CN101195031B - 葡萄糖酸改性壳聚糖亲核no供体及其合成方法 - Google Patents

Abstract

一种葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法，属于医药工程技术领域。本发明对壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖上的NH₂基团进行羧化反应改性，使其产生能够与NO反应的亲核NH基团。葡萄糖酸改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖分子上的仲胺NH基团同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行反应，其中Na⁺/NH＝2，产生[N(O)NO]-基团，所得到的葡萄糖酸改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖亲核NO供体分子结构式如下。本发明亲核NO供体具有不同的NO释放速率和较大的负载量，同时能够克服亲核试剂(多胺)的细胞毒性和避免致癌性副产物亚硝胺的生成，并且有一定的靶向能力。

Description

葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法

技术领域

本发明涉及一种医药工程技术领域的药物及其合成方法，具体是一种葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法。

背景技术

心血管疾病是威胁人类健康的首要疾病，而经皮冠状动脉成形术后再狭窄是仍然没有解决的一个世界性的医学难题。NO释放材料被认为是一种有效的抗再狭窄药物。能够产生和释放NO的材料目前被认为是抗血栓凝结和抑制术后再狭窄等临床医学难题最有希望的解决方案。含有[N(O)NO]^-官能团的化合物是近几年发展起来的一种最重要的NO供体药物。它既可在生理条件下自发的释放NO分子，经02取代后又可在靶器官和靶细胞中被特定酶脱离，具有靶向性的功能，它还具有良好的可调控性，另外它可制备成各种形态，根据需要应用于不同的医学领域。虽然大量的体外试验已经证明了它可有效的预防成型术后再狭窄，提高医疗装置的抗血栓性能，减轻肺部高压和血管痉挛然等用途，但是这些合成产物的NO供体再经02取代，反应较为复杂，经过多次反应，势必使反应率比一次反应更低，大大降低了NO的利用率。

在最近的十年中，国外对基于含有[N(O)NO]^-官能团的NO供体控释材料进行了大量的研究。最初的研究集中于将离子型的亲核NO供体NONOate分散于各种疏水性聚合物中，通过NO的释放增强这些材料的血液相容性。虽然这些研究取得了相当大的成功，但是将这类材料应用于临床，还必须考虑作为聚合物基体材料的生物相容性和生物可降解性，亲核试剂的细胞毒性和生物相容性。因此选用无毒的有良好生物相容性的NO载体引起人们的关注。

壳聚糖(CS)及其衍生物由于其良好的生物相容性、可生物降解性、低的免疫原性和生物学的性质，使得壳聚糖及其衍生物的应用受到广泛的应用。然而在生理环境(pH7.4)下的非溶解性却限制了壳聚糖在很多领域的应用，壳聚糖仅能溶于pH＜6.5稀酸溶液，在这种酸性条件下，壳聚糖上2位胺基发生质子化，破坏了壳聚糖结晶区形成的分子内和分子间氢键，所以变得易溶于水。

为了提高壳聚糖的溶解性，在2位胺基上引入一些亲水性基团，如酰化产物、羧甲基和季胺盐。最这些水溶性壳聚糖衍生物已经作为生物医学材料在体内进行了研究，然而，为了制备能溶于水的壳聚糖，壳聚糖上的很多D-氨基葡萄糖单元都得引入亲水基团。因为壳聚糖的物理化学和生物化学活性来源于骨架上的胺基，所以对D-氨基葡萄糖单元充分的改性将是不利的。所以既能提高壳聚糖的水溶性又能不过分消耗D-氨基葡萄糖单元的改性是可取的。

细胞表面的糖类物质来源于糖蛋白、糖脂和蛋白多糖，它们参与了很多重要的生物活动，细胞表面的这些糖类物质是细胞之间和细胞与胞外环境物质之间相互作用的媒介。将葡萄糖改性的壳聚糖作为一种无毒的NO药物载体，可克服常用壳聚糖改性产物的低物理化学和生物活性，还可克服一般壳聚糖改性产物负载NO效率低的问题，发挥糖类物质的特殊靶向作用。

