CN102151337B - 调节消化道蛋白表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗可通过在动物粘膜细胞或组织以可调节方式产生蛋白治疗的疾病的组合物和方法。所述治疗方法包括体内和活体外方法，包括将分泌所述蛋白的体外转化细胞植入哺乳动物患者体内。

Description

调节消化道蛋白表达的组合物和方法
技术领域
本发明涉及消化道蛋白的可调节产生，更具体地说，涉及消化道内分泌细胞营养调节型生产降低葡萄糖的因子。
发明背景
肽和蛋白凭借其构象多能性和功能特异性已用于治疗许多疾病，包括糖尿病、血友病、癌症、心血管疾病、感染性疾病和关节炎(Russell C.S.& Clarke L.A.Clin Gent 55(6)：389(1999)；Ryffel B.Biomedenviron Sci 10：65(1997)；Koths K.Curr Opin Biotechnol 6：681(1995)；Buckel P.Trends Pharmacol Sci 17：450(1996))。目前，已获批准的生物工程药物超过2/3是系统性蛋白药物。随着近来功能基因组学、蛋白质组学和基因工程领域的发展，越来越多的蛋白药物正在进入生物制药市场。
最初，由动物组织或人血清纯化蛋白药物。基于蛋白的药物通过若干发展阶段进入了目前的临床应用状态。例如，生物制药厂现在使用基因工程酵母和细菌生产重组人蛋白(Scopes R.K.BiotechnolAppl Biochem 23：197(1996))。这种开拓性技术克服了困扰第一代蛋白药物的健康风险和缺点，并因此改善了蛋白的治疗能力。但是，尽管具有这些优势，蛋白质作为治疗剂广泛应用仍然受困于难以纯化活性形式的重组蛋白和高成本的生产过程(Berthold W.& Walter J.Biologicals 22：135(1994)；Scopes R.K.Biotechnol Appl Biochem 23：197(1996))。另外，蛋白药物进入机体还面临阻碍。在口服使用时，蛋白药物易被胃肠道酶降解(Wang W.J Drug Target 4：195(1996)；Woodley J.F.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 11：61(1994))。
已探明的其它蛋白传递途径包括输液泵(Bremer等，PharmBiotechnol 10：239(1997))、经皮传递(Burkoth T.L.Crit Rev Ther DrugCarrier Syst 16：331(1999))、微囊化(Cleland J.L.Pharma Biotechnol10：1(1997))和吸入(Gonda I.J Pharm Sci 89：940(2000))。目前，用针注射皮下和静脉给药是传递蛋白治疗剂的备选途径。不幸的是，这种传递方式不理想，因为蛋白浓度经常不能保持在治疗范围内或者不能提供适宜的传递动力学。而且，蛋白药物有效治疗通常需要频繁地用针注射，可能引起局部反应和不适，因此导致患者顺应性差(Jorgensen J.T.J Pediatr Endocrinol7：175(1994))。各种因素限制了许多药物的治疗应用，并最终妨碍了其商业化潜力。因此，鉴定新的蛋白治疗剂传递方法是理所当然的。
已使用将特异性治疗蛋白编码基因插入到机体细胞中的方法解决疾病治疗中的前述传递问题。这种方法称作基因治疗，很有希望成为蛋白传递的新方向。采用这种方法可将机体细胞转化为‘生物反应器’，生产足够量的治疗蛋白，并因此解除了对频繁用针注射的需要。目前，基因治疗可以分类为两个基本方法(Drew J.& MartinL-A，载于：Lemoine N.R.(主编)Understanding Gene Therapy.Springer-Verlag，New York，第1章：1-10页(1999))。
第一种方法叫做体内基因治疗，是以允许位于活体宿主中的细胞吸收的形式引入基因。例如，将一种治疗基因包装到病毒(如反转录病毒、腺伴随病毒或腺病毒)基因组中。然后将含有所述治疗基因的重组病毒引入到活体生物中，并使其感染生物体细胞。通过此感染过程，病毒将其含所述治疗基因的基因组掺入到宿主细胞的基因组结构中。结果，感染细胞表达所述治疗基因。
第二种方法涉及将遗传物质体外转移到取自宿主生物的细胞。在基因成功掺入到细胞基因组后，将转化细胞植回到宿主中。该基因转移方法叫做活体外基因治疗。
体内和活体外基因治疗都向医师提供了加入或修饰治愈疾病的特定基因的手段(Friedmann T.载于：Friedmann T(主编)，人类基因治疗的发展，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor：第1章：1-20页(1999))。正研究该技术对大范围疾病的临床应用，所述疾病包括癌症、心血管疾病、代谢疾病、神经退行性疾病、免疫疾病和其它遗传或后天病(Friedmann T.，载于：Friedmann T(主编)，人类基因治疗的发展，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor：第1章：1-20页(1999)；Drew J & Martin L A.，载于：Lemoine N.R.(主编)Understanding Gene Therapy.Springer-Verlag，New York，第1章：1-10页(1999))。在将众多蛋白编码基因通过基因治疗方法引入到细胞中后，已经获得了稳定治疗浓度的蛋白。但是，对于某些疾病，需要调节性传递治疗蛋白。例如，用于糖尿病患者的胰岛素替代疗法实际上需要在进餐时给予适量胰岛素。同样，可通过膳食依赖性释放达到食欲抑制剂的最佳效用。因此，为传递所述治疗蛋白，优选由信号或刺激物(如膳食)触发的释放系统。
非常适于定时传递的一种特别疾病是糖尿病，该病是一种胰腺β细胞产生的胰岛素缺乏(1型)或不足(2型)引起的消耗性代谢疾病(Unger，R.H.等，Williams Textbook of Endocrinology Saunders，Philadelphia(1998))。β细胞是特化的内分泌细胞，生产和储存胰岛素，用于在进食后释放(Rhodes等，J.Cell.Biol.105：145(1987))，而胰岛素是一种促进葡萄糖由血液转移至需要葡萄糖组织的激素。糖尿病患者必须经常监测血糖水平，许多患者需要每日多次注射胰岛素才能生存。然而，这些患者几乎不能通过胰岛素注射获得理想的血糖水平(Turner，R.C.等，JAMA 281：2005(1999))。而且，长期胰岛素水平升高可能产生有害的副作用，例如低血糖休克和机体胰岛素反应脱敏。因此，糖尿病患者还会出现远期并发症，例如心血管疾病、肾病、失明、神经损伤和伤口愈合失调(UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)Group，Lancet 352,837(1998))。
基因治疗提供了一种实现治疗肽(例如治疗糖尿病的胰岛素)生理性传递的有前途的方法(Leibowitz，G.& Levinev，F.Diabetes Rev.7：124(1999))。代用细胞表达掺入的基因，加工和储存编码蛋白，并以可调节方式分泌胰岛素，由此治疗糖尿病。通过将胰岛素生产和改变机体营养需求结合在一起控制血浆胰岛素水平还减轻了与胰岛素注射相关的副作用。因此，需要控制蛋白质释放，以获得对糖尿病和其它人类疾病的有效治疗。本发明满足了这种需要，并具有相关优势。
发明概述
本发明部分基于产生转化的消化道细胞，这些细胞在葡萄糖作用下产生胰岛素。存在于动物消化道中的转化葡萄糖反应性细胞能够分泌生理水平的胰岛素，恢复糖尿病动物的正常葡萄糖稳态。因此，消化道内分泌细胞是活体外或体内治疗性引入蛋白编码核酸的合适靶位，动物在信号或刺激物(例如营养物)作用下产生所述蛋白有利于治疗。
本发明因此提供产生粘膜细胞和包括粘膜细胞的组合物的方法，所述粘膜细胞应答于营养物生产蛋白。在一个实施方案中，一种方法包括在允许粘膜细胞转化的条件下使该粘膜细胞与含表达控制元件的多核苷酸接触，该表达控制元件与蛋白编码核酸有效连接；并鉴定以营养调节方式生产所述蛋白的细胞转化体，由此获得应答于营养物生产蛋白的粘膜细胞。在另一个实施方案中，一种组合物包括分离或培养的生产营养调节蛋白的粘膜细胞，其中包含与所述蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件的转基因使所述蛋白表达。
本发明因此还提供治疗患病或有患病风险患者的方法，所述疾病可通过组织生产蛋白治疗。在一个实施方案中，一种方法包括将一种或多种应答于营养物生产蛋白的粘膜细胞以疾病治疗有效量植入组织中。代表性的可植入组织包括粘膜组织(例如胃肠道)和非粘膜组织(例如肝脏、胰腺或肌肉)。
本发明包括的粘膜细胞包括营养反应性细胞，所述细胞增加所述蛋白的表达(例如通过营养调节表达控制元件)或分泌(例如在信号或刺激物(即“促分泌素”)作用下分泌合成蛋白。
营养物包括天然和非天然的可摄食化合物，例如糖、脂肪、碳水化合物或淀粉、氨基酸或多肽、甘油三酯、维生素、矿物质或纤维素。营养调节元件包括消化道内分泌启动子，例如葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)启动子。营养调节元件包括其功能变异体(例如点突变)或全长调节元件的功能亚序列(缺失序列)。与蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件还可包括一种载体(例如病毒载体)。
本发明包括的粘膜细胞得自患者例如哺乳动物(例如人)、胃肠道组织或器官或衍生自消化道来源的培养细胞系。可获得粘膜细胞的代表性组织包括胃肠道、大肠或小肠(空肠、十二指肠)、胃、食道、口颊或口腔组织。粘膜细胞还包括那些可以或适于在粘膜部位(mucosum)中生长的细胞，即便时间很短。粘膜细胞色括内分泌细胞或非内分泌细胞、K细胞、干细胞、L细胞、S细胞、G细胞、I细胞、Mo细胞、Gr细胞和肠内分泌细胞。
本发明组合物和方法包括治疗性蛋白，如胰岛素、瘦素、GLP-1、GLP-2、缩胆囊素、胰高血糖素拮抗剂、Ghrelin、生长激素、凝血因子或抗体。
本发明因此还提供治疗患病或有患病风险的患者的方法，所述疾病可通过在粘膜组织生产治疗性蛋白治疗。在一个实施方案中，一种方法包括将已用多核苷酸(例如与所述治疗性蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件)转化的患者粘膜细胞与诱导产生疾病治疗有效量蛋白的营养物接触。
本发明方法和组合物可治疗的疾病包括高血糖病(例如胰岛素依赖性和非依赖性糖尿病或空腹血糖水平超过110mg/dl)、肥胖或体重过重。
本发明因此还提供动物遗传模型。在一个实施方案中，提供一种在粘膜组织产生治疗性蛋白(例如胰岛素)的非人转基因动物。一方面，由粘膜组织中存在的转基因使天生无此能力的动物粘膜组织生产治疗性蛋白，所述转基因包括含与所述蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件的多核苷酸，其中动物粘膜组织应答于营养物生产所述蛋白。一方面，所述蛋白包括胰岛素。因此，可使转基因动物不易产生高血糖病。因此，可使患高血糖病或具有患高血糖病风险的转基因动物葡萄糖减少或不大可能出现高血糖。另一方面，所述动物为小鼠(例如糖尿病或高血糖或肥胖小鼠)。再另一方面，赋予表达能力的表达控制元件包括营养调节元件、其功能变异体或其功能亚序列。再另一方面，所述表达控制元件包括葡萄糖诱导型启动子，例如葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)启动子。可使所述动物的胃肠道、肠道、胃表达蛋白。可分离应答于营养物生产胰岛素的转基因动物的细胞和组织。表达蛋白并还可以分离的细胞包括K细胞、干细胞和内分泌细胞或非内分泌细胞。
