CN104395391B - 双重衍生化的壳聚糖纳米粒子以及制造和使用其用于体内基因转移的方法 - Google Patents

双重衍生化的壳聚糖纳米粒子以及制造和使用其用于体内基因转移的方法 Download PDF

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Abstract

本文中提供了用精氨酸和葡糖酸双重衍生化的壳聚糖；以及制造和使用其例如用于体内基因传递的方法。

Description

双重衍生化的壳聚糖纳米粒子以及制造和使用其用于体内基 因转移的方法
技术领域
本发明一般涉及包含双重衍生化的壳聚糖的纳米粒子，以及制造和使用其用于体内传递核酸，例如基因转移的方法。
发明背景
壳聚糖是N-乙酰基-D-葡糖胺与D-葡糖胺的共聚物，它是一种无毒的阳离子型共聚物。壳聚糖可以与核酸形成复合物，并作为一种生物相容且无毒的多醣，它已经用作DNA传递媒介物来转染细胞。归因于病毒包膜的复杂性和潜在毒性，故很多的兴趣集中将壳聚糖用于核酸的非病毒传递中。
为了鉴别出非常适合基因转染的组合物，已经检验了许多壳聚糖/DNA复合物，包括经过修饰的壳聚糖与核酸之间的复合物。参见例如WO2010/088565；WO2008/082282。已经发现所述复合物尤其在溶解性、聚集倾向、复合物稳定性、粒度、释放DNA的能力和转染功效方面不同。
本文中意外地发现了精氨酸和葡糖酸协同地作用，从而提高了壳聚糖的转染功效。
发明概要
本文公开的是意外地发现了精氨酸和葡糖酸协同地增加壳聚糖纳米粒子的转染功效。因此，本文提供了新颖的组合物来促进例如体内核酸传递到细胞、组织和器官。具体地说，本文提供了基于双重衍生化的壳聚糖的纳米粒子，其中所述纳米粒子任选地进一步包含核酸。
在一个实施方案中，纳米粒子包含至少与氨基酸偶合的壳聚糖。在一个优选实施方案中，氨基酸带正电。在一个更优选实施方案中，氨基酸是精氨酸。
在另一个实施方案中，纳米粒子包含与有机酸、优选地与葡糖酸偶合的壳聚糖。
在另一个实施方案中，纳米粒子包含与精氨酸和葡糖酸两者偶合的壳聚糖，参见例如式I
其中n是1到2000的整数，
α是精氨酸的官能度，
β是葡糖酸的官能度；以及
每一R1独立地选自氢、乙酰基、式(II)和式(III)。
如本文所描述的双重衍生化的壳聚糖包含不同初始浓度百分比或最终官能化百分比的精氨酸和葡糖酸。初始浓度百分比用于经葡糖酸修饰的壳聚糖，其表示葡糖酸上的羧基除以壳聚糖或经精氨酸修饰的壳聚糖上的总氨基的摩尔比，而最终官能化百分比表示由元素分析得到的碳和氮重量比计算的最终修饰的壳聚糖的官能度。在一个实施方案中，壳聚糖与约5％到约60％、例如约8％到约30％的初始浓度的葡糖酸偶合。在另一个实施方案中，优选地是约30％。在另一个实施方案中，壳聚糖与约10％到约55％的最终浓度的精氨酸偶合。
具体地说，由此类双重衍生化的壳聚糖(“DD-壳聚糖”)形成的壳聚糖-核酸多聚复合物(polyplex)展现转染功效比由未官能化的壳聚糖或与单个氨基酸残基、氨基酸聚合物或者单独葡糖酸残基结合的壳聚糖形成的核酸多聚复合物高。其它通过在本文中描述的多聚复合物中使用双重官能化的壳聚糖所赋予的需要特性包括提高的渗透粘液屏障的能力、增加的多聚复合物稳定性、减小的细胞毒性和增强的细胞内核酸释放。此外，在一些优选实施方案中，主题DD-壳聚糖多聚复合物组合物可以在生理pH值下施用(例如全身性施用)。
因此，在一个方面，本发明提供了DD-壳聚糖核酸多聚复合物。DD-壳聚糖核酸多聚复合物包含经精氨酸和葡糖酸双重衍生化的壳聚糖。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物在低于DD-壳聚糖的pKa的pH值下形成。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物在低于7的pH值下形成。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物具有1％-60％的精氨酸与葡糖酸的组合官能度。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物具有1％-30％的精氨酸与葡糖酸的组合官能度。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物中精氨酸与葡糖酸的摩尔比在100:1与1:100之间。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物中精氨酸与葡糖酸的摩尔比在50:1与1:50之间。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物中精氨酸与葡糖酸的摩尔比在10:1与1:10之间。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物中精氨酸与葡糖酸的摩尔比在5:1与1:5之间。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物中精氨酸与葡糖酸的摩尔比在2:1与1:2之间。
在优选的实施方案中，精氨酸与葡糖酸的摩尔比与壳聚糖的分子量成反比，即，较小分子量的DD-壳聚糖需要较高的精氨酸与壳聚糖的摩尔比，且反之亦然。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物的核酸是DNA。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物的核酸是RNA。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物的核酸是人工核酸。在一个优选实施方案中，人工核酸选自肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物的核酸是治疗核酸。在一个实施方案中，治疗核酸是治疗RNA。在一个优选实施方案中，治疗RNA选自反义RNA、siRNA、短发夹RNA、微RNA和酶RNA。
在一个实施方案中，治疗核酸是DNA。
在一个实施方案中，治疗核酸包含编码治疗蛋白质的核酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种包含多个DD-壳聚糖核酸多聚复合物的组合物。
在一个实施方案中，组合物具有3.0-8.0之间、更优选地4.0-7.0之间且最优选地4.5-6.5之间的pH值。
在一个方面，本发明提供了一种包含本发明的DD-壳聚糖核酸多聚复合物的药物组合物。在一个优选实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物包含治疗核酸。
在一个方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。
在一个实施方案中，主题药物组合物在生理pH值下施用。
在一个实施方案中，主题药物组合物全身性施用。
在一个实施方案中，主题药物组合物局部施用目标组织。在一个优选实施方案中，主题药物组合物施用粘膜组织。在一个实施方案中，粘膜组织是GI组织。
在一个方面，本发明提供了一种包含DD-壳聚糖核酸多聚复合物的疫苗，其中所述核酸编码抗原。
在一个方面，本发明提供了用于接种患者的方法。所述方法包括向患者施用本发明的疫苗。
在一个方面，本发明提供了一种包含DD-壳聚糖核酸多聚复合物的免疫原性组合物，其中所述核酸编码免疫原。
在一个方面，本发明提供了用于引发或增加对感兴趣分子的免疫反应的方法。所述方法包括向患者施用本发明的免疫原性组合物，其中所述核酸编码感兴趣分子的表位。
附图简述
图1是制造经精氨酸和葡糖酸双重衍生化，产生两种偶合组分之间的最佳官能度组合的壳聚糖的工艺的流程图。
图2展示与(A)10％、30％或60％初始浓度(x轴)的葡糖酸或(B)9.7％、12.3％、26％或52％最终官能度(x轴)的精氨酸偶合的24聚体壳聚糖的转染功效(每毫克蛋白质的SEAP纳克数；y轴)。
图3展示在20的胺/磷酸酯(N/P)比率下用(A)与精氨酸和葡糖酸双重偶合到26％精氨酸和5％葡糖酸的最终官能度；(B)与单独精氨酸偶合到26％的最终官能度；或(C)与相对于总胺30％葡糖酸的初始浓度的单独葡糖酸偶合的24聚体壳聚糖制造的多聚复合物的转染功效(每毫克蛋白质的SEAP纳克数；y轴)。
图4展示在20的胺/磷酸酯(N/P)比率下用与单独26％精氨酸的最终官能化偶合(0％；x轴)或进一步与葡糖酸偶合到3％、5％、6％和9％的葡糖酸最终官能度(x轴)的24聚体壳聚糖制造的多聚复合物的转染功效(每毫克蛋白质的SEAP纳克数；y轴)。
图5展示40(N40)、20(N20)或10(N10)的胺/磷酸酯(N/P)比率(x轴)对用分别26％和5％最终官能度的精氨酸和葡糖酸双重衍生化的24聚体壳聚糖(小方框)或与单独26％精氨酸偶合的壳聚糖(大方框)的转染功效(每毫克蛋白质的SEAP纳克数；y轴)的作用。
图6展示调配物的pH值(x轴)对用分别26％和5％最终官能度的精氨酸和葡糖酸双重衍生化的24聚体壳聚糖(小方框)或仅仅与26％最终官能度的精氨酸偶合的壳聚糖(大方框)的转染功效(每毫克蛋白质的SEAP纳克数)的作用。
图7展示精氨酸官能化百分比对经52％(A、B)或26％(C、D)最终浓度的单独的精氨酸(A、C)或还经8％(B)或6％(D)最终浓度的葡糖酸衍生化的24聚体壳聚糖的转染功效(每毫克蛋白质的SEAP纳克数；y轴)的作用。还包括与30％初始浓度的单独葡糖酸(E)偶合的24聚体壳聚糖作为参考。
图8展示在(A)293T细胞、(B)HT1080或Hela人类细胞系或(C)猴VERO或鼠类NIH3T3细胞系中经分别26％和5％最终官能度的精氨酸和葡糖酸双重衍生化的24聚体壳聚糖(小方框)或与单独26％精氨酸偶合的壳聚糖(大方框)的转染功效。
图9展示在肌肉内注射壳聚糖(A)、经26％精氨酸官能化的壳聚糖(B)和经最终官能度26％精氨酸和5％葡糖酸双重官能化的壳聚糖(C)两天后肌肉中的基因表达。
图10展示在通过结肠传递壳聚糖(A)、经26％精氨酸官能化的壳聚糖(B)和经最终官能度26％精氨酸和6％葡糖酸双重官能化的壳聚糖(C)两天后末端结肠中的基因表达。
图11展示包含在40的胺/磷酸酯(N/P)比率下产生且(A)与单独26％精氨酸偶合或(B)经26％精氨酸和5％最终官能度的葡糖酸双重衍生化的24聚体壳聚糖的萤光素酶siRNA多聚复合物的体外敲减功效。
图12展示在室温下储存3个月后用水复原后的冻干DD-壳聚糖-核酸多聚复合物的物理化学性质。
发明详述
壳聚糖是壳多糖的脱乙酰基化形式，壳多糖是作为甲壳类动物(例如虾、蟹、龙虾)的外骨骼主要组分的N-乙酰基葡糖胺的聚合物。壳聚糖是由壳多糖通过脱乙酰基化形成，因而它不是单个的聚合物分子，而是具有不同的分子量和不同的脱乙酰基化程度的一类分子。在商业壳聚糖中脱乙酰基化百分比典型地在50％-100％之间。
本文中描述的壳聚糖衍生物是通过如本文所描述，用带正电或中性部分将所得游离氨基官能化来产生。本文中描述的衍生化的壳聚糖具有许多有利于核酸传递媒介物的特性，包括：其有效地与带负电的核酸结合和复合，其可以形成具有可控制的尺寸的纳米粒子，其可以被细胞吸收，且其可以在细胞内在适当时间释放核酸。
具有超过50％的任何脱乙酰基化程度的壳聚糖用于本发明中，其中官能化在1％与50％之间(官能化百分比是相对于壳聚糖聚合物上的游离氨基部分的数目确定)。脱乙酰基化程度和官能度赋予官能化的壳聚糖衍生物特定的电荷密度。所得电荷密度影响溶解性、核酸结合和随后释放以及与哺乳动物细胞膜的相互作用。因此，根据本发明，这些特性必须为达到最佳功效而最佳化。例示性壳聚糖衍生物描述于Baker等人2007年1月24日提出的11/657,382(其以引用的方式并入本文中)中。在一个实施方案中，本文中描述的双重衍生化的壳聚糖包含具有至少50％的脱乙酰基化程度的壳聚糖。在一个实施方案中，脱乙酰基化程度是至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，且最优选地至少95％。在一个优选实施方案中，本文中描述的双重衍生化的壳聚糖包含具有至少98％的脱乙酰基化程度的壳聚糖。