经对现有技术的文献检索发现，美国专利(USP6261594，Chitosan-basednitric oxide donor compositions，2001；USP6451337，Chitosan-based nitricoxide donor compositions，2002)提出了将改性壳聚糖作为亲核NO载体，合成出系列壳聚糖-NO加成物。壳聚糖的具体的改性分为两类：(1)亲水基团改性：N-羧丁基壳聚糖，N-羧乙基壳聚糖，N-羧甲基壳聚糖。(2)疏水性基团改性：N-丙基壳聚糖，N-羧乙基壳聚糖甲酯。其不足在于NO的负载程度较低，原因有两点：(1)壳聚糖氨基改性(烷基化)的取代度一般只有25-27％，低的取代度导致NO的负载量很低。(2)壳聚糖改性产物作为NO供体材料在释放NO的时候由于不具有特意靶向性使得NO的利用率不高。因此限制了其在医学上的用途。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法，即葡萄糖酸(GA)改性壳聚糖(CS)或O-羧甲基壳聚糖(O-CMCS)亲核NO供体及其合成方法。本发明通过对壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖进行葡萄糖酸改性，产生仲胺(NH)亲核位点，同NO反应后，得到一系列以葡萄糖酸改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖为载体的含有[N(O)NO]^-官能团的新型的NO供体，解决了目前此类亲核NO供体应用于临床时存在的问题(负载量较小，靶向性差)。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及的葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体，用壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖作为基体材料，采用葡萄糖酸改性产生仲胺亲核位点(NH基团)，与NO反应产生[N(O)NO]^-官能团，分子结构式如下：

其中N[N(O)NO]^-基团为NH基团同NO反应形成。而NH基团来自于葡萄糖酸改性的壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖；

壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖分子量大小是40万-188万，NH基团是由壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖上的NH₂基团和葡萄糖酸上的羧基-COOH基团发生羧化反应得到的。

本发明所涉及的葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，是对壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖分子上的NH₂基团进行羧基化改性，使其产生能够与NO反应的亲核NH基团，羧基改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖分子上的仲胺NH基团同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行反应，其中，Na⁺/NH＝2，压力为5-10atm，室温反应3-7天，产生[N(O)NO]^-基团，得到含有[N(O)NO]^-基团的亲核NO供体。将合成产物用甲醇乙醚分别清洗多次，室温真空干燥，储存于-20℃的干燥器内。

所述对壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖上的NH₂基团进行羧基化改性，是通过葡萄糖酸分子上的-COOH羧基基团跟壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖上的NH₂基团进行缩聚脱水制得。其产物在超纯水中透析，除去未反应得小分子物质，然后烘干。

本发明得到的葡萄糖酸改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖亲核NO供体分别为无色和白色膜状物质或粉红色粉末，储存于-20℃的干燥器内。在室温下能够稳定存在，在酸性或中性水溶液中能够自发分解释放出NO和N-葡萄糖酸壳聚糖(SBC)分子或N-葡萄糖酸-O-羧甲基壳聚糖(SBCS)分子。

本发明制备的葡萄糖酸改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖亲核NO供体，具有稳定的化学性质和较大的负载量，可广泛的应用于治疗心血管系统疾病，肺部高压，促进伤口愈合，有效的预防成型术后再狭窄，提高医疗装置的抗血栓性能。对于葡萄糖酸改性40万分子量壳聚糖制得的N-葡萄糖酸壳聚糖(SBC)，负载NO后所得NO供体40SBC-NO，释放总量达到了334nmol/mg，半衰期t_1/2是0.235h。

附图说明

图1壳聚糖跟葡萄糖酸的合成(SBC)反应路线图

图2O-羧甲基壳聚糖跟葡萄糖酸的合成(SBCS)反应路线图

图3 SBC/NO和SBCS/NO负载反应路线图

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1、2所示，本发明对壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖上的NH₂基团进行葡萄糖酸改性，通过以下方法进行：将壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖0.01moL和葡萄糖酸0.002moL溶于0.1N HCl盐酸溶液中100ml，然后向溶液中加入EDC 0.003moL和NHS 0.00075moL，之后用1moL/L NaOH和1moL/L的HCl溶液调溶液的pH＝5，反应液在室温下继续搅拌反应24h，反应结束后用1N NaOH溶液调制pH＝9，反应液在透析袋中用蒸馏水透析5天，烘干后分别得到葡萄糖酸改性壳聚糖的产物N-葡萄糖酸壳聚糖(SBC)和葡萄糖酸改性O-羧甲基壳聚糖的产物N-葡萄糖酸-O-羧甲基壳聚糖(SBCS)。

如图3所示，SBC/NO和SBCS/NO负载反应路线图，将得到的葡萄糖酸改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖后的产物同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行反应，其中Na⁺/NH＝1-3，压力为5-10atm，室温反应3-7天，得到含有[N(O)NO]^-基团的亲核NO供体，具体结构式如下：

SBC/NO结构式                                  SBCS/NO结构式

实施例1：葡萄糖酸改性40万分子量壳聚糖/NO的合成

40万分子量的壳聚糖(1g)和葡萄糖酸(0.1或0.2等份/[-NH2])溶于0.1NHCl盐酸溶液中(100ml)，然后向溶液中加入EDC(1.5等份/葡萄糖酸)和NHS(0.25等份/EDC)，之后用1N NaOH/1N HCl的溶液调溶液的pH＝5，反应液在室温下继续搅拌反应24h，反应结束后用1N NaOH溶液调制pH＝9，反应液在透析袋中用蒸馏水透析5天，烘干后得产物，为无色透明膜状物质SBC(1.44g)。

