WO2012105685A1

WO2012105685A1 - キトサン誘導体から得られるヒドロゲル

Info

Publication number: WO2012105685A1
Application number: PCT/JP2012/052487
Authority: WO
Inventors: 孝行武井; 幸衛川上; 中原　秀樹
Original assignee: 国立大学法人九州大学
Priority date: 2011-02-04
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2012-08-09
Also published as: JPWO2012105685A1; JP5907489B2

Abstract

　生体に有害な添加剤を使用せず任意の形状に成形でき創傷被覆材として有用なキトサン由来のヒドロゲルを得る技術を提供する。　キトサンのグルコサミン単位のアミノ基にアルドン酸（例えばグルコン酸）が結合しているキトサン誘導体による。このキトサン誘導体含有水溶液は凍結および融解するだけで任意の形状のヒドロゲルを形成する。ポリビニルアルコールを混合することにより強度などの諸特性の向上したヒドロゲルが得られる。

Description

キトサン誘導体から得られるヒドロゲル

　本発明は、新規なヒドロゲルに関し、特に、創傷被覆材等として有用なキトサン誘導体由来のヒドロゲルに関する。

　創傷被覆材には創傷治療を促進する性質が求められる。創傷部位に湿潤環境を提供できるヒドロゲル状の創傷被覆材は、創傷部位の肉芽組織形成および再表皮化を促し、治癒を促進することが報告されている。

　キトサンは抗菌性ならびに創傷治癒効果を有する天然多糖類であり、その特性故、これまでキトサンは創傷被覆材材料として広く使用されてきた。しかしながら、キトサンは生理的ｐＨにおいて難水溶性であるため、ヒドロゲル状のキトサン創傷被覆材を作製することは困難である。一方、生理的ｐＨにおいて水溶性を示すキトサン誘導体が報告されているが、このキトサン誘導体からヒドロゲルを調製するためには、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を使用しなければならなく、ゲル中に残存した架橋剤の生体毒性が問題である。

　特表２００９－５２０７０５号公報（特許文献１）には、キトサンとトレハロースのような二糖類またはグリセロールのようなポリオールとを混合することにより、熱でゲル化するキトサン組成物が記載されており、この熱ゲル化特性は凍結乾燥後も再構成される旨言及されている。特表２００１－５１３３６７号公報（特許文献２）には、キトサン（誘導体）と、グリセロールのようなポリオールまたは糖の塩（例えば、一リン酸二塩基塩）とを混合することにより、３０～６０℃でゲル化する組成物が記載されている。特表２００３－５０３３６７号公報（特許文献３）には、キトサンとポリエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシドとから構成されるヒドロゲルが記載されている。特開２００８－１７４６７１号公報（特許文献４）には、キトサンにフェノール性水酸基を導入したキトサン誘導体が開示され、これを該フェノール性水酸基が酸化される環境に供することによりゲル化する旨記載されている。特表２０１０－５３３１５４号公報（特許文献５）には、キトサンのカルボキシアルキルアミドから成り美容的および皮膚科的用途に向けられたヒドロゲルが記載されている。

　上述の文献は、キトサンまたはキトサン誘導体を用いるヒドロゲルに関するものであるが、いずれも、単にヒドロゲルが形成されることを示しているにすぎず、個々の用途に適合した形状のキトサン由来のヒドロゲルを調製し得るような技術はどの文献にも開示されていない。

特表２００９－５２０７０５号公報特表２００１－５１３３６７号公報特表２００３－５０３３６７号公報特開２００８－１７４６７１号公報特表２０１０－５３３１５４号公報

　本発明の目的は、生体に有害な添加剤を使用することなく、しかも、簡単に任意の形状に成形することができ創傷被覆材等として有用なキトサン由来のヒドロゲルを得る新しい技術を提供することにある。

　本発明者は、検討を重ねた結果、生理的ｐＨにおいて溶解可能なキトサン誘導体に注目し、このキトサン誘導体を含有する水溶液は、凍結および融解するだけでヒドロゲルを形成することを見出し、本発明を導き出した。

