CN102164618A - 用于体内转染肠细胞的非病毒组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能保护核酸并将所述核酸递送入肠粘膜细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒。提供用于在肠粘膜细胞表达治疗性核酸的组合物和方法。也提供用于从肠粘膜的细胞系统地递送治疗性蛋白的组合物和方法。

Description

用于体内转染肠细胞的非病毒组合物和方法
技术领域
本发明涉及基于壳聚糖的纳米颗粒和核酸载体。另外，本发明涉及在体内转染肠细胞的方法。
背景技术
壳聚糖是无毒的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺的阳离子共聚物，所述共聚物具有良好的粘膜粘着特性，并已被广泛用于可控的药物递送。壳聚糖的粘膜粘着性被认为延长了相关药物在胃肠道的停留时间，因此增加了其生物利用度。(Kotze AF，Luessen HL，Thanou M，VerhoefJC，de Boer AG，Juninger HE，Lehr CM.Chitosan and chitosanderivatives as absorption enhancers for peptide drugs across mucosalepithelia(作为用于肽类药物跨粘膜上皮的吸收增强剂的壳聚糖和壳聚糖的衍生物).Mathiowitz E，Chickering DE，Lehr CM，eds.BioadhesiveDrug Delivery Systems(生物粘着药物递送系统).New York，NY：Marcel Dekker；1999.)
几个团体已经探究了壳聚糖作为DNA递送载体的潜力，且许多壳聚糖/DNA复合物的特性也已被检测以试图确定能良好适合基因转染的组合物。已发现所述复合物在溶解性、聚合倾向、复合物稳定性、颗粒大小、释放DNA的能力以及转染效率的其他特性中是不同的。大分子量的壳聚糖在生理PH下是相对不溶的，但溶于酸性溶液以备用。一旦形成，含有大分子量的壳聚糖和DNA的复合物是相对稳定的，但已被报道转染效率低下，这可能是由于DNA摄取和释放差导致。低分子量的壳聚糖/DNA复合物在溶液中更为可溶但较不稳定。据报道低分子量的壳聚糖聚合物与DNA形成不稳定的复合物，如在电场中分离(琼脂糖凝胶电泳)所提示的那样。这些复合物在体外也显示了低转染效率和低水平的报告基因表达(例如，Koping-Hoggard et al.，Gene Then，8:1108-1121，2001；MacLaughlin，et al.，J Control Release.1998Dec4；56(1-3):259-72；Sato et al.，Biomaterials，22:2075-2080，2001；US2005/0170355；US2005/0164964)。实验也显示，低分子量的壳聚糖/DNA复合物在用盐或血清刺激的应答中倾向释放DNA，提示它们不能很好地适合许多体内应用。
壳聚糖分子量对体外转染效率的影响的研究还不明确。一些研究显示，对20-200kDa大小范围内的壳聚糖聚合物而言，转染效率对分子量没有明显的依赖(Koping-Hoggard et al.，上述；MacLaughlin et al，上述)。但其他人(Sato etal.，上述)报道，与>100kDa的壳聚糖聚合物相比，15kDa和52kDa的壳聚糖显示更高的体外报告基因表达，且1.3kDa的壳聚糖聚合物是无效的。而且，体外和体内转染效率之间的不一致经常被报道(例如，Koping-Hoggard et al.，Gene Ther.2004Oct；11(19):1441-52；US2005/0170355；US2005/0164964)。
许多研究已经检测了大分子量壳聚糖/DNA复合物转导胃肠道细胞的能力。将合并溶内体(endosomolytic)肽的壳聚糖/DNA复合物直接给予上部的小肠，显示盲肠已在上皮细胞、派尔集合淋巴结(Peyer′spatches)和肠系膜淋巴结产生报告基因表达(MacLaughlin et al.，上述)。另外，已显示口服壳聚糖与编码促红细胞生成素的DNA的复合物产生瞬时的红细胞压积增加(Chen et al.，World J.Gastroenter.，10:112-116，2004)。在食物过敏模型中，壳聚糖已经被用于口部递送编码花生变应原蛋白Arah2的DNA以试图使小鼠耐受摄取花生提取物(Roy et al.，Nat.Med.，5:387-391，1999)。总之，相对低转染效率和低水平的转基因表达已被报道，部分由于低的DNA摄取和释放，也部分由于肠道内细胞的迅速更新。肠道上皮是体内更新最迅速的组织之一，上皮细胞每3-5天更新。重要的是，肠道粘膜细胞的转基因表达由于腔粘膜细胞寿命短的这一事实又是复杂的，一旦它进入细胞核，提供短暂时期的DNA的表达。
其他研究组已经以多种方式化学修饰壳聚糖，以试图开发具有改善的转染效率以及诸如转导远端肠道组织的能力的其他所需特性的DNA复合物。Kai等人在他们的报告中指出已经离开胃部且已进入较为中性的十二指肠环境的壳聚糖/DNA组合物失去了具有辅助改变PH的正电荷，并由此倾向释放相关的DNA。Kai等人报道冻干的大分子量的壳聚糖/DNA复合物的N-乙酰化作用稳定了口部递送的复合物，且增加了远端肠道转导的效率。Kai et al.，Pharm.Res.21:838-843，2004。
考虑到腔内肠粘膜细胞的寿命，通过壳聚糖递送到肠粘膜的基因的长期表达还没有被报道可能并不令人吃惊。此外，壳聚糖DNA复合物转染诸如内分泌细胞的较不常见的肠粘膜细胞类型的能力还没有被详细检测。与实现肠内分泌细胞的长期表达和转染相关的困难可由考虑到肠道结构而被理解。
胃肠道壁由四层组成。所述肠道最内层是粘膜层，其由与腔接界的被覆上皮组成。所述上皮是身体与摄取物质相互作用的部位。在影响吸收的胃肠道区域，所述上皮是单层细胞厚度。所述上皮位于基底层，其进一步覆盖固有层。在所述肠道的吸收区域下方，以固有层的长度布满了毛细血管床，而且吸收的食物原料的加工产物是进入这些血管。
人小肠由三部分组成：十二指肠、空肠和回肠。所述小肠的粘膜广泛折叠，当环状折叠突入肠腔时，使它有一个褶饰边的外观。这种折叠填充了所述小肠腔的大部分面积，且使上皮的吸收表面积增加了几倍。在腔表面，所述小肠粘膜的折叠出现绒毛，所述绒毛是进一步增加吸收面积的粘膜的外翻部分。每一绒毛进一步由一个细胞厚度的上皮覆盖。该上皮绝大多数由吸收性肠细胞构成，该细胞在它们的顶(腔)面分布有数千个短的微小绒毛，使吸收面积再次增加了许多倍。被称为糖萼的所述微小绒毛的外表面是细丝状的并富有碳水化合物。这个膜区域也富有有助于被消化的物质降解和吸收的多种酶和转运系统。
吸收性肠细胞构成了超过90％的所述绒毛的上皮细胞和甚至更大比例的所述腔的表面积。分散在这些细胞之中的是数目相对较小的内分泌细胞，据报道其构成大约0.3％的所述绒毛上皮。与其呈现大的和超结构的复合物顶表面的吸收性肠细胞相比，内分泌细胞有与所述固有层毛细管并列的宽阔的基底表面，且面向腔时变得极窄。
比肠道粘膜的内分泌细胞更难以想到的是肠道粘膜的前体细胞。在凸出的绒毛下面，在内衬于隐窝深处的上皮中，存在产生粘膜的主要细胞类型的前体细胞，包括吸收性肠细胞和肠内分泌细胞。所述绒毛上皮层形成大约每三天就更新的短寿命分化上皮细胞的连续层，且上皮的维持需要大量细胞的分裂和分化。所述隐窝的前体细胞产生从所述隐窝迁移出到绒毛并进行分化的子代。
通常肠内分泌细胞特征在于对信号或刺激物(“促分泌素”)应答时分泌合成的蛋白进入血液的能力。内分泌细胞的特定实例包括K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞。
K细胞主要位于胃、十二指肠和空肠。这些内分泌细胞分泌激素GIP，其正常功能是促进餐后胰岛素的释放。
肠内分泌细胞通常，且特别是K细胞，是用于转基因递送的有吸引力的细胞靶标。这些细胞具有加工许多蛋白前体的能力，并且具有提供调节的分泌蛋白进入系统循环响应信号的细胞机制。这些特性以前已被利用(参见Cheung et al.，Science，290:1959-1962，2000；美国专利申请第09/804,409号；通过引用特别并入本文)。用K-细胞特异的葡萄糖反应性胰岛素表达构建体设计的K细胞被观察到表达和分泌胰岛素响应升高的血糖，且能够在糖尿病小鼠模型中恢复正常的葡萄糖耐受。
尽管对壳聚糖作为核酸递送的病毒方式的另一选择有普遍的兴趣，但是低转染效率、稳定性和溶解性问题、体内不可预测性以及只能转染短寿命粘膜细胞已经大大阻止了壳聚糖在肠道严格的环境中作为核酸载体的应用。
发明概述
在一个方面，本发明提供了基于壳聚糖的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括表达在肠粘膜细胞时能够发挥治疗效应的治疗性核酸。这些基于壳聚糖的纳米颗粒提供了治疗或防止多种状况和病症的新的非病毒方法。
本发明公开的是能够在体内的肠粘膜引起治疗性核酸长期表达的基于壳聚糖的纳米颗粒。所述纳米颗粒对治疗性RNA或治疗性蛋白在肠粘膜中长期产生是有用的。
本发明公开的是能够引起由治疗性核酸编码的治疗性蛋白的系统水平增加的基于壳聚糖的纳米颗粒。所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够将生理相关水平的治疗性蛋白递送入血液循环系统。
本发明公开的是能够在体内转染肠粘膜前体细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒。所述纳米颗粒用于肠粘膜内治疗性RNA或治疗性蛋白的长期产生。
本发明公开的是能够体内转染肠内分泌细胞前体细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒。所述纳米颗粒提供了在粘膜细胞类型内治疗性蛋白的产生，所述细胞类型能够加工前体蛋白并以调节的或组成性方式分泌治疗性蛋白进入系统循环。
在本发明的许多优选实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒包括编码能够在非肠组织内发挥治疗效应的治疗性蛋白的治疗性核酸。特别优选的是具有系统活性的治疗性蛋白。
在本发明的许多优选实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒被设计用于治疗性核酸在肠粘膜细胞内的非组成性表达。所述纳米颗粒提供治疗性核酸的动态长期表达。在许多优选实施方案中，纳米颗粒被设计以便提供治疗性核酸在肠粘膜细胞内的可调节表达。
在许多优选的实施方案中，纳米颗粒被设计以便提供治疗性蛋白从肠内分泌细胞的调节的分泌响应促分泌素。
与上述目的一致，在一个方面，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含(i)多个具有3kDa至250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸在表达于肠粘膜细胞时，能够发挥治疗效应，并且其中所述的基于壳聚糖的纳米颗粒能够实现所述治疗性核酸在肠粘膜长于约4天，更优选的是长于约5天，更优选的是长于约6天，更优选的是长于约7天，更优选的是长于约10天，更优选的是长于约2周，更优选的是长于约3周，更优选的是长于约4周，更优选的是长于约6周，更优选的是长于约8周，更优选的是长于约10周，且最优选的是长于约12周的表达。
在一个实施方案中，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒能够在体内转染肠粘膜前体细胞。这种纳米颗粒包含(i)多个具有3kDa至250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包括可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸在肠粘膜细胞表达时，能够发挥治疗效应。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够引起治疗性核酸在肠粘膜长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周的表达。
在一个实施方案中，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒能够增加治疗性蛋白的所述系统水平。这种纳米颗粒包含(i)多个具有3kDa至250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包括可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸在表达于肠粘膜细胞时，能够发挥治疗效应，其中所述治疗性核酸编码从肠粘膜被递送入系统循环的治疗性蛋白。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周的表达。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒基本上由(i)多个具有3kDa至250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体组成，其中所述治疗性构建体包括可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸在表达于肠粘膜细胞时，能够发挥治疗效应。
在优选的实施方案中，本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的所述表达调控区具有非组成性活性，且所述纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸的长期动态表达。在特别的优选实施方案中，所述表达调控区是可调节的，并且所述纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸的长期的可调节的表达。
所述基于壳聚糖的纳米颗粒的壳聚糖聚合物优选具有小于约250kDa，更优选小于230kDa，更优选小于220kDa的平均分子量。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa至约210kDa的平均分子量。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约10kDa至约250kDa的平均分子量。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约10kDa至约210kDa的平均分子量。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa至约50kDa的平均分子量。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa至约6kDa的平均分子量。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约200kDa至约210kDa的平均分子量。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约100:1的胺:磷酸盐(N:P)比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约从1:1至约6:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约4:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约3:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约90:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约50:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约40:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约30:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约60:1至约100:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约70:1至约100:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约20:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约60:1的N:P比。
在优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约5:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约3:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约2:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约45:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约25:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约20:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约15:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约30:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约35:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约10:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约30:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+5mV至+50mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+30mV至+50mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+30mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+32mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+5mV至+25mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+5mV至+8mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于225nm的平均直径的纳米颗粒。
在另一优选实施方案中，所述组合物包含具有80nm至225nm的平均直径的纳米颗粒。
在另一优选实施方案中，所述组合物包含具有80nm至175nm的平均直径的纳米颗粒。
在优选实施方案中，所述组合物具有约1μg/ml至约1.5mg/ml，更优选约1μg/ml至约1mg/ml，更优选约10μg/ml至约1mg/ml，更优选约50μg/ml至约1mg/ml，更优选约100μg/ml至约1mg/ml，更优选约150μg/ml至约1mg/ml，更优选约200μg/ml至约1mg/ml的DNA浓度。
在优选实施方案中，所述组合物的PH小于6.5，更优选小于6.0，且最优选约4.5至约5.5。
在优选实施方案中，所述纳米颗粒的所述壳聚糖聚合物的脱乙酰化程度大于约70％，更优选大于约75％，更优选大于约80％，更优选大于约85％，更优选大于约90％，更优选大于约95％，且最优选至少98％。
在优选实施方案中，所述组合物包含低分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述低分子量纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有3kD至25kD的平均分子量。在优选实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒具有10:1至90:1的N:P比。在优选实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有+30mV至+50mV的平均ζ电位，更优选+30mV至+40mV。在优选实施方案中，低分子量壳聚糖纳米颗粒具有小于175nm的平均直径。
在另一个优选实施方案中，所述组合物包含高分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述高分子量纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有25kD至250kD的平均分子量。在优选实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有2:1至40:1的N:P比。在优选实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有+5mV至+25mV的平均ζ电位。在优选的实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有小于225nm的平均直径。在优选的实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有1:1至30:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在特别优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有约3.9kD的平均分子量，且脱乙酰化程度约98％。在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约25μg/ml至约100μg/ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约40:1至约80:1的N:P比，最优选约60:1的N:P比。在优选实施方案中，所述纳米颗粒具有20:1至40:1的壳聚糖与核酸的重量比，最优选30:1的重量比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有约3.9kD的平均分子量，且脱乙酰化程度约98％。在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约200μg/ml至约1mg/ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约10:1至约30:1的N:P比，最优选约20:1的N:P比。在优选实施方案中，所述纳米颗粒具有5:1至15:1，最优选10：1的重量比的壳聚糖与核酸的重量比。
在优选的实施方案中，本发明的纳米颗粒能够转染所述小肠的肠粘膜前体细胞。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够转染十二指肠、空肠或回肠的肠粘膜前体细胞。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够转染胃的肠粘膜前体细胞。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够转染结肠的肠粘膜前体细胞。
在优选实施方案中，所述纳米颗粒能够转染肠内分泌细胞前体细胞。在优选实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞能够产生选自K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞的肠内泌细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞是K细胞前体细胞。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒缺乏内吞溶酶体肽。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性RNA。在优选的实施方案中，所述治疗性RNA是siRNA、反义RNA、短发夹RNA或酶性RNA。