本文中描述的壳聚糖衍生物具有在中性和生理pH值下可溶的平均分子量范围，且出于本发明的目的，包括3-110kDa范围内的分子量。本文中描述的实施方案提供了较低平均分子量的衍生化的壳聚糖(<25kDa，例如从约5kDa到约25kDa)，其可以具有合乎需要的传递和转染特性，且尺寸小并具有良好的溶解性。较低平均分子量的衍生化的壳聚糖一般比较高分子量更可溶，前者因此产生将更容易地释放核酸并增加细胞转染的核酸/壳聚糖复合物。许多文献已经致力于最佳化基于壳聚糖的传递系统的所有这些参数。
本领域技术人员将认识到，壳聚糖是指具有式I结构的多个分子，其中n是任何整数，且每一R1是氢。还有，称为具有例如3kD到110kD的平均分子量的壳聚糖一般是指分别具有例如3kD到110kD的重量平均分子量的多个壳聚糖分子，其中每一壳聚糖分子可具有不同的链长(n+2)。还公认的是，称为“n聚体壳聚糖”的壳聚糖不一定包含式I的壳聚糖分子，其中每一壳聚糖分子具有n+2的链长。更确切些，如本文所用的“n聚体壳聚糖”是指多个壳聚糖分子，每一者可以具有不同的链长，其中所述多个具有基本上类似于或等于具有链长n的壳聚糖分子的平均分子重量。举例来说，24聚体壳聚糖可以包含多个壳聚糖分子，每一者具有例如7-50范围内的不同的链长，但其具有基本上类似或等于具有链长24的壳聚糖分子的重量平均分子量。
本文中描述的官能化的壳聚糖衍生物是双重衍生化的壳聚糖化合物，例如壳聚糖-精氨酸-葡糖酸化合物。一般说来，壳聚糖-精氨酸-葡糖酸化合物具有以下式I结构
其中n是1到2000的整数，
α是精氨酸的官能度，
β是葡糖酸的官能度；以及
每一R1独立地选自氢、乙酰基、式(II)和式(III)。
根据本发明用于在水性介质中将壳聚糖与精氨酸或葡糖酸结合的一种优选方法描述于本文中，其中使用Boc-L-精氨酸(Boc-R)和葡糖酸(Gluco)。所述方法利用众所周知的水溶性1-乙基--3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来催化壳聚糖主链上的胺与Boc-R或葡糖酸上的羧酸之间的酰胺的形成。
一般说来，调节pH值以实现例如6.0±0.5且更优选6.0±0.2的目标偶合pH值的稀HCl溶液中的壳聚糖首先与Boc-R或Gluco偶合，纯化，接着与第二官能团偶合。举例来说，如果壳聚糖先与精氨酸偶合，那么精氨酸偶合的壳聚糖(R-壳聚糖)可以进行纯化，接着与葡糖酸偶合。相反地，如果壳聚糖先与葡糖酸偶合，那么葡糖酸偶合的壳聚糖(gluco-壳聚糖)可以进行纯化，接着与精氨酸偶合。不管偶合次序如何，精氨酸和葡糖酸都可以与壳聚糖使用众所周知的方法偶合。
举例来说，精氨酸可以通过添加具有调节pH值的Boc-R与NHS水溶液的混合物到含壳聚糖的稀HCl中，接着添加EDC水溶液以引发在室温下偶合24小时，来与壳聚糖或gluco官能化的壳聚糖(gluco-壳聚糖)偶合。可以预先计算壳聚糖胺的浓度、反应pH值和R-COOH对壳聚糖胺和EDC:NHS:R-COOH的摩尔比，并满足具有可再生的精氨酸的最终官能度。Boc-R-壳聚糖可以在脱Boc反应前纯化。脱Boc可以在HCl介质中在控制的HCl浓度和反应时间下进行。在脱Boc期间壳聚糖的任何解聚都可以通过测量反应溶液的粘度来监测，经证明，解聚是可以忽略的，且脱Boc的功效可以通过对脱Boc-R-壳聚糖和Boc-R-壳聚糖进行质子NMR来确定。官能度可以根据纯化的脱Boc-R-壳聚糖的C、N元素分析来确定。
葡糖酸可以与壳聚糖或精氨酸偶合的壳聚糖(R-壳聚糖)在6.0±0.3的反应pH值下偶合。在此pH值下，葡糖酸的羧酸基可以根据亲核取代反应机理，通过壳聚糖主链上的脱偶合胺来攻击。本领域技术人员将认识到，当葡糖酸与R-壳聚糖偶合时，也可能少量的葡糖酸可通过相同的机制与精氨酸的氨基形成共价键，不过很可能将主要与壳聚糖主链的氨基发生亲核取代反应。因而，在某些实施方案中，式I的R1也可以独立地选自氢、乙酰基、式(II)、式(III)和式(IV)。
Boc-R-壳聚糖、脱Boc-R-壳聚糖、gluco-壳聚糖和/或双重衍生化的壳聚糖可以通过沉淀，或柱处理，或常规的渗析，或使用适当分子量截留(MWCO)的纤维素渗析管，相对于Milli-Q水进行反向流渗析，或通过切向流过滤(TFF)和渗滤筒来纯化。
因此，“双重衍生化的壳聚糖”或“DD-壳聚糖”也是指已经双重官能化的壳聚糖(“双重官能化的壳聚糖”或“DF-壳聚糖”)，例如与精氨酸和葡糖酸两者偶合，所述两者都共价附接到壳聚糖。精氨酸可以呈单个氨基酸或者呈多肽共价附接到壳聚糖。
如本文所用，除非另外指明，否则术语“肽”和“多肽”可互换使用。
术语“多肽”以其最广泛意义使用，是指常规的多肽(即含有L或D-氨基酸的短的多肽)，以及保留所需功能活性的肽的同等物、肽类似物和肽模拟物。肽的同等物与常规肽的不同之处可能在于一个或多个氨基酸经相关有机酸、氨基酸等置换，或侧链或官能团的取代或修饰。
肽模拟物可以具有一个或多个经替代键置换的肽键，如本领域中所知。部分或所有的肽主链还可以经构象限制的环状烷基或芳基取代基置换以限制功能性氨基酸侧链的移动性，如本领域中所知。
本发明的多肽可以通过例如本领域中众所周知的重组和合成方法等公认的方法产生。用于合成肽的技术是众所周知的并包括以下中所描述的技术：Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2456(1963)，Atherton等人,Solid Phase PeptideSynthesis:A Practical Approach,IRL Press(1989)；以及Merrifield,Science 232:341-347(1986)。
如本文所用，“线性多肽”是指缺乏共价附接到其构成氨基酸侧链的分支基团的多肽。如本文所用，“分支多肽”是指包含共价附接到其构成氨基酸侧链的分支基团的多肽。
如本文所用，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸以及非天然存在的氨基酸，例如氨基酸类似物。术语“氨基酸”是指天然存在的(D)或(L)氨基酸、化学修饰的氨基酸、天然存在的氨基酸(例如正白胺酸)和具有本领域中已知是氨基酸的特点的特性的化学合成的化合物。
肽中的氨基酸残基按本领域中标准来缩写。
在一些实施方案中，适当时，DD-壳聚糖包括DD-壳聚糖衍生物，例如并入额外官能化的DD壳聚糖，例如附接有配体的DD-壳聚糖。应了解“衍生物”包括一大类包含共价修饰的N-乙酰基-D-葡糖胺和/或D-葡糖胺单位的基于壳聚糖的聚合物以及并入其它单元或附接到其它部分的基于壳聚糖的聚合物。衍生物经常是基于葡糖胺的羟基或氨基的修饰，例如精氨酸官能化的壳聚糖所进行的。壳聚糖衍生物的实例包括(但不限于)三甲基化壳聚糖、聚乙二醇化壳聚糖、硫醇化壳聚糖、半乳糖苷化壳聚糖、烷基化壳聚糖、并入PEI的壳聚糖、糖醛酸修饰的壳聚糖、二醇壳聚糖等等。关于壳聚糖衍生物上的进一步教示，参见例如“Non-viral Gene Therapy”,K.Taira,K.Kataoka,T.Niidome(编辑),Springer-VerlagTokyo,2005,ISBN 4-431-25122-7第63-74页；Zhu等人,Chinese Science Bulletin,2007年12月,第52卷(23),第3207-3215页；以及Varma等人,Carbohydrate Polymers 55(2004)77-93。
分散系统由称为分散相的颗粒物质分布在整个连续介质中组成。DD-壳聚糖核酸多聚复合物的“分散液”是包含水合DD-壳聚糖核酸多聚复合物的组合物，其中多聚复合物分布在整个介质中。
如本文所用，“浓缩前”分散液是尚未进行浓缩工艺，形成浓分散液的分散液。
如本文所用，“基本上不含”多聚复合物沉淀意指组合物基本上没有可以通过肉眼观察而观测到的粒子。
如本文所用，生理pH值是指6到8之间的pH值。
“DD-壳聚糖核酸多聚复合物”或其语法上的同等物意指包含多个DD-壳聚糖分子和多个核酸分子的复合物。在一个优选实施方案中，双重衍生化的壳聚糖与所述核酸复合。
DD-壳聚糖核酸多聚复合物包含核酸组分和DD-壳聚糖组分。壳聚糖和DD-壳聚糖核酸多聚复合物可以通过本领域中所知的任何方法制备。举例来说，官能化的壳聚糖和核苷酸原料浓度可以调节以提供各种胺与磷酸酯比率(N/P)、混合比和目标核苷酸浓度。在一些实施方案中,尤其是少量批料，例如2mL以下的批料，官能化的壳聚糖和核苷酸原料可以通过缓慢滴加核苷酸原料到官能化的壳聚糖原料，同时使容器发生涡动来混合。在其它实施方案中，官能化的壳聚糖和核苷酸原料可以通过在管线中混合两种流体流来混合。在其它实施方案中，所得多聚复合物分散液可以通过TFF浓缩。一种优选的用于多聚复合物形成的方法公开于WO 2009/039657中，该文献以引用的方式整体明确地并入本文中。
本发明的核酸将一般含有磷酸二酯键，不过在一些情况下，包括可并入替代主链或其它修饰或部分以达成各种目的中任一者，例如稳定性和保护的核酸类似物。其它涵盖的类似核酸包括具有非核糖主链的核酸。另外，可制造天然存在的核酸、类似物和两者的混合物。核酸可以是单股或双股的，或含有双股或单股序列的一部分。核酸包括(但不限于)DNA、RNA和混杂物，其中核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等碱基的任何组合。核酸包括任何形式的DNA、任何形式的RNA，包括三股螺旋、双螺旋或单股、反义、siRNA、核糖酶、脱氧核糖酶、聚核苷酸、寡核苷酸、嵌合体、微RNA和其衍生物。核酸包括人工核酸，包括(但不限于)肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
在一个实施方案中，核酸组分包含治疗核酸。主题DD-壳聚糖核酸多聚复合物可使用本领域中所知的任何治疗核酸。治疗核酸包括治疗RNA，其是能够在哺乳动物细胞中发挥治疗作用的RNA分子。治疗RNA包括(但不限于)反义RNA、siRNA、短发夹RNA、微RNA和酶RNA。治疗核酸包括(但不限于)打算形成三股螺旋分子的核酸、蛋白质结合核酸、核糖酶、脱氧核糖酶和小的核苷酸分子。
很多类型的治疗RNA为本领域中已知。例如参见Grimm等人,Therapeuticapplication of RNAi:is mRNA targeting finally ready for prime time？J.Clin.Invest.,117:3633-3641,2007；Aagaard等人,RNAi therapeutics:Principles,prospects and challenges,Adv.Drug Deliv.Rev.,59:75-86,2007；Dorsett等人,siRNAs:Applications in functional genomics and potential as therapeutics,Nat.Rev.Drug Discov.,3:318-329,2004。这些包括双股短干扰RNA(siRNA)。
治疗核酸还包括编码包括细胞毒性蛋白质和前药在内的治疗蛋白质的核酸。
在一个优选实施方案中，核酸组分包含治疗核酸构建体。治疗核酸构建体是能够发挥治疗作用的核酸构建体。治疗核酸构建体可以包含编码治疗蛋白质的核酸以及产生作为治疗RNA的转录物的核酸。治疗核酸可以通过用作有缺陷基因的替换或增强而用于实现遗传疗法，或通过编码治疗产物而用于补偿具体基因产物的缺乏。治疗核酸还可以抑制内源性基因的表达。治疗核酸可以编码所有或一部分翻译产物，并可以通过与已存在于细胞中的DNA重组，由此替换基因的缺陷部分而起作用。其还可以编码蛋白质的一部分并借助于基因产物的共同抑制来发挥其作用。在一个优选实施方案中，治疗核酸选自以引用的方式明确并入本文中的U.S.S.N.11/694,852中公开的治疗核酸。
在一个优选实施方案中，治疗核酸编码选自以下的治疗蛋白质：激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管生成的因子、影响血块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血液胆固醇水平的因子、影响血液LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄入的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响炎症的因子和影响骨形成的因子。尤其优选的是编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、胃饥饿素、缩胆囊肽、生长激素、凝血因子、PYY、促红细胞生成素、炎症抑制剂、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFα拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗核酸。