下文的附图和说明描述了本发明一个或多个实施方案的细节。由说明书和附图以及权利要求可清楚看出本发明的其它特征、目的和优势。
附图说明
图1显示在肿瘤衍生的肠内分泌细胞STC-1中由GIP启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)表达。左图显示样品的亮光视野细胞。右图借助于可鉴定GFP表达细胞的荧光观察同一视野。选择荧光细胞簇并培养扩增，以产生K细胞系GTC-1。
图2是STC-1和GTC-1细胞的GIP mRNA代表性RNA印迹分析，显示GTC-1是高度富集的生产GIP的K细胞。
图3是构建用于表达人胰岛素的K细胞的GIP/Ins质粒的示意图。它含有有效连接至GIP启动子(约2.5kb的GIP基因5′调节序列)的人胰岛素基因的基因组序列。3个外显子以实心框表示(E1、2和3)。标示了用于RT-PCR检测胰岛素原mRNA的引物位置。显示了HindIII(H)、PvuII(P)和XhoI(X)位点。标明了起始密码子(ATG)和终止密码子的位置。
图4显示肿瘤衍生的K细胞表达人胰岛素和胰岛素原加工酶。上图显示人胰岛(H)和用GIP/Ins质粒转染(T)或未转染(UT)的GTC-1细胞的cDNA的RT-PCR分析。用(+)或不用(-)反转录酶制备样品。下图显示GTC-1细胞和β细胞系(INS-1)表达的蛋白质原转化酶PC1/3和PC2的免疫印迹分析。箭头表示PC1/3同种型(64和82kD)和PC2同种型(66和75kD)的预测产物大小。
图5显示于培养基中检测到的用GIP/Ins构建物转染(T)或未转染(UT)的GTC-1细胞的人胰岛素和C肽水平。胰岛素和C肽分别用空心和实心条柱表示。
图6显示葡萄糖对GIP/Ins质粒稳定转染的GTC-1细胞分泌胰岛素的刺激作用。
图7显示在小鼠十二指肠切片中葡糖激酶(GK，红色)和GIP(绿色)共表达。
图8显示转基因细胞系的基因组DNA印迹和PCR鉴定。小鼠编号标示于上方。
图9显示在具有GIP/Ins构建物的转基因小鼠中K细胞定向表达人胰岛素。上图显示人胰岛、对照十二指肠(小鼠)和转基因小鼠组织中表达的人胰岛素基因的代表性RNA印迹分析。下图显示人胰岛(H)、小鼠胰岛(M)和两种转基因小鼠的十二指肠样品(D)的cDNA的RT-PCR分析，该分析使用人或小鼠特异性胰岛素原引物。样品在存在(+)或不存在反转录酶(-)下制备。
Figure BSA00000458436600071
表示无DNA，而M表示标记物。
图10显示转基因小鼠胃(左图)和十二指肠(中图)切片的人胰岛素免疫组织化学染色结果。箭头表示人胰岛素免疫反应细胞。右图显示在与胰岛素(INS，绿色)和GIP(红色)特异性抗血清共染色后经免疫荧光显微镜检查同一动物的十二指肠切片。
图11A显示膳食调节转基因小鼠消化道K细胞产生人胰岛素。
图11B显示转基因小鼠消化道K细胞在混合膳食测试和口服葡萄糖刺激作用下的人胰岛素释放动力学。
图12显示在口服葡萄糖(1.5g葡萄糖/kg体重)后正常对照小鼠、链脲霉素(STZ)治疗的对照小鼠和STZ治疗的转基因小鼠的血糖浓度变化。
图13是一组显微照片，显示对照和STZ治疗的转基因小鼠胰腺切片的小鼠胰岛素免疫组织化学染色。箭头表示胰岛。
图14为大鼠GIP和小鼠嗜铬粒蛋白A基因启动子区的核苷酸序列。
图15为小鼠分泌粒蛋白II(登录号AF037451)的启动子和外显子1以及小鼠葡糖激酶基因启动子(登录号U93275)的5′部分的核苷酸序列。
图16为小鼠葡糖激酶基因启动子(登录号U93275)的3′部分、人腺苷脱氨酶基因启动子区(登录号X02189)的核苷酸序列；以及人前胰岛素原的氨基酸序列和60bp的前胰岛素原5′区。
图17为余下的人前胰岛素原3′部分和人瘦素基因cDNA的5′部分的核苷酸序列。
图18为余下的人瘦素3′部分的核苷酸序列、人CCK氨基酸和核苷酸序列以及60bp的大鼠CCK启动子。
图19为余下的大鼠CCK启动子3′部分的核苷酸序列以及人生长激素的氨基酸和核苷酸序列。
图20为大鼠GIP启动子-1至-1894bp的序列。
发明详述
本发明部分基于以足以提供治疗的水平在动物组织定向生产蛋白。更具体地说，本发明包括在患者胃肠道内分泌细胞定向表达任意目标蛋白以使所述蛋白以调节方式释放到所述患者血流中的方法。可以使用包含表达控制元件(例如启动子)的遗传构建物，所述表达控制元件有效连接至治疗性蛋白编码核酸，将基因表达导向消化道内分泌细胞。当将基因构建物掺入到内分泌细胞中时，其以调节方式表达和分泌编码蛋白。在进食一种增加蛋白产生的物质(例如营养物)时，表达目的核酸编码蛋白的转化内分泌细胞可分泌治疗有效量的蛋白至患者血流中。
包含有效连接至人胰岛素基因的GIP启动子的遗传构建物在小鼠中的传递在转基因后代的胃肠道K细胞中成功定向表达和分泌人胰岛素。而且，所述转基因动物生产人胰岛素受膳食调节。所述细胞分泌的胰岛素量足以保护转基因小鼠在胰腺β-细胞损伤后免得糖尿病。产生的胰岛素还足以提供正常的葡萄糖稳态。因此，通过体内或活体外方法(例如将分泌胰岛素的转化细胞体外移植入动物体内)将编码治疗性蛋白(例如胰岛素)的基因引入动物消化道的膳食调节性内分泌细胞中，可用于治疗通过生产蛋白可治疗的疾病。
按照本发明，提供获得生产营养调节蛋白的粘膜细胞的方法。本发明方法包括在允许细胞转化的条件下使粘膜细胞与含表达控制元件的多核苷酸接触，该表达控制元件与蛋白编码核酸有效连接；并鉴定以营养调节方式生产所述蛋白的转化细胞。在一个实施方案中，粘膜细胞与多核苷酸体内接触。在另一个实施方案中，粘膜细胞与多核苷酸体外接触。在再另一个实施方案中，与多核苷酸体外接触的粘膜细胞适于移植入动物体内。在其它的实施方案中，所述粘膜细胞为内分泌细胞(例如K细胞)或非内分泌细胞。在再另一个实施方案中，所述粘膜细胞为干细胞或多能祖细胞。
在另一个实施方案中，用于本发明的核酸表达构建物用来在胃肠道内分泌细胞中定向表达蛋白。所述构建物含有有效连接至目的核酸序列的表达控制元件。表达控制元件包括能够使消化道内分泌细胞定向表达连接的目的核酸的启动子。可用本领域众所周知的常规方法(渗透压休克(例如磷酸钙)、电穿孔、病毒载体、囊泡或脂质载体(例如脂转染)、直接微注射等)将构建物引入靶细胞中。
细胞转化通常使用载体。术语“载体”是指例如质粒、病毒(如病毒载体)或其它本领域已知的载体，它们可通过插入或掺入多核苷酸进行遗传操作(即“克隆载体”)，或可用于转录或翻译插入的多核苷酸(即“表达载体”)。这样的载体用于引入多核苷酸(包括与核酸有效连接的营养调节型表达控制元件)，并在体外或体内于细胞中表达转录的反义或编码蛋白。
载体通常含有至少一个用于在细胞中繁殖的复制起点。载体中存在的控制元件包括促进转录和翻译的元件，包括本文提出的表达控制元件(例如营养调节型表达控制元件)。术语“控制元件”最低限度应包括一种或多种其存在可影响组分表达，并可包括非启动子或增强子的组分或启动子或增强子以外的组分，例如前导序列和融合配偶体序列、用于产生多基因的内部核糖体结合位点(IRES)元件或多顺反子信息、用于内含子的保持基因正确读框以使mRNA按读框翻译的剪接信号、使目的基因转录物正确聚腺苷酸化的多腺苷酸信号、终止密码子等等。
载体可以包含选择标记。正如本领域所已知的一样，“选择标记”或同义词是指允许选择含有其的细胞的基因。“正选择”是指一种在接触正选择条件时只有含正选择标记的细胞才能存活或被标记的过程。例如，药物抗性是常用的正选择标记，含正选择标记的细胞在含选择药物的培养基中生长，而那些不含所述抗性基因的细胞将死亡。
合适的药物抗性基因有赋予对G418抗性的neo基因或赋予对潮霉素抗性的hygr基因或赋予对嘌呤霉素抗性的puro基因等。其它的正选择标记基因包括允许分类或筛选细胞的基因。这些基因包括荧光蛋白基因、lacZ基因、碱性磷酸酶基因和表面标记如CD8等。
本发明包括的载体可以包含负选择标记。“负选择”是指一种在接触合适的杀死含负选择标记细胞的负选择条件时杀死含负选择标记细胞的过程。例如，包含单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因的细胞对药物丙氧鸟苷(GANC)敏感。同样，gpt基因使细胞对6-硫代黄嘌呤敏感。
本发明包括的载体基于病毒载体，例如能够以染色体外因子复制的猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒(BPV)(Eukaryotic Viral Vector，Cold spring Harbor Laboratory，Gluzman主编，1982；Sarver等，Mol.Cell.Biol.，1：486(1981))。病毒载体包括反转录病毒、腺相关病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、轮状病毒基因组等，对其进行修饰以引入粘膜细胞并控制其中的多核苷酸或转基因表达(Cone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349(1984))。
“表达控制元件”包括影响有效连接的核酸表达的多核苷酸，例如启动子和增强子。表达控制元件和启动子包括那些在特定组织或细胞类型中起作用的元件，本文称为“组织特异性表达控制元件/启动子”。组织特异性表达控制元件通常在特定的细胞或组织中起作用，因为它们可被特定细胞或组织类型独有的转录激活蛋白或其它转录调节物识别。
一类特别的组织特异性启动子为“消化道内分泌细胞特异性启动子”，其驱动有效连接的核酸在消化道内分泌细胞中表达。GIP启动子是消化道内分泌细胞启动子的一个具体实例。GIP启动子包括能够在胃肠道特异性表达的多调节序列(Tseng，C.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1992(1993)；Yeng，C.M.等，Mol.Cell.Endocrinol.154：161(1999))。长度约2.5Kb(-1至约-2500bp)大小的启动子使胃和十二指肠定向表达转基因(图9和10)。较短的GIP启动子(-1至约-1200bp)能使胃表达转基因，但不能使十二指肠表达转基因，并且不能使胰腺定向表达转基因(Yeng，C.M.等，Mol.Cell.Endocrinol.154：161(1999))。因此，-1200至-2500bp的调节序列对于肠GIP生产细胞定向表达转基因似乎是必需的。
GIP启动子转录元件的特征鉴定显示有两个TATA盒(-27至-23和-115至-111)和两个CCAAT样盒(-158至-154和-170至-167)、潜在的AP-1和AP-2位点、cAMP效应元件(CRE)以及位于推定的转录起始位点上游的潜在胰岛素效应元件(TRE)。还在GIP启动子中鉴定出两个推定的GATA结合基序(-178至-172(近侧的GATA)的CAGATAC和-190至-184(远侧的GATA)的CAGATAA)，它们符合保守GATA结合基序序列(A/T)GATA(A/G)。根据荧光素酶报告基因表达的评价，GIP启动子远侧和近侧GATA基序的特异性突变分别导致GIP启动子活性降低约90％和35％(Boylan等，J.Biol.Chem.273：17438(1997))。但是，具有两个GATA基序突变的GIP启动子与仅有远侧GATA基序改变的启动子表现相同。因此，含一个或多个前述核苷酸序列的GIP启动子或变异体是可保持有效连接的核酸葡萄糖调节性或组织特异性(消化道)表达的亚序列实例。这种亚序列和变异体可用于使有效连接的核酸在体外或体内葡萄糖调节性或细胞特异性表达。