　かくして、本発明は、キトサンのグルコサミン単位のアミノ基にアルドン酸が脱水縮合により結合して成るキトサン誘導体に由来するヒドロゲルの調製方法であって、前記キトサン誘導体を含有する水溶液を所定の形状の型に流し込む工程、その型内で、キトサン誘導体含有水溶液を凍結する工程、および、凍結したキトサン誘導体含有水溶液を融解して、所定の形状に応じた形状のゲルを得る工程、を含むことを特徴とするキトサン由来のヒドロゲルの調製方法を提供するものである。

　本発明は、さらに、上記の方法によって得られることを特徴とするヒドロゲル（ヒドロゲル構造体）を提供する。本発明は、さらに、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を混合した上記のヒドロゲルを提供する。

　特定構造のキトサン誘導体から、架橋剤など生体に有害な添加剤を使用することなく、創傷部に湿潤環境を提供して創傷被覆材など医療用に適した各種の形状のヒドロゲルを調製することができる。

本発明において用いられるキトサン誘導体に用いられるアルドン酸の化学構造式を例示する。本発明において用いられるキトサン誘導体を合成する反応スキームを例示する。本発明において用いられるキトサン誘導体におけるグルコン酸の導入率を測定するに際して、キトサン誘導体水溶液に加えた水酸化ナトリウム水溶液の量と導電率の関係を示す。本発明において用いられるキトサン誘導体の水溶性を評価するために測定したキトサン誘導体水溶液のｐＨと濁度の関係を示す。本発明に従うキトサン誘導体から得られる成型ゲルをその鋳型とともに例示する。本発明に従うキトサン誘導体から得られる成型ゲルに関する強度評価として、（ａ）歪み（％）と応力（ｍＮ／ｍｍ^２）を測定した圧縮強度の結果と、（ｂ）ゲルの含水率（％）の結果を示す。本発明に従うキトサン誘導体から得られる成型ゲルに関して、（ａ）水分保持力に関する離水率（％)の結果と、（ｂ）～（ｄ）耐酵素分解性に関するリゾチーム水溶液に浸した写真を示す。本発明に従うキトサン誘導体から得られる成型ゲルの創傷治癒促進評価として、（ａ）本発明に係るヒドロゲルと５（重量／容量）％のポリビニルアルコールゲル（対照）とを埋植したマウス背部皮下を撮影した写真と、（ｂ）創傷部の経時変化を撮影した写真と、（ｃ）創傷面積の経時変化の結果を示す。本発明において用いられるキトサン誘導体の細胞毒性の評価実験の結果を示す。（ａ）グルコン酸修飾キトサン、（ｂ）トレオン酸修飾キトサン。本発明において用いられる別のキトサン誘導体の水溶性を評価するために測定したキトサン誘導体水溶液のｐＨと濁度の関係を示す。

　本発明において用いられるキトサン誘導体を合成するのに用いられるキトサンとは、キチンの脱アセチル化物である。よく知られているように、キチンのキトサンへの変換（脱アセチル化反応）は完全には進まず、糖鎖上に一部Ｎ－アセチルグルコサミンを含み、市販のキトサンの脱アセチル化度は通常５０～１００％の範囲にあり、特に７０～９０％程度のものが多い。
　本発明に関連して用いるキトサンとは、特に言及しない限り、脱アセチル化度が５０～１００％のものを意味し、したがって、脱アセチル化度が１００％でないものも包含する。

　本発明において用いられるキトサン誘導体を合成するのに用いられるアルドン酸とは、単糖を酸化して得られる誘導体のうち、アルドースの１位のホルミル基がカルボシキル基に変わったカルボン酸の総称であり、例えば、下記の一般式（Ｉ）で表すことができる。