在优选实施方案中，所述纳米颗粒的所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。在特别优选的实施方案中，所述治疗性蛋白是分泌的治疗性蛋白。优选地，所述纳米颗粒能够增加所述分泌的治疗性蛋白的系统水平。优选地，所述纳米颗粒能够引起所述分泌的治疗性蛋白的所述系统水平的长期增加。在一个实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的系统水平的长期增加是静态的。在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的系统水平的长期增加是动态的。
在优选实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白，所述蛋白选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响炎症的因子以及影响骨形成的因子。特别优选编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、葛瑞林(Ghrelin)、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、红细胞生成素、炎症抑制因子、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFα拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗性核酸。在优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码分泌的治疗性蛋白。在优选实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白能够通过调节的分泌从肠内分泌细胞分泌。在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白能够从肠内分泌细胞被分泌响应优选是营养物的促分泌素。在特别优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白在应答葡萄糖时能够从肠内分泌细胞被分泌。
在一个实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒包含两种或更多不同的治疗性核酸。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区不包含CMV启动子。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区不包含病毒启动子。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含非组成性启动子。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含肠特异的调控序列。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含粘膜细胞特异的调控序列。
在优选实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含肠内分泌细胞特异的调控序列。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含诱导型启动子。在一个实施方案中，所述启动子可通过小分子化合物调节。在另一实施方案中，所述启动子是营养物可调节的启动子。在一个实施方案中，所述营养物可调节的启动子由葡萄糖调节。在特别优选的实施方案中，所述营养物可调节的启动子是GIP启动子。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性构建体还包含整合序列。在一个实施方案中，所述治疗性构建体包含单一的整合序列。在另一个实施方案中，所述治疗性构建体包含第一和第二整合序列，所述第一和第二整合序列侧邻着可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区(即，所述表达调控区与治疗性核酸在一起)。在优选实施方案中，所述整合序列是与选自水手(mariner)、睡美人(sleeping beauty)、FLP、Cre、ΦC31、R、λ的整合元件以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件结合起作用的。
在优选实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒除了包括治疗性构建体之外，还包括非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到第二表达调控区的整合元件的核酸序列，所述第二表达调控区在肠粘膜前体细胞中是有功能的。该第二表达调控区和可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区可以相同或不同。所述编码的整合元件优选选自水手、睡美人、FLP、Cre、ΦC31、R、λ、以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒基本上由(i)多个具有3kD至250kD的平均分子量的壳聚糖聚合物，(ii)治疗性构建体以及(iii)非治疗性构建体组成，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸表达于肠粘膜细胞内时能够发挥治疗效应，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到第二表达调控区的整合元件的核酸序列，所述第二表达调控区在肠粘膜前体细胞是有功能的。
在一个方面，所述发明提供能够体内转染肠粘膜前体细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒，所述颗粒包括(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到在肠粘膜前体细胞内有功能的表达调控区的整合元件的核酸。所述被编码的整合元件优选选自水手、睡美人、FLP、Cre、ΦC31、R、λ以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒基本上由(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体组成，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到表达调控区的整合元件的核酸，所述表达调控区在肠粘膜前体细胞内是有功能的。
在一个方面，本发明提供用治疗性核酸体内转染肠粘膜细胞的方法，所述方法包括将体内肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
在优选的实施方案中，所述方法包括接触所述小肠的粘膜。在优选的实施方案中，所述方法包括将十二指肠、空肠或回肠的粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
在优选的实施方案中，所述方法包括将所述胃的粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
在优选的实施方案中，所述方法包括将所述结肠的粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
在优选的实施方案中，所述基于壳聚糖的纳米颗粒转染所述肠粘膜的肠粘膜前体细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是肠内分泌细胞前体细胞。在优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞产生选自K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞的肠内泌细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞产生K细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述小肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述十二指肠、空肠或回肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述胃的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述结肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞产生表达治疗性核酸的粘膜细胞。
在一个实施方案中，所述治疗性核酸编码治疗性RNA。
在优选的实施方案中，所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白是分泌的治疗性蛋白。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白，所述蛋白选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响炎症的因子以及影响骨形成的因子。特别优选编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、葛瑞林、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、红细胞生成素、炎症抑制因子、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFα拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗性核酸。在一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。
在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白在肠粘膜细胞内产生并且进入系统循环以致所述治疗蛋白的系统水平增加。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白通过调节的分泌被释放入系统循环。
在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周。
在一个实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加是静态的。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加是动态的。
在一个实施方案中，所述方法包括将所述体内肠粘膜与第一基于壳聚糖的纳米颗粒和第二基于壳聚糖的纳米颗粒接触。所述第一基于壳聚糖纳米颗粒能够在体内转染肠粘膜前体细胞并且包含(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含治疗性核酸和整合序列，所述治疗性核酸可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区。所述第二基于壳聚糖纳米颗粒能够在体内转染肠粘膜前体细胞并且包含(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到其在肠粘膜前体细胞内有功能的表达调控区的整合元件的核酸。不受理论的限制，可以用所述第一和第二纳米颗粒转染在肠粘膜内的肠粘膜前体细胞。所述第二纳米颗粒的核酸被表达在肠粘膜前体细胞内以产生整合元件，由此所述整合元件将可操作连接到由所述第一纳米颗粒提供的表达调控区的治疗性核酸整合入所述肠粘膜前体细胞的基因组。
在另一实施方案中，所述方法包括将体内肠粘膜与基于壳聚糖的纳米颗粒接触，所述纳米颗粒包含(i)多个壳聚糖聚合物、(ii)治疗性构建体以及(iii)非治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞有功能的表达调控区的治疗性核酸和整合序列，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到在肠粘膜前体细胞有功能的表达调控区的整合元件的核酸序列。不受理论的限制，可以使用所述纳米颗粒转染肠粘膜内的肠粘膜前体细胞。所述编码整合元件的核酸被表达在肠粘膜前体细胞内以产生整合元件，由此所述整合元件将可操作连接到表达调控区的所述治疗性核酸整合入所述肠粘膜前体细胞的基因组。
应了解取决于预期使用的特定整合元件，用于促进整合的治疗性和非治疗性构建体的最优比可以变化。在没有不适当的实验情况下，治疗性与非治疗性构建体的最优比由本领域的技术人员做出决定。
在一个方面，本发明提供实现治疗性核酸在哺乳动物肠粘膜细胞内长期表达的方法。所述方法包括将哺乳动物的所述肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触，其中所述纳米颗粒包括治疗性核酸，且其中所述治疗性核酸被表达在所述哺乳动物的肠粘膜细胞中。
在一个实施方案中，所述方法包括本发明的纳米颗粒的所述用途，所述纳米颗粒包括治疗性构建体和非治疗性构建体。
在一个实施方案中，所述方法包括本发明的两个纳米颗粒的用途，第一纳米颗粒包含治疗性构建体，且第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。
在一个方面，本发明提供增加哺乳动物内分泌的治疗性蛋白的系统水平的方法。所述方法包括将哺乳动物的肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触，其中所述纳米颗粒包括编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸，其中所述分泌的治疗性蛋白在所述肠粘膜的粘膜细胞内产生，且其中所述在肠粘膜内产生的分泌的治疗性蛋白进入系统循环以致所述分泌的治疗性蛋白的所述系统水平是增加的。
在一个实施方案中，所述方法包括本发明的纳米颗粒的用途，所述纳米颗粒包括治疗性构建体和非治疗性构建体。
在一个实施方案中，所述方法包括本发明的两个纳米颗粒的用途，第一纳米颗粒包含治疗性构建体，且第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。
在一个方面，本发明提供治疗患有可由增加治疗性蛋白的所述系统水平治疗的疾病或状况的患者的方法。所述方法包括将患者的肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触，其中所述纳米颗粒包括编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸，其中所述分泌的治疗性蛋白在所述患者的所述肠粘膜的粘膜细胞内产生，且其中产生在所述粘膜细胞内的分泌的治疗性蛋白进入系统循环以致所述分泌的治疗性蛋白的系统水平增加到治疗有效水平。
在优选的实施方案中，所述疾病是代谢性疾病。
在优选的实施方案中，所述疾病是糖尿病。
在另一个优选的实施方案中，所述状况是病态肥胖。
在另一个优选的实施方案中，所述状况是生长缺陷。
在优选的实施方案中，经口给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，通过内窥镜给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，通过直肠给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是肠内分泌细胞。在优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞选自K-细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞是K细胞。
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是所述小肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是十二指肠、空肠或回肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是胃的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是结肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白，所述蛋白选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响炎症的因子以及影响骨形成的因子。特别优选编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、葛瑞林、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、红细胞生成素、炎症抑制因子、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFα拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗性核酸。在优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。
在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白通过调节的分泌被从肠内分泌细胞释放。
在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的所述系统水平的增加长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周。
在一个实施方案中，所述方法包括本发明的纳米颗粒的用途，所述纳米颗粒包括治疗性构建体和非治疗性构建体。
在一个实施方案中，所述方法包括本发明的两个纳米颗粒的用途，第一纳米颗粒包含治疗性构建体且第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。
在一个方面，本发明提供包括本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明提供能够增加所述治疗性蛋白的系统水平的药物组合物。这种药物组合物包含本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸。
在一个实施方案中，所述药物组合物包括本发明的两种或多种不同的治疗性核酸。
在一个实施方案中，所述药物组合物包括本发明的第一基于壳聚糖的纳米颗粒，以及本发明的第二基于壳聚糖的纳米颗粒，其中所述第一和第二纳米颗粒包含不同的治疗性核酸。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含本发明的治疗性构建体和非治疗性构建体。
在一个实施方案中，所述药物组合物包括本发明的第一基于壳聚糖的纳米颗粒和本发明的第二基于壳聚糖的纳米颗粒，其中所述第一纳米颗粒包含治疗性构建体，以及第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。
在优选的实施方案中，所述药物组合物能够增加所述治疗性蛋白的系统水平长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周。
在优选的实施方案中，可以通过口部给予所述药物组合物。
在优选的实施方案中，可以通过内窥镜给予所述药物组合物。
在优选的实施方案中，可以通过直肠给予所述药物组合物。
在一个方面，本发明提供修饰的肠粘膜细胞，所述修饰的肠粘膜细胞通过根据本文公开的方法将体内的肠粘膜与基于壳聚糖的纳米颗粒接触而产生。
在一个方面，本发明提供产生本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的方法。在一个实施方案中，提供了产生能够引起治疗性核酸在肠粘膜细胞内长期表达的纳米颗粒的方法。所述方法包括纳米颗粒制备混合物的形成。
在优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。
在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约210kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。
在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约10kDa至约250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。
在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约10kDa至约210kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。
在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约50kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。
在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约6kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。
在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约200kDa至约210kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约100:1的胺：磷酸盐(N:P)比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约6:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约4:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约3:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约90:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约50:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约40:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约30:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约60:1至约100:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约70:1至约100:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约20:1的N:P比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约60:1的N:P比。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约5:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约3:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约2:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约45:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约25:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约20:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约15:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约30:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约35:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约10:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约30:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在一个方面，本发明提供通过本文公开的纳米颗粒制备方法生产的基于壳聚糖的纳米颗粒。
