KR102295130B1 - 이중으로 유도체화된 키토산 나노입자 및 생체내에서 유전자 전달을 위해 이들을 만들고 이용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

양이온성 아미노산 및 친수성 폴리올로 기능화된 키토산을 포함하는 키토산-유도체 나노입자; 그리고 예로서, 생체내 유전자 전달을 위해 이를 만들고 이용하는 방법이 본원에서 제공된다.

Description

이중으로 유도체화된 키토산 나노입자 및 생체내에서 유전자 전달을 위해 이들을 만들고 이용하는 방법 {DUALLY DERIVATIZED CHITOSAN NANOPARTICLES AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME FOR GENE TRANSFER IN VIVO}
발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 이중으로 유도체화된 키토산을 포함하는 나노입자, 그리고 핵산을 전달하기 위해, 예를 들면, 생체내에서 유전자 전달을 위해 이들을 만들고 이용하는 방법에 관계한다.
발명의 배경
키토산은 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루코사민의 비독성 양이온성 공중합체이다. 키토산은 핵산과 복합체를 형성할 수 있고, 그리고 생체적합성과 비독성 다당류로서, 세포를 형질감염시키기 위한 DNA 전달 운반제로서 이용되었다. 바이러스 벡터의 복잡성과 잠재적 독성으로 인해 핵산의 비바이러스 전달에서 키토산을 이용하는데 많은 관심이 집중되었다.
변형된 키토산과 핵산 사이에 복합체를 비롯한 다수의 키토산/DNA 복합체가 유전자 형질감염에 충분히 적합한 조성물을 확인하기 위한 시도에서 조사되었다. 가령, WO2010/088565; WO2008/082282를 참조한다. 이들 복합체는 다른 성질 중에서, 용해도, 응집에 대한 성향, 복합체 안정성, 입자 크기, DNA를 방출하는 능력, 그리고 형질감염 효율에서 변하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 향상된 형질감염 효율로 생체내 유전자 전달을 위한 새로운 조성물과 방법이 요구된다. 본원에서 설명된 조성물과 방법은 이런 저런 필요에 부합하는데 도움을 준다.
발명의 요약
특정 Arg:HP 비율에서 (1) 아르기닌 (Arg) 및 (2) 친수성 폴리올 (HP)로 기능화된 키토산이 극적으로 향상된 형질감염 효율을 전시한다는 놀라운 발견이 본원에서 제시된다. 아르기닌과 글루콘산은 키토산 나노입자의 형질감염 효율을 증가시키는 기능기로서 상승적으로 행동하는 것으로 나타났다. 가령, PCT/CA2013/050218을 참조한다. 다른 분자가 키토산의 유도체로서 글루콘산을 대신하고 이러한 상승 효과를 여전히 전시할 수 있다는 놀라운 발견이 본원에서 개시된다. 게다가, 이들 두 치환체의 최적화된 기능화 정도 비율이 제공되는데, 이들 내에서 유도체화된 키토산은 최고 형질감염 효율을 전시한다. 따라서 예로서, 생체내에서 핵산의 세포, 조직과 장기로의 전달을 용이하게 하는 신규한 조성물이 본원에서 제공된다. 특히, 이중으로 유도체화된 키토산 기초된 나노입자가 본원에서 제공되는데, 여기서 키토산은 최적화된 Arg 최종 기능화 정도:HP 최종 기능화 정도 (가령, Arg:HP) 비율에서 양이온성 아미노산 아르기닌 (Arg) 및 친수성 폴리올 (HP)로 기능화되었다.
바람직한 구체예에서, 나노입자는 복수의 아르기닌 및 복수의 친수성 폴리올 둘 모두에 연계되는 키토산을 포함한다, 가령, 화학식 I을 참조한다.
Figure 112016039396449-pct00001
(I)
여기서 n은 1 내지 650의 정수이고,
α는 아르기닌의 기능화 정도이고,
β는 친수성 폴리올의 기능화 정도이고, 그리고
각 R1은 수소, 아세틸, 아르기닌, 그리고 친수성 폴리올에서 독립적으로 선택된다.
바람직한 구체예에서, 나노입자는 아르기닌에 연계되는 키토산을 포함한다. 화학식 II를 참조한다. 바람직한 구체예에서, 아르기닌은 키토산의 용해도를 증가시키고 및/또는 유도체화된 키토산이 더욱 높은 pH에서 핵산에 결합하도록 허용하는데 도움을 준다.
Figure 112016039396449-pct00002
(II)
다른 구체예에서, 나노입자는 친수성 폴리올에 연계되는 키토산을 포함하는데, 상기 친수성 폴리올은 바람직하게는, 키토산에 연계하기 위한 카르복실 또는 알데히드 기를 갖는다. 한 구체예에서, 친수성 폴리올은 키토산에 연계하기 위한 카르복실 기 또는 알데히드 기를 갖는 분자, 그리고 사카라이드로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 상기 친수성 폴리올은 글루콘산이 아니다. 한 구체예에서, 친수성 폴리올은 카르복실 기를 갖는다. 한 구체예에서, 키토산에 연계하기 위한 카르복실 기를 갖는 친수성 폴리올은 글루콘산 및 트레온산으로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 친수성 폴리올은 글루콘산이다, 가령, 화학식 III을 참조한다. 다른 구체예에서, 친수성 폴리올은 트레온산이다, 가령, 화학식 IV를 참조한다. 다른 구체예에서, 친수성 폴리올은 사카라이드이고, 이것은 사카라이드의 자연 또는 합성, 또는 산 형태일 수 있다. 무제한적 실례는 글리세르알데히드, 트레오스, 에리트로오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 알로오스, 글루코오스, 알트로오스, 만노오스, 굴로오스, 이도오스, 갈락토오스, 그리고 탈로오스를 포함한다. 한 구체예에서, 친수성 폴리올은 글루코오스이다, 가령, 화학식 V를 참조한다. 한 구체예에서, 친수성 폴리올은 트레오스이다, 가령, 화학식 VI를 참조한다.
Figure 112016039396449-pct00003
(III) (IV)
Figure 112016039396449-pct00004
(V) (VI)
본원에서 설명된 바와 같이 이중으로 유도체화된 키토산은 최적화된 Arg:HP 최종 기능화 정도 비율에서 아르기닌 및 친수성 폴리올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이중으로 유도체화된 키토산은 약 1:1 및 약 10:1 사이에 Arg:HP 최종 기능화 정도, 또는 몰 비율을 갖는다. 다른 구체예에서, Arg:HP 최종 기능화 정도 비율은 약 3:1 내지 약 7:1이다. 다른 구체예에서, Arg:HP 최종 기능화 정도 비율은 약 5:1이다.
특히, 이런 이중으로 유도체화된 키토산 ("DD-키토산")으로 형성된 키토산-핵산 폴리플렉스는 비-기능화된 키토산, 단독적으로 유도체화된 키토산, 또는 1:1 및 10:1 사이에 Arg:HP 최종 기능화 정도 비율에서 이중으로 유도체화된 키토산으로 형성된 핵산 폴리플렉스보다 높은 형질감염 효율을 전시한다. 본원에서 설명된 폴리플렉스에서 이중으로 기능화된 키토산의 이용에 의해 부여된 다른 바람직한 성질은 점막 장벽을 관통하는 향상된 능력, 6.5보다 큰 pH에서 증강된 폴리플렉스 안정성, 높은 폴리플렉스 농도에서 감소된 응집, 감소된 세포 독성 및 핵산의 증강된 세포내 방출을 포함한다. 게다가, 일부 바람직한 구체예에서, 본 DD-키토산 폴리플렉스 조성물은 생리학적 pH에서 투여될 수 있다 (가령, 전신 투여).
따라서, 한 양상에서, 본 발명은 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 제공한다. DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 아르기닌 및 친수성 폴리올로 이중으로 유도체화된 키토산을 포함한다.
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 DNA이다.
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 RNA이다.
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 인공 핵산이다. 바람직한 구체예에서, 인공 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고 (PMO), 잠금된 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)으로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 치료적 핵산이다. 한 구체예에서, 치료적 핵산은 치료적 RNA이다. 바람직한 구체예에서, 치료적 RNA는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, 그리고 효소적 RNA로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 치료적 핵산은 DNA이다.
한 구체예에서, 치료적 핵산은 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 복수의 DD키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 조성물은 3.0-8.0 사이, 더욱 바람직하게는 4.0-7.0 사이, 그리고 가장 바람직하게는 4.5-6.5 사이의 pH를 갖는다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 치료적 핵산을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 이들 방법은 본 발명의 제약학적 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 본 제약학적 조성물은 생리학적 pH에서 투여된다.
한 구체예에서, 본 제약학적 조성물은 전신적으로 투여된다.
한 구체예에서, 본 제약학적 조성물은 표적 조직에 국부 투여된다. 바람직한 구체예에서, 본 제약학적 조성물은 점막 조직에 투여된다. 한 구체예에서, 점막 조직은 위장관 (GI) 조직이다.
한 양상에서, 본 발명은 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 백신을 제공하고, 여기서 상기 핵산은 항원을 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 환자를 예방접종하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 발명의 백신을 환자에 투여하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, 여기서 상기 핵산은 면역원을 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 관심되는 분자에 대한 면역 반응을 개시하거나 또는 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 발명의 면역원성 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 핵산은 관심되는 분자의 에피토프를 인코딩한다. 다른 양상에서, 본 발명은 면역 반응을 조정하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 본 발명의 키토산-핵산 폴리플렉스를 환자에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 핵산은 면역조정성 사이토킨을 인코딩한다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 3% 또는 10%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산으로만, 10%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌으로만, 또는 약 1:1 또는 약 3.3:1의 아르기닌 대 글루콘산 최종 기능화 정도 비율에서 글루콘산과 아르기닌 둘 모두로 기능화된 5 kDa 키토산 (x 축)의 시험관내 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y 축)을 보여준다.
도면 2는 3% 내지 10%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산으로만, 52%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌으로만, 또는 약 6:1 또는 약 17:1의 아르기닌 대 글루콘산 최종 기능화 정도 비율에서 글루콘산과 아르기닌 둘 모두로 기능화된 5 kDa 키토산 (x 축)의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y 축)을 보여준다.
도면 3은 3% 내지 10%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산으로만, 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌으로만, 또는 약 4:1의 아르기닌 대 글루콘산 최종 기능화 정도 비율에서 글루콘산과 아르기닌 둘 모두로 기능화된 5 kDa 키토산 (x 축)의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y 축)을 보여준다.
도면 4는 3%의 최종 기능화 정도에서 트레온산으로만, 29%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌으로만, 또는 약 10:1의 아르기닌 대 트레온산 최종 기능화 정도 비율에서 트레온산과 아르기닌 둘 모두로 기능화된 5 kDa 키토산 (x 축)의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y 축)을 보여준다.
상세한 설명
키토산은 키틴의 탈아세틸화된 형태인데, 이것은 갑각류 (가령, 새우, 게, 바닷가재)의 외골격의 주요 성분인 N-아세틸글루코사민의 중합체이다. 키토산은 탈아세틸화에 의해 키틴으로부터 형성되고, 그리고 따라서, 단일 중합성 분자가 아니고, 상이한 분자량 및 상이한 정도의 탈아세틸화를 갖는 한 부류의 분자이다. 상업적인 키토산에서 퍼센트 탈아세틸화는 전형적으로 50-100% 사이이다.
본원에서 설명된 키토산 유도체는 본원에서 설명된 바와 같이, 결과의 유리 아미노 기를 양성으로 하전된 및/또는 친수성 모이어티로 기능화함으로써 산출된다. 본원에서 설명된 유도체화된 키토산은 다음을 비롯한, 핵산 전달 운반제에 유리한 다수의 성질을 갖는다: 이들은 음성으로 하전된 핵산에 효과적으로 결합하고 복합체를 형성하고, 이들은 제어가능한 크기의 나노입자로 형성될 수 있고, 이들은 세포에 의해 흡수될 수 있고, 그리고 이들은 세포 내에서 적절한 시점에서 핵산을 방출할 수 있다.
50%보다 큰 임의의 정도의 탈아세틸화 (DDA)를 갖는 키토산이 본 발명에서 이용되고, 기능화가 1%와 50% 사이이다. (퍼센트 기능화는 키토산 중합체 상에서 유리 아미노 모이어티의 숫자에 비하여 결정된다.) 탈아세틸화와 기능화의 정도는 특이적 전하 밀도를 기능화된 키토산 유도체에 부여한다. 결과의 전하 밀도는 용해도, 핵산 결합과 차후 방출, 그리고 포유류 세포막과의 상호작용에 영향을 준다. 따라서, 본 발명에 따르면, 이들 성질은 최적 효력을 위해 최적화되어야 한다. 예시적인 키토산 유도체는 2007년 1월 24일자에 제출된 Baker et al; 11/657,382에서 설명되고, 이것은 본원에 참조로서 편입된다. 한 구체예에서, 본원에서 설명된 이중으로 유도체화된 키토산은 최소한 50%의 탈아세틸화의 정도를 갖는 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 탈아세틸화의 정도는 최소한 60%, 더욱 바람직하게는 최소한 70%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 더욱 바람직하게는 최소한 90%, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 95%이다. 바람직한 구체예에서, 본원에서 설명된 이중으로 유도체화된 키토산은 최소한 98%의 탈아세틸화의 정도를 갖는 키토산을 포함한다.
본원에서 설명된 키토산 유도체는 중성과 생리학적 pH에서 가용성인 다양한 평균 분자량을 갖고, 그리고 본 발명의 목적으로, 3 - 110 kDa 범위에서 변하는 분자량을 포함한다. 본원에서 설명된 구체예는 더욱 낮은 평균 분자량의 유도체화된 키토산 (<25 kDa, 예를 들면, 약 5kDa 내지 약 25kDa)을 특징으로 하고, 이들은 바람직한 전달과 형질감염 성질을 가질 수 있고, 그리고 크기에서 작고 우호적인 용해도를 갖는다. 더욱 낮은 평균 분자량 유도체화된 키토산은 일반적으로, 더욱 높은 분자량을 갖는 것보다 더욱 가용성이고, 따라서 전자는 핵산을 더욱 쉽게 방출하고 세포의 증가된 형질감염을 제공할 핵산/키토산 복합체를 생산할 것이다. 많은 기존 문헌이 키토산 기초된 전달 시스템에 대한 이들 모든 파라미터의 최적화에 헌신되었다.
당업자는 키토산이 화학식 I의 구조를 갖는 복수의 분자를 지칭한다는 것을 인식할 것인데, 여기서 n은 임의의 정수이고, 그리고 각 R1은 아세틸 또는 수소에서 독립적으로 선택되고, 여기서 수소에서 선택되는 R1의 정도는 50% 내지 100% 사이이다. 또한, 예로서 3kD 내지 110kD의 평균 분자량을 갖는 것으로 지칭된 키토산은 일반적으로, 각각 예로서 3kD 내지 110kD의 중량 평균 분자량을 갖는 복수의 키토산 분자를 지칭하고, 여기서 각 키토산 분자는 상이한 사슬 길이 (n+2)를 가질 수 있다. 또한, "n-mer 키토산"으로서 지칭된 키토산은 화학식 I의 키토산 분자를 반드시 포함하는 것은 아닌 것으로 충분히 인식되고, 여기서 각 키토산 분자는 n+2의 사슬 길이를 갖는다. 오히려, 본원에서 이용된 바와 같은 "n-mer 키토산"은 복수의 키토산 분자를 지칭하고, 이들은 각각, 상이한 사슬 길이를 가질 수 있고, 여기서 복수는 n의 사슬 길이를 갖는 키토산 분자와 실제적으로 유사하거나 또는 동등한 평균 분자 중량을 갖는다. 가령, 24-mer 키토산은 예로서, 각각 7-50 범위에서 변하는 상이한 사슬 길이를 갖지만, 24의 사슬 길이를 갖는 키토산 분자와 실제적으로 유사하거나 또는 동등한 중량 평균 분자량을 갖는 복수의 키토산 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 설명된 기능화된 키토산 유도체는 이중으로 유도체화된-키토산 화합물, 예를 들면, 키토산-Arg-HP 화합물이다. 일반적으로, 키토산-Arg-HP 화합물은 다음의 화학식 I의 구조를 갖는다:
Figure 112016039396449-pct00005
(I)
여기서 n은 1 내지 650의 정수이고,
α는 Arg의 최종 기능화 정도이고,
β는 HP의 최종 기능화 정도이고; 그리고
각 R1은 수소, 아세틸, Arg, 그리고 HP에서 독립적으로 선택된다.