　上記式中、ｎは２から４の整数である。

　本発明において用いられるキトサン誘導体の合成に用いられるのに好ましいアルドン酸としては、グルコン酸が挙げられ、その他に、トレオン酸やキシロン酸も好適に使用することができる。さらに、ガラクトン酸、マンノン酸、リキソン酸、エリトロン酸、リボン酸、アラビノン酸、アロン酸、アルトロン酸、グロン酸、イドン酸、タロン酸などアルドン酸として知られたカルボン酸はいずれも使用可能である。図１には、これらのアルドン酸の幾つかの化学構造式をFischer投影式に準じて示している。

　以上の説明から理解されるように、本発明において用いられるキトサン誘導体は、一般に、下記の式（II）に示されるようにグルコサミン単位のアミノ基にアルドン酸が結合している部位とアセチルグルコサミン単位の残存している部位とから成る繰り返し単位（反復単位）を有するものとして表すことができる。

　上記式中、ｎは２から４の整数である。

　したがって、アルドン酸がグルコン酸の場合、本発明において用いられるキトサン誘導体は、一般に、下記の式（III）で示される繰り返し単位を有するものとして表すことができる。

　本発明において用いられるキトサン誘導体は、アルドン酸をキトサンに縮合脱水反応させてキトサンのグルコサミン単位の２位のアミノ基にアルドン酸を結合（導入）することにより合成することができる。アルドン酸は、一般に、適当な塩（例えばＮａ塩）として反応させる。図２には、アルドン酸としてグルコン酸を用いた場合についての反応スキームが示されている。

　この縮合脱水反応は、縮合剤（脱水縮合剤）を用い酸性条件下に室温で実施することができる。このキトサンとアルドン酸との縮合脱水反応における縮合剤として好適なものとして、アルドン酸のカルボキシル基を活性化する機能を果たす１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および副反応を抑制する機能を果たすＮ－ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　キトサンへのグルコン酸等のアルドン酸の導入率は、キトサンに対するアルドン酸の相対的な使用量および縮合剤の使用量を変えることにより調整することができ、アルドン酸の相対的使用量および縮合剤の使用量を多くすることにより当該導入率を高くすることができる。アルドン酸導入率は最大５０％程度まで可能であるが、得られるキトサン誘導体（アルドン酸修飾キトサン）をヒドロゲルとして用いる本発明においては、後述するように、キトサンへのアルドン酸導入率は、脱アセチル化度７５～８５％のキトサンを用いて、通常１０～３０％とすることが好ましい。

　ここで、グルコン酸等のアルドン酸の（キトサンへの）導入率とは、下記の式（Ａ）で表されるものである。
　アルドン酸導入率（％）＝［Ｙ／（Ｘ＋Ｙ）］×１００　（Ａ）
　Ｘ＝キトサン導入体中に含まれるグルコサミン単位の物質量（モル数）、Ｙ＝キトサン誘導体中に含まれるアルドン酸導入グルコサミン単位の物質量（モル数）。

　この導入率は、キトサン誘導体（アルドン酸修飾キトサン）を適当な濃度の塩酸水溶液に溶解させた水溶液に、その塩酸と当モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液を加えた際の導電率の変化を測定することにより算出することができる。

　この測定法を、アルドン酸としてグルコン酸を用いて得られるグルコン酸修飾キトサン（以下、ＧＣと省略することがある）について、図３に沿って詳述すると次のようになる：グルコン酸修飾キトサンを溶解した０．１Ｍ塩酸水溶液中に０．１Ｍ水酸化ナトリウムを加えていくと、中和反応により溶液中のＨ⁺が減少し、それに伴って水溶液の導電率は低下する（図３Ａ－Ｂ）。その中和反応が完了すると、グルコサミン単位中のプロトン化したアミノ基の脱プロトン化がはじまり、その脱プロトン化が完了するまで導電率は変化しない（図３Ｂ－Ｃ）。脱プロトン化が完了すると水溶液中のＯＨ^－が増加することから導電率も増加する（図１Ｃ－Ｄ）。ここで、図３中のＢ－Ｃで水溶液に加えた水酸化ナトリウムの物質量は、グルコサミン単位中のプロトン化したアミノ基の物質量に相当する。また、この塩酸水溶液中ではほとんどのグルコサミン単位中のアミノ基がプロトン化していることを考慮すると、図１中のＢＣで水溶液に加えた水酸化ナトリウムの物質量は、グルコン酸が修飾されていないグルコサミン単位の物質量に相当する。したがって、この測定法によりグルコン酸修飾および未修飾キトサン中のグルコサミン単位の物質量を算出し、それらを比較することでグルコン酸の導入率を求めることができる。

