔｒｏの異種遺伝子の発現の開発に対しても有意な利点を持つ。図面の簡単な説明図１ＡおよびＢは、ＢＫＶエピソームベクターであるｐＲＰ−ｃｎｅｏＸで安定に形質導入したＨＴ−１３７６細胞のサザン解析を示す。細胞は、Ｇ４１８で選択した７１日後に評価した。パネルＡ．３Ｘ１０⁵細胞からのヒルト(Hirt)ＤＮＡをレーン１−４にのせ、示した制限酵素で消化した。ＢａｍＨＩで消化したｐＲＰ−ｃｎｅｏＸプラスミドを量を増加させて（５０−４００ｐｇ）レーン５ −９にのせた。パネルＢ．同様のＨＴ−１３７６／ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸからの安定な形質導入体由来の全細胞ＤＮＡ（１０ｐｇ）をＢａｍＨＩで消化した（レーン１）。レーン２は、ＢａｍＨＩで消化した５００ｐｇのｐＲＰ−ｃｎｅｏＸプラスミドである。両パネルのハイブリダイゼーション用のプローブは³²ＰでラベルしたｐＲＰ−ｃｎｅｏＸである。図２は、ＢＫＶエピソーム（ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ、レーン１）およびエピソームでない（ｐＳＶ２ＮＥＯ，レーン２−４）発現ベクターで安定に形質導入したＨＴ−１３７６細胞におけるネオマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡの発現を示す。ハイブリダイゼーションプローブ：ネオマイシン耐性遺伝子（パネルＡ）、β− アクチン（パネルＢ）。図３は、選択圧をはずしてからのｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのＨＴ−１３７６細胞におけるエピソームプラスミドとしての存続性を示す。Ｇ４１８存在下（７１日、レーン１；１２２日、レーン２）または非存在下（１６日、レーン３；３４日、レーン４；４７日、レーン５；６４日、レーン６）において増殖した３Ｘ１０⁵ 個のＨＴ−１３７６ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ形質導入体由来の、ＢａｍＨＩで消化したヒルト上清ＤＮＡのサザン解析。ハイブリダイゼーション用のプローブは、³² ＰでラベルしたｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ（パネルＡ）またはｐＡＭ１（マルテンス、ら．，１９７９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３５：３２７−３５１）の誘導体であるｐＫＳＵ１から得たマウスミトコンドリアＤＮＡ（ＮＤ１）の³²Ｐでラベルした３４３塩基対のＢａｍＨＩ断片である（パネルＢ）。図４は、選択圧をはずしてからのＨＴ−１３７６ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ形質導入体におけるネオマイシン耐性遺伝子の発現の存続を示す。Ｇ４１８存在下（７１日、レーン１；１２６日、レーン６；１５６日、レーン７）または非存在下（１６日、レーン２；３４日、レーン３；４７日；レーン４；６４日、レーン５）におけるＨＴ−１３７６形質導入体由来のＲＮＡ２０μｇのノーザンブロット解析。ハイブリダイゼーション用のプローブは、ネオマオシン耐性遺伝子（Ａ）のコード配列を含むｐＳＶ２ＮＥＯの³²ＰでラベルしたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片または³²Ｐでラベルしたβアクチンプラスミド、ｐＨＦβＡ−１（グヌンク、ら。、１９８３）（Ｂ）である。図５は、複製可能で、形質転換能の陰性なＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ−Ｔ）変異体における点突然変異の位置を示す。カッコで示した１０７／４０２−Ｔのｐ５３およびＲＢの結合特性は予期される結果である。図６は、ＳＶ−Ｔまたは１０７−Ｔで安定に形質導入した５６３７細胞の単一細胞クローンのウエスタンブロット解析を示す。ｐＲｃ／ＣＭＶ．ＳＶ−Ｔ（レーン１−３）またはｐＲｃ／ＣＭＶ．１０７−Ｔ（レーン４−７）で形質導入した５６３７細胞のクローンを示す。ブロットは、坑Ｔ抗原モノクローナル坑体ｐＡＢ４１６および化学蛍光発生システム（アマシャム）を使用して作製した。レーンごとに抽出物４０μｇをのせた。図７。サザンブロット解析は、１０７−Ｔがプラスミドの染色体外で複製を引き起こすことを示す（ＳＶ４０のＤＮＡ複製開始点を含むｐＳＶ２ＣＡＴ）。１０７−Ｔ５６３７クローンのＣ１０（検出可能な発現無し）およびＥ１（高発現）を、ｐＳＶ２ＣＡＴで形質導入し、ヒルト上清ＤＮＡを形質導入のおよそ４日後に調製した。約５Ｘ１０⁵細胞由来のヒルト上清ＤＮＡをレーンごとにのせ、ＤｐｎＩで消化する前と後で上記に示したように評価した。ハイブリダイゼーションのプローブは³²ＰでラベルしたｐＳＶ２ＣＡＴである。発明の詳細な記載我々は、形質転換した一過性の上皮細胞（例えば、ＨＴ−１３７６膀胱癌細胞系列）において効率的に複製するエピソームベクターを同定した。このベクター（ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ）は、ＳＶ４０の初期プロモーター制御下にあるマーカー遺伝子およびＢＫＶの複製開始点を含む３．２ｋｂのＢＫＶ断片およびＢＫＶの初期プロモーターの制御下にあるＢＫＶラージＴ抗原を含む。ＥＢＶエピソームエレメントはＨＴ−１３７６一過的形質導入体中では活性でない一方、ＢＫＶエピソームはこれらの細胞において染色体外で複製する。さらに重要なことに、ＢＫＶエピソームはＨＴ−１３７６細胞において何の細胞毒性も示さずに効率的に複製でき、安定な形質導入体において高コピー数のエピソームが生じる。このコンストラクトで安定に形質導入したＨＴ−１３７６細胞におけるＢＫＶエピソームｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのコピー数は、およそ細胞あたり１５０コピーであった（実施例１参照）。このコピー数は、リンパ細胞腫系列におけるＥＢＶ由来のエピソームがおよそ１０−５０コピーで、およびマウスＣ１２７細胞におけるウシパピローマウイルス由来のエピソームが１０−８０コピーであることと比較できる（サーバー、ら．，１９８１；ジマイオ、ら．，１９８２；イエイツ、ら．，１９８５）。ＨＴ−１３７６形質導入体におけるｐＲＰ−ｃｎｅｏＸの高コピー数は、何世代にも渡ってこれらＨＴ−１３７６形質導入体の子孫にｐＲＰ −ｃｎｅｏｘが効率的に転移するのに重要なようである。挿入（インテグレーション）用ベクターｐＳＶ２ＮＥＯまたはｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのいずれで形質転換し、Ｇ４１８存在下または非存在下においてまいた、ＨＴ−１３７６細胞の軟寒天上でクローンをつくる効率は本質的に同等であった。これらのデータは、ネオマイシン耐性遺伝子の娘細胞へのエピソームの転移は、遺伝子がＨＴ−１３７６のゲノムＤＮＡに挿入された場合と同じ効率であることを示している。細胞分裂の間多くのプラスミドのコピーがランダムに分離することを仮定すると、エピソームを１コピーしか含まないという娘細胞の可能性は非常に小さいであろうことから、この結果は、予測されなかったことではない。我々のデータは、ＢＫＶエピソーム発現ベクターはＨＴ−１３７６細胞において形質導入した遺伝子を非常に高レベルで転写できることを示している。ｐＳＶ２ＮＥＯを５コピー挿入（インテグレート）した形質導入体に比較して、ｐＲＰ −ｃｎｅｏＸ形質導入体における定常状態のネオマイシン耐性遺伝子の発現レベルはおよそ２０倍であった。ネオマイシン耐性遺伝子は、どちらの構造でもＳＶ４０の初期プロモーターによって転写制御されているため、これらのデータは、ＢＫＶエピソームベクターは、安定な形質導入体を作製するために宿主細胞ゲノム中に挿入（インテグレート）しなければならないプラスミドベクターよりも、形質導入した遺伝子の発現が有意に高くなることを示している。この相違は、一部には、ＨＴ−１３７６形質導入体におけるｐＳＶ２ＮＥＯ（５コピー）に比較してｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ（１５０コピー）のコピー数が高いことによるのであろう。エピソームベクターの比較ＢＫＶ由来のエピソームは、ＥＢＶ，ＢＰＶ，およびＳＶ４０由来のエピソームとは異なるいくつかの特徴を持つ。ＢＫＶおよびＳＶ４０のラージＴ抗原間の有意なアミノ酸の相同性にも関わらず（マン、ら．，１９８４，Ｖｉｏｌ．，１３８：３７９−３８５）、ＢＫＶエピソームは安定な生育可能な形質導入体を生み出す一方、ＳＶ４０に基ずくエピソームは非常に高コピー数複製するために典型的に細胞死が起こる（ツイ、ら．，１９８２；ロバートら．，１９８６）。この結果は、これらの形質導入体に存在するＴ抗原のレベル、これらのウイルス由来のＤＮＡ開始点の特性、またはＳＶ４０−ＢＰＶ由来のエピソームにおいて記載された（ロバート、ら．，１９８６；ハンバー、ら．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４０１０−４１０４）ように、ＤＮＡ複製を制御するＢＫＶエピソーム中のシス制御配列の存在といった相違による部分があるのかも知れない。重要なことは、ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのコピー数は、細胞あたりおよそ１５０コピーの安定なプラトーに達するため、ＢＫＶエピソームは安定な形質導入体において細胞周期１回につき１回複製するようである。安定なコピー数はまた、低いコピー数ではあるが同じように生存可能であり安定な形質導入体を生じる、ＥＢＶおよびＢＰＶ由来のエピソームの特徴である。しかし、ＥＢＶ由来のエピソーム（イエイツ、ら．，１９８４；ハンバー、ら．，１９８８）とは逆に、ＢＫＶエピソームのコピー数は選択圧なしで２カ月間増殖した後にも量が減少しないで維持される。Ｇ４１８をぬいてから時間経過を追って調べたｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのコピー数の変動は（図３に示した）、エピソームの存在を維持するようにする因子（細胞周期における効率的なエピソームの複製および、ＢＫＶラージＴ抗原を発現する細胞に増殖の利点がある場合）およびエピソームのコピー数を減少させる因子（細胞分裂に際してエピソームが不等に分離されたり、または細胞内ヌクレアーゼで破壊される場合）のあいだの動的相互作用を表わすのかもしれない。ＢＫＶエピソームと比較して、ＢＰＶエピソームはまた、選択をかけない形質導入したＣ１２７形質導入体において安定なコピー数が維持される（サーバー、ら．