在一个方面，本发明提供制备用于治疗可由增加分泌的治疗蛋白的系统水平治疗的疾病或状况的药剂的方法。所述方法包括生产本文公开的基于壳聚糖的纳米颗粒的方法。
附图简要说明
图1显示了用包括所标明的多种分子量的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒体外转染293T细胞的结果。
图2显示用包括所标明的多种分子量的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒体内转染鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果。
图3显示用包括所标明的多种分子量的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒且以多种N:P比在体内转染鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果。
图4显示用N:P比为2.85:1的RCO5基于壳聚糖的纳米颗粒在体内转染鼠十二指肠的肠粘膜细胞与用FIV和AAV颗粒转导相比的结果。
图5显示用N:P比为60:1的P1基于壳聚糖的纳米颗粒在体内转染(单次给予)鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果，其中所述纳米颗粒包括EF1α-SEAP的构建体。显示了不同时间点时血中SEAP蛋白的水平。
图6显示用N:P比为60:1的P1基于壳聚糖的纳米颗粒在体内转染(单次给予)鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果，其中所述纳米颗粒包含(i)CMV-lacZ整合构建体(pMM2611-β-gal)，以及(ii)CMV-Mariner表达构建体(pCMV-C9.gck)。显示了转染后14天的基因拷贝数。
图7A显示使用的带有水手转座酶的CMV-lacZ整合构建体(pMM2611-β-gal)的示意图。图7B显示水手表达构建体(pCMV-C9.gck)的示意图。
图8显示在递送后2天壳聚糖介导的基因转移到小鼠十二指肠粘膜细胞的结果，以及使用ΦC31时在递送后14天的持续性结果。
图9显示单次给予携带GIP-hINS基因的xΦ-GEMSTM以实现人胰岛素在小鼠的长期系统的产生的结果。
图10显示用携带GIP-胰岛素基因的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的小鼠的葡萄糖和进餐应激结果。
图11显示矩阵研究的结果，所述矩阵研究分析用携带GIP-hINS基因的不同的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的小鼠中人C-肽随着时间的产生。
图12显示用携带GIP-hINS基因的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的猪十二指肠在递送后7天人胰岛素mRNA测量的结果。
图13显示矩阵研究的结果，所述矩阵研究分析用携带GIP-hINS基因的不同的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的猪中人胰岛素的产生。
图14显示通过经口递送壳聚糖包裹的DNA多聚物转化胃粘膜细胞。在口服载体后2天，小鼠胃粘膜的胰岛素和SEAP基因表达的水平。NTC＝非处理对照，T＝处理的动物。
详细说明
肠粘膜细胞
如本文所使用的“肠粘膜细胞”指所述肠粘膜的细胞。内分泌细胞、非内分泌细胞以及其前体都包括在肠粘膜细胞之中。肠粘膜前体细胞包括干细胞。肠粘膜前体细胞是所述肠粘膜的分化细胞类型的直接或间接的前体。肠粘膜前体细胞包括未分化的肠粘膜细胞。肠粘膜前体细胞产生所述肠粘膜的主要细胞类型，包括内分泌细胞和非内分泌细胞。肠内分泌细胞前体细胞是例如K细胞的肠内分泌细胞的肠粘膜细胞的前体。
肠粘膜细胞的特定实例包括诸如K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞、Gr-细胞的内分泌细胞和诸如吸收性肠细胞的非内分泌细胞。内分泌细胞的一般特征是它们分泌合成蛋白进入血液响应信号或刺激物(“促分泌素”)的能力。一般认为非内分泌细胞不会分泌合成蛋白进入血液响应信号或刺激物。
用于本发明的特别优选的肠内分泌细胞是K细胞(Sandstrom O.，El-Salhy M.，Mech.Ageing Dev.108:39(1999))。
几种类型的肠内分泌细胞以及通常由此产生的蛋白的部分目录显示于表1中。
表1
细胞类型 肽
G-细胞 胃泌素
D-细胞 生长抑制素
K-细胞 葡萄糖依赖性促胰岛素多肽
L-细胞 GLP-1GLP-2
I-细胞 胆囊收缩素
Mo-细胞 促胃动素
Gr-细胞 葛瑞林
基于壳聚糖的纳米颗粒
所用“基于壳聚糖的纳米颗粒”或“DNA/壳聚糖颗粒”是指包括多个壳聚糖聚合物和DNA分子的复合物。“多聚物(Polyplex)”与本文的“基于壳聚糖的纳米颗粒”可交换使用。所述基于壳聚糖的纳米颗粒的壳聚糖聚合物优选具有小于约250kDa的平均分子量。在所述基于壳聚糖的纳米颗粒中的DNA分子被递送到体内细胞。基于壳聚糖的纳米颗粒在本文中经常被称为纳米颗粒。
如本文中所使用的，壳聚糖聚合物的平均重量指重量平均分子量。
在一个实施方案中，壳聚糖通过Richardson et al.，Int.J.Pharmaceutics，178:231-243，1999的方法获得。
在一个实施方案中，如下生产高分子量的基于壳聚糖的纳米颗粒。将分别准备的质粒DNA和壳聚糖溶液调整到等于所需终浓度的两倍的浓度。DNA在水中或50mM的硫酸钠溶液中被稀释。所需分子量的壳聚糖聚合物制剂被溶于pH为5.5的5mM的醋酸钠中，所述壳聚糖聚合物制剂包括优选具有小于250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。两种溶液在被组合以形成基于壳聚糖的纳米颗粒制剂混合物之前在55℃孵育5分钟。等体积的所述两种溶液被混合且被迅速涡旋30秒以形成DNA/壳聚糖颗粒。该制剂在使用之前可以在多种缓冲液中被进一步稀释。本发明的所述纳米颗粒的生产不需要冻干且在乙酰化反应中不需要使用冻干的产物。
在优选实施方案中，如下生产基于壳聚糖的纳米颗粒，特别是低分子量的基于壳聚糖的纳米颗粒。将壳聚糖粉末加入到0.5％的醋酸水溶液中直至所述壳聚糖工作液的PH达到4.8。然后将所述工作液通过膜过滤器(Acrodisc0.2μm孔径，Pall Life Sciences)过滤。质粒A和质粒B的储存DNA溶液(溶于1xTE)以质粒A对质粒B的5:1比混合，在水中稀释，然后通过膜过滤器(Acrodisc0.2μm孔径，Pall LifeSciences)过滤以产生所述DNA工作液。进一步的细节参见实验部分。
所述基于壳聚糖的纳米颗粒的壳聚糖聚合物优选具有小于约250kDa的平均分子量，更优选小于230kDa，更优选小于220kDa。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa至约250kDa的平均分子量。在本发明的优选纳米颗粒中，壳聚糖聚合物平均分子量的其他范围包括3至6kDa、3至10kDa、3至50kDa、3至210kDa、10至210kDa、10至250kDa和210至250kDa。
所述基于壳聚糖纳米颗粒制剂混合物中优选的DNA浓度是在约1μg/ml至约1.5mg/ml的范围，更优选约10μg/ml至约1mg/ml，更优选约25μg/ml至约1mg/ml，更优选约50μg/ml至约1mg/ml，更优选约100μg/ml至约1mg/ml。
所述基于壳聚糖的纳米颗粒制剂混合物中优选的壳聚糖浓度是在0.001％至1.0％的重量比的范围内。
在优选的实施方案中，所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有从约1:1至约100:1的胺：磷酸盐(N:P)比。本发明的优选基于壳聚糖的纳米颗粒的其他N:P比范围包括约1:1至约6:1，约1:1至约4:1，约10:1至约90:1，约10:1至约50:1，约10:1至约40:1，约10:1至约30:1，约60:1至约100:1，以及约70:1至约100:1。
通过改变所述壳聚糖乙酰化的程度可以改变壳聚糖的胺含量。用于本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的所述壳聚糖聚合物优选具有70％至100％，更优选80％至100％，更优选90％至100％的脱乙酰化。
在优选的实施方案中，所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有从约1:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。优选的基于壳聚糖的纳米颗粒的其他壳聚糖与核酸的重量比范围包括约1:1至约5:1，约1:1至约3:1，约5:1至约45:1，约5:1至约25:1，约5:1至约20:1，约5:1至约15:1，约30:1至约50:1，以及约35:1至约50:1。
在优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+5mV至+50mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+30mV至+50mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+30mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+32mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+5mV至+25mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+5mV至+8mV的平均ζ电位的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于225nm的平均直径的纳米颗粒。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含具有80nm至225nm的平均直径的纳米颗粒。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含具有80nm至175nm的平均直径的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，所述组合物具有约1μg/ml至约1.5mg/ml，更优选约1μg/ml至约1mg/ml，更优选约10μg/ml至约1mg/ml，更优选约50μg/ml至约1mg/ml，更优选约100μg/ml至约1mg/ml，更优选约150μg/ml至约1mg/ml，更优选约200μg/ml至约1mg/ml的DNA浓度。
在优选的实施方案中，所述组合物具有低于6.5，更优选低于6.0，且最优选约4.5至约5.5的PH。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的壳聚糖聚合物具有大于约70％，更优选大于约75％，更优选大于约80％，更优选大于约85％，更优选大于约90％，更优选大于约95％，且最优选至少98％的脱乙酰化度。
在优选的实施方案中，所述组合物包含低分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述低分子量纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有3kDa至25kDa的平均分子量。在优选的实施方案中，低分子量纳米颗粒具有10:1至90:1的N:P比。在优选的实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有+30mV至+50mV，更优选+30mV至+40mV的平均ζ电位。在优选的实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒具有小于175nm的平均直径。
在另一个优选实施方案中，所述组合物包括高分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述高分子量的纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有25kDa至250kDa的平均分子量。在优选的实施方案中，高分子量壳聚糖纳米颗粒具有2:1至40:1的N:P比。在优选的实施方案中，高分子量壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有5mV至25mV的平均ζ电位。在优选的实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有小于225nm的平均直径。在优选的实施方案中，高分子量壳聚糖纳米颗粒具有1:1至30:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在特别优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有约3.9kDa的平均分子量以及约98％的脱乙酰化度。在优选的实施方案中，所述组合物包括具有小于175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约25μg/ml至约100μg/ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约40:1至约80:1的N:P比，最优选约60:1的N:P比。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有20:1至40:1的壳聚糖与核酸的重量比，最优选30:1的重量比。
在另一优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有约3.9kDa的平均分子量以及约98％的脱乙酰化度。在优选的实施方案中，所述组合物包括具有小于175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约200μg/ml至约1mg/ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约10:1至约30:1的N:P比，最优选约20:1的N:P比。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有5:1至15:1的壳聚糖与核酸的重量比，最优选10:1的重量比。
可以被使用或添加以改变转染效率的操作或特征包括溶酶体溶解(lysosomolytic)试剂在纳米颗粒中的共络合，尽管溶酶体溶解剂不是必需的。包括附加的共络合的治疗剂的组合纳米颗粒是被包括的。这些附加试剂和溶酶体溶解剂可以在络合形成过程中被共络合。
另外，所述纳米颗粒的稳定性可以通过交联改变。
另外，配体或靶部分可以偶联到或以别的方式连接到纳米颗粒以增强特异性或例如通过受体介导的内吞作用的摄取。
在许多优选的实施方案中，本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒能够产生治疗性核酸在肠粘膜细胞内的长期表达。分化的肠粘膜细胞通常是短寿命的。正如本文所使用的，粘膜细胞内的长期表达指一个或多个粘膜细胞内的表达，而且粘膜内的表达优选多于约4天。不受理论的限制，在本发明中粘膜细胞转染的优选位置的小肠的环境中，本发明的纳米颗粒可以进入所述肠粘膜的隐窝并转染肠粘膜前体细胞。相对于终末分化和短寿命的粘膜细胞的转染，这提供了治疗性核酸的长期表达。另外，在治疗性构建体包含整合序列的实施方案中，所述纳米颗粒提供了所述治疗性核酸进入前体细胞(包括干细胞)的基因组的基因整合，且在优选的实施方案中，提供了治疗性核酸在起源于所述前体细胞的一系列分化的粘膜细胞内的长期表达。因此，如本文使用的，粘膜细胞内的长期表达并不一定指在相同细胞内的持续表达。
在一些实施方案中，治疗性构建体的所述表达调控区具有组成性活性，提供治疗性核酸的所述静态表达。在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的所述表达调控区不具有组成性活性。这提供了治疗性核酸的动态表达。所用“动态”表达是指随着时间变化的表达。这种随时间的表达可以包括无表达期或检测不到的表达期，在所述无表达或检测不到的表达期间，治疗性核酸存在于粘膜细胞，但没有表达或没有在可检测的水平表达。动态表达可以包括几种这样的由可检测表达期分开的低或无表达期。在许多优选的实施方案中，所述治疗性核酸被可操作连接到可调节的启动子。这提供了所述治疗性核酸的可调节表达。
引起治疗性核酸长期表达的能力是许多优选的本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的鉴别特征。所述产生长期表达的能力指优选的纳米颗粒在单次给予后引起长期表达的能力，尽管本文的一些方法包括基于壳聚糖的纳米颗粒的重复给予。特别地，在纳米颗粒能够引起治疗性核酸的长期表达的实施方案中，这种治疗性核酸的长期表达可以是动态的，具有低表达或检测不到的表达期。
表达调控区
表达调控区包括影响可操作连接的治疗性核酸的表达的诸如启动子和增强子的调节多核苷酸(本文中有时被称为元件)。优选的表达调控区是在肠组织或特定的肠组织细胞类型中选择性活化的那些。
在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的表达调控区包括肠特异性启动子。肠特异性启动子在肠粘膜细胞及潜在的其他肠细胞内显示活性。在优选的实施方案中，肠特异性启动子在广泛多样的其他组织中并不显示基本活性。在广泛多样的细胞类型中显示活性的诸如CMV启动子的病毒启动子不是肠特异性启动子。肠特异性启动子可以显示组成性或非组成性活性。特别优选的是可调节的肠特异性启动子。
例如，胰高血糖素原基因的启动子包括肠特异的元件且可以用于本发明(Lee，Y.C，et al.J Biol.Chem.267:10705(1992)；Gajic andDrucker，Endocrinol.132:1055(1993)。
在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的表达调控区包括肠粘膜细胞特异的启动子。肠粘膜细胞特异性启动子在肠粘膜细胞内显示活性。在优选的实施方案中，肠粘膜细胞特异性启动子在其他肠细胞或广泛多样的其他组织中不显示基本活性。
在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的表达调控区包含肠内分泌细胞特异的启动子。特别优选的是可调节的内分泌细胞特异的启动子。所述GIP启动子是可调节的肠内分泌细胞启动子的具体实例(参见U.S.S.N.09/804,409，其整体以引用的方式被清楚地并入本文)。所述GIP启动子是葡萄糖可调节的，并且能赋予可操作连接的治疗性核酸以葡萄糖可调节的内分泌细胞特异的表达。
可以被用于本发明的肠特异性启动子的其他实例列于表2中。这些启动子的许多也是可调节的。该列表仅是示例性的，并不意图详尽用于本发明的所有可能的肠特异性启动子。
表2用于将蛋白的表达靶向肠内分泌细胞的示例性启动子和增强子
用于将蛋白的表达靶向肠内分泌细胞的示例性启动子和增强子
葡萄糖激酶
嗜铬粒蛋白A和B
葡萄糖依赖性促胰岛素多肽
胆囊收缩素
胰高血糖素原
腺苷脱氨酶
分泌素
胃泌素
生长抑制素
促胃动素
葛瑞林
蔗糖酶-异麦芽糖酶
优选的表达调控区赋予可操作连接的治疗性核酸可调节的表达。信号(有时被称为刺激)能够增加或减少可操作连接到这种表达调控区的治疗性核酸的表达。增加表达响应信号的这种表达调控区通常被称作可诱导的。减少表达响应信号的这种表达调控区通常被称作可阻遏的。通常，由这种元件赋予的所述增加或减少量与存在的信号量成比例，所述信号量越大，所述表达的增加或减少就越明显。
本领域已知许多可调节的启动子。优选的可诱导表达调控区包括包含被用小分子量的化合物刺激的可诱导启动子的那些。在一个实施方案中，表达调控区对被经口递送但通常并不存在于食物的化合物是有反应的。例如，在美国专利第5,989,910、5,935,934、6,015,709和6,004,941号中可以找到特定的实例。
特别优选的表达调控区是增加或减少可操作连接的治疗性核酸的表达响应营养物存在的调控区，其中所述表达的调控区被称为“营养可调节的”。营养可调节的表达调控区通常在缺乏所述营养物时提供基础水平的转录。通常，可阻遏元件的基础转录水平比可诱导元件的基础转录水平高。
所述术语“营养物”被广泛使用，指存在于可消化的或可消耗的物质中的任一有机或无机物质。营养物特定的实例包括糖(例如，葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖等)、碳水化合物、淀粉、脂肪(饱和的或不饱和的)、脂质、脂肪酸、甘油三酯、多肽、氨基酸、纤维素、激素、维生素和矿物质。
例如，营养物可调节的表达调控区作为调节涉及糖酵解、脂质代谢、碳水化合物代谢及胆固醇(例如，类固醇)代谢的酶的表达的启动子存在，所述启动子分别被糖、脂肪、碳水化合物和胆固醇调节，并且能应用于本发明。营养物可调节的元件的特定实例是葡萄糖可诱导的元件，所述元件启动L-丙酮酸激酶、乙酰辅酶A羧化酶、spot-14、脂肪酸合成酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和果糖磷酸激酶的表达(同样参见例如，Rutter，GA et al.，News Physiol Sci.15:149(2000))。营养物可调节的元件的另一实例是所述的醇脱氢酶基因调节元件。营养物可调节的元件的另一实例是所述的维生素-D反应元件，其在维生素D存在下赋予表达。哺乳动物金属硫蛋白基因启动子是由金属诱导的表达调控元件。与组织特异性调控元件一致，营养物可调节的调控元件可以对多种营养物应答。例如，葡糖糖-可诱导的元件也可以对乳糖产生应答。因此特定的营养物(例如葡萄糖)并不是排除其他的营养物，因为其他的营养物可以较小程度地调节所述调控元件的活性(增加或减少)。
本发明包括的表达调控元件可以来自细菌、酵母、植物或动物(哺乳动物或非哺乳动物)。因此，可以使用能够被哺乳动物肠粘膜细胞，优选人肠粘膜细胞内的信号(例如营养物)诱导的来自任何有机体的任何表达调控元件。
表达调控区包括全长的启动子序列，诸如天然启动子和增强子元件，以及保留全部或部分全长的或非变异的功能(例如，保留一定量的营养调节或细胞/组织特异性表达)的亚序列或多核苷酸变体。如本文所使用的，术语“功能的”及其合乎语法的变体当用于指核酸序列、亚序列或片段时，表示所述序列具有天然核酸序列(例如，非变异的或未修饰的序列)的一个或多个功能。如本发明所使用的，术语“变体”指序列取代、删除或添加，或其它的修饰(例如，诸如抗核酶的修饰形式的化学衍生物)。
如本文所使用的，术语“可操作连接”指所述组分的物理并置以使它们以它们的期望方式起作用。在与核酸可操作连接的表达调控元件的实施例中，所述关系是调控元件调节所述核酸的表达。通常，调节转录的表达调控区被并置于所转录的核酸的5′末端(即“上游”)附近。表达调控区也可以被定位于所转录序列的3′末端(即“下游”)或转录子内(例如，在内含子内)。表达调控区可以被定位于远离所转录序列处(例如，距离所述核酸100至500、500至1000、2000至5000或更多的核甘酸)。表达调控元件的具体实例是启动子，其通常定位于所述转录序列的5′。表达调控元件的另一个实例是增强子，其可以被定位于所述转录序列的5′或3′，或定位于所述转录序列内部。