表达控制区域
在一个优选实施方案中，本发明的多聚复合物包含治疗核酸，所述治疗核酸是治疗构建体，包含可操作地连接于编码区域的表达控制区域。治疗构建体产生治疗核酸，其可以自身是治疗性的，或可以编码治疗蛋白质。
在一些实施方案中，治疗构建体的表达控制区域具有固有活性。在许多优选实施方案中，治疗构建体的表达控制区域不具有固有活性。此提供了治疗核酸的动态表达。“动态”表达意指随着时间改变的表达。动态表达可以包括由可检测的表达的时段分开的低表达或无表达的若干此类时段。在许多优选实施方案中，治疗核酸可操作地连接于可调控的启动子。此提供了治疗核酸的可调控的表达。
表达控制区域包含调控聚核苷酸(本文中有时称为元件)，例如启动子和增强子，其影响可操作地连接的治疗核酸的表达。
本文中包括的表达控制元件可以来自细菌、酵母、植物或动物(哺乳动物或非哺乳动物)。表达控制区域包括全长启动子序列，例如天然启动子和增强子元件，以及保留所有或一部分全长或非变异功能(例如保留一定量的营养调控或细胞/组织特异性表达)的子序列或聚核苷酸变异体。如本文所用，术语“功能性”和其语法上的变体在关于核酸序列、子序列或片段使用时，意指序列具有天然核酸序列(例如非变异或未修饰的序列)的一个或多个功能。如本文所用，术语“变异体”意指序列取代、缺失或添加或其它修饰(例如化学衍生物，例如对核酸酶有抗性的修饰形式)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指这样描述的组分实体并置以允许它们以其预期方式起作用。在与核酸可操作地连接的表达控制元件的实例中，这种关系使得控制元件调节核酸的表达。典型地，调节转录的表达控制区域并置于转录核酸的5'端附近(即“上游”)。表达控制区域还可以位于转录序列的3'端(即“下游”)或转录物内(例如内含子中)。表达控制元件可以位于离转录序列一定距离处(例如离核酸100到500、500到1000、2000到5000或更多核苷酸)。表达控制元件的一个特定实例是启动子，其通常位于转录序列的5'。表达控制元件的另一实例是增强子，其可以位于转录序列的5'或3'，或转录序列内。
一些表达控制区域赋予可操作地连接的治疗核酸以可调控的表达。信号(有时称为刺激)可以增加或减少可操作地连接于此类表达控制区域的治疗核酸的表达。响应于信号而增加表达的此类表达控制区域经常称为可诱导的。响应于信号而降低表达的此类表达控制区域经常称为可抑制的。典型地，此类元件所赋予的增加或减少的量与所存在的信号的量成比例；信号的量越大，表达的增加或减少越大。
本领域中已知许多可调控的启动子。优选的可诱导的表达控制区域包括包含经小分子化合物刺激的可诱导的启动子的表达控制区域。在一个实施方案中，表达控制区域对经口可传递，但通常在食物中未发现的化学品起反应。具体实例可以见于例如美国专利号5,989,910、5,935,934、6,015,709和6,004,941中。
在一个实施方案中，治疗构建体进一步包含整合序列。在一个实施方案中，治疗构建体包含单个整合序列。在另一个实施方案中，治疗构建体包含用于将治疗核酸或其一部分整合到目标细胞的基因组中的第一和第二整合序列。在一个优选实施方案中，整合序列与选自以下的整合部件组合来起作用：水手转座子(mariner)、睡美人转座子(sleepingbeauty)、FLP、Cre、ФC31、R、λ和来自例如AAV、反转录病毒和慢病毒等整合病毒的整合部件。
在一个实施方案中，主题组合物除治疗构建体外还包含非治疗构建体，其中非治疗构建体包含编码可操作地连接于第二表达控制区域的整合部件的核酸序列。此第二表达控制区域和可操作地连接于治疗核酸的表达控制区域可以是相同或不同的。所编码的整合部件优选地选自水手转座子、睡美人转座子、FLP、Cre、ФC31、R、λ和来自例如AAV、反转录病毒和慢病毒等整合病毒的整合部件。
为进一步教示，参见WO2008020318，其以引用的方式整体明确地并入本文中。在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物的核酸是人工核酸。
优选的人工核酸包括(但不限于)肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物的核酸是治疗核酸。在一个实施方案中，治疗核酸是治疗RNA。优选的治疗RNA包括(但不限于)反义RNA、siRNA、短发夹RNA、微RNA和酶RNA。
在一个实施方案中，治疗核酸是DNA。
在一个实施方案中，治疗核酸包含编码治疗蛋白质的核酸序列。
多聚复合物
在一个优选实施方案中，组合物的多聚复合物包含在官能化前平均分子量小于110kDa、更优选地小于65kDa、更优选地小于50kDa、更优选地小于40kDa且最优选地小于30kDa的壳聚糖分子。在一些实施方案中，组合物的多聚复合物包含在官能化前平均分子量小于15kDa、小于10kDa、小于7kDa或小于5kDa的壳聚糖。
在一个优选实施方案中，多聚复合物包含平均具有小于680个葡糖胺单体单元、更优选地小于400个葡糖胺单体单元、更优选地小于310个葡糖胺单体单元、更优选地小于250个葡糖胺单体单元且最优选地小于190个葡糖胺单体单元的壳聚糖分子。在一些实施方案中，多聚复合物包含平均具有小于95个葡糖胺单体单元、小于65个葡糖胺单体单元、小于45个葡糖胺单体单元或小于35个葡糖胺单体单元的壳聚糖分子。
在一个优选实施方案中，主题多聚复合物具有2到100，例如2到50，例如2到40，例如2到30，例如2到20，例如2到5的胺与磷酸酯(N/P)比率。优选地，N/P比率与壳聚糖的分子量成反比，即，较小分子量的DD-壳聚糖需要较高的精N/P比率，且反之亦然。
在一个优选实施方案中，主题多聚复合物具有小于1000nm、更优选地小于500nm且最优选地小于200nm的平均流体动力学直径。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物具有在酸性pH值，例如低于7的pH值，最优选地约4到6之间的pH值下，至少0mV的平均ζ电位。
在一个实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物具有酸性pH值下+1到+60mV、更优选地+1到+40mV、更优选地+1到+30mV之间的平均ζ电位。
在一个优选实施方案中，在生理pH值和低于6的pKa下多肽具有低的净正电荷、不带电或净负电荷。此类DD-壳聚糖核酸多聚复合物显示减小的细胞毒性和增强的细胞内核酸释放。
组合物的DD-壳聚糖核酸多聚复合物在多聚复合物尺寸方面优选地是均一的。因此，在一个优选实施方案中，组合物具有低的平均多分散指数(“PDI”)。在一个尤其优选的实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物分散液具有小于0.5、更优选地小于0.4、更优选地小于0.3且最优选地小于0.25的PDI。
主题组合物的多聚复合物优选地在组合物中是基本上尺寸稳定的。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含在室温下历时6小时、更优选地12小时、更优选地24小时且最优选地48小时，平均直径增加小于100％、更优选地小于50％且最优选地小于25％的多聚复合物。
主题组合物的多聚复合物优选地在冷却条件下是基本上尺寸稳定的。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含在2-8℃下历时6小时、更优选地12小时、更优选地24小时且最优选地48小时，平均直径增加小于100％、更优选地小于50％且最优选地小于25％的多聚复合物。
主题组合物的多聚复合物优选地在冻融条件下是基本上尺寸稳定的。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含在从-20到-80℃下冷冻进行解冻后在室温下历时6小时、更优选地12小时、更优选地24小时且最优选地48小时，平均直径增加小于100％、更优选地小于50％且最优选地小于25％的多聚复合物。
在一个优选实施方案中，组合物具有超过0.5mg/ml的核酸浓度且基本上不含沉淀的多聚复合物。更优选地，组合物具有至少0.6mg/ml、更优选地至少0.75mg/ml、更优选地至少1.0mg/ml、更优选地至少1.2mg/ml且最优选地至少1.5mg/ml的核酸浓度，且基本上不含沉淀的多聚复合物。组合物是水合的。在一个优选实施方案中，组合物基本上不含未复合的核酸。
在一个优选实施方案中，DD-壳聚糖核酸多聚复合物组合物是等张的。实现等张性同时维持多聚复合物稳定性在调配药物组合物中是非常合乎需要的，且这些优选的组合物非常适于药物调配和治疗应用。
一般说来，包含DD-壳聚糖核酸多聚复合物的组合物用以接触目标细胞。此类接触一般使得核酸进行传递，被目标细胞表达。适于本文中描述的DD-壳聚糖核酸多聚复合物的组合物为本领域中众所周知，并概述于下文中。
粉末状调配物
本发明的DD-壳聚糖核酸多聚复合物组合物包括粉末。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种干粉DD-壳聚糖核酸多聚复合物组合物。在一个优选实施方案中，干粉DD-壳聚糖核酸多聚复合物组合物是通过本发明的壳聚糖-核酸多聚复合物分散液脱水而产生。
药物调配物
本发明还提供了包含本发明的DD-壳聚糖核酸多聚复合物组合物的“药学上可接受”或“生理学上可接受”的调配物。此类调配物可以在体内施用受试者以实践治疗方法。
如本文所用，术语“药学上可接受”和“生理学上可接受”是指可以施用受试者，优选地没有产生过度有害的副作用(例如恶心、腹痛、头痛等)的载剂、稀释剂、赋形剂等等。用于施用的此类制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。
药物调配物可以由与施用受试者相容的载剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、分散介质、涂料、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等制成。此类调配物可以含于片剂(包覆包衣或无包衣)、胶囊(硬或软)、微球珠、乳液、粉末、颗粒、晶体、悬浮液、糖浆或酏剂中。连同其它添加剂一道，也可以存在补充活性化合物和防腐剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。
赋形剂可以包括盐、等张剂、血清蛋白、缓冲剂或其它pH值控制剂、抗氧化剂、增稠剂、不带电聚合物、防腐剂或低温保护剂。本发明的组合物中所用的赋形剂可以进一步包括等张剂和缓冲剂或其它pH值控制剂。这些赋形剂可以添加达到pH值(约6.0-8.0)和容积摩尔渗透浓度(约50-300mmol/L)的优选范围。适合的缓冲剂的实例是乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和磺化有机分子缓冲剂。此类缓冲剂可以按0.01％到1.0％(w/v)的浓度存在于组合物中。等张剂可以选自本领域中所知的任何等张剂，例如甘露糖醇、右旋糖、葡萄糖和氯化钠或其它电解质。优选地，等张剂是葡萄糖或氯化钠。等张剂可以按赋予组合物以与引入其的生物环境相同或类似的渗透压的量使用。组合物中等张剂的浓度将取决于所用的具体等张剂的性质并可以在约0.1％到10％范围内。当使用葡萄糖时，其优选地按1到5％w/v、更具体地说5％w/v的浓度使用。当等张剂是氯化钠时，其优选地按最多1％w/v、具体地说0.9％w/v的量使用。本发明的组合物可以进一步含有防腐剂。防腐剂的实例是聚六亚甲基-双胍、氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、稳定化的氧基氯代复合物(例如被称为PuriteR的复合物)、乙酸苯汞酯、氯代丁醇、山梨酸、双氯苯(chlorhexidine)、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。典型地，此类防腐剂按约0.001％到1.0％的浓度存在。此外，本发明的组合物还可以含有低温防腐剂。优选的低温防腐剂是葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、胶状二氧化硅、分子量优选低于100,000g/mol的葡聚糖、甘油和分子量低于100,000g/mol的聚乙二醇或其混合物。最优选的是葡萄糖、海藻糖和聚乙二醇。典型地，此类低温防腐剂按约0.01％到10％的浓度存在。
