KR20100077155A

KR20100077155A - 고농도 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물

Info

Publication number: KR20100077155A
Application number: KR1020107006747A
Authority: KR
Inventors: 에릭 씨 수; 카를로스 플릿; 안토니 청; 준 가오
Original assignee: 엔진 인코포레이티드
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2010-07-07
Also published as: US10647785B2; JP5650533B2; US20110039917A1; EP2195035A4; CA2700842C; NO2195035T3; ES2660846T3; MX2010003323A; EP2195035B1; CA2700842A1; WO2009039657A1; US8722646B2; AU2008302979A1; BRPI0817725A2; SI2195035T1; JP2014208696A; DK2195035T3; KR101761289B1; CN101873867A; EP2195035A1

Abstract

본 발명은 고도로 농축된 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물 및 분산액, 및 상기 조성물 및 분산액을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 키토산-핵산 폴리플렉스를 혼합하는 방법은, 키토산 용액 및 핵산 용액의 인라인 혼합 후 키토산-핵산 폴리플렉스의 분산액을 임의로는 응집 억제제와 함께 추가 농축시키는 것을 포함한다. 키토산-핵산 폴리플렉스의 직경을 변경시키는 방법이 추가로 제공된다.

Description

고농도 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물 {HIGH CONCENTRATION CHITOSAN-NUCLEIC ACID POLYPLEX COMPOSITIONS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 포함되는, 2007년 9월 28일에 출원된 USSN 60/976,376의 혜택의 권리를 주장한다.

본 발명은 균질한 키토산-핵산 폴리플렉스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 용액 중 키토산-핵산 폴리플렉스를 농축시키는 방법, 및 균질한 키토산-핵산 폴리플렉스의 고도로 농축된 제제에 관한 것이다.

키토산은 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루코사민의 비독성 양이온 공중합체이다. 키토산은 핵산과 복합체를 형성할 수 있고, 세포를 트랜스펙션시키기 위한 DNA 전달 비히클로서 사용되었다.

키토산-핵산 복합체의 농축액을 제조하는데 있어서 어려움이 존재한다. 혼합 용액 중 키토산 및 핵산의 농도를 증가시키는 것은 침전 뿐 아니라 그렇게 제조된 키토산-핵산 복합체의 크기에서의 바람직하지 않은 변화를 야기한다. 추가적으로, 제조된 용액 중 키토산-핵산 복합체의 농도를 증가시키는 것은 복합체의 응집 및 용액으로부터의 침전을 야기한다.

DNA 및 축합제 (예를 들어 다가양이온 탄수화물)를 포함하는 균일한 입자가 제조되도록 병발 흐름 혼합을 사용하는 것이 기재되었다 (U.S. 6,537,813). 이러한 입자를 제조하기 위해, DNA 용액 및 축합제 용액은 병발적 및 개별적으로 혼합기 (혼합 및 입자 형성을 제공하는 정적 또는 동적 혼합기를 포함)를 통한 흐름에 도입될 수 있다. 도입 및 혼합 공정에 걸쳐 DNA 및 축합제의 적절한 비율을 유지하는 것은 중요한 것으로 보고되며, 전하 중성으로부터의 유의한 편차는 공정 중 불완전 축합 또는 입자 응집을 야기할 수 있다.

발명의 요약

본 발명자들은, 연구 및 의료에서의 많은 적용이 발견되는, 고도로 농축된 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물을 제조하기 위해 분야에서의 장애를 극복하였다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 높은 농도에도 불구하고 응집 또는 침전하지 않으며, 다양한 조건 하에서 안정성을 나타내는 균일한 크기의 폴리플렉스를 포함한다. 또한, 본 발명의 바람직한 조성물은 또한 형성된 바와 같이 등장성이다. 등장성을 달성하면서 폴리플렉스 안정성을 유지하는 것은 약학적 및 치료적 적용을 위해 매우 바람직하다. 또한 발명자들은, 정적 또는 동적 혼합기를 필요로 하지 않으며 이를 포함하지 않음으로써 개선되는 인라인 (inline) 혼합 공정에 의해 키토산-핵산 폴리플렉스를 제조하는 방법을 발견하였다. 또한, 이들 방법은 중성으로부터 크게 이탈하는 전하 (즉, 제타 전위)를 갖는 안정한 폴리플렉스를 제조하는데 사용될 수 있다. 놀랍게도, 발명자들은 또한 입자 크기 및 균일성이, DNA 대 키토산의 혼합 비율을 변경하지 않고, 또는 혼합 용액 중 DNA 및 키토산의 농도를 실질적으로 변경하지 않고 인라인 혼합에 대한 공급 원료 부피를 변경함으로써 조절될 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 수화된 키토산-핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은, 약 0.5 mg/mL 초과의 핵산 농도를 갖는 키토산-핵산 폴리플렉스 중에서 고도로 농축되며, 여기서 조성물에는 침전된 폴리플렉스가 실질적으로 없다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 키토산-핵산 폴리플렉스 입자를 포함하는 분산액이다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 등장성이다. 다른 구현예에서, 조성물은 고장성 (hypertonic) 또는 열장성 (hypotonic)일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 약 0.6 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 0.75 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1.0 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1.2 mg/mL 이상, 및 가장 바람직하게는 약 1.5 mg/mL 이상의 핵산 농도를 갖는다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 추가적으로는 응집 억제제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 응집 억제제는 당, 바람직하게는 수크로오스이다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 약 8O mM 미만, 보다 바람직하게는 약 60 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 40 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 20 mM 미만의 상대 음이온 (counter anion) 농도를 포함한다. 바람직하게는 상대 음이온은 아세테이트 이온이다.

바람직한 구현예에서, 조성물의 키토산-핵산 폴리플렉스는 약 0.5 미만, 보다 바람직하게는 약 0.4 미만, 보다 바람직하게는 약 0.3 미만, 보다 바람직하게는 약 0.2 미만의 평균 다분산도 지수 ("PDI")를 갖는다.

바람직한 구현예에서, 폴리플렉스는 약 2:1 이상, 보다 바람직하게는 약 5:1 이상, 보다 바람직하게는 약 10:1 이상, 보다 바람직하게는 약 15:1 이상, 보다 바람직하게는 약 20:1 이상의 N:P 비율을 갖는다.

바람직한 구현예에서, 폴리플렉스는 평균 약 3000개 미만, 보다 바람직하게는 약 2000개 미만, 보다 바람직하게는 약 1500개 미만, 보다 바람직하게는 약 1000개 미만, 보다 바람직하게는 약 500개 미만, 보다 바람직하게는 약 100개 미만, 보다 바람직하게는 약 50개 미만의 글루코사민 단량체 단위를 갖는 키토산 분자를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 폴리플렉스는 약 500 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 250 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 150 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 100 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 50 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 25 kDa 미만의 평균 분자량을 갖는 키토산을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 조성물의 폴리플렉스는 약 750 nm 미만, 보다 바람직하게는 약 500 nm 미만, 보다 바람직하게는 약 250 nm 미만, 보다 바람직하게는 약 200 nm 미만, 및 가장 바람직하게는 약 150 nm 미만의 평균 직경을 갖는다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 본질적으로 키토산-핵산 폴리플렉스 및 응집 억제제로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 조성물은 본질적으로 키토산-핵산 폴리플렉스로 이루어진다.

한 측면에서, 본 발명은 키토산-핵산 폴리플렉스의 분산액을 농축하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액을 제공하며 농축 수단, 바람직하게는 접선 흐름 여과 (tangential flow filtration)를 사용하여 키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액을 농축하여 키토산-핵산 폴리플렉스의 농축된 분산액을 제조하는 것을 포함한다. 바람직하게는 비-농축된 분산액은 응집 억제제를 포함한다. 이러한 농축 공정은 소분자 (예를 들어 응집 억제제)의 농도를 실질적으로 유지시키면서, 이로써 키토산-핵산 복합체 내에서 농축된 조성물을 야기시킴으로써, 키토산-핵산 복합체의 농도를 실질적으로 증가시킨다.

바람직한 구현예에서, 농축 수단은 2배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 6배 이상, 보다 바람직하게는 7배 이상, 보다 바람직하게는 8배 이상, 보다 바람직하게는 9배 이상, 및 가장 바람직하게는 10배 이상으로 분산액을 농축시킨다.

바람직한 구현예에서, 응집 억제제는 당, 바람직하게는 수크로오스이다.

바람직한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액은 상대 음이온, 바람직하게는 아세테이트 이온을 포함하며, 농축 수단은 상대 음이온을 선택적으로 농축시키지 않는다. 상대 음이온 부유는 농축된 분산액 중 핵산 부유만큼 크지 않다. 바람직하게는, 농축된 분산액은 비-농축된 분산액의 것보다 실질적으로 크지 않은 상대 음이온 농도를 갖는다.

바람직한 구현예에서, 농축된 분산액 중 핵산의 농도는 약 0.5 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 0.6 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 0.75 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1.0 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1.2 mg/mL 이상, 및 가장 바람직하게는 약 1.5 mg/mL 이상이다.

바람직한 구현예에서, 인라인 혼합은 키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액을 제조하는데 사용된다.