본 발명의 이중으로 유도체화된 키토산은 양이온성 아미노산, 아르기닌으로 기능화될 수 있다.
본 발명의 이중으로 유도체화된 키토산은 또한, 키토산 (Arg-키토산 포함)의 친수성을 증가시키는데 도움을 줄 수 있고 및/또는 히드록실 기를 기증할 수 있는 친수성 폴리올로 기능화될 수 있다.
아르기닌 (Arg) 및 화학식 VII의 친수성 폴리올 (HP)로 기능화된 키토산을 포함하는 키토산-유도체 나노입자가 제공된다:
Figure 112016039396449-pct00006
(VII)
여기서:
R2는 H 및 히드록실에서 선택되고;
R3은 H 및 히드록실에서 선택되고; 그리고
X는 하나 또는 그 이상의 히드록실 치환체로 임의선택적으로 치환된 C2-C6 알킬렌에서 선택된다.
일부 구체예에서, 키토산-유도체 나노입자는 화학식 VII의 친수성 폴리올을 포함한다:
Figure 112016039396449-pct00007
(VII)
여기서:
R2는 H 및 히드록실에서 선택되고;
R3은 H 및 히드록실에서 선택되고; 그리고
X는 하나 또는 그 이상의 히드록실 치환체로 임의선택적으로 치환된 C2-C6 알킬렌에서 선택되고; 단서로서 상기 친수성 폴리올은 글루콘산이 아니다.
본원에서 이용된 바와 같은 용어 "C2-C6 알킬렌"은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 다중 결합을 임의선택적으로 내포하는 선형 또는 분지된 이가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 의심할 여지를 없애기 위해, 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "C2-C6 알킬렌"은 알칸, 알켄과 알킨의 이가 라디칼을 포괄한다.
본 발명에 따른 친수성 폴리올은 3, 4, 5, 6, 또는 7개 탄소 중추를 가질 수 있다. 한 구체예에서, 3 내지 7개 탄소를 갖는 본 발명에 따른 친수성 폴리올은 2, 3, 4, 5, 또는 6개 히드록실 기를 가질 수 있다. 한 구체예에서, 3 내지 7개 탄소를 갖는 본 발명에 따른 친수성 폴리올은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 다중 결합을 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 친수성 폴리올은 카르복실 기를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 친수성 폴리올은 알데히드 기를 포함한다. 당업자는 본 발명에 따른 친수성 폴리올이 알데히드 기를 포함할 때, 이런 친수성 폴리올이 개방성-사슬 입체형태 (알데히드) 및 환상 입체형태 (헤미아세탈) 둘 모두를 포괄한다는 것을 인식할 것이다.
친수성 폴리올의 무제한적 실례는 글루콘산, 트레온산, 글루코오스 및 트레오스를 포함한다, 가령, 화학식 III-VI를 참조한다. 카르복실 및/또는 알데히드 기를 가질 수 있거나, 또는 사카라이드 또는 이의 산 형태일 수 있는 다른 이런 친수성 폴리올의 실례는 아래 표 1-3 내에 포함된다. 당업자는 표 1-3이 친수성 폴리올의 무제한적 실례를 제공하고, 그리고 게다가, 도시된 친수성 폴리올이 도시된 입체화학에 한정되지 않는다는 것을 인식할 것이다.
Figure 112016039396449-pct00008
Figure 112016039396449-pct00009
Figure 112016039396449-pct00010
Figure 112016039396449-pct00011
Figure 112016039396449-pct00012
Figure 112016039396449-pct00013
Figure 112016039396449-pct00014
Figure 112016039396449-pct00015
Figure 112016039396449-pct00016
Figure 112016039396449-pct00017
Figure 112016039396449-pct00018
Figure 112016039396449-pct00019
Figure 112016039396449-pct00020
Figure 112016039396449-pct00021
Figure 112016039396449-pct00022
바람직한 구체예에서, HP는2,3-디히드록실프로파논산; 2,3,4,5,6,7-헥사히드록실헵타날; 2,3,4,5,6-펜타히드록실헥사날; 2,3,4,5-테트라히드록실헥사날; 그리고 2,3-디히드록실프로파날로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
바람직한 구체예에서, HP는 D-글리세린산, L-글리세린산, L-글리세로-D-만노헵토오스, D-글리세로-L-만노헵토오스, D-글루코오스, L-글루코오스, D-푸코오스, L-푸코오스, D-글리세르알데히드, 그리고 L-글리세르알데히드로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
바람직한 구체예에서, α:β 비율은 약 1:1 및 약 10:1 사이이다. 바람직한 구체예에서, 상기 비율은 약 3:1 및 약 7:1 사이이다. 가장 바람직한 구체예에서, 비율은 약 5:1이다.
본 발명에 따라서, 수성 매체에서 키토산을 아르기닌 또는 친수성 폴리올과 접합하기 위한 무제한적 방법이 본원에서 설명된다. 상기 방법은 키토산 중추 상에서 아민 및 Boc-보호된 Arg 상에서 카르복실산 또는 카르복실 기를 갖는 친수성 폴리올 사이에 아미드의 형성을 촉매작용하기 위해 널리 공지된 수용성 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 활용한다.
일반적으로, 예로서 6.0 ± 0.5 및 더욱 바람직하게는 6.0 ± 0.2의 표적화된 커플링 pH를 위해 조정된 pH를 갖는 묽은 HCl 용액에서 키토산은 먼저 Arg, 예를 들면, Boc-Arg 또는 카르복실 기를 갖는 친수성 폴리올에 연계되고, 정제되고, 그리고 이후, 두 번째 기능기와 연계된다. 가령, 키토산이 Arg에 먼저 연계되면, Arg-연계된 키토산 (Arg-키토산)은 정제되고, 그리고 이후, 친수성 폴리올에 연계될 수 있다. 반대로, 키토산이 친수성 폴리올에 먼저 연계되면, 친수성 폴리올-연계된 키토산은 정제되고, 그리고 이후, Arg에 연계될 수 있다. 연계의 순서와 상관없이, Arg 및 친수성 폴리올은 널리 공지된 방법을 이용하여 키토산에 연계될 수 있다.
가령, Arg는 Boc-Arg 및 조정된 pH의 NHS 수성 용액의 혼합물을 묽은 HCl에서 키토산 내로 첨가하고, 그 이후에 실온에서 24 시간 동안 EDC 물 용액을 첨가하여 커플링을 개시함으로써, 키토산 또는 폴리올-기능화된 키토산 (폴리올-키토산)에 연계될 수 있다. 키토산 아민의 농도, 반응 pH, 그리고 키토산-아민 및 EDC:NHS:Arg-COOH 위에서 Arg-COOH의 몰 비율은 Arg의 재현가능한 최종 기능화 정도를 갖도록 미리 계산되고 충족될 수 있다. Boc-Arg-키토산은 De-Boc 반응에 앞서 정제될 수 있다. De-Boc는 제어된 HCl 농도와 반응 시간을 갖는 HCl 매체에서 진행될 수 있다. de-Boc 동안 키토산의 임의의 해중합화는 반응 용액의 점성에서 변화를 계측함으로써 모니터링될 수 있는데, 이것은 미미한 것으로 입증되었고, 그리고 de-Boc의 효율은 de-Boc-Arg-키토산 및 Boc-Arg-키토산 상에서 핵 자기 공명 (NMR) 방법에 의해 확인될 수 있다. 기능화 정도는 정제된 de-Boc-Arg-키토산의 C, N 원소 분석으로부터 결정될 수 있다.
카르복실 기를 갖는 친수성 폴리올은 6.0 ± 0.3의 반응 pH에서 키토산 또는 Arg-연계된 키토산 (Arg-키토산)에 연계될 수 있다. 이러한 pH에서, 친수성 폴리올의 카르복실산 기는 친핵성 치환 반응 기전에 따라, 키토산 중추 상에서 연계되지 않은 아민에 의해 공격될 수 있다. 당업자는 이런 친수성 폴리올을 Arg-키토산에 커플링할 때, 비록 친핵성 치환 반응이 키토산 중추의 아민 기에서 우세하게 발생할 확률이 크긴 하지만, 소량의 친수성 폴리올이 동일한 기전을 통해 Arg의 아민 기와 공유 결합을 형성하는 것이 또한 가능하다는 것을 인식할 것이다.
자연 사카라이드인 친수성 폴리올은 환원성 아미노화, 그 이후에 NaCNBH3 또는 NaBH4로 환원을 이용하여 키토산 또는 Arg-연계된 키토산 (Arg-키토산)에 연계될 수 있다.
Boc-Arg-키토산, de-Boc-Arg-키토산, 폴리올-키토산, 및/또는 이중으로 유도체화된 키토산은 침전, 또는 칼럼 처리, 또는 규칙적인 투석, 또는 적절한 분자량 컷오프 (MWCO)의 투석 배관을 이용하여 물에 대한 역-흐름 투석에 의해, 또는 접선 유동 여과 (TFF) 및 정용여과 카트리지를 통해 정제될 수 있다.
따라서, "이중으로 유도체화된-키토산" 또는 "DD-키토산"은 또한, 이중으로 기능화된 ("이중으로 기능화된-키토산" 또는 "DF-키토산), 예를 들면, Arg 및 친수성 폴리올 둘 모두 (이들 둘 모두 키토산에 공유 부착된다)와 연계된 키토산을 지칭한다. Arg는 단일 아미노산으로서 또는 폴리펩티드로서 키토산에 공유 부착될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 달리 지시되지 않으면, 용어 "펩티드"와 "폴리펩티드"는 교체가능하게 이용된다.
용어 "폴리펩티드"는 전통적인 폴리펩티드 (즉, L 또는 D-아미노산을 내포하는 짧은 폴리펩티드)뿐만 아니라 원하는 기능적 활성을 유지하는 펩티드 등가물, 펩티드 유사체와 펩티드모방체를 지칭하기 위해 가장 넓은 의미에서 이용된다. 펩티드 등가물은 관련된 유기 산, 아미노산 또는 기타 유사한 것으로 하나 또는 그 이상의 아미노산의 대체, 또는 측쇄 또는 기능기의 치환 또는 변형에 의해 전통적인 펩티드와 상이할 수 있다.
펩티드모방체는 당분야에서 공지된 바와 같이, 대안 연쇄에 의해 대체된 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합을 가질 수 있다. 펩티드 중추의 부분 또는 전부가 또한, 당분야에서 공지된 바와 같이, 기능적 아미노산 측쇄의 이동성을 제한하기 위해 입체형태적으로 제약된 환상 알킬 또는 아릴 치환체에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 인식된 방법, 예를 들면, 당분야에서 널리 공지된 재조합 방법과 합성 방법에 의해 생산될 수 있다. 펩티드의 합성을 위한 기술은 널리 공지되어 있고, 그리고 Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2456 (1963), Atherton, et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989), 그리고 Merrifield, Science 232:341-347 (1986)에서 설명된 것들을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "선형 폴리펩티드"는 이의 성분 아미노산 측쇄에 공유 부착된 분지성 기를 결여하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "분지된 폴리펩티드"는 이의 성분 아미노산 측쇄에 공유 부착된 분지성 기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명의 DD-키토산의 Arg 최종 기능화 정도 또는 폴리올 최종 기능화 정도는 원소 분석에 의해 결정될 수 있다. 다음은 예로서, 키토산 중추에 연계되는 아르기닌과 글루콘산의 최종 기능화 정도의 예시적인 계산을 설명한다. 명료함을 위해, 다음의 실례는 100% DDA의 20-mer 키토산 분자를 이용한다.
100% DDA의 키토산은 D-글루코사민의 동종중합체이다; 이러한 반복 단위는 C/N의 몰 비율이 6/1이 되도록, 6개 C 원자 및 1개 N 원자를 갖는다.
해중합화 과정으로 인해, 중합체의 한쪽 단부에서 말단 단위는 2,5-안히드로-D-만노오스이다. 이러한 단위는 6/0의 C/N 비율을 갖는다.
결과적으로, 20-mer 키토산 실례에는 19개 단위의 D-글루코사민 및 1개 단위의 2,5-안히드로-D-만노오스가 있다. 이런 이유로, C/N의 전체 비율은 아래와 같다:
Figure 112016039396449-pct00023
이러한 비율은 평균적으로 질소의 공지된 진정수와 대비하여 6개 탄소 (이것은 단위당 C 원자의 평균 숫자이다)에 정규화된다:
Figure 112016039396449-pct00024
예로서, 아르기닌을 키토산에 연계하는데 있어서, 아르기닌 모이어티는 6개 C 및 4개 N을 갖는다. R%의 평균 아르기닌 기능화 정도를 갖는 20개 반복 단위의 아르기닌-변형된 키토산의 경우에, 다음의 관계가 키토산과 아르기닌으로부터 C와 N의 기여를 설명한다:
Figure 112016039396449-pct00025
C/N의 몰 비율은 C/N의 실험적으로 도출된 질량 비율로부터 계산된다. 결과적으로, R%의 기능화 정도, 다시 말하면, 아르기닌 기와 연계되는 키토산 중추 상에서 아미노 기의 백분율은 일단 C/N 몰 비율이 알려지면 도출될 수 있다.
글루콘산을 키토산에 연계:
글루콘산 모이어티는 6개 C 및 0개 N을 갖는다. G%의 기능화 정도를 갖는 20개 반복 단위의 글루콘산-변형된 키토산의 경우에, 다음의 관계가 키토산과 글루콘산으로부터 C와 N의 기여를 설명한다:
Figure 112016039396449-pct00026
C/N의 몰 비율은 C/N의 실험적으로 도출된 질량 비율로부터 계산된다. 결과적으로, G%의 기능화 정도, 다시 말하면, 글루콘산 모이어티와 연계되는 키토산 중추 상에서 아민 기의 백분율은 일단 C/N 몰 비율이 알려지면 도출될 수 있다.
아르기닌을 키토산에 연계, 그 이후에 글루콘산 연계:
글루콘산을 이전에 결정된 아르기닌 최종 기능화 정도 (R%)를 갖는 20개 반복 단위의 R-키토산에 연계할 때, 다음의 관계가 키토산, 아르기닌 및 글루콘산으로부터 C와 N의 기여를 설명한다:
Figure 112016039396449-pct00027
C/N의 몰 비율은 C/N의 실험적으로 도출된 질량 비율로부터 계산된다. 결과적으로, R%가 이전에 결정되었기 때문에, G%의 기능화 정도는 일단 C/N 몰 비율이 알려지면 도출될 수 있다.