药物调配物可以调配成与其预期的施用途径相容。举例来说，对于经口施用来说，组合物可以掺有赋形剂并呈片剂、糖衣锭、胶囊(例如明胶胶囊)或包衣(例如肠溶衣(或))的形式使用。药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可以包括在口服调配物中。片剂、丸剂、胶囊、糖衣锭等等可以含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或香料。
调配物还可以包括防止组合物从身体快速降解或消除的载剂，例如控制释放的调配物，包括植入物和微囊密封的传递系统。举例来说，可以采用单独或与蜡组合的时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
还涵盖栓剂和其它直肠可施用的调配物(例如通过灌肠剂可施用的调配物)。进一步关于直肠传递，参见例如Song等人,Mucosal drug delivery:membranes,methodologies,and applications,Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.,21:195-256,2004；Wearley,Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasiveroutes,Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.,8:331-394,1991。
适合于施用的另外的药物调配物为本领域中已知且可适用于本发明的方法和组合物(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)第18版,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.；The Merck Index(1996)第12版,Merck Publishing Group,Whitehouse,N.J.；以及Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms,Technonic PublishingCo.,Inc.,Lancaster,Pa.,(1993))。
施用
在一个实施方案中，在DD-壳聚糖核酸多聚复合物中使用DD-壳聚糖提供了多聚复合物在生理pH值下长期的稳定性。此提供了有效的全身性施用以及其它施用模式。
多种施用途径中的任一种都是可能的，且具体途径的选择将部分地取决于目标组织。注射器、内窥镜、套管、插管、导管和其它物品可以用于施用。
用于治疗受试者的剂量或“有效量”优选地足以改善病状的一种、若干或所有症状，达到可测量的或可检测的程度，不过预防或抑制病症或病状的进展或恶化或者症状是一种让人满意的结果。因此，在病状或病症可通过在目标组织中表达治疗核酸来治疗的情况下，产生的用来改善可通过本发明的方法治疗的病状的治疗RNA或治疗蛋白质的量将取决于病状和所希望的结果，且熟练的技术人员可以容易地确定。适当的量将取决于所治疗的病状、所希望的治疗作用以及个别受试者(例如受试者内的生物利用率、性别、年龄等等)。有效量可以通过测量相关的生理作用来确定。
本发明还涵盖兽医学应用。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗非人类哺乳动物的方法，其包含向需要治疗的非人类哺乳动物施用本发明的基于壳聚糖的纳米粒子。
肠胃外施用
本发明的化合物可以直接施用到血流、肌肉或内脏器官中。适用于肠胃外施用的方法包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内和皮下。适用于肠胃外施用的装置包括针(包括微针)式注射器、无针注射器和输注技术。
肠胃外调配物典型地是水溶液，其可以含有例如盐、碳水化合物和缓冲剂等赋形剂，但对于一些应用来说，其可以更适合地调配成无菌的非水溶液或干燥形式以与例如无菌的无热原水等适合媒介物结合使用。
在无菌条件下例如通过冻干制备肠胃外调配物可以容易地使用本领域技术人员众所周知的标准制药技术实现。
用于制备肠胃外溶液的化合物的溶解性可以通过使用适当的调配技术，例如并入增强溶解性的试剂来增加。
用于肠胃外施用的调配物可以调配成即时和/或调节释放。调节释放的调配物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。因此，本发明的化合物可以调配成固体、半固体或触变性液体以作为植入储集器施用，从而提供了活性化合物的调节释放。
经口施用
主题组合物可以经口施用。经口施用可以包含吞咽，以便化合物进入胃肠道。本发明的组合物还可以直接施用到胃肠道。
适于经口施用的调配物包括固体调配物，例如片剂、胶囊、含有微粒的包衣胶囊或包衣微粒、液体或粉末、锭剂(包括填充液体的锭剂)、咀嚼剂、多微粒和纳米微粒、凝胶剂、薄膜、珠形剂(ovule)和喷雾剂。
液体调配物包括混悬液、溶液、糖浆和酏剂。液体调配物可以通过复原固体来制备。
片剂剂型一般含有崩解剂。崩解剂的实例包括羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、经低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶凝化淀粉和海藻酸钠。一般地，崩解剂将占该剂型的1重量％到25重量％，优选地5重量％到20重量％。
粘合剂一般用于赋予片剂调配物内聚性质。适合的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然和合成胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶凝化淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。片剂还可以含有稀释剂，例如乳糖(单水合物、喷雾干燥的单水合物、无水等等)、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉和磷酸氢钙二水合物。
片剂还可以任选地包含例如十二烷基硫酸钠和聚山梨醇酯80等表面活性剂，和例如二氧化硅和滑石等助流剂。存在时，表面活性剂可以占片剂的0.2重量％到5重量％，且助流剂可以占片剂的0.2重量％到1重量％。
片剂一般还含有润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰基反丁烯二酸钠和硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠的混合物。一般地，润滑剂占片剂的0.25重量％到10重量％，优选地0.5重量％到3重量％。
其它可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂和掩味剂。
片剂掺合物可以直接压缩或通过滚筒压缩来形成片剂。或者片剂掺合物或部分掺合物可以湿法制粒、干法制粒或熔融制粒、熔融凝结或在压片前挤出。最终的调配物可以包含一个或多个层并可以包衣或无包衣；其甚至可以装入胶囊中。
片剂的调配物论述于Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,第1卷,H.Lieberman和L.Lachman(Marcel Dekker,New York,1980)。
用于人类或兽医学用途的可消耗的经口薄膜典型地是柔软的水溶性或水可膨胀的薄膜剂型，其可以快速地溶解或粘附粘膜，并典型地包含成膜聚合物、粘合剂、溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂或乳化剂、粘度改良剂和溶剂。调配物的一些组分可以执行超过一个的功能。
本发明中还包括包含本发明的组合物的多微粒珠粒。
其它可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、香料和风味增强剂、防腐剂、唾液刺激剂、冷却剂、共溶剂(包括油类)、润肤剂、填充剂、消泡剂、表面活性剂和掩味剂。
根据本发明的薄膜典型地通过被涂布到可剥离的背衬支撑物或纸上的水性薄膜的蒸发式干燥来制备。此可以在干燥箱或烘道中，典型地组合的涂布机干燥器，或通过冷冻干燥或抽真空来进行。
用于经口施用的固体调配物可以调配成即时和/或调节释放。调节释放的调配物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。
已知其它适合的释放技术，例如高能分散液以及渗透和包衣粒子。
局部施用
本发明的化合物还可以局部施用到皮肤或粘膜，即，经过皮肤或经皮。用于达成此目的的典型调配物包括凝胶剂、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏、扑粉、调味品、泡沫、薄膜、皮肤贴片、糯米纸(wafer)、植入物、棉塞、纤维、绷带和微乳液。
局部施用的其它方式包括通过电穿孔、离子电渗疗法、超声透入疗法、超声波导入术和微针或无针(例如PowderjectTM、BiojectTM等等)注射来传递。
用于局部施用的调配物可以调配成即时和/或调节释放。调节释放的调配物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。
吸入/鼻内施用
本发明的化合物还可以经鼻内或通过吸入，典型地从干粉吸入器，呈干粉形式(单独、呈混合物形式(例如在与乳糖的干掺合物中)或呈混合的组分粒子形式)来施用，或从使用或不使用适合推进剂的加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器，呈气溶胶喷雾的形式来施用。
用于吸入器或吹入器中的胶囊、泡罩和药筒可以调配成含有本发明的化合物、适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)和性能调节剂(例如I-亮氨酸、甘露糖醇或硬脂酸镁)的粉末混合物。
用于吸入/鼻内施用的调配物可以调配成即时和/或调节释放。调节释放的调配物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。
直肠/阴道内施用
本发明的化合物可以经直肠或经阴道，例如呈栓剂、子宫托或灌肠剂的形式施用。可可脂是传统的栓剂基质，但可以酌情使用各种替代物。
用于直肠/阴道施用的调配物可以调配成即时和/或调节释放。调节释放的调配物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。
经眼/经耳施用
本发明的化合物还可以直接施用到眼睛或耳朵，典型地呈液滴的形式。适于经眼和经耳施用的其它调配物包括软膏、生物可降解(可吸收的凝胶海棉、胶原蛋白)和不能生物降解的(例如硅酮)植入物、糯米纸、晶体(lense)和颗粒系统。调配物还可以通过离子电渗疗法传递。
用于经眼/经耳施用的调配物可以调配成即时和/或调节释放。调节释放的调配物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放或程序化释放。
使用方法
在一个实施方案中，本发明的DD-壳聚糖核酸多聚复合物组合物可以用于治疗性治疗。此类组合物在本文中有时称为治疗组合物。
如下所讨论的本发明的治疗蛋白质是由包含治疗核酸的本发明的多聚复合物产生。如下所述的主题蛋白质的使用是指使用主题多聚复合物实现此类蛋白质的使用。
预期用于本发明的治疗蛋白质具有多种活性并可用于治疗多种病症。治疗蛋白质的活性和能用本发明的治疗蛋白质治疗的适应症的以下描述是例示性的，且并不意图是详尽的。术语“受试者”是指动物，哺乳动物优选，且人类尤其优选。
治疗蛋白质和目标疾病的部分清单展示于表1中。
表1.