在许多优选实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白。在特别优选的实施方案中，所述治疗性蛋白是分泌的治疗性蛋白。优选地，所述纳米颗粒能够增加所述分泌的治疗性蛋白的系统水平。优选地，所述纳米颗粒能够引起所述分泌的治疗性蛋白的系统水平的长期增加。在一个实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的系统水平的长期增加是静态的。在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的系统水平的长期增加是动态的。
应了解用组成性的及非组成性的表达调控区可以实现治疗性蛋白的动态水平。在许多优选的实施方案中，治疗性蛋白贮存于肠内分泌细胞内并且在应答信号时释放，因此产生了治疗性蛋白的动态系统水平，与转录活性是组成性的或非组成性的无关。
整合
在许多优选实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒包括治疗性构建体，所述治疗性构建体包括(i)可操作连接到表达调控区的治疗性核酸和(ii)整合序列。所述整合序列能够使所述可操作连接到表达调控区的治疗性核酸一起整合入肠粘膜细胞的基因组。这种治疗性构建体当携带整合元件结合入肠粘膜内时，产生具有携带可操作连接到治疗性核酸的异源表达调控序列的修饰基因组的肠粘膜细胞。因此，所述纳米颗粒提供产生包含可操作连接到治疗性核酸的异源表达调控序列的肠粘膜细胞。使用所述的纳米颗粒可以实现扩展到数周甚至数月的长期表达。
本领域已知用于整合的众多方式以及起作用的整合序列(参见，例如Nunes-Duby et al.，Nucleic Acids Res.26:391-406，1998；Sadwoski，J.Bacterid.，165:341-357，1986；Bestor，Cell，122(3):322-325，2005；Plasterk et al.，TIG15:326-332，1999；Kootstra et al.，Ann.Rev.Pharm.Toxicol.，43:413-439，2003)。这些包括重组酶和转座酶。实例包括Cre(Sternberg and Hamilton，J.Mol.Biol.，150:467-486，1981)、λ(Nash，Nature，247，543-545，1974)、Flp(Broach，et al，Cell，29:227-234，1982)R(Matsuzaki，et al，J.Bacteriology，172:610-618，1990)、ΦC31(参见，例如Groth et al.，J.Mol.Biol.335:667-678，2004；Calos，Curr GeneTher.，6:633-45，2006)、睡美人、水手家族的转座酶(Plasterk et al.，上述)，以及来自具有诸如逆转录病毒或慢病毒的LTR序列和AAV的ITR序列的提供病毒整合的组分的诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的元件(Kootstra et al.，Ann.Rev.Pharm.Toxicol.，43:413-439，2003)。
在一个实施方案中，治疗性构建体包括可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区多核苷酸的单一整合序列。在另一个实施方案中，治疗性构建体包括第一和第二整合序列，所述序列可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区多核苷酸。在本发明的方法中，使用的整合元件和整合序列的类型是兼容的。
在许多优选的实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒包含非治疗性构建体，所述非治疗性构建体包含编码整合元件的核酸。可操作连接到治疗性核酸的表达调控区多核苷酸的整合序列当结合入携带整合元件的细胞时，提供所述治疗性核酸的表达调控区多核苷酸的基因组插入。
治疗性核酸
如本文所使用的，治疗性核酸是当在肠粘膜细胞内表达时能够发挥治疗效应的核酸。治疗性核酸发挥的所述治疗效应不必在肠组织内。
治疗性核酸包括编码治疗性蛋白的核酸，以及产生治疗性RNA的转录物的核酸。治疗性RNA是能够在哺乳动物细胞内发挥治疗效应的RNA分子。治疗性RNA包括反义RNA、siRNA、短发夹RNA和酶的RNA。
如本文所使用的，编码治疗性蛋白的治疗性核酸包括编码治疗性蛋白的前蛋白形式的核酸，为发挥活性，所述前蛋白需要处理，例如通过转化酶的蛋白水解处理。
在一个实施方案中，治疗性核酸不编码食物变应原。所用的食物变应原指导致超敏反应的食物变应蛋白。通常，由于潜在的致命性表达后果，使用编码这种食物变应原蛋白的核酸是不理想的。
在一个实施方案中，治疗性核酸编码免疫原，所述免疫原能够引发针对所述免疫原的特异性抗体反应和/或T细胞反应。优选地，所述免疫原能够引发治疗性免疫反应。
用于本发明的治疗性蛋白和编码治疗性核酸的特性并不局限于本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒。可以考虑使用大小在大范围变动的多种治疗性核酸。本发明特别优选使用的是编码可分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸，所述蛋白可以由肠内分泌细胞分泌入血液循环系统。
如本文所使用的，术语“产生(produces)”或“产生(production)”当在提及分泌的治疗性蛋白使用时，指所述蛋白通过肠粘膜细胞的表达或分泌。在一些实施方案中，信号或刺激(即，促分泌素)刺激已经存在于细胞的可分泌的治疗性蛋白释放入系统循环中。
在一些优选的实施方案中，编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸表达于肠内分泌细胞(例如，K-细胞、L-细胞等)。用于赋予治疗性蛋白表达的表达调控区可以是或可以不是可调节的，但在任一情况下，信号通常会调节所述蛋白从细胞进入血液的分泌。在这种情况下，所述信号或刺激作为刺激或增加蛋白分泌的促分泌素起作用。
在一个实施方案中，治疗性核酸被设计以编码不在肠细胞内加工的治疗性蛋白的可分泌的前体。这些前体(治疗原)是在靶组织附近处被激活。
用于治疗与肠粘膜有关的疾病的方法和治疗性核酸也是本发明所涉及的。例如，用于治疗肠粘膜相关的癌症和/或炎症的组合物和方法是被涉及的。
所涉及的用于本发明的治疗性蛋白具有广泛多样的活性，并用于治疗广泛多样的病症。下面治疗性蛋白活性的描述以及可用本发明的治疗性蛋白治疗的适应症是示例的并非意图详尽的。术语“个体”指动物，优选哺乳动物，特别优选人。
治疗性蛋白和目标疾病的部分目录在表3显示。
表3
前导化合物 目标疾病 功能 治疗效应
胰岛素 糖尿病 胰岛素替代 改善葡萄糖耐量，推迟/预防糖尿病 
胰高血糖拮抗剂 糖尿病 降低内源性葡萄糖产生 改善葡萄糖耐量
GLP-1 糖尿病肥胖   刺激β-细胞生长，改善胰岛素敏感性，抑制食欲    改善葡萄糖耐量诱导体重降低  
瘦素 肥胖糖尿病 抑制食欲及改善胰岛素敏感性                   诱导体重降低改善葡萄糖耐量
CCK 肥胖 抑制食欲 诱导体重降低
生长激素(GH) GH缺陷消瘦和抗衰老 GH替代 改善生长
凝血因子 血友病 凝血因子替代 改善凝血时间
治疗性抗体和抗体片段/部分 感染癌症 病原体中和或免疫调节 预防感染或移植排斥  
炎症抑制因子，例如，IL-10、TNFα拮抗剂、IL-17拮抗剂    胃肠道炎症；例如，炎症性肠病       免疫调节 预防胃肠道炎症
高血糖症和体重
治疗性蛋白包括胰岛素和胰岛素类似物。糖尿病是由于胰岛素从胰腺β-细胞的产生缺乏(1型)或不足(2型)导致的使人虚弱的代谢病(Unger，R.H.et al.，Williams Textbook of Endocrinology(威廉姆斯内分泌学教科书)Saunders，Philadelphia(1998))。β-细胞是生产和贮存用于饭后释放的胰岛素的特化的内分泌细胞(Rhodes，et.al.J.Cell Biol.105:145(1987))，并且胰岛素是促进葡萄糖从血液进入它被需要的组织的转移的激素。糖尿病患者必需经常监测血葡萄糖水平，并且许多患者需要一天多次注射胰岛素以维持生命。然而，这些患者很少能通过胰岛素注射达到理想的葡萄糖水平(Turner，R.C.et al.JAMA281:2005(1999))。此外，延长的胰岛素水平升高能够导致诸如低血糖休克和机体对胰岛素反应的脱敏化的有害副作用。结果，糖尿病患者仍发展有诸如心血管疾病、肾脏疾病、失明、神经损伤和伤口愈合病症的长期并发症(UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)Group(英国前瞻性糖尿病研究组)，Lancet352，837(1998))。
可通过本发明的方法治疗的病症包括诸如胰岛素依赖的(1型)或非依赖的(2型)糖尿病的高血糖状况，以及与高血糖状况相关的或由高血糖症状导致的生理状况或病症。因而，可通过本发明的方法治疗的高血糖状况也包括与慢性或急性高血糖症(例如糖尿病)相关的组织病理学变化。特定的实例包括胰腺变性(β-细胞破坏)、肾小管钙化、肝变性、视力损害(糖尿病性视网膜病)、糖尿病足、诸如口腔和牙龈的粘膜溃疡、过量出血、延迟的凝血或伤口愈合以及增加的冠心病、中风、外周血管疾病、脂质紊乱、高血压和肥胖的风险。
因此，在本发明的多种方法中，应答葡萄糖时产生胰岛素或胰岛素功能性亚序列或胰岛素的类似物的肠粘膜细胞用于降低葡萄糖，改善葡萄糖耐受，治疗高血糖状况(例如糖尿病)或用于治疗与高血糖状况相关或由高血糖状况导致的生理病症。所述病症包括，例如，糖尿病性神经病(自主的)、肾病(肾脏损害)、皮肤感染和其它皮肤病症、慢性或延迟的损伤或伤口愈合(例如导致糖尿病痈的那些)、导致失明的视力损害(视网膜病、白内障)、糖尿病足和加速的牙周炎。这些病症也包括发展的冠心病、中风、外周血管疾病、脂质紊乱、高血压和肥胖的增加的风险。
如本发明所使用的，术语“高血糖的”或“高血糖症”当用于提及个体的状况时，指存在于个体血液中的短暂的或长期的异常高水平葡萄糖。所述状况可由葡萄糖代谢或吸收的延迟导致，以致所述个体显示出通常在正常个体不会发现的葡萄糖不耐受或葡萄糖升高的状态(例如在有发展为糖尿病风险的葡萄糖不耐受的亚糖尿病个体或在糖尿病个体)。血糖量正常的空腹血浆葡萄糖(FPG)水平低于约110mg/dl，对于受损的葡萄糖代谢，为约110至126mg/dl，且对于糖尿病患者而言，高于约126mg/dl。
可由在肠粘膜组织产生蛋白治疗的病症也包括肥胖或非理想的体重。瘦素、胆囊收缩素、PYY和GLP-1减少饥饿，增加能量消耗，诱导体重降低或提供正常的葡萄糖体内平衡。因此，在多种实施方案中，本发明用于治疗肥胖或非理想体重或高血糖症的方法包括使用编码瘦素、胆囊收缩素、PYY或GLP-1的治疗性核酸。可治疗的病症也包括通常与肥胖有关的那些，例如，异常升高的血清/血浆LDL、VLDL、甘油三酯、胆固醇、导致血管狭窄或阻塞的斑块形成、增加的高血压/中风的风险、冠心病等等。
如本文使用的，术语“肥胖的”或“肥胖”指与年龄和性别匹配的正常个体相比体重至少增加30％的个体。“非理想体重”指体重超过匹配的正常个体的1％至29％的个体以及体重正常但希望降低体重或防止体重增加的个体。
在一个实施方案中，本发明的治疗性蛋白是胰高血糖素拮抗剂。胰高血糖素是由胰岛内的α-细胞产生的肽激素，并且是葡萄糖代谢的主要调节剂(Unger R.H.& Orci L.N.Eng.J.Med.304:1518(1981)；Unger R.H.Diabetes25:136(1976))。与胰岛素一样，血葡萄糖浓度介导胰高血糖素的分泌。然而，与胰岛素相反，胰高血糖素被分泌响应血葡萄糖降低。因此，胰高血糖素的循环浓度在禁食期是最高的并且在进食期间是最低的。胰高血糖素水平增加以限制胰岛素促进葡萄糖贮存并刺激肝脏释放葡萄糖入血。胰高血糖素拮抗剂的特定实例是[des-His1，des-Phe6，Glu9]胰高血糖素-NH2。在链脲霉素糖尿病大鼠，血葡萄糖水平在该胰高血糖素拮抗剂静脉推注(0.75μg/g体重)的15分钟内下降了37％(Van Tine B.A.et.al.Endocrinology137:3316(1996))。
在另一个实施方案中，本发明用于治疗高血糖状况或非理想体重(例如，肥胖)的治疗性蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。GLP-1是进食期间从肠的L-细胞释放的激素，其刺激胰腺β-细胞以增加胰岛素分泌。GLP-1具有使它成为用于治疗肥胖和糖尿病的有吸引力的治疗试剂的其它活性。例如，GLP-1降低了胃排空时间，抑制食欲，降低胰高血糖素的浓度，增加β-细胞群，以葡萄糖依赖方式刺激胰岛素生物合成和分泌，以及可能增加组织对胰岛素的敏感性(Kieffer T.J.，Habener J.F.Endocrin.Rev.20:876(2000))。因此，与进餐同步的GLP-1在肠内的可调节释放能够为高血糖状况或非理想的体重提供治疗益处。抗二肽基肽酶IV(DPP IV)的GLP-1类似物提供更长的作用持续时间和提高的治疗价值。因而，GLP-1类似物是优选的治疗性多肽。
在另一个实施方案中，用于治疗高血糖状况的本发明的治疗性蛋白是激素抵抗素的拮抗剂。抵抗素是脂肪细胞来源的因子，其表达在饮食诱导形式的和遗传形式的肥胖中是升高的。循环抵抗素的中和改善了肥胖小鼠的血葡萄糖和胰岛素作用。相反地，在正常小鼠中给予抵抗素损害了葡萄糖耐受和胰岛素作用(Steppan CM et.al.Nature409:307(2001))。因此，拮抗肠道中抵抗素的生物效应的蛋白的产生能够为肥胖相关的胰岛素抵抗和高血糖状况提供有效的治疗。
在另一个实施方案中，用于治疗高血糖状况或非理想体重(例如，肥胖)的本发明的治疗性多肽是瘦素。瘦素尽管主要由脂肪细胞产生，但是也在胃内以进餐依赖的方式较少量产生。瘦素将脂肪细胞代谢和体重的信息传递到脑内的食欲中枢，在那里它发出信号降低食物摄取(促进饱腹感)以及增加机体的能量消耗。
在另一个实施方案中，用于治疗高血糖状况或非理想体重(例如，肥胖)的本发明的治疗性多肽是脂肪细胞补体相关蛋白(Acrp30)的C-末端球状头结构域。Acrp30是由分化的脂肪细胞产生的蛋白。给予小鼠由所述球状头结构域组成的Acrp30的蛋白水解裂解产物导致明显的体重降低(Fruebis J.et al.Proc.NatL Acad.Sci USA98:2005(2001))。
在另一个实施方案中，本发明用于治疗高血糖状况或非理想体重(例如，肥胖)的治疗性多肽是胆囊收缩素(CCK)。CCK是从肠分泌的响应肠道内特定营养物的胃肠肽。CCK的释放与消耗的食物量成比例且被认为向大脑发出信号以终止进餐(Schwartz M.W.et.al.Nature404:661-71(2000))。因此，升高的CCK能够降低进餐量且促进体重降低或体重稳定(即防止或抑制体重增长的增加)。
关于PYY，参见例如le Roux et al.，Proc Nutr Soc.2005May；64(2):213-6。
免疫学病症
在一个实施方案中，本发明的治疗性蛋白具有免疫调节活性。例如，本发明的治疗性多肽通过激活或抑制免疫细胞的增殖、分化或动员(趋化现象)可以用于治疗免疫系统的缺陷或病症。免疫细胞通过造血过程发生，从多能干细胞产生骨髓(血小板、红血细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)和淋巴细胞(B和T淋巴细胞)。这些免疫缺陷或病症的病因学可以是遗传的、躯体的、诸如癌症或一些自身免疫病症、后天获得的(例如通过化学疗法或毒素)或传染性的。
本发明的治疗性多肽可以用于治疗造血细胞的缺陷或病症。本发明的治疗性多肽可以被用于增加包括多能干细胞的造血细胞的分化或增殖，以试图治疗与某些(或许多)类型的造血细胞降低相关的那些病症。免疫缺陷症的实例包括但不限于血液蛋白病症(例如丙种球蛋白缺乏血症、异常丙种球蛋白血症)、运动失调性毛细血管扩张症、普通可变型免疫缺陷、迪格奥尔格综合征(Digeorge Syndrome)、HIV感染、HTLV-BLV感染、白细胞粘附缺陷综合征、淋巴细胞减少症、吞噬细胞杀菌功能不良、重症联合免疫缺陷(SCID)、Wiskott-Aldrich病症、贫血、血小板减少症、或血红蛋白尿。
本发明的治疗性多肽也可以用于治疗自身免疫性病症。许多自身免疫病症是由于免疫细胞将自体作为外源物质的不适当识别导致的。该不适当的识别导致引起宿主组织破坏的免疫反应。因此，给予抑制免疫反应、特别是T-细胞的增殖、分化或趋化性的本发明的治疗性多肽可以是预防自身免疫病症的有效治疗。
能够通过本发明治疗的自身免疫病症的实例包括但不限于阿狄森氏疾病(Addison′s Disease)、溶血性贫血、抗磷脂综合征、风湿性关节炎、皮炎、变应性脑脊髓炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture′s Syndrome)、格雷夫斯病(Graves′Disease)、多发性硬化、重症肌无力、神经炎、眼炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌腺病、紫癜、赖特尔病(Reiter′s Disease)、僵体综合征(Stiff-ManSyndrome)、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、自体免疫肺部炎症、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre Syndrome)、胰岛素依赖性糖尿病、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎以及自身免疫炎症性眼病。类似地，诸如哮喘(特别是过敏性哮喘)或其它的呼吸器官问题的变态反应和状况也可以通过本发明的治疗性多肽治疗。此外，这些分子可以用于治疗过敏性反应、对抗原分子的超敏反应或血型不合。
本发明的治疗性多肽也可以用于治疗和/或预防器官排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。通过宿主免疫细胞经免疫反应破坏移植的组织发生器官排斥。类似地，免疫反应也发生在GVHD，但在这种情况下，所述外源移植的免疫细胞破坏所述宿主组织。抑制免疫反应、特别是T-细胞的增殖、分化或趋化性的本发明的治疗性多肽的给予在预防器官排斥或GVHD中可以是有效的治疗。
类似地，本发明的治疗性多肽也可以用于调节炎症。例如，治疗性多肽可以抑制涉及炎症反应的细胞的增殖和分化。这些分子可以用于治疗慢性和急性状况的炎症性状况，包括感染相关的炎症(例如脓毒性休克、脓毒症或系统性炎症反应综合征(SIRS))、缺血再灌注损伤、内毒素致死性、关节炎、补体介导的超急性排斥、肾炎、细胞因子或趋化因子诱导的肺损伤、炎性肠病、克罗恩氏病或由于细胞因子(例如TNF或IL-1)产生过多。
凝血障碍
在一些实施方案中，本发明的治疗性多肽也可以用于调节止血(制止出血)或血栓溶解(血块形成)活性。例如，通过增加止血或血栓溶解活性，本发明的治疗性多肽可以用于治疗血液凝结障碍(例如，无纤维蛋白原血症、因子缺乏症)、血小板异常(例如，血小板减少症)，或由外伤、手术或其它原因导致的伤口。可选地，能够降低止血或血栓溶解活性的本发明的治疗性多肽可以用于抑制或溶解凝块。这些分子在治疗心脏疾病发作(梗塞形成)、中风或疤痕形成中可能是重要的。在一个实施方案中，本发明的治疗性多肽是凝血因子，用于治疗血友病或其它凝结/血凝障碍(例如，因子VIII、IX或X)。
过度增生病症
在一个实施方案中，本发明的治疗性蛋白能够调节细胞增殖。这样一种治疗性多肽能够用于治疗包括赘生物的过度增生病症。
可以由本发明的治疗性多肽治疗的过度增生的病症的实例包括，但不限于位于腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经(中枢的和外周的)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖器的赘生物。
类似地，其它过度增生的病症也可以由本发明的治疗性多肽治疗。这些过度增生病症的实例包括但不限于高丙种球蛋白血症、淋巴细胞增殖症、副蛋白血症、紫癜、肉瘤样病、塞扎里综合征(SezarySyndrome)、沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstron′sMacroglobulinemia)、高歇病(Gaucher′s Disease)、组织细胞增多症以及位于上列器官系统内的除了赘生物之外的任何其它的过度增生性疾病。
本发明所述的肠粘膜内产生的治疗性多肽可以通过直接或间接的相互作用抑制所述病症的增生。递送到循环系统使治疗性蛋白可以进入多种组织。可选地，本发明的治疗性多肽可以刺激能抑制所述过度增生病症的其它细胞的增殖。
例如，可以通过增加免疫反应，特别增加所述过度增生病症的抗原量或通过增殖、分化或动员T-细胞治疗过度增生病症。该免疫反应可以通过提高已有的免疫反应或通过引发新的免疫反应被增加。可选地，降低免疫反应也可以是治疗过度增生性病症的方法，诸如用化疗剂。
传染性疾病
在一个实施方案中，本发明的治疗性多肽可以用于治疗传染性疾病。例如，通过增加免疫反应、特别是增加B和/或T细胞的增殖和分化可以治疗传染性疾病。可以通过提高已有的免疫反应或通过引发新的免疫反应增加所述的免疫反应。可选地，本发明的治疗性多肽也可以直接抑制传染原，而不是必须引发免疫反应。
病毒是能够导致疾病或症状的传染原的一个实例，所述疾病和症状可以由本发明的治疗性多肽治疗。病毒的实例包括但不限于下列DNA和RNA病毒家族：虫媒病毒(Arbovirus)、腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉病毒属(Arterivirus)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、布尼安病毒科(Bunyaviridae)、嵌杯病毒科(Caliciviridae)，环状构象病毒科(Circoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(肝炎(Hepatitis))、疱疹病毒科(Herpesviridae)(诸如巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、单纯疱疹(Herpes Simplex)、带状疱疹(Herpes Zoster))、单负病毒(Mononegavirus)(例如副粘液病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae))、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感(Influenza))、乳多空病毒科(Papovaviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、细小RNA病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)(诸如天花(Smallpox)或牛痘(Vaccinia))、呼肠病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒属(Rotavirus))、逆转录病毒科(Retroviridae)(HTLV-I、HTLV-II、慢病毒(Lentivirus))以及披膜病毒科(Togaviridae)(例如风疹病毒属(Rubivirus))。属于这些家族的病毒能够导致多种疾病或症状，包括但不限于关节炎、毛细支气管炎、脑炎、眼部感染(例如结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合征、肝炎(A、B、C、E、慢性活动性、δ)、脑脊膜炎、机会致病菌感染(例如AIDS)、肺炎、伯基特淋巴瘤(Burkitt′sLymphoma)、水痘、出血热、麻疹、腮腺炎、副流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤病(例如卡波西疣)(Kaposi′s warts)和病毒血症。本发明的治疗性多肽可以用于治疗这些症状或疾病的任一项。