，１９８１；ジマイオ、ら．，１９８２）。しかし、選択をかけない形質導入体においてＢＫＶエピソームのコピー数がより高いことは、これらのエピソームを遺伝子治療に使用するための手法において利点である。Ｉ．定義本発明を記載するにあたり、以下の技術用語を以下の定義にしたがって使用する。 ”ヘテロな”領域またはＤＮＡ構築物のドメインは、自然にはより大きな分子とは結合しない、より大きなＤＮＡ分子の中の同定可能なＤＮＡ断片である。従って、ヘテロな領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合には、遺伝子は、通常元来の生物体ゲノムでは哺乳動物のゲノムＤＮＡと隣あわないＤＮＡと隣あう。ヘテロな領域の別の例は、コード配列それ自身が自然にはみられないような構築物である（例えば、ゲノムのコード配列はイントロンを含むがイントロンを持たないコード配列（ｃＤＮＡ）、または自然の遺伝子とは異なるコドンを持つ合成配列）。アリル多様性または自然に起こる変異導入は、本明細書中で記載するヘテロなＤＮＡ領域には含まない。ＤＮＡ”コード配列”は、適切な制御配列の制御下に置いたときにｉｎｖｉｖｏで転写されて翻訳されポリペプチドになるＤＮＡ配列のことである。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常コード配列の３’部位に位置する。”プロモーター”は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼが結合でき、下流の（３’ 方向）コード配列の転写を開始するＤＮＡ制御領域である。細胞中のプロモーターの制御下にあるコード配列は、ポリメラーゼがプロモーターに結合した後にＲＮＡポリメラーゼによって転写され、コード配列はｍＲＮＡに転写されてそれからコード配列にコードされるタンパク質に翻訳される。細胞の”形質導入”は、外来遺伝子ＤＮＡを細胞膜の内側に導入するときに起こる。”形質転換”は、一次細胞または有限回の分裂しか行なわない細胞系列の細胞集団が不死になるとき、または不死の細胞系列がさらに腫瘍形成特性を獲得したときに起こる。例えば、形質転換は、形質転換した細胞の軟寒天上においてクローンを形成またはヌードまたはＳＣＩＤマウスで腫瘍を形成する能力によって検出する。”クローゾ”は、細胞分裂によって単一の細胞または共通の祖先に由来する細胞集団である。 ”レプリコソ”は、ｉｎｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自動単位として働く遺伝的要素である（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）。 ”ベクター”は、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンであり、つなげた断片の複製を行なうように他のＤＮＡ断片（ヘテロな断片）をつなげられる。 ”エピソーム”は、細胞の染色体とは別に細胞中に存在する低分子量ＤＮＡ分子である。エピソームは染色体の分裂複製とは独立に複製し、細胞分裂の際に細胞内容物のランダムな分離の一部として娘細胞に転移される。”コピー数”は、エピソームとして個々の細胞中に存在する倍化したＤＮＡ分子の数またはゲノム中の倍化した配列の数である。細菌のエピソームは通常プラスミドと呼ばれる。 ”外来遺伝子”は、個々の宿主細胞のゲノムにはみられない遺伝子である。外来遺伝子は、宿主と同一種または異なる種由来である。本発明は、細胞中で外来遺伝子を発現するように意図した外来遺伝子を含むＤＮＡを使用した細胞の形質導入について記載し、もちろんそのＤＮＡは外来遺伝子が要求された方向に発現するのに必要な制御配列を含む。実質的に相同的な２つのＤＮＡ配列は、例えば特別のシステムで提示された厳しい条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験において互いにハイブリダイズする能力により同定できる。定義した適切なハイブリダイゼーションの条件は、当該技術分野に従事する者の技術範囲内である。例えば、マニアチスら．，上述；ＤＮＡクローニング、第Ｉ巻およびＩＩ巻上述；核酸ハイブリダイゼーション、上述、参照。ＩＩ．ベクターについての記載Ａ．パポバウイルスパポバウイルスは、二重鎖ＤＮＡで、共有結合により閉じており、およそ５０００塩基対の環状ゲノムであり、３種のウイルスタンパク質を含む正二重面体キャプシドを持つ。パポバウイルスは、ヒト（ＢＫウイルスおよびＪＣウイルス）、サル（サル小腔ウイルス（ＳＶ４０）およびリンパ細胞系パポバウイルス）、ヒヒ（サル薬剤１２）、マウス（ポリオーマウイルスおよびＫウイルス）、ハムスター（ハムスターパポバウイルス）、ウサギ（ウサギ肝臓小腔ウイルス）、およびセキセイインコ（セキセイインコヒナ病ウイルス）を含む、様々な宿主に感染する。これらのウイルスは、核酸配列の比較に基ずいて関連が判断された。ウイルスゲノムは、初期および後期転写領域に分けられ、複製開始点を１つ含む。転写は、複製開始点の近くのプロモーターから始まり、２方向に進行する一１つは初期転写物の方向でもう１つは後期転写物の方向。後期転写領域は、コートタンパク質（ＶＰ１，ＶＰ２，およびＶＰ３）をコードする。初期転写領域は、Ｔ抗原、特にウイルスＤＮＡ複製に機能するラージＴ抗原をコードする。ラージＴ抗原はまた、初期プロモーターの近くのウイルスＤＮＡに結合することによって初期転写を下方制御し、ＤＮＡ合成に含まれる細胞内遺伝子を活性化し、組織培養した一次細胞を形質転換する。ウイルスＤＮＡは、核内において”ミニ染色体”として複製するが、ウイルスＤＮＡは細胞の１回のＳ期において何度も複製できる。ウイルスＤＮＡの複製は、ラージＴ抗原によって開始し、細胞内ＤＮＡ合成の刺激とは独立している。ラージＴ抗原は、複製開始点の隣のウイルスＤＮＡに結合し、ＤＮＡヘリックスを解き、これはウイルスＤＮＡの複製に必要である。それから新しいウイルスＤＮＡが細胞内酵素によって合成される。Ｂ．エピソーム増幅カセット遺伝子治療の応用において高い発現を提供するために、エピソームベクターは、形質導入した細胞を形質転換することなく染色体外で複製しなくてはならない。本発明は、このようなパポバウイルスの複製に必須のエレメントを含む複製カセットを提供する。複製カセットは（またはエピソーム増幅カセット）、１）パポバウイルスのＤＮＡ複製開始点（ＯＲＩ）；２）パポバウイルスラージＴ抗原の複製可能な、形質転換に陰性な変異型；および３）変異Ｔ抗原の発現を引き起こすプロモーターを含む。本発明の複製カセットが、環状ＤＮＡ分子において細胞ＤＮＡ分子内の他のＤＮＡ配列と結合している場合、ＤＮＡ分子は、形質導入の後に哺乳動物細胞によってエピソーム様に複製される。ミラネシ、ら．，（１９８４）によって報告された最初のＢＫＶエピソームベクターは、ＤＮＡ複製の開始点およびＢＫＶ初期プロモーターによって転写制御されるＢＫＶラージＴ抗原を含む３．２ｋｂのＢＫＶ断片を含む。以下に示し、実施例に例示したように、ＢＫＶ発現システムは、染色体とは別に複製する能力は保持するが腫瘍は形成しない細胞において軟寒天上での増殖は誘導しないように本発明にしたがって修飾される。複製カセットの構成分は、以下の基準に従って選択し、および以下に記載した様にくみあわせる。１．複製開始点複製カセットにおける複製開始点は、パポバウイルスの１つのＯＲＩ配列から選択する。これらの位置から開始したＤＮＡ複製は、同じウイルスのラージＴ抗原による制御に感受性であり、および他のパポバウイルスのラージＴ抗原による感受性は同程度またはさらに低くなる。適合したラージＴ抗原の存在下において、パポバウイルス開始点はエピソームの複製を引き起こす。開始点／ラージＴ抗原の組合せは、エピソームの複製を引き起こすかどうかについて試験する必要がある。複製能力についての１つの簡単な試験は、調べたい複製カセットとしてのラージＴ抗原を発現する細胞集団を調べたい複製開始点を含むベクターで形質導入し、それからサザンブロットによりエピソームＤＮＡの合成について形質導入した細胞を検査する（例えば、実施例６Ｃ参照）。特に好適には、ＢＫＶラージＴ抗原（ＢＫ−Ｔ）またはＳＶ−Ｔのいずれかによりエピソームの複製を引き起こすことが示されているＢＫＶ開始点である。他の好適な開始点は、ＳＶ４０，ＪＣウイルス、リンパ細胞系パポバウイルス、およびサル薬剤１２を含む、霊長類において複製を引き起こすものである。ヒト細胞においてエピソームの複製を引き起こすことが示されたパポバウイルスの複製開始点は、本発明の複製カセットに適している。ＢＫＶレプリコンは、ＨＴ−１３７６膀胱癌細胞系列において活性である一方、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）レプリコンはこれらの細胞において機能はない。ＢＫＶはヒト尿上皮細胞に対して栄養性を示し（アーサー、ら．，１９８６、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１５：２３０−２３４）、ＢＫＶ由来のエピソームベクターは、ヒト膀胱癌細胞系列において効率的に複製する。ＳＶ４０／ＢＫハイブリッドウイルス由来のエピソームは、腫瘍を形成しない５６３７膀胱細胞系列において染色体とは別に複製する。これらのデータは、エピソームのコンストラクトが由来するウイルスの組織栄養性から、エピソームコンストラクトが活性となる細胞型を予測できることを示唆している。２．ラージＴ抗原変異体ＢＫＶエピソームの複製活性は、ＢＫ−Ｔの発現に依存する。ＢＫ−Ｔは、これまでかなり記載された不死および腫瘍形成の性質を持つ（シン、ら．，１９７５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：４４３５−４４３９；クリスチャン、ら．，１９８７、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４７：６０６６ −６０７３；ミッチャロビツ、ら．，１９８７，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６１：２６４８−２６５４；ハナハン、ら．，１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２６５ −１２７５；デカプリオ、ら．，１９８８、Ｃｅｌｌ，５４：２７５−２８３；チェン、ら．，１９９０，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６４：３３５０−３３５７；チェン、ら．