在另一个实施方案中，本发明的治疗组合物包含不编码治疗蛋白质的治疗核酸，例如治疗RNA。举例来说，通过选择靶向与疾病和/或不合乎需要的细胞或生理状况的机制有关的基因的治疗RNA，主题组合物可以用于治疗广泛的疾病和病状。主题组合物具有使得所用的治疗RNA在目标选择范围上不受限制的特征。因此，主题组合物可用于涉及适合目标的任何疾病或病状。
优选的组织、疾病和病状包括以下，这些是例示性的且并决不限制：
高血糖和体重
治疗蛋白质包括胰岛素和胰岛素类似物。糖尿病是一种使人虚弱的代谢疾病，由从胰腺β-细胞产生胰岛素缺乏(1型)或不足(2型)引起(Unger,R.H.等人,WilliamsTextbook of Endocrinology Saunders,Philadelphia(1998))。β-细胞是专门的内分泌细胞，其制造和储存胰岛素用于在进餐后释放(Rhodes等人,J.Cell Biol.105:145(1987))且胰岛素是一种促进葡萄糖从血液转移到需要其的组织中的激素。糖尿病患者必须经常监测血糖水平且很多为了生存而需要每日多次注射胰岛素。然而，此类患者很少通过胰岛素注射达到理想的葡萄糖水平(Turner,R.C.等人JAMA 281:2005(1999))。此外，胰岛素水平长时间的升高会产生不良副作用，例如低血糖休克和身体对胰岛素的反应敏感性降低。因此，糖尿病性患者还出现长期的并发症，例如心血管疾病、肾病、失明、神经损伤和伤口愈合病症(UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)Group,Lancet 352,837(1998))。
能被本发明的方法治疗的病症包括高血糖性病状，例如胰岛素依赖性(1型)或非胰岛素依赖性(2型)糖尿病以及与高血糖性病状相关联或由高血糖性病状引起的生理病状或病症。因此，能被本发明的方法治疗的高血糖性病状还包括与慢性或急性高血糖(例如糖尿病)相关联的组织病理学改变。具体的实例包括胰腺变性(β-细胞破坏)、肾小管钙化、肝变性、眼睛损害(糖尿病性视网膜病)、糖尿病足、粘膜(例如口腔和齿龈)溃疡、过度出血、血液凝固或伤口愈合延迟以及冠状动脉性心脏病、中风、周围性血管疾病、血脂障碍、高血压和肥胖的风险增加。
主题组合物可用于降低葡萄糖、提高葡萄糖耐量、治疗高血糖性病状(例如糖尿病)或治疗与高血糖性病状相关联或由高血糖性病状引起的生理病症。此类病症包括例如糖尿病性神经病(自主)、肾病(肾损害)、皮肤感染和其它皮肤病症、缓慢或延迟的损伤或伤口愈合(例如引起糖尿病性痈)、会导致失明的眼睛损害(视网膜病、白内障)、糖尿病足和加速的牙周炎。此类病症还包括出现冠状动脉性心脏病、中风、周围性血管疾病、血脂障碍、高血压和肥胖的风险增加。
如本文所用，术语“高血糖性”或“高血糖”在关于受试者的病状使用时，意指受试者血液中短暂或长期存在异常高水平的葡萄糖。所述病状可能是由葡萄糖代谢或吸收延迟，使得受试者展现葡萄糖不耐或在正常受试者中未典型地发现的高葡萄糖状态(例如在处于出现糖尿病的风险下的不耐葡萄糖的准糖尿病受试者中，或在糖尿病受试者中)引起。血糖量正常的空腹血糖(FPG)水平小于约110mg/dl，对于减弱的葡萄糖代谢，空腹血糖水平在约110与126mg/dl之间，且对于糖尿病患者，超过约126mg/dl。
能通过在肠粘膜组织中产生蛋白质来治疗的病症还包括肥胖或不合乎需要的体重。瘦素、缩胆囊肽、PYY和GLP-1减少饥饿，增加能量消耗，诱导重量减轻或提供正常的葡萄糖体内平衡。因此，在各种实施方案中，用于治疗肥胖或不合乎需要的体重或高血糖症的本发明的方法包括使用编码瘦素、缩胆囊肽、PYY或GLP-1的治疗核酸。在另一个实施方案中，使用靶向胃饥饿素的治疗RNA。胃饥饿素增加食欲和饥饿。因此，在各种实施方案中，用于治疗肥胖或不合乎需要的体重或高血糖症的本发明的方法包括使用靶向胃饥饿素以减少其表达的治疗RNA。能治疗的病症还包括典型地与肥胖相关联的病症，例如异常升高的血清/血浆LDL、VLDL、甘油三酸酯、胆固醇、导致血管狭窄或堵塞的斑块形成、高血压/中风、冠状动脉性心脏病的风险增加等等。
如本文所用，术语“肥胖的”或“肥胖”是指体重与年龄和性别匹配的正常受试者相比增加至少30％的受试者。“不合需要的体重”是指体重比匹配的正常受试者重1％-29％的受试者以及体重正常但希望减少或预防体重增加的受试者。
在一个实施方案中，本发明的治疗蛋白质是胰高血糖素拮抗剂。胰高血糖素是一种由胰岛中的β-细胞产生的肽类激素且是葡萄糖代谢的主要调节剂(Unger R.H.和OrciL.N.Eng.J.Med.304:1518(1981)；Unger R.H.Diabetes 25:136(1976))。如同胰岛素一样，血糖浓度介导胰高血糖素的分泌。然而，与胰岛素相比，胰高血糖素响应于血糖的下降而分泌。因此，胰高血糖素的循环浓度在空腹期间是最高的，而在进餐期间是最低的。胰高血糖素水平增加到剥夺胰岛素促进葡萄糖储存并刺激肝释放葡萄糖到血液中。胰高血糖素拮抗剂的一个具体实例是[des-His1,des-Phe6,Glu9]胰高血糖素-NH2。在链脲佐菌素糖尿病大鼠中，血糖水平在此胰高血糖素拮抗剂静脉内推注(每克体重0.75μg)的15分钟内降低37％(Van Tine B.A.等人Endocrinology 137:3316(1996))。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗糖尿病或高血糖症的方法，其包括使用治疗RNA降低从胰腺产生的胰高血糖素的水平。
在另一个实施方案中，可用于治疗高血糖性病状或不合乎需要的体重(例如肥胖)的本发明的治疗蛋白质是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。GLP-1是一种在进餐期间从肠中L-细胞释放的激素，其刺激胰腺β-细胞增加胰岛素分泌。GLP-1具有额外的活性，使其成为治疗肥胖和糖尿病的吸引人的治疗剂。举例来说，GLP-1减少胃排空，抑制食欲，降低胰高血糖素浓度，增加β-细胞团块，以葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素生物合成和分泌，并可能增加组织对胰岛素的敏感性(Kieffer T.J.,Habener J.F.Endocrin.Rev.20:876(2000))。因此，肠中与进餐一致的经过调节的GLP-1释放可以提供治疗高血糖性病状或不合乎需要的体重的益处。对肽酸二肽基酯IV(DPP IV)具有抗性的GLP-1类似物提供较久的作用持续时间和改善的治疗价值。因此GLP-1类似物是优选的治疗多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗糖尿病或高血糖症的方法，其包括使用治疗RNA降低DPP IV的水平。
在另一个实施方案中，可用于治疗高血糖性病状的本发明的治疗蛋白质是激素抵抗素的拮抗剂。抵抗素是一种脂肪细胞衍生的因子，在饮食诱发和遗传形式的肥胖中其表达升高。在肥胖小鼠中循环抵抗素的中和提高血糖和胰岛素作用。相反地，正常小鼠中抵抗素的施用减弱葡萄糖耐量和胰岛素作用(Steppan CM等人Nature 409:307(2001))。因此，肠中对抗抵抗素生物作用的蛋白质的产生可以提供一种对肥胖相关联的胰岛素抵抗和高血糖性病状有效的疗法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗糖尿病或高血糖症的方法，其包括使用治疗RNA降低脂肪组织中抵抗素表达的水平。
在另一个实施方案中，可用于治疗高血糖性病状或不合乎需要的体重(例如肥胖)的本发明的治疗多肽是瘦素。瘦素虽然主要由脂肪细胞产生，但也以膳食依赖性方式在胃中较少量产生。瘦素将有关脂肪细胞代谢和体重的信息转播到脑中的食欲中心，在食欲中心其发出降低食物摄入(促进饱腹感)的信号并增加身体的能量消耗。
在另一个实施方案中，可用于治疗高血糖性病状或不合乎需要的体重(例如肥胖)的本发明的治疗多肽是脂肪细胞补体相关蛋白质(Acrp30)的C端球状头部域。Acrp30是由分化脂肪细胞产生的蛋白质。向小鼠施用由球状头部域组成的Acrp30的蛋白裂解产物引起重量显著减轻(Fruebis J.等人Proc.NatL Acad.Sci USA 98:2005(2001))。
在另一个实施方案中，可用于治疗高血糖性病状或不合乎需要的体重(例如肥胖)的本发明的治疗多肽是缩胆囊肽(CCK)。CCK是一种响应于肠中的具体养分而从肠分泌的胃肠肽。CCK的释放与消耗的食物量成比例并相信其发信号给脑部以终止进餐(SchwartzM.W.等人Nature 404:661-71(2000))。因此，升高的CCK可以降低进餐量并促进重量减轻或重量稳定化(即预防或抑制重量增加)。
关于PYY，参见例如le Roux等人,Proc Nutr Soc.2005年5月；64(2):213-6。
免疫病症
在一个实施方案中，本发明的治疗组合物具有免疫调节活性。举例来说，本发明的治疗多肽可以通过活化或抑制免疫细胞的增殖、分化或动员(趋化性)用于治疗免疫系统缺陷或病症。免疫细胞通过造血过程形成，从多潜能干细胞产生脊髓细胞(血小板、红血球、嗜中性白细胞和巨噬细胞)和淋巴样细胞(B和T淋巴细胞)。这些免疫缺陷或病症的病因学可以是遗传的、身体的(例如癌症或一些自体免疫病症)、后天的(例如通过化学疗法或毒素)或传染性的。
本发明的治疗组合物可以用于治疗造血细胞的缺陷或病症。举例来说，本发明的治疗多肽可以用于增加包括多潜能干细胞在内的造血细胞的分化或增殖，试图治疗与某些(或很多)类型造血细胞减少相关联的病症。免疫缺陷综合症的实例包括(但不限于)：血液蛋白质病症(例如丙种球蛋白缺乏症、异常丙种球蛋白血症)、共济失调毛细血管扩张、常见变异型免疫缺陷病、迪乔治综合症(Digeorge Syndrome)、HIV感染、HTLV-BLV感染、白细胞粘附缺陷综合症、淋巴球减少症、吞噬细胞杀菌功能障碍、严重联合免疫缺陷(SCID)、维斯科特-奥尔德里奇病症(Wiskott-Aldrich Disorder)、贫血、血小板减少症或血红蛋白尿。
本发明的治疗组合物还可以用于治疗自体免疫病症。很多自体免疫病症是由免疫细胞将自身不当地识别为外来物质引起。此不当的识别产生免疫反应，导致宿主组织被破坏。因此，抑制免疫反应、尤其是T细胞的增殖、分化或趋化性的本发明的治疗组合物的施用可能是一种有效预防自体免疫病症的疗法。
本发明可以治疗的自体免疫病症的实例包括(但不限于)：阿狄森氏病(Addison'sDisease)、溶血性贫血、抗磷脂综合症、类风湿性关节炎、皮炎、变态反应性脑脊髓炎、血管球性肾炎、古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture's Syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves'Disease)、多发性硬化、重症肌无力、神经炎、眼炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌病变、紫癜、莱特尔氏病(Reiter's Disease)、僵人综合症、自体免疫性甲状腺炎、全身性红斑狼疮、自体免疫性肺部炎症、格林-巴利综合症(Guillain-Barre Syndrome)、胰岛素依赖性糖尿病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎和自体免疫性炎症眼病。