앞서 설명된 바와 같이, 본원에서 이용된 바와 같은 Arg 또는 HP의 "최종 기능화 정도"는 각각, Arg 또는 HP로 기능화된 키토산 중추 상에서 아미노 기의 백분율을 지칭한다. 따라서, "α:β 비율", "최종 기능화 정도 비율" (가령, Arg 최종 기능화 정도: HP 최종 기능화 정도 비율) 등은 용어 "몰 비율" 또는 "숫자 비율과 교체가능하게 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 이중으로 유래된 키토산은 PCT 출원 번호 PCT/CA2013/050218, 특히 PCT/CA2013/050218의 실시예에서 구현된 바와 같은 키토산-유도체 나노입자 또는 키토산-유도체 나노입자 폴리플렉스가 아니다. 한 구체예에서, 키토산-유도체 나노입자는 다음의 나노입자 중에서 한 가지가 아니다:
a. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 52%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 8%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
b. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 3%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
c. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
d. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 6%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
e. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 9%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
f. 40의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
g. 10의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
h. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
i. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 6%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다; 또는
j. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 52%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 8%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다.
한 구체예에서, 키토산-유도체 나노입자는 1%, 2%, 4%, 7%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 그 이상의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 1% 내지 약 25%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계된 키토산을 포함한다. 다른 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 27% 내지 약 51%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 53% 내지 약 70%의 아르기닌의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계된 키토산을 포함한다. 다른 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 26% 또는 52%가 아닌 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계된 키토산을 포함한다.
한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계되고 3%가 아닌 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 키토산을 포함한다.
한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계되고 5%가 아닌 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계되고 6%가 아닌 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계되고 9%가 아닌 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계되고 3%, 5%, 6% 또는 9%가 아닌 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 52%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계되고 8%가 아닌 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 3%, 5%, 6%와 9%에서 선택되는 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계되고 26%가 아닌 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계된 키토산을 포함한다. 한 구체예에서, 키토산 유도체 나노입자는 8%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계되고 52%가 아닌 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 연계된 키토산을 포함한다.
일부 구체예에서, 적절한 경우에, DD-키토산은 DD-키토산 유도체, 예를 들면, 추가 기능화를 통합하는 DD 키토산, 예를 들면, 부착된 리간드를 갖는 DD-키토산을 포함한다. "유도체"는 공유적으로 변형된 N-아세틸-D-글루코사민 및/또는 D-글루코사민 단위를 포함하는 키토산-기초된 중합체뿐만 아니라 다른 단위를 통합하거나, 또는 다른 모이어티에 부착된 키토산-기초된 중합체의 광범위한 범주를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 유도체는 빈번하게, 글루코사민의 히드록실 기 또는 아민 기의 변형에 근거된다, 예를 들면, 아르기닌-기능화된 키토산으로 행위된다. 키토산 유도체의 실례는 트리메틸화된 키토산, 페길화된 키토산, 티올화된 키토산, 갈락토실화된 키토산, 알킬화된 키토산, PEI-통합된 키토산, 우론산 변형된 키토산, 글리콜 키토산, 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 키토산 유도체에 관한 추가 교시를 위해, 예로서 "Non-viral Gene Therapy", K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (편집자), Springer-Verlag Tokyo, 2005, ISBN 4-431-25122-7의 pp.63-74; Zhu et al., Chinese Science Bulletin, December 2007, vol. 52 ( 23), pp. 3207-3215; 그리고 Varma et al., Carbohydrate Polymers 55 (2004) 77-93을 참조한다.
분산된 시스템은 연속적 매체 전역에서 분포된 분산상으로서 알려져 있는 미립자 물질로 구성된다. DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 "분산액"은 수화된 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물이고, 여기서 폴리플렉스는 매체 전역에서 분포된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "미리 농축된" 분산액은 농축된 분산액을 형성하기 위한 농축 과정을 겪지 않은 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 폴리플렉스 침전물이 "실제적으로 없는"은 조성물이 시각적 검사 시에 관찰될 수 있는 입자가 본질적으로 없다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 생리학적 pH는 6 내지 8 사이에 pH를 지칭한다.
"DD-키토산 핵산 폴리플렉스" 또는 이의 문법적 등가물은 복수의 DD-키토산 분자 및 복수의 핵산 분자를 포함하는 복합체인 것으로 의미된다. 바람직한 구체예에서, 이중으로 유도체화된-키토산은 상기 핵산으로 복합화된다.
DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 핵산 성분 및 DD-키토산 성분을 포함한다. 키토산, 그리고 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 가령, 기능화된 키토산과 뉴클레오티드 공급원료 농도는 다양한 아민-대-인산염 비율 (N/P), 혼합 비율 및 표적 뉴클레오티드 농도를 수용하기 위해 조정될 수 있다. 일부 구체예, 특히 작은 배치, 예를 들면, 2 mL 미만의 배치에서, 기능화된 키토산 및 뉴클레오티드 공급원료는 용기를 와동하면서, 뉴클레오티드 공급원료를 기능화된 키토산 공급원료 내로 천천히 떨어뜨림으로써 혼합될 수 있다. 다른 구체예에서, 기능화된 키토산과 뉴클레오티드 공급원료는 이들 2가지 유체 흐름을 직렬 혼합함으로써 혼합될 수 있다. 다른 구체예에서, 결과의 폴리플렉스 분산액은 TFF에 의해 농축될 수 있다. 폴리플렉스 형성을 위한 바람직한 방법은 WO 2009/039657에서 개시되고, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 명시적으로 편입된다.
본 발명의 핵산은 비록 일부 경우에, 다양한 목적 중에서 한 가지, 예를 들면, 안정성 및 보호를 위해 통합된 대안 중추 또는 다른 변형 또는 모이어티를 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함되지만, 포스포디에스테르 결합을 일반적으로 내포할 것이다. 예기되는 다른 유사체 핵산은 비-리보오스 중추를 갖는 것들을 포함한다. 이에 더하여, 자연발생 핵산, 유사체, 그리고 둘 모두의 혼합물이 만들어질 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 둘 모두의 부분을 내포할 수 있다. 핵산은 DNA, RNA, 그리고 핵산이 데옥시리보-와 리보뉴클레오티드의 임의의 조합, 그리고 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산타닌, 히포크산타닌, 이소시토신, 이소구아닌 등을 비롯한 염기의 임의의 조합을 내포하는 하이브리드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 핵산은 임의의 형태에서 DNA, 삼중, 이중 또는 단일 가닥, 안티센스, siRNA, 리보자임, 데옥시리보자임, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 키메라, 마이크로RNA, 그리고 이들의 유도체를 비롯한 임의의 형태에서 RNA를 포함한다. 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고 (PMO), 잠금된 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 인공 핵산을 포함한다.
한 구체예에서, 핵산 성분은 치료적 핵산을 포함한다. 본 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 당분야에서 공지된 임의의 치료적 핵산의 이용에 순응한다. 치료적 핵산은 치료적 RNA를 포함하고, 이들은 포유류 세포에서 치료 효과를 발휘할 수 있는 RNA 분자이다. 치료적 RNA는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, 그리고 효소적 RNA를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 치료적 핵산은 삼중 분자, 단백질 결합 핵산, 리보자임, 데옥시리보자임, 그리고 작은 뉴클레오티드 분자를 형성하는 것으로 의도된 핵산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
많은 유형의 치료적 RNA가 당분야에서 공지된다. 가령, Grimm et al., Therapeutic application of RNAi is mRNA targeting finally ready for prime time? J. Clin. Invest., 117:3633-3641, 2007; Aagaard et al., RNAi therapeutics: Principles, prospects and challenges, Adv. Drug Deliv. Rev., 59:75-86, 2007; Dorsett et al., siRNAs: Applications in functional genomics and potential as therapeutics, Nat. Rev. Drug Discov., 3:318-329, 2004를 참조한다. 이들은 이중 가닥 짧은 간섭 RNA (siRNA)를 포함한다.
치료적 핵산은 또한, 세포독성 단백질 및 전구약물을 비롯한 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 핵산 성분은 치료적 핵산 구조체를 포함한다. 치료적 핵산 구조체는 치료 효과를 발휘할 수 있는 핵산 구조체이다. 치료적 핵산 구조체는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산뿐만 아니라 치료적 RNA인 전사체를 생산하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료적 핵산은 결함성 유전자에 대한 대체제 또는 증강제로서 역할함으로써 유전자 요법을 달성하거나 또는 치료적 산물을 인코딩함으로써 특정 유전자 산물의 결여를 보상하는데 이용될 수 있다. 치료적 핵산은 또한, 내인성 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 치료적 핵산은 번역 산물의 전부 또는 일부를 인코딩할 수 있고, 그리고 세포 내에 이미 존재하는 DNA와 재조합하고, 따라서 유전자의 결함성 부분을 대체함으로써 기능할 수 있다. 이것은 또한, 단백질의 부분을 인코딩하고, 그리고 유전자 산물의 동시억제에 의해서 이의 효과를 발휘할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 치료적 핵산은 U.S.S.N. 11/694,852에서 개시된 것들에서 선택되고, 이것은 본원에 참조로서 명시적으로 편입된다.
바람직한 구체예에서, 치료적 핵산은 호르몬, 효소, 사이토킨, 케모킨, 항체, 분열촉진 인자, 성장 인자, 분화 인자, 혈관형성에 영향을 주는 인자, 혈전 형성에 영향을 주는 인자, 혈당 수준에 영향을 주는 인자, 글루코오스 물질대사에 영향을 주는 인자, 지질 물질대사에 영향을 주는 인자, 혈중 콜레스테롤 수준에 영향을 주는 인자, 혈액 LDL 또는 HDL 수준에 영향을 주는 인자, 세포 아폽토시스에 영향을 주는 인자, 식품 섭취에 영향을 주는 인자, 에너지 소비에 영향을 주는 인자, 식욕에 영향을 주는 인자, 영양소 흡수에 영향을 주는 인자, 염증에 영향을 주는 인자, 그리고 뼈 형성에 영향을 주는 인자로 구성된 군에서 선택되는 치료적 단백질을 인코딩한다. 인슐린, 렙틴, 글루카곤 길항제, GLP-1, GLP-2, 그렐린, 콜레시스토키닌, 성장 호르몬, 응고 인자, PYY, 에리트로포이에틴, 염증의 저해제, IL-10, IL-17 길항제, TNFα 길항제, 성장 호르몬 방출 호르몬, 또는 부갑상선 호르몬을 인코딩하는 치료적 핵산이 특히 바람직하다.
발현 제어 영역
바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리플렉스는 치료적 핵산을 포함하는데, 이것은 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 발현 제어 영역을 포함하는 치료적 구조체이다. 치료적 구조체는 치료적 핵산을 생산하는데, 이것은 그 자체로 치료적일 수 있거나, 또는 치료적 단백질을 인코딩할 수 있다.
일부 구체예에서, 치료적 구조체의 발현 제어 영역은 구조성 활성을 소유한다. 다수의 바람직한 구체예에서, 치료적 구조체의 발현 제어 영역은 구조성 활성을 갖지 않는다. 이것은 치료적 핵산의 역동적 발현을 제공한다. "역동적" 발현은 시간의 추이에서 변화는 발현인 것으로 의미된다. 역동적 발현은 검출가능한 발현의 기간에 의해 분리된 여러 이와 같은 낮은 또는 부재한 발현의 기간을 포함할 수 있다. 다수의 바람직한 구체예에서, 치료적 핵산은 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 이것은 치료적 핵산의 조절가능 발현을 제공한다.
발현 제어 영역은 조절 폴리뉴클레오티드 (때때로 요소로서 본원에서 지칭됨), 예를 들면, 프로모터와 인핸서를 포함하고, 이들은 작동가능하게 연결된 치료적 핵산의 발현에 영향을 준다.
본원에서 포함된 발현 제어 요소는 세균, 효모, 식물, 또는 동물 (포유류 또는 비포유류)로부터 유래될 수 있다. 발현 제어 영역은 전장 프로모터 서열, 예를 들면, 선천적 프로모터 및 인핸서 요소뿐만 아니라 전장 또는 비-변이체 기능 중에서 전부 또는 일부를 유지하는 (가령, 어느 정도의 영양소 조절 또는 세포/조직 특이적 발현을 유지하는) 하위서열 또는 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "기능적" 및 이의 문법적 변이체는 핵산 서열, 하위서열 또는 단편에 관하여 이용될 때, 상기 서열이 선천적 핵산 서열 (가령, 비-변이체 또는 변형되지 않은 서열)의 하나 또는 그 이상의 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 서열 치환, 결실, 또는 부가, 또는 다른 변형을 의미한다 (가령, 화학적 유도체, 예를 들면, 뉴클레아제에 내성인 변형된 형태).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "작동가능한 연쇄"는 이렇게 설명된 성분이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하기 위한 이들 성분의 물리적 근접위치를 지칭한다. 핵산과 작동가능한 연쇄 상태에서 발현 제어 요소의 실례에서, 관계는 제어 요소가 핵산의 발현을 조정하는 정도이다. 전형적으로, 전사를 조정하는 발현 제어 영역은 전사된 핵산의 5' 단부 (즉, "상류")에 근접하게 병치된다. 발현 제어 영역은 또한, 전사된 서열의 3' 단부 (즉, "하류")에서 또는 전사체 이내에 (가령, 인트론에서) 위치될 수 있다. 발현 제어 요소는 전사된 서열로부터 먼 거리 (가령, 핵산으로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000, 또는 그 이상 뉴클레오티드)에서 위치될 수 있다. 발현 제어 요소의 특정한 실례는 프로모터이고, 이것은 통상적으로, 전사된 서열의 5'에 위치된다. 발현 제어 요소의 다른 실례는 인핸서이고, 이것은 전사된 서열의 5' 또는 3'에서, 또는 전사된 서열 이내에 위치될 수 있다.
일부 발현 제어 영역은 작동가능하게 연결된 치료적 핵산에 조절가능 발현을 부여한다. 신호 (때때로 자극으로서 지칭됨)는 이런 발현 제어 영역에 작동가능하게 연결된 치료적 핵산의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 신호에 대한 응답으로 발현을 증가시키는 이런 발현 제어 영역은 유도성으로 종종 지칭된다. 신호에 대한 응답으로 발현을 감소시키는 이런 발현 제어 영역은 억제성으로 종종 지칭된다. 전형적으로, 이런 요소에 의해 부여된 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호의 양에 비례한다; 신호의 양이 더욱 클수록, 발현에서 증가 또는 감소가 더욱 커진다.
다양한 조절가능 프로모터가 당분야에서 공지된다. 바람직한 유도성 발현 제어 영역은 소형 분자 화학적 화합물로 자극되는 유도성 프로모터를 포함하는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 발현 제어 영역은 경구 전달가능하지만 식품에서 정상적으로는 발견되지 않는 화학물질에 반응성이다. 특정 실례는 예로서, U.S. 특허 번호 5,989,910; 5,935,934; 6,015,709; 그리고 6,004,941에서 발견될 수 있다.
한 구체예에서, 치료적 구조체는 통합 서열을 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 치료적 구조체는 단일 통합 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 치료적 구조체는 치료적 핵산 또는 이의 부분을 표적 세포의 유전체 내로 통합하기 위한 첫 번째와 두 번째 통합 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 통합 서열(들)은 마리너, 잠자는 미녀, FLP, Cre, ΦC31, R, 람다, 그리고 통합하는 바이러스, 예를 들면, AAV, 레트로바이러스 및 렌티바이러스로부터 통합을 위한 수단으로 구성된 군에서 선택되는 통합을 수단과 합동으로 기능적이다.