，１９９２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：１１６７−１１７５）、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ−Ｔ）と７５％のアミノ酸における相同性がある（ヤング、ら．，１９７９）。ＳＶ−Ｔと同様に、これらのＴ抗原が腫瘍形成特性を誘導するという初めに提唱された機構である（デカプリオ、ら．，１９８８；チェン、ら．，１９９２）、ＢＫ−Ｔは野生型ｐ５３および網膜芽細胞腫（ＲＢ）抑制遺伝子産物と結合しそれによって不活性化することができる（マン、ら．，１９８４；ダイソン、ら．，１９９０、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６４：１３５３−１３５６）。ＢＫ−Ｔを発現するトランスジェニックマウスは、腎臓の腫瘍が発達しおよび胸腺の増殖が無秩序になり（ダリンプル、ら．，１９９０，，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６４：１１８２−１１９１）、およびＢＫ−ＴはＮＩＨ３Ｔ３細胞およびラット胎児の腎臓細胞を形質転換できる（ナクシャトリー、ら．，１９８８、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：４６１３−４６２１）。それゆえ、野生型ＢＫ−Ｔを含むＢＫＶエピソームベクターは、ある腫瘍を形成しない細胞系列に対して腫瘍形成の特性を与え、ベクターが培養中の細胞に軟寒天上の増殖を可能にするまたはｉｎｖｉｖｏで腫瘍への形質転換を誘導することが可能であることから、このようなエピソームベクターは遺伝子治療における使用に適さない。しかし、ＳＶ−ＴおよびＢＫ−Ｔ間の有意な相同性から、この問題を解決する特別な手法が導かれる。ＳＶ−ＴはｉｎｖｉｔｒｏでＢＫＶ複製開始点に結合でき、ＣＯＳ細胞においてＢＫＶ複製開始点を含むプラスミドの複製を刺激できる（レイダー、ら．，１９８３，Ｖｉｏｌ．，１２９：２３９−２４５；デイリー、ら．，１９８９，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６３：３５６−３６５）。それ故、形質転換特性を抑圧する複製可能なＳＶ−Ｔ変異は、形質転換することなくＢＫＶエピソームの複製を促進するＢＫ−Ｔの代用物として検討した。複製可能で、形質転換の陰性なＳＶ−Ｔ変異ＳＶ４０ＤＮＡ開始点に結合するＳＶ−Ｔドメインは、実施例６の下に例示したように、ＲＢおよびｐ５３結合ドメインとは離れている。３つの複製可能で形質転換の陰性なＳＶ−Ｔ変異もまた例示する。第一のＳＶ−Ｔ変異は、１０７ −Ｔ（Ｋ１としても呼ばれる、カルデロン、ら．，１９８４，Ｖｉｏｌ．，１３９：１０９−１３７）であり、これはある細胞型において腫瘍は形成しないが複製可能である（デカプリオ、ら．，１９８８；チェン、ら．，１９９０；チェン、ら．，１９９２；カルデロン、ら．，１９８４；チェリングトン、ら．，１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：１３８０−１３８４）。１０７−Ｔは、１０７番目のコドンがグルタミン酸のかわりにリジンに置換した結果、野生型ＳＶ−Ｔと１塩基対異なる。１０７番目のコドンは、ＳＶ−ＴのＲＢ結合ドメインの中にあり、１０７−ＴがＲＢに結合できないことが腫瘍を形成しない特徴を説明するようである。しかし、１０７−ＴのＤＮＡ結合領域は、変化しておらず、以下に示すように我々は１０７−ＴはＳＶ４０ＤＮＡ開始点を含む試験用プラスミドの複製を引き起こすことが可能であると決定した。第二の変異体は４０２−Ｔであり、これは４０２番目のコドンがアスパラギンのかわりにグルタミン酸に置換している（リン、ら．，１９９１、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６５：２０６６−２０７２）。４０２−Ｔ点突然変異は、ＳＶ−Ｔのｐ５３結合ドメインの中にあり、４０２−ＴはＲＢと結合でき、またＳＶ４０ＤＮＡ開始点の複製も引き起こすようであるけれども、野生型のｐ５３と結合できない。４０２−Ｔは、ヒト二倍体繊維芽細胞系列Ｄ．５５１およびＷＩ−３８において腫瘍を形成しない（リン、ら．，１９９１、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６５：６４４７ −６４５３）。最後に、新規のＳＶ−Ｔ変異体は１０７−Ｔおよび４０２−Ｔに見いだされた両方の点変異を含む（１０７／４０２−Ｔ）ように構築された。このＳＶ−Ｔ変異体は、ｐ５３およびＲＢのいずれにも結合せず、腫瘍形成特性に関与する能力は非常に低い。複製可能な１０７／４０２−Ｔは、特別価値がある。野生型ｐ５３およびＲＢへの結合活性が異なる３つの異なるＳＶ−Ｔ変異をコードする挿入用ベクターを作製し、これらのＳＶ−Ｔ変異ベクターを腫瘍を形成しない膀胱細胞系列中に形質導入した。単一の細胞クローンを、変異ＳＶ−Ｔ分子を発現するが腫瘍を形成しないままであるものとして同定し、およびこれらのクローンのあるものはＳＶ４０ＤＮＡ開始点を含むプラスミドの複製を引き起こすことが示された。それゆえこの方法は、腫瘍を形成しない細胞において外来遺伝子を効率的に発現するためのＳＶ４０レプリコンを保持するエピソームベクターに使用するためのパポバウイルスラージＴ抗原の調節に成功した。本発明の複製カセットによってコードされるラージＴ抗原は、複製可能でおよび形質転換の陰性でなければならない、つまりＤＮＡ複製を誘導するが宿主細胞を形質転換してはいけない。ＤＮＡ複製のトランスの活性化は、上記に記載した様に、一過性のエピソーム形質導入体から抽出したヒルト上清または全細胞ＤＮＡのサザンブロット解析を使用して試験できる。変異ラージT抗原の形質転換活性は直接分析でき（例えばNakshatriら、1988を参照のこと）、または変異T抗原を発現する発現ベクターを形質導入した細胞は、変異T抗原が形質転換陰性であるかどうかを決定するために、ソフトアガーのクローニング活性、またはヌードまたはSCIDマウスでの増殖を分析することができる。代わりになるべきものとして、変異抗原は野生型p53および野生型RBとの非結合実験に基づいて選択する。一つの適当な分析法は、invitroで翻訳した変異ラージT抗原タンパク質を調製し、それぞれp53またはRBに対する抗血清で免疫沈降させる前に、これらのタンパク質およびそれらと複合体をつくっているどんなT抗原も免疫沈降させるために、それを本物の野生型p53またはRB（例えば、in vitro で翻訳するかまたはバキュロウィルスで調製したもの）と混合することによって結合を測定する。免疫沈降物のウェスタンブロットは、ラージT抗原に対する抗血清を用いて行い、それは結合に対して陽性な変異T抗原を検出する。代わりとなる方法は、野生型p53およびRBを発現している哺乳動物細胞群（好ましくはヒトの細胞株由来のもの）を、細胞がラージT抗原の変異体を発現するように（例えばT抗原に対する抗血清への結合で検出される）発現ベクターで形質導入する方法である。それから細胞を溶解させ、溶解物をp53またはRBに対する抗血清で処理する。免疫沈降物は上述したように処理する。後者の分析法は、例えば発現される変異T抗原の量が、存在するp53またはRBの量と極端に異なっていたり、または分析する細胞によって発現されるp53またはRBに僅かな変異が存在する場合には偽陰性の可能性があるが、それはよりin vivoの状態に近い。特に好ましい変異ラージT抗原は、上述したSV-T変異体の107/402-Tである。SV -Tの他の変異体および他のパポバウィルスのラージT抗原は文献に記載されており、さらなる変異体は周知の組換えDNA技術によって作製することができる。これらの変異体は、上記の分析によって決定されるように複製可能および形質転換陰性である限りは、本発明の複製カセットとして適している。３．プロモーター一般に、複製可能で形質転換陰性のパポバウィルスのラージT抗原は、異種または同種のどちらかのプロモーターによって転写が制御される。異種のプロモーターとは、通常哺乳動物のプロモーターおよび哺乳動物ウィルスのプロモーターのように哺乳動物細胞内で活性のあるプロモーターである。エピソームの増幅カセットが遺伝子治療への適用のためのエピソームの発現ベクターの一部である場合には、プロモーターはもちろん外来遺伝子の発現の標的となる細胞内で活性をもつように選択する。 CMVの即時型初期プロモーター(immediate early promoter)のエンハンサーのようないくつかの異種のプロモーターはT抗原によって負に制御されず、その結果T抗原の発現が最大限に増加し、それによってエピソームの複製が最大限になる。これは高レベルの遺伝子発現が望ましいような遺伝子治療への適用のための一過的な形質導入法に特に有利である。代わりとなるべきものとして、T抗原によって負に制御される同種のパポバウィルスのプロモーターの利用によって、制御の効かなくなったエピソームの複製を抑えることができ、その結果、制御された安定な発現が得られる。このようなプロモーター/T抗原/複製起点の組み合わせによって、形質導入された細胞内で高コピー数で安定なエピソームが提供される。代わりとなるべきものとして、エピソームの複製を制御できるように変異ラージT抗原の発現を制御するプロモーターを選択することができる。例えば、（メタロチオネインのプロモーターのような）誘導可能なプロモーターが利用でき、エピソームの複製は誘導物質の存在下で増幅される。代わりになるべきものとして、発生の段階によって制御される遺伝子または組織特異的遺伝子（例えば乳漿の酸性タンパク質遺伝子に対する胸部特異的プロモーター、Shoenebergerら、19 88，EMBO J.,7: 169-175）のためのプロモーターが、そのプロモーターが活性なある細胞種に対してエピソームのコピー数の増幅を制限するために利用される。その発現レベルがコピー数に比例するような外来遺伝子をもつエピソームを用いた遺伝子治療では、T抗原の発現を制御するプロモーターの選択によって治療による発現制御の測定法が提供される。４．カセットの挿入のためのベクター概して、本発明の複製カセットが挿入されるベクターとは、特定のパポバウィルスの複製起点およびラージT抗原がベクターの複製を起こさせる哺乳動物細胞に、どれもそのカセットおよび関連した外来遺伝子を持ち込むようなベクターである。もちろん、そのベクターは、哺乳動物細胞においてパポバウィルスの複製起点からの複製を阻害し、または遺伝子治療への適用のためにベクターに挿入されたどのような外来遺伝子の発現も阻害するようなどのような配列も含まない。適当なベクターは、哺乳動物細胞の形質導入への続いた使用のために、バクテリア培養液中で複製カセットを含む大量のベクターを産生するように、シャトルベクターとして利用できるバクテリアのプラスミドを含む。