组织特异性控制元件的另一个实例是胰高血糖素原基因启动子。与GIP启动子类似，胰高血糖素原启动子具有能在胃肠道或大脑和胰腺表达的多控制序列(Lee，Y.C.等，J.Biol.Chem.267：10705(1992)；Gajic和Drucker，Endocrinol.132：1055(1993))。大鼠胰高血糖素原启动子序列上游的1300bp部分使转基因在大脑和胰腺定向表达，但不在胃肠道中表达(Efrat S.等，Neuron 1：605(1988))。较长的胰高血糖素原基因启动子(-1至-2000bp)控制转基因除了在大脑和胰腺表达之外还在肠中表达(Lee，Y.C.等，J.Biol.Chem.267：10705(1992))。因此，能够在消化道中表达的部分出现在位于胰高血糖素原基因上游1300和2000bp之间的700bp的启动子区内。
可用于使目的核酸在消化道内分泌细胞中定向表达的其它组织特异性表达控制元件列于表1。其中许多也是营养调节元件。例如，GIP启动子包括能使有效连接的核酸应答于营养物表达的多调节序列。
该列表无意列举出所有可能用于驱动基因在消化道内分泌细胞表达的表达控制元件，仅仅是举例而已。
尽管组织特异性表达控制元件在其它组织中可能有活性，例如消化道特异性表达控制元件可能在非消化道组织中有活性，但表达明显低于在消化道组织中的表达(例如非消化道组织比消化道组织低6-10倍)。载体向消化道组织的定向传递可限制在机体其它地方(例如在非靶组织)表达的可能性。因此，本文包括的组织特异性元件不需要具有绝对的组织表达特异性。
表1
Figure BSA00000458436600131
其它的表达控制元件可使表达以可调节方式进行，即信号或刺激物增加或降低有效连接的核酸表达。在信号或刺激物作用下增加有效连接的核酸表达的调节元件也叫做“诱导型元件”(即受信号例如营养物诱导)。在信号或刺激物作用下降低有效连接的核酸表达的调节元件叫做“抑制型元件”(即信号降低表达，使得在信号去除或不存在时表达增加)。通常，所述元件能够增加或降低的量与存在的信号或刺激物的量成比例；信号或刺激物的量越大，表达的增加或降低就越大。
调节型表达控制元件的一个具体实例是应答于营养物或在取消营养物时增加或降低有效连接的核酸表达的元件，在此情况下该元件叫做“营养调节元件”。营养诱导型或抑制型元件通常提供基础水平的转录(即不存在刺激物或信号时的表达水平)。通常，抑制型元件的基础转录水平大于诱导型元件。
本文使用的术语“营养物”是指任何可摄入或可消耗的物质，例如食物或饮料中存在的物质。因为在食物或饮料中存在许多(可能有几十亿种)不同的有机物和无机物，所以本文使用的术语含义广阔。营养物的特定实例包括糖(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖等)、碳水化合物、淀粉、脂肪(饱和或不饱和脂肪)、脂质、脂肪酸、甘油三酯、多肽、氨基酸、纤维素、激素、维生素和矿物质。
营养物还可以调节蛋白的翻译或稳定性。因此，“营养调节”包括营养物调节转录、转录物翻译为蛋白或蛋白稳定性并由此增加或降低转录物或蛋白的量的各种情况。
表达控制元件可以是“组成型”，使有效连接的核酸在不存在信号或刺激物的情况下发生转录。另外，表达控制元件还包括能在细胞周期或分化的特定阶段表达的元件。因此，本发明还包括能够组成型、调节性(例如营养调节性)、组织特异性、细胞周期特异性和分化期特异性表达的表达控制元件。
表达控制元件包括全长序列(如天然启动子和增强子元件)以及保留全部或部分全长或非变异体功能(例如保留一定量的营养调节性或细胞特异性表达)的亚序列或多核苷酸变异体。本文使用的术语“功能”及其各种语法变化在应用于核酸或多肽序列、亚序列或片段或核苷酸或氨基酸序列变异体时，是指该序列具有天然核酸或多肽序列(例如非变异体或未修饰的序列)的一种或多种功能。本文使用的术语“变异体”是指序列(核苷酸或氨基酸)取代(例如点突变)、缺失(内部或外部)或添加(例如嵌合多肽)或其它的点突变修饰(例如化学衍生物，如抗蛋白酶或核酸酶的修饰形式)。通常，氨基酸变异体具有几个或若干氨基酸变化(例如1-10、10-20、20-50)，例如一个或几个保守氨基酸取代，或对希望变异体保留的功能很关键的结构域之外的非保守氨基酸取代。
表达控制元件，例如营养调节元件，还包括功能变异体或亚序列。例如，约2.5Kb的葡萄糖调节性GIP启动予的亚序列(例如2Kb、1Kb、0.5Kb、0.25Kb、0.20Kb、100bp或更小)可保留有效连接核酸的葡萄糖调节性或组织特异性(消化道或胰腺或大脑)表达。特性已知的各种启动子的功能结构域可使有效连接核酸的表达量和表达模式最佳。
本文包括的表达控制元件可得自细菌、酵母、植物或动物(哺乳动物或非哺乳动物)，只要其能够使有效连接核酸的表达受控。因此，可使用得自任何生物的受物质或刺激物(例如营养物)诱导的任何表达控制元件调节有效连接核酸在粘膜细胞中的转录，并且如本文所述在适当时可用于调节所述物质或刺激物作用下的编码蛋白翻译。
营养调节型表达控制元件以例如调节涉及糖酵解、脂质代谢、碳水化合物代谢和胆固醇(例如类固醇)代谢的酶表达的启动子形式存在，它们分别受糖、脂肪、碳水化合物和胆固醇调节，并适用于本发明。营养调节型控制元件的具体实例为驱动L-丙酮酸激酶、乙酰辅酶A羧化酶、spot-14、脂肪酸合酶、磷酸甘油醛脱氢酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸果糖激酶表达的葡萄糖诱导元件(另外参见例如Rutter GA等，News Physiol Sci.15：149(2000))。营养调节型控制元件的另一个实例是乙醇脱氢酶基因调节元件。营养调节型控制元件的再另一个实例是维生素D效应元件，其能够在维生素D存在时表达。哺乳动物金属硫蛋白基因启动子是金属诱导的表达控制元件。同组织特异性控制元件一样，营养调节型控制元件可对多种营养物起反应。例如，葡萄糖诱导元件还可以对乳糖起反应。因此，一种特定的营养物(例如葡萄糖)并未排除其它营养物，因为其它营养物可在较低程度上调节所述控制元件的活性(增加或降低)。
细菌营养调节型表达控制元件的实例是受β-半乳糖苷诱导的lac阻抑蛋白。酵母营养调节型表达控制元件的实例是存在于GAL1和GAL10基因中的gal启动子，该启动子具有半乳糖诱导型表达能力。这些元件可有效连接至核酸并导入粘膜细胞中，以便营养调节性生产编码蛋白。
所包括的其它表达控制元件为对非营养物起反应的元件。具体的实例是具口服活性但通常食物中没有的化学物质或药物。非营养性药物或化学物质在摄入时刺激有效连接至非营养型表达控制元件的核酸表达。摄入所述化学物质或药物的具体量控制产生(通过转录或分泌)的核酸或蛋白量。例如，当药物诱导型表达控制元件使胰岛素编码核酸表达时，通过增加药物消耗量可使消化道中产生的胰岛素量增大。这种非营养型表达控制系统的具体实例可见于例如美国专利号5,989,910、5,935,934、6,015,709和6,004,941。
本文使用的术语“有效连接”或其各种语法变体是指物理或功能上的所述组分邻接，使得这些组分可以其希望的方式起作用。在与核酸有效连接的表达控制元件的实例中，这种关系使所述控制元件调节所述核酸的表达。
可在转录、翻译、剪接、信使稳定性等水平上实现表达控制。通常，调节转录的表达控制元件邻接在转录核酸的5′末端附近(即“上游”)。表达控制元件还可以位于转录序列的3′末端(即“下游”)或转录物之中(例如在内含子中)。表达控制元件可以位于离转录序列较远的位置(例如距所述核酸100-500、500-1000、2000-5000或更多核苷酸)。有效连接核酸的表达至少部分受控于所述元件(例如启动子)，使得所述元件调节所述核酸的转录，合适时调节转录物的翻译。表达控制元件的一个具体实例是启动子，其经常位于转录序列的5′端。表达控制元件的另一个实例是增强子，其可以位于转录序列的5′、3′端，也可以位于转录序列之中。
本文使用的术语“产生”或“生产”当应用于粘膜细胞或组织表达的蛋白时，是指粘膜细胞表达或分泌蛋白。因此，当粘膜细胞在信号或刺激物(例如营养物)作用下生产蛋白时，蛋白的表达和分泌超过信号或刺激之前的量。粘膜细胞或组织生产蛋白可能是由于增加了核酸的转录、转录物的翻译、转录物或蛋白的稳定性或者编码蛋白的分泌。通常，信号或刺激物(即促分泌素)增加细胞的蛋白分泌刺激细胞中已翻译蛋白释放。其分泌受控的蛋白通常储存在内分泌细胞的分泌小泡中。
另一方面，信号或刺激物可增加蛋白编码核酸的转录或翻译以及随后的翻译蛋白分泌。因此，在非内分泌细胞的实例中，信号或刺激物(例如营养物)可通过营养诱导型表达控制元件刺激蛋白(例如胰岛素)编码核酸的转录，细胞随后在蛋白翻译以后分泌编码蛋白。在内分泌细胞(例如消化道内分泌细胞，如K细胞、L细胞等)的实例中，用于使蛋白表达的表达控制元件可以调节或者可以不调节，但在任一种情况下信号或刺激物通常将调节所述细胞分泌蛋白。在此情况下，信号或刺激物起刺激或增加蛋白分泌的促分泌素作用。因此，在内分泌细胞中，无论表达是还是不是营养调节型(例如组成型启动子)，细胞生产蛋白都是营养调节型，因为蛋白的分泌受营养物调节。因此，“营养调节型”也指营养物调节细胞分泌蛋白。
与非内分泌细胞通过增加蛋白编码核酸转录以及随后的分泌生产蛋白相比，内分泌细胞在信号或刺激物作用下蛋白分泌增加对信号或刺激物的反应更快。相反，在非内分泌细胞中，信号或刺激物(如营养物)可增加蛋白编码核酸的转录，细胞随后分泌翻译的蛋白而不需要信号和或刺激物(如营养物)。因此，对于营养调节型转基因转化的非内分泌粘膜细胞，转基因的转录为营养诱导型，但分泌不需要营养物。
核酸可以编码治疗性多肽，如胰岛素、胰高血糖素拮抗剂、瘦素、GLP-1或缩胆囊素。例如，在体内降低葡萄糖水平、提供正常葡萄糖稳态或减轻与慢性或急性高血糖症相关的组织病理学症状方面保留一定能力的全长胰岛素亚序列仅仅是具有其全长相应物一种或多种活性的功能亚序列的一个实例。同样，在抑制食欲或导致体重稳定或体重减轻、刺激生长、减少凝血时间或出血或提供对外源抗原(例如幽门螺杆菌)的被动保护能力方面保留全部或部分能力的瘦素或CCK或生长激素、凝血因子或抗体的亚序列或变异体是可在动物粘膜组织表达以提供治疗利益的功能序列或变异体的另外的实例。
因此，由“核酸”编码的“多肽”、“蛋白”和“肽”包括与天然蛋白一样的全长天然序列以及功能亚序列、修饰形式或序列变异体，只要所述亚序列、修饰形式或变异体保留一定程度的天然全长蛋白的功能性。
本文使用的术语“转基因”是指已经人工引入到细胞或生物体中的多核苷酸。例如，具有转基因的粘膜细胞，所述转基因已通过遗传操作或“转化”细胞导入。转基因导入其中的细胞或其子代叫做“转化细胞”或“转化体”。通常，转基因包含在转化体的子代中，或者成为细胞所发育生物的一部分。可将转基因插入到染色体DNA中，或者作为自主复制的质粒、YAC、小染色体等保持。
转基因包括任何转录为反义RNA或编码多肽的基因。由转基因编码的特定多肽包括可检测的蛋白，如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(用于非侵入性体内检测)、氯霉素乙酰转移酶或可检测的蛋白(例如可免疫检测)。例如，可根据对细胞存活或增殖的检测(例如在将转化细胞移植入动物粘膜后)，使用可检测蛋白评价细胞转化率(例如体内基因转移)、细胞移植成功率。
治疗性蛋白包括胰岛素，一种用于治疗高血糖症(例如糖尿病)的特定转基因。胰岛素是葡萄糖代谢的主要激素调节物，促进葡萄糖由血液转运至关键的代谢器官，如肌肉、肝脏和脂肪。如实施例III所显示，通过胰岛素转基因在转基因小鼠消化道中产生胰岛素预防小鼠患糖尿病。产生胰岛素的量足以恢复葡萄糖耐受，而胰岛素的定时释放恢复了正常的葡萄糖稳态。