바람직한 구현예에서, 비-농축된 분산액은 1O mL 이상, 보다 바람직하게는 약 5O mL 이상, 보다 바람직하게는 약 500 mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1 L 이상, 보다 바람직하게는 약 2 L 이상, 보다 바람직하게는 약 3 L 이상, 보다 바람직하게는 약 4 L 이상, 보다 바람직하게는 약 5 L 이상, 보다 바람직하게는 약 10 L 이상의 부피를 갖는다.

바람직한 구현예에서, 비-농축된 분산액의 키토산-핵산 폴리플렉스는 약 0.5 미만, 보다 바람직하게는 약 0.4 미만, 보다 바람직하게는 약 0.3 미만, 보다 바람직하게는 약 0.2 미만의 평균 PDI를 갖는다.

바람직한 구현예에서, 농축된 분산액의 키토산-핵산 폴리플렉스는 약 0.5 미만, 보다 바람직하게는 약 0.4 미만, 보다 바람직하게는 약 0.3 미만, 보다 바람직하게는 약 0.2 미만의 평균 PDI를 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 키토산 핵산 폴리플렉스의 농축된 분산액을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 키토산과 핵산 용액을 혼합함으로써 형성된 키토산-핵산 폴리플렉스의 특성을 조정하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 키토산-핵산 폴리플렉스 직경을 조정하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 키토산-핵산 폴리플렉스 제타 전위를 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 핵산 대 키토산의 비율, 또는 혼합 용액 중 핵산 및 키토산의 농도를 변경하지 않고 폴리플렉스를 제조하는데 사용되는 키토산 또는 핵산 용액의 부피를 변경시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 키토산 및 핵산 공급 원료 용액의 인라인 혼합을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 수화된 키토산-핵산 폴리플렉스를 포함하며 약 0.5 mg/mL 초과의 핵산 농도를 갖는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 키토산-핵산 폴리플렉스는 치료적 핵산 구성물을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 약학 조성물은 약 0.6 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 0.75 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1.0 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1.2 mg/mL 이상, 및 가장 바람직하게는 약 1.5 mg/mL 이상의 핵산 농도를 갖는다.

바람직한 구현예에서, 약학 조성물은 응집 억제제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 응집 억제제는 당, 바람직하게는 수크로오스이다.

바람직한 구현예에서, 약학 조성물은 약 80 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 60 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 40 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 20 mM 미만의 상대 음이온 농도를 갖는다. 바람직하게는 상대 음이온은 아세테이트 이온이다.

바람직한 구현예에서, 약학 조성물은 등장성이다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 고장성 또는 열장성일 수 있다.

한 측면에서 본 발명은, 키토산 및 핵산 용액을 인라인 혼합하여 비-농축된 키토산-핵산 분산액을 형성시킨 후, 비-농축된 키토산 핵산 분산액을 TFF를 사용하여 농축하여 농축된 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액을 제조하는 것을 포함하는, 농축된 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액의 제조 방법을 제공한다.

바람직한 구현예에서, TFF는 분산액을 2배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 6배 이상, 보다 바람직하게는 7배 이상, 보다 바람직하게는 8배 이상, 보다 바람직하게는 9배 이상, 및 가장 바람직하게는 10배 이상 농축시킨다.

바람직한 구현예에서, 농축된 분산액은 약 80 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 60 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 40 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 20 mM 미만의 상대 음이온 농도를 갖는다. 바람직하게는 상대 음이온은 아세테이트 이온이다.

바람직하게는 농축된 분산액은 응집 억제제를 포함한다. 바람직하게는 응집 억제제는 당, 바람직하게는 수크로오스이다.

바람직하게는 농축된 분산액은 등장성이다. 다른 구현예에서, 농축된 분산액은 고장성 또는 열장성일 수 있다.

상세한 설명

"키토산-핵산 폴리플렉스", "키토산-핵산 폴리플렉스 입자" 또는 "폴리플렉스"는 다수의 키토산 분자 (글루코사민 단량체의 각각의 중합체) 및 다수의 핵산 분자를 포함하는 복합체를 의미한다. 키토산 단량체는 부착된 리간드를 갖는 키토산을 포함하는 유도체를 포함한다. "유도체"는 공유결합적으로 개질된 N-아세틸-D-글루코사민 및/또는 D-글루코사민 단위를 포함하는 키토산계 중합체 뿐 아니라 다른 단위를 혼입하거나 또는 다른 부분에 부착된 키토산계 중합체의 광범위한 카테고리를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 유도체는 종종 글루코사민의 아민기 또는 하이드록실기의 개질에 기재한다. 키토산 유도체의 예에는, 비제한적으로, 트리메틸화된 키토산, 페길레이트화 (PEGylated)된 키토산, 티올화된 키토산, 갈락토실화된 키토산, 알킬화된 키토산, PEI-혼입된 키토산, 아르기닌 개질된 키토산, 우론산 개질된 키토산 등이 포함된다. 키토산 유도체에 대한 추가적인 교시에 대해서는, 예를 들어 ["Non-viral Gene Therapy"의 pp.63~74, K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (편집자), Springer-Verlag Tokyo, 2005, ISBN 4-431-25122-7; Zhu 등, Chinese Science Bulletin, December 2007, vol. 52 ( 23), pp. 3207-3215; 및 Varma 등, Carbohydrate Polymers 55 (2004) 77-93]를 참조한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 키토산 중합체의 "평균 중량"은 중량 평균 분자량을 나타낸다.

"상대 음이온"은 하전된 키토산 아민과 정전기적으로 반응할 수 있는 음이온을 의미한다. 바람직한 상대 음이온에는 아세테이트 이온 및 염화물 이온이 포함된다.

키토산은, 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 명백히 포함되는, 2007년 3월 30일에 출원한 U.S.S.N. 11/694,852에서 개시되는 바와 같이 제조될 수 있다. 키토산 유도체는 또한, 리간드 부분을 포함하는 키토산 유도체를 포함하여 사용될 수 있다.

키토산-핵산 폴리플렉스 조성물

한 측면에서, 본 발명은 수화된 카토산-핵산 폴리플렉스를 포함하는 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물을 제공한다. 조성물은 약 0.5 mg/mL 초과의 핵산 농도를 갖는 키토산-핵산 폴리플렉스 중에서 고도로 농축된다. 조성물에는 폴리플렉스 침전물이 실질적으로 없다. 본원에서 사용된 바와 같이, 폴리플렉스 침전물이 "실질적으로 없다"는 것은 조성물에 시각적 검사 상 관찰될 수 있는 입자가 본질적으로 없다는 것을 의미한다.

바람직한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물은 약 0.6 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 0.75 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1 mg/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 1.2 mg/mL 이상, 및 가장 바람직하게는 약 1.5 mg/mL 이상의 핵산 농도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 조성물에는 비복합화된 (uncomplexed) 핵산이 실질적으로 없다.

바람직한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물은 분산액이다. 바람직한 구현예에서, 분산액은 등장성이다. 등장성을 획득하면서 폴리플렉스 안정성을 유지하는 것은, 약학 조성물을 제형화하는데 있어서 매우 바람직하며, 이들 바람직한 조성물은 약학 제형 및 치료적 적용에 잘 적합화된다.

다른 구현예에서, 조성물은 고장성 또는 열장성일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물은 추가적으로 응집 억제제를 포함한다. 응집 억제제는 폴리플렉스 응집 및/또는 침전을 부분적으로 또는 완전히 감소시키는 제제이며, 농축 수단, 바람직하게는 접선 흐름 여과 ("TFF")의 사용을 통해 농축 키토산-핵산 폴리플렉스를 제공한다. 매우 바람직한 응집 억제제는 수크로오스이지만, 기타 응집 억제제 예컨대 폴리플렉스 침전을 감소시킬 수 있고 농축 키토산-핵산 폴리플렉스를 제공하는 기타 당이 사용될 수 있다. 기타 응집 억제제의 예에는, 비제한적으로, 트레할로오스, 글리세롤, 프룩토오스, 글루코오스 및 기타 환원 및 비-환원 당이 포함된다.

바람직한 구현예에서, 사용되는 응집 억제제는 수크로오스이다. 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액 중 수크로오스의 농도는 바람직하게는 약 3 내지 20 wt%이다. 가장 바람직하게는 수크로오스의 농도는 등장 조성물을 제공한다.

키토산-핵산 폴리플렉스 조성물은 폴리플렉스 크기에 대해 바람직하게는 균질하다. 따라서 바람직한 구현예에서, 조성물의 키토산-핵산 폴리플렉스는 저평균 다분산도 지수 ("PDI")를 갖는다. 특히 바람직한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액은 약 0.5 미만, 보다 바람직하게는 약 0.4 미만, 보다 바람직하게는 약 0.3 미만, 보다 바람직하게는 약 0.2 미만의 PDI를 갖는다.

키토산-핵산 폴리플렉스는 바람직하게는, 조성물 중 실질적으로 크기 안정적이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 실온에서 6시간, 보다 바람직하게는 12시간, 보다 바람직하게는 24시간, 보다 바람직하게는 48시간 동안 100% 미만, 보다 바람직하게는 50% 미만, 보다 바람직하게는 25% 미만으로 평균 직경이 증가하는 폴리플렉스를 포함한다.