他の適当なベクターは、通常ウィルス由来で哺乳動物細胞に形質導入されることが知られていて、欠陥があるかまたは変異のあるウィルスを含む、病原性がないかまたは限られた病原性しかない周知の哺乳動物のベクターを含む（例えば、Hockら、1986，Nature,3 20 :275-277; Sorrentinoら、1992，Science,257:99-103; Bayleら、1993，Human Gene Therapy，4:161-170; Le Gal La Salleら、1993，Science,259:988-990; Quantinら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:2581-2584; Rosenfeldら、 1992，Cell，68:143-155、を参照のこと）。ベクターが哺乳動物ウィルスであるところでは、外来遺伝子のウィルスゲノムへの挿入がウィルスの伝染力を破壊しないことがもちろん重要である。特定のベクターの選択には、エピソームの増幅が望まれる特定の哺乳動物または特定の細胞種を考慮に入れ、当業者は当該技術分野において利用可能な多くのベクターの中から、適したベクターを容易に選択することができる（例えば、Sambrookら、1989，"Molecular Cloning:A Laborat ory Manual"; Millerら、1989，BioTechniques,7:980-990; Salmonsら、1993，H uman Gene Therapy，4:129-141; Stratford-Perricaudetら、1991，"Human Gene Transfer"中、Cohen-Haguenauerら編集、John Libbery Eurotest Ltd.219:51-6 1、を参照のこと）。 III.ベクターの作製法 A. 構成要素のDNA配列の供給源様々なパポバウィルスのDNA配列は文献に記載されており、そこには複製起点、初期プロモーター、およびラージT抗原をコードするDNA配列が含まれる（例えば、(SV40のためには)Subramanianら、1977，J．Biol．Chem.，252:355-367; Re ddyら、1978，Science，200:494-502; Fiersら、1978，Nature，273:113-120; V an Heuverswynら、1978，Eur．J．Biochem.，100:51-60; （BKVのためには）Yan gら、1979，Science，206:456-461; Deyerleら、1989，J.Virol.，63:356-365; （ハムスターのパポバウィルスのためには）Delmasら、1985，EMBO J.，4:1279- 1286; (JCウィルスのためには)Frisqueら、1984，J．Virol.，51:458-469; （ポリオーマのためには）Zhuら、1984，J．Virol.，51:170-180、を参照のこと）。配列の多くを含むクローンは、Stratagene、Gibco-BRL Life Technologies、Uni ted States Biochemicals、およびPromegaのような業者から入手可能な様々な哺乳動物のベクターに含まれている。BKウィルス、JCウィルス、Kウィルス、ポリオーマウィルス、およびSV40の完全なゲノム配列を含むクローンは、American T ype Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852 ，U．S．A．(ATCC)より入手可能である。プロモーター、バクテリアの複製起点、および様々なベクターもまた、組換えDNA操作に従事する当業者によってよく理解されている他の供給元と同様に、上に列挙した商業的な供給元またはATCCから入手可能である。特定のタンパク質をコードする特異的な配列または制御配列は、以下に記載されているような標準的な組換えDNA技術を用いて、これらのクローンから得ることができる。哺乳動物の細胞内で発現する特定の外来遺伝子、およびそれらをコードする配列のための材料元は、遺伝子治療に従事する当業者にとって容易に分かることであろう。 B. ベクター構築のための組換え技法本発明の実践には、別の方法で示されない限りは、当該技術分野の範囲内の慣例的な分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を使用する。そのような技術は、当業者によく理解されており、文献で十分に説明が為されている。例えば、Maniatis，Fritsch & Sambrook，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Apploach,"ＩおよびII巻(D．N．Glover編集，1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J．Gait編集，1984); "Nucleic A cid Hybridization" (Hames & S.J．Higgins 編集，1984); "Animal Cell Cultu re" (R.I．Freshney 編集，1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRLPres s，1986); B．Perbal，"A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984)、およびSambrookら、 "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (1989)、を参照のこと。パポバウィルスの複製起点に対応するDNA部分、パポバウィルスのラージT抗原のコード配列、およびパポバウィルスの初期プロモーターは、BKウィルス、JCウィルス、Kウィルス、ポリオーマウィルス、およびSV40ウィルスを含む、ATCCから入手可能なものような容易に入手可能な組換えDNA材料から得ることができる。特異的配列をもつDNA部分またはオリゴヌクレオチドは、化学的に合成するか、またはいくつかの手段の中の一つを用いて単離することができる。望みの順に望みの配列ドメインを含むより大きなDNA分子に会合させるのと同様に、望みのD NA配列を同定、増幅、および単離するための基本的な方法は、当該技術分野において通常の知識を有する者によってよく知られている。例えば、Sambrookら，(1 989); B．Perbal，（1984）を参照のこと。好ましくは、パポバウィルスの複製起点、ラージT抗原、および初期プロモーターに対応するDNA部分は、ポリメラーゼ・チェーン反応（M.A．Innisら、"PCR Protocols: A Guide To Methods and A pplications," Academic Press，1990）を用いて個別に単離する。完全な配列は、標準的な方法によって調製され、完全なコード配列へと組み立てられた重複したオリゴヌクレオチトから組み立てられる。例えば、Edge（1981）Nature292:75 6; Nambairら、(1984)Science 223: 1299; Jayら、(1984)J．Biol．Chem.，259: 6311、を参照のこと。組み立てた配列は、どのような適したベクターまたはレプリコンにもクローニングでき、そこで組み立てた配列を含まないベクターに対して実質的に独立した構成要素として維持される。これによって、組み立てた配列の貯蔵庫か提供され、部分的または完全な配列は、制限酵素を用いて貯蔵庫の材料中のDNAから切り出したり、PCRによる増幅によって貯蔵庫から抽出することができる。数多くのクローニングベクターが当業者に知られており、適当なクローニングベクターの選択は選ぶ側の問題である（例えば、Sambrookら、本明細書中に参考文献として引用されている、を参照のこと）。適当なDNA配列につながった望みのDNA部分を含むベクターの構築は、その部分に対して使用された技術と同様の技術によって為される。これらのベクターは、遺伝子治療のための外来遺伝子、シャトルベクター（原核生物の中間宿主と哺乳動物の最終的な宿主の間を行き来することから）を作製するためのバクテリアの複製起点などをコードする部分のような、付加的なDNA部分を含むように構築される。限定した配列の変異タンパク質の構築および発現のための方法は、当該技術分野においてよく知られている。パポバウィルスのラージT抗原の既知の変異体をコードするDNA配列は、化学的に合成するか、または野生型の配列からプライマー伸長、リンカー挿入、およびPCRを含むいくつかの方法の中の一つによって調製することができる（例えばSambrookら、を参照のこと）。代わりになるべきものとして、さらなる変異体は、野生型配列への付加、削除、および置換を含むこれらの技法によって調製することができる。どちらの場合においても、変異体が複製可能および形質転換陰性であることを確認するために、上述した分析によって変異体を調べるのが好ましい。調べる変異ラージT抗原タンパク質は、この（発現）ベクターで形質転換された宿主細胞の中で、そのDNA配列がRNAに転写されタンパク質へと翻訳されるように、ポリペプチドのコード配列をベクター中のプロモーターの制御下に置くことによって調製する。変異ラージT抗原タンパク質は、変異T抗原をコードする配列を含む発現ベクターによって形質導入された増殖中の宿主細胞によって、そのポリペプチドが発現される条件下で産生される。適当な増殖の条件は当該技術分野の範囲内のことである。 C. 中間段階のベクター好ましくは、複製のカセットを含むベクターはまた、機能的なバクテリアの複製起点およびバクテリア内で機能する選択マーカーも含む（例えば、シャトルベクター）。これらによって、複製カセットおよび何らかの関連外来遺伝子を含む大量のベクターがバクテリアの培養液から回収できるところでは、貯蔵のためのベクターの安定な貯蔵庫を供給し、増幅を促進するためのバクテリア内でのベクターのクローニングが可能となる。適当なバクテリアの複製起点および選択マーカーと同様に、その方法も当該技術分野でよく知られている（例えば、Sambrook ら、を参照のこと）。代わりとなるべきものとして、哺乳動物のウィルスベクターは、周知の技法を用いて哺乳動物細胞培養液中で増幅することができる。ウィルスベクターまたはシャトルプラスミドベクターをもつバクテリア細胞を含む調製物の貯蔵および標準化のための適当な方法は、当業者には容易に分かるだろう。 D. ベクターの機能テスト本発明の複製カセットを含むベクターは通常、それらが構築されてそのベクターが複製可能をもちおよび形質転換活性が無いと確認された後に分析する。