编码治疗高血糖症的治疗性蛋白的转基因的另一个实例是胰高血糖素拮抗剂。胰高血糖素是一种由胰岛α-细胞产生的肽激素，是葡萄糖代谢的主要调节物(Unger R.H.& Orci L.N.Eng.J.Med.304：1518(1981)；Unger R.H.Diabetes 25：136(1976))。如同胰岛素一样，血糖浓度介导胰高血糖素分泌。然而，与胰岛素相反，胰高血糖素在血糖降低时分泌。因此，胰高血糖素的循环浓度在禁食期间最高，而在进食期间最低。胰高血糖素水平增加以克制胰岛素促进葡萄糖储存，并刺激肝脏释放葡萄糖至血液中。胰高血糖素拮抗剂的一个具体实例是[脱-His1，脱-Phe6，Glu9]胰高血糖素-NH2。在链脲霉素糖尿病大鼠中，血糖水平在静脉快速浓注(0.75μg/g体重)该胰高血糖素拮抗剂的15分钟内下降约37％(Van Tine B.A.等，Endocrinology 137：3316(1996))。
编码治疗高血糖症或体重过重(例如肥胖)的治疗性蛋白的转基因的另一个实例是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。GLP-1是一种在进食期间由肠L细胞释放的激素，它刺激胰腺β-细胞以增加胰岛素分泌。GLP-1具有另外的活性，这种活性使其成为富有吸引力的肥胖和糖尿病治疗剂。例如，GLP-1减缓胃排空、抑制食欲、降低胰高血糖素浓度、增加β-细胞量、刺激胰岛素生物合成并以葡萄糖依赖方式分泌，并可能增加组织对胰岛素的敏感性(Kiefier T.J.，Habener J.F.Endocrin.Rev.20：876(2000))。因此，与进食相一致的消化道GLP-1调节释放有利于对高血糖症或体重过重的治疗。
抗二肽肽酶IV(DPP IV)的GLP-1类似物提供较长期作用和改善的治疗能力。因此，可使用本文所述的本发明，将编码增加作用持续时间的GLP-1类似物的转基因靶向消化道，以提供营养调节型产生的GLP-1类似物，用于治疗高血糖症或体重过重。
编码治疗高血糖症的治疗性蛋白的转基因的另一个实例是激素抵抗素拮抗剂。抵抗素是一种脂肪细胞衍生因子，在饮食诱导形式和遗传形式的肥胖中其表达提高。中和循环抵抗素改善了肥胖小鼠的血糖和胰岛素作用。相反，给予正常小鼠抵抗素损害了葡萄糖耐受和胰岛素作用(Steppan CM等，Nature 409：307(2001))。因此，在消化道中产生拮抗抵抗素生物作用的蛋白提供了对肥胖相关的胰岛素抗性和高血糖症的有效治疗。
编码治疗体重过重(例如肥胖)或高血糖症的治疗性蛋白的转基因的再另一个实例是瘦素。瘦素尽管主要是由脂肪细胞产生，但也在胃中以进食依赖性方式小量产生。瘦素将有关脂肪细胞代谢和体重的信息传送至大脑的食欲中心，食欲中心发出减少食物摄取的信号(促进饱胀感)，并增加机体的能量消耗。每日单次皮下注射瘦素对人体重减轻仅具有很小的作用，但瘦素治疗使啮齿动物脂肪量显著下降，并且血糖降低(Seufert J.等，Proc Natl Acad Sci USA.96：674(1999))。先前的研究已表明，瘦素在循环中迅速降解。因此，以调节方式由消化道传递可能增强瘦素降低食物摄入和体重以及血糖的临床作用。
编码治疗体重过重(例如肥胖)或高血糖症的治疗性蛋白的转基因的再另一个实例是脂肪细胞互补相关蛋白(Acrp30)的C末端球形头结构域。Acrp30是由分化脂肪细胞产生的蛋白。给予小鼠由球形头结构域组成的Acrp30的蛋白切割产物使体重显著下降(Fruebis J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：2005(2001))。因此，消化道定向表达编码Acrp30球形结构域的转基因可促使体重下降。
编码治疗体重过重(例如肥胖)的治疗性蛋白的转基因的再另一个实例是缩胆囊素(CCK)。CCK是在消化道特定营养物作用下由肠分泌的胃肠肽。CCK的释放与食物消耗量成比例，据信其向大脑发射停止进食的信号(Schwartz M.W.等，Nature 404：661-71(2000))。因此，CCK升高可减少进食量，并促使体重下降或体重稳定(即防止或抑制体重增加)。因此，营养调节型CCK传递系统可提供用于减少人摄取食物目的的治疗作用。
编码治疗性蛋白的转基因的另一个实例包括治疗血友病和其它凝结/凝血疾病的凝血因子(例如凝血因子VIII、IX或X)、治疗生长疾病或消耗综合症的生长因子(例如生长激素、胰岛素样生长因子-1、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等)以及为患者提供抗外源抗原或病原体(例如幽门螺杆菌)的被动免疫或保护或提供对癌症、关节炎或心血管疾病的治疗的抗体(例如人抗体或人源化抗体)。
编码治疗性蛋白的其它转基因包括细胞因子、干扰素(例如干扰素(INF)、INF-α2b和2a、IFN-αN1、IFN-β1b、IFN-γ)、白介素(例如IL-1至IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β)、趋化因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、多肽激素、抗生素多肽(例如抗细菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生物多肽)、酶(例如腺苷脱氨酶)、促性腺激素、趋化素、脂质结合蛋白、filgastim(Neupogen)、血红蛋白、促红细胞生成素、促胰岛素、imiglucerase、sarbramostim、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、链激酶、轴突生长因子(NGF)、苯丙氨酸氨裂解酶、脑衍生轴突因子(BDNF)、轴突生长因子(NGF)、苯丙氨酸氨裂解酶、血栓形成素(TPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷脱氨酶、过氧化氢酶降钙素、内皮素、L-天冬酰胺胃蛋白酶、尿酸酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶、羧肽酶乳糖酶、蔗糖酶内在因子、降血钙素甲状旁腺激素(PTH)样激素、可溶性CD4以及抗体和/或其抗原结合片段(例如Fab)(例如orthoclone OKT-e(抗CD3)、GPIIb/Iia单克隆抗体)。
本文所述转基因特别适用于本发明，但不限于此。在这方面，熟练技术人员可容易地预见到其它转录为治疗性反义RNA或编码治疗性多肽的转基因。
靶细胞包括粘膜细胞或粘膜部位通常不存在的可以或适于在粘膜部位生长的细胞。本文使用的术语“粘膜”当用于表示细胞时，是指可以在粘膜生长的细胞。粘膜细胞包括例如通常可见于动物粘膜的细胞，例如消化道(例如嘴(舌头和颊组织)、食道和胃、小肠和大肠、直肠、肛门)、呼吸道、肺和鼻咽以及其它腔体(例如阴道)的细胞。因此，粘膜细胞是指通常存在于前述部位的各种细胞类型，包括干细胞或其它分化为各种粘膜细胞类型的多能细胞。粘膜细胞的具体实例包括内分泌细胞，例如K细胞、L细胞、S细胞、G细胞、D细胞、I细胞、Mo细胞、Gr细胞和肠内分泌细胞。通常，内分泌细胞的特征为能够在信号或刺激物(“促分泌素”)作用下将合成的蛋白分泌到血液中。非内分泌粘膜细胞包括排列在大多数粘膜组织外表面的上皮细胞、粘液细胞、绒毛细胞、柱状细胞、基质细胞和Paneth细胞。通常已知非内分泌细胞在信号或刺激物作用下不将合成的蛋白分泌到血液中。
消化道K细胞可以起替代细胞的作用，用于在动物中产生适当调节的生理水平胰岛素，这一发现预示了一种糖尿病治疗方式，使患者免于胰岛素注射并降低甚至消除相关的糖尿病并发症。因为在人消化道中可能存在无数K细胞(
Figure BSA00000458436600221
O.，El-Salhy M.，Mech.Ageing Dev.108：39(1999))，所以调节这些细胞中的一部分分泌胰岛素可能足以达到治疗作用，包括改善与糖尿病相关的综合症和并发症。
消化道是机体最大的内分泌器官，能够产生巨量的蛋白，并含有易于利用分裂细胞的快速再生组织。靶细胞如K细胞和干细胞，主要位于容易接受非侵入性基因治疗技术的上消化道。因此，非侵入性技术如口服制剂、内窥镜方法或改良饲管允许利用促进转基因整合入宿主基因组的载体。已经开发了传递基因至肠道细胞(包括干细胞)的载体(Croyle等，Gene Ther.5：645(1998)；S.J.Henning，Adv.Drug Deliv.Rev.17：341(1997)，美国专利第5,821,235号和6,110,456号)。这些载体中有许多已批准用于人类研究。因此，以可调节方式分泌蛋白如胰岛素、苗条蛋白、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、Ghrelin、缩胆囊素、生长激素、凝血因子、抗体等等的消化道细胞如K细胞，是治疗糖尿病、肥胖、生长缺陷和其它可通过在粘膜组织产生蛋白治疗的疾病的一种手段。
表2显示了几种类型的消化道内分泌细胞、在特定营养物(“促分泌素”)作用下由所述细胞分泌的蛋白和典型功能的部分举例。所述蛋白、内分泌细胞和营养物都适用于本发明。
表2
Figure BSA00000458436600231
本文使用的术语“培养(的)”当用来表示细胞时，是指体外培养的细胞。这类细胞的一个具体实例是分离自患者并在组织培养物中生长或适于在组织培养物中生长的细胞。另一个实例是体外遗传操作并移植回相同或不同患者体内的细胞。术语“分离(的)”当用来表示细胞时，是指分离自其天然存在的体内环境的细胞。分离细胞的一个实例是得自个体(例如人)的粘膜细胞。可人工(例如遗传转化)操作“培养的”和“分离的”细胞。这些术语包括所述细胞的任何子代，包括由于在细胞分裂过程中发生突变而与亲代细胞不同的子代细胞。所述术语不包括整个人体。
靶粘膜细胞可存在于患者的粘膜组织或器官中，例如消化道的粘膜组织或器官(例如肠)。因此，一种引入患者粘膜部位蛋白以实现治疗的方法是胞内传递多核苷酸至患者粘膜部位存在的细胞中，其中所述多核苷酸包括与蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件。或者，可由患者的合适组织分离粘膜细胞，用转基因转染并导入(移植入)患者组织(粘膜或其它组织)中。因此，将蛋白引入患者体内实现治疗的另一个方法是将多核苷酸转染入培养的粘膜细胞中，接着将转化细胞或子代细胞移植入患者体内，所述多核苷酸包括与蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件。
用转基因转染的粘膜细胞包括培养生长的内分泌和非内分泌细胞系。例如，可将消化道来源或谱系的转化细胞(如STC-1或GTC-1细胞)植入患者组织。用转基因体外、活体外或体内转染的粘膜细胞包括内分泌细胞(例如K细胞、L细胞、G细胞、D细胞、S细胞、I细胞或Mo细胞、Gr细胞)和非内分泌性上皮细胞、柱状细胞、基质细胞、绒毛细胞、Panth细胞、干细胞或动物粘膜组织通常存在的其它细胞类型。
靶细胞还可以是可在粘膜部位或其它组织中生长或适于在其中生长(即使生长时间有限，例如数天或几个月)的非粘膜细胞(内分泌细胞或非内分泌细胞)。例如，细胞可得自患者的非粘膜组织，用转基因或多核苷酸转化，然后植入患者(同一患者或不同患者)组织中，以便在产生转录的反义RNA或编码蛋白时实现治疗。或者，可用转基因或多核苷酸转化原代细胞分离物或建立的非粘膜细胞系，然后植入患者粘膜组织。
因此，为产生本发明的分离或培养的粘膜细胞，可由例如患者胃肠道组织或器官获得粘膜细胞。然后可用转基因通过常规核酸技术转染粘膜细胞并增殖。例如，可分离肠干细胞，然后体外培养并转染(Booth，C.等，Exp.Cell Res.241：359(1999)；Kawaguchi，A.L.等，J.Pediatr.Surg.33：559(1998))。可单独使用常规方法(例如DNA印迹、RNA印迹或蛋白质印迹)或与使用选择标记的选择方法组合鉴定包含或表达转基因的细胞。然后可将转化细胞再导入(移植/植入)与其获得来源相同或不同患者的相同或不同组织中。