키토산-핵산 폴리플렉스는 바람직하게는, 냉각된 조건 하 실질적으로 크기 안정적이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 2~8℃에서 6시간, 보다 바람직하게는 12시간, 보다 바람직하게는 24시간, 보다 바람직하게는 48시간 동안 100% 미만, 보다 바람직하게는 50% 미만, 보다 바람직하게는 25% 미만으로 평균 직경이 증가하는 폴리플렉스를 포함한다.

조성물의 키토산-핵산 폴리플렉스는 바람직하게는, 동결-해동 조건 하 실질적으로 크기 안정적이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 실온에서 6시간, 보다 바람직하게는 12시간, 보다 바람직하게는 24시간, 보다 바람직하게는 48시간 후 -20 내지 -80℃에서의 동결로부터 해동에서 100% 미만, 보다 바람직하게는 50% 미만, 보다 바람직하게는 25% 미만으로 평균 직경이 증가하는 폴리플렉스를 포함한다.

키토산-핵산 폴리플렉스는 핵산 성분 및 키토산 성분을 포함한다. 본 발명의 핵산은 일반적으로는 포스포디에스테르 결합을 함유하지만, 일부 경우에서, 임의의 다양한 목적, 예를 들어 안정성 및 보호를 위해 대안적 주쇄 또는 기타 개질 또는 혼입된 부분을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함된다. 숙고되는 기타 유사체 핵산에는 비-리보오스 주쇄를 갖는 것이 포함된다. 또한, 자연적으로 발생하는 핵산, 유사체 및 둘 모두의 혼합물이 만들어질 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 또는 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열의 일부를 함유할 수 있다. 핵산에는, 비제한적으로, DNA, RNA 및 하이브리드가 포함되는데, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 임의 조합, 및 염기 (우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 자타닌 하이폭사타닌, 이소사이토신, 이소구아닌 등을 포함)의 임의 조합을 함유한다. 핵산은 3중, 2중 또는 단일 가닥, 안티-센스, siRNA, 리보자임, 데옥시리보자임, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 키메라 및 이의 유도체를 포함하는 임의 형태의 DNA, 임의 형태의 RNA를 포함한다.

한 구현예에서, 핵산 성분은 치료적 핵산을 포함한다. 치료적 핵산은 치료적 RNA를 포함하는데, 이는 포유류 세포에서 치료적 효과를 줄 수 있는 RNA 분자이다. 치료적 RNA는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA 및 효소적 RNA를 포함한다. 치료적 핵산은 3중 분자, 단백질 결합 핵산, 리보자임, 데옥시리보자임 및 작은 뉴클레오티드 분자를 형성하도록 의도되는 핵산을 포함한다.

치료적 핵산은 또한, 세포독성 단백질 및 전구약물; 리보자임; 안티센스 또는 이의 보체; 또는 기타 이러한 분자를 포함하는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 핵산 성분은 치료적 핵산 구성물을 포함한다. 치료적 핵산 구성물은 치료적 효과를 줄 수 있는 핵산 구성물이다. 치료적 핵산 구성물은 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 뿐 아니라, 치료적 RNA인 전사물을 생성하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료적 RNA는 포유류 세포에서 치료적 효과를 줄 수 있는 RNA 분자이다. 치료적 RNA는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA 및 효소적 RNA를 포함한다. 치료적 핵산은 3중 분자, 단백질 결합 핵산, 리보자임, 데옥시리보자임 및 작은 뉴클레오티드 분자를 형성하도록 의도되는 핵산을 포함한다. 치료적 핵산은, 결손 유전자에 대한 대체 또는 증강으로서 역할함으로써 유전적 치료요법에 영향을 주거나, 또는 치료적 생성물을 인코딩함으로써 특정 유전자 생성물의 결핍을 보상하는데 사용될 수 있다. 치료적 핵산은 또한 내인성 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 치료적 핵산은 번역 생성물의 전부 또는 일부를 인코딩할 수 있고, 세포 내 이미 존재하는 DNA와 재조합함으로써 유전자의 결손 부분을 대체함에 의해 기능할 수 있다. 이는 또한 단백질의 일부를 인코딩할 수 있고, 유전자 생성물의 공동-억압에 의해 이의 효과를 줄 수 있다. 바람직한 구현예에서, 치료적 핵산은 U.S.S.N. 11/694,852에서 개시된 것들에서 선택된다.

바람직한 구현예에서, 폴리플렉스는 약 500 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 250 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 150 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 100 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 50 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 25 kDa 미만의 평균 중량을 갖는 키토산을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 조성물의 폴리플렉스는 750 nm 미만, 보다 바람직하게는 500 nm 미만, 보다 바람직하게는 약 250 nm 미만, 보다 바람직하게는 약 200 nm 미만, 및 가장 바람직하게는 약 150 nm 미만의 평균 직경을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산 성분은 3 kDa 내지 25O kDa의 평균 분자량을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산 성분은 25O kDa 이상의 평균 분자량을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산 성분은 3 kDa 이하의 평균 분자량을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 약 2:1 내지 약 100:1, 보다 바람직하게는 약 5:1 내지 약 90:1, 보다 바람직하게는 약 10:1 내지 약 90:1의 N:P 비율을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 90:1 이상의 N:P 비율을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 10:1 이하의 N:P 비율을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 pH 5에서 +3O mV 내지 +5O mV의 평균 제타 전위를 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 pH 5에서 +30 mV 이하의 평균 제타 전위를 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 pH 5에서 +5O mV 이상의 평균 제타 전위를 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 225 nm 미만의 평균 직경을 갖는다.

한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 225 nm 이상의 평균 직경을 갖는다.

한 구현예에서, 조성물은 pH 6.5 미만, 보다 바람직하게는 pH 6.0 미만, 및 가장 바람직하게는 pH 약 4.5 내지 약 5.5를 갖는다.

한 구현예에서, 조성물은 pH 6.5 이상을 갖는다.

한 구현예에서, 조성물은 pH 4.5 이하를 갖는다.

한 구현예에서, 폴리플렉스의 키토산 분자는 약 70% 초과, 보다 바람직하게는 약 75% 초과, 보다 바람직하게는 약 80% 초과, 보다 바람직하게는 약 85% 초과, 보다 바람직하게는 약 90% 초과, 보다 바람직하게는 약 95% 초과, 및 가장 바람직하게는 98% 이상의 탈아세틸화 정도를 갖는다.

한 구현예에서, 폴리플렉스의 키토산 분자는 70% 이하의 탈아세틸화 정도를 갖는다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 본질적으로 키토산-핵산 폴리플렉스 및 응집 억제제로 이루어진다. 이러한 조성물은 상대 음이온 및 기타 부형제, 예를 들어 파라벤을 포함할 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 조성물은 본질적으로 키토산-핵산 폴리플렉스로 이루어진다. 이러한 조성물은 상대 음이온 및 기타 부형제, 예를 들어 파라벤을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 구현예에서, 키토산-핵산 폴리플렉스는 U.S.S.N. 11/694,852에서 개시된 것에서 선택된다.

제조 방법

바람직한 구현예에서, 본 발명의 고농도 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물은 키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액을 농축시켜 제조된다.

비-농축된 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물은 바람직하게는 0.5 mg/mL 미만의 핵산 농도를 갖는다.

키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액은 바람직하게는 인라인 혼합에 의해 제조되지만, 기타 방법 예컨대 핵산 또는 키토산 용액을 다른 것에 드립핑 (dripping)하여 혼합 용액을 형성하는 방법이 사용될 수 있다. 그러나, 인라인 혼합은 바람직하게는 0.5 미만, 보다 바람직하게는 약 0.4 미만, 보다 바람직하게는 약 0.3 미만, 보다 바람직하게는 약 0.2 미만의 평균 PDI를 바람직하게 갖는, 큰 부피의 균질 키토산-핵산 폴리플렉스의 제조를 제공한다.

인-라인 혼합은 잘 공지된 방법이며, 이로써 둘 (또는 그 이상)의 유체 스트림이 단일 스트림 내로 함께 도입된다. 인라인 혼합은 하기에서 예시된다. 인라인 혼합에 대한 추가적인 개시에 대해서는, 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 명백히 포함되는 U.S. 6,251,599 및 6,537,813을 참조한다.

정적 혼합기 및 동적 혼합기와 같은 혼합기가 사용될 수 있는 반면, 이러한 장치는 본 방법에 의해 형성된 복합체의 PDI를 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인라인 혼합은 이러한 혼합기를 사용하지 않고 수행된다.

본 발명에서, 접선 흐름 여과 ("TFF")는 키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액을 농축하기 위한 바람직한 수단이다. TFF 작업에서, 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액이 반투과성 막의 표면을 가로질러 펌프되면서, 막을 통한 유체의 일부에 힘이 가해지도록 압력이 막 쪽으로 적용된다. 막 구멍보다 작은 분자는 막 구멍을 통해 이송되고 투과로서 수집된다. 투과 용질에는 비제한적으로, 염, 이온, 당 및 미생물 보존제가 포함된다. 막 구멍을 통과하기에는 지나치게 큰 분자 실재물 (키토산-핵산 폴리플렉스 포함)은, 스트림 내에서 유지되며 농축액 (retentate)으로서 재순환된다. TFF를 사용하여, 폴리플렉스 농도는 많은 배수로 증가할 수 있어, 그 결과 고도로 농축된 폴리플렉스 분산액이 야기된다. 바람직한 구현예에서, 고도로 농축된 폴리플렉스 분산액은 등장성이다.