类似地，变态反应和病状，例如哮喘(尤其是变应性哮喘)或其它呼吸问题，也可以通过本发明的治疗组合物治疗。此外，这些分子可以用于治疗过敏性反应、抗原分子超敏反应或血型不合。
本发明的治疗组合物也可以用以治疗和/或预防器官排斥反应或移植物抗宿主疾病(GVHD)。器官排斥反应是通过移植组织通过免疫反应对宿主免疫细胞进行破坏来发生。类似地，免疫反应也与GVHD有关，但在此情况下，外来的移植免疫细胞破坏宿主组织。抑制免疫反应、尤其是T细胞的增殖、分化或趋化性的本发明的治疗组合物的施用可能是一种有效预防器官排斥反应或GVHD的疗法。
类似地，本发明的治疗组合物也可以用以调节炎症。举例来说，治疗多肽可以抑制参与炎症反应的细胞的增殖和分化。这些分子可以用于治疗炎症性病状、慢性和急性病状，包括与感染相关联的炎症(例如败血性休克、败血症或全身性炎症反应综合症(SIRS))、缺血-再灌注损伤、内毒素致命、关节炎、胰腺炎、补体介导的超急性排斥反应、肾炎、细胞因子或趋化因子诱发的肺损伤、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病或由细胞因子(例如TNF或IL-1)过度产生引起的炎症。在一个实施方案中，靶向TNFα的治疗RNA用于主题组合物中来治疗炎症。在另一个优选实施方案中，靶向IL-1的治疗RNA用于主题组合物中来治疗炎症。siRNA治疗RNA尤其优选。用于本发明中治疗的感兴趣的炎症性病症包括(但不限于)慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性膀胱炎和炎症性肠病。
凝血病症
在一些实施方案中，本发明的治疗组合物也可以用以调节止血(终止出血)或溶解血栓活性(凝块形成)。举例来说，通过增加止血或溶解血栓活性，本发明的治疗组合物可以用于治疗凝血病症(例如无纤维蛋白原血症、因子缺乏)、血小板病症(例如血小板减少症)或由外伤、手术或其它原因引起的创伤。或者，可以降低止血或溶解血栓活性的本发明的治疗组合物可以用于抑制或溶解凝血。这些治疗剂组合物在治疗心脏病发作(梗塞)、中风或疤痕形成中可能是重要的。在一个实施方案中，本发明的治疗多肽是凝血因子，可用于治疗血友病或其它凝结/凝血病症(例如因子VIII、IX或X)。
过度增生性病症
在一个实施方案中，本发明的治疗组合物能够调节细胞增殖。此类治疗多肽可以用于治疗过度增生性病症，包括赘生物。
本发明的治疗组合物可以治疗的过度增生性病症的实例包括(但不限于)位于以下中的赘生物：腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经(中枢和周围)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖器。
类似地，其它过度增生性病症也可以通过本发明的治疗组合物治疗。此类过度增生性病症的实例包括(但不限于)：高丙种球蛋白血症、淋巴组织增生病症、病变蛋白血、紫癜、结节病、赛谢综合症(Sezary Syndrome)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstron's Macroglobulinemia)、高雪氏病(Gaucher's Disease)、组织细胞增多病和除瘤形成外位于上列的器官系统中的任何其它过度增生性疾病。
传递到循环系统使得多个组织可以获得治疗蛋白质。或者，本发明的治疗组合物可以刺激能够抑制过度增生性病症的其它细胞的增殖。
举例来说，通过增加免疫反应，尤其是增加过度增生性病症的抗原质量或通过增殖、分化或动员T细胞，可以治疗过度增生性病症。此免疫反应可以通过增强现有的免疫反应，或者通过引发新的免疫反应来增加。或者，降低免疫反应也可能是一种例如用化学治疗剂治疗过度增生性病症的方法。
传染性疾病
在一个实施方案中，本发明的治疗组合物可以用于治疗传染性疾病。举例来说，通过增加免疫反应，尤其是增加B细胞和/或T细胞的增殖和分化，可以治疗传染性疾病。免疫反应可以通过增强现有的免疫反应，或者通过引发新的免疫反应来增加。或者，本发明的治疗组合物也可以直接抑制传染物，不一定引起免疫反应。
病毒是可以引起本发明的治疗组合物能够治疗的疾病或症状的传染物的一个实例。病毒的实例包括(但不限于)以下DNA和RNA病毒家族：虫媒病毒(Arbovirus)、腺病毒科(Adenoviridae)、沙状病毒科(Arenaviridae)、动脉炎病毒(Arterivirus)、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、肝病毒科(Hepadnaviridae)(肝炎)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如巨细胞病毒、单纯性疱疹、带状疱疹)、单负病毒(Mononegavirus)(例如副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒(Morbillivirus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae))、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流行性感冒)、巴波法病毒科(Papovaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)(例如天花或牛痘)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如轮状病毒)、反转录病毒科(Retroviridae)(HTLV-I、HTLV-II、慢病毒)和披膜病毒科(Togaviridae)(例如风疹病毒)。属于这些家族的病毒可以引起各种疾病或症状，包括(但不限于)：关节炎、细支气管炎、脑炎、眼睛感染(例如结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合症、肝炎(甲型、乙型、丙型、戊型、慢性活动性、丁型)、脑膜炎、机会性感染(例如AIDS)、肺炎、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma)、水痘、出血热、囊虫、腮腺炎、副流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤疾病(例如卡波西氏疣(Kaposi's wart))和病毒败血症。本发明的治疗组合物可以用于治疗任何这些症状或疾病。
类似地，可以引起疾病或症状并可以通过本发明的治疗组合物治疗的细菌或真菌体包括(但不限于)以下革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌家族和真菌：放线菌目(Actinomycetale)(例如棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌(Norcardia))、曲霉病、芽胞杆菌科(Bacillaceae)(例如炭疽(Anthrax)、梭菌属(Clostridium))、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、芽生菌病(Blastomycosis)、博代杆菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏杆菌病(Brucellosis)、念珠菌病(Candidiasis)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、球孢子菌病(Coccidioidomycosis)、隐球菌病(Cryptococcosis)、皮肤真菌病、肠内菌科(Enterobacteriaceae)(克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、螺杆菌(Helicobacter)、军团杆菌病(Legionellosis)、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、李斯特菌属(Listeria)、支原菌目(Mycoplasmatale)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)(例如不动杆菌属(Acinetobacter)、淋病(Gonorrhea)、脑膜炎球菌(Menigococcal))、巴斯德菌科感染(PasteurellaceaInfection)(例如放线杆菌属(Actinobacillus)、流感嗜血杆菌(Heamophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella))、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体科(Rickettsiaceae)、衣原体科(Chlamydiaceae)、梅毒(Syphilis)和葡萄球菌(Staphylococcal)。这些细菌或真菌家族可以引起以下疾病或症状，包括(但不限于)：菌血症、心内膜炎、眼睛感染(结膜炎、肺结核、葡萄膜炎)、齿龈炎、机会性感染(例如AIDS相关感染)、甲沟炎、修复术相关的感染、莱特尔氏病、呼吸道感染(例如百日咳或积脓症)、败血症、莱姆病(Lyme Disease)、猫抓病、痢疾、副伤寒热、食物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑膜炎、衣原体、梅毒、白喉、麻疯病、副结核、肺结核、狼疮、肉毒中毒、坏疽、破伤风、脓疱病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤疾病(例如蜂窝织炎、皮肤真菌病)、毒血症、泌尿道感染、伤口感染。本发明的治疗组合物可以用于治疗任何这些症状或疾病。
此外，本发明的治疗组合物可以治疗的引起疾病或症状的寄生虫体包括(但不限于)以下家族：阿米巴病、巴贝虫病、球虫病、隐孢子虫病、双核阿米巴病、马媾疫、外寄生虫、贾第鞭毛虫病、蠕虫病、利什曼病、泰勒虫病、弓形体病、锥虫病和毛滴虫属(Trichomonas)。这些寄生虫可以引起各种疾病或症状，包括(但不限于)：疥疮、恙螨病、眼睛感染、肠病(例如痢疾、贾第鞭毛虫病)、肝病、肺病、机会性感染(例如AIDS相关)、疟疾、妊娠并发症和弓形体病。本发明的治疗组合物可以用于治疗任何这些症状或疾病。
再生
本发明的治疗组合物可以用于分化、增殖和吸引细胞，促进组织再生(参见Science 276:59-87(1997))。组织再生可以用于修复、替换或保护被先天性缺陷、外伤(创伤、烧伤、切口或溃疡)、年龄、疾病(例如骨质疏松症、骨关节炎、牙周病、肝功能衰竭)、手术(包括美容整形手术)、纤维化、再灌注损伤或全身性细胞因子损害破坏的组织。
本发明的治疗组合物可以促进各种组织的再生，包括(但不限于)器官(例如胰腺、肝、肠、肾、皮肤、内皮)、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)、血管(包括血管内皮)、神经、造血和骨骼(骨、软骨、腱和韧带)组织。优选地，再生引起少量的疤痕形成，或没有疤痕形成。再生还可以包括血管生成。