将上述反应产物0.23g(0.001mol)加入到含有0.22g(0.002mol)甲醇钠的100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力5atm，反应3天，反应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到无色透明膜状物质约0.32g。

[N(O)NO]^-官能团最直观和有效地表征方法是在230-280处的紫外特征吸收，合成产物SBC/NO中[N(O)NO]^-官能团的特征吸收在258nm，测定了在PBS缓冲液中其吸光率随时间的变化，通过释放曲线的函数拟合求出其半衰期(t_1/2)。对于40SBC-NO，释放总量为334nmol/mg，半衰期t_1/2是0.235h。

实施例2：葡萄糖酸改性124万分子量0-羧甲基壳聚糖/NO的合成

124万分子量的0-羧甲基壳聚糖(1g)和葡萄糖酸(0.1或0.2等份/[-NH2])溶于0.1N HCl盐酸溶液中(100ml)，然后向溶液中加入EDC(1.5等份/葡萄糖酸)和NHS(0.25等份/EDC)，之后用1N NaOH/1N HCl的溶液调溶液的pH＝5，反应液在室温下继续搅拌反应24h，反应结束后用1N NaOH溶液调制pH＝9，反应液在透析袋中用蒸馏水透析5天，烘干后得产物，为粉色细粉末状物质N-葡萄糖酸-0-羧甲基壳聚糖SBCS(1.33g)。

将上述反应产物SBCS 0.32g(0.001mol)加入到含有0.22g(0.002mol)甲醇钠的100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力7atm，反应5天，反应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到粉红色粉末状物质约0.44g。

[N(O)NO]-官能团最直观和有效地表征方法是在230-280处的紫外特征吸收，合成产物SBCS/NO中[N(O)NO]^-官能团的特征吸收在258nm，测定了在PBS缓冲液中其吸光率随时间的变化，通过释放曲线的函数拟合求出其半衰期(t_1/2)。对于124SBCS-NO，释放总量为238.2nmol/mg，半衰期t_1/2为0.365h。

实施例3葡萄糖酸改性188万分子量壳聚糖/NO的合成

188万分子量的壳聚糖(1g)和葡萄糖酸(0.1或0.2等份/[-NH2])溶于0.1N HCl盐酸溶液中(100ml)，然后向溶液中加入EDC(1.5等份/葡萄糖酸)和NHS(0.25等份/EDC)，之后用1N NaOH/1N HCl的溶液调溶液的pH＝5，反应液在室温下继续搅拌反应24h，反应结束后用1N NaOH溶液调制pH＝9，反应液在透析袋中用蒸馏水透析5天，烘干后得产物，得白色不透明膜状物质SBC(1.20g)。

将上述反应产物0.20g(0.001mol)加入到含有0.22g(0.002mol)甲醇钠的100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力10atm，反应7天，反应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到蓝白色不透明膜状物质约0.25g。

[N(O)NO]^-官能团最直观和有效地表征方法是在230-280处的紫外特征吸收，合成产物N-葡萄糖酸壳聚糖/NO(SBC/NO)中[N(O)NO]^-官能团的特征吸收在258nm，测定了在PBS缓冲液中其吸光率随时间的变化，通过释放曲线的函数拟合求出其半衰期(t_1/2)。对于188SBC-NO，释放总量为124nmol/mg，半衰期t_1/2为0.323h。

Claims (4)

1.一种葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体，其特征在于：分子结构式如下：

其中一氧化氮供体结构N[N(O)NO]^-基团为NH基团同NO反应形成，而仲胺NH基团来自于羧化反应改性的壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖；R为-H或-CH₂COONa，它来自于壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖，壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖分子量大小是40万-188万。

2.一种如权利要求1所述的葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体的制备方法，其特征在于：对壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖分子上的NH₂基团进行羧基化改性，使其产生能够与NO反应的亲核NH基团，羧基改性壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖分子上的仲胺NH基团同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行反应，其中，温度为室温，时间为3天-7天，压力为5atm-10atm，Na⁺/NH＝2，产生[N(O)NO]^-基团，得到含有[N(O)NO]^-基团的亲核NO供体。

3.根据权利要求2所述的葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体的制备方法，其特征是，所述对壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖上的NH₂基团进行羧基化改性，是通过葡萄糖酸分子上的-COOH羧基基团跟壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖上的NH₂基团进行缩聚脱水制得。

4.根据权利要求2或3所述的葡萄糖酸改性壳聚糖亲核NO供体的制备方法，其特征是，所述壳聚糖或O-羧甲基壳聚糖的NH₂基团进行羧基化改性后，其产物在超纯水中透析，除去未反应的小分子物质，然后烘干。

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