类似地，能够导致疾病和症状以及能够由本发明的治疗性多肽治疗识别的细菌或真菌剂包括，但不限于下述革兰氏阴性和革兰氏阳性菌家族以及真菌：放线菌目(Actinomycetales)(例如棒杆菌属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Norcardia))、曲霉菌病(Aspergillosis)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)(例如炭疽(Anthrax)、梭菌属(Clostridium))、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、芽生菌病(Blastomycosis)、博德特菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁杆菌病(Brucellosis)、念珠菌病(Candidiasis)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、球孢菌病(Coccidioidomycosis)、隐球菌病(Cryptococcosis)、皮肤真菌病(Dermatomycoses)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(克雷伯菌属(Klebsiella)、沙门菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森菌属(Yersinia))、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团杆菌病(Legionellosis)、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、李司忒氏菌属(Listeria)、支原体目(Mycoplasmatales)、奈瑟球菌科(Neisseriaceae)(例如，不动杆菌属(Acinetobacter)、淋病(Gonorrhea)、脑膜炎球菌(Menigococcal))、巴斯德菌科感染(Pasteurellacea Infections)(例如放线杆菌属(Actinobacillus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、巴斯德菌属(Pasteurella))、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次体科(Rickettsiaceae)、衣原体科(Chlamydiaceae)、梅毒(Syphilis)以及葡萄球菌属(Staphylococcal)。这些细菌或真菌家族可以导致下述疾病或症状，包括但不限于：菌血症、心内膜炎、眼部感染(结膜炎、结核、葡萄膜炎)、牙龈炎、机会致病菌感染(例如，AIDS相关感染)、甲沟炎、假体相关感染、赖特氏病、诸如百日咳或脓胸的呼吸道感染、脓毒症、莱姆病(Lyme Disease)、猫抓病、痢疾、副伤寒、食物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑脊膜炎、衣原体(Chlamydia)、梅毒、白喉、麻疯病、副结核、肺结核、狼疮、食物中毒、坏疽、破伤风、脓疱病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤疾病(例如，蜂窝织炎、皮肤真菌病)、毒血症、泌尿道感染、伤口感染。本发明的治疗性多肽可以用于治疗这些症状或疾病的任一种。
此外，导致可以由本发明的治疗性多肽治疗的疾病或症状的寄生剂包括但不限于下列家族：阿米巴病(Amebiasis)、巴贝虫病(Babesiosis)、球虫病(Coccidiosis)、隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)、双核阿米巴病(Dientamoebiasis)、马锥虫病(Dourine)、外寄生的(Ectoparasitic)、贾第虫病(Giardiasis)、蠕虫病(Helminthiasis)、利什曼病(Leishmaniasis)、泰勒虫病(Theileriasis)、弓形体病(Toxoplasmosis)、锥虫病(Trypanosomiasis)以及毛滴虫属(Trichomonas)。这些寄生虫可以导致许多疾病或症状，包括但不限于：疥疮、恙螨病、眼部感染、肠疾病(例如，痢疾、贾第虫病)、肝脏疾病、肺疾病、机会致病菌感染(例如AIDS相关)、疟疾、妊娠并发症和弓形体病。本发明的治疗性多肽可以用于治疗这些症状或疾病的任一种。
再生
本发明的治疗性多肽可以用于分化、增殖和吸引细胞，所述细胞被培养用于组织的再生。(参见，Science276:59-87(1997))所述组织的再生可以被用于修复、替代或保护由先天性缺陷损伤的组织、外伤(伤口、烧伤、切口或溃疡)、老化、疾病(例如，骨质疏松症、骨软骨炎(osteocarthritis))、牙周病、肝功能衰竭)、包括美容整形手术的手术、纤维化、再灌注损伤或系统性细胞因子损伤。
可以利用本发明的治疗性蛋白的作用再生的组织包括器官(例如胰腺、肝脏、肠、肾、皮肤、内皮)、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)、血管组织(包括血管内皮)、神经组织、造血组织以及骨骼组织(骨、软骨、肌腱和韧带)。优选地，再生导致少量的瘢痕形成或没有瘢痕形成。再生也包括血管发生。
此外，本发明的治疗性多肽可以增加难以愈合的组织的再生。例如，增加的肌腱/韧带的再生会加速损伤后的恢复时间。也可预防上使用本发明的治疗性多肽以避免损伤。可以治疗的具体疾病包括肌腱炎、腕管综合征和其它的肌腱或韧带缺陷。未愈伤口的组织再生的另外实施例包括压力性溃疡、与血管功能不全相关的溃疡、手术的和外伤的伤口。
类似地，通过使用本发明的治疗性多肽增殖和分化神经细胞，也可以再生神经和脑组织。可以使用该方法治疗的疾病包括中枢和外周神经系统疾病、神经病、或机械性和外伤性病症(例如脊髓病症、头部外伤、脑血管病和中风)。具体地，与外周神经损伤、外周神经病(例如由化疗或其它医学治疗导致的)、局限性神经病以及中枢神经系统疾病(例如，阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′sdisease)、亨廷顿病(Huntington′s disease)、肌萎缩侧索硬化以及夏伊-德雷格综合征(Shy-Drager syndrome))相关的疾病都可以用本发明的治疗性蛋白治疗。关于中枢神经系统(CNS)病症，本领域已知用于促进治疗性进入脑组织的许多方法，包括破坏血脑屏障的方法以及将治疗剂偶联到可以转运入所述CNS的部分的方法。在一个实施方案中，设计治疗性核酸以编码融合蛋白，所述融合蛋白包括转运部分和治疗性蛋白。
趋化作用
在一个实施方案中，本发明的治疗性多肽具有趋化作用活性。趋化分子将细胞(例如，单核细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、T-细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、上皮和/或内皮细胞)吸引或动员到诸如炎症、感染或增生过度部位的机体的特定部位。随后动员的细胞能够对抗和/或愈合特定的外伤或异常。
本发明的治疗性多肽可以增加特定细胞的趋化活性。然后这些趋化分子通过增加靶向机体特定部位的细胞的数目，可以用于治疗炎症、感染、过度增生病症或任何免疫系统病症。例如，趋化分子可以通过吸引免疫细胞到损伤部位可以用于治疗组织的伤口或其它外伤。本发明的趋化分子也可以吸引成纤维细胞，所述成纤维细胞可以用于治疗伤口。
本发明的治疗性多肽可以抑制趋化活性也是被考虑的。这些分子也可以用于治疗病症。因此，本发明的治疗性多肽可以被用作趋化作用的抑制剂。
特别优选的使用是在靶组织附近被激活的治疗前的蛋白。
被考虑使用的其它治疗性多肽包括但不限于治疗生长障碍或消耗综合征的生长因子(例如生长激素、胰岛素样生长因子-1、血小板源性生长因子、表皮生长因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等)；提供被动免疫或保护个体免受外源抗原或病原侵袭(例如H.Pylori)或提供癌症、关节炎或心血管疾病的治疗的抗体；细胞因子、干扰素(例如，干扰素(INF)、INF-α2b和2a、INF-αN1、INF-β1b、INF-γ)，白介素(例如IL-1到IL-10)，肿瘤坏死因子(TNF-αTNF-β)，趋化因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、多肽激素、抗微生物多肽(例如抗细菌的、抗真菌的、抗病毒的、和/或抗寄生物的多肽)，酶(例如，腺苷脱氨酶)，促性腺激素，趋化性剂，脂结合蛋白，非格司亭(filgastim)(Neupogen)，血色素，促红细胞生成素，胰岛素调理素，伊米苷酶、沙格司亭、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、链激酶、苯丙氨酸氨裂解酶、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、血小板生成素(TPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷脱氨酶、过氧化氢酶降钙素、内皮缩血管肽、L-天门冬酰胺酶，胃蛋白酶、尿酸酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、缩肽酶、乳糖酶、蔗糖酶固有因子、降钙素甲状旁腺激素(PTH)样、激素、可溶性CD4以及其抗体和/或抗原结合片段(例如FAb)(例如临位克隆(Orthoclone)OKT-e(抗-CD3)、GPIIb/IIa单克隆抗体)。
转染肠粘膜细胞的方法
在一个方面，本发明提供用治疗性核酸在体内转染肠粘膜细胞的方法。本方法包括将体内肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
所述方法用于转染哺乳动物的肠粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述哺乳动物是灵长类动物。在特别优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是非灵长类动物。优选的非灵长哺乳动物包括狗、猫和马。
在优选的实施方案中，所述方法包括接触小肠的粘膜。在优选的实施方案中，所述方法包括将十二指肠、空肠或回肠的粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
在优选的实施方案中，所述方法包括将胃粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
在优选的实施方案中，所述方法包括将结肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。
在优选的实施方案中，所述基于壳聚糖的纳米颗粒转染肠粘膜前体细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是肠内分泌细胞前体细胞。在优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞产生选自K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr细胞的肠内分泌细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞产生K细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是小肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是十二指肠、空肠或回肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是胃的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是结肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞产生表达所述治疗性核酸的粘膜细胞。
在一个实施方案中，所述治疗性核酸编码治疗性RNA。
在优选的实施方案中，所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白是分泌的治疗性蛋白。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白，所述治疗性蛋白选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血葡萄糖水平和葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响摄食的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响炎症的因子以及影响骨形成的因子。编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、葛瑞林、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、促红细胞生成素、炎症抑制剂、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFα拮抗剂、生长激素释放激素、甲状旁腺激素的治疗性核酸是特别优选的。在优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。
在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白在肠粘膜细胞内产生并且进入系统循环以致所述治疗性蛋白的系统水平是增加的。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白通过调节的分泌释放入系统循环。
在一个实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平增加了至少约10pM，更优选至少约100pM，更优选至少1nM，更优选至少约10nM。
在一个实施方案中，所述治疗蛋白的系统水平增加了高于所述治疗蛋白的最低可检测浓度至少10倍，更优选至少100倍，更优选至少125倍，更优选至少150倍，更优选至少200倍，更优选至少200倍，更优选至少500倍，更优选至少750倍，更优选至少1000倍。
在一个实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平增加到生理活性浓度的至少10％，更优选25％，更优选50％，更优选75％，更优选100％，更优选125％，更优选150％，更优选200％，更优选500％，更优选750％，且最优选至少1000％。
在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周。
在一个实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平增加是静态的。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平增加是动态的。
在一个实施方案中，所述方法包括将体内肠粘膜与第一基于壳聚糖的纳米颗粒和第二基于壳聚糖的纳米颗粒接触。所述第一基于壳聚糖的纳米颗粒能够转染体内肠粘膜前体细胞，并且包含(i)多个壳聚糖聚合物以及(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞内起作用的表达调控区的治疗性核酸以及整合序列。所述第二基于壳聚糖的纳米颗粒能够在体内转染肠粘膜前体细胞，并且包含(i)多个壳聚糖聚合物以及(ii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到在肠粘膜前体细胞内起作用的表达调控区的整合元件的核酸。在肠粘膜的肠粘膜前体细胞用所述第一和第二纳米颗粒转染。所述第二纳米颗粒的核酸表达于肠粘膜前体细胞以产生整合元件，由此所述整合元件将可操作连接到由所述第一纳米颗粒提供的表达调控区的治疗性核酸整合进所述肠粘膜前体细胞的基因组。
在另一个实施方案中，所述方法包括将体内肠粘膜与基于壳聚糖的纳米颗粒接触，所述纳米颗粒包含(i)多个壳聚糖聚合物；(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞内起作用的表达调控区的治疗性核酸和整合序列；以及(iii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到在肠粘膜前体细胞内起作用的表达调控区的整合元件的核酸。使用所述纳米颗粒转染肠粘膜内的肠粘膜前体细胞。编码整合元件的所述核酸表达于肠粘膜前体细胞以产生整合元件，由此所述整合元件将可操作连接到表达调控区的治疗性核酸整合进所述肠粘膜前体细胞的基因组。
在一个方面，本发明提供增加哺乳动物分泌的治疗性蛋白的系统水平的方法。所述方法包括将哺乳动物的肠粘膜与本发明基于壳聚糖的纳米接触，其中所述纳米颗粒包含编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸，其中所述分泌的治疗性蛋白在肠粘膜的粘膜细胞内产生，并且其中所述的在肠粘膜细胞产生的分泌的治疗性蛋白进入系统循环以致所述分泌的治疗性蛋白的系统水平是增加的。
在一个方面，本发明提供治疗患有能够由增加治疗性蛋白的系统水平治疗的疾病或状况的患者的方法。所述方法包括将患者的肠粘膜与本发明基于壳聚糖的纳米颗粒接触，其中所述纳米颗粒包括编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸，其中所述分泌的治疗性蛋白在所述患者的肠粘膜的粘膜细胞内产生，并且其中在粘膜细胞内产生的所述分泌的治疗性蛋白进入系统循环以致所述分泌的治疗性蛋白的系统水平是增加的。
在优选的实施方案中，所述疾病是代谢疾病。
在优选的实施方案中，所述疾病是糖尿病。
在另一个优选的实施方案中，所述状况是病态肥胖。
在另一个优选的实施方案中，所述状况是生长缺陷。
在优选的实施方案中，经口给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，通过内窥镜给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。
在优选的实施方案中，通过直肠给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是肠内分泌细胞。在优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞选自K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞细胞是K细胞。
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是小肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是十二指肠、空肠或回肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是胃的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是结肠的粘膜细胞。
在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响炎症的因子以及影响骨形成的因子的治疗性蛋白。特别优选编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、葛瑞林、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、促红细胞生成素、炎症抑制因子、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFα拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗性蛋白。在优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。
在一个优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白通过调节的分泌从肠内分泌细胞释放。
在一个实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平增加了至少约10pM，更优选至少约100pM，更优选至少1nM，更优选至少约10nM。
在一个实施方案中，所述治疗蛋白的系统水平增加了高于所述治疗蛋白的最低可检测浓度至少10倍，更优选至少100倍，更优选至少125倍，更优选至少150倍，更优选至少200倍，更优选至少200倍，更优选至少500倍，更优选至少750倍，更优选至少1000倍。
在一个实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平增加到生理活性浓度的至少10％，更优选25％，更优选50％，更优选75％，更优选100％，更优选125％，更优选150％，更优选200％，更优选500％，更优选750％，且最优选至少1000％。
在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周。
治疗通常导致降低或预防所述个体状况的严重性或症状，即个体状况的改善或“治疗效应”。因此，治疗能够降低严重性或预防所述状况或相关病症的一个或多个症状，抑制所述状况或相关的病症的进展或恶化，以及在某些情况下，逆转所述状况或相关的病症。因而，例如，在高血糖状况的情况下，治疗可以降低血糖，改善葡萄糖耐量，提供正常的葡萄糖动态平衡，或预防、改善或逆转与所述高血糖状况相关的或由所述高血糖状况导致的组织病理学变化。
与高血糖状况相关的组织病理学变化的改善包括，例如，进一步预防或降低肾小管钙化、降低或消除视网膜病变或白内障，降低伤口或损伤愈合时间，减少糖尿病足，预防或降低加速的牙周炎或降低发展的冠心病、中风、外周血管疾病、脂质紊乱、高血压和肥胖的风险。肥胖的改善可以包括，例如，体重的减低或相关病症的改善，诸如胆固醇、LDL或VLDL水平的降低，血压的降低，与高脂饮食相关的血管内膜厚度的降低，静息心率的降低，肺容量增加等。诸如血友病的出血障碍的改善可以引起例如凝血时间或出血发作的频率/持续时间的降低。
如本文中所使用的，术语“改善”指个体状况的改善、所述症状严重性的降低，或所述状况进展或恶化的抑制。例如，在高血糖状况的情况下(例如，糖尿病)，改善可以是血葡萄糖的降低、胰岛素的增加、葡萄糖耐量或葡萄糖动态平衡的改善。高血糖状况的改善也可以包括改善的胰腺功能(例如，抑制或预防β-胰岛细胞的破坏)，与所述状况相关或由所述状况导致的病理病状的降低(诸如，本发明提及的受损组织或器官的组织病理学的改善)。例如在肥胖的情况下，改善可以是如本发明提及的体重增加的降低、体重降低或与肥胖相关的状况的改善，如本文提及的(例如，血葡萄糖、胆固醇、LDL或VLDL水平的降低，血压的下降，血管内膜厚度的降低等)。在血友病或其它血液凝固/凝结/出血障碍的情况下，改善可以降低出血发作或出血的频率或持续时间。同样改善包括与血液凝固/凝结/出血障碍相关的慢性病症，诸如，例如神经学问题、致残性组织和关节损伤的减少。
本发明治疗个体的方法适用于预防疗法以预防诸如高血糖状况或相关的病症、或肥胖的发展或体重的增加的个体的症状。可选地，如本文所描述个体治疗后可以实践所述方法。例如，治疗和体重降低到理想重量后，如本文所描述的，瘦素、GLP-1、PYY或CCK可由肠粘膜细胞定时产生以抑制食欲、降低膳食消耗等并由此维持理想的体重。
本发明用于治疗个体的方法也可以由其它形式的治疗所补充。补充治疗包括药物治疗、饮食改变(低糖、脂等)、手术切除、移植、放射疗法等。例如，本发明用于治疗高血糖状况的方法可以与增加个体胰岛素或降低个体葡萄糖的药物或其它药物制剂联合使用。治疗糖尿病的药物包括，例如，双胍类和磺脲类(例如，甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、醋酸己脲、妥拉磺脲、格列本脲和格列吡嗪)。食欲抑制药物也是公知的并且可以与本发明的所述方法联合使用。可以在本发明治疗方法之前、同时或之后给予补充治疗。本领域的技术人员可以容易地确定可以与本发明的治疗方法联合使用的疗法。
药物制剂