　本発明において用いられるキトサン誘導体（アルドン酸修飾キトサン）は、酸性領域で水溶性を有するとともに、アルドン酸の導入率が増加するに従い、水溶性を呈する領域がｐＨの高い領域にまで拡がる特性を有する。例えば、脱アセチル化度７５～８５％のキトサンを用いて、アルドン酸の導入率が１０～３０％の場合には、本発明のキトサン誘導体は、ｐＨ７の中性付近（生理的ｐＨ域）においても良好な水溶性を呈することが見出されている。そして、驚くべきことに、このような生理的ｐＨ値のキトサン誘導体水溶液を凍結した後、融解するだけでヒドロゲルが形成されることが見出された。

　かくして、本発明に従えば、キトサン誘導体（アルドン酸修飾キトサン）を含有する水溶液を所定の形状の型（鋳型）に流し込んで凍結させ、その後、融解することにより、所定の形状に応じた形状のゲルを得ることができる。凍結は、例えば、－２０℃、また、融解は、一般に、室温下に行われるが、凍結および融解の温度や時間は特に限定されるものではなく、必要に応じて調整すればよい。

　本発明に従いキトサン誘導体を凍結・融解することによりヒドロゲルを形成する詳細なメカニズムは未だ充分には解明されていないが、疎水結合や水素結合を介してキトサン誘導体（アルドン酸修飾キトサン）分子が互いに絡み合った構造が凍結により固定化された後、融解により該構造が幾分緩むことによりゲル化するものと推測される。

　さらに、本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、上記のキトサン誘導体にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を混合して同様の操作を行うことにより諸特性の向上したヒドロゲルが形成することをも見出した。すなわち、前記キトサン誘導体を含有する水溶液（鋳型に流し込む水溶液）にポリビニルアルコールを混合し、凍結・融解することにより、キトサン誘導体にポリビニルアルコールが混合されたヒドロゲルが得られる。

　キトサン誘導体にポリビニルアルコールが混合されたヒドロゲルを得る場合、ヒドロゲル中のポリビニルアルコール配合量は、キトサン誘導体／ポリビニルアルコール［（重量／容量）％比］が、１／１０以上２／５未満であることが好ましく、より好ましくは１／５であり、例えば、キトサン誘導体［１（重量/容量）％］とポリビニルアルコール［５（重量／容量）％］という配合比率で形成することができる。また、本発明に適用されるポリビニルアルコールの分子量は、ゲルの形成しやすさから、６．６×１０^４Ｄａ（ダルトン）以上２．５×１０^５Ｄａ（ダルトン）以下のものを使用することが好ましく、例えば、１．５×１０^５Ｄａのものを使用することができる。分子量が６．６×１０^４Ｄａより小さい場合には、ゲル化しても高い強度が得られず、２．５×１０^５Ｄａより大きい場合には水溶液の粘度が高くポリビニルアルコールとキトサン誘導体の混合が困難であるためである。

　このようにして得られたヒドロゲルは、ポリビニルアルコールの寄与によって、高い生体適合性を維持しつつ、極めて優れた強度、水分保持力、耐酵素分解性等の特性を有するものとなる（後述の実施例参照）。このため、本発明に係るヒドロゲルは、強度、水分保持力、耐酵素分解性が要求されるような用途に使用する場合には、ポリビニルアルコールを混合することが好ましく、例えば、創傷被覆材として使用する場合には、生体適合性を維持しつつ、ゲル強度の低下を防止するとともに、より長期間にわたり創傷を湿潤状態に維持することが可能となる。