바람직한 구현예에서, 비-농축된 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액은 당, 바람직하게는 수크로오스를 포함한다. 하기에 기재한 바와 같이, 수크로오스가 농축 공정 동안의 입자의 응집을 방지하는 응집 억제제라는 것이 발견되었다. 추가적으로, 수크로오스는 효과적인 냉동보호제이며, 약 1 mg/mL의 DNA 농도를 가지며 15%까지의 수크로오스를 함유하는 예시적인 동결 폴리플렉스 분산액은 1개월 이상까지 안정하다.

비-농축된 키토산-핵산 폴리플렉스를 농축하기 위한 TFF의 용도가 하기에 예시된다.

공급 원료 부피 조작에 의한 키토산-핵산 폴리플렉스 특성의 변경

놀랍게도, 실질적으로 일정한 키토산:핵산 비율을 유지시키고 키토산 및 핵산의 실질적으로 일정한 혼합 농도를 유지시키면서 핵산 및 키토산을 혼합하여 형성된 키토산-핵산 폴리플렉스의 특성을 조정할 수 있다는 것이 발견되었다. 특히, 키토산 및 핵산 공급 원료 용액의 부피 비율을 변경함으로써, 두 용액을 혼합하여 형성된 생성 폴리플렉스의 특성을 변경할 수 있다는 것이 발견되었다.

따라서 한 측면에서, 본 발명은 키토산 및 핵산 용액을 혼합하여 형성된 키토산-핵산 폴리플렉스의 특성을 조정하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 키토산-핵산 폴리플렉스 직경을 조정하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 키토산-핵산 폴리플렉스 제타 전위를 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 혼합 용액 중 핵산 및 키토산의 농도, 또는 핵산 대 키토산의 비율을 실질적으로 변경하지 않고, 폴리플렉스를 제조하는데 사용되는 키토산 또는 핵산 용액의 부피를 변경하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 키토산 및 핵산 공급 원료 용액의 인라인 혼합을 포함한다.

분말화된 제형

본 발명의 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물에는 분말이 포함된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 건조 분말 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 건조 분말 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물은 본 발명의 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액의 탈수를 통해 제조된다.

사용 방법

치료적 적용에 추가적으로, 본 발명은 핵산의 안정화가 요구되며 증가된 농도의 핵산이 요구 (예를 들어, 증가된 트랜스펙션 효율을 위해) 될 때마다 일반적으로 유용하다. 실험실 설정에서, 핵산의 안정성은 핵산의 구조적 보전성 (integrity) 및 관능성을 절충시키는 절차가 수행될 때마다 중요하다.

약학 제형

본 발명은 또한, 본 발명의 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물을 포함하는 "약학적으로 허용가능한" 또는 "생리학적으로 허용가능한" 제형을 제공한다. 이러한 제형은 실습 치료 방법을 위해 대상에게 생체내 투여될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "생리학적으로 허용가능한"은, 바람직하게는 과다한 부작용 (예를 들어 구역, 복통, 두통 등)을 생성시키지 않고 대상에게 투여될 수 있는 담체, 희석제, 부형제 등을 나타낸다. 이러한 투여용 제제에는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 유액이 포함된다.

약학 제형은 담체, 희석제, 부형제, 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등 (대상으로의 투여와 혼화가능한)으로부터 생성될 수 있다. 이러한 제형은 정제 (코팅 또는 비코팅된), 캡슐 (경질 또는 연질), 마이크로비드, 유액, 분말, 과립, 결정, 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르에 함유될 수 있다. 기타 첨가제 중, 보충 활성 화합물 및 보존제가 또한 존재할 수 있다 (예를 들어 살균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등).

약학 제형은 투여의 의도된 경로와 혼화가능하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어 경구 투여를 위해, 조성물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고 정제, 트로치, 또는 캡슐 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 혼화가능한 결합제 및/또는 보강제 물질이 경구 제형에 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로치 등은 임의의 하기 구성성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 셀룰로오스, 트래거캔스 고무 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 녹말 또는 락토오스, 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔 (Primogel) 또는 옥수수 녹말; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로트 (Sterotes); 활택제 (glidant) 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로오스 또는 사카린; 또는 풍미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 풍미료.

제형은 또한, 신체로부터의 급속한 분해 또는 제거에 대하여 조성물을 보호하기 위한 담체를 포함할 수 있다 (예컨대, 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형). 예를 들어, 시간 지연 물질 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스와 조합하여 사용할 수 있다.

좌약 및 기타 직장 투여가능 제형 (예를 들어 관장에 의해 투여가능한 것들)이 또한 숙고된다. 추가적으로 관련되는 직장 전달에 대해서는, 예를 들어 [Song 등, Mucosal drug delivery: membranes, methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 21:195-256, 2004; Wearley, Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 8:331-394, 1991]을 참조한다.

투여용으로 적정한 추가적인 약학 제형은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법 및 조성물에서 적용가능하다 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; 및 Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993) 참조).

투여

임의 수의 투여 경로가 가능하며, 특정 경로의 선택은 표적 조직에 일부 의존할 것이다. 주사기, 내시경, 투관, 경관 튜브, 카테터 및 기타 물품이 투여에 사용될 수 있다.

대상을 치료하기 위한 용량 또는 "유효량"은 바람직하게는, 장애 또는 병상, 또는 증상의 진전 또는 악화를 방지 또는 억제하는 것이 만족스러운 결과물이지만, 병상의 증상 중 하나, 몇몇, 또는 전부를 측정가능 또는 검출가능한 정도로 향상시키기에 충분한 것이다. 따라서, 표적 조직에서 치료적 핵산을 발현시킴으로써 치료가능한 장애 또는 병상의 경우, 본 발명의 방법에 의해 치료 가능한 병상을 향상시키도록 생성된 치료적 RNA 또는 치료적 단백질의 양은 병상 및 원하는 결과물에 의존할 것이며, 숙련된 전문가에 의해 쉽게 규명될 수 있다. 적정량은 치료되는 병상, 원하는 치료 효과 뿐 아니라 개별 대상 (예를 들어 대상 내 생물학적 이용도, 성별, 연령 등)에 의존할 것이다. 유효량은 관련된 생리학적 효과를 측정하여 규명될 수 있다.

수의학적 적용이 또한 본 발명에 의해 숙고된다. 따라서 한 구현예에서 본 발명은, 본 발명의 키토산계 나노입자를 치료가 필요한 비인간 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 비인간 포유류의 치료 방법을 제공한다.

경구 투여

본 발명의 화합물은 경구 투여될 수 있다. 경구 투여는 삼켜서 화합물이 위장관에 들어가는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 위장관에 직접적으로 투여될 수 있다.

경구 투여에 적합한 제형에는 고체 제형 예컨대 정제, 미립자, 액체 또는 분말 함유 캡슐, 로젠지 (액체가 채워진 것을 포함), 씹는 형태 (chews), 멀티- 및 나노-미립자, 겔, 필름, 배주 (ovule) 및 분무가 포함된다.

액체 제형에는 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르가 포함된다. 액체 제형은 고체를 재형성시켜 제조될 수 있다.

정제 투약 형태는 일반적으로 붕해제를 함유한다. 붕해제의 예에는 나트륨 녹말 글리콜레이트, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 크로스카르멜로오스 나트륨, 크로스포비돈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 저급 알킬-치환된 하이드록시프로필 셀룰로오스, 녹말, 예비젤라틴화된 녹말 및 나트륨 알기네이트가 포함된다. 일반적으로, 붕해제는 1 wt% 내지 25 wt%, 바람직하게는 5 wt% 내지 20 wt%의 투약 형태를 포함할 것이다.

결합제는 일반적으로 정제 제형에 결합성 품질을 부여하는데 사용된다. 적합한 결합제에는 미세결정질 셀룰로오스, 젤라틴, 당, 폴리에틸렌 글리콜, 천연 및 합성 고무, 폴리비닐피롤리돈, 예비젤라틴화된 녹말, 하이드록시프로필 셀룰로오스 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스가 포함된다. 정제는 또한 희석제, 예컨대 락토오스 (일수화물, 분무 건조된 일수화물, 무수 등), 만니톨, 자일리톨, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 미세결정질 셀룰로오스, 녹말 및 이염기성 칼슘 포스페이트 이수화물을 함유할 수 있다.

정제는 또한 표면 활성제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트 및 폴리소르베이트 80, 및 활택제 예컨대 이산화규소 및 탈크를 임의 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 표면 활성제는 0.2 wt% 내지 5 wt%의 정제를 포함할 수 있고, 활택제는 0.2 wt% 내지 1 wt%의 정제를 포함할 수 있다.

정제는 또한 일반적으로 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 및 마그네슘 스테아레이트와 나트륨 라우릴 설페이트와의 혼합물을 함유한다. 윤활제는 일반적으로 0.25 wt% 내지 10 wt%, 바람직하게는 0.5 wt% 내지 3 wt%의 정제를 포함한다.

기타 가능한 구성성분에는 항산화제, 착색제, 풍미제, 보존제 및 미각 차폐제 (taste-masking agent)가 포함된다.

정제 배합물을 직접적으로 또는 롤러에 의해 압축하여 정제를 형성시킬 수 있다. 정제 배합물 또는 배합물의 일부는 대안적으로는 정제화 전에 젖은-, 건조- 또는 용융-과립화, 용융 응결, 또는 압출될 수 있다. 최종 제형은 하나 이상의 층을 포함할 수 있고, 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있으며; 이는 캡슐화될 수 있다.