この分析によって、ベクターに含まれる配列がその複製カセットが機能するのを妨げないことが保証される。複製能（即ち、変異ラージＴ抗原および複製起点の両方が機能できること）は、通常、標的の細胞種の形質転換されていない一群の細胞にベクターを形質導入し、サザンブロットによってエピソームDNAの産生をモニターすることによって分析する。複製分析から得られた安定な感染細胞は、ベクターが細胞を形質転換していないことを確認するために、ソフトアガーでのクローン化活性、またはヌードまたはSCIDマウスにおける腫瘍形成でさらに調べることができる。安定な感染細胞由来のDNAに対するサザンブロットは、それらがベクターをゲノムDNAに組み込んでいるか、またはベクターが安定なエピソームとして保持されているかを示すために利用される。 IV．ベクターの利用 A. 治療上の利用遺伝子治療において利用するためのベクターは、エピソームの発現ベクターを産生するように上述したような標準的な組換えDNA技術を用いて、本発明の複製カセットを発現が望まれる外来遺伝子と共に適当な哺乳動物のベクターに挿入することによって構築する。続いて、細胞の生存能を保ち、細胞内でベクターがエピソームとして複製する条件下で、細胞をこれらのエピソームの発現ベクターで形質導入する。エピソームの発現ベクターは様々な方法で患者に投与される。一つの具体例では、細胞をinvitroにおいてエピソームの発現ベクターで形質導入する。通常は適当な細胞は患者から得られ、例えば血液標品からは末梢血単球が得られ、これらの細胞を患者に再導入する前にエピソームの発現ベクターで形質導入する。代わりとなるべきものとして、患者の細胞群中の幹細胞を、患者を多数の和合性の細胞を供給するために培養し、それから細胞を培養液中でエピソームの発現ベクターで形質導入する。続いて形質導入された細胞群を患者に再導入する。別の具体例では、エピソームの発現ベクターは本発明に従った複製カセットおよび外来遺伝子を含み、患者の哺乳動物に感染する哺乳動物のウィルスに基づいている。ウィルスのエピソームの発現ベクターはそれが患者の細胞に感染するようなところで患者に投与され、そのエピソームの発現ベクターは続いて細胞内でエピソームとして複製する。別の具体例では、エピソームの発現ベクターは、リポソームの、または受容体を介した輸送システムと共に患者の哺乳動物に導入される（Felbnerら、1987,Pr oc．Natl．Acad．Sci USA 84:7413-7417、およびZhuら、1993，Science,261:209 -211、本明細書中に参考文献として引用されている）。一度患者の細胞がinvivo において形質導入されると、エピソームの発現ベクターは染色体外で複製する。外来遺伝子の発現は一度細胞がエピソームの発現ベクターで形質導入されれば起こる。通常は外来遺伝子は構成的に発現され、発現レベルはエピソームのコピー数によって制御される。別の具体例では、外来遺伝子の発現は先に記載した意味において、変異ラージT抗原の発現は、正にまたは負に制御されているというよりは、プロモーターの制御下にある。外来遺伝子の制御に適したプロモーターの選択は、望ましい臨床結果に基づいて当業者にとって明白に分かる。哺乳動物細胞で発現できる遺伝子は、どれも本発明に従って外来遺伝子として形質導入ベクターに組み込むことができるが、より好ましい遺伝子は、標的細胞群での発現が病気の進行を妨げる遺伝子である。例えば、エピソームの遺伝子治療ベクターは、in vivoにおいて腫瘍細胞を殺すために免疫系を標的にするのに利用できる。サイトカインcDNAを形質導入した腫瘍細胞株は癌のワクチンとして使われて成功してきており（Connorら、1993，J．Exp．Med.，177:1127-1134;Go lumbekら、1991，Science,254:713; Porgadorら、1992，Cancer Res.,52:3678; Aokiら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA,89:3850）、in vivoにおける腫瘍細胞の適当なエピソームのベクターによる形質導入は、腫瘍細胞内でのエピソームの複製が望ましい局所的な高濃度のサイトカインを効率良く産生し、それによって免疫のエフェクター細胞を刺激するために、腫瘍細胞死を高めるだろう。そのような一の実例は、in vivoにおいて膀胱癌細胞にリポソーム/DNA混合物の膀胱内腔への直接の点滴注入によって、インターロイキン-2をコードするエピソームの発現ベクターを導入することである。別の実例は、in vivoにおいてエーロゾル化したリポソーム/DNA混合物の吸入によって、インターロイキン-6を肺癌細胞に形質導入することである（非エピソーム系ベクターを用いた方法には、Stri blingら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:11277-11281、を参照のこと）。癌細胞を殺す他の遺伝子治療法には、単純庖疹のチミジンキナーゼをコードするベクターの形質導入に続いたガンシクローバー処理のような、薬剤感受性を付与する遺伝子の発現が含まれる（Culverら、1992，Science,256:1550-1552、は挿入ベクターを用いた。挿入ベクターをエピソームの発現ベクターに換えることによって感受性を付与する酵素の濃度が高まる）。患者の細胞による発現が病気の進行を妨げるような他の外来遺伝子の配列は、当該分野において当然の知識を有する者にとって明白になるであろう。レトロウィルスのベクターに比べると、レトロウィルスは細胞当たりたった１から数コピー挿入されるだけであるため、パポバウィルス由来のエピソームが多コピーで存在することによってコードされる遺伝子の発現が増加する。その上、エピソームのDNAは、挿入されたベクターからの発現が減少してしまうような位置的な影響の問題もない。本発明のエピソームのベクターによって生み出される高レベルの転写は、アンチセンスの転写産物の高レベルの発現が過剰に発現された標的mRNAの翻訳を減少させるのに必要であるため、特にアンチセンスの実験において有用である（Whitesellら、1991，Mol．Cell．Biol.，11:1360-1371）。選択圧を解除した後のpRP-cneoX/HT-1376感染者におけるBKVエピソームの持続性は、これらのベクターがヒトの組織内で妥当な期間維持されることを示唆している。一時的な期間でさえ、エピソームの複製は癌患者を治療するために効果的なパポバウィルスのエピソームを利用するのに十分である。例えば、p53（Baker ら、1990，Science,249:912-915; shawら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，89:4495-4499）のようなアポトーシスを誘導することのできる野生型癌抑制遺伝子は、形質導入された腫瘍細胞を殺すためにごく僅かな期間でも発現される必要がある。同様に、化学治療剤に感受性の因子をコードする遺伝子の一過的な発現は腫瘍細胞を殺すのに効果的であると思われ、それはガンシクローバー処理による結果として単純庖疹のチミジンキナーゼで、および5'-フルオロシトシン処理の結果としてシトシン脱アミノ酵素で最近証明された（Culerら、1992,Scienc e,256:1550-1552; Mullerら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:33-37）。さらに、インターロイキン-4のようなサイトカインの一過的な発現は、腫瘍細胞を除去するために免疫システムを調節するのに効果的であると思われる（Golu mbekら、1991，Science,254，713-716）。エピソームベクターの材料は、一般的に組換え細胞または形質導入された細胞によって産生されて、通常は生理学的に融和性の水溶液である薬学的に受容できる溶液または懸濁液、または当該分野で記述されているように、例えば米国特許第4,446,128号、本明細書中に参考文献として引用されている、にあるように、コートした錠剤、錠剤、カプセル、座薬、吸入噴霧剤、またはアンプルの中に入れられて処方される。投与は経口て、直腸から、鼻腔内へ、または小胞（例えば膀胱）への点滴注入、または例えば真皮中、皮下、筋肉内、または静脈内であり得る注射を含むどのような適した手段でもよい。ベクターを含む組成物は哺乳動物の標的細胞の実質的な部分に形質導入するのに十分な量で哺乳動物に投与する。量の決定にはベクターの感染性、in vitroにおける形質導入効率、患者の免疫反応等の考慮を必要とする。典型的な初期投与量は、他の薬理剤の投与において一般になされるようにこの量は投与を行う臨床医によって調節されるのだが、静脈内、皮下、小胞内、または吸入噴霧剤で投与する場合には10-1000μg、口からの場合は100から1000μg、または組換えベクターの10⁵から10¹⁰プラーク形成ユニットであろう。通常、一度の投与で治療効果を生み出すのに十分であるが、実質的な期間の間連続した反応を確かめるためには複数回の投与が必要だと思われる。本発明に従った処方および投与の適当な方法のさらなる記述は、米国特許第4,592,002号、および第4,920,209号、本明細書中に参考文献として引用されている、になされている。 B. 特許請求した組成物の別の利用法本発明に従ったエピソームの発現ベクターはまたin vitroにおける利用もできる。例えば、エピソームの発現ベクターは、哺乳動物細胞の培養液中で産生されるタンパク質の産生を、おそらくそれらは翻訳後にグリコシル化されなければならないために（例えば因子VIII）、高めるのに用いることができる。産生細胞群を、上記のように調製した複製カセットおよび望みのタンパク質をコードする外来遺伝子を含むエピソームの発現ベクターで形質導入することによって、エピソームの増幅が産生細胞内で外来遺伝子を高コピー数にするために、望みのタンパク質の発現レベルが増加する。本発明のエピソームの発現ベクターは、腫瘍の進行に関連した新規の可能性のある優性の癌遺伝子および/または癌抑制遺伝子を同定するために研究に利用できる。cDNAクローンを高レベルで構成的に発現することによって、この手段は新規の遺伝子または現在のところ腫瘍形成には関与することが示されていない生物学的経路を特徴づける遺伝子を同定することができる。さらに、この分析システムによって腫瘍抑制遺伝子に対するアンチセンスcDNAライブラリーのスクリーニングが可能となり、これによってこのクラスの遺伝子のメンバーを同定するために必要な目下の仕事の集約的な方法を多いに単純化する。これは、例えばソフトアガーでクローン化しないような非発癌性の膀胱の細胞株を、発癌性で足場から独立した細胞株由来のcDNAで形質導入し、ソフトアガー中で増殖する活性として感染細胞を表現型でスクリーニングすることによって達成できる。