　本発明のキトサン誘導体から形成されるゲルは、一般に、弾性のある硬質のヒドロゲルである。用いる型（鋳型）の形状に従い、シート状のものや球形のものなど、用途に応じて各種の形状に成形することができる。また、上記の説明から理解されるように、ゲル化に際して架橋剤を全く用いておらず、生体に有害な添加剤の使用を回避している。
　以下、本発明の特徴をさらに具体的に説明するため、グルコン酸をはじめとして、幾つかのアルドン酸を用いた場合の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。

グルコン酸修飾キトサン（ＧＣ）の合成
　２－モルホリノエタンスルホン酸を２３．５ｍＭの濃度で溶解させた蒸留水３００ｍｌ（ｐＨ４．０）にキトサン３．０ｇ（商品名「キトサンＬＬ」、脱アセチル化度８０％、焼津水産化学工業株式会社製）を溶解させ、１Ｍ塩酸水溶液を加えることによりｐＨを４．０に調整した。表１に示すとおり、この水溶液にグルコン酸ナトリウム（以下、ＧＡと省略）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣと省略）およびＮ－ヒドロキシこはく酸イミド（以下、ＮＨＳと省略）を溶解させ、室温で２４時間攪拌することで、キトサンのグルコサミン単位の２位のアミノ基にグルコン酸を導入した（図２参照）。

　続いて、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより反応溶液のｐＨを８．０に調整した後、９９．５％エタノールを加えることでグルコン酸修飾キトサンおよび未反応のグルコン酸ナトリウムを沈殿させ、遠心操作により沈殿物を回収した。その後、沈殿物を透析膜に封入し、１週間蒸留水に浸すことでグルコン酸ナトリウムを除去した。この際、１日に２回蒸留水を交換した。続いて、透析膜内の沈殿物および水溶液を回収し、９９．５％エタノールを加えることでグルコン酸修飾キトサンを沈殿させ、その沈殿物を回収した。その後、凍結・乾燥処理を行い、保管した。

　反応結果を下記の表１に示す。グルコン酸導入率は、既述のように、０．１Ｍ塩酸水溶液４０ｍｌにグルコン酸修飾キトサン乾燥粉末０．２ｇを溶解させ、その水溶液に０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えた際の導電率の変化を測定することで算出した。

　グルコン酸導入率１８．７％の場合の生成物および未修飾のキトサンについてＦＴ－ＩＲ測定を行ったところ、いずれも、３４００ｃｍ^－１および１５９０ｃｍ^－１にピークが認められたが、そのピーク高さの差は、グルコン酸を導入した生成物の方が大きかった。ＦＴ－ＩＲ測定において、３４００ｃｍ^－１のピーク高さは分子中のヒドロキシル基数に依存し、１５９０ｃｍ^－１のピーク高さはグルコサミン単位のアミノ基数に依存する。３４００ｃｍ^－１のピーク高さと１５９０ｃｍ^－１のピーク高さの差は、理論上、グルコン酸修飾キトサンの方が、未修飾キトサンよりも大きくなる。実際に、３４００ｃｍ^－１のピーク高さと１５９０ｃｍ^－１のピーク高さの差は、グルコン酸修飾キトサンの方が、未修飾キトサンよりも大きかったことからキトサンにグルコン酸を導入したグルコン酸修飾キトサンの生成が確認された。

グルコン酸修飾キトサンの水溶性評価
　２－モルホリノエタンスルホン酸を５０ｍＭの濃度で溶解させた蒸留水５０ｍｌ（ｐＨ４．０）にグルコン酸修飾キトサン乾燥粉末を０．５ｇ溶解させ、１Ｍ塩酸水溶液を加えることによりｐＨを４．０に調整した。続いて、０．１Ｍまたは１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えることでｐＨを上昇させ、その際の溶液の濁度（波長６００ｎｍ）を測定した。その結果、グルコン酸導入率が増加するにつれ、濁度が上昇しはじめるｐＨはアルカリ側にシフトし、導入率１０．５％および１８．７％のキトサン誘導体を溶解させた水溶液はｐＨ７付近の中性領域においてもほとんど白濁せず、生理的ｐＨにおいても溶解可能であることが示された（図４参照）。更に測定を行ったところ、導入率１０～３０％において生理的ｐＨ域における白濁は認められず、キトサン誘導体（グルコン酸修飾キトサン）が水溶性を有することが明らかとなった。