因为本发明的所述方法可以包括将个体的粘膜细胞与多核甘酸接触，本发明也提供包括本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”制剂。这种制剂可在体内给予个体以实践本发明的治疗方法。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”指可以给予个体的载体、稀释剂、赋形剂等等，优选不产生过度的相反的副作用(例如恶心、腹痛、头痛等)。给予的这种制剂包括灭菌水的或非水的溶液、悬液和乳状剂。
药物制剂可以由载体、稀释剂、赋形剂、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等生产，与给予个体相兼容。这些制剂可以包含在片剂(包被或未包被的)、胶囊(硬的或软的)、微珠、乳剂、粉末、颗粒、晶体、悬液、糖浆剂或酏剂。补充的活性化合物以及其它添加剂中的防腐剂也可以存在，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂，以及惰性气体等等。
药物制剂可以配制成与其目的给药途径相兼容。本发明优选的给药途径是口服的、内窥镜的或直肠的。因而，优选的药物制剂包括适于通过包括口服的、内窥镜的和直肠的途径给药的载体、稀释剂或赋形剂，尽管能够到达特别是胃、小肠和结肠的肠腔的其它制剂和其它给药途径也是被包括的。
对于口服给药，组合物可以被合并入赋形剂并且以片剂、含片或例如明胶胶囊的胶囊的形式被使用。药学上可兼容的结合剂，和/或辅佐材料可以包括在口服制剂中。所述片剂、丸剂、胶囊、含片等可以包含下述成分或相似性质的化合物的任何一种：诸如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶的粘合剂；诸如淀粉或乳糖的赋形剂，诸如海藻酸、羧甲基淀粉钠或玉米淀粉的崩解剂；诸如硬脂酸镁或Sterotes的润滑剂；诸如胶体二氧化硅的助流剂；诸如蔗糖或糖精的甜味剂；或诸如薄荷、水杨酸甲酯或调味料的调味剂。
制剂也可以包括载体以保护所述组合物免于迅速降解或从体内清除，诸如调控释放制剂，包括埋植剂和微型胶囊递送系统。例如，可以使用诸如单独的或与蜡结合的单硬脂酸甘油或硬脂酸甘油的延时材料。
栓剂和其它通过直肠给药的制剂(例如，通过可通过灌肠剂给予的那些)也是被包括的。关于直肠递送的更多内容参见，例如Song et al.，Mucosal drug delivery：membranes，methodologies，and applications(粘膜药物递送：膜、方法学和应用)，Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.，21:195-256，2004；Wearley，Recent progress in protein and peptidedelivery by noninvasive routes(蛋白和肽通过非侵袭性途径递送的新进展)，Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst，8:331-394，1991。
其它适合给予的药物制剂在本领域是已知的且应用于本发明的方法和组合物(参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(1990)第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.；The MerckIndex(默克索引)(1996)第12版.，Merck Publishing Group，Whitehouse，N.J.；和Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(固体剂型的制药原则)，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993))。
给药
优选的给药途径是口服。对于口服给药，组合物可以与赋形剂合并，且以片剂、含片或例如明胶胶囊的胶囊形式被使用。药学上可兼容的结合剂，和/或佐剂材料可包括在口服制剂中。所述片剂、丸剂、胶囊、含片等可以包含下述成分或相似性质的化合物的任一种：诸如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶的粘合剂；诸如淀粉或乳糖的赋形剂，诸如海藻酸、羧甲基淀粉钠或玉米淀粉的崩解剂；诸如硬脂酸镁或Sterotes的润滑剂；诸如胶体二氧化硅的助流剂；诸如蔗糖或糖精的甜味剂；或诸如薄荷、水杨酸甲酯或调味料的调味剂。
内窥镜、插管(cannulas)、插管(intubation tubes)、导管(catheters)及其类似物可以用于将所述制剂递送到个体的肠的各部分。这允许纳米颗粒有效递送到和靶向所述肠的特定部位。在一个方面，本发明提供包含本发明公开的基于壳聚糖的纳米颗粒的递送装置。
治疗个体的剂量或“有效量”优选足以将所述状况的一个、多个或全部症状改善到可测量或可检测的程度，尽管预防或抑制所述病症或状况或症状的进展或恶化是满意的结果。因而，在可通过在肠粘膜细胞表达治疗性核酸治疗的状况或病症的情况下，所产生的改善可由本发明的方法治疗的状况的治疗性RNA或治疗性蛋白的量取决于所述状况以及所期待的结果，并且可由本领域的技术人员容易地确定。合适的量取决于被治疗的状况、所需的治疗效果以及独特的个体(例如所述个体的生物利用度、性别、年龄等)。
兽医的应用也是本发明所包括的。因此，在一个实施方案中，本发明提供治疗非人类哺乳动物的方法，所述方法包括将本发明基于壳聚糖的纳米颗粒给予需要治疗的非人类哺乳动物。
所述有效量可以通过测量相关的生理效应来确定。例如，就糖尿病或其它高血糖状况而言，血葡萄糖的降低或葡萄糖耐量实验的改善可以用于确定是否胰岛素的量对治疗所述高血糖状况是有效的。例如，将FPG从126mg/dl降到120、115、110或更低的量是有效的量。在肥胖或非理想体重的情况下，个体重量的降低、膳食量或膳食的卡路里量的减少、对给定的膳食量增加的饱腹感以及脂质、胆固醇、脂肪酸、LDL或VLDL的血清/血浆水平的降低都可以是改善个体肥胖或非理想体重的有效量。在血友病的情况下，有效量是降低个体的血凝时间或出血发作的频率或持续时间的量。
在给药前，粘膜组织的粘液可以被移除或以其它方式准备，例如，使用渗透剂或其它屏障渗透促进剂。适合要被渗透的屏障的所述渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜给药、与N-乙酰-半胱氨酸孵育(Nakanishi et al.Chem Pharm Bull(Tokyo)40:1252(1992)，Meaney and O′Driscoll Eur J Pharm Sci.8:167(1999)；通过纯化的σ1蛋白和有传染性的亚病毒颗粒水解肠粘液素(Bisaillon et al.JMol Biol.286:759(1999)；通过十二烷基β-D-麦芽(糖)苷移除粘液和增加基因转移Connor et al，Gene Ther.2001Jan；8(1):41-8.；去唾酸化(Slomiany et al.Gen Pharmacol.27:761(1996)；(Hirmo et al.FEMSImmunol Med Microbiol.20:275(1998)；通过幽门螺杆菌(H.pylori)糖硫酸酯酶去硫酸化(Slomiany et al.Am J GastroenteroL87:1132(1992)；通过神经氨酸酶去唾酸化(Hanski et al.Cancer Res.51:5342(1991))；通过β-巯基乙醇断裂二硫键(Gwozdzinski et al.Biochem Int.17:907(1988)；用诸如岩藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰-半乳糖胺酶、β-N-乙酰氨基己糖苷酶以及神经氨酸酶的特定糖苷外切酶去糖基化(Slomiany et al.Biochem Biophys Res Commun.142:783(1987)；通过0.4N HCl去酸化(Ruggieri et al.Urol Res.12:199(1984)，Davis C.P.and Avots-Avotins A.E.Scan Electron Microsc.(Pt2):825-30(1982)，Parsons et.al.Am J Pathol.93:423(1978))。
肠粘膜内前体细胞的数目可以通过暴露于细胞毒试剂和生长因子增加。例如，对小肠的放射增加了克隆形成的细胞/干细胞的数目(Roberts S.A.Radiat.Res.141:303(1995)；Cai W.B.et.al.Intl.J.Radiat.Biol.71:145(1997))。此外，用GLP-2、表皮生长因子、TNF-α、胰岛素样生长因子、白介素等的治疗已经显示出促进粘膜细胞的生长(Potten C.S.Int.J.Exp.Path78:219(1997))。以这种方式，可以产生其它的靶细胞，由此增加转染效率以及随后通过修饰的肠粘膜细胞产生的调节的蛋白。
不同壳聚糖/DNA多聚物的理化性质
表4显示示例性的基于壳聚糖的纳米颗粒的理化性质。
壳聚糖 平均数目基于平均重量的单体 分子量kDa    DDA(％) N:P比 颗粒大小(nm)     ζ电位(mV)  
P3；C(15，98) 15 2.4 98 60 140 +34.8
P1；C(24，98) 24 3.9 98 60 123 +37.9
RCO5；C(1199，74) 1199 206 74 2.9 205 +6.2
CH01；C(2038，95) 2038 332 95 3.82 243 +8.5
CH10；C(2036，83) 2036 342 83 3.24 243 +6.5
在30分钟测量大小并在5小时测量ζ电位，每一组合物具有50μg/ml的DNA浓度且pH为5.5(RC05、CH01、CH10)或5.0(P1和P3)。使用“C”代表壳聚糖，第一因子指单体的平均数目，并且第二因子指DDA。
因为由具有相同或相似平均分子量的壳聚糖聚合物组成的组合物中，DNA浓度是不同的，所以N:P比优选为达最优化而变化。例如，对于包含由具有约3.9kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物和约98％的DDA组成的基于壳聚糖的纳米颗粒(上述P1)、和约50μg/ml的DNA浓度的组合物，高度优选的N:P比是60:1。对于包含由具有约3.9kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物和约98％的DDA组成的相同的基于壳聚糖的纳米颗粒，但DNA浓度约250μg/ml的组合物，更高度优选的N:P比是20:1。通常，随着DNA浓度的增加，优选降低N:P比，特别对于低分子量的壳聚糖纳米颗粒而言。
在低于壳聚糖胺基的pKa的pH处，所述N:P比更接近反映了纳米颗粒中真实的电荷比。在优选的实施方案中，本发明的组合物具有低于6.5，更优选低于6.0，且最优选约4.5至约5.5的pH，且N:P比非常接近地反映了真实的电荷比。
特别地，ζ电位随着pH和壳聚糖胺基质子化的程度而变化。通常，随着所述pH增加以及所述壳聚糖胺基质子化程度的降低，所述ζ电位降低。
同样，因为具有相同平均单体长度的壳聚糖聚合物的乙酰化程度(DDA)是不同的，优选调整组合物中N:P比。例如，对于包含具有约24的平均单体长度的基于壳聚糖的纳米颗粒、约98％的DDA以及约250μg/ml的DNA浓度的组合物，高度优选的N:P比是20:1。对于包含具有约24的平均单体长度的相同的基于壳聚糖的纳米颗粒、约250μg/ml的DNA浓度，但DDA为约80％的组合物，高度优选的N:P比是40:1。通常，随着DDA的降低，优选增加N:P比，特别是对于低分子量的壳聚糖纳米颗粒。
所有的引用以其整体通过引用清楚地并入本发明。
实验
基于壳聚糖的纳米颗粒制剂
(与图1-10的数据相关的组合物)分别制备的质粒DNA和壳聚糖溶液被调整到等于所需终浓度的两倍的浓度。对于P3和P1，DNA稀释于水中并且所标示的壳聚糖溶于5mM，pH5.0的乙酸钠。对于表5中其它的复合物，DNA稀释于50mM的硫酸钠溶液且所标示的壳聚糖溶于5mM，pH5.5的乙酸钠。在所有情况下，两种溶液在混合前于55℃孵育5分钟。将等体积的两种溶液混合并迅速涡旋30秒以形成DNA/壳聚糖颗粒。对某些应用而言，该制剂在分析之前还可被稀释于多种缓冲液。使用的壳聚糖获自FMC(挪威)和Biosyntech(加拿大)。
表5：基于壳聚糖的纳米颗粒制剂
Figure G2007800109500D00591
使用基于壳聚糖的纳米颗粒转染293T细胞
携带SV40大T抗原的人胚胎肾细胞(293T)生长于补充有10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified EagleMedium)培养基(DMEM)。使它们受胰蛋白酶作用，在PBS中洗涤并铺板于完全培养基中，在6孔板的每孔3ml培养基中有约6x105细胞。对于DNA/壳聚糖介导的转染，第二天在加入DNA/壳聚糖颗粒之前用无血清的Optimem洗涤细胞。用于这些孵育的培养基是无血清的Optimem，pH7.4或调整到5.0的Optimem。转染后4小时，将3ml pH7.4的Optimem加到每孔。用在CMV启动子(pShuttle-CMV-LacZ)调控下的β-半乳糖苷酶质粒转染48小时后，用Galacto-Light Plus系统(ABI)分析β-半乳糖苷酶的活性。简言之，细胞用PBS洗两遍，用200μl含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解并用细胞刮棒分离。通过以最大速度旋转2分钟使细胞裂解液澄清并取20ml按照厂商说明书进行分析。使用带有1秒整合的LMax II384光度计(Molecular Devices)检测信号。所述β-半乳糖苷酶的活性用样本中总蛋白校正，所述总蛋白通过依照厂商的说明书使用Bio-Rad DC蛋白分析测量蛋白量得到。
纳米颗粒形成分析
通过在0.04M Tris、0.001M乙酸钠、0.02M EDTA缓冲液、pH8(TAE)中的0.8％琼脂糖与溴化乙锭(0.2μg/ml)中的凝胶电泳分析壳聚糖与DNA组合以及保持它与DNA相互作用的能力。凝胶在100mV持续1h并且在紫外光下观察DNA保持力。(数据没有显示)
病毒载体
携带感兴趣的标志物基因(例如胰岛素、β-半乳糖苷酶或SEAP)的基于猫免疫缺陷病毒(FIV)和腺病毒相关病毒(AAV)的基因转移载体被产生。FIV载体用标准的方法产生。携带目的转基因的AAV2颗粒也使用标准的方法产生。转染后3天通过使用HiTrap肝素HP柱(Amersham)收集颗粒。
基因转移到体内的十二指肠
如上文描述的，壳聚糖CH01(N:P3.82)、CH10(N:P3.24)、RC05(N:P2.85)，P1(N:P60)和P3(N:P60)在给予小鼠之前用于形成与12.5μg质粒DNA(50μg/ml)的复合物(图2)。使用P1和RC05的其它试验使用如图3所述的N:P比范围。简言之，在麻醉的禁食过夜小鼠进行腹部手术。分离十二指肠节段(距离幽门括约肌2cm)并用固定的玻璃钩使其固定。所述十二指肠节段的腔用生理盐水冲洗一次，并任选地用粘液溶解剂(10％NAC)孵育10分钟。孵育结束后，所述粘液溶解剂被推向所述肠道的远侧区并用生理盐水洗三次。然后将200微升基因转移溶液(基于壳聚糖的纳米制剂或相当的病毒载体)递送入所述分离的十二指肠节段的腔，并与在高位用玻璃钩稳定的十二指肠节段孵育1小时。所述固定的肠节段用生理盐水浸湿的纱布覆盖以防止过度的组织干燥。孵育后，所述十二指肠节段放回腹部且所述切口用5-0vicryl缝线闭合。在手术结束时，每只小鼠给予100mg/kg氨苄青霉素(腹腔注射)，5mg/kg ketaprofen(皮下注射)和1ml乳酸盐林格溶液(皮下注射)。然后将动物在耳部作标记并将其放回笼中，在加热垫上恢复。
对于DNA/壳聚糖复合物的口服给药，使用胃饲针将500μl测试溶液给予到小鼠的胃部。
定量PCR以测量基因递送到十二指肠
通过定量聚合酶链反应(Q-PCR)测量转染入十二指肠组织的DNA的量。组织样本解冻到室温，然后用研棒和乳钵研磨。使用厂商关于Qiagen DNeasy组织试剂盒的说明书提取DNA，除了使用的蛋白激酶K和ATL缓冲液的体积是列出的体积的两倍。在扩增前使用分光光度计测量基因组DAN浓度，所述扩增使用特异针对被测试的特定转基因的引物。也使用18S RNA编码序列的引物进行标准化。所述扩增用加标质粒DNA的空白样品量化。使用ABI7000循环仪进行扩增。
肠粘膜细胞转染后系统蛋白的长期增加
在小鼠的小肠评估产生长期表达的能力。与壳聚糖络合的SEAP质粒被应用于上述的十二指肠。所述质粒包含组成性启动子EF1α调控下的SEAP基因。所述质粒也包含细菌的复制起点和氨苄青霉素可选择的标志物rGIP-hINS。
治疗性核酸的整合
如上文描述的，在给予小鼠之前，壳聚糖P1(N:P60)用于形成与全部12.5μg质粒DNA(50μg/ml)的复合物。报告基因整合质粒包含复制起点、氨苄青霉素抗性基因和启动β-半乳糖苷酶报告基因表达的CMV启动子(pMM2611)。所述报告盒通过末端反向重复(ITR)在任一侧的侧面，所述末端反向重复通过水手转座酶被识别并且被整合入宿主基因组。所述水手转座酶本身被递送到由CMV启动子启动的pCMV-9质粒上，所述质粒也包含复制起点和细菌增殖过程中用于选择的氨苄青霉素抗性基因。参见图7的质粒图谱。所述质粒在与壳聚糖络合前以5:1(pMM2611:pCMV-C9)混合。图6显示体内的小鼠十二指肠细胞与N:P比为60:1的基于壳聚糖的纳米颗粒P1的共转染。
体内SEAP活性的测量
使用Roche化学发光的SEAP报告基因分析确定小鼠血浆中的SEAP水平。冷冻的样品被解冻、涡旋、旋沉、稀释且在69℃加热灭活45分钟。加热灭活后，样品在冰上冷却、离心并根据厂商的说明书分析。用带有1秒整合的LMax II384光度计(Molecular Devices)检测信号。
结果：图1显示用包含不同分子量和脱乙酰化程度的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒(具体参见表4)体外转染293细胞的结果。壳聚糖CH01(N:P7.6)、CH10(N:P6.5)、RC05(N:P5.7)、P1(N:P60)和P3(N:P60)在转染前与pShuttle-CMV-LacZ质粒络合，并且β-半乳糖苷酶的活性作为转染效率的量度被测量。这些结果显示了转染效率依赖于所使用的特定壳聚糖的差异以及相对于裸DNA的极为显著的转染水平。
图2显示用基于壳聚糖的纳米颗粒体内转染鼠类的十二指肠腔细胞的结果，所述纳米颗粒包含不同分子量和脱乙酰化程度的壳聚糖聚合物(具体参见表4)。壳聚糖CH01(N:P3.82)、CH10(N:P3.24)、RC05(N:P2.85)、P1(N:P60)和P3(N:P60)在转染前与pShuttle-CMV-LacZ质粒络合，并且β-半乳糖苷酶的活性作为转染效率的量度被测量。这些结果显示了转染效率依赖于所使用的特定壳聚糖的差异。RC05也给出体外和体内获得的转染效率之间的差异的明显例子。
图3显示用包含所示的不同分子量的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒(具体参见表4)且以不同的N:P比体内转染鼠十二指肠腔细胞的结果。所述pShuttle-CMV-LacZ质粒被用于转染，并且β-半乳糖苷酶的活性作为转染效率的量度被测量。这些结果显示了转染效率依赖于所使用的NP比的差异，且多种壳聚糖分子的最优化的NP比是不同的。
图4显示与用FIV(109转导单位)和AAV(1011转导单位)颗粒转导相比，用N:P比为2.85:1的RC05基于壳聚糖的纳米颗粒体内转染鼠十二指肠腔细胞的结果。数据代表使用定量PCR在组织内检测的基因拷贝数。该数据表明使用颗粒制剂的壳聚糖介导的基因转移到肠比通常被认为有效的病毒基因转移系统更有效。
图5显示用N:P比为60:1的P1基于壳聚糖的纳米颗粒体内转染(单次给予)鼠十二指肠腔细胞的结果，其中所述的纳米颗粒包含EF1a-SEAP质粒。显示了在不同时间点血中SEAP蛋白的水平。该数据表明了壳聚糖在小鼠十二指肠内递送长期基因表达的能力。
图6显示在鼠十二指肠腔细胞内用N:P比为60:1的P1基于壳聚糖的纳米颗粒体内转染及整合作用的结果。两种质粒(在LacZ基因的任一侧包含一个ITR的pMM2611-β-gal；编码水手整合酶的pCMV-C9)在与P1壳聚糖络合前以5:1比例混合。转染后14天，收集十二指肠并通过定量PCR测定pMM2611-β-gal质粒的存在。
图7显示了用于图6所示的实验中质粒pCMV-C9(图A)和pMM2611-β-gal(图B)的两个示意图。所述图显示了诸如启动子、转基因和ITR整合位点的主要序列元件。也显示了主要的限制性酶位点。
送后2天壳聚糖介导递基因转移到小鼠十二指肠粘膜细胞，以及使用ΦC31的情况下递送后14天基因的持续性
小鼠十二指肠用壳聚糖-DNA纳米颗粒进行基因转移后的Q-PCR：为了定量壳聚糖-DNA纳米颗粒到小鼠十二指肠的腔递送后的基因拷贝数，在多聚物递送后2天或14天收集小鼠十二指肠并使用Qiagen DNeasy组织试剂盒提取DNA。随后用TaqMan PCR Master Mix(Applied Biosystems)以及对LacZ或荧光素酶基因特异的引物及探针对1μg DNA进行实时定量PCR(Q-PCR)。进行使用18S引物和探针的Q-PCR(Applied Biosystems)作为内部对照。
为了确定使用基于壳聚糖的纳米颗粒的基因转移效率，我们将裸DNA(pShuttle-CMV-LacZ)或用C(24，98)包装的pShuttle-CMV-LacZ递送到小鼠的十二指肠。2天后，我们发现接受壳聚糖-DNA纳米颗粒的组比接受裸DNA的组的基因拷贝数高100倍多(图8，左)。这证实了基于壳聚糖的纳米颗粒将DNA有效递送到所述十二指肠的细胞的能力。
包含荧光素酶标志物基因表达盒和attB序列(pLuc-aftB)的质粒与或不与ΦC31整合酶表达质粒(pCMV-INT)用C(24，98)包装，并被递送到小鼠的十二指肠腔。当ΦC31整合酶表达质粒被共包装在纳米颗粒中时，所述标志物基因在肠粘膜的存在于递送后14天是持续的，其水平高于用仅携带pLuc-attB质粒的纳米颗粒处理的小鼠的水平100倍多。在载体递送后14天肠道内荧光素酶基因的显著较高水平表明ΦC31整合酶成功地将转基因整合入长寿命的十二指肠粘膜前体细胞群。
递送C(24，98)-GIP-INS或C(1119，74)-GIP-INS后，小鼠血浆的C-肽水平
多聚物形成：分别制备的质粒DNA和壳聚糖溶液被调整到等于所需终浓度的两倍的浓度。对于P1(C(24，98))，将DNA稀释于水中并将所标示的壳聚糖溶于5mM，pH5.0的乙酸钠。对于RC05(C(1119，74))的制备，将DNA稀释于50mM的硫酸钠溶液并将所标示的壳聚糖溶于5mM，pH5.5的乙酸钠。在每种情况下，两种溶液在混合前于55℃孵育5分钟。将等体积的两种溶液混合并迅速涡旋30秒以形成DNA/壳聚糖颗粒。使用的壳聚糖获自FMC(挪威)和Biosyntech(加拿大)。
血浆采集：在C(24，98)-GIP-INS或C(1119，74)-GIP-INS(总DNA剂量＝10μg/动物)腔递送后的不同时间点从小鼠的隐静脉采集小鼠血浆。所述小鼠禁食过夜，然后在采血前15分钟被给予2g葡萄糖/kg小鼠。通过使用ALPCO超灵敏胰岛素ELISA试剂盒测定小鼠血浆中人类C-肽的水平，所述使用是根据厂商的推荐并做了较小的改良。这些改良包括：将小鼠血浆1:2稀释而不是使用原液，且在测定缓冲液中孵育2小时而不是1小时。
结果(图9)：为了评估纳米颗粒在将胰岛素的产生靶向肠K-细胞中的潜在治疗功效，我们将带有attB序列的GIP/Ins转基因(prnGIP-hINS-WPRE-attB)和ΦC31整合酶表达质粒(pCMV-INT)(INS:INT比＝5:1)用壳聚糖(C(24，98)NP＝60或C(1119，74)NP＝2.9))包装，并使用上述的腔递送的方法将所述多聚物递送到小鼠的十二指肠。我们能够使小鼠内人C-肽的循环水平在超过120天是可检测的。用C(24，98)多聚物的单次载体给予十二指肠后，在这些小鼠获得的血浆人C-肽的平均水平在载体递送后约80天达到10pM高。相反，接受C(1119，74)-GIP-INS的动物的循环C-肽水平有最初的早期增加，随后是持续的低水平且到100天时C-肽消失。该研究表明低分子量的壳聚糖纳米颗粒在实现长于50天的时间段内通过K细胞的稳健的胰岛素的产生和分泌方面更为有效。