必要时，靶粘膜内分泌细胞可含有多个转基因(即两个或多个)。这样，表达由所述转基因编码的不同蛋白可具有累加或协同作用，这又产生超过任一种单独蛋白表达的治疗作用。另外，如果两个转基因与不同表达控制元件连接，或者两种编码多肽的分泌受不同信号或刺激物(例如两种不同营养物)调节，那么所述蛋白或者可以互相之间独立产生，或者可以组合产生(同时提供两种不同营养物时)。例如，可构建两种转基因，一种编码GLP-1，而另一种编码胰岛素，其产生分别受两种不同信号(例如葡萄糖和药物)控制。葡萄糖刺激GLP-1产生(如本文所述通过刺激转录或分泌)，而药物刺激胰岛素产生(如本文所述通过刺激转录或分泌)。加入刺激胰岛素产生的药物(还是通过刺激转录或分泌进行)和加入葡萄糖可刺激GLP-1产生；增加药物或葡萄糖量可诱导产生更高量的胰岛素或GLP-1。通过加入药物和进食(含葡萄糖)同时产生胰岛素和GLP-1可提供甚至更大的治疗作用，特别是对于例如患严重糖尿病的患者。因此，本发明还包括含多个转基因的粘膜细胞及其生产和使用方法。
因此，按照本发明，提供产生营养物调节蛋白的粘膜细胞，含与蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件的转基因使蛋白在细胞中表达。在一个实施方案中，所述粘膜细胞为内分泌细胞(例如K细胞)。在另一个实施方案中，所述粘膜细胞为非内分泌细胞。在再另一个实施方案中，所述粘膜细胞为干细胞或多能祖细胞。在另外的一个实施方案中，所述表达控制元件能够进行营养调节型表达。一方面，营养调节型元件包含消化道内分泌细胞启动子(例如GIP启动子)。在另一个实施方案中，所述营养物增加核酸编码蛋白的分泌。在再另一个实施方案中，所述核酸编码治疗性多肽(例如胰岛素、苗条蛋白、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、胰高血糖素拮抗剂、缩胆囊素、生长激素、凝血因子、抗体等)。在再另一个实施方案中，所述粘膜细胞包括两个或多个转基因。
可将用于稳定表达的多核苷酸引入到整个生物体细胞中，所述多核苷酸包含有效连接核酸的表达控制元件。所述生物包括转基因动物，用于研究整个动物产生的粘膜蛋白的作用和治疗作用。例如，如本文所述，转基因小鼠消化道产生的胰岛素保护小鼠在胰腺β细胞破坏后避免发生糖尿病和葡萄糖耐受。罹患或易感特定疾病(例如糖尿病、退行性疾病、癌症等)的小鼠品系也可用于引入本文所述的治疗性蛋白，以便研究疾病易感小鼠中表达的治疗性蛋白的作用。对特定疾病或生理情况易感的转基因和遗传动物模型是本领域已知的，并且是消化道表达治疗性蛋白的合适标靶。
因此，按照本发明，提供在粘膜组织生产蛋白的非人转基因动物，这种生产在所述动物粘膜组织不是天然存在的，而是由存在于所述动物体细胞或生殖细胞中的转基因赋予。在一个实施方案中，所述转基因包含多核苷酸，包括与治疗性多肽(例如胰岛素、苗条蛋白、GLP-1、GLP-2、Ghrelin、CCK、胰高血糖素拮抗剂、生长激素、凝血因子、抗体等)编码核酸有效连接的表达控制元件。在另一个实施方案中，所述转基因动物为小鼠。在再另一个实施方案中，治疗性多肽在动物粘膜组织的表达对营养物敏感。在再另一个实施方案中，营养物增加粘膜组织的治疗性多肽分泌。在另一个实施方案中，营养物增加粘膜组织的治疗性多肽表达(即控制胰岛素表达的表达控制元件包含营养诱导型元件)。在另一个实施方案中，营养调节型元件包含葡萄糖诱导型启动子(例如葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子)。在另一个实施方案中，所述粘膜组织为胃肠道(例如肠)或消化道组织或器官，并包括内分泌细胞。在另一个实施方案中，提供表达治疗性多肽的本发明转基因动物分离细胞。
术语“转基因动物”是指其体细胞或生殖细胞系携带直接或间接接受的遗传信息的动物，其中所述遗传信息的接受是通过亚细胞水平的有目的的遗传操作(例如微注射或重组病毒感染)进行。术语“转基因”还包括得自如本文所述遗传操作的转基因动物的细胞或组织(即
“转基因细胞”、“转基因组织”)。在本文中，“转基因动物”不包括传统杂交或体外受精产生的动物，而是其中一种或多种细胞接受核酸分子的动物。本发明的转基因动物可以为所述转基因的杂合子或纯合子。生产转基因动物(包括小鼠、绵羊、猪和青蛙)的方法是本领域众所周知的(参见美国专利第5,721,367、5,695,977、5,650,298和5,614,396号)，这些方法同样也包括在本发明中。
按照本发明，提供治疗感病患者或具感病风险患者的方法，所述疾病可通过在粘膜组织生产治疗性蛋白进行治疗。在一个实施方案中，本发明方法包括使多核苷酸转化(体外、活体外或体内)患者的粘膜组织细胞与以疾病治疗有效量诱导蛋白产生的营养物接触，其中所述多核苷酸包含与治疗性蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件。在另一个实施方案中，本发明方法包括通过将一种或多种生产所述蛋白的转化粘膜细胞(体外或活体外)植入患者组织中，以疾病治疗有效量在粘膜组织产生治疗性蛋白。
本发明方法可治疗的疾病包括高血糖症，例如胰岛素依赖性(1型)糖尿病和非胰岛素依赖性(2型)糖尿病，以及与高血糖症相关或由其导致的生理状况和疾病。因此，本发明方法可治疗的高血糖症还包括与慢性或急性高血糖症(例如糖尿病)有关的组织病理学变化。具体的实例包括胰腺退化(β细胞破坏)、肾小管钙化、肝变性、眼损伤(糖尿病性视网膜病)、糖尿病足、粘膜(例如嘴和齿龈)溃疡、流血不止、凝血或伤口愈合迟缓以及冠心病、中风、周围性血管疾病、脂血异常、高血压和肥胖风险增加。
因此，在本发明的各种方法中，在葡萄糖作用下产生胰岛素或胰岛素功能亚序列的粘膜细胞可用于增加胰岛素、降低葡萄糖、改善葡萄糖耐受、治疗高血糖症(例如糖尿病)或用于治疗与高血糖症相关或由其导致的生理紊乱。所述疾病包括例如糖尿病性神经病(自主性神经病)、肾病(肾损伤)、皮肤感染和其它皮肤病、损伤或伤口愈合缓慢(例如产生糖尿病痈)、可致盲的眼损伤(糖尿病性视网膜病、白内障)、糖尿病足和急性牙周炎。所述疾病还包括发生冠心病、中风、周围性血管疾病、脂血异常、高血压和肥胖的风险增加。
本文使用的术语“高血糖”当用来表示患者病症时，是指患者血液中存在的葡萄糖短暂或长期处于不正常的高水平。该病可由葡萄糖代谢或吸收缓慢引起，使得所述患者表现出葡萄糖不耐受或正常患者中通常没有的葡萄糖升高状态(例如具糖尿病发病风险的葡萄糖不耐受的亚糖尿病患者或糖尿病患者)。正常血糖的空腹血浆葡萄糖(FPG)水平低于约110mg/dl，葡萄糖代谢受损的FPG在约110-126mg/dl之间，而糖尿病患者的FPG高于约126mg/dl。
可通过在粘膜组织生产蛋白治疗的疾病还包括肥胖或体重过重。苗条蛋白、缩胆囊素和GLP-1减轻饥饿，增加能量消耗、诱使体重下降或提供正常的葡萄糖稳态。因此，在各种实施方案中，用于治疗肥胖或体重过重或高血糖的本发明方法包括使具有苗条蛋白、缩胆囊素或GLP-1编码转基因的粘膜组织细胞与营养物接触，以便以治疗肥胖或体重过重的有效量生产蛋白。可治疗的疾病还包括通常与肥胖有关的疾病，例如血清/血浆LDL、VLDL、甘油三酯、胆固醇不正常升高、导致血管狭窄或闭锁的斑块形成异常增加、高血压/中风、冠心病风险增加等。
本文使用的术语“肥胖”是指体重相比于年龄和性别匹配的正常患者多出至少30％的患者。“体重过重”是指比匹配的正常患者多出1-29％的患者以及体重正常但希望体重降低或防止体重增加的患者。
术语“患者”是指动物。通常所述动物为哺乳动物，但是任何具有粘膜组织(例如消化道)的动物也包含在该术语中。哺乳动物的具体实例是灵长类(人)、狗、猫、马、母牛、猪和绵羊。患者包括患病(例如高血糖症如糖尿病)的动物或者没病但可能具有发病风险的动物(例如FPG水平在约110-126mg/dl之间的亚糖尿病患者)。具发病风险的患者包括例如那些其膳食可能导致糖尿病或肥胖发生或与其相关的患者，以及那些可能具有糖尿病或肥胖发病家族史或遗传倾向的患者。患者还包括外表正常的患者，例如那些希望降低体重但不被认为是肥胖或高于正常体重的患者。
表3显示了治疗性蛋白和目标疾病的部分清单。
表3
Figure BSA00000458436600291
一般来说，治疗能减轻或预防所述患者病症的严重性或症状，即改善患者病况或“治疗作用”。因此，治疗可以减轻所述病症或相关疾病的严重性或预防一种或多种症状、抑制所述病症或相关疾病发展或恶化，并在某些情况下逆转所述病症或相关疾病。因此，例如在高血糖症时，治疗可降低血糖，改善葡萄糖耐受，提供正常葡萄糖稳态，或预防、改善或逆转与高血糖症相关或由高血糖症引起的组织病理学变化。
与高血糖症相关的组织病理学变化的改善包括例如预防乃至减轻肾小管钙化、减轻或抑制视网膜病或白内障，减少伤口或损伤的愈合时间、减轻糖尿病足、预防或减轻急性牙周炎或降低冠心病、中风、周围性血管疾病、脂血异常、高血压和肥胖的发病风险。肥胖改善可包括例如降低体重或相关疾病改善，例如胆固醇、LDL或VLDL水平降低、血压下降、与高脂肪膳食相关的血管内膜变厚减轻、静止心率下降、肺活量增加等。出血性疾病(例如血友病)改善可包括例如凝血时间或出血频率/持续时间减少。
本文使用的术语“改善”是指改善患者病症、减轻病症严重性或抑制病症发展或恶化。例如，在高血糖症(例如糖尿病)的情况下，改善可降低血糖、增加胰岛素、改善葡萄糖耐受或葡萄糖稳态。改善高血糖症还可以包括本文所述的改善胰腺功能(例如抑制或防止β-胰岛细胞破坏)、减轻与病症相关或由其产生的病状，例如改善受影响组织或器官的组织病理学。例如在肥胖的情况下，改善可减少体重增加、降低体重或改善本文所述的肥胖相关病症(例如血糖、胆固醇、LDL或VLDL水平降低、血压下降、血管内膜变厚减轻等)。在血友病或其它血液凝集/凝血/出血性疾病的情况下，改善可以降低出血频率或持续时间。改善还包括与血液凝集/凝血/出血相关疾病有关的慢性紊乱，例如减少神经问题、组织破坏和关节损伤。
尽管防止或抑制所述疾病或病症或症状发展或恶化的结果令人满意，但用于治疗患者的剂量或“有效量”优选足以在可检测程度上改善所述病症的一种、几种或全部症状。因此，当可通过在粘膜组织生产蛋白治疗疾病时，足以改善本发明方法可治疗病症的蛋白产生量或移植细胞量取决于所述病症和需要的结果，并可由熟练技术人员容易地确定。合适量取决于所治疗的病症、需要的治疗效果以及各个患者的情况(例如患者的生物利用度、性别、年龄等)。例如，患者正常葡萄糖稳态的部分恢复虽然还不能完全避免胰岛素注射，但可降低胰岛素注射的频率。
通过检测相关生理作用可确定所述有效量。例如，在糖尿病或其它高血糖症情况下，可利用血糖降低和葡萄糖耐受测试改善确定胰岛素量或植入动物粘膜的胰岛素表达细胞量是否可有效治疗高血糖症。例如，FPG由126mg/dl降低至120、115、110或更低的量是有效量。在肥胖或体重过重的情况下，降低患者体重、减少进食量或膳食热含量、增加对给予膳食量的饱胀感以及降低血清/血浆脂质、胆固醇、脂肪酸、LDL或VLDL水平都可以是改善患者肥胖或体重过重的有效量。在血友病情况下，有效量是减少患者凝血时间或出血频率和持续时间的量。
本发明用于治疗患者的方法适用于预防，以防止患者患例如高血糖症或相关疾病的病症或出现肥胖或体重增加。或者，可在如本文所述治疗患者之后实施该方法。例如，在治疗和体重降低到理想重量之后，如本文所述由粘膜细胞定时产生瘦素、GLP-1或CCK，以便抑制食欲、降低膳食消耗等，由此保持理想体重。
用于治疗患者的本发明方法还可以补充其它形式治疗。补充治疗包括药物治疗、膳食改变(低糖、低脂肪等)、手术切除、移植、放疗等。例如，用于治疗高血糖症的本发明方法可与增加患者胰岛素或降低葡萄糖的药物或其它药剂联合使用。用于治疗糖尿病的药物包括例如双胍和磺脲(例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、醋磺己脲、甲磺氮
Figure BSA00000458436600311