정제의 제형은 [Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1 , by H. Lieberman 및 L. Lachman (Marcel Dekker, New York, 1980)]에서 토의된다.

인간 또는 수의적 사용을 위한 소모가능한 경구 필름은 전형적으로는 유연한 (pliable) 수용성 또는 수팽윤성 얇은 필름 투약 형태이며, 이는 빠르게 용해되거나 또는 점막점착성일 수 있고, 전형적으로는 필름-형성 중합체, 결합제, 용매, 습윤제 (humectant), 가소제, 안정화제 또는 유화제, 점도-개질제 및 용매를 포함한다. 제형의 일부 성분은 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 다중입자 비드가 본 발명에 포함된다.

기타 가능한 구성성분에는 항산화제, 착색제, 풍미료 및 풍미 증강제, 보존제, 타액 자극제, 냉각제, 조-용매 (오일 포함), 에몰리언트, 벌크제, 항거품제, 계면활성제 및 미각 차폐제가 포함된다.

본 발명에 따른 필름은 전형적으로는, 박리가능한 뒷받침 지지체 또는 종이 상에 코팅된 얇은 수성 필름의 증발성 건조에 의해 제조된다. 이는 건조 오븐 또는 터널, 전형적으로는 조합된 코팅기 건조기에서, 또는 동결 건조 또는 진공화에 의해 수행될 수 있다.

경구 투여용 고체 제형은 즉시 및/또는 개질 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 개질 방출 제형에는 지연-, 지속-, 파동-, 조절-, 표적 및 프로그래밍된 방출이 포함된다.

기타 적합한 방출 기술 예컨대 고 에너지 분산액 및 삼투, 및 코팅된 입자가 공지된다.

비경구 투여

본 발명의 화합물은 또한 혈류, 근육, 또는 내부 기관 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여용 적합한 수단에는 정맥내, 동맥내, 복강내, 외피내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개골내, 근육내 및 피하가 포함된다. 비경구 투여용 적합한 장치에는 바늘 (미세바늘 포함) 주사기 (injector), 무-바늘 주사기 및 주입 기술이 포함된다.

비경구 제형은 전형적으로는 부형제 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제를 함유할 수 있는 수용액이지만, 일부 적용에서, 이는 보다 적합하게는 적합한 비히클 예컨대 멸균, 무-발열원수와 함께 사용될 건조 형태 또는 멸균 비수용액으로서 제형화될 수 있다.

예를 들어 동결건조에 의한, 멸균 조건 하 비경구 제형의 제조는, 당업자에게 잘 공지된 표준 약학 기술을 사용하여 쉽게 성취될 수 있다.

비경구 용액의 제조에서 사용되는 화합물의 용해성은, 적정한 제형 기술 예컨대 용해성-증강제의 혼입의 사용에 의해 증가될 수 있다.

비경구 투여용 제형은 즉시 및/또는 개질 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 개질 방출 제형에는 지연-, 지속-, 파동-, 조절-, 표적 및 프로그래밍된 방출이 포함된다. 따라서 본 발명의 화합물은 활성 화합물의 개질 방출을 제공하는 이식된 저장소로서 투여용 고체, 반고체, 또는 요변성 액체로서 제형화될 수 있다.

국소 투여

본 발명의 화합물은 또한 피부 또는 점막에 국소적으로, 즉 진피적 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위한 전형적인 제형에는 겔, 하이드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 땀띠분 (dusting powder), 드레싱, 거품, 필름, 피부 패치, 웨이퍼, 임플란트, 스폰지, 섬유, 붕대 및 미세유액이 포함된다.

국소 투여의 기타 수단에는 전기 천공, 이온 도입 (iontophoresis), 음파영동 (phonophoresis), 초음파 치료 (sonophoresis) 및 미세바늘 또는 무-바늘 (예를 들어 Powderject™, Bioject™ 등) 주사에 의한 전달이 포함된다.

국소 투여용 제형은 즉시 및/또는 개질 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 개질 방출 제형에는 지연-, 지속-, 파동-, 조절-, 표적 및 프로그래밍된 방출이 포함된다.

흡입/ 비강내 투여

본 발명의 화합물은 또한, 적합한 추진체를 사용하거나 또는 사용하지 않고, 건조 분말 흡입기로부터의 전형적으로 건조 분말의 형태 (단독으로, 예를 들어 락토오스와의 건조 배합물 중 혼합물로서, 또는 혼합된 성분 입자로서)로, 또는 가압 용기, 펌프, 분무, 무화기 (atomiser) 또는 네뷸라이저 (nebuliser)로부터 연무질 분무로서, 비강내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.

흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐, 발포고 (blister) 및 카트리지는 본 발명의 화합물의 분말 혼합물, 적합한 분말 베이스 예컨대 락토오스 또는 녹말, 및 성능 개질제 예컨대 l-류신, 만니톨 또는 마그네슘 스테아레이트를 함유하도록 제형화될 수 있다.

흡입/비강내 투여용 제형은 즉시 및/또는 개질 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 개질 방출 제형에는 지연-, 지속-, 파동-, 조절-, 표적 및 프로그래밍된 방출이 포함된다.

직장/ 질내 투여

본 발명의 화합물은 예를 들어 좌약, 질좌약 또는 관장제의 형태로 직장 또는 질내 투여될 수 있다. 코코아 버터가 전형적인 좌약 베이스이지만, 다양한 대체물이 적정하게 사용될 수 있다.

직장/질내 투여용 제형은 즉시 및/또는 개질 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 개질 방출 제형에는 지연-, 지속-, 파동-, 조절-, 표적 및 프로그래밍된 방출이 포함된다.

안구/ 이과적 ( aural ) 투여

본 발명의 화합물은 또한, 전형적으로 액적의 형태로 눈 또는 귀에 직접적으로 투여될 수 있다. 안구 및 이과적 투여를 위해 적합한 기타 제형에는 연고, 생물 분해성 (예를 들어 흡수가능 겔 스폰지, 콜라겐) 및 비-생물 분해성 (예를 들어 실리콘) 임플란트, 웨이퍼, 렌즈 및 미립자 시스템이 포함된다. 제형은 또한 이온 도입에 의해 전달될 수 있다.

안과/이과적 투여용 제형은 즉시 및/또는 개질 방출이 되도록 제형화될 수 있다. 개질 방출 제형에는 지연-, 지속-, 파동-, 조절-, 표적 또는 프로그래밍된 방출이 포함된다.

도 1. 1 L 뱃치 (batch)의 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액 제조 후 TFF 농축에 대한 전형적인 공정 블럭의 도식적 그림을 나타낸다.
도 2. 소규모 인라인 혼합 공정의 도식적 그림. 주사기는 폴리프로필렌 무-라텍스이고 각각 60 mL까지 측정될 수 있다. 두 정밀 주사기 펌프가 주사기를 운전한다. 배관은 1/16-인치 ID 백금-경화된 실리콘이다. 나타낸 혼합 접합은 Y이지만, 또한 T일 수 있다. 구성물의 혼합 접합 물질은 폴리프로필렌이다.
도 3. 10 L 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액의 제조를 위한 중간 규모 인-라인 혼합 공정의 도식적 그림. 모든 용기는 더 작은 뱃치 크기에 따라 측정된다. 배관 직경은 0.48 cm (3/16-인치)이다. 펌프 유속을 2:1 DNA:키토산 부피 혼합 비율에 대해 나타낸다.
도 4. TFF 농축 공정의 도식적 그림.
도 5. 중간 규모 공정에 의해 생성되고 상이한 속도에서 혼합된 폴리플렉스에 대한 시험관내 트랜스펙션 결과의 그래프.
도 6. 10% 수크로오스와의 소규모 혼합 및 빠른 TFF에 의해 제조된 폴리플렉스에 대한 실온에서의 안정성의 그래프.
도 7. 폴리플렉스 직경 및 PDI 상에서의 DNA 및 키토산의 공급 원료 부피 변경의 효과를 나타내는 그래프. 부피 비율의 조절은 입자 크기를 조절한다. 조성물은 표 10에 기재된다. 모든 최종 생성물은 N40-c75였다.

실험

실시예 1: 250 μg/ mL 까지의 폴리플렉스 제조 후 >1 mg / mL 로의 농축.

도 1 및 시약, 농도 및 비율의 예시적 설명에 대한 하기 설명을 참조한다.

단순 소규모 인-라인 혼합 기구를, 주사기 펌프 및 고속 연동 펌프, 실리콘 배관 및 폴리프로필렌 T-접합을 사용하여 시험하였다. 상기 방법을, 23 mer/98% DDA 키토산 (즉, 평균 23개 단량체 (글루코사민), 및 98% 탈아세틸화를 갖는 키토산 중합체)을 사용하여 N/P 비율 20에서 250 μg/mL 이하의 최종 DNA 농도를 갖는 폴리플렉스를 제조하는데 사용하였다. 결과는, DNA 및 키토산 용액의 공급 원료 농도, 부피 혼합 비율 및 유속을 조절함으로써 폴리플렉스의 PDI 및 입자 크기가 엄격히 조절될 수 있었다는 것을 나타내었다. 또한, DNA 및 키토산 공급 원료 중 수크로오스의 혼입이, 입자 크기 및 PDI를 감소시킴으로써 제작 공정 (fabrication process)을 보조하였다는 것이 발견되었다. 수크로오스의 포함은 또한 농축 공정 동안 입자의 응집을 방지하였다. 약 1 mg/mL의 DNA 농도 및 15% 이하의 수크로오스를 함유하는 동결 폴리플렉스는 1개월 이상까지 안정하였다. 추가적으로, 인-라인 혼합 공정은 낮은 상대 표준 편차 (RSD) 값으로 50 mL에서 2 L까지 쉽게 측정되었다: 입자 크기 = ±9%, PDI = ±6%.