(图10)为了确定是否体内人胰岛素由K-细胞的产生和分泌是进餐调节的，给予禁食过夜的小鼠在约8分钟内被完全吃完的0.5g标准食物丸或通过经口灌胃给予2g/kg体重的葡萄糖。食物进入30分钟后或葡萄糖进入15分钟后，处理的小鼠的血浆人C-肽显著增加，从大于2pM的禁食水平到葡萄糖或标准食物进入后的约4.8-6pM。葡萄糖溶液经口灌胃后60分钟，所述人C-肽水平恢复到基线水平。这些结果表明胰岛素从肠K-细胞的分泌是进餐调节的；并且与b-细胞类似，它们能够快速分泌胰岛素响应进餐。
不同的壳聚糖-GIP-INS颗粒递送后小鼠血浆内C-肽水平
多聚物形成(数据图11-14)：将壳聚糖粉末加到0.5％的乙酸水溶液中直至壳聚糖工作液达到pH4.8。然后将所述工作液通过膜滤器(Acrodisc0.2μm孔径，Pall Life Sciences)过滤。将质粒A和质粒B的贮存DNA溶液(溶于1xTE)以质粒A与质粒B为5:1的比例混合，稀释于水中，然后通过膜滤器(Acrodisc0.2孔径，Pall Life Scieces)过滤以产生DNA工作液。所述工作液的浓度是多样的以产生具有依据表6所需的DNA和壳聚糖浓度的终产物。通过连续的在线混合体积比为2:1的壳聚糖和DNA工作液来制备DNA-壳聚糖多聚物。
表6：不同的多聚物制剂所需的工作液浓度
Figure G2007800109500D00661
如上述进行多聚物递送到小鼠。
小鼠血浆采集：在C(24，98)-GIP-INS、C(65，98)、C(165，98)或C(58，80)(总DNA剂量＝50μg/动物)腔递送后的不同时间点从小鼠的隐静脉采集小鼠血浆。所述小鼠禁食过夜，然后在采血前15分钟被给予2g葡萄糖/kg小鼠。通过使用ALPCO超灵敏胰岛素ELISA试剂盒测定小鼠血浆中人C-肽的水平，所述使用是根据厂商的推荐并做了较小的改良。这些改良包括：将小鼠血浆1:2稀释而不是使用原液，且在测定缓冲液中孵育2小时而不是1小时。
结果(图11)：我们进行研究以比较链长度和脱乙酰化百分比(DDA)不同的多种壳聚糖聚合物靶向的小鼠K细胞内胰岛素产生的效率。配制壳聚糖多聚物以包含连接到大鼠GIP启动子的人胰岛素基因(prnGIP-hINS-WPRE-attB)和ΦC31整合酶表达质粒(pCMV-INT)(INS:INT比＝5:1)。我们发现C(24，98)在给予后5天开始导致了最高水平的人C-肽产生并且这些水平在整个109天的研究期间是持续的。具有相同DDA的较长链聚合物C(65，98)和C(165，98)最初产生了显著的但较低水平的人C-肽，所述水平到50天时降到检出限以下。使用包含具有较低脱乙酰化度(DDA)的中等长度聚合物的纳米颗粒以给定的N:P比和DNA浓度不会产生显著的人C-肽水平。该研究表明低分子量的壳聚糖纳米颗粒在实现长于50天的时间段内通过K细胞的稳健的胰岛素的产生和分泌方面更为有效。此外，该研究和上述图9所示的结果支持低分子量的壳聚糖纳米颗粒除了提供更长时间段的表达，还提供更高水平的表达。在不受理论限制的情况下，这看起来反映低分子量的壳聚糖纳米颗粒转染更大数目的前体细胞的能力，从而导致更大数目的子代细胞(包括K细胞)具有整合的GIP-胰岛素转基因。
在猪十二指肠内人GIP启动子驱动的人胰岛素的表达
如上所述进行壳聚糖/DNA多聚物制剂试验(图11)。携带连接到人胰岛素转基因的大鼠GIP启动子的FIV载体质粒(FIV-rGIP/hIns)用已建立的三质粒转染系统产生。为了将rGIP/hIns转基因包装入VSV-G假型FIV病毒颗粒，用载体质粒pFLX-rGIP/hIns、包装质粒(pCPRΔEnv)和pCMV-VSV-G转染293细胞用于假型化。具体地，在转染前一天，293细胞被传入30个150mm的组织培养皿。使用磷酸钙沉淀方法将全部20μg DNA(8μg pFLX-rGIP/hIns、8μg pCPRΔEnv和4μgpCMV-VSV-G)转染入80％的汇合细胞。转染后8小时，细胞用含10％FCS的新鲜达尔伯克改良伊格尔培养基(D-MEM)培养并在37℃孵育过夜。所述培养基第二天早上被替换并且转染的细胞被转移到32℃的孵箱。在转染后48h和72h从细胞培养基中收集病毒颗粒。包含所述病毒颗粒的上清通过低速离心澄清，经由0.45mm滤器被过滤并且随后通过在4℃以38,000g离心2.5h被浓缩。然后将所述沉淀物重悬在TNE缓冲液中(50mM Tris和130mM NaCl和1mMEDTA)。浓缩的FIV载体被贮存在-80℃。对于每批产生的病毒载体，通过使用特异性针对人胰岛素的探针的实时PCR确定病毒滴定度。
依据enGene′s UBC协议A03-0101(基因转移到哺乳动物的肠细胞)，通过英国哥伦比亚大学动物保护中心(ACC)获得约克夏(Yorkshire)猪和优卡坦(Yucatan)猪。研究方案由UBC动物保护和生物危害委员会独立评审和批准。动物饲养于ACC并转运到动物资源中心(ARU)，在ARU进行内窥镜操作程序和组织的收集。
猪禁食过夜，并由ARU的工作人员通过肌内注射阿托品(0.04-1.00mg/kg)、盐酸氯胺酮(10-20mg/kg)和甲苯噻嗪(0.1mg/kg)的混合物进行药物预处理。随后，对动物进行气管内插管用于递送2％异氟烷，所述异氟烷在整个操作过程中都被维持。经由静脉内导管术给予林格乳酸盐用于容量替代。在载体递送时，猪的体重为29kg至51kg。
猪被置于仰卧位，用hibi-cleanse清洁腹部，用酒精消毒以及用碘酒灭菌。使用经由从剑突移动远端水平到腹股沟区的皮肤的烧灼术作一正中切口。使用10号刀片的手术刀穿过下面的肌肉层和白线重复同样的切口。四条剖腹手巾沿着中线铺好以便腹部牵开器的放置。分离幽门扩约肌和近端的十二指肠，并将6段用使用4.0vicryl的表面环形缝合模式划界。进行表面注射(每一注射部位2.5ml)入划界的处理部位内的粘膜。
递送后7天，如上所述将猪进行药物预处理和麻醉。腹部被如上所述切开以确定所述十二指肠作标记区的位置。将夹子置于所述处理部位的近端和远端以夹陷十二指肠。邻近十二指肠的血管被夹固且随后被切断。将夹固的十二指肠段切断并将所述节段从腹部取出，放置于冰冷的生理盐水中冲洗。移走夹子后，将十二指肠沿纵轴切开，用新鲜的冰冷生理盐水冲洗并用大头针钉于切板。用手术刀切割所标记的十二指肠区，留有5mm的外缘以确保收集所有被处理的组织。然后将这些段的每段切成两部分用于RT-Q-PCR和IHC。将用于RT-qPCR的组织样本浸没于TRIzol试剂(Invitrogen Canada Inc；Burlington，ON)中，然后快速冰冻于干冰内。收集用于IHC的组织样本并将其固定于4％的多聚甲醛。
实时定量RT-PCR(RT-q-PCR)：使用ultra-turrax T8匀浆器(IKAWorks Inc.；Wilmington，NC)将TRIzol试剂中的组织匀浆。分离全部组织RNA并按照厂商的操作步骤纯化。
将每一个RNA样本首先用DNA酶I(Invitrogen)消化以去除任何DNA污染。每1μgRNA样本，加入1μL10x DNA酶I反应缓冲液、1μL DNA酶I和不含RNA酶/DNA酶水，以达到10μL的终体积。将试管在室温孵育15分钟，然后通过加入1μL25mM EDTA灭活DNA酶I。所述样本在65℃被加热10分钟。
逆转录：通过使用SuperscriptTM II逆转录酶(Invitrogen)合成第一链cDNA。DNA消化后，将1μL每种随机引物(Invitrogen)和10mMdNTP混合物(Invitrogen)加入到每管中，所述管在65℃加热5分钟，然后置于冰上。每管加入下列物质：4μL5x第一链缓冲液(Invitrogen)、2μL0.1M DTT和1μLRNaseOUTTM重组核糖核酸酶抑制剂(Invitrogen)，并将所述管在42℃孵育2分钟。然后加入1μLSuperscriptTM II，并将所述管在42℃孵育50分钟。最后，通过在70℃加热15分钟终止所述反应。
实时PCR：一对PCR引物和探针被设计以扩增部分人胰岛素基因，并且18S引物被用于标准化来自实验组的组织和来自对照组的组织之间的18S和人胰岛素的cDNA量。人胰岛素引物的序列是：5′CGCCCTTGCTGCATCAG3′(正向)，5′GCAGGAGGCGCATCCA3′(反向)(IDT Inc.；Coralville，IA)。使用的胰岛素探针是6FAM CTCACACCTGGTGGAAG MGBNFQ(Applied Biosystems，Foster City，CA)。18S引物以及探针、TaqMan Master Mix也购自Applied Biosystems。所有的样本都用于检测胰岛素基因和18S。在层流净化罩中进行，双份样本被装入
Figure G2007800109500D00701
光学96-孔反应板(Applied Biosystems)。将10μLcDNA样本(包含0.3μg初始RNA)、0.25μL探针、12.5μL TaqManMaster Mix、1.125μL每种胰岛素引物或10μLcDNA样本(包含0.5ng初始RNA)、1.25μL18S引物和探针以及1.25μL不含RNA酶/DNA酶的水和12.5uL TaqMan Master Mix加到每孔中。在ABI PRISM7000序列检测系统(Applied Biosystems)中运行所有的样本。数据通过18S标准化并且实验组和对照动物之间的相对量上差异通过Log2倍数变化表示。
免疫组织化学(数据未显示)：猪十二指肠样本在0.1摩尔/升PBC(pH7.5)中的4％的多聚甲醛中被固定4小时并用70％乙醇冲洗。石蜡包埋切片(5um)在95-100℃于10mM柠檬酸钠溶液(pH6.0)中被孵育20分钟，然后用10％的正常山羊血清(Vector Laboratories，Burlingame，CA)封闭。所述切片随后用1:200稀释的兔抗人GIP的抗血清(CedarlaneLaboratories，Ontario，Canada)或1:100稀释的豚鼠抗-猪胰岛素(DakoCytomation，Carpinteria，CA)在室温孵育1小时。冲洗后，切片用1:600稀释的山羊抗-兔Alexa488或山羊抗-豚鼠Alexa555(MolecularProbes，Eugene，OR)孵育1小时以分别检测胰岛素或GIP的存在。最后，载玻片通过使用DAPI的Vectashield封闭剂(Vector Laboratories)封片，并使用装有Photometries CoolSNAP照相机(Roper Scientific，Tucson，Arizona)和MetaMorph7.0成像软件(PerkinElmer LAS Canada，Woodbridge，Ontario)的Leica DMIRB显微镜(Leica Microsystems，Richmond Hill，Ontario)观察。
结果：在使用猪的临床前试验中，人GIP启动子被用于将人胰岛素的表达靶向K细胞。带有attB序列的人GIP启动子连接的人胰岛素cDNA表达盒和ΦC31整合酶表达质粒(pCMV-INT)被用小分子量壳聚糖C(24，98)(NP＝40，DNA浓度＝75ug/ml)包装，并通过注射递送入所述猪十二指肠的划界区。此外，所述人GIP启动子连接的人胰岛素cDNA表达盒也可以包装在VSVG-假型化的FIV载体中并通过注射递送以比较所述两载体间的基因转移效率。给予载体后7天，获得来自划界部位的活检用于使用人胰岛素特异引物和探针设定的定量RT-PCR并用于使用人胰岛素和GIP特异性抗体的免疫染色。
(图12)来自壳聚糖/DNA多聚物处理的和VSV-G假型化FIV载体处理的猪十二指肠的活检样本的定量RT-PCR分析提供了可检测的人胰岛素mRNA。该数据表明所述人GIP启动子在猪十二指肠内是活跃的。此外，当与所述FIV处理的猪相比时，所述壳聚糖/DNA多聚物处理的猪的人胰岛素mRNA水平呈现出接近10倍的升高，这表明了壳聚糖/DNA多聚物作为到猪十二指肠的有效的基因递送载体的能力。
在所述十二指肠的粘膜细胞内检测到了对人胰岛素呈现免疫活性的独特细胞。这些免疫阳性细胞呈现出“烧瓶样”外形，类似肠内分泌细胞的典型特征。此外，双重免疫荧光检测显示胰岛素与GIP在十二指肠细胞的共定位，这提示我们载体中使用的所述人GIP启动子准确地将胰岛素的表达靶向猪的K-细胞(数据未显示)。
使用不同的预冲洗条件的猪的腔递送
如上所述制备壳聚糖/DNA多聚物。
约克夏猪和优卡坦猪的护理上面已描述。
猪禁食过夜，并由ARU的工作人员通过肌内注射阿托品(0.04-1.00mg/kg)、盐酸氯胺酮(10-20mg/kg)和甲苯噻嗪(0.1mg/kg)的混合物进行药物预处理。随后，对动物进行气管内插管用于递送2％异氟烷，所述异氟烷在整个操作过程中都被维持。经由静脉导管给予林格乳酸盐用于容量替代。在载体递送时，猪的体重为29kg至51kg。
使用连接到摄像机系统(Visera OTV-S7V)的纤维光束内窥镜(Olympus，model CF-1T10L)以进入十二指肠。所述内窥镜包含工作管道，通过所述管道活检工具、夹子装置和导管被放置。在干冰上收集活检，并随后转移到-80℃。使用可旋转的夹紧固装置(Olympus)放置三把止血夹以标记病毒递送的目标区。通过导管线的IV注射口给予丁溴东莨菪碱(0.3mg/kg IV)以抑制肠蠕动。在冲洗步骤开始时给予一个剂量，并就在病毒载体溶液递送前给予第二剂量。
十二指肠预处理：对于所有动物，十二指肠用40ml5％N-乙酰半胱氨酸(NAC，pH7.0)处理10分钟以去除粘膜层，用40ml19mM、pH5的乙酸钠处理以调整周围环境的pH，用40ml NAC和乙酸钠联合处理或40ml单独的盐水处理。所有预处理的溶液用Hobbs Mistifier喷雾导管(REF2190)递送。
载体给予：所述内窥镜进入十二指肠后，处理部位(约5cm)使用十二指肠夹(Olympus Canada，HX-600-090L)标记，所述夹通过内窥镜的开路通道放置。然后将所述预处理溶液经由贯穿整个处理部位的放射状喷雾导管喷射。预处理后，将20ml含有pCMV-SEAP-3xFLAG和pCMV-INT质粒(5:1体积比)的壳聚糖/DNA多聚物(DNA浓度＝75ug/ml)用Mystifier导管(REF2190)递送到所述处理部位。
组织收集：递送后7天，如上所述将猪药物预处理和麻醉。腹部被如上所述切开以确定所述十二指肠幽门和近端区的位置。将夹子横置于幽门括约肌和所述幽门远端25cm处以夹陷十二指肠。邻近十二指肠的血管被夹固且随后被切断。将夹固的十二指肠段切断并将所述节段从腹部取出，放置于冰冷的生理盐水中冲洗。移走夹子后，将十二指肠沿纵轴切开，用新鲜的冰冷生理盐水冲洗并用大头针钉于切板。用手术刀切割近端和远端区以移走标记的2.5mm的外缘来确保所有被处理的组织被收集。所得的组织阶段被切分成2.8cm段。然后将这些段的每段切成两部分用于RT-Q-PCR和IHC。将用于RT-qPCR的组织样本浸没于TRIzol试剂(Invitrogen Canada Inc；Burlington，ON)中，然后快速冰冻于干冰内。收集用于IHC的组织样本并将其固定于4％的多聚甲醛。
实时定量RT-PCR(RT-q-PCR)：使用ultra-turrax T8匀浆器(IKAWorks Inc.；Wilmington，NC)将TRIzol试剂中的组织匀浆。分离全部组织RNA并按照厂商的操作步骤纯化。
将每一RNA样本首先用DNA酶I(Invitrogen)消化以去除任何DNA污染。将1μL10x DNA酶I反应缓冲液，1μL DNA酶I和不含RNA酶/DNA酶的水加入到每1μgRNA样本，以达到10μL的终体积。将试管在室温孵育15分钟，然后通过加入1μL25mM EDTA灭活DNA酶I。所述样本在65℃被加热10分钟。
逆转录：通过使用SuperscriptTM II逆转录酶(Invitrogen)合成第一链cDNA。DNA消化后，将1μL每种随机引物(Invitrogen)和10mMdNTP混合物(Invitrogen)加入到每管中。所述管在65℃加热5分钟，然后置于冰上。每管加入下列物质：4μL5x第一链缓冲液(Invitrogen)、2μL0.1M DTT和1μLRNaseOUTTM重组核糖核酸酶抑制剂(Invitrogen)，并将所述管在42℃孵育2分钟。然后加入1μLSuperscriptTM II，并将所述管在42℃孵育50分钟。最后，通过在70℃加热15分钟终止所述反应。
实时PCR：PCR引物对和探针被设计以扩增部分标志物基因SEAP，并且18S引物被用于标准化来自实验组和对照组的组织之间的18S和SEAP的cDNA量。SEAP引物的序列是：5′-ACATGTGCCAGACAGTGGAGC-3′(正向)和5′-TCTGGAAGTTGCCCTTGACC-3′(反向)(IDT Inc.；Coralville，IA)。SEAP探针是6FAMCAG CCACGGCCTACCTGTGCG MGBNFQ(Applied Biosystems；Foster City，CA)。18S引物以及探针、TaqMan Master Mix也购自Applied Biosystems。所有的样本都用于检测SEAP基因和18S。在层流净化罩运行，双份样本被装入
Figure G2007800109500D00731
光学96-孔反应板(Applied Biosystems)。将10μL cDNA样本(包含0.3μg初始RNA)、0.25μL探针、12.5μL TaqMan MasterMix、1.125μL每种SEAP引物或10μLcDNA样本(包含0.5ng初始RNA)、1.25μL18S引物和探针和1.25μL不含RNA酶/DNA酶的水以及12.5μL TaqMan Master Mix加到每孔中。在ABI PRISM7000序列检测系统(Applied Biosystems)中运行所有的样本。数据通过18S标准化并且用Log2倍数变化表示实验组和对照动物之间的相对量上的差异。
结果(数据未显示)：进行该实验以鉴定将基因载体递送到猪十二指肠的有效方法。在给予壳聚糖/DNA多聚物之前，使用了四种预冲洗条件，包括5％N-乙酰半胱氨酸(NAC)、pH为5的19mM乙酸钠(NaOAc)缓冲液、5％NAC和10mM NaOAc合用以及单独的盐水。来自暴露于不同预冲洗条件的猪的RT-q-PCR结果表明5％NAC预冲洗以及5％NAC和19mM pH5的NaOAc缓冲液的联合产生了最有效的基因转移。既然上述两种预冲洗条件之间没有显著的统计学差异，我们推断单独的5％NAC预冲洗足以促进壳聚糖/DNA多聚物转导猪的十二指肠。单独的生理盐水预冲洗显示阴性结果，表明盐水冲洗不能促进十二指肠内的基因转导。
猪矩阵研究表明低分子量壳聚糖纳米颗粒在基因递送中更有效
如上述制备壳聚糖/DNA多聚物。
约克夏猪和优卡坦猪的护理上面已描述。
在上面所述标题猪十二指肠内人GIP启动子驱动的人胰岛素的表达下面描述了猪的处理。如上所述的NAC预冲洗被用于所有的实验以辅助基因转导。
结果(图13)：将NP20、40、60的DNA-壳聚糖多聚物C(24，98)和NP5、20、30的C(65，98)递送到十二指肠细胞以测试哪种多聚物提供最好的基因转导。来自暴露于不同DNA-壳聚糖多聚物的猪的RT-q-PCR结果显示24mer产生了最好的基因转移，并且在所述24mer制备物中所测试的不同的N:P比之间没有统计学上的显著差异。所述65mer也能够在较弱的程度产生基因转移。我们可以得出结论：C(24，98)提供了最有效的基因转移。
口服递送壳聚糖/DNA多聚物到小鼠胃和十二指肠
实施该实验以研究是否口服递送到小鼠的壳聚糖包装的质粒DNA能够导致基因转移到胃的粘膜细胞以及导致基因在胃粘膜细胞内的表达。携带GIP启动子连接的人胰岛素基因构建体或E1Fa启动子连接的SEAP基因的质粒与N:P比为40:1的壳聚糖(分子量：3.9kD，脱乙酰化度＝98％)混合。所述多聚物被如上所述包装和特征化。
禁食过夜的小鼠被喂以0.5mL含有壳聚糖包装的DNA多聚物([DNA]＝75μg/ml)的悬液，所述悬液经由饲管单次推注完。载体递送后4小时，处理的动物返回它们的笼中，自由进食和饮水。所述多聚物口部饲喂后2天，动物被处死且它们的胃粘膜通过组织刮片被收集。通过标准的逆转录实时定量PCR分析定量胰岛素或SEAP mRNA的水平。
如图14所示，单纯口部给予壳聚糖包装的DNA颗粒导致了胰岛素和SEAP基因在胃粘膜内成功的转染和表达，确定了体内肠粘膜细胞的转染可以通过口部给予非病毒基因载体来实现。
物理化学特性
颗粒大小
使用Zetasizer纳光散射仪(Malvern Instruments ZEN3600)进行颗粒大小的测量。通常，样本是未稀释的并装入一次性比色杯(Plastibrand759075D)内。所述Zetasizer被设定程序以在三次3-分钟测量前于25℃孵育样本3分钟。Z-平均值和多分散性(PDI)被报告。也可以设定所述Zetasizer的程序以就粘度和折光率来解释所述样本的组成。
ζ电位
使用Zetasizer纳光散射仪(Malvern Instruments ZEN3600)进行ζ电位的测量。通常，样本是未稀释的或在10mM NaCl中稀释5或10倍，并被装入Zetasizer折叠毛细管单元(Malvern Instruments DTS1060)。设计所述Zetasizer的程序以在测量前于25℃孵育样本3分钟。所述Zetasizer被编程以就粘度和介电常量解释所述样本的最终组成。

Claims (19)

1.包含基于壳聚糖的纳米微粒的组合物，所述基于壳聚糖的纳米颗粒包含(i)具有3kDa至250kDa的平均分子量的多个壳聚糖聚合物和(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜细胞时能够发挥治疗作用，以及其中所述基于壳聚糖的纳米微粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于4天的表达。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于14天的表达。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于60天的表达。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸的表达产物的系统水平的增加。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒是低分子量壳聚糖纳米颗粒，其中所述多个壳聚糖聚合物具有小于25kDa的平均分子量。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有10:1至90:1的N:P比。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有小于225nm的直径。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒是高分子量壳聚糖纳米颗粒，其中所述多个壳聚糖聚合物具有大于25kDa的平均分子量。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有2:1至40:1的N:P比。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有小于225nm的直径。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述表达调控区包含肠特异的调控序列。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述治疗性构建体还包含整合序列。
14.如权利要求13所述的组合物，还包含非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码整合元件的核酸序列，所述整合元件可操作连接到在肠粘膜前体细胞内有功能的第二表达调控区，并且其中所述第二表达调控区和所述可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区可以相同或不同。
15.包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述基于壳聚糖的纳米颗粒包含(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到表达调控区的整合元件的核酸，所述表达调控区在肠粘膜前体细胞内有功能。
16.在肠粘膜细胞表达治疗性核酸的方法，所述方法包括将肠粘膜与权利要求1所述的组合物接触，由此将所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜的肠粘膜细胞。
17.如权利要求16所述的方法，还包括将所述肠粘膜与权利要求15所述的组合物接触。
18.在肠粘膜细胞表达治疗性核酸的方法，包括将肠粘膜与权利要求14所述的组合物接触，由此将所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜的肠粘膜细胞。