非発癌性の細胞がソフトアガー中でクローン化するのを誘導する原因となるcDNAは、次に膀胱の感染細胞由来のエピソームベクターをバクテリアに移すことによって同定できる。続いて第２世代の形質導入の研究によって、候補となる優性の癌遺伝子が非発癌性の膀胱細胞を十分に形質転換する活性を確認できる。同様の方法で、アンチセンスの方向でスクリーニングした形質転換されていない細胞由来のcDNAライブラリーによって、理論上癌抑制遺伝子を同定することができる。実施例発明のより完全な理解を容易にするために、以下に多くの実施例を提供する。しかしながら、発明の範囲は、例証だけが目的であるこれらの実施例に開示されている特別の具体例に限定されるものではない。実施例 1. BKVエピソームプラスミドはHT-1376細胞内で安定に複製できるプラスミド pRP-cCATXおよびpRP-cncoXは、DNA複製起点およびラージT抗原をコードする3. 2-kbのBKVの断片を含むBKVのエピソームプラスミドである（Grossiら、1988）。 pRP-cncoxがSV40の初期プロモーターによって発現誘導されるネオマイシン耐性遺伝子[トランスポゾンTh5由来のホスホトランスフェラーゼ APH(3')II]をコードするのに対して、pRP-cCATXはSV40の初期プロモーターによって発現誘導されるクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードしている。pSV2CAT/220.2はEBVのエピソーム要素を含むpSV2CATの派生物である（Haver ら、1989）。pSV2NEOはSV40の初期プロモーターによって発現誘導されるネオマイシン耐性遺伝子をコードしている（SouthernおよびBerg、1982）。pSV2CATはS V40の初期プロモーターによって転写が制御されるCAT遺伝子をコードし、pSVOCA TはSV40の初期プロモーターを欠くpSV2CATの派生物である（Gormanら、1982）。 BKVのエピソームプラスミドが膀胱癌細胞内で安定に複製できるかどうかを評価するために、HT-1376細胞を、BKVのDNA複製起点およびBKVのラージT抗原から成る3.2kbのエピソーム要素を含むpSV2NEOの派生物であるpRP-cneoX（Grossiら、1988，Arch．Virol.，102:275-283）で形質導入した。形質導入および選別 60-mm皿の1.5×10⁶の全細胞を、10μgのプラスミドDNAおよび3mlのOptimemに溶解した40μgのリポフェクチン（Gibco-Bethesda Research Labs，Gaithersbur g，MD）を用いて形質導入した。6時間のインキュベーションに続いて、DMEMを最終濃度10%になるように補足的な胎児ウシ血清と共に加えた。形質導入した2日後、細胞をトリプシン消化し、6穴のプレートに植え、24時間後に200μgのG418を選択を開始するために培地に加えた。サザンブロット形質導入された細胞から得られたDNAは、G418による選択の71日後にサザンブロットによって評価し、サザンブロットしたものは³²P標識したpRP-cneoXでプローブ探索した。低分子量DNA（Hirt上清DNA）はHirt，1967，J．Mol．Biol.,26:3 65-369、に記載されているように、HT-1376感染細胞から調製した。全細胞DNAは CsCl濃度勾配から分離し、先に記載されているように精製した（Davisら、1986, "Basic Methods In Molecular Biology"，Elsevier Science Publishing，NY， pp．130-135）。Hirt上清および消化した全細胞DNAは、0.7%のアガロースゲルで電気泳動し、Nytran膜（Schleicher & Scheull，Keene，NH）にトランスファーし、³²P標識したランダムプライムプローブでハイブリダイゼーションした後、6 5℃で0.2×クエン酸ナトリウム塩（SSC）/ 1.0%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の最終強度になるまで洗浄した。 A. 安定した感染細胞におけるエピソームの複製これらの安定な感染細胞から得られた低分子量DNA（Hirt上清DNA）をサザンブロット分析にかけ、以下の図１のパネルAに示したデータはエピソームプラスミドを示している。プラスミドのII型（ニックの入った環状のもの）、およびIII 型（スーパーコイル状のもの）がレーン1にはっきりと認められ、それはこれらの感染細胞内では遊離のプラスミドDNAが存在していることを示している。これらのHirt上清におけるpRP-cneoXエピソームは、対照のプラスミドと同じサイズであり、これはエピソームがHT-1376細胞に入れられた時の状態のままで、検出可能な再配列または内部の欠失が起こっていないことを示している。このプラスミドDNAが新たに複製したエピソームDNAであることを確認するために、レーン2および3はHirt上清DNAがそれぞれDpnIおよびMboIで消化されたことを示している（Pipasら、1983，Mol．Cell．Biol.，3:203-213）。DNAアデニンメチラーゼ（DAM）を持つバクテリアで合成したプラスミドDNA（インプットDNA ）の特徴である、両方のアデニン残基がメチル化されている時に、DpnIはGATC認識部位を切断する。これとは対照的にヒトの細胞はDAM酵素を欠いているために、Hirt上清DNAのMboIによる消化はエピソームが染色体外で複製することを示す。DpnI消化後の制限断片の欠如およびMboI消化後のHirt上清DNAの完全切断によって、これらの感染細胞内に存在するプラスミドDNAが新たに複製したエピソームDNAであることが確認できる。 B. HT-1376感染細胞には高コピー数のBKVエピソームが存在する細胞当たりのエピソームのコピー数を決定するために、BamHI消化したHirt上清DNA、および増加的な量（50-400pg）のBamHIで消化して直線化したpRP-cneoX プラスミドを含む標準曲線を、サザンブロット分析によって評価した（図1、パネルA、レーン4-9）。これらのバンドの濃度計による分析によって、3×10⁵の細胞当たり約500pgのpRP-cneoX、または細胞当たり約150コピーのエピソームが存在することが示された。このコピー数は、他のエピソームベクターのほとんどについて報告されたものよりも高い。例えば、リンパ球細胞におけるEstein-Barr ウィルス由来のエピソームベクターの典型的なコピー数は、細胞当たりおよそ10 から50である（Yatesら、1985）。HT-1376細胞においてBKVエピソームが高コピー数であることは、そのようなベクターによってコードされる遺伝子の転写のための定常状態のレベルが非常に高くなり、このベクターが細胞分裂の間にこれらの膀胱の感染細胞の子孫に効率良く伝わることを示唆している。これらの可能性のどちらも次に続く実験によって評価する。 C. pRP-cneoXがHT-1376のゲノムDNAに組み込まれる証拠はない pRP-cneoXもまたHT-1376のDNAに組み込まれるかどうかを評価するために、HT- 1376感染細胞から得られた全細胞DNAをBamHIで消化し、サザンブロット分析によって評価した（図1、パネルA、レーン1）。対照のBamHI消化したpRP-cneoXプラスミド（レーン２）と同じサイズである9.9kbの単一バンドは、直線化したエピソームプラスミドと一致する。9.9kbのバンドはまた、一列に並んだpRP-cneoXプラスミドによるものであるかも知れないが、本分析において他の制限断片が存在しないことから、pRP-cneoXエピソームの組み込み（インテグレーション）の頻度は、本分析の感度の限りでは非常に低いことが示唆される。低頻度のBKVエピソームの組み込みは、原癌遺伝子の偶然の挿入による活性化または挿入による腫瘍抑制遺伝子の不活性化を制限するであろうから、この結果は重要である。実施例２． pRP-cneoX形質導入細胞における定常状態でのネオマイシン耐性遺伝子の転写レベルは、pSV2NEO形質導入細胞より20倍高い。通常のプラスミドベクターと較べ、BKVエピソームベクターを利用することで得られ得る利点を評価するため、HT-1376細胞をpSV2NEOで処理した。このプラスミドはHT-1376 細胞内では外因性のラージT抗原が存在しないと染色体外で複製することができない。トランスフェクション後、ネオマイシン存在下で細胞の選択を行い、5から10クローンを3つの別々のプール（a、b、c）にまとめた。これらのプールから得られたジェノミックDNAのサザン解析から、細胞当たりおよそ5コピーのpSV2NE Oが存在することが示唆された（データは示さない）。 BKVエピソーム由来発現ベクターが高レベルの転写を達成できるか評価するため、pRP-cneoX及びpSV2NEOに感染させたHT-1376細胞の定常状態でのネオマイシン耐性遺伝子のmRNAレベルをノザンブロット解析によって比較した。どちらのプラスミドにおいても、ネオマイシン耐性遺伝子の転写はSV40初期プロモーターによって制御されている。ノザンブロット細胞のトータルRNAをChirgwinらのCsClイソチオシアン酸法（1979,Biochem,18 :5294-5299）によって調製した。先に記載されているように（Cooper et al., 1990,Cell Growth Differen.,1:149-159）、細胞のトータルRNA20μgを1%アガロースホルムアミドゲルで電気泳動し、Nytranメンブレンにトランスファーし、³² P-ラベルしたランダムプライマーによるプローブでハイブリダイゼーションし、 65℃で最終塩強度0.1× SSC/1.0% SDSまで洗浄した。図2のパネルAでは、pRP-cneoX形質導入細胞（レーン１）及びpSV2NEO形質導入細胞（プールa、レーン2；プールb、レーン3；プールc、レーン4）のトータル RNA20μgを、pSV2NOのネオマイシン耐性遺伝子をコードするBamHI/HindIII断片を放射線標識したものでプローブ探査した。各レーンにほぼ等量のmRNAが流されていることを確認するため、このブロットを放射線標識したベータアクチンのプローブで再びプローブ探査した（図2、パネルB）。これらのデータをデンシトメーターによって分析したところ、pSV2NEO形質導入細胞に較べると、pRP-cneoXエピソーム形質導入細胞では定常状態のネオマイシン耐性遺伝子の発現レベルがおよそ20倍高いことが示唆された。恐らくこの差の一部は、感染したHT-1376細胞内でpSV2NEOのコピー数（５コピー）に較べて pRP-cneoXのコピー数（150コピー）が高いためである。