폴리플렉스 명칭 규약 ( Naming Convention )

용어는 키토산의 유형, N/P 비율, 아세트산 함량, pH 및 DNA 농도를 나타낸다. 상세한 설명을 갖는 예를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1: 폴리플렉스 제형 명칭 규약 예]

인-라인 혼합 공정 흐름

1 L 뱃치 제조 후 TFF 농축에 대한 전형적인 공정 블럭을 도 1에 나타내었다.

소규모 인 -라인 혼합

단순 소규모 인-라인 혼합 기구를, 주사기 펌프, 1/16-인치 ID 실리콘 배관; 및 T 배열의 3/32-인치 ID 폴리프로필렌 접합을 사용하여 시험하였다. 3 mL 용량 주사기를 갖는 장치 (set-up)의 도식을 도 2에 나타내었다. 상기 장치용 최대 주사기 부피가 60 mL라는 것에 주목한다. 상기 공정은, 24 mer/98% DDA 키토산을 사용하여 NP 비율 20에서 150 μg/mL의 최종 DNA 농도를 갖는 폴리플렉스를 제조하는데 사용되었다. DNA 및 키토산 공급 원료를 2:1의 부피 비율에서 혼합하여 균일한 폴리플렉스 제형을 제조하였다.

중간 규모 인 -라인 혼합

단순 중간 규모 인-라인 혼합 기구를, 연동 펌프, 3/16-인치 ID 실리콘 배관; 및 3/16-인치 ID 폴리프로필렌 접합을 사용하여 시험하였다. Y-접합을 갖는 장치의 도식을 도 3에 나타내었다. 상기 장치용 최대 배출 부피가 공급 원료 관의 부피에 의해서만 제한된다는 것에 주목한다. 상기 공정은, 24 mer/98% DDA 키토산을 사용하여 NP 비율 20에서 150 μg/mL의 최종 DNA 농도를 갖는 폴리플렉스를 제조하는데 사용되었다. DNA 및 키토산 공급 원료를 2:1의 부피 비율에서 혼합하여 균일한 폴리플렉스 제형을 제조하였다.

TFF 공정

TFF 연구를 실행하기 전에, 제조사의 지시 사항에 따라 속이 빈 섬유 필터를 헹구고 세정하였다. 농축을 실행하기 위해, TFF 시스템을 도식적 그림 (도 4)에서 나타낸 바와 같이 설정하고 잔류 물로 퍼징하였다. 투과 밸브를 잠그고 후압 밸브를 완전히 열은 후, DNA-키토산 폴리플렉스를 생성물 저장소에 첨가하였다. 펌프의 스위치를 켜고 투과 밸브를 완전히 연 후 후압 밸브를 표적 필터 후미 (inlet) 압력으로 조정하여 농축을 시작하였다. 농축 공정 동안, 수집된 투과물 덩어리를 균형에 대해 모니터링하였고, 표적 DNA 농도가 달성되는 때를 측정하는데 사용하였다. 하기 등식을 참조한다:

[DNA]_농축액 = [DNA]_초기 x 덩어리_초기 ÷ (덩어리_초기 - 덩어리_투과)

표적 부피 감소가 이루어진 후, 투과 밸브를 잠그고 후압 밸브를 완전히 열어 농축 공정을 중단하였다. 농축액 (retentate) 유체선을 퍼징하고 최종 생성물을 수집한 후, 이러한 TFF 후 (post-TFF) 생성물의 샘플을 PicoGreen 검정에 의한 DNA 농축 및 분석 시험을 위해 기탁하였다. 잔류물을 분석 시험이 완료될 때까지 4℃에서 보관한 후, 즉시 사용하거나 또는 보관을 위해 동결하였다.

분석 시험

입자 정립 ( sizing )

Zetasizer Nano 광 산란 계기를 사용하여 입자 크기를 측정하였다. 일반적으로, 샘플을 희석하지 않거나 또는 10 mM NaCl (최소 0.4 mL)에서 20배 희석하고, 일회용 큐벳에 로딩하였다. 3반복으로 3분 측정하기 전에 25℃에서 3분 동안 샘플이 인큐베이션되도록 Zetasizer를 프로그래밍하였다. Z-평균 직경 및 다분산도 (PDI)를, 표준 편차 (n=3)와 함께 보고하였다. 또한 점도 및 굴절률에 대해 샘플의 조성이 설명되도록 Zetasizer를 프로그래밍하였다.

제타 전위

Zetasizer Nano 광 산란 계기를 사용하여 제타 전위를 측정하였다. 일반적으로, 희석하지 않은 샘플을 Zetasizer 접힌 모세관 세포 (최소 0.8 mL) 내에 로딩하였다. 반복 측정 (반복 수는 Zetasizer 소프트웨어에 의해 자동으로 결정됨) 전에 25℃에서 3분 동안 샘플이 인큐베이션되도록 Zetasizer를 프로그래밍하였다. 제타 전위 값을, 표준 편차 (n=3)와 함께 보고하였다. 또한 점도 및 굴절률에 대해 샘플의 최종 조성이 설명되도록 Zetasizer를 프로그래밍하였다.

동결에 의한 단기간 안정성

단기간 안정성 연구를 위해, 최종 폴리플렉스 생성물을 동결하고 적정한 온도 (-20℃, -30℃ 또는 -80℃)에서 보관하였다. 일부 경우에서, 샘플을 드라이 아이스/에탄올 수조에서 급속히 동결시킨 후, 적정한 온도에서 보관하였다. 적정한 시간에서, 샘플을 실온으로 해동시키고 기재된 바와 같이 분석하였다.

PicoGreen 으로의 DNA 정량화

PicoGreen 검정을 사용하여 DNA를 측정하기 전에, 키토사나아제에 의해 폴리플렉스로부터 총 DNA가 방출되어야만 한다. 방출 후, DNA를 적합한 제한 효소로 DNA 소화시켜 초나선 DNA 플라스미드를 선형화시켰다.

키토사나아제 소화

DNA의 완전한 방출을 확인하기 위해, 폴리플렉스를 37℃에서 150 mM NaOAc, pH 5.5 중 50 μl로 최초 희석하여 0.909~1.818 mM 키토산의 농도를 얻었다 (C(24,98)-N20-c1000 입자에 대해서, 샘플을 전형적으로 1/70 및 1/35로 희석하여 표적하는 키토산 농도를 얻었음). 50 μl의 희석된 폴리플렉스를 50 μl의 4.44 U/mL 키토사나아제로 37℃에서 2시간 동안 소화시켰다 (저장 키토사나아제 농도는 62 U/mL이고, 차가운 5O mM NaOAc, pH 5.5로 37℃에서 희석되었음).

EcoR1 소화

인큐베이션 후, *χ μL의 키토사나아제-소화된 샘플을 5 μL의 EcoR1 및 5 μL의 EcoR1 완충액에 첨가하고, MilliQ 물로 최종 부피 50 μL가 되게 하였다 (샘플 부피 χ μL가 조정되어 최종 DNA 농도가 4 ng/μL이었음. 전형적으로 C(24,98)-N20-c1000 입자 샘플에 대해, 샘플 부피 χ는 25 μL임). EcoR1 샘플을 이후 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

PicoGreen 검정

PicoGreen Quant-iT ds DNA HS 검정 키트가 두 가지 완충액 (A 및 B) 및 두 가지 표준 (1 및 2)과 함께 공급되었다. 완충액 A를 완충액 B에 1:20 희석하여 용액 "A/B"를 제조하였다. 표준 1 및 2를 용액 A/B로 20배 희석하였다 (10 μL를 200 μL로). 표준 1 및 2에 대한 최종 농도는 각각 0 및 10 ng/μL였다.

10 내지 20 μL의 EcoR1 소화된 샘플을 용액 A/B로 최종 부피 200 μL가 되게 하여 짧게 볼텍싱하고, 실온에서 2분 동안 인큐베이션한 후 제조사 지시 사항에 따라 Qubit 형광측정계 상에서 형광을 측정하였다.

겔 전기영동

폴리플렉스 내로의 DNA 포획물을 확인하기 위해, 샘플을 겔 전기영동하였다. 1~5 μL의 샘플 분취액 (800 ng DNA 표적)을 2 μL의 Tracklt 로딩 완충액과 조합하여, 물로 최종 부피 10 μL가 되게 하였다. 표준 렌즈에 초나선 DNA 사다리를 로딩하였다. 에티디움 브로마이드 (50 μg/mL)를 함유하는 0.8% 아가로오스 겔 상에서, 120 V에서 45분 동안 샘플을 분석하였다. 상기 겔을 FluorChem 영상화 시스템으로 영상화하였다.