한 구체예에서, 본 조성물은 치료적 구조체에 더하여 비-치료적 구조체를 더욱 포함하고, 여기서 비-치료적 구조체는 두 번째 발현 제어 영역에 작동가능하게 연결된 통합을 위한 수단을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 두 번째 발현 제어 영역 및 치료적 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 제어 영역은 동일하거나 상이할 수 있다. 통합을 위한 인코딩된 수단은 바람직하게는, 마리너, 잠자는 미녀, FLP, Cre, ΦC31, R, 람다, 그리고 통합하는 바이러스, 예를 들면, AAV, 레트로바이러스 및 렌티바이러스로부터 통합을 위한 수단으로 구성된 군에서 선택된다.
추가 교시를 위해, WO2008020318을 참조하고, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 명시적으로 통합된다. 한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 인공 핵산이다.
바람직한 인공 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고 (PMO), 잠금된 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 치료적 핵산이다. 한 구체예에서, 치료적 핵산은 치료적 RNA이다. 바람직한 치료적 RNA는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, 그리고 효소적 RNA를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 치료적 핵산은 DNA이다.
한 구체예에서, 치료적 핵산은 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스는 다음의 키토산-유도체 나노입자 중에서 한 가지에 복합화된 분비된 알칼리 인산분해효소 (SEAP) 또는 루시페라아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리플렉스가 아니다:
a. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 52%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 8%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
b. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 3%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
c. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
d. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 6%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
e. 20의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 9%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
f. 40의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
g. 10의 아민/인산염 (N/P) 비율을 갖는 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
h. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 5%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다;
i. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 6%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다; 또는
j. 키토산-유도체 나노입자, 여기서 상기 나노입자는 52%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 8%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산과 연계된 24mer 키토산을 포함한다.
폴리플렉스
바람직한 구체예에서, 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 110 kDa보다 적은, 더욱 바람직하게는 65 kDa보다 적은, 더욱 바람직하게는 50 kDa보다 적은, 더욱 바람직하게는 40 kDa보다 적은, 그리고 가장 바람직하게는 30 kDa보다 적은 평균 분자량을 갖는 키토산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 15 kDa보다 적은, 10 kDa보다 적은, 7 kDa보다 적은, 또는 5 kDa보다 적은 평균 분자량을 갖는 키토산을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 폴리플렉스는 평균적으로 680개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 더욱 바람직하게는 400개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 더욱 바람직하게는 310개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 더욱 바람직하게는 250개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 그리고 가장 바람직하게는 190개보다 적은 글루코사민 단위체 단위를 갖는 키토산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리플렉스는 평균적으로 95개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 65개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 45개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 또는 35개보다 적은 글루코사민 단위체 단위를 갖는 키토산 분자를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 폴리플렉스는 2 내지 100, 예를 들면, 2 내지 50, 예를 들면, 2 내지 40, 예를 들면, 2 내지 30, 예를 들면, 2 내지 20, 예를 들면, 2 내지 5의 아민 대 인산염 (N/P) 비율을 갖는다. 바람직하게는, N/P 비율은 키토산의 분자량에 역비례한다, 다시 말하면, 더욱 작은 분자량 DD-키토산은 더욱 높은 N/P 비율을 필요로 하고, 그리고 그 반대이다.
바람직한 구체예에서, 본 폴리플렉스는 1000 nm보다 적은, 더욱 바람직하게는 500 nm보다 적은, 그리고 가장 바람직하게는 200 nm보다 적은 평균 수력학적 직경을 갖는다.
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 산성 pH, 예를 들면, 7 미만의 pH, 가장 바람직하게는 약 4 내지 6 사이의 pH에서 최소한 0 mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 산성 pH에서 +1 내지 +60 mV, 더욱 바람직하게는 +1 내지 +40 mV, 더욱 바람직하게는 +1 내지 +30 mV 사이에 평균 제타 전위를 갖는다.
바람직한 구체예에서, 폴리플렉스는 생리학적 pH 및 6 미만의 pKa에서 낮은 순 양성, 중성, 또는 순 음성 전하를 갖는다. 이런 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 감소된 세포 독성 및 핵산의 증강된 세포내 방출을 전시한다.
조성물의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 바람직하게는, 폴리플렉스 크기에 관해서 균질하다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 조성물은 낮은 평균 다분산성 지수 ("PDI")를 갖는다. 특히 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 분산은 0.5보다 적은, 더욱 바람직하게는 0.4보다 적은, 더욱 바람직하게는 0.3보다 적은, 그리고 가장 바람직하게는 0.25보다 적은 PDI를 갖는다.
본 조성물의 폴리플렉스는 바람직하게는, 조성물에서 실제적으로 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 실온에서 6 시간, 더욱 바람직하게는 12 시간, 더욱 바람직하게는 24 시간, 그리고 가장 바람직하게는 48 시간 동안 평균 직경에서 100%보다 적게, 더욱 바람직하게는 50%보다 적게, 그리고 가장 바람직하게는 25%보다 적게 증가하는 폴리플렉스를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 실온에서 최소한 24 시간 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경에서 25%보다 적게 증가하는 폴리플렉스를 포함한다.
본 조성물의 폴리플렉스는 바람직하게는, 냉각된 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 2-8 섭씨 온도에서 6 시간, 더욱 바람직하게는 12 시간, 더욱 바람직하게는 24 시간, 그리고 가장 바람직하게는 48 시간 동안 평균 직경에서 100%보다 적게, 더욱 바람직하게는 50%보다 적게, 그리고 가장 바람직하게는 25%보다 적게 증가하는 폴리플렉스를 포함한다.
본 조성물의 폴리플렉스는 바람직하게는, 동결-해동 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 -20 내지 -80 섭씨 온도에서 동결로부터 해동 이후에, 실온에서 6 시간, 더욱 바람직하게는 12 시간, 더욱 바람직하게는 24 시간, 그리고 가장 바람직하게는 48 시간 동안 평균 직경에서 100%보다 적게, 더욱 바람직하게는 50%보다 적게, 그리고 가장 바람직하게는 25%보다 적게 증가하는 폴리플렉스를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 0.5 mg/ml보다 큰 핵산 농도를 갖고, 그리고 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없다. 더욱 바람직하게는, 조성물은 최소한 0.6 mg/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 0.75 mg/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 1.0 mg/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 1.2 mg/ml, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 1.5 mg/ml의 핵산 농도를 갖고, 그리고 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없다. 조성물은 수화된다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 비복합화된 핵산이 실제적으로 없다.
바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성이다. 폴리플렉스 안정성을 유지하면서 등장성을 달성하는 것은 제약학적 조성물을 조제하는데 있어서 고도로 바람직하고, 그리고 이들 바람직한 조성물은 제약학적 제제 및 치료적 적용에 충분히 적합하다.
일반적으로, DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물은 표적 세포에 접촉하는데 이용된다. 이런 접촉은 일반적으로, 표적화된 세포에 의한 발현을 위한 핵산의 전달을 유발한다. 본원에서 설명된 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에 적합한 조성물은 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 전반적으로 아래에 설명된다.
바람직한 구체예에서, 이들 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 50 kDa보다 적은 평균 분자량, 평균적으로 310개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 20의 N/P 비율, 500 nm보다 적은 평균 수력학적 직경, 산성 pH에서 최소한 0 mV의 평균 제타 전위, 0.5보다 적은 PDI, 0.5 mg/ml보다 큰 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없고, 그리고 이들 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 100 %보다 적게 증가한다는 점에서 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성이고, 그리고 동결-해동 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다.
바람직한 구체예에서, 이들 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 65 kDa보다 적은 평균 분자량, 평균적으로 400개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 20의 N/P 비율, 500 nm보다 적은 평균 수력학적 직경, 산성 pH에서 +1 내지 +40 mV의 평균 제타 전위, 0.4보다 적은 PDI, 0.5 mg/ml보다 큰 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없고, 그리고 이들 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 50 %보다 적게 증가한다는 점에서 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성이고, 그리고 동결-해동 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다.
바람직한 구체예에서, 이들 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 40 kDa보다 적은 평균 분자량, 평균적으로 250개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 20의 N/P 비율, 500 nm보다 적은 평균 수력학적 직경, 산성 pH에서 +1 내지 +30 mV의 평균 제타 전위, 0.3보다 적은 PDI, 0.5 mg/ml보다 큰 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없고, 그리고 이들 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 50 %보다 적게 증가한다는 점에서 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성이고, 그리고 동결-해동 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다.
바람직한 구체예에서, 이들 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 30 kDa보다 적은 평균 분자량, 평균적으로 190개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 5의 N/P 비율, 500 nm보다 적은 평균 수력학적 직경, 산성 pH에서 +1 내지 +30 mV의 평균 제타 전위, 0.25보다 적은 PDI, 0.5 mg/ml보다 큰 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없고, 그리고 이들 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 25 %보다 적게 증가한다는 점에서 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성이고, 그리고 동결-해동 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다.
바람직한 구체예에서, 이들 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 30 kDa보다 적은 평균 분자량, 평균적으로 190개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 5의 N/P 비율, 500 nm보다 적은 평균 수력학적 직경, 산성 pH에서 +1 내지 +30 mV의 평균 제타 전위, 0.25보다 적은 PDI, 0.75 mg/ml보다 큰 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없고, 그리고 이들 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 25 %보다 적게 증가한다는 점에서 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성이고, 그리고 동결-해동 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다.
바람직한 구체예에서, 이들 조성물의 폴리플렉스는 기능화 전에 15 kDa보다 적은 평균 분자량, 평균적으로 95개보다 적은 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 5의 N/P 비율, 200 nm보다 적은 평균 수력학적 직경, 산성 pH에서 +1 내지 +30 mV의 평균 제타 전위, 0.25보다 적은 PDI, 1.0 mg/ml보다 큰 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 침전된 폴리플렉스가 실제적으로 없고, 그리고 이들 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 50 %보다 적게 증가한다는 점에서 크기 안정된다. 바람직한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성이고, 그리고 동결-해동 조건 하에 실제적으로 크기 안정된다.
분말 제제
본 발명의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 분말을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 건조 분말 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 건조 분말 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 본 발명의 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액의 탈수를 통해 생산된다.
제약학적 제제
본 발명은 또한, 본 발명의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물을 포함하는 "제약학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 제제를 제공한다. 이런 제제는 치료 방법을 실시하기 위해, 개체에 생체내 투여될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "제약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은 바람직하게는, 과도한 불리한 부작용 (가령, 메스꺼움, 복통, 두통 등)을 유발하지 않으면서 개체에 투여될 수 있는 담체, 희석제, 부형제 등을 지칭한다. 투여를 위한 이런 제조물은 무균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 그리고 유제를 포함한다.
제약학적 제제는 개체에 투여와 양립성인 담체, 희석제, 부형제, 용매, 분산 매체, 코팅, 항균과 항진균 작용제, 등장성과 흡수 지연 작용제, 기타 등등으로부터 만들어질 수 있다. 이런 제제는 정제 (코팅되거나 또는 코팅되지 않은), 캡슐 (경성 또는 연성), 마이크로비드, 유제, 분말, 과립, 결정, 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르에서 내포될 수 있다. 다른 첨가제 사이에서, 보충 활성 화합물과 보존제, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 그리고 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
부형제는 염, 등장성 작용제, 혈청 단백질, 완충액 또는 다른 pH-제어 작용제, 항산화제, 농후제, 하전되지 않은 중합체, 보존제 또는 냉동보호제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에서 이용된 부형제는 등장성 작용제 및 완충액 또는 다른 pH-제어 작용제를 더욱 포함할 수 있다. 이들 부형제는 바람직한 범위의 pH (약 6.0-8.0)와 오스몰농도 (약 50-400 mmol/L)의 획득을 위해 첨가될 수 있다. 적합한 완충액의 실례는 아세트산염, 붕산염, 탄산염, 구연산염, 인산염 및 술폰화된 유기 분자 완충액이다. 이런 완충액은 조성물에서 0.01 내지 1.0% (w/v)의 농도로 존재할 수 있다. 등장성 작용제는 당분야에서 공지된 것들 중에서 한 가지, 예를 들면, 만니톨, 덱스트로스, 글루코오스 및 염화나트륨, 또는 다른 전해질에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 등장성 작용제는 글루코오스 또는 염화나트륨이다. 등장성 작용제는 조성물이 도입되는 생물학적 환경의 것과 동일하거나 또는 유사한 삼투압을 조성물에 부여하는 양으로 이용될 수 있다. 조성물에서 등장성 작용제의 농도는 이용된 특정 등장성 작용제의 성질에 의존할 것이고, 그리고 약 0.1 내지 10% 범위에서 변할 수 있다. 글루코오스가 이용될 때, 이것은 바람직하게는, 1 내지 5% w/v, 더욱 구체적으로 5% w/v의 농도에서 이용된다. 등장성 작용제가 염화나트륨일 때, 이것은 바람직하게는, 최대 1% w/v, 특히 0.9% w/v의 양으로 이용된다. 본 발명의 조성물은 보존제를 더욱 내포할 수 있다. 보존제의 실례는 폴리헥사메틸렌-비구아니딘, 벤잘코늄 염화물, 안정된 옥시클로로 복합체 (가령, Purite®로서 알려져 있는 것들), 페닐수은 아세트산염, 클로로부탄올, 소르브산, 클로르헥시딘, 벤질 알코올, 파라벤, 그리고 티메로살이다. 전형적으로, 이런 보존제는 약 0.001 내지 1.0%의 농도에서 존재한다. 게다가, 본 발명의 조성물은 또한, 냉동보존 작용제를 내포할 수 있다. 바람직한 냉동보존제는 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 락토오스, 트레할로스, 소르비톨, 콜로이드성 이산화실리콘, 가급적 100,000 g/mol 미만 분자량의 덱스트란, 글리세롤, 그리고 100,000 g/mol 미만 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합물이다. 글루코오스, 트레할로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 가장 바람직하다. 전형적으로, 이런 냉동보존제는 약 0.01 내지 10%의 농도에서 존재한다.
제약학적 제제는 이의 의도된 투여 루트와 양립하도록 조제될 수 있다. 가령, 경구 투여를 위해, 조성물은 부형제와 통합되고, 그리고 정제, 트로키제, 캡슐, 예를 들면, 젤라틴 캡슐, 또는 코팅, 예를 들면, 장용 코팅 (Eudragit® 또는 Sureteric®)의 형태에서 이용될 수 있다. 제약학적으로 양립성 결합 작용제, 및/또는 어쥬번트 물질이 경구 제제 내에 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키제, 기타 등등은 다음 성분, 또는 유사한 성격의 화합물 중에서 한 가지를 내포할 수 있다: 결합제, 예를 들면, 미정질 셀룰로오스, 검 트래거캔스 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 전분 또는 락토오스; 붕해제, 예를 들면, 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아르산염 또는 다른 스테아르산염; 활택제, 예를 들면, 콜로이드성 이산화실리콘; 감미제, 예를 들면, 수크로오스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예를 들면, 박하, 메틸 살리실산염, 또는 풍미.
제제, 예를 들면, 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어된 방출 제제는 또한, 조성물을 신체로부터 급속한 분해 또는 제거에 대항하여 보호하기 위한 담체를 포함할 수 있다. 가령, 시간 지연 물질, 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아르산염이 단독으로 또는 왁스와 합동으로, 이용될 수 있다.
좌약 및 다른 직장 투여가능한 제제 (가령, 관장에 의해 투여가능한 것들) 또한 예기된다. 게다가 직장 전달에 관하여, 가령, Song et al., Mucosal drug delivery: membranes, methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 21:195-256, 2004; Wearley, Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 8:331-394, 1991을 참조한다.