これらのデータから、BK Vエピソーム由来発現ベクターは、安定した発現には挿入（インテグレーション）が必要なプラスミド又はレトロウィルスベクターよりも実質的に高い転写レベルを実現できるということが示唆される。実施例３．細胞分裂を通じて、BKVエピソーム由来発現ベクターは形質導入した膀胱細胞の子細胞に効率良く受け継がれる。エピソーム由来発現ベクターをcDNAライブラリーのスクリーニングに効果的に利用するためには、細胞分裂を通して、エピソームが一つの形質導入細胞からその子細胞に効率的に受け継がれなくてはならない。細胞当たりのエピソームのコピー数が高ければ、効率的に娘細胞に受け継がれることが予測される。なぜなら、その条件では全てのエピソームが一つの娘細胞に偏って分配されることは有り得ないからである。親細胞系列のHT-1376は軟寒天中で増殖するので、感染したHT-1376細胞をネオマイシンの存在下又は非存在下の軟寒天にまくことで、pRP-cneoXが娘細胞に受け継がれる効率を直接的に評価することが可能であった。エピソームが娘細胞に効率的に受け継がれる正の対照として、pSV2NEOを感染させたHT-1376（プールb）をネオマイシンの存在下又は非存在下の軟寒天にまいた。この細胞ではネオマイシン耐性遺伝子はHT-1376DNAに挿入（インテグレート）されている。この結果を下の表1に示す。軟寒天中で、親細胞系のHT-1376はネオマイシン非存在下で0.83%の効率でクローン形成し、200pg/mlのネオマイシン存在下では増殖しない。この濃度では、これらの細胞は14日間培養することで死ぬことが先に明らかにされている。ネオマイシンの存在下又は非存在下の軟寒天中での2種類の形質導入細胞のクローン形成効率比は本質的に同じであり、細胞分裂を通してエピソームが効率的に受け継がれることを示している。さらに、ネオマイシンの存在下又は非存在下で生じた軟寒天中でのpRP-cneoX形質導入HT-1376細胞のコロニーの大きさには差が無かった（データは示さない）。これは、BKVエピソームが効率的に受け継がれることを支持するさらなる証拠である。実施例４． BKVエピソームは選択圧を除いた後も、形質導入した膀胱細胞内に存在し続ける。形質導入したHT-1376細胞にpRP-cneoXが多コピーで存在すること及びこれらの形質導入細胞の子細胞にこのエピソームが効率的に受け継がれることによって、選択圧が存在しなくても数週間あるいは数カ月の間、pRP-cneo Xがこれらの細胞内で保持されるという可能性が提起された。選択圧の非存在下でのHT-1376細胞のpRP-cneoX保持性を評価するため、これらの形質導入細胞をG4 18を除去した完全培地で培養し、様々な時点でHirt上清DNAを調製してサザン解析を行った。図3のレーン3から6では、G418の非存在下でそれぞれ16、34、47及び64日培養した形質導入細胞のDNAを解析している。レーン2の試料は122日間選択条件に置いた後G418存在下で培養した細胞のもので、比較の参考のためである。これはG418除去の過程における34日目と同じ時点のものである。パネルAのブロットは、放射線標識したpRP-cneoXでプローブ探査したものである。エピソームのコピー数のレベルは、G418を除去した16日を経ても本質的に減少しないままに維持されている。続いて、34日の選択条件によって一時的に対照のおよそ10%に減少している。意外にも、続いてエピソームのコピー数はG418 除去64日で増加し、対照のレベルにもどっている。エピソームのコピー数の差が生じたのはHirt上清DNA調製がランダムで非効率的なためなのかどうか評価するために、このブロットをミトコンドリアDNAのプローブでリハイブリダイゼーションした（パネルB）。各Hirt上清DNAに本質的に等量のミトコンドリアDNAが見られることから、各レーンに同程度の数の細胞からの抽出物が流されていることが示され、選択圧の非存在下で64日培養した後にもpRP-cneoXのコピー数が実際に高いレベルに維持されていることが示されている。これらのデータにより、形質導入した膀胱細胞をG418非存在下で短期間培養することでエピソームプラスミドDNAが失われることは無いということが示唆される。 G418非存在下で2ケ月培養した後にもBKV由来のエピソームが高いコピー数で維持される、という結果は予想されていなかった。なぜなら、通常EBV及びSV40 由来のエピソームは、2から4週間の選択圧非存在下の培養で安定な形質導入細胞から失われるからである（Yates,et al.,1984;Hamber,et al.,1988;Chittenden, etal.,1991）。G418非存在下でもpRP-cneoXがHT-1376細胞内で保持されることをさらに確かめるため、このタイムコースにおけるネオマイシン耐性遺伝子の発現を評価した（図4A）。エピソームのコピー数（図3A）と同様に、ネオマイシン耐性遺伝子の発現は一時的に減少し、続いてG418除去64日で本質的に対照のレベルにまで回復するのが観察された。各レーンに等量のmRNAが流されていることは、このブロットをベータアクチンのプローブで再びハイブリダイゼーションすることで示されている（図4B）。これらのデータにより、BKV由来のエピソームが選択圧非存在下の膀胱癌細胞でも高いコピー数で保持されることが強く証明された。実施例５． BKV由来エピソームベクターはHT-1376膀胱細胞とバクテリアとの間でシャトルすることができる。通常のプラスミド又はウィルス由来のものと較べたエピソーム由来発現ベクターの重要な利点は、エピソームを安定な形質導入細胞からバクテリアのコンピテント細胞に移せることである。安定なHT-1376/ pRP-cneoX形質導入細胞から得たHirt上清DNAを使用し、大腸菌DH10Bのエレクトロポレーションを行った。分析した12の小量調製物のうち、10個から再配列していないプラスミドが得られた（データは示さない）。これは、図1の結果と一致する。わずかな再配列のあった2個のコロニーについては、再配列が形質導入した膀胱細胞内で起きたのか、又はバクテリア内に移した際に起きたのかは明らかではない。実施例６．複製能はあるが形質転換能は無いSV40/BKV由来のハイブリッドエピソーム発現系の開発。実施例1から5で使用されたBKV由来エピソームベクターは、DNA複製開始点及びBKVラージT抗原（BK-T）を含む3.2kbのBKV断片から成り、このBK-Tの転写はBK V初期プロモーターによって制御されている。BK-Tが野生型のp53とRBとの複合体を作る（Mann,et al.,1984;Dyson,et al.,1990)という機能のために、軟寒天中での増殖が誘導されると予想された。以下に記載するように、BK-Tに代えて、複製能はあり形質転換能の無いSV40の変異型ラージT抗原を用いることによって、このベクター系に改良を加えた。この方法は成功し、高レベルのSV-T変異型蛋白を発現する形質導入膀胱細胞のクローンは、非腫瘍性のままで、染色体外で複製するためのSV40又はBKVの複製開始点を含むプラスミドを産生する。野生型のSV-T及び各変異型SV-TをpRc/CMV発現ベクター（Invitrogen）にサブクローニングした。このベクターでは、SV-Tの発現は効率の良いCMVプロモーターエンハンサーに制御されており、このプロモーターエンハンサーは調べた膀胱細胞の系列全てで活性がある。加えて、SV-T蛋白質による負の制御（ダウンレギュレーション）が無いために、CMVプロモーターエンハンサーはこれらの研究に適したものである。野生型及び変異型SV40ラージT抗原のcDNAを、pRc/CMV発現ベクター（Invitrogen）のCMVプロモーターエンハンサー転写カセット内のマルチクローニングサイトに2段階方法でサブクローニングした。第一に、pRc/CMV.T 及びpRc/CMV.107-Tを作製した。先ず、野生型SV40ラージT抗原及び107-T（K1）変異型（Kalderon,et al）をコードするcDNAをpSG5ベクターの唯一のBamHIサイトにサブクローニングされた断片として入手した。これらのベクターをBamHIで消化し、T抗原cDNAを含む断片をゲル精製し、3'端をDNAポリメラーゼ1のクレノウフラグメントでフィルインした。リン酸化されたXbaIリンカーを取り付け、続いてXbaIによる消化を行い、ゲル精製した。次にT抗原cDNAクローンを、XbaI消化し牛小腸アルカリフォスファターゼ処理したpRc/CMVにライゲーションした。T 抗原cDNAクローンの向きはXmnI及びPstIによる消化で決定した。第二に、pRc/CMV.T及びpRc/CMV.107-Tに改良を加え、pRc/CMV.402-T 及びpR c/CMV.107/402-Tを作製した。SV40ラージT抗原のコドン402のアスパラギン酸をグルタミン酸に代えた変異体をコードするSV40のクローンはD.Simmons博士の研究室から入手した。このクローンをHpaIで消化し、T抗原の1067塩基対のＣ端断片をゲル精製した。同様に、pRc/CMV.T及びpRc/CMV.107-TをHpaIで消化し、6.4 キロベースの大きな断片をゲル精製した。402-Tから得られたＣ端側HpaI断片を続いて牛小腸アルカリフォスファターゼ処理した親ベクターにつなぎ、pRc/CMV. 402-T 及びpRc/CMV.107/402-Tを作製した。T抗原cDNAクローンの向きはAlwNIによる消化で決定した。これらの構築物の部分的なDNA配列を解析した所、これらの変異型SV-Tが実際に予想された点変異を持つことが確かめられた。図5に、複製能はあるが形質転換能の無いSV40ラージT抗原（SV-T）変異型における点変異の位置を示す。カッコ内に示す、107/402-Tのp53及びRBに対する結合性は予想される結果である。 A. 非腫瘍性5637細胞系列における変異型ラージT抗原の発現。5637細胞系列は非腫瘍性であり、p53及びRBに変異を持つので、野生型あるいは変異型のSV- T蛋白質のいずれでも、腫瘍形質を誘導しないと思われた。よって、5637を初期の形質導入実験に使用した。脂質転換（リポフェクション）法（Felgner,et al. ,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84;7413-7417）を用いて、5637をpRc/CMV.SV-T 及びpRc/CMV.107-Tに感染させ、G418中で安定な形質導入細胞を選択し、クローニングシリンダーを用いて単一の細胞のクローンを単離した。下の図6に示されているのは、典型的な単一の細胞のクローンを用いてSV-T及び107-Tの発現を見たウェスタンブロット解析である。