脲、格列苯脲和吡磺环己脲)。食欲抑制药物也是众所周知的，可与本发明方法联合使用。补充治疗可以在本发明治疗方法之前、同时、之后给予。熟练技术人员可容易地确定在治疗方案中可与本发明治疗方法组合使用的疗法。
因为本发明方法可包括将例如含有效连接至核酸的表达控制元件的多核苷酸体内传递至患者的粘膜细胞，以便在患者中产生编码蛋白，例如表达系统还包括特别为体内传递而设计的载体。已经开发了将基因有效传递至肠道细胞(例如干细胞)的载体，并设想使用其将多核苷酸传递至粘膜细胞中(参见例如美国专利第5,821,235、5,786,340和6,110,456号；Croyle，M.A.等，Gene Ther.5：645(1998)；Croyle，M.A.等，Pharm Res.15：1348(1998)；Croyle，M.A.等，Hum.Gene Ther.9：561(1998)；Foreman，P.K.等，Hum.Gene Ther.9：1313(1998)；Wirtz，S.等，Gut 44：800(1999))。适于基因治疗的腺病毒和腺伴随病毒载体描述于美国专利第5,700,470、5,731,172和5,604,090号。其它适于基因治疗的载体包括单纯疱疹病毒载体(参见例如美国专利第5,501,979号)、反转录病毒载体(参见例如美国专利第5,624,820、5,693,508和5,674,703号；以及WO 92/05266和WO92/14829)、牛乳头瘤病毒(BPV)载体(参见例如美国专利第5,719,054号)、CMV型载体(参见例如美国专利第5,561,063号)以及细小病毒、轮状病毒和Norwalk病毒载体。慢病毒载体可用于感染分裂细胞以及非分裂细胞(参见例如美国专利第6,013,516号)。
还可以使用其它技术体外、活体外和体内引入核酸和多肽。例如，可将包含与蛋白编码核酸有效连接的表达控制元件的多核苷酸加入到颗粒或多聚物质中，例如聚酯、多氨基酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯-乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。可用如下制备的微胶囊捕获多核苷酸：所述制备通过凝聚技术或界面聚合(例如分别通过使用羟甲基纤维素或明胶微囊或多(甲基异丁烯酸酯)微囊)或用胶体药物传递系统进行。胶体分散系统包括大分子复合物、纳胶囊、微球、珠和脂质型系统，包括水包油乳化剂、胶束、混合胶束和脂质体。使用脂质体引入各种组合物(包括多核苷酸)是本领域技术人员已知的(参见例如美国专利第4,844,904、5,000,959、4,863,740和4,975,282号)。WO 94/20078和美国专利第6,096,291号描述了一种包含天然多聚物或其衍生物或水解物的载体，该载体适于粘膜传递分子(例如多肽和多核苷酸)。用于基因治疗的哌嗪型两性阳离子脂质也是已知的(参见例如美国专利第5,861,397号)。阳离子脂质系统也是已知的(参见例如美国专利第5,459,127号)。因此，可以获得以及设想体外、体内和活体外传递至粘膜细胞或组织的载体(病毒和非病毒，例如裸DNA)和非载体方法。
因为本发明方法可包括将患者中存在的粘膜细胞与多核苷酸接触，所以本发明还提供其中包括转基因或治疗性多肽的“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”制剂。这些制剂可活体外或体内给予患者，以便实施例如本发明的治疗方法。
本文使用的术语“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”是指可给予患者的载体、稀释剂、赋形剂等，优选不产生过度的副作用(例如恶心、腹痛、头痛等)。用于给药的所述制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳浊液。
药用制剂可由与给予患者相容的载体、稀释剂、赋形剂、溶剂、分散剂、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等制备。所述配方可制成片剂(包衣或未包衣)、胶囊(硬或软)、微珠、乳化剂、粉剂、颗粒剂、晶体、悬浮剂、糖浆或酏剂。还可以添加其它的活性化合物和防腐剂连同添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
可以配制与其希望的给予途径相适的药用制剂。因此，药用制剂包括适于通过以下途径给药的载体、稀释剂或赋形剂，所述途径包括腹膜内、皮内、皮下、口服(例如摄入或吸入)、静脉内、腔内、颅内、经皮(局部)、胃肠外(例如经粘膜和直肠)。
用于胃肠外、皮内或皮下用途的溶液或悬浮液可包括以下物质：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如EDTA；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的物质如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。胃肠外制剂可封入玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射的药用制剂包括无菌水溶液(可溶于水时)或分散剂以及临时配制为无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。对于静脉给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。所述载体可为包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可通过例如使用包衣剂(如卵磷脂)、在分散剂情况下通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂保持流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂防止微生物作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。所述组合物中可包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可通过包含延迟吸收剂例如单硬脂酸铝或明胶延长注射剂的吸收。
对于口服给予，组合物可加入赋形剂，并以片剂、锭剂或胶囊剂(例如明胶胶囊)的形式使用。在口服制剂中可包括药学上相匹配的粘合剂和/或佐剂物质。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含以下物质或相似性质化合物中的任一种：粘合剂如微晶纤维素、黄芪树胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或风味剂如薄荷、水杨酸甲酯或调味品。
制剂还可以包括保护组合物抗机体快速降解或清除的载体，例如包含植入和微囊化传递系统的控释制剂。例如，可以使用延时物质如单独或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
其它制剂包括生物降解性或生物相容性颗粒或多聚物质如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯-乙交酯共聚物、聚丙交酯-乙交酯共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物，以便控制所给予组合物的传递。制备所述制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。所述物质还可以购自例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。
组合物的释放速率可通过改变这些大分子的浓度或组成进行控制。例如，可用如下制备的微胶囊捕获所述组合物：所述制备通过凝聚技术或介面聚合(例如分别通过使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊或多(甲基异丁烯酸酯)微胶囊)或用胶体药物传递系统进行。胶体分散系统包括大分子复合物、纳胶囊、微球、微珠和脂质型系统，包括水包油乳化剂、胶束、混合胶束和脂质体。这些物质可以按照本领域技术人员已知的方法制备，例如描述于美国专利第4,522,811号的方法。
其它适于给药的药用制剂是本领域已知的，并可应用于本发明的方法和组合物(参见例如Remington′s Pharmacentical Sciences(1990)第18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA；The Merck Index(1996)第12版，Merck Publishing Group，Whitehouse，NJ；和Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993))。
可在给予之前，例如使用渗透剂或其它屏障穿透增强剂去除或另外制备粘膜组织的粘膜或内皮表层。适于穿透屏障的所述渗透剂是本领域普遍知道的，包括(例如经粘膜给予时)与N-乙酰-半胱氨酸温育(Nakanishi等，Chem Pharm Bull(Tokyo)40：1252(1992)，Meaney和O’Driscoll Eur J Pharm Sci.8：167(1999)；通过纯化Sigma l蛋白和感染性亚病毒颗粒水解肠粘液素(Bisaillon等，J Mol Biol.286：759(1999)；desialation(Slomiany等，Gen Pharmacol.27：761(1996)；(Hirmo等，FEMS Immunol Med Microbiol.20：275(1998)；通过幽门螺杆菌糖硫酸酯酶脱硫(Slomiany等，Am J Gastroenterol.87：1132(1992)；经神经氨酸酶desialation(Hanski等，Cancer Res.51：5342(1991))；β-巯基乙醇破裂二硫键(Gwozdzinski等，Biochem Int.17：907(1988)；用特异性外糖苷酶如岩藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰-半乳糖胺酶、β-N-乙酰-己糖胺酶和神经氨酸酶去糖基化(Slomiany等，Biochem BiophysRes Commun.142：783(1987)；使用0.4N HCl的酸去除(Ruggieri等，Urol Res.12：199(1984)，Davis C.P.和Avots-Avotins A.E.ScanElectron Microsc.(第2部分)：825-30(1982)，Parsons等，Am J Pathol.93：423(1978))等。还可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现粘膜给予。对于吸入给予，可通过泵或气溶胶喷雾器由包含合适喷射剂(例如气体，如二氧化碳)的分散容器或压力容器或喷雾器中传递所述制剂。
干细胞的数量可通过接触细胞毒性剂和生长因子增加。例如，辐射小肠增加形成克隆性/干细胞数目(Roberts S.A.Radiat.Res.141：303(1995)；Cai W.B.等，Intl.J.Radiat.Biol.71：145(1997))。另外，已经表明，用GLP-2、表皮生长因子、TGF-α、胰岛素样生长因子、白介素等治疗促进粘膜细胞生长(Potten C.S.Int.J.Exp.Path 78：219(1997))。这样，可产生其它的靶细胞，由此增加转化效率以及随后由转化细胞产生的调节蛋白。