투여에 적절한 추가 제약학적 제제는 당분야에서 공지되고, 그리고 본 발명의 방법과 조성물에서 적용가능하다 (가령, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; 그리고 Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)를 참조한다).
투여
한 구체예에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 DD-키토산의 이용은 생리학적 pH에서 폴리플렉스의 연장된 안정성을 제공한다. 이것은 효과적인 전신 투여뿐만 아니라 다른 투여 방식을 제공한다.
다수의 투여 루트 중에서 한 가지가 가능하고, 그리고 특정 루트의 선택은 부분적으로, 표적 조직에 의존할 것이다. 주사기, 내시경, 삽관, 삽관법 튜브, 카테터 및 다른 물품이 투여에 이용될 수 있다.
개체를 치료하기 위한 용량 또는 "효과량"은 비록 장애 또는 질환, 또는 증상의 진행 또는 악화를 예방하거나 저해하는 것이 만족스러운 결과이긴 하지만, 바람직하게는 질환의 한 가지, 여러 가지 또는 모든 증상을 측정가능한 또는 검출가능한 정도까지 개선하는데 충분하다. 따라서, 표적 조직에서 치료적 핵산을 발현함으로써 치료가능한 질환 또는 장애의 경우에, 본 발명의 방법에 의해 치료가능한 질환을 개선하기 위해 생산된 치료적 RNA 또는 치료적 단백질의 양은 질환 및 원하는 결과에 의존할 것이고, 그리고 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 적절한 양은 치료되는 질환, 원하는 치료 효과뿐만 아니라 개별 개체 (가령, 개체 내에서 생체이용률, 성별, 연령 등)에 의존할 것이다. 효과량은 유관한 생리학적 효과를 계측함으로써 확인될 수 있다.
수의학적 적용 또한 본 발명에 의해 예기된다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 비인간 포유동물을 치료하는 방법을 제공하고, 이것은 본 발명의 키토산-기초된 나노입자를 치료가 필요한 비인간 포유동물에 투여하는 것을 수반한다.
비경구 투여
본 발명의 화합물은 혈류 내로, 근육 내로, 또는 내부 장기 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 수단은 정맥내, 동맥내, 복막내, 척수강내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내 및 피하를 포함한다. 비경구 투여를 위한 적합한 장치는 바늘 (미세바늘 포함) 주입기, 바늘-없는 주입기 및 주입 기술을 포함한다.
비경구 제제는 전형적으로 수성 용액인데, 이들은 부형제, 예를 들면, 염, 탄수화물 및 완충제를 내포할 수 있지만, 일부 적용의 경우에, 이들은 적합한 운반제, 예를 들면, 무균, 발열원 없는 증류수와 함께 이용되는 무균 비수성 용액으로서 또는 건조된 형태로서 더욱 적절하게 조제될 수 있다.
무균 조건 하에 예로서, 동결건조에 의한 비경구 제제의 제조는 당업자에게 널리 공지된 표준 제약학적 기술을 이용하여 쉽게 달성될 수 있다.
비경구 용액의 제조에서 이용된 화합물의 용해도는 적절한 제제 기술의 이용, 예를 들면, 용해도-증강 작용제의 함입에 의해 증가될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 즉각적인 및/또는 변형된 방출 제제로 조제될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된-, 지속된-, 펄싱된-, 제어된-, 표적화된 및 프로그램된 방출을 포함한다. 따라서 본 발명의 화합물은 활성 화합물의 변형된 방출을 제공하는 이식된 저장소로서 투여를 위한 고체, 반고체, 또는 요변성 액체로서 조제될 수 있다.
경구 투여
본 조성물은 경구 투여될 수 있다. 경구 투여는 화합물이 위장관을 들어가도록, 삼키기를 수반할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 위장관에 직접적으로 투여될 수 있다.
경구 투여에 적합한 제제는 고체 제제, 예를 들면, 정제, 캡슐, 미립자 또는 코팅된 미립자를 내포하는 코팅된 캡슐, 액체, 또는 분말, 로젠지 (액체-충전된 로젠지 포함), 츄, 다중미립자와 나노미립자, 겔, 필름, 소란, 그리고 스프레이를 포함한다.
액체 제제는 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 액체 제제는 고체의 재구성에 의해 제조될 수 있다.
정제 약형은 일반적으로, 붕괴제를 내포한다. 붕괴제의 실례는 나트륨 전분 글리콜산염, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 저급 알킬-치환된 히드록시프로필 셀룰로오스, 전분, 전호화된 전분 및 알긴산나트륨을 포함한다. 일반적으로, 붕괴제는 약형의 1 중량 % 내지 25 중량 %, 바람직하게는 5 중량 % 내지 20 중량 %를 포함할 것이다.
결합제는 일반적으로, 점성 속성을 정제 제제에 부여하는데 이용된다. 적합한 결합제는 미정질 셀룰로오스, 젤라틴, 당, 폴리에틸렌 글리콜, 자연과 합성 검, 폴리비닐피롤리돈, 전호화된 전분, 히드록시프로필 셀룰로오스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 포함한다. 정제는 또한, 희석제, 예를 들면, 락토오스 (일수화물, 분무건조된 일수화물, 무수성 등), 만니톨, 자일리톨, 덱스트로스, 수크로오스, 소르비톨, 미정질 셀룰로오스, 전분 및 이염기성 인산칼슘 이수화물을 내포할 수 있다.
정제는 또한, 표면 활성제, 예를 들면 나트륨 라우릴 황산염 및 폴리소르베이트 80, 그리고 활택제, 예를 들면, 이산화실리콘 및 활석을 임의선택적으로 포함할 수 있다. 존재할 때, 표면 활성제는 정제의 0.2 중량 % 내지 5 중량 %을 포함할 수 있고, 그리고 활택제는 정제의 0.2 중량 % 내지 1 중량 %를 포함할 수 있다.
정제는 또한, 일반적으로 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아르산염, 칼슘 스테아르산염, 아연 스테아르산염, 나트륨 스테아릴 푸마르산염, 그리고 마그네슘 스테아르산염과 나트륨 라우릴 황산염의 혼합물을 내포한다. 윤활제는 일반적으로, 정제의 0.25 중량 % 내지 10 중량 %, 바람직하게는 0.5 중량 % 내지 3 중량 %을 포함한다.
다른 가능한 성분은 항산화제, 착색제, 풍미제, 보존제 및 맛-차폐제를 포함한다.
정제 블렌드는 정제를 형성하기 위해 직접적으로 또는 롤러에 의해 압축될 수 있다. 정제 블렌드 또는 블렌드의 부분은 대안으로 습성-, 건성-, 또는 융해-제립화되거나, 융해 엉김되거나, 또는 정제화 전에 압출될 수도 있다. 최종 제제는 하나 또는 그 이상의 층을 포함할 수 있고, 그리고 코팅되거나 또는 코팅되지 않을 도 있다; 이것은 심지어 피포될 수도 있다.
정제의 조제는 H. Lieberman 및 L. Lachman (Marcel Dekker, New York, 1980)에 의한 Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1에서 논의된다.
인간 또는 수의학적 이용을 위한 소모성 경구 필름은 전형적으로 유연한 수용성 또는 물-팽창가능한 박막 약형인데, 이것은 급속히 용해되거나 또는 점막부착성이고, 그리고 전형적으로, 필름-형성 중합체, 결합제, 용매, 보습제, 가소제, 안정제 또는 유화제, 점성-조절제 및 용매를 포함한다. 제제의 일부 성분은 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함하는 다입자체 비드가 또한 본 발명에 포함된다.
다른 가능한 성분은 항산화제, 착색제, 풍미와 향미 개선제, 보존제, 타액 자극제, 냉각 작용제, 보조용매 (오일 포함), 피부연화제, 증량제, 항기포제, 계면활성제 및 맛-차폐제를 포함한다.
본 발명에 따른 필름은 전형적으로, 벗겨지는 받침대 또는 종이 위에 코팅된 얇은 수성 필름의 증발 건조에 의해 제조된다. 이것은 건조 오븐 또는 터널, 전형적으로 합동된 제피기 건조기에서, 또는 동결건조 또는 진공처리에 의해 행위될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 제제는 즉각적인 및/또는 변형된 방출 제제로 조제될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된-, 지속된-, 펄싱된-, 제어된-, 표적화된 및 프로그램된 방출을 포함한다.
다른 적합한 방출 기술, 예를 들면, 고에너지 분산액 및 삼투성과 코팅된 입자가 알려져 있다.
국소 투여
본 발명의 화합물은 또한, 피부 또는 점막층에 국소, 다시 말하면, 진피 또는 경피 투여될 수 있다. 이런 목적을 위한 전형적인 제제는 겔, 하이드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 살포제, 드레싱, 거품, 필름, 피부 패치, 웨이퍼, 이식물, 스펀지, 섬유소, 붕대 및 마이크로유제를 포함한다.
국소 투여의 다른 수단은 전기천공, 이온영동, 음파영동, 초음파영동 및 미세바늘 또는 바늘-없는 (가령, PowderjectTM, BiojectTM 등) 주사에 의한 전달을 포함한다.
국소 투여를 위한 제제는 즉각적인 및/또는 변형된 방출 제제로 조제될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된-, 지속된-, 펄싱된-, 제어된-, 표적화된 및 프로그램된 방출을 포함한다.
흡입된/비내 투여
본 발명의 화합물은 또한, 전형적으로 건조 분말 흡입기로부터 건조 분말 (단독으로, 혼합물로서, 예를 들면, 락토오스와의 건성 블렌드에서, 또는 혼합된 성분 입자로서)의 형태에서, 또는 적합한 추진제의 이용으로 또는 이러한 이용 없이, 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기, 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이로서 비내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
흡입기 또는 취입기에서 이용을 위한 캡슐, 블리스터와 카트리지는 본 발명의 화합물, 적합한 분말 기제, 예를 들면, 락토오스 또는 전분 및 성능 조절제, 예를 들면, I-류신, 만니톨 또는 마그네슘 스테아르산염의 분말 믹스를 내포하도록 조제될 수 있다.
흡입된/비내 투여를 위한 제제는 즉각적인 및/또는 변형된 방출 제제로 조제될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된-, 지속된-, 펄싱된-, 제어된-, 표적화된 및 프로그램된 방출을 포함한다.
직장/질내 투여
본 발명의 화합물은 예로서, 좌약, 페서리, 또는 관장의 형태에서 직장 또는 질 투여될 수 있다. 코코아 버터가 전통적인 좌약 기제이지만, 다양한 대안이 적절하면 이용될 수 있다.
직장/질 투여를 위한 제제는 즉각적인 및/또는 변형된 방출 제제로 조제될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된-, 지속된-, 펄싱된-, 제어된-, 표적화된 및 프로그램된 방출을 포함한다.
안구/귀 투여
본 발명의 화합물은 또한, 전형적으로 점적제의 형태에서 눈 또는 귀에 직접적으로 투여될 수 있다. 안구와 귀 투여에 적합한 다른 제제는 연고, 생물분해성 (가령, 흡수성 겔 스펀지, 콜라겐)과 비생물분해성 (가령, 실리콘) 삽입물, 웨이퍼, 렌즈 및 미립자 시스템을 포함한다. 제제는 또한, 이온영동에 의해 전달될 수 있다.
안구/귀 투여를 위한 제제는 즉각적인 및/또는 변형된 방출 제제로 조제될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된-, 지속된-, 펄싱된-, 제어된-, 표적화된, 또는 프로그램된 방출을 포함한다.
이용 방법
한 구체예에서, 본 발명의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 치료적 처치에 이용될 수 있다. 이런 조성물은 때때로, 치료적 조성물로서 본원에서 지칭된다.
본 발명의 치료적 단백질은 아래에 논의된 바와 같이, 치료적 핵산을 포함하는 본 발명의 폴리플렉스에 의해 생산된다. 아래에 설명된 바와 같은 본 단백질의 이용은 이런 단백질 이용에 영향을 주기 위한 본 폴리플렉스의 이용을 지칭한다.
본 발명에서 이용에 예기되는 치료적 단백질은 매우 다양한 활성을 갖고, 그리고 매우 다양한 장애의 치료에서 용도를 발견한다. 치료적 단백질 활성, 그리고 본 발명의 치료적 단백질로 치료가능한 징후에 관한 다음 설명은 예시에 불과하고 완전한 것으로 의도되지 않는다. 용어 "개체"는 동물을 지칭하는데, 포유동물이 바람직하고, 그리고 인간이 특히 바람직하다.
치료적 단백질 및 표적 질환의 부분적인 목록이 표 4에서 도시된다.
Figure 112016039396449-pct00028
다른 구체예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 치료적 단백질, 예를 들면, 치료적 RNA를 인코딩하지 않는 치료적 핵산을 포함한다. 가령, 질환 및/또는 바람직하지 않은 세포 또는 생리학적 상태의 기전에 관련된 유전자를 표적으로 하는 치료적 RNA를 선별함으로써, 본 조성물은 넓은 어레이의 질환과 상태의 치료에서 이용될 수 있다. 본 조성물은 이용된 치료적 RNA가 표적 선별의 범위에 관해서 제한되지 않는 특징을 갖는다. 따라서, 본 조성물은 적합한 표적을 수반하는 임의의 질환 또는 상태에서 용도를 발견한다.
바람직한 조직, 질환, 그리고 상태는 다음을 포함하는데, 이들은 예시이고 결코 제한하지 않는다:
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과혈당증 및 신체 질량
치료적 단백질은 인슐린 및 인슐린 유사체를 포함한다. 진성 당뇨병은 췌장 β-세포로부터 부재한 (유형 1) 또는 불충분한 (유형 2) 인슐린 생산에 의해 유발된 심신쇠약성 대사성 질환이다. (Unger, R.H. et al., Williams Textbook of Endocrinology Saunders, Philadelphia (1998)). 베타-세포는 식사 이후에 방출을 위한 인슐린을 제조하고 저장하는 특수한 내분비 세포이고 (Rhodes, et. al. J. Cell Biol. 105:145(1987)), 그리고 인슐린은 필요한 경우에 혈액으로부터 글루코오스의 조직 내로의 전달을 용이하게 하는 호르몬이다. 당뇨병을 앓는 환자는 혈당 수준을 빈번하게 모니터링해야 하고, 그리고 대다수는 생존하기 위해 복수의 매일 인슐린 주사를 필요로 한다. 하지만, 이런 환자는 인슐린 주사에 의해 이상적인 글루코오스 수준을 드물게 획득한다 (Turner, R. C. et al. JAMA 281:2005(1999)). 게다가, 인슐린 수준의 연장된 상승은 유해한 부작용, 예를 들면, 저혈당 쇼크 및 인슐린에 대한 신체 반응의 탈민감화를 유발할 수 있다. 결과적으로, 당뇨병성 환자는 장기간 합병증, 예를 들면, 심혈관 질환, 신장병, 시각상실, 신경 손상 및 상처 치유 장애가 여전히 발생한다 (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group, Lancet 352, 837 (1998)).
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 장애는 고혈당 상태, 예를 들면, 인슐린 의존성 (유형 1) 또는 독립된 (2형) 당뇨병뿐만 아니라 고혈당 상태와 연관되거나 또는 이것으로부터 발생하는 생리학적 상태 또는 장애를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 치료가능한 고혈당 상태는 또한, 만성 또는 급성 과혈당증 (가령, 당뇨병)과 연관된 조직병리학적 변화를 포함한다. 특정 실례는 췌장의 변성 (β-세포 파괴), 신장 소관 석회화, 간의 변성, 눈 손상 (당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 발, 점막층, 예를 들면, 입과 잇몸에서 궤양형성, 과잉 출혈, 지연된 혈액 응고 또는 상처 치유, 그리고 관상동맥성 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 이상지질혈증, 고혈압과 비만의 증가된 위험을 포함한다.