この実験では94kDの蛋白質が検出されているが、これは対照のC0S-7細胞で産生されたT抗原と同一の大きさである。3つのSV- Tクローン全てで、T抗原の発現レベルは中程度であった（レーン1から3）。4つの107-Tクローンのうち3つ（レーン4、5及び7）では、T抗原の発現レベルは高かった。C10ではT抗原の発現は検出されなかった（レーン6）。変異型ラージT抗原の発現についても、pRc/CMV.402-T 及びpRc/CMV.107/402-Tに感染させた5637細胞において同様の結果が得られた。 B. 変異型ラージT抗原の発現によって感受性細胞に腫瘍形質が誘導されることは無い。SV-T及び107-Tに感染した5637細胞クローンの、軟寒天中での増殖能、培養組織中でのフォーカス形成能、及びヌードマウスの腹部での腫瘍形成能を評価した。3つの5637クローンがこの初期の研究に使用された（図6参照）。すなわち、ｃ４（SV-Tを発現する）、C10（107-Tを持つが発現しない）及びE1（10 7-Tを発現する）である。軟寒天でのクローニング形質導入細胞をトリプシン消化し、30ミクロンナイロンフィルター（Tetko, Lancaster,NY）を通して個々の細胞がばらばらになった懸濁液を作った。寒天培地の下層は10%の胎児牛血清及び0.6%シープラーク(Seaplaque)アガロース（FMCB ioProducts,Rockland,ME）を低グルコースDMEMに加えたものである。上層は、10³ から10⁶の細胞を10%の胎児牛血清及び0.3%シープラークアガロースを加えた低グルコースDMEM中に連続的に希釈したものである。直径が125μmより大きい細胞塊（約50個の細胞）をコロニーとして数え、プレーティング後最低1カ月プレートを観察した。これらのデータを下の図2に示した。非腫瘍性である5637親細胞系列は軟寒天中では増殖せず、培養組織中でフォーカス形成をしない。そしてこれを接種したヌードマウスのうち腫瘍を形成したのは1/12のみで、それも潜伏期は長かった。C4は弱くSV-Tを発現するが、ヌードマウス中では非腫瘍性のままで、軟寒天中では増殖しない。興味深いことに、このクローンは顕微鏡下ではフォーカスを形成しているが、肉眼で観察できるフォーカスは形成しない。107-Tを持つが発現はしないクローンC10は、予測されたように、非腫瘍性で5637親細胞系列と同一の外形を持っていた。高レベルで107-T を発現するE1はC4と同一の外形を持ち、顕微鏡で観察できるフォーカスは形成するが、軟寒天中あるいはヌードマウス中では増殖しない。これらのデータにより、足場非依存性あるいはヌードマウス中で腫瘍の形成を誘導すること無しに、非腫瘍性膀胱癌細胞にT抗原蛋白質を発現させることに成功したことが示された。野生型SV40T抗原の発現は、適当な受容細胞の軟寒天中での増殖を引き起こす。T24細胞系列は野生型のRB（及び変異型のp53）を持つので、SV-Tあるいは40 2-Tの発現はRB蛋白質を不活性化すると考えられる。我々は、SV-T（A7）及び402 -T（G1）を弱く発現するT24細胞のクローンにおける腫瘍形質の性質の特徴を調べた。T24親細胞系列は軟寒天中でクローン形成しないのに対し、A7及びG1はそれぞれ0.10%±0.02%（標準誤差）及び0.12%±0.04%のクローン形成効率を持つ。この結果により、これらの形質導入細胞で発現されるT抗原は形質転換能を保持する、生物学的に機能のある分子であることが示唆される。対照的に、高レベルの107/402-Tを発現するT24の単細胞クローンは、軟寒天中で増殖しない。 C. 107-TはSV40のDNA複製開始点の複製を引き起こすことができる。SV-T及び107-Tの予測された生物学的な機能は、SV40のDNA複製開始点の複製をひき起こすという機能である。107-Tが複製を引き起こす活性を評価するため、5637クローンのC10及びE1をSV40のDNA複製開始点を持つプラスミド、pSV2CATに感染させた。感染4日後にHirt上清DNAを調製し、図7に示すようにエピソームの複製の有無を評価した。染色体外での複製は、Hirt上清DNAがDpnI消化に部分的に耐性であるかどうか決定することで調べられる。DNAアデニンメチラーゼを持つバクテリア中で調製されたプラスミドDNAではGATCという配列のアデニン塩基がメチル化されているのに対し、哺乳動物細胞ではこの酵素が無い。そのため、ヒトのDN AはDpnI消化に耐性である。図7で観察されるように、5637クローンのC10（107-T を持つが発現しない）から調製されたHirt DNAはエピソームの複製を起こすことができず、それはpSV2CATは効率的にDpnIによって消化されるためである。対照的に、5637クローンのE1（107-Tを発現する）から調製されたHirt DNAは大部分がDpnIによる消化に耐性であり、これらの形質導入細胞でpSV2CATが染色体外で複製していることが示唆される。これらのデータにより、感染した膀胱細胞で発現されたSV40ラージT抗原が生物学的に機能する分子であり、複製を引き起こす活性を持つことが示された。本発明はその特定の態様に関して記載したが、前述の記載事項と実施例は本発明の範囲を例示するためのもので、その範囲を限定するものでは無いことは理解されよう。他の側面、利点及び改良は、本発明の分野の当業者には自明のものであろう。それらの側面及び応用は本発明の範囲内であり、これは添付の請求の範囲によってのみ定まる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点、および該複製開始点の複製能のための結合部位を含むが野生型ｐ５３産物または網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物の少なくとも一方には結合しないパポバウイルスラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列であってプロモーターに機能的につながれたもの、を含んでなる、複製可能で形質転換の陰性な哺乳動物ベクター。２．パポバウイルスの複製開始点が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４０の複製開始点から選択される、請求項１に記載のベクター。３．ラージＴ抗原の変異型が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４０の複製開始点の両方に対する複製可能な結合部位を含む、請求項２に記載のベクター。４．パポバウイルスラージＴ抗原の変異型が、野生型ｐ５３へ結合せずおよび網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合しない、請求項１に記載のベクター。５．さらに細菌の複製開始点を含む、請求項１に記載のベクター。６．プロモーターが誘導可能である、請求項１に記載のベクター。７．プロモーターが構成的である、請求項１に記載のベクター。８．プロモーターがホルモンの制御下にある、請求項１に記載のベクター。９．以下を含む哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現方法：（ａ）少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点、該複製開始点の複製能のための結合部位を含むが野生型ｐ５３産物または網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物の少なくとも一方には結合しないパポバウイルスラージＴ抗原の変異型をコードする第一ＤＮＡ配列であって上述の哺乳動物細胞において機能する第一プロモーターにつながれたもの、および哺乳動物細胞において機能する第二プロモーターにつながれた外来遺伝子をコードする第二ＤＮＡ配列を含む、複製能を有するが形質転換能の陰性なベクターで哺乳動物細胞を形質導入すること；および（ｂ）形質転換した細胞において外来遺伝子を発現させること。１０．パポバウイルスの複製開始点が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４０の複製開始点から選択される、請求項９に記載の方法。１１．ラージＴ抗原の変異型が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４０の複製開始点の両方に対する複製のための結合部位を含む、請求項１０に記載の方法。１２．パポバウイルスラージＴ抗原の変異型が、野生型ｐ５３へ結合せずおよび網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合しない、請求項９に記載の方法。１３．複製能をもつが形質転換能の陰性なベクターが細菌の複製開始点をさらに含む、請求項９に記載の方法。１４．第一プロモーターが誘導可能である、請求項９に記載の方法。１５．第一プロモーターが構成的である、請求項９に記載の方法。１６．第一プロモーターがホルモンの制御下にある、請求項９に記載の方法。１７．外来遺伝子がｉｎｖｉｖｏで発現する、請求項９に記載の方法。１８．哺乳動物細胞が哺乳動物の体内にありベクターを哺乳動物に投与する、請求項９に記載の方法。１９．ＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型が、野生型ｐ５３へ結合せずおよび網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合しない、請求項１０、１７または１８に記載の方法。２０．ＳＶ４０の複製開始点の複製可能な結合部位を含むが野生型ｐ５３および網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物に結合しないＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。２１．ＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型の１０７番目の残基がリジンで、４０２番目の残基がグルタミン酸である、請求項２０に記載のＤＮＡ分子。２２．ＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型がＢＫウイルスの複製開始点の複製可能な結合部位もまた含む、請求項２０に記載のＤＮＡ分子。２３．野生型ｐ５３へ結合せずおよび網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合しないが、ＢＫウイルスの複製開始点に結合することによってＤＮＡ複製を活性化するＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。