可使用内窥镜、套管、插管、导管等将所述制剂传递至患者消化道的各个部位。这使得可以将载体有效传递和导向消化道的特定区域。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科技术语的含义都和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。尽管可使用与本文描述类似或等同的方法和材料实施或检验本发明，但本文描述了合适的方法和材料。
本文提及的所有出版物、专利和其它参考文献都通过引用整体结合到本文中。在有冲突时，以本说明书(包括定义)为准。
本文使用的单数形式“a”、“and”和“the”包括复数修饰对象，除非文章中清楚指出另外的含义。因此，例如，所提到的“一种粘膜细胞”包括一群所述细胞，而所提到的“包含与核酸有效连接的表达控制元件的多核苷酸”包括一种或多种所提到的构建物等等。
已经描述了本发明的许多实施方案。应当理解的是，尽管如此，仍可在不违背本发明精神和范围的情况下进行各种修改。因此，以下的实施例意图说明本发明，但不限制权利要求中描述的本发明范围。
实施例1
本实施例描述了建立用于研究调节胰岛素生产和体内导向胰岛素表达的消化道内分泌细胞系。该实施例还描述了构建人胰岛素基因表达载体。
建立GIP表达细胞系研究GIP启动予对K细胞定向表达胰岛素基因是否有效。该细胞系克隆自小鼠肠细胞系STC-1，STC-1是一种混合肠内分泌细胞群(Rindi等，Am.J.Pathol.136：1349(1990))。可通过转染由约2.5Kb的大鼠GIP启动子驱动的绿色荧光蛋白表达质粒目测鉴别混合细胞中的K细胞。如前所述(Boylan等，J.Biol.Chem.273：17438(1997))通过与大鼠GIP cDNA克隆噬菌斑杂交由大鼠基因组λDASH文库(Strategene)获得大鼠GIP启动子，并将其亚克隆入无启动子的pEGFP-1质粒(Clontech)。使用Lipofectamine(GIBCO)将获得的报告载体转染入STC-1细胞(D.Drucker，University ofToronto)。用胰蛋白酶/EDTA将细胞分散，双手挑选表达EGFP的荧光细胞，并放置于用于克隆扩增的各个培养皿中(图1)。
在克隆扩增瞬时荧光细胞之后，通过RNA印迹分析克隆的GIPmRNA表达情况。简而言之，用Trizol(Gibco)按照生产商的说明由GTC-1和STC-1细胞中分离总RNA。电泳分离每个样品的总细胞RNA(20μg)，并转移到尼龙膜上。将其与放射标记的660bp大鼠GIP cDNA的EcoRI片段进行杂交，所述cDNA片段由[α-32P]dCTP随机标记。杂交后，清洗膜并对X-射线胶片曝光。一个克隆(GIP肿瘤细胞；GTC-1)的GIP mRNA水平约比亲代异源STC-1细胞高8倍(图2)。
为了确定GTC-1细胞是否正确加工人基因组前胰岛素原，将其中胰岛素基因连接至大鼠GIP启动子3′末端的胰岛素表达构建物(图3，GIP/Ins)转染入GTC-1细胞中。
为构建人胰岛素/GIP表达质粒，如上所述将约2.5Kb的大鼠GIP启动子部分插入到pGLBH中(Boylan等，J.Biol.Chem.273：17438(1997))。通过用BamHI消化由pBR322(ATCC号57399)中切除人胰岛素cDNA，该cDNA包含由核苷酸2127延伸至3732的包括天然多腺苷酸位点的约1.6Kb基因组序列，然后将其连接至含GIP的pGLBH构建物的BglII位点。表达构建物示于图3。
由GIP/Ins-转染和非转染细胞以及人胰岛(Trizol，GIBCO)分离总RNA。使用Superscript II反转录酶(GIBCO)用寡脱氧胸苷引物反转录5μg分离的RNA。用人前胰岛素原基因特异性引物(引物1和3，图3)扩增2μl cDNA产物。结果表明，人前胰岛素原mRNA转录物被正确加工(图4，上部)。
当将GIP/Ins构建物转染入β-细胞系(INS-1)、肝细胞系(HepG2)和大鼠成纤维细胞系(3T3-L1)时，几乎未检测到人前胰岛素原mRNA。这些观察结果表明，GIP启动子是细胞特异性的，并很可能在体内将转基因表达有效导向K细胞。
然后对GTC-1细胞进行蛋白质印迹分析，以确定是否存在将胰岛素原转变为成熟胰岛素的加工酶。简而言之，用冰冻RIPA缓冲液裂解GTC-1细胞，使用Bardford法分析上清液的总蛋含量。在10％SDS-PAGE上分离细胞裂解蛋白(50μg)，将分离蛋白电印迹至硝酸纤维素膜上，并与识别PC1/3和PC2的多克隆抗体(Dr.Iris Lindberg，Louisiana State Medical Center)温育。清洗膜，与偶联辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗血清(Amersham-Pharmacia)温育，并用化学发光蛋白质印迹检测试剂盒显像。结果表明，GTC-1细胞表达将胰岛素原正确加工为成熟胰岛素所需的蛋白原转化酶(PC1/3和PC2；Steiner，D.F.，Curr.Opin.Chem.Biol.2：31(1998))(图4，底部)。
为证实胰岛素原被正确加工，检测细胞培养液中的胰岛素和C-肽水平(图5)。在由GIP/Ins质粒转染的GTC-1细胞收集的培养液中同时检测到C-肽和胰岛素两种物质。该结果表明，K细胞将胰岛素原加工为成熟胰岛素。
为证实GIP/Ins质粒转染的GTC-1细胞产生人胰岛素为葡萄糖调节型，检测不同葡萄糖浓度下细胞培养液的胰岛素水平。简单来说，将于12孔板中70-80％汇合的GTC-1细胞在具有1.0mM葡萄糖和1％胎牛血清(FCS)的DMEM中饥饿2小时。清洗细胞，然后在0.5ml释放培养基(DMEM+1％FCS和1.0或10.0mM葡萄糖)中温育2小时。每个条件2小时后收集培养液，使用人特异性ELISA试剂盒按照供应商的说明(ALPCO)分析。而且，这些细胞的胰岛素释放为葡萄糖依赖型(图6)。
实施例II
本实施例描述了在葡萄糖作用下产生胰岛素的转基因小鼠。
使用实施例I描述的人胰岛素表达构建物GIP/Ins，用HindIII消化取出GIP/胰岛素片段(约4.1Kb)。通过将约4.1Kb的转基因原核微注射入受精卵中，并将受精卵植入代孕雌性小鼠中，产生转基因小鼠。通过DNA印迹分析鉴定转基因后代。用XhoI和PvuII消化耳部DNA(图3)，电泳分离并转移至尼龙膜。为检测所述转基因，使用引物2和4扩增含有内含子2的416bp人胰岛素基因片段(图3)。通过用[α-32P]dCTP随机标记制备作为探针的PCR产物，通过放射自显影检测条带。通过使用引物2和4PCR扩增基因组DNA进一步证实DNA分析结果。将阳性小鼠和野生型FVB/N小鼠远系杂交，建立转基因系(图8)。
检查转基因小鼠组织的胰岛素表达情况。简单来说，分离每只小鼠胃和十二指肠、回肠、肌肉、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪、大脑、肺、心脏、膀胱和睾丸的总RNA(50μg)，转移至膜并用包含人前胰岛素原基因外显子1和2以及部分外显子3的333碱基对cDNA片段探测。分析揭示，胰岛素在所获得的转基因小鼠的胃和十二指肠中表达，但不在其回肠、肌肉、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪、大脑、肺、心脏、膀胱或睾丸中表达(图9)。
为证实在十二指肠中产生胰岛素，对胰岛素mRNA进行RT-PCR。简单来说，使用人胰岛素原特异性正向引物5′-CCAGCCGCAGCCTTTGTGA-3′和反向引物5′-GGTACAGCATTGTTCCACAATG-3′；小鼠胰岛素原特异性正向引物5′-ACCACCAGCCCTAAGTGAT-3′和反向引物5′-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC-3′。PCR条件如下：于94℃变性1分钟，于50℃退火1分钟，于72℃延伸1分钟，45个循环。在2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并通过溴化乙锭染色显色。人和小鼠特异性引物组分别产生350bp和396bp的产物。
在确认胰岛素不是缘于邻近的小鼠胰腺污染的转基因小鼠十二指肠样品中检测出胰岛素RNA(图9)。利用胰岛素抗体以转基因小鼠的活组织检测样品测定胰岛素蛋白的细胞定位。在转基因小鼠胃切片的不同内分泌细胞中检测出胰岛素免疫反应性(图10)。
前述结果表明，胰岛素表达在转基因小鼠中的组织分布符合GIP的组织表达模式(Tseng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1992(1993)；Yeung等，Mol.Cell.Endocrinol.154：161(1999))。
为测定表达胰岛素的细胞是否为K细胞，分析组织对GIP抗血清的免疫反应性。简单来说，将组织在Bouin溶液中过夜固定并包埋在石蜡中。将组织切片(5μm厚)放置在载玻片上。对于免疫组织化学，使用生物素-抗生物素复合方法，用过氧化物酶和二氨基联苯胺作为色原。切片与豚鼠抗胰岛素(1∶500；Linco Research，Inc.)或小鼠抗-GIP(1∶200；R.Pederson，University of British Columbia)温育30分钟，并与合适的第二抗体于室温温育20分钟。使用生物素化第二抗体进行免疫组织化学，缀合荧光素或Cy3的第二抗体用于免疫荧光。结果表明，由于共表达免疫反应性GIP，所以胰岛素表达细胞为K细胞(图10)。这些结果证实，人胰岛素生产被有效导向小鼠消化道K细胞。
实施例III
本实施例显示，转基因小鼠生产胰岛素提供正常葡萄糖稳态，并起免于发生糖尿病的保护作用。转基因小鼠的消化道K细胞生产人胰岛素还受膳食调节。本实施例还描述了数据，显示转基因小鼠葡萄糖诱导型生产胰岛素在胰腺β-细胞破坏后提供葡萄糖稳态。
对食物摄取作用下的转基因小鼠血浆人胰岛素水平进行分析。简单来说，使用人特异性胰岛素ELISA试剂盒(ALPCO)按照供应商的说明检测血浆胰岛素水平。该测定与人胰岛素原和C-肽的交叉反应性＜0.01％，不能检测小鼠胰岛素。血浆C-肽检测用大鼠/小鼠C-肽RIA试剂盒(Linco)进行。该测定显示与人C-肽无交叉反应性。
在口服葡萄糖后收集的合并血浆样品中，转基因小鼠的胰岛素为39.0±9.8pM(n＝10，平均数±平均数标准误差)，而在对照小鼠中未检测出胰岛素(n＝5)。为证实K细胞产生的人胰岛素受膳食调节，让转基因小鼠禁食。禁食40小时后，经尾静脉收集血样。然后用标准食物再喂食小鼠，给予食物后24小时再收集血样。
如图11A所示，禁食使转基因小鼠的循环人胰岛素显著降低超过40％(13.0±4.2pM对7.6±2.3pM，p＜0.03)。在食物限制之后，再喂食导致循环人胰岛素增加超过400％。
为评价消化道K细胞人胰岛素的释放动力学，以标准颗粒形式的混合膳食(0.5g)或口服葡萄糖(3mg/g体重)喂食禁食的转基因小鼠。如图11B所示，两种口服营养物迅速地刺激消化道K细胞释放人胰岛素，在30分钟内释放至少20％。这些结果证实，消化道K细胞的胰岛素分泌确实受膳食调节。
令人感兴趣的是，在转基因小鼠口服葡萄糖之后小鼠C-肽水平比对照低约30％(227.1±31.5pM与361.5±31.2pM，每组n＝3，平均数±平均数标准误差)。该观察结果提示，消化道产生的人胰岛素可能已经导致内源胰岛素生产代偿性下调。
研究消化道K细胞生产人胰岛素保护转基因小鼠免得糖尿病的能力。给予转基因小鼠和年龄相当的对照小鼠一种β-细胞毒素链脲菌素(STZ)。简单来说，通过腹膜内注射给予8周龄转基因小鼠和年龄相当的对照小鼠链脲菌素(200mg/kg体重)的柠檬酸盐缓冲液。在此链脲菌素剂量下，小鼠通常在注射后3天内表现出糖尿。