본 조성물은 글루코오스를 줄이거나, 내당성을 향상시키거나, 고혈당 상태 (가령, 당뇨병)을 치료하거나 또는 고혈당 상태와 연관되거나 또는 이것으로부터 발생하는 생리학적 장애를 치료하는데 유용하다. 이런 장애는 예로서, 당뇨병성 신경병증 (생리자율신경), 신병증 (신장 손상), 피부 감염 및 다른 피부 장애, 손상 또는 상처의 느린 또는 지연된 치유 (가령, 당뇨병성 옹종을 야기한다), 시각상실을 야기할 수 있는 눈 손상 (망막병증, 백내장), 당뇨병성 발 및 가속된 치주염을 포함한다. 이런 장애는 또한, 관상동맥성 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 이상지질혈증, 고혈압과 비만이 발달할 증가된 위험을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "고혈당" 또는 "과혈당증"은 개체의 상태에 관하여 이용될 때, 개체의 혈액 내에 존재하는 글루코오스의 일시적인 또는 만성적인 비정상적으로 높은 수준을 의미한다. 이러한 질환은 개체가 글루코오스 불내성 또는 정상적인 개체에서는 전형적으로 발견되지 않는 상승된 글루코오스의 상태 (가령, 당뇨병이 발달할 위험에 처해있는 글루코오스-불내성 당뇨병이하 개체에서, 또는 당뇨병성 개체에서)를 전시할 정도로, 글루코오스 물질대사 또는 흡수에서 지연에 의해 유발될 수 있다. 정상혈당에 대한 공복 혈장 글루코오스 (FPG) 수준은 약 110 mg/dl보다 적고, 글루코오스 대사 장애의 경우에, 약 110 및 126 mg/dl 사이이고, 그리고 당뇨병성의 경우에 약 126 mg/dl보다 크다.
소화관 점막 조직에서 단백질을 생산함으로써 치료가능한 장애는 또한, 비만 또는 바람직하지 않은 신체 질량을 포함한다. 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY 및 GLP-1은 배고픔을 줄이거나, 에너지 소비를 증가시키거나, 체중 감소를 유도하거나 또는 정상적인 글루코오스 항상성을 제공한다. 따라서, 다양한 구체예에서, 비만 또는 바람직하지 않은 신체 질량, 또는 과혈당증을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY 또는 GLP-1을 인코딩하는 치료적 핵산의 이용을 수반한다. 다른 구체예에서, 그렐린을 표적으로 하는 치료적 RNA가 이용된다. 그렐린은 식욕과 배고픔을 증가시킨다. 따라서, 다양한 구체예에서, 비만 또는 바람직하지 않은 신체 질량, 또는 과혈당증을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 그렐린의 발현을 줄이기 위해 그렐린을 표적으로 하는 치료적 RNA의 이용을 수반한다. 치료가능한 장애는 또한, 비만과 전형적으로 연관된 것들, 예를 들면, 비정상적으로 상승된 혈청/혈장 LDL, VLDL, 트리글리세리드, 콜레스테롤, 혈관의 좁아짐 또는 폐쇄를 야기하는 플라크 형성, 고혈압/뇌졸중의 증가된 위험, 관상동맥성 심장 질환 등을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "비만한" 또는 "비만"은 연령과 성별 정합된 정상적인 개체와 비교하여 신체 질량에서 최소한 30% 증가를 갖는 개체를 지칭한다. "바람직하지 않은 신체 질량"은 정합된 정상적인 개체보다 1%-29% 큰 신체 질량을 갖는 개체뿐만 아니라 신체 질량에 대하여 정상적이지만 그들의 신체 질량에서 감소 또는 증가의 예방을 희망하는 개체를 지칭한다.
한 구체예에서, 본 발명의 치료적 단백질은 글루카곤 길항제이다. 글루카곤은 췌장 섬에서 β-세포에 의해 생산된 펩티드 호르몬이고, 그리고 글루코오스 물질대사의 주요 조절인자이다 (Unger R. H. & Orci L. N. Eng. J. Med. 304:1518(1981); Unger R. H. Diabetes 25:136 (1976)). 인슐린에서처럼, 혈당 농도는 글루카곤 분비를 매개한다. 하지만, 인슐린과 대조적으로 글루카곤은 혈당에서 감소에 대한 응답으로 분비된다. 이런 이유로, 글루카곤의 순환 농도는 공복의 기간 동안 가장 높고 식사 동안 가장 낮다. 글루카곤 수준이 증가하면 인슐린이 글루코오스 저장을 증진하는 것을 축소시키고, 그리고 간이 글루코오스를 혈액 내로 방출하도록 자극한다. 글루카곤 길항제의 특정한 실례는 [데스-His1, 데스-Phe6, Glu9]글루카곤-NH2이다. 스트렙토조토신 당뇨병성 쥐에서, 혈당 수준은 이러한 글루카곤 길항제의 정맥내 대량주입 (0.75 μg/g 체중) 의 15 분 이내에 37% 낮아졌다 (Van Tine B. A. et. al. Endocrinology 137:3316 (1996)). 다른 구체예에서, 본 발명은 당뇨병 또는 과혈당증을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 췌장으로부터 글루카곤 생산의 수준을 감소시키기 위한 치료적 RNA의 이용을 포함한다.
다른 구체예에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 신체 질량 (가령, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료적 단백질은 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1)이다. GLP-1은 식사 동안 장에서 L-세포로부터 방출된 호르몬인데, 이것은 췌장 β-세포를 자극하여 인슐린 분비를 증가시킨다. GLP-1은 자신을 비만과 당뇨병을 치료하기 위한 매력적인 치료적 작용제로 만드는 추가 활성을 갖는다. 가령, GLP-1은 위 배출을 감소시키고, 식욕을 억제하고, 글루카곤 농도를 감소시키고, β-세포 덩어리를 증가시키고, 인슐린 생합성과 분비를 글루코오스-의존성 방식으로 자극하고, 그리고 아마도 인슐린에 대한 조직 감수성을 증가시킨다 (Kieffer T. J., Habener J. F. Endocrin. Rev. 20:876 (2000)). 이런 이유로, 식사와 일치하는 소화관에서 GLP-1의 조절된 방출은 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 신체 질량에 대한 치료적 이익을 제공할 수 있다. 디펩티딜 펩티드분해효소 IV (DPP IV)에 내성인 GLP-1 유사체는 더욱 긴 작용 기간 및 향상된 치료적 가치를 제공한다. 따라서, GLP-1 유사체는 선호되는 치료적 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 당뇨병 또는 과혈당증을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 DPP IV의 수준을 감소시키기 위한 치료적 RNA의 이용을 포함한다.
다른 구체예에서, 고혈당 상태를 치료하는데 유용한 본 발명의 치료적 단백질은 호르몬 레시스틴에 대한 길항제이다. 레시스틴은 비만의 식이-유도된 유전적 형태에서 발현이 상승되는 지방세포-유래된 인자이다. 순환하는 레시스틴의 중화는 비만한 생쥐에서 혈당과 인슐린 작용을 향상시킨다. 반대로, 정상적인 생쥐에서 레시스틴의 투여는 내당성 및 인슐린 작용을 손상시킨다 (Steppan CM et. al. Nature 409:307 (2001)). 소화관에서 레시스틴의 생물학적 효과를 길항작용하는 단백질의 생산은 이런 이유로, 비만-연결된 인슐린 저항성 및 고혈당 상태에 대한 효과적인 요법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 당뇨병 또는 과혈당증을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 지방 조직에서 레시스틴 발현의 수준을 감소시키기 위한 치료적 RNA의 이용을 포함한다.
다른 구체예에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 신체 질량 (가령, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 렙틴이다. 렙틴은 비록 지방세포에 의해 일차적으로 생산되지만, 위에서 또한 식사-의존성 방식에서 더욱 적은 양으로 생산된다. 렙틴은 지방세포 물질대사와 체중에 관한 정보를 뇌에서 식욕 중추에 전달하고, 여기서 이것은 감소된 식품 섭취를 신호하고 (포만을 증진하고) 신체의 에너지 소비를 증가시킨다.
다른 구체예에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 신체 질량 (가령, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 지방세포 보체-관련된 단백질 (Acrp30)의 C 말단 구형 머리 도메인이다. Acrp30은 분화된 지방세포에 의해 생산된 단백질이다. 생쥐에 구형 머리 도메인으로 구성되는 Acrp30의 단백질분해 개열 산물의 투여는 유의미한 체중 감소를 야기한다 (Fruebis J. et al. Proc. Natl Acad. Sci USA 98:2005 (2001)).
다른 구체예에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 신체 질량 (가령, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 콜레시스토키닌 (CCK)이다. CCK는 소화관에서 특정 영양소에 대한 응답으로 장으로부터 분비된 위장관 펩티드이다. CCK 방출은 소비된 식품의 양에 비례하고, 그리고 뇌에 식사를 종결하라는 신호를 보내는 것으로 생각된다 (Schwartz M. W. et. al. Nature 404:661-71(2000)). 결과적으로, 상승된 CCK는 식사 크기를 감소시킬 수 있고, 그리고 체중 감소 또는 체중 안정화를 증진한다 (즉, 체중 증가를 예방하거나 또는 저해한다).
PYY에 관하여, 가령 le Roux et al., Proc Nutr Soc. 2005 May; 64(2):213-6을 참조한다.
면역학적 장애
한 구체예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 면역조정 활성을 소유한다. 가령, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 면역 세포의 증식, 분화, 또는 동원 (화학주성)을 활성화하거나 또는 저해함으로써 면역계의 결함 또는 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 면역 세포는 조혈의 과정을 통해 발달하고, 만능성 줄기 세포로부터 골수성 (혈소판, 적혈구, 호중구, 그리고 대식세포)과 림프구양 (B와 T 림프구) 세포를 생산한다. 이들 면역 결핍 또는 장애의 병인은 유전성, 체성, 예를 들면, 암 또는 일부 자가면역 장애, 후천성 (가령, 화학요법 또는 독소에 의해), 또는 감염성일 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 조혈 세포의 결함 또는 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 가령, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 일정한 (또는 많은) 유형 조혈 세포에서 감소와 연관된 장애를 치료하기 위한 노력에서, 만능성 줄기 세포를 비롯한 조혈 세포의 분화 또는 증식을 증가시키는데 이용될 수 있었다. 면역학적 결핍 증후군의 실례는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 혈액 단백질 장애 (가령, 무감마글로불린혈증, 이상감마글로불린혈증), 모세혈관확장성 운동실조증, 통상적인 가변적 면역결핍, 디조지 증후군, HIV 감염, HTLV-BLV 감염, 백혈구 부착 결핍 증후군, 림프구감소증, 식세포 살균적 기능장애, 중증 복합형 면역 부전증 (SCIDs), 비스코트 올드리치 장애, 빈혈, 혈소판감소증, 또는 헤모글로빈뇨증.
본 발명의 치료적 조성물은 또한, 자가면역 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 많은 자가면역 장애는 면역 세포에 의한 자가 물질의 이물로의 부적절한 인식으로부터 발생한다. 이러한 부적절한 인식은 숙주 조직의 파괴로 이어지는 면역 반응을 야기한다. 따라서, 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화, 또는 화학주성을 저해하는 본 발명의 치료적 조성물의 투여는 자가면역 장애를 예방하는데 효과적인 요법일 수 있다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 자가면역 장애의 실례는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 애디슨병, 용혈성 빈혈, 항인지질 증후군, 류마티스성 관절염, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 신경염, 안염, 수포성 유천포창, 천포창, 다발성 내분비병증, 자반병, 라이터병, 강직 인간 증후군, 자가면역 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 자가면역 폐 염증, 길랭 바레 증후군, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 그리고 자가면역 염증성 눈 질환.
유사하게, 알레르기 반응과 상태, 예를 들면, 천식 (특히 알레르기 천식) 또는 다른 호흡기 문제 또한, 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있다. 게다가, 이들 분자는 아나필락시스, 항원성 분자에 대한 과민성, 또는 혈액형 부적합을 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 또한, 장기 거부 또는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 치료하고 및/또는 예방하는데 이용될 수 있다. 장기 거부는 면역 반응을 통해, 이식된 조직의 숙주 면역 세포 파괴에 의해 발생한다. 유사하게, 면역 반응은 GVHD에 또한 관련되지만, 이러한 경우에, 외래 이식된 면역 세포가 숙주 조직을 파괴한다. 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화, 또는 화학주성을 저해하는 본 발명의 치료적 조성물의 투여는 장기 거부 또는 GVHD를 예방하는데 효과적인 요법일 수 있다.
유사하게, 본 발명의 치료적 조성물은 또한, 염증을 조정하는데 이용될 수 있다. 가령, 치료적 폴리펩티드는 염증 반응에 관련된 세포의 증식과 분화를 저해할 수 있다. 이들 분자는 감염과 연관된 염증 (가령, 패혈성 쇼크, 패혈증, 또는 전신성 염증성 반응 증후군 (SIRS)), 허혈-재관류 손상, 내독소 치사, 관절염, 췌장염, 보체-매개된 초급성 거부, 신장염, 사이토킨 또는 케모킨 유도된 폐 손상, 염증성 장 질환 (IBD), 크론병을 포함하거나, 또는 사이토킨 (가령, TNF 또는 IL-1)의 과다생산으로부터 발생하는 염증성 병태 (만성과 급성 상태 둘 모두)를 치료하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, TNFα에 대항하여 표적화된 치료적 RNA는 염증을 치료하기 위해 본 조성물에서 이용된다. 다른 바람직한 구체예에서, IL-1에 대항하여 표적화된 치료적 RNA가 염증을 치료하기 위해 본 조성물에서 이용된다. siRNA 치료적 RNA가 특히 바람직하다. 본 발명에서 치료를 위해 관심되는 염증성 장애는 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD), 간질성 방광염, 그리고 염증성 장 질환을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
응고 장애
일부 구체예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 또한, 지혈 (출혈의 정지) 또는 혈전용해 활성 (응괴 형성)을 조정하는데 이용될 수 있다. 가령, 지혈 또는 혈전용해 활성을 증가시킴으로써, 본 발명의 치료적 조성물은 혈액 응고 장애 (가령, 무피브리노겐혈증, 인자 결핍), 혈액 혈소판 장애 (가령, 혈소판감소증), 또는 외상, 수술 또는 다른 원인으로부터 발생하는 상처를 치료하는데 이용될 수 있었다. 대안으로, 지혈 또는 혈전용해 활성을 줄일 수 있는 본 발명의 치료적 조성물은 응고를 저해하거나 또는 용해시키는데 이용될 수 있었다. 이들 치료적 조성물은 심장마비 (경색), 뇌졸중, 또는 흉터형성의 치료에서 중요할 수 있었다. 한 구체예에서, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 혈우병 또는 다른 응고/응고 장애의 치료에 유용한 응고 인자 (가령, 인자 VIII, IX 또는 X)이다.
과증식성 장애
한 구체예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 세포 증식을 조정할 수 있다. 이런 치료적 폴리펩티드는 신생물을 비롯한 과증식성 장애를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 과증식성 장애의 실례는 다음에서 위치된 신생물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 배, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선 (부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경 (중추와 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부, 그리고 비뇨생식기.
유사하게, 다른 과증식성 장애 또한, 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있다. 이런 과증식성 장애의 실례는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 고감마글로불린혈증, 림프세포증식성 질환, 형질세포질환, 자반병, 사르코이드증, 세자리 증후군, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고셔병, 조직구증, 그리고 상기 열거된 장기 시스템에서 위치된, 신생물 이외에 임의의 다른 과증식성 질환.