19.引起治疗性核酸的表达产物的系统水平增加的方法，包括将肠粘膜与权利要求4所述的组合物接触，由此将所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜的肠粘膜细胞。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010503640A (ja) * 2006-09-15 2010-02-04 エフエムシー バイオポリマー エイエス オリゴヌクレオチド非ウイルスデリバリーシステム
CA2794923A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-07 Engene, Inc. Highly acidic chitosan-nucleic acid polyplex compositions
WO2012040832A1 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Mcmaster University Immunomodulatory nucleic acid composition comprising chitosan nanoparticles
CN103889457A (zh) * 2011-05-24 2014-06-25 波利威乐赞助有限公司 使用特异性的基于壳聚糖的纳米复合物用于有效并安全递送siRNA的组合物和方法
WO2015042711A1 (en) * 2013-09-25 2015-04-02 Engene, Inc. Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo
US11180538B2 (en) * 2015-11-13 2021-11-23 University Of Utah Research Foundation Combinatorial gene construct and non-viral delivery for anti-obesity
US11603398B2 (en) * 2016-11-09 2023-03-14 Engene, Inc. Intestinal expression of programmed death ligand 1
EP3693024A1 (en) * 2019-02-05 2020-08-12 Altona Diagnostics GmbH Control for nucleic acid preparation and/or detection methods

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3880826A (en) 1971-09-17 1975-04-29 Sami I Said Vasoactive intestinal peptide
WO1987003197A1 (en) 1985-11-29 1987-06-04 Fisons Plc Pharmaceutical composition including sodium cromoglycate
GB8601100D0 (en) 1986-01-17 1986-02-19 Cosmas Damian Ltd Drug delivery system
US5690954A (en) 1987-05-22 1997-11-25 Danbiosyst Uk Limited Enhanced uptake drug delivery system having microspheres containing an active drug and a bioavailability improving material
GB8723846D0 (en) 1987-10-10 1987-11-11 Danbiosyst Ltd Bioadhesive microsphere drug delivery system
GB8826116D0 (en) 1988-11-08 1988-12-14 Danbiosyst Ltd Adhesive drug delivery composition
GB8904370D0 (en) 1989-02-25 1989-04-12 Cosmas Damian Ltd Liquid delivery compositions
US5744166A (en) 1989-02-25 1998-04-28 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions
US6217857B1 (en) 1989-06-28 2001-04-17 Schering Corporation Cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) and pharmaceutical compositions thereof
US5231012A (en) 1989-06-28 1993-07-27 Schering Corporation Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (interleukin-10)
US5725871A (en) 1989-08-18 1998-03-10 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid
US5707644A (en) 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
US6312680B1 (en) 1990-06-29 2001-11-06 Timothy R. Mosmann Methods of treatment using cytokine synthesis inhibitory factor
GB9116610D0 (en) 1991-08-01 1991-09-18 Danbiosyst Uk Preparation of microparticles
US5833976A (en) 1991-08-06 1998-11-10 Schering Corporation Use of interleukin-10 (IL-10) to treat endotoxin- or superantigen-induced toxicity
JP3534749B2 (ja) 1991-08-20 2004-06-07 アメリカ合衆国 アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送
GB9202464D0 (en) 1992-02-05 1992-03-18 Danbiosyst Uk Composition for nasal administration
WO1993019660A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Baylor College Of Medicine Gene therapy using the intestine
US5681816A (en) 1992-04-24 1997-10-28 Korman; Louis Y. Method of inducing temporary paralysis of the gastrointestinal tract during medical procedure
AU685054C (en) 1992-05-14 2003-02-27 Baylor College Of Medicine Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy
GB9216082D0 (en) 1992-07-28 1992-09-09 Univ Nottingham Lymphatic delivery composition
US5368854A (en) 1992-08-20 1994-11-29 Schering Corporation Use of IL-10 to treat inflammatory bowel disease
GB9310412D0 (en) 1993-05-20 1993-07-07 Danbiosyst Uk Nasal nicotine system
US6004941A (en) 1993-06-14 1999-12-21 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US6348449B1 (en) 1993-09-21 2002-02-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of inducing mucosal immunity
US6054462A (en) 1994-04-13 2000-04-25 Janssen Pharmaceutica, N.V. Intranasal antimigraine compositions
US20010053359A1 (en) 1994-07-26 2001-12-20 Peter Watts Drug delivery composition for the nasal administration of antiviral agents
GB9416884D0 (en) 1994-08-20 1994-10-12 Danbiosyst Uk Drug delivery compositions
US6066333A (en) 1994-09-22 2000-05-23 William Harvey Research Limited Pharmaceutical control of inflammation
US6040295A (en) 1995-01-13 2000-03-21 Genemedicine, Inc. Formulated nucleic acid compositions and methods of administering the same for gene therapy
US5681744A (en) 1995-03-17 1997-10-28 Greenstein; Robert J. Delivery and expression of heterologus genes using upstream enhancer regions of mammalian gene promoters
US6531455B1 (en) 1995-03-24 2003-03-11 The Regents Of The University Of California Delivery of polynucleotides by secretory gland expression
US5885971A (en) 1995-03-24 1999-03-23 The Regents Of The University Of California Gene therapy by secretory gland expression
US5837693A (en) 1995-03-24 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Intravenous hormone polypeptide delivery by salivary gland expression
US6316007B1 (en) 1995-04-04 2001-11-13 Wound Healing Of Oklahoma Combined physical and immunotherapy for cancer
US6110456A (en) 1995-06-07 2000-08-29 Yale University Oral delivery or adeno-associated viral vectors
GB9514878D0 (en) 1995-07-20 1995-09-20 Danbiosyst Uk Vitamin E as a solubilizer for drugs contained in lipid vehicles
GB9516268D0 (en) 1995-08-08 1995-10-11 Danbiosyst Uk Compositiion for enhanced uptake of polar drugs from the colon
GB9525083D0 (en) 1995-12-07 1996-02-07 Danbiosyst Uk Vaccine compositions
GB9606188D0 (en) 1996-03-23 1996-05-29 Danbiosyst Uk Pollysaccharide microspheres for the pulmonary delivery of drugs
US6184037B1 (en) 1996-05-17 2001-02-06 Genemedicine, Inc. Chitosan related compositions and methods for delivery of nucleic acids and oligonucleotides into a cell
US6001816A (en) 1996-06-20 1999-12-14 Merck & Co., Inc. Gene therapy for leptin deficiency
EP0920339A2 (en) 1996-07-09 1999-06-09 The Johns Hopkins University Gene delivery system
GB2330534B (en) 1996-07-10 2000-09-06 Danbiosyst Uk Gene therapy delivery system for targeting to endothelia
US6225290B1 (en) 1996-09-19 2001-05-01 The Regents Of The University Of California Systemic gene therapy by intestinal cell transformation
GB9700624D0 (en) 1997-01-14 1997-03-05 Danbiosyst Uk Drug delivery composition
GB9707934D0 (en) 1997-04-18 1997-06-04 Danbiosyst Uk Improved delivery of drugs to mucosal surfaces
US5830730A (en) 1997-05-08 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Enhanced adenovirus-assisted transfection composition and method
GB9710699D0 (en) 1997-05-24 1997-07-16 Danbiosyst Uk Gastro-retentive controlled release system
US6127598A (en) 1997-07-25 2000-10-03 The Regents Of The University Of California NKX-2.2 and NKX-6.1 transgenic mouse models for diabetes, depression, and obesity
US6015709A (en) 1997-08-26 2000-01-18 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Transcriptional activators, and compositions and uses related thereto
WO1999027905A1 (en) 1997-12-02 1999-06-10 West Pharmaceutical Services Drug Delivery & Clinical Research Centre Limited Compositions for nasal administration
DE69921773D1 (de) 1998-01-16 2004-12-16 Univ Johns Hopkins Orale verabreichung von nukleinsäure-impstoffen durch partikelkomplexe
US6537813B1 (en) 1998-02-13 2003-03-25 Selective Genetics, Inc. Concurrent flow mixing methods and apparatuses for the preparation of gene therapy vectors and compositions prepared thereby
EP1100548A2 (en) 1998-07-28 2001-05-23 Advanced Tissue Sciences, Inc. Genetically engineered cells and tissues
US5989910A (en) 1998-08-03 1999-11-23 University Of Lausanne Potent genetic switch allowing regulated gene expression in eukaryotic cells
AU5898599A (en) 1998-08-19 2000-03-14 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for genomic modification
FR2782732A1 (fr) 1998-08-28 2000-03-03 Transgene Sa Systeme d'expression inductible
AU770726B2 (en) 1998-10-20 2004-02-26 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Use of a cytokine-producing lactococcus strain to treat colitis
GB9823246D0 (en) 1998-10-24 1998-12-16 Danbiosyst Uk A nasal drug delivery composition
US6251599B1 (en) 1998-11-06 2001-06-26 Selective Genetics, Inc. Stabilized nucleic acid compositions and methods of preparation and use thereof
GB9828861D0 (en) 1998-12-31 1999-02-17 Danbiosyst Uk Compositions
US6503887B1 (en) 1999-02-19 2003-01-07 Matthew During Peroral gene therapy of diabetes and obesity
GB9904627D0 (en) 1999-03-02 1999-04-21 Danbiosyst Uk Polymer compositions for polynucleotide delivery
US6967019B2 (en) 1999-04-06 2005-11-22 The Regents Of The University Of California Production of pancreatic islet cells and delivery of insulin
US6746870B1 (en) 1999-07-23 2004-06-08 The Regents Of The University Of California DNA recombination in eukaryotic cells by the bacteriophage PHIC31 recombination system
US20030036520A1 (en) 1999-07-23 2003-02-20 Jack Gauldie Intestinal gene therapy
WO2001061049A1 (en) 2000-02-18 2001-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Altered recombinases for genome modification
AU4175101A (en) 2000-02-23 2001-09-03 Univ California Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation
EP1274464B1 (en) 2000-03-13 2011-09-21 Engene, Inc. Compositions and methods for regulated protein expression in gut
CA2416701A1 (en) 2000-07-21 2002-01-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agricul Ture Methods for the replacement, translocation and stacking of dna in eukaryotic genomes
US20030157071A1 (en) * 2001-05-31 2003-08-21 Wolfe M. Michael Treatment or replacement therapy using transgenic stem cells delivered to the gut
DE60132094T3 (de) 2001-10-26 2012-02-02 Octoplus Polyactive Sciences B.V. Verfahren zur Herstellung von gereinigten Partikeln
NO317654B1 (no) 2002-05-03 2004-11-29 Stiftelsen Biopolymer Formulering som inneholder en nukleinsyre og et kitosan, fremgangsmate for fremstilling av formuleringen, samt anvendelser derav.
NO317653B1 (no) 2002-05-03 2004-11-29 Stiftelsen Biopolymer Formulering som omfatter komplekser av kitosanoligomerer og nukleinsyre, fremgangsmate for a fremstille formuleringen samt anvendelser derav.
US8304233B2 (en) 2002-06-04 2012-11-06 Poetic Genetics, Llc Methods of unidirectional, site-specific integration into a genome, compositions and kits for practicing the same
AU2003304425A1 (en) 2002-06-04 2005-03-07 Michele Calos Methods of unidirectional, site-specific integration into a genome, compositions and kits for practicing the same
US20090075383A1 (en) 2005-11-04 2009-03-19 Bio Syntech Canada Inc. Composition and method for efficient delivery of nucleic acids to cells using chitosan

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