在对照动物中，STZ处理产生禁食性高血糖(26.2±1.52mm，n＝3，平均数±平均数标准误差)，在3-4天内尿中出现葡萄糖，表明发生糖尿病。此后未治疗小鼠迅速恶化并在7-10天内死亡。相反，转基因小鼠在STZ处理后长达3个月既未检测出糖尿，也未检测出禁食性高血糖(9.52±0.67mm，n＝5，平均数±平均数标准误差)，它们的体重持续正常增加。
为测定K细胞生产的胰岛素即使STZ严重损伤β细胞的情况下是否也能够保持这些小鼠的口服葡萄糖耐受，在STZ处理后5天口服葡萄糖处理小鼠。简单来说，通过喂食管将葡萄糖(1.5g/kg体重)的40％溶液(重量/体积)口服给予禁食14小时的小鼠。在口服葡萄糖后于0、10、20、30、60、90和120分钟由有知觉小鼠的尾静脉收集血样(40μl)。通过酶比色测定(Sigma)测定血浆葡萄糖水平，并使用人特异性胰岛素ELISA试剂盒(ALPCO)检测血浆胰岛素水平。
给予STZ的对照小鼠在摄入葡萄糖之前和之后都为严重高血糖(图12)。相反，STZ处理的转基因小鼠血糖水平正常，并和年龄匹配的正常对照小鼠一样快速代谢去除口服葡萄糖量增高(图12)。
为确保STZ处理有效破坏这些实验动物中的β-细胞，如先前所述对对照和STZ处理的转基因小鼠的胰腺切片对进行小鼠胰岛素免疫染色。与假处理的对照相比，STZ处理小鼠的小鼠胰岛素染色阳性的细胞簇数目明显偏低(图13)。通过匀浆胰腺并于4℃在含0.25％BSA的2mM乙酸中超声处理，估测STZ处理的转基因小鼠的总胰腺胰岛素含量。在冰上温育2小时后再对组织匀浆超声，离心(8,000g，20分钟)，仅通过放射免疫测定上清液的胰岛素。结果表明，STZ处理的转基因小鼠的总胰腺含量是假治疗对照的0.5％(0.18对34.0μg胰岛素/胰腺，n＝2)。这些STZ处理的转基因小鼠尽管实际上没有胰腺β-细胞，但同正常小鼠一样代谢口服葡萄糖，这一事实表明，消化道产生的人胰岛素足以保持正常葡萄糖耐受。
这些发现表明，消化道K细胞产生胰岛素可以保护小鼠免于发生糖尿病，还提供达到恢复正常葡萄糖耐受程度的正常葡萄糖稳态。因此，消化道表达胰岛素是可用于治疗高血糖症如糖尿病的一种方法。
实施例IV
本实施例描述了将应答于营养物产生蛋白的转化细胞移植入哺乳动物患者的组织。
为分离靶粘膜细胞，由患者的十二指肠收集活组织。用冰冷的Hank平衡缓冲盐溶液(HBSS；Gibco BRL)清洗活组织，该缓冲液pH约7.4，含0.1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma)，将活组织用解剖刀剁碎，接着用含75U/ml I型胶原蛋白酶(Sigma)、75U/ml XI型胶原蛋白酶(Sigma)、0.9U/ml IX型胶原蛋白酶(Sigma)和1U/ml胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corp)的酶混合物在37℃振摇水浴中将活组织消化1小时。然后用HBSS-BSA将总体积稀释1倍，并让其沉降10分钟。废弃含脱离细胞的上清液。余下的组织再用所述酶混合物消化2×45分钟，每步之后都在15分钟内加入300μl的0.5M EDTA。将得自第3步消化的细胞悬浮液通过Nitex筛(200μm，B&SHThompson)过滤，清洗并用补加0.01％二硫苏糖醇和0.001％DNase的HBSS-BSA以200×g离心2次。然后将细胞第二次通过精细的Nitex筛(62μm，B&SH Thompson)过滤，计数，并用HBSS-BSA-DTT-DNase稀释至6×106细胞/ml，用于淘析。
使用逆流离心淘析细胞使粘膜内分泌细胞富集(Lindahl P.E.Nature 161：648(1948)，逆流离心淘析是一种基于细胞沉降系数分离细胞的方法。将细胞悬浮液泵入旋转腔，细胞在通过分离腔时被保留在其沉将速率与流体流动相平衡的位置。然后通过增加流过腔体的流速或降低离心速度，‘洗脱’不同纯化细胞。凭经验确定合适的流速和离心速度。经与无菌HBSS-BSA源连接的泵(Cole Palmer)将由1.5×108分散细胞组成的各批次引入Beckman淘析器(型号J2-21M/E；Beckman)中。
将酶分散粘膜细胞加样至淘析腔，转速为2500rpm，流速为25ml/分钟，清洗2分钟。在将流速改变为30ml/分钟后收集100ml组分(F1)。于2100rpm转速和55ml/分钟获得第二个100ml组分(F2)。于200×g离心10分钟浓缩F2的细胞，然后重悬浮在无菌培养基(DMEM(47.5％)和含5.5mM葡萄糖、5％胎牛血清、2ng/ml神经生长因子、8mg/L胰岛素、mg/L氢化可的松、50mg/L庆大霉素、0.25mg/L两性霉素B、50U/ml青霉素、50mg/L链霉素和20μM半胱氨酸-β-D-阿拉伯呋喃糖苷的Ham F-12K)中。
按照Kobayashi等(Science 287：1258(2000))所述有条件地无限增殖化获得的粘膜内分泌细胞。用具有遗传构建物的无复制能力标准反转录病毒载体转导培养的粘膜细胞，所述遗传构建物由有效连接至癌基因(例如端粒酶、大T抗原、v-myc、ras等)的GIP启动子组成，而所述癌基因与IRES和HSV-tk基因串联融合。胰岛素和选择标记以双顺反子表达。所述遗传构建物位于重组酶识别位点侧翼，以允许切除所述癌基因，并因此在移植前使细胞去无限增殖化。
为建立无限增殖化K细胞系，用携带有效连接至癌基因的GIP启动子的反转录病毒载体转导细胞，通过免疫荧光染色和蛋白质印迹检查存活的细胞克隆表达GIP的情况。进一步扩增表达令人满意量的GIP的克隆，以建立K细胞系。再用携带遗传构建物的反转录病毒载体转导K细胞系，所述遗传构建物由有效连接至人胰岛素和正选择标记编码核酸的GIP启动子组成。胰岛素和选择标记以双顺反子表达。将转染的K细胞与合适的选择药物温育。分离存活的克隆，并通过蛋白质印迹和ELISA(ALPCO)检测其人胰岛素表达情况。
培养表达合适水平人胰岛素的K细胞克隆，直至获得足够数目的细胞。在转移至哺乳动物患者之前，通过切除癌基因使表达人胰岛素的K细胞系去无限增殖化。这可通过用表达合适重组酶(例如cre、flp等)的腺病毒转染细胞完成。转染后24-48小时，细胞在丙氧鸟苷中温育。接触丙氧鸟苷78小时后，纯化并制备存活细胞(106-1012细胞)，用于移植入哺乳动物患者体内。
作为替代方案，通过酶(例如嗜热菌蛋白酶)解离由十二指肠活组织中分离粘膜前体细胞或干细胞，并如前所述在培养基中扩增(Perraeault N.& Beaulieu J.F.Exp Cell Res 245：34(1998)；Perraeault N.& Beaulieu J.F.Exp Cell Res 224：354(1996))。用携带GIP/Ins构建物的病毒载体转染这些干细胞和前体细胞。通过在选择药物中温育选择成功转染的细胞。然后诱导这些遗传加工的细胞分化，最后移植入哺乳动物患者体内。
总之，该实施例阐述了工程K细胞和粘膜内分泌前体细胞以产生人胰岛素的活体外方法。可将工程细胞移植回同一患者或不同患者体内。可通过本文公开的几种充分确立的方法或本领域已知的方法实现移植。例如，可将细胞囊化，并移植入哺乳动物患者皮肤下，或者可以通过门静脉传递将细胞移植入肝脏。
已经描述了本发明的许多实施方案。应当理解的是，尽管如此，仍可在不背离本发明精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其它实施方案属于以下权利要求书的范围。
Figure ISB00001111145900011
Figure ISB00001111145900021
Figure ISB00001111145900031
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Figure ISB00001111145900091
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Claims (23)

1.遗传构建物在制备用于治疗患有糖尿病或高血糖症的患者的药物中的用途，其中所述遗传构建物包含编码胰岛素的核酸，该核酸的表达由葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)启动子驱动。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述遗传构建物被靶向于由消化道K细胞表达。
3.包含与编码胰岛素的核酸有效连接的葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)启动子的多核苷酸在制备用于治疗患有高血糖症或具有患高血糖症风险的患者的药物组合物或装置中的用途，所述多核苷酸用于由葡萄糖或膳食所诱导的消化道K细胞中胰岛素的产生。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述高血糖症包括糖尿病。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述糖尿病包括I型糖尿病。
6.如权利要求4所述的用途，其中所述糖尿病包括胰岛素依赖型糖尿病。
7.如权利要求1或3所述的用途，其中所述患者的空腹血浆葡萄糖水平高于110mg/dl。
8.如权利要求3所述的用途，其中应答于葡萄糖或膳食的消化道K细胞中胰岛素的分泌增加。
9.如权利要求1或3所述的用途，其中所述遗传构建物或多核苷酸包括载体。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述载体包括病毒载体。
11.制备应答于葡萄糖或膳食产生胰岛素的消化道K细胞的体外或离体方法，包括：
(a)在允许细胞体外或离体转化的条件下，将消化道K细胞或能分化为消化道K细胞的干细胞与包含与编码胰岛素的核酸有效连接的葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)启动子的多核苷酸接触；和
(b)鉴定受葡萄糖或膳食调节产生胰岛素的细胞转化体，从而制备应答于葡萄糖或膳食产生胰岛素的消化道K细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述消化道K细胞获自患者。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述患者是人。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述消化道K细胞获自胃肠道组织或器官，或所述消化道K细胞来源于消化道来源的细胞系。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述组织是胃或十二指肠。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述多核苷酸包括载体。
17.受葡萄糖或膳食调节产生胰岛素的分离或培养的消化道K细胞，其中由包含与编码胰岛素的核酸有效连接的葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)启动子的转基因实现胰岛素的表达。
18.如权利要求17所述的消化道K细胞，其中所述消化道K细胞获自患者。
19.如权利要求18所述的消化道K细胞，其中所述患者是人。
20.如权利要求17所述的消化道K细胞，其中所述消化道K细胞获自胃肠道组织或器官，或所述消化道K细胞来源于消化道来源的细胞系。
21.如权利要求20所述的消化道K细胞，其中所述组织是胃或十二指肠。
22.如权利要求17所述的消化道K细胞，其中所述转基因包括载体。
23.通过权利要求11所述的方法制备的分离的消化道K细胞，其中该细胞应答于葡萄糖或膳食产生胰岛素。
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