시험관내 트랜스펙션

일반적으로, 293T-K 세포의 폴리플렉스 제형으로의 시험관내 트랜스펙션은 두 단계에서 수행되었다: 세포의 제조 후 트랜스펙션.

293T-K 세포의 유지

293T-K 세포주는 UBC에서의 Kieffer 박사의 실험실에서 승낙된 것이며, 하기와 같이 생성되었다. 인간 신장 세포를 SV40 T-항원으로 형질전환시키고; 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 높은 글루코오스 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM)에서 성장시키고; 80% 이하의 합류 (confluency)를 유지시켰다.

트랜스펙션용 세포의 제조

트랜스펙션을 위해 하기와 같이 세포를 제조하였다. 트랜스펙션 하기 전날에, 293T-K 세포를 3 mL의 완전 배지 (높은 글루코오스 DMEM + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신) 중에서 6-웰 조직 배양 플레이트에 첨가하였다 (3 x 10⁵ 세포/웰). 트랜스펙션한 날에, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세포를 세척하고, 1 mL의 0.05% 트립신으로 세포를 트립신화시키고, 1 mL의 완전 배지를 첨가하고 혈구 계산기를 사용하여 10 μl를 계수함으로써, 두 개의 선택된 웰에 대해 세포 수를 측정하였다. 세포가 ~50% 합류인 경우 (~7 x 10⁵ 세포/웰), 이후 트랜스펙션을 진행하였다 (세포가 희박하거나 또는 지나치게 합류인 경우, 이후 트랜스펙션을 진행하지 않았음).

세포의 트랜스펙션

하기와 같이 트랜스펙션을 실행하였다. 우선, 각각의 웰로부터 배지를 제거한 후 1 mL Opti-mem (HCl로 pH 5.0으로 조정되고 0.2 um 필터로 여과된)을 각각의 웰에 첨가하고, 부드럽게 휘저은 후 제거하였다 (6개 웰을 한 번에 세척하여 세포가 손실되는 것을 방지하였음). 이후 또 다른 1 mL의 Opti-mem (pH 5.0)을, 세포가 손실되지 않도록 각각의 웰에 주의 깊게 첨가하였다. 다음으로, 폴리플렉스 샘플을 각각의 웰에 첨가 (2 μg DNA 표적)하고, 휘젓고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고 2 mL의 완전 배지로 교체하고 37℃에서 다시 인큐베이션하였다. 필요한 시간 지점에서, 상청액을 제거하고 후속 SEAP 검정을 위해 -20℃에서 보관하였다.

SEAP 검정

SEAP 화학발광 검정 키트를 사용하여 SEAP 검정을 수행하였다. 검정을 위한 모든 시약을, 사용하기 전에 25℃에서 30분간 평형화시켰다. 태반 알칼리 포스파타아제를, 0.1% 소 혈청 알부민 및 50% 글리세롤로 스파이킹된 키트로부터의 1X 희석 완충액 중에서 1 mg/mL로 용해한 후 DMEM로, 0.01 pg/uL로 10배 연속 희석하여 검정용 표준을 제조하였다. 표준 및 해동된 샘플을 이후 희석 완충액으로 1/4로 희석하고, 65℃에서 30분 동안 열 불활성화시키고, 얼음에서 2분 동안 인큐베이션하고, 원심분리 (실온에서 2분 동안 16100 x rcf)하고, 상청액을 새로운 튜브에 옮겼다. 25℃에서 5분 동안 평형화시킨 후, 50 μL의 샘플 및 표준을 Microlite-1 플레이트의 각각의 웰에 2반복으로 첨가하였다. 이후 불활성 완충액 (50 μL)을 각각의 웰에 첨가하고 기포가 생기지 않도록 부드럽게 상하 피펫팅하여 혼합하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 기질 대 증강제의 1:19 비율로 5분 인큐베이션하는 동안 기질/증강제 시약을 제조하였다. 이후 기질/증강제를 각각의 웰에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션한 후, 발광측정계에서 1초의 통합 시간 (integration time)으로 상기 플레이트를 판독하였다.

결과

C(23,98)- N40 - c75 + TFF 의 고속 인 -라인 혼합

90, 210, 270 및 420 mL/분의 가변적인 유속에서 중간 규모 인라인 혼합 시스템을 사용하여 폴리플렉스를 제조하였다. 이러한 혼합 시스템은 또한 장치의 효용을 평가하기 위해 인-라인 정적 혼합 장치를 사용하였다. 이러한 시스템은 또한 임의의 부형제를 함유하지 않았다. 이 연구에서, 폴리플렉스의 출발 DNA 농도는 0.075 mg/mL이었고 이후 TFF에 의해 0.25 mg/mL로 농축되었다.

주어진 유속에서 용액의 최적 혼합이 달성되도록 하는데 필요한 요소의 최소 수를 결정하는, 인-라인 정적 혼합 장치에 대해 계산된 레이놀드 수 (Reynolds number)를 기준으로 유속을 선택하였다 (표 2). 하기 등식은 제조사의 지시 사항을 기준으로 한다.

[표 2 : 인-라인 정적 혼합 장치에 대해 계산된 레이놀드 수]

표 3은 혼합의 최종 유속의 증가가 Z-평균 입자 크기 및 PDI의 증가를 야기한다는 것을 나타낸다. TFF에 의한 농축은 입자 크기, PDI, 제타 전위, 점도 (표 3) 또는 시험관내 트랜스펙션 (도 5)에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았다.

[표 3: 상이한 속도에서 혼합된 중간 규모 폴리플렉스의 크기, PDI 및 제타 전위]

인-라인 혼합 및 TFF 침전

1 mg/mL 이상의 DNA 농도를 달성하기 위해, 폴리플렉스를 0.15 mg/mL DNA에서 혼합한 후 1 mg/mL로 TFF 하는 것을 탐색하였다. 그러나 이들 연구 동안, 농축 단계 후 유의한 침전이 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않았음). 이는 소규모 혼합 (3 mL/분 및 23 mL/분) 및 중간 규모 혼합 공정 (210 mL/분 및 420 mL/분)에서 발생하였다.

침전을 방지하기 위한, 폴리플렉스 형성 동안 수크로오스의 포함

TFF 동안의 침전 문제를 바로잡기 위해, 폴리플렉스가 형성되도록 혼합하기 전, 키토산 및 DNA 공급 원료 모두에 모든 부형제 (~10 wt% 수크로오스, 0.09 wt% 메틸 파라벤, 0.01 wt% 프로필 파라벤)을 포함시켰다. 정적 혼합 장치는 사용하지 않았다. 부형제의 포함이 TFF 농축 공정 동안의 입자 응집 및 침전을 방지하였다는 것을 발견하였다. 추가적으로, 정적 혼합 장치가 포함되지 않은 경우 PDI 및 입자 안정성이 개선되었다는 것을 발견하였다.

업데이트된 공정을 갖는 소규모 뱃치

혼합하기 전 DNA 및 키토산 공급 원료 중 10% 수크로오스를 사용하여 소규모 뱃치를 제조하고, 90 mL/분의 재순환 속도 (7200 s^-1의 전단 속도)를 사용하여 TFF 농축하였다. TFF 후, 입자 크기는 침전물 없이 200 nm 미만이었다. 입자 크기를 하기 표 4에 요약하였다.

[표 4]

실온에서 18시간 후, 크기는 약 140 nm로 정체되었고 실온에서 3일 후 침전이 관찰되지 않았다 (도 6). 또한, TFF 후 샘플은 -20℃ 또는 -8O℃에서 동결/해동 후 침전이 없었다. 실온에서 24시간 후, 해동된 입자는 -20℃ 및 -80℃에서 각각 약 160 및 150 nm로 정체되었다 (표 5). 또한, 시험관내 트랜스펙션 검정은 뱃치가 생물학적 효능을 갖는다는 것을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않았음).

[표 5: 10% 수크로오스와의 소규모 혼합 및 빠른 TFF: 동결-해동]

업데이트된 공정을 갖는 중간 규모 뱃치

상기 기재된 모든 공정 변화를 사용하여 확실한 중간 규모 뱃치를 제조하였다: 수크로오스 용액과 혼합하기 전 DNA 저장액을 여과; 혼합하기 전 DNA 및 키토산 공급 원료 중 10% 수크로오스 포함, 및 90 mL/분의 재순환 속도 (7200 s^-1의 전단 속도)를 사용하여 TFF 농축. 또한, 수크로오스 및 파라벤 부형제가 제외된 대조군 뱃치를 제조하였다.

비-부형제 (대조군) 뱃치에서, TFF 도중 및 이후에 침전이 쉽게 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않았음). 그러나, 부형제 뱃치 (표 6)에서, DNA 농도가 약 1.5 mg/mL를 초과할 때까지 침전은 관찰되지 않았다.

[표 6: 부형제를 포함하는 폴리플렉스 뱃치의 매개 변수]

중간 규모 0.8 L 논증 뱃치

인-라인 혼합 공정 및 TFF의 측정 가능성을 0.8 L 뱃치 크기에 대해 시험하였다. 폴리플렉스를 0.8 L의 부피로 혼합한 후, TFF에 의해 1.1 mg/mL로 농축하였다. 이 연구에는 혼합 공정의 시작, 중간 및 끝에서 혼합 폴리플렉스의 다수의 5 mL 분취액을 취함에 의한 혼합 공정의 동질성 시험이 포함된다. TFF 공정은 850 cm² 카트리지를 사용하였고 (반면 이전의 소규모 TFF 연구는 73 cm² 카트리지를 사용하였음), 바이알에 넣고 -30℃에서 동결시키기 전에 4℃에서 농축된 생성물의 홀딩 시간을 시험하는 것을 포함하였다.