グルコン酸修飾キトサンの細胞毒性評価
　Ｌ９２９繊維芽細胞を１．０×１０^－４cells／wellの密度で９６wellプレートに播種し、２４時間培養した。実施例１で合成したグルコン酸修飾キトサン誘導体を濃度を変えて溶解した最少必須培地（Minimum Essential Medium）（ｐH７．０）をwellに加え、さらに２４時間培養した。続いて、cell counting kit ８（同仁化学）を用いて、細胞の生存率を測定した。なお、キトサン誘導体を含まない培地で培養した細胞の生存率を１００％とした。
　その結果を図９の（ａ）に示す。測定誤差の範囲内で、ほぼ１００％を示しており、グルコン酸修飾キトサン誘導体は、キトサンと同様に、細胞毒性がきわめて低いことが理解される。

凍結・融解によるヒドロゲルの調製
　実施例１で合成したグルコン酸導入率１８．７％のキトサン誘導体乾燥粉末０．１ｇを蒸留水１０ｍｌに加え、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えることにより、粉末を完全に溶解させた。続いて、０．１Ｍまたは１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えることでｐＨを７．０に調整し、得られた水溶液を断面が星形状の金属鋳型に入れて、－２０℃で１２時間凍結した。その後、室温での静置により溶解させたところ、金属鋳型の形状に応じた星形状のゲルの生成が確認された（図５参照）。なお、対照として、グルコン酸を導入していないキトサンについても同様にゲル化を試みたが、ゲル化は起らなかった。

ヒドロゲルの細胞接着性評価
　実施例１で合成したグルコン酸導入率１８．７％のグルコン酸修飾キトサンの１％（w/v）水溶液（pＨ７．０）を４８wellプレートに注ぎ、その底面の半分を当該キトサン誘導体から成るポリマー溶液で覆った。続いて、－２０℃で凍結（２４時間）後、室温で融解（２時間）することで、ポリマー溶液をゲル化させた。その４８wellプレートにＬ９２９繊維芽細胞を播種し、培養２４時間後に細胞形態を顕微鏡観察したところ、ゲルによる細胞接着性は非常に低いことが認められた。

ポリビニルアルコールを混合したヒドロゲルの調製
　グルコン酸導入率１９．３％のキトサン誘導体乾燥粉末をｐＨ４．０の生理食塩水に溶
解して２（重量/容量）％のキトサン誘導体溶液を得た。また、別の生理食塩水にポリビニルアルコール粉末（分子量１．５×１０^５Ｄａ、シグマ・アルドリッチ製）を加えて加熱することで溶解して１０（重量/容量）％のポリビニルアルコール溶液を得た。キトサン誘導体溶液とポリビニルアルコール溶液を１：１（体積比）で混合し、その中に０．１Ｍまたは１．０Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を加えることで、水溶液のｐＨを７．０に調整し、得られた水溶液１ｍｌを内径１１ｍｍの円筒容器に入れて－３０℃で２４時間凍結した。その後、室温（２０℃）で２時間静置して融解させることにより、ポリビニルアルコールを混合したヒドロゲルの生成が確認された。