此外，本发明的治疗组合物可以增加难以愈合的组织的再生。举例来说，增加的腱/韧带再生将加快损伤后的恢复时间。本发明的治疗组合物还可以为了防止损伤而预防使用。可以治疗的具体疾病包括腱炎、腕管综合症和其它腱或韧带缺陷。不愈合伤口的组织再生的另一个实例包括褥疮、与血管功能不全相关联的溃疡、手术和外伤伤口。
类似地，神经和脑组织还可以通过使用本发明的治疗组合物增殖和分化神经细胞来再生。可以使用此方法治疗的疾病包括中枢和周围神经系统疾病、神经病或机械和外伤病症(例如脊髓病症、头外伤、脑血管疾病和中风)。确切地说，与周围神经损伤相关的疾病、周围神经病(例如由化学疗法或其它医药疗法引起)、局限性神经病和中枢神经系统疾病(例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化和香-德综合症(Shy-Drager syndrome))都能够使用本发明的治疗组合物治疗。关于CNS病症，在本领域中已知许多手段用于促进治疗剂进入脑组织，包括用于破坏血脑屏障的方法和使治疗剂与提供输送到CNS中的部分偶合的方法。在一个实施方案中，治疗核酸进行工程化，以便编码融合蛋白质，所述融合蛋白质包含输送部分和治疗蛋白质。或者，主题组合物可以直接传递到CNS。
趋化性
在一个实施方案中，本发明的治疗组合物可以调节趋化性。举例来说，在一个实施方案中，本发明的治疗多肽具有趋化活性。趋化分子吸引或动员细胞(例如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性白细胞、T细胞、肥大细胞、嗜曙红细胞、上皮和/或内皮细胞)到身体内的具体部位，例如炎症、感染或过度增生部位。动员的细胞接着可以治好和/或愈合具体的外伤或异常。
举例来说，本发明的治疗多肽可以增加具体细胞的趋化活性。这些趋化分子接着可以用以通过增加靶向身体内具体位置的细胞的数目来治疗炎症、感染、过度增生性病症或任何免疫系统病症。举例来说，趋化分子可以通过吸引免疫细胞到受伤位置来用于治疗伤口和其它的组织外伤。本发明的趋化分子还可以吸引成纤维细胞，成纤维细胞可以用于治疗伤口。
还预期本发明的治疗组合物可以抑制趋化活性。这些治疗组合物还可以用以治疗病症。因此,本发明的治疗组合物可以用作趋化性的抑制剂。
尤其优选使用的是在目标组织附近活化的促治疗蛋白质。
预期使用的额外的治疗多肽包括(但不限于)生长因子(例如生长激素、胰岛素样生长因子-1、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等)，治疗生长病症或消耗综合症；和抗体(例如人类或人类化)，提供被动免疫接种或保护受试者免受外来抗原或病原体(例如幽门螺杆菌(H.Pylori))伤害，或提供癌症、关节炎或心血管疾病的治疗；细胞因子、干扰素(例如干扰素(IFN)、IFN-α2b和2α、IFN-αN1、IFN-β1b、IFN-γ)、介白素(例如IL-1到IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β)、趋化因子、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、多肽激素、抗菌多肽(例如抗菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生虫多肽)、酶(例如腺苷脱氨酶)、促性腺激素、趋化素、脂质结合蛋白、非格司亭(filgastim)(Neupogen)、血红蛋白、促红细胞生成素、胰岛素调理素、伊米苷酶(imiglucerase)、沙莫司亭(sarbramostim)、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)、尿激酶、链激酶、苯丙氨酸氨解酶、脑衍生神经营养性因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、促血小板生成素(TPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷脱酰胺酶、接触酶、降血钙素、内皮素(endothelian)、L-天冬酰胺酶、胃蛋白酶、尿酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、乳糖酶、蔗糖酶、内在因子、降血钙素、甲状旁腺激素(PTH)样激素、可溶性CD4和抗体和/或其抗原结合片段(例如FAb)(例如orthoclone OKT-e(抗CD3)、GPIIb/IIa单克隆抗体)。另外涵盖靶向编码此类因子的核酸的治疗RNA。
疫苗
在一个实施方案中，本发明提供了用于接种患者的方法。所述方法包括施用能够产生需要的表位的本发明的组合物。在一个优选实施方案中，组合物包含能够表达包含表位的蛋白质的治疗核酸构建体。
美容应用
在一个实施方案中，本发明提供了用于美容用途的DD-壳聚糖核酸多聚复合物。主题化妆品包含呈适于美容使用的调配物形式的DD-壳聚糖核酸多聚复合物。
实施例
双重衍生化的壳聚糖的形成和DNA多聚复合物的形成
根据众所周知的方法将壳聚糖用精氨酸和葡糖酸双重衍生化(DD-壳聚糖)。DD-壳聚糖用编码分泌的碱性磷酸酶(SEAP)的DNA载体或者萤光素酶siRNA多聚复合。
用DNA多聚复合物体外转染
一般说来，用DD-壳聚糖核酸多聚复合物调配物体外转染293T细胞分两步进行：制备细胞，接着转染。
细胞系的维持
293T细胞系由UBC的Dr.Kieffer实验室赠予，并如下制备。人类肾细胞用SV40T-抗原转化；在含有10％胎牛血清(FBS)和青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的高葡萄糖达伯克改性伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)中生长；并维持在80％以下的汇合。HT1080(来自人类结缔组织的上皮细胞)和HeLa(人类子宫颈上皮细胞)在含有10％FBS和青霉素/链霉素的最小必需培养基(minimum essential media，MEM)中生长；并维持在90％以下的汇合。VERO(猴肾上皮细胞)在含有10％热灭活FBS(56℃，30分钟)、1mM丙酮酸钠和500ug/ml庆大霉素(gentamicin)的DMEM中生长；并维持在90％以下的汇合。NIH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)在含有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM中生长；并维持在90％以下的汇合。
用于转染的细胞的制备
如下制备细胞用于转染。转染前一天，293T细胞于3mL完全培养基(高葡萄糖DMEM+10％FBS+青霉素/链霉素)中添加到6孔组织培养盘(4.5×105个细胞/孔)中。转染当天，通过用磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)洗涤细胞1次，用0.5mL 0.05％胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶处理，添加0.5mL完全培养基并使用血球计计数10μL，来确定两个选择孔的细胞数。如果细胞是约50％汇合(约7×105个细胞/孔)，那么转染继续进行(如果细胞过于稀少或过于汇合，那么转染不继续进行)。类似地，转染前一天，HeLa细胞以1×105个细胞/孔涂铺，而HT1080、NIH3T3和VERO细胞于3ml其各自完全培养基中以2×105个细胞/孔涂铺，并在第二天在约50％汇合下进行转染。
细胞转染
转染如下进行。首先，从每一孔去除培养基，接着添加1mLOpti-mem(pH 7.4)到每一孔，轻轻旋动，接着去除(每次洗涤六个孔以防止细胞移去)。接着小心地添加另1mLOpti-mem(pH 7.4)到每一孔，免得移去细胞。接着添加多聚复合物样品到每一孔(2μg DNA的目标)，旋动并在37℃下温育2小时。温育后，将培养基去除并用2mL完全培养基替换并在37℃下再温育。在需要的时候，去除上清液并储存在-20℃下，用于随后SEAP分析。
SEAP蛋白质分析
SEAP分析使用SEAP化学发光分析试剂盒进行。所有分析试剂都在使用前在25℃下平衡30分钟。分析标准品是通过将胎盘碱性磷酸酶在来自试剂盒的外加有0.1％牛血清白蛋白和50％甘油的1X稀释缓冲液中溶解到1mg/mL，并接着用DMEM以10倍连续稀释法稀释到0.01pg/uL来制备。接着标准品和解冻样品用稀释缓冲液以1:4稀释，在65℃下热灭活30分钟，在冰上温育2分钟，离心(在室温下16100×rcf，2分钟)并将上清液转移到新的管中。在25℃下平衡5分钟后，一式两份地添加50uL样品和标准品到Microlite-1盘的每一孔。接着添加灭活缓冲液(50uL)到每一孔并上下轻轻地吸移以进行混合而不产生气泡，并温育5分钟。底物/强化试剂在5分钟温育期间以1:19底物:增强子的比率制备。接着添加底物/强化剂到每一孔中，温育20分钟，接着在光度计(Lmax11384，Molecular Devices)中，使用1秒的积分时间来读取盘。
SEAP mRNA分析-定量实时聚合酶链反应(Q-RT-PCR)
各种样品中SEAP mRNA表达的相对定量通过Q-RT-PCR测定。简单地说，使用TRIzol试剂提取和纯化总mRNA，并使用Superscript II进行Q-RT-PCR。使用Primer Express(1.5版)(Applied Biosystems,Foster City,California)设计SEAP基因引物和荧光生成探针。ABI 7000序列检测系统(Applied Biosystems)用以进行所有聚合酶链反应(PCR)，总体积是25μl。每一反应混合物含有1×TaqMan Universal Master混合物、20μM每一引物和10μM探针。十微升每一互补DNA(等于4.5-45ng反转录的总RNA)用于每一PCR反应。PCR过程由50℃下初始温育2分钟、接着95℃下10分钟温育、40个循环的在95℃下15秒和60℃下1分钟PCR组成。每一96孔分析盘含有缺失反转录酶和缺失互补DNA对照。结果相对于看家基因GAPDH(参考基因)标准化并表示为处理组织与未处理的对照组织之间的相对目标基因表达比率。所述方法称为帕夫法(Pfaffl's method)(Pfaffl MW.Nucleic Acids Res(2001)29:e45)。
细胞的siRNA敲减转染
基因表达的敲减是通过首先用siRNA/改性的dd-壳聚糖多聚复合物转染宿主细胞，接着用DNA/脂染胺(Lipofectamine)2000转染相同的宿主细胞进行。