인-라인 혼합 공정의 동질성 시험

혼합 공정 동안 동질성이 측정되도록 혼합 공정의 최초, 중간 및 최종 25 mL에서 다수의 0.5 mL 샘플을 수집하였다. 상기 결과는 최초 혼합 샘플이 약 120 nm에서 출발한 후, 15 mL의 혼합 후 80 nm로 안정화되었다는 것을 나타내었다.

[표 7. 중간 규모 인-라인 혼합의 동질성]

모든 샘플을 -30℃에서 미리 동결, 해동시킨 후 분석하였다. "B"는 1에서 5의 순서로 혼합 공정의 시작 (최초 25 mL)으로부터의 5 mL 샘플을 나타낸다. "M"은 1에서 5의 순서로 혼합 공정의 중간 (약 400 mL에서 출발)으로부터의 5 mL 샘플을 나타낸다. "E"는 1에서 5의 순서로 혼합 공정의 끝 (약 750 mL에서 시작)에서의 5 mL 샘플을 나타낸다.

최종 TFF 생성물에 대한 홀딩 시간 시험

TFF 공정이 완료된 후, 최종 TFF 생성물을 9 x 1O mL 분취액 (2O mL 갈색 (amber) 유리 바이알 중) 내에 분배하고 밀봉하였다. 이후, 전형적인 제조 홀딩 조건을 모방하기 위해 상기 바이알에 다양한 홀딩 시간을 가하였다:

해동된 생성물의 결과는 4℃에서 24시간의 홀딩 시간에 걸쳐 생성물의 양호한 안정성을 나타내었다 (표 8). 또한, "4℃에서 4시간 후 -30℃" 샘플에 대한 7시간에 걸친 해동 후 안정성은 출발 물질과 비교하여 10% 미만의 증가를 갖는 입자 안정성을 나타내었다.

[표 8]

모든 샘플을 미리 -30℃에서 동결, 해동시킨 후 분석하였다.

중간 규모 2 L 엔지니어링 런 ( Engineering Run )

인-라인 혼합 공정 및 TFF의 측정 가능성을 2 L 뱃치 크기에 대해 시험하였다. 폴리플렉스를 2 L 부피로 혼합한 후, TFF에 의해 1.1 mg/mL로 농축하였다. 이 연구에는 혼합 공정의 시작 (25 mL 폐기), 중간 및 끝에서 혼합 폴리플렉스의 다수의 5 mL 분취액을 취함에 의한 혼합 공정의 동질성 반복 시험이 포함된다. TFF 공정은 850 cm² 카트리지를 사용하였고, 바이알에 넣고 -30℃에서 동결시키기 전에 4℃에서 최종 농축된 생성물을 하룻밤 동안 홀딩하는 것을 포함하였다.

일반적으로, 폴리플렉스의 물리적 특성은 예기된 범위 및 한계 내에 잘 존재하였다 (표 9).

[표 9]

모든 샘플은 새로운 것이거나 또는 미리 30℃ (나타낸 바와 같음)에서 동결, 해동시킨 후 분석되었다.

부형제를 갖는 인-라인 혼합의 측정 가능성

하기는 두 가지 상이한 규모 및 네 가지 뱃치 부피에서의 인-라인 혼합에 의해 제조된 폴리플렉스 뱃치의 물리적 특성의 요약이다 (표 10). 모든 뱃치는 C(24,98)-N20-c150-pH4.8-Suc15%-PbnO.1% 였다. 혼합 비율은 2:1 DNA:키토산이었다. 소규모 및 중간 규모 혼합에 대한 총 흐름은 각각 23.3 mL/분 및 210 mL/분이었다 (이들 속도에서, 두 가지 혼합 규모에 대한 배관을 통한 선형 유속은 동등하였음).

[표 10. 측정된 혼합 뱃치의 물리적 특성]

겔 전기영동에 의한 DNA 포획물 시험

모든 DNA가 키토산에 의해 포획되었는지를 측정하기 위해, 여러 폴리플렉스 제형을 자유 DNA의 존재에 대해 시험하였다. 전부, 어떠한 시험 제형에서도 자유 DNA가 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않았음).

폴리플렉스의 시험관내 트랜스펙션

드립 (drip)법 (예를 들어 U.S.S.N. 11/694,852)에 의해 제조된 폴리플렉스 대 인-라인 혼합에 의해 제조된 폴리플렉스를 비교하기 위해 두 개 제형에 대해 시험관내 트랜스펙션을 실행하였다. 인-라인 혼합법의 평균 트랜스펙션 효율은 드립법보다 약 11% 초과였다.

최종 폴리플렉스 제형은 C(23,98)-N40-Ac10.5-pH4.8-c75 였다. 인-라인 혼합 뱃치에 대해, DNA:키토산의 부피 혼합 비율은 2:1이고, 배출 유속은 3 mL/분이었다.

폴리플렉스 크기 및 PDI 를 변경시키는 가변적 공급 원료 부피

본원에 기재된 방법을 사용하여 하기 표 11에 따라 조성물을 제조하였다.

[표 11]

제제의 입자 크기 및 PDI를 본원에 기재된 바와 같이 분석하였다. 결과를 도 7에 나타내었고, 키토산 및 DNA의 혼합 비율을 실질적으로 유지시키고 키토산 및 DNA의 혼합 농도를 실질적으로 유지시키면서 공급 원료 부피를 변경시킴으로써, 입자 크기가 조절될 수 있다는 것을 확립하였다.

모든 인용은 그 전문이 본원에 참고 문헌으로 명백히 포함된다.

Claims

수화된 키토산-핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물로서, 0.5 mg/mL 이상의 핵산 농도를 갖는 조성물.
제 1 항에 있어서, 폴리플렉스 침전물이 실질적으로 없는 조성물.
제 1 항에 있어서, 0.75 mg/mL 초과의 핵산 농도를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 1.0 mg/mL 초과의 핵산 농도를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 1.2 mg/mL 초과의 핵산 농도를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 1.5 mg/mL 초과의 핵산 농도를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 응집 억제제를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 약 8O mM 미만의 상대 음이온 농도를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리플렉스가 750 nm 미만의 평균 직경을 갖는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리플렉스가 2:1 이상의 N:P 비율을 갖는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리플렉스가 500 kDa 미만의 평균 분자량을 갖는 키토산 분자를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리플렉스가 3000개 미만의 글루코사민 단량체 단위를 갖는 키토산 분자를 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 수화된 키토산-핵산 폴리플렉스 및 응집 억제제로 본질적으로 이루어지는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 키토산-핵산 폴리플렉스가 0.5 미만의 평균 다분산도 지수를 갖는 조성물.
제 1 항에 있어서, 등장성인 조성물.
키토산-핵산 폴리플렉스를 농축하는 방법으로서, 키토산-핵산 폴리플렉스의 비-농축된 분산액을 제공하고, 키토산-핵산 폴리플렉스의 농축된 분산액이 형성되도록 농축 수단을 사용하여 키토산-핵산 폴리플렉스의 상기 비-농축된 분산액을 농축하는 것을 포함하며, 여기서 상기 조성물이 0.5 mg/mL 이상의 핵산 농도를 가지고, 조성물에 폴리플렉스 침전물이 실질적으로 없는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 비-농축된 분산액이 본래 농도에서 응집 억제제를 포함하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 농축 단계가 상기 농축된 분산액 중 상기 응집 억제제의 상기 본래 농도를 실질적으로 유지하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 농축 수단이 접선 흐름 여과 (tangential flow filtration)인 방법.
제 16 항에 있어서, 인라인 혼합이 키토산-핵산 폴리플렉스의 상기 비-농축된 분산액을 제조하는데 사용되는 방법.
제 16 항에 따른 방법에 의해 제조되는 키토산-핵산 폴리플렉스의 농축된 분산액.
수화된 키토산-핵산 폴리플렉스를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 조성물이 0.5 mg/mL 이상의 핵산 농도를 가지고 상기 키토산-핵산 폴리플렉스가 치료적 핵산 구성물을 포함하는 약학 조성물.
제 22 항에 있어서, 등장성인 약학 조성물.
키토산 용액 및 핵산 용액을 혼합함으로써 제조되는 혼합 분산액에서 형성되는 키토산-핵산 폴리플렉스의 직경을 변경하는 방법으로서, 키토산 대 핵산의 혼합 비율을 실질적으로 변경하지 않고, 혼합 분산액 중 키토산 또는 핵산의 농도를 실질적으로 변경하지 않고 키토산 또는 핵산 분산액의 부피를 변경하는 것을 포함하는 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 혼합 용액이 상기 키토산 용액 및 상기 핵산 용액의 혼합에 의해 제조되며, 상기 키토산 용액 및 상기 핵산 용액의 유속이, 속도를 통한 혼합 흐름이 유지되고 키토산 및 핵산의 혼합 농도가 유지되도록 조정되는 방법.