순환계로의 전달은 매우 다양한 조직에 치료적 단백질의 접근을 제공한다. 대안으로, 본 발명의 치료적 조성물은 과증식성 장애를 저해할 수 있는 다른 세포의 증식을 자극할 수 있다.
가령, 면역 반응을 증가시킴으로써, 특히 과증식성 장애의 항원 속성을 증가시킴으로써, 또는 T-세포를 증식하거나, 분화하거나 또는 동원함으로써, 과증식성 장애가 치료될 수 있다. 이러한 면역 반응은 기존의 면역 반응을 증강함으로써 또는 새로운 면역 반응을 개시함으로써 증가될 수 있다. 대안으로, 면역 반응을 줄이는 것은 또한, 예로서 화학요법 작용제로 과증식성 장애를 치료하는 방법일 수 있다.
감염성 질환
한 구체예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 감염성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 가령, 면역 반응을 증가시킴으로써, 특히 B 및/또는 T 세포의 증식과 분화를 증가시킴으로써, 감염성 질환이 치료될 수 있다. 이러한 면역 반응은 기존의 면역 반응을 증강함으로써 또는 새로운 면역 반응을 개시함으로써 증가될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 치료적 조성물은 또한, 면역 반응을 반드시 이끌어내지는 않으면서, 감염체를 직접적으로 저해할 수 있다.
바이러스는 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 증상을 유발할 수 있는 감염체의 한 가지 실례이다. 바이러스의 실례는 다음의 DNA와 RNA 바이러스 패밀리를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 아르보바이러스 (Arbovirus), 아데노바이러스과 (Adenoviridae), 아레나바이러스과 (Arenaviridae), 아르테리바이러스 (Arterivirus), 버나바이러스과 (Birnaviridae), 부니아바이러스과 (Bunyaviridae), 칼시비바이러스과 (Caliciviridae), 시르코바이러스과 (Circoviridae), 코로나바이러스과 (Coronaviridae), 플라비바이러스과 (Flaviviridae), 헤파드나바이러스과 (Hepadnaviridae) (간염), 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) (가령, 시토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus), 단순 포진, 대상 포진), 모노네가바이러스 (Mononegavirus) (가령, 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae), 홍역바이러스 (Morbillivirus), 랍도바이러스과 (Rhabdoviridae)), 오소믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae) (가령, 인플루엔자), 파포바바이러스과 (Papovaviridae), 파보바이러스과 (Parvoviridae), 피코르나바이러스과 (Picornaviridae), 폭스바이러스과 (Poxviridae) (가령, 천연두 또는 우두), 레오바이러스과 (Reoviridae) (가령, 로타바이러스 (Rotavirus)), 레트로바이러스과 (Retroviridae) (HTLV-I, HTLV-II, 렌티바이러스 (Lentivirus)), 그리고 토가바이러스과 (Togaviridae) (가령, 루비바이러스 (Rubivirus)). 이들 패밀리 범위에 들어가는 바이러스는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 질환 또는 증상을 유발할 수 있다: 관절염, 세기관지염, 뇌염, 눈 감염 (가령, 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염 (A, B, C, E, 만성 활성, 델타), 수막염, 기회 감염 (가령, AIDS), 폐렴, 버킷 림프종, 수두, 출혈열, 홍역, 유행성 이하선염, 파라인플루엔자, 광견병, 감기, 소아마비, 백혈병, 풍진, 성병, 피부 질환 (가령, 카포시, 사마귀), 그리고 바이러스혈증. 본 발명의 치료적 조성물은 이들 증상 또는 질환 중에서 한 가지를 치료하는데 이용될 수 있다 .
유사하게, 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 증상을 유발할 수 있는 세균 또는 진균 병원체는 다음의 그람 음성과 그람 양성 세균 패밀리와 균류를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 악티노마이세탈레스 (Actinomycetales) (가령, 코리네박테륨 (Corynebacterium), 미코박테리움 (Mycobacterium), 노르카르디아 (Norcardia)), 아스페르길루스증, 바실루스과 (Bacillaceae) (가령, 탄저균 (Anthrax), 클로스트리듐 (Clostridium)), 박테로이다케아이과 (Bacteroidaceae), 분아균증, 보르데텔라 (Bordetella), 보렐리아 (Borrelia), 브루셀라증, 칸디다증, 캄필로박터 (Campylobacter), 콕시디오이데스진균증, 효모균증, 데르마토시코세스, 장내세균 (클렙시엘라 (Klebsiella), 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia), 예르시니아 (Yersinia)), 애리시펠로트릭스 (Erysipelothrix), 헬리코박터 (Helicobacter), 레기오넬라증, 랩토스피라증, 리스테리아 (Listeria), 마이코플리스마과 (Mycoplasmatales), 나이세리아과 (Neisseriaceae) (가령, 아시네토박터 (Acinetobacter), 임질균 (Gonorrhea), 수막구균), 파스퇴렐라과 (Pasteurellaceae) 감염 (가령, 악티노바실루스 (Actinobacillus), 헤모필루스 (Heamophilus), 파스퇴렐라 (Pasteurella)), 슈도모나스 (Pseudomonas), 리케차과 (Rickettsiaceae), 클라미디아과 (Chlamydiaceae), 매독, 그리고 포도상구균. 이들 세균 또는 진균 패밀리는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 질환 또는 증상을 유발할 수 있다: 세균혈증, 심내막염, 눈 감염 (결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회 감염 (가령, AIDS 관련된 감염), 손발톱주위염, 보철-관련된 감염, 라이터병, 기도 감염, 예를 들면, 백일해 또는 축농증, 패혈증, 라임병, 고양이 발톱병, 이질, 파라티푸스열, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염, 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 파라결핵, 결핵, 루푸스, 보툴리눔독소증, 괴저, 파상풍, 농가진, 류마티스열, 성홍열, 성병, 피부 질환 (가령, 봉소염, 데르마토시코세스), 독소혈증, 요로 감염, 상처 감염. 본 발명의 치료적 조성물은 이들 증상 또는 질환 중에서 한 가지를 치료하는데 이용될 수 있다 .
게다가, 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 증상을 유발하는 기생충성 병원체는 다음의 패밀리를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 아메바증, 바베스열원충증, 콕시디아증, 와포자충증, 디엔트아메비아시스, 구역, 외부기생충, 편모충증, 연충증, 리슈만편모충증, 범안열원충증, 톡소포자충증, 파동편모충증, 그리고 트리코모나스 (Trichomonas). 이들 기생충은 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 질환 또는 증상을 유발할 수 있다: 옴, 털진드기유충증, 눈 감염, 장 질환 (가령, 이질, 편모충증), 간 질환, 폐 질환, 기회 감염 (가령, AIDS 관련된), 말라리아, 임신 합병증, 그리고 톡소포자충증. 본 발명의 치료적 조성물은 이들 증상 또는 질환 중에서 한 가지를 치료하는데 이용될 수 있다.
재생
본 발명의 치료적 조성물은 세포를 분화시키고, 증식하고, 유인하여 조직의 재생을 조성하는데 이용될 수 있다. (Science 276:59-87 (1997)을 참조한다.) 조직의 재생은 선천 결함, 외상 (상처, 화상, 절개, 또는 궤양), 연령, 질환 (가령, 골다공증, 골관절염, 치주 질환, 간부전), 미용 성형 수술을 비롯한 수술, 섬유증, 재관류 손상, 또는 전신 사이토킨 손상에 의해 손상된 조직을 수복하거나, 대체하거나, 또는 보호하는데 이용될 수 있었다.
본 발명의 치료적 조성물은 장기 (가령, 췌장, 간, 장, 신장, 피부, 내피), 근육 (평활근, 골격근 또는 심장 근육), 혈관 (혈관 내피 포함), 신경, 조혈, 그리고 골격 (뼈, 연골, 힘줄, 그리고 인대) 조직을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 조직의 재생을 증진할 수 있다. 바람직하게는, 재생은 소량의 흉터형성을 초래하거나, 또는 흉터형성 없이 발생한다. 재생은 또한, 혈관형성을 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명의 치료적 조성물은 치유되기 어려운 조직의 재생을 증가시킬 수 있다. 가령, 증가된 힘줄/인대 재생은 손상 후 회복 기간을 단축할 것이다. 본 발명의 치료적 조성물은 또한, 손상을 방지하는 노력에서 예방적으로 이용될 수 있었다. 치료될 수 있었던 특정한 질환은 건염, 수근관 증후군, 그리고 다른 힘줄 또는 인대 결함을 포함한다. 비-치유 상처의 조직 재생의 추가 실례는 압박 궤양, 혈관 부전증과 연관된 궤양, 외과적 상처, 그리고 외상성 상처를 포함한다.
유사하게, 신경과 뇌 조직 역시, 본 발명의 치료적 조성물을 이용하여 신경 세포를 증식하고 분화함으로써 재건될 수 있었다. 이러한 방법을 이용하여 치료될 수 있었던 질환은 중추와 말초 신경계 질환, 신경병증, 또는 기계적 장애와 외상성 장애 (가령, 척수 장애, 두부 외상, 뇌혈관 질환, 그리고 뇌졸중)을 포함한다. 구체적으로, 말초 신경 손상과 연관된 질환, 말초 신경병증 (가령, 화학요법 또는 다른 의학적 요법으로부터 발생), 국부화된 신경병증, 그리고 중추신경계 질환 (가령, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 및 샤이-드래거 증후군) 모두 본 발명의 치료적 조성물을 이용하여 치료될 수 있었다. CNS 장애에 대하여, 혈액 뇌 장벽을 교란하기 위한 방법, 그리고 CNS 내로 운반을 제공하는 모이어티에 치료적 작용제를 연계하는 방법을 비롯하여, 뇌 조직에 대한 치료적 접근을 용이하게 하기 위한 다양한 수단이 당분야에서 공지된다. 한 구체예에서, 치료적 핵산은 융합 단백질을 인코딩하기 위해 가공되고, 상기 융합 단백질은 운반 모이어티 및 치료적 단백질을 포함한다. 대안으로, 본 조성물은 CNS에 직접적으로 전달될 수 있다.
화학주성
한 구체예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 화학주성을 조정할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 화학주성 활성을 소유한다. 화학주성 분자는 세포 (가령, 단핵구, 섬유모세포, 호중구, T-세포, 비만 세포, 호산구, 상피 및/또는 내피 세포)를 체내에서 특정 부위, 예를 들면, 염증, 감염, 또는 과다증식의 부위로 유인하거나 또는 동원한다. 동원된 세포는 이후, 특정 외상 또는 이상을 격퇴시키고 및/또는 치유할 수 있다.
가령, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 특정 세포의 화학주성 활성을 증가시킬 수 있다. 이들 화학주성 분자는 이후, 체내에서 특정 위치에 표적화된 세포의 숫자를 증가시킴으로써 염증, 감염, 과증식성 장애, 또는 임의의 면역계 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 가령, 화학주성 분자는 면역 세포를 손상된 위치에 유인함으로써, 상처 및 조직에 대한 다른 외상을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 화학주성 분자는 또한, 섬유모세포를 유인할 수 있는데, 이들은 상처를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 화학주성 활성을 저해할 수 있는 것으로 또한 예기된다. 이들 치료적 조성물은 또한, 장애를 치료하는데 이용될 수 있었다. 따라서, 본 발명의 치료적 조성물은 화학주성의 저해제로서 이용될 수 있었다.
표적 조직의 인근에서 활성화되는 친치료적 단백질이 이용에 특히 바람직하다.
이용에 예기되는 추가 치료적 폴리펩티드는 성장 장애 또는 소모 증후군을 치료하기 위한 성장 인자 (가령, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 산성과 염기성 섬유모세포 성장 인자, 전환 성장 인자-β 등); 그리고 외래 항원 또는 병원체 (가령, 헬리코박터 파일로리 (H. pylori))에 대항하여 개체의 수동 면역화 또는 보호를 제공하거나, 또는 암, 관절염 또는 심혈관 질환의 치료를 제공하기 위한 항체 (가령, 인간 또는 인간화); 사이토킨, 인터페론 (가령, 인터페론 (IFN), IFN-α2b와 2α, IFN-α N1, IFN-β1b, IFN-감마), 인터류킨 (가령, IL-1 내지 IL-10), 종양 괴사 인자 (TNF-α TNF-β), 케모킨, 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 폴리펩티드 호르몬, 항균성 폴리펩티드 (가령, 항균성, 항진균성, 항바이러스성, 및/또는 항기생충성 폴리펩티드), 효소 (가령, 아데노신 탈아미노효소), 생식선자극호르몬, 케모탁틴, 지질-결합 단백질, 필가스팀 (Neupogen), 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 인슐리노트로핀, 이미글루세라제, 사르그라모스팀, 조직 플라스미노겐 활성제 (tPA), 우로키나아제, 스트렙토키나아제, 페닐알라닌 암모니아 리아제, 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 초과산화물 디스뮤타아제 (SOD), 아데노신 탈아미드효소, 카탈라아제, 칼시토닌, 엔도텔린, L-아스파라기나아제 펩신, 요산분해효소, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 카르복시펩티드분해효소, 젖당분해효소, 수크레아제, 내인성 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH)-유사 호르몬, 가용성 CD4, 그리고 이들의 항체 및/또는 항원 결합 단편 (가령, FAbs) (가령, 올소클론 OKT-e (항-CD3), GPIIb/IIa 단일클론 항체)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이런 인자를 인코딩하는 핵산을 표적으로 하는 치료적 RNA가 추가적으로 예기된다.
백신
한 구체예에서, 본 발명은 환자를 예방접종하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 원하는 에피토프를 생산할 수 있는 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 에피토프를 포함하는 단백질을 발현할 수 있는 치료적 핵산 구조체를 포함한다.
미용 적용
한 구체예에서, 본 발명은 미용 이용을 위한 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 제공한다. 본 미용제는 미용 이용에 적합한 제제에서 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함한다.
실시예
실시예 1: 이중으로 유도체화된 키토산의 형성 및 DNA 폴리플렉스의 형성
키토산은 널리 공지된 방법에 따라, 아르기닌 및 글루콘산으로, 또는 아르기닌 및 트레온산으로 이중으로 유도체화되었다 (DD-키토산). DD-키토산은 분비된 알칼리 인산분해효소 (SEAP)를 인코딩하는 DNA 벡터 또는 루시페라아제 siRNA로 폴리플렉스화되었다.
실시예 2: DNA 폴리플렉스로 시험관내 형질감염
일반적으로, DD-키토산 핵산 폴리플렉스 제제로 293T 세포의 시험관내 형질감염은 2 단계에서 수행되었다: 세포의 준비, 그 이후에 형질감염.
실시예 3: 세포주의 유지
293T 세포주는 University of British Columbia (Vancouver, Canada)에서 Dr. Timothy Kieffer 실험실의 호의이었고 아래와 같이 준비되었다. 인간 신장 세포는 SV40 T-항원으로 형질전환되고; 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신을 내포하는 높은 글루코오스 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM)에서 성장되고; 그리고 80% 합류 미만에서 유지되었다.