转染前一天，将24孔盘的9×104个293T细胞/孔于1ml完全培养基中涂铺。转染当天，细胞(50％汇合)在转染前用Opti-mem洗涤。通过去除孔中的培养基，重新添加0.25mlOpti-mem，适当旋动，接着去除Opti-mem并用0.25ml新鲜Opti-mem替换来洗涤细胞。通过添加200nM siRNA/改性的壳聚糖多聚复合物到每一孔并在37C下在5％CO2温育箱中温育来进行siRNA转染。2小时后，将Opti-mem去除并用0.5ml完全培养基替换。通过添加0.4ug含有萤光素酶的脂染胺粒子到每一孔并在37C下在5％CO2温育箱中温育来进行DNA转染。2小时后，将培养基去除并用0.5ml新鲜的完全培养基替换，接着细胞回到温育箱。用siRNA转染四十八小时后，收集细胞溶解产物进行萤光素酶分析。为了收集，将细胞用达伯克氏磷酸盐缓冲生理食盐水洗涤，并外加500ul含有无EDTA蛋白酶抑制剂的Glo溶解缓冲液，温育5分钟后收集到管，并立刻分析或储存在-80℃下。
萤光素酶分析
使用Bright-Glo萤光素酶分析系统进行萤光素酶分析。Glo溶解缓冲液、Bright-Glo缓冲液和分析样品在使用前平衡到室温。分析标准品是通过将QuantiLum重组萤光素酶在含有无EDTA蛋白酶抑制剂和1mg/ml BSA的1X Glo溶解缓冲液中稀释到90ng/ml，接着稀释到30ng/ml，接着以10倍连续稀释法稀释到0.003ng/ml来制备。Bright-Glo底物用Bright-Glo缓冲液复原以在使用前的至少10分钟制成Bright-Glo分析试剂。一百微升样品和标准品一式两份地添加到Microlite-1盘的每一孔中。接着添加Bright-Glo分析试剂(100uL)到每一孔中并在光度计中温育2分钟且使用1秒的积分时间读取。
动物
动物研究的手术方案经英属哥伦比亚大学动物保健委员会(the University ofBritish Columbia Committee for Animal Care)批准。动物工作由合格和经过培训的工作人员进行，雌性约8周龄的C57BL/6小鼠从Jackson Laboratory(Bar Harbour,Maine)购买。小鼠圈养在12小时亮/暗的循环中，每笼2-4只动物，并给予一周时间来适应新环境，以及标准啮齿动物食物(Research Diets Inc.,New Brunswick,NJ)和水随意取食。小鼠圈养在英属哥伦比亚大学(UBC)的生理学系的动物设施中。
小鼠中结肠转染
将未处理的C57BL/6小鼠麻醉(1.5％-2.0％异氟烷吸入剂，Baxter CA2L9108)，并单次灌肠传递0.25mg/mL载有gWiz-SEAP质体的官能化的DD-壳聚糖-DNA多聚复合物或未官能化的壳聚糖-DNA多聚复合物。2天后，将小鼠处死并收获组织。
体内小鼠转染：多聚复合物传递到肌肉
为了传递标记物到小鼠肌肉，包含SEAP表达载体的DD-壳聚糖-DNA多聚复合物通过注射到内侧肌腱来施用。将小鼠麻醉并通过注射器注射50uL多聚复合物。在各个时间点，将小鼠处死并收集其肌肉组织且进行加工，以进行SEAP的mRNA表达。单独注射DNA作为对照。
冻干和用水复原DD-壳聚糖-核酸多聚复合物
冻在-80℃下的DD-壳聚糖-核酸多聚复合物(各280ul)放于预先冷却的容器中。接着容器连接到冻干器(SAVANT-Modulyo D)。多聚复合物在5托的恒压下在<-40℃的温度下冻干超过28小时。冻干后，DD-壳聚糖-核酸多聚复合物用水复原到原始浓度，用于随后实验。
结果
图2-4和7展示仅仅用葡糖酸(图2A)、仅仅用精氨酸(图2B)衍生化的壳聚糖或与仅仅用精氨酸或葡糖酸衍生化的壳聚糖相比用葡糖酸和精氨酸两者双重衍生化的壳聚糖(图3和7)的转染功效。图3和7展示当壳聚糖用精氨酸和葡糖酸两者双重衍生化时的协同效应。当壳聚糖用最终官能度为26％的精氨酸和最终官能度为3％到9％范围内的葡糖酸双重官能化时可以看到协同效应，不过最大的效应在约5％的葡糖酸最终官能度下看到(图4；也参见图7，其展示用最终官能度分别为26％和6％的精氨酸和葡糖酸双重官能化的壳聚糖的协同效应)。图5和6分别展示多聚复合物调配物的N/P比率和pH值对转染功效的作用。用(1)仅仅精氨酸或(2)精氨酸和葡糖酸衍生化的两种壳聚糖的转染功效直接与N/P比率有关，不过在所有测试的N/P比率下双重衍生化的壳聚糖的转染功效比用单独精氨酸衍生化的壳聚糖高(图5)。相比之下，pH值不影响转染功效(图6)。横跨不同的细胞系，离体(图8)、针对siRNA(图11)和体内(图9-10)，也可以看到协同效应。肌肉内传递DD-壳聚糖-DNA多聚复合物使体内肌细胞中的SEAP mRNA表达显著增加(图9)。另外，展示经处理的小鼠的结肠组织中SEAPmRNA相比于未处理小鼠(未转染)相对增加(图10)。冷冻和冻干的DD-壳聚糖-核酸多聚复合物在室温下储存3个月后都展示物理化学性质的稳定性。这些多聚复合物在用水复原后温育过夜后还维持其稳定性(图12)。
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本领域技术人员在阅读以上描述时可想到某些修改和改善。应了解，为了简洁和易读，本文中已经删除了所有这类的修改和改善，但其完全在以下权利要求书的范围内。

Claims (33)

1.一种壳聚糖衍生物的纳米粒子，其包含与葡糖酸和精氨酸偶合的壳聚糖。
2.如权利要求1所述的纳米粒子，其中所述壳聚糖与5％到60％的初始浓度的葡糖酸偶合。
3.如权利要求2所述的纳米粒子，其中所述壳聚糖与8％到30％的初始浓度的葡糖酸偶合。
4.如权利要求3所述的纳米粒子，其中所述壳聚糖与3％到10％的最终官能化的葡糖酸偶合。
5.如权利要求4所述的纳米粒子，其中所述壳聚糖与5％的最终官能化的葡糖酸偶合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的纳米粒子，其中所述壳聚糖与10％到55％的最终官能化的精氨酸偶合。
7.一种组合物，其包含如权利要求1至6中任一项所述的纳米粒子，其中所述壳聚糖与核酸复合形成双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述核酸是DNA或RNA。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物的胺与磷酸酯比率在2到100之间。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物的胺与磷酸酯比率在2到50之间。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物的胺与磷酸酯比率在2到30之间。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物的胺与磷酸酯比率在2到15之间。
13.一种传递核酸分子到细胞的方法，其包括使所述细胞与如权利要求7至12中任一项所述的组合物接触。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞在体内。
15.如权利要求7所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有1-60％的所述精氨酸与所述葡糖酸的组合官能度。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有1-30％的所述精氨酸与所述葡糖酸的组合官能度。
17.如权利要求7所述的组合物，其中所述核酸选自肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
18.如权利要求8所述的组合物，其中所述RNA选自反义RNA、siRNA、短发夹RNA、微RNA和酶RNA。
19.如权利要求7所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物包含在与所述葡糖酸和所述精氨酸偶合之前具有小于110kDa的平均分子量的壳聚糖分子。
20.如权利要求7所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有小于0.5的平均多分散指数(PDI)。
21.如权利要求7所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有100:1与1:100之间的所述精氨酸与所述葡糖酸的摩尔比。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有50:1与1:50之间的所述精氨酸与所述葡糖酸的摩尔比。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有10:1与1:10之间的所述精氨酸与所述葡糖酸的摩尔比。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有5:1与1:5之间的所述精氨酸与所述葡糖酸的摩尔比。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有2:1与1:2之间的所述精氨酸与所述葡糖酸的摩尔比。
26.如权利要求7所述的组合物，其用于治疗糖尿病，其中所述纳米粒子与编码胰岛素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1或瘦素的核酸复合形成所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物。
27.如权利要求7所述的组合物，其用于治疗炎症性肠病，其中所述纳米粒子与编码IL-10、TNFα拮抗剂或IL-17拮抗剂的核酸复合形成所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物。
28.如权利要求7所述的组合物，其用于治疗肥胖，其中所述纳米粒子与编码瘦素、缩胆囊肽、PYY或GLP-1的核酸复合形成所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物。
29.如权利要求20所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有小于0.4的平均多分散指数。
30.如权利要求28所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有小于0.3的平均多分散指数。
31.如权利要求29所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有小于0.25的平均多分散指数。
32.药物组合物，其包含权利要求7所述的组合物。
33.如权利要求7所述的组合物，其中所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物的胺与磷酸酯比率在2到100之间，所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有1-60％的所述精氨酸与所述葡糖酸的组合官能度，所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物包含在与所述葡糖酸和所述精氨酸偶合之前具有小于110kDa的平均分子量的壳聚糖分子，所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有小于0.5的平均多分散指数(PDI)，以及所述双重衍生化的壳聚糖核酸多聚复合物具有100:1与1:100之间的所述精氨酸与所述葡糖酸的摩尔比。
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