ヒドロゲルの特性評価
　既述の実施例に従って調製したグルコン酸修飾キトサン（ＧＣ）由来のヒドロゲルおよびＧＣにポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を混合して得られたヒドロゲルについて、下記のように幾つかの特性を評価した。
（１）力学強度（圧縮強度）
　円筒容器から円盤状となったゲルを取り出し、その圧縮強度を測定した。この円盤状ゲルを圧縮した際の歪み（％）と応力（ｍＮ／ｍｍ^２）を測定した結果を図６（ａ）に示す。同図（ａ）に示すように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分な圧縮強度を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、１（重量／容量）％ＧＣ（グルコン酸修飾キトサン）の５倍、２（重量/容量）％ＧＣの３倍まで圧縮強度が飛躍的に向上することがわかった。さらに、ゲルの含水率（％）を（ゲル湿潤重量／ゲル乾燥重量）の比率として算出した結果を図６（ｂ）に示す。一般にゲルの力学強度が高くなるほどゲルの含水率が低くなることから、同図（ｂ）に示すように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分に低いゲルの含水率を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、１（重量／容量）％ＧＣに対して１／４まで、２（重量/容量）％ＧＣに対して１／３までゲルの含水率が低下したことから、ゲルの力学強度が飛躍的に向上することがわかった。

（２）水分保持力
　５０ｍｌ遠沈管の管口に、孔径４０μｍのメッシュで構成されるセルストレーナー（日本ＢＤ製）を設置し、このセルストレーナー内に上記の円盤状ゲル（体積：２ｍｌ）を入れ、１２００ｒｐｍで１５分間遠心した。遠心後に遠沈管内に溜まった水の重量から、離水率（％）を（遠心後に遠沈管内にたまった水重量／遠心前のゲル中の水重量）の比率として算出した結果を図７(ａ)に示す。同図（ａ）に示すように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分に高い水分保持力を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、１（重量/容量）％ＧＣに対して１／１０まで、２（重量/容量）％ＧＣに対して１／１５まで離水率が抑えられたことから、水分保持力が飛躍的に向上することがわかった。

（３）耐酵素分解性
　本発明に係るヒドロゲルの耐酵素分解性を確認するために、リゾチーム（ヒト体内にも存在するキトサン分解酵素）を含有するリゾチーム水溶液に、本発明に係るヒドロゲルを浸してゲル形状の経時的な変化を観察した。リゾチーム水溶液に浸した直後の写真と２４時間後の写真を図７(ｂ)および（ｃ）に示す。特にポリビニルアルコールを混合したヒドロゲルは、同図（ｄ）に示すように、リゾチーム水溶液に浸してから２４時間後にも、リゾチーム水溶液に浸した直後と同じような明確なゲル形状を維持していた。このように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分な耐酵素分解性を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、耐酵素分解性が飛躍的に向上することがわかった。

ヒドロゲルの創傷治癒促進評価
　グルコン酸修飾キトサン（ＧＣ）にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を混合した本発明に係るヒドロゲルの免疫賦活能（創傷治癒促進効果）を確認するために、マウス背部皮下にゲルを1週間埋植して経過観察した。本発明に係るヒドロゲルと、５（重量／容量）％のポリビニルアルコールゲル（対照）とを埋植したマウス背部皮下を撮影した写真を図８（ａ）に示す。同図（ａ）に示すように、1週間経過後には、本発明に係るヒドロゲルの近傍では、過剰な白血球（免疫細胞）が集積していたが、対照である５（重量／容量）％ポリビニルアルコールゲルの近傍では、白血球の集積は見られなかった。本発明に係るヒドロゲルは、ポリビニルアルコールを混合した後も、キトサンが本来的に有する免疫賦活能を維持していることがわかった。

　さらに、本発明に係るヒドロゲルを、ストレプトゾトシンの投与により糖尿病にしたラット（血中グルコース濃度：＞３００ｍｇ／ｄｌ）の皮膚全層欠損モデルに適用した。雄性Wistarラット（糖尿病、７週齢）背部に4つの皮膚全層欠損創（直径1ｃｍ）を作製し、本発明に係るヒドロゲルと、本発明に係るヒドロゲルに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加したものと、対照としてガーゼおよびビューゲル（登録商標）の計４ケースの経時変化を検証した。創傷部の経時変化を撮影した写真を図８（ｂ）に示す。また、創傷面積の経時変化を図８（ｃ）に示す。

　図８（ｂ）および（ｃ）の結果から、本発明に係るヒドロゲルは、市販されているガーゼおよびビューゲルよりも、創傷治癒を著しく促進することがわかった。さらに、本発明に係るヒドロゲルに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加することで、特に創傷治癒の初期における創傷治癒が有意に促進されることがわかった。

トレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンの合成、水溶性評価およびヒドロゲルの調製
　実施例１に記載の方法と同様の方法により、アルドン酸としてトレオン酸およびキシロン酸を用いて、トレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンを合成した。反応結果を下記の表３に示す。それぞれのアルドン酸の導入率は、実施例１に記載の場合と同様に、キトサン誘導体（アルドン酸修飾キトサン）を塩酸水溶液に溶解させた水溶液に、その塩酸と当モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液を加えた際の導電率の変化を測定することにより求めた。

　次に、以上のようにして合成したトレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンについて、実施例２と同様の手法により、ｐＨに対する濁度の変化を測定することにより、水溶性を評価した。その結果を図１０に示す。図に示されるように、トレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンのいずれも、グルコン酸修飾キトサンと同様に、無処理のキトサンに比べて、ｐＨ７付近の中性領域（生理的ｐＨ域）においても水溶性が高いことが認められる。
　さらに、合成したトレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンを実施例４と同様の手法により、－２０℃で１２時間凍結した後、室温で融解したところ、ゲル化していることが確認された。

トレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンの細胞毒性評価
　Ｌ９２９繊維芽細胞を１．０×１０^４cells/wellの密度で９６wellプレートに播種し、２４時間培養した。実施例９で合成したトレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンのそれぞれを溶解した最少必須培地（pＨ７．０）をwellに加え、さらに２４時間培養した。続いて、cell counting kit 8（同仁化学）を用いて、細胞の生存率を測定した。キトサン誘導体を含まない培地で培養した細胞の生存率を１００％とした。トレオン酸修飾キトサン誘導体の場合の測定結果を図９の（ｂ）に示す。グルコン修飾キトサンと同様に、トレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンの細胞毒性は低いことが認められた。

ヒドロゲルの細胞接着性評価
　実施例９で合成したトレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンの１％（w/v）水溶液（ｐH７．０）を４８wellプレートに注ぎ、その底面の半分をそれらのアルドン酸修飾キトサンから成るポリマー溶液で覆った。続いて－２０℃で凍結（２４時間）後、室温で融解（２時間）することで、ポリマー溶液をゲル化させた。その４８wellプレートにＬ９２９繊維芽細胞を播種し、培養２４時間後に細胞形態を顕微鏡観察した。トレオン酸修飾キトサン由来のゲルおよびキシロン酸由来のゲルのいずれの場合においても、ゲルによる細胞接着性は低かった。

Claims

　キトサンのグルコサミン単位のアミノ基にアルドン酸が脱水縮合により結合して成るキトサン誘導体に由来するヒドロゲルの調製方法であって、前記キトサン誘導体を含有する水溶液を所定の形状の型に流し込む工程、前記型内で前記キトサン誘導体含有水溶液を凍結する工程、および、前記凍結したキトサン誘導体含有水溶液を融解して、前記所定の形状に応じた形状のゲルを得る工程、を含むことを特徴とするヒドロゲルの調製方法。
　キトサン誘導体として、脱アセチル化度７５～８５％のキトサンを使用して、アルドン酸のキトサンへの導入率が１０～３０％であるものを用いる請求項１に記載のヒドロゲルの調製方法。
　アルドン酸がグルコン酸である請求項２に記載のヒドロゲルの調製方法。
　アルドン酸がトレオン酸である請求項２に記載のヒドロゲルの調製方法。
　アルドン酸がキシロン酸である請求項２に記載のヒドロゲルの調製方法。
　前記キトサン誘導体を含有する水溶液にポリビニルアルコールが混合されている請求項１に記載のヒドロゲルの調製方法。
　請求項１の方法によって得られることを特徴とするキトサン誘導体由来のヒドロゲル。
　ポリビニルアルコールが混合されている請求項７に記載のキトサン誘導体由来のヒドロゲル。