실시예 4: 형질감염을 위한 세포의 준비
세포는 아래와 같이 형질감염을 위해 준비되었다. 형질감염 전날에, 293T 세포는 3 mL의 완전한 배지 (높은 글루코오스 DMEM + 10% FBS + pen/strep)에서 6-웰 조직 배양 평판 (4.5 x 105 세포/웰)에 첨가되었다. 형질감염의 당일에, 세포 계수가 세포를 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 1X 세척하고, 세포를 0.5 mL의 0.05% 트립신으로 트립선처리하고, 0.5 mL의 완전한 배지를 첨가하고, 그리고 혈구계를 이용하여 10 μL를 계수함으로써 2개의 선별된 웰에 대해 결정되었다. 세포가 ~50% 합류성 (~7 x 105 세포/웰)이면, 형질감염이 진행되었다. (세포가 너무 희소성이거나 또는 너무 합류성이면, 형질감염이 진행되지 않았다.)
실시예 5: 세포의 형질감염
형질감염은 아래와 같이 수행되었다. 먼저, 배지가 각 웰로부터 제거되고, 그 이후에 각 웰에 1 mL Opti-mem (pH 7.4)의 첨가, 부드럽게 빙빙 돌림, 그리고 이후 제거가 수행되었다. (6개 웰은 세포가 이탈하는 것을 예방하는 시간에서 세척되었다.) 이후, 다른 1 mL의 Opti-mem (pH 7.4)이 세포를 이탈시키지 않기 위해, 각 웰에 조심스럽게 첨가되었다. 그 다음, 폴리플렉스 표본이 각 웰 (2 μg DNA의 표적)에 첨가되고, 빙빙 돌려지고, 그리고 37℃에서 2 시간 동안 배양되었다. 배양 후, 배지가 제거되고, 2 mL의 완전한 배지로 대체되고, 그리고 37℃에서 재배양되었다. 필요한 시점에서, 상층액이 제거되고 차후 SEAP 검정을 위해 -20℃에서 보관되었다.
실시예 6: SEAP 단백질 검정
SEAP 검정은 SEAP 화학발광 검정 키트를 이용하여 수행되었다. 검정을 위한 모든 시약은 이용 전 30 분 동안 25℃에서 평형화되었다. 검정을 위한 표준은 태반 알칼리 인산분해효소를 0.1% 소 혈청 알부민 및 50% 글리세롤로 스파이크된 키트로부터 1X 희석 완충액에서 1 mg/mL까지 용해하고, 그리고 이후, DMEM으로 0.01 pg/uL까지 10-배 연속 희석액으로 희석함으로써 준비되었다. 표준 및 해동된 표본은 이후, 희석 완충액으로 4분의 1로 희석되고, 65℃에서 30 분 동안 열 비활성화되고, 얼음 위에서 2 분 동안 배양되고, 원심분리되고 (실온에서 2 분 동안 16100 x rcf), 그리고 상층액이 새로운 튜브로 이전되었다. 25℃에서 5 분 동안 평형시킨 후에, 50 uL의 표본 및 표준이 Microlite-1 평판의 각 웰에 2중으로 첨가되었다. 비활성화 완충액 (50 uL)이 이후, 각 웰에 첨가되고, 그리고 기포를 발생시키지 않으면서 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합되고 5 분 동안 배양되었다. 기질/인핸서 시약은 1:19의 기질 대 인핸서에 대한 비율에서 5 분 배양 동안 제조되었다. 기질/인핸서는 이후, 각 웰에 첨가되고, 20 분 동안 배양되고, 그리고 이후 평판이 1 초의 통합 시간으로 광도계 (Lmax11384, Molecular Devices)에서 판독되었다.
실시예 7: 결과
도면 1-3은 상이한 %의 아르기닌 또는 글루콘산으로 유도체화된 키토산, 그리고 글루콘산과 아르기닌 둘 모두로 이중으로 유도체화된 키토산의 형질감염 효율을 보여준다. 도면 1-3은 키토산이 아르기닌과 글루콘산 둘 모두로 이중으로 유도체화될 때 상승 효과를 보여준다. 상승 효과는 비록 최대 효과가 약 3%의 글루콘산 최종 기능화 정도에서 목격되었지만, 키토산이 10%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 3% 내지 10%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산으로 이중으로 기능화될 때 목격될 수 있다 (도면 1). 상승 효과는 또한, 비록 최대 효과가 약 8%의 글루콘산 최종 기능화 정도에서 목격되었지만, 키토산이 52%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 3% 내지 8%의 최종 기능화 정도에서 글루콘산으로 이중으로 기능화될 때 목격될 수 있다 (도면 2). 이에 더하여, 26%와 6%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 글루콘산으로 이중으로 기능화된 키토산이 형질감염 효율에서 최대 상승 효과를 나타냈다 (도면 3). 최종적으로, 상승 효과는 또한, 키토산이 아르기닌 및 글루콘산 대신에 대안 모이어티, 예를 들면, 트레온산으로 이중으로 유도체화될 때 목격될 수 있다. 상승 효과는 키토산이 29%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 및 3%의 최종 기능화 정도에서 트레온산으로 이중으로 기능화될 때 관찰된다 (도면 4).
실시예 8:
키토산은 아르기닌 및 2,3-디히드록실프로파논산; 2,3,4,5,6,7-헥사히드록실헵타날; 2,3,4,5,6-펜타히드록실헥사날; 2,3,4,5-테트라히드록실헥사날; 그리고 2,3-디히드록실프로파날로 구성된 군에서 선택되는 HP로 이중으로 유도체화되고 (DD-키토산), 그리고 실시예 1-7에 따라 검정된다. DD-키토산은 분비된 알칼리 인산분해효소 (SEAP)를 인코딩하는 DNA 벡터 또는 루시페라아제 siRNA로 폴리플렉스화된다.
모든 인용 문서는 전체적으로 본원에 명시적으로 참조로서 편입된다.
본원에서 언급된 모든 특허와 특허 간행물은 본원에 참조로서 편입된다.
일정한 변형과 향상은 전술한 설명의 판독 시에 당업자에게 발생할 것이다. 모든 이런 변형과 향상은 간결성과 판독성을 위해서 본원에서 생략되었지만 다음 청구항의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (42)

  1. 삭제
  2. 아르기닌 (Arg) 및 화학식 VII 의 친수성 폴리올 (HP) 로 기능화된 키토산을 포함하는 키토산-유도체 나노입자로서:
    Figure 112021004939080-pct00039

    [식에서:
    R2 는 H 및 히드록실에서 선택되고;
    R3 은 H 및 히드록실에서 선택되고; 그리고
    X 는 하나 또는 그 이상의 히드록실 치환체로 치환된 C2-C6 알킬렌에서 선택됨];
    단서로서 상기 친수성 폴리올은 글루콘산이 아닌 키토산-유도체 나노입자.
  3. 제 2 항에 있어서, 친수성 폴리올은 카르복실 기를 갖는 키토산-유도체 나노입자.
  4. 제 3 항에 있어서, 친수성 폴리올은 트레온산인 키토산-유도체 나노입자.
  5. 제 2 항에 있어서, 친수성 폴리올은 알데히드 기를 갖는 키토산-유도체 나노입자.
  6. 제 5 항에 있어서, 친수성 폴리올은 글리세르알데히드, 트레오스, 에리트로오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 알로오스, 글루코오스, 알트로오스, 만노오스, 굴로오스, 이도오스, 갈락토오스, 그리고 탈로오스로 구성된 군에서 선택되는 사카라이드인 키토산-유도체 나노입자.
  7. 제 2 항에 있어서, 화학식 V 또는 화학식 VI 의 친수성 화합물을 포함하는 키토산-유도체 나노입자.
    Figure 112021004939080-pct00040
    Figure 112021004939080-pct00041
  8. 제 2 항에 있어서, 친수성 폴리올은 2,3-디히드록실프로파논산; 2,3,4,5,6,7-헥사히드록실헵타날; 2,3,4,5,6-펜타히드록실헥사날; 2,3,4,5-테트라히드록실헥사날; 그리고 2,3-디히드록실프로파날로 구성된 군에서 선택되는 키토산-유도체 나노입자.
  9. 제 2 항에 있어서, 친수성 폴리올은 글루코오스인 키토산-유도체 나노입자.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 키토산은 기능화 전에 65 kDa 미만, 30 kDa 미만, 15 kDa 미만, 10 kDa 미만, 또는 5 kDa 미만의 평균 분자량을 갖는 키토산-유도체 나노입자.
  11. 제 2 항에 있어서, 나노입자는 1:1 내지 10:1 사이에 Arg 최종 기능화 정도:HP 최종 기능화 정도 비를 갖는 키토산-유도체 나노입자.
  12. 제 11 항에 있어서, Arg 최종 기능화 정도:HP 최종 기능화 정도 비는 3:1 내지 7:1 사이인 키토산-유도체 나노입자.
  13. 제 12 항에 있어서, Arg 최종 기능화 정도:HP 최종 기능화 정도 비는 5:1인 키토산-유도체 나노입자.
  14. 제 2 항에 따른 나노입자를 포함하는 조성물로서, 상기 키토산은 핵산과 복합화되어 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 형성하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 인 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 아민 대 인산염 비는 2 내지 100 사이, 2 내지 50 사이, 2 내지 30 사이, 또는 2 내지 15 사이인 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 조성물이 등장성인 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 아민 대 인산염 비는 2 내지 30 사이인 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 아민 대 인산염 비는 2 내지 15 사이인 조성물.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 조성물은 3.0-8.0 사이, 4.0-7.0 사이, 또는 4.5-6.5 사이의 pH 를 갖는 조성물.
  21. 제 14 항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만 또는 0.25 미만의 평균 다분산성 지수 (PDI) 를 갖는 조성물.
  22. 제 14 항에 있어서, 상기 키토산 핵산 폴리플렉스는 기능화 전에 50 kDa 미만의 평균 분자량, 평균적으로 310개 미만의 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 20 의 N/P 비율, 500 nm 미만의 평균 수력학적 직경, 산성 pH 에서 최소한 0 mV 의 평균 제타 전위, 0.5 미만의 다분산성 지수 (PDI), 및 0.5 mg/ml 초과의 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 여기서 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 침전된 폴리플렉스가 없고, 그리고 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 100 % 미만으로 증가한다는 점에서 크기 안정된 조성물.
  23. 제 14 항에 있어서, 상기 키토산 핵산 폴리플렉스는 기능화 전에 65 kDa 미만의 평균 분자량, 평균적으로 400개 미만의 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 20 의 N/P 비율, 500 nm 미만의 평균 수력학적 직경, 산성 pH 에서 +1 내지 +40 mV 의 평균 제타 전위, 0.4 미만의 다분산성 지수 (PDI), 및 0.5 mg/ml 초과의 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 여기서 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 침전된 폴리플렉스가 없고, 그리고 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 50 % 미만으로 증가한다는 점에서 크기 안정된 조성물.
  24. 제 14 항에 있어서, 상기 키토산 핵산 폴리플렉스는 기능화 전에 40 kDa 미만의 평균 분자량, 평균적으로 250개 미만의 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 20 의 N/P 비율, 500 nm 미만의 평균 수력학적 직경, 산성 pH 에서 +1 내지 +30 mV 의 평균 제타 전위, 0.3 미만의 다분산성 지수 (PDI), 및 0.5 mg/ml 초과의 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 여기서 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 침전된 폴리플렉스가 없고, 그리고 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 50 % 미만으로 증가한다는 점에서 크기 안정된 조성물.
  25. 제 14 항에 있어서, 상기 키토산 핵산 폴리플렉스는 기능화 전에 30 kDa 미만의 평균 분자량, 평균적으로 190개 미만의 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 5 의 N/P 비율, 500 nm 미만의 평균 수력학적 직경, 산성 pH 에서 +1 내지 +30 mV 의 평균 제타 전위, 0.25 미만의 다분산성 지수 (PDI), 및 0.5 mg/ml 초과의 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 여기서 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 침전된 폴리플렉스가 없고, 그리고 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 25 % 미만으로 증가한다는 점에서 크기 안정된 조성물.
  26. 제 14 항에 있어서, 상기 키토산 핵산 폴리플렉스는 기능화 전에 15 kDa 미만의 평균 분자량, 평균적으로 95개 미만의 글루코사민 단위체 단위, 2 내지 5 의 N/P 비율, 200 nm 미만의 평균 수력학적 직경, 산성 pH 에서 +1 내지 +30 mV 의 평균 제타 전위, 0.25 미만의 다분산성 지수 (PDI), 및 1.0 mg/ml 초과의 핵산 농도를 갖는 키토산 분자를 포함하고, 여기서 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 침전된 폴리플렉스가 없고, 그리고 상기 키토산-핵산 폴리플렉스는 실온에서 최소한 6 시간, 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 또는 최소한 48 시간 동안 평균 직경이 50 % 미만으로 증가한다는 점에서 크기 안정된 조성물.
  27. 제 14 항에 있어서, 상기 핵산은 인공 핵산인 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 인공 핵산은 잠금된 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA), 및 트레오스 핵산 (TNA) 으로 구성된 군에서 선택되는 조성물.
  29. 제 14 항에 있어서, 상기 핵산은 치료적 RNA 이며, 상기 치료적 RNA 는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, mRNA, 마이크로 RNA, 또는 효소적 RNA 인 조성물.
  30. 제 14 항에 있어서, 상기 핵산은 인슐린, 렙틴, 글루카곤 길항제, GLP-1, GLP-2, 그렐린, 콜레시스토키닌, 성장 호르몬, 응고 인자, PYY, 에리트로포이에틴, 염증의 저해제, 사이토킨, TNFα 길항제, 성장 호르몬 방출 호르몬, 또는 부갑상선 호르몬으로 구성된 군에서 선택되는 치료적 단백질을 인코딩하는 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 핵산은 인슐린, 글루카곤 길항제, GLP-1, 또는 렙틴을 인코딩하는 조성물.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 핵산은 IL-10, 또는 TNFα 길항제를 인코딩하는 조성물.
  33. 제 30 항에 있어서, 상기 핵산은 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY, 또는 GLP-1 을 인코딩하는 조성물.
  34. 제 30 항에 있어서, 상기 핵산은 IL-10 또는 IL-12 를 인코딩하는 조성물.
  35. 제 14 항에 있어서, 상기 친수성 폴리올은 글루코오스인 조성물.
  36. 핵산 분자를 세포에 전달하는 시험관내 방법으로서, 상기 세포를 제 14 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  37. 제 14 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물로서, 생체내에서 세포를 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 핵산 분자를 세포에 전달하는 방법에서 사용하기 위한 조성물.
  38. 제 14 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물로서, 치료적 핵산을 이를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법에서 사용하기 위한 조성물.
  39. 제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 키토산-유도체 나노입자를 포함하는 조성물로서, 당뇨병의 치료에서 사용하기 위한 조성물이며, 나노입자는 인슐린, 글루카곤 길항제, GLP-1 또는 렙틴을 인코딩하는 핵산 분자와 복합화되어 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 형성하는 조성물.
  40. 제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 키토산-유도체 나노입자를 포함하는 조성물로서, 염증성 장 질환의 치료에서 사용하기 위한 조성물이며, 나노입자는 IL-10 또는 TNFα 길항제를 인코딩하는 핵산 분자와 복합화되어 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 형성하는 조성물.
  41. 제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 키토산-유도체 나노입자를 포함하는 조성물로서, 비만의 치료에서 사용하기 위한 조성물이며, 나노입자는 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY 또는 GLP-1 을 인코딩하는 핵산 분자와 복합화되어 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 형성하는 조성물.
  42. 제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 키토산-유도체 나노입자를 포함하는 조성물로서, 비뇨생식기 과증식성 장애의 치료에서 사용하기 위한 조성물이며, 나노입자는 IL-12 를 인코딩하는 핵산 분자와 복합화되어 이중으로 유도체화된 (